1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 1
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►BREGULAMENTO (CEE) N.o2568/91 DA COMISSÃO
de 11 de Julho de 1991
relativoàscaracterísticas dosazeitesedosóleosdebagaçodeazeitona,bemcomoaosmétodosde
análise relacionados
(JO L 248 de 5.9.1991, p. 1)
Alterado por:
Jornal Oficial
n.opágina data
►M1Regulamento (CEE) n.o3682/91 da Comissão de 17 de Dezembro de
1991L 349 36 18.12.1991
►M2Regulamento (CEE) n.o1429/92 da Comissão de 26 de Maio de 1992 L 150 17 2.6.1992
►M3Regulamento (CEE) n.o1683/92 da Comissão de 29 de Junho de 1992 L 176 27 30.6.1992
►M4Regulamento (CEE) n.o1996/92 da Comissão de 15 de Julho de 1992 L 199 18 18.7.1992
►M5Regulamento (CEE) n.o3288/92 da Comissão de 12 de Novembro de
1992L 327 28 13.11.1992
►M6Regulamento (CEE) n.o183/93 da Comissão de 29 de Janeiro de 1993 L 22 58 30.1.1993
►M7alterado pelo Regulamento (CEE) n.o826/93 da Comissão de 6 de
Abril de 1993L 87 6 7.4.1993
►M8Regulamento (CEE) n.o620/93 da Comissão de 17 de Março de 1993 L 66 29 18.3.1993
►M9Regulamento (CE) n.o177/94 da Comissão de 28 de Janeiro de 1994 L 24 33 29.1.1994
►M10Regulamento (CE) n.o2632/94 da Comissão de 28 de Outubro de 1994 L 280 43 29.10.1994
►M11Regulamento (CE) n.o656/95 da Comissão de 28 de Março de 1995 L 69 1 29.3.1995
►M12Regulamento (CE) n.o2527/95 da Comissão de 27 de Outubro de 1995 L 258 49 28.10.1995
►M13Regulamento (CE) n.o2472/97 da Comissão de 11 de Dezembro de 1997 L 341 25 12.12.1997
►M14Regulamento (CE) n.o282/98 da Comissão de 3 de Fevereiro de 1998 L 28 5 4.2.1998
►M15Regulamento (CE) n.o2248/98 da Comissão de 19 de Outubro de 1998 L 282 55 20.10.1998
►M16Regulamento (CE) n.o379/1999 da Comissão de 19 de Fevereiro de 1999 L 46 15 20.2.1999
►M17Regulamento (CE) n.o455/2001 da Comissão de 6 de Março de 2001 L 65 9 7.3.2001
►M18Regulamento (CE) n.o2042/2001 da Comissão de 18 de Outubro de 2001 L 276 8 19.10.2001
►M19Regulamento (CE) n.o796/2002 da Comissão de 6 de Maio de 2002 L 128 8 15.5.2002
►M20Regulamento (CE) n.o1989/2003 da Comissão de 6 de Novembro de
2003L 295 57 13.11.2003
Rectificado por:
►C1Rectificação, JO L 347 de 28.11.1992, p. 69 (2568/91)
►C2Rectificação, JO L 176 de 20.7.1993, p. 26 (183/93)
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REGULAMENTO (CEE) N.o2568/91 DA COMISSÃO
de 11 de Julho de 1991
relativo àscaracterísticas dosazeites e dosóleos de bagaçode azei-
tona, bem como aos métodos de análise relacionados
A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,
Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Euro-peia,
Tendo em conta o Regulamento n.
o136/66/CEE do Conselho, de 22 de
Setembro de 1966, que estabelece uma organização comum de mercado
no sector das matérias gordas (1), com a última redacção que lhe foi
dada pelo Regulamento (CEE) n.o3577/90 (2), e, nomeadamente, o seu
artigo 35.oA,
Considerando que o anexo do Regulamento n.o136/66/CEE estabelece
as denominações e definições dos azeites e dos óleos de bagaço deazeitona comercializados no interior de cada Estado-membro, bem
como nas trocas comerciais intracomunitárias e com países terceiros;
Considerando que, para poder distinguir os diversos tipos de azeite e
óleo de bagaço de azeitona, há que definir as características físico--químicas de cada um deles, bem como as característicasorganolépticas dos azeites virgens, por forma a assegurar a pureza e aqualidade dos produtos em causa, sem prejuízo de outras disposiçõesexistentes na matéria;
Considerando que é conveniente determinar de modo uniforme, em
toda a Comunidade, a presença das características dos diversos tipos
de azeite e óleo de bagaço de azeitona; que, para o efeito, é necessárioestabelecer métodos comunitários de análise química e de apreciaçãoorganoléptica; que, no entanto, é conveniente autorizar, durante umperíodo transitório, a utilização de outros métodos de análise aplicados
nos Estados-membros, com a condição de, em caso de divergência de
resultados, serem determinantes os obtidos de acordo com o métodocomum;
Considerando que a definição das características físico-químicas dos
azeites e óleos de bagaço de azeitona e o estabelecimento dos métodosde análise implicam a adaptação das notas complementares do capítulo15 da Nomenclatura Combinada;
Considerando que o método de avaliação das características organolép-
ticas dos azeites virgens prevê a criação de júris de provadores
seleccionados e formados; que é, por conseguinte, conveniente prevero prazo necessário para a instalação dessa estrutura; que, atendendo àsdificuldades que serão sentidas por determinados Estados-membros naconstituição dos júris de provadores, é conveniente autorizar o recurso
a júris existentes em outros Estados-membros;
Considerando que, para assegurar o correcto funcionamento do sistema
dos direitos niveladores aplicáveis à importação de bagaços de azei-tona, é conveniente prever um método único para a determinação doteor de óleo desses produtos;
Considerando que, para não causar um prejuízo ao comércio, deve ser
previsto um período limitado para o escoamento dos azeites e óleos debagaço de azeitona acondicionados antes da entrada em vigor do
presente regulamento;
Considerando que deve, consequentemente, ser revogado o Regula-
mento (CEE) n.
o1058/77 da Comissão (3), com a última redacção que
lhe foi dada pelo Regulamento (CEE) n.o1858/ /88 (4);1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 2
(1)J O n .o172 de 30. 9. 1966, p. 3025/66.
(2)J O n .oL 353 de 17. 12. 1990, p. 23.
(3)J O n .oL 128 de 24. 5. 1977, p. 6.
(4)J O n .oL 166 de 1. 7. 1988, p. 10.
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Considerando que o Comité de Gestão das Matérias Gordas não emitiu
parecer no prazo fixado pelo seu presidente,
ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO:
Artigo 1.o
1. São considerados azeites virgens, na acepção do ponto 1, alíneasa), b) e c), do anexo do Regulamento n.
o136/66/CEE, os azeites que
apresentem as características indicadas nos pontos 1 e 2 do anexo I dopresente regulamento.
2. É considerado azeite lampante, na acepção do ponto 1, alínea c)
do anexo do Regulamento n.
o136/66/CEE, o azeite que apresente as
características indicadas no ponto 3 do anexo I do presente regula-
mento.
3. É considerado azeite refinado, na acepção do ponto 2 do anexo do
Regulamento n.o136/66/CEE, o azeite que apresente as características
indicadas no ponto 4 do anexo I do presente regulamento.
4. É considerado azeite constituído por azeite refinado e azeites
virgens, na acepção do ponto 3 do anexo do Regulamento n.o136/66/
/CEE, o azeite que apresente as características indicadas no ponto 5 doanexo I do presente regulamento.
5. É considerado óleo de bagaço de azeitona bruto, na acepção do
ponto 4 do anexo do Regulamento n.
o136/66/CEE, o óleo que apre-
sente as características indicadas no ponto 6 do anexo I do presente
regulamento.
6. É considerado óleo de bagaço de azeitona refinado, na acepção do
ponto 5 do anexo do Regulamento n.o136/66/CEE, o óleo que apre-
sente as características indicadas no ponto 7 do anexo I do presenteregulamento.
7. É considerado óleo de bagaço de azeitona, na acepção do ponto 6
do anexo do Regulamento n.
o136/66/CEE, o óleo que apresente as
características indicadas no ponto 8 do anexo I do presente regula-mento.
Artigo 2.
o
1. A determinação das características dos azeites e óleos de bagaço
de azeitona previstas no anexo I do presente regulamento é efectuadade acordo com os seguintes métodos de análise:
— para a determinação dos ácidos gordos livres, expressos em percen-
tagem de ácido oleico, o método constante do anexo II,
— para a determinação do índice de peróxidos, o método constante do
anexo III,
— para a determinação do teor de ceras, o método constante do anexo
IV,
— para a determinação do teor de esteróis, o método constante do
anexo V,
— para a determinação do eritrodiol, e uvaol o método constante do
anexo VI,
— para a determinação dos ácidos gordos saturados em posição 2 nos
triglicéridos, o método constante do anexo VII,
— para a análise espectrofotométrica, o método constante do anexo
IX,
— para a determinação dos ácidos gordos componentes, o método
constante dos anexos XA e XB,1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 3
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— para a determinação dos solventes halogenados voláteis, o método
constante do anexo XI,
— para a avaliação das características organolépticas dos azeites
virgens, o método constante do anexo XII, aplicado em conformi-dade com o n.
o2,
— para a determinação dos estigmastadienos, o método constante do
Anexo XVII;
— para a determinação da composição de triglicéridos com NCE42, o
método constante do anexo XVIII,
— para a determinação dos teores de álcoois alifáticos, o método cons-
tante do anexo XIX.
2. A verificação, pelas autoridades nacionais ou seus representantes,
das características organolépticas dos azeites virgens será efectuada por
júris de provadores aprovados pelos Estados-Membros.
As características organolépticas de um azeite referido no primeiro
parágrafo serão consideradas conformes com a categoria de azeitedeclarada se um júri aprovado pelo Estado-Membro em causaconfirmar a classificação atribuída.
Se o júri aprovado não confirmar a declaração no respeitante às carac-
terísticas organolépticas da categoria de azeite declarada, as autoridades
nacionais ou os seus representantes farão proceder, a pedido do interes-
sado, a duas contra-análises por outros júris aprovados, das quais pelomenos uma será efectuada por um júri aprovado pelo Estado-Membroprodutor em causa. As características em questão serão consideradasconformes com as declaradas se as duas contra-análises confirmarema classificação declarada. Caso contrário, e sem prejuízo das sanções
incorridas, as despesas das contra-análises serão imputadas ao interes-
sado.
3. A colheita de amostras para fins de verificação pelas autoridades
nacionais ou seus representantes das características dos azeitesprevistas no n.
o1 é efectuada de acordo com as normas internacionais
EN ISO 661 e EN ISO 5555, relativas à preparação das amostras para
ensaio e à amostragem. Todavia, por derrogação ao ponto 6.8 da norma
EN ISO 5555, para os lotes constituídos pelos referidos azeites emembalagens imediatas de capacidade igual ou inferior a 100 litros, acolheita das amostras é efectuada em conformidade com o anexo I Ado presente regulamento.
Sem prejuízo do disposto na norma EN ISO 5555 e no capítulo 6 da
norma EN ISO 661, as amostras devem ser colocadas, o mais rapida-
mente possível, ao abrigo da luz e de temperaturas elevadas e serenviadas para análise, ao laboratório, o mais tardar:
— de Outubro a Maio, no décimo dia útil após a colheita,
— de Junho a Setembro, no quinto dia útil após a colheita.
4.►
M20Para a verificação prevista no n.o3, as análises referidas
nos anexos II, III, IX, X e XII, bem como, se for caso disso, as contra--análises previstas pelas legislações nacionais, devem ser efectuadasantes do termo do prazo de durabilidade mínima. Se a colheita da
amostra se efectuar mais de quatro meses antes do termo do prazo de
durabilidade mínima, as análises em causa devem ser realizadas, o maistardar, no quarto mês seguinte ao da colheita da amostra. Não se prevêqualquer prazo para as restantes análises previstas pelo referidoregulamento. ◄
Salvo no caso de a colheita da amostra ter ocorrido menos de um mês
antes do final do prazo de durabilidade mínima, se os resultados das1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 4
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análises não corresponderem às características da categoria de azeite ou
de óleo de bagaço de azeitona declarada, o interessado é notificado, omais tardar, um mês antes do final do período previsto no primeiro
parágrafo.
5. Para a determinação das características dos azeites pelos métodos
previstos no n.
o1, comparar-se-ão directamente os resultados analíticos
com os limites previstos no presente regulamento.
Artigo 2.oA
A verificação, pelas autoridades nacionais ou pelos seus representantes,
da conformidade de uma amostra dos azeites e dos óleos de bagaço deazeitona com a categoria declarada pode efectuar-se:
a) Quer realizando as análises previstas no anexo I, sendo irrelevante a
ordem de realização;
b) Quer seguindo a ordem indicada no anexo I-B, relativo ao esquema
de tomada de decisão, até à tomada de uma das decisões mencio-
nadas no referido esquema.
Artigo►M193.o◄
Caso se verifique que as características organolépticas de um azeite são
diferentes das que decorrem da sua denominação, o Estado-membro emcausa aplicará, sem prejuízo de outras sanções eventuais, sanções pecu-niárias administrativas, cujo montante será determinado em função dagravidade da irregularidade detectada.
Para efeitos da avaliação da irregularidade, será nomeadamente tida em
conta a evolução natural das características de um azeite que tenha sido
conservado em condições normais.
No início de cada semestre, os Estados-membros informarão a
Comissão do número e da natureza das irregularidades detectadas edas sanções aplicadas no decurso do semestre anterior.
Artigo 4.
o
1. Para a apreciação e controlo das características organolépticas
pelas autoridades nacionais ou representantes destas, os Estados--Membros podem aprovar júris de provadores.
As condições de aprovação serão estabelecidas pelos Estados-
-Membros, nomeadamente de modo a:
— satisfazer as condições do ponto 4 do anexo XII.
— assegurar que a formação do chefe do júri seja efectuada por um
estabelecimento e em condições reconhecidos para o efeito peloEstado-Membro.
— fazer depender a validade da aprovação dos resultados obtidos no
quadro de um sistema de controlo anual instituído pelo Estado-
-Membro.
Cada Estado-Membro comunicará à Comissão a lista dos júris apro-
vados e as medidas tomadas em conformidade com o presente número.
2. Caso um Estado-membro encontre dificuldades na criação de um
júri de provadores no seu território, pode recorrer a um júri de prova-
dores aprovado noutro Estado-membro.
3. Cada Estado-membro estabelecerá a lista dos júris de provadores
criados por organizações profissionais ou interprofissionais, em confor-midade com as condições estabelecidas no n.
o1 e velará pelo respeito
dessas condições.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 5
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Artigo 6.o
1. O teor de ►C1óleo de bagaço ◄e outros resíduos da extracção
do azeite (códigos NC 2306 9011 e 2306 9019) é determinado em
conformidade com o método constante do anexo XV.
2. O teor de óleo referido no n.o1 é expresso em percentagem do
seu peso em relação ao extracto seco.
Artigo 7.o
São aplicáveis as disposições comunitárias respeitantes à presença de
contaminantes.
Relativamente ao teor de solventes halogenados, os limites para todas
as categorias de azeite são os seguintes:
— teor máximo de cada solvente halogenado detectado 0,1 mg/kg,
— teor máximo da soma dos solventes halogenados detectados 0,2 mg/
/kg
Artigo 8.o
1. Cada Estado-membro comunicará à Comissão as medidas
tomadas para aplicação do presente regulamento.
2. Os Estados-membros comunicarão à Comissão, no início de cada
semestre, uma súmula dos dados analíticos das determinações efec-tuadas durante o semestre anterior.
Esses resultados são examinados pelo Comité de Gestão das Matérias
Gordas, de acordo com o processo previsto no artigo 39.
odo Regula-
mento n.o136/66/CEE.
Artigo 9.o
É revogado o Regulamento (CEE) n.o1058/77.
Artigo 10.o
1. O presente regulamento entra em vigor no terceiro dia seguinte ao
da sua publicação no Jornal Oficial das Comunidades Europeias .N o
entanto, o método constante do anexo XII é aplicável a partir de►
M11 de Novembro de 1992 ◄, salvo no que concerne às
operações ligadas à intervenção.
Este método não se aplica aos azeites virgens acondicionados antes de
1 de Novembro de 1992.
2. O presente regulamento não é aplicável aos azeites e óleos de
bagaço de azeitona acondicionados antes da entrada em vigor dopresente regulamento e comercializados até 31 de Outubro de 1992.
O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e
directamente aplicável em todos os Estados-Membros.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 6
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ANEXOS
Sumário
Anexo I: Características dos azeites e óleos de bagaço de azeitona
Anexo I A: Amostragem de lotes de azeite ou óleo de bagaço de azeitona
em embalagens imediatas de capacidade máxima de 100 litros
Anexo I-B: Esquema de decisãoAnexo II: Determinação da acidez
Anexo III: Determinação do índice de peróxidos
Anexo IV: ►
M6Determinação do teor de ceras por intermédio de
cromatografia gás-líquido com coluna capilar ◄
Anexo V: Determinação da composição e do teor de esteróis por croma-
tografia em fase gasosa com coluna capilar
Anexo VI: Determinação do teor de eritrodiol e uvaol
Anexo VII: Determinação dos ácidos gordos na posição 2 nos triglicéridos
Anexo IX: Análise por espectrofotometria no ultravioletaAnexo XA: Análise por cromatografia em fase gasosa de ésteres metílicos
de ácidos gordos
Anexo XB: Preparação dos ésteres metílicos de ácidos gordos
Anexo XI: Determinação do teor de solventes halogenados voláteis no
azeite
Anexo XII: Exame organoléptico do azeite virgem
Anexo XV: Teor de óleo do bagaço de azeitonaAnexo XVI: Determinação do índice de iodo
Anexo XVII: Método de determinação dos estigmastadienos nos óleos
vegetais
Anexo XVIII: Método de determinação da composição de triglicéridos com
NCE42
Anexo XIX: Método de determinação dos teores de álcoois alifáticos1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 7
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ANEXO I
CARACTERÍSTICASDOS AZEITESE ÓLEOS DE BAGAÇO DE AZEITONA
CategoriaAcidez
(%)
(*)Índice de
peróxidos
mEq O2/kg (*)Ceras
mg/kg (**)Ácidos satu-
rados na
posição 2 do
triglicérido
(%)Estigmasta-
-dieno mg/
/kg (1)Diferença
ECN42 por
HPLC-ECN42
por cálculo
teóricoK232(*) K270(*) Delta-K (*)Avaliação
organoléptica
Mediana dos
defeitos
(Md) (*)Avaliação
organoléptica
Mediana do
frutado
(Mf) (*)
1. Azeite virgem extra ≤0,8 ≤20 ≤250 ≤1,5 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,50 ≤0,22 ≤0,01 Md = 0 Mf > 0
2. Azeite virgem ≤2,0 ≤20 ≤250 ≤1,5 ≤0,15 ≤0,2 ≤2,60 ≤0,25 ≤0,01 Md ≤2,5 Mf > 0
3. Azeite lampante > 2,0 — ≤300(3) ≤1,5 ≤0,50 ≤0,3 — — — Md > 2,5 (2)—
4. Azeite refinado ≤0,3 ≤5 ≤350 ≤1,8 — ≤0,3 — ≤1,10 ≤0,16 — —
5. Azeite constituído por
azeites refinados e azeites
virgens ≤1,0 ≤15 ≤350 ≤1,8 — ≤0,3 — ≤0,90 ≤0,15 — —
6. Óleo de bagaço de azei-
tona bruto — — > 350(4) ≤2,2 — ≤0,6 — — — — —
7. Óleo de bagaço de azei-
tona refinado ≤0,3 ≤5 > 350 ≤2,2 — ≤0,5 — ≤2,00 ≤0,20 — —
8. Óleo de bagaço de azei-
tona ≤1,0 ≤15 > 350 ≤2,2 — ≤0,5 — ≤1,70 ≤0,18 — —
(1) Soma dos isómeros, separados ou não por coluna capilar.
(2) Ou quando a mediana dos defeitos for inferior ou igual a 2,5 e a mediana do frutado for igual a 0.
(3) Os azeites com um teor de ceras compreendido entre 300 mg/kg e 350 mg/kg serão considerados azeite lampante se o teor de álcoois alifáticos totais for i nferior ou igual a 350 mg/kg ou a percentagem de eritrodiol e uvaol for
inferior ou igual a 3,5.
(4) Os azeites com um teor de ceras compreendido entre 300mg/kg e 350 mg/kg serão considerados óleo de bagaço de azeitona bruto se o teor de álcoois alifáti cos totais for superior a 350 mg/kg e a percentagem de eritrodiol e
uvaol for superior a 3,5.▼M201991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 8
CategoriaTeor de ácidos gordos (1)
Soma dos
isómeros
transo-
leicos
(%)Soma dos
isómeros
translino-
leicos +
translino-
lénicos
(%)Composição em esteróis
Esteróis
totais
(mg/kg)Eritrodiol
e uvaol
(%)
(**)Mirístico
(%)Lino-
-lénico
(%)Araquí-
dico
(%)Eico-
senóico
(%)Beé nico
(%)Linho-
cérico
(%)Coles-
terol
(%)Brassi-
casterol
(%)Cam-
pesterol
(%)Estigmas-
terol
(%)Beta-
sitosterol
(%) (2)Delta-7-
-Estigmas-
terol
(%)
1. Azeite virgem
extra ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
2. Azeite virgem ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,05≤0,05 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
3. Azeite lampante ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,10≤0,10 ≤0,5≤0,1≤4,0 — ≥93,0 ≤0,5≥1 000≤4,5 (3)
4. Azeite refinado ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,20≤0,30 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
5. Azeite consti-
tuído por azeites
refinados e
azeites virgens ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,2≤0,2≤0,20≤0,30 ≤0,5≤0,1≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 000 ≤4,5
6. Óleo de bagaço
de azeitona bruto ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,20≤0,10 ≤0,5≤0,2≤4,0 — ≥93,0 ≤0,5≥2 500 > 4,5(4)
7. Óleo de bagaço
de azeitona refi-
nado ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,40≤0,35 ≤0,5≤0,2≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 800 > 4,5
8. Óleo de bagaço
de azeitona ≤0,05 ≤1,0≤0,6≤0,4≤0,3≤0,2≤0,40≤0,35 ≤0,5≤0,2≤4,0 < Camp. ≥93,0 ≤0,5≥1 600 > 4,5
(1) Teor de outros ácidos gordos (%): palmítico: 7,5 — 20,0; palmitoleico: 0,3 — 3,5; heptadecanóico: ≤0,3; heptadecenóico: ≤0,3; esteárico: 0,5 — 5,0; oleico: 55,0 — 83,0; linoleico: 3,5 — 21,0.
(2) Soma de: delta-5,23-Estigmastadienol + Clerosterol + beta-Sitosterol+Sitostanol + delta-5-Avenasterol + Delta-5,24-Estigmastadienol.
(3) Os azeites com um teor de ceras compreendido entre 300 mg/kg e 350 mg/kg serão considerados azeites lampantes se o teor de álcoois alifáticos totais fo r inferior ou igual a 350 mg/kg ou a percentagem de eritrodiol e uvaol for
inferior ou igual a 3,5.
(4) Os azeites com um teor de ceras compreendido entre 300 mg/kg e 350 mg/kg serão considerados óleo de bagaço de azeitona bruto se o teor de álcoois alifáti cos totais for superior a 350 mg/kg e a percentagem de eritrodiol e
uvaol for superior a 3,5.
Notas:
a) Os resultados das análises devem ser expressos com o mesmo número de decimais que o previsto para cada característica. O último algarismo deve ser au mentado de uma unidade se o algarismo seguinte for superior a 4.
b) Basta que uma única características não seja conforme aos valores indicados para que o azeite mude de categoria ou seja declarado não conforme quant o à sua pureza.
c) As características de qualidade do azeite marcadas com um asterisco (*) implicam que:
— tratando-se de azeite lampante, os limites respectivos podem não ser respeitados simultaneamente;— tratando-se de azeites virgens, o desrespeito de, pelo menos, um desses limites implica mudança de categoria, mantendo-se, embora, classificados numa das categorias de azeites virgens.
d) As características marcadas com dois asteriscos (**) implicam que, relativamente a todos os óleos de bagaço de azeitona, os limites respectivos po dem não ser simultaneamente respeitados.▼M201991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 9
▼M20
ANEXO I-A
Amostragemdosazeitesouóleosdebagaçodeazeitonaentreguesememba-
lagens imediatas de 100 litros de capacidade máxima
O presente método de amostragem é aplicável às entregas de azeite ou óleo de
bagaço de azeitona com um volume máximo de 125000 litros, acondicionados
em embalagens imediatas de 100 litros de capacidade máxima.
Se o volume da entrega for superior a 125000 litros, deve a mesma subdividir-
-se em lotes de volumes iguais ou inferiores a 125000 litros. Se o volume da
entrega for inferior a 125000litros, a entrega em causa constituirá um lote.
Nesse caso, o método é aplicável a cada lote.
O número mínimo de amostras de partida é determinado em função da dimensão
do lote, em conformidade com o quadro constante do ponto 1.
A importância da amostra de partida é determinada em função da capacidade
das embalagens imediatas, segundo o quadro constante do ponto 2.1.
As definições de «entrega», «amostra de partida» e «amostra de laboratório» são
as referidas pela norma EN ISO 5555.
Entende-se por «lote» um conjunto de unidades de venda produzidas, fabricadas
e acondicionadas em circunstâncias tais que o azeite contido em cada uma
dessas unidades de venda seja considerado homogéneo relativamente a todas as
características analíticas.
1. NÚMERO DE AMOSTRAS DE PARTIDA
O número mínimo de amostras de partida é estabelecido em função das
dimensões do lote, de acordo com o seguinte quadro:
Dimensão do lote (litros) inferior a Número mínimo de amostras de partida
7 500 2
25000 3
75000 4
125000 5
As embalagens imediatas de uma mesma amostra de partida devem ser
escolhidas por contiguidade no lote.
Em caso de dúvida, o Estado-Membro aumentará o número de amostras de
partida.
2. CONSTITUIÇÃO DE UMA AMOSTRA DE PARTIDA
2.1Cada amostra de partida é constituída por:
Se as embalagens imediatas tiverem
uma capacidade:A amostra de partida incide no azeite
de:
a) Superior ou igual a 5 litros a) Três embalagens imediatas
b) Superior ou igual a 3 litros e
inferior a 5 litrosb) Três embalagens imediatas
c) Superior ou igual a 2 litros e
inferior a 3 litrosc) Três embalagens imediatas
d) Superior ou igual a 1 litro e
inferior a 2 litrosd) Seis embalagens imediatas
e) Superior ou igual a 0,75 litros e
inferior a 1 litroe) Seis embalagens imediatas
f) Inferior 0,75 litros f) Três vezes o azeite do número
mínimo de embalagens cuja
capacidade total supere 1,5 litros1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 10
▼M20
2.2As amostras de partida devem ser mantidas nas embalagens imediatas
atéàrealização dasanálises.Oazeite dasamostrasdepartidadeve,em
seguida, se for caso disso, ser subdividido em três amostras de labora-
tório com vista à realização:
a) Das análises referidas nos anexos II, III, IX e X;
b) Da análise referida no anexo XII;
c) Das outras análises.
2.3As embalagens que constituem uma amostra de partida são subdivi-
didas segundo os procedimentos de controlo previstos pelas legislações
nacionais.
3. ANÁLISES E RESULTADOS
a) Cada amostra de partida referida no ponto 1 é subdividida em amostras
de laboratório, em conformidade com o ponto 2.5 da norma EN ISO
5555, para ser submetida às seguintes análises:
— determinação dos ácidos gordos livres, referida no n.o1, primeiro
travessão, do artigo 2.o,
— determinação do índice de peróxidos, referida no n.o1, segundo
travessão, do artigo 2.o,
— análise espectrofotométrica, referida no n.o1, oitavo travessão, do
artigo 2.o,
— composição de ácidos gordos, referida no n.o1, nono travessão, do
artigo 2.o;
b) Se nem todos os resultados das análises referidas na alínea a) de, pelo
menos, uma das amostras de partida colhidas do mesmo lote forem
conformes às características da categoria de azeite declarada, o lote em
causa, na sua totalidade, é declarado não conforme.
