Este documento constitui um instrumento de documentação e não vincula as instituições  
►B REGULAMENTO (CE) N.  o 440/2008 DA COMISSÃO  
de 30 de Maio de 2008  
que estabelece métodos de ensaio nos termos do Regulamento (CE) n.  o 1907/2006 do Parlamento 
Europeu e do Conselho relativo ao registo, avaliação, autorização e restrição de substâncias 
químicas (REACH)  
(Texto relevante para efeitos do EEE)  
(JO L 142 de 31.5.2008, p. 1)  
Alterado por:  
Jornal Oficial  
n.° página  data  
►M1 Regulamento (CE) n.  o 761/2009 da Comissão de 23 de Julho de 2009  L 220  1  24.8.2009  
►M2 Regulamento (UE) n.  o 1152/2010 da Comissão de 8 de Dezembro de 
2010  L 324  13  9.12.2010  
►M3 Regulamento (UE) n.  o 640/2012 da Comissão de 6 de julho de 2012  L 193  1  20.7.2012  
►M4 Regulamento (UE) n.  o 260/2014 da Comissão de 24 de janeiro de 2014  L 81  1  19.3.2014  
►M5 Regulamento (UE) n.  o 900/2014 da Comissão de 15 de julho de 2014  L 247  1  21.8.2014  2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1
REGULAMENTO (CE) N.  o 440/2008 DA COMISSÃO  
de 30 de Maio de 2008  
que estabelece métodos de ensaio nos termos do Regulamento (CE) 
n. o 1907/2006 do Parlamento Europeu e do Conselho relativo ao 
registo, avaliação, autorização e restrição de substâncias químicas 
(REACH)  
(Texto relevante para efeitos do EEE)  
A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,  
Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia,  
Tendo em conta o Regulamento (CE) n.  o 1907/2006 do Parlamento 
Europeu e do Conselho, de 18 de Dezembro de 2006, relativo ao registo, avaliação, autorização e restrição de substâncias químicas (REACH), que cria a Agência Europeia das Substâncias Químicas, 
que altera a Directiva 1999/45/CE e revoga o Regulamento (CEE) 
n.
 o 793/93 do Conselho e o Regulamento (CE) n.  o 1488/94 da Comis ­
são, bem como a Directiva 76/769/CEE do Conselho e as Directivas 91/155/CEE, 93/67/CEE, 93/105/CE e 2000/21/CE da Comissão (
 1 ), 
nomeadamente o n.  o 3 do artigo 13.  o , 
Considerando o seguinte:  
(1) Nos termos do Regulamento (CE) n.  o 1907/2006, devem adoptar- 
-se métodos comunitários para o ensaio de substâncias, sempre que tais métodos sejam necessários à produção de informações sobre as propriedades intrínsecas das substâncias.
 
(2) A Directiva 67/548/CEE do Conselho, de 27 de Junho de 1967, 
relativa à aproximação das disposições legislativas, regulamenta ­
res e administrativas respeitantes à classificação, embalagem e rotulagem das substâncias perigosas (
 2 ) estabelece, no seu anexo 
V, métodos para a determinação das propriedades físico-químicas, da toxicidade e da ecotoxicidade das substâncias e preparações. O anexo V da Directiva 67/548/CEE foi revogado pela Directiva 2006/121/CE do Parlamento Europeu e do Conselho, com efeitos a partir de 1 de Junho de 2008.
 
(3) Os métodos de ensaio constantes do anexo V da Directiva 
67/548/CEE devem ser incorporados no presente regulamento.  
(4) O presente regulamento não exclui a utilização de outros métodos 
de ensaio, desde que a mesma seja conforme com o n.  o 3 do 
artigo 13.  o do Regulamento (CE) n.  o 1907/2006.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 2  
( 1 ) JO L 396 de 30.12.2006, p. 1. Rectificação no JO L 136 de 29.5.2007, p. 3. 
( 2 ) JO 196 de 16.8.1967, p. 1. Directiva com a última redacção que lhe foi dada 
pela Directiva 2006/121/CE do Parlamento Europeu e do Conselho (JO L 396 de 30.12.2006, p. 850). Rectificação no JO L 136 de 29.5.2007, p. 281.
 (5) Os princípios da substituição, redução e aperfeiçoamento da uti ­
lização de animais em procedimentos devem ser plenamente tidos em conta na concepção dos métodos de ensaio, nomeadamente sempre que se tornem disponíveis métodos adequados, validados para substituir, reduzir ou aperfeiçoar a experimentação com ani ­
mais.
 
(6) As disposições do presente regulamento estão em conformidade 
com o parecer do Comité instituído pelo artigo 133.  o do Regu­
lamento (CE) n.  o 1907/2006,  
ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO:  
Artigo 1.  o 
Os métodos de ensaio a aplicar para os fins do Regulamento (CE) 
n. o 1907/2006 são os estabelecidos no anexo do presente regulamento.  
Artigo 2.  o 
A Comissão reexaminará, quando pertinente, os métodos de ensaio 
constantes do presente regulamento, com o objectivo de substituir, re ­
duzir ou aperfeiçoar os ensaios com vertebrados.  
Artigo 3.  o 
Todas as referências ao anexo V da Directiva 67/548/CEE devem en ­
tender-se como referências ao presente regulamento.  
Artigo 4.  o 
O presente regulamento entra em vigor no dia seguinte ao da sua 
publicação no  Jornal Oficial da União Europeia . 
É aplicável a partir de 1 de Junho de 2008.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 3
 
ANEXO  
PARTE A: MÉTODOS PARA A DETERMINAÇÃO DAS 
PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS  
ÍNDICE 
A.1. TEMPERATURA DE FUSÃO/CONGELAÇÃO 
A.2. TEMPERATURA DE EBULIÇÃO 
A.3. DENSIDADE RELATIVA 
A.4. PRESSÃO DE VAPOR A.5. TENSÃO SUPERFICIAL 
A.6. SOLUBILIDADE EM ÁGUA 
A.8. COEFICIENTE DE PARTIÇÃO A.9. PONTO DE INFLAMAÇÃO 
A.10. INFLAMABILIDADE (SÓLIDOS) 
A.11. INFLAMABILIDADE (GASES) A.12. INFLAMABILIDADE (CONTACTO COM ÁGUA) A.13. PROPRIEDADES PIROFÓRICAS DE SÓLIDOS E LÍQUIDOS 
A.14. PROPRIEDADES EXPLOSIVAS 
A.15. TEMPERATURA DE AUTO-IGNIÇÃO (LÍQUIDOS E GASES) A.16. TEMPERATURA DE AUTO-IGNIÇÃO RELATIVA PARA OS 
SÓLIDOS 
A.17. PROPRIEDADES OXIDANTES (SÓLIDOS) 
A.18. MASSA MOLECULAR MÉDIA EM FUNÇÃO DO NÚMERO 
DE MOLES E DISTRIBUIÇÃO DA MASSA MOLECULAR EM 
POLÍMEROS 
A.19. TEOR EM POLÍMEROS DE BAIXA MASSA MOLECULAR 
A.20. COMPORTAMENTO DOS POLÍMEROS DA DISSOLUÇÃO/ 
/EXTRACÇÃO AQUOSA 
A.21. PROPRIEDADES DE COMBURÊNCIA (LÍQUIDOS) 
A.22. DIÂMETRO MÉDIO GEOMÉTRICO PONDERADO EM FUN ­
ÇÃO DO COMPRIMENTO DE FIBRAS
 
▼M4 
A.23. COEFICIENTE DE PARTIÇÃO (1-OCTANOL/ÁGUA): MÉ ­
TODO DE AGITAÇÃO LENTA  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 4
 
A.1. TEMPERATURA DE FUSÃO/CONGELAÇÃO  
1. MÉTODO  
A maior parte dos métodos descritos baseiam-se na publicação 
«OECD Test Guideline» (1) (normas de procedimento para testes 
da OCDE). Os princípios fundamentais encontram-se descritos nas 
referências (2) e (3).  
1.1. INTRODUÇÃO  
Os métodos e dispositivos descritos destinam-se a ser aplicados à 
determinação da temperatura de fusão de substâncias, sem quaisquer 
restrições no que diz respeito ao seu grau de pureza.  
A selecção do método depende da natureza da substância que se 
pretende testar. Em consequência, o factor limitativo dependerá do 
facto de a substância poder ser ou não ser facilmente pulverizada, 
pulverizada com dificuldade, ou não poder ser mesmo pulverizada.  
Para algumas substâncias considera-se mais apropriado a determina ­
ção da temperatura de congelação ou de solidificação, tendo as nor ­
mas para estas determinações sido englobadas também neste método.  
No caso de não se poder medir convenientemente nenhum dos pa ­
râmetros anteriores devido à existência de propriedades particulares 
da substância, recomenda-se a determinação de um ponto de fluidez.  
1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES  
Define-se a temperatura de fusão como sendo a temperatura à qual 
ocorre a transição de fase do estado sólido para o estado líquido à pressão atmosférica, correspondendo idealmente essa temperatura à 
temperatura de fusão.
 
Uma vez que a transição de fase de diversas substâncias ocorre num 
intervalo de temperaturas, associa-se-lhe frequentemente um inter ­
valo de fusão.  
Conversão de unidades (K para  o C) 
t = T - 273,15  
t: temperatura de Celsius, graus Celsius (  o C) 
T: temperatura termodinâmica, Kelvin (K)  
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNC1A  
Não é necessário utilizar substâncias de referência quando se está a 
investigar uma nova substância. Essas substâncias servem essencial ­
mente para verificar, de vez em quando, as características de execu ­
ção do método e para proporcionar a comparação com resultados obtidos com outros métodos.
 
Na referência (4) encontram-se enumeradas algumas substâncias de 
calibração.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 5
 
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Determina-se a temperatura (intervalo de temperaturas) da transição 
de fase do estado sólido para o estado líquido ou do estado líquido para o estado sólido. Na prática, enquanto se aquece/arrefece uma 
amostra da substância ensaiada à pressão atmosférica, determina-se 
as temperaturas da fase inicial de fusão/congelação e da fase final de fusão/congelação. Descrevem-se cinco tipos de métodos, designada ­
mente o método capilar, os métodos das fases quentes, as determi ­
nações da temperatura de congelação, os métodos de análise térmica 
e a determinação do ponto de fluidez (desenvolvido para os deriva ­
dos oleosos do petróleo).
 
Em alguns casos pode ser conveniente medir a temperatura de con ­
gelação em vez de se medir a temperatura de fusão.  
1.4.1.  Método capilar  
1.4.1.1.  Dispositivos para a determinação da temperatura de fusão, com 
banho líquido  
Coloca-se uma pequena quantidade da substância finamente triturada 
num tubo capilar e compacta-se fortemente. Aquece-se o tubo em simultâneo com um termómetro e ajusta-se a subida de temperatura 
para um valor inferior a 1 K/min durante a fusão efectiva. Determi ­
nam-se as temperaturas de fusão inicial e final.
 
1.4.1.2.  Dispositivos para a determinação da temperatura de fusão, com 
bloco metálico  
Conforme descrito em 1.4.1.1, com a excepção de o tubo capilar e o 
termómetro estarem num bloco metálico aquecido e poderem ser observados através de aberturas existentes no bloco.
 
1.4.1.3.  Detecção por célula fotoeléctrica  
A amostra no tubo capilar é aquecida automaticamente num cilindro 
metálico. Dirige-se um feixe de luz através da substância, passando 
por uma abertura existente no cilindro, de modo a atingir uma célula fotoeléctrica calibrada com precisão. Quando da fusão, as proprieda ­
des ópticas da maior parte das substâncias variam de opacas para 
transparentes. A intensidade da luz que atinge a célula fotoeléctrica aumenta e envia um sinal de paragem para o indicador digital, que procede à leitura da temperatura de um termómetro de resistência de 
platina localizado na câmara de aquecimento. Este método não é 
adequado para algumas substâncias fortemente coradas.
 
1.4.2.  Fases quentes  
1.4.2.1.  Barra quente de Kofler  
O método da barra quente de Kofler utiliza duas peças metálicas de 
condutividade térmica diferente, aquecidas electricamente, sendo a barra 
concebida de tal modo que o gradiente de temperatura é quase linear segundo o seu comprimento. A temperatura da barra quente pode variar desde 283 até 573 K, existindo um dispositivo especial de leitura da 
temperatura constituído por um cursor com um ponteiro e uma escala, 
concebidos especificamente para a barra. No sentido de se determinar uma temperatura de fusão, espalha-se a substância em camada fina di ­
rectamente sobre a superfície da barra quente. Decorridos alguns segun ­
dos surge uma linha que separa as fases fluida e sólida. Lê-se a tempe ­
ratura nesta linha ajustando o ponteiro sobre ela.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 6
 
1.4.2.2.  Microscópio de fusão  
Existem diferentes tipos de microscópios de placas quentes para a 
determinação das temperaturas de fusão, utilizando-se quantidades muito pequenas de material. Na maior parte dos aparelhos mede-se 
a temperatura com um termopar sensível mas, por vezes, utilizam-se 
termómetros de mercúrio. Existe um equipamento típico para a me ­
dição da temperatura de fusão pelo método das placas quentes uti ­
lizando microscópio, o qual possui uma câmara de aquecimento 
contendo uma placa metálica, sobre a qual se coloca a amostra 
numa lâmina. O centro da placa metálica contém um orifício que permite a entrada de luz proveniente do espelho de iluminação do 
microscópio. Durante a utilização o compartimento é fechado com 
uma placa de vidro para eliminar o ar da zona da amostra.
 
O aquecimento da amostra é regulado com um reóstato. Para as 
medições de elevada precisão das substâncias opticamente anisotró ­
picas, pode utilizar-se luz polarizada.  
1.4.2.3.  Método do menisco  
Este método é utilizado especificamente para as poliamidas.  
A temperatura à qual ocorre o deslocamento de um menisco de óleo 
de silicone, encerrado entre uma placa quente e um vidro de cober ­
tura da amostra de poliamida testada, é determinada visualmente.  
1.4.3.  Método para determinar a temperatura de congelação  
Coloca-se a amostra num tubo de ensaio especial e leva-se a um aparelho 
para a determinação da temperatura de congelação. Agita-se a amostra 
suave e continuamente durante o arrefecimento e mede-se a temperatura 
em intervalos adequados. Logo que a temperatura permaneça constante durante algumas leituras considera-se que esse valor (corrigido em fun ­
ção do erro do termómetro) é a temperatura de congelação.
 
Deve evitar-se o sobrearrefecimento, mantendo-se o equilíbrio entre 
as fases sólida e líquida.  
1.4.4.  Análise térmica  
1.4.4.1.  Análise térmica diferencial (ATD)  
Esta técnica regista a diferença de temperaturas existente entre a 
substância e um material de referência em função da temperatura, 
enquanto a substância e o material de referência são submetidos ao 
mesmo programa de temperatura controlada. Quando a amostra sofre uma transição que implica uma variação de entalpia, essa variação é indicada por um afastamento endotérmico (fusão) ou exotérmico 
(congelação), relativamente à linha de referência do registo de tem ­
peratura.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 7
 
1.4.4.2.  Calorimetria de exploração diferencial (CED)  
Esta técnica regista a diferença entre a absorção de energia por uma 
substância e por um material de referência em função da temperatura, enquanto a substância e o material de referência são submetidos ao 
mesmo programa de temperatura controlada. Essa energia é a necessária 
para estabelecer uma diferença nula de temperatura entre a substância e o material de referência. Quando a amostra sofre uma transição que im ­
plica uma variação de entalpia, essa variação é indicada por um afasta ­
mento endotérmico (fusão) ou exotérmico (congelação), relativamente à 
linha de referência do registo de fluxo de calor.
 
1.4.5.  Ponto de fluidez  
Este método foi desenvolvido para ser utilizado com os derivados 
oleosos do petróleo e é adequado para utilização apenas com subs ­
tâncias de baixas temperaturas de fusão.  
Após um aquecimento preliminar procede-se ao arrefecimento da 
amostra segundo um regime específico e faz-se a observação das 
suas características de fluidez em intervalos de 3 K. A temperatura mais baixa para a qual se observa movimento da substância é con ­
siderada como ponto de fluidez.
 
1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
A aplicabilidade e a precisão dos diversos métodos utilizados para a 
determinação da temperatura de fusão/intervalo de fusão encontram- 
-se resumidas no quadro seguinte:  
QUADRO: APLICABILIDADE DOS MÉTODOS  
A. Métodos capilares  
Método de medição Substâncias que 
podem ser pulve ­
rizadas Substâncias dificil ­
mente pulverizadas Intervalo de tem ­
peraturas Precisão 
estimada (  1 ) Norma existente  
Dispositivos com 
banho líquido Sim Só para algu ­
mas 273 a 573 K ± 0,3 K JIS K 0064 
Dispositivos com 
bloco metálico Sim Só para algu ­
mas 293 a > 573 K ± 0,5 K ISO 1218 (E) 
Detecção por cé ­
lula fotoeléctrica Sim Diversas com 
dispositivos de 
aplicação 253 a 573 K ± 0,5 K  
( 1 ) Dependente do tipo de instrumento e do grau de pureza da substância.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 8
 
B. Métodos das fases quentes e de congelação  
Método de medição Substâncias que 
podem ser 
pulverizadas Substâncias 
dificilmente 
pulverizadas Intervalo de 
temperaturas Precisão 
estimada (  1 ) Norma existente  
Barra quente de 
Kofler Sim Não 283 a > 573 K ± 1,0 K ANSI/ASTM D 
3451-76 
Microscópio de 
fusão Sim Só para algu ­
mas 273 a > 573 K ± 0,5 K DIN 53736 
Método do me ­
nisco Não Especifica ­
mente para po ­
liamidas 293 a > 573 K ± 0,5 K ISO 1218 (E) 
Métodos da tem ­
peratura de con ­
gelação Sim Sim 223 a 573 K ± 0,5 K por ex., BS 
4695  
( 1 ) Dependente do tipo de instrumento e do grau de pureza da substância.  
C. Análise térmica  
Método de medição Substâncias que 
podem ser 
pulverizadas Substâncias 
dificilmente 
pulverizadas Intervalo de 
temperaturas Precisão 
estimada (  1 ) Norma existente  
Análise térmica 
diferencial Sim Sim 173 a 1 273 K até 
600 K ± 0,5 K até 
1 273 K ± 2,0 K ASTM E 537-76 
Calorimetria de 
exploração dife ­
rencial Sim Sim 173 a 1 273 K até 
600 K ± 0,5 K até 
1 273 K ± 2,0 K ASTM E 537-76  
( 1 ) Dependente do tipo de instrumento e do grau de pureza da substância.  
D. Ponto de fluidez  
Método de medição Substâncias que 
podem ser 
pulverizadas Substâncias 
dificilmente 
pulverizadas Intervalo de 
temperaturas Precisão 
estimada (  1 ) Norma existente  
Ponto de fluidez Para deriva ­
dos oleosos 
do petróleo e 
para substân ­
cias oleosas Para derivados 
oleosos do pe ­
tróleo e para 
substâncias 
oleosas 223 a 323 K ± 3,0 K ASTM D 97-66  
( 1 ) Dependente do tipo de instrumento e do grau de pureza da substância.  
1.6. DESCRIÇÃO DOS MÉTODOS  
Os procedimentos de quase todos os métodos de ensaio encontram-se 
descritos em normas internacionais e nacionais (ver apêndice 1).  
1.6.1.  Métodos com tubo capilar  
Quando submetidas a uma lenta subida de temperatura, as substân ­
cias finamente pulverizadas apresentam normalmente as fases de 
fusão representadas na figura 1.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 9
 
Figura 1
  
Durante a determinação da temperatura de fusão procede-se ao re ­
gisto das temperaturas da fase inicial da fusão e da fase final.  
1.6.1.1.  Dispositivos para a determinação da temperatura de fusão com 
aparelho de banho líquido  
A figura 2 representa um tipo de aparelho normalizado para a de ­
terminação da temperatura de fusão, feito de vidro (JIS K 0064); todas as especificações são dadas em milímetros.
 
Figura 2
  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 10
 
Líquido do banho:  
Deve escolher-se um líquido adequado. A escolha do líquido de ­
pende da temperatura de fusão que se pretende determinar; por 
exemplo, escolher-se-á parafina líquida para temperaturas de fusão não superiores a 473 K, óleo de silicone para temperaturas de fusão não superiores a 573 K.
 
Para temperaturas superiores a 523 K pode utilizar-se uma mistura 
constituída por três partes de ácido sulfúrico e por duas partes de sulfato de potássio (em peso). Deverão ser tomadas precauções ade ­
quadas no caso de se utilizar uma mistura deste tipo.
 
Termómetro  
Apenas deverão ser utilizados termómetros que satisfaçam as exigên ­
cias das normas indicadas a seguir ou critérios equivalentes:  
ASTM E 1-71, DIN 12770, JIS K 8001.  
Procedimento:  
Pulveriza-se finamente a substância seca utilizando um almofariz e 
coloca-se no interior do tubo capilar, selado numa das extremidades, de tal modo que a altura do enchimento seja aproximadamente 3 mm após boa compactação. Para se obter uma amostra compacta uni ­
forme o tubo capilar deverá cair verticalmente de uma altura de 
aproximadamente 700 mm através de um tubo de vidro e sobre um vidro de relógio.
 
Depois de cheio coloca-se o tubo capilar no banho, de tal modo que 
a parte média da ampola de mercúrio do termómetro toque no tubo 
capilar na parte onde se encontra a amostra. Normalmente o tubo capilar é introduzido no aparelho a uma temperatura cerca de 10 K inferior à temperatura de fusão.
 
Aquece-se o líquido do banho de tal modo que o aumento da tem ­
peratura seja aproximadamente 3 K/min. O líquido deverá ser agita ­
do. Quando se atingir uma temperatura cerca de 10 K inferior à 
temperatura de fusão esperada, ajusta-se a subida da temperatura 
para um valor máximo de 1 K/min.  
Cálculo:  
O cálculo da temperatura de fusão efectua-se do modo seguinte:  
T = T  D + 0,00016 (T  D - T E ) n 
em que:  
T = temperatura de fusão corrigida, em K;  
T D = leitura da temperatura no termómetro D, em K;  
T E = leitura da temperatura no termómetro E, em K;  
n = número de graduações na linha do mercúrio no termómetro 
D na parte emergente da haste.  
1.6.1.2.  Dispositivos para a determinação da temperatura de fusão, com 
bloco metálico  
Aparelho:  
Este é constituído por:  
— um bloco metálico cilíndrico, cuja parte superior é oca e forma 
um compartimento (ver figura 3),  
— uma tampa metálica, com duas ou várias aberturas, para permitir 
a montagem de tubos no bloco metálico,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 11
 
— um sistema de aquecimento para o bloco metálico, que pode ser, 
por exemplo, uma resistência eléctrica encerrada no bloco,  
— um reóstato para regular a potência de entrada no caso de se 
utilizar aquecimento eléctrico,  
— quatro janelas de vidro resistente ao calor situadas nas paredes 
laterais do compartimento, dispostas diametralmente segundo ân ­
gulos rectos relativamente umas às outras. Em frente de uma 
destas janelas monta-se um óculo para observação do tubo capi ­
lar. As outras três janelas são utilizadas para iluminar o interior do compartimento, por meio de lâmpadas,
 
— um tubo capilar, em vidro resistente ao calor e fechado numa 
extremidade (ver 1.6.1.1).  
Termómetro  
Ver as normas referidas em 1.6.1.1. Também se podem utilizar 
dispositivos de medição termoeléctrica, de precisão equivalente.  
Figura 3
  
1.6.1.3.  Detecção por célula fotoeléctrica  
Aparelho e procedimento:  
O aparelho é constituído por um compartimento metálico com um 
sistema de aquecimento automático. Procede-se ao enchimento de 
três tubos capilares conforme descrito em 1.6.1.1, os quais são de ­
pois colocados na estufa.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 12
 
Utilizam-se várias variações lineares de temperatura para calibrar o 
aparelho e ajusta-se electricamente o aumento de temperatura ade ­
quado, segundo uma razão linear e constante pré-seleccionada. Os registadores mostram a temperatura efectiva da estufa e a tempera ­
tura da substância nos tubos capilares.
 
1.6.2.  Fases quentes  
1.6.2.1.  Barra quente de Kofler  
Ver apêndice.  
1.6.2.2.  Microscópio de fusão  
Ver apêndice.  
1.6.2.3.  Método do menisco (poliamidas)  
Ver apêndice.  
O esquema gradual de aquecimento próximo da temperatura de fusão 
deverá ser inferior a 1 K/min.  
1.6.3.  Métodos para a determinação da temperatura de congelação  
Ver apêndice.  
1.6.4.  Análise térmica  
1.6.4.1.  Análise térmica diferencial  
Ver apêndice.  
1.6.4.2.  Calorimetria de exploração diferencial  
Ver apêndice.  
1.6.5.  Determinação do ponto de fluidez  
Ver apêndice.  
2. RESULTADOS  
Em alguns casos é necessário efectuar uma correcção devida ao 
termómetro.  
3. RELATÓRIO  
O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação se ­
guinte:  
— método utilizado,  
— especificação exacta da substância (identificação e impurezas) e 
fases de purificação prévias no caso de existirem,  
— uma estimativa da precisão.  
Considera-se como temperatura de fusão a média de peio menos 
duas medições efectuadas no intervalo de precisão estimado (ver 
quadros).  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 13
 
Se a diferença entre a temperatura na fase inicial e a temperatura na 
fase final da fusão estiver entre os limites de precisão do método, 
considera-se como temperatura de fusão o valor observado na fase final da fusão; caso contrário serão indicadas as duas temperaturas.
 
No caso de a substância se decompor ou sublimar antes de atingir a 
temperatura de fusão, indicar-se-á a temperatura para a qual se ob ­
serva esse efeito.  
Todas as informações e notas relevantes para a interpretação dos 
resultados deverão ser descritas, especialmente no que diz respeito às impurezas e ao estado físico da substância.
 
4. REFERÊNCIAS  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 102, Decision of the Coun ­
cil C(81) 30 final.  
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermody ­
namics, Butterworths, London 1975, vol. II, p. 803-834.  
(3) R. Weissberger ed.: Technique of organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VII.
 
(4) IUPAC, Physicochemical measurements: Catalogue of reference 
materials from national laboratories, Pure and applied chemistry, 
1976, vol. 48, p. 505-515.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 14
 
Apêndice  
Para pormenores técnicos adicionais é possível consultar, por exemplo, as 
normas seguintes:  
1. Métodos capilares  
1.1. Dispositivos de medição da temperatura de fusão com banho líquido 
ASTM E 324-69 Standard test method for relative initial 
and final melting points and the mel ­
ting range of organic chemicals 
BS 4634 Method for the determination of mel ­
ting point and/or melting range 
DIN 53181 Bestimmung des Schmelzintervalles 
von Harzen nach Kapillarverfahren 
JIS K 00-64 Testing methods for melting point of 
chemical products  
1.2. Dispositivos para a determinação da temperatura de fusão com bloco 
metálico 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen Kunststof ­
fen 
ISO 1218 (E) Plastics — polyamides — determina ­
tion of «melting point»  
2. Fases quentes  
2.1. Barra quente de Kofler 
ANSI/ASTM D 3451-76 Standard recommended practices for 
testing polymeric power coatings  
2.2. Microscópio de fusão 
DIN 53736 Visuelle Bestimmung der Schmelztem ­
peratur von teilkristallinen Kunststof ­
fen. 
2.3. Método do menisco (poliamidas) 
ISO 1218 (E) Plastics — polyamides — determina ­
tion of «melting point»  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 15
 
ANSI/ASTM D 2133-66 Standard specification for acetal resin 
injection moulding and extrusion ma ­
terials 
NF T 51-050 Résines de polyamides. Détermination 
du «point de fusion». Méthode du mé ­
nisque  
3. Métodos para a determinação da temperatura de congelação  
BS 4633 Method for the determination of crys ­
tallizing point 
BS 4695 Method for Determination of Melting 
Point of Petroleum Wax (cooling cur ­
ve) 
DIN 51421 Bestimmung des Gefrierpunktes von 
Flugkraftstoffen, Ottokraftstoffen und 
Motorenbenzolen 
ISO 2207 Cires de pétrole: détermination de la 
température de figeage 
DIN 53175 Bestimmung des Erstarrungspunktes 
von Fettsäuren 
NF T 60-114 Point de fusion des paraffines NF T 20-051 Méthode de détermination du point de 
cristallisation (point de congélation) 
ISO 1392 Method for the determination of the 
freezing point
 
4. Análise térmica  
4.1. Análise térmica diferencial 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by met ­
hods of differential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 16
 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting ther ­
moanalytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  
4.2. Calorimetria de exploração diferencial 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the 
thermal stability of chemicals by met ­
hods of differential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating 
to thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting ther ­
moanalytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse, Begriffe  
5. Determinação do ponto de fluidez  
NBN 52014 Échantillonnage et analyse des pro ­
duits du pétrole: point de trouble et point d'écoulement limite — Monster ­
neming en ontleding van aardoliepro ­
ducten: Troebelingspunt en vloeipunt 
ASTM D 97-66 Standard test method for pour point of 
petroleum oils 
ISO 3016 Petroleum oils — Determination of 
pour point
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 17
 
A.2. TEMPERATURA DE EBULIÇÃO  
1. MÉTODO  
A maior parte dos métodos descritos baseia-se nas normas de ensaio 
da OCDE (1). Os princípios fundamentais encontram-se descritos nas 
referências (2) e (3).  
1.1. INTRODUÇÃO  
Os métodos e dispositivos aqui descritos podem ser aplicados a 
líquidos e a substâncias de baixo ponto de fusão, desde que não sofram uma reacção química para os valores da temperatura de ebu ­
lição (por exemplo: auto-oxidação, rearranjo, degradação, etc.). Os 
métodos podem ser aplicados a substâncias líquidas puras e impuras.
 
Dá-se maior importância aos métodos que utilizam a detecção por 
célula fotoeléctrica e aos métodos de análise térmica uma vez que 
esses métodos permitem a determinação das temperaturas de fusão e 
também das temperaturas de ebulição. Além disso, as medições po ­
dem ser efectuadas automaticamente.  
O «método dinâmico» possui a vantagem de também poder ser 
aplicado à determinação da pressão de vapor e de não ser necessário 
corrigir o valor da temperatura de ebulição para a pressão normal (101,325 kPa) uma vez que a pressão normal pode ser ajustada durante a medição utilizando um manómetro.
 
Observações  
A influência das impurezas na determinação da temperatura de ebu ­
lição depende bastante da natureza dessas impurezas. No caso de existirem na amostra impurezas voláteis que possam afectar os re ­
sultados, a substância deve ser purificada.
 
1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES  
Define-se a temperatura de ebulição normal como sendo a tempera ­
tura para a qual a pressão de vapor de um líquido é de 101,325 kPa.  
No caso de a temperatura de ebulição não ser medida à pressão 
atmosférica normal, a dependência da pressão do vapor em função 
da temperatura pode ser descrita pela equação de Clausius-Clapey ­
ron: 
log p ¼ Δ H v 
2; 3 RT þ const : 
em que:  
p = pressão de vapor da substância em pascal  
ΔH v = calor de vaporização em J mol  -1 
R = constante universal dos gases perfeitos = 8,314 J mol  -1 K -1 
T = temperatura termodinâmica em K  
A temperatura de ebulição é especificada tendo em consideração a 
pressão ambiente durante a medição.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 18
 
Conversões  
Pressão (unidades: kPa)  
100 kPa = 1 bar = 0,1 MPa 
(«bar» ainda é uma unidade permitida mas não reco ­
mendada)  
133 Pa = 1 mm Hg = 1 Torr 
(as unidades «mm Hg» e «Torr» não são permitidas)  
1 atm = atmosfera padrão = 101,325 Pa 
(a unidade «atm» não é permitida)  
Temperatura (unidades: K)  
t = T - 273,15  
t: temperatura de Celsius, graus Celsius (  o C) 
T: temperatura termodinâmica, kelvin (K)  
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Não é necessário utilizar as substâncias de referência em todos os 
casos quando se investiga uma nova substância. Elas deverão servir essencialmente para aferir, periodicamente, o método e para permitir a comparação com resultados obtidos com outros métodos.
 
