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►B REGULAMENTO (CE) N.o86/94 DA COMISSÃO
de 19 de Janeiro de 1994
que estabelece o método de referência para a determinação do sitosterol e do estigmasterol na
manteiga
(JO L 17 de 20.1.1994, p. 7)
Alterado por:
Jornal Oficial
n.opágina data
►M1Regulamento (CE) n.o175/1999 da Comissão de 26 de Janeiro de 1999 L20 22 27.1.1999
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REGULAMENTO (CE) N.o86/94 DA COMISSÃO
de 19 de Janeiro de 1994
que estabelece o método de referência para a determinação do
sitosterol e do estigmasterol na manteiga
A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,
Tendo emconta o Tratado que institui a Com unidade Europeia,
TendoemcontaoRegulamento(CEE)n.o804/68doConselho,de27
deJunhode1968,queestabeleceaorganizaçãocomumdemercadonosectordoleiteedosprodutoslácteos(
1),comaúltimaredacçãoquelhe
foidadapeloRegulamento(CEE)n.o2071/92(2),e,nomeadamente,o
n.o7 do seu artigo 6.o,
Considerandoqueamanteigadevesersubmetidaamarcaçãoequeos
produtos m arcados devemser controlados emconform idade comosartigos3.
oe6.odoRegulamento(CEE)n.o570/88daComissão(3),com
a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CE) n.o3049/
/93(4);
Considerando que a estrita observância das condições relativas à
marcação da manteiga é essencial para prevenir o risco de utilizaçõesnão autorizadas da mantiga subsidiada;
Considerando que, dada a importância da marcação para o correcto
funcionamentodoregime,énecessáriodefinirmétodoscomuns,aplicá-veisdomesmomodoemtodaaComunidade,paraadetecçãodetodosos marcadores exigidos pelo regime; que dessa forma se garantirá,designadamente, um tratamento idêntico a todos os operadores quetenhamacessoaoregim eeaeliminaçãodecondiçõesnãoequitativasde
concorrência que, actualmente, podem decorrer de diferentes métodosde análise nacionais;
Considerando que o Regulamento (CEE) n.
o3942/92 da Comissão(5)
estabeleceométododereferênciaparaadeterminaçãodeestigmasterole de sitosterol no butteroil;que este método pode ser aplicável, com
ligeiras alterações, à deteriação de esteróis marcadores na manteiga;
Considerando que é necessário determinar a precisão do método e os
respectivos limites de determinação;
Considerando que as medidas previstas na presente decisão estão em
conformidade com o parecer do Comité de Gestão do Leite e dosProdutos Lácteos,
ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO:
Artigo 1.o
Se o teor de estigmasterol ou de β-sitosterol da manteiga tiver de ser
determinadoemconformidadecomoartigo6.odo►M1Regulamento
(CE) n.o2571/97 ◄, será aplicado o método de análise de referência
descrito emanexo.
(1)J On .oL 148 de 28. 6. 1968, p. 13.
(2)J On .oL 215 de 30. 7. 1992, p. 64.
(3)J On .oL 55 de 1. 3. 1988, p. 31.
(4)J On .oL 273 de 5. 11. 1993, p. 7.
(5)J On .oL 399 de 31. 12. 1992, p. 29.
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A manteiga terá sido marcada correctamente se os resultados obtidosforemconform es aos critérios especificados no ponto 8 do anexo dopresente regulamento.
Artigo 2.
o
O presente regulamento entra em vigor no terceiro dia seguinte ao da
sua publicação no Jornal Oficial das Comunidades Europeias .
É aplicável a partir de 1 de Abril de 1994.
O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e
directamente aplicável em todos os Estados-membros.
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ANEXO
DETERMINAÇÃO DO SITOSTEROL OU DO ESTIGMASTEROL NA
MANTEIGA POR CROMATOGRAFIA GASOSA EM COLUNA
CAPILAR
1. OBJECTIVO E CAMPO DE APLICAÇÃO
O método descreve um processo para a determinação quantitativa do
sitosterol ou do estigmasterol na manteiga. Considera-se o sitosterolcomo sendo a soma do β-sitosterol e do 22-di-hidro- β-sitosterol; os
outrossitosteróissãoconsideradosinsignificantes.Ométodoéaplicávelàs amostras recebidas nos termos do Regulamento (CEE) n.
o570/88.