Se os resultados das análises referidas na alínea a) de todas as amostras
de partida colhidas do mesmo lote não forem homogéneos no que
respeita às características de repetibilidade dos métodos utilizados, o
lote é declarado, na sua totalidade, não homogéneo, devendo cada
amostra de partida ser submetida às outras análises exigidas. Caso
contrário, apenas uma das amostras de partida do referido lote deve ser
submetida às outras análises exigidas;
c) Se o resultado de uma das análises referidas no segundo parágrafo da
alínea b) não for conforme às características da categoria de azeite decla-
rada, o lote em causa, na sua totalidade, é declarado não conforme.
Se todos os resultados das análises referidas no segundo parágrafo da
alínea b) forem conformes às características da categoria de azeite decla-
rada, o lote em causa, na sua totalidade, é declarado conforme.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 11
▼M20
ANEXO I-B
Esquemadetomadade decisão paraa verificação daconformidade de uma
amostra de azeite com a categoria declarada
A análise da conformidade de um azeite ou de óleo de bagaço de azeitona com
a categoria declarada pode efectuar-se:
a) Quer realizando as análises previstas para verificar o respeito das caracterís-
ticas estipuladas no anexo I, sendo irrelevante a ordem de realização;
b) Quer realizando as análises previstas no esquema de tomada de decisão, pela
ordem nele indicada, até à tomada de uma das decisões aí mencionadas.
As análises relativas aos contaminantes, necessárias para verificar a conformi-
dade com as normas da Comunidade Europeia, devem ser realizadas
separadamente.
O esquema de tomada de decisão aplica-se a todas as categorias de azeite e de
bagaço de azeitona. Compõe-se de quadros numerados de 1 a 11 que devem ser
abordados em função da declaração da categoria de azeite em presença e pela
ordem prevista no quadro geral.
Para efeitos da leitura do quadro geral (quadro 11):
— a linha dupla (=) indica o caminho a seguir em caso de conformidade
(resposta positiva) com as condições previstas na casa anterior. O pontilhado
(…) indica, pelo contrário, o caminho a seguir em caso de não-conformi-
dade,
— os títulos das casas constantes dos quadros 1 a 11 referem-se às análises
previstas pelo presente regulamento, segundo as correspondências mencio-
nadas no apêndice 1 do presente anexo,
— as letras nos círculos de decisão negativa dos quadros 1 a 11 remetem para
informações indicativas constantes do apêndice 2 do presente anexo. Não
implicam, por si sós, a obrigação de prosseguir as análises nem a correcção
das presunções referidas.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 12
▼M20
Quadro geral1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 13

▼M20
Quadro 11991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 14

▼M20
Quadro 21991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 15

▼M20
Quadro 31991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 16

▼M20
Quadro 41991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 17

▼M20
Quadro 51991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 18

▼M20
Quadro 61991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 19

▼M20
Quadro 71991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 20

▼M20
Quadro 81991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 21

▼M20
Quadro 91991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 22

▼M20
Quadro 101991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 23

▼M20
Quadro 111991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 24

▼M20
Apêndice 1
Correspondência entre os anexos do presente regulamento e as análises referidas pelo esquema
de tomada de decisão
— Acidez Anexo II Determinação da acidez
— Índice de peróxidos Anexo III Determinação do índice de peróxidos
— Espectrofotometria no ultravioleta Anexo IX Análise por espectrofotometria no
ultravioleta
— Avaliação organoléptica Anexo XII Exame organoléptico do azeite
virgem
— Estigmasta – 3,5 — dieno Anexo XVII Método para a determinação dos esti-
gamastadienos em óleos vegetais
— Isómeros Transdos ácidos gordos Anexo X-a e Análise dos ésteres metílicos de
ácidos gordos por cromatografia em
fase gasosa
Anexo X-bPreparação dos ésteres metílicos dos
ácidos gordos
— Composição de ácidos gordos Anexo X-a e Análise por cromatografia em fase
gasosa de ésteres metílicos de ácidos
gordos
Anexo X-bPreparação dos ésteres metílicos de
ácidos gordos
—∆NCE42 Anexo XVIII Determinação do teor de triacilglice-
róis com NCE42 (diferença entre o
teor obtido por HPLC e o teor
teórico)
— Composição em esteróis e este-
róis totaisAnexo V Determinação da composição e do
teor de esteróis por cromatografia
em fase gasosa com coluna capilar
— Eritrodiol e Uvaol Anexo VI Determinação da composição de
eritrodiol e uvaol
— Ceras Anexo IV Determinação do teor de ceras por
intermédio de cromatografia
gáslíquido com coluna capilar
— Álcoois alifáticos Anexo XIX Determinação dos teores de álcoois
alifáticos por cromatografia em fase
gasosa com coluna capilar
— Ácidos gordos saturados na
posição 2Anexo VII Determinação dos ácidos gordos
saturados na posição 2 nos triglicé-
ridos1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 25
▼M20
Apêndice 2
Quadro 1
a) Ver azeite virgem ou lampante (critérios de qualidade, quadro 2, ou critérios
de qualidade e pureza, quadro 4)
b) Ver azeite lampante (critérios de qualidade e pureza, quadro 4)
Quadro 2
a) Ver azeite lampante (critérios de qualidade e pureza, quadro 4)
b) Ver azeite virgem extra (critérios de qualidade, quadro 1)
Quadro 3
a) Presença de óleo refinado (azeite ou outros)
b) Presença de óleo de bagaço de azeitona
Quadro 4
a) Ver azeite virgem extra e azeite virgem (critérios de qualidade, quadros 1 e
2)
b) Presença de óleo refinado (azeite ou outros)
c) Presença de óleo de bagaço de azeitona
d) Presença de óleos esterificados
Quadro 7
a) Presença de óleo de bagaço de azeitona
b) Presença de óleos esterificados
Quadro 8
a) Presença de óleo refinado (azeite ou outros)
b) Ver azeite lampante (critérios de qualidade e pureza, quadro 4)
c) Presença de óleos esterificados
Quadro 11
a) Presença de óleos esterificados1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 26
▼B
ANEXO II
DETERMINAÇÃODA ACIDEZ
1. OBJECTIVO
Determinação dos ácidos gordos livres em azeites. O teor de ácidos
gordos livres é expresso em termos de acidez, calculada convencional-
mente, ou em índice de acidez.
1.1.Princípio
Dissolução da amostra numa mistura de solventes, seguida de titulação
dos ácidos gordos livres presentes com uma solução etanólica de hidró-
xido de potássio.
1.2.Reagentes
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica reconhecida e a água
a utilizar deve ser destilada ou de pureza equivalente.
1.2.1. Éter etílico e etanol a 95 % (V/V), mistura 1 + 1 em volume
Advertência: O éter etílico é muito inflamável e pode formar peróxidas
explosivos, pelo que deve ser utilizado com as devidas
precauções.
Neutraliza-se exactamente no momento de utilização com a solução de
hidróxido de potássio (ponto 1.2.2), em presença de 0,3 ml de solução
de fenolftaleína (ponto 1.2.3) por 100 ml de mistura.
Nota:Se não for possível utilizar éter etílico, poderá ser utilizada uma
mistura de solventes constituída por etanol e tolueno. Se
necessário, o etanol pode ser substituído por 2-propanol.
1.2.2. Solução etanólica titulada de hidróxido de potássio, c(KOH) — 0,1 mol/l
aproximadamente ou, se necessário, c(KOH) — 0,5 mol/l aproximada-
mente.
A concentração exacta da solução etanólica de hidróxido de potássio deve
ser conhecida e verificada antes da utilização. A solução deve ser incolor
ou amarelo-palha. Decantação para um frasco de vidro castanho fechado
com uma rolha de borracha.
Nota:Uma solução incolor estável de hidróxido de potássio pode ser
preparada do seguinte modo: mantém-se durante uma hora em
ebulição, sob refluxo, 1000 ml de etanol com 8 g de hidróxido de
potássio e 0,5 g de aparas de alumínio. Destila-se imediatamente.
Dissolve-se no destilado a quantidade necessária de hidróxido de
potássio. Deixa-se repousar durante vários dias e decanta-se o
líquido claro sobrenadante do precipitado de carbonato de potássio.
A solução pode também ser preparada sem destilação, do seguinte
modo:
Adicionam-se 4 ml de butilato de alumínio e deixa-se repousar a
mistura durante alguns dias. Decanta-se o líquido sobrenadante e
dissolve-se nele a quantidade necessária de hidróxido de potássio.
Esta solução está pronta para ser utilizada.
1.2.3. Fenolftaleína, solução de 10 g/l em etanol a 95—96 % (V/V) ou azul
alcalino (no caso de matérias gordas fortemente coradas), solução de
20 g/l em etanol a 95—96 % (V/V).
1.3.Aparelhos e utensílios
Material corrente de laboratório, designadamente:
1.3.1. Balança analítica.1.3.2. Erlenmeyer de 250 ml de capacidade.1.3.3. Galheta de 10 ml de capacidade, graduada em 0,05 ml.
1.4.Processo
1.4.1. Preparação da amostra para análise1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 27
▼B
A determinação é efectuada a partir da amostra filtrada. Se o teor total da
humidade e impurezas for inferior a 1 % a análise é efectuada na amostra
não filtrada.
1.4.2. Tomas de ensaio
Colhem-se as tomas de ensaio, de acordo com o índice de acidez presu-
mido, em conformidade com as indicações do quadro seguinte.
Índice de acidez presu-
midoPeso da toma de ensaio
(g)Precisão da pesagem da
toma de ensaio
< 1 20 0,05
1—4 10 0,02
4—15 2,5 0,01
15—75 0,5 0,001
> 75 0,1 0,0002
A pesagem deverá ser efectuada no erlenmeyer (ponto 1.3.2).
1.4.3. Determinação
Dissolve-se a toma em 50 a 100 ml de mistura éter/etanol (ponto 1.2.1)
previamente neutralizada. Titula-se, com agitação, com a solução de
hidróxido de potássio (ver nota 2) até à viragem do indicador (coloração
carmim da fenolftaleína persistente durante pelo menos 10 s).
Nota 1:A solução etanólica de hidróxido de potássio (ponto 1.2.2) pode
ser substituída por solução aquosa de hidróxido de potássio ou de
sódio desde que o volume de água introduzido não conduza a
uma separação de fases.
Nota 2:Se a quantidade necessária de solução de hidróxido de potássio a
0,1 mol/l ultrapassar 10 ml, utiliza-se uma solução a 0,5 mol/l.
Nota 3:Se a solução se tornar turva durante a titulação, junta-se uma
quantidade suficiente da mistura de solventes (ponto 1.2.1) para
obter uma solução límpida.
1.5.Expressão da acidez em percentagem de ácido oleico
A acidez, expressa em percentagem em massa, é igual a:
V/C2c/C2M
1000/C2100
m¼V/C2c/C2M
10/C2m
em que:
V = é o volume consumido, expresso em mililitros de solução titulada
de hidróxido de potássio.
c = é a concentração exacta, em moles por litro, da solução titulada de
hidróxido de potássio utilizada.
M = é a massa molar, em gramas por mole, do ácido adoptado para a
expressão dos resultados (= 282).
m = é a massa, em gramas, da toma do ensaio.
Toma-se como resultado a média aritmética de duas determinações.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 28
▼B
ANEXO III
DETERMINAÇÃODO ÍNDICEDE PERÓXIDOS
1. OBJECTIVO
A presente norma descreve um método para a determinação do índice de
peróxidos em óleos e gorduras.
2. DOMÍNIO DE APLICAÇÃO
A presente norma é aplicada a óleos e gorduras de origem animal e vegetal.
3. DEFINIÇÃO
O índice de peróxidos é a quantidade de substâncias presentes na amostra,
expressa em miliequivalentes de oxigénio activo por kg, capazes de oxidar
o iodeto de potássio nos condições operacionais descritas.
4. PRINCÍPIO
Tratamento da toma da amostra em estudo, dissolvida em ácido acético e
clorofórmio, com uma solução de iodeto de potássio. Titulação do iodo
libertado com uma solução padrão de tiossulfato de sódio.
5. APARELHOS E UTENSÍLIOS
Todo o equipamento usado deve estar isento de substâncias oxidantes ou
redutoras.
Nota:Não se lubrificam os contactos esmerilados.
5.1. Cápsula de vidro de 3 ml.
5.2. Frascos com rolhas e juntas esmeriladas, de cerca de 250 ml de capacidade,
previamente secos e cheios de um gás inerte puro e seco (azoto ou, de
preferência, dióxido de carbono).
5.3. Galheta de 25 ou 50 ml, graduada em 0,1 ml.
6. REAGENTES
6.1. Clorofórmio, de qualidade analítica reconhecida, tornado sento de oxigénio
fazendo borbulhar uma corrente de gás inerte puro e seco.
6.2. Ácido acético glacial, de qualidade analítica reconhecida, tornado isento de
oxigénio fazendo borbulhar uma corrente de gás inerte puro e seco.
6.3. Solução aquosa saturada de iodeto de potássio, preparada recentemente e
isenta de iodo e iodatos.
6.4. Solução aquosa, rigorosamente titulada, imediatamente antes da utilização,
a 0,01 ou 0,002 N, de tiossulfato de sódio.
6.5. Solução de amido, obtida por dispersão recente em água, na proporção de
10 g/l, de amido natural solúvel.
7. AMOSTRA
A amostra deverá ser colhida e conservada na ausência de luz, devendo
ainda ser mantida a baixa temperatura e contida em recipientes de vidro
completamente cheios, hermeticamente fechados com rolhas de vidro esme-
rilado ou cortiça.
8. TÉCNICA
O ensaio deverá ser efectuado em presença de luz solar difusa ou luz artifi-
cial. Pesa-se numa cápsula de vidro (ponto 5.1) ou, na falta desta, num
frasco (ponto 5.2), com uma aproximação de 0,001 g, uma massa de toma
de acordo com o quadro seguinte, em conformidade com o índice de peró-
xidos presumido:1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 29
▼B
Índice de peróxidos presumido
(meq)Peso da toma
(g)
0 a 12 5,0 a 2,0
12 a 20 2,0 a 1,2
20 a 30 1,2 a 0,8
30 a 50 0,8 a 0,5
50 a 90 0,5 a 0,3
Abre-se o frasco (ponto 5.2) e introduz-se a cápsula de vidro contendo a
toma em estudo. Adicionam-se 10 ml de clorofórmio (ponto 6.1) e
dissolve-se a toma rapidamente, sobagitação. Adicionam-se 15 ml de
ácido acético glacial (ponto 6.2) e, de seguida, 1 ml de solução de iodeto
de potássio (ponto 6.3). Tapa-se rapidamente, agita-se durante 1 minuto, e
deixa-se durante exactamente 5 minutos na ausência de luz a uma tempera-
tura de 15 a 20 ºC.
Adicionam-se cerca de 75 ml de água destilada. Titula-se o iodo libertado
com a solução de tiossulfato de sódio (ponto 6.4) (solução 0,002 N para
valores presumidos inferiores a 12 e solução 0,01 N para valores presu-
midos superiores a 12), agitando vigorosamente e usando solução de
amido (ponto 6.5) como indicador.
Fazem-se duas determinações com a mesma amostra.
Efectua-se simultaneamente um ensaio em branco. Se o resultado do ensaio
em branco exceder 0,05 ml de solução de tiossulfato de sódio 0,01 N
(ponto 6.4), substituem-se os reagentes impuros.
9. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS
O índice de peróxidos (I.P.), expresso em miliequivalentes de oxigénio
activo por kg, é dado pela fórmula:
I:P:¼V/C2N/C21000
m
onde:
V = é o número de mililitros de solução de tiossulfato de sódio (ponto
6.4) gasta no ensaio, com a correcção relativa ao ensaio em branco.
N = é a normalidade exacta da solução de tiossulfato de sódio utilizada.
m = é a massa, expressa em gramas, da toma de amostra em estudo.
Toma-se como resultado a média aritmética das duas determinações efec-
tuadas.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 30
▼M6
ANEXO IV
DETERMINAÇÃO DO TEOR DE CERAS POR INTERMÉDIO DE
CROMATOGRAFIA GÁS-LÍQUIDOCOM COLUNA CAPILAR
1. OBJECTIVO
O presente método descreve um processo para a determinação do teor
de ceras de algumas gorduras e óleos, nas condições de ensaio.
O método pode ser utilizado, em particular, para distinguir o azeite
obtido por pressão do azeite obtido por extracção (óleo de bagaço de
azeitona).
2. PRINCÍPIO
Após a adição de um padrão interno adequado, a gordura ou o óleo em
causa é fraccionado por cromatografia numa coluna de silicagel hidra-
tada. Recolhe-se a fracção eluída em primeiro lugar, nas condições de
ensaio (fracção cuja polaridade é inferior à polaridade dos trigliceridos),
procedendo-se à análise directa por cromatografia gás-líquido com
coluna capilar.
3. EQUIPAMENTO
3.1. Erlenmeyer de 25 ml.3.2. Coluna de vidro para cromatografia, com 15 mm de diâmetro interno e
30 a 40 cm de altura.
3.3. Aparelho de cromatografia em fase gasosa com coluna capilar, equi-
pado com um sistema para a introdução directa da amostra na coluna,
constituído por:
3.3.1. Forno com termóstato para as colunas, susceptível de manter a tempe-
ratura desejada com uma precisão de ± 1 ºC.
3.3.2. Injector a frio para introdução directa na coluna.3.3.3. Detector de ionização de chama e convertedor-amplificador.3.3.4. Registador-integrador adequado para funcionamento com o conver-
tedor-amplificador (ponto 3.3.3), com tempo de resposta não superior
a um segundo e velocidade do papel variável.
3.3.5. Coluna capilar de vidro ou sílica fundida, com ►
C210 a 15 m ◄de
comprimento e 0,25 a 0,32 mm de diâmetro interno, revestida interna-
mente com líquido SE-52, SE-54 ou equivalente, numa espessura
uniforme compreendida entre 0,10 e 0,30 µm.
3.4. Microsseringa de 10 µl adequada para injecção directa na coluna, com
agulha de aço cementado.
4. REAGENTES
4.1. Silicagel 70-230 mesh, art. 7754 Merck.
Colocar a silicagel numa mufla a 500 ºC, durante quatro horas. Após
arrefecimento, adicionar 2 % de água. Agitar bem, de modo a homoge-
neizar. Conservar ao abrigo da luz durante pelo menos 12 horas antes
da utilização.
4.2. n-hexano para cromatografia.4.3. Éter etílico para cromatografia.4.4. n-heptano para cromatografia.4.5. Solução padrão de araquidato de laurilo, a 0,1 % (m/v) em hexano
(padrão interno).
4.6. Gás de arrastamento: hidrogénio, com um grau de pureza adequado
para cromatografia gás-líquido.
4.7. Gases auxiliares:
— hidrogénio, com um grau de pureza adequado para cromatografia
gás-líquido,
— ar, com um grau de pureza adequado para cromatografia gás-
-líquido.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 31
▼M6
5. PROCEDIMENTO
5.1. Separação da fracção que contém as ceras.5.1.1. Preparação da coluna cromatográfica.
Suspender 15 g de silicagel hidratada a 2 % em n-hexano anidro e
introduzir na coluna.
Deixar assentar espontaneamente e completar a operação por recurso a
um vibrador eléctrico, de modo a tornar mais homogénea a camada
cromatográfica. Fazer passar 30 ml de n-hexano para remover eventuais
impurezas.
5.1.2. Cromatografia em coluna
Pesar rigorosamente 500 mg de amostra num Erlenmeyer de 25 ml e
adicionar uma quantidade adequada de padrão interno, em função do
teor de ceras previsto. A título de exemplo, juntar 0,1 mg de araquidato
de laurilo no caso de azeite e 0,25 a 0,50 mg no caso de óleo de bagaço
de azeitona.
Transferir a amostra para a coluna cromatográfica, preparada de acordo
com o ponto 5.1.1, com o auxílio de duas porções de 2 ml de n-hexano.
Deixar fluir o solvente até 1 mm acima da camada de silicagel. Iniciar a
eluição cromatográfica, recolhendo 140 ml da mistura n-hexano/éter
etílico na proporção de 99:1, de acordo com um fluxo de cerca de 15
gotas por cada 10 segundos (2,1 ml/minuto).
Evaporar a fracção resultante num evaporador rotativo, até à eliminação
de quase todo o solvente; remover os últimos 2 ou 3 ml do mesmo com
o auxílio de uma corrente de azoto de fluxo reduzido e adicionar 10 ml
de n-heptano.
5.2. Análise por cromatografia gás-líquido.
5.2.1. Operações preliminares; acondicionamento da coluna.
5.2.1.1. Instalar a coluna no cromatógrafo gás-líquido, ligando uma das extremi-
dades ao sistema de injecção directa na coluna e a outra extremidade ao
detector.
Efectuar o controlo geral do sistema cromatográfico (operacionalidade
dos circuitos de gases, eficiência do detector e do registador, etc.).
5.2.1.2. No caso de a coluna ser utilizada pela primeira vez, é aconselhável
proceder ao seu acondicionamento. Fazer passar um fluxo ligeiro de
gás através da coluna, ligando em seguida o sistema. Aquecer gradua-
lmente até uma temperatura superior em pelo menos 20 ºC à
temperatura de trabalho (nota). Manter esta temperatura durante pelo
menos duas horas, regulando seguidamente o aparelho para as
condições de trabalho (regular o fluxo de gás, acender a chama, ligar
o registador electrónico, regular a temperatura do forno para a coluna,
regular o detector, etc.). Registar o sinal obtido com uma sensibilidade
pelo menos dupla da sensibilidade prevista para a execução da análise.
A linha de base deve apresentar-se linear e isenta de picos de qualquer
tipo, não devendo apresentar desvios.
A existência de um desvio rectilíneo negativo indica que as ligações da
coluna não foram efectuadas de um modo correcto; a existência de um
desvio positivo indica que a coluna não foi acondicionada de um modo
adequado.
Nota:a temperatura de acondicionamento deve, em todos os casos, ser
inferior em pelo menos 20 ºC à temperatura máxima especificada
para o eluente utilizado.
5.2.2. Escolha das condições de trabalho.5.2.2.1. As condições de trabalho são, em geral, as seguintes:
— temperatura da coluna: no início, 80 ºC, aumentando à taxa de 30
ºC/minuto até 120 ºC e, em seguida, programada para aumentar à
taxa de 5 ºC/minuto até 340 ºC;
— temperatura do detector: 350 ºC,— velocidade linear do gás de arrastamento (hidrogénio): 20 a 35 cm/
/segundo,
— sensibilidade do aparelho: 4 a 16 vezes a atenuação mínima,— sensibilidade do registador: 1 a 2 mV, a partir do início da escala,— velocidade do papel: 30 cm/hora,
— quantidade injectada: 0,5 a 1 µl de solução.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 32
▼M6
Estas condições podem ser alteradas em função das características da
coluna e do cromatógrafo (de modo a obter cromatogramas que satis-
façam as condições seguintes:
— o tempo de retenção do padrão interno C32 deverá ser de 25 ± dois
minutos e o pico mais representativo correspondente às ceras deverá
situar-se entre 60 e 100 % do início da escala).
5.2.2.2. Os parâmetros de integração dos picos devem ser determinados de
modo a obter uma estimativa correcta das áreas dos picos com inte-
resse.
5.2.3. Execução da análise
5.2.3.1. Efectuar uma toma de 1 µl de solução com a microsseringa de 10 µl;
manejar o êmbolo de modo a que a agulha não contenha nenhuma
porção de amostra. Introduzir a agulha no sistema de injecção e injectar
rapidamente após um a dois segundos. Retirar cuidadosamente a agulha
após cerca de cinco segundos.
5.2.3.2. Efectuar o registo até à eluição completa das ceras.
A linha de base deve satisfazer sempre as condições requeridas (ponto
5.2.1.2.).
5.2.4. Identificação dos picos
A identificação dos picos é efectuada com base nos tempos de retenção
que são comparados com os tempos de retenção conhecidos de misturas
de ceras analisadas em condições idênticas.
Na figura 1 apresenta-se um cromatograma relativo às ceras de um
azeite virgem.
5.2.5. Análise quantitativa5.2.5.1. Por recurso ao integrador, determinar as áreas dos picos correspon-
dentes ao padrão interno e aos ésteres alifáticos de C40 a C46.
5.2.5.2. Determinar o teor de cada um dos ésteres, expresso em mg/kg de
gordura, através da fórmula:
éster (mg/kg) =A
x·ms·►M91 000◄
As·m
em que:
Ax= área do pico de cada éster;
As= área do pico de araquidato de laurilo;
ms= massa de araquidato de laurilo adicionada, expressa em mg;
m = massa de amostra tomada para análise, expressa em g.
6. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS
Apresentar os teores das várias ceras, bem como a soma dos teores
expressos em mg/kg de gordura.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 33
▼M6
APÊNDICE
Determinação da velocidade linear do gás
Injectar 1 a 3 µl de metano (ou propano) no cromatógrafo, regulado para as
condições normais de trabalho, e medir o tempo requerido pelo gás para
percorrer a coluna, desde o momento da injecção até ao registo do respectivo
pico (tM).
A velocidade linear, expressa em centímetros por segundo, é dada por L/tM,
sendo L o comprimento da coluna, expresso em centímetros, e tM o tempo de
retenção, expresso em segundos.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 34
▼M61991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 35
▼B
ANEXO V
DETERMINAÇÃODACOMPOSIÇÃOE DOTEORDEESTERÓISPOR
CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA COM COLUNA CAPILAR
1. OBJECTIVO
O método descreve o processo de determinação do teor de esteróis,
simples e totais, das matérias gordas.
2. FUNDAMENTO
A matéria gorda, adicionada de α-colestanol como padrão interno, é
saponificada com hidróxido de potássio em solução etanólica, em
seguida, o insaponificável é extraído com éter etílico.
A fracção esterólica é separada do extracto insaponificável por croma-
tografia em camada fina de gel de sílica básica; os esteróis recuperados
no gel de sílica são transformados em trimetilsililéteres e analisados por
cromatografia em fase gasosa em coluna capilar.
3. APARELHOS E UTENSÍLIOS
3.1. Balão de 250 ml, equipado com um refrigerador de refluxo com juntas
esmeriladas.
3.2. Ampola de decantação de 500 ml.3.3. Balões de 250 ml.
3.4. Equipamento completo para cromatografia em camada fina, com placas
de vidro de 20 × 20 cm.
3.5. Lâmpada de ultravioleta, de comprimento de onda de 366 ou 254 nm.
3.6. Micro-seringas de 100 e 500 µl.
3.7. Cadinho de fundo filtrante com porosidade G3 (poros de 15 a 40 µm)
de, aproximadamente, 2 cm de diâmetro e 5 cm de altura, com junta
adequada à filtração no vazio (junta esmerilada macho 12/21).
3.8. Frasco de kitasato de 50 ml com junta esmerilada fêmea 12/21,
adaptável ao cadinho de fundo filtrante (ponto 3.7).
3.9. Tubo de centrifugação de fundo cónico, de 10 ml, com rolha hermética.3.10. Cromatógrafo de gás adequado ao funcionamento com coluna capilar,
dotado de um sistema de separação, constituído por:
3.10.1. Forno com termóstato para a coluna, que permita manter a temperatura
desejada com uma precisão de ± 1 ºC.
3.10.2. Câmara de injecção e vaporização de temperatura regulável, com
elemento vaporizador de vidro persilanizado.
3.10.3. Detector de ionização de chama e conversor-amplificador.3.10.4. Registador-integrador adequado ao funcionamento com o conversor-
-amplificador.
3.10.5. Coluna capilar de vidro ou sílica fundida, de 20 a 30 m de compri-
mento, com 0,25 a 0,32 mm de diâmetro interno, coberta internamente
de líquido SE-52 ou SE-54 ou equivalente, com espessura uniforme
compreendida entre 0,10 e 0,30 µm.
3.10.6. Micro-seringa para cromatografia em fase gasosa de 10 µl com agulha
cementada.
4. REAGENTES
4.1. Hidróxido de potássio, em solução etanólica cerca de 2 N: dissolvem-
-se, com arrefecimento, 130 g de hidróxido de potássio (pureza mínima
85 %) em 200 ml de água destilada e completa-se até um litro com
etanol. A solução conserva-se em garrafas de vidro escuro bem
fechadas.
4.2. Éter etílico puro para análise.
4.3. Sulfato de sódio anidro puro para análise.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 36
▼B
4.4. Placas de vidro cobertas com gel de sílica, sem indicador de fluo-
rescência, de 0,25 mm de espessura (disponíveis no comércio, já
prontas para utilização).
4.5. Hidróxido de potássio, em solução etanólica 0,2 N: dissolvem-se 13 g
de hidróxido de potássio em 20 ml de água destilada e completa-se até
um litro com etanol.