Nos métodos enumerados no apêndice é possível encontrar algumas 
substâncias utilizadas para calibração.  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Existem cinco métodos para a determinação da temperatura de ebu ­
lição (intervalo de ebulição) que se baseiam na medição da tempe ­
ratura de ebulição, e existem dois métodos que se baseiam na análise 
térmica.  
1.4.1.  Determinação utilizando o ebuliómetro  
Os ebuliómetros foram originariamente desenvolvidos para a deter ­
minação do peso molecular por elevação da temperatura de ebulição, mas também são adequados para as medições exactas da temperatura 
de ebulição. Existe um aparelho muito simples que se encontra des ­
crito na norma ASTM D 1120-72 (ver apêndice). O líquido é aque ­
cido nesse aparelho, sob condições de equilíbrio à pressão atmosfé ­
rica, até entrar em ebulição.
 
1.4.2.  Método dinâmico  
Este método implica a medição da temperatura de recondensação do 
vapor por meio de um termómetro apropriado no refluxo, mantendo- -se a ebulição. Neste método é possível variar a pressão.
 
1.4.3.  Método da destilação para a determinação da temperatura de 
ebulição  
Este método compreende a destilação do líquido, a medição da 
temperatura de recondensação do vapor e a determinação da quanti ­
dade do destilado.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 19
 
1.4.4.  Método de Siwoloboff  
Aquece-se uma amostra num tubo de ensaio, que é imerso num 
líquido num banho aquecido. Mergulha-se no tubo de ensaio um tubo capilar fechado, contendo uma bolha de ar na parte inferior.
 
1.4.5.  Detecção por célula fotoeléctrica  
Utilizando o princípio de Siwoloboff efectuam-se medições automá ­
ticas por célula fotoeléctrica das bolhas ascendentes.  
1.4.6.  Análise térmica diferencial  
Esta técnica regista a diferença existente entre as temperaturas da 
substância e do material de referência, em função da temperatura, quando a substância e o material de referência são submetidos ao mesmo programa de temperatura controlada. Quando a amostra sofre 
uma transição que implica uma variação de entalpia, essa variação é 
indicada por um afastamento endotérmico (ebulição) em relação à linha de referência do registo de temperaturas.
 
1.4.7.  Calorimetria de exploração diferencial  
Esta técnica regista a diferença de absorção de energia existente entre 
uma substância e um material de referência, em função da tempera ­
tura, quando a substância e o material de referência são submetidos ao mesmo programa de temperatura controlada. Essa energia repre ­
senta a energia necessária para estabelecer uma diferença nula de 
temperatura entre a substância e o material de referência. Quando a amostra sofre uma transição que implica uma alteração da entalpia, essa alteração é indicada por um afastamento endotérmico (ebulição), 
em relação à linha de referência do registo do fluxo do calor.
 
1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
A aplicabilidade e a precisão dos diferentes métodos utilizados para 
a determinação da temperatura de ebulição/intervalo de ebulição en ­
contram-se resumidas no quadro 1.  
Quadro 1  
Comparação dos métodos  
Método de medição Precisão estimada Norma existente  
Ebuliómetro ± 1,4 K (até 373 K) (  1 ) ( 2 ) 
± 2,5 K (até 600 K) (  1 ) ( 2 ) ASTM D 1120-72 (  1 ) 
Método dinâmico ± 0,5 K (até 600 K) (  2 ) 
Processo de destilação (intervalo de 
ebulição) ± 0,5 K (até 600 K) ISO/R 918, DIN 53171, BS 
4591/71 
Método de Siwoloboff ± 2 K (até 600 K) (  2 ) 
Detecção por célula fotoeléctrica ± 0,3 K (até 373 K) (  2 ) 
Análise térmica diferencial ± 0,5 K (até 600 K) 
± 2,0 K (até 1 273 K) ASTM E 537-76 
Calorimetria de exploração dife ­
rencial ± 0,5 K (até 600 K) 
± 2,0 K (até 1 273 K) ASTM E 537-76  
( 1 ) Esta precisão apenas é válida para um dispositivo simples, como, por exemplo, o descrito na norma ASTM D 1120-72; 
pode ser melhorada com ebuliómetros mais sofisticados. 
( 2 ) Válido apenas para substâncias puras. A utilização noutras circunstâncias deverá ser justificada.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 20
 
1.6. DESCRIÇÃO DOS MÉTODOS  
Os procedimentos de alguns destes métodos encontram-se descritos 
em normas internacionais e nacionais (ver apêndice).  
1.6.1.  Ebuliómetro  
Ver apêndice.  
1.6.2.  Método dinâmico  
Ver o método de ensaio A.4 para a determinação da pressão de 
vapor.  
Regista-se a temperatura de ebulição observada para um valor da 
pressão aplicada de 101,325 kPa.  
1.6.3.  Processo da destilação (intervalo de ebulição)  
Ver apêndice.  
1.6.4.  Método de Siwoloboff  
Aquece-se a amostra num aparelho para a determinação da tempe ­
ratura de fusão num tubo de ensaio com um diâmetro de aproxima ­
damente 5 mm (figura 1).  
A figura 1 representa um tipo de aparelho normalizado para a de ­
terminação das temperaturas de fusão e de ebulição (JIS K 0064) (o material é vidro e todas as especificações são em milímetros).
 
Figura 1
  
Coloca-se no tubo de ensaio um tubo capilar (capilar para a deter ­
minação do ponto de ebulição), o qual se encontra fechado a cerca 
de 1 cm acima da sua extremidade inferior. Adiciona-se a substância 
que se pretende testar de modo a que a parte fechada do capilar fique abaixo da superfície do líquido. O tubo de ensaio que contém o capilar para a determinação do ponto de ebulição é preso ao termó ­
metro com uma fita de borracha ou fixado lateralmente com um 
suporte (ver figura 2).
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 21
 
Figura 2  
Princípio de Siwoloboff  Figura 3  
Princípio modificado
  
Escolhe-se o líquido do banho de acordo com a temperatura de 
ebulição. Para temperaturas até 573 K é possível utilizar óleo de silicone. A parafina líquida apenas pode ser utilizada até 473 K. O aquecimento do líquido do banho deve ser ajustado de modo a que a 
subida de temperatura seja de 3 K/minuto inicialmente. O líquido do 
banho deve ser agitado. Quando a temperatura atinge cerca de 10 K abaixo da temperatura de ebulição esperada, reduz-se o aque ­
cimento de tal modo que o aumento de temperatura não ultrapasse 1 
K/minuto. Ao aproximar-se a temperatura de ebulição, observa-se a 
formação de bolhas que emergem rapidamente do capilar utilizado para a determinação do ponto de ebulição.
 
A temperatura de ebulição é a temperatura para a qual, face a um 
arrefecimento momentâneo, cessa a corrente de bolhas e o fluido inicia repentinamente a subida no capilar. A leitura correspondente efectuada no termómetro é a temperatura de ebulição da substância.
 
De acordo com o princípio modificado (figura 3) determina-se a 
temperatura de ebulição num capilar para a determinação da tempe ­
ratura de fusão. O capilar é distendido até se obter uma ponta fina com cerca de 2 cm de comprimento (a) e aspira-se uma pequena 
quantidade da amostra. Fecha-se por fusão a extremidade aberta do 
capilar de tal modo que na extremidade fique uma pequena bolha de ar. Enquanto se aquece o aparelho para a determinação da tempera ­
tura de fusão, a bolha de ar expande-se (b). A temperatura de ebu ­
lição corresponde à temperatura para a qual o tampão dessa subs ­
tância atinge o nível da superfície do líquido do banho (c).
 
1.6.5.  Detecção por célula fotoeléctrica  
A amostra é aquecida num tubo capilar no interior de um bloco 
metálico aquecido.  
Pelos orifícios existentes no bloco, é enviado um feixe de luz através 
da substância para uma célula fotoeléctrica calibrada com precisão.  
Durante o aumento da temperatura da amostra emergem bolhas de ar 
simples provenientes do capilar de ebulição. Ao atingir-se a tempe ­
ratura de ebulição o número de bolhas aumenta fortemente. Isto provoca uma alteração na intensidade da luz registada pela célula fotoeléctrica, que envia um sinal de paragem transmitido para o 
indicador que efectua a leitura da temperatura num termómetro de 
resistência de platina localizado no bloco.
 
Este método é especialmente útil, uma vez que permite determinações 
de valores inferiores à temperatura ambiente e até 253,15 K (- 20  o C) 
sem qualquer modificação no aparelho. Apenas é necessário colocar o 
instrumento num banho de arrefecimento.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 22
 
1.6.6.  Análise térmica  
1.6.6.1.  Análise térmica diferencial  
Ver apêndice.  
1.6.6.2.  Calorimetria de exploração diferencial  
Ver apêndice.  
2. RESU LTADOS  
Para pequenos desvios em relação à pressão normal (máximo ± 5 
kPa), as temperaturas de ebulição são corrigidas para o valor T  n pela 
equação de conversão de Sidney Young:  
T n = T + (f  T × Δp) 
em que:  
Δp = (101,325 - p) [atenção ao sinal]  
p = pressão medida em kPa  
f T = taxa de variação da temperatura de ebulição com a pressão 
em K/kPa  
T = temperatura de ebulição medida em K  
T n = temperatura de ebulição corrigida para a pressão normal, 
em K  
Os factores para a correcção da temperatura, o valor f  T e as equações 
para a sua aproximação estão descritos nas normas internacionais e nacionais anteriormente referidas para diversas substâncias.
 
Por exemplo, o método DIN 53171 refere as seguintes correcções 
aproximadas para solventes incorporados em tintas:  
Quadro 2  
Temperatura — factores de correcção f  T 
Temperatura T (K) Factor de correcção f  T (K/kPa)  
323,15 0,26 
348,15 0,28 373,15 0,31 
398,15 0,33 
423,15 0,35 448,15 0,37 473,15 0,39 498,15 0,41 523,15 0,44 548,15 0,45 573,15 0,47
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 23
 
3. RELATÓRIO  
O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação se ­
guinte:  
— método utilizado,  
— especificação exacta da substância (identificação e impurezas) e 
fases prévias de purificação, se for caso disso,  
— uma estimativa da precisão.  
Estabelece-se que a temperatura de ebulição é a média de pelo 
menos duas medições situadas no intervalo de precisão estimada (ver quadro 1).
 
As temperaturas de ebulição medidas e os seus valores médios de ­
verão ser especificados e os valores da pressão para os quais se 
efectuaram as medições deverão ser apresentados em kPa. Preferen ­
cialmente a pressão deverá ser próxima da pressão atmosférica nor ­
mal. 
Todas as informações e notas relevantes para a interpretação de 
resultados deverão ser apresentadas, especialmente no que diz res ­
peito às impurezas e estado físico da substância.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 103, Decision of the Coun ­
cil C(81) 30 final.  
(2) IUPAC, B. Le Neindre, B. Vodar, eds. Experimental thermody ­
namics, Butterworths, London, 1975, vol. II.  
(3) R. Weissberger ed.: Technique of organic chemistry, Physical 
methods of organic chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter VIII.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 24
 
Apêndice  
Para pormenores técnicos adicionais é possível consultar, por exemplo, as 
normas seguintes:  
1. Ebuliómetro  
1.1 Dispositivos de medição da temperatura de fusão com banho líquido 
ASTM D 1120-72 Standard test method for boiling point of 
engine anti-freezes  
2. Processo de destilação (intervalo de ebulição)  
ISO/R 918 Test Method for Distillation (Distillation 
Yield and Distillation Range) 
BS 4349/68 Method for determination of distillation of 
petroleum products 
BS 4591/71 Method for the determination of distilla ­
tion characteristics 
DIN 53171 Lösungsmittel für Anstrichstoffe, Bestim ­
mung des Siedeverlaufes 
NF T 20-608 Distillation: détermination du rendement 
et de 1'intervalle de distillation  
3. Análise térmica diferencial e calorimetria de exploração diferen ­
cial 
ASTM E 537-76 Standard method for assessing the thermal 
stability of chemicals by methods of dif ­
ferential thermal analysis 
ASTM E 473-85 Standard definitions of terms relating to 
thermal analysis 
ASTM E 472-86 Standard practice for reporting thermoana ­
lytical data 
DIN 51005 Thermische Analyse: Begriffe  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 25
 
A.3. DENSIDADE RELATIVA  
1. MÉTODO  
Os métodos descritos baseiam-se nas Normas de Ensaio da OCDE 
(1). Os princípios fundamentais encontram-se na referência (2).  
1.1. INTRODUÇÃO  
Os métodos descritos para a determinação da densidade relativa são 
aplicáveis a substâncias sólidas e a substâncias líquidas, sem qual ­
quer restrição no que diz respeito ao seu grau de pureza. Os diversos métodos utilizáveis encontram-se resumidos no quadro 1.
 
1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES  
A densidade relativa D  20 4 de um sólido ou de um líquido é a razão 
entre a massa de um determinado volume da substância que se 
pretende testar, à temperatura de 20  o C, e a massa de igual volume 
de água, à temperatura de 4  o C. A densidade relativa não tem di ­
mensões.  
A densidade, p, de uma substância é o quociente entre a massa, m, e 
o seu volume, v.  
A densidade, p, é dada, em unidades do SI, em kg/m  3 . 
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA (1) (3)  
Não é necessário utilizar substâncias de referência em todos os casos 
quando se está a investigar uma nova substância. Essas substâncias servem essencialmente para verificar, de vez em quando, a calibração 
do método e para proporcionar a comparação com resultados obtidos 
com outros métodos.
 
1.4. PRINCÍPIO DOS MÉTODOS  
Recorre-se à utilização de quatro classes de métodos.  
1.4.1.  Métodos de flutuação  
1.4.1.1.  Hidrómetro (para substâncias líquidas)  
É possível efectuar determinações rápidas e suficientemente exactas 
de densidade utilizando hidrómetros de flutuação, os quais permitem 
obter a densidade de um líquido a partir da profundidade de imersão 
por simples leitura de uma escala graduada.  
1.4.1.2.  Balança hidrostática  (para substâncias líquidas e sólidas)  
Pode recorrer-se à diferença entre o peso de uma amostra testada 
medido ao ar e num líquido adequado (por exemplo água) para se 
determinar a sua densidade.  
No caso dos sólidos, a densidade medida é apenas representativa da 
amostra particular utilizada. Para a determinação da densidade de líquidos pesa-se primeiro ao ar um corpo de volume conhecido, v, e depois pesa-se mergulhado no líquido.
 
1.4.1.3.  Método do corpo imerso  (para substâncias líquidas) (4)  
De acordo com este método determina-se a densidade de um líquido 
a partir da diferença entre os resultados da pesagem do líquido antes 
e após a imersão, nesse líquido, de um corpo de volume conhecido.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 26
 
1.4.2.  Métodos do picnómetro  
Tanto para os sólidos como para os líquidos é possível utilizar 
picnómetros de configurações diversas e com volumes conhecidos. Calcula-se a densidade a partir da diferença em peso entre o picnó ­
metro cheio e vazio e pelo conhecimento do seu volume.
 
1.4.3.  Picnómetro por comparação ao ar  (para sólidos)  
Pode medir-se a densidade de um sólido de qualquer configuração, à 
temperatura ambiente, utilizando o picnómetro de comparação de gases. Mede-se o volume de uma substância ao ar ou num gás inerte, usando um cilindro de volume calibrado variável. Para se calcular a 
densidade efectua-se uma medição de massa depois da medição de 
volume.
 
1.4.4.  Densímetro oscilante  (5) (6) (7)  
É possível medir a densidade de um líquido utilizando um densíme ­
tro oscilante. Utiliza-se um oscilador mecânico com a forma de um tubo em U o qual se faz vibrar à frequência de ressonância do 
oscilador, a qual depende da sua massa. A introdução de uma amos ­
tra altera a frequência de ressonância do oscilador. O aparelho tem de ser calibrado utilizando duas substâncias líquidas de densidades conhecidas. Essas substâncias deverão ser preferencialmente escolhi ­
das de tal modo que as suas densidades relativas cubram o intervalo 
que se pretende medir.
 
1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
A aplicabilidade dos diversos métodos utilizados para a determinação 
da densidade relativa encontra-se resumida no quadro.  
1.6. DESCRIÇÃO DOS MÉTODOS  
As normas apresentadas como exemplos, que devem ser consultadas 
para obtenção de pormenores técnicos adicionais, estão mencionadas no apêndice.
 
Os testes devem ser efectuados à temperatura de 20  o C e deverão ser 
realizadas pelo menos duas medições.  
2. RESULTADOS  
Ver normas.  
3. RELATÓRIO  
O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação se ­
guinte:  
— método utilizado,  
— especificação exacta da substância (identificação e impurezas) e 
fases prévias de purificação, se as houver.  
A densidade relativa  D 4 20 deverá constar do relatório conforme definido 
em 1.2, em conjunto com o estado físico da substância ensaiada.  
No relatório devem constar todas as informações e notas relevantes 
para a interpretação dos resultados, especialmente no que diz respeito 
a impurezas e ao estado físico da substância.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 27
 
Quadro  
Aplicabilidade dos métodos  
Método de medida Densidade Viscosidade dinâ ­
mica máxima pos ­
sível Normas existentes 
Sólido Líquido  
1.4.1.1. Hidrómetro Sim 5 Pa s ISO 387, 
ISO 649-2, 
NF T 20-050 
1.4.1.2. Balança hidrostática a) sólidos Sim ISO 1183 (A) 
b) líquidos Sim 5 Pa s ISO 901 e 758 
1.4.1.3. Método do corpo imerso Sim 20 Pa s DIN 53217 1.4.2. Picnómetro ISO 3507 
a) sólidos Sim ISO 1183 (B), 
NF T 20-053 
b) líquidos Sim 500 Pa s ISO 758 1.4.3. Picnómetro por compara ­
ção ao ar Sim DIN 55990 parte 3, 
DIN 53243 
1.4.4. Densímetro oscilante Sim 5 Pa s
 
4. REFERÊNCIAS  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 109, Decision of the Coun ­
cil C(8l) 30 final.  
(2) R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Chapter IV, Inters ­
cience Publ., New York, 1959, vol. I, Part l.  
(3) IUPAC, Recommended reference materiais for realization of 
physico-chemical properties, Pure and applied chemistry, 1976, vol. 48, p. 508.
 
(4) Wagenbreth, H., Die Tauchkugel zur Bestimmung der Dichte von 
Flüssigkeiten, Technisches Messen tm, 1979, vol. ll, p. 427-430.  
(5) Leopold, H., Die digitale Messung von Flüssigkeiten, Elektro ­
nik, 1970, vol. 19, p. 297-302.  
(6) Baumgarten, D., Füllmengenkontrolle bei vorgepackten Er ­
zeugnissen — Verfahren zur Dichtebestimmung bei flüssigen 
Produkten und ihre praktische Anwendung, Die Pharmazeutis ­
che Industrie, 1975, vol. 37, p. 717-726.  
(7) Riemann, J., Der Einsatz der digitalen Dichtemessung im Braue ­
reilaboratorium, Brauwissenschaft, 1976, vol. 9, p. 253-255.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 28
 
Apêndice  
Para obtenção de pormenores técnicos adicionais é possível consultar, por 
exemplo, as normas seguintes:  
1. Métodos de flutuação  
1.1. Hidrómetro 
DIN 12790, ISO 387 Hidrómetro; instruções gerais 
DIN 12791 Parte I: Hidrómetros de densidade; sua 
construção, ajustamento e utilização 
Parte II: Hidrómetros de densidade; di ­
mensões normalizadas, designação 
Parte III: Utilização e teste 
ISO 649-2 Objectos de vidro laboratoriais: hidróme ­
tros de densidade para fins gerais 
NF T 20-050 Produtos químicos para utilização indus ­
trial — Determinação da densidade de lí ­
quidos — Método areométrico 
DIN 12793 Objectos de vidro laboratoriais: hidróme ­
tros de resolução variável  
1.2. Balança hidrostática  
Para as substâncias sólidas  
ISO 1183 Método A: Métodos para a determinação 
da densidade e para a determinação da densidade relativa de plásticos excluindo 
os plásticos celulares 
NF T 20-049 Produtos químicos para utilização indus ­
trial — Determinação da densidade de sólidos que não sejam pós e de produtos 
celulares — Método da balança hidrostá ­
tica 
ASTM-D-792 Determinação do peso específico e da 
densidade de plásticos por deslocamento 
DIN 53479 Testes de plásticos e de elastómeros; de ­
terminação da densidade
 
Para substâncias líquidas  
ISO 901 ISO 758  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 29
 
DIN 51757 Testes de óleos minerais e de materiais 
afins; determinação da densidade 
ASTM D 941-55, ASTM D 1296-67 e ASTM D 1481-62 
ASTM D 1298 Densidade, peso específico ou densidade 
relativa IPA (indicador de posição atmos ­
férico) do petróleo bruto e de produtos 
derivados de petróleo líquido pelo método do hidrómetro 
BS 4714 Densidade, peso específico ou densidade 
IPA (indicador de posição atmosférico) do petróleo bruto e de produtos derivados de 
petróleo líquido pelo método do hidróme ­
tro
 
1.3. Método do corpo imerso 
DIN 53217 Testes de tintas, de vernizes e de mate ­
riais de revestimentos análogos; determi ­
nação da densidade; método do corpo 
imerso  
2. Métodos picnométricos  
2.1. Para substâncias líquidas 
ISO 3507 Picnómetros 
ISO 758 Produtos químicos líquidos; determinação 
da densidade à temperatura de 20  o C 
DIN 12797 Picnómetro de Gay-Lussac (para líquidos 
não voláteis que não sejam muito visco ­
sos) 
DIN 12798 Picnómetro de Lipkin (para líquidos com 
uma viscosidade cinemática inferior a 100,10
 -6 m 2 s -1 à temperatura de 15  o C) 
DIN 12800 Picnómetro de Sprengel (para líquidos 
conforme a norma DIN 12798) 
DIN 12801 Picnómetro de Reischauer (para líquidos 
com uma viscosidade cinemática inferior 
a 100,10  -6 m 2 s -1 à temperatura de 20  o C, 
aplicável em particular também aos hidro ­
carbonetos e às soluções aquosas e bem assim aos líquidos com uma pressão de 
vapor superior, aproximadamente 1 bar à 
temperatura de 90
 o C) ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 30
 
DIN 12806 Picnómetro de Hubbard (para líquidos 
viscosos de todos os tipos e que não pos ­
suam uma pressão de vapor demasiada ­
mente elevada, aplicável particularmente também para tintas, vernizes e betumes) 
DIN 12807 Picnómetro de Bingham (para líquidos, 
conforme a norma DIN 12801) 
DIN 12808 Picnómetro de Jaulmes (em particular 
para a mistura de etanol e água) 
DIN 12809 Picnómetro com termómetro incorporado 
e tubo lateral capilar (para líquidos que não sejam muito viscosos) 
DIN 53217 Testes de tintas, de vernizes e de produtos 
análogos; determinação da densidade com picnómetro 
DIN 51757 Ponto 7: Testes de óleos minerais e de 
materiais afins; determinação da densi ­
dade 
ASTM D 297 Secção 15: Produtos de borracha — aná ­
lise química 
ASTM D 2111 Método C: Compostos orgânicos haloge ­
nados 
BS 4699 Método para a determinação do peso es ­
pecífico e da densidade de produtos deri ­
vados do petróleo (método do picnómetro 
bicapilar graduado) 
BS 5903 Método para a determinação da densidade 
relativa e da densidade de produtos deri ­
vados do petróleo recorrendo ao método 
do picnómetro de capilar fechado 
NF T 20-053 Produtos químicos para utilização indus ­
trial — Determinação da densidade de 
sólidos convertidos em pó e de líquidos 
— Método picnométrico
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 31
 
2.2. Para substâncias sólidas 
ISO 1183 Método B: Método para a determinação 
da densidade e da densidade relativa dos plásticos com exclusão dos plásticos celu ­
lares 
NF T 20-053 Produtos químicos para utilização indus ­
trial — Determinação da densidade de sólidos convertidos em pó e de líquidos — Método picnométrico 
DIN 19683 Determinação da densidade de solos
 
3. Picnómetro por comparação ao ar  
DIN 55990 Parte III: Prüfung von Anstrichstoffen und 
ähnlichen Beschichtungsstoffen; Pulver ­
lack; Bestimmung der Dichte 
DIN 53243 Anstrichstoffe; Chlorhaltige Polymere; 
Prüfung  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 32
 
A.4. PRESSÃO DE VAPOR  
1. MÉTODO  
O presente método é equivalente ao método OCDE TG 104 (2004).  
1.1. INTRODUÇÃO  
A presente versão revista do Método A.4 (1) inclui um método 
adicional, o método de efusão: termogravimetria isotérmica, conce ­
bido para produtos químicos com pressões de vapor muito baixas 
(até 10  –10 Pa). Tendo em conta a necessidade de procedimentos, em 
especial para a determinação da pressão de vapor de substâncias com uma pressão de vapor muito baixa, as gamas de aplicação de outros 
procedimentos deste método foram reavaliadas.
 
Em equilíbrio termodinâmico, a pressão de vapor de uma substância 
pura é exclusivamente função da temperatura. Os princípios funda ­
mentais são descritos noutro local (2) (3).  
Não existe nenhum procedimento único de medição que seja aplicável a 
toda a gama de pressões de vapor, desde menos de 10  –10 Pa até 10  5 Pa. O 
presente método inclui oito métodos diferentes de medição da pressão de vapor, que podem ser aplicados em função da gama de pressões em causa. A aplicação e a gama de medição dos diferentes métodos são 
comparadas no quadro 1. Estes métodos só podem ser aplicados para 
compostos que não sejam degradados nas condições de ensaio. Nos casos em que os métodos experimentais não sejam aplicáveis por moti ­
vos técnicos, a pressão de vapor pode também ser estimada, e o anexo 
apresenta um método recomendado para essa estimativa.
 
1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES  
A pressão de vapor de uma substância é a pressão de saturação 
exercida sobre uma substância sólida ou líquida.  
Deve ser utilizada a unidade SI de pressão, o Pascal (Pa). Apresen ­
tam-se a seguir outras unidades que têm sido utilizadas, com os 
respectivos factores de conversão: 
1 Torr = 1 mm Hg = 1,333 × 10  2 Pa 
1 atmosfera = 1,013 × 10  5 Pa 
1 bar = 10  5 Pa 
A unidade SI de temperatura é o Kelvin (K). A conversão de graus 
centígrados em graus Kelvin é dada pela fórmula:  
T = t +273,15  
onde T é a temperatura Kelvin ou temperatura termodinâmica e t é a 
temperatura em graus centígrados.  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 33
 
Quadro 1  
Método de medição Substâncias Repetibilidade 
estimada Reproductividade 
estimada Gama recomendada: 
Sólidas Líquidas  
Método dinâmico Fusão a baixa 
temperatura Sim Até 25 % 
1 a 5 % Até 25 % 
1 a 5 % 10 3 Pa 
a 2 × 10  3 Pa 
2 × 10  3 Pa 
a 10  5 Pa 
Método estático Sim Sim 5 a 10 % 5 a 10 % 10 Pa a 10  5 Pa 
10 –2 Pa 
a 10  5 Pa (  1 ) 
Método do isotenis ­
cópio Sim Sim 5 a 10 % 5 a 10 % 10  2 Pa a 10  5 Pa 
Método de efusão: 
equilíbrio de pres ­
são de vapor Sim Sim 5 a 20 % Até 50 % 10  –3 Pa a 1 Pa 
Método de efusão: 
célula de Knudsen Sim Sim 10 a 30 % — 10  –10 Pa a 1 Pa 
Método de efusão: 
termogravimetria isotérmica Sim Sim 5 a 30 % Até 50 % 10
 –10 Pa a 1 Pa 
Método da satura ­
ção de gases Sim Sim 10 a 30 % Até 50 % 10  –10 Pa a 10  3 Pa 
Método de rotação Sim Sim 10 a 20 % — 10  –4 Pa a 0,5 Pa  
( 1 ) Utilizando um manómetro de capacitância.  
1.3. PRINCÍPIO DO ENSAIO  
Em geral, a pressão de vapor é determinada a diferentes temperatu ­
ras. Numa gama limitada de temperaturas, o logaritmo da pressão de 
vapor de uma substância pura é função linear do inverso da tempe ­
ratura termodinâmica, de acordo com a equação de Clapeyron-Clau ­
sius simplificada:  
log p ¼ ΔHv 
2; 3RT þ constante  
onde:  
p = pressão de vapor, em Pascal  
ΔHv = calor de vaporização, em J mol  –1 
R = constante universal dos gases perfeitos, 8,314 J mol  –1 K –1 
T = temperatura, em K  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 34
 
1.4. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Não é necessário utilizar substâncias de referência. Essas substâncias 
servem fundamentalmente para verificar periodicamente o desempe ­
nho de um método, permitindo ainda a comparação entre os resul ­
tados de diferentes métodos.  
1.5. DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
1.5.1.  Método dinâmico (método de Cottrell)  
1.5.1.1.  Princípio  
A pressão de vapor é determinada medindo a temperatura de ebuli ­
ção da substância a diferentes pressões pré-estabelecidas, mais ou menos entre 10
 3 a 10  5 Pascal. Este método é igualmente recomen ­
dado para a determinação da temperatura de ebulição. Para esse 
efeito, pode ser utilizado até 600 K. As temperaturas de ebulição dos líquidos são aproximadamente 0,1 °C mais elevadas a uma profundidade de 3 a 4 cm do que à superfície, devido à pressão 
hidrostática da coluna de líquido. No caso do método de 
Cottrell (4), o termómetro é colocado no vapor, acima da superfície do líquido, e o líquido em ebulição é bombeado em contínuo sobre a ponta do termómetro. Uma fina camada do líquido, que se encontra 
em equilíbrio com o vapor à pressão atmosférica, forma-se em torno 
da ponta do termómetro. Deste modo, o termómetro lê o verdadeiro ponto de ebulição, sem erros devidos ao sobreaquecimento ou à pressão hidrostática. A bomba originalmente utilizada por Cottrell 
é apresentada na figura 1. O tubo A contém o líquido em ebulição. 
O fio de platina B, selado no fundo do tubo, facilita uma ebulição uniforme. O tubo lateral C conduz a um condensador, enquanto que a manga D evita que o condensado frio atinja o termómetro E. 
Quando o líquido contido em A entra em ebulição, as bolhas e o 
líquido recolhidos pelo funil são transportados pelos dois braços da bomba F até à ponta do termómetro.  
Figura 1
 Figura 2
  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 35
 
Bomba de Cottrell (4)  
A: Termopar  
B: Volume tampão de vácuo  
C: Manómetro  
D: Vácuo  
E: Ponto de medição  
F: Resistência, cerca de 150 W  
1.5.1.2.  Equipamento  
A figura 2 mostra um aparelho de alta precisão que utiliza o prin ­
cípio de Cottrell. O aparelho consiste num tubo com uma secção inferior para a ebulição, um condensador na parte intermédia e uma 
saída com flange na parte superior. A bomba de Cottrell é colocada 
na secção de ebulição, obtida através de uma resistência eléctrica. A temperatura é medida por um termopar coberto ou por um termóme ­
tro de resistência, inseridos através da flange, na parte superior. A 
saída é ligada a um sistema de regulação da pressão, composto por uma bomba de vácuo, um volume tampão, um manostato de admis ­
são de azoto para a regulação da pressão e um manómetro.
 
1.5.1.3.  Procedimento  
A substância é colocada na secção de ebulição. É possível que 
surjam problemas com sólidos não pulverizados, mas esta questão 
pode por vezes ser resolvida aquecendo a água da manga de arrefe ­
cimento. O aparelho é selado a nível da flange e a substância é desgaseificada. Este processo não é aplicável às substâncias que 
provocam a formação de espuma.
 
