1976L0372 — PT — 19.08.1981 — 001.001 — 1
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►BSÉTIMA DIRECTIVADA COMISSÃO
de 1 de Março de 1976
que fica os métodos de análise comunitários para o controlo oficial dos alimentos para animais
(76/372/CEE)
(JO L 102 de 15.4.1976, p. 8)
Alterada por:
JornalOficial
n.opágina data
►M1 Directiva 81/680/CEE da Comissão de 30 de Julho de 1981 L 246 32 29.8.1981
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SÉTIMA DIRECTIVADA COMISSÃO
de 1 de Março de 1976
que fica os métodos de análise comunitários para o controlo oficial
dos alimentos para animais
(76/372/CEE)
A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,
Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Euro-
peia,
Tendo em conta a Directiva do Conselho de 20 de Julho de 1970, rela-
tiva à introdução dos modos de recolha de amostras e de métodos de
análise comunitários para o controlo oficial dos alimentos paraanimais (
1), com a última redacção que lhe foi dada pelo Acto de
Adesão (2) e, nomeadamente, o seu artigo 2.o,
Considerando que a referida directiva prevê que os controlos oficiais
dos alimentos para animais destinados a verificar o respeito pelascondições exigidas por disposições legislativas, regulamentares ou
administrativas relativas à qualidade e composição dos alimentos para
animais sejam efectuadas mediante modos de recolha de amostras emétodos de análise comunitários;
Considerando que as Directivas 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/
/CEE, 73/46/CEE, 74/203/CEE e 75/84/CEE da Comissão,respectivamente de 15 de Junho de 1971 (
3), 18 de Novembro de
1971 (4), 27 de Abrilde 1972 (5), 5 de Dezembro de 1972 (6), 25 de
Março de 1974 (7), e 20 de Dezembro de 1974 (8), ficaram já um certo
número de métodos de análise comunitários; que, tendo em conta oestado de adiantamento dos trabalhos desde então efectuados importaadoptar uma sétima série de métodos;
Considerando que as medidas previstas na presente diretiva estão em
conformidade com o parecer do Comité Permanente dos Alimentos
para Animais,
ADOPTOU A PRESENTE DIRECTIVA:
Artigo 1.o
Os Estados-membros deverão estipular que as análises destinadas ao
controlo oficial dos alimentos para animais sejam, no que diz respeitoao teor de aflatoxina B
1, efectuadas em conformidade com os métodos
descritos no Anexo à presente directiva.
Artigo 2.o
Os Estados-membros parão em vigor antes de 1 de Outubro de 1976 as
disposições da presente directiva. Deste facto informarão imediata-
mente a Comissão.
Artigo 3.o
Os Estados-membros são destinatários da presente directiva.1976L0372 — PT — 19.08.1981 — 001.001 — 2
(1)J O n .oL 170 de 3. 8. 1970, p. 2.
(2)J O n .oL 73 de 27. 3. 1972, p. 14.
(3)J O n .oL 155 de 12. 7. 1971, p. 13.
(4)J O n .oL 279 de 20. 12. 1971, p. 7.
(5)J O n .oL 123 de 29. 5. 1972, p. 6.
(6)J O n .oL 83 de 30. 3. 1973, p. 21.
(7)J O n .oL 108 de 22. 4. 1974, p. 7.
(8)J O n .oL 32 de 5. 2. 1975, p. 26.▼M1
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ANEXO
ELEMENTO DA AFLATOXINAB1
A. MÉTODO POR CROMATOGRAFIA MONODIMENSIONAL EM
CAMADA FINA
1. Finalidade e objecto de aplicação
Esta técnica permite determinar o teor de aflatoxina B1nos
seguintes alimentos: bagaços de amendoim, copra, linhaça, soja,
gergelim, babaçu e de gérmenes de milho, além de cereais e
produtos cerealíferos, farinha de ervilhas, e polpa e fécula de
batata. O limite mínimo do doseamento é de 0,01 mg/kg (10 ppb).
