1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 1
Este documento constitui um instrumento de documentação e não vincula as instituições
►BTERCEIRA DIRECTIVADA COMISSÃO
de 27 de Abril de 1972
que fixa os métodos de análise comunitários para o controlo dos alimentos para animais
(72/199/CEE)
(JO L 123 de 29.5.1972, p. 6)
Alterada por:
Jornal Oficial
n.opágina data
►M1Directiva 81/680/CEE da Comissão de 30 de Julho de 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2Directiva 84/4/CEE da Comissão de 20 de Dezembro de 1983 L 15 28 18.1.1984
►M3Directiva 93/28/CEE da Comissão de 4 de Junho de 1993 L 179 8 22.7.1993
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TERCEIRA DIRECTIVADA COMISSÃO
de 27 de Abril de 1972
que fixa os métodos de análise comunitários para o controlo dos
alimentos para animais
(72/199/CEE)
A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,
Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Euro-
peia,
Tendo em conta a Directiva do Conselho, de 20 de Julho de 1970, rela-
tiva à introdução de modos de colheita de amostras e de métodos de
análise comunitárias para o controlo oficial de alimentos para
animais (1) e, nomeadamente, o seu artigo 2.o,
Considerando que a directiva atrás referida prevê que os controlos
oficiais dos alimentos para animais, para verificar se as condições pres-
critas em virtudes de disposições legislativas, regulamentares ou
administrativas referentes à qualidade e composição de alimentos paraanimais, são respeitados e efectuados segundo modos de colheita deamostra e métodos de análise comunitários;
Considerando que as Directivas n.
os71/250/CEE e 71/393/CEE da
Comissão, de 15 de Junho de 1971 (2) e de 18 de Novembro de
1971 (3), fixaram já um certo número de métodos de análise comuni-
tários; que, tendo em conta o estado de evolução dos trabalhosefectuados desde então, é conveniente adoptar uma terceira série de
métodos;
Considerando que as medidas previstas na presente directiva estão
conformes com o parecer do Comité Permanente dos Alimentos paraAnimais,
ADOPTOU A PRESENTE DIRECTIVA:
Artigo 1.o
Os Estados-membros determinaram que as análises para os controlosoficiais de alimentos para animais, no que respeita ao teor de amido,proteínas brutas solubilizáveis pela pepsina e pelo ácido clorídrico ede gossipol livre e total, assim como à actividade da pepsina, sejamefectuadas segundo os métodos descritos no Anexo I da presente direc-
tiva.
Artigo 2.o
Os Estados-membros determinarão que as análises para os controlos
oficiais dos alimentos para animais com vista à detecção e identifi-
cação dos antibióticos do grupo das tetraciclinas, assim como o que
respeita ao teor de clorotetraciclina, oxitetraciclina, tetraciclina, olean-domicina, tilosina, virginiamicina, sejam efectuadas segundo osmétodos descritos no Anexo II da presente directiva.
Artigo 3.
o
Os Estados-membros porão em vigor em 1 de Julho de 1973, o mais
tardar, as disposições legislativas, regulamentares ou administrativasnecessárias para darem cumprimento às disposições da presente direc-tiva. Deste facto informarão imediatamente a Comissão.1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 2
(1)J O n .oL 170 de 3. 8. 1970, p. 2.
(2)J O n .oL 155 de 12. 7. 1971, p. 13.
(3)J O n .oL 279 de 20. 12. 1971, p. 7.▼M1
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Artigo 4.o
Os Estados-membros são destinatários da presente directiva.1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 3
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ANEXO I
1.DOSEAMENTO DO AMIDO
— Método polarimétrico —
1.Objecto e domínio de aplicação
Este método permite determinar o teor de amido e de produtos de degradação
deste, de alto peso molecular dos alimentos para animais, com excepção dos
que contenham tiras, polpa, folhas ou colos secos de beterraba, polpa de
batata, leveduras desidratadas, produtos ricos em inulina (por exemplo, tiras
e farinhas de tupinambos) ou de torresmos.
2.Princípio
O método inclui uma dupla determinação. Na primeira, a amostra é tratada a
quente por ácido clorídrico diluído. Depois da clarificação e filtração, mede-
-se por polarimetria o poder rotatório da solução.
Na segunda, a amostra é extraída por etanol a 40 %. Depois da acidificação
do filtrado pelo ácido clorídrico, da clarificação e filtração, mede-se o poder
rotatório nas mesmas condições da primeira determinação.
A diferença entre as duas, multiplicada por um factor conhecido dá o teor de
amido da amostra.
3.Reagentes
3.1. Ácido clorídrico a 25 % (p/p), d: 1,126.
3.2. Ácido clorídrico a 1,128 % (p/v).
A concentração deve ser verificada por titulação com uma solução de
hidróxido de sódio 0,1 N em presença de vermelho de metilo a 0,1 %
(p/v) em etanol a 94 % (v/v). 10 ml = 30,94 ml de NaOh 0,1 N.
3.3. Solução de Carrez I: dissolver em água 21,9 g de acetato de zinco Zn
(CH3COO)2.2H2O e 3 g de ácido acético glacial. Completar até 100 ml
com áqua.
3.4. Solução de Carrez II: dissolver em água 10,6 g de ferrocianeto de
potássio K4[Fe(CN)6]. 3H2O. Completar até 100 ml com água.
3.5. Etanol a 40 % (v/v), d: 0,948 a 20 ºC.
4.Instrumentos
4.1. Erlenmeyer de 250 ml de colo esmerilado normalizado com refrigerador
de refluxo.
4.2. Polarímetro ou sacarímetro.
5.Modo operatório
5.1.Preparação da amostra
Triturar a amostra de maneira a passar a totalidade através de um crivo
de malha redonda de 0,5 mm de diâmetro.
5.2.Determinação do poder rotatório total(P ou S) (v. obervação 7.1.)
Pesar com a aproximação de 1 mg, 5 g de amostra triturada e introduzir
num balão aferido de 100 ml. Adicionar 25 ml de ácido clorídrico (3.2.),
agitar para obter uma boa repartição da amostra e adicionar novamente
25 ml de ácido clorídrico. Introduzir o balão num banho-maria em
ebulição e, durante três minutos, agitar enérgica e regularmente para
evitar a formação de aglomerados. A quantidade de água do banho
deve ser suficiente para permitir mantê-lo em ebulição quando o balão
é introduzido. Este não pode ser retirado do banho durante a agitação.
Exactamente quinze minutos depois, retirar o balão do banho, juntar-
-lhe 30 ml de água fria e arrefecer imediatamente a 20 ºC.
Adicionar 5 ml de solução de Carrez I (3.3.) e agitar durante um minuto.
Adicionar em seguida 5 ml de solução de Carrez II (3.4.) e agitar de
novo durante um minuto. Completar o volume com água, homogeneizar
e filtrar. Se o filtrado não ficar perfeitamente límpido (o que é pouco
frequente) recomeçar a análise utilizando uma quantidade maior das
soluções de Carrez I e II, por exemplo, 10 ml.1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 4
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Medir em seguida o poder rotatório da solução num tubo de 200 mm no
polarímetro ou no sacarímetro.
5.3.Determinação do poder rotatório (P ′ou S ′) de substâncias solúveis em
etanola 40 %
Introduzir num balão aferido de 100 ml 5 g de amostra, pesada com a
aproximação de 1 mg e adicionar cerca de 80 ml de etanol (3.5.) (v.
observação 7.2.). Deixar o balão à temperatura ambiente durante 1
hora; durante esse lapso de tempo, agitar energicamente 6 vezes, de
maneira a que a amostra fique bem misturada com o etanol. Completaraté 100 ml com etanol (3.5.), homogeneizar e filtrar.
Introduzir com uma pipeta 50 ml de filtrado (= 2,5 g de amostra) num
erlenmeyer de 250 ml, adicionar 2,1 ml de ácido clorídrico (3.1.) e
agitar energicamente. Aplicar um refrigerador de refluxo ao erlenmeyer
e mergulhar este num banho-maria em ebulição. Exactamente 15
minutos depois, retirar o erlenmeyer do banho, despejar o seu conteúdo
num balão aferido de 100 ml, passando por um pouco de água fria e
arrefecer a 20 ºC. Clarificar em seguida com as soluções de Carrez I
(3.3.) e II (3.4.), completar o volume com água, homogeneizar, filtrar e
medir o poder rotatório como indicado em (5.2.), 2.
oe3 .oparágrafos.
6.Cálculo dos resultados
O teor de amido, em percentagem de amostra, é calculado como se segue:
6.1.Medições efectuadas no polarímetro
percentagem de amido ¼2000 P /C0P0ðÞ
α½/C13820º
D
P = poder rotatório em graus de arco
P′ = poder rotatório em graus de arco dados pelas
substâncias solúveis em etanol a 40 %
α½/C13820º
D = poder rotatório específico do amido puro. Os
valores convencionalmente admitidos para este
factor são os seguintes:
+ 185,9º: amido de arroz
+ 185,4º: amido de batata+ 184,6º: amido de milho+ 182,7º: amido de trigo+ 181,5º: amido de cevada
+ 181,3º: amido de aveia
+ 184,0º: outros tipos de amidos, assim como misturas de
amidos de alimentos compostos
6.2.Medidas efectuadas no sacarímetro
percentagem de amido ¼
2000
α½/C13820º
D/C12N/C10;665 ðÞ S/C0S0ðÞ
100¼26;6N S /C0S0ðÞ
α½/C13820º
D
S = poder rotatório total em graus sacarimétricos
S′= poder rotatório em graus sacarimétricos, dados pelas
substâncias solúveis em etanol a 40 %.
N = peso em gramas de sacarose, em 100 ml de água que, através
de uma espessura de 200 mm, dê um poder rotatório de 100 º
sacarimétricos.
16,29 g para os sacarímetros franceses26,00 g para os sacarímetros alemães
20,00 g para os sacarímetros mistos
α½/C138
20º
D= Poder rotatório específico do amido puro (ver 6.1).
6.3.Reprodutibilidade
A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efec-
tuadas na mesma amostra não deve ultrapassar 0,4, em valor absoluto,
para os teores de amido inferiores a 40 %, e 1,1 % em valor relativo
para os teores de amido iguais ou superiores a 40 %.1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 5
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7.Observações
7.1. Sempre que a amostra contenha mais de 6 % de carbonatos, calculados
em carbonato de cálcio, estes devem ser destruídos por um tratamento
com a quantidade apropriada de ácido sulfúrico diluído, antes da deter-
minação do poder rotatório total.
7.2. No caso de produtos com forte teor de lactose, tais como soro de leite
em pó ou de nata de leite em pó, proceder como se segue, depois da
adição de 80 ml de etanol (3.5.). Aplicar ao balão um refrigerador de
refluxo, mergulhar o balão durante 30 minutos num banho de água a
50 ºC. Em seguida, deixar arrefecer e prosseguir a análise como indi-
cado em (5.3.).
2.DETERMINAÇÃODO TEOR DE PROTEÍNA BRUTA
1.Objectivo e campo de aplicação
O presente método permite determinar o teor de proteína bruta dos alimentos
para animais com base no teor de azoto, determinado pelo método de Kjel-dahl.
2.Princípio
A amostra é digerida com ácido sulfúrico, na presença de um catalisador. A
solução ácida é tornada alcalina por adição de uma solução de hidróxido de
sódio. A amónia é destilada e recolhida numa quantidade determinada de
ácido sulfúrico, cujo excesso é titulado com uma solução-padrão de hidró-
xido de sódio.
3.Reagentes
3.1. Sulfato de potássio.3.2. Catalisador: óxido de cobre (II), CuO, ou sulfato de cobre (II) penta-
-hidratado, CuSO
4·5H2O.