Estabiliza-se a pressão ao nível mais baixo a que se pretende efectuar 
a leitura e o sistema de aquecimento é posto a funcionar. Ao mesmo tempo, o sensor de temperatura é ligado a um registador.
 
O equilíbrio é atingido quando se regista uma temperatura de ebu ­
lição constante a pressão constante. É necessário ter o cuidado de evitar que o aparelho seja sacudido durante a ebulição. Além disso, deve garantir-se a condensação total no sistema de arrefecimento. 
Para a determinação da pressão de vapor de sólidos com baixo ponto 
de fusão, é necessário tomar precauções para evitar o bloqueio do condensador.
 
Depois de registar este ponto de equilíbrio, passa-se para uma pres ­
são mais elevada. Repete-se este processo até se atingir a pressão de 10
 5 Pa (aproximadamente 5 a 10 pontos de medição na totalidade). 
Para fins de verificação, os pontos de equilíbrio deverão ser repetidos 
para valores decrescentes de pressão.  
1.5.2.  Método estático  
1.5.2.1.  Princípio  
No método estático (5), a pressão de vapor em equilíbrio termodi ­
nâmico é determinada a uma dada temperatura. Este método é apli ­
cável para substâncias e para líquidos e sólidos compostos numa 
gama de pressões entre os 10  –1 e os 10  5 Pa, podendo, com os 
devidos cuidados, ser também utilizado na gama de 1 a 10 Pa.  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 36
 
1.5.2.2.  Equipamento  
O equipamento consiste num banho a temperatura constante (preci ­
são de ± 0,2 K), num recipiente para a amostra, ligado a uma linha de vácuo, num manómetro e num sistema de regulação da pressão. A 
câmara que contém a amostra (figura 3a) é ligada à linha de vácuo 
através de uma válvula e de um manómetro diferencial (tubo em U cheio com um fluido manométrico apropriado), que servirá de indi ­
cador do zero. O manómetro diferencial poderá ser cheio com mer ­
cúrio, silicones ou ftalatos, dependendo da gama de pressões e do 
comportamento químico da substância em estudo. No entanto, a utilização de mercúrio deve, sempre que possível, ser evitada por 
razões ambientais. A substância em estudo não deve dissolver-se de 
forma perceptível nem reagir com o fluido contido no tubo em U. Em vez de um tubo em U, pode utilizar-se um manómetro com indicador da pressão (figura 3b). No caso do manómetro, o mercúrio 
pode ser utilizado para pressões entre a pressão normal e os 10
 2 Pa, 
enquanto que os fluidos de silicone e os ftalatos são apropriados para pressões abaixo dos 10
 2 Pa, até 10 Pa. Existem outros manómetros 
que podem ser utilizados abaixo dos 10  2 Pa e os manómetros de 
membrana aquecível podem mesmo ser utilizados para valores infe ­
riores a 10  –1 Pa. A temperatura é medida na parede externa do 
recipiente que contém a amostra ou no interior do mesmo.  
1.5.2.3.  Procedimento  
Utilizando o aparelho descrito na figura 3a, enche-se o tubo em U 
com o líquido escolhido, que deve ser desgaseificado a temperatura 
elevada antes de se proceder às leituras. A substância em estudo é 
colocada no aparelho e desgaseificada a baixa temperatura. Caso a amostra seja um composto, a temperatura deverá ser suficientemente baixa para evitar qualquer alteração da composição do material. O 
equilíbrio pode ser estabelecido mais rapidamente por agitação. A 
amostra pode ser arrefecida com azoto líquido ou com gelo seco, mas deve ter-se o cuidado de evitar a condensação do ar ou do fluido da bomba. Com a válvula de cima do recipiente da amostra aberta, 
aplica-se sucção durante vários minutos, para remoção do ar. Se 
necessário, a operação de desgasificação deve ser repetida várias vezes.  
Figura 3a
 Figura 3b
  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 37
 
Quando a amostra é aquecida com a válvula fechada, a pressão de 
vapor aumenta, o que altera o equilíbrio do fluido no tubo em U. 
Para compensar este fenómeno, permite-se a entrada de azoto ou de ar no aparelho até que o indicador de pressão diferencial marque novamente zero. A pressão necessária para que tal ocorra pode ser 
lida no manómetro ou através de um instrumento de maior precisão. 
Essa pressão corresponde à pressão de vapor da substância para essa temperatura de medição. Utilizando o aparelho descrito na Figura 3b, a pressão de vapor pode ser lida directamente.
 
A pressão de vapor é determinada para pequenos intervalos adequa ­
dos de temperatura (aproximadamente 5 a 10 pontos de medição na 
totalidade), até à temperatura máxima pretendida.  
Para fins de verificação, as leituras a baixas temperaturas devem ser 
repetidas. Caso os valores obtidos na repetição das leituras não coincidam com a curva obtida para os valores crescentes de tempe ­
ratura, isso poderá dever-se às seguintes razões:
 
i) a amostra ainda contém ar (p.ex.: materiais de elevada viscosida ­
de) ou substâncias com um ponto de fusão mais baixo, que são 
libertadas durante o aquecimento;  
ii) a substância sofreu uma reacção química no intervalo de tempe ­
ratura estudado (p. ex.: decomposição, polimerização).  
1.5.3.  Método do isoteniscópio  
1.5.3.1.  Princípio  
O isoteniscópio (6) baseia-se no princípio do método estático. O 
método implica a colocação da amostra numa ampola que é mantida a temperatura constante e que está ligada a um manómetro e a uma 
bomba de vácuo. As impurezas mais voláteis do que a substância em 
estudo são eliminadas por desgasificação a baixa pressão. A pressão de vapor da amostra às temperaturas seleccionadas será equilibrada contra uma pressão conhecida de um gás inerte. O isoteniscópio foi 
desenvolvido para medição da pressão de vapor de determinados 
hidrocarbonetos líquidos, mas também é aplicável para o estudo de sólidos. Normalmente, este método não é adequado para sistemas com múltiplos componentes. Os resultados estarão sujeitos a ligeiros 
erros, caso as amostras contenham impurezas não voláteis. A gama 
recomendada é de 10
 2 a 10  5 Pa. 
1.5.3.2.  Equipamento  
A figura 4 mostra um exemplo típico de dispositivo de medição. A 
descrição completa pode ser consultada no ATSM D 2879-86 (6).  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 38
 
1.5.3.3.  Procedimento  
No caso dos líquidos, a própria substância serve como fluido para o 
manómetro diferencial. Coloca-se no isoteniscópio uma quantidade de líquido suficiente para encher a ampola e o segmento mais curto do manómetro. O isoteniscópio é ligado a um sistema de vácuo e 
purgado, sendo depois enchido com azoto. Repete-se duas vezes a 
evacuação e a purga do sistema, para garantir a remoção do oxigénio residual. Coloca-se o isoteniscópio cheio em posição horizontal, de modo a que a amostra se espalhe numa camada fina sobre a ampola 
da amostra e o manómetro. Reduz-se a pressão do sistema para 133 
Pa e aquece-se suavemente a amostra até entrar em ligeira ebulição (remoção dos gases dissolvidos). O isoteniscópio é depois colocado de forma a que a amostra regresse à ampola e encha a secção mais 
curta do manómetro. A pressão é mantida a 133 Pa. A parte saliente 
da ampola é aquecida em chama fraca até que o vapor libertado pela amostra se expanda suficientemente para deslocar parte da amostra da parte superior da ampola para o interior do manómetro, criando 
um espaço cheio de vapor da amostra e livre de azoto. Coloca-se 
depois o isoteniscópio num banho a temperatura constante, ajustando a pressão do azoto até ser idêntica à da amostra. Em situação de equilíbrio, a pressão de azoto é igual à pressão de vapor da subs ­
tância.
 
Figura 4
  
No caso dos sólidos, em função das gamas de pressão e de tempe ­
ratura, poderão ser utilizados no manómetro líquidos como os fluidos 
de silicone ou os ftalatos. O líquido do manómetro, depois de des ­
gaseificado, é utilizado para encher uma protuberância existente no segmento mais longo do isoteniscópio. Depois, coloca-se na ampola o sólido em estudo e desgaseifica-se a alta temperatura. O isotenis ­
cópio é então inclinado de modo a que o líquido do manómetro 
possa correr para o tubo em U.
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 39
 
1.5.4.  Método de efusão: equilíbrio de pressão de vapor  (7) 
1.5.4.1.  Princípio  
Uma amostra da substância em estudo é aquecida num pequeno 
forno e colocada numa campânula onde o ar foi esgotado. O forno 
é coberto com uma tampa, com pequenos orifícios de diâmetro 
conhecido. O vapor libertado pela substância e que se escapa por um dos orifícios é dirigido para o prato de uma balança de precisão, que também se deverá encontrar no interior da mesma campânula. 
Em certas montagens, o prato da balança pode estar rodeado por 
uma caixa de refrigeração que conduza o calor dissipado para o exterior por condução térmica, sendo arrefecido por radiação de 
modo a condensar o vapor que se escapa da substância. O momento 
gerado pelo jacto de vapor actua como uma força sobre o prato da balança. A pressão de vapor pode ser deduzida de duas formas: directamente a partir da força exercida sobre o prato da balança ou 
através da velocidade de evaporação, utilizando a equação de Hertz- 
-Knudsen (2):
 
p ¼ G ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
2πRT Ü 10  3 
M r 
onde:  
G = velocidade de evaporação (kg s  –1 m –2 ) 
M = massa molar (g mol  –1 ) 
T = temperatura (K)  
R = constante universal dos gases perfeitos (J mol  –1 K –1 ) 
P = pressão de vapor (Pa)  
A gama recomendada é de 10  –3 a 1 Pa.  
1.5.4.2.  Equipamento  
O princípio geral do aparelho é ilustrado na figura 5.  
Figura 5
  
A: Base plate F: Refrigeration box and cooling bar 
B: Moving coil instrument G: Evaporator furnace C: Bell jar H: Dewar flask with liquid nitrogen D: Balance with scale pan I: Measurement of temperature of sample E: Vacuum measuring device J: Test Substance
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 40
 
1.5.5.  Método de efusão: célula de Knudsen  
1.5.5.1.  Princípio  
O método baseia-se na estimativa da massa da substância em estudo 
que flui para o exterior a partir de uma célula de Knudsen em cada 
unidade de tempo (8) sob a forma de vapor, através de um micro ­
orifício, em condições de ultravácuo. A massa de vapor efluente pode ser calculada através da determinação da massa perdida pela célula ou condensando o vapor a baixa temperatura e determinando a 
quantidade de substância que se volatilizou, por cromatografia. A 
pressão de vapor é calculada através da relação de Heinz-Knudsen (ver o ponto 1.5.4.1), com aplicação de factores de correcção que 
dependem dos parâmetros do aparelho (9). A gama recomendada é 
de 10
 –10 to 1 Pa (10)(11)(12)(13)(14).  
1.5.5.2.  Equipamento  
O princípio geral do aparelho é ilustrado na figura 6.  
Figura 6
  
1: Connection to vacuum 7: Threaded lid 
2: Wells from platinum resistance thermo ­
meter or temperature measurement and control 8: Butterfly nuts 
3: Lid for vacuum tank 9: Bolts 
4: O-ring 10: Stainless steel effusion cells 
5: Aluminum vacuum tank 11: Heater cartridge 6: Device for installing and removing the 
effusion cells
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 41
 
1.5.6.  Método de efusão: termogravimetria isotérmica  
1.5.6.1.  Princípio  
O método baseia-se na determinação das velocidades de evaporação 
aceleradas das substâncias em estudo a alta temperatura e à pressão 
ambiente, utilizando a termogravimetria (10)(15)(16)(17)(18)(19)(20). 
As velocidades de evaporação v  T são calculadas expondo o composto 
seleccionado a um fluxo atmosférico lento de gás inerte e procedendo ao seguimento da diminuição do seu peso a temperaturas isotérmicas 
pré-determinadas T, em Kelvin, ao longo de um período adequado. As 
pressões de vapor p
 T são calculadas a partir dos valores de v  T , apli­
cando a relação linear entre o logaritmo da pressão de vapor e o loga ­
ritmo da velocidade de evaporação. Se necessário, pode proceder-se a 
uma extrapolação para as temperaturas de 20 e de 25 °C, por análise da regressão de log p
 T vs. 1/T. Este método é adequado para substâncias a 
pressões de vapor tão baixas quanto 10  –10 Pa (10  –12 mbar) e com um 
grau de pureza tão próximo quanto possível de 100 %, de modo a evitar 
a incorrecta interpretação da diminuição de peso constatada.  
1.5.6.2.  Equipamento  
O princípio geral do aparelho experimental é apresentado na 
figura 7.  
Figura 7
  
A placa de suporte com a amostra, pendurada de uma microbalança 
no interior de uma câmara a temperatura controlada, é sujeita a um fluxo de azoto seco, que transporta consigo as moléculas vaporizadas 
da substância em estudo. Depois de sair da câmara, o fluxo de gás é 
purificado numa unidade de adsorção.
 
1.5.6.3.  Procedimento  
A substância em estudo é aplicada sobre a superfície de uma placa 
de vidro rugoso, numa camada homogénea. No caso dos sólidos, a 
placa é molhada de forma uniforme numa solução da substância, utilizando um solvente adequado, e seca em atmosfera inerte. Para a medição, a placa revestida é pendurada no analisador termogravi ­
métrico e a subsequente diminuição do seu peso é medida em con ­
tínuo, em função do tempo.
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 42
 
A velocidade de evaporação v  T a uma determinada temperatura é 
calculada a partir da perda de peso Δm da placa com a amostra 
através da seguinte equação:  
v T ¼ Δm 
F Ö t Ê 
gcm  –2 h –1 Ì 
onde F é a área do revestimento da substância em estudo, que 
normalmente corresponde à área da própria placa, e t é o tempo 
ao longo do qual se verificou a perda de peso Δm. 
A pressão de vapor p  T é calculada em função da velocidade de 
evaporação v  T pela seguinte equação:  
Log p  T = C + D log v  T 
onde C e D são constantes específicas do aparelho experimental 
utilizado, dependentes do diâmetro da câmara de medição e da in ­
tensidade do fluxo de gás. Essas constantes têm de ser determinadas uma vez para cada aparelho experimental, através da medição e da regressão de log p
 T vs. log v  T para uma série de compostos com 
pressão de vapor conhecida (11)(21)(22).  
A relação entre a pressão de vapor p  T e a temperatura T, em Kelvin, 
é dada pela seguinte equação:  
Log p  T = A + B 1/T  
onde A e B são as constantes obtidas pela regressão de log p  T vs. 
1/T. Através desta equação, a pressão de vapor pode ser calculada 
para qualquer outra temperatura, por extrapolação.  
1.5.7.  Método da saturação de gases  (23)  
1.5.7.1.  Princípio  
Um gás inerte é passado, à temperatura ambiente e com um caudal 
conhecido e suficientemente lento para garantir a saturação, através 
ou sobre uma amostra da substância em estudo. É particularmente 
importante garantir a saturação da fase gasosa. A substância assim transportada é capturada, normalmente utilizando um adsorvente, e a sua quantidade é determinada. Em alternativa à captura e posterior 
análise do vapor, podem utilizar-se diversas técnicas analíticas em 
linha, como por exemplo a cromatografia gasosa, para determinar quantitativamente a quantidade de material transportado. A pressão de vapor é calculada partindo do pressuposto de que as leis dos 
gases ideais são aplicáveis e de que a pressão total de uma mistura 
de gases é igual à soma das pressões dos gases componentes da mistura. A pressão parcial da substância em estudo, ou seja, a pres ­
são de vapor, é calculada a partir do volume total conhecido dos 
gases e do peso do material transportado.
 
O procedimento de saturação dos gases é aplicável a substâncias 
químicas líquidas ou sólidas. Pode ser utilizado para pressões de vapor superiores a 10
 –10 Pa (10)(11)(12)(13)(14). O método é mais 
fiável para as pressões de vapor inferiores a 10  3 Pa. Acima dos 10  3 
Pa, as pressões de vapor são geralmente sobrestimadas, provavel ­
mente devido à formação de aerossóis. Na medida em que as medi ­
ções da pressão de vapor são efectuadas à temperatura ambiente, não 
é necessário extrapolar dados obtidos a temperaturas mais elevadas, 
sendo evitado esse passo que pode frequentemente acarretar erros importantes.
 
1.5.7.2.  Equipamento  
O procedimento exige a utilização de uma câmara a temperatura 
constante. O esquema da figura 8 mostra uma câmara que contém três placas para amostras sólidas e três câmaras para amostras líqui ­
das, o que permite a análise em triplicado de amostras sólidas ou 
líquidas. A temperatura é controlada com uma precisão mínima de 
± 0,5 °C.
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 43
 
Figura 8
  
Normalmente, o gás inerte utilizado como transportador é o azoto, mas 
por vezes pode ser necessário utilizar outro gás (24). O gás transportador 
tem de ser seco. O fluxo de gás é dividido em 6 partes, controladas por válvulas de agulha (orifício de aproximadamente 0,79 mm), sendo trans ­
portado para a câmara por tubagens de cobre com 3,8 mm de diâmetro 
interno. Depois de alcançado o equilíbrio térmico, o gás flui pela amostra 
e pelo colector adsorvente, após o que sai da câmara.
 
As amostras sólidas são introduzidas em tubos de vidro com diâmetro 
interno de 5 mm, com rolhas de lã de vidro nas duas extremidades (ver a figura 9). A figura 10 mostra um sistema para amostras líquidas com 
colector adsorvente. Para a medição da pressão de vapor de líquidos, o 
método mais reprodutível passa pelo revestimento de esferas de vidro ou de um adsorvente inerte, por exemplo sílica, com o líquido em estudo e 
pelo enchimento do recipiente com essas esferas. Em alternativa, o gás 
transportador pode ser passado por uma frita grosseira e borbulhado através de uma coluna da substância líquida em estudo.  
Figura 9
 Figura 10
  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 44
 
O sistema adsorvente inclui duas secções, uma das quais funciona 
como sistema de apoio ( backup ). Nos casos em que a pressão de 
vapor seja muito baixa, o adsorvente só irá reter quantidades ínfimas da substância, pelo que a adsorção sobre a lã de vidro e sobre a tubagem de vidro entre a amostra e o adsorvente poderá representar 
um problema sério.
 
A utilização de colectores arrefecidos com CO  2 sólido é outra forma 
eficaz de recolha do material vaporizado. Esse tipo de colectores não provoca retornos de pressão na coluna de saturação, facilitando assim a remoção e quantificação do material recolhido.
 
1.5.7.3.  Procedimento  
O caudal do gás transportador à saída é medido à temperatura am ­
biente. O caudal deve ser verificado frequentemente durante a reali ­
zação da experiência, de forma a garantir que se obtém um valor 
preciso para o volume total de gás transportador. O ideal é proceder à medição em contínuo, utilizando um fluxómetro mássico. A satu ­
ração da fase gasosa pode exigir um tempo de contacto considerável, 
o que implica a utilização de fluxos bastante baixos (25).
 
No final da experiência, as duas secções adsorventes (principal e de 
apoio) são analisadas separadamente. O componente adsorvido em cada secção é retirado por adição de um solvente. As soluções resultantes são sujeitas a análise quantitativa, de forma a determinar 
o peso total dessorvido em cada secção. A escolha do método ana ­
lítico (tal como a escolha do adsorvente e do solvente utilizado para a dessorção) será ditada pela natureza do material em estudo. A eficiência da dessorção é determinada injectando uma quantidade 
conhecida de amostra no adsorvente e procedendo depois à sua 
dessorção e à análise da quantidade recuperada. É importante que a eficiência da dessorção seja verificada para uma concentração idêntica ou semelhante à da amostra, em condições de ensaio.
 
Para garantir a saturação do gás transportador com a substância em 
estudo, são utilizados três caudais diferentes de gás. Se a pressão de 
vapor calculada não se mostrar dependente do caudal utilizado, pre ­
sume-se que o gás está saturado.  
A pressão de vapor é calculada pela seguinte equação:  
p ¼ W 
V Ü RT 
M 
onde:  
p = pressão de vapor (Pa)  
W = massa da substância em estudo evaporada (g)  
V = volume de gás saturado (m  3 ) 
R = constante universal dos gases perfeitos 8,314 (J mol  –1 K –1 ) 
T = temperatura (K)  
M = massa molar da substância em estudo (g mol  –1 ) 
Os volumes medidos devem ser corrigidos para tomar em conta as 
diferenças de pressão e de temperatura entre o fluxómetro e o satu ­
rador.  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 45
 
1.5.8.  Método de rotação  
1.5.8.1.  Princípio  
Este método utiliza uma sonda de viscosidade rotativa, na qual o 
elemento de medição é uma pequena esfera de aço que é suspensa 
num campo magnético e forçada a rodar por campos rotativos (26) ­
(27)(28). A velocidade de rotação é medida por bobinas de captação. Quando a esfera atinge uma determinada velocidade de rotação, normalmente cerca de 400 rotações por segundo, interrompe-se o 
fornecimento de energia e dá-se uma desaceleração devida ao atrito 
com o gás. A diminuição da velocidade de rotação em função do tempo é medida. A pressão de vapor é deduzida a partir da desace ­
leração da esfera de aço, que depende da pressão. A gama recomen ­
dada é de 10
 –4 a 0,5 Pa.  
1.5.8.2.  Equipamento  
A figura 11 representa esquematicamente o aparelho experimental. O 
sensor de medição é colocado numa câmara a temperatura constante, regulada com uma precisão mínima de 0,1 °C. A célula com a amostra é colocada noutra câmara, com a temperatura igualmente regulada com 
uma precisão mínima de 0,1 °C. As restantes partes do aparelho expe ­
rimental são mantidas a uma temperatura superior, para evitar a conden ­
sação. O aparelho é ligado a um sistema de alto vácuo.
 
Figura 11
  
2. DADOS E RELATÓRIOS  
2.1. DADOS  
Qualquer que seja o método escolhido, a pressão do vapor deve ser 
determinada pelo menos a duas temperaturas. É preferível proceder à 
determinação para três ou mais valores de temperatura entre 0 e 50 °C, para verificar a linearidade da curva de pressão de vapor. No caso do método de efusão (célula de Knudsen e termogravimetria 
isotérmica) e do método de saturação dos gases, recomenda-se a 
utilização da gama de temperaturas de 120 a 150 °C, em vez da gama de 0 a 50 °C.
 
2.2. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deve incluir as seguintes informações:  
— método utilizado,  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 46
 
— especificação exacta da substância (identificação e impurezas) e 
passos prévios de purificação, se for caso disso,  
— são necessários pelo menos dois — e de preferência três ou mais 
— valores de pressão de vapor e de temperatura na gama de 0 a 50 °C (ou de 120 a 150 °C),
 
— pelo menos uma das temperaturas deverá ser igual ou inferior a 
25 °C, se tal for tecnicamente possível em função do método de ensaio escolhido,
 
— todos os dados originais,  
— a curva de log p em função de 1/T,  
— uma estimativa da pressão de vapor a 20 ou a 25 °C.  
Caso se observe um fenómeno de transição (mudança de estado, 
decomposição), deverá ser acrescentada a seguinte informação:  
— natureza da alteração,  
— temperatura à qual ocorre a alteração, à pressão atmosférica,  
— pressão de vapor a 10 e a 20 °C abaixo da temperatura de 
transição, bem como a 10 C e a 20 °C acima dessa temperatura 
(excepto no caso de passagem do estado sólido ao estado gaso ­
so). 
Devem ser fornecidas todas as informações e observações de inte ­
resse para a interpretação dos resultados, nomeadamente no que se 
refere às impurezas e ao estado físico da substância.  
3. BIBLIOGRAFIA  
(1) Jornal Oficial das Comunidades Europeias  L 383 A, 26-47 
(1992).  
(2) Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, 
Le Neindre, B., e Vodar, B., Eds., Butterworths, Londres.  
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Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., Nova Iorque, 1959, vol. I, parte I, capítulo IX.
 
(4) Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2nd ed., 
Van Nostrand Company, Nova Iorque.  
(5) NF T 20-048 AFNOR (Setembro de 1985). Chemical products 
for industrial use — Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within range from 10  –1 to 10  5 Pa — Static method.  
(6) ASTM D 2879-86, Standard test method for vapour pressure 
— temperature relationship and initial decomposition tempera ­
ture of liquids by isoteniscope.  
(7) NF T 20-047 AFNOR (Setembro de 1985). Chemical products 
for industrial use — Determination of vapour pressure of solids 
and liquids within range from 10  –3 to 1 Pa — Vapour pressure 
balance method.  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 47
 
(8) Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 
593. 
(9) Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. 
Thermodynamics 7, 1173.  
(10) Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, 
D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest Management Science 56, 521-532.
 
(11) Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, Twelfth Edition 
(2000).  
(12) Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determi ­
nation of small vapour pressures determination of the vapour 
pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964), 
22-28.  
(13) Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), 
269-278.  
(14) Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and 
enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p- -dioxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987), 117-122.
 
(15) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Pro ­
tection; Pesticide Science 4 (1973) 137-147.  
(16) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Deter ­
mining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Pro ­
tection II. Application to Formulated Products; Pesticide 
Science 5 (1974) 393-400.  
(17) Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A 
Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Relations ­
hip between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesticide 
Science 13 (1982) 161-168.
 
(18) Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for 
Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used 
in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 45 (1995) 27-31.
 
(19) Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., 
Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermo ­
gravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction 
(SPME); Pesticide Science, 53 (1998) 300-310.
 
(20) Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric 
Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low- 
-Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 87 ­
(12) (1998) 1512-20.  
(21) Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 81th 
ed.(2000), Vapour Pressure in the Range -25 °C to 150 °C.  
(22) Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, Vol. 88 
(2002).  
(23) 40 CFR, 796. (1993). pp 148-153, Office of the Federal Re ­
gister, Washington DC.  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 48
 
(24) Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, 435.  
(25) Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, 1375.  
(26) Messer G., Röhl, P., Grosse G., and Jitschin W. (1987). J. Vac. 
Sci. Technol. (A), 5(4), 2440.  
(27) Comsa G., Fremerey J.K., and Lindenau, B. (1980). J. Vac. 
Sci. Technol. 17(2), 642.  
(28) Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715.  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 49
 
Apêndice  
Método de estimação  
INTRODUÇÃO  
Um valor estimado da pressão de vapor pode ser utilizado para:  
— decidir qual o método experimental mais apropriado,  
— apresentar uma estimativa ou um valor limite para os casos em que os 
métodos experimentais não podem ser aplicados por razões técnicas.  
MÉTODO DE ESTIMAÇÃO  
A pressão de vapor de líquidos e de sólidos pode ser estimada utilizando a 
correlação de Watson modificada (a). O único dado experimental necessário é o ponto de ebulição normal. O método é aplicável na gama de pressões entre 10
 5 
Pa e 10  –5 Pa. 
Para mais informações sobre o método, consultar o «Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods» (b). Ver igualmente a Environmental Monograph 
n. o 67 (c) da OCDE.  
PROCEDIMENTO DE CÁLCULO  
A pressão de vapor é calculada do seguinte modo:  
ln P vp ≈ ΔH vb 
ΔZ b RT b 1 – 3 – 2  T 
T b Í Î  m 
T 
T b – 2m 3 – 2  T 
T b Í Î  m – 1 
ln T 
T b 2 
6 6 6 6 4 3 
7 7 7 7 5
 
onde:  
T = temperatura de interesse  
T b = ponto de ebulição normal  
P VP = pressão de vapor à temperatura T  
ΔH Vb = calor de vaporização  
ΔZ b = factor de compressibilidade (estimado em 0,97)  
m = factor empírico, dependente do estado físico à temperatura de inte ­
resse  
Para além do que,  
ΔH vb 
T b ¼ K F ð8; 75 þ R ln T b Þ 
onde K  F é um factor empírico que permite tomar em consideração a polaridade 
da substância. Os factores K  F estão listados, para diferentes tipos de compostos, 
na referência bibliográfica (b).  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 50
 
É bastante frequente que existam dados disponíveis que apresentam os pontos de 
fusão a pressões reduzidas. Nesses casos, a pressão de vapor é calculada do 
seguinte modo:  
lnP vp ≈ ln P  1 þ ΔH v1 
ΔZ b RT 1 1 – 3 – 2  T 
T 1 Í Î  m 
T 1 
T – 2m 3 – 2  T 
T 1 Í Î  m – 1 
ln T 
T 1 2 
6 4 3 
7 5 
onde T  1 é o ponto de ebulição à pressão reduzida P  1 . 
RELATÓRIO  
Quando for utilizado o método de estimativa, o respectivo relatório incluirá uma 
documentação exaustiva do método de cálculo utilizado.  
BIBLIOGRAFIA  
(a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398.  
(b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982). Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill.  
(c) OCDE Environmental Monograph N.  o 67. Application of Structure-Activity 
Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Asses ­
sment (1993).  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 51
 
A.5. TENSÃO SUPERFICIAL  
1. MÉTODO  
Os métodos descritos baseiam-se nas normas de ensaio da 
OCDE (1). Os princípios fundamentais encontram-se descritos 
na referência (2).  
1.1. INTRODUÇÃO  
Os métodos descritos são aplicáveis à medição da tensão superficial 
em soluções aquosas.  
Considera-se útil possuir informações preliminares sobre a substân ­
cia, relativamente a: solubilidade em água, estrutura, propriedades relativas à hidrólise e concentração crítica de formação de micelas, antes de se efectuarem estes testes.
 
Os métodos que se seguem são aplicáveis à maior parte das subs ­
tâncias químicas, sem qualquer restrição no que diz respeito ao seu grau de pureza.
 
A medição da tensão superficial pelo método do tensiómetro de anel 
é aplicável apenas a soluções aquosas com uma viscosidade dinâ ­
mica inferior a cerca de 200 mPa s.  
1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES  
Define-se como tensão superficial a entalpia superficial livre, por 
unidade de área da superfície.  
A tensão superficial é dada por:  
N/m (unidade do SI) ou  
mN/m (subunidade do SI)  
1 N/m = 10  3 dines/cm  
1 mN/m = 1 dine/cm no antigo e obsoleto sistema cgs  
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Não é necessário utilizar substâncias de referência quando se está a 
investigar uma nova substância. Essas substâncias servem essencial ­
mente para verificar, de vez em quando, a calibração do método e 
para proporcionar a comparação com resultados obtidos com outros métodos.
 
As substâncias de referência que abrangem um intervalo amplo de 
tensões superficiais encontram-se enumeradas nas referências (1) 
e (3).  
1.4. PRINCÍPIO DOS MÉTODOS  
Os métodos baseiam-se na medição da força máxima que é neces ­
sário exercer verticalmente sobre um colchete ou anel em contacto 
com a superfície do líquido que se pretende examinar colocado num 
recipiente, no sentido de o separar dessa superfície, ou sobre uma placa, com uma aresta em contacto com a superfície, no sentido de 
se remover a película que se formou.
 
As substâncias solúveis em água pelo menos para valores de concen ­
tração de 1 mg/l são testadas em solução aquosa para um valor único de concentração.
 
1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
Estes métodos são susceptíveis de proporcionar maior precisão do 
que a eventualmente necessária para a avaliação ambiental.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 52
 
1.6. DESCRIÇÃO DOS MÉTODOS  
Prepara-se uma solução da substância em água destilada. A concen ­
tração desta solução deve atingir 90 % do valor da solubilidade de saturação da substância em água; no caso de esta concentração ex ­
ceder o valor de 1 g/l, utiliza-se para os testes a concentração de 1 
g/l. Não é necessário testar as substâncias cujo valor de solubilidade em água seja inferior a 1 mg/l.
 