Na presença de substâncias perturbadoras que dificultam as deter-
minações é conveniente recomeçar a análise utilizando o processo
B (cromatografia bidimensionalem camada fina).
2. Princípio
Submete-se a amostra à extracção por clorofórmio. Filtra-se o
extracto e recolhe-se uma parte alíquota que em seguida se purifica
por cromatografia numa coluna de gel de sílica. Evapora-se o
líquido assim eluído e recolhe-se o seu resíduo com um volume
determinado de clorofórmio ou mistura de benzeno e acetonitrilo.
Submete-se uma parte alíquota desta solução a cromatografia em
camada fina, e determina-se por irradiação UV a quantidade de
aflatocina B1do cromatograma, visualmente ou por fluorometria
densitométrica, comparando com quantidades conhecidas de aflato-
cina B1-padrão. Deverá confirmar-se a detecção de aflatoxina B1extraída do alimento pelos processos adiante indicados.
3. Reagentes
NB: Na ausência de indicações especiais quanto à qualidade dos
reagentes, deverão utilizar-se reagentes da qualidade «para
análise».
3.1. Acetona.
3.2. Clorofórmio, estabilizado com 0,5 a 1,0 % de etanol a 96 % (v/v).
3.3. n-Hexano.
3.4. Metanol.
3.5. Éter dietílico anido, isento de peróxidos3.6. Mistura de benzeno e de acetonitrilo: 98/2 (v/v).
3.7. Mistura de clorofórmio (3.2.) e Metanol (3.4.): 97/3 (v/v).
3.8. Gel de sílice, para cromatografia em coluna, com granulometria de
0,05 a 0,20 mm.
3.9. Algodão hidrófilo, préviamente desengordurado com clorofórmio
ou lã de vidro.
3.10. Sulfato de sódio anidro, granulado.
3.11. Gás inerte, por exemplo: azoto.
3.12. Ácido clorídrico 1 N.
3.13. Ácido sulfúrico a 50 % (v/v).
3.14. Terra de infusórios (Hiflosupercel) lavada con ácido.
3.15. Gel de sílica G-HR ou equivalente, por cromatografia em camada
fina.
3.16. Solução-padrão, de clorofórmio (3.2.) e cerca de 0,1 µg de aflato-
xina B
1por milímetro da mistura de benzeno e acetonitrilo (3.6.),
preparada e verificada como se indica no ponto 7, contendo a
mesma quantidade de aflatoxina B 1.
3.17. Solução-padrão qualitativa, com cerca de 0,1 µg de aflatoxina B1,e
B2por ml, em el clorofórmo (3.2.) ou mistura de benzeno e aceto-
nitrilo (3.6.). Estas concentrações são dadas a título indicativo,1976L0372 — PT — 19.08.1981 — 001.001 — 3
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devendo ser corrigidas de modo que se obtenha a mesma intensi-
dade de fluorescência com ambas as aflatoxinas.
3.18. Diluentes para revelação:
3.18.1. Clorofórmo (3.2.)/acetona (3.1.): 9/1 (v/v), tina não saturada;
3.18.2. Éter dietílico (3.5.)/metanol (3.4.)/água: 96/3/1 (v/v/v), tina não
saturada;
3.18.3. Éter dietílico (3.5.)/metanol (3.4.)/água: 94/4,5/1,5 (v/v/v), tina
saturada;
3.18.4. Clorofórmio (3.2.)/metanol (3.4.): 94/6 (v/v), tina saturada;
3.18.5 Clorofórmio (3.2.)/metanol (3.4.): 97/3 (v/v), tina saturada.
4. Material
4.1. Triturador — misturador
4.2. Aparalho para agitar ou agitador magnético.
4.3. Filtros franzidos Schleicher e Schül n.o588, ou equivalente com
24 cm de diâmetro.
4.4. Tubos de vidro para cromatografia, (diâmetro interno: 22 mm,
comprimento: 300 mm), com torneira de teflon e reservatório de
250 ml.