4.6. Benzeno para cromatografia (ver ponto 5.2.2).4.7. Acetona para cromatografia.
4.8. Hexano para cromatografia.
4.9. Éter etílico para cromatografia.
4.10. Clorofórmio puro para análise.
4.11. Solução de referência para cromatografia em camada fina: colesterol ou
fitósterol em solução a ►
M62%◄(m/V) em clorofórmio.
4.12. 2 ′,7′-diclorofluoresceína, em solução etanólica a 0,2 % (m/V). Torna-
-se ligeiramente básica pela adição de algumas gotas de uma solução
alcoólica 2 N de hidróxido de potássio.
4.13. Piridina anidra para cromatografia.
4.14. Hexametildissilazano.
4.15. Trimetilclorossilano.4.16. Solução de verificação de trimetilsililéteres de esteróis: prepara-se no
momento da utilização a partir de esteróis puros ou de misturas de este-
róis obtidos de óleos que os contenham.
4.17. Alfa-colestanol, em solução a 0,2 % (m/V), em clorofórmio (padrão
interno).
4.18. Gás vector: hidrogénio ou hélio, puro para cromatografia em fase
gasosa.
4.19. Gases auxiliares:
— hidrogénio puro para cromatografia em fase gasosa,
— ar puro para cromatografia em fase gasosa.
5. TÉCNICA
5.1. Preparação do insaponificável
5.1.1. Introduzem-se no balão de 250 ml, por meio de micro-seringa de 500 µl,
um volume de solução de alfa-colestanol a 0,2 % (m/V) em clorofórmio
(ponto 4.17) que contenha uma quantidade de alfa-colestanol correspon-
dente a cerca de 10 % do teor de esteróis da alíquota da amostra a
colher para a determinação. Por exemplo, para 5 g de amostra é
necessário juntar 500 µl de solução de alfa-colestanol a 0,2 % (m/V),
se ser tratar de uma amostra de azeite e 1 500 µl, se se tratar de
►
M6 ◄óleo de bagaço de azeitona.
Evapora-se numa corrente de azoto até à secura e, em seguida, pesam-
-se exactamente 5 g de amostra seca e filtrada para o mesmo balão.
No caso dos óleos ►M6 ◄que contêm quantidades
consideráveis de colesterol, pode observar-se um pico com um tempo
de retenção idêntico ao do colestanol. Nesse caso, é necessário analisar
a fracção esterólica com e sem padrão interno ►M6ou utilizar, em
vez de colestanol, betulinol ◄.
5.1.2. Juntam-se 50 ml de ►C1solução etanólica de hidróxido de potássio 2
N◄, monta-se o refrigerador de refluxo e aquece-se em banho-maria
até uma ligeira ebulição, mantendo uma agitação enérgica até que se
produza a saponificação (a solução fica límpida). Continua-se a aquecer
durante 20 minutos, juntam-se 50 ml de água destilada que se faz
descer do alto do refrigerador, desliga-se o refrigerador e arrefece-se o
balão a cerca de 30º C.
5.1.3. Transvasa-se o conteúdo do balão quantitativamente para a ampola de
decantação de 500 ml, utilizando diversas vezes água destilada, num
total de aproximadamente 50 ml. Juntam-se cerca de 80 ml de éter
etílico, agita-se energicamente durante cerca de 30 segundos e deixa-se
que a separação se produza (nota 1).
Separa-se a fase aquosa inferior recolhendo-a numa outra ampola de
decantação.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 37
▼B
Procede-se ainda a duas extracções na fase aquosa, de acordo com as
mesmas modalidades, utilizando de cada vez 60-70 ml de éter etílico.
Nota 1:As eventuais emulsões podem ser eliminadas juntando, com
um esguicho, uma pequena quantidade de álcool etílico ou
metílico.
5.1.4. Reúnem-se os extractos etéreos numa ampola de decantação e lava-se
com água destilada (50 ml de cada vez), até obter uma reacção neutra
da água de lavagem.
Elimina-se a água de lavagem, seca-se ►C1filtrando ◄com sulfato
de sódio anidro num balão de 250 ml previamente pesado, lavando o
funil e o filtro com pequenas quantidades de éter etílico.
5.1.5. Destila-se o éter até obter poucos mililitros, e seca-se em seguida sob
ligeiro vazio ou numa corrente de azoto; completa-se a secagem na
estufa a 100º C durante cerca de um quarto de hora e pesa-se após arre-
fecimento num exsicador.
5.2. Separação da fracção esterólica5.2.1. Preparação das placas básicas: imergem-se completamente as placas
com gel de sílica (ponto 4.4) na ►
C1solução etanólica 0,2 N ◄de
hidróxido de potássio (ponto 4.5) durante 10 segundos; em seguida,
deixam-se fechadas durante duas horas sobum exaustor e, por último,
colocam-se na estufa a 100º C durante uma hora.
Retiram-se da estufa e conservam-se num exsicador com cloreto de
cálcio até ao momento da utilização (as placas assim tratadas devem
ser utilizadas no prazo de quinze dias).
Nota 2:A utilização de placas de gel de sílica básica para a separação
da fracção esterólica ►C1torna desnecessário ◄o trata-
mento do insaponificável com alumina. Deste modo, todos os
compostos de natureza ácida (ácidos gordos e outros) ficam
retidos na linha de partida. Assim, a mancha de esteróis fica
nitidamente separada da mancha de álcoois alifáticos e triterpé-
nicos.
5.2.2. Introduz-se na câmara de revelação das placas uma mistura de benzeno
e acetona a 95/5 (V/V) até uma altura de aproximadamente 1 cm. Pode
utilizar-se, em alternativa, uma mistura de hexano e éter etílico a 55/
/35 % (V/V). Fecha-se a câmara com uma tampa adequada e deixa-se
em repouso durante, pelo menos, meia hora, de modo a que se esta-
beleça o equilíbrio líquido/vapor. É possível fixar nas superfícies
internas da câmara folhas de papel de filtro que mergulham no eluente:
esta precaução permite reduzir em cerca de um terço o tempo de reve-
lação e obter uma eluição dos componentes mais uniforme e regular.
Nota 3:A fim de obter condições de eluição perfeitamente reprodutí-
veis, a mistura deve ser mudada em cada ensaio.
5.2.3. Prepara-se uma solução a cerca de 5 % (m/V) de insaponificável (ponto
5.1.5) em clorofórmio e, com a micro-seringa de 100 µl, apõem-se na
placa cromatográfica (ponto 5.2.1), a aproximadamente 2 cm do bordo,
0,3 ml da solução supracitada numa linha contínua, o mais fina e
uniforme possível. No alinhamento da linha de partida deita-se, numa
das extremidades da placa, 2-3 µl da solução de referência de esteróis
(ponto 4.11), a fim de identificar a mancha de esteróis quando da
última revelação.
5.2.4. Coloca-se a placa na câmara da revelação, preparada como descrito no
ponto 5.2.2. A temperatura ambiente deve ser mantida entre 15 e 20º C.
Fecha-se imediatamente a câmara com a tampa e deixa-se eluir até que
a frente de solvente chegue a cerca de 1 cm do bordo superior da placa.
Em seguida, retira-se a placa da câmara de revelação e faz-se evaporar
o solvente numa corrente de ar quente, ou deixando a placa sobum
exaustor durante alguns momentos.
5.2.5. Nebuliza-se a placa, ligeira e uniformente, com a solução de 2,7-diclo-
rofluoresceína. Quando a placa é observada ao ultra-violeta, a mancha
de esteróis é identificada por alinhamento com a mancha obtida com a
solução de referência; delimita-se a mancha com um lápis preto ao
longo da margem de fluorescência.
5.2.6. Raspa-se com uma espátula metálica o gel de sílica na zona delimitada.
O material retirado, finamente triturado, é introduzido no cadinho de
fundo filtrante (ponto 3.7); juntam-se 10 ml de clorofórmio quente,
mistura-se cuidadosamente com a espátula metálica e filtra-se no vazio;
em seguida recolhe-se o filtrado no frasco de kitasato (ponto 3.8) ligado
ao cadinho de fundo filtrante.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 38
▼B
Lava-se o resíduo no cadinho três vezes com éter etílico (cerca de 10 ml
de cada vez) e recolhe-se o filtrado no frasco de kitasato adaptado ao
cadinho de fundo filtrante. Evapora-se o filtrado até se obter um
volume de cerca de 4 a 5 ml; transvasa-se a solução residual para um
tubo de centrifugação de 10 ml (ponto 3.9), previamente pesado, e seca-
-se aquecendo ligeiramente numa leve corrente de azoto. Deitam-se
algumas gotas de acetona, leva-se novamente à secura, coloca-se
durante cerca de 10 minutos na estufa a 105º C, deixa-se arrefecer no
exsicador e pesa-se.
O resíduo contido no tubo é constituído pela fracção esterólica.
5.3. Preparação dos trimetilsililéteres5.3.1. No tubo de centrifugação que contém a fracção esterólica, junta-se o
reagente de sililação, constituído por uma mistura de piridina, hexame-
tildissilazano e trimetilclorossilano 9 + 3 + 1 (V/V/V) (nota 4), numa
proporção de 50 µl por miligrama de esteróis, evitando qualquer
absorção de humidade (nota 5).
Nota 4:Existem no comércio soluções prontas para utilização; além
disso, encontram-se também outros reagentes silanizantes
como, por exemplo, o N,O (trimetilsilil) acetamida + 1 % de
trimetilclorossilano, a diluir num volume igual de piridinaanidra.
5.3.2. Tapa-se o tubo de centrifugação agita-se cuidadosamente (sem virar)
até à solubilização completa dos esteróis. Deixa-se repousar durante
pelo menos 15 minutos, à temperatura ambiente e, em seguida, centri-
fuga-se durante alguns minutos: a solução límpida está pronta para
análise por cromatografia em fase gasosa.
Nota 5:A ligeira opalescência que se pode eventualmente formar é
normal e não provoca qualquer perturbação. A formação de
um floculado branco ou o aparecimento de uma coloração
rosa indicam a presença de humidade ou a deterioração do
reagente. Neste caso, a análise deve ser repetida.
5.4. Análise por cromatografia em fase gasosa5.4.1. Operações preliminares, condicionamento da coluna
5.4.1.1. Instala-se a coluna num cromatógrafo de gás, ligando a extremidade da
entrada à câmara de injecção e a extremidade de saída ao detector.
Efectuam-se os controlos gerais do conjunto de cromatografia em fase
gasosa (hermeticidade do circuito dos gases, eficácia do detector,
eficácia do sistema de separação e do sistema de registo, etc.).
5.4.1.2. Se a coluna for utilizada pela primeira vez, é aconselhável proceder à
sua maturação. Faz-se passar um ligeiro fluxo gasoso e inicia-se um
aquecimento gradual até atingir uma temperatura pelo menos 20º C
superior à temperatura de trabalho (nota 6). Mantém-se essa tempera-
tura durante pelo menos duas horas; em seguida, leva-se o conjunto às
condições de funcionamento (regulação do fluxo gasoso e da separação,
inflamação da chama, ligação ao registador electrónico, regulação de
temperatura do forno para a coluna, do detector e do injector, etc.) e
regista-se o sinal com uma sensibilidade pelo menos duas vezes supe-
rior à prevista para a realização da análise. O traçado da linha base
obtida deve ser linear, isento de picos de qualquer natureza e não deve
apresentar derivações.
Uma derivação rectilínea negativa indica uma hermeticidade imperfeita
das ligações da coluna; uma derivação positiva indica um condiciona-
mento insuficiente da coluna.
Nota 6:A temperatura de condicionamento deve ser sempre inferior
pelo menos 20º C à temperatura máxima prevista para o
líquido estacionário utilizado.
5.4.2. Escolha das condições de funcionamento
5.4.2.1. As condições de funcionamento normais são as seguintes:
— temperatura da coluna: 260º C ± 5º C,
— temperatura do evaporador: 280º C,— temperatura do detector: 290º C,
— velocidade linear do gás vector: hélio, 20 a 35 cm/s; hidrogénio, 30
a 50 cm/s,
— relação de separação: de 1/50 a 1/100,
— sensibilidade instrumental: 4 a 16 vezes a atenuação mínima,
— sensibilidade de registro: 1 a 2 mV em escala de fundo,1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 39
▼B
— velocidade do papel: 30 a 60 cm/hora,
— quantidade de substância injectada: 0,5 a 1 µl de solução TMSE.
Estas condições podem ser alteradas em função das características da
coluna e do cromatógrafo de gás, de modo a obter cromatogramas que
satisfaçam as seguintes condições:
— o tempo de retenção do beta-sitosterol deve ser de 20 ± 5 minutos,
— o pico do campesterol deve ser para o azeite (teor médio 3 %)
15 ± 2 % da escala de fundo e para o óleo de soja (teor médio
20 %) 80 ± 10 % da escala de fundo,
— deve-se verificar a separação de todos os esteróis presentes; é
necessário que os outros picos separados apresentem também uma
resolução completa, o que significa que o traçado do pico deve
voltar à linha base antes do arranque do pico seguinte. No entanto,
é tolerada uma resolução incompleta, desde que seja quantificável
segundo a perpendicular ao pico em TRR 1,02.
5.4.3. Execução da análise
5.4.3.1. Com a micro-seringa de 10 µl, colhe-se 1 µl de hexano, aspiram-se
0,5 µl de ar e sucessivamente 0,5 a 1 µl da solução da amostra; puxa-
-se ainda o êmbolo da seringa de modo a que a agulha fique vazia.
Introduz-se a agulha através da membrana da câmara de injecção e após
1-2 segundos, injecta-se rapidamente, retira-se a agulha devagar, cerca
de 5 segundos depois.
5.4.3.2. Procede-se ao registo até à eluição completa dos TMSE dos esteróis
presentes.
A linha base deve continuar a corresponder às condições exigidas
(ponto 5.4.1.2).
5.4.4. Identificação dos picos
A identificação individual dos picos é efectuada com base nos tempos
de retenção e em comparação com a mistura dos TMSE dos esteróis
cromatografados nas mesmas condições.
Os esteróis são eluídos pela seguinte ordem: colesterol, brassicasterol,
24-metilenocolesterol, campesterol, campestanol, estigmasterol, delta-7-
-campesterol, delta-5,23-estimastadienol, clerosterol, beta-sitosterol,
sitostanol, delta-5-avenasterol, delta-5,24-estigmastadienol, delta-7-
-estigmastenol, delta-7-avenasterol.
No quadro I são indicados os tempos de retenção relativos ao sitosterol,
para as colunas SE-52 e SE-54.
As figuras 1 e 2 apresentam cromatogramas típicos de alguns óleos.
5.4.5. Avaliação quantitativa
5.4.5.1. Procede-se com o integrador ao cálculo da área dos picos do alfa-coles-
tanol e dos outros esteróis. Não se consideram os eventuais picos de
compostos não incluídos na lista do quadro I. O coeficiente de resposta
para o α-colestanol deve ser igual a 1.
5.4.5.2. Calcula-se o teor de cada esterol, em mg/100 g de matéria gorda, do
seguinte modo:
Esterol x =Ax·ms·100
As·m
onde:
Ax= área do pico do esterol x ►M6 ◄.
As= área do pico do alfa-colestanol ►M6 ◄.
ms= massa de alfa-colestanol adicionada, em miligramas.
m = massa da amostra colhida para a determinação, em gramas.
6. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS
6.1. Determinam-se os teores de cada um dos esteróis em mg/100 g de
matéria gorda e a sua soma como «esteróis totais».
6.2. Calcula-se a percentagem de cada esterol a partir da relação entre a área
do respectivo pico e a soma das áreas dos picos de todos os esteróis.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 40
▼B
% do esterol x =Ax
A· 100
onde:
Ax= área do pico x.
A = soma das áreas de todos os esteróis.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 41
▼B
APÊNDICE
Determinação da velocidade linear do gás
No cromatógrafo de gás, regulado para condições de funcionamento normais,
injectam-se 1 a 3 µl de metano (ou propano) e cronometra-se o tempo gasto
pelo gás para percorrer a coluna entre o momento da injecção e o da saída do
pico (tM).
A velocidade linear em cm/s é dada por l/t, onde l é o comprimento da coluna
em centímetros e t o tempo cronometrado em segundos.
Quadro I
Tempos de retenção relativos dos esteróis
Pico IdentificaçãoTempos de retenção
relativos
Coluna
SE 54Coluna
SE 52
1 colesterol delta,5-colesteno-3-beta-ol 0,67 0,63
2 colestanol 5-alfa-colestano-3-beta-ol 0,68 0,64
3 brassicasterol [24S]-24-metil-delta,5,22-colestadieno-3-
-beta-ol0,73 0,71
4 24-metilenocolesterol 24-metileno-delta,5,24-colestadieno-3-
-beta-ol0,82 0,80
5 campesterol [24R]-24-metil-delta,5-colesteno-3-beta-
-ol0,83 0,81
6 campestanol [24R]-24-metil-colestano-3-beta-ol 0,85 0,82
7 estigmasterol [24S]-24-etil-delta,5,22-colestadieno-3-
-beta-ol0,88 0,87
8 delta,7-campesterol [24R]-24-metil-delta,7-colesteno-3-beta-
-ol0,93 0,92
9 delta,5,23-estigmasta-
dienol[24R,S]-24-etil-delta,5,23-colestadieno-3-
-beta-ol0,95 0,95
10 clerosterol [24S]-24-etil-delta,5,25-colestadieno-3-
-beta-ol0,96 0,96
11 beta-sitosterol [24R]-24-etil-delta,5-colesteno-3-beta-ol 1,00 1,00
12 sitostanol 24-etil-colestano-3-beta-ol 1,02 1,02
13 delta,5-avenasterol [24Z]-24-etilideno-delta,5-colesteno-3-
-beta-ol1,03 1,03
14 delta,5,24-estigmasta-
dienol[24R,S]-24-etil-delta,5,24-colestadieno-3-
-beta-ol1,08 1,08
15 delta,7-estigmasterol [24R,S]-24-etil-delta,7-colesteno-3-beta-
-ol1,12 1,12
16 delta,7-avenasterol [24Z]-24-etilideno-delta,7-colesteno-3-
-beta-ol1,16 1,161991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 42
▼B
Figura 1
Cromatograma em fase gasosa da fracção esterólica de um azeite virgem
1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 43
▼B
Figura 2
Cromatograma em fase gasosa da fracção esterólica de um azeite refinado
1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 44
▼B
ANEXO VI
DETERMINAÇÃODO TEOR DE ERITRODIOLE UVAOL
PREÂMBULO
O eritrodiol (convencionalmente entendido como o conjunto dos dióis
eritrodiol e uvaol) é um constituinte da fracção insaponificável, carac-
terístico de alguns tipos de matérias gordas. A sua concentração é
apreciavelmente mais elevada em óleos de bagaço de azeitona do que
noutros óleos que o contêm (azeites virgens, óleo de grainha de uva),
pelo que a sua determinação pode servir para detectar a presença de
óleo de bagaço de azeitona.
1. OBJECTIVO
O método descreve o processo para determinar o eritrodiol de gorduras e
óleos.
2. PRINCÍPIO
A matéria gorda é saponificada com solução etanólica de hidróxido de
potássio, sendo posteriormente o insaponificável extraído com éter etílico
e purificado por passagem através de coluna de alumina.
Procede-se à separação do insaponificável por cromatografia em camada
fina em placa de gel de sílica, isolando-se as manchas correspondentes à
fracção esterólica e à fracção do eritrodiol.
Os esteróis e o eritrodiol recuperado da placa são convertidos nos respec-
tivos éteres trimetilsilílicos, cuja mistura é analisada por cromatografia
em fase gasosa. O resultado é expresso em percentagem de eritrodiol em
relação ao conjunto eritrodiol mais esteróis.
3. APARELHOS E UTENSÍLIOS
3.1. O mesmo equipamento descrito no anexo V (determinação do teor de
esteróis).
4. REAGENTES
4.1. Os mesmos reagentes descritos no anexo V (determinação do teor de
esteróis).
4.2. Solução de referência de eritrodiol a 0,5 % (m/V) em clorofórmio.
5. PROCESSO
5.1. Preparação do insaponificável
Procede-se de acordo com a descrição do ponto 5.1.2 do anexo V.
5.2.Separação do eritrodiol e dos esteróis
5.2.1. Veja-se o ponto 5.2.1 do anexo V.5.2.2. Veja-se o ponto 5.2.2 do anexo V.5.2.3. Prepara-se uma solução de insaponificável a 5 % (m/V) em clorofórmio.
Com o auxílio da ►
C1micro-seringa de 100µl ◄, apõem-se sobre uma
placa cromatográfica, a cerca de 1,5 cm do bordo ►C1inferior, 0,3
ml◄da dita solução, numa linha de partida o mais possível fina e
uniforme. Apõem-se também, numa extremidade da placa, como
referência, alguns mililitros de solução de colesterol e eritrodiol.
5.2.4. Coloca-se a placa na câmara de desenvolvimento, preparada de acordo
com o ponto 5.2.1. A temperatura ambiente deve ser cerca de 20º C.
Tapa-se rapidamente e elui-se até que a frente do solvente se encontre a
cerca de 1 cm do bordo superior da placa. Retira-se a placa da câmara e
evapora-se o solvente em corrente de ar quente.
5.2.5. Nebuliza-se a placa uniformemente com solução alcoólica de 2 ′,7′-
-diclorofluoresceína. O exame da placa ao ultra-violeta permite
identificar as manchas correspondentes aos esteróis e ao eritrodiol por
comparação com as manchas relativas às substâncias de referência. Deli-
mitam-se as manchas em estudo com o auxílio de um lápis, ligeiramente
fora das margens de fluorescência.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 45
▼B
5.2.6. Raspa-se o gel de sílica interior às áreas delimitadas com auxílio de uma
espátula metálica. Coloca-se o material assim recolhido da placa num
frasco de 50 ml, ao qual se adicionam 15 ml de clorofórmio quente.
Agita-se bem e filtra-se num cadinho de fundo filtrante transferindo o
gel de sílica para esse cadinho. Lava-se por três vezes com sucessivas
porções de 10 ml de clorofórmio quente, recolhe-se o filtrado num frasco
de 100 ml, previamente tarado, e leva-se à secura mediante aquecimento
suave em corrente de azoto, pesando-se de seguida.
5.3. Preparação dos éteres trimetilsilílicos
Procede-se de acordo com a descrição do ponto 5.3 do anexo V.
5.4. Análise por cromatografia em fase gasosa
Procede-se de acordo com a descrição do ponto 5.4 do anexo V. As
condições operacionais da análise cromatográfica devem ser tais que,
além de satisfazerem aos requisitos necessários para análise dos esteróis,
conduzam à separação dos éteres trimetilsilílicos do eritrodiol e do uvaol.
Procede-se em seguida à identificação dos picos (o eritrodiol e o uvaol
possuem tempos de retenção em relação ao β-sitosterol de cerca de 1,45
e 1,55, respectivamente) e ao cálculo das áreas, segundo um processo
idêntico ao adoptado para os esteróis.
6. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS
Percentagem de eritrodiol =A1+A2
A1+A2+ΣAesteróis× 100
onde:
A1= é a área do pico correspondente ao eritrodiol
►M6 ◄.
A2= é a área do pico correspondente ao uvaol
►M6 ◄.
ΣAAesteróis= é a soma das áreas correspondentes aos esteróis
presentes ►M6 ◄.
O resultado é arredondado às décimas.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 46
▼B
ANEXO VII
DETERMINAÇÃO DOS ÁCIDOS GORDOS NA POSIÇÃO 2 NOS
TRIGLICÉRIDOS
1. OBJECTIVO
A presente norma descreve um método para determinar a composição da
fracção de ácidos gordos de óleos e gorduras que se encontrem esterifi-
cados na posição 2 (ou posição interna) do glicerol.
2. DOMÍNIOS DE APLICAÇÃO
A presente norma é aplicável a óleos e gorduras com temperatura de fusão
inferior a 45º C, devido às particularidades da acção da lipase pancreática.
A norma não é aplicável sem reserva a óleos e gorduras possuindo teores
apreciáveis de ácidos gordos com doze ou menos átomos de carbono
(óleos de amendoim e noz de palma, bem como manteiga) ou ácidos
gordos altamente insaturados (com mais de quatro ligações duplas)
contendo vinte ou mais átomos de carbono (óleo de peixe ou de outros
animais marinhos) ou ainda ácidos gordos contendo outros grupos oxige-
nados além do carboxilo.
3. PRINCÍPIO
Possível neutralização de óleos ácidos e gorduras ácidas na presença de
um solvente.
Purificação mediante passagem através de coluna de alumina, seguida de
hidrólise parcial dos triglicéridos por acção da lipase pancreática durante
um tempo determinado. Separação dos monoglicéridos assim formados
por cromatografia em camada fina e metanólise dos mesmos. A análise
dos éteres metílicos é feita por cromatografia gás-líquido.
4. APARELHOS E UTENSÍLIOS
4.1. Balão de fundo redondo com capacidade de 100 ml.
4.2. Balão de fundo redondo com capacidade de 25 ml e com junta esmerilada.
4.3. Refrigerante de vidro com 1 m de comprimento, para adaptar ao balão
4.2.
4.4. Erlenmeyer de 250 ml de capacidade.4.5. Copo de 50 ml de capacidade.4.6. Ampola de decantação com 500 ml de capacidade.4.7. Coluna cromatográfica de vidro, com 13 mm de diâmetro interno e
400 mm de comprimento, equipada com um disco poroso de vidro e
uma tampa.
4.8. Tubo de centrifugação de 10 ml de capacidade, com rolha de vidro esme-
rilado.
4.9. Galheta de 5 ml de capacidade, graduada em 0,05 ml.4.10. Seringa hipodérmica com 1 ml de capacidade, equipada com uma agulha
fina.
4.11. Micro-seringa própria para gotas de 3-4 µl.4.12. Distribuidor para cromatografia em camada fina.4.13. Placas de vidro para cromatografia em camada fina, de 20 × 20 cm.4.14. Câmara de desenvolvimento de vidro para cromatografia ascendente em
camada fina, com tampa esmerilada, própria para placas de 20 × 20 cm.
4.15. Nebulizador para cromatografia em camada fina.4.16. Estufa regulada a 103 ± 2º C.4.17. Termóstato regulável entre 30 a 45º C, com uma precisão de 0,5º C.4.18. Evaporador rotativo.4.19. Agitador vibratório eléctrico, permitindo a agitação vigorosa do tubo de
centrifugação.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 47
▼B
4.20. Lâmpada de ultra-violeta para observação das placas cromatográficas.
Para o controlo da actividade da lipase:
4.21. Potenciómetro para medição de pH.
4.22. Agitador magnético.
4.23. Galheta com 5 ml de capacidade.4.24. Cronómetro.
Para a eventual preparação da lipase:
4.25. Agitador mecânico, próprio para a dispersão e mistura de esteróis hetero-
géneos.
5. REAGENTES
5.1. n-Hexano ou, na sua falta, éter de petróleo (intervalo de ebulição 30-50º
C), para cromatografia.
5.2. 2-Propanol ou etanol a 95 % (V/V), de qualidade analítica reconhecida.5.3. 2-Propanol ou etanol, em solução aquosa a 1 + 1.
5.4. Éter dietílico, isento de peróxidos.
5.5. Acetona.5.6. Ácido fórmico com pureza mínima de 98 % (m/m).5.7. Solvente de desenvolvimento: mistura de n-hexano (ponto 5.1), éter
dietílico (ponto 5.4) e ácido fórmico (ponto 5.6) em proporções 70 + 30 + 1
(V/V/V).
5.8. Alumina activada para cromatografia, neutra, de grau Brockmann I.
5.9. Gel de sílica de qualidade apropriada para cromatografia em camada fina.5.10. Lipase pancreática de qualidade apropriada (notas 1 e 2).5.11. Solução aquosa a 120 g/l de hidróxido de sódio.
5.12. Solução aquosa 6 N de ácido clorídrico.
5.13. Solução aquosa a 220 g/l de cloreto de cálcio (CaCl
2).
5.14. Solução aquosa a 1 g/l de colato de sódio (qualidade enzimática).
5.15. Solução tampão: solução aquosa 1M de tris-hidroxi-metil-aminometano
levada a pH 8 mediante a adição de ácido clorídrico (ponto 5.12) (veri-
fica-se com o auxílio de potenciómetro medidor de pH).
5.16. Solução a 10 g/l de fenolftaleína em etanol a 95 % (V/V).5.17. Solução a 2 g/l de 2 ′,7′-diclorofluoresceína em etanol a 95 % (V/V),
ligeiramente alcalinizada mediante a adição de uma gota de solução 1 N
de hidróxido de sódio por 100 ml.