1.6.1.  Método da placa  
Ver ISO 304 e NF T 73-060 (agentes tensioactivos: determinação da 
tensão superficial por remoção de películas líquidas).  
1.6.2.  Método do colchete  
Ver ISO 304 e NF T 73-060 (agentes tensioactivos: determinação da 
tensão superficial por remoção de películas líquidas).  
1.6.3.  Método do anel  
Ver ISO 304 e NF T 73-060 (agentes tensioactivos: determinação da 
tensão superficial por remoção de películas líquidas).  
1.6.4.  Método do anel harmonizado pela OCDE  
1.6.4.1.  Aparelho  
Os tensiómetros comercialmente disponíveis são adequados para esta 
medição. São constituídos pelos elementos seguintes:  
— mesa de amostra móvel,  
— sistema de medição de força,  
— corpo para medição (anel),  
— recipiente de medição.  
1.6.4.1.1. M e s a d e a m o s t r a m ó v e l  
Utiliza-se a mesa de amostra móvel como suporte para o recipiente 
de medição de temperatura controlada que contém o líquido que se pretende testar. A sua montagem faz-se num suporte em conjunto com o sistema de medição de força.
 
1.6.4.1.2. S i s t e m a d e m e d i ç ã o d e f o r ç a  
O sistema de medição de força (ver figura) fica colocado sobre a 
mesa da amostra. O erro de medição de força não deverá exceder ± 
10 -6 N, correspondente a um erro limite de ± 0,1 mg numa medição 
de massa. Em muitos casos, a escala dos tensiómetros comercial ­
mente disponíveis é calibrada em mN/m, de modo que a tensão 
superficial pode ser lida directamente em mN/m, com uma precisão 
de 0,1 mN/m.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 53
 
1.6.4.1.3. C o r p o p a r a a m e d i ç ã o ( a n e l )  
Normalmente o anel é feito de um fio de platina/irídio com a espes ­
sura aproximada de 0,4 mm e com um perímetro médio de 60 mm. 
O anel é suspenso horizontalmente de uma haste metálica, através de um suporte triangular de montagem, que estabelece a ligação ao sistema de medição de força (ver figura).
 
Figura  
Corpo para a medição  
(Todas as dimensões estão expressas em milímetros)
  
1.6.4.1.4. R e c i p i e n t e d e m e d i ç ã o  
O recipiente de medição que contém a solução a testar deverá ser um 
recipiente de vidro termostatizado. Deve ser concebido de tal modo 
que durante a medição a temperatura da solução líquida que se pretende testar e a fase gasosa sobre a sua superfície permaneçam constantes e impedindo que haja evaporação da amostra. São acei ­
táveis recipientes cilíndricos de vidro que possuam um diâmetro 
interno não inferior a 45 mm.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 54
 
1.6.4.2.  Preparação do equipamento  
1.6.4.2.1. L i m p e z a  
Os recipientes de vidro devem ser cuidadosamente limpos. Se neces ­
sário, deverão ser lavados com ácido cromossulfúrico quente e de ­
pois lavados com ácido fosfórico xaroposo (83 a 98 % em peso de H
 3 PO 4 ), lavados muito bem com água da torneira e lavados final ­
mente com água bidestilada até se obter uma reacção neutra, efec ­
tuando-se depois a secagem ou a lavagem com um pouco do líquido da amostra que se pretende medir.
 
O anel deve ser primeiro muito bem lavado com água para se fazer a 
remoção de quaisquer substâncias que sejam solúveis em água, de ­
pois mergulhado rapidamente em ácido cromossulfúrico, lavado com 
água bidestilada até se obter uma reacção neutra e finalmente deverá ser aquecido rapidamente sobre uma chama de metanol.
 
Nota:  
A contaminação com substâncias que não sejam dissolvidas ou des ­
truídas com o ácido cromossulfúrico ou com o ácido fosfórico, tais 
como os silicones, deve ser removida usando um solvente orgânico adequado.
 
1.6.4.2.2. C a l i b r a ç ã o d o a p a r e l h o  
A validação do aparelho consiste em verificar o seu zero e em 
ajustá-lo de tal modo que a indicação do instrumento permita uma 
determinação segura em mN/m.  
Montagem:  
O aparelho deve ser nivelado, por exemplo, por meio de um nível de 
bolha de ar colocado na base do tensiómetro, ajustando-se os para ­
fusos de nivelamento existentes na base.  
Ajustamento do zero:  
Após a montagem do anel no aparelho e antes da imersão no líquido 
deve ajustar-se o zero do tensiómetro e deve verificar-se o parale ­
lismo do anel com a superfície do líquido. Para satisfazer este ob ­
jectivo pode utilizar-se como espelho a superfície do líquido.  
Calibrações:  
A calibração pode ser efectuada recorrendo a um de dois procedi ­
mentos:  
a) Utilizando uma massa: procedimento que utiliza cavaleiros de 
massa conhecida compreendida entre 0,1 e 1,0 g colocados sobre 
o anel. O factor de calibração Ф a pelo qual todas as leituras do 
instrumento devem ser multiplicadas determina-se de acordo com a equação (1):
 
Φ a ¼ σ r 
σ a (1) 
em que:  
σ r ¼ mg 
2b (mN/m)  
m = massa do cavaleiro (g)  
g = aceleração da gravidade (981 cm s  -2 ao nível do mar)  
b = perímetro médio do anel (cm)  
σ a = leitura do tensiómetro após colocação do cavaleiro no 
anel (mN/m)  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 55
 
b) Utilizando água: procedimento que utiliza água pura cuja tensão 
superficial, por exemplo, à temperatura de 23  o C é igual a 72,3 
mN/m. Este procedimento é mais rápido do que a calibração com cavaleiros, mas existe sempre o risco de a tensão superficial da água estar falseada por vestígios de contaminação com agentes 
tensioactivos.
 
O factor de calibração Φ b pelo qual todas as indicações do ins ­
trumento deverão ser multiplicadas determina-se de acordo com a 
equação (2):  
Φ b ¼ σ o 
σ g (2) 
em que:  
σ o = valor referido na literatura para a tensão superficial da 
água (mN/m)  
σ g = valor medido da tensão superficial da água (mN/m) am ­
bos à mesma temperatura.  
1.6.4.3.  Preparação de amostras  
As soluções aquosas deverão ser preparadas com as substâncias que 
se pretende testar, utilizando as necessárias concentrações em água, e 
não deverão conter quaisquer substâncias não dissolvidas.  
A solução deve ser mantida a uma temperatura constante (± 0,5  o C). 
Uma vez que a tensão superficial de uma solução no recipiente de 
medição se altera no decurso do tempo, deverão ser efectuadas di ­
versas medições em momentos diferentes e deverá ser traçada uma curva que represente a tensão superficial em função do tempo. 
Quando já não ocorrerem mais variações significa que se atingiu 
um estado de equilíbrio.
 
A contaminação com poeiras e com gases interfere com a medição. 
Em consequência, o trabalho deverá ser efectuado sob uma cobertura de protecção.
 
1.6.5.  Condições do teste  
A medição deverá ser efectuada aproximadamente à temperatura de 
20 o C e deverá ser controlada entre ± 0,5  o C. 
1.6.6.  Realização do teste  
As soluções que se pretendem medir devem ser cuidadosamente 
transferidas para o recipiente de medição, limpo, tomando-se precau ­
ções para evitar a formação de espuma, e depois o recipiente de 
medida deverá ser colocado sobre a mesa do aparelho de teste. A 
parte superior da mesa com o recipiente de medida deverá ser ele ­
vada até que o anel fique imerso sob a superfície da solução que se pretende medir. Depois, a parte superior da mesa deverá ser baixada 
gradual e uniformemente (aproximadamente a velocidade de 0,5 cm/ ­
minuto) até que ocorra a separação do anel da superfície no mo ­
mento em que se atingiu a força máxima. A camada de líquido associada ao anel não deve separar-se do anel. Depois de se terem 
completado as medições deve imergir-se o anel novamente sob a 
superfície e devem repetir-se as medições até se atingir um valor constante para a tensão superficial. O momento da transferência da solução para o recipiente de medição deverá ser registado para cada 
determinação. Deverão ser efectuadas leituras da força máxima ne ­
cessária para separar o anel da superfície do líquido.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 56
 
2. RESULTADOS  
Para se calcular a tensão superficial, o valor lido em mN/m no 
aparelho deverá ser multiplicado primeiro pelo factor de calibração Ф
 a ou Ф b (conforme o procedimento de calibração utilizado). Obter- 
-se-á deste modo um valor aproximado, pelo que é necessária correc ­
ção posterior.  
Harkins e Jordan (4) determinaram empiricamente factores de cor ­
recção para valores de tensão superficial medidos pelo método do 
anel, os quais dependem das dimensões do anel, da densidade do líquido e da sua tensão superficial.
 
Uma vez que é trabalhoso determinar o factor de correcção para cada 
medição individual a partir das tabelas de Harkins e Jordan, para se 
calcular a tensão superficial de soluções aquosas pode utilizar-se o procedimento simplificado de leitura dos valores de tensão superfi ­
cial corrigidos directamente a partir da tabela. (Recorrer-se-á à in ­
terpolação para leituras compreendidas entre os valores indicados na 
tabela.)
 
Tabela  
Correcção da tensão superficial medida  
Apenas para soluções aquosas, p = 1 g/cm  3 
R 9,55 mm (raio médio do anel) 
r 0,185 mm (raio do fio do anel)  
Valor experimental (mN/m) Valor corrigido (mN/m) 
Calibração de massa [ver 1.6.4.2.2. a)] Calibração com água [ver 1.6.4.2.2. 
b)] 
20 16,9 18,1 
22 18,7 20,1 24 20,6 22,1 26 22,4 24,1 
28 24,3 26,1 
30 26,2 28,1 32 28,1 30,1 34 29,9 32,1 36 31,8 34,1 38 33,7 36,1 40 35,6 38,2 42 37,6 40,3 44 39,5 42,3 46 41,4 44,4 48 43,4 46,5 
50 45,3 48,6 
52 47,3 50,7 54 49,3 52,8 56 51,2 54,9
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 57
 
Valor experimental (mN/m) Valor corrigido (mN/m) 
Calibração de massa [ver 1.6.4.2.2. a)] Calibração com água [ver 1.6.4.2.2. 
b)] 
58 53,2 57,0 
60 55,2 59,1 62 57,2 61,3 64 59,2 63,4 66 61,2 65,5 68 63,2 67,7 70 65,2 69,9 72 67,2 72,0 
74 69,2 — 
76 71,2 — 78 73,2 —
 
Este quadro foi compilado com base na correcção de Harkins-Jordan 
e é idêntico ao da norma DIN (DIN 53914) para a água e para soluções aquosas (densidade p = 1 g/cm
 3 e destina-se a um anel 
comercialmente disponível que possui as dimensões R = 9,55 mm 
(raio médio do anel) e r = 0,185 mm (raio do fio do anel). A tabela proporciona valores corrigidos para as medições de tensão superficial obtidas após calibração com massas ou calibração com água.
 
Em alternativa, sem que haja a calibração precedente, pode calcular- 
-se a tensão superficial de acordo com a fórmula seguinte:  
σ ¼ f Ü F 
4πR 
em que:  
F = força medida no dinamómetro no ponto de ruptura da pelí ­
cula 
R = raio do anel  
f = factor de correcção (1)  
3. RELATÓRIO  
3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação se ­
guinte:  
— método utilizado,  
— tipo de água ou de solução utilizada,  
— especificação exacta da substância (identificação e impurezas),  
— resultados da medição: tensão superficial (leitura) especificando 
as duas leituras individuais e a sua média aritmética e bem assim 
o valor médio corrigido (tomando em consideração o factor re ­
lativo ao equipamento e a tabela de correcção,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 58
 
— concentração da solução,  
— temperatura do teste,  
— período de vida da solução utilizada; em particular, o tempo 
decorrido entre a preparação e a medição efectuada na solução,  
— descrição da dependência temporal da tensão superficial após a 
transferência da solução para o recipiente de medição,  
— todas as informações e notas relevantes para a interpretação dos 
resultados devem ser descritas, especialmente no que diz respeito 
a impurezas e estado físico da substância.  
3.2. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS  
Considerando que a água destilada possui uma tensão superficial de 
72,75 mN/m à temperatura de 20  o C, as substâncias que apresentem 
uma tensão superficial inferior a 60 mN/m sob as condições descritas para este método deverão ser consideradas como materiais tensioac ­
tivos.
 
4. REFERÊNCIAS  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 115, Decision of the Coun ­
cil C(81) 30 final.  
(2) R. Weissberger ed., Technique of Organic Chemistry, Physical 
Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Interscience Publ., New York, 1959, vol. I, Part I, Chapter XIV.
 
(3) Pure Appl. Chem., 1976, vol. 48, p. 511.  
(4) Harkins, W.D., Jordan, H.F., J. Amer. Chem. Soc., 1930, vol. 
52, p. 1751.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 59
 
A.6. SOLUBILIDADE EM ÁGUA  
INTRODUÇÃO  
1. Este método é equivalente ao  Test Guideline  TG 105 (1995) da OCDE, 
constituindo uma versão revista do TG 105 inicialmente adotado em 1981. Não há diferenças substanciais entre a versão atual e a de 1981, sendo as 
principais diferenças ao nível da apresentação. A revisão baseou-se no mé ­
todo de ensaio "Solubilidade em água" da UE (1).
 
CONSIDERAÇÕES INICIAIS  
2. A hidrossolubilidade das substâncias pode ser consideravelmente afetada 
pela presença de impurezas. Este método serve para determinar a hidrosso ­
lubilidade de substâncias essencialmente puras, estáveis na água e não vo ­
láteis. Antes de determinar a hidrossolubilidade, é útil dispor de alguns 
elementos prévios sobre a substância em estudo, tais como a fórmula es ­
trutural, a pressão de vapor, a constante de dissociação e a hidrólise em função do pH.
 
3. São descritos neste método de ensaio dois métodos distintos, que se desti ­
nam a solubilidades respetivamente inferiores e superiores a 10  –2 g/l: o 
método de eluição em coluna e o método do balão. É descrito igualmente 
um ensaio preliminar, que permite determinar a quantidade aproximada de amostra adequada para o ensaio final, bem como o tempo necessário para a saturação.
 
DEFINIÇÕES E UNIDADES  
4. A hidrossolubilidade de uma substância é a concentração mássica de satu ­
ração da substância em água a uma dada temperatura.  
5. A hidrossolubilidade exprime-se em massa de soluto por volume de solução. 
A unidade SI é o kg/m  3 , mas também pode utilizar-se o g/l.  
PRODUTOS QUÍMICOS DE REFERÊNCIA  
6. Não é necessário utilizar produtos químicos de referência para estudar subs ­
tâncias por este método.  
DESCRIÇÃO DOS MÉTODOS  
Condições de realização dos ensaios  
7. Os ensaios realizam-se, de preferência, à temperatura de 20 °C ± 0,5 °C. 
Deve manter-se a temperatura escolhida constante em todas as partes im ­
portantes do equipamento.  
Ensaio preliminar  
8. Numa proveta graduada de 10 ml com tampa de vidro, adicionam-se suces ­
sivamente volumes crescentes de água, à temperatura ambiente, a aproxi ­
madamente 0,1 g de amostra (é necessário pulverizar as substâncias sólidas). 
Após cada adição de água, agita-se a mistura durante 10 minutos e verifica-se visualmente se resta amostra por dissolver. Se, após a adição de 10 ml de água, a amostra ou parte dela ainda não se tiver dissolvido, 
prossegue-se a experiência numa proveta graduada de 100 ml. A solubili ­
dade aproximada é dada na tabela 1, por debaixo do volume de água que
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 60
 
solubiliza completamente a amostra. Quando a solubilidade é baixa, o tempo 
necessário para dissolver a substância em estudo pode ser longo, devendo 
aguardar-se pelo menos 24 horas. Se, após 24 horas, a substância em estudo ainda não se tiver dissolvido, deve esperar-se mais tempo (até 96 horas) ou experimentar-se uma diluição maior, para verificar se deve utilizar-se o 
método de eluição em coluna ou o método do balão.
 
Quadro 1  
Volume de água (ml) no qual 
se dissolve 0,1 g de amostra 0,1 0,5 1 2 10 100 > 100 
Solubilidade aproximada (g/l) > 1 000 1 000- 
-200 200-100 100-50 50-10 10-1 < 1  
Método de eluição em coluna  
Princípio  
9. Este método baseia-se na eluição da substância em estudo com água numa 
microcoluna carregada com um material de enchimento inerte previamente revestido com um excesso da substância (2). A hidrossolubilidade é dada 
pela concentração mássica do eluído depois de atingido um patamar em 
função do tempo.
 
Material e aparelhagem  
10. É necessária uma microcoluna (figura 1) mantida a temperatura constante, 
ligada a uma bomba de recirculação (figura 2) ou a um reservatório de nível (figura 3). O enchimento inerte que a microcoluna contém é mantido no lugar por um pequeno tampão de fibra de vidro, que também serve para 
reter as partículas presentes. Pode utilizar-se como enchimento esférulas de 
vidro, terra de diatomáceas ou outros materiais inertes.
 
11. A microcoluna ilustrada na figura 1 é adequada para funcionar com uma 
bomba de recirculação. Tem uma parte superior de volume correspondente a cinco vezes o volume do leito (descartado no início do ensaio) mais o volume de cinco amostras (retiradas para análise durante o ensaio). O vo ­
lume da cabeça da coluna pode ser menor se for possível adicionar água ao 
sistema durante o ensaio, em substituição do volume inicial removido com as impurezas, equivalente a cinco vezes o volume do leito. Liga-se a coluna com tubagem de material inerte a uma bomba de recirculação capaz de 
debitar cerca de 25 ml/h. Esta pode ser, por exemplo, uma bomba peristál ­
tica ou uma bomba de membrana. É necessário garantir que o material das tubagens não provoca contaminações nem nele há adsorções.
 
12. A figura 3 ilustra uma montagem com um reservatório de nível, na qual a 
microcoluna dispõe de uma torneira de via única. A ligação ao reservatório de nível consiste numa junta de vidro esmerilado e em tubagem de material 
inerte. O caudal proveniente desse reservatório deve ser de aproximada ­
mente 25 ml/h.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 61
 
Figura 1
  
Dimensões em mm  
A. Junta de vidro esmerilado  
B. Parte superior  
C. Diâmetro interior (5)  
D. Diâmetro exterior (19)  
E. Tampão de fibra de vidro  
F. Torneira  
Figura 2
  
A. Saída para equilíbrio atmosférico  
B. Medidor de caudal  
C. Microcoluna  
D. Bomba de circulação termostatizada  
E. Bomba de recirculação  
F. Torneira de duas vias para recolha das amostras  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 62
 
Figura 3
  
A. Reservatório de nível (por exemplo, frasco de reagentes com 2,5 l)  
B. Coluna  
C. Recetor de frações  
D. Termóstato  
E. Tubagem de  Teflon  
F. Junta de vidro esmerilado  
G. Tubagem de circulação de água (entre o termóstato e a coluna; diâme ­
tro interno: aproximadamente 8 mm)  
13. Transfere-se aproximadamente 600 mg de material de enchimento para um 
balão de fundo redondo de 50 ml. Dissolve-se num solvente volátil de qualidade para análise uma quantidade adequada da substância em estudo 
e adiciona-se ao material de enchimento uma quantidade adequada desta 
solução. Evapora-se completamente o solvente, utilizando, por exemplo, um evaporador rotativo. Caso contrário, não se conseguirá manter o enchi ­
mento saturado com água durante a eluição, devido a efeitos de partição à 
superfície. Uma vez impregnado como se descreveu com a substância em 
estudo, embebe-se o material de enchimento com cerca de 5 ml de água, durante duas horas, e transfere-se a seguir a suspensão para a microcoluna. Em alternativa, pode introduzir-se o material de enchimento, impregnado 
como se descreveu com a substância em estudo, na microcoluna já com 
água, deixando depois em repouso durante duas horas para se atingir o equilíbrio.
 
14. A impregnação do material de enchimento pode causar problemas, gerando 
resultados errados, por exemplo, se a substância em estudo se depositar como um óleo. Devem examinar-se estes problemas e consignar-se as con ­
clusões no relatório.
 
Processo com bomba de recirculação  
15. Inicia-se o fluxo através da coluna. Recomenda-se um caudal de aproxima ­
damente 25 ml/hora, correspondente a dez vezes o volume do leito da 
coluna descrita por hora. A fim de eliminar as impurezas solúveis na água, 
começa-se por rejeitar, pelo menos, um volume correspondente a cinco vezes o volume do leito. Em seguida, deixa-se a bomba de recirculação funcionar até se atingir o equilíbrio, definido pela obtenção de cinco amos ­
tras sucessivas cujas concentrações não difiram entre si mais do que ± 30 %, 
por qualquer ordem. Estas amostras devem estar desfasadas umas das outras de intervalos de tempo correspondentes à passagem de um volume corres ­
pondente a, pelo menos, dez vezes o do leito da coluna. Conforme o método 
de análise utilizado, pode ser preferível traçar uma curva da concentração 
em função do tempo, para evidenciar o estado de equilíbrio.
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Processo com reservatório de nível  
16. Recolhem-se frações sucessivas de eluído e analisam-se pelo método esco ­
lhido. Para determinar a solubilidade utilizam-se frações provenientes da eluição intermédia, na qual as concentrações de, pelo menos, cinco frações 
consecutivas não diferem umas das outras mais de ± 30 %.
 
17. O eluente preferível é água bidestilada. Também pode utilizar-se água de ­
sionizada de resistividade superior a 10 megaohms/cm e teor total de car ­
bono de origem biológica inferior a 0,01 %.  
18. Em ambos os processos, procede-se a uma repetição da sequência descrita 
com metade do caudal inicial. Se os resultados das duas séries forem coin ­
cidentes, considera-se o ensaio satisfatório. Se a solubilidade medida com o 
caudal menor for superior, reduzir-se-á sucessivamente o caudal a metade, 
até se obter a mesma solubilidade em duas séries consecutivas.  
19. Em ambos os processos, verifica-se se as frações contêm matérias coloidais 
por observação do efeito de Tyndall. A presença de partículas invalida o 
ensaio, que deve repetir-se depois de melhorada a ação filtrante da coluna.  
20. Mede-se o pH de cada amostra, de preferência com bandas indicadoras 
próprias.  
Método do balão  
Princípio  
21. Dissolve-se em água a substância em estudo (pulverizada, se for sólida), a 
uma temperatura ligeiramente superior à do ensaio. Ao atingir-se a satura ­
ção, arrefece-se a mistura e mantém-se esta à temperatura de ensaio. Em 
alternativa, desde que, por meio de uma amostragem adequada, se garanta 
que o equilíbrio de saturação foi atingido, pode efetuar-se a medição dire ­
tamente à temperatura de ensaio. Em seguida, determina-se por um método analítico adequado a concentração mássica da substância em estudo na 
solução aquosa, a qual não pode conter partículas não dissolvidas (3).
 
Material e aparelhagem  
22. É necessário o seguinte:  
— utensílios de vidro e aparelhagem de uso corrente em laboratório,  
— dispositivo para agitação das soluções em condições termostáticas,  
— se necessário (para emulsões), uma centrifugadora, de preferência ter ­
mostatizada,  
— equipamento de análise.  
Procedimento  
23. A partir do ensaio preliminar, estima-se a quantidade da substância em 
estudo necessária para saturar o volume pretendido de água. Pesam-se três porções de aproximadamente cinco vezes essa quantidade em três recipien ­
tes de vidro com tampa de vidro (por exemplo, tubos de centrifugação ou 
balões). Adiciona-se a cada recipiente um volume de água escolhido em função do método analítico e da gama de solubilidades. Tapam-se hermeti ­
camente os recipientes e agitam-se a 30 °C, utilizando um agitador capaz de 
funcionar a temperatura constante — por exemplo, agitação magnética em 
banho-maria termostatizado. Decorrido um dia, equilibra-se um dos recipien ­
tes durante 24 horas à temperatura de ensaio, agitando de vez em quando. Em seguida, centrifuga-se o conteúdo desse recipiente à temperatura de 
ensaio e determina-se a concentração da substância em estudo na fase 
aquosa límpida, recorrendo a um método analítico adequado. Procede-se do
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 64
 
mesmo modo com os outros dois balões, após o equilíbrio inicial a 30 °C, 
respetivamente durante dois e três dias. Se as concentrações medidas pelo 
menos nos dois últimos recipientes não diferirem entre si mais de 15 %, o ensaio é satisfatório. Se os resultados obtidos para os recipientes 1, 2 e 3 mostrarem uma tendência crescente, repete-se todo o ensaio, utilizando 
tempos de equilibragem maiores.
 
24. O ensaio também pode efetuar-se sem o período prévio a 30 °C. Para 
verificar se já se estabeleceu o equilíbrio de saturação, vai-se colhendo amostras até que o tempo de agitação deixe de influenciar as concentrações 
medidas.
 
25. Mede-se o pH de cada amostra, de preferência com bandas indicadoras 
próprias.  
Determinações analíticas  
26. É preferível recorrer a um método específico para a substância em causa, 
dado que a presença de pequenas quantidades de impurezas solúveis pode 
causar grandes erros na solubilidade medida. Exemplos: cromatografia em 
fase líquida ou em fase gasosa, titulação, fotometria e voltametria.  
DADOS E RELATÓRIOS  
Dados  
Método de eluição em coluna  
27. Calcula-se, para cada série, o valor médio e o desvio-padrão de pelo menos 
cinco amostras consecutivas recolhidas no patamar de saturação. Os valores 
médios obtidos em dois ensaios com caudais diferentes não devem diferir 
mais de 30 %.  
Método do balão  
28. Calcula-se o valor médio dos resultados obtidos para cada um dos três 
balões, que não devem diferir entre si mais de 15 %.  
Relatório dos ensaios  
Método de eluição em coluna  
29. Elementos a constar do relatório dos ensaios:  
— resultados do ensaio preliminar,  
— identidade química e impurezas (eventual etapa preliminar de purifica ­
ção),  
— concentração, caudal e pH correspondentes a cada amostra,  
— média e desvio-padrão de, pelo menos, cinco amostras do patamar de 
saturação de cada série,  
— média de, pelo menos, duas séries consecutivas,  
— temperatura da água durante o processo de saturação,  
— método de análise,  
— material de enchimento,  
— impregnação do material de enchimento,  
— solvente utilizado,  
— indícios de eventual instabilidade química da substância durante o en ­
saio, 
— todas as informações importantes para a interpretação dos resultados, 
especialmente no que respeita a impurezas e ao estado físico da subs ­
tância em estudo.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 65
 
Método do balão  
30. Elementos a constar do relatório dos ensaios:  
— resultados do ensaio preliminar,  
— identidade química e impurezas (eventual etapa preliminar de purifica ­
ção),  
— cada uma das determinações analíticas — e o respetivo valor médio, no 
caso de se ter determinado mais de um valor para cada balão,  
— pH de cada amostra,  
— média dos valores correspondentes aos balões concordantes,  
— temperatura do ensaio,  
— método analítico,  
— indícios de eventual instabilidade química da substância durante o en ­
saio, 
— todas as informações importantes para a interpretação dos resultados, 
especialmente no que respeita a impurezas e ao estado físico da subs ­
tância em estudo.  
REFERÊNCIAS  
(1) Diretiva 92/69/CEE da Comissão, de 31 de julho de 1992, que adapta ao 
progresso técnico pela décima sétima vez a Diretiva 67/548/CEE do Conse ­
lho relativa à aproximação das disposições legislativas, regulamentares e 
administrativas respeitantes à classificação, embalagem e rotulagem das subs ­
tâncias perigosas (JO L 383 de 29.12.1992, p. 113).  
(2) NF T 20-045 (AFNOR) (setembro de 1985). Chemical products for industrial 
use — Determination of water solubility of solids and liquids with low solubility — Column elution method.
 
(3) NF T 20-046 (AFNOR) (setembro de 1985). Chemical products for industrial 
use — Determination of water solubility of solids and liquids with high solubility — Flask method.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 66
 
A.8 COEFICIENTE DE PARTIÇÃO  
1. MÉTODO  
O método do «frasco agitado» descrito baseia-se na norma de ensaio 
da OCDE (1).  
1.1. INTRODUÇÃO  
É útil possuir informações preliminares sobre a fórmula estrutural, a 
constante de dissociação, a solubilidade em água, hidrólise, solubi ­
lidade em n-octanol e tensão superficial, da substância sujeita a este 
teste.  
As medições deverão ser efectuadas em substâncias ionizáveis ape ­
nas na sua forma não ionizada (ácido livre ou base livre) produzida 
pela utilização de um tampão apropriado cujo pH possua um valor de pelo menos uma unidade de pH abaixo (ácido livre) ou acima (base livre) do valor pK.
 
Este método de ensaio engloba dois procedimentos separados — o 
método do frasco agitado e a cromatografia líquida de elevado ren ­
dimento (mais conhecida por «HPLC» ou High Performance Liquid 
Chromatography). O primeiro método aplica-se nos casos em que o valor log P
 oa (ver as definições mais adiante) se encontra no inter ­
valo entre — 2 e 4 e o outro método aplica-se nos casos em que 
aquele valor está compreendido entre 0 e 6. Antes de se executar 
qualquer dos procedimentos experimentais dever-se-á obter primeiro uma estimativa preliminar do coeficiente de partição.
 
O método do frasco agitado aplica-se apenas a substâncias essencial ­
mente puras solúveis em água e em n-octanol. Não é aplicável aos materiais tensioactivos (para os quais deverá ser obtido o valor cal ­
culado ou uma estimativa com base nas solubilidades individuais em 
n-octanol e em água).
 
O método de HPLC não se aplica a bases e ácidos fortes, a com ­
plexos de metais, a materiais tensioactivos ou a substâncias que 
reajam com o eluente. Para estes materiais deverá ser obtido um valor calculado ou uma estimativa, tomando como base as solubili ­
dades individuais em n-octanol e em água.
 
O método de HPLC é menos sensível à presença de impurezas do 
que o método do frasco agitado. Contudo, em alguns casos as im ­
purezas podem tornar difícil a interpretação de resultados devido ao 
facto de se tornar incerta a determinação dos picos. Para misturas que originem uma banda não resolvida deverão ser especificados os limites inferior e superior de log P.
 
1.2. DEFINIÇÃO E UNIDADES  
Define-se o coeficiente de partição (P) como sendo a razão entre as 
concentrações de equilíbrio (c  i ) de uma substância dissolvida num 
sistema de duas fases, constituído por dois solventes claramente 
imiscíveis. No caso do n-octanol e da água temos:  
P ow ¼ c nÄoctanol  
c water 
Em consequência, o coeficiente de partição (P) é o quociente entre 
duas concentrações e é dado vulgarmente na forma do seu logaritmo 
de base 10 (log P).  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 67
 
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Método do frasco agitado  
Não é necessário utilizar substâncias de referência quando se está a 
investigar uma nova substância. Essas substâncias servem essencial ­
mente para verificar, de vez em quando, a calibração do método e 
para proporcionar a comparação com resultados obtidos com outros 
métodos.  
Método de HPLC  
No sentido de se estabelecer uma correlação entre os dados de HPLC 
medidos para um determinado composto com o seu valor P, torna-se 
necessário estabelecer um gráfico de calibração de log P em função dos dados cromatográficos utilizando pelo menos 6 pontos de refe ­
rência. É deixado ao arbítrio do utilizador seleccionar as substâncias 
de referência apropriadas. Sempre que possível, pelo menos uma 
substância de referência deverá possuir um valor P
 oa superior, e outra 
um valor P  oa inferior ao da substância a testar. Para valores de log P 
inferiores a 4, a calibração pode basear-se nos dados obtidos pelo 
método do frasco agitado. Para valores de log P superiores a 4, a 
calibração pode basear-se em valores calibrados e publicados em diversa literatura se esses valores estiverem em conformidade com os valores calculados. Para se conseguir melhor precisão é preferível 
escolher substâncias de referência cuja estrutura química esteja rela ­
cionada com a da substância a testar.
 