3.3. Zinco granulado.3.4. Ácido sulfúrico, ρ
20= 1,84 g/ml.
3.5 Ácido sulfúrico, c(½H2SO4) = 0,5 mol/l.
3.6. Ácido sulfúrico, c(½H2SO4) = 0,1 mol/l.
3.7. Indicador de vermelho de metilo: dissolver 300 mg de vermelho de
metilo em 100 ml de etanol, σ= 95 — 96 % (v/v).
3.8. Solução de hidróxido de sódio (pode-se utilizar uma solução de pureza
técnica), β= 40 g/100 ml (m/v: 40 %).
3.9. Solução de hidróxido de sódio, c = 0,25 mol/l.3.10. Solução de hidróxido de sódio, c = 0,1 mol/l.3.11. Pedra-pomes finamente fragmentada, lavada em ácido clorídrico e
inflamada.
3.12. Acetanilida (p.f.= 114 ºC, N = 10,36 %).3.13. Sacarose (isenta de azoto).
4.Equipamento
Aparelho adequado para efectuar a digestão, destilação e titulação pelo
método de Kjeldahl.
5.Procedimento
5.1.Digestão
Pesar 1 grama de amostra com aproximação de ± 0,001 grama e trans-
ferir para o recipiente do aparelho de digestão. Adicionar 15 gramas de
sulfato de potássio (3.1), uma quantidade adequada de catalisador (3.2)
[0,3 a 0,4 grama de óxido de cobre (II) ou 0,9 a 1,2 gramas de sulfato
de cobre (II) penta-hidratado], 25 mililitros de ácido sulfúrico (3.4) e
alguns fragmentos de pedra-pomes (3.11), misturando. Aquecer modera-
damente a mistura, agitando ocasionalmente se necessário, até à
carbonização completa da massa e o desaparecimento da espuma.
Aquecer de um modo mais vigoroso até à ebulição; o aquecimento é1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 6
▼M3
▼M3
adequado quando se observar a condensação do ácido nas paredes do
recipiente. Evitar o sobreaquecimento lateral e a adesão de partículas
orgânicas às paredes. Quando a amostra assumir um tom verde claro,
continuar a ebulição durante mais duas horas, arrefecendo da seguida.
5.2.Destilação
Adicionar cuidadosamente uma quantidade de água adequada para a
dissolução completa dos sulfatos. Deixar arrefecer e adicionar alguns
grânulos de zinco (3.3).
Colocar no recipiente de recolha do dispositivo de destilação 25 milili-
tros, rigorosamente medidos, de ácido sulfúrico (3.5) ou (3.6), em
função de teor presumido de azoto. Adicionar algumas gotas de
vermelho de metilo (3.7).
Adaptar o recipiente de digestão ao refrigerante do dispositivo de desti-
lação, imergindo a extremidade do refrigerante no líquido contido no
recipiente de recolha, até uma profundidade mínima de 1 cm (ver a
observação 8.3). Juntar cuidadosamente 100 ml de solução de hidróxido
de sódio (3.8) ao recipiente de digestão, evitando perdas de amoníaco
(ver a observação 8.1).
Aquecer o recipiente até à destilação completa do amoníaco.
5.3.Titulação
Titular o excesso de ácido sulfúrico existente no recipiente de recolha
com a solução de hidróxido de sódio (3.9) ou (3.10), em função da
concentração de ácido sulfúrico utilizada, até atingir o ponto final.
5.Ensaio em branco
Com vista a confirmar a ausência de azoto nos reagentes, efectuar um
ensaio em branco (digestão, destilação e titulação), utilizando 1 g de
sacarose (3.13) em vez da amostra.
6.Cálculo dos resultados
O teor de proteínas totais é calculado de acordo com a seguinte fórmula:
V0/C0V1 ðÞ /C2 c/C20;014/C2100/C26;25
m
Em que
V0= Volume, expresso em ml, de NaOH (3.9 ou 3.10) utilizado no ensaio
em branco
V1= Volume, expresso em ml, de NaOH (3.9 ou 3.10) utilizado na titu-
lação da amostra
c = Concentração, expressa em mol/l, da solução de hidróxido de sódio
(3.9 ou 3.10)
m = Massa da amostra, empressa em gramas.
7.Comprovação do método
7.1.Repetibilidade
A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas, efec-
tuadas com a mesma amostra, não deve exceder:
— 0,2 %, em valor absoluto, para teores de proteína bruta inferiores
a2 0% ,
— 1,0 %, em valor relativo, em relação aos resultados mais
elevados, para teores de proteínas totais compreendidos
entre 20 % e 40 %,
— 0,4 %, em valor absoluto, para teores superiores a 40 %.
7.2.Exactidão
Efectuar a análise (digestão, destilação e titulação) de 1,5 a 2,0 gramas
de acetanilida (3.12), na presença de 1 grama de sacarose (3.13); 1
grama de acetanilida deverá consumir 14,80 mililitros de ácido sulfúrico
(3.5). A taxa de recuperação deve ser de, pelo menos, 99 %.1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 7
▼M3
8.Observações
8.1. O aparelho a utilizar pode ser do tipo manual, semiautomático ou
automático. Se for necessário efectuar uma operação de transferência
entre os processos de digestão e destilação, não deverão observar-se
perdas. Se o recipiente do dispositivo de destilação não se encontrar
munido de uma ampola de carga, adicionar o hidróxido de sódio imedia-
tamente antes de adaptar o recipiente ao refrigerante, vertendo o líquido
cuidadosamente ao longo das paredes.
8.2. Se o resíduo da digestão solidificar, recomeçar o processo, utilizando
um volume de ácido sulfúrico (3.4) superior ao especificado.
8.3. No caso de produtos com baixo teor de azoto, o volume de ácido sulfú-
rico (3.6) a adicionar ao recipiente de recolha pode ser reduzido, se
necessário, para 10 ou 15 mililitros e diluído para 25 mililitros, com
água.
3.DOSEAMENTO DE PROTEÍNAS BRUTAS SOLUBILIZADAS PELA
PEPSINA E PELO ÁCIDO CLORÍDRICO
1.Objecto e domínio de aplicação
Este método permite determinar a fracção de proteínas brutas solubilizadas
pela pepsina e pelo ácido clorídrico em condições determinadas. O método
é aplicável a todos os alimentos.
2.Princípio
A mostra é submetida a um tratamento por uma solução clorídrica de pepsina
durante 48 h a 40 ºC. A suspensão é filtrada e o teor de azoto do filtrado
determinado segundo o método descrito para o doseamento das proteínas
brutas.
3.Reagentes
3.1. Ácido clorídrico, d: 1,125
3.2. Ácido clorídrico: 0,075 N.3.3. Pepsina a 2,0 U/mg; esta actividade está definida e deve ser controlada
segundo o método referido na Parte 4 do presente Anexo.
3.4. Solução recém-preparada com cerca de 0,02 % (p/v) de pepsina em
ácido clorídrico (3.2.); actividade: 400 U/1.
3.5. Emulsão de anti-espuma (silicone por exemplo)
3.6. Todos os reagentes indicados ao ponto 3 do método de doseamento das
proteínas brutas
4.Instrumentos
4.1. Banho-maria ou estufa incubadora regulada a 40 ºC ± 1 ºC.
4.2. Aparalhos de mineralização e destilação segundo Kjeldahl.
5.Modo operatório
5.1.Obtenção da solução (ver observação 7.2.)
Introduzir 2 g de amostra pesada com a aproximação de 1 mg num
balão aferido de 500 ml e adicionar 450 ml de solução clorídrica de
pepsina (3.4.) previamente elevada a 40 ºC. Agitar de forma a evitar a
formação de aglomerados. Verificar que o pH da suspensão é inferior a
1,7. Colocar o balão no banho-maria ou na estufa incubadora (4.1.),
durante 48 horas. Agitar decorridas 8, 24 e 32 h. Após 48 h, adicionar
15 ml de ácido clorídrico (3.1.), arrefecer a 20 ºC, completar até 500 ml
com água e filtrar.
5.2.Mineralização
Recolher 250 ml do filtrado e introduzi-los no balão do destilador (4.2.).
Juntar os reagentes necessários à mineralização, como indicado no
método de doseamento das proteínas brutas, no ponto (5.1.), 2.
afrase.
Homogeneizar e aquecer até à ebulição. Se houver formação de espuma,
juntar algumas gotas de emulsão anti-espuma (3.5.). Manter uma
ebulição viva até à evaporação quase completa da água. Eliminar com1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 8
▼B
▼B
precaução os últimos vestígios de água, reduzindo a intensidade do
aquecimento. Quando a solução aparecer límpida e incolor (verde claro
em presença do catalisador à base de cobre), prosseguir a ebulição
durante mais 1 hora. Em seguida, deixar arrefecer.
5.3.Destilação e titulação
Proceder como indicado no método de doseamento de proteínas brutas,
pontos (5.2.) e (5.3.).
5.4.Ensaio em branco
Efectuar um ensaio em branco, aplicando o modo operatório na ausência
da amostra para analisar.
6.Cálculo dos resultados
Deduzir o volume do ácido sulfúrico consumido no ensaio em branco do que
foi gasto pela amostra. 1 ml de ácido sulfúrico 0,1 N corresponde a 1,4 mg
de azoto.
Multiplicar a quantidade do azoto pelo factor 6,25. Expressar o resultado em
percentagem de amostra.
Reprodutibilidade
A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas na
mesma amostra não deve ultrapassar:
— 0,4 em valor absoluto, para os teores inferiores a 20 %,
— 2,0 %, em valor relativo, para os teores compreendidos entre 20 e 40 %;— 0,8 em valor absoluto, para os teores superiores a 40 %.
7.Observações
7.1. Os valores obtidos pelo presente método não têm ligação directa com a
digestibilidade «in vivo».
7.2. Aos produtos cujo teor de matérias gordas ultrapasse 10 % deve ser
extraída previamente a gordura com éter de petróleo (eb. 40-60 ºC).
4.DETERMINAÇÃODA ACTIVIDADEDA PEPSINA
1.Objecto e domínio de aplicação
Este método permite controlar a actividade da pepsina utilizada para o dose-
amento de proteínas brutas solubilizadas pela pepsina e pelo ácido clorídrico.
2.Princípio
A hemoglobina é tratada, em condições definidas, pela pepsina em meio
clorídrico. A fracção não hidrolizada das proteínas é precipitada pelo ácido
tricloroacético. Ao filtrado é adicionado hidróxido de sódio e do reagente de
Folin-Ciocalteu. A densidade óptica desta solução é medida a 750 nm e a
quantidade de tirosina que lhe corresponde é lida numa curva-padrão.
Definição: A unidade de pepsina é definida como a quantidade desta enzima
que liberta, por minuto, nas condições do método, uma quantidade de grupos
hidroxiaril cuja coloração pelo reagente de Folin-Ciocalteu tem uma densi-
dade óptica correspondente à de uma mole de tirosina, nas mesmas
condições.
3.Reagentes
3.1. Ácido clorídrico 0,2 N.
3.2. Ácido clorídrico 0,06 N.
3.3. Ácido clorídrico 0,025 N.
3.4. Solução a 5 % (p/v) de ácido tricloroacético3.5. Solução de hidróxido de sódio 0,5 N
3.6. Reagente de Folin-Ciocalteu. Introduzir 100 g de tungstato de sódio
(Na
2WO4.2 H2O), 25 g de molibdato de sódio (Na2MoO4.2 H2O) e
700 ml de água num balão de fundo redondo de 2 l de colo esmerilado
normalizado. Juntar 50 ml de ácido fosfórico (d: 1,71) e 100 ml de ácido
clorídrico concentrado (d: 1,19), ajustar ao balão um refrigerador de
refluxo, aquecer até à ebulição e manter a solução em ebulição suave1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 9
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durante 10 h. Deixar arrefecer, desligar o refrigerador de refluxo.