4.5. Aparelho para evaporação no vácuo, por rotação com balão de
500 mlde base circul ar.
4.6. Frascos cónicos de 500 ml, com tampa esmerilada.
4.7. Instrumentos para cromatografia em camada fina.
4.8. Placas de vidro para cromatografia em camada fina, com
200 × 200 mm, preparadas da seguinte maneira (as quantidades
indicadas são suficientes para cobrir cinco placas): introduzir 30 g
de gelde síl ica G-HR (3.15.) num frasco cónico, juntar 60 mlde
água, tapar e agitar durante um minuto. Espalhar a suspensão sobre
as placas de forma a obter uma camada uniforme de 0,25 mm de
espessura. deixar secar ao ar e conservar em seguida num secador
com gel de sílica. No momento da utilização, activar as placas
mantendo-as durante uma hora em estufa a 110 º C.
Só deverão utilizar-se placas já preparadas na medida em que com
elas se obtenham resultados semelhantes aos das placas preparadas
como acima se indica.
4.9. Lámpada UV de ondas longas (360 nm), com uma intensidade de
irradiação que permita identificar com nitidez, a uma distância de
10 cm da lâmpada, uma mancha de 1,0 ng de aflatoxina B1sobre
a placa de cromatografia em camada fina.
4.10. Tubos de 10 ml, graduados, e com tampa de polietileno con
tapones de polietileno.
4.11. Espectrofotómetro UV
4.12. Fluordensitómetro (eventualmente).
5. Método
5.1. Preparação da amostra (ver «observações», parte C, ponto 1)
Triturar a amostra de modo a passar integralmente através de uma
peneira com malha de 1 mm (de harmonia com a recomendação
ISO R 565).
5.2. Extracção
Introduzir 50,0 g da amostra moída e homogeneizada num frasco
cónico de 500 ml(4.6.). Juntar 25 g de terra de infusórios (3.14.),
25 mlde água e 250 mlde cl orofórmio (3.2.). Tapar o frasco,
sacudir ou agitar durante 30 minutos no aparelho (4.2.) e filtrar no
filtro franzido (4.3.). Deitar fora os 10 primeiros ml do filtrado e
recolher em seguida 50 ml.
5.3. Purificação en coluna
Colocar na extremidade inferior de um tubo para cromatografia
(4.4.) um tampão de algodão ou lã de vidro (3.9.), encher dois1976L0372 — PT — 19.08.1981 — 001.001 — 4
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terços do tubo com clorofórmio (3.2.) e juntar 5 g de sulfato de
sódio (3.10.).
Verificar se a superfície superior da camada de sulfato de sódio se
aoresenta plana e, seguidamente, juntar 10 g de gel de sílica, por
pequenas fracções (3.8.) Mexer com cuidado, após cada adição
fracções (3.8.). Mexer com cuidado, após cada adição, para
eliminar as bolhas de ar.
Deixar depositar, durante 15 minutos, e em seguida juntar com
precaução, 15 g de sulfato de sódio (3.10.). Deixar descer o líquido
até quase à superfície superior da camada de sulfato de sódio.
Misturar os 50 mlde extracto recol hido em (5.2.) com 100 mlde n-
-hexano (3.3.) e passar quantitativamente a mistura para a coluna.
Deixar descer o líquido até à superfície superior da camada de
sulfato de sódio. Retirar o líquido e juntar em seguida 100 ml de
éter dietílico (3.5.) deixando de novo descer o líquido até à
superfície superior da camada de sulfato de sódio. Durante estas
operações controlar o débito de líquido para que seja de 8 a 12 ml
por minuto e não deixar que a coluna fique em seco. Deitar fora os
líquidos vasados. Seguidamente, eluir com 150 ml da mistura de
clorofórmio e metanol (3.7.) e recolher a totalidade do líquido
eluído.