Existem disponíveis listagens extensivas de valores de log P  oa para 
muitos grupos de compostos químicos (2)(3). No caso dos dados 
sobre os coeficientes de partição dos compostos estruturalmente afins 
não se encontrarem disponíveis, pode-se utilizar então uma calibra ­
ção mais geral estabelecida com outros compostos de referência.  
No apêndice 2 apresenta-se uma listagem de substâncias de referên ­
cia recomendadas e seus valores P  oa . 
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO  
1.4.1.  Método do frasco agitado  
No sentido de se determinar um coeficiente de partição, torna-se 
necessário conseguir o equilíbrio entre todos os componentes do sistema que actuam entre si e devem-se determinar as concentrações das substâncias dissolvidas nas duas fases. Um estudo publicado na 
literatura relativa a este assunto indica que é possível utilizar diversas 
técnicas diferentes para resolução deste problema, isto é, a mistura perfeita das duas fases seguindo-se a sua separação, no sentido de se determinar a concentração de equilíbrio para a substância que se 
pretende examinar.
 
1.4.2.  Método de HPLC  
Efectua-se o HPLC em colunas analíticas carregadas com uma fase 
sólida comercialmente disponível contendo hidrocarbonetos de ca ­
deia longa (por exemplo C  8 , C  18 ) quimicamente ligados à sílica. 
Os compostos químicos injectados nessa coluna movem-se através 
dela a velocidades diferentes devido aos diferentes graus de partição 
entre a fase móvel e a fase estacionária do hidrocarboneto. As mis ­
turas de compostos químicas são eluídas por ordem da sua hidrofo ­
bicidade, sendo eluídos primeiro os compostos químicos solúveis em 
água e depois os compostos químicos solúveis em óleo, proporcio ­
nalmente ao seu coeficiente de partição entre hidrocarboneto e água. Isto permite estabelecer uma relação entre o tempo de retenção numa tal coluna (fase reversa) e o coeficiente de partição entre n-octanol/ ­
água. Deduz-se o coeficiente de partição a partir do factor de capa ­
cidade k, dado pela expressão:
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 68
 
k ¼ t r Ä t o 
t o 
na qual t  r = tempo de retenção da substância a testar e t  0 = tempo 
médio que uma molécula de solvente necessita para passar através da 
coluna (tempo limite).  
Não são necessários métodos analíticos quantitativos e apenas é 
necessária a determinação dos tempos de eluição.  
1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
1.5.1.  Repetitividade  
Método do frasco agitado  
No sentido de se garantir a exactidão do coeficiente de partição é 
necessário efectuar determinações em duplicado sob três condições 
de ensaio diferentes, podendo consequentemente alterar a quantidade 
de substância especificada e também a proporção entre os volumes de solvente. Os valores determinados do coeficiente de partição, 
expressos pelos seus logaritmos, deverão estar compreendidos num 
intervalo limitado por ± 0,3 unidades logarítmicas.
 
Método de HPLC  
No sentido de se aumentar a confiança da medição deverão ser 
efectuadas determinações em duplicado. Os valores de log P deriva ­
dos das medições individuais deverão estar dentro de um intervalo limitado por ± 0,1 unidades logarítmicas.
 
1.5.2.  Sensibilidade  
Método do frasco agitado  
Determina-se o intervalo de medição do método pelo limite de de ­
tecção do procedimento analítico. Isto deverá permitir a determina ­
ção de valores log P  oa no intervalo compreendido entre - 2 e 4 
(ocasionalmente, quando houver condições adequadas, este intervalo pode ser dilatado até valores de log P
 oa próximos de 5), quando a 
concentração do soluto em qualquer fase não for superior a 0,01 mol 
por litro.  
Método de HPLC  
O método de HPLC permite estimar os coeficientes de partição em 
termos de log P  oa no intervalo 0 a 6.  
Normalmente o coeficiente de partição de um composto pode ser esti ­
mado a menos de ± 1 unidade logarítmica relativamente ao valor obtido pelo método do frasco agitado. Existem correlações típicas que é pos ­
sível encontrar na literatura (4)(5)(6)(7)(8). Normalmente, pode-se con ­
seguir uma precisão superior quando as curvas de correlação se ba ­
seiam em compostos de referência estruturalmente afins (9).
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 69
 
1.5.3.  Especificidade  
Método do frasco agitado  
A Lei de Partição de Nernst aplica-se apenas quando os parâmetros 
temperatura, pressão e pH são constantes para soluções diluídas. Aplica-se estritamente a uma substância pura dispersa entre dois 
solventes puros. Se houver diversos solutos diferentes numa ou em 
ambas as fases simultaneamente, isto pode afectar os resultados.
 
A dissociação ou a associação das moléculas dissolvidas provoca 
desvios em relação à Lei de Partição de Nernst. Esses desvios são indicados pelo facto de o coeficiente de partição se tornar depen ­
dente da concentração da solução.
 
Devido à existência de múltiplos estados de equilíbrio, este método 
não deve ser aplicado a compostos ionizáveis sem se aplicar uma correcção. Deve-se tomar em consideração a utilização de soluções- 
-tampão em vez de água para esses compostos; o valor do pH da 
solução-tampão deverá ser pelo menos uma unidade de pH afastada do valor pKa da substância e deve-se ter sempre presente a relevân ­
cia desse valor de pH para o ambiente.
 
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
1.6.1.  Estimativa preliminar do coeficiente de partição  
Efectua-se uma estimativa do coeficiente de partição utilizando pre ­
ferencialmente um método de cálculo (ver apêndice 1) ou, se for apropriado, recorrendo à razão entre solubilidades da substância a testar nos solventes puros (10).
 
1.6.2.  Método do frasco agitado  
1.6.2.1.  Preparação  
n-octanol: a determinação do coeficiente de partição deverá ser efec ­
tuada com um reagente de qualidade analítica de elevada pureza.  
Água: deve-se utilizar água destilada ou bidestilada num aparelho de 
vidro ou de quartzo. Para os compostos ionizáveis dever-se-á utilizar 
soluções-tampão em vez de água, se tal se justificar.  
Nota:  
Não deve ser utilizada água obtida directamente a partir de um 
permutador iónico.  
1.6.2.1.1. P r é - s a t u r a ç ã o d o s s o l v e n t e s  
Antes de se determinar um coeficiente de partição as fases do sis ­
tema solvente são mutuamente saturadas por agitação à temperatura da experiência. Para se conseguir isto, é prática corrente agitar dois 
frascos grandes contendo água ou n-octanol de qualidade analítica, 
contendo cada um deles uma quantidade suficiente do outro solvente, durante um período de 24 horas, num agitador mecânico, e deixan ­
do-os depois em repouso durante um período de tempo suficiente 
para permitir a separação de fases e para se conseguir um estado de 
saturação.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 70
 
1.6.2.1.2. P r e p a r a ç ã o p a r a o e n s a i o  
O volume total do sistema bifásico deverá encher quase completa ­
mente o recipiente de ensaio. Isto auxiliará a evitar as perdas de 
material por volatilização. A razão volumétrica e as quantidades de substância a utilizar são fixadas pelos factores seguintes:
 
— avaliação preliminar do coeficiente de partição (ver  supra ), 
— a quantidade mínima da substância a testar necessária para o 
procedimento analítico, e  
— a limitação de uma concentração máxima, em qualquer das fases, 
no valor de 0,01 mol por litro.  
Efectuam-se três testes. No primeiro utiliza-se a razão volumétrica 
calculada entre n-octanol e a água; no segundo divide-se essa razão 
por dois e no terceiro multiplica-se essa razão por dois (por exemplo, 
1:1, 1:2, 2:1).  
1.6.2.1.3. S u b s t â n c i a a t e s t a r  
Prepara-se uma solução em n-octanol pré-saturado com água. A 
concentração desta solução deverá ser determinada com exactidão antes de se utilizar na determinação do coeficiente de partição. 
Esta solução deverá ser guardada em condições que assegurem a 
sua estabilidade.
 
1.6.2.2.  Condições de ensaio  
A temperatura de ensaio deverá ser mantida constante (± 1  o C) e 
estar compreendida no intervalo entre 20 e 25  o C. 
1.6.2.3.  Procedimento de medição  
1.6.2.3.1. E s t a b e l e c i m e n t o d o e q u i l í b r i o d e p a r t i ç ã o  
Para cada uma das condições de ensaio dever-se-á preparar recipien ­
tes de ensaio em duplicado, contendo as quantidades necessárias, medidas com exactidão, dos dois solventes em conjunto com a 
quantidade necessária da solução referida.
 
Deve-se medir o volume das fases de n-octanol. Os recipientes de 
ensaio deverão ser colocados num agitador adequado ou em alterna ­
tiva deverão ser agitados manualmente. Quando se usa um tubo de centrifugação, o método recomendado consiste em rodar o tubo ra ­
pidamente 180
 o em torno do seu eixo transversal, de modo que 
qualquer bolha de ar que esteja presa se movimente através das 
duas fases. A experiência demonstrou que 50 rotações deste tipo são normalmente suficientes para se estabelecer o equilíbrio de par ­
tição. Para melhor garantia, recomenda-se a execução de 100 rota ­
ções em 5 minutos.
 
1.6.2.3.2. S e p a r a ç ã o d e f a s e s  
Sempre que necessário, no sentido de se efectuar a separação de 
fases, dever-se-á efectuar a centrifugação da mistura. Isto deverá 
ser feito numa centrifugadora de laboratório mantida à temperatura ambiente ou, no caso de se utilizar uma centrifugadora de tempera ­
tura não controlada, os tubos de centrifugação deverão ser mantidos, 
por razões de equilíbrio, à temperatura de ensaio durante pelo menos 
1 hora antes da análise.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 71
 
1.6.2.4.  Análise  
Para a determinação do coeficiente de partição é necessário determi ­
nar as concentrações da substância a testar em ambas as fases. Isto pode ser feito extraindo uma quantidade alíquota de cada uma das 
duas fases a partir de cada um dos tubos, de cada uma das séries de 
ensaio, procedendo depois à sua análise de acordo com o procedi ­
mento escolhido. Deve-se calcular a quantidade total de substância presente em ambas as fases e efectuar-se-á a comparação com a 
quantidade de substância originalmente introduzida.
 
Deverá ser extraída uma amostra da fase aquosa recorrendo a um 
procedimento que minimize o risco de introduzir vestígios de n- 
-octanol: pode-se utilizar uma seringa de vidro com uma agulha 
removível para extrair uma amostra da fase aquosa. A seringa deverá estar, de início, parcialmente cheia com ar. O ar deverá ser expelido suavemente enquanto se introduz a agulha através da camada de n- 
-octanol. Retira-se com a seringa um volume adequado de fase aquo ­
sa. Remove-se a seringa rapidamente da solução e separa-se a agu ­
lha. O conteúdo da seringa pode ser utilizado depois como amostra aquosa. A concentração das duas fases separadas deverá ser deter ­
minada preferencialmente recorrendo a um método específico da 
substância. Como exemplos de métodos analíticos considerados apropriados faz-se referência aos seguintes:
 
— métodos fotométricos,  
— cromatografia gasosa,  
— cromatografia líquida de elevado rendimento (HPLC).  
1.6.3.  Método de HPLC  
1.6.3.1.  Preparação  
Aparelho  
É necessário um cromatógrafo líquido equipado com uma bomba de 
pulsação livre e um dispositivo de detecção adequado. Recomenda-se 
a utilização de uma válvula de injecção com ciclos de injecção. A 
presença de grupos polares na fase estacionária pode prejudicar gra ­
vemente os resultados da coluna de HPLC. Em consequência, as fases estacionárias deverão possuir uma percentagem mínima de 
grupos polares (11). Podem-se utilizar colunas pré-carregadas ou 
cargas de fase reversa de micropartículas disponíveis comercialmen ­
te. Pode-se interpor uma coluna de protecção entre o sistema de injecção e a coluna analítica.
 
Fase móvel  
Utiliza-se metanol e água de qualidade apropriada para HPLC, para a 
preparação do solvente de eluição, o qual é desgaseificado antes da 
utilização. Deve-se utilizar uma eluição isocrática. Dever-se-á utilizar 
proporções metanol/água com um teor mínimo de água de 25 %. Normalmente, é satisfatória a proporção de 3:1 (v/v) para a mistura de metanol/água para se efectuar a eluição de compostos de log P 6 
ao fim de uma hora para um débito de 1 mililitro por minuto. Para 
os compostos com um valor log P elevado pode ser necessário reduzir o tempo de eluição (e também para os compostos de refe ­
rência) diminuindo a polaridade da fase móvel ou o comprimento da 
coluna.
 
As substâncias com muito fraca solubilidade em n-octanol tendem a 
originar valores de log P  oa anormalmente baixos quando se utiliza o 
método de HPLC; os picos desses compostos acompanham frequen ­
temente a frente do solvente. Isto deve-se provavelmente ao facto de 
o processo de partição ser muito lento não se atingindo o equilíbrio no tempo normalmente necessário para uma separação por HPLC. Consequentemente, a diminuição do débito e/ou a diminuição da 
proporção metanol/água pode ser eficaz para se atingir um valor 
de confiança.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 72
 
Os compostos de ensaio e de referência deverão ser solúveis na fase 
móvel em concentrações suficientes para permitirem as suas detec ­
ções. Apenas em casos excepcionais será aceitável adicionar aditivos à mistura de metanol/água, uma vez que esses aditivos irão modificar as propriedades da coluna. Para as cromatografias com aditivos é 
obrigatório utilizar uma coluna separada do mesmo tipo. No caso de 
a mistura metanol/água não ser apropriada é possível utilizar outras misturas de solvente orgânico/água, por exemplo, etanol/água ou acetonitrilo/água.
 
O pH do eluente constitui um parâmetro crítico para os compostos 
ionizáveis. Aquele valor deverá estar compreendido no intervalo de 
valores de pH de funcionamento da coluna, sendo esse intervalo normalmente compreendido entre 2 e 8. Recomenda-se a utilização de uma mistura tampão. É necessário tomar precauções para evitar a 
precipitação de sal e a deterioração da coluna cuja ocorrência é 
possível com algumas misturas de fase orgânica/tampão. As medi ­
ções por HPLC com fases estacionárias à base de sílica, para valores de pH superiores a 8, não são aconselháveis uma vez que a utiliza ­
ção de uma fase móvel alcalina pode provocar a deterioração rápida 
do funcionamento da coluna.
 
Solutos  
Os compostos de referência deverão possuir a maior pureza possível. 
Os compostos destinados a serem utilizados para efeitos de ensaio ou 
calibração são dissolvidos na fase móvel, se possível.  
Condições de ensaio  
Durante as medições a temperatura não deverá variar ± 2 K.  
1.6.3.2.  Medição  
Cálculo do tempo limite t  o 
O tempo limite t  o pode ser determinado utilizando em alternativa 
uma série homóloga (por exemplo, n-alquil-metil-cetonas) ou com ­
postos orgânicos não retidos (por exemplo, tioureia ou formamida). Para se calcular o tempo limite t
 o utilizando uma série homóloga, 
injecta-se um conjunto de pelo menos 7 componentes de uma série 
homóloga e procede-se à determinação dos respectivos tempos de 
retenção. Elabora-se um gráfico dos tempos de retenção t  r(nc + 1) em 
função de t  r(nc) e procede-se à determinação da ordenada a na origem 
e do declive b, através da equação de regressão:  
t r(n c + 1) = a + b t  r(n c ) 
(n c = número de átomos de carbono). O tempo limite t  o é dado pela 
equação:  
t o = a/(1 - b)  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 73
 
Gráfico de calibração  
O passo seguinte consiste em construir a curva de correlação de log 
k em função de log P para os compostos de referência apropriados. Na prática, efectua-se a injecção simultânea, de um conjunto com ­
preendido entre 5 e 10 compostos de referência padrão cujo valor log 
P seja próximo do valor esperado e procede-se à determinação dos 
tempos de retenção, utilizando preferencialmente um integrador de registo ligado ao sistema de detecção. Procede-se ao cálculo dos logaritmos correspondentes dos factores de capacidade, log k, e tra ­
ça-se uma curva em função do valor log P determinado pelo método 
do frasco agitado. Efectua-se a calibração a intervalos regulares, pelo menos uma vez diariamente, de modo a poder fazer a compensação das possíveis variações na evolução da coluna.
 
Determinação do factor de capacidade da substância de ensaio  
Injecta-se a substância de ensaio numa quantidade da fase móvel tão 
pequena quanto possível. Determina-se o tempo de retenção (em 
duplicado), permitindo o cálculo do factor k de capacidade. A partir do gráfico de correlação dos compostos de referência, pode-se fazer uma interpolação para determinação do coeficiente de partição da 
substância de ensaio. Para coeficientes de partição muito baixos ou 
muito elevados é necessária a extrapolação. Nesses casos particulares é necessário tomar precauções relativamente aos limites de confiança da curva de regressão.
 
2. RESULTADOS  
Método do frasco agitado  
Pode-se testar a fiabilidade dos valores de P determinados efec ­
tuando a comparação das médias das determinações em duplicado com a média geral.
 
3. RELATÓRIO  
O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação se ­
guinte:  
— especificação exacta da substância (identificação e impurezas),  
— no caso de os métodos não serem aplicáveis (por exemplo, ma ­
terial tensioactivo), apresentar-se-á um valor calculado ou uma estimativa tomando como base as solubilidades individuais em n- -octanol e em água,
 
— todas as informações e notas relevantes para a interpretação dos 
resultados, especialmente no que diz respeito a impurezas e ao 
estado físico da substância.  
Para o caso do método do frasco agitado:  
— o resultado da estimativa preliminar, se existir,  
— temperatura da determinação,  
— dados relativos aos procedimentos analíticos utilizados na deter ­
minação das concentrações,  
— tempo e velocidade de centrifugação, se for caso disso,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 74
 
— concentrações medidas de ambas as fases para cada determinação 
(significa isto que deverão ser descritas 12 concentrações na 
totalidade),  
— o peso da substância de ensaio, o volume de cada fase utilizada 
em cada recipiente de ensaio e a quantidade total calculada de substância de ensaio presente em cada fase após se atingir o equilíbrio,
 
— para cada conjunto de condições de ensaio deverão ser indicados 
os valores calculados do coeficiente de partição (P) e o valor 
médio, devendo-se indicar igualmente a média para todas as 
determinações. No caso de haver indícios de dependência da concentração relativamente ao coeficiente de partição, esse facto deverá constar do relatório,
 
— deve-se referir o desvio-padrão dos valores P individuais relati ­
vamente à sua média,  
— o valor médio de P correspondente a todas as determinações deve 
ser expresso também na forma logarítmica (base 10),  
— o valor teórico P  oa calculado no caso de se ter feito a determi ­
nação desse valor ou quando o valor medido for > 10  4 , 
— os valores de pH da água utilizada e da fase aquosa durante a 
experiência,  
— no caso de se ter recorrido à utilização de tampões, o relatório 
deverá conter justificação da utilização desses tampões em vez de 
água, a sua composição, a sua concentração e os valores de pH e 
também os valores de pH da fase aquosa antes e após a expe ­
riência.  
Para o caso do método de HPLC:  
— o resultado da estimativa preliminar, se existir,  
— substâncias de ensaio e de referência e sua pureza,  
— intervalo de temperaturas das determinações,  
— os valores de pH para os quais foram feitas as determinações,  
— pormenores sobre a coluna analítica e sobre a coluna de protec ­
ção, fase móvel e meios de detecção,  
— dados de retenção e valores de log P encontrados na literatura 
para os compostos de referência utilizados na calibração,  
— pormenores sobre a linha de regressão ajustada (log k em função 
de log P),  
— dados de retenção média e valor de log P interpolado para o 
composto de ensaio,  
— descrição do equipamento e condições de funcionamento,  
— perfil de eluição,  
— quantidades das substâncias de ensaio e de referência introduzi ­
das na coluna,  
— tempo limite e método para a sua medição.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 75
 
4. REFERÊNCIAS  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 107, Decision of the Coun ­
cil C(81) 30 final.  
(2) C. Hansch and A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation 
Analysis in Chemistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.
 
(3) Log P and Parameter Database, A tool for the quantitative 
prediction of bioactivity (C. Hansch, chairman, A.J. Leo, dir.) — Available from Pomona College Medical Chemistry Project 1982, Pomona College, Claremont, California 91711.
 
(4) L. Renberg, G. Sundström and K. Sundh-Nygãrd, Chemosphe ­
re, 1980, vol. 80, p. 683.  
(5) H. Ellgehausen, C. D'Hondt and R. Fuerer, Pestic. Sci., 1981, 
vol. 12, p. 219 (1981).  
(6) B. McDuffie, Chemosphere, 1981, vol. 10, p. 73.  
(7) W.E. Hammers et al., J. Chromatogr., 1982, vol. 247, p. 1.  
(8) J.E. Haky and A.M. Young, J. Liq. Chromat., 1984, vol. 7, p. 
675. 
(9) S. Fujisawa and E. Masuhara, J. Biomed. Mat. Res., 1981, vol. 
15, p. 787.  
(10) O. Jubermann, Verteilen und Extrahieren, in Methoden der 
Organischen Chemie (Houben Weyl), Allgemeine Laborato ­
riumpraxis (edited by E.Muller), Georg Thieme Verlag, Stutt ­
gart, 1958, Band 1/1, p. 223-339.  
(11) R.F. Rekker and H.M. de Kort, Euro. J. Med. Chem., 1979, 
vol. 14, p. 479.  
(12) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Partition coefficients and 
their uses, Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525.  
(13) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmentai Constant, Elsevier, 
Amsterdam, 1977.  
(14) NF T 20-043 AFNOR (1985). Chemical products for industrial 
use — Determination of partition coefficient — Flask shaking method.
 
(15) C.V. Eadsforth and P.Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, p. 
1459.  
(16) A. Leo, C. Hansch and D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, 
p. 525.  
(17) C. Hansch, A. Leo, S.H. Unger, K.H. Kim, D. Nikaitani and 
E.J. Lien, J. Med. Chem., 1973, vol. 16, p. 1207.  
(18) W.B. Neely, D.R. Branson and G.E. Blau, Environ. Sci Tech ­
nol., 1974, vol. 8, p. 1113.  
(19) D.S. Brown and E.W. Flagg, J. Environ. Qual., 1981, vol. 10, 
p. 382.  
(20) J.K. Seydel and K.J. Schaper, Chemische Struktur und biolo ­
gische Aktivität von Wirkstoffen, Verlag Chemie, Weinheim, 
New York, 1979.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 76
 
(21) R. Franke, Theoretical Drug Design Methods, Elsevier, Ams ­
terdam, 1984.  
(22) Y.C. Martin, Quantitative Drug Design, Marcel Dekker, New 
York, Basel, 1978.  
(23) N.S. Nirrlees, S.J. Noulton, C.T. Murphy, P.J. Taylor, J. Med. 
Chem., 1976, vol. 19, p. 615.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 77
 
Apêndice 1  
Métodos de cálculo/estimação  
INTRODUÇÃO  
Na publicação «Handbook of Chemical Property Estimation Methods» (a) encon ­
tra-se uma introdução geral aos métodos de cálculo, dados e exemplos.  
É possível utilizar os valores calculados de P  oa : 
— para se decidir qual dos métodos experimentais é apropriado (gama de utili ­
zação para o frasco agitado: log P  oa : - 2 a 4, gama de HPLC: log P  oa : 0 a 6),  
— para selecção das condições de ensaio apropriadas (por exemplo, substâncias 
de referência para os procedimentos de HPLC, relação volumétrica n- -octanol/água para o método do frasco agitado),
 
— como verificação interna laboratorial sobre possíveis erros experimentais,  
— para se obter um valor estimado de P  oa no caso em que os métodos experi ­
mentais não podem ser aplicados por razões técnicas.  
MÉTODO DE ESTIMAÇÃO  
Estimativa preliminar do coeficiente de partição  
Pode-se estimar o valor do coeficiente de partição conhecendo as solubilidades 
da substância de ensaio em solventes puros, utilizando a equação:  
P estimado ¼ saturação c  nÄoctanol  
saturação c  água 
MÉTODOS DE CÁLCULO  
Princípio dos métodos de cálculo  
Todos os métodos de cálculo se baseiam na fragmentação formal da molécula em 
substruturas adequadas para as quais sejam conhecidos valores dos fragmentos de log P
 oa . Calcula-se depois o valor log P  oa da molécula inteira como sendo a soma 
dos correspondentes valores dos seus fragmentos mais a soma dos termos de 
correcção, para as interacções intramoleculares.  
Existem disponíveis listas de constantes dos fragmentos e dos termos de corre ­
lação (b)(c)(d)(e). Algumas são actualizadas regularmente (b).  
Critérios de qualidade  
De um modo geral, a fiabilidade do método de cálculo diminui com a comple ­
xidade crescente do composto submetido a estudo. No caso de moléculas simples 
com baixo peso molecular e com um ou dois grupos funcionais admite-se um 
desvio compreendido entre 0,1 e 0,3 unidades de log P  oa entre os resultados 
obtidos com diferentes métodos de fragmentação e o valor medido. No caso das moléculas mais complexas a margem de erro pode ser superior. Isto dependerá da 
fiabilidade e da disponibilidade de constantes dos fragmentos e também da 
capacidade para identificar interacções intramoleculares (por exemplo, ligações de hidrogénio) e para utilizar correctamente os termos de correcção (este pro ­
blema pode ser minimizado utilizando a aplicação informática CLOGP-3) (b). 
No caso dos compostos ionizantes é importante tomar em consideração correc ­
tamente a carga e o grau de ionisação.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 78
 
Procedimentos de cálculo  
Método π de Hansch  
A constante do substituinte hidrofóbico original, π, introduzida por Fujita et al. 
(f), define-se do modo seguinte:  
π x = log P  oa (PhX) - log P  oa (PhH)  
em que P  oa (PhX) representa o coeficiente de partição de um derivado aromático 
e P oa (PhH) representa o coeficiente de partição do composto original  
(por exemplo: π Cl = log P  oa (C 6 H 5 Cl) - log P  oa (C 6 H 6 ) = 2,84 - 2,13 = 0,71).  
De acordo com esta definição, o método π é aplicável essencialmente nos casos 
de substituição aromática. Os valores π para um grande número de substituintes 
encontram-se em tabelas (b)(c)(d) e são utilizados para o cálculo dos valores log 
P oa de substruturas ou moléculas aromáticas.  
Método de Rekker  
De acordo com Rekker (g) o valor de log P  oa calcula-se do modo seguinte:  
log P  oa ¼ Σ i a i f i þ Σ j ðtermos de interacção Þ 
em que f  i representa as diferentes constantes dos fragmentos moleculares e a  i 
representa a frequência da sua ocorrência na molécula sujeita a investigação. 
Os termos de correcção podem ser expressos na forma de um integral múltiplo de uma única constante C
 m (designada por «constante mágica»). As constantes 
dos fragmentos f  i e C  m foram determinadas a partir de uma listagem de 1 054 
valores experimentais de P  oa (825 compostos) utilizando análise de regressão 
múltipla (c)(h). A determinação dos termos de interacção efectua-se de acordo com regras consagradas descritas na literatura (e)(h)(i).
 
Método de Hansch-Leo  
De acordo com Hansch e Leo (c) calcula-se o valor de log P  oa de acordo com a 
equação:  
log P  oa ¼ Σ i a i f i þ Σ j b j F j 
em que f  i representa as diferentes constantes dos fragmentos moleculares, F  j 
representa os termos de correcção e a  i e b  j representam as correspondentes 
frequências de ocorrência. Por aproximações sucessivas determinou-se, a partir dos valores experimentais de P
 oa , uma listagem de valores de fragmentos atómi ­
cos e de grupos e uma listagem dos termos de correcção F  j (designados «facto ­
res»). Os termos de correcção foram ordenados segundo diversas classes dife ­
rentes (a)(c). É relativamente complicado e moroso levar em consideração todas as regras e termos de correcção. Existem disponíveis diversas aplicações infor ­
máticas (b).
 
Método combinado  
O cálculo dos valores log P  oa de moléculas complexas pode ser consideravel ­
mente aperfeiçoado, se a molécula for cindida em substruturas para as quais se 
encontrem disponíveis valores fiáveis de log P  oa , tanto a partir de tabelas (b)(c) 
como a partir das medições do próprio investigador. Esses fragmentos (por exemplo, heterociclos, antraquinona, azobenzeno) podem ser combinados depois com os valores y segundo Hansch ou com as constantes dos fragmentos segundo 
Rekker ou Leo.
 
Observações  
i) Os métodos de cálculo apenas podem ser aplicados a compostos parcial ou 
totalmente ionizados no caso de ser possível tomar em consideração os 
necessários factores de correcção;  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 79
 
ii) No caso de se admitir a existência de ligações intramoleculares entre átomos 
de hidrogénio é necessário adicionar (a) os correspondentes termos de cor ­
recção (aproximadamente + 0,6 a + 1,0 unidades log P  oa ). As indicações para 
a presença dessas ligações podem ser obtidas a partir de modelos espaciais ou a partir de dados espectroscópicos da molécula;
 
iii) No caso de serem possíveis diversas formas tautoméricas, deve-se utilizar a 
forma mais provável como base de cálculo;  
iv) As revisões das listagens de constantes de fragmentos deverão ser acompa ­
nhadas cuidadosamente.  
Relatório  
No caso de se utilizar métodos de cálculo/estimação o relatório do ensaio deverá, 
se possível, conter a informação seguinte:  
— descrição da substância (mistura, impurezas, etc.),  
— indicação de quaisquer possíveis ligações intramoleculares entre átomos de 
hidrogénio, dissociação, carga e quaisquer outros efeitos extraordinários (por exemplo, tautomerismo),
 
— descrição do método de cálculo,  
— identificação ou fonte da base de dados,  
— peculiaridades na escolha dos fragmentos,  
— documentação compreensiva relativa aos cálculos.  
BIBLIOGRAFIA  
(a) W.J. Lyman, W.F. Reehl and D.H. Rosenblatt (ed.), Handbook of Chemical 
Property Estimation Methods, McGraw-Hill, New York, 1983.  
(b) Pomona College, Medicinal Chemistry Project, Claremont, California 91711, 
USA, Log P Database and Med. Chem. Software (Program CLOGP-3).  
(c) C. Hansch, A.J. Leo, Substituent Constants for Correlation Analysis in Che ­
mistry and Biology, John Wiley, New York, 1979.  
(d) A. Leo, C. Hansch, D. Elkins, Chem. Rev., 1971, vol. 71, p. 525.  
(e) R.F. Rekker, H.M. de Kort, Eur. J. Med. Chem. — Chim. Ther. 1979, vol. 
14, p. 479.  
(f) T. Fujita, J. Iwasa and C. Hansch, J. Amer. Chem. Soc., 1964, vol. 86, p. 
5175.  
(g) R.F. Rekker, The Hydrophobic Fragmentai Constant, Pharmacochemistry 
Library, Elsevier, New York, 1977, vol. 1.  
(h) C.V. Eadsforth, P. Moser, Chemosphere, 1983, vol. 12, p. 1459.  
(i) R.A. Scherrer, ACS — American Chemical Society, Washington D.C., 1984, 
Symposium Series 255, p. 225.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 80
 
Apêndice 2  
Substâncias de referência recomendadas para o método de HPLC  
Substância de referência 2-butanona log P  oa pKa 
1 2-butanona 0,3 
2 4-acetilpiridina 0,5 3 anilina 0,9 4 acetanilida 1,0 
5 álcool benzílico 1,1 
6 p-metoxifenol 1,3 pKa = 10,26 7 ácido fenoxi-acético 1,4 pKa = 3,12 8 fenol 1,5 pKa = 9,92 9 2,4-dinitrofenol 1,5 pKa = 3,96 
10 benzonitrilo 1,6 11 fenilacetonitrilo 1,6 12 álcool 4-metilbenzílico 1,6 13 acetofenona 1,7 14 2-nitrofenol 1,8 pKa = 7,17 
15 ácido 3-nitrobenzóico 1,8 pKa = 3,47 
16 4-cloranilina 1,8 pKa = 4,15 17 nitrobenzeno 1,9 18 álcool cinâmico 1,9 19 ácido benzóico 1,9 pKa = 4,19 20 p-cresol 1,9 pKa = 10,17 21 ácido cinâmico 2,1 pKa = 3,89 cis 4,44 trans 22 anisol 2,1 23 benzoato de metilo 2,1 24 benzeno 2,1 
25 ácido 3-metilbenzóico 2,4 pKa = 4,27 
26 4-clorofenol 2,4 pKa = 9,1 27 tricloroetileno 2,4 28 atrazina 2,6 29 benzoato de etilo 2,6 30 2,6-diclorobenzonitrilo 2,6 31 ácido 3-clorobenzóico 2,7 pKa = 3,82 32 tolueno 2,7 33 1-naftol 2,7 pKa = 9,34 34 2,3-dicloroanilina 2,8 
35 clorobenzeno 2,8 
36 éter alil-fenílico 2,9 37 bromobenzeno 3,0
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 81
 
Substância de referência 2-butanona log P  oa pKa 
38 etilbenzeno 3,2 
39 benzofenona 3,2 
40 4-fenilfenol 3,2 pKa = 9,54 
41 timol 3,3 42 1,4-diclorobenzeno 3,4 43 difenilamina 3,4 pKa = 0,79 44 naftaleno 3,6 45 benzoato de fenilo 3,6 46 isopropilbenzeno 3,7 47 2,4,6-triclorofenol 3,7 pKa = 6 48 bifenilo 4,0 49 benzoato de benzilo 4,0 50 2,4-dinitro-6-sec-butil-fenol 4,1 
51 1,2,4-tricloro-benzeno 4,2 
52 ácido dodecanóico 4,2 53 éter difenílico 4,2 54 n-butil-benzeno 4,5 55 fenantreno 4,5 56 fluoranteno 4,7 57 dibenzilo 4,8 58 2,6-difenilpiridina 4,9 59 trifenilamina 5,7 60 DDT 6,2 
Outras substâncias de referência de baixo valor log P
 oa 
1 ácido nicotínico - 0,07  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 82
 
A.9. PONTO DE INFLAMAÇÃO  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
É útil possuir informação preliminar sobre a inflamabilidade da subs ­
tância antes de se efectuar este ensaio. O procedimento de ensaio 
aplica-se a substâncias líquidas cujos vapores possam ser inflamados por fontes de ignição. Os métodos de ensaio enumerados neste texto são apenas fiáveis para os intervalos de pontos de inflamação espe ­
cificados nos métodos individuais.
 