Adicionar 175 g de sulfato de lítio (Li2SO4.2 H2O), 50 ml de água e
1 ml de bromo. Ferver durante 15 minutos para eliminar o excesso de
bromo.
Deixar arrefecer, transvasar a solução num balão aferido de 1 litro,
completar o volume com água, homogeneizar e filtrar. Não poderá
subsistir qualquer coloração esverdeada. Antes de utilizar, diluir um
volume de reagente com dois volumes de água.
3.7. Solução de hemoglobina: Pesar uma quantidade de hemoglobina,
substrato proteico de Anson (cerca de 2 g) correspondente a 354 mg de
azoto (1) e introduzir num balão de 200 ml de colo esmerilado normali-
zado. Juntar alguns ml de ácido clorídrico (3.2.), ligar o balão à bomba
de vácuo e agitar até à dissolução completa da hemoglobina. Desligar o
vácuo e adicionar, agitando sempre, o ácido clorídrico (3.2.) para
completar a 100 ml. Preparar inmediatamente antes de utilizar .
3.8. Solução-padrão de tirosina: dissolver 181,2 mg de tirosina em ácido
clorídrico (3.1.) e completar para 1 litro com o mesmo ácido (soluç-
ãomãe). Recolher 20,0 ml e diluir para 100 ml pelo ácido clorídrico
(3.1.). 1 ml desta solução contém 0,2 mole de tirosina.
4.Instrumentos
4.1. Banho-maria, rgulado a 25 ºC ± 0,1 ºC por ultratermóstato.4.2. Espectrofotómetro.4.3. Cronómetro, precisão: 1 segundo.4.4. Aparelho medidor de pH.
5.Modo operatório
5.1.Preparação da solução (v. observação 7.1)
Dissolver 150 mg de pepsina em 100 ml de ácido clorídrico (3.2.).
Recolher com uma pipeta 2 ml da solução, introduzi-los num balão
aferido de 50 ml e completar o volume com ácido clorídrico (3.3.). O
pH, verificado no aparelho medidor de pH, deve ser de 1,6 ± 0,1.
Mergulhar o balão no banho-maria (4.1.).
5.2.Hidrólise
Introduzir com a pipeta num tubo de ensaio 5,0 ml de solução de hemo-
globina (3.7.), elevar a temperatura a 25 ºC em banho-maria (4.1.),
adicionar 1,0 ml da solução de pepsina obtida em (5.1.) e misturar,
com uma haste de vidro engrossada numa extremidade, com cerca de
10 movimentos de vaivém. Manter o tubo de ensaio no banho a 25 ºC
durante 10 minutos, contados exactamente a partir da adição da solução
de pepsina (a duração e a temperatura devem ser rigorosamente respei-
tadas). Em seguida, juntar 10,0 ml de solução de ácido tricloroacético
(3.4.) a 25 ºC, homogeneizar e filtrar num filtro seco.
5.3.Desenvolvimento da coloração e medida da densidade óptica
Recolher com uma pipeta 5,0 ml do filtrado, introduzi-los num erlen-
meyer de 50 ml, adicionar 10,0 ml de solução de hidróxido de sódio
(3.5.) e, agitanto sempre, 3,0 ml do reagente diluído de Folin-Ciocalteu
(3.6.). Após 5 a 10 minutos, determinar a densidade óptica da solução
em espectrofotómetro, a 750 nm em «cuvettes» de 1 cm de espessura,
por comparação com a água.
5.4.Ensaio em branco
Para cada determinação, proceder a um ensaio em branco como se
segue: Introduzir num tubo de ensaio com uma pipeta 5,0 ml de solução
de hemoglobina (3.7.), elevar a temperatura a 25 ºC num banho-maria
(4.1.), adicionar 10,0 ml de solução de ácido tricloroacético (3.4.) a
25 ºC, homogeneizar e adicionar em seguida, 1,0 ml da solução de
pepsina obtida em (5.1.). Misturar com uma vareta de vidro e manter o
tubo de ensaio exactamente 10 minutos no banho-maria (4.1.) a 25 ºC.1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 10
(1) Determinar o teor de azoto por um semi-microkjeldahl (concentração teórica: 17,7 %
de azoto).
▼B
Homogeneizar e filtrar num filtro seco. Prosseguir como indicado em
(5.3.).
5.5.Curva-padrão
Introduzir em erlenmeyer de 50 ml volumes de 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 e 5,0 ml
de solução-padrão de tirosina (3.8.), correspondente, respectivamente, a
quantidades de tirosina de 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0 moles. Completar a
série por um testemunho sem tirosina. Completar os volumes para
5,0 ml com ácido clorídrico (3.1.). Adicionar 10,0 ml de solução de
hidróxido de sódio (3.5.) e, agitando sempre 3,0 ml de reagente diluído
de Folin-Ciocalteu (3.6.). Medir a densidade óptica como indicado em
(5.3.), na última frase. Traçar a curva-podrão, correlacionando as densi-
dades ópticas com as quantidades de tirosina.
6.Cálculo dos resultados
Ler na curva-padrão a quantidade de tirosina, em mole, correspondente à
densidade óptica da solução corada, diminuída dos valores do ensaio em
branco.
A actividade da pepsina, em mole de tirosina por mg e por minuto, a 25 ºC, é
dada pela fórmula:
Unidades por mg V =mgðÞ ¼0;32 a
p
em que:
a — quantidade de tirosina, em µmole, lida na curva-padrão
p — peso em mg da quantidade de pepsina adicionada em 5.2.
7.Observações
7.1. A quantidade de pepsina a pôr em solução deve ser escolhida de
maneira a obter, na medição fotométrica final, uma densidade óptica de
0,35 ± 0.035.
7.2. Duas unidades por mg obtidas pelo presente método correspondem a:
3,64 miliunidades Anson/mg (µmole de tirosina/mg min a 35,5 ºC) ou
36.400 unidades comerciais/g (µmole de tirosina/ g em 10 min a
35,5 ºC).
5.DOSEAMENTO DO GOSSIPOL LIVRE E TOTAL
1.Objecto e domínio de aplicação
Este método permite dosear o gossipol livre, o gossipol total e as substâncias
quimicamente aparentadas, nas sementes, farinhas e bagaços de algodão,
assim como nos alimentos compostos que os contêm. O limite inferior do
doseamento é de 20 ppm.
2.Princípio
O gossipol é extraído em presença de 3-amino-1-propanol, quer por uma
mistura de isopropanol e de hexano para o doseamento do gossipol livre,
quer pela dimetilformamida, para o doseamento do gossipol livre, quer pela
dimetilformamida, para o doseamento do gossipol total. O gossipol é trans-
formado por meio de anilina em gossipol-dianilina, cuja densidade óptica é
medida em 440 nm.
3.Reagentes
3.1. Mistura de isopropanol-hexano: misturar 60 partes de isopraponol p.a.
com 40 partes de volume de hexano normal, volume por volume.
3.2. Solvente A: Deitar num balão aferido de 1 l, cerca de 500 ml da mistura
de isopropanol-hexano (3.1.), 2 ml de 3-amino-1-propanol, 8 ml de
ácido acético glacial e 50 ml de água. Completar o volume com a
mistura de isopropanol-hexano (3.1.). Este reagente é estável durante
uma semana.
3.3. Solvente B: Deitar, com uma pipeta, num balão aferido de 100 ml, 2 ml
de 3-amino-1-propanol e 10 ml de ácido acético glacial. Deixar arrefecer
até à tempertura ambiente e completar o volume com N,N-dimetilforma-
mida. Este reagente é estável durante uma semana.
3.4. Anilina p.a.: se a densidade óptica do ensaio em branco exceder 0,022,
destilar a anilina em pó de zinco, eliminando as primeiras e últimas1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 11
▼B
fracções de 10 % do líquido destilado. Em frasco bem rolhado de vidro
escuro e no frigorífico este reagente conserva-se vários meses.
3.5. Solução-padrão A de gossipol: Deitar, num balão aferido de 250 ml,
27,9 mg de acetato de gossipol. Dissolver e completar o volume com o
solvente A (3.2.). Introduzir com uma pipeta 50 ml desta solução num
balão aferido de 250 ml e completar o volume com o solvente A. A
concentração em gossipol desta solução é de 0,02 mg/ml. Deixar
repousar durante 1 hora à temperatura ambiente, antes de utilizar.
3.6. Solução-padrão B de gossipol: Deitar, num balão aferido de 50 ml,
27,9 mg de acetato de gossipol. Dissolver e completar o volume com o
solvente B (3.3.). A concentração em gossipol desta solução é de 0,5 mg/
/ml.
Conservados ao abrigo da luz, as soluções padrão A e B de gossipol são
estáveis durante 24 horas.
4.Instrumentos
4.1. Misturador basculante: cerca de 35 rotações por minuto4.2. Espectrofotómetro.
5.Modo operatório
5.1.Toma de ensaio
A toma de ensaio está relacionada com o que se calcula ser o teor de
gossipol da amostra total. É preferível trabalhar com uma pequena
toma de ensaio e com uma alíquota do filtrado relativamente importante,
de maneira a obter uma quantidade de gossipol suficiente para efectuar
uma medida fotométrica precisa. Para o doseamento do gossipoll ivre
nas sementes, nas farinhas e nos bagaços de algodão, a toma de ensaio
não deve exceder 1 g; para os alimentos compostos poderá atingir 5 g.
Na maioria dos casos, uma alíquota de 10 ml do filtrado é conveniente:
deverá conter 50 a 100 mg de gossipol. Para o doseamento de gossipol
total, a toma de ensaio poderá variar de 0,5 a 5 g para que uma alíquota
de 2 ml do filtrado contenha 40 a 200 µg de gossipol.
A análise deve ser feita a uma tempertura ambiente próxima de 20 ºC.
5.2.Doseamento do gossipoll ivre
Introduzir a toma de ensaio num balão de colo esmerilado de 250 ml,
com o fundo coberto de vidro moído. Adicionar com uma pipeta 50 ml
de solvente A (3.2.), rolhar o balão e misturar durante uma hora no
misturador-basculante. Filtrar num filtro seco e recolher o filtrado num
pequeno balão de colo esmerilado. Durante a filtração, cobrir o funil
com um vidro de relógio. Introduzir com uma pipeta em dois balões
aferidos de 25 ml (A e B) alíquotas idênticas de filtrado contendo 50 a
100 µg de gossipol. Completar eventualmente o volume para 10 ml com
o solvente A (3.2.). Completar em seguida para 25 ml o conteúdo do
balão (A) com a mistura de isopropanol-hexano (3.1.). Esta solução
será utilizada como solução de referência para a medição da solução da
amostra.
Introduzir com uma pipeta 10 ml do solvente A (3.2.) respectivamente
em dois outros balões aferidos de 25 ml (C e D). Completar o conteúdo
do balão (C) com a mistura de isopropanol-hexano (3.1.). Esta solução
do ensaio em branco.
Adicionar 2 ml de anilina (3.4.) em cada um dos balões (D) e (B).
Aquecer durante 30 minutos num banho-maria em ebulição para fazer
desenvolver a coloração. Arrefecer até à temperatura ambiente,
completar para 25 ml com a mistura de isopropanol-hexano (3.1.),
homogeneizar e deixar repousar durante uma hora.