Proceder à evaporação do líquido eluído, practicamente a seco, sob
corrente de gaz inerte (3.11.) e a uma temperatura que não ultra-passe os 50 ºC, por meio do aparelho de evaporação por rotação
no vácuo (4.5.). Com clorofórmio (3.2.) ou mistura de benzeno e
acetonitrilo (3.6.), passar quantitativamente o resíduo para um tubo
de 10 ml(4.10.). Concentrar a sol ução sob corrente de gás inerte
(3.11.) e completar em seguida o volume, com clorofórmio (3.2.)
ou mistura de benzeno e acetonitrilo (3.6.), até obter 2,0 ml.
5.4. Cromatografia em camada fina
Colocar pontualmente sobre a placa para cromatografia em camada
fina (4.8.), a 2 cm de bordo inferior e com intervalos de 2 cm, os
volumes abaixo indicados de solução-padrão e de extracto:
— 10, 15, 20, 30 e 40 µl de solução-padrão de aflatoxina B
1(3.16.);
— 10 µldo extracto obtido em 5.3. e, sobrepostos nos mesmos
pontos, 20 µlde sol ução-padrão (3.16.);
— 10 y 20 µldo extracto obtido em 5.3.
Elaborar o cromatograma ao abrigo da luz, com um dos diluentes
indicados para o efeito (3.18.). A escolha do diluente, que deveráter sido feita previamente, faz-se colocando sobre a placa 12 µl da
solução-padrão qualitativa (3.17.) e verificando em seguida se as
aflatoxinas B
1eB2ficam completamente separadas durante a
operação.
Deixar evaporar os diluentes ao abrigo da luz e fazer em seguida a
irradiação com a lâmpada UV, colocando a placa a 10 cm da
distância da mesma (4.9.). A fluorescência das manchas da aflato-
xina B1é de cor azul.
5.5. Determinaçoes quantitativas
Proceder às determinações, visualmente ou por fluorometriadensito-
métrica, como adiante se indica:
5.5.1. Medição visual
Determinar a quantidade de aflatoxina B, existente no extracto
comparando a intensidade de fluorescência das respectivas manchas
com a das manchas da solução-padrão, se necessário por interpo-
lação-padrão deverá ser superior à dos 10 µl de extracto e dela
deverá apenas resultar uma mancha. Se a intensidade da fluo-
rescência dos 10 µlde extracto for superior à dos 40 µlda sol ução
padrão, diluir o extracto 10 ou 100 vezes antes de submeter a nova
cromatografia sobre camada fina, em clorofórmio (3.2.) ou na
mistura de benzeno e acetonitrilo (3.6.).
5.5.2. Medição por fluorometriadensitómétrica
Medir a intensidade da fluorescência das manchas de aflatoxina B1com o fluorodensitómetro (4.12.), utilizando um comprimento de
onda de excitação de 365 nm e um comprimento de onda de
emissão de 443 nm. Determinar a quantidade de aflatoxina B1dos1976L0372 — PT — 19.08.1981 — 001.001 — 5
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depósitos contidos no extracto comparando as intensidades de fluo-
rescência das manchas do extracto com as da solução-padrão.
5.6. Confirmação da detecção de aflatoxina B1
Confirmar a detecção de aflatoxina B1existente no extracto pelos
seguintes processos:
5.6.1. Tratamento por ácido sulfúrico
Pulverizar o cromatograma obtido em (5.4.) com ácido sulfúrico
(3.13.). Com a irradiação UV, a fluorescência das manchas de afla-
toxina B1deverá passar do azulao amarel o.
5.6.2. Cromatografia bidimensionall evando à formação de
aflatoxina B1— hemiacetal(afl atoxina B2a)
NB: As operações adiante descritas deverão ser efectuadas segundo
e esquema apresentado na figura 3.