Deve tomar-se em consideração a possibilidade de ocorrência de 
reacções químicas entre a substância e o suporte da amostra quando se selecciona o método a utilizar.
 
1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES  
O ponto de inflamação é a menor temperatura, corrigida para a 
pressão de 101,325 kPa, à qual um líquido liberta vapores, sob as condições definidas no método de ensaio, numa quantidade tal que se produz no recipiente de ensaio uma mistura ar/vapor inflamável.
 
Unidades:  o C 
t = T - 273,15  
(t em  o C e T em K)  
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Não é necessário utilizar substâncias de referência quando se está a 
investigar uma nova substância. Essas substâncias servem essencial ­
mente para verificar, de vez em quando, as características de execu ­
ção do método e para proporcionar a comparação com resultados obtidos com outros métodos.
 
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO  
Coloca-se a substância no recipiente de ensaio e aquece-se ou arre ­
fece-se até à temperatura de ensaio de acordo com o procedimento 
descrito no método de ensaio individual. Efectuam-se diversas ten ­
tativas para provocar a ignição no sentido de se determinar se a amostra é ou não é inflamável à temperatura de ensaio.
 
1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
1.5.1.  Repetitividade  
A repetitividade varia de acordo com o intervalo de pontos de in ­
flamação e com o método de ensaio utilizado; máximo 2  o C. 
1.5.2.  Sensibilidade  
A sensibilidade depende do método de ensaio utilizado.  
1.5.3.  Especificidade  
A especificidade de alguns métodos de ensaio está limitada a certos 
intervalos de pontos de inflamação e sujeita a dados associados à 
substância (por exemplo, viscosidade elevada).  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 83
 
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
1.6.1.  Preparações  
Coloca-se uma amostra da substância de ensaio num aparelho de 
teste de acordo com 1.6.3.1. e/ou 1.6.3.2.  
Por razões de segurança recomenda-se que no caso das substâncias 
energéticas ou tóxicas se pratique um método que utilize uma pe ­
quena quantidade de amostra, cerca de 2 cm  3 . 
1.6.2.  Condições de ensaio  
Tanto quanto for possível por razões de segurança, o aparelho deverá 
ser colocado numa posição livre de correntes de ar.  
1.6.3.  Realização do ensaio  
1.6.3.1.  Método de equilíbrio  
Ver ISO 1516, ISO 3680, ISO 1523, ISO 3679.  
1.6.3.2.  Método de não equilíbrio  
Aparelho de Abel:  
Ver BS 2000 parte 170, NF M07-011, NF T66-009.  
Aparelho de Abel-Pensky:  
Ver EN 57, DIN 51755 parte 1 (para temperaturas entre 5 e 65  o C), 
DIN 51755 parte 2 (para temperaturas inferiores a 5  o C), NF M07- 
-036.  
Aparelho de Tag:  
Ver ASTM D 56.  
Aparelho de Pensky-Martens:  
Ver ISO 2719, EN 11, DIN 51758, ASTM D 93, BS 2000-34, NF 
M07-019.  
Observações:  
No caso de se verificar que o ponto de inflamação, determinado por 
um método de não equilíbrio em 1.6.3.2., possui os valores 0 ± 2  o C, 
21 ± 2  o C ou 55 ± 2  o C, deve fazer-se a sua confirmação recorrendo 
a um método de equilíbrio que utilize o mesmo aparelho.  
Apenas os métodos que possam proporcionar os valores de tempe ­
ratura do ponto de inflamação podem ser utilizados para uma noti ­
ficação.  
Para se determinar o ponto de inflamação de líquidos viscosos (tin ­
tas, gomas e análogos) contendo solventes, apenas se pode utilizar 
aparelhos e métodos de ensaio adequados para a determinação dos pontos de inflamação de líquidos viscosos.
 
Ver ISO 3679, ISO 3680, ISO 1523, DIN 53213 parte 1.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 84
 
2. RESULTADOS  
3. RELATÓRIO  
O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação se ­
guinte:  
— a especificação exacta da substância (identificação e impurezas),  
— deve especificar-se o método utilizado e bem assim quaisquer 
desvios possíveis,  
— os resultados e quaisquer observações adicionais relevantes para 
a interpretação dos resultados.  
4. REFERÊNCIAS  
Nenhuma.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 85
 
A.10.  INFLAMABILIDADE (SÓLIDOS)  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
Considera-se útil possuir informações preliminares sobre as proprie ­
dades potencialmente explosivas da substância antes de se efectuar 
este ensaio.  
Este ensaio apenas deverá ser aplicado a substâncias pulverulentas, 
granuladas ou pastosas.  
No sentido de não se incluírem todas as substâncias que podem ser 
inflamadas, mas apenas aquelas que ardem rapidamente ou aquelas cuja combustão é de alguma forma especialmente perigosa, apenas as 
substâncias cuja velocidade de combustão excede um determinado 
valor limite são consideradas altamente inflamáveis.
 
Pode ser especialmente perigosa qualquer situação em que a incan ­
descência se propague através de um metal em pó, devido às difi ­
culdades em extinguir o fogo. Os pós de metais deverão ser consi ­
derados altamente inflamáveis se permitirem a propagação da incan ­
descência através da sua massa, num intervalo de tempo específico.  
1.2. DEFINIÇÃO E UNIDADES  
O tempo de combustão exprime-se em segundos.  
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Não especificadas.  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO  
Dispõe-se a substância numa fita inquebrável ou num rastilho de pó 
com aproximadamente 250 mm de comprimento e efectua-se um ensaio preliminar para se determinar se ao provocar-se a ignição com uma chama de gás existe propagação por combustão rápida 
ou por combustão lenta. Se ocorrer a propagação da combustão ao 
longo de 200 mm do rastilho no decurso de um intervalo específico de tempo, efectua-se seguidamente o programa de ensaio total para se determinar a velocidade de combustão.
 
1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
Não especificados.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 86
 
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
1.6.1.  Ensaio preliminar  
Dispõe-se a substância numa fila inquebrável ou num rastilho de pó 
com aproximadamente 250 mm de comprimento por 20 mm de 
largura e por 10 mm de altura, sobre uma placa não combustível, 
não porosa e de fraca condutividade térmica. Aplica-se a uma ex ­
tremidade do rastilho de pó uma chama de um queimador de gás (diâmetro mínimo de 5 mm) até o pó iniciar a ignição ou durante um 
período máximo de 2 minutos (5 minutos para pós de metais ou de 
ligas metálicas). Deve verificar-se se a combustão se propaga ao longo de 200 mm do rastilho no período de tempo do ensaio cor ­
respondente a 4 minutos (ou 40 minutos para os pós de metais). 
No caso de a substância não se inflamar e não houver propagação de combustão, quer por combustão viva, quer por combustão lenta, ao longo de 200 mm do rastilho de pó no período de ensaio corres ­
pondente a 4 minutos (ou 40 minutos), então a substância não deverá 
ser considerada altamente inflamável e não será necessário mais qualquer ensaio. Se a substância propagar a combustão ao longo de 200 mm do rastilho de pó em menos de 4 minutos ou em menos 
de 40 minutos no caso dos pós de metais, deve dar-se continuidade 
ao procedimento a seguir descrito (ponto 1.6.2 e seguintes).
 
1.6.2.  Ensaio da velocidade de combustão  
1.6.2.1.  Preparação  
Enche-se livremente com as substâncias pulverulentas ou granuladas 
um molde de 250 mm de comprimento com uma secção transversal 
triangular cuja altura interna é de 10 mm e cuja largura é de 20 mm. 
De ambos os lados do molde, segundo uma direcção longitudinal, faz-se a montagem de duas placas metálicas que constituem limita ­
ções laterais e as quais se projectam 2 mm para além da aresta 
superior da secção recta triangular (ver figura). Depois deixa-se 
cair o molde três vezes de uma altura de 2 cm sobre uma superfície sólida. Se necessário completa-se depois o enchimento do molde. Efectua-se depois a remoção das limitações laterais e retira-se o 
excesso de substância. Na parte superior do molde coloca-se uma 
placa não combustível, não porosa e de baixa condutividade térmica, inverte-se o aparelho e remove-se o molde.
 
As substâncias pastosas são dispostas sobre uma placa não combus ­
tível, não porosa e de baixa condutividade térmica na forma de um 
cordão de 250 mm de comprimento possuindo uma secção trans ­
versal de aproximadamente 1 cm  2 . 
1.6.2.2.  Condições de ensaio  
No caso de se tratar de uma substância sensível à humidade o ensaio 
deverá ser efectuado tão rapidamente quanto possível após a sua remoção do recipiente.
 
1.6.2.3.  Realização do ensaio  
Coloca-se a pilha numa zona de um sistema de exaustão de fumos.  
A velocidade do ar deverá ser suficiente para evitar que os fumos 
escapem para o interior do laboratório e não deverá variar durante o 
ensaio. Em torno do aparelho deverá ser instalada uma blindagem em forma de chaminé.
 
Para iniciar a ignição da pilha numa das suas extremidades utiliza-se 
uma chama de um queimador de gás (diâmetro mínimo de 5 mm). 
Depois de a pilha ter ardido numa extensão de 80 mm, mede-se a 
velocidade de combustão nos 100 mm seguintes.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 87
 
Efectua-se o ensaio seis vezes, utilizando-se de cada vez uma placa 
fria limpa, a não ser que se observe um resultado positivo mais cedo.  
2. RESULTADOS  
O tempo de combustão determinado no ensaio preliminar (1.6.1.) e o 
tempo mais curto de combustão observado nos seis ensaios (1.6.2.3.) 
são relevantes para a avaliação.  
3. RELATÓRIO  
3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação se ­
guinte:  
— especificação exacta da substância (identificação e impurezas),  
— uma descrição da substância que se pretende ensaiar, o seu es ­
tado físico incluindo o teor em humidade,  
— os resultados do ensaio preliminar e do ensaio da velocidade de 
combustão, se tiverem sido efectuados,  
— todas as observações adicionais relevantes para a interpretação 
dos resultados.  
3.2. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS  
As substâncias pulverulentas, granuladas ou pastosas são considera ­
das altamente inflamáveis no caso de o tempo de combustão em quaisquer ensaios efectuados de acordo com o procedimento de en ­
saio descrito em 1.6.2. ser inferior a 45 segundos. Os pós de metais 
ou de ligas metálicas são considerados altamente inflamáveis no caso 
de poderem ser inflamados e de a chama ou a zona de reacção se propagar a toda a amostra em 10 minutos ou menos.
 
4. REFERÊNCIAS  
(1) NF T 20-042 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of solids.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 88
 
Apêndice  
Figura  
Molde e acessórios para a preparação da pilha  
(Todas as dimensões estão em milímetros)
  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 89
 
A.11.  INFLAMABILIDADE (GASES)  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
Este método permite determinar se os gases misturados com ar à 
temperatura ambiente (cerca de 20  o C) e à pressão atmosférica são 
inflamáveis e, em caso afirmativo, qual o intervalo de concentrações. As misturas de concentrações crescentes do gás com ar são expostas a uma faísca eléctrica e observa-se a eventual ocorrência de ignição.
 
1.2. DEFINIÇÃO E UNIDADES  
O intervalo de inflamabilidade é o intervalo de concentrações entre 
os limites inferior e superior de explosão. Os limites inferior e su ­
perior de explosão são os limites de concentração do gás inflamável misturado com ar para cujos valores não ocorre a propagação da 
chama.
 
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Não especificadas.  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO  
Aumenta-se gradualmente a concentração do gás em ar e expõe-se a 
mistura escalonadamente à acção de uma faísca eléctrica.  
1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
Não especificados.  
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
1.6.1.  Aparelho  
O recipiente de ensaio é um cilindro de vidro colocado em posição 
vertical, possuindo um diâmetro interno mínimo de 50 mm e uma 
altura mínima de 300 mm. Os eléctrodos de ignição encontram-se 
separados por uma distância de 3 a 5 mm e estão colocados 60 mm acima do fundo do cilindro. O cilindro possui uma abertura para a libertação de pressão. O aparelho deve ser protegido por uma blin ­
dagem para minimizar quaisquer danos provocados pela explosão.
 
Como fonte de ignição utiliza-se uma faísca de indução com a 
duração de 0,5 segundo, que é gerada por um transformador de alta tensão com uma tensão de saída compreendida entre 10 e 15 
kV (potência máxima de entrada da ordem de 300 W). Na referência 
(2) encontra-se descrito um exemplo de um aparelho adequado.
 
1.6.2.  Condições de ensaio  
O ensaio deve ser efectuado à temperatura ambiente (cerca de 20  o C). ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 90
 
1.6.3.  Realização do ensaio  
Utilizando bombas doseadoras introduz-se no cilindro de vidro uma 
concentração conhecida de gás em ar. Provoca-se uma faísca na mistura e verifica-se se ocorre ou não a existência de uma chama 
que se separa da fonte de ignição e se propaga independentemente. 
Faz-se variar a concentração do gás por escalões de 1 % em volume até que haja ocorrência de ignição conforme anteriormente descrito.
 
No caso de a estrutura química do gás indicar que poderá ser even ­
tualmente não inflamável e de se poder calcular a composição da 
mistura estequiométrica com ar, apenas será necessário ensaiar em escalões de 1 % misturas compreendidas no intervalo entre 10 % menos do que a composição estequiométrica e 10 % mais do que 
essa composição.
 
2. RESULTADOS  
A ocorrência de propagação da chama é a única informação rele ­
vante para a determinação desta propriedade.  
3. RELATÓRIO  
O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação se ­
guinte:  
— a especificação exacta da substância (identificação e impurezas),  
— uma descrição, com dimensões, do aparelho utilizado,  
— a temperatura a que se efectuou o ensaio,  
— as concentrações de ensaio e os resultados obtidos,  
— o resultado do ensaio: gás não inflamável ou gás altamente in ­
flamável,  
— no caso de se ter concluído que o gás é não inflamável, deverá 
especificar-se então o intervalo de concentrações no qual foi ensaiado em escalões de 1 %,
 
— toda a informação e observações relevantes para a interpretação 
dos resultados.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) NF T 20-041 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of gases.  
(2) W. Berthold, D. Conrad, T. Grewer, H. Grosse-Wortmann, T. 
Redeker und H.Schacke. «Entwicklung einer Standard-Appara ­
tur zur Messung von Explosionsgrenzen». Chem.-Ing.-Tech. 
1984, vol. 56, 2, p. 126-127.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 91
 
A.12.  INFLAMABILIDADE (CONTACTO COM ÁGUA)  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
Este método de ensaio pode ser utilizado para se determinar se a 
reacção de uma substância com água ou com ar húmido origina o 
desenvolvimento de quantidades perigosas de um gás ou de gases que possam ser altamente inflamáveis.
 
O método de ensaio pode ser aplicado tanto a substâncias sólidas 
como a substâncias líquidas. Este método não é aplicável a subs ­
tâncias cuja ignição seja espontânea quando em contacto com o ar.  
1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES  
Altamente inflamável: substâncias que em contacto com água ou 
com ar húmido libertam gases altamente inflamáveis em quantidades 
perigosas numa proporção mínima de 1 litro/kg por hora.  
1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO  
Ensaia-se a substância de acordo com os passos sequenciais adiante 
descritos: se ocorrer ignição em qualquer desses passos não é neces ­
sário continuar o ensaio. No caso de se saber já que a substância não reage violentamente com a água, prosseguir com o passo 4 (1.3.4.).
 
1.3.1.  Passo 1  
Coloca-se a substância de ensaio numa tina contendo água destilada 
à temperatura de 20  o C e verifica-se se ocorre ou não o início da 
combustão do gás libertado.  
1.3.2.  Passo 2  
Coloca-se a substância de ensaio sobre uma folha de papel de filtro 
flutuando sobre a superfície da água destilada contida num prato, à 
temperatura de 20  o C, e observa-se se ocorre ou não o início da 
combustão do gás libertado. O papel de filtro destina-se apenas a manter a substância num determinado local para aumentar as proba ­
bilidades de ocorrência de ignição.
 
1.3.3.  Passo 3  
Com a substância de ensaio prepara-se uma pilha com aproximada ­
mente 2 cm de altura e 3 cm de diâmetro. Verte-se nessa pilha 
algumas gotas de água e observa-se se há ou não ocorrência de 
início de combustão do gás libertado.  
1.3.4.  Passo 4  
Mistura-se a substância a ensaiar com água destilada à temperatura 
de 20  o C e mede-se a velocidade de libertação de gás durante um 
período de sete horas, em intervalos de uma hora. Se essa taxa de libertação de gás for errática ou no caso de ser crescente decorridas as sete horas, deverá prolongar-se o tempo de medição até ao má ­
ximo de cinco dias. O ensaio pode ser interrompido se em qualquer 
momento essa taxa exceder 1 litro/kg por hora.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 92
 
1.4. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Não especificadas.  
1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
Não especificados.  
1.6. DESCRIÇÃO DOS MÉTODOS  
1.6.1.  Passo 1  
1.6.1.1.  Condições de ensaio  
Efectua-se o ensaio à temperatura ambiente (cerca de 20  o C). 
1.6.1.2.  Realização do ensaio  
Deve-se colocar uma pequena quantidade (aproximadamente com 
2 mm de diâmetro) da substância de ensaio numa tina contendo 
água destilada. Deve-se anotar (i) qualquer eventual libertação de gás e (ii) a eventual ocorrência de ignição do gás. No caso de ocorrer ignição do gás não é necessário continuar o ensaio da substância 
uma vez que esta é considerada perigosa.
 
1.6.2.  Passo 2  
1.6.2.1.  Aparelho  
Utiliza-se um papel de filtro flutuando sobre a superfície de água 
destilada contida em qualquer recipiente adequado, por exemplo, um prato de evaporação com o diâmetro de 100 mm.
 
1.6.2.2.  Condições de ensaio  
Efectua-se o ensaio à temperatura ambiente (cerca de 20  o C). 
1.6.2.3.  Realização do ensaio  
Coloca-se no centro da folha de papel de filtro uma pequena quan ­
tidade da substância de ensaio (aproximadamente com 2 mm de 
diâmetro). Deve-se anotar se ocorre (i) qualquer eventual libertação 
de gás e (ii) se ocorre ignição desse gás. Se ocorrer a ignição do gás não é necessário continuar o ensaio da substância, uma vez que esta é considerada perigosa.
 
1.6.3.  Passo 3  
1.6.3.1.  Condições de ensaio  
Efectua-se o ensaio à temperatura ambiente (cerca de 20  o C). 
1.6.3.2.  Realização do ensaio  
Com a substância de ensaio prepara-se uma pilha com aproximada ­
mente 2 cm de altura e 3 cm de diâmetro com um entalhe na parte 
superior. Verte-se na perfuração algumas gotas de água e verifica-se (i) se ocorre eventualmente qualquer libertação de gás e (ii) se ocorre ignição desse gás. Se ocorrer ignição do gás não é necessário con ­
tinuar o ensaio da substância uma vez que esta é considerada peri ­
gosa.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 93
 
1.6.4.  Passo 4  
1.6.4.1.  Aparelho  
O aparelho tem a configuração que se mostra na figura.  
1.6.4.2.  Condições de ensaio  
Procede-se a uma inspecção da embalagem para verificação da exis ­
tência de pó (dimensão das partículas < 500 μm) da substância de 
ensaio. Se o pó constituir mais do que 1 % p/p do total, ou se a amostra for friável, então dever-se-á triturar toda a substância redu ­
zindo-a a pó antes do ensaio de modo a proporcionar uma redução 
das dimensões das partículas durante o armazenamento e o manu ­
seamento; caso contrário faz-se o ensaio da substância tal como foi recebida. O ensaio deverá ser efectuado à temperatura ambiente 
(cerca de 20
 o C) e à pressão atmosférica.  
1.6.4.3.  Realização do ensaio  
Coloca-se 10 a 20 ml de água no funil de gotejamento do aparelho e 
coloca-se 10 g de substância no frasco cónico. Pode-se medir o volume de gás libertado recorrendo a meios adequados. Abre-se a 
torneira do funil de gotejamento para deixar entrar a água no frasco 
cónico e põe-se em funcionamento um cronómetro. Mede-se a liber ­
tação de gás em cada hora durante um período de sete horas. No caso da libertação de gás durante esse período ser errática ou 
no caso de no fim desse período a taxa de libertação de gás ser 
crescente, então dever-se-á continuar a efectuar medições durante cinco dias. Se em qualquer momento do período de medição a taxa de libertação de gás exceder 1 litro/kg por hora pode-se inter ­
romper o ensaio. Este ensaio deverá ser efectuado em triplicado.
 
No caso de ser desconhecida a identidade do gás, deve-se proceder a 
uma análise desse gás. No caso de o gás conter componentes alta ­
mente inflamáveis e de não se saber se a mistura global é altamente 
inflamável, deve-se preparar uma mistura da mesma composição e ensaiar-se de acordo com o método A.11.
 
2. RESULTADOS  
A substância é considerada perigosa se:  
— ocorrer ignição espontânea em qualquer passo do procedimento 
de ensaio,  
ou 
— ocorrer libertação de gás inflamável a uma taxa superior a 1 
litro/kg de substância por hora.  
3. RELATÓRIO  
O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação se ­
guinte:  
— a especificação exacta da substância (identificação e impurezas),  
— pormenores sobre qualquer preparação inicial da substância de 
ensaio,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 94
 
— os resultados dos ensaios (passos 1, 2, 3 e 4),  
— a identidade química do gás libertado,  
— a taxa de libertação de gás no caso de se realizar o passo 4 
(1.6.4.),  
— quaisquer observações adicionais relevantes para a interpretação 
dos resultados.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test 
and Criteria, 1990, United Nations, New York.  
(2) NF T 20-040 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the flammability of gases formed by the 
hydrolysis of solid and liquid products.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 95
 
Apêndice  
Figura  
Aparelho
  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 96
 
A.13  PROPRIEDADES PIROFÓRICAS DE SÓLIDOS E LÍQUIDOS  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
O procedimento de ensaio é aplicável a substâncias sólidas ou líqui ­
das as quais, em pequenas quantidades, entram espontaneamente em 
combustão, decorrido um curto período de tempo após estarem em contacto com o ar à temperatura ambiente (cerca de 20
 o C). 
As substâncias que necessitem de estar expostas ao ar durante diver ­
sas horas ou dias, à temperatura ambiente ou a temperaturas eleva ­
das, antes que ocorra a ignição, não estão abrangidas por este mé ­
todo.  
1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES  
Considera-se que uma substância possui propriedades pirofóricas se 
entrar em combustão ou se carbonizar sob as condições descritas em 
1.6. 
Pode ser necessário ensaiar também a auto-inflamabilidade de líqui ­
dos utilizando o método A.15 relativo à temperatura de auto-ignição (líquidos e gases).
 
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Não especificadas.  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO  
Adiciona-se a substância, no estado sólido ou no estado líquido, a 
um veículo inerte e coloca-se em contacto com o ar à temperatura ambiente durante um período de cinco minutos. Se as substâncias líquidas não se inflamarem utiliza-se papel de filtro para as absorver 
e faz-se a exposição ao ar à temperatura ambiente (cerca de 20
 o C) 
durante cinco minutos. No caso de uma substância sólida ou líquida se inflamar, ou no caso de um líquido se inflamar ou carbonizar uma folha de papel de filtro, então considera-se que essa substância é 
pirofórica.
 
1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
Repetitividade: devido à importância que assumem as questões rela ­
tivas à segurança, um único resultado positivo é suficiente para que essa substância seja considerada pirofórica.
 
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.6.1.  Aparelho  
Utiliza-se um vaso de porcelana com cerca de 10 cm de diâmetro e 
enche-se com terra de diatomáceas até cerca de 5 mm de altura, à 
temperatura ambiente (cerca de 20  o C). 
Nota:  
A terra de diatomáceas ou quaisquer outras substâncias inertes com ­
paráveis geralmente disponíveis deverão ser consideradas como re ­
presentativas do solo onde a substância de ensaio possa ser derra ­
mada em caso de acidente.  
É necessário papel de filtro seco para ensaiar os líquidos que não se 
inflamem em contacto com o ar quando estão em contacto com um 
veículo inerte.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 97
 
1.6.2.  Realização do ensaio  
a) Sólidos pulverulentos  
De uma altura de cerca de 1 m deixa-se cair 1 a 2 cm  3 da substância 
pulverulenta que se pretende ensaiar, sobre uma superfície não com ­
bustível e verifica-se a eventualidade dessa substância se inflamar 
durante a queda ou decorridos cinco minutos em repouso.  
Efectua-se o ensaio seis vezes, salvo no caso de se observar com ­
bustão.  
b) Líquidos  
Verte-se no vaso de porcelana cerca de 5 cm  3 do líquido que se 
pretende ensaiar e observa-se a eventual inflamação da substância no 
período de cinco minutos.  
Se não houver inflamação nos seis ensaios, executam-se os ensaios 
seguintes:  
Com o auxílio de uma seringa coloca-se 0,5 ml da amostra de ensaio 
num papel de filtro recortado e observa-se a eventual ocorrência de 
inflamação ou de carbonização do papel de filtro nos cinco minutos 
subsequentes à adição do líquido. Efectua-se o ensaio três vezes, salvo se ocorrer inflamação ou carbonização.
 
2. RESULTADOS  
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS  
Pode interromper-se o processo de ensaio logo que ocorra um resul ­
tado positivo em qualquer dos ensaios.  
2.2. AVALIAÇÃO  
Se a substância se inflama no período de cinco minutos após ter sido 
adicionada a um veículo inerte e exposta ao ar, ou se uma substância líquida carboniza ou inflama um papel de filtro no período de cinco minutos após a adição e exposição ao ar, então considera-se que é 
pirofórica.
 
3. RELATÓRIO  
O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação se ­
guinte:  
— a especificação exacta da substância (identificação e impurezas),  
— os resultados dos ensaios,  
— quaisquer observações adicionais relevantes para a interpretação 
dos resultados.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) NF T 20-039 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the spontaneous flammability of solids and 
liquids.  
(2) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Test 
and Criteria, 1990, United Nations, New York.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 98
 
A.14.  PROPRIEDADES EXPLOSIVAS  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
O método proporciona um sistema de ensaio para se determinar se 
uma substância sólida ou pastosa representa perigo de explosão 
quando submetida ao efeito de uma chama (sensibilidade térmica) ou quando submetida a choque ou fricção (sensibilidade a estímulos mecânicos) e se uma substância líquida representa perigo de explo ­
são quando submetida ao efeito de uma chama ou choque.
 
O método decompõe-se em três partes:  
a) Um ensaio de sensibilidade térmica (1);  
b) Um ensaio de sensibilidade mecânica relativamente ao 
choque (1);  
c) Um ensaio de sensibilidade mecânica relativamente à fricção (1).  
O método proporciona dados para se avaliar a possibilidade de se 
iniciar uma explosão por meio de diversos estímulos comuns. O 
método não pretende garantir que uma substância seja susceptível de explodir sob quaisquer condições.
 
O método é apropriado para se determinar se uma substância repre ­
senta perigo de explosão (sensibilidade térmica e mecânica) sob as condições particulares especificadas na directiva. Esse método ba ­
seia-se em diversos tipos de aparelhos amplamente utilizados à es ­
cala internacional (1) e os quais proporcionam normalmente resulta ­
dos significativos. Admite-se que o método não é definitivo. É pos ­
sível utilizar aparelhos alternativos aos especificados desde que se ­
jam internacionalmente aceites e desde que os resultados possam ser 
adequadamente correlacionados com os que se obtêm com o apare ­
lho especificado.
 
Não é necessário efectuar os ensaios quando existir informação ter ­
modinâmica disponível (por exemplo, calor de formação, calor de decomposição) e/ou a ausência de diversos grupos reactivos (2) na 
fórmula estrutural permitir concluir, para além de quaisquer dúvidas 
razoáveis, que a substância é incapaz de sofrer decomposição rápida com libertação de gases ou libertação de calor (isto é, o material não representa qualquer risco de explosão). No caso dos líquidos não é 
necessário qualquer ensaio de sensibilidade mecânica relativamente à 
fricção.
 
1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES  
Explosivo:  
Substâncias que possam explodir sob o efeito de uma chama ou que 
sejam sensíveis ao choque ou à fricção no aparelho especificado (ou 
que sejam mecanicamente mais sensíveis do que o 1,3-dinitroben ­
zeno num aparelho alternativo).  
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
O 1,3-dinitrobenzeno, produto cristalino técnico, peneirado de modo 
a poder passar por uma malha de 0,5 mm, no caso do método por fricção e choque.
 
A perhidro-l,3,5-trinitro-l,3,5-triazina (RDX, hexogéneo, ciclonite — 
CAS 121-82-4), cuja recristalização é feita a partir de uma solução aquosa de ciclohexanona, peneirada a húmido através de uma malha de 250 μm e retida num peneiro de malha de 150 μm, fazendo-se a 
secagem a 103 ± 2
 o C (durante 4 horas) para a segunda série de 
ensaios de fricção e choque.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 99
 
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO  
São necessários ensaios preliminares para se determinar as condições 
de segurança para a realização dos três ensaios de sensibilidade.  
1.4.1.  Segurança na realização dos ensaios (3)  
Por razões de segurança, antes de se efectuarem os ensaios principais 
submetem-se amostras muito pequenas (cerca de 10 mg) da subs ­
tância a aquecimento em ambiente não confinado, com uma chama 
de gás, à acção de choque em qualquer aparelho conveniente e à acção de fricção recorrendo à utilização de um malhete contra uma bigorna ou recorrendo à utilização de qualquer máquina de fricção. 
O objectivo consiste em determinar se a substância é tão sensível e 
explosiva que os ensaios de sensibilidade prescritos, particularmente o ensaio de sensibilidade térmica, devam ser efectuados com precau ­
ções especiais de modo a evitar ferimentos no operador.
 