2. PRINCÍPIO
Amanteigaésaponificadacomumasoluçãoetanólicadehidróxidode
potássio; os insaponificáveis são extraídos cométer etílico.
Os esteróis são convertidos eméteres trim etilsilílicos e analisados por
cromatografia gasosa em coluna capilar, tomando como referência umpadrão interno de betulina.
3. EQUIPAMENTO
3.1. Balãodesaponificaçãode150mililitros,equipadocomumcondensador
de refluxo comjuntas esm eriladas.
3.2. Ampolas de decantação de 500 mililitros.3.3. Balões de 250 mililitros.3.4. Balões de 250 mililitros, para equilíbrio da pressão, ou similar, para
recolha do éter etílico evaporado.
3.5. Coluna de vidro com 350 mm × 20 mm, com tampa de vidro sinteri-
zado.
3.6. Banho de água ou manta de aquecimento.3.7. Tubos de reacção de 2 mililitros.3.8. Cromatógrafodefasegasosautilizávelcomcolunacapilar,quedisponha
de um sistema de divisão da amostra sendo constituído por:
3.8.1. Câmara termostatizada para colunas, capaz de manter a temperatura
desejadaa±1 °C;
3.8.2. Unidade de vaporização comregulação de tem peratura;
3.8.3. Detector de ionização de chama com conversor/amplificador;3.8.4. Integrador/registador adequado ao conversor/amplificador (3.8.3).3.9. ColunacapilardesílicafundidatotalmenterevestidacomBP1ouequi-
valente, com uma espessura uniforme de 0,25 mícron; a coluna devepermitir a resolução dos picos dos derivados trimetilsilílicos do lanos-terol e do sitostero l — é adequada uma coluna com 0,2 milímetro de
diâmetro interno e 12 metros de comprimento revestida de BP1.
3.10. Microsseringa para cromatografia gasosa 1µl de capacidade e agulha
rígida.
4. REAGENTES
Todos os reagentes devemser de grau analítico reconhecido. A água
utilizadadeveseráguadestiladaouáguadegraudepurezapelomenosequivalente.
4.1. Etanol, comumgrau de pureza de, pelo m enos, 95 %.4.2. Solução de hidróxido de potássio, a 60 %: dissolver 600 gramas de
hidróxidodepotássio(mínimo:85%)emáguaecompletarovolume,comágua, até umlitro.
4.3. Betulina (Sigma Chemicals Ltd.) com um grau de pureza de, pelo
menos, 99 %.
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4.3.1. Padrão interno: solução de betulina eméter etílico (4.4).
4.3.1.1. A concentração da solução de betulina utilizada na determinação do
sitosterol deve ser 1,0 mg/ml.
4.3.1.2. A concentração da solução de betulina utilizada na determinação do
estigmasterol deve ser 0,4 mg/ml.
4.4. Éter etílico de qualidade analítica (isento de peróxidos ou resíduos).4.5. Sulfato de sódio anidro granular, previamente seco a 102 °C, durante
duas horas.
4.6. TRI-SIL como reagente de sililação (fornecido por Pierce Chemical
CO., número de catálogo 49001), ou equivalente. (ATENÇÃO: oTRI-SIL é inflamável, tóxico, corrosivo e, possivelmente, cancerígeno.Opessoaldolaboratóriodeveestarfamiliarizadocomoscuidadosatercomo TRI-SIL e tom ar as precauções apropriadas.)
4.7. Lanosterol.4.8. Sitosterolcomumgraudepureza(P),conhecido,nãoinferiora90%.
Nota 1:ograudepurezadospadrõesutilizadosnacalibraçãodeveser
determinado pelo método da normalização. Considerar que todos osesteróispresentesnaamostrafiguramnocromatograma,queaáreatotaldos picos representa 100 % dos componentes esteróis e que todos osesteróis produzem a mesma resposta do detector. A linearidade dosistema deve ser assegurada para a gama de concentrações utilizada.
4.8.1. Solução-padrão de sitosterol: preparar uma solução aproximadamente
0,5mg/ml(W1)desitosterol(4.8)eméteretílico(4.4),comaprecisãode 0,001 mg/ml.
4.9. Estigmasterolcomumgraudepureza(P),conhecido,nãoinferiora90
%.