5.6.2.1. Aplicação das soluãões
Traçar sobre uma placa de cromatografia (4.8.) duas rectas, para-
lelas respectivamente a dois lados contíguos da placa cada uma
6 cm de distância do lado a que é paralela. Estas rectas destinam-
-se a demarcar p movimento dos bordos dos diluentes. Com pipetas
capilares ou microseringas colocar sobre uma placa as sequintes
soluções:
—no ponto A: um volume de extracto purificado da amostra
obtida em (5.3.) contendo aproximadamente 2,5 nanogramas
de aflatoxina B1;
—nos pontos B e C: 25 µlde sol ução-padrão (3.16.).
5.6.2.2. Revelação
Elaborar o cromatograma segundo a direcção I com diluente para
revelação (3.18.1.) [uma camada de 1 cm em tina não saturada] aoabrigo da luz, até que o bordo do diluente atinja a linha de demar-
cação.
Retirar a placa da tina, deixando-a secar durante 5 minutos ao
abrigo da luz à temperatura ambiente. Pulverizá-la em seguida
com ácido clorídrico (3.12.), mas apenas ao longo de uma faixa
vem indicada a tracejado na figura 3, até ao seu escurecimento,
devendo o resto da placa ter sido protegido com uma placa de
vidro. Deixar reagir durante dez minutos na obscuridade e secar
por corrente de ar à temperatura ambiente.
Elaborar em seguida o cromatograma segundo a direcção II com
diluente de revelação (3.18.1.) [camada de 1 cm em tina não satu-
rada], ao abrigo da luz, até que o bordo do diluente atinja a linha
de demarcação. Retirar a placa da tina e deixar secar à temperatura
ambiente.
5.6.2.3. Interpretação do cromatograma
Examinar o cromatograma à luz (UV (4.9.) e observar a existência
ou não do seguinte:
a) Aparecimento de uma mancha fluorescente azul correspondente
à aflatoxina B
1proveniente da solução-padrão utilizada em C
(movimento na direcção I).
b) Aparecimento de uma mancha fluorescente azul correspondente
à aflatocina B1(que não reagiu ao ácido clorídrico) e de outra
mancha fluorescente azul, mais intensa correspondente à aflato-
xina B1-hemiacetal proveniente da solução-padrão utilizada em
B (movimento na direcção II).
c) Aparecimento de manchas semelhantes às indicadas na alínea
b), provenientes do extracto da amostra utilizado em A. A
posição dessas manchas define-se pela distância percorrida pela
aflatoxina B1, a partir do ponto A, na direcção I (igualà percor-
rida pela solução-padrão utilizada em C) seguida das distâncias
percorridas na direcção II pela aflatocina B1-hemiacetal(distân-
cias iguais às percorridas pela solução padrão utilizada em B).
As intensidades de fluorescência das manchas de hemiacetal
proveniente do extracto e da solução-padrão utilizada em B
deverão coincidir.1976L0372 — PT — 19.08.1981 — 001.001 — 6
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6. Cálculo dos resultados
6.1. A partir da medição visual
Calcula-se o teor de aflatoxina B1, em microgramas por quilograma
de amostra (ppb), mediante a seguinte fórmula:
S/C1Y/C1V
W /C1X
em que:
Y e X correspondem respectivamente aos volumes em microlitros
de solução-padrão de aflatoxina B1(3.16.) e de extracto com fluo-
rescências de intensidade semelhante;
S = concentração de aflatocina B1, em microprogramas por ml
de solução-padrão (3.16.);
V = volume final do extracto em microlitros, tendo em conta as
eventuais dilui-ões;
W = peso, em gramas, da quantidade da amostra de ensaio
correspondente ao colume de extracto submetido a purifi-
cação em coluna.
6.2. A partir da fluorodensitometria
Calcula-se o teor de aflatoxina B1, em microgramas por quilograma
de amostra (ppb) mediante a seguinte fórmula:
S/C1V
W /C1Y
em que:
Y = volume em microlitoros do extracto colocado na placa (10
ou 20 µl);
S = quantidade de aflatoxina B1, em nanogramas (contida no
extracto colocado sobre a placa proporcional a Y), obtida
na mediçã0.