1.4.2.  Sensibilidade térmica  
O método implica o aquecimento da substância num tubo de aço, 
tapado por placas perfuradas com furos de diferentes diâmetros, no 
sentido de se determinar se a substância é susceptível de explodir 
sob condições de aquecimento intenso e confinamento definido.  
1.4.3.  Sensibilidade mecânica (choque)  
O método consiste em submeter a substância ao choque provocado 
por uma massa determinada caindo de uma altura determinada.  
14.4.  Sensibilidade mecânica (fricção)  
O método consiste em submeter substâncias sólidas ou pastosas à 
fricção entre superfícies normalizadas sob condições específicas de carga e de movimento relativo.
 
1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
Não especificados.  
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
1.6.1.  Sensibilidade térmica (efeito de uma chama)  
1.6.1.1.  Aparelho  
O aparelho é constituído por um tubo de aço não reutilizável com o 
seu dispositivo de fecho reutilizável (figura 1), instalado num dispo ­
sitivo de aquecimento e de protecção. Cada tubo é constituído por folha de aço de estiramento profundo (ver apêndice) e possui um diâmetro interno de 24 mm, um comprimento de 75 mm e paredes 
com espessura de 0,5 mm. Os tubos possuem uma flange na extre ­
midade aberta para permitir que sejam fechados pelo corpo da placa perfurada. Esse corpo é constituído por uma placa perfurada resis ­
tente à pressão, possuindo um furo central, presa firmemente a um 
tubo por meio de uma peça roscada de duas partes (porca e manga 
roscada). A porca e a manga roscada são feitas de aço de crómio e manganés (ver apêndice), que não produz faíscas até à temperatura de 800
 o C. As placas perfuradas possuem 6 mm de espessura, são 
feitas de aço resistente ao calor (ver apêndice) e encontram-se dis ­
poníveis com perfurações de diversos diâmetros.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 100
 
1.6.1.2.  Condições de ensaio  
Normalmente ensaia-se a substância tal como é recebida, embora em 
alguns casos a substância após trituração seja, por exemplo, com ­
primida, moldada ou aglomerada por qualquer outra forma, necessá ­
ria para o ensaio.  
No caso dos sólidos determina-se a massa de material a utilizar em 
cada ensaio recorrendo a um procedimento experimental a seco em 
dois andares. Enche-se com 9 cm  3 de substância um tubo de tara 
determinada e carrega-se a substância com uma força de 80 N apli ­
cada a toda a secção transversal do tubo. Por razões de segurança ou nos casos em que a forma física da amostra possa ser modificada por 
compressão, pode recorrer-se a outros procedimentos de enchimento; 
por exemplo, se a substância for muito sensível à fricção o enchi ­
mento pelo método de embuchar não é apropriado. Se o material for compressível adiciona-se mais e carrega-se enchendo-se o tubo até à 
distância de 55 mm medida a partir da parte superior. Determina-se a 
massa total utilizada para encher o tubo até àquele nível de 55 mm e adiciona-se mais duas porções carregando-se qualquer delas com a força de 80 N. Depois, ou se adiciona mais material ou se retira, 
conforme necessário, deixando o tubo cheio até ao nível de 15 mm 
medidos a partir da parte superior. Realiza-se uma segunda experiên ­
cia a seco, começando com uma quantidade carregada correspon ­
dente a um terço da massa total determinada na primeira experiência 
a seco. Adiciona-se mais duas porções dessas utilizando uma força 
de 80 N e ajusta-se o nível da substância no tubo até à distância de 15 mm, medida desde a parte superior, por adição ou por subtracção de material conforme necessário. A quantidade de sólido determi ­
nada na segunda experiência a seco é utilizada para cada ensaio; o 
enchimento efectua-se com três quantidades iguais, qualquer delas comprimida até ao volume de 9 cm
 3 utilizando-se a força que for 
necessária (isto pode ser facilitado utilizando anéis espaçadores).  
Os líquidos e os geles são carregados no tubo até à altura de 60 mm 
tomando-se precauções particulares com os geles para se evitar a formação de espaços ocos. Faz-se deslizar a manga roscada pelo tubo, pela parte de baixo, insere-se a placa perfurada apropriada e 
aperta-se a porca depois de se ter aplicado um pouco de lubrificante 
à base de dissulfureto de molibdénio. É essencial verificar que não haja quaisquer vestígios de substância retida entre a flange e a placa, ou nas roscas.
 
O aquecimento é proporcionado por uma chama de gás propano 
obtido em garrafa de gás industrial, equipada com um regulador de pressão (60 a 70 mbar), que passa através de uma válvula cali ­
bradora e é distribuído uniformemente (conforme indicado por ob ­
servação visual das chamas dos queimadores) a quatro queimadores através de um cano distribuidor. Os queimadores estão localizados em torno da câmara de ensaio conforme se mostra na figura 1. Os 
quatro queimadores conjuntamente possuem um consumo de aproxi ­
madamente 3,2 litros de propano por minuto. É possível utilizar outros queimadores e gases combustíveis alternativos mas o regime de aquecimento deve ser conforme especificado na figura 3. Para 
todos os aparelhos o regime de aquecimento deve ser verificado 
periodicamente utilizando tubos cheios com ftalato de dibutilo con ­
forme se indica na figura 3.
 
1.6.1.3.  Realização dos ensaios  
Cada ensaio é efectuado até o tubo se fragmentar ou até o tubo ter 
sido aquecido durante cinco minutos. Um ensaio que tenha como 
consequência a fragmentação do tubo em três ou mais partes, as 
quais podem em alguns casos ser unidas umas às outras utilizando estreitas fitas de metal, conforme se ilustra na figura 2, é considerado do tipo explosivo. Um ensaio que tenha como consequência menos 
fragmentos ou ausência de fragmentação é considerado como sendo 
do tipo não explosivo.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 101
 
Efectua-se primeiro uma série de três ensaios com uma placa cujo 
diâmetro do orifício seja de 6,0 mm e se não se obtiver qualquer 
explosão efectua-se uma segunda série de três ensaios com uma placa cujo diâmetro do orifício seja de 2,0 mm. Se ocorrer uma explosão durante quaisquer das séries de ensaio, não é necessário 
efectuar mais ensaios.
 
1.6.1.4.  Avaliação  
Considera-se que o resultado do ensaio é positivo se ocorrer uma 
explosão em qualquer das anteriores séries de ensaios.  
1.6.2.  Sensibilidade mecânica (choque)  
1.6.2.1.  Aparelho (figura 4)  
As partes essenciais de um aparelho de martelo cadente típico são 
um bloco de aço moldado com base, bigorna, coluna, guias, massas 
cadentes, dispositivo de libertação e um suporte para a amostra. A 
bigorna de aço de 100 mm (diâmetro) × 70 mm (altura) é enroscada à parte superior de um bloco de aço de 230 mm (comprimento) × 250 mm (largura) × 200 mm (altura) com uma base moldada de 
450 mm (comprimento) × 450 mm (largura) × 60 mm (altura). 
Num suporte aparafusado à parte posterior do bloco de aço pren ­
de-se uma coluna feita de tubo de aço estirado sem juntas. Quatro parafusos prendem o aparelho a um sólido bloco de cimento de 60 × 
60 × 60 cm de tal modo que as guias são absolutamente verticais e a 
massa cadente cai livremente. Existem disponíveis para utilização massas de 5 e 10 kg, feitas de aço. A cabeça batente de cada massa é feita de aço duro, HRC 60 a 63, e possui um diâmetro mínimo de 
25 mm.
 
A amostra de ensaio é encerrada num dispositivo de choque cons ­
tituído por dois cilindros de aço coaxiais, um sobre o outro, num guia de aço cilíndrico e oco. Os cilindros de aço deverão possuir um 
diâmetro de 10 (- 0,003, - 0,005) mm e uma altura de 10 mm e 
deverão possuir superfícies polidas, arestas arredondadas (raio de curvatura de 0,5 mm) e uma dureza de HRC 58 a 65. O cilindro oco deve possuir um diâmetro externo de 16 mm, um furo polido de 
10 (+ 0,005, + 0,010) mm e uma altura de 13 mm. O dispositivo de 
choque é montado numa bigorna intermédia (26 mm de diâmetro e 26 mm de altura) feita de aço e centrada por um anel com perfura ­
ções para permitir o escape dos fumos.
 
1.6.2.2.  Condições de ensaio  
O volume da amostra deverá ser de 40 mm  3 ou um volume que se 
ajuste a qualquer aparelho alternativo. As substâncias no estado só ­
lido deverão ser testadas devidamente secas e preparadas do modo seguinte:
 
a) As substâncias pulverizadas são peneiradas (malha com dimen ­
sões de 0,5 mm); toda a substância que passar pelo peneiro é 
utilizada no ensaio;  
b) As substâncias comprimidas, moldadas ou aglomeradas por qual ­
quer outra forma são partidas em pequenas partes e peneiradas; a fracção peneirada com diâmetros compreendidos entre 0,5 e 
1 mm é usada no ensaio e deverá ser representativa da substância 
original.
 
As substâncias normalmente fornecidas em pasta deverão ser ensaia ­
das no estado seco, quando possível, ou depois de remover a quan ­
tidade máxima possível de diluente. As substâncias líquidas são 
ensaiadas com o intervalo de 1 mm entre os cilindros de aço superior 
e inferior.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 102
 
1.6.2.3.  Realização dos ensaios  
Realiza-se uma série de seis ensaios deixando cair uma massa de 
10 kg, de uma altura de 0,4 m (40 J). Se ocorrer uma explosão durante os seis ensaios para o valor de 40 J deve realizar-se outra 
série de seis ensaios deixando cair uma massa de 5 kg e de uma 
altura de 0,15 m (7,5 J). Noutros aparelhos compara-se a amostra com a substância de referência escolhida utilizando um procedimento reconhecido (por exemplo, técnica de sobe-e-desce, etc.).
 
1.6.2.4.  Avaliação  
Considera-se positivo o resultado do ensaio se ocorrer uma explosão 
(o aparecimento súbito de uma chama e/ou uma repercussão é equi ­
valente a uma explosão) pelo menos uma vez em qualquer dos 
ensaios com o aparelho de choque especificado ou considera-se que a amostra é mais sensível do que o composto 1,3-dinitrobenzeno ou RDX num ensaio de choque alternativo.
 
1.6.3.  Sensibilidade mecânica (fricção)  
1.6.3.1.  Aparelho (figura 5)  
O aparelho de fricção é constituído por uma placa de base de aço 
moldado sobre a qual se monta o dispositivo de fricção. Este é 
constituído por uma cavilha de porcelana fixa e por uma placa de porcelana móvel. A placa de porcelana é suportada por uma armação que desliza em duas guias. A armação é ligada a um motor eléctrico 
através de uma biela de ligação, um ressalto excêntrico e uma en ­
grenagem adequada de tal modo que a placa de porcelana se move, uma vez apenas, para trás e para diante por baixo da cavilha de porcelana numa distância de 10 mm. A carga da cavilha de porcelana 
é de 120 a 360 newtons, por exemplo.
 
As placas lisas de porcelana são feitas de porcelana branca (rugosi ­
dade de 9 a 32 μm) e possuem as dimensões de 25 mm (compri ­
mento) × 25 mm (largura) × 5 mm (altura). A cavilha cilíndrica de porcelana é feita também de porcelana branca e tem 15 mm de 
comprimento, possui um diâmetro de 10 mm e na extremidade es ­
férica rugosa possui superfícies com um raio de curvatura de 10 mm.
 
1.6.3.2.  Condições de ensaio  
O volume da amostra deverá ser de 10 mm  3 ou um volume ajustado 
a qualquer aparelho alternativo.  
As substâncias sólidas são ensaiadas devidamente secas e preparadas 
do modo seguinte:  
a) As substâncias pulverizadas são peneiradas (com malha de 
0,5 mm); utiliza-se no ensaio toda a substância que passe através do peneiro;
 
b) As substâncias comprimidas, moldadas ou aglomeradas por qual ­
quer outra forma são partidas em peças pequenas e peneiradas; 
utiliza-se para o ensaio a fracção peneirada de diâmetro < 
0,5 mm.  
As substâncias normalmente fornecidas em pasta deverão ser ensai ­
das no estado seco, quando possível. Se a substância não pode ser preparada no estado seco, a pasta (depois de removida a quantidade máxima possível de diluente) é ensaiada na forma de uma película 
com 0,5 mm espessura, 2 mm de largura e 10 mm de comprimento 
preparada com uma matriz.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 103
 
1.6.3.3.  Realização dos ensaios  
Coloca-se a cavilha de porcelana sobre a amostra submetida ao 
ensaio e aplica-se a carga. Ao efectuar-se o ensaio, as marcas es ­
ponjosas da placa de porcelana devem ficar transversais à direcção 
do movimento. Devem ser tomadas precauções para que a cavilha se 
ajuste sobre a amostra, para que haja material de ensaio suficiente sob a cavilha e também para que a placa se mova correctamente sob a cavilha. Para as substâncias pastosas utiliza-se um calibrador com 
0,5 mm de espessura e com uma fenda de 2 × 10 mm para se aplicar 
a substância à placa. A placa de porcelana tem de se mover 10 mm para diante e para trás sob a cavilha de porcelana no tempo de 0,44 
segundos. Cada parte da superfície da placa e da cavilha deve ser 
utilizada apenas uma vez; as duas extremidades de cada cavilha servirão para duas experiências e as duas superfícies de uma placa servirão, cada uma delas, para três experiências.
 
Efectua-se uma série de seis ensaios com uma carga de 360 N. Se 
ocorrer um evento positivo durante estes seis ensaios deve ser efec ­
tuada outra série de seis ensaios com uma carga de 120 N. Com 
outros aparelhos compara-se a amostra com a substância de referên ­
cia escolhida utilizando um procedimento consagrado (por exemplo, técnica de sobe-e-desce, etc.).
 
1.6.3.4.  Avaliação  
Considera-se positivo o resultado do ensaio se ocorrer uma explosão 
(a crepitação e/ou uma repercussão ou o aparecimento súbito de uma chama são equivalentes a uma explosão) pelo menos uma vez em 
qualquer dos ensaios com o aparelho de fricção especificado ou se 
for satisfeito um critério equivalente num ensaio de fricção alterna ­
tivo.
 
2. RESULTADOS  
Em princípio considera-se que uma substância representa perigo de 
explosão no sentido da directiva se for obtido um resultado positivo no ensaio de sensibilidade térmica, de choque ou de fricção.
 
3. RELATÓRIO  
3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação se ­
guinte:  
— identidade, composição, pureza, teor em humidade, etc., da subs ­
tância ensaiada,  
— a forma física da amostra e o facto eventual de ter sido triturada, 
quebrada e/ou peneirada,  
— as observações durante os ensaios de sensibilidade térmica (por 
exemplo, a massa da amostra, o número de fragmentos, etc.),  
— as observações efectuadas durante os ensaios de sensibilidade 
mecânica (por exemplo, a formação de quantidades consideráveis 
de fumos ou a decomposição completa sem repercussão, chamas, 
faíscas, crepitação, etc.),  
— os resultados de cada tipo de ensaio,  
— no caso de se ter utilizado um aparelho alternativo, o relatório 
deverá conter a justificação científica e também a evidência de 
correlação entre os resultados obtidos com o aparelho especifi ­
cado e os resultados obtidos com o aparelho equivalente,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 104
 
— quaisquer comentários úteis tais como as referências em ensaios 
com produtos idênticos e que possam ser relevantes para uma 
interpretação adequada dos resultados,  
— todas as observações adicionais relevantes para a interpretação 
dos resultados.  
3.2. INTERPRETAÇÃO E AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS  
O relatório do ensaio deverá mencionar quaisquer resultados que 
sejam considerados falsos, anómalos ou não representativos. Se for 
necessário deduzir quaisquer dos resultados deverá descrever-se uma 
explicação e os resultados de ensaios alternativos ou complementa ­
res. Salvo nos casos em que possa ser explicado um resultado anó ­
malo, deve aceitar-se o valor nominal e utilizar-se esse valor para 
classificar a substância em conformidade.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods: Tests 
and Criteria, 1990, United Nations, New York.  
(2) Bretherick, L., Handbook of Reactive Chemical Hazards, 4th 
edition, Buttcrworths, London, ISBN 0-750-60103-5, 1990.  
(3) Koenen, H., Ide, K.H. and Swart, K.H., Explosivstoffe, 1961, 
vol. 3, p. 6-13 and p. 30-42.  
(4) NF T 20-038 (Sept. 85). Chemical products for industrial use 
— Determination of explosion risk.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 105
 
Apêndice  
Exemplo de especificação de material para o ensaio de sensibilidade térmica 
(ver DIN 1623)  
(1) Tubo: especificação de material n  o 1.0336.505 g.  
(2) Placa perfurada: especificação de material n.  o 1.4873  
(3) Manga roscada e porca: especificação de material n.  o 1.3817.  
Figura 1  
Aparelho para o ensaio da sensibilidade térmica  
(Todas as dimensões estão em milímetros)
  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 106
 
Figura 2  
Ensaio de sensibilidade térmica  
Exemplos de fragmentação
  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 107
 
Figura 3  
Calibração da taxa de aquecimento para o ensaio da sensibilidade térmica
  
Curva de temperatura/tempo obtida ao aquecer-se ftalato de dibutilo (27 cm3) num tubo 
fechado (placa com orifício de 1,5 mm) utilizando gás propano com o débito de 3,2 litros/ ­
minuto. Mede-se a temperatura com um termopar de 1 mm de diâmetro feito de crómio/ ­
alumínio revestido com aço inoxidável, colocado centralmente 43 mm sob o aro do tubo. A taxa de aquecimento entre 135 °C e 285 °C deverá estar compreendida entre 185 e 215 K/minuto.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 108
 
Figura 4  
Aparelho para o ensaio de choque  
(Todas as dimensões estão em milímetros)
  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 109
 
Figura 4  
Continuação
  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 110
 
Figura 5  
Sensibilidade à fricção: aparelho
  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 111
 
A.15.  TEMPERATURA DE AUTO-IGNIÇÃO (LÍQUIDOS E GASES)  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
As substâncias explosivas e as substâncias que sofrem ignição es ­
pontânea em contacto com o ar à temperatura ambiente não devem 
ser submetidas a este ensaio. O procedimento de ensaio é aplicável a gases, líquidos e vapores, que, na presença de ar, podem ser infla ­
mados por uma superfície quente.
 
A temperatura de auto-ignição pode ser consideravelmente reduzida 
pela presença de impurezas catalíticas, pela superfície do material ou 
pelo facto de o recipiente de ensaio ter um volume superior.  
1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES  
O grau de propensão para a auto-ignição exprime-se em termos de 
temperatura de auto-ignição. A temperatura de auto-ignição é a me ­
nor temperatura para a qual a substância de ensaio se inflama quando misturada com ar sob as condições definidas no método de ensaio.
 
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
As substâncias de referência estão enumeradas nas normas (ver 
1.6.3.). Devem servir essencialmente para a calibração do método, de vez em quando, e para permitir a comparação com resultados 
obtidos com outros métodos.
 
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO  
O método permite a determinação da temperatura mínima da super ­
fície interior de um recinto fechado à qual ocorre a ignição de um 
gás, vapor ou líquido injectados nesse recinto fechado.  
1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
A repetitividade varia de acordo com o intervalo de temperaturas de 
auto-ignição e com o método de ensaio utilizado,  
A sensibilidade e a especificidade dependem do método de ensaio 
utilizado.  
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
1.6.1.  Aparelho  
O aparelho encontra-se descrito no método referido em 1.6.3.  
1.6.2.  Condições de ensaio  
O ensaio de uma amostra da substância efectua-se de acordo com o 
método referido em 1.6.3.  
1.6.3.  Realização do ensaio  
Ver IEC 79-4, DIN 51794, ASTM-E 659-78, BS 4056, NF T 20-037.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 112
 
2. RESULTADOS  
Regista-se a temperatura de ensaio, a pressão atmosférica, a quanti ­
dade de amostra utilizada e o intervalo de tempo decorrido até à ocorrência da ignição.
 
3. RELATÓRIO  
O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação se ­
guinte:  
— a especificação exacta da substância (identificação e impurezas),  
— a quantidade de amostra utilizada,  
— a pressão atmosférica,  
— o aparelho utilizado,  
— os resultados das medições (temperaturas de ensaio, resultados 
relativos à ignição, correspondentes intervalos de tempo),  
— todas as observações adicionais relevantes para a interpretação 
dos resultados.  
4. REFERÊNCIAS  
Nenhuma.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 113
 
A.16.  TEMPERATURA DE AUTO-1GNIÇÃO RELATIVA PARA OS 
SÓLIDOS  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
As substâncias explosivas e as substâncias que se inflamam espon ­
taneamente em contacto com o ar à temperatura ambiente não deve ­
rão ser submetidas a este ensaio.  
O objectivo deste ensaio consiste em proporcionar informação pre ­
liminar sobre a auto-inflamabilidade de substâncias sólidas a tempe ­
raturas elevadas.  
Se o calor desenvolvido por reacção da substância com oxigénio ou 
por decomposição exotérmica não for perdido para o meio envol ­
vente com rapidez suficiente, ocorre o fenómeno de auto-aqueci ­
mento que conduz à auto-ignição. Em consequência, a auto-ignição ocorre sempre que a razão de produção de calor excede a razão da 
perda de calor.
 
O procedimento de ensaio é útil como pesquisa preliminar para as 
substâncias sólidas. Dada a natureza complexa da ignição e da com ­
bustão de sólidos, a temperatura de auto-ignição determinada de acordo com este método apenas deverá ser utilizada para efeitos de comparação.
 
1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES  
A temperatura de auto-ignição obtida por este método é a tempera ­
tura ambiente mínima expressa em  o C à qual se inflamará um deter ­
minado volume de substância sob condições definidas.  
1.3. SUBSTÂNCIA DE REFERÊNCIA  
Nenhuma.  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO  
Coloca-se num forno, à temperatura ambiente, um determinado vo ­
lume de substância a ensaiar; traça-se uma curva temperatura/tempo 
relativa às condições no centro da amostra, aumentando-se a tempe ­
ratura do forno até 400  o C ou até ao ponto de fusão da substância se 
for menor, à razão de 0,5  o C/minuto. Para os objectivos deste ensaio, 
a temperatura do forno para a qual a temperatura da amostra é de 
400  o C por auto-aquecimento é designada por temperatura de auto- 
-ignição.  
1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
Nenhum.  
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
1.6.1.  Aparelho  
1.6.1.1.  Forno  
Utiliza-se um forno de laboratório de temperatura programada (com 
o volume aproximado de dois litros) equipado com sistema de cir ­
culação de ar natural e com sistema para aliviar os efeitos da ex ­
plosão. No sentido de se evitar um potencial risco de explosão, não 
se deverá permitir que quaisquer gases de decomposição estabeleçam 
contacto com os componentes eléctricos do sistema de aquecimento.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 114
 
1.6.1.2.  Cubo de rede de arame  
De acordo com o diagrama da figura 1 prepara-se uma peça de rede 
de arame de aço inoxidável com aberturas de 0,045 mm. A rede deverá ser dobrada e presa com arame no interior de cubos abertos 
por cima.
 
1.6.1.3.  Termopares  
Termopares adequados.  
1.6.1.4.  Registador  
Utiliza-se qualquer registador de dois canais calibrado de 0 a 600  o C 
ou calibrado para a tensão correspondente.  
1.6.2.  Condições de ensaio  
As substâncias são ensaiadas tal qual são recebidas.  
1.6.3.  Realização do ensaio  
Enche-se o cubo com a substância de ensaio e bate-se suavemente 
adicionando-se mais substância até o cubo estar completamente cheio. Depois suspende-se o cubo no centro do forno, à temperatura 
ambiente. Coloca-se um termopar no centro do cubo e coloca-se 
outro entre o cubo e a parede do forno para registar a temperatura deste.
 
As temperaturas do forno e da amostra são registadas continuamente 
ao mesmo tempo que a temperatura do forno aumenta até 400  o C ou 
até ao ponto de fusão da substância, se for inferior, à razão de 0,5
 o C/minuto.  
Ao ocorrer a ignição da substância o termopar da amostra indicará 
uma subida muito rápida da temperatura, superior à temperatura do 
forno.  
2. RESULTADOS  
A temperatura do forno à qual a temperatura da amostra atinge 
400  o C por auto-aquecimento é relevante para a avaliação (ver 
figura 2).  
3. RELATÓRIO  
O relatório do ensaio deverá, se possível, conter a informação se ­
guinte:  
— uma descrição da substância a ensaiar,  
— os resultados da medição, incluindo a curva temperatura/tempo,  
— todas as observações adicionais relevantes para a interpretação 
dos resultados.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) NF T 20-036 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the relative temperature of the spontaneous flam ­
mability of solids.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 115
 
Figura 1  
Planificação do cubo de ensaio com 20 mm de aresta
  
Figura 2  
Curva típica de temperatura/tempo
  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 116
 
A.17.  PROPRIEDADES OXIDANTES (SÓLIDOS)  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
É útil possuir informações preliminares sobre quaisquer potenciais 
propriedades explosivas da substância antes de se efectuar este en ­
saio. 
Este ensaio não é aplicável a líquidos, gases, substâncias explosivas 
ou altamente inflamáveis ou peróxidos orgânicos.  
Não é necessário efectuar este ensaio no caso de o exame da fórmula 
estrutural determinar, para além de qualquer dúvida razoável, que a 
substância é incapaz de reagir exotermicamente com um material combustível.
 
No sentido de se determinar se o ensaio deve ser efectuado com 
precauções especiais, dever-se-á efectuar um ensaio preliminar.  
1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES  
Tempo de combustão: é o tempo de reacção, em segundos, neces ­
sário para a zona de reacção se deslocar ao longo de uma pilha utilizando o procedimento descrito em 1.6.
 
Velocidade de combustão: expressa em milímetros por segundo.  
Velocidade máxima de combustão: é o valor máximo das velocida ­
des de combustão obtidas com misturas contendo entre 10 % e 90 % 
em peso do oxidante.  
1.3. SUBSTÂNCIA DE REFERÊNCIA  
Utiliza-se o nitrato de bário (qualidade analítica) como substância de 
referência para o ensaio e para o ensaio preliminar.  
A mistura de referência é uma mistura de nitrato de bário com pó de 
celulose preparada de acordo com 1.6., que possui a velocidade 
máxima de combustão (normalmente é uma mistura contendo nitrato 
de bário na proporção de 60 % em peso).  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO  
Por razões de segurança, efectua-se um ensaio preliminar. Não é 
necessário mais nenhum ensaio no caso de se verificar claramente no ensaio preliminar que a substância de ensaio possui propriedades 
oxidantes. Se não for esse o caso, a substância deverá ser então 
submetida ao ensaio completo.
 
No ensaio completo mistura-se, segundo proporções variáveis, a 
substância que se pretende ensaiar e uma substância combustível previamente definida. Depois forma-se uma pilha com cada mistura 
e procede-se à ignição dessa pilha numa das suas extremidades. A 
velocidade máxima de combustão determinada é então comparada com a velocidade máxima de combustão da mistura de referência.
 
1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
Se necessário, é válido qualquer método de trituração e de mistura 
desde que a diferença entre as velocidades máximas de combustão 
em seis ensaios separados não se afastem do valor correspondente à 
média aritmética em mais do que 10 %.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 117
 
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
1.6.1.  Preparação  
1.6.1.1.  Substância de ensaio  
Reduz-se a amostra de ensaio a partículas com dimensões < 
0,125 mm utilizando o procedimento seguinte: peneira-se a substân ­
cia de ensaio, tritura-se a parte restante e repete-se o procedimento até toda a substância de ensaio passar pelo peneiro.
 
Pode-se utilizar qualquer método de trituração e de crivagem que 
satisfaçam os critérios qualitativos.  
Antes da preparação da mistura seca-se a substância à temperatura de 
105  o C, até se obter um peso constante. No caso de a temperatura de 
decomposição da substância de ensaio ser inferior a 105  o C, torna-se 
necessário secar a substância a uma temperatura inferior adequada.  
1.6.1.2.  Substância combustível  
Utiliza-se pó de celulose como substância combustível. A celulose 
deverá ser do tipo utilizado para a cromatografia de camada fina ou para a cromatografia em coluna. Verificou-se que é adequada a 
celulose em que 85 % das fibras possui um comprimento compreen ­
dido entre 0,020 e 0,075 mm. Faz-se passar o pó de celulose através de um peneiro de malha de 0,125 mm. Em todo o ensaio deve-se utilizar o mesmo lote de celulose.
 
Antes de se preparar a mistura efectua-se a secagem do pó de celu ­
lose à temperatura de 105  o C até se obter um peso constante.  
No caso de se utilizar serradura no ensaio preliminar faz-se a pre ­
paração dessa serradura de madeira macia recolhendo a porção que passa através de um peneiro de malha de 1,6 mm, mistura-se muito bem e depois seca-se à temperatura de 105
 o C durante 4 horas numa 
camada com espessura inferior a 25 mm. Arrefece-se e armazena-se 
num recipiente estanque ao ar, tão cheio quanto for possível, de preferência ao fim de 24 horas de secagem.
 
1.6.1.3.  Fonte de ignição  
Como fonte de ignição deve utilizar-se uma chama de um queimador 
de gás (com diâmetro mínimo de 5mm). No caso de se utilizar outra fonte de ignição (por exemplo, quando se efectua o ensaio em at ­
mosfera inerte), deverá constar do relatório uma descrição e a justi ­
ficação.
 
1.6.2.  Realização do ensaio  
Nota:  
As misturas de oxidantes com celulose ou com serradura devem ser 
tratadas como potencialmente explosivas e manuseadas com as de ­
vidas precauções.  
1.6.2.1.  Ensaio preliminar  
Mistura-se muito bem a substância seca com a celulose ou com a 
serradura seca na proporção em peso de duas partes da substância de 
ensaio para uma parte de celulose ou de serradura e com essa mis ­
tura prepara-se uma pequena pilha com a configuração de um cone com as dimensões de 3,5 cm (diâmetro da base) × 2,5 cm (altura) 
enchendo, sem bater, uma forma com a configuração do cone (por 
exemplo, um funil de vidro de laboratório com o bico tapado).
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 118
 
Coloca-se essa pilha sobre uma placa fria, não combustível, não 
porosa e de fraca condutividade térmica. O ensaio deve ser efectuado 
num aparador com exaustão de fumos tal como em 1.6.2.2.  
Coloca-se a fonte de ignição em contacto com o cone. Observa-se e 
regista-se o vigor e a duração da reacção resultante.  
Considera-se que a substância é um oxidante se a reacção for vigo ­
rosa.  
Em qualquer caso em que o resultado suscite dúvidas é necessário 
completar depois a sequência de ensaio adiante descrita.  
1.6.2.2.  Sequência de ensaio  
Procede-se à preparação de misturas oxidante/celulose contendo oxi ­
dante em proporções compreendidas entre 10 % e 90 % em peso, por acrescimentos sucessivos de 10 %. Nos casos limite, deve utilizar-se 
misturas intermédias de oxidante/celulose para se obter com maior 
precisão a velocidade máxima de combustão.
 
A configuração da pilha é conseguida por meio de um molde. Esse 
molde é feito de metal, tem um comprimento de 250 mm e uma secção recta transversal com uma altura interior de 10 mm e com uma largura interior de 20 mm. De ambos os lados do molde, 
segundo a direcção longitudinal, faz-se a montagem de duas placas 
metálicas que constituem limitações laterais que ultrapassam 2 mm a aresta superior da secção recta triangular (ver figura). Enche-se li ­
vremente este dispositivo com um ligeiro excesso de mistura. Depois 
de se deixar cair o molde uma vez, de uma altura de 2 cm sobre uma 
superfície sólida, remove-se a substância em excesso remanescente com uma folha colocada em posição oblíqua, procede-se à remoção das limitações laterais e alisa-se o pó restante utilizando um cilindro. 
Depois coloca-se sobre o molde uma placa não combustível, não 
porosa e de fraca condutibilidade térmica, inverte-se o aparelho e remove-se o molde.
 