Determinar em espectrofotómetro a 440 nm, em cuvetes de vidro de
1 cm, a densidade óptica da solução do ensaio em branco (D), por
comparação com a solução de referência (C) e a densidade óptica da
solução da amostra (B) por comparação com a solução de referência
(A).
Subtrair a densidade óptica da solução do ensaio em branco da densi-
dade óptica da solução da amostra (= densidade óptica corrigida).
Calcular, a partir deste valor, o teor de gossipol livre, com indicado em
6.1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 12
▼B
5.3.Doseamento do gossipoltotal
Introduzir uma amostra contendo de 1 a 5 mg de gossipol num balão
aferido de 50 ml e adicionar 10 ml de solvente B (3.3.). Preparar simul-
taneamente um ensaio em branco, introduzindo 10 ml de solvente B
(3.3.) noutro balão aferido de 50 ml. Aquecer os dois balões durante
30 minutos num banho-maria em ebulição. Arrefecer até à temperatura
ambiente e completar o conteúdo de cada balão até ao volume de
aferição com a mistura de isopropanol-hexano (3.1.). Homogeneizar e
deixar depositar durante 10 a 15 minutos, filtrar em seguida e recolher
os filtrados em balões de colo esmerilado.
Deitar com uma pipeta 2 ml do filtrado da amostra em cada um de dois
outros balões aferidos de 25 ml e 2 ml do filtrado do ensaio em branco
em cada um de dois outros balões de 25 ml. Retirar um balão de cadà
série e completar os conteúdos respectivos para 25 ml com a mistura de
isopropanol-hexano (3.1.). Estas soluções serão utilizadas como soluções
de referência.
Adicionar 2 ml de anilina (3.4.), respectivamente, a cada um dos dois
outros balões. Aquecer durante 30 minutos num banho de água a ferver
para fazer desenvolver a coloração. Arrefecer até à temperatura ambi-
ente, completar para 25 ml com a mistura de isopropanol-hexano (3.1.),
homogeneizar e deixar repousar durante uma hora.
Determinar a densidade óptica, como indicado em (5.2.) para o gossipol
livre. Calcular, a partir deste valor, o teor do gossipol total, como indi-
cado em 6.
6.Cálculo dos resultados
O cálculo dos resultados pode fazer-se, quer a partir da densidade óptica
específica (6.1.), quer por referência a uma curva-padrão (6.2.).
6.1.A partir da densidade óptica específica
Nas condições descritas, as densidades ópticas específicas são as
seguintes:
gossipol libre: E1%
1c m¼625
gossipol total: E1%
1c m¼600
O teor de gossipol livre ou total da amostra é dado pela seguinte
fórmula:
gossipol % ¼E/C11250
E1%
1c m/C1p/C1a
em que:
E = densidade óptica corrigida, determinada como indicado em (5.2.)
p = amostra em g,
a = alíquota do filtrado em ml.
6.2.A partir de uma curva-padrão
6.2.1. Gossipoll ivre
Preparar duas séries de 5 balões aferidos de 25 ml. Em cada série,
introduzir com uma pipeta nos balões, respectivamente, 2,0 —
4,0 — 6,0 — 8,0 e 10,0 ml da solução-padrão A de gossipol
(3.5). Completar os volumes para 10 ml com solvente A (3.2.)
Completar cada série com um testemunho constituído por um
balão aferido de 25 ml contendo unicamente 10 ml de solvente
A (3.2.).
Completar para 25 ml o volume dos balões da primeira série
(incluindo o testemunho) com a mistura isopropanol-hexano
(3.1.) (série de referência).
Juntar 2 ml de anilina (3.4.) em cada balão da segunda série
(incluindo o testemunho). Aquecer durante 30 minutos num
banho-maria em ebulição para fazer desenvolver a coloração.
Arrefecer até à temperatura ambiente, completar o volume com
a mistura de isopropanol-hexano (3.1.), homogeneizar e deixar
repousar durante 1 hora (série-podrão).1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 13
▼B
Determinar, nas condições indicadas em (5.2.), a densidade óptica
das soluções da série-padrão, por comparação com as soluções
correspondentes da série de referência. Traçar graficamente a
solução-padrão, inscrevendo as densidades ópticas em correlação
com as quantidades de gossipol (em µg).
6.2.2. Gossipoltotal
Preparar 6 balões aferidos de 50 ml. Introduzir no primeiro balão
10 ml de solvente B (3.3.) e nos outros, respectivamente, 2,0 —
4,0 — 6,0 — 8,0 e 10,0 ml da solução-padrão B de gossipol
(3.6.). Completar o conteúdo de cada balão para 10 ml com
solvente B (3.3.). Aquecer durante 30 minutos num banho-maria
em ebulição. Arrefecer até à temperatura ambiente, completar o
volume com a mistura de isopropanol-hexano (3.1.) e homoge-
neizar.
Introduzir 2, 0 ml destas soluções, respectivamente, em duas
séries de 6 balões aferidos de 25 ml. Completar para 25 ml o
conteúdo dos balões da primeira série com a mistura de isopro-
panol-hexano (3.1.) (série de referência).
Adicionar 2 ml de anilina (3.4.) a cada balão da 2.asérie. Aquecer
durante 30 minutos num banho-maria em ebulição. Arefecer até à
temperatura ambiente, completar o volume com a mistura de
isopropanol-hexano (3.1.), homogeneizar e deixar repousar
durante 1 hora (série-padrão).
Determinar nas condições indicadas em (5.2.), a densidade óptica
das soluções da série-padrão, por comparação com as soluções
correspondentes da série de referência. Traçar graficamente a
curva-padrão, inscrevendo as densidades ópticas em correlação
com as quantidades de gossipol (em µg).
6.3.Reprodutibilidade
A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas, efec-
tuadas na mesma amostra, não deve ultrapassar:
— 15 %, em valor relativo, para os teores de gossipol inferiores a
500 ppm,
— 75 ppm, em valor absoluto, para os teores compreendidos entre 500
e 750 ppm,
— 10 %, em valor relativo, para os teores superiores a 750 ppm.1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 14
▼B
ANEXO II
1.DETECÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE ANTIBIÓTICOS DO GRUPO
DASTETRACICLINAS
1.Objecto e domínio e aplicação
Este método permite revelar e identificar os antibióticos do grupo das tetraci-
clinas nos alimentos que contenham pelo menos em 0,1 ppm destes, nos
concentrados e nas pré-misturas.
2.Princípio
A amostra é submetida a extracção por uma mistura de metanol e de ácido
clorídrico. O extracto é cromatografado em papel, por via ascendente, em
comparação com as soluções de referência. Os antibióticos são revelados e
identificados por comparação dos seus valores Rf, com os das substâncias-
-padrão, quer por fluorescência aos UV (fortes concentrações de
antibióticos), quer por bioautografia em meio de ágar-ágar, inoculado com
B. cereus.
3.Reagentes e meio de cultura
3.1. Tampão, pH 3,5
Ácido cítrico monohidratado p.a. 10,256 g
Fosfato dissódico NA2HPO42H2O p.a. 7,45 g
Acetona p.a. 300 ml
Água destilada para 1 000 ml
3.2. Tampão de fosfato, pH 5,5
Fosfato monopotássico KH2PO4p.a. 130,86 g
Fosfato dissódico Na2HPO4·2 H2O p.a. 6,947 g
Agua destilada para 1 000 ml
3.3. Eluente I: Mistura de nitrometano puro/clorofórmio puro/ α-diclori-
drina: 20/10/1,5 em volume. Preparar no momento da
utilização.
3.4. Eluente II: mistura de nitrometano puro/clorofórmio puro/ α-picolino:
20/10/3 em volume. Preparar no momento da utilização.
3.5. Mistura de metanol puro/ácido clorídrico (d: 1,19): 98/2 em volume.
3.6. Ácido clorídrico 0,1 N.3.7. Amoníaco, d: 0,91.3.8. Substâncias-padrão: clorotetraciclina, oxitetraciclina, tetraciclina cuja
actividade é expressa em cloridrato.
3.9. Microorganismo: B. cereus ATCC n.
o11.778
Conservação da estirpe, preparação da suspensão de esporos e inocu-
lação do meio de cultura: aplicar as prescrições 3.1 e 3.2 do método
de doseamento da clorotetraciclina, da oxitetraciclina e da tetraciclina
por difusão em ágar-ágar, constantes da Parte 2 do presente anexo.
3.10. Meio de cultura (1)
Glicosa 1 g
Peptona trípsica 10 g
Extracto de carne 1,5 g
Extracto de levedura 3 g1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 15
(1) Pode ser utilizado qualquer meio de cultura comercial de composição análoga e que
conduza aos mesmos resultados.
▼B
Ágar-ágar 20 g
Água destilada para 1 000 ml
Ajustar o pH a 5,8 no momento da utilização.
3.11. Solução a 0,1 % (p/v) de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio e 5 % (p/v)
de glicose.
4.Instrumentos
4.1. Aparelhagem de cromatografia ascendente em papel (altura do papel:
25 cm). Papel Schleicher e Schüll 2040 b ou 2043 b, ou equivalente.
4.2. Centrífugadora.
4.3. Estufa de incubadora, regulada a 30 ºC.
4.4. Lâmpada UV para detecção da fluorescência.4.5. Placas de vidro de cerca de 20 × 30 cm, permitindo a montagem de uma
caixa achatada para a bioautografia.
5.Soluções-padrão
5.1.Soluções-mãe
Preparar, a partir das substâncias-padrão (3.8.) com ácido clorídrico
(3.6.), soluções cuja concentração corresponda, respectivamente, a
500 µg de clorotetraciclina-HCl por ml e de tetraciclina-HCl por ml.
5.2.Soluções de referência para a detecção aos UV
Diluir as soluções (5.1.) com tampão fosfato (3.2.) para obter soluções
cuja concentração corresponda a 100 µg de clorotetraciclina-HCl, de
oxitetraciclina-HCl e de tetraciclina-HCl por ml.
5.3.Soluções de referência para a detecção por bioautografia
Diluir as soluções (5.1.) com tampão fosfato (3.2.) para obter soluções
cuja concentração corresponda a 5 µg de clorotetraciclina-HCl, de oxite-
traciclina-HCl e de tetraciclina-HCl por ml.
6.Extracção
Sempre que se espera uma concentração de antibiótico inferior a 10 ppm,
pode utilizar-se quer a amostra homogeneizada, quer a fracção mais fina
separada através de uma peneira, dado que os antibióticos se encontram
preferencialmente nesta fracção.
Ressuspender a amostra na mistura (3.5.) e centrifugar. Recolher o sobrena-
dante para utilizar tal como esteja, ou dilui-lo, se necessário com a mistura
(3.5.), para obter concentrações de antibiótico de cerca de 100 µg (6.1.) e
5 µg (6.2.) por ml.
7.Detecção e identificação
7.1.Cromatografia
Mergulhar o papel na solução tampão pH 3,5 (3.1.). Eliminar o excesso
de líquido comprimindo o papel entre folhas de papel de filtro seco. Em
seguida, depositar no papel, volumes de 0,01 mldas soluções de
referência (5.2. e 5.3.) e do extracto (6.1. e 6.2.). Para obter uma boa
separação é muito importante, o teor apropriado de humidade do papel;
deixar secar ligeiramente, se necessário.
Revelar por cromatografia ascendente. Utilizar o eluente I (3.3.) para a
detecção por bioautografia, o eluente II (3.4.) para a detecção aos UV.
Logo que a linha de frente do solvente atingir 15 a 20 cm de altura
(cerca de 1 h 30 m), interromper a cromatografia e secar o papel.