4.9.1. Solução-padrão de estigmasterol: preparar uma solução aproximada-
mente0,2mg/ml(W1)deestigmasterol(4.9)eméteretílico(4.4),coma precisão de 0,001 mg/ml.
4.10. Solução para teste da resolução: preparar uma solução que contenha
0,05mgdelanosterol(4.7)e0,5mgdesitosterol(4.8)pormililitro,eméter etílico (4.4).
5. TÉCNICA
5.1. Preparação das soluções-padrão para a cromatografia: o padrão interno
(4.3.1) deve ser adicionado à solução-padrão do esterol apropriado aomesmo tempo que for adicionado à amostra saponificada (5.2.2).
5.1.1. Solução-padrão cromatográfica de sitosterol: transferir um mililitro da
solução-padrão de sitosterol (4.8.1) para dois tubos de ensaio (3.7) eremover o éter etílico com uma corrente de azoto. Adicionar um mili-litro do padrão interno (4.3.1.1) e remover o éter etílico com umacorrente de azoto.
5.1.2. Solução-padrão cromatográfica de estigmasterol: transferir um mililitro
da solução-padrão de estigmasterol (4.9.1) para dois tubos de ensaio(3.7)eremoveroéteretílicocomumacorrentedeazoto.Adicionarummililitro do padrão interno (4.3.1.2) e remover o éter etílico com umacorrente de azoto.
5.2. Preparação dos insaponificáveis.
5.2.1. Fundiraamostrademanteigaporaquecimentoaumatemperaturanão
superiora35 °C,misturandoporagitação.Pesarparaumbalãode150
ml (3.1), com a precisão de 1 mg, cerca d e1gd emanteiga (W2).
Adicionar 50 mililitros de etanol (4.1) e 10 mililitros da solução dehidróxidodepotássio(4.2).Adaptarocondensadorderefluxoeaquecer
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acercade75 °C,durante30minutos.Retirarocondensadorearrefecer
o balão até à temperatura ambiente, aproximadamente.
5.2.2. Adicionaraobalão1,0mldopadrãointerno(4.3.1.1)casosepretenda
determinar o sitosterol, ou 1,0 ml de (4.3.1.2), caso se pretenda deter-minaroestigmasterol.Homogeneizarcompletamente.Transferirquanti-tativamenteoconteúdodobalãoparaumaampoladedecantaçãode500mililitros(3.2),procedendoalavagenscom50mililitrosdeáguae250mililitrosdeéteretílico(4.4).Agitaraampoladedecantaçãovigorosa-mente, durante dois minutos, e deixar as fases separarem-se. Escoar afase aquosa inferior e proceder à lavagemda fase etérea, agitando aampola com quatro alíquotas sucessivas de 100 mililitros de água.
Nota 2:paraevitaraformaçãodeumaemulsãoéessencialqueasduas
prim eiras lavagens comágua sejamefectuadas comprecaução (proce-dendo a 10 inversões). Na terceira lavagem, pode-se agitar vigorosa-mente durante 30 segundos. No caso de se formar uma emulsão, estapodesereliminadaatravésdaadiçãod e5a10mililitrosdeetanol.Sese
adicionar etanol, é essencial proceder a mais duas lavagens vigorosascomágua.
5.2.3. Passarafaseetérea,límpidaeisentadesabões,porumacolunadevidro
(3.5),contendo30gramasdesulfatodesódioanidro(4.5).Recolherafase etérea numbalão de 250 m ililitros (3.3). Introduzir umregulari-zadordeebuliçãoeevaporarquaseatéàsecuraporrecursoaumbanhodeáguaouaumamantadeaquecimento;recolherossolventesevapo-rados.
Nota 3:seoextractoquecontémaamostraforlevadoàsecuratotal,a
temperaturas muito elevadas, podem ocorrer perdas de esteróis.
5.3. Preparação dos éteres trimetilsilílicos.
5.3.1. Comoauxíliode2mldeéteretílico,transferirdobalãoparaumtubo
deensaiode2ml(3.7)asoluçãoetérearemanescenteeremoveroétercomumacorrentedeazoto.Lavarobalãocommaisduasalíquotasde2mldeéteretílico,transferindo-asparaotubodeensaioeremovendooéter, cada uma das vezes, com uma corrente de azoto.