Para a verificação da actividade da lipase:
5.18. Óleo neutralizado.5.19. Solução aquosa 0,1 N de hidróxido de sódio.5.20. Solução aquosa a 200 g/l de colato de sódio (qualidade enzimática).
5.21. Solução aquosa a 100 g/l de goma arábica.
6. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Se a acidez da amostra for inferior a 3 %, determinada de acordo com o
anexo II, purifica-se directamente através de alumina (descrição no ponto
6.2). Se a acidez da amostra for superior a 3 %, determinada de acordo
com o anexo II, neutraliza-se com álcali, depois de dissolvida num
solvente do tipo descrito no ponto 6.1, passando de seguida através de
alumina, de acordo com o ponto 6.2.
6.1. Neutralização por álcali depois da dissolução
Introduz-se numa ampola de decantação (ponto 4.6) cerca de 10 g de óleo
virgem, adicionando 100 ml de hexano (ponto 5.1), 50 ml de 2-propanol
(ponto 5.2), umas gotas de solução de fenolftaleína (ponto 5.16) e uma1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 48
▼B
quantidade de solução de hidróxido de sódio (ponto 5.11) correspondente
à acidez livre de óleo com um excesso de 0,3 %.
Agita-se vigorosamente durante 1 minuto, adicionam-se 30 ml de água
destilada, agita-se de novo e deixa-se repousar.
Após a separação, remove-se a camada aquosa inferior de sabão.
Removem-se igualmente quaisquer eventuais camadas intermédias (muci-
lagem, matéria insolúvel). Lava-se a solução de óleo neutralizado em
hexano com sucessivas porções de 25 a 30 ml de solução de 2-propanol
(ponto 5.3), até ao desaparecimento da coloração carmim da fenolftaleína.
Remove-se a maior parte do solvente por destilação em vazio no evapo-
rador rotativo (ponto 4.18) e seca-se o óleo a 30-40º C, no vazio, com
auxílio de uma corrente de azoto puro, até à remoção completa do
solvente.
6.2. Purificação através de alumina
Prepara-se uma suspensão de 15 mg de alumina activada (ponto 5.8) em
50 ml de hexano (ponto 5.1) a qual se verte, agitando, na coluna croma-
tográfica (ponto 4.7).
Deixa-se a alumina assentar lentamente, de modo que o solvente se
encontre a 1-2 mm da superfície superior. Deita-se cuidadosamente na
coluna uma solução de 5 g de óleo em 25 ml de hexano (ponto 5.1) e
recolhe-se a totalidade do efluente da coluna num balão de fundo redondo
(ponto 4.1).
7. PREPARAÇÃO DAS PLACAS CROMATOGRÁFICAS
Limpam-se as placas de vidro (ponto 4.13) com etanol, éter de petróleo e
acetona, de modo e eliminar quaisquer vestígios de matéria gorda.
Deitam-se num erlenmeyer (ponto 4.4) 30 g de gel de sílica (ponto 5.9),
adicionando 60 ml de água destilada. Tapa-se e agita-se vigorosamente
durante 1 minuto.
Transfere-se imediatamente a mistura para um distribuidor (ponto 4.12) e
revestem-se as placas limpas com uma camada de 0,25 mm de espessura.
Secam-se as placas ao ar durante 15 minutos e seguidamente na estufa
(ponto 4.16) a 103 ± 2º C. Arrefecem-se as placas num exsicador a tempe-
ratura ambiente, antes de usar.
(Existem no comércio placas já preparadas).
8. TÉCNICA
8.1. Hidrólise com lipase pancreática
Pesa-se no tubo de centrifugação (ponto 4.8) uma toma de cerca de 0,1 g
de amostra preparada; no caso de gorduras sólidas, dissolve-se em 0,2 ml
de hexano (ponto 5.1), aquecendo ligeiramente se necessário.
Adicionam-se 20 mg de lipase (ponto 5.10) e 2 ml de solução tampão
(ponto 5.15). Agita-se bem, mas cuidadosamente, e juntam-se em seguida
0,5 ml de solução de colato de cálcio (ponto 5.13).
Tapa-se o tubo com a rolha esmerilada, agita-se cuidadosamente (de modo
a evitar o contacto da solução com a rolha) e coloca-se de imediato o tubo
no termóstato (ponto 4.17), mantido a uma temperatura de 40 ± 0,5º C.
Agita-se manualmente durante 1 minuto exacto.
Remove-se o tubo do termóstato e agita-se vigorosamente com auxílio do
agitador eléctrico (ponto 4.19), durante 2 minutos exactos.
Arrefece-se de imediato sobágua corrente; adiciona-se 1 ml de ácido
clorídrico (ponto 5.12) e 1 ml de éter dietílico (ponto 5.4). Tapa-se de
novo e mistura-se vigorosamente com o auxílio do agitador eléctrico.
Deixa-se repousar e remove-se a camada orgânica com a seringa (ponto
4.10), após centrifugação, se necessário.
8.2. Separação dos monoglicéridos por cromatografia em camada fina
Apõe-se o extracto na placa cromatográfica com a micro-seringa (ponto
4.11), a cerca de 1,5 cm do bordo inferior, segundo uma faixa fina e
uniforme, tão estreita quanto possível. Coloca-se a placa na câmara de
desenvolvimento (ponto 4.14) bem saturada e elui-se com o solvente apro-
priado (ponto 5.7) a uma temperatura igual ou próxima de 20º C, até cerca
de 1 cm do bordo superior da placa.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 49
▼B
Seca-se a placa ao ar, à temperatura da câmara, e nebuliza-se com a
solução de 2 ′,7′-diclorofluoresceína (ponto 5.17), identifica-se a mancha
correspondente aos monoglicéridos (Rf próximo de 0,035) por observação
no ultravioleta (ponto 4.20).
8.3. Análise dos monoglicéridos por cromatografia gás-líquido
Remove-se a mancha obtida no ponto 8.2 com o auxílio de uma espátula
(evitando a remoção de componentes situados na linha base) e transfere-se
para o balão de metilação (ponto 4.2). Trata-se directamente a sílica remo-
vida de acordo com os métodos indicados no anexo XB alternativo, para
conversão dos monoglicéridos nos respectivos ésteres metílicos, e efectua-
-se a análise dos ésteres por cromatografia gás-líquido, conforme o anexo
XA, ponto 5.4.
9. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS
Calcula-se o teor de ácidos gordos na posição 2 arredondado às décimas
(nota 3).
10. NOTAS
Nota 1:Verificação da actividade da lipase
Com um agitador apropriado prepara-se uma emulsão de óleo
mediante agitação de uma mistura de 165 ml de solução de
goma arábica (ponto 5.21), 15 g de gelo triturado e 20 ml de
óleo neutralizado (ponto 5.18).
Colocam-se num copo (ponto 4.5) 10 ml da emulsão e
adicionam-se sucessivamente 0,3 ml de solução de colato de
sódio (ponto 5.20) e 20 ml de água destilada.
Coloca-se o copo num termóstato mantido à temperatura de
37 ± 0,5º C (nota 4); inserem-se os eléctrodos no medidor de
pH (ponto 4.21) e o agitador magnético (ponto 4.22). Com o
auxílio de uma galheta (ponta 4.23), adiciona-se gota a gota a
solução de hidróxido de sódio (ponto 5.19) até se atingir um
valor de pH 8,5.
Junta-se uma quantidade suficiente de suspensão aquosa de lipase
(veja-se abaixo). No instante em que o potenciómetro indicar um
valor de 8,3, acciona-se o cronómetro (ponto 4.24) e adiciona-se
a solução de hidróxido de sódio (ponto 5.19) de modo a manter o
pH num valor de 8,3. Regista-se o volume de solução de álcali
consumida em cada minuto.
Anotam-se as observações sob a forma de um gráfico, com as
leituras correspondentes ao tempo em abcissas e o volume de
solução necessário para manter o pH constante em ordenadas.
Deste modo, deve obter-se no gráfico uma recta.
A suspensão aquosa de lipase, acima mencionada, deve possuir
uma concentração de 1/1000 (m/m). A quantidade de supensão
utilizada em cada ensaio deve ser tal que aproximadamente 1 ml
de solução de álcali seja consumida em 4 a 5 minutos.
Em geral, é necessário uma quantidade de 1 a 5 mg de pó. A
unidade de lipase é definida como a quantidade de enzimas capaz
de libertar 10 miliequivalentes de ácido por minuto. Deste modo,
a actividade A do pó usado, expressa em unidades de lipase por
miligrama, é dada pela fórmula:
A¼V/C210
m
onde:
V — é o volume de solução de hidróxido de sódio (ponto 5.19)
consumido por minuto (calculada a partir do gráfico).
m — é a massa, em miligramas, da amostra em pó em estudo.
Nota 2:Preparação da lipase
É possível encontrar no comércio lipase com grau satisfatório de
actividade. Contudo, pode também preparar-se no laboratório, do
seguinte modo:
Arrefecem-se 5 kg de pâncreas de porco a 0º C; remove-se a
matéria gorda sólida periférica bem como o tecido conjuntivo e1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 50
▼B
tritura-se num almofariz de modo a obter um fluido pastoso.
Agita-se esta pasta com auxílio do agitador (ponto 4.25) durante
4 a 6 horas, em 2,5 l de acetona anidra e centrifuga-se. Extrai-se
o resíduo três vezes com o mesmo volume de acetona e, seguida-
mente, extrai-se duas vezes com uma mistura de acetona e éter
etílico na proporção de 1 + 1 (V/V). Por fim, extrai-se duas vezes
com éter dietílico. Seca-se o resíduo no vazio durante 48 horas,
de modo a obter um pó estável, que deve ser armazenado no
frigorífico.
Nota 3:Em qualquer caso, é aconselhável determinar o teor de ácidos
gordos totais da mesma amostra, uma vez que a comparação
com o teor de ácidos na posição 2 poderá auxiliar a interpretação
dos gráficos obtidos.
Nota 4:A temperatura de hidrólise mantém-se a 37º C dado ser usado
óleo; deverá contudo manter-se a 40º C no caso do produto ser
gordura.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 51
▼M20
▼B
ANEXO IX
ANÁLISEPOR ESPECTROFOTOMETRIA NO ULTRAVIOLETA
INTRODUÇÃO
A análise por espectrofotometria no ultravioleta pode fornecer indicações
sobre a qualidade de uma matéria gorda, o seu estado de conservação e as
modificações devidas ao processamento tecnológico.
As absorvâncias nos comprimentos de onda previstos no método são
devidas à presença de sistemas diénicos e triénicos conjugados. Os valores
destas absorvâncias são expressos em termos de extinção específica
(extinção de uma solução de matéria gorda a 1 g/100 ml no solvente pres-
crito, para um percurso óptico de 1 cm), designado por K (coeficiente de
extinção).
1. OBJECTIVO
O método descreve o processo de execução do exame espectrofotométrico
de matérias gordas no ultravioleta.
2. PRINCÍPIO DO MÉTODO
A matéria gorda em estudo é dissolvida num solvente apropriado, determi-
nando-se em seguida a extinção da solução no comprimento de onda
prescrito em relação ao solvente puro. As extinções específicas são calcu-
ladas a partir das leituras espectrofotométricas.
3. APARELHOS E UTENSÍLIOS
3.1. Espectrofotómetro para medição das extinções no ultravioleta, entre 220 e
360 nm, com possibilidade de leitura por cada unidade nanométrica.
3.2. Tinas de quartzo, com tampa, com um percurso óptico de 1 cm, não
devendo apresentar diferenças superiores a 0,01 unidades de extinção nas
leituras efectuadas com água ou outro solvente apropriado.
3.3. Balão aferido de 25 ml.
3.4. Coluna para cromatografia com uma parte superior com 270 mm de
comprimento e 35 mm de diâmetro e uma parte inferior com 270 mm de
comprimento e 10 mm de diâmetro.
4. REAGENTES
4.1. Iso-octano (2,2,4-trimetilpentano), para espectrofotometria, puro, devendo
apresentar, em relação à água destilada, uma transmitância não inferior a
60 % a 220 nm e não inferior a 95 % a 250 nm; ou como alternativas:
ciclo-hexano, para espectrofotometria, puro, devendo apresentar, em
relação à água destilada, uma transmitância não inferior a 40 % a 220 nm
e não inferior a 95 % a 250 nm ►M6 ◄.
4.2. Alumina básica para cromatografia em coluna, preparada e controlada de
acordo com a descrição do apêndice I.
4.3. n-Hexano para cromatografia.
5. TÉCNICA
5.1. A amostra a analisar deve estar perfeitamente homogénea e isenta de impu-
rezas em suspensão. Os óleos líquidos à temperatura ambiente são filtrados
em papel a uma temperatura próxima de 30º C; as gorduras sólidas são
homogeneizadas e filtradas a uma temperatura não superior a 10º C acima
da sua temperatura de fusão.
5.2. Pesa-se num balão aferido de 25 ml cerca de 0,25 g da amostra preparada
de acordo com o ponto anterior, completando o volume com o solvente
prescrito e homogeneiza-se. A solução obtida deve ser perfeitamente
límpida. No caso de a solução apresentar opalescência ou turvação, filtra-
-se rapidamente por papel.
5.3. Enche-se uma tina com a solução obtida e medem-se as extinções, usando
como referência o solvente utilizado, nos comprimentos de onda compreen-
didos entre 232 e 276 nm. Os valores medidos registados devem estar
compreendidos no intervalo de 0,1 a 0,8; no caso contrário, torna-se1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 52
▼M6
▼B
▼B
necessário repetir as medições recorrendo a soluções mais concentradas ou
mais diluídas.
5.4. No caso de ser requerida a determinação das extinções específicas, após a
passagem por alumina, procede-se do seguinte modo: introduzem-se na
coluna cromatográfica 30 g de alumina básica suspensa em hexano; quando
a alumina assentar, procede-se à eliminação do excesso de hexano até pelo
menos cerca de 1 cm acima do nível superior da alumina.
Dissolvem-se 10 g de matéria gorda, homogeneizada e filtrada de acordo
com a descrição do ponto 5.1, em 100 ml de hexano e verte-se na coluna
a solução assim obtida. Recolhe-se o eluído e evapora-se o solvente no
vazio a uma temperatura inferior a 25º C.
Procede-se de imediato conforme a descrição do ponto 5.2.
6. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS
6.1. Exprimem-se as extinções específicas (coeficientes de extinção) nos dife-
rentes comprimentos de onda, de acordo com a fórmula:
Kλ¼Eλ
c/C1s
em que:
Kλ= extinção específica no comprimento de onda λ.
Eλ= extinção medida no comprimento de onda λ.
c = concentração da solução em g/100 ml.s = espessura da tina em centímetros.
Os resultados arredondam-se às centésimas.
6.2. A análise espectrofotométrica do azeite de acordo com o método oficial
dos regulamentos oficiais da Comunidade Económica Europeia prevê a
determinação da extinção específica em solução no iso-octano, nos compri-
mentos de onda 232 e 276 nm, sendo a determinação de ∆K efectuada
segundo:
∆K¼K
m/C0Km/C04þKmþ4
2
onde:
Kmrepresenta a extinção específica no comprimento de onda m, correspon-
dente a um valor máximo de absorvância na gama de 270 nm.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 53
▼B
APÊNDICE I
Preparação da alumina e controlo da sua actividade
A.1.1. Preparação da alumina
Introduz-se num recipiente susceptível de se fechar hermeticamente a
alumina seca na estufa a 380-400º C, durante 3 horas. Junta-se água
destilada na proporção de 5 ml por 100 g de alumina, fecha-se rapida-
mente o recipiente, agita-se várias vezes e deixa-se repousar durante
pelo menos 12 horas antes da utilização.
A.1.2. Controlo da actividade da alumina
Prepara-se uma coluna cromatográfica com 30 g de alumina. Procede-se
de acordo com a descrição do ponto 5.4. Faz-se passar através da coluna
uma mistura constituída por:
— 95 % de azeite virgem, com uma extinção específica a 268 nm infe-
rior a 0,18,
— 5 % de óleo de amendoim tratado com terra descorada durante o
processo de refinação, com uma extinção específica a 268 nm supe-
rior ou igual a 4.
Se a mistura, após passagem pela coluna, apresentar uma extinção
específica a 268 nm superior a 0,11, a alumina é aceitável. No caso
contrário, faz-se aumentar a hidratação (escalão de actividade).1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 54
▼B
APÊNDICE II
Aferição do espectrofotómetro
A.2. O aparelho deve ser aferido periodicamente (pelo menos de 6 em 6
meses), tanto para a correspondência dos comprimentos de onda como
para a precisão da resposta.
A.2.1. A verificação da resposta do comprimento de onda pode ser feita medi-
ante lâmpada de vapor de mercúrio ou filtros apropriados.
A.2.2. Para verificação da célula fotoeléctrica e do fotomultiplicador, procede-
-se do seguinte modo: pesam-se 0,2 g de cromato de potássio puro para
espectroscopia e dissolvem-se numa solução de hidróxido de potássio
0,05 N até completar o volume de 100 ml num balão aferido. Retiram-
-se em seguida 25 ml exactos da solução obtida, transferem-se para um
balão aferido de 500 ml e completa-se o volume com a mesma solução
de hidróxido de potássio. Mede-se a extinção a 275 nm da nova solução,
tomando a solução de hidróxido de potássio como referência. A extinção
medida com uma tina de 1 cm de percurso óptico deverá ser de
0,200 ± 0,005.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 55
▼B
ANEXO XA
ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA DE ÉSTERES
METÍLICOS DE ÁCIDOSGORDOS
1. OBJECTIVO
A presente norma fornece uma orientação geral para a aplicação de
cromatografia em fase gasosa, mediante o uso de colunas de enchi-
mento ou capilares, para determinação qualitativa e quantitativa de
uma mistura de ésteres metílicos de ácidos gordos obtidos de acordo
com o método descrito no anexo XB.
2. REAGENTES
2.1.Gás vector
Gás inerte (azoto, hélio, árgon, hidrogénio, etc.) seco e com um teor de
oxigénio inferior a 10 mg/kg.
Nota 1:O hidrogénio, usado como gás vector apenas em colunas capi-
lares, pode duplicar a rapidez da análise, sendo, porém,
perigoso.
Encontram-se disponíveis conselhos para a sua manipulação
com segurança.
2.2.Gases auxiliares
2.2.1. Hidrogénio (pureza > 99,9 %), isento de impurezas orgânicas.2.2.2. Ar ou oxigénio, isento de impurezas orgânicas.
2.3.Padrão de referência
Mistura de ésteres metílicos de ácido gordos puros ou os ésteres
metílicos de uma gordura de composição conhecida, de preferência
semelhante à gordura a analisar.
Devem ser tomadas precauções com vista a evitar a oxidação de ácidos
gordos polinsaturados.
3. APARELHOS E UTENSÍLIOS
As instruções fornecidas referem-se a equipamento vulgarmente utili-
zado para cromatografia em fase gasosa, mediante a utilização quer de
colunas de enchimento quer capilares e um detector de ionização de
chama. Quaisquer aparelhos susceptíveis de fornecer a eficiência e a
resolução especificadas no ponto 5.1.2 são apropriados.
3.1.Cromatógrafo de fase gasosa
O cromatógrafo de fase gasosa deve compreender os seguintes
elementos:
3.1.1. Sistema de injecção
Utiliza-se um sistema de injecção:
a) No caso de colunas de enchimento, com o menor espaço-morto
possível (o sistema de injecção deverá, neste caso, ser susceptível
de aquecimento a uma temperatura de 20º C a 50º C superior à
temperatura de coluna);
b) No caso das colunas capilares, com injector apropriado para uso
com este tipo de colunas, podendo apresentar divisão de fluxo
(«split») ou não ou injectores para injecção directa na coluna («on
column»).
Nota 2:Na ausência de ácidos gordos com menos de 16 átomos de
carbono, poderá utilizar-se um injector equipado com uma
agulha móvel.
3.1.2. Forno
O forno deve ser susceptível de aquecer a coluna à temperatura mínima
de 260º C e de manter a temperatura desejada com uma precisão de 1º
C, no caso de colunas de enchimento, e de 0,1º C, no caso de colunas1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 56
▼B
capilares. Este último requisito é de particular importância quando se
utiliza um tubo de sílica fundida (quartzo).
Recomenda-se em todos os casos o uso de aquecimento com progra-
mação de temperatura, particularmente para ácidos gordos com menos
de 16 átomos de carbono.
3.1.3. Coluna de enchimento
3.1.3.1. Coluna de material inerte às substâncias a analisar (vidro ou aço
inoxidável), possuindo as dimensões seguintes:
a) Comprimento: 1 m a 3 m, poderá usar-se uma coluna relativamente
curta quando se encontram presentes ácidos gordos de cadeia longa
(superiores a C20). Na análise de ácidos com 4 a 6 átomos de
carbono, recomenda-se o uso de uma coluna de 2 m de compri-
mento;
b) Diâmetro interno: 2 mm a 4 mm.
Nota 3:Quaisquer compostos polinsaturados com mais de três duplas
ligações que se encontrem eventualmente presentes poderão
sofrer decomposição numa coluna de aço inoxidável.
Nota 4:Poderá usar-se um sistema de duas colunas de enchimento.
3.1.3.2. Enchimento, constituído pelos elementos seguintes:
a) Suporte: terra de infusórios lavada com ácido e silanizada ou outro
suporte inerte com uma gama limitada de granulometria (25 µm
entre os limites 125-200 µm), sendo as dimensões médias de cada
grão relacionadas com o diâmetro interno e o comprimento da
coluna;
b) Fase estacionária: líquido polar do tipo poliéster (tal como polissuc-
cinato de dietilenoglicol, polissuccinato de butanodiol, poliadipato
de etilenoglicol, etc.) ou qualquer outro líquido (designadamente
uma cianossilicona) susceptível de permitir a separação cromatográ-
fica desejada (veja-se o ponto 5). A fase estacionária deve ser de 5 %
(m/m) a 20 % (m/m) do enchimento. Para certas separações, pode
ser utilizada uma fase estacionária apolar.
3.1.3.3. Condicionamento da coluna
Aquece-se o forno gradualmente até 185º C, mantendo a coluna desli-
gada do detector, e faz-se passar através desta uma corrente de gás
inerte, à razão de 20-60 ml/minuto, durante um intervalo de tempo
mínimo de 16 horas, àquela temperatura e, seguidamente, de 2 horas a
195º C.
3.1.4. Coluna capilar
3.1.4.1. Tubo de material inerte às substâncias a analisar (geralmente vidro ou
sílica fundida). O diâmetro interno deve estar compreendido entre
0,2 mm e 0,8 mm. A superfície interna deve ser submetida a um trata-
mento apropriado (por exemplo, preparação da superfície ou
inactivação) antes de receber o revestimento correspondente à fase esta-
cionária. Na maioria dos casos é suficiente um comprimento de 25 m.
3.1.4.2. Fase estacionária, geralmente do tipo poliglicol (polietilenoglicol
20000), poliéster (polissuccinato de butanodiol) ou polissiloxano polar
(cianossiliconas).
Nota 5:Existe o risco de os polissiloxanos polares originarem dificul-
dades na identificação e separação do ácido linolénico e de
ácidos em C20.
Os revestimentos devem ser finos, isto é, de 0,1 µm a 0,2 µm.
3.1.4.3. Instalação e condicionamento da coluna
Observam-se as precauções normais na instalação de colunas capilares,
isto é, na colocação da coluna no forno (suporte), escolhe-se a
montagem das juntas de forma a garantir a hermeticidade, adaptando
as extremidades da coluna no injector e no detector (redução de
espaços-mortos). Coloca-se a coluna sobum fluxo de gás vector [por
exemplo 0,3 bar (30 KPa) para uma coluna de 25 m de comprimento
e 0,3 mm de diâmetro interno].
Condiciona-se a coluna mediante programação de temperatura do forno
a uma frequência de 3º C/minuto, desde a temperatura ambiente até
uma temperatura 10º C inferior ao limite de decomposição da fase esta-
cionária. Mantém-se o forno a esta temperatura durante 1 hora, até à1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 57
▼B
estabilização da linha base. Voltar a 180º C, para trabalhar sob
condições isotérmicas.
Nota 6:Encontram-se disponíveis no comércio colunas pré-condicio-
nadas apropriadas.
3.1.5. Detector
O detector deve, de preferência, ter a possibilidade de ser aquecido a
uma temperatura superior à coluna.
3.2.Seringa
A seringa deverá ter a capacidade máxima de 10 µl, e ser graduada em
divisões de 0,1 µl.
3.3.Registador
No caso de o cálculo da composição da mistura ser efectuado a partir
da curva registada, torna-se necessário o uso de um registador de alta
precisão, compatível com a restante aparelhagem. As características do
registador devem ser:
a) Velocidade de resposta inferior a 1,5 segundos, preferencialmente
inferior a 1 segundo (a velocidade de resposta é o tempo requerido
para a caneta passar de 0 a 90 %, após a introdução momentânea de
um sinal de 100 %);
b) Largura do papel: 20 cm, no mínimo;
c) Velocidade do papel ajustável a valores compreendidos entre 0,4 cm/
/minuto e 2,5 cm/minuto.
3.4.Integrador ou calculador (opcional)
O uso de um integrador ou calculador electrónico permite a realização
de cálculos rápidos e rigorosos. O aparelho a utilizar deve fornecer uma
resposta linear com a sensibilidade adequada e a correcção do desvio da
linha base deve ser satisfatória.
4. TÉCNICA
As técnicas descritas nos pontos 4.1 a 4.3 referem-se ao uso do detector
de ionização de chama.
Em alternativa, poderá usar-se um cromatógrafo gás-líquido equipado
com um catarómetro (cujo funcionamento se baseia em alterações da
condutibilidade térmica) como detector, tornando-se neste caso
necessário modificar as condições operatórias de acordo com o ponto 6.
4.1.Condições operatórias
4.1.1. Selecção das condições óptimas4.1.1.1. Coluna de enchimento
Relativamente à selecção das condições operatórias, devem tomar-se
em conta as variáveis seguintes:
a) Comprimento e diâmetro da coluna;
b) Natureza e quantidade da fase estacionária;
c) Temperatura da coluna;
d) Fluxo do gás vector;
e) Resolução requerida;
f) Quantidade da toma de ensaio, escolhida de modo a que o conjunto
formado pelo detector e o electrómetro forneça uma resposta linear;
g) Duração da análise.
De um modo geral, os valores fornecidos nos quadros 1 e 2 conduzem
aos resultados desejados, ou seja, um mínimo de 2000 pratos teóricos
por metro de coluna para o estearato de metilo e a sua eluição no inter-
valo de 15 minutos, aproximadamente.
Se o aparelho o permitir, a temperatura do injector deve ser próxima de
200º C e a temperatura do detector igual ou superior à temperatura da
coluna.
Como regra, a proporção entre a fluxo de hidrogénio que alimenta o
detector de ionização de chama e o fluxo de gás vector deve variar de1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 58
▼B
1:2 a 1:1, de acordo com o diâmetro da coluna. O fluxo de oxigénio
deverá ser 5 a 10 vezes superior ao fluxo de hidrogénio.
Quadro 1
Diâmetro interno da coluna (mm) Fluxo de gás vector (ml/min)
2 1 5—2 5
3 2 0—4 0
4 4 0—6 0
Quadro 2
Concentração da fase estacionária %
(m/m)Temperatura (ºC)
5 175
10 180
15 185
20 185
4.1.1.2. Coluna capilar
As propriedades de eficiência e permeabilidade das colunas capilares
conduzem a uma grande dependência entre a separação dos consti-
tuintes e a duração da análise, por um lado, e o fluxo de gás vector na
coluna, por outro.
Torna-se, deste modo, necessário optimizar as condições operacionais
mediante a regulação daquele fluxo (ou, mais simplesmente, das perdas
na coluna) consoante se pretenda melhorar as separações ou executar
uma análise rápida.
4.1.2. Determinação do número de pratos teóricos (eficiência) e da resolução
— (ver figura 1)
Efectua-se a análise de uma amostra de estearato de metilo e oleato de
metilo (resultantes, por exemplo, de manteiga de cacau) em proporções
aproximadamente equivalentes.
Escolhe-se a temperatura da coluna e o fluxo de gás vector de modo a
que o máximo do pico relativo ao estearato de metilo seja registadocerca de 15 minutos depois do pico relativo ao solvente. Usa-se uma
quantidade de mistura de ésteres metílicos, de modo que o pico relativo
ao estearato de metilo ocorra a três quartos da escala completa, aproxi-
madamente.