7.2.Detecção aos UV
Logo que a concentração de antibiótico seja superior a 1 µg/cm
2,
observam-se manchas fluorescentes douradas por irradiação com UV
(4.4.), após tratamento do cromatograma por vapores amoniacais (3.7.).1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 16
▼B
7.3Detecção por bioautografia
Deitar o meio de cultura (3.10.), previamente inoculado com B. cereus
(3.9.), sobre placas de vidro (4.5.) e colocar o papel sobre o meio de
cultura. Depois de 5 minutos de contacto, tirar o papel e colocá-lo sobre
um outro ponto do meio de cultura, onde deve ser mantido durante o
período de incubação. Incubar em seguida, durante uma noite, na estufa
a 30 ºC. A presença de um antibiótico do grupo das tetraciclinas reco-
nhece-se por zonas de inibição claras no meio de cultura turvo.
Para fixar o cromatograma, vaporiza-se a solução (3.11.) sobre o papel,
depois da incubação.
7.4.Identificação
Dão-se a seguir os valores Rf relativos dos antibióticos do grupo das
tetraciclinas. Estes valores podem variar ligeiramente, conforme a quali-
dade do papel e o seu teor de humidade.
Clorotetraciclina (CTC) 0,60
Tetraciclina (TC) 0,40
Oxitetraciclina (OTC) 0,20
4-epi-CTC 0,154-epi-TC 0,13
4-epi-OTC 0,10
Os compostos «epi» têm uma actividade antibiótica inferior à dos
compostos normais.
2.DOSEAMENTO DA CLOROTETRACICLINA, DA OXITETRACI-
CLINA E DA TETRACICLINA
A. POR DIFUSÃO EM ÁGAR-ÁGAR
1.Objecto e domínio da aplicação
Este método permite dosear a clorotetraciclina (CTC), a oxitetraciclina
(OTC) e a tetraciclina (TC) nos alimentos, concentrados e pré-misturas. O
limite inferior do doseamento é de 5 ppm. Os teores inferiores a 5 ppm
podem ser estimados por extrapolação gráfica.
2.Princípio
Para os teores iguais ou inferiores a 50 ppm, a amostra é submetida a
extracção pela formamida diluída. Para os teores superiores a 50 ppm,
procede-se à extracção por uma mistura de acetona, água e ácido clorídrico
para o doseamento da CTC, e por uma mistura de metanol e de ácido clorí-
drico para o doseamento da OTC e da TC.
Os extractos são em seguida diluídos e a sua actividade antibiótica é determi-
nada pela medição da difusão da CTC, da OTC ou da TC, em meio de ágar-
-ágar, inoculado com B. cereus. A difusão é indicada pela formação de zonas
de inibição em presença de um microrganismo. O diâmetro dessas zonas é
directamente proporcional ao logaritmo da concentração do antibiótico.
3.Microrganismo: B. cereus ATCC n.
o11.778
3.1.Conservação da estirpe
Inocular B cereus em ágar-ágar inclinado em tubo, constituído pelo
meio de cultura (4.1.) sem azul de metileno nem ácido bórico. Incubar
durante uma noite a cerca de 30 ºC. Conservar a cultura no frigorífico e
repicar, de 14 em 14 dias para ágar-ágar inclinado.
3.2.Preparação da suspensão de esporos
Recolher as bactérias de um tubo de ágar-ágar inclinado (3.1.). com 2 a
3 ml de soro fisiológico (4.5.). Inocular com esta suspensão um frasco
de Roux contendo 300 ml do meio de cultura (4.1.), sem azul de meti-
leno nem ácido bórico, com uma concentração de ágar-ágar de 3 a 4 %.
Incubar 3 a 5 dias a 28-30 ºC, recolher em seguida os esporos em 15 ml
de etanol (4.6.), depois de ter verificado a esporulação ao microscópio, e
homogeneizar. Esta suspensão pode ser conservada no frigorífico
durante 5 meses, pelo menos.
Por ensaios preliminares em placas com o meio de base do doseamento
(4.1.), determinar a quantidade de inóculo que permite obter, para as
diferentes concentrações de antibiótico utilizadas, zonas de inibição tão
extensas quanto possível e que estejam ainda límpidas. Esta quantidade1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 17
▼B
é geralmente de 0,2 a 0,3 ml/1 000 ml. A inoculação do meio de cultura
faz-se entre 50 e 60 ºC.
4.Meios de cultura e reagentes
4.1. Meio de base do doseamento (1)
Glicose 1 g
Peptona trípsica 10 g
Extracto de carne 1,5 g
Extracto de levedura 3 gÁgar-ágar, segundo a quantidade 10 a 20 g
Tween 80 1 ml
Tampão fosfato, pH 5,5 (4.2) 10 mlSolução de ácido bórico a 5 % (p/v) 15 ml
Solução etanólica de azul de metileno a 5 % 4 ml
Água destilada para 1 000 ml
Ajustar a pH 5,8 antes da utilização
4.2. Tampão fosfato, pH 5,5
Fosfato monopotássico KH
2PO4p.a. 130,86 g
Fosfato disódico Na2HPO4·2 H2O p.a. 6,947 g
Água destilada para 1 000 ml
4.3. Tampão fosfato, pH 5,5 diluído a 1/10.
4.4 Tampão fosfato, pH 8
Fosfato monopotássico KH2PO4p.a. 1,407 g
Fosfato dissódico Na2HPO4·2 H2O p.a. 57,539 g
Água destilada para 1 000 ml
4.5. Soro fisiológico esterilizado
4.6. Etanol a 20 % (v/v).4.7. Ácido clorídrico 0,1 N.
4.8. Formamida a 70 % (v/v): preparar, de fresco, antes de utilizar e ajustar
o pH 4,5 com ácido sulfúrico 2 N, aproximadamente.
4.9. Mistura de acetona pura/água/ácido clorídrico (d: 1,19): 65/33/2, em
volume.
4.10. Mistura de metanol puro/ácido clorídrico (d: 1,19): 98/2 em volume.4.11. Substâncias-padrão: CTC, OTC, TC cuja actividade é expressa em
cloridrato.
5.Soluções-padrão
5.1.Clorotetraciclina
Preparar, a partir da substância-padrão (4.11.) com ácido clorídrico
(4.7.) uma solução-mãe cuja concentração corresponda a 500 µg de
clorotetraciclina-HCl por ml. Esta solução conserva-se uma semana no
frigorífico.
A partir desta solução-mãe, preparar uma solução-padrão de trabalho S
8cuja concentração corresponda a 0,2 µg de clorotetraciclina-HCl por ml.
A diluição é feita com tampão fosfato, pH 5,5, diluído 1/10 (4.3.), com
0,01 % de negro de amido (2).1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 18
(1) Pode ser utilizado qualquer meio de cultura comercial de composição análoga e que
conduza aos mesmos resultados.
(2) O negro de amido serve para caracterizar as zonas de inibição das soluções-padrão
(aneis azuis).
▼B
Preparar em seguida, por diluições sucessivas (1 + 1) com tampão (4.3.),
as seguintes concentrações:
S40,1 µg/ml
S20,05 µg/ml
S10,025 µg/ml
5.2.Oxitetraciclina
Procedendo como indicado em (5.1.), preparar, a partir de uma solução-
-mãe cuja concentração corresponda a 400 µg de oxitetraciclina-HCl por
ml, uma solução-padrão de trabalho S8a 1,6 µg de oxitetraciclina-HCl
por ml e as seguintes concentrações:
S40,8 µg/ml
S20,4 µg/ml
S10,2 µg/ml
5.3.Tetraciclina
Procedendo com indicado em (5.1.), preparar, a partir de uma solução-
-mãe cuja concentração corresponda a 500 µg de tetraciclina-HCl por ml,
uma solução-padrão de trabalho S8a 1,0 µg de tetraciclina-HCl por ml e
as seguintes concentrações:
S40,5 µg/ml
S20,25 µg/ml
S10,125 µg/ml
6.Extracção
6.1.Teores iguais ou inferiores a 50 ppm
Tratar a amostra pela formamida (4.8.), segundo as indicações dadas no
quadro abaixo inserido. Agitar durante 30 minutos numa mesa vibrató-
rioa. Diluir imediatamente a seguir com tampão fosfato (4.3.), segundo
as indicações dadas no quadro abaixo inserido, para se obter a concen-
tração U8. A concentração de formamida desta solução não deve
ultrapassar 40 %. Centrifugar ou deixar decantar de forma a obter uma
solução límpida.
Preparar em seguida as concentrações U4,U2eU1, por diluições suces-
sivas (1 + 1) com tampão fosfato (4.3.).
Antibiótico CTC OTC TC
Concentração
esperada em ppm 10 50 10 50 10 50
Amostra em g 10 10 24 9,6 20 10
ml de formamida
(4.8.) 100 100 80 100 80 100
ml de tampão
fosfato (4.3.)dil.
1: 5
(a)dil.
1: 25
(b)70 200 120dil.
1: 5
(a)
Concentração U8em µg/ml 0,2 0,2 1,6 1,6 1,0 1,0
(a) Recolher 20 ml de extracto e completar para 100 ml com o tampão num balão
aferido.
(b) Recolher 4 ml de extracto e completar para 100 ml com o tampão num balão
aferido.1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 19
▼B
6.2.Teores superiores a 50 ppm
6.2.1. Clorotetraciclina
Tratar, segundo a concentração esperada de antibiótico da
amostra total ou a sua garantia de fabrico, uma toma de ensaio
de 2 a 10 g por 20 vezes o seu volume de mistura (4.9.). Agitar
durante 30 minutos em mesa vibratória. Verificar que o pH se
mantém inferior a 3 no decorrer da extracção; se for necessário,
ajustar a pH 3 (para os compostos minerais, com ácido acético a
10 %), Recolher uma alíquota do extracto e ajustar o pH a 5,5,
com tampão fosfato, pH 8 (4.4.) em presença de verde de bromo-
cresol (passagem do amarelo a azul). Diluir com o tampão
fosfato, pH 5,5 diluído 1/10 (4.3.) para obter a concentração U6(ver 6.1.).
Preparar, em seguida, as concentrações U4,U2eU1por diluições
sucessivas (1 + 1) com tampão fosfato (4.3.).
6.2.2. Oxitetraciclina e tetraciclina
Proceder como indicado em (6.2.1.), substituindo mistura (4.9.)
pela mistura (4.10.).
7.Método de doseamento
7.1.Inoculação do meio de cultura
Inocular a 50-60 ºC o meio de base do doseamento (4.1.) com a
suspensão de esporos (3.2.).
7.2Preparação das placas
A difusão em ágar-ágar efectua-se em placas com as 4 concentrações da
solução-padrão (S8,S4,S2,S1) e as 4 concentrações do extracto (U8,U4,
U2,U1). Cada placa deve receber necessariamente as 4 concentrações do
padrão e do extracto.
Para este efeito, escolher as dimensões das placas de tal forma que se
possam fazer no meio de ágar-ágar, pelo menos 8 cavidades de 10 a
13 mm de diâmetro. Calcular a quantidade de meio de cultura inoculado
(7.1.) a utilizar, de forma a obter uma camada uniforme de cerca de
2 mm de espessura, aproximadamente. É preferível utilizar placas de
vidro munidas de um anel de alumínio ou de matéria plástica completa-
mente liso de 200 mm de diâmetro e 20 mm de altura.
Introduzir com a pipeta nas cavidades quantidades rigorosamente
medidas de solução de antibiótico, compreendidas entre 0,10 e 0,15 ml,
conforme o diâmetro.
Para cada amostra, fazer pelo menos 4 repetições de difusão com cada
concentração, de forma a que cada doseamento seja objecto de uma
avaliação de 32 zonas de inibição.