V = volume final do extracto em microlitros, cujo valor deverá
ter em conta as diluições que tenha sido necessário fazer;
W = peso em gramas, da amostra de ensaio correspondente ao
colume de extracto submetido a purificação em coluna.
7. Preparação e verificação da solução-padrão (3.16.)
7.1. Determinação da concentração de aflatocina B1
Preparar uma solução de aflatoxina B1— padrão em clorofórmio
(3.2.) ou mistura de benzeno e acetonitrilo (3.6.) a uma concen-
tração de 8 a 10 µg por mililitro e, com o espectrofotómetro
(4.11.), determinar o espectro de absorção entre 330 e 370 nm.
Medir a densidade óptica (a) 363 nm, caso tenha sido utilizada a
solução clorofórmica ou a 348 nm cas tenha sido utilizada a
mistura de benzeno e acetonitrilo.
Calcular a concentração de aflatoxina B1, em microgramas por
mililitro de solução, a partir das fórmulas seguintes:
312 /C1A/C11 000
20 600(para a solução clorofórmica);
312 /C1A/C11 000
19 800(para a solução com mistura de benzeno e acetoni-
trilo).
Efectuar, ao abrigo da luz, as diluições necessárias à obtenção de
uma solução-padrão de trabalho cuja concentração de aflatoxina
B1, seja aprocimadamente de 0,1 µg por mililitro. Conservada no
frigorífico a 4º C, esta solução mantém-se estável durante duas
semanas.1976L0372 — PT — 19.08.1981 — 001.001 — 7
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7.2. Verificação da pureza cromatográfica
Colocar sobre uma placa (4.8.) 5 µl de solução-padrão com 8-10 µg
de aflatoxina B1por mililitro (ver 7.1.). Elaborar o cromatograma
como se indica em (5.4.). A luz UV, a fluorescência apenas deverá
permitir a percepção de uma única mancha, não devendo observar-
-se qualquer fluorescência na zona em que se havia feito a primeira
deposição.
8. Possibilidade de repetição
A diferença entre os resultados e duas determinações paralelas,
efectuadas com a mesma amostra pelo mesmo analista não deverá
ultrapassar:
— 25 % em relação aos máximos valores obtidos com teores entre
10 e 20 µg/kg de aflatoxina B1,
— 5 µg, em valores absolutos, para teores entre 20 e 50 µg/kg,
— 10 % em relação aos mácimos valores obtidos com teores supe-
riores a 50 µg/kg.
9. Reprodutibilidade
Ver «observações», parte C, ponto 2.
B. MÉTODO DA CROMATOGRAFIA BIDIMENSIONAL EM CAMADA
FINA
1. Finalidade e objecto de aplicação
Esta técnica permite determinar o teor de aflatoxina B1,e m
alimentos para animais aos quais não se aplique o método A. O
limite de doseamento mínimo é de 0,91 mg/kg (10 p.p.b). Esta
técnica não se aplica aos alimentos que contenham polpa de
citrinos.
2. Princípio
Submete-se à amostra à extracção por clorofórmio. Filtra-se o
extracto e recolhe-se dele uma parte alíquota, que se purifica por
cromatografia em coluna de gel de sílica. Evapora-se o líquido
eluído e põe-se o resíduo em contacto com um volume determinado
de clorofórmio ou mistura de benzeno e acetonitrilo. Submete-se
uma parte alíquota desta solução à cromatografia bidimensional
sobre camada fina. Determina-se a quantidade de aflatoxina B1,
por irradiação UV, visualmente ou por fluorodensitometria, por
comparação com quantidades conhecidas da aflatoxina B1-padrão.
A detecção da aflatoxina B1extraída do alimento deve ser confir-
mada pelo processo indicado para o efeito.
3. Reagentes
NB: Caso não sejam dadas indicações especiais, deverão utilizar-se
reagentes de qualidade «para análise».