5.3.2. Proceder à sililação da amostra, adicionando um mililitro de TRI-SIL
(4.6). Tapar o tubo de reacção e agitar vigorosamente, para dissolver.Nocasodeadissoluçãoserincompleta,aquecera65-70 °C.Deixarem
repousodurante,pelomenos,cincominutosantesdeprocederàinjecçãono cromatógrafo de fase gasosa. Proceder à sililação dos padrões domesmomodoqueasamostras.Procederàsililaçãodasoluçãoparatesteda resolução (4.10) do mesmo modo que as amostras.
Nota 4:asililaçãodeveserefectuadanaausênciadeágua.Asililação
incompleta da betulina é revelada pela presença de um segundo pico,próximo do pico correspondente à betulina.
Apresençadeetanolduranteasililaçãointerferenoprocessopodendo
resultardelavageminadequadanaetapadeextracção.Seesteproblemapersistir,poderáserefectuadaumaquintalavagem,comagitaçãovigo-rosa durante 30 segundos, na etapa de extracção.
5.4. Análise por cromatografia em fase gasosa.
5.4.1. Selecção das condições operatórias.
Montarocromatógrafodefasegasosadeacordocomasinstruçõesdo
fabricante.
Apresentam-se a seguir condições operatórias indicativas:
— temperatura da coluna: 265 °C
— temperatura do injector: 280 °C,
— temperatura do detector: 300 °C,
— caudal do gás-vector: 0,6 ml/minuto,— pressão de hidrogénio: 84 kPa,— pressão de ar: 155 kPa,
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—divisãodaamostra:10 :1a50:1;estarelaçãodeveseroptimizada
emfunção das instruções do fabricante devendo, de seguida, asse-gurar-se a linearidade da resposta do detector emtoda a gam a deconcentrações utilizada.
Nota 5:é de especial importância que a linha de injecção seja limpa
comregularidade.
— volume injectado: 1 µl de solução (éter trimetilsilílico).
Deixarqueosistemaatinjaoequilíbrioeobterumarespostasuficiente-
mente estável antes de começar as análises.
As condições indicadas podemser alteradas emfunção das caracterís-
ticas da coluna e do cromatógrafo de fase gasosa, de modo a obtercromatogramas que obedeçam às seguintes condições:
— opicodositosteroldeve-sedistinguirclaramentedopicodolanos-
terol.Afigura1mostraocromatogramatípicoquedeveserobtidocomasoluçãoparatestedaresolução(4.10),depoisdesubmetidaasililação,
— ostemposderetençãorelativosdosesteróisqueseindicamaseguir
devem ser, aproximadamente:
Colesterol: 1,0
Estigmasterol: 1,3Sitosterol: 1,5Betulina: 2,5,
— otempoderetençãodabetulinadeveser,aproximadamente,de24
minutos.
5.4.2. Execução da análise
Injectar 1 µl da solução-padrão sililada (estigmasterol ou sitosterol) e
ajustar os parâmetros de calibração do integrador.
Injectarnovovolumede1µldasolução-padrãosililadaparadeterminar
os factores de resposta da betulina.
Injectar 1 µl da solução-amostra silidada e medir as áreas dos picos.
Intercalarcadasériedeamostrascomainjecçãodospadrões.Atítulodeorientação,procederaseisinjecçõesdeamostraemcadasérielimitadapelos padrões.
Nota 6:a integração do pico do estigmasterol deve incluir as caudas
respectivas, definidas pelos pontos 1 ,2e3d afigura 2 b.
Ao calcular o total de sitosterol, incluir na integração do pico do
sitosterolaáreado22-dihidro- β-sitosterol(estigmastanol),queéeluído
imediatamente a seguir ao sitosterol (ver a figura 3 b).
6. CÁLCULO DOS RESULTADOS
6.1. Determinarasáreasdospicosdoesteroledabetulinanospadrõesque
delimitam cada série de amostras e calcular R
1:
R1=área média dos picos do esterol no padrão
área média dos picos da betulina no padrão
Determinarasáreadospicosdoesterol(estigmasterolousitosterol)eda
betulina da amostra e calcular R2:
R2=área do pico do esterol da amostra
área do pico da betulina da amostra
W1= m assa (emm g) de esterol contida emumm ililitro de solução-
-padrão (4.8.1 ou 4.9.1).
W2= massa da amostra (em g) (5.2.1).