Calcula-se o número de pratos teóricos, n (eficiência), através da
fórmula:
n¼16drI
WI/C20/C21
2
e a resolução, R, através da fórmula:
R¼2∆
WIþWII
em que:
drI — representa a distância de retenção, medida em milímetros, desde
o início do cromatograma até ao máximo do pico correspondente ao
estearato de metilo.
WI e WII — são as larguras, em milímetros, dos picos relativos ao
estearato de metilo e oleato de metilo, respectivamente, medidas entre
os pontos de intersecção das tangentes aos pontos de inflexão da curva
com a linha base.
∆— é a distância, em milímetros, entre os máximos dos picos corres-
pondentes ao estearato e oleato de metilo.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 59
▼M2
E o índice de resolução, lr, através da fórmula:
a
b
em que:
a representa a altura do pico mais baixo, medida em relação à linha de
base;
brepresenta a altura do mínimo do vale entre dois picos adjacentes,
medida em relação à linha de base.
Figura 1
Cromatogramas para a determinação do número de pratos teóricos (eficácia) e
da resolução
As condições operativas a escolher deverão permitir a obtenção de, pelo
menos, 2 000 pratos teóricos por metro de coluna para o estearato de
metilo e uma resolução mínima de 1:25.
4.2.Toma de ensaio
Com o auxílio da seringa (ponto 4.2), recolhe-se 0,1 µl a 2 µl da
solução de ésteres metílicos, preparada de acordo com o anexo XB, e
injecta-se na coluna.
No caso de os ésteres não se encontrarem em solução, dissolvem-se em
heptano, de qualidade cromatográfica, na proporção de 10 mg/ml e
injectam-se 0,1 a 1 µl da solução assim obtida.
No caso de se pretender detectar constituintes presentes apenas em
vestígios a quantidade da toma deve ser aumentada (até 10 vezes).
4.3.Análise
Em geral, as condições de trabalho devem ser idênticas às descritas no
ponto 5.1.1. Contudo, é possível trabalhar a uma temperatura inferior
para a coluna, no caso da determinação de ácidos gordos com menos1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 60
▼B
▼B
de 12 átomos de carbono, ou a uma temperatura superior, para ácidos
gordos com mais de 20 átomos de carbono. Fortuitamente é possível
recorrer à programação de temperatura em ambos os casos. Se, por
exemplo, a amostra contiver ésteres metílicos de ácidos gordos com
menos de 12 átomos de carbono, injecta-se a amostra a 100º C (ou a
50-60º C, no caso de se encontrar presente ácido butírico), aumentando
a temperatura de imediato, a uma razão de 4º C/min a 8º C/min, até se
atingir o valor óptimo. Em alguns casos, podem combinar-se ambos os
procedimentos.
Após o aquecimento programado, continua-se a eluição a temperatura
constante até que todos os componentes tenham sido eluídos. Se o
aparelho não permitir um aquecimento programado, trabalha-se a duas
temperaturas fixas, entre 100 e 195º C.
Se possível, recomenda-se que a análise seja feita com duas fases esta-
cionárias de polaridades diferentes, com vista a verificar a ausência de
picos irresolúveis ou no caso da presença de C18:3 e C20:0 ou C18:3 e
C18:2 conjugados.
4.4.Obtenção do cromatograma de referência e dos gráficos de
referência
Procede-se à análise da mistura de padrão de referência (ponto 2.3)
usando as mesmas condições operativas seguidas para a amostra e
medem-se os tempos de retenção ou distâncias de retenção para os
ácidos gordos constituintes. Traçam-se, em papel semilogarítmico, para
qualquer grau de insaturação, os gráficos relativos ao logaritmo do
tempo ou distância de retenção em função do número de átomos de
carbono. Sob condições isotérmicas, os gráficos relativos a ácidos
gordos de cadeia linear com o mesmo grau de insaturação devem apre-
sentar-se soba forma de linhas rectas aproximadamente paralelas.
Torna-se necessário evitar condições favoráveis à ocorrência de picos
irresolúveis, isto é, em que a resolução é insuficiente para a separação
dos dois componentes.
5. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS
5.1.Análise qualitativa
Identificam-se os picos correspondentes aos ésteres metílicos da
amostra a partir dos gráficos preparados de acordo com o ponto 4.4,
recorrendo a interpolação, se necessário.
5.2.Analise quantitativa
5.2.1. Determinação da composição
Salvo em alguns casos excepcionais, deve usar-se o método de norma-
lização interna, ou seja, considerar que a totalidade dos componentes da
amostra se encontra representada no cromatograma, de modo à soma
das áreas relativas a todos os picos corresponder a 100 % dos consti-
tuintes (eluição total).
Se o equipamento incluir um integrador, usam-se os valores nele
obtidos. No caso contrário, determina-se a área referente a cada pico
mediante a multiplicação da altura pela largura a meia-altura, tomando
em conta, se necessário, as diversas atenuações utilizadas durante o
registo.
5.2.2. Método de cálculo
5.2.2.1. Caso geral
Calcula-se o teor de um dado constituinte, I, expresso em termos de
percentagem, em massa, de ésteres metílicos, mediante a determinação
de cem vezes o quociente da área do pico correspondente pela soma das
áreas de todos os picos, de acordo com a seguinta fórmula:
AI
ΣAI/C2100
onde:
AI = representa a área do pico relativo ao componente I.
ΣAI = representa a soma das áreas relativas à totalidade dos picos.
O resultado arredonda-se às décimas.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 61
▼B
Nota 7:Neste caso geral, considera-se que o resultado do cálculo
baseado nas áreas relativas representa uma percentagem em
massa. Para os casos em que tal considerando não é
permissível, veja-se o ponto 5.2.2.2.
5.2.2.2. Uso de factores de correcção
Em certos casos, particularmente na presença de ácidos gordos com
menos de 8 átomos de carbono ou de ácidos gordos com grupos secun-
dários, ou quando se usam detectores de condutibilidade térmica, ou
nos casos em que se requer particularmente o mais elevado grau de
precisão, torna-se necessário o uso de factores de correcção para
converter as percentagens relativas às áreas dos picos em percentagem
em massa de componentes.
Determinam-se os factores de correcção mediante um cromatograma
resultante da análise de uma mistura de referência de ésteres metílicos,
de composição conhecida, sobcondições operacionais idênticas às utili-
zadas para a amostra.
Para a mistura de referência, a percentagem em massa do componente I
é dada pela fórmula:
mI
Σm/C2100
onde:
mI = representa a massa do componente I na mistura de referência.
Σm = representa a soma das massas dos vários componentes da
mistura de referência.
A partir do cromatograma da mistura de referência (ponto 4.4), calcula-
-se a percentagem (área/área) relativa ao componente I, pela expressão:
AI
ΣA/C2100
onde:
AI = representa a área do pico relativo ao componente I.
ΣA = representa a soma das áreas correspondentes a todos os picos.
O factor de correcção é calculado segundo a expressão:
KI¼MI/C2ΣA
AI/C2Σm
Os factores de correcção são apresentados habitualmente em termos de
KC 1 6 de modo a que os factores relativos serão:
K0I¼KI
KC 1 6
O teor de cada componente I da amostra, expresso em termos de
percentagem em massa de ésteres metílicos, é dado por:
K0I/C2AI
ΣK0I/C2AI ðÞ/C2100
Os resultados arredondam-se às décimas.
5.2.2.3. Uso de padrão interno
Em certos casos (nomeadamente quando nem todos os ácidos gordos
são eluídos, o que acontece por exemplo quando se encontram presentes
ácidos com 4 e 6 átomos de carbono, juntamente com ácidos com 16 e18 átomos de carbono, ou quando é necessário determinar o teor abso-
luto de um ácido gordo numa amostra) torna-se indispensável o uso de
um padrão interno. Para tal, recorre-se frequentemente ao uso dos
ácidos gordos com 5,15 ou 17 átomos de carbono. O factor de
correcção relativa ao padrão interno deve ser determinado (se existir).1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 62
▼B
A percentagem em massa de componente I, expressa em termos de
ésteres metílicos, é, assim, dada pela fórmula:
ms/C2K0I/C2AI
m/C2K0s/C2As/C2100
onde:
ms = representa a massa, em miligramas, do padrão interno.
m = representa a massa, em miligramas, da toma de ensaio.K′s = representa o factor de correcção para o padrão interno (relativa-
mente a KC 1 6).
K′I = representa o factor de correcção para o componente I (relativa-
mente a KC 1 6).
As = representa a área do pico correspondente ao padrão interno.
AI = representa a área do pico correspondente ao componente I.
Os resultados arredondam-se às décimas.
6. CASO PARTICULAR DA DETERMINAÇÃO DOS ISÓMEROS
TRANS
É possível determinar o teor dos isómeros trans dos ácidos gordos com
um número de átomos de carbono compreendido entre 10 e 24 por
separação dos ésteres metílicos, utilizando colunas cromatográficas
capilares com uma polaridade específica.
6.1. Coluna capilar de sílica com diâmetro interno de 0,25 mm a 0,32 mm e
comprimento de 50 m, revestida interiormente de cianopropilsilicone; a
espessura do filme varia entre 0,1 e 0,3 µm (tipo SP 2340, tipo SP
2380, C.P. sil 88, Silor 10 e tipos similares).
6.2. Os ésteres metílicos são preparados pelo processo B descrito no anexo
X B. As substâncias gordas com acidez livre superior a 3 % deverão ser
previamente neutralizadas, conforme descrito no ponto 6.1 do anexo
VII.
6.3. As condições de trabalho da cromatografia em fase gasosa são, generi-
camente, as seguintes:
— temperatura da coluna programada de 150 ºC a 230 ºC (por
exemplo, 165 ºC durante 15 minutos e, a seguir, um aumento de
5 ºC por minuto até 200 ºC),
— temperatura do injector: 250 ºC, se for utilizado um sistema de
injector divisor ou a temperatura inicial da coluna, se a amostra for
introduzida directamente no topo da coluna (sistema «on column»),
— temperatura do detector: 250 ºC,
— fluxo do gás vector (hélio e hidrogénio): 1,2 ml/minuto.
A quantidade injectada deve ser tal que, para a sensibilidade utilizada, a
altura do pico correspondente ao éster metílico do ácido araquídico seja
igual ou superior a 20 % da linha de base.
6.4. A identificação dos vários ésteres metílicos é efectuada com base nos
tempos de retenção, que são comparados com os tempos de retenção
de misturas de referência (como indicado no ponto 2.3).
Os ésteres dos ácidos gordos trans são eluídos antes dos isómeros cis
correspondentes. Na figura 2 apresenta-se um exemplo de cromato-
grama.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 63
▼M2
▼M2
Figura 2
Cromatograma-tipo em fase grazosa relativo à determinação dos ísomeros trans
dos ácidos gordos com coluna capilar.
6.5. A eficácia da coluna, calculada de acordo com o ponto 4.1.2, deve
permitir a separação de determinados acoplamentos críticos, por
exemplo, o acoplamento da banda correspondente aos ácidos transiso-
leicos e do pico do ácido oleico, trans C18: 1/cis C18: 1, com índice
de resolução superior a 2.
6.6. A percentagem dos diversos ácidos gordos trans é calculada com base
na relação entre a área do pico correspondente e a soma das áreas de
todos os picos do cromatograma.
Serão consideradas as percentagens correspondentes aos seguintes
ácidos:
— trans-octadecenóicos (T 18: 1), indicados no anexo I do presente
regulamento como soma dos isómeros transoleicos,
— cis, trans e trans, cis-octadecadienóicos [(CT/TC) 18: 2], indicados
no anexo I do presente regulamento como soma dos isómeros trans-linoleicos,
— trans, cis, trans; cis, cis, trans; cis, trans, cis; trans, cis, cis-octadeca-
trienóicos [(TCT + CCT + CTC + TCC) 18: 3], indicados no anexo
I do presente regulamento como soma dos isómeros translinolé-
nicos.
Nota 8:tendo em conta as características particulares deste método,
apresentar os resultados com duas casas decimais.
►
M27.◄CASO ESPECIAL
Uso de um catarómetro (baseado em alterações na condutibilidade
térmica) como detector.
Para a determinação qualitativa e quantitativa da composição de uma
mistura de ésteres metílicos de ácidos gordos poderá também ser usado
um cromatógrafo de fase gasosa equipado com um detector cujo funcio-
namento se baseia em alterações na condutibilidade térmica
(catarómetro). Neste caso, as condições operacionais descritas em 3 e
4 deverão ser modificadas de acordo com o quadro 3.
Para a análise quantitativa, usam-se os factores de correcção definidos
no ponto 5.2.2.2.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 64
▼B
▼B
Quadro 3
Variável Condições
Coluna Comprimento: 2 a 4 metros
Diâmetro interno: 4 mm
Suporte Granulometria: compreendida
entre 160 e 200 µm
Concentração da fase estacionária 15 % (m/m) a 25 % (m/m)
Gás vector Hélio ou, na sua falta, hidrogénio
com um teor de oxigénio tão
baixo quanto possível
Gases auxiliares Nenhum
Temperatura do injector 40º C a 60º C superior à tempe-
ratura da coluna
Temperatura da coluna 180º C a 200º C
Fluxo do gás vector Geralmente compreendido entre
60 ml/min e 80 ml/min
Quantidade de amostra injectada Geralmente compreendida entre
0,5 e 2 µl
►M28.◄RELATÓRIO
O relatório deverá especificar os métodos utilizados para a preparação
dos ésteres metílicos e para a realização da análise cromatográfica, bem
como os resultados obtidos. Deverá mencionar igualmente quaisquer
condições operacionais não especificadas na presente norma interna-
cional, ou consideradas opcionais, assim como quaisquer
circunstâncias que possam ter influenciado os resultados.
O relatório deverá incluir todas as informações necessárias para a
completa identificação da amostra.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 65
▼M19
ANEXO XB
PREPARAÇÃO DOS ÉSTERES METÍLICOS DOS ÁCIDOS GORDOS
DO AZEITE E DO ÓLEO DE BAGAÇO DE AZEITONA
São recomendados os dois métodos seguintes para a preparação dos ésteres
metílicos dos ácidos gordos do azeite e do óleo de bagaço de azeitona.
MÉTODO A: Transesterificação a frio por meio de uma solução metanólica de
hidróxido de potássio
MÉTODO B: Metilação a quente por meio de uma solução metanólica de
metóxido de sódio, seguida de uma esterificação em meio ácido
A escolha de um ou outro método dependerá do parâmetro analítico a deter-
minar e da categoria do azeite ou óleo, tal como se descreve a seguir:
a) Determinação da diferença entre o teor real e o teor teórico de triglicéridos
com NCE 42 ( ∆NCE42):
— o método A será aplicado às amostras de todas as categorias de azeite e
óleo de bagaço, depois da purificação do azeite ou óleo por passagem
numa coluna de sílica-gel;
b) Determinação da composição de ácidos gordos:
— o método A será aplicado directamente às amostras de azeites e óleos de
bagaço das seguintes categorias:
— azeites virgens com acidez livre inferior a 3,3 %.
— azeite refinado,— azeite (lote de azeites virgens com azeite refinado),
— óleo de bagaço de azeitona refinado,
— óleo de bagaço de azeitona (lote de azeites virgens com óleo de
bagaço de azeitona refinado),
— o método B será aplicado directamente às amostras de azeites e óleos de
bagaço das seguintes categorias:
— azeite virgem com acidez livre superior a 3,3 %,
— óleo de bagaço de azeitona bruto;
c) Determinação dos isómeros transde ácidos gordos:
— o método A será aplicado directamente às amostras de azeites e óleos de
bagaço das seguintes categorias:
— azeites virgens com acidez livre inferior a 3,3 %,
— azeite refinado,— azeite (lote de azeites virgens com azeite refinado),
— óleo de bagaço de azeitona refinado,
— óleo de bagaço de azeitona (lote de azeites virgens com óleo de
bagaço de azeitona refinado),
— o método A será aplicado às amostras de azeites e óleos de bagaço das
categorias seguintes, depois da purificação do azeite ou óleo por
passagem numa coluna de sílica-gel:
— azeite virgem com acidez livre superior a 3,3 %,
— óleo de bagaço de azeitona bruto.
PURIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS DE AZEITE OU ÓLEO
Se necessário, purificar as amostras por passagem do azeite ou óleo por uma
coluna de sílica-gel, utilizando hexano/óxido dietílico (87: 13, v/v) como
solvente de eluição, conforme descrito no método IUPAC 2.507.
Como processo alternativo, pode recorrer-se a uma extracção em fase sólida
com cartuchos de sílica-gel. Para o efeito, colocar um cartucho de sílica-gel
(1 g, 6 ml) num aparelho de eluição sobvazio e lavar com 6 ml de hexano.
Cessar a aplicação de vazio, para evitar a secagem da coluna. Introduzir, em
seguida, na coluna uma solução de azeite ou óleo (cerca de 0,12 g) em 0,5 ml
de hexano e reduzir a pressão, para que a solução penetre na sílica; eluir com
10 ml de hexano/óxido dietílico (87: 13 v/v) sobvazio. Homogeneizar a totali-
dade dos eluatos e dividir em dois volumes semelhantes. Evaporar um dosvolumes até à secura, num evaporador rotativo, sobpressão reduzida, à tempe-
ratura ambiente. Dissolver o resíduo em 1 ml de heptano. A solução obtida está
pronta para a análise dos ácidos gordos por cromatografia em fase gasosa.
Evaporar o segundo volume e dissolver o resíduo em 1 ml de acetona, para a
análise dos triglicéridos por HPLC, se necessário.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 66
▼M19
MÉTODOS PARA A PREPARAÇÃO DOS ÉSTERES METÍLICOS DOS
ÁCIDOS GORDOS
1.Método A: Transesterificação a frio por meio de uma solução meta-
nólica de hidróxido de potássio
1.1.Aplicação
Este método rápido é aplicável aos azeites e óleos de bagaço de azei-
tona cujo teor de ácidos gordos livres seja inferior a 3,3 %. Os ácidos
gordos livres não são esterificados pelo hidróxido de potássio. Os
ésteres etílicos de ácidos gordos transesterificam mais lentamente do
que os ésteres glicerídicos e a metilação pode ser apenas parcial.
1.2.Princípio
Formação dos ésteres metílicos por transesterificação numa solução
metanólica de hidróxido de potássio, como fase intermédia antes da
saponificação (ponto 5 do método ISO 5509: 2000; ponto 5 do método
IUPAC 2.301).
1.3.Reagentes
Metanol com teor de humidade não superior a 0,5 % (m/m).Heptano para cromatografia.Solução metanólica aproximadamente 2 N de hidróxido de potássio:
dissolver 11,2 g de hidróxido de potássio em 100 ml de metanol.
1.4.Material
Tubo de ensaio com tampa de rosca e junta de PTFE, com 5 ml de
capacidade.
Pipetas graduadas ou automáticas de 2 ml e 0,2 ml.
1.5.Técnica
Num tubo de ensaio com tampa de rosca de 5 ml, pesar cerca de 0,1 g
da amostra de azeite ou óleo de bagaço. Juntar 2 ml de heptano e
agitar. Juntar 0,2 ml da solução metanólica 2 N de hidróxido de
potássio, tapar com a tampa com junta de PTFE, fechar bem e agitar
energicamente durante 30 segundos. Deixar repousar até que a parte
superior da solução fique límpida. Decantar a camada superior, que
contém os ésteres metílicos. A solução de heptano está pronta para ser
injectada no cromatógrafo. É aconselhável manter a solução no frigorí-
fico até ao momento da análise cromatográfica. Não é recomendável
guardar a solução durante mais de 12 horas.
2.Método B: Metilação a quente por meio de uma solução metanólica
de metóxido de sódio, seguida de uma esterificação em meio ácido
2.1.Aplicação
O método é aplicável aos azeites e óleos de bagaço de azeitona cujo
teor de ácidos gordos livres seja superior a 3,3 %.
2.2.Princípio
Neutralização dos ácidos gordos livre e metanólise alcalina dos glicé-
ridos, seguida de uma esterificação dos ácidos gordos em meio ácido
(ponto 4.2 do método IUPAC n.
o2.301).
2.3.Reagentes
— Heptano para cromatografia.
— Metanol com teor de humidade não superior a 0,05 % (m/m).— Solução metanólica 0,2 N de metóxido de sódio: dissolver 5 g de
sódio em 1 000 ml de metanol (a preparação pode ser feita a partir
de soluções comerciais).
— Solução metanólica a 0,2 % de fenolftaleína.
— Solução metanólica 1 N de ácido sulfúrico: juntar 3 ml de ácido
sulfúrico a 96 % a 100 ml de metanol.
— Solução aquosa saturada de cloreto de sódio.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 67
▼M19
2.4.Material
— Balão volumétrico de 50 ml, de fundo plano e gargalo longo e
estreito com esmerilado.
— Refrigerante de refluxo. Refrigerante de ar (1 m de comprimento)
com junta de esmerilado.
— Regularizador de ebulição.
— Funil de vidro.
2.5.Técnica
Deitar 0,25 g da amostra de azeite ou óleo num balão volumétrico de
50 ml com esmerilado. Com o funil, juntar 10 ml da solução metanólica
0,2 N de metóxido de sódio e o regularizador de ebulição. Adaptar o
refrigerante de refluxo, agitar e levar à ebulição. A solução deve ficar
límpida ao fim de cerca de 10 minutos e a reacção estará praticamente
terminada ao fim de cerca de 15 minutos. Retirar o balão da fonte de
calor, aguardar o final do refluxo, retirar o refrigerante e juntar duas
gotas da solução de fenolftaleína. Juntar alguns mililitros da solução
metanólica 1 N de ácido sulfúrico, até ficar incolor, e, em seguida,
mais 1 ml. Adaptar o refrigerante e levar de novo à ebulição,
mantendo-a durante cerca de 20 minutos. Retirar o balão da fonte de
calor e arrefecê-lo em água corrente. Retirar o refrigerante, juntar
20 ml da solução saturada de cloreto de sódio e agitar. Juntar 5 ml de
heptano, tapar o balão e agitar energicamente durante 15 segundos.
Deixar decantar até à separação completa das duas fases. Juntar de
novo uma parte da solução saturada de cloreto de sódio, até que a faseaquosa atinja a parte inferior do gargalo do balão. A camada superior
contida no gargalo é a que contém os ésteres metílicos. A solução
obtida está pronta para ser injectada no cromatógrafo de fase gasosa.
Precaução: A metilação pelo método B deve ser efectuada debaixo deum exaustor em aspiração.
2.6.Alternativas à metilação pelo método B
2.6.1. Método C
2.6.1.1. Princípio
Tratamento da matéria gorda a analisar com uma solução metanólica de
cloreto de hidrogénio, numa ampola fechada, a 100 ºC.
2.6.1.2. Material
— Ampola de vidro espesso com cerca de 5 ml de capacidade (altura
de 40 mm a 45 mm e diâmetro de 14 mm a 16 mm).
— Pipetas graduadas de 1 ml e 2 ml.
2.6.1.3. Reagentes
Solução a 2 % de cloreto de hidrogénio em metanol, preparada a partir
de cloreto de hidrogénio gasoso e de metanol anidro (Nota 1).
Hexano para cromatografia.
Nota 1:Podem utilizar-se soluções comerciais de cloreto de hidrogénio
em metanol. Podem preparar-se facilmente no laboratório
pequenas quantidades de cloreto de hidrogénio gasoso modifi-
cando a solução comercial (d = 1,18) por adição de algumas
gotas de ácido sulfúrico concentrado. Dado que o metanol
absorve rapidamente o cloreto de hidrogénio, é aconselhável
tomar todas as precauções habituais na dissolução (por
exemplo, introduzir o gás com o auxílio de um pequeno funil
em posição invertida, que mergulhe muito ligeiramente no
metanol). Podem preparar-se com antecedência quantidades
importantes de soluções metanólicas de cloreto de hidrogénio,
que se conservam perfeitamente no escuro em frascos com
tampa de vidro. Este reagente também pode ser preparado por
dissolução de cloreto de acetilo em metanol anidro.
2.6.1.4. Técnica
— Deitar na ampola de vidro 0,2 g da matéria gorda — previamente
seca com sulfato de sódio e filtrada — e 2 ml da solução metanólica
de cloreto de hidrogénio. Fechar a ampola.
— Mergulhar a ampola num banho a 100 ºC e mantê-la a essa tempe-
ratura durante 40 minutos.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 68
▼M19
— Arrefecer a ampola numa corrente de ar, abri-la e juntar 2 ml de
água destilada e 1 ml de hexano.
— Centrifugar e extrair a fase do hexano, que se encontra pronta a
utilizar.
2.6.2. Método D
2.6.2.1. Princípio
Aquecimento da matéria gorda a analisar, sobrefluxo, com metanol,
hexano e ácido sulfúrico. Extracção dos ésteres metílicos obtidos, com
éter de petróleo.
2.6.2.2. Material
— Tubo de ensaio de cerca de 20 ml, equipado com um refrigerante de
refluxo a ar com cerca de 1 m de comprimento, com junta esmeri-
lada.
— Pipeta graduada de 5 ml.
— Ampola de decantação de 50 ml.
— Provetas de 10 ml e 25 ml.— Tubo de ensaio de fundo cónico de 15 ml.
2.6.2.3. Reagentes
— Reagente de metilação: mistura de metanol anidro, hexano e ácido
sulfúrico concentrado (d = 1,84) nas proporções de 75: 25: 1, em
volume.
— Éter de petróleo 40 ºC-60 ºC.
— Sulfato de sódio anidro.
2.6.2.4. Técnica
Introduzir 0,1 g de azeite ou óleo no tubo de 20 ml e juntar 5 ml do
reagente de metilação.
Adaptar o refrigerante de refluxo e manter em ebulição durante 30
minutos num banho de água (Nota 2).
Transferir quantitativamente a mistura para uma ampola de decantação
de 50 ml, com 10 ml de água destilada e 10 ml de éter de petróleo.
Agitar vigorosamente e aguardar a separação de fases. Separar a fase
aquosa e lavar duas vezes a camada etérea com 20 ml de água desti-
lada. Deitar na ampola de decantação uma pequena quantidade de
sulfato de sódio anidro, agitar, deixar repousar durante alguns minutos
e filtrar, recolhendo o filtrado num tubo de fundo cónico de 15 ml.
Evaporar o solvente num banho de água, sob corrente de azoto.
Nota 2:Para regular a ebulição, colocar uma vareta de vidro no tubo e
limitar a temperatura do banho a 90 ºC.
3.Parâmetros de precisão
A avaliação estatística da precisão dos métodos A e B encontra-se
publicada no método COI/T.20/DOC n.
o24 do Conselho Oleícola Inter-
nacional.
RECOMENDAÇÕES PARA A ANÁLISE DE ÉSTERES DOS ÁCIDOS
GORDOS DO AZEITE E DO ÓLEO DE BAGAÇO DE AZEITONA POR
CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA
1.Técnica
Análise das soluções de ésteres de ácidos gordos em hexano por croma-
tografia em fase gasosa em conformidade com a norma ISO 5508, em
coluna capilar (50 m × 0,25 mm ou 0,32 mm de diâmetro interno)
revestida de cianopropilsilicone, tal como indicado na determinação
dos isómeros transdos ácidos gordos (COI/T.20/Doc. n.o17).
Representa-se na figura 1 o perfil cromatográfico típico de um óleo de
bagaço de azeitona com ésteres metílicos e etílicos de ácidos gordos e
isómeros transde ésteres metílicos.
2.Cálculos
2.1. Para determinar a composição de ácidos gordos e o ∆NCE42, devem
ser tidos em conta os seguintes ácidos gordos:
Mirístico (C14: 0).1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 69
▼M19
Palmítico (C16: 0). Soma das áreas dos picos correspondentes aos
ésteres metílicos e etílicos.
Palmitoleico (C16: 1). Soma das áreas dos picos correspondentes aos
isómeros ω9eω7do éster metílico.
Heptadecanóico (C17: 0).Heptadecenóico (C17: 1).
Esteárico (C18: 0).
Oleico (C18: 1). Soma das áreas dos picos correspondentes aos
isómeros ω
9eω7do éster metílico, do éster etílico e dos isómeros trans
do éster metílico.
Linoleico (C18: 2). Soma das áreas dos picos correspondentes aos
ésteres metílicos e etílicos e aos isómeros transdo éster metílico.
Araquídico (C20: 0).Linolénico (C18: 3). Soma das áreas do éster metílico e dos isómeros
transdo éster metílico.
Eicosenóico (C20: 1).Beénico (C22: 0).