7.3.Incubação
Incubar as placas durante cerca de 18 horas a 28-30 ºC.
8.Avaliação
Medir o diâmetro das zonas de inibição, de preferência por projecção.
Inscrever as medidas em papel semilogarítmico, correlacionando o logaritmo
das concentrações com os diâmetros das zonas de inibição. Traçar as rectas
representativas da solução-padrão e do extracto. Na ausência de interferên-
cias, as duas rectas devem ser paralelas.
O logaritmo da actividade relativa é calculado por meio da seguinte fórmula:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C1 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Actividade real = actividade esperada × actividade relativa
9.Reprodutibilidade
A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas na
mesma amostra não deve ultrapassar 10 %, em valor relativo.1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 20
▼B
B. POR TURBIDIMETRIA
1.Objecto e domínio de aplicação
Este método permite dosear a clorotetraciclina (CTC), a oxitetraciclina
(OTC) e a tetraciclina (TC) em concentrações superiores a 1 g/kg desde que
nenhuma outra substância interfira dando lugar a extractos túrbidos. Este
método é mais rápido do que o método de difusão em ágar-ágar.
2.Princípio
A amostra é submetida a extracção por uma mistura de acetona, água e ácido
clorídrico para o doseamento de CTC, e por uma mistura de metanol e de
ácido clorídrico para o doseamento de OTC e TC.
Os extractos são em seguida diluídos e o seu efeito antibiótico é determinado
pela medição da transmissão luminosa de um meio de cultura inoculado com
Staphylococcus aureus, com adição do antibiótico. A transmissão luminosa é
função da concentração do antibiótico.
3.Microrganismo: Staphilococcus aureus K 141 (1)
3.1.Conservação da estirpe
Inocular S. aureus em ágar-ágar inclinado em tubo, constituído pelo
meio de cultura (4.1.), com adição de 1,5 a 3 % de ágar-ágar (conforme
a qualidade). Incubar durante uma noite a 37 ºC. Conservar a cultura no
frigorífico e repicar de 4 em 4 semanas para ágar-ágar inclinado.
Preparar simultaneamente subculturas para uso de laboratório.
3.2.Preparação do inóculo
Repicar 24 horas antes da sua utilização, uma subcultura para ágar-ágar
inclinada e incubar durante uma noite a 37 ºC. Ressuspender a totali-
dade da cultura de um tubo de ágar-ágar em cerca de 2 ml do meio de
base (4.1.) e transvasar em seguida a suspensão em condições de esteri-
lidade em cerca de 100 ml, aproximadamente, do mesmo meio de base
(4.1.). Incubar em banho-maria a 37 ºC, até que o cresimento da estirpe
entre na fase logarítmica (1 h 30 a 2 h).
4.Meio de cultura e reagentes
4.1.Meio de base do doseamento (2)
Peptona 5 g
Extracto de levedura 1,5 gExtracto de carne 1,5 g
Cloreto de sódio 3,5 g
Glicose 1,0 gFosfato monopotássico KH
2PO4p.a. 1,32 g
Fosfato bipotássico K2HPO4p.a. 3,68 g
Água destilada para 1 000 ml
pH depois da esterilização: 6,8 a 7,0
4.2.Tampão fosfato, pH 4,5
Fosfato monopotássico KH2PO4p.a. 13,6 g
Agua destilada para 1 000 ml
4.3. Ácido clorídrico 0,1 N.
4.4. Mistura de acetona pura/água/ácido clorídrico (d: 1,19): 65/33/2 em
volume.
4.5. Mistura de metanol puro/ácido clorídrico (d: 1,19): 98/2 em volume.
4.6. Solução de formaldeído a, aproximadamente, 10 % (p/v).1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 21
(1) Esta estirpe, isolada pela LUFA en Kiel, apresenta um crescimento mais rápido do que
S. aureus ATCC 6538 P .
(2) Podo ser utilizado qualquer meio de cultura comercial de composição análoga e condu-
zindo aos mesmos resultados.
▼B
4.7. Substâncias-padrão: CTC, OTC, TC, cuja actividade é expressa em
cloridrato.
5.Solução-padrão
Preparar, a partir da substância-padrão (4.7.) com ácido clorídrio (4.3.), uma
solução-mãe cuja concentração corresponda a 400 a 500 µg de CTC-HCl,
OTC-HCl ou TC-HCl por ml. Esta solução conserva-se uma semana no
frigorífico.
6.Extracção
6.1.Clorotetraciclina
Introduzir num balão aferido de 200 ou 250 ml uma amostra de 1 a 2 g.
Adicionar cerca de 100 ml da mistura (4.4.) e agitar durante 30 minutos
sobre uma mesa vibratória. Completar o volume com tampão fosfato,
pH 4,5 (4.2.). Homogeneizar e deixar depositar.
6.2.Oxitetraciclina e tetraciclina
Introduzir num balão aferido de 200 ou 250 ml uma amostra de 1 a 2 g.
Adicionar 100 ml, aproximadamente, da mistura (4.5.) e agitar durante
30 minutos sobre a mesa vibratória. Completar, o volume com tampão
fosfato, pH 4,5 (4.2.). Homogeneizar e deixar depositar.
7.Método de doseamento
7.1.Preparação de séries-padrão e de extracto
Diluir de forma apropriada com tampão fosfato, pH 4,5 (4.2.) a solução-
-padrão (5.) e extracto (6.) de forma a obter uma série de concentrações
que permita estabelecer, para cada doseamento, uma curva-padrão e a
interpolação, nesta curva, de pelo menos dois valores relativos ao
extracto. As diluições devems er escolhidas em função das condições
de crescimento da estirpe, que podem variar de um laboratório para
outro. Procede-se geralmente, como se segue:
7.1.1. Clorotetraciclina
Diluir a solução-padrão (5.) com tampão fosfato (4.2.) para obter
uma solução-padrão de trabalho cuja concentração corresponda a
0,2 µg de CTC-HCl por ml. Preparar seguidamente com tampão
fosfato (4.2) como indicado a seguir e em tubos destinados ao
doseamento, 6 diluições, com uma repetição de cada diluição.
ml de solução-padrão
de trabalhoml de tampão fosfato
(4.2.)concentração de
CTC-HCl
(µg/ml)
0,7 0,3 0,14
0,6 0,4 0,12
0,55 0,45 0,11
0,45 0,55 0,09
0,4 0,6 0,08
0,3 0,7 0,06
Diluir o extracto (6.1.) com tampão fosfato (4.2.) para obter uma
concentração esperada de CTC-HCl de 0,12 µg/l. Introduzir 1 ml
desta solução em 2 tubos e 0,75 ml (= 0,09 µg) em outros 2
tubos. Completar o volume destes últimos para 1 ml com tampão
fosfato (4.2.).
7.1.2. Oxitetraciclina e tetraciclina
Diluir a solução-padrão (5.) com tampão fosfato (4.2.) para obter
uma solução uma solução-padrão de trabalho cuja concentração
corresponda a 0,6 µg de OTC-HCl ou de TC-HCl por ml.
Preparar em seguida com tampão fosfato (4.2.), como indicado a
seguir, e nos tubos destinados ao doseamento, 7 diluições com
uma repetição de cada diluição.1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 22
▼B
ml de solução-padrão
de trabalhoml de tampão fosfato
(4.2.)concentração em
OTC-HCl ou CT-HCl
(1µg/ml)
0,9 0,1 0,54
0,8 0,2 0,48
0,7 0,3 0,42
0,6 0,4 0,36
0,4 0,6 0,24
0,3 0,7 0,18
0,2 0,8 0,12
Diluir o extracto (6.2.) com tampão fosfato (4.2.) para obter uma
concentração téorica de OTC-HCl ou TC-HCl de 0,48 µg/ml.
Introduzir 1 ml desta solução em 2 tubos e 0,5 ml (= 0,24 µg)
em outros 2 tubos. Completar o volume destes últimos para 1 ml
com tampão de fosfato (4.2).
7.2.Inoculação do meio de cultura
Inocular o meio de base de doseamento (4.1.) com o inóculo (3.2.), de
forma a obter no fotómetro em 590 nm, uma transmissão luminosa de
85 %, numa «cuvette» de 5 cm, ou 92 % numa «cuvette» de 2 cm,
estando o aparelho regulado para 100 % de transmissão com o meio de
base (4.1.) não inoculado.
7.3.Inoculação
Introduzir em cada tubo (7.1.1. ou 7.1.2.) 9 ml do meio de cultura
inoculado (7.2.). O enchimento dos tubos deve fazer-se correctamente,
mas não necessariamente em condições de esterilidade.
7.4.Incubação
A incubação deve fazer-se, obrigatoriamente, num banho-maria cuja
temperatura seja mantida homogeneamente a 37 ºC ± 0,1 ºC, por
agitação. O tempo de incubação deve ser escolhido de forma a poder
traçar curvas de transmissão, cuja inclinação seja adequada a medições
rigorosas (geralmente 2 h 30 a 3 h). Bloquear em seguida o crescimento,
injectando rapidamente 1 ml de solução de formaldeído (4.6.) em cada
tubo.
7.5.Medição do crescimento
Medir as transmissões no fotómetro a 590 nm, regulando o aparalho
para 100 % de transmissão com a solução-padrão mais límpida (corres-
pondente ao teor mais elevado de antibiótico). Em virtude das fracas
diferenças de turbidez apresentadas por diferentes tubos, recomenda-se
a utilização de cuvettes de 2 cm, pelo menos, e, de preferência, de 5 cm.
8.Cálculo dos resultados
Traçar graficamente a curva-padrão em papel milimétrico, marcando as trans-
missões fotométricas em correlação com as concentraçãoes de antibiótico.
Interpolar na curva as transmissões relativas ao extracto. Calcular o teor de
antibiótico da amostra.
9.Reprodutibilidade
A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas na
mesma amostra não deve ultrapassar 10 %, em valor relativo.
3.DOSEAMENTO DA OLEANDOMICINA
— por difusão em ágar-ágar —
1.Objecto e domínio de aplicação
Este método permite dosear a oleandomicina em alimentos, concentrados e
pré-misturas, mesmo em presença de tetraciclina. O limite inferior do dosea-
mento é de 0,5 ppm.1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 23
▼B
2.Princípio
A amostra é submetida a extracção por uma solução metanólica diluída de
tris (hidroximetil) aminometano. Depois da centrifugação, o extracto é
diluído e a sua actividade antibiótica determinada pela medição da difusão
da oleandomicina em meio de ágar-ágar inoculado com B. cereus . A difusão
é indicada pela formação de zonas de inibição em presença do microrga-
nismo. O diâmetro destas zonas é directamente proporcional ao logaritmo
da concentração do antibiótico.
3.Microrganismo B. cereus K 205 TR (1) (resistente às tetraciclinas)
3.1.Conservação da estirpe
Inocular B. cereus em ágar-ágar inclinado em tubo, constituído pelo
meio de cultura (4.1.) com adição de 100 µg de oxitetraciclina por
5 ml. Incubar durante uma noite a cerca de 30 ºC. Conservar a cultura
no frigorífico e repicar de 4 em 4 semanas em ágar-ágar inclinado.
3.2.Preparação da suspensão de esporos
Recolher as bactérias de um tubo de ágar-ágar inclinado (3.1.) com
cerca de 3 ml de soro fisiológico (4.3.). Inocular com esta suspensão
um frasco de Roux contendo 300 ml do meio de cultura (4.1.) cuja
concentração de ágar-ágar seja de 3 a 4 % . Incubar 3 a 5 dias a 28-
-30 ºC, recolher em seguida os esporos em 15 ml de etanol (4.4.),
depois de ter verificado a esporulação ao microscópio e homogeneizar.