P = grau de pureza do esterol padrão (4.8 ou 4.9).
Teor de esterol da amostra (em mg/kg) =R2
R1×W1
W2×P×1 0 .
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7. PRECISÃO DO MÉTODO
7.1. Repetibilidade
7.1.1. Estigmasterol
Adiferençaentreosresultadosdeduasdeterminações,efectuadascomo
menor intervalo de tempo possível pelo mesmo operador, utilizando omesmo equipamento e testando o mesmo material, não deve exceder19,3 mg/kg.
7.1.2. Sitosterol
Adiferençaentreosresultadosdeduasdeterminações,efectuadascomo
menor intervalo de tempo possível pelo mesmo operador, utilizando omesmo equipamento e testando o mesmo material, não deve exceder23,0 mg/kg.
7.2. Reprodutibilidade
7.2.1. Estigmasterol
A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas por
operadoresdelaboratóriosdiferentes,utilizandoequipamentodiferenteetestando o mesmo material, não deve exceder 31,9 mg/kg.
7.2.2. Sitosterol
A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas por
operadoresdelaboratóriosdiferentes,utilizandoequipamentodiferenteetestando o mesmo material, não deve exceder 8,7 % da média dasdeterminações.
7.3. Origemdos dados relativos à precisão
Osdadosrelativosàprecisãoforamdeterminadoscombasenumensaio
efectuado em1992, que envolveu oito laboratórios, seis am ostras (trêsduplicados em teste cego) de estigmasterol e seis amostras (três dupli-cados emteste cego) para o sitosterol.
8. TOLERÂNCIAS
▼
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8.1. Devem ser recolhidas três amostras do produto marcado, por forma a
verificar a correcção da sua marcação.
▼B
8.2. Estigmasterol
8.2.1. Ataxadeincorporaçãodeestigmasteroléde150gramasdeestigmas-
terol comgrau de pureza de, pelo m enos, 95 % por tonelada demanteiga,istoé,142,5mg/kg;ou170gramasdeestigmasterolcomgraudepurezade,pelomenos,85%portoneladademanteiga,istoé,144,5mg/kg.
▼
M1
8.2.2. Osresultadosdastrêsamostrasobtidascomaanálisedoprodutoserão
utilizadosparacomprovaratax aeahomogeneidadedeincorporaçãodo
marcadoreomenor destes resultados será comparado com os limites
que se seguem[tendo emconta a diferença crítica para umnível deprobabilidade de 95% (CrD95)]:
— 116,0mg/kg(95%dataxamínimadeincorporacãonoquerespeita
ao estigm asterol comumgrau de pureza de 95%),
— 118,0mg/kg(95%dataxamínimadeincorporaçãonoquerespeita
ao estigm asterol comumgrau de pureza de 85%);
— 81,0mg/kg(70%dataxamínimadeincorporaçãonoquerespeita
ao estigm asterol comumgrau de pureza de 95%),
— 82,0mg/kg(70%dataxamínimadeincorporaçãonoquerespeita
ao estigm asterol comumgrau de pureza de 85%).
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▼M1
Deve usar-se a concentração de marcador na amostra que apresente o
resultado mais baixo e uma interpolação respectivamente entre 116,0mg/kg e 81,0 mg/kg, ou entre 118,0 mg/kg e 82,0 mg/kg.
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B
8.3. Sitosterol
8.3.1. Ataxadeincorporaçãodesitosteroléde600gramasdesitosterolcom
graudepurezade,pelomenos,90%portoneladademanteiga,istoé,540 mg/kg.
▼
M1
8.3.2. Osresultadosdastrêsamostrasobtidascomaanálisedoprodutoserão
utilizadosparacomprovaratax aeahomogeneidadedeincorporaçãodo
marcadoreomenor destes resultados será comparado com os limites
que se seguem[tendo emconta a diferença crítica para umnível deprobabilidade de 95% (CrD95)]:
— 486,0mg/kg(95%dataxamínimadeincorporaçãonoquerespeita
ao sitosterol comumgrau de pureza de 90%),
— 358,0mg/kg(70%dataxamínimadeincorporaçãonoquerespeita
ao sitosterol comumgrau de pureza de 90%).
Deve usar-se a concentração de marcador na amostra que apresente o
resultado mais baixo e uma interpolação entre 486,0 mg/kg e 358,0mg/kg.
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