Linhocérico (C24: 0).
A esqualeno não é tido em conta no cálculo da área total.
2.2. Para calcular a percentagem de trans-C18: 1, utilizar-se-á o pico corres-
pondente aos ésteres metílicos deste ácido gordo. Para calcular a soma
[trans-C18: 2 + trans-C18: 3], adicionar-se-ão todos os picos correspon-
dentes aos isómeros transdesses dois ácidos gordos. Para calcular a
área total, ter-se-ão em conta todos os picos mencionados em 2.1 (ver
COI/T.20/Doc. n.
o17).
O cálculo da percentagem de cada ácido gordo será efectuado pela
seguinte fórmula:
% X = (área X x 100)/(área total)
Figura 1: Perfil cromatográfico de um óleo de bagaço de azeitona, obtido pelo
método de metilação a frio. Salvo indicação em contrário, os picos cromatográ-
ficos correspondem aos ésteres metílicos.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 70
▼B
ANEXO XI
DETERMINAÇÃO DO TEOR DE SOLVENTES HALOGENADOS
VOLÁTEIS NO AZEITE
1. FUNDAMENTO
Análise por cromatografia em fase gasosa segundo a técnica do espaço de
cabeça.
2. APARELHOS E UTENSÍLIOS
2.1. Aparelho de cromatografia em fase gasosa equipado com um detector de
captura de electrões (ECD).
2.2. Órgãos para o espaço de cabeça.2.3. Colunas de cromatografia em fase gasosa em tubo de vidro, com 2 metros
de comprimento, 2 mm de diâmetro interior e fase estacionária constituída
por OV101 a 10 % ou equivalente, impregnando terra de diatomáceas
calcinada, lavada com ácidos e silanizada, com granulometria de 80-100
Mesh (200-150 µm).
2.4. Gás vector e gás auxiliar: azoto para a cromatografia em fase gasosa com
detecção por captura de electrões.
2.5. Frascos de vidro de 10 a 15 ml sobre cujo gargalo se coloca um septo elas-
tómetro ( teflon) ajustado por anel de alumínio sendo o conjunto fixado por
capsulador manual.
2.6. Capsulador manual.
2.7. Seringa para gás de 0,5 a 2 ml.
3. REAGENTES
3.1. Padrões: hidrocarbonetos halogenados voláteis com um grau de pureza
adequado para utilização em cromatografia em fase gasosa.
4. TÉCNICA
4.1. Pesam-se exactamente cerca de 3 g de azeite num frasco de vidro (ponto
1.5) a não reutilizar, fecha-se o frasco hermeticamente e mantém-se à
temperatura de 70º C durante uma hora. Recolhe-se com precisão, utili-
zando a seringa, um volume de 0,2 a 0,5 ml do espaço de cabeça.
Injecta-se na coluna do aparelho de cromatografia em fase gasosa, regulado
do seguinte modo:
— temperatura do injector: 150º C,
— temperatura da coluna: 70-80º C,— temperatura do detector: 200-250º C.
Podem igualmente utilizar-se outras temperaturas, desde que os resultados
sejam equivalentes.
4.2. Soluções de referência
Preparam-se soluções-padrão utilizando azeite refinado, sem vestígios de
solventes, com concentrações variáveis entre 0,05 e 1 mg/kg e em relação
com o teor presumido da amostra.
4.3. Avaliação quantitativa
Estabelece-se a relação entre as áreas ou altura dos picos dos cromato-
gramas da amostra e da solução-padrão que tenha a concentração
presumida mais próxima. Caso o desvio relativo seja superior a 10 % é
necessário voltar a proceder à análise por comparação com uma nova
solução-padrão, até que a sua concentração respeite o desvio relativo acima
mencionado.
4.4. Expressão dos resultados
Os resultados são expressos em mg/kg (ppm).O limite de detecção do processo é de 0,01 mg/kg.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 71
▼M19
ANEXO XII
EXAME ORGANOLÉPTICO DOS AZEITES VIRGENS
1. OBJECTIVO E CAMPO DE APLICAÇÃO
O presente método tem por objectivo estabelecer os critérios necessários à
avaliação das características organolépticas dos azeites virgens, na acepção
do ponto 1 do anexo do Regulamento 136/66/CEE, e descrever o processo
de classificação a utilizar para o efeito.
O método descrito só é aplicável na classificação de azeites virgens em
função da existência de um frutado e da intensidade dos defeitos, determi-
nadas por um grupo de provadores seleccionados e formados e constituídos
em júri em conformidade com o ponto 4.
2. GENERALIDADES
No respeitante ao vocabulário geral de base, à sala de provas, à metodo-
logia geral e ao copo de prova dos azeites, são recomendadas as
prescrições do Conselho Oleícola Internacional.
3. VOCABULÁRIO ESPECÍFICO3.1.Atributos positivos
Frutado: conjunto das sensações olfactivas dependentes da variedade de
azeitona e características dos azeites provenientes de frutos sãos e frescos,
verdes ou maduros, por via directa ou retronasal.
Amargo: gosto característico dos azeites obtidos de azeitonas verdes ou em
fase precoce de maturação.
Picante: sensação táctil de picadas, característica dos azeites produzidos no
início da campanha, principalmente a partir de azeitonas ainda verdes.
3.2.Atributos negativos
Tulha: «flavour» característico dos azeites obtidos de azeitonas amontoadas
num estado avançado de fermentação anaeróbia.
Mofo/húmido : «flavour» característico dos azeites obtidos de azeitonas
atacadas por bolores e leveduras devido à armazenagem dos frutos durante
vários dias em condições húmidas.
Borra: «flavour» característico dos azeites que permaneceram em contacto
com as matérias decantadas nos depósitos e reservatórios.
Avinhado-avinagrado : «flavour» característico de certos azeites que lembra
o vinho ou o vinagre. Deve-se, fundamentalmente, a um processo fermen-
tativo das azeitonas, que leva à formação de ácido acético, acetato de etilo
e etanol.
Metálico: «flavour» que lembra os metais. É característico dos azeites que
permaneceram prolongadamente em contacto com superfícies metálicas
durante os processos de trituração, malaxagem, prensagem ou armaze-
nagem.
Ranço: «flavour» dos azeites que sofreram um processo de oxidação.
Cozido ou queimado : «flavour» característico dos azeites devido a um
aquecimento excessivo e/ou prolongado durante a obtenção dos mesmos,
principalmente durante a termomalaxagem da pasta, se esta for realizada
em condições térmicas inadequadas.
Feno-madeira : «flavour» característico de certos azeites provenientes de
azeitonas secas.
Encorpado : sensação bucotáctil densa e pastosa produzida por certos
azeites.
Lubrificantes : «flavour» dos azeites que lembra o gasóleo, massas consis-
tentes ou óleos minerais.
Água-ruça : «flavour» adquirido pelos azeites devido a contacto prolongado
com as água-ruças.
Salmoura : «flavour» dos azeites obtidos de azeitonas conservadas em
salmoura.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 72
▼M19
Esparto: «flavour» característico dos azeites obtidos de azeitonas prensadas
em capachos de esparto novos. Pode variar consoante se trate de capachos
fabricados de esparto verde ou de esparto seco.
Terra: «flavour» dos azeites obtidos de azeitonas colhidas com terra ou
lamacentas e não lavadas.
Gafa: «flavour» dos azeites obtidos de azeitonas fortemente atacadas por
larvas da mosca da oliveira ( Bactrocera Oleae ).
Pepino: «flavour» dos azeites característico de um acondicionamento
hermético excessivamente prolongado, nomeadamente em latas. É atribuída
à formação de 2,6-nonadienal.
4. JÚRI
O júri será nomeado pelo Estado-Membro e constituído por um chefe e oito
a 12 provadores. Todavia, na campanha de 2001/2002, o número de prova-
dores pode ser inferior a oito.
O chefe do júri terá recebido uma formação sólida e será um perito experi-
ente nos diferentes tipos de azeite. O chefe será o responsável pelo júri,
pela sua organização e funcionamento, pela preparação, codificação e apre-
sentação das amostras aos provadores e pela recolha e tratamento estatístico
dos dados.
O chefe do júri seleccionará os provadores e supervisionará a formação e a
prestação dos mesmos, para que se mantenham num nível de aptidão
adequado.
Os provadores para os exames organolépticos de azeites serão escolhidos e
formados em função da sua capacidade de distinção de amostras similares,
em conformidade com o guia do Conselho Oleícola Internacional para a
selecção, formação e supervisão dos provadores qualificados de azeite
virgem.
Os júris comprometer-se-ão a participar nos exames organolépticos
previstos num plano nacional, comunitário ou internacional de controlo
periódico e harmonização dos critérios de percepção. Devem, além disso,
fornecer anualmente ao Estado-Membro em causa todos os elementos rela-
tivos à composição dos mesmos e ao número de exames efectuados como
júri aprovado.
5. EXAME ORGANOLÉPTICO E MÉTODO DE CLASSIFICAÇÃO5.1.Utilização da folha de perfil pelo provador
A folha de perfil a utilizar pelos provadores figura no apêndice A do
presente método.
Cada provador membro do júri deve cheirar e, em seguida, provar (
1)o
azeite examinado, contido no copo de prova, para analisar as percepções
olfactivas, gustativas, tácteis e cinestésicas. Deve, a seguir, inscrever na
folha de perfil a intensidade que julga corresponder a cada atributo nega-
tivo e positivo.
Se forem detectados atributos negativos não indicados na folha de perfil,
devem ser mencionados na rubrica «outros», empregando o termo ou
termos que os descrevam com mais precisão entre os definidos no ponto
3.2 do presente método.
5.2.Utilização dos dados pelo chefe do júri
O chefe do júri recolherá as folhas de perfil preenchidas pelos provadores e
verificará as intensidades atribuídas. Se for detectada alguma anomalia,
solicitará ao provador que reveja a folha de perfil respectiva e, se
necessário, que repita o exame.
O chefe do júri pode introduzir os dados de cada provador num programa
informático conforme com o método de cálculo estatístico da mediana
constante do apêndice B. A introdução dos dados respeitantes a uma
amostra será efectuada com base numa matriz de 10 colunas — correspon-
dentes aos 10 atributos sensoriais — e n linhas — correspondentes aos n
provadores do júri.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 73
(1) Poderá não provar se detectar certos atributos negativos extremamente intensos, caso
em que anotará essa circunstância excepcional na folha de perfil.
▼M19
Se um atributo negativo for inscrito na rubrica «outros» por pelo menos
50 % dos membros do júri, o chefe do júri efectuará o cálculo da mediana
desse atributo e procederá à classificação correspondente.
No caso das análises efectuadas no âmbito de verificações de conformidade
com normas, ou de contra-análises, o chefe do júri providenciará para que
o exame organoléptico do azeite seja efectuado em triplicado, com pelo
menos um dia de intervalo. A mediana dos atributos será calculada a partir
do conjunto dos dados das folhas de perfil dos três exames.
5.3.Classificação dos azeites
O azeite será classificado de acordo com as denominações seguintes, em
função da mediana dos defeitos e da mediana do atributo «frutado».
Entende-se por «mediana dos defeitos» a mediana do atributo negativo a
que tenha sido atribuída a intensidade mais elevada. O valor do coeficiente
de variação robusto para esse atributo negativo deve ser igual ou inferior a
20 %.
a)Azeite virgem extra : mediana dos defeitos igual a 0 e mediana do
frutado superior a 0;
b)Azeite virgem : mediana dos defeitos superior a 0 e inferior ou igual a
2,5 e mediana do frutado superior a 0;
c)Azeite virgem corrente : mediana dos defeitos superior a 2,5 e inferior ou
igual a 6,0; ou mediana dos defeitos inferior ou igual a 2,5 e mediana
do frutado igual a 0;
d)Azeite virgem lampante : mediana dos defeitos superior a 6,0.
A partir de 1 de Novembro de 2003 as categorias c) e d) são, porém,
substituídas pela seguinte categoria:
c)Azeite lampante : mediana dos defeitos superior a 2,5; ou mediana dos
defeitos inferior ou igual a 2,5 e mediana do frutado igual a 0.
5.4.Casos especiais
Se a mediana de um atributo positivo diverso do frutado for superior a 5,0,
o chefe do júri assiná-lo-á no certificado de análise do azeite.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 74
▼M19
APÊNDICE A
1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 75
▼M19
APÊNDICE B
MÉTODO DE CÁLCULO DA MEDIANA E DOS INTERVALOS DE
CONFIANÇA
Mediana
A mediana é o número real Xm caracterizado pelo facto de a probabilidade (P)
de os valores da distribuição (X) serem inferiores a esse número (Xm) ser infe-
rior ou igual a 0,5 e, simultaneamente, de a probabilidade (P) de os valores da
distribuição (X) serem inferiores ou iguais a Xm ser superior ou igual a 0,5.
Outra definição considera a mediana o percentil 50 de uma distribuição de
números ordenados por ordem crescente. Por outras palavras, a mediana repre-
senta o valor central de uma série ordenada de números ímpares ou a média dos
dois valores centrais de uma série ordenada de números pares.
Desvio-padrão robusto
Para se obter uma estimativa fiável da variabilidade em redor da mediana, torna-
-se necessário estimar o desvio-padrão robusto de Stuart e Kendall. A fórmula do
desvio-padrão assimptótico S depende de N e de IQR. N é o número de obser-
vações e IQR é o intervalo interquartílico, isto é, a estimativa robusta da
variabilidade dos dados considerados (o intervalo interquartílico encerra exacta-
mente 50 % dos casos de uma distribuição de probabilidade). O cálculo do
intervalo interquartílico efectua-se determinando a dimensão do desvio entre o
percentil 75 e o percentil 25.
IQR = percentil 75 - percentil 25
O percentil é o valor Xpc caracterizado pelo facto de a probabilidade (P) de os
valores da distribuição serem inferiores a Xpc ser inferior ou igual a um deter-
minado centésimo e, simultaneamente, de a probabilidade (P) de os valores da
distribuição serem inferiores ou iguais a Xpc ser superior ou igual a esse centé-
simo. O centésimo indica a fracção considerada da distribuição. No caso da
mediana, essa fracção é de 50/100.
Por outras palavras, o percentil é o valor de distribuição correspondente a umaárea determinada, traçada a partir da curva de distribuição ou de densidade. A
título de exemplo, o percentil 25 representa o valor de distribuição correspon-
dente a uma área igual a 0,25 ou 25/100.
Coeficiente de variação percentual robusto
O CVR representa um número puro, adimensional, que indica a percentagem de
variabilidade da série de números analisada relativamente ao valor Me da
mediana. Por esse motivo, este coeficiente é muito útil para verificar a fiabili-
dade dos membros do júri.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 76
▼M19
Intervalos de confiança a 95 % da mediana
Os intervalos de confiança (IC) a 95 % (valor do erro de primeira espécie igual
a 0,05 ou 5 %) representam o intervalo no qual o valor da mediana poderá
variar, na hipótese de a experiência poder ser repetida um número infinito de
vezes. Na prática, esse intervalo indica o intervalo de variabilidade do ensaio
nas condições de trabalho consideradas, na hipótese de aquele poder ser repetido
várias vezes. Tal como o CVR, este intervalo ajuda a avaliar a fiabilidade do
ensaio.
I.C. Superior = Me + (c.S)
I.C. Inferior = Me - (c.S)
em que, no caso do intervalo de confiança de 0,95, c é igual a 1,96.
A classificação será efectuada por comparação dos valores da mediana com os
intervalos de referência determinados no ponto 5.3 do método. O programa
informático permite visualizar a classificação num quadro de dados estatísticos
ou num gráfico.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 77
▼M20
▼M19
▼B
ANEXO XV
1. TEOR DE ÓLEO DO BAGAÇO DE AZEITONA
1.1.Aparelhos e utensílios
— aparelho de Soxhlet munido de um balão de 200 a 250 ml,
— banho de aquecimento eléctrico (banho de areia, banho de água, etc.)
ou placa de aquecimento,
— balança analítica,
— estufa regulada a 80 ºC, no máximo,— estufa com aquecimento eléctrico munido de um depósito de termore-
gulação regulado a 103 ºC ± 2 ºC, que permita realizar uma insuflação
de ar ou uma pressão reduzida,
— triturador mecânico fácil de limpar e que permita a trituração sem aque-
cimento e sem diminuição sensível do teor de água e de óleo,
— cartucho de extracção e algodão hidrófilo ou filtro de papel, isento de
produtos extraíveis pelo hexano,
— exsicador,— peneiro com orifícios de 1 mm de diâmetro,— pedra-pomes em pequenos grãos, previamente seca.
1.2.Reagentes
n-Hexano técnico cujo resíduo, na evaporação completa, deve ser inferior a
0,002 g por 100 ml.
2. TÉCNICA2.1.Preparação da amostra para análise
Tritura-se a amostra para laboratório, se necessário, num triturador mecâ-
nico previamente bem limpo a fim de a reduzir a partículas que possam
atravessar completamente o peneiro.
Utiliza-se cerca de um vigésimo da amostra para perfazer a limpeza do
triturador, deita-se essa parte fora, tritura-se o restante que se recolhe,
mistura-se com cuidado e analisa-se sem demora.
2.2.Toma
Pesa-se com uma precisão de 0,01 g, logo após o final da trituração, uma
toma para análise com aproximadamente 10 g.
2.3.Preparação do cartucho de extracção
Coloca-se a toma no cartucho e tapa-se este com o tampão de algodão
hidrófilo. No caso de se ter utilizado um filtro de papel, embala-se amoedura nesse papel.
2.4.Pré-secagem
Se o bagaço estiver muito húmido (teor de água e de matérias voláteis
superior a 10 %) efectua-se uma pré-secagem colocando durante um espaço
de tempo conveniente o cartucho cheio (ou filtro de papel) na estufa aque-
cida a 80 ºC, no máximo, para reduzir o teor de água e de matérias voláteis
a menos de 10 %.
2.5.Preparação do balão
Pesa-se, com uma precisão de 1 mg, o balão contendo 1 a 2 grãos de pedra-
-pomes, previamente seco na estufa a 103 ºC ± 2 ºC e depois arrefecido
durante pelo menos uma hora num exsicador.
2.6.Primeira extracção
Coloca-se no aparelho de Soxhlet o cartucho (ou filtro de papel) que
contém a toma. Verte-se para o balão a quantidade necessária de hexano.
Adapta-se o balão ao aparelho de Soxhlet, coloca-se o conjunto sobre um
banho com aquecimento eléctrico. Regula-se o aquecimento em condições
tais que o refluxo seja pelo menos de três gotas por segundo (ebulição
moderada, não tumultuosa).1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 78
▼B
Após quatro horas de extracção, deixa-se arrefecer. Tira-se o cartucho do
aparelho de Soxhlet e coloca-se numa corrente de ar a fim de eliminar a
maior parte do solvente que o impregna.
2.7.Segunda extracção
Despeja-se o cartucho no microtriturador e tritura-se o mais possível.
Volta-se a colocar quantitativamente a mistura no cartucho e este no
aparelho de Soxhlet.
Recomeça-se a extracção ainda durante duas horas utilizando o mesmo
balão que contém a primeira extracção.
A solução obtida no balão de extracção deve ser límpida. Se o não for,
filtra-se por filtro de papel lavando várias vezes o primeiro balão e o filtro
com hexano. Recolhe-se o filtrado e o solvente de lavagem num segundo
balão previamente seco e pesado com uma precisão de 1 mg.
2.8.Eliminação do solvente e pesagem do extracto
Expulsa-se, por destilação sobre banho de aquecimento eléctrico, a maior
parte do solvente. Eliminam-se os últimos vestígios de solvente aquecendo
o balão na estufa a 103 ºC ± 2 ºC durante 20 minutos. Facilita-se esta
eliminação quer insuflando ar de vez em quando ou de preferência um gás
inerte quer submetendo-o a pressão reduzida.
Deixa-se arrefecer o balão num exsicador durante pelo menos uma hora e
pesa-se com uma precisão de 1 mg.
Volta-se a aquecer durante 10 minutos nas mesmas condições, arrefece-se
no exsicador e pesa-se.
A diferença entre os resultados destas duas pesagens deve ser inferior ou
igual a 10 mg. Se não, volta-se a aquecer durante períodos de dez minutos,
seguidos de arrefecimento e de pesagem, até que a diferença de massa seja
no máximo igual a 10 mg. Tenha-se em consideração a última pesagem do
balão.
Efectuam-se duas determinações na mesma amostra para análise.
3. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS
3.1.Cálculos
a) O extracto, expresso em percentagem em massa, do produto tal como se
apresenta é:
S=m1×100
m0
onde:S é a percentagem em massa do extracto do produto tal
como se apresenta.
m0é a massa, em gramas, da toma.
m1é a massa, em gramas, do extracto após secagem.
Toma-se como resultado a média aritmética de duas determinações se as
condições de repetibilidade estiverem prenchidas.
O resultado exprime-se arredondado às décimas.
b) O extracto é referido à matéria seca utilizando a seguinte fórmula:
S×100
100 − U= extracto em % gordo/seco
onde:
S = é percentagem em massa do extracto do produto tal como se
apresenta [ver alínea a].
U = é o seu teor de água e de matérias voláteis.
3.2.Repetibilidade
A diferença entre os resultados das duas determinações, efectuadas simulta-
neamente ou rapidamente uma após a outra pelo mesmo analista, não deve
ser superior a 0,2 g de extracto com hexano para 100 g de amostra.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 79
▼B
No caso contrário, repete-se a análise com outras duas tomas. Se ainda
desta vez a diferança ultrapassar 0,2 g, toma-se como resultado a média
aritmética das quatro determinações efectuadas.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 80
▼B
ANEXO XVI
DETERMINAÇÃODO ÍNDICEDE IODO
1. OBJECTIVO
Determinação do índice de iodo de óleos e gorduras animais e vegetais, a
seguir denominados gorduras.
2. DEFINIÇÃO
No final da presente norma internacional, aplicar-se-á a seguinte definição:
2.1. Índice de iodo: o peso de iodo absorvido pela amostra nas condições de
trabalho que se especificam na presente norma internacional.
O índice de iodo expressa-se em gramas de iodo por 100 g de amostra.
3. RESUMO DO PROCESSO
Dissolução de uma toma de amostra num solvente seguida da adição de
reagente de Wijs. Após um intervalo de tempo determinado, adição de
solução de iodeto de potássio e água, titulação do iodo libertado com uma
solução de tiossulfato de sódio.
4. REAGENTES
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica reconhecida.
4.1. Iodeto de potássio, solução a 100 g/l, isenta de iodato e iodo livre.
4.2. Amido, solução:
Dissolvem-se 5 g de amido solúvel em 30 ml de água, adiciona-se esta
mistura a 1 000 ml de água em ebulição, mantém-se em ebulição durante
3 minutos e deixa-se arrefecer.
4.3. Tiossulfato de sódio, solução titulada:
c (Na2S2O35H2O) = 0,1 mol/l, titulada não mais de 7 dias antes da utili-
zação.
4.4. Solvente, preparado mediante mistura de volumes iguais de ciclohexano e
ácido acético.
4.5. Reagente de Wijs, contendo monocloreto de iodo em ácido acético.
Deverá usar-se reagente Wijs de origem comercial.
Nota:O reagente contém 9 g de ICI3+ 9 g I em ácido acético.
5. APARELHOS E UTENSÍLIOS
Material de uso corrente em laboratório, nomeadamente o seguinte:
5.1. Cápsulas pequenas de vidro apropriadas para nelas pesar a toma e intro-
duzi-las depois nos erlenmeyers (ponto 5.2).
5.2. Erlenmeyers, de 500 ml de capacidade, equipados com rolhas de vidro
esmerilado e completamente secos.
6. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA PARA ANÁLISE
A amostra homogeneizada é seca com sulfato de sódio e filtrada.
7. TÉCNICA
7.1. Toma
A massa da toma varia de acordo com o valor esperado do índice de iodo,
como se indica no quadro 1.
Quadro 1
Índice de iodo esperado Massa da toma (g)
inferior a 5 3,00
5 a 20 1,00
21 a 50 0,401991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 81
▼B
Índice de iodo esperado Massa da toma (g)
51 a 100 0,20
101 a 150 0,13
151 a 200 0,10
Pesa-se a toma de ensaio com aproximação a 0,1 mg numa cápsula
pequena de vidro (ponto 5.1).
7.2. Determinação
Introduz-se a toma num erlenmeyer de 500 ml (ponto 5.2). Juntam-se 20 ml
do solvente (ponto 4.4), para dissolver a gordura. Adicionam-se exacta-
mente 25 ml de reagente Wijs (ponto 4.6), coloca-se a rolha, agita-se o
conteúdo e coloca-se o erlenmeyer no escuro. Não utilizar a sucção com a
boca para medir por pipeta o reagente de Wijs.
De um modo similar, procede-se à preparação de um ensaio em branco
com o solvente e o reagente, mas sem a toma de gordura.
Para amostras com um índice de iodo inferior a 150, mantêm-se os erlen-
meyers no escuro durante 1 hora; para amostras com um índice de iodo
superior a 150 e para produtos polimerizados ou oxidados em quantidade
apreciável, durante 2 horas.
No final do intervalo de tempo prescrito, deitam-se 20 ml de solução de
iodeto de potássio (ponto 4.1) e 150 ml de água em cada erlenmeyer.
Titula-se com a solução volumétrica padrão de tiossulfato de sódio (ponto
4.3), até a coloração amarela, devida à presença de iodo, ter praticamente
desaparecido. Adicionam-se algumas gotas da solução de amido (ponto 4.2)
e continua-se a titulação até à coloração azul desaparecer após agitação
bastante vigorosa.
Nota:a determinação potenciométrica do ponto final é permitida.
7.3. Número de determinações
Efectuam-se duas determinações para cada amostra em estudo.
8. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS
O índice de iodo é dado pela expressão:
12;69 c V 1/C0V2 ðÞ
m
onde:
c = representa a concentração exacta, expressa em moles por litro, de
solução titulada de tiossulfato de sódio (ponto 4.3) utilizada.
V1= representa o volume, expresso em mililitros, da solução titulada de
tiossulfato de sódio (ponto 4.3) gasto no ensaio em branco.
V2= representa o volume, expresso em mililitros, da solução titulada de
tiossulfato de sódio (ponto 4.3) gasto na determinação.
m = representa a massa, expressa em gramas, da toma (ponto 7.1).
Considera-se como resultado a média aritmética das duas determinações,
desde que as exigências de repetibilidade (ponto 11.2) sejam satisfeitas.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 82
▼M11
ANEXO XVII
MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO DE ESTIGMASTADIENOS EM
ÓLEOS VEGETAIS
1. OBJECTIVO
Determinação de estigmastadienos em óleos vegetais que contenham
concentrações reduzidas destes hidrocarbonetos, nomeadamente azeites
virgens e óleos de bagaço de azeitona.
2. ÂMBITO
O método é aplicável a todos os óleos vegetais, embora as determinações
apenas sejam fiáveis nos casos em que o teor de hidrocarbonetos em
causa esteja compreendido entre de 0,01 e 4,0 mg/kg. O método é parti-
cularmente adequado para detectar a presença de óleos vegetais refinados
(azeite, óleo de bagaço de azeitona, óleo de girassol, óleo de palma, etc.)
em azeites virgens, uma vez que, contrariamente a estes últimos, os
azeites refinados contêm estigmastadienos.
3. PRINCÍPIO
Isolamento da matéria insaponificável, seguido de separação da fracção
que contém hidrocarbonetos esteróides por cromatografia em coluna de
silicagel e análise por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar.
4. EQUIPAMENTO
4.1. Balões de 250 ml adequados para uso com refrigerante de refluxo.4.2. Ampolas de decantação de 500 ml.4.3. Balões de fundo redondo de 100 ml.4.4. Evaporador rotativo.4.5. Coluna de vidro para cromatografia (1,5-2,0 cm de diâmetro interno e 50
cm de comprimento), equipada com uma torneira de teflone um tampão
de lã de vidro ou um disco de vidro sinterizado. Para preparar a coluna de
silicagel, deitar hexano na coluna cromatográfica até uma altura aproxi-
mada de 5 cm, enchendo de seguida com uma suspensão de silicagel em
hexano (15 g em 40 ml), com o auxílio de várias porções de hexano.
Deixar assentar, com o eventual recurso a uma ligeira vibração. Adicionar
sulfato de sódio anidro até uma altura aproximada de 0,5 cm e eluir o
excesso de hexano.
4.6. Cromatógrafo de fase gasosa equipado com um detector de ionização de
chama, um injector com divisão de fluxo ou um sistema de injecção
directa na coluna a frio e forno com programação de temperatura com
precisão de ± 1 ºC.