Esta suspensão pode ser conservada no frigorífico durante 5 meses, pelo
menos.
Por ensaios preliminares em placas com o meio de base de doseamento
(4.2.), determinar a quantidade de inóculo, que permite obter, para as
diferentes concentrações de oleandomicina utilizadas, zonas de inibição
tão extensas quanto possível e que sejam ainda límpidas. Esta quanti-
dade é geralmente de 0,1 a 0,2 ml/1 000 ml. A inoculação do meio de
cultura faz-se a 60 ºC.
4.Meios de cultura e reagentes
4.1.Meio de conservação da estirpe (2)
Glicose 1 g
Peptona trípsica 10 gExtracto de carne 1,5 g
Extracto de levedura 3 g
Ágar-ágar, conforme a
qualidade10 a 20 g
Água destilada para 1 000 ml
Ajustar o pH a 6,5 no momento da utilização.
4.2.Meio de base de doseamento (
2)
Meio (4.1.) ajustado a pH 8,8
4.3. Soro fisiológico esterilizado4.4. Etanol a 20 % (v/v)
4.5. Metanol puro
4.6. Solução de tris (hidroximetil) aminometano p.a. a 5 % (p/v)
4.7.Solução de extracção
Metanol puro 50 ml
Água destilada 50 mlTris (hidroximetil)1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 24
(1) Estirpe isolada pela LUFA, em Kiel.
(2) Pode ser utilizado qualquer meio de cultura comercial de composição análoga e condu-
zindo aos mesmos resultados.
▼B
aminometano p.a. 0,5 g
4.8. Substância-padrão: oleandomicina de actividade conhecida.
5.Solução-padrão
Dissolver a substância-padrão (4.8.) em 5 ml de metanol (4.5.) e diluir com a
solução (4.6.) para se obter uma concentração em oleandomicina de 100 µg/
/ml.
A partir desta solução-mãe preparar, diluindo com a solução (4.6.), uma
solução-padrão de trabalho S8contendo 0,1 µg de oleandomicina por ml.
Preparar em seguida, por diluições sucessivas (1 + 1) com a solução (4.6.),
as seguintes soluções:
S40,05 µg/ml
S20,025 µg/ml
S10,0125 µg/ml
6.Extracção
Recolher, conforme a concentração esperada de oleandomicina da amostra,
uma toma de ensaio de 2 a 10 g, adicionar 100 ml da solução (4.7.) e agitar
durante 30 minutos na mesa vibratória.
Centrifugar, recolher uma alíquota do extracto e diluir com a solução (4.6.)
para obter uma concentração teórica de oleandomicina de 0,1 µg/ml (= U8).
Preparar em seguida as concentrações U4,U2eU1por diluições sucessivas
(1 + 1) com a solução (4.6.).
7.Método de doseamento
7.1.Inoculação do meio de cultura
Inocular a 60 ºC o meio de base do doseamento (4.2.) com a suspensão
de esporos (3.2.).
7.2.Preparação das placas
A difusão em ágar-ágar é efectuada em placas com as 4 concentrações
da solução-padrão (S8,S4,S2,S1) e as 4 concentrações do extracto (U8,
U4,U2,U1). Cada placa deve receber necessariamente as 4 concentrações
do padrão e do extracto.
Para este efeito, escolher as dimensões das placas de forma a que se
possam fazer, no meio de ágar-ágar, pelo menos 8 cavidades de 10 a
13 mm de diâmetro. Calcular a quantidade do meio de cultura inoculado
(7.1.) a utilizar, de forma a obter uma camada uniforme de cerca de
2 mm, aproximadamente de espessura. É preferível utilizar placas de
Petri munidas de um anel de alumínio ou de matéria plástica perfeita-
mente plano de 200 mm de diâmetro e 20 mm de altura.
Introduzir com uma pipeta nas cavidades quantidades rigorosamente
medidas de solução de antibiótico, compreendidas entre 0,10 e 0,15 ml,
conforme o diâmetro.
Para cada amostra, fazer pelo menos 4 repetições de difusão com cada
concentração, de forma a que cada doseamento seja objecto de uma
avaliação de 32 zonas de inibição.
7.3.Incubação
Incubar as caixas durante cerca de 18 h a 28-30 ºC.
8.Avaliação
Medir o diâmetro das zonas de inibição de preferência por projecção.
Inscrever os valores de medições em papel semilogarítmico, correlacionando
o logaritmo das concentrações com os diâmetros das zonas de inibição.
Traçar as rectas da solução-padrão e do extracto. Na ausência de interferên-
cias as duas rectas devem ser paralelas.
O logaritmo da actividade relativa é calculado por meio da seguinte fórmula:1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 25
▼B
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C1 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Actividade real = actividade esperada × actividade relativa.
9.Reprodutibilidade
A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas na
mesma amostra não deve ultrapassar 10 %, em valor relativo.
4.DOSEAMENTO DA TILOSINA
— por difusão em ágar-ágar —
1.Objecto e domínio de aplicação
Este método permite dosear a tilosina em alimentos, concentrados e pré-
-misturas. O limite inferior do doseamento é de 2 ppm.
2.Princípio
A amostra é tratada por uma solução de tampão fosfato a pH 8, previamente
aquecido a 80 ºC, e submetida em seguida a extracção pelo metanol. Após
centrifugação, o extracto é diluído e a sua actividade antibiótica determinada
pela medição da difusão da tilosina num meio de ágar-ágar, inoculado com a
Sarcina lutea . A difusão é indicada pela formação de zonas de inibição em
presença do microrganismo. O diâmetro destas zonas é directamente propor-
cional ao logaritmo da concentração do antibiótico.
3.Microrganismo Sarcina lutea ATCC n.o9341
3.1.Conservação da estirpe
Inocular Sarcina lutea em ágar-ágar inclinado em tubo, constituído pelo
meio de cultura (4.1.), com o pH ajustado a 7,0. Incuabar durante uma
noite a cerca de 35 ºC. Conservar a cultura no frigorífico e repicar todos
os meses para ágar-ágar inclinado.
3.2.Preparação da suspensão de bactérias
Recolher as bactérias de um tubo de ágar-ágar inclinado (3.1.) de prepa-
ração recente, com 2 a 3 ml de soro fisiológico (4.4.). Inocular com esta
suspensão um frasco de Roux contendo 250 ml do meio de cultura
(4.1.), com o pH ajustado a 7,0. Incubar durante 24 horas a 35 ºC, reco-
lher as bactérias com 25 ml de soro fisiológico (4.4.). Homogeneizar e
diluir esta suspensão para obter uma transmissão luminosa de cerca de
75 % a 650 nm.
Conservada no frigorífico, esta suspensão é utilizável durante uma
semana.
Por ensaios preliminares em placas com o meio de base de doseamento
(4.1.), determinar a quantidade de inóculo que permite obter, para as
diferentes conoentrações de tilosina utilizada, zonas de inibição tão
extensas quanto possível e que estejam ainda límidas. A inoculação do
meio de cultura é feita a 48—50 ºC.
4.Meios de cultura e reagentes
4.1.Meio de base do doseamento (1)
Glicose 1 g
Peptona trípsica 10 gExtracto de carne 1,5 g
Extracto de levedura 3 g
Ágar-ágar, conforme a qualidade 10 a 20 g1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 26
(1) Pode ser utilizado qualquer meio de cultura comercial, de composição análoga e condu-
zindo aos mesmos resultados.
▼B
Água destilada para 1 000 ml
Ajustar no momento da utilização a pH 7,0 para a conservação da
estirpe e a preparação da suspensão de bactérias e a pH 2,0 para o dose-
amento.
4.2.Tampão fosfato pH 8
Fosfato monopotássico KH2PO40,523 g
Fosfato bipotássico K2HPO4p.a. 16,730 g
Água destilada para 1 000 ml
4.3.Tampão fosfato, pH 7
Fosfato monopotássico KH2PO4p.a. 5,5 g
Fosfato bipotássico K2HPO4p.a. 13,6 g
Água destilada para 1 000 ml
4.4. Soro fisiológico esterilizado
4.5. Metanol puro
4.6. Metanol a 10 % (v/v)
4.7. Mistura tampão fosfato (4.2.)/metanol puro: 60/40, em volume.
4.8. Substância-padrão: tilosina de actividade conhecida.
5.Soluções padrão
Secar a substância-padrão (4.8.) durante 3 h a 60 ºC numa estufa de vácuo
(5 mm de mercúrio). Pesar 10 a 50 mg num balão aferido, dissolvê-los em
5 ml de metanol (4.5.) e diluir a solução com o tampão fosfato, pH 7 (4.3.)
para obter uma concentração de tilosina-base de 1 000 µg/ml.
A partir desta solução-mãe, preparar, diluindo com a mistura (4.7.), uma
solução-padrão de trabalho S8contendo 2 µg de tilosina-base por ml.
Preparar em seguida, por meio de diluições sucessivas (1 + 1), com a mistura
(4.7), as seguintes concentrações:
S41 µg/ml
S20,5 µg/ml
S10,25 µg/ml
6.Extracção
Recolher, para os concentrados, uma toma de ensaio de 10 g; para as prémis-
turas e alimentos, uma toma de ensaio de 20 g. Adicionar 60 ml de tampão
fosfato, pH 8 (4.2.), previamente aquecido a 80 ºC, e homogeneizar durante 2
minutos (electrodoméstico, Ultra-turrax, etc.).
Em seguida, deixar repousar 10 minutos, adicionar 40 ml de metanol (4.5.) e
homogeneizar durante 5 minutos. Centrifugar, recolher uma alíquota do
extracto e diluir com a mistura (4.7.) para obter uma concentração teórica
de tilosina de 2 µg/ml (= U8). Preparar em seguida as concentrações U4,U2eU1, por meio de diluições sucessivas (1 + 1) com a mistura (4.7).
Para os teores inferiores a 10 ppm, fazer evaporar o extracto a seco num
evaporador rotativo a 35 ºC e ressuspender o resíduo em metanol a 40 %
(4.6).
7.Método de doseamento
7.1.Inoculação do meio de cultura
Inocular a 48—50 ºC o meio de base do doseamento (4.1.), ajustado a
pH 8,0 pela suspensão de bactérias (3.2.).1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 27
▼B
7.2.Preparação das placas
A difusão em ágar-ágar efectua-se em placas com as 4 concentrações da
solução-padrão (S8,S4,S2,S1) e as 4 concentrações do extracto (U8,U4,
U2,U1). Cada placa deve receber necessariamente as 4 concentrações do
padrão e do extracto.
Para este efeito, escolher as dimensões das placas de tal forma que se
possam fazer, no meio de ágar-ágar, pelo menos, 8 cavidades de 10 a
13 mm de diâmetro. Calcular a quantidade do meio de cultura inoculado
(7.1.) a utilizar, de forma a obter uma camada uniforme de cerca de
2 mm de espessura. É preferível utilizar placas de Petri munidas de um
anel de alumínio ou de matéria plástica perfeitamente plana de 200 mm
de diâmetro e 20 mm de altura.
Introduzir com uma pipeta nas cavidades, quantidades rigorosamente
medidas de solução de antibiótico compreendida entre 0,10 e 0,15 ml,
conforme o diâmetro.
Para cada amostra, fazer, pelo menos, quatro repetições de difusão com
cada concentração, de forma a que cada doseamento seja objecto de
uma avaliação de 32 zonas de inibição.
7.3.Incubação
Incubar as placas durante uma noite a 35-37 ºC.
8.Avaliação
Medir o diâmetro das zonas de inibição, de preferência, por projecção.