3.1. Acetona
3.2. Clorofórmio estabilizado com 0,5 a 1,0 % de etanol a 96 % (v/v).3.3. n-Hexano.3.4. Metanol.3.5. Éter dietílico anido, isento de peróxidos.3.6. Mistura de benzeno e de acetonitrilo: 98/2 (v/v).3.7. Mistura de clorofórmio (3.2.) e metanol (3.4.): 97/3 (v/v).3.8. Gel de sílica, para cromatografia em coluna com granulometria de
0,05 a 0,20 mm.
3.9. Algodço hidrófilo, previamente desengordurado com clorofórmio
ou lã de vidro.
3.10. Sulfato de sódio, anídro, granulado.3.11. Gás inerte, por exemplo: ázoto.3.12. Ácido clorídrico 1 N.3.13. Terra de infusórios (hiflosupercel), lavada com ácido.1976L0372 — PT — 19.08.1981 — 001.001 — 8
▼B
3.14. Gel de sílico G-HR ou equivalente, para cromatografia em camada
fina.
3.15. Diluentes de revelação.
3.15.1. Éter dietílico (3.5.)/metanol (3.4.)/água: 94/4,5/1,5 (v/v/v), tina
saturada.
3.15.2. Clorofórmio (3.2.)/acetona (3.1.): 9/1 (v/v) tina não saturada
3.16. Solução-padrão com aproximadamente 0,1 µg de aflatoxina B1por
milímerto de clorofórmio (3.2.) ou mistura de benzeno e acetoni-
trilo (3.6.), preparado e verificado como se indica no ponto 7 do
método A.
4. Material
Ver ponto 4 do método A.
5. Método
5.1. Preparação da amostra
Ver pontos (5.1.), (5.2.) e (5.3.)
do método A/C148/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C149/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C147/C1505.2. Extracção em coluna
5.3. Purificação em coluna
5.4. Cromatografia bidimensional em camada fina.
5.4.1. Aplicação das soluções (seguir o esquema apresentado na
figura 1)
Sobre uma placa (4.8.) traçar duas rectas, paralelas respectivamente
a dois lados contíguos da placa uma a 5 e outra a 6 cm do lado a
que é paralela, as quais se destinam a demarcar o movimento dos
bordos dos diluentes. com pipetas capilares ou microseringas
colocar na planta as soluções adiante indicadas:
—no ponto A, 20 µldo extracto de amostra abtido em (5.3.) puri-
ficado.
—no ponto B, 20 µlde sol ução-padrão (3.16.),
—no ponto C, 10 µlde sol ução-padrão (3.16.),
—no ponto D, 20 µlde sol ução-padrão (3.16.),
—no ponto E, 40 µlde sol ução-padrão (3.16.).
Secar por corrente de ar de fraca intensidade ou gás inerte (3.11.).
As manchas obtidfas devem ser de cerca de 5 mm de diâmetro.
5.4.2. Revelação (seguir o esquema apresentado na figura 1).
Elaborar o cromatograma na direcção I com diluente de revelação,
(3.15.1.) [camada de 1 cm em tina saturada] ao abrigo da luz, até
que o bordo do diluente atinja a linha de demarcação. Retirar a
placa da tina e deixá-la secar durante pelo menos 15 minutos ao
abrigo da luz e à temperatura ambiente.
Elaborar em seguida o cromatograma na direcção II com diluente
de revelação (3.15.2.) [camada de 1 cm em tina não saturada] ao
abrigo da luz, até que o bordo do diluente atinja a linha de demar-
cação. Retirar a placa da tina e deixá-la secar ao abrigo da luz e à
temperatura ambiente.
5.4.3. Leitura do cromatograma (seguir o esquema apresentado na
figura 2).