4.7. Coluna capilar de sílica fundida para cromatografia em fase gasosa (0,25
ou 0,30 mm de diâmetro interno e 25 m de comprimento), revestidas com
uma fase de fenilmetilsilicone a 5 %, de 0,25 mm de espessura.
Nota 1.
Podem utilizar-se outras colunas de polaridade idêntica inferior.
4.8. Registador-integrador com possibilidade de integração entre dois mínimos
consecutivos.
4.9. Microsseringa de 5-10 ml para cromatografia em fase gasosa, com agulha
cementada.
4.10. Manta ou placa de aquecimento.
5. REAGENTES
Salvo indicação em contrário, todos os reagentes devem ser de qualidade
analítica. Deve utilizar-se água destilada ou de grau de pureza equiva-
lente.
5.1. Hexano ou mistura de alcanos com intervalo de ebulição 65-70 ºC, desti-
lada numa coluna de rectificação.
Nota 2.
O solvante deve ser destilado, com vista a remover as impurezas.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 83
▼M11
5.2. Etanol a 96 % v/v.
5.3. Sulfato de sódio anidro.5.4. Solução alcoólica de hidróxido de potássio a 10 %. Adicionar 10 ml de
água a 50 g de hidróxido de potássio, agitar e dissolver a mistura em
etanol, até perfazer 500 ml.
Nota 3.
Em repouso, a solução alcoólica de hidróxido de potássio adquire uma
coloração acastanhada, pelo que deve preparar-se diariamente antes do
uso e armazenar-se, pelo que deve preparar-se diariamente antes do usoe armazenar-se em recipientes de vidro escuro, devidamente rolhados.
5.5. Silicagel 60 para cromatografia em coluna, 70-230 mesh (Merck ref.
7734 ou similar)
Nota 4.
De um modo geral, a silicagel pode ser utilizada directamente, sem qual-
quer tratamento prévio. Contudo, alguns lotes podem exibir uma
actividade reduzida, originando separações cromatográficas deficientes.
Nestas circunstâncis, a silicagel deve ser tratada do seguinte modo: desac-
tivar a silicagel por aquecimento a 500 ºC durante 4 horas. Após o
aquecimento, colocar a silicagel num exsicador, transferindo-a, após arre-
fecimento, para um balão rolhado. Adicionar 2 % de água e agitar até que
deixem de observar-se aglomerados e o pó flua livremente.
Caso os lotes de silicagel originem cromatogramas com picos atribuíveis
a interferências, a silicagel deve ser tratada de modo supra. Como alter-
nativa, pode utilizar-se silicagel de qualidade extra (Merck, ref. 7754).
5.6. Solução-mãe (200 ppm) de colesta-3,5-dieno (Sigma, 99 % de pureza) em
hexano (10 mg em 50 ml).
5.7. Solução-padrão de colesta-3,5-dieno em hexano, numa concentração de
20 ppm, obtida por diluição da solução supra.
Nota 5.
Se mantidas a uma temperatura inferior a 4 ºC, as soluções 5.6 e 5.7 não
sofrem deterioração durante um período de, pelo menos, 4 meses.
5.8. Solução de n-nonacosano em hexano com uma concentração aproximada
de 100 ppm.
5.9. Gás de arrastamento para cromatografia: hélio ou hidrogénio com um
grau de pureza de 99,9990 %.
5.10. Gases auxiliares para o detector de ionização de chama: hidrogénio com
um grau de pureza de 99,9990 % ou ar depurado.
6. PROCEDIMENTO6.1.Preparação da matéria insaponificável:
6.1.1. Pesar 20 ± 0,1 g de óleo num balão de 250 ml (4.1), adicionando 1 ml de
solução-padrão de colesta-3,5-dieno (20 mg) e 75 ml de solução alcoólica
de hidróxido de potássio a 10 %. Adaptar o refrigerante e aquecer à
ebulição ligeira durante 30 minutos. Remover o balão da fonte de calor
e deixar arrefecer ligeiramente (não deixar arrefecer até à temperatura
ambiente, uma vez que a amostra poderá aderir ao fundo do balão).
Adicionar 100 ml de água e transferir a solução para uma ampola de
decantação (4.2), com o auxílio de 100 ml de hexano. Agitar a mistura
vigorosamente durante 30 segundos e deixar separar as fases.
Nota 6.
Caso se observe a formação de uma emulsão persistente, adicionar
pequenas quantidades de etanol
6.1.2. Transferir a fase aquosa inferior para outra ampola de decantação e
extrair novamente com 100 ml de hexano. Como anteriormente, recolher
a fase inferior, lavando os extractos de hexano (combinados numa
terceira ampola de decantação) com três porções de 100 ml de mistura
etanol-água (1 : 1), até obter pH neutro.
6.1.3. Tratar a solução de hexano com sulfato de sódio anidro (50 g), lavar com
20 ml de hexano e evaporar à secura num evaporador rotativo a 30 ºC e
pressão reduzida.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 84
▼M11
6.2.Separação da fracção que contém hidrocarbonetos esteróides:
6.2.1. Remover o resíduo com o auxílio de duas porções de 1 ml de hexano,
transferir para a coluna, de modo a que o nível da solução atinja no
topo da camada de sulfato de sódio, e iniciar a eluição cromatográfica
com hexano, a um fluxo aproximado de 1 ml/min. Desprezar os primeiros
25-30 ml de eluído e recolher os 40 ml seguintes. Transferir a fracção
recolhida para um balão de fundo redondo em 100 ml (4.3).
Nota 7.
A primeira fracção contém os hidrocarbonetos saturados (figura 1a) e a
segunda os hidrocarbonetos esteróides. O prosseguimento da eluição
permite obter esqualeno e compostos afins. Para uma separação adequada
dos hidrocarbonetos saturados e esteróides, é necessário optimizar os
volumes das diversas fracções. Assim, o volume da primeira fracção
deve ser ajustado de modo a que, aquando da análise da segundo fracção,
os picos relativos aos hidrocarbonetos saturados sejam pouco intensos
(veja-se a figura 1c); se estes picos estiverem ausentes e a intensidade
do pico-padrão for reduzida, o volume deve ser reduzido. De qualquer
modo, não é necessário efectuar a separação completa dos componentes
da primeira e da segunda fracção, uma vez que, no caso de se ajustarem
as condições de trabalho de acordo com 6.3.1, não ocorre a sobreposição
dos picos durante a análise cromatográfica. Em geral, a optimização do
volume da segunda fracção não é também necessária, em virtude da sepa-
ração adequada dos restantes componentes. Todavia, a presença de um
pico intenso com um tempo de retenção aproximadamente 1,5 minutos
inferior ao pico relativo ao padrão resulta de uma separação deficiente,
sendo atribuível ao esqualeno.
6.2.2. Evaporar a segunda fracção num evaporador, a 30 ºC e pressão reduzida,
até à secura, e dissolver imediatamente o resíduo em 0,2 ml de hexano.
Manter a solução no frigorífico até efectuar a análise.
Nota 8.
Os resíduos 6.1.3 e 6.2.2 não devem permanecer a seco, à temperatura
ambiente. Logo que obtidos, deve adicionar-se solvente, devendo as
soluções resultantes ser armazenadas no frigorífico.
6.3.Cromatrografia em fase gasosa:
6.3.1. Condições de trabalho no caso de injecção com divisão de fluxo:
— temperatura do injector: 300 ºC,
— temperatura do detector: 320 ºC.
— integrador-registrador: os parâmetros de integração devem ser selec-
cionados de modo a obter uma estimativa adequada das áreas.
Recomenda-se um modo de integração entre dois mínimos consecu-
tivos,
— sensibilidade: cerca de 16 vezes superior à atenuação mínima,
— quantidade de solução a injectar: 1ml,
— programação de temperatura: temperatura inicial de 235 ºC durante 6
minutos, aumentando de seguida à razão de 2 ºC/min até atingir
285 ºC,
— injector com divisão de fluxo na proporção 1: 15,
— gás de arrastamento: hélio ou hidrogénio, a uma pressão aproximada
de 120 kPa.
Estas condições podem ser ajustadas em função das características do
cromatógrafo e da coluna, de modo a que, no cromatograma, o pico
correspondente ao padrão interno ocorra a cerca de 5 minutos do tempo
referido em 6.3.2 e tenha uma intensidade equivalente a, pelo menos 80 %
da escala.
Deve proceder-se à verificação do sistema mediante a injecção de uma
mistura de solução-mãe de colestadieno (5.6) e n-nonacosano (5.8). O
pico correspondente ao colesta-3,5-dieno deve surgir antes do pico corres-pondente ao n-nonacosano (veja-se a figura 1c); se tal não suceder, pode
proceder-se de dois modos: reduzir a temperatura do forno ou utilizar
uma coluna de polaridade inferior.
6.3.2. Identificação dos picos
O pico correspondente ao padrão interno surge a cerca de 19 minutos; o
estigmasta-3,5-dieno possui um tempo de retenção relativo de aproxima-
damente 1,29 (veja-se a figura 1b). O estigmasta-3,5-dieno é
acompanhado de pequenas quantidades de um isómero que não origina,
em geral, um pico independente. Todavia, se a coluna possuir uma
elevada polaridade ou um elevado poder de resolução, poderá surgir um1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 85
▼M11
pico pouco intenso imediatamente antes do pico relativo ao estigmasta-
-3,5-dieno (veja-se a figura 2). De modo a assegurar que a eluição dos
estigmastadienos produza um único pico, é aconselhável substituir a
coluna por outra menos polar ou de diâmetro interno superior.
Nota 9.
Pode obter-se um pico de referência para os estigmastadienos através da
aplicação do método para a determinação de hidrocarbonetos esteróides a
óleos vegetais; os estigmastadienos originam um pico característico, facil-
mente identificável.
6.3.3. Análise quantitativa
O teor de estigmastadienos é determinado por recurso à fórmula:mg/kg de estigmastadienos =
As/C2Mc
Ac/C2Mo
em que:Ab= área do pico relativo aos estigmastadienos (ou soma
das áreas dos picos correspondentes aos dois
isómeros, se for caso disso).
Ac= área do pico relativo ao padrão interno (colesta-
dieno).
Mc= massa de padrão adicionada, em microgramas.
Mo= massa de óleo, em gramas.
Limite de detecção: cerca de 0,01 mg/kg.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 86
▼M11
Figura 1
Cromatogramas obtidos na análise de amostras de azeite com uma coluna
capilar de sílica fundida (0,25 mm de diâmetro interno e 25 m de compri-
mento), revestida com uma película de fenilmetilsilicone a 5 % de
0,25 mm de espessura.
a) Primeira fracção (30 ml) de um azeite virgem, adicionda do padrão.
c) Segunda fracção (40 ml) de um azeite contendo 0,10 mg/kg de estig-
mastadienos.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 87
▼M11
d) Segunda fracção (40 ml), contendo uma pequena quantidade da
primeira fracção.
Figura 2
Cromatogramas obtidos na análise de uma amostra de azeite refinado
com uma coluna DB-5, em que se observa o pico correspondente ao
isómero do estigmasta-3,5-dieno.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 88
▼M13
ANEXO XVIII
DETERMINAÇÃO DO TEOR DE TRIACILGLICERÓIS COM NCE42
(DIFERENÇA ENTRE O TEOR OBTIDO POR HPLC E O TEOR
TEÓRICO)
1.Objectivo
Determinação da composição de triacilgliceróis (TAG) em azeites, em
termos do número de átomos de carbono equivalente respectivo, com
base nas diferenças entre os resultados analíticos obtidos por cromato-
grafia líquida de alta resolução (HPLC) e o teor teórico, calculado a
partir da composição de ácidos gordos.
2.Domínio de aplicação
A presente norma aplicável aos azeites. O método é aplicável à
pesquisa de pequenas quantidades de óleos de sementes (ricos em
ácido linoleico) em todas as categorias de azeites.
3.Princípio
Nos azeites puros, o teor de triacilgliceróis com NCE42 determinado
por HPLC e o teor teóretico de triacilgliceróis com NCE42 (calculado
com base na determinação da composição de ácidos gordos por croma-
tografia gás-líquido, CGL) estão em correspondência dentro de certos
limites. Diferenças superiores às indicadas no regulamento para cada
categoria de azeite indicam que o azeite em questão contém óleos de
sementes.
4.Método
O método de cálculo do teor teórico de triacilgliceróis com NCE42 e da
diferença entre este e o valor obtido por HPLC assenta essencialmente
na coordenação de dados analíticos obtidos por outros métodos. Podem
distinguir-se três etapas: determinação da composição de ácidos gordos
por cromatografia gás-líquido em coluna capilar; cálculo da composição
teórica de triacilgliceróis com NCE42; determinação do teor de triacil-
gliceróis com NCE42 por HPLC.
4.1.Aparelhos e utensílios
4.1.1. Balões de fundo redondo de 250 ml e 500 ml.4.1.2. Provetas de 100 ml.
4.1.3. Coluna de vidro para cromatografia com 21 mm de diâmetro interno,
450 mm de comprimento, torneira e extremidade superior cónica
(fêmea) normalizada.
4.1.4. Funis separadores de 250 ml com extremidade inferior cónica (macho)
normalizada adaptável à parte superior da coluna.
4.1.5. Vareta de vidro com 600 mm de comprimento.4.1.6. Funil de vidro com 80 mm de diâmetro.4.1.7. Balões aferidos de 50 ml.4.1.8. Pipetas aferidas de 20 ml.
4.1.9. Evaporador rotativo.
4.1.10. Cromatógrafo de HPLC com controlo termostático da temperatura da
coluna.
4.1.11. Seringas de injecção para tomas de 10 µl.
4.1.12. Detector: refractómetro diferencial. A sensibilidade mínima é de 10
−4
unidades de índice de refracção em toda a escala.
4.1.13. Coluna: tubo de aço inoxidável com 250 mm de comprimento e 4,5 mm
de diâmetro interno com um enchimento de partículas de sílica com 5
µm de diâmetro e 22 % a 23 % de carbono, na forma de octadecilsilano
(nota 2).
4.1.14. Registador e/ou integrador.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 89
▼M13
4.2.Reagentes
Os reagentes devem ser de qualidade analítica. Os solventes de eluição
devem estar isentos de gases e podem ser reciclados várias vezes sem
prejuízo para as separações.
4.2.1. Éter de petróleo, 40 ºC-60 ºC, para cromatografia.
4.2.2. Éter etílico recentemente destilado, isento de peróxidos.
4.2.3. Solvente e eluição para cromatografia en coluna de vidro: mistura
87+13 (v/v) de éter de petróleo e éter etílico.
4.2.4. Sílica-gel com granulometria de 70 a 230 mesh, tipo Merck 7734, com
teor de água normalizado de 5 % (m/m).
4.2.5. Fibra de vidro.4.2.6. Acetona.4.2.7. Acetonitrilo.4.2.8. Solvente de eluição para HPLC: mistura de acetonitrilo e acetona numa
proporção a ajustar em função da separação pretendida (començar com
uma mistura 50 + 50).
4.2.9. Solvente de solubilização: acetona.4.2.10. Triacilgliceróis de referência: podem utilizar-se triacilgliceróis exis-
tentes no mercado (tripalmitina, trioleína, etc.), caso em que se
representarão os tempos de retenção em função do número de atómos
de carbono equivalente, ou, em alternativa, cromatogramas de
referência obtidos para o oléo de soja, uma mistura 30 + 70 de óleo
de soja e azeite e azeite puro (ver as notas 3 e 4 e as figuras 1, 2, 3 e
4).
4.3.Preparação das amostras
Dado que há varias substâncias interferentes que podem produzir falsos
positivos, as amostras devem ser sempre purificadas de acordo com o
método IUPAC 2507, utilizado para a determinação de substâncias
polares em óleos oxidados.
4.3.1. Preparação da coluna cromatográfica
Encher a coluna (4.1.3) com cerca de 30 ml de solvente de eluição
(4.2.3). Introduzir um pouco de fibra de vidro (4.2.5), empurrando-a
até ao fundo com a vareta de vidro (4.1.5).
Preparar, numa proveta de 100 ml, uma suspensão de 25 g de sílica-gel
(4.2.4) em 80 ml da mistura de eluição (4.2.3). Transferir a suspensão
para a coluna utilizando o funil de vidro (4.1.6).
Para garantir a transferência completa do sílica-gel para a coluna, lavar
várias vezes a proveta com a mistura de eluição e transferir o líquido de
lavagem para a coluna.
Abrir a torneira da coluna e deixar escoar o solvente de eluição até que
o nível deste desça até 1 cm acima do enchimento de sílica-gel.
4.3.2. Cromatografia em coluna
Num balão aferido de 50 ml (4.1.7), pesar, com a precisão de 0,001 g,
2,5 ± 0,1 g de azeite filtrado, homogeneizado e, se necessário, desidra-
tado. Diluir com cerca de 20 ml de solvente de eluição (4.2.3). Se
necessário, aquecer ligeiramente para facilitar a dissolução. Arrefecer
até à temperatura ambiente e completar o volume com solvente de
eluição.
Com uma pipeta aferida, introduzir 20 ml da solução na coluna, prepa-
rada conforme descrito no ponto 4.3.1. Abrir a torneira e eluir o
solvente até atingir o nível do enchimento de sílica-gel.
Proceder em seguida a uma eluição com 150 ml de solvente de eluição
(4.2.3), regulando o caudal para aproximadamente 2 ml/minuto (de
modo que os 150 ml passem pela coluna em 60 a 70 minutos). Recolher
o eluata num balão de fundo redondo de 250 ml (4.1.1) previamente
tarado em estufa e pesado com exactidão. Eliminar o solvente a pressão
reduzida (Rotavapor) e pesar o resíduo, com o qual se prepararão a
solução a analisar por HPLC e os ésteres metílicos.
No caso das categorias azeite virgem extra, azeite virgem, azeite refi-
nado e azeite, a recuperação da amostra depois da passagem na coluna1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 90
▼M13
deve ser, pelo menos, de 90 %; no caso do azeite lampante e do óleo de
bagaço de azeitona, deve ser, no mínimo, de 80 %.
4.4.Análise por HPLC
4.4.1. Preparação das amostras para a análise cromatográfica
Prepara-se uma solução a 5 % da amostra a analisar pesando uma toma
de 0,5 g ± 0,001 g da amostra num balão aferido de 10 ml e comple-
tando o volume até 10 ml com o solvente de solubilização (4.2.9).
4.4.2. Técnica
Preparar o sistema cromatográfico para ser utilizado. Proceder à purga
total do sistema por bombagem de solvente de eluição (4.2.8) ao caudal
de 1,5 ml/minuto. Aguardar até ser obtida uma linha de base estável.
Injectar 10 µl de amostra, preparada conforme descrito no ponto 4.3.
4.4.3. Cálculo e expressão dos resultados
Utiliza-se o método da normalização interna, isto é, considera-se que a
soma das áreas dos picos correspondentes aos triacilgliceróis com
NCE42 a 52 é igual a 100 %. A percentagem relativa de cada triacilgli-
cerol é calculada pela seguinte fórmula:
% do triacilglicerol = área do pico × 100 / soma das áreas dos picosOs resultados devem ter, pelo menos, duas casas decimais.
Nota 1: A ordem de eluição pode se determinada calculando o número
de átomos de carbono equivalente (NCE), normalmente definidos pela
relação NCE = NC-2n, em que NC representa o número de atómos de
carbono e n o número de ligações duplas (pode ser calculado com
maior precisão tendo em conta a origem das ligações duplas). Se n
o,nlenlnrepresentarem o número de ligações duplas atribuído, respectiva-
mente, aos ácidos oleico, linoleico e linolénico, o número de átomos
de carbono equivalente poderá ser calculado através da seguinte
fórmula:
ECN = CN − dono−dlnl−dlnnln
na qual os coeficientes do,dledlnpodem ser calculados a partir dos
triacilgliceróis de referência. Nas condições especificadas no presente
método, a relação obtida deve aproximar-se da seguinte:
NCE = NC − (2,60. no) − (2,35. nl) − (2,17. nln)
Nota 2:Exemplos: Lichrosorb(Merck) RP18, art. 50333;
Lichrosphere (Merck) 100 CH18, art. 50377, ou
equivalente.
Nota 3:Com vários triacilgliceróis de referência, também é possível
calcular a resolução em relação à trioleína:
α= tr' / trtrioleína
utilizando para o efeito o tempo de retenção reduzido, tr' = tr − trsolvente.
A representação gráfica de log αem função de f (número de ligações
duplas) permite determinar os parâmetros de retenção de cada um dos
triacilgliceróis de ácidos gordos presentes nos triacilgliceróis de
referência — ver a figura 2.
Nota 4: A eficiência da coluna deve permitir uma separação nítada
entre o pico a trilinoleína e os picos dos triacilgliceróis com tr próximo.
A eluição prosseguirá até ao pico correspondente a NCE 52.
Nota 5: Para se poderem medir correctamente as áreas de todos os
picos de interesse para a determinação, é necessário que a intensidade
do segundo pico correspondente a NCE50 seja igual a 50 % do máximo
da escala do registador.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 91
▼M13
4.5.Cálculo da composição de triacilgliceróis (% molar) com base nos
dados obtidos para os ácidos gordos por CGL (áreas expressas em
percentagem)
4.5.1. Determinação da composição de ácidos gordos
A composição de ácidos gordos é determinada pelo método CEE de
cromatografia em fase gasosa descrito no anexo X A do Regulamento
(CEE) n.o2568/91, utilizando para o efeito uma coluna capilar e prepa-
rando os ésteres metílicios por aplicação do método descrito no anexo
X B do mesmo regulamento (reacção com metilato de sódio em solução
alcoólica).
4.5.2. Ácidos gordos tidos em conta nos cálculos
Os acilgliceróis são agrupados em função do número de átomos de
carbono equivalente (NCE) com base nas relações entre os NCE e os
ácidos gordos a seguir indicadas. Só são tidos em conta os ácidos
gordos com 16 ou 18 átomos de carbono, os únicos com interesse no
caso dos azeites.
Ácido gordo (AG) AbreviaturaPeso mole-
cular (PM)NCE
Ácido palmítico P 256,4 16
Ácido palmitoleico Po 254,4 14Ácido esteárico S 284,5 18Ácido oleico O 282,5 16Ácido linoleico L 280,4 14Ácido linolénico Ln 278,4 12
4.5.3. Conversão em moles da percentagem corres pondente a cada
área para todos os ácidos gordos
moles de P ¼
%d a
´area de P
PM de Pmoles de S ¼%d a
´area de S
PM de Smoles de Po ¼%d a
´area de Po
PM de Po/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(1)
moles de O ¼%d a
´area de O
PM de Omoles de L ¼%d a
´area de L
PM de Lmoles de Ln ¼%d a
´area de Ln
PM de Ln
4.5.4. Normalização dos ácidos gordos a 100 %
% molar de P 1 ;2;3 ðÞ ¼moles de P /C3100
moles de P þSþPoþOþLþLn ðÞ/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(2)% molar de S 1 ;2;3 ðÞ ¼
moles de S /C3100
moles de P þSþPoþOþLþLn ðÞ
% molar de Po 1 ;2;3 ðÞ ¼moles de Po /C3100
moles de P þSþPoþOþLþLn ðÞ
% molar de O 1 ;2;3 ðÞ ¼moles de O /C3100
moles de P þSþPoþOþLþLn ðÞ
% molar de L 1 ;2;3 ðÞ ¼moles de L /C3100
moles de P þSþPoþOþLþLn ðÞ
% molar de Ln 1 ;2;3 ðÞ ¼moles de Ln /C3100
moles de P þSþPoþOþLþLn ðÞ
O resultato indica a percentagem molar de cada ácido gordo em todos
as posições (1,2,3) dos TAG.
Calcula-se a seguir o somatório dos ácidos gordos saturados P e S
(AGS) e dos ácidos gordos insaturados Po, O, L e Ln (AGI):
% molar de AGS = % molar de P + % molar de S/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C150(3)% molar de AGI = 100 − % molar de AGS1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 92
▼M13
4.5.5. Cálculo da composição de ácidos gordos nas posições 2 e
1,3 dos TAG
Os ácidos gordos são distribuídos por três grupos do seguinte modo:
dois grupos idênticos para as posições 1 e 3 e um grupo para a posição
2, com coeficientes diferentes para os ácidos saturados (P e S) e insatu-
rados (Po, O, L e Ln).
4.5.5.1. Ácidos gordos saturados na posição 2 [P(2) e S(2)]
% molar de P(2) = % molar de P (1,2,3) * 0,06/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C150(4)% molar de S(2) = % molar de S (1,2,3) * 0,06
4.5.5.2. Ácidos gordos insaturados na posição 2 [Po(2), O(2), L(2) e Ln(2)]:
% molar de Po 2 ðÞ ¼% molar
Po 1 ;2;3 ðÞ
% molar
de AGI/C3100/C0% molar de P 2 ðÞ /C0% molar de S 2 ðÞ ½/C138/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(5)% molar O 2 ðÞ ¼
% molar
de O 1 ;2;3 ðÞ
% molar
de AGI/C3100/C0% molar de P 2 ðÞ /C0% molar de S 2 ðÞ ½/C138
% molar de L 2 ðÞ ¼% molar
de L 1 ;2;3 ðÞ
% molar
de AGI/C3100/C0% molar de P 2 ðÞ /C0% molar de S 2 ðÞ ½/C138
% molar de Ln 2 ðÞ ¼% molar
de Ln 1 ;2;3 ðÞ
% molar
de AGI/C3100/C0% molar de P 2 ðÞ /C0% molar de S 2 ðÞ ½/C138
4.5.5.3. Ácidos gordos nas posições 1,3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3) O(1,3), L(1,3) e
Ln(1,3)]:
% molar de P 1 ;3ðÞ ¼% molar de P 1 ;2;3 ðÞ /C0
% molar de P 2 ðÞ
2þ% molar de P 1 ;2;3 ðÞ/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(6)% molar de S 1 ;3ðÞ ¼
% molar de S 1 ;2;3 ðÞ /C0
%molar de S 2 ðÞ
2þ% molar de S 1 ;2;3 ðÞ
% molar de Po 1 ;3ðÞ ¼% molar de Po 1 ;2;3 ðÞ /C0
% molar de Po 2 ðÞ
2þ% molar de Po 1 ;2;3 ðÞ
% molar de O 1 ;3ðÞ ¼% molar de O 1 ;2;3 ðÞ /C0
% molar de O 2 ðÞ
2þ% molar de O 1 ;2;3 ðÞ
% molar de L 1 ;3ðÞ ¼% molar L 1 ;2;3 ðÞ /C0
% molar de L 2 ðÞ
2þ% molar de L 1 ;2;3 ðÞ
% molar de Ln 1 ;3ðÞ ¼% molar de Ln 1 ;2;3 ðÞ /C0
% molar de Ln 2 ðÞ
2þ% molar de Ln 1 ;2;3 ðÞ1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 93
▼M13
4.5.6. Cálculos relativos aos triacilgliceróis
4.5.6.1. TAG com um único ácido gordo (AAA, neste caso LLL, PoPoPo)
% molar de AAA ¼% molar de A 1 ;3ðÞ /C3 % molar de A 2 ðÞ/C3% molar de A 1 ;3ðÞ
10000(7)
4.5.6.2. TAG com dois ácidos gordos (AAB, neste caso PoPoL, PoLL)
% molar de AAB ¼% molar de A 1 ;3ðÞ /C3 % molar de A 2 ðÞ /C3
% molar de B 1 ;3ðÞ /C22
10000/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(8)
% molar de ABA ¼% molar de A 1 ;3ðÞ /C3% molar de B 2 ðÞ /C3
% molar de A 1 ;3ðÞ
10000
4.5.6.3. TAG com três ácidos gordos diferentes (ABC, neste caso OLLn, PLLn,
PoOLn, PPoLn)
% molar de ABC ¼% molar de A 1 ;3ðÞ /C3 % molar de B 2 ðÞ /C3
% molar de C 1 ;3ðÞ /C22
10000/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C150(9)% molar de BCA ¼
% molar de B 1 ;3ðÞ /C3% molar de C 2 ðÞ/C3
% molar de A 1 ;3ðÞ /C22
10000
% molar de CAB ¼% molar de C 1 ;3ðÞ /C3 % molar de A 2 ðÞ /C3
% molar de B 1 ;3ðÞ /C22
10000
4.5.6.4. Triacilgliceróis com NCE42
Procede-se aos cálculos relativos aos triacilgliceróis seguintes com
NCE42 com base nas equações 7, 8 e 9 por ordem de eluição esperada
em HPLC (normalmente, evidenciam-se apenas três picos).