Inscrever as medidas em papel semilogarítmico, correlacionando o logaritmo
das concentrações com os diâmetros das zonas de inibição. Traçar as rectas
da solução-padrão e do extracto. Na ausência de interferências as duas rectas
devem ser paralelas.
O logaritmo da actividade relativa é calculado por meio da seguinte fórmula:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C1 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Actividade real = actividade esperada × actividade relativa.
9.Reprodutibilidade
A diferença entre os resultádos de duas determinações paralelas efectuadas na
mesma amostra não deve ultrapassar 10 %, em valor relativo.
5.DOSEAMENTO DA VIRGINIAMICINA
— por difusão em agar —
1.Objecto e domínio de aplicação
Este método permite dosear a virginiamicina nos alimentos e prémisturas. O
limite inferior do doseamento é de 2 mg/kg (2 ppm) (1).
2.Princípio
A amostra é submetida a uma extracção por uma solução metanólica de
Tween 80. O extracto é decantado ou centrifugado e em seguida diluído. A
sua actividade antibiótica é determinada pela medição da difusão da virginia-
micina num meio de agar inoculado com Micrococcus luteus . A difusão
revela-se pela formação de zonas de inibição do microrganismo. O diâmetro
dessas zonas é considerado como sendo directamente proporcional ao loga-
ritmo da concentração de antibiótico para a gama das concentrações
utilizadas.1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 28
(1) 1 mg de virginiamicina equivale a 1 000 unidades «UK».▼M2
▼M2
3.Microrganismo: «Micrococcus luteus» ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB
8553)
3.1.Conservação da estirpe
Inocular o meio de cultura (4.1.) com «Micrococcus luteus», em tubos
inclinados. Incubar durante 24 horas a 30 ºC, conservar no frigorífico a
cerca de 4 ºC e renovar a inoculação de 15 em 15 dias.
3.2.Preparação da suspensão bacteriana (a)
Recolher as bactérias de um tubo de agar (3.1.) de preparação recente,
com 2 a 3 ml de solução de cloreto de sódio (4.3.). Inocular com esta
suspensão 250 ml do meio de cultura (4.1.) num frasco de Roux e
incubar durante dezoito a vinte horas a 30 ºC. Recolher as bactérias em
25 ml de solução de cloreto de sódio (4.3.) e homogeneizar.
Diluir a suspensão de1/10, com a solução de cloreto de sódio (4.3.). A
transmissão luminosa da suspensão, medida a 650 nm através de uma
espessura de 1 cm por comparação com a solução de cloreto de sódio
(4.3.), deve ser de cerca de 75 %. Esta suspensão pode ser conservada
uma semana a cerca de 4 ºC.
4.Meios de cultura e reagentes
4.1.Meio de conservação da estirpe e de base do doseamento (b)
Peptona de carne 6,0 g
Triptona 4,0 g
Extracto de levedura 3,0 g
Extracto de carne 1,5 g
Glucose 1,0 g
Agar 10,0 a 20,0 g
Água 1 000 ml
pH 6,5 (após esterilização)
4.2.Tampão fosfato, pH 6
Hidrogenofosfato de potássio, K2HPO42,0 g
Diidrogenofosfato de potássio, KH2PO48,0 g
Água para 1 000 ml
4.3. Solução a 0,8 % (p/v) de cloreto de sódio: dissolver em água 8 g de
cloreto de sódio, diluir para 1000 ml e esterilizar.
4.4. Metanol.4.5. Mistura de tampão fosfato (4.2.) e de metanol (4.4.): 80/20 (v/v).4.6. Solução metanólica a 0,5 % (p/v) de Tween 80: dissolver 5 g de Tween
80 en metanol (4.4.) e diluir para 1 000 ml com metanol.
4.7. Substância-padrão: virginiamicina de actividade conhecida.
5.Soluções-padrão
Dissolver uma quantidade pesada com exactidão da substância-padrão (4.7.)
em metanol (4.4.) e diluir com metanol (4.4.) para obter uma solução-mãe a
1 000 µg de virginiamicina/ml. Conservada em frasco rolhado a 4 ºC, esta
solução é estável durante cinco dias.
Preparar a partir desta solução por diluições sucessivas, com a mistura (4.5.),
as soluções seguintes:
S
81 µg/ml
S40,5 µg/ml
S20,25 µg/ml
S10,125 µg/ml1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 29
(a) Podem ser utilizados outros métodos desde que esteja provado que produzem suspen-
sões bacterianas análogas.
(b) Pode ser utilizado qualquer meio de cultura comercial de composição análoga e que dê
os mesmos resultados.
▼M2
6.Preparação do extracto e das soluções
6.1.Extracção
6.1.1. Produtos cujo teor de virginiamicina não seja superior a 100 mg/
/kg
Pesar 50,0 g de amostra. Adicionar 200 ml de solução (4.6.),
agitar durante 30 minutos, em seguida deixar depositar ou centri-
fugar. Recolher 20 ml do sobrenadante e evaporar até 5 ml, num
evaporador rotativo, a uma temperatura não superior a 40 ºC.
Diluir o resíduo com a mistura (4.5.) para obter uma concen-
tração teórica de virginiamicina de 1 µg/ml (= U8).
6.1.2. Produtos cujo teor de virginiamicina seja superior a 100 mg/kg
Pesar uma quantidade de amostra não superior a 10,0 g e
contendo de 1 a 50 mg de virginiamicina. Juntar 100 ml de
solução (4.6.), agitar durante 30 minutos, em seguida deixar
depositar ou centrifugar. Diluir o sobrenadante com a mistura
(4.5.) para obter uma concentração de virginiamicina de 1 µg/ml
(= U8).
6.2.Soluções do extracto
Preparar a partir da solução U8por diluições sucessivas (1 + 1), com a
mistura (4.5.), as soluções U4(concentração teórica: 0,5 µg/ml), U2(concentração teórica: 0,25 µg/ml) e U1(concentração teórica: 0,125 µg/
/ml).
7.Modalidades de doseamento
7.1.Inoculação do meio de cultura
Inocular a cerca de 50 ºC o meio de base de doseamento (4.1.) com a
suspensão bacteriana (3.2.). Por meio de ensaios preliminares em placas
com o meio (4.1.), determinar a quantidade de suspensão bacteriana que
permite obter, para as diferentes concentrações de virginiamicina, zonas
de inibição tão extensas quanto possível, que ainda sejam límpidas.
7.2.Preparação das placas
A difusão em agar efectua-se em placas com as quatro concentrações da
solução-padrão (S8,S4,S2,S1) e as quatro concentrações do extracto (U8,
U4,U2,U1). Cada placa tem de receber as quatro concentrações do
padrão e do extracto. Para este efeito, escolher a dimensão das placas
de tal forma que se possam cavar no meio de agar pelo menos oito cavi-
dades de 10 a 13 mm de diâmetro cujos centros distem pelo menos
30 mm uns dos outros. Podem utilizar-se como placas, placas de Peetri
tendo sobreposto um anel de alumínio ou de matéria plástica de 200 mm
de diâmetro e 20 mm de altura.
Introduzir nas placas uma quantidade do meio (4.1.), inoculado como
indicado em (7.1.), que permita obter uma camada de cerca de 2 mm
de espessura (60 ml para uma caixa de 200 mm de diâmetro). Deixar
solidificar, fazer as cavidades e depositar nelas os volumes exactamente
medidos das soluções-padrão e do extracto (0,10 a 0,15 ml por cavidade,
conforme o diâmetro). Fazer pelo menos quatro repetições de cada
concentração, de forma que cada determinação seja objecto de uma
avaliação de 32 zonas de inibição.
7.3.Incubação
Incubar as placas durante dezasseis a dezoito horas, a 30 ºC ± 2 ºC.
8.Avaliação
Medir o diâmetro das zonas de inibição com a aproximação de 0,1 mm. Para
cada concentração, registar as medidas médias em papel semi-logarítmico,
marcando o logaritmo das concentrações em correlação com o diâmetro das
zonas de inibição. Traçar as rectas mais ajustadas para a solução-padrão e
para o extracto, procedendo, por exemplo, como se segue:
Determinar o ponto mais apropriado do nível mais baixo da solução-padrão
(SL) aplicando a fórmula:
(a) SL ¼7s1þ4s2þs4/C02s8
101972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 30
▼M2
Determinar o ponto mais apropriado do nível mais elevado da solução-padrão
(SH), aplicando a fórmula:
(b) SH ¼7s8þ4s4þs2/C02s1
10
Determinar da mesma maneira os pontos mais apropriados do extracto para o
nível mais baixo (UL) e o nível mais elevado (UH) substituindo, nas
fórmulas acima mencionadas, S1,S2,S4eS8por U1,U2,U4,U8.
Inscrever os valores SL e SH no mesmo gráfico. Unindo os dois pontos
obtém-se a recta mais ajustada para a solução-padrão. Procedendo da mesma
maneira para UL e UH, obtém-se a recta mais ajustada para o extracto.
Na ausência de qualquer interferência, as rectas devem ser paralelas. Na
prática, consideram-se paralelas quando (SH-SL) e (UH-UL) não diferem
mais de 10 % da sua média.
Se as linhas não forem paralelas, pode eliminar-se quer U1eS1, quer U8eS8.
Os valores SL, SH, UL e UH que permitem obter as rectas mais ajustadas
são então calculados por meio das seguintes fórmulas:
(a′)S L ¼5s1þ2s2/C0s4
6ou5s2þ2s4/C0s8
6
(b′)S H ¼5s4þ2s2/C0s1
6ou5s8þ2s4/C0s2
6
e de fórmulas análogas para UL e UH. A utilização desta alternativa, impõe
que sejam respeitados os mesmos critérios de paralelismo.
A obtenção de um resultado proveniente de três níveis deve ser mencionado
no boletim de análise.
Sendo as rectas consideradas paralelas, calcular o logaritmo da actividade
relativa (log. A) por meio de uma das fórmulas seguintes, segundo o número
de níveis (4 ou 3) utilizados para a avaliação do paralelismo.
Para 4 níveis:
(c) log :A¼u1þu2þu4þu8/C0s1/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;602
u4þu8þs4þs8/C0u1/C0u2/C0s1/C0s2
Para 3 níveis:
(d) log :A¼u1þu2þu4/C0s1/C0s2/C0s4 ðÞ /C2 0;401
u4þs4/C0u1/C0s1
ou
(d′) log :A¼u2þu4þu8/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;401
u8þs8/C0u2/C0s2
Actividade do extracto do extracto da amostra = actividade do padrão corres-
pondente × A:
(U8=S8×A )
Se a actividade relativa se encontrar fora da gama dos valores compreendidos
entre 0,5 e 2,0, repetir a determinação procedendo a ajustamentos das
concentrações do extracto ou, eventualmente, das soluções-padrão. Quando
esta actividade não puder ser introduzida na gama dos valores adequados, o
resultado deve ser considerado como aproximado e esta indicação deve ser
anotada no boletim de análise.
Quando as rectas forem consideradas não paralelas, repetir a determinação.
Se o paralelismo nunca for conseguido, a determinação deve ser considerada
não satisfatória.
Exprimir o resultado em miligramas de virginiamicina por quilograma de
alimento.
9.Reprodutibilidade
A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas na mesma
amostra pelo mesmo analista não deve ultrapassar:
2 mg/kg, em valor absoluto, para os teores de virginiamicina inferiores a
10 mg/kg,1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 31
▼M2
20 % do resultado mais elevado para os teores de 10 a 25 mg/kg,
5 mg/kg, em valor absoluto, para os teores de 25 a 50 mg/kg,
10 % do resultado mais elevado para os teores superiores a 50 mg/kg.1972L0199 — PT — 22.07.1993 — 003.001 — 32