Submeter o cromatograma à irradiação da lâmpada UV, colocando
a placa a 10 cm da distância desta última (4.9.). Localizar as
manchas de fluorescência azul, B, C, D, e E, correspondentes à
aflatoxina B
1proveniente da solução-padrão e traçar duas rectas
imaginárias, perpendiculares às direcãões I e II, que passem por
essas manchas. O ponto de intersecção P destas rectas será o ponto
onde deverá aparecer a mancha de aflatoxina B1proveniente do
extracto da amostra utilizado em A (figura 1). No entanto, o ponto
realdo aparecimento da manche poderá situar-se no ponto Q,correspondente à intersecção e duas outras rectas imaginárias,
formando entre si um ângulo de cerca de 100 º C, que passem
respectivamente pelas manchas B e C. Determinar como se indica
em (5.5.) a quantidade de aflatoxina B
1existente no extracto de
amostra.1976L0372 — PT — 19.08.1981 — 001.001 — 9
▼B
5.4.4. Cromatografia complementar
Traçar, sobre outra placa (4.8.), duas rectas paralelas respectiva-
mente a dois lados contíguos da placa, como se indica no no
esquema da figura 1, e colocar no ponto A (ver figuara 1) 20 µl
do extracto de amostra obtido em (5.3.), purificado, sobrepondo-
-lhe 20 µl de solução-padrão (3.16.). Revelar como se indica em
(5.4.2.) Irradiar o cromatograma com a lâmpada UV (4.9.) e veri-
ficar se:
— as manchas de aflatoxina B1do extracto e da solução-padrão
coincidem,
— a fluorescência da mancha da solução-padrão é mais intensa
que a da mancha de aflatoxina B1revelada no ponto Q da
primeira placa.
5.5. Determinações quantitativas
Proceder às determinações, visualmente ou por fluorodensitometria,
como adiante se indica:
5.5.1. Medições visuais
Calcular a quantidade de aflatocina B1existente no extracto compa-
rando a intensidade da fluorescência da respectiva mancha com a
das manchas C, D, e E da solução-padrão. Interpolar, se necessário.
Se a fluorescência dos 20 µl de extracto for superior, em intensi-
dade, àdos 40 µl de solução-padrão, diluir o extracto 10 a 100
vezes com clorofórmio (3.2.) ou mistura de benzeno/acetonitrilo
(3.6.) antes de o submeter a nova cromatrografia em camada fina.
5.5.2. Medição por fluorodensitometria
Medir a intensidade da fluorescência das manchas de aflatoxina B1com o fluorodensitómetro (4.12.) utilizando um comprimento de
onda de excitação de 265 nm e um comprimento de onda de
emissão de 443 nm.
Calcular a quantidade de aflatoxina B1existente no depósito do
extracto comparando a intensidade de fluorescência da sua mancha
com a das manchas C, D, e E da solução-padrão.
5.6. Confirmação da detecção de aflatoxina B1
Ver ponto (5.6.) do método A.
6. Cálculo dos resultados
Ver ponto 6 do método A.
7. Possibilidade de repetição
Ver ponto B do método A.
8. Reprodutibilidade
Ver «observações», parte C, ponto 2.
C. OBSERVAÇOES RELATIVAS AOS MÉTODOS A E B
1.Desengorduramento
As amostras que contenham mais de 5 % de substâncias gordas devem ser
desengorduradas com éter de petróleo (eb. 40-50 ºC) após a preparação indi-
cada em (5.1.). Nestes casos, os resultados da análise devem referir-se ao
peso da amostra antes de ter sido desengordurada.
2.Reprodutibilidade dos resultados
La reprodutibilidade dos resultados, isto é, a variabilidade entre os resultados
obtidos por dois ou mais laboratórios a partir de uma mesma amostra, foi
avaliada em:
± 50 % média dos resultados obtidos com valores médios entre 10 e 20 µg/
/kg, de aflatoxina B1/kg;
± 10 µg/kg relativamente à média obtido com valores médios entre 20 e
50 µg/kg,
± 20 % da média obtida com valores médios superiores a 50 µg/kg.1976L0372 — PT — 19.08.1981 — 001.001 — 10
▼B
ANEXO
Figura 1
Figura 21976L0372 — PT — 19.08.1981 — 001.001 — 11
▼B
Figura 31976L0372 — PT — 19.08.1981 — 001.001 — 12