LLLPoLL e o isómero posicional LPoLOLLn e os isómeros posicionais OLnL e LnOLPoPoL e o isómero posicional PoLPoPoOLn e os isómeros posicionais OPoLn e OLnPoPLLn e os isómeros posicionais LLnP e LnPLPoPoPoSLnLn e o isómero posicional LnSLn
PPoLn e os isómeros posicionais PLnPo e PoPLn
Os triacilgliceróis com NCE42 são dados pelo somatório dos nove tria-
cilgliceróis acima, incluindo os respectivos isómeros posicionais. Os
resultados devem ter, pelo menos, duas casas decimais.
5.Avaliação dos resultados
Comparam-se o teor teórico calculado e o teor determinado por HPLC.
Se a diferença «teor determinado por HPLC — teor teórico calculado»
exceder os valores indicados no regulamento para a categoria de azeite
em questão, conclui-se que a amostra contém óleos de sementes.
Nota:Os resultados são apresentados com uma casa decimal.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 94
▼M13
6.Exemplo (Os números dos pontos correspondem aos do texto descritivo
do método)
4.5.1. Cálculo da percentagem molar dos ácidos gordos a partir de
dados de CGL (percentagem) correspondente a cada área)
Pelo método de CGL, obtiveram-se os dados seguintes para a compo-
sição de ácidos gordos:
AG
PMP
256,4S
284,5Po
254,4O
282,5L
280,4Ln
278,4
% da área 10,0 3,0 1,0 75,0 10,0 1,0
4.5.3. Conversão em moles da percentagem correspondentes a
cada área para todos os ácidos gordos
moles de P ¼10
256 ;4¼0;03900 moles de P Ver a fórmula (1)
moles de S ¼3
284 ;5¼0;01054 moles de S Ver a fórmula (1)
moles de Po ¼1
254 ;4¼0;00393 moles de Po Ver a fórmula (1)
moles de O ¼75
282 ;5¼0;26549 moles de O Ver a fórmula (1)
moles de L ¼10
280 ;4¼0;03566 moles de L Ver a fórmula (1)
moles de Ln ¼1
278 ;4¼0;00359 moles de Ln Ver a fórmula (1)
Somatório = 0,35822 moles de TAG
4.5.4. Normalização dos ácidos gordos a 100 %
% molar de P 1 ;2;3 ðÞ ¼0;03900 moles de P /C3100
0;35822 moles¼10;888 % Ver a fórmula (2)
% molar de S 1 ;2;3 ðÞ ¼0;01054 moles de S /C3100
0;35822 moles¼2;944 % Ver a fórmula (2)
% molar de Po 1 ;2;3 ðÞ ¼0;00393 moles de Po /C3100
0;35822 moles¼1;097 % Ver a fórmula (2)
% molar de O 1 ;2;3 ðÞ ¼0;26549 moles de O /C3100
0;35822 moles¼74;113 % Ver a fórmula (2)
% molar de L 1 ;2;3 ðÞ ¼0;03566 moles de L /C3100
0;35822 moles¼9;956 % Ver a fórmula (2)
% molar de Ln 1 ;2;3 ðÞ ¼0;00359 moles de Ln /C3100
0;35822 moles¼1;003 % Ver a fórmula (2)
Total da percentagem molar = 100,0 %
Somatório dos ácidos gordos saturados e insaturados nas posições 1,2,3
dos TAG:
% molar de AGS = 10,888 % + 2,944 % = 13,831 % Ver a fórmula (3)
% molar de AGI = 100,000 % − 13,831 % = 86,169 % Ver a fórmula (3)1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 95
▼M13
4.5.5. Cálculo da composição de ácidos gordos nas posições 2 e
1,3 dos TAG
4.5.5.1. Ácidos gordos saturados na posição 2 [P(2) e S(2)]
% molar de P(2) = 10,888 % * 0,06 = 0,653 % Ver a fórmula (4)
% molar de S(2) = 2,944 % * 0,06 = 0,177 % Ver a fórmula (4)
4.5.5.2. Ácidos gordos insaturados nas posições 1,3 [Po(1,3), O(1,3), L(1,3) e
Ln(1,3)]
% molar de Po 2 ðÞ ¼1;097 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 1;263 % Ver a fórmula (5)
% molar de O 2 ðÞ ¼74;113 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 85;295 % Ver a fórmula (5)
% molar de L 2 ðÞ ¼9;956 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 11;458 % Ver a fórmula (5)
% molar de Ln 2 ðÞ ¼1;003 %
86;169 %/C3100/C0/C00;659/C00;177 ðÞ ¼ 1;154 % Ver a fórmula (5)
4.5.5.3. Ácidos gordos nas posições 1,3 [P(1,3), S(1,3), Po(1,3), O(1,3), L(1,3) e
Ln(1,3)]
% molar de P 1 ;3ðÞ ¼10;888/C00;659
210;888¼16;005 % Ver a fórmula (6)
% molar de S 1 ;3ðÞ ¼2;944/C00;177
22;944¼4;327 % Ver a fórmula (6)
% molar de Po 1 ;3ðÞ ¼1;097/C01;263
21;097¼1;015 % Ver a fórmula (6)
% molar de O 1 ;3ðÞ ¼74;113/C085;295
274;113¼68;522 % Ver a fórmula (6)
% molar de L 1 ;3ðÞ ¼9;956/C011;458
29;956¼9;205 % Ver a fórmula (6)
% molar de Ln 1 ;3ðÞ ¼1;003/C01;154
21;003¼0;927 % Ver a fórmula (6)
4.5.6. Cálculos relativos aos triacilgliceróis
A partir da composição calculada de ácidos gordos nas posições 2 e 1,3
(ver acima)
AG na posição 1,3 na posição 2
P 16,005 % 0,653 %
S 4,327 % 0,177 %
Po 1,015 % 1,263 %
O 68,522 % 85,295 %L 9,205 % 11,458 %Ln 0,927 % 1,154 %
Somatório 100,0 % 100,0 %
procede-se aos cálculos relativos aos seguintes triacilgliceróis:
LLL
PoPoPoPoLL com um isómero posicional1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 96
▼M13
SLnLn com um isómero posicional
PoPoL com um isómero posicional
PPoLn com dois isómeros posicionais
OLLn com dois isómeros posicionais
PLLn com dois isómeros posicionais
PoOLn com dois isómeros posicionais
4.5.6.1. TAG com um único gordo (LLL, PoPoPo) Ver a fórmula (7)
% molar de LLL ¼9;205 % /C311;458 % /C39;205 %
10000= 0,09708 em moles de LLL
% molar de PoPoPo ¼1;015 % /C31;263 % /C31;015 %
10000= 0,00013 em moles de PoPoPo
4.5.6.2. TAG com dois ácidos gordos (PoLL, SLnLn, PoPoL) Ver a fórmula (8)
% molar de PoLL þLLPo ¼1;015 % /C311;458 % /C39;205 % /C32
10000= 0,02141
% molar de LPoL ¼9;205 % /C31;263 % /C39;205 %
10000= 0,01070
0,03211 (em moles
de PoLL)
% molar de SLnLn þLnLnS ¼4;327 % /C31;154 % /C30;927 % /C32
10000= 0,00093
% molar de LnSLn ¼0;927 % /C30;177 % /C30;927 %
10000= 0,00002
0,00095 (em moles
de SLnLn)
% molar de PoPoL þLPoPo ¼1;015 % /C31;263 % /C39;205 % /C32
10000= 0,00236
% molar de PoLPo ¼1;015 % /C311;458 % /C31;015 %
10000= 0,00118
0,00354 (em moles
de PoPoL)
4.5.6.3. TAG com três ácidos gordos diferentes (PoPLn, OLLn, PLLn, PoOLn)
Ver a fórmula (9)
% molar de PPoLn ¼16;005 % /C31;263 % /C30;927 % /C32
10000= 0,00375
% molar de LnPPo ¼0;927 % /C30;653 % /C31;015 % /C32
10000= 0,00012
% molar de PoLnP ¼1;015 % /C31;154 % /C316;005 % /C32
10000= 0,00375
0,00762 (em moles de
PPoLn)
% molar de OLLn ¼68;522 % /C311;458 % /C30;927 % /C32
10000= 0,14577
% molar de LnOL ¼0;927 % /C385;295 % /C39;205 % /C32
10000= 0,14577
% molar de LLnO ¼9;205 % /C31;154 % /C368;522 % /C32
10000= 0,14577
0,43671 (em moles de
OLLn)
% molar de PLLn ¼16;005 % /C311;458 % /C30;927 % /C32
10000= 0,03400
% molar de LnPL ¼0;927 % /C30;653 % /C39;205 % /C32
10000= 0,001111991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 97
▼M13
% molar de LLnP ¼9;205 % /C31;154 % /C316;005 % /C32
10000 = 0,03400
0,06911 (de moles de
PLLn)
% molar de PoOLn ¼1;015 % /C385;295 % /C30;927 % /C32
10000= 0,01605
% molar de LnPoO ¼0;927 % /C31;263 % /C368;522 % /C32
10000= 0,01605
% molar de OLnPo ¼68;522 % /C31;154 % /C31;015 % /C32
10000= 0,01605
0,04815 (em moles de
PoOLn)
NCE42=0,69540 (em moles de
TAG)1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 98
▼M14
Figura1: Gráfico de log αem função de f (número de duplas ligações)
Nota:La: ácido láurico; My: ácido mirístico; P: ácido palmítico; St:
ácido oleico; O: ácido oleico; L: ácido linoleico; Ln: ácido lino-
lénico.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 99
▼M14
Figura 2: Óleo de soja
Figura 3: Óleo de soja / azeite 30/70
1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 100
▼M14
Figura 4: Azeite
1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 101
▼M19
ANEXO XIX
DETERMINAÇÃO DOS TEORES DE ÁLCOOIS ALIFÁTICOS POR
CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA EM COLUNACAPILAR
1. OBJECTIVO
O método descreve um processo de determinação dos teores de álcoois
alifáticos, individuais e totais, das matérias gordas.
2. PRINCÍPIO
Saponificação da matéria gorda, adicionada de 1-eicosanol como padrão
interno, com uma solução etanólica de hidróxido de potássio; extracção
do insaponificável com éter etílico. Separação da fracção alcoólica, do
extracto insaponificável, por cromatografia em camada fina de sílica-gel
básico; transformação dos álcoois separados no sílica-gel em éteres
trimetilsilílicos e análise destes por cromatografia em fase gasosa em
coluna capilar.
3. APARELHOS E UTENSÍLIOS
3.1. Balão de 250 ml de fundo redondo, equipado com um refrigerante de
refluxo com juntas esmeriladas.
3.2. Ampola de decantação de 500 ml.3.3. Balões de 250 ml de fundo redondo.3.4. Equipamento completo para cromatografia em camada fina, com placas
de vidro de 20 cm × 20 cm.
3.5. Lâmpada de ultravioleta, de comprimento de onda de 366 nm ou
254 nm.
3.6. Microsseringas de 100 µl e 500 µl.
3.7. Cadinho filtrante, com filtro de porosidade G3 (poros de 15 µma
40µm), cerca de 2 cm de diâmetro e cerca de 5 cm de altura, próprio
para filtração sobvazio, com junta esmerilada macho 12/21.
3.8. Kitasato de 50 ml com junta esmerilada fêmea 12/21, adaptável ao
cadinho filtrante (3.7).
3.9. Tubo de fundo cónico, de 10 ml, com rolha hermética.
3.10. Cromatógrafo de fase gasosa adequado para colunas capilares, com
sistema de fraccionamento, constituído por:
3.10.1. Bloco (forno) termostatizado para a coluna, que permita manter a
temperatura desejada com uma precisão de cerca de 1 ºC.
3.10.2. Câmara de injecção de temperatura regulável, com elemento vapori-
zador de vidro silanizado.
3.10.3. Detector de ionização de chama e conversor-amplificador.3.10.4. Registador-integrador próprio para funcionar com o conversor-amplifi-
cador, com tempo de resposta não superior a 1 s e velocidade do
papel variável.
3.11. Coluna capilar de vidro ou de sílica fundida, com 20 m a 30 m de
comprimento e 0,25 mm a 0,32 mm de diâmetro interno, revestida inte-
riormente com um filme líquido uniforme de SE-52 ou SE-54 ou
equivalente, de espessura compreendida entre 0,10 µm e 0,30 µm.
3.12. Microsseringa de 10 µl para cromatografia em fase gasosa, com agulha
cementada.
3.13. Balança de precisão com 1 mg de sensibilidade (leituras em décimas de
miligrama).
4. REAGENTES
4.1. Solução etanólica aproximadamente 2 N de hidróxido de potássio:
dissolver, com arrefecimento, 130 g de hidróxido de potássio (pureza
mínima: 85 %) em 200 ml de água destilada; completar o volume até
um litro com etanol. A solução conserva-se em garrafas de vidro escuro
bem fechadas.
4.2. Éter etílico puro, pro analise .1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 102
▼M19
4.3. Sulfato de sódio anidro puro, pro analise .
4.4. Placas de vidro revestidas de sílica-gel, sem indicador de fluorescência,
com 0,25 mm de espessura (disponíveis no comércio prontas a utilizar).
4.5. Solução etanólica 0,2 N de hidróxido de potássio: dissolver 13 g de
hidróxido de potássio em 20 ml de água destilada; completar o volume
até um litro com etanol.
4.6. Benzeno para cromatografia (ver 5.2.2).4.7. Acetona para cromatografia (ver 5.2.2).4.8. Hexano para cromatografia (ver 5.2.2).4.9. Éter etílico para cromatografia (ver 5.2.2).4.10. Clorofórmio para cromatografia.4.11. Solução de referência para a cromatografia em camada fina: solução a
0,5 % de colesterol ou fitosterol em clorofórmio.
4.12. Solução etanólica a 0,2 % de 2 ′,7′-diclorofluoresceína. Adicionar
algumas gotas da solução alcoólica 2 N de hidróxido de potássio para
tornar a solução ligeiramente básica.
4.13. Piridina anidra para cromatografia.4.14. Hexametildissilazano.4.15. Trimetilclorossilano.4.16. Solução-padrão de éteres trimetilsilílicos dos álcoois alifáticos C
20aC28.
A preparar, a partir de misturas de álcoois puros, no momento da utili-
zação.
4.17. Solução a 0,1 % (m/v) de 1-eicosanol em clorofórmio (padrão interno).4.18. Gás vector: hidrogénio ou hélio puros, para cromatografia em fase
gasosa.
4.19. Gás auxiliar: azoto puro, para cromatografia em fase gasosa.
5. TÉCNICA5.1.Preparação do insaponificável
5.1.1. Introduzir no balão de 250 ml de fundo redondo, com a microsseringa
de 500 µl, um volume da solução a 0,1 % de 1-eicosanol em cloro-
fórmio (4.17) que contenha uma quantidade de 1-eicosanol
correspondente a cerca de 10 % do teor de álcoois alifáticos da alíquota
da amostra a tomar para a determinação. Por exemplo, para uma toma
de 5 g de amostra, juntar 250 µl da solução a 0,1 % de 1-eicosanol, se
se tratar de azeite, ou 1 500 µl, se se tratar de óleo de bagaço de azei-
tona.
Evaporar em corrente de azoto até à secura e, em seguida, pesar quan-
titativamente uma toma de 5 g de amostra seca e filtrada para o mesmo
balão.
5.1.2. Juntar 50 ml da solução etanólica 2 N de hidróxido de potássio e
adaptar o refrigerante de refluxo; aquecer em banho-maria até ebulição
ligeira, mantendo sobagitação contínua até se produzir a saponificação
(a solução fica límpida). Continuar o aquecimento durante 20 minutos,
juntar 50 ml de água destilada (pela parte superior do refrigerante),
retirar o refrigerante e arrefecer o balão a cerca de 30 ºC.
5.1.3. Transferir quantitativamente o conteúdo do balão para uma ampola de
decantação de 500 ml, utilizando várias porções de água destilada, num
total de aproximadamente 50 ml. Juntar cerca de 80 ml de éter etílico,
agitar energicamente durante cerca de 30 s e deixar que a separação se
faça (nota 1).
Separar a fase aquosa (inferior), recolhendo-a noutra ampola de decan-
tação. Efectuar mais duas extracções da fase aquosa, da mesma forma,
utilizando de cada vez 60 ml a 70 ml de éter etílico.
Nota 1:As eventuais emulsões podem ser eliminadas juntando, com
um esguicho, uma pequena quantidade de álcool etílico ou
metílico.
5.1.4. Reunir os extractos etéreos numa ampola de decantação e lavar com
água destilada (50 ml de cada vez), até reacção neutra da água de
lavagem.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 103
▼M19
Eliminar a água de lavagem, secar com sulfato de sódio anidro e filtrar
para um balão de 250 ml previamente tarado, lavando a ampola e o
filtro com pequenas quantidades de éter etílico e recolhendo o líquido
de lavagem no balão.
5.1.5. Destilar o éter até restar apenas uma pequena quantidade e, em seguida,
levar à secura sobvazio ligeiro ou em corrente de azoto; completar a
secagem em estufa a 100 ºC durante cerca de 15 minutos e pesar após
arrefecimento em exsicador.
5.2.Separação da fracção alcoólica
5.2.1. Preparação das placas básicas: imergir completamente as placas de
sílica-gel (4.4), durante 10 s, na solução etanólica 0,2 N de hidróxido
de potássio (4.5); retirar as placas e deixá-las secar bem, debaixo de
um exaustor, durante duas horas; em seguida, colocar as placas na
estufa, a 100 ºC, durante uma hora.
Retirar as placas da estufa e conservá-las num exsicador com cloreto de
cálcio até ao momento da utilização (devem ser utilizadas no prazo de
15 dias).
Nota 2:A utilização de placas de sílica-gel básico para a separação da
fracção alcoólica torna desnecessário o tratamento do insaponi-
ficável com alumina. Deste modo, todos os compostos ácidos
(ácidos gordos e outros) ficam retidos na linha de partida. As
bandas dos álcoois alifáticos e dos álcoois terpénicos ficam
nitidamente separadas da banda dos esteróis.
5.2.2. Introduzir na cuba de revelação uma mistura 65/35 (v/v) de hexano e
éter etílico até cerca de 1 cm de altura (*).
Fechar a cuba com uma tampa adequada e deixar em repouso durante,
pelo menos, meia hora, para que se estabeleça o equilíbrio líquido-
-vapor. Podem fixar-se nas superfícies internas da cuba folhas de papel
de filtro mergulhadas no eluente; esta precaução permite reduzir o
tempo de revelação em cerca de um terço e obter uma eluição mais
uniforme dos componentes.
Nota 3:Para que as condições de eluição sejam perfeitamente repro-
dutíveis, a mistura deve ser mudada em cada ensaio.
5.2.3. Preparar uma solução aproximadamente 5 % do insaponificável (5.1.5)
em clorofórmio e, com a microsseringa de 100 µl, depositar na placa
cromatográfica (5.2.1), a aproximadamente 2 cm do bordo, 0,3 ml dessa
solução, numa linha contínua, o mais fina e uniforme possível. No
alinhamento da linha de partida depositar, numa das extremidades da
placa, 2 µla3 µl da solução de referência de álcoois alifáticos (4.11),
para identificação da banda dos álcoois alifáticos no final da revelação.
5.2.4. Colocar a placa na cuba de revelação, preparada como descrito em
5.2.2. A temperatura ambiente deve ser mantida entre 15 ºC e 20 ºC.
Tapar imediatamente a cuba e deixar eluir até que a frente de solvente
chegue a cerca de 1 cm do bordo superior da placa.
Retirar a placa da cuba de revelação e evaporar o solvente numa
corrente de ar quente ou secar a placa debaixo de um exaustor durante
algum tempo.
5.2.5. Pulverizar a placa, ligeira e uniformemente, com a solução de 2 ′,7′-
-diclorofluoresceína e observar à luz ultravioleta. Identificar a banda
dos álcoois alifáticos pelo alinhamento com a banda obtida com a
solução de referência; com um lápis preto, delimitar o conjunto consti-
tuído pela banda dos álcoois alifáticos e pela banda imediatamente
superior, correspondente aos álcoois terpénicos.
Nota 4:A banda dos álcoois alifáticos e a banda dos álcoois terpénicos
são agrupadas tendo em vista uma possível migração de alguns
álcoois alifáticos para a banda dos álcoois terpénicos.
5.2.6. Raspar com uma espátula metálica o sílica-gel da zona delimitada.
Introduzir o material retirado, finamente triturado, no cadinho filtrante
(3.7), juntar 10 ml de clorofórmio quente, misturar cuidadosamente
com a espátula metálica e filtrar sobvazio; recolher o filtrado no kita-
sato (3.8) ligado ao cadinho filtrante.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 104
(*) Em determinados casos, pode ser necessário utilizar uma mistura 95/5 (v/v) de
benzeno e acetona para obter uma boa separação de bandas.
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Lavar o resíduo do cadinho filtrante, por três vezes, com éter etílico
(cerca de 10 ml de cada vez) e recolher de novo o filtrado no kitasato
adaptado ao cadinho. Evaporar o filtrado até obter um volume de 4 ml
a 5 ml, transferir a solução residual par ao tubo de 10 ml (3.9), previa-
mente tarado, e levar à secura por aquecimento suave sobligeira
corrente de azoto; juntar algumas gotas de acetona, voltar a levar à
secura e colocar durante cerca de 10 minutos na estuda, a 105 ºC;
deixar arrefecer em exsicador e pesar.
O resíduo contido no tubo é constituído pela fracção alcoólica.
5.3.Preparação dos éteres trimetilsilílicos
5.3.1. No tubo que contém a fracção alcoólica, juntar o reagente de sililação,
constituído por uma mistura 9 + 3 + 1 (v/v/v/) de piridina, hexametil-
dissilazano e trimetilclorossilano (nota 5), na proporção de 50 µl por
miligrama de álcoois alifáticos, evitando qualquer absorção de humi-
dade (nota 6).
Nota 5:Existem no comércio soluções prontas a utilizar; encontram-se
também outros reagentes silanizantes, como o
bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida + 1 % de trimetilclorossi-
lano, a diluir num volume igual de piridina anidra.
Nota 6:A ligeira opalescência eventualmente formada é normal e não
provoca interferências. A formação de um floculado branco ou
o aparecimento de uma coloração rosa indicam a presença de
humidade ou deterioração do reagente. Nesse caso, a análise
deve ser repetida.
5.3.2. Tapar o tubo e agitar cuidadosamente (sem virar) até à solubilização
completa dos álcoois alifáticos. Deixar repousar durante, pelo menos,
15 minutos, à temperatura ambiente, e depois centrifugar durante alguns
minutos; a solução límpida está pronta para ser analisada por cromato-
grafia em fase gasosa.
5.4.Análise por cromatografia em fase gasosa
5.4.1. Operações preliminares, condicionamento da coluna
5.4.1.1. Instalar a coluna no cromatógrafo de fase gasosa, ligando a extremidade
de entrada ao injector, ligado ao sistema de fraccionamento, e a extre-
midade da saída ao detector. Efectuar uma verificação geral do
conjunto de cromatografia em fase gasosa (hermeticidade dos circuitos
gasosos, eficácia do detector, eficácia do sistema de fraccionamento e
do sistema de registo, etc.).
5.4.1.2. Se a coluna for utilizada pela primeira vez, é aconselhável proceder ao
seu condicionamento. Para o efeito, passar um ligeiro fluxo gasoso pela
coluna. Ligar, em seguida, o conjunto de cromatografia em fase gasosa
e aquecer gradualmente, até atingir uma temperatura pelo menos 20 ºC
superior à temperatura de trabalho (nota 7). Manter essa temperatura
durante, pelo menos, duas horas; em seguida, pôr o conjunto nas
condições de funcionamento (regulação do fluxo gasoso e da relação
de fraccionamento, ignição da chama, ligação ao registador electrónico,
regulação da temperatura do forno da coluna, do detector e do injector,
etc.) e registar o sinal com uma sensibilidade pelo menos dupla da
prevista para a realização da análise. O traçado da linha de base obtida
deve ser linear, sem qualquer pico ou desvio. Um desvio rectilíneo
negativo indica hermeticidade imperfeita das ligações da coluna; se for
positivo, indica condicionamento insuficiente da mesma.
Nota 7:A temperatura de condicionamento deve ser sempre pelo
menos 20 ºC inferior à temperatura máxima prevista para a
fase líquida utilizada.
5.4.2. Escolha das condições de funcionamento
5.4.2.1. Seguem-se condições indicativas de funcionamento:
— temperatura da coluna: inicialmente, isotérmica durante 8 minutos a
180 ºC; depois, programada a 5 ºC/minuto até 260 ºC; em seguida,
15 minutos a 260 ºC,
— temperatura do vaporizador: 280 ºC,— temperatura do detector: 290 ºC,
— velocidade linear do gás vector: hélio, 20 cm/s a 35 cm/s; hidro-
génio, 30 cm/s a 50 cm/s,
— relação de fraccionamento ( splitting): de 1/50 a 1/100,1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 105
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— sensibilidade instrumental: 4 a 16 vezes a atenuação mínima,
— sensibilidade de registo: 1 a 2 mV (escala completa),
— velocidade do papel: 30 cm/hora a 60 cm/hora,
— quantidade de substância injectada: 0,5 µla1 µl de solução de
TMSE.
Estas condições podem ser alteradas em função das características da
coluna e do cromatógrafo de fase gasosa, de modo a obter cromato-
gramas que satisfaçam as seguintes condições:
— tempo de retenção do álcool C26: 18 minutos ± 5 minutos,
— pico do álcool C22: 80 % ± 20 % da escala completa, no caso do
azeite, e 40 % ± 20 % da escala completa no caso dos óleos de
sementes.
5.4.2.2. Para verificar as condições referidas, efectuar várias injecções da
mistura-padrão de TMSE dos álcoois e ajustar as condições de funcio-
namento até obter os melhores resultados.
5.4.2.3. Os parâmetros de integração dos picos devem ser fixados de modo a
obter uma avaliação correcta das áreas dos picos considerados.
5.4.3. Execução da análise
5.4.3.1. Com a microsseringa de 10 µl, tomar 1 µl de hexano, aspirar 0,5 µld e
ar e, em seguida, 0,5 µla1 µl da solução da amostra; puxar um pouco
mais o êmbolo da seringa, para que a agulha fique vazia. Introduzir a
agulha através da membrana da câmara de injecção e, transcorridos 1 s
a 2 s, injectar rapidamente; passados cerca de 5 s, retirar a agulha
devagar.
5.4.3.2. Efectuar o registo até à eluição completa dos TMSE de álcoois alifá-
ticos presentes. A linha de base deve continuar a corresponder às
condições exigidas (5.4.1.2).
5.4.4. Identificação dos picos
A identificação de cada pico é efectudada com base nos tempos de
retenção e por comparação com a mistura-padrão de TMSE de álcoois
alifáticos, analisada nas mesmas condições.
A figura 1 mostra um cromatograma da fracção alcoólica de um azeite
virgem.
5.4.5. Avaliação quantitativa
5.4.5.1. Efectuar, com o integrador, o cálculo da área dos picos do 1-eicosanol e
dos álcoois alifáticos C22,C24,C26eC28.
5.4.5.2. O teor de cada álcool alifático, em mg/1 000 g de matéria gorda, é
calculado do seguinte modo:
em que:
Ax= área do pico do álcool x
As= área do pico do 1-eicosanol
ms= massa de 1-eicosanol adicionada, em miligramas
m = massa da toma de amostra para a determinação, em gramas.
6. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS
O teor de cada álcool alifático é expresso em mg/1 000 g de matéria
gorda e a sua soma como álcoois alifáticos totais.1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 106
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APÊNDICE
Determinação da velocidade linear do gás
No cromatógrafo de fase gasosa, regulado para condições de funcionamento
normais, injectar 1 µla3 µl de metano (ou propano) e cronometrar o tempo
gasto pelo gás para percorrer a coluna, entre o momento da injecção e o da
saída do pico (tM).
A velocidade linear, em cm/s, é dada por L/tM, sendo L o comprimento da
coluna, em centímetros, e tMo tempo cronometrado, em segundos.
Figura 1: Cromatograma da fracção alcoólica de um azeite virgem
1 = Eicosanol
2 = Docosanol
3 = Tricosanol4 = Tetracosanol
5 = Pentacosanol
6 = Hexacosanol7 = Heptacosanol8 = Octacosanol1991R2568 — PT — 01.11.2003 — 020.001 — 107