Coloca-se a placa sob o exaustor de um aparador com exaustão de 
fumos.  
A velocidade do ar deverá ser suficiente para evitar que os fumos 
escapem para o interior do laboratório e não deverá variar durante o ensaio. Em torno do aparelho deverá instalar-se uma blindagem au ­
xiliar da exaustão.
 
Devido às propriedades higroscópicas da celulose e de algumas subs ­
tâncias que se pretendem ensaiar o teste deverá ser efectuado tão rapidamente quanto possível.
 
Inflama-se uma extremidade da pilha por contacto com a chama.  
Mede-se o tempo de reacção para uma distância de 200 mm após a 
zona de reacção se ter propagado, segundo uma distância inicial de 30 mm.
 
Efectua-se o ensaio com a substância de referência e pelo menos 
com cada uma das misturas de substância de ensaio com celulose, no intervalo definido.
 
No caso de se verificar que a velocidade máxima de combustão é 
significativamente superior à da mistura de referência, pode-se inter ­
romper o ensaio; caso contrário, deve-se repetir o ensaio cinco vezes 
para cada uma das três misturas que proporcionam a velocidade de 
combustão mais rápida.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 119
 
No caso de se suspeitar que o resultado é falsamente positivo, deve- 
-se repetir o ensaio utilizando uma substância inerte com partículas de 
dimensões idênticas, tal como a diatomite, em vez de celulose. Em alternativa deve-se ensaiar novamente a mistura de substância de ensaio/celulose que possui a velocidade de combustão mais rápida 
em atmosfera inerte (teor em oxigénio < 2 % v/v).
 
2. RESULTADOS  
Por razões de segurança deve-se considerar a velocidade máxima de 
combustão — em vez do valor médio — como sendo a propriedade oxidante característica da substância de ensaio.
 
Para a avaliação é relevante o valor máximo da velocidade de com ­
bustão obtido numa série de seis ensaios para uma determinada 
mistura.  
Traça-se um gráfico do valor máximo da velocidade de combustão 
para cada mistura em função da concentração do oxidante. A partir 
de gráfico conclui-se sobre a velocidade máxima de combustão.  
Os seis valores de velocidade de combustão medidos numa expe ­
riência efectuada com a mistura de máxima velocidade de combustão não devem diferir do valor da média aritmética em mais do que 
10 %; caso contrário, devem aperfeiçoar-se os métodos de trituração 
e de mistura.
 
A velocidade máxima de combustão obtida é comparada com a 
velocidade máxima de combustão da mistura de referência (ver 1.3.).  
Se os ensaios forem efectuados em atmosfera inerte, compara-se a 
velocidade máxima de reacção com a que se obtém com a mistura de referência em atmosfera inerte.
 
3. RELATÓRIO  
3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação se ­
guinte:  
— identidade, composição, pureza, teor em humidade, etc., da subs ­
tância ensaiada,  
— qualquer tratamento da substância de ensaio (por exemplo, tritu ­
ração, secagem, etc.),  
— a fonte de ignição utilizada nos ensaios,  
— os resultados das medições,  
— o modo de reacção (por exemplo, combustão com chama à su ­
perfície, combustão através de toda a massa, qualquer informação 
relativa aos produtos de combustão, etc.),  
— todas as observações adicionais relevantes para a interpretação 
dos resultados, incluindo uma descrição do vigor (chamas, faís ­
cas, fumos, combustão lenta, etc.) e duração aproximada obser ­
vados no ensaio preliminar sobre segurança/pesquisa, tanto para a substância de ensaio como para a substância de referência,
 
— os resultados dos ensaios com uma substância inerte, se existi ­
rem, 
— os resultados dos ensaios em atmosfera inerte, se existirem.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 120
 
3.2. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS  
Considera-se que uma substância é um oxidante nos casos em que:  
a) No ensaio preliminar se observa uma reacção vigorosa;  
b) No ensaio completo, a velocidade máxima de combustão das 
misturas ensaiadas é superior ou igual à velocidade máxima de 
combustão da mistura de referência constituída por celulose e 
nitrato de bário.  
No sentido de se evitar um resultado positivo falso, os resultados 
obtidos ao fazer-se o ensaio da substância misturada com um mate ­
rial inerte e/ou ao fazer-se o ensaio sob atmosfera inerte deverão ser 
considerados também ao fazer-se a interpretação dos resultados.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) NF T 20-035 (Sept. 85). Chemical products for industrial use. 
Determination of the oxidizing properties of solids.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 121
 
Apêndice  
Figura  
Molde e acessórios para a preparação da pilha  
(Todas as dimensões estão em milímetros)
  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 122
 
A.18.  MASSA MOLECULAR MÉDIA EM FUNÇÃO DO NÚMERO 
DE MOLES E DISTRIBUIÇÃO DA MASSA MOLECULAR 
EM POLÍMEROS  
1. MÉTODO  
O presente método, que utiliza a cromatografia de permeação em gel 
(GPC), é idêntico ao método OCDE TG 118 (1996). Os respectivos fundamentos e outras informações técnicas são apresentados na re ­
ferência (1).
 
1.1. INTRODUÇÃO  
Tendo em conta a diversidade das propriedades dos biopolímeros, 
torna-se impossível descrever um único método que estabeleça de modo preciso as condições de separação e avaliação dos mesmos, 
abrangendo todas as possibilidades e especificidades. Muitos siste ­
mas poliméricos complexos, nomeadamente, não são analisáveis por cromatografia de permeação em gel. Nos casos em que o recurso a esta técnica não se afigure viável, a massa molecular pode ser de ­
terminada através de outros métodos (ver apêndice), devendo docu ­
mentar-se e justificar-se a opção utilizada.
 
O método descrito baseia-se na norma DIN 55672 (1); esta última 
contém informações pormenorizadas sobre o modo de execução do 
ensaio e a avaliação dos respectivos resultados. Caso seja necessário alterar determinadas condições do processo experimental, deve apre ­
sentar-se a devida justificação. Podem utilizar-se outras normas, na 
condição de apresentar as respectivas referências. O método descrito 
utiliza, para fins de calibração, amostras de poliestireno de polidis ­
persibilidade conhecida, podendo ser necessário efectuar alterações de modo a torná-lo adequado a determinados polímeros, nomeada ­
mente polímeros hidrossolúveis e polímeros reticulados de cadeia 
longa.
 
1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES  
A massa molecular média em função do número de moles, M  n , e a 
massa molecular média relativa à massa das espécies, M  w , são de­
terminadas por recurso às equações: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i Ü M i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
em que:  
H i é a intensidade do sinal do detector correspondente ao volume de 
retenção V  i , contado a partir da linha de base,  
M i é a massa molecular da fracção do polímero correspondente ao 
volume de retenção V  i e 
n é o número de pontos obtidos experimentalmente.  
A amplitude da distribuição de massas moleculares, que constitui 
uma medida da dispersibilidade do sistema, é dada pelo quociente 
M w /M n ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 123
 
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Uma vez que a cromatografia de permeação em gel constitui um 
método relativo, deve efectuar-se uma calibração. Para tal, podem utilizar-se padrões de poliestireno de cadeia linear, com uma distri ­
buição limitada, e massas moleculares médias (M
 n e M  w ) e distri­
buição de massas moleculares conhecidas. A curva de calibração apenas pode ser utilizada na determinação da massa molecular da amostra desconhecida caso as condições de separação da referida 
amostra e dos padrões tenham sido seleccionadas de modo idêntico.
 
Uma determinada relação entre a massa molecular e o volume de 
eluição apenas é válida nas condições específicas de cada ensaio. 
Estas últimas incluem, nomeadamente, a temperatura, o tipo de sol ­
vente (ou mistura de solventes), as condições cromatográficas e a coluna ou sistema de colunas de separação.
 
As massas moleculares da amostra determinadas pelo método em 
causa constituem valores relativos, sendo designadas «massas mole ­
culares em equivalentes de poliestireno». Tal facto significa que as massas moleculares podem apresentar desvios relativamente aos va ­
lores absolutos em função das diferenças estruturais e químicas entre 
a amostra e os padrões. Caso se utilizem outros padrões, nomeada ­
mente polietilenoglicol, óxido de polietileno, metracrilato de polime ­
tilo ou ácido poliacrílico, devem justificar-se os motivos.
 
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
A determinação da distribuição das massas moleculares, bem como 
das massas moleculares médias da amostra (M  n , M  w ), pode fazer-se 
por recurso à cromatografia de permeação em gel, que consiste numa variante da cromatografia líquida em que a amostra é separada em função dos volumes hidrodinâmicos dos diversos componentes (2).
 
A separação é efectuada por passagem através de uma coluna cujo 
enchimento consiste num material poroso, de modo geral um gel orgânico. As moléculas de dimensões mais reduzidas passam através dos poros, sendo as restantes excluídas. A fixação das moléculas de 
maiores dimensões é, pois, menor, sendo eluídas em primeiro lugar. 
As moléculas de dimensões médias passam através de alguns poros, sendo eluídas numa fase posterior. Finalmente, as moléculas de di ­
mensões mais reduzidas, que possuem um raio hidrodinâmico infe ­
rior ao dos poros do gel, penetram estes últimos, sendo eluídas em 
último lugar.
 
Em condições ideais, a separação é determinada apenas pelas dimen ­
sões das moléculas, embora, na prática, seja difícil evitar algumas 
interferências devidas à adsorção. A não uniformidade do enchi ­
mento e a existência de volumes mortos poderão induzir problemas complementares (2).
 
A detecção pode ser efectuada com base no índice de refracção ou 
por absorção no ultravioleta, originando uma curva de distribuição 
simples. Todavia, de modo a atribuir valores de massa molecular aos vários pontos da curva, é necessário efectuar uma calibração por recurso a polímeros de massa molecular conhecida e, se possível, 
de estrutura similar, nomeadamente padrões de poliestireno. A curva 
resultante da representação gráfica da quantidade, em massa, das diversas espécies eluídas em função do logaritmo da massa molecu ­
lar deve exibir uma distribuição de Gauss, por vezes distorcida por 
uma ligeira assimetria na região das massas moleculares mais redu ­
zidas.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 124
 
1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
A repetibilidade (desvio-padrão relativo) do volume de eluição deve 
ser superior a 0,3 %. Se um cromatograma elaborado em função do tempo não corresponder aos critérios  supra , deve assegurar-se a 
necessária repetibilidade da análise mediante correcção por recurso 
a um padrão interno (1). As polidispersões dependem da massa molecular de cada padrão. No caso da utilização de padrões de poliestireno, os valores característicos são os seguintes: 
M
 p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 ≤ M p ≤ 10 6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20  
em que M  p representa a massa molecular do padrão correspondente 
ao máximo do pico.  
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.6.1.  Preparação das soluções-padrão de poliestireno  
Os padrões de poliestireno são dissolvidos, com agitação, no eluente 
escolhido. Na preparação das soluções devem ter-se em conta as 
recomendações do fabricante.  
As concentrações dos padrões dependem de vários factores, nomea ­
damente o volume de injecção, a viscosidade da solução e a sensi ­
bilidade do detector. Deve adaptar-se o volume de injecção máximo ao comprimento da coluna, de modo a evitar uma sobrecarga. Os volumes de injecção característicos de separações analíticas por cro ­
matografia de permeação em gel com uma coluna de 30 cm × 
7,8 mm situam-se, de modo geral, entre 40 e 100 μl. É possível 
injectar volumes superiores, que não devem, contudo, exceder 250 μl. Antes de calibrar a coluna, deve determinar-se o rácio adequado 
volume de injecção/concentração.
 
1.6.2.  Preparação da solução de amostra  
De modo geral, as condições atrás referidas são também aplicáveis à 
preparação das soluções de amostra. Esta última é dissolvida num 
solvente adequado, nomeadamente tetra-hidrofurano (THF), sob agi ­
tação cuidadosa. Em caso algum deverá utilizar-se um banho de ultra-sons. Se necessário, a solução de amostra pode ser purificada por passagem através de um filtro de membrana, cujos poros deverão 
ter dimensões compreendidas entre 0,2 e 2 μm.
 
Deve referir-se no relatório final a eventual presença de partículas 
não dissolvidas, que poderão conter espécies de massa molecular 
superior. Deve utilizar-se um método adequado para determinar a percentagem ponderal das partículas em causa. As soluções devem ser utilizadas nas 24 horas subsequentes à sua preparação.
 
1.6.3.  Equipamento  
— Reservatório de solvente,  
— desgaseificador (se adequado),  
— bomba,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 125
 
— amortecedor de pulsações (se adequado),  
— sistema de injecção,  
— colunas cromatográficas,  
— detector,  
— medidor de caudal (se adequado),  
— sistema de registo e processamento de dados,  
— recipiente para resíduos.  
Deve assegurar-se o carácter inerte do sistema cromatográfico em 
relação aos solventes utilizados (nomeadamente no caso da utilização de capilares de aço com THF).
 
1.6.4.  Sistema de injecção e de aporte de solvente  
Introduz-se na coluna um determinado volume de solução de amos ­
tra, manualmente ou por intermédio de um amostrador automático, 
numa zona bem definida. No caso da introdução manual, a com ­
pressão do êmbolo ou a retirada da seringa demasiado rápidas po ­
derão determinar alterações na distribuição de massas moleculares obtida. O sistema de aporte de solvente deve ser uniforme, recorren ­
do, se possível, a um amortecedor de pulsações. O caudal deve ser 
da ordem de 1 ml/min.
 
1.6.5.  Coluna  
Em função do tipo de amostra, os polímeros são analisados por 
recurso a uma única coluna ou a diversas colunas ligadas em série. Encontram-se disponíveis nos circuitos comerciais colunas de mate ­
riais porosos com propriedades (por exemplo, dimensões dos poros, 
limites de exclusão) bem definidas. A selecção do gel a utilizar, bem como do comprimento da coluna, depende das propriedades da amostra (volumes hidrodinâmicos, distribuição das massas molecula ­
res) e das condições específicas de separação, nomeadamente o tipo 
de solvente utilizado, a temperatura e o caudal (l) (2) (3).
 
1.6.6.  Pratos teóricos  
Deve caracterizar-se a coluna ou sistema de colunas a utilizar na 
separação pelo respectivo número de pratos teóricos. No caso da 
utilização de THF como solvente de eluição, introduzir uma solução 
de etilbenzeno ou outro soluto apolar adequado numa coluna de comprimento conhecido. O número de pratos teóricos é dado pela equação: 
N ¼ 5; 54
 Í 
V e 
W 1=2 Î 2 
ou N ¼ 16 V e 
W Í Î  2 
em que:  
N = representa o número de pratos teóricos,  
V e = representa o volume de eluição correspondente ao máximo 
do pico,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 126
 
W = representa a largura da base do pico,  
W 1/2 = representa a largura do pico a meia altura.  
1.6.7.  Eficiência de separação  
Além do número de pratos teóricos, que determina a largura das 
bandas, a eficiência de separação, obtida a partir do declive da curva de calibração, desempenha também um papel importante. A eficiên ­
cia de separação de uma coluna é dada por:
 
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
secção transversal da coluna ≥ 6; 0 " 
cm 3 
cm 2 # 
em que:  
V e, M x = representa o volume de eluição de uma fracção de 
poliestireno com massa molecular  M x e 
V e,(10M xx) = representa o volume de eluição de uma fracção de 
poliestireno com massa molecular dez vezes superior.  
A resolução do sistema é geralmente definida do seguinte modo:  
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
em que:  
V e1 , V e2 = representam os volumes de eluição dos dois padrões 
de poliestireno, correspondentes ao máximo dos pi ­
cos, 
W 1 , W  2 = representam a largura da base dos picos, e  
M 1 , M  2 = representam as massas moleculares correspondentes 
aos máximos dos picos, devendo diferir num factor de 10.
 
O valor R do sistema de colunas deve ser superior a 1,7 (4).  
1.6.8.  Solventes  
Todos os solventes devem possuir um elevado grau de pureza (no 
caso do THF, o grau de pureza deve ser de 99,5 %). As dimensões 
do reservatório de solvente (que pode, se necessário, encontrar-se sob atmosfera inerte) devem ser suficientes para permitir a calibração da coluna e a realização de diversas análises. O solvente deve ser 
desgaseificado antes da sua introdução na coluna por intermédio da 
bomba.
 
1.6.9.  Controlo da temperatura  
A temperatura dos componentes críticos internos (septo de injecção, 
colunas, detector, tubagens) deve ser constante e adequada ao sol ­
vente escolhido.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 127
 
1.6.10.  Detector  
A função do detector consiste no registo quantitativo da concentra ­
ção da amostra eluída da coluna. De modo a evitar o alargamento dos picos, o volume da célula de detecção deve ser tão reduzido 
quanto possível, não devendo exceder 10 μl, excepto no caso dos 
detectores de difusão de radiações e de viscosidade. O método de detecção mais corrente consiste na refractometria diferencial. Toda ­
via, se as propriedades específicas da amostra ou do solvente de 
eluição o justificarem, podem utilizar-se outros tipos de detectores, 
nomeadamente de radiação ultravioleta/visível, infravermelha e de ­
tectores de viscosidade.
 
2. RESULTADOS E SUA APRESENTAÇÃO  
2.1. RESULTADOS  
Para pormenores sobre os critérios de avaliação, bem como no que 
respeita às exigências em matéria de recolha e processamento de 
dados, deve consultar-se a norma DIN relevante (1).  
Devem efectuar-se duas análises independentes e individuais de cada 
amostra.  
Em cada análise, devem determinar-se os parâmetros M  n , M  w , M  w /­
M n e M  p . Deve indicar-se explicitamente que os valores determina ­
dos constituem valores relativos equivalentes à massa molecular do padrão utilizado.
 
Após a determinação dos volumes de retenção ou tempos de reten ­
ção (eventualmente corrigidos por recurso a um padrão interno), representa-se graficamente o logaritmo de M
 p (valor correspondente 
ao máximo do pico relativo ao padrão de calibração) em função de 
um dos parâmetros referidos. São necessários pelo menos dois pon ­
tos de calibração por década de massas moleculares e pelo menos cinco pontos para a curva total, que deve abranger a massa molecular 
estimada da amostra. A extremidade da curva de calibração corres ­
pondente às massas moleculares mais reduzidas é definida pelo n- -hexilbenzeno ou outro solvente apolar adequado. As massas mole ­
culares relativas ao número de moles e à massa das espécies são, em 
geral, obtidas por processamento electrónico dos dados, com base 
nas fórmulas que se apresentam no ponto 1.2. Caso se recorra ao tratamento manual dos mesmos, pode consultar-se a norma ASTM D 3536-91 (3).
 
Deve apresentar-se a distribuição na forma de quadro ou de gráfico 
(percentagem da soma ou do diferencial da frequência em função de 
log M). Na representação gráfica, uma década de massas moleculares 
deve corresponder a cerca de 4 cm, devendo a altura máxima dos picos ser de cerca de 8 cm. No caso de curvas de distribuição integral, a diferença entre 0 e 100 % deve corresponder a cerca de 
10 cm.
 
2.2. RELATÓRIO  
O relatório do ensaio deve incluir as seguintes informações:  
2.2.1.  Substância em estudo  
— Dados disponíveis sobre a substância em estudo (identidade, 
aditivos, impurezas),  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 128
 
— descrição do tratamento da amostra, observações, problemas sur ­
gidos.  
2.2.2.  Equipamento  
— Reservatório de eluente, gás inerte, desgaseificação do eluente, 
composição do eluente, impurezas,  
— bomba, amortecedor de pulsações, sistema de injecção,  
— colunas de separação (fabricante, todas as informações disponí ­
veis sobre as características das colunas, nomeadamente dimen ­
sões dos poros, tipo de material utilizado, número, comprimento e ordem de utilização das colunas),
 
— número de pratos teóricos da coluna ou sistema de colunas; 
eficiência de separação (resolução do sistema),  
— informações relativas à simetria dos picos,  
— temperatura da coluna, tipo de controlo da temperatura utilizado,  
— detector (princípio utilizado, tipo, volume da célula),  
— medidor de caudal, se utilizado (fabricante, princípio utilizado),  
— sistema de registo e processamento dos dados (equipamento e 
suporte lógico).  
2.2.3.  Calibração do sistema  
— Descrição pormenorizada do método utilizado para obter a curva 
de calibração,  
— informações relativas aos critérios de qualidade aplicáveis ao 
método (por exemplo, coeficiente de correlação, erro quadrático médio, etc.),
 
— informações relativas às extrapolações, hipóteses e aproximações 
efectuadas no decurso do processo experimental, bem como da avaliação e processamento dos dados,
 
— devem apresentar-se na forma de quadro os dados utilizados para 
a obtenção da curva de calibração, incluindo, para cada ponto de 
calibração, as seguintes informações:  
— nome da amostra,  
— fabricante da amostra,  
— valores de M  p , M  n , M  w , M  w /M n característicos dos padrões, 
fornecidos pelo fabricante ou obtidos em determinações pos ­
teriores, bem como pormenores sobre o método de determi ­
nação utilizado,  
— volume de injecção e concentração da substância injectada,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 129
 
— valor de M  p utilizado para a calibração,  
— volume de eluição ou tempo de retenção corrigido correspon ­
dentes ao máximo dos picos,  
— valores de M  p correspondentes ao máximo dos picos,  
— percentagem de erro dos valores de M  p calculados e do valor 
de calibração.  
2.2.4.  Avaliação  
— Avaliação com base no tempo: métodos utilizados para assegurar 
a reprodutibilidade requerida (método de correcção, padrão inter ­
no, etc.),  
— informações que indiquem se a avaliação foi efectuada com base 
no volume de eluição ou no tempo de retenção,  
— informações sobre os limites de avaliação, caso um pico não seja 
totalmente analisado,  
— descrição dos eventuais métodos de nivelamento de dados utili ­
zados,  
— processos de preparação e tratamento prévio da amostra,  
— eventual presença de partículas não dissolvidas,  
— volume de injecção (expresso em μl) e concentração de injecção 
(expressa em mg/ml),  
— observações que indiquem efeitos susceptíveis de induzir desvios 
relativamente às condições cromatográficas ideais,  
— descrição pormenorizada das alterações aos procedimentos de 
ensaio,  
— pormenores relativos às margens de erro,  
— quaisquer outras informações e observações que possuam impor ­
tância para a interpretação dos resultados.  
3. REFERÊNCIAS  
(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit 
Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.  
(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.  
(3) ASTM D 3536-91 (1991). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography- 
-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelp ­
hia, Pennsylvania.
 
(4) ASTM D 5296-92 (1992). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polys ­
tyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. 
American Society for Testing and Materials, Philadelphia, 
Pennsylvania.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 130
 
Apêndice  
Exemplos de outros métodos de determinação da massa molecular média em 
função do número de moles (M  n ) em polímeros  
A cromatografia de permeação em gel constitui o método mais indicado para a 
determinação de M  n , em especial sempre que se encontre disponível uma série de 
padrões com estrutura idêntica à do polímero a analisar. Todavia, nos casos em 
que o recurso àquela técnica apresente dificuldades práticas ou em que se preveja que a substância em causa não satisfaz um critério regulamentar em matéria de M
 n , sendo necessário confirmar tal facto podem aplicar-se métodos alternativos, 
nomeadamente:  
1. Utilização das propriedades coligativas  
1.1. Ebulioscopia/crioscopia : 
estas técnicas baseiam-se, respectivamente, na determinação do au ­
mento do ponto de ebulição e do abaixamento do ponto de conge ­
lação de um solvente induzidos pela adição do polímero. O princípio 
do método consiste no facto de os efeitos do polímero dissolvido no 
ponto de ebulição ou de congelação do solvente dependerem da massa molecular do polímero (1) (2).
 
Aplicabilidade: M  n < 20 000  
1.2. Abaixamento da pressão de vapor : 
esta técnica baseia-se na medição da pressão de vapor de um líquido 
de referência antes e após a adição de determinadas quantidades do polímero (1) (2).
 
Aplicabilidade: M  n < 20 000 (em teoria; na prática, o valor é limi ­
tado).  
1.3. Osmometria de membrana:  
esta técnica baseia-se no princípio da osmose, isto é, da tendência 
natural das moléculas de solvente de passarem, através de uma mem ­
brana semipermeável, de uma solução diluída para uma solução concentrada, até atingir o equilíbrio. No ensaio em causa, a concen ­
tração da solução diluída é nula, enquanto que a solução concentrada 
contém o polímero. A passagem do solvente através da membrana determina uma diferença de pressão dependente da concentração e da massa molecular do polímero (1) (3) (4).
 
Aplicabilidade: valores de M  n compreendidos entre 20 000 e 
200 000.  
1.4. Osmometria de fase de vapor : 
esta técnica baseia-se na comparação da velocidade de evaporação de 
um aerossol de solvente puro com a velocidade de evaporação de, no 
mínimo, três aerossóis que contêm o polímero em concentrações diversas (1) (5) (6).
 
Aplicabilidade: M  n < 20 000  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 131
 
2. Análise dos grupos terminais  
A utilização deste método implica o conhecimento simultâneo da 
estrutura global do polímero e da natureza dos grupos terminais, distinguíveis da cadeia principal por recurso a técnicas tais como a ressonância magnética nuclear, a titulação ou a formação de deriva ­
dos. Com base na determinação da concentração molecular dos gru ­
pos terminais presentes no polímero, pode obter-se a respectiva massa molecular (7) (8) (9).
 
Aplicabilidade: M  n não superior a 50 000 (com fiabilidade decres ­
cente).  
3. Referências  
(1) Billmeyer, F.W. Jr., (1984). Textbook of Polymeer Science, 
3rd ed., John Wiley, New York.  
(2) Glover, CA., (1975), Absolute Colligative Property Methods. 
Chapter 4 In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E., Slade, 
Jr. ed., Marcel Dekker, New York.  
(3) ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination 
of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Mem ­
brane Osmometry. American Society for Testing and Materials, 
Philadelphia, Pennsylvania.  
(4) Coll, H. (1989), Membrane Osmometry. In: Determination of 
Molecular Weight, A.R. Cooper e., J. Wiley and Sons, p. 25- -52.
 
(5) ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for 
Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, Ame ­
rican Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsyl ­
vania.  
(6) Morris, C.E.M., (1989). Vapour Pressure Osmometry. In: De ­
termination of Molecular Weight, A.R. Cooper ed., John Wiley 
and Sons.  
(7) Schröder, E. Muller, G., and Arndt, K-F, (1989). Polymer 
Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich.  
(8) Garmon, R.G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 
3. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P.E. Slade, Jr. ed. 
Marcel Dekker, New York.  
(9) Amiya, S.,  et al.  (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 
2139-2146.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 132
 
A.19.  TEOR EM POLÍMEROS DE BAIXA MASSA MOLECULAR  
1. MÉTODO  
O presente método, que utiliza a cromatografia de permeação em gel, 
é idêntico ao método OCDE TG 119 (1996). Os respectivos funda ­
mentos e outras informações técnicas são apresentados nas referên ­
cias. 
1.1. INTRODUÇÃO  
Tendo em conta a diversidade das propriedades dos biopolímeros, 
torna-se impossível descrever um único método que estabeleça de 
modo preciso as condições de separação e avaliação dos mesmos, 
abrangendo todas as possibilidades e especificidades. Muitos siste ­
mas poliméricos complexos, nomeadamente, não são analisáveis por cromatografia de permeação em gel (GPC). Nos casos em que o 
recurso a esta técnica não se afigure viável, a massa molecular 
pode ser determinada através de outros métodos (ver apêndice), de ­
vendo documentar-se e justificar-se a opção utilizada.
 
O método descrito baseia-se na norma DIN 55672 (1); esta última 
contém informações pormenorizadas sobre o modo de execução do 
ensaio e a avaliação dos respectivos resultados. Caso seja necessário alterar determinadas condições do processo experimental, deve apre ­
sentar-se a devida justificação. Podem utilizar-se outras normas, na 
condição de apresentar as respectivas referências. O método descrito 
utiliza, para fins de calibração, amostras de poliestireno de polidis ­
persibilidade conhecida, podendo ser necessário efectuar alterações 
de modo a torná-lo adequado a determinados polímeros, nomeada ­
mente polímeros hidrossolúveis e polímeros reticulados de cadeia longa.
 
1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES  
Por convenção, considera-se baixa uma massa molecular inferior a 
1 000 dalton.  
A massa molecular média em função do número de moles, M  n , e a 
massa molecular média relativa à massa das espécies, M  w , são de­
terminadas por recurso às equações: 
M n ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i 
Σ n 
i ¼ 1 H i=M i M w ¼ Σ n 
i ¼ 1 H i Ü M i 
Σ n 
i ¼ 1 H i 
em que:  
H i = é a intensidade do sinal do detector correspondente ao 
volume de retenção V  j , contado a partir da linha de base,  
M i = é a massa molecular da fracção do polímero correspon ­
dente ao volume de retenção V  i , e n é o número de pontos 
obtidos experimentalmente.  
A amplitude da distribuição de massas moleculares, que constitui 
uma medida da dispersibilidade do sistema, é dada pelo quociente 
M w /M n . ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 133
 
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Uma vez que a cromatografia de permeação em gel constitui um 
método relativo deve efectuar-se uma calibração. Para tal, podem utilizar-se padrões de poliestireno de cadeia linear, com uma distri ­
buição limitada, e massas moleculares médias (M
 n e M  w ) e distri­
buição de massas moleculares conhecidas. A curva de calibração apenas pode ser utilizada na determinação da massa molecular da amostra desconhecida caso as condições de separação da referida 
amostra e dos padrões tenham sido seleccionadas de modo idêntico.
 
Uma determinada relação entre a massa molecular e o volume de 
eluição apenas é válida nas condições específicas de cada ensaio. 
Estas últimas incluem, nomeadamente, a temperatura, o tipo de sol ­
vente (ou mistura de solventes), as condições cromatográficas e a coluna ou sistema de colunas de separação.
 
As massas moleculares da amostra determinadas pelo método em 
causa constituem valores relativos, sendo designadas «massas mole ­
culares em equivalentes de poliestireno». Tal facto significa que as massas moleculares podem apresentar desvios relativamente aos va ­
lores absolutos em função das diferenças estruturais e químicas entre 
a amostra e os padrões. Caso se utilizem outros padrões, nomeada ­
mente polietilenoglicol, óxido de polietileno, metracrilato de polime ­
tilo ou ácido poliacrílico, devem justificar-se os motivos.
 
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
A determinação da distribuição das massas moleculares, bem como 
das massas moleculares médias da amostra (M  n M w ), pode fazer-se 
por recurso à cromatografia de permeação em gel, que consiste numa variante da cromatografia líquida em que a amostra é separada em função dos volumes hidrodinâmicos dos diversos componentes (2).
 
A separação é efectuada por passagem através de uma coluna cujo 
enchimento consiste num material poroso, de modo geral um gel orgânico. As moléculas de dimensões mais reduzidas passam através dos poros, sendo as restantes excluídas. A fixação das moléculas de 
maiores dimensões é, pois, menor, sendo eluídas em primeiro lugar. 
As moléculas de dimensões médias passam através de alguns poros, sendo eluídas numa fase posterior. Finalmente, as moléculas de di ­
mensões mais reduzidas, que possuem um raio hidrodinâmico infe ­
rior ao dos poros do gel, penetram estes últimos, sendo eluídas em 
último lugar.
 
Em condições ideais, a separação é determinada apenas pelas dimen ­
sões das moléculas, embora, na prática, seja difícil evitar algumas 
interferências devidas à absorção. A não uniformidade do enchi ­
mento e a existência de volumes mortos poderão induzir problemas complementares (2).
 
A detecção pode ser efectuada com base no índice de refracção ou 
por absorção no ultravioleta, originando uma curva de distribuição 
simples. Todavia, de modo a atribuir valores de massa molecular aos vários pontos da curva, é necessário efectuar uma calibração por recurso a polímeros de massa molecular conhecida e, se possível, 
de estrutura similar, nomeadamente padrões de poliestireno. A curva 
resultante da representação gráfica da quantidade, expressa em mas ­
sa, das diversas espécies eluídas em função do logaritmo da massa molecular deve exibir uma distribuição de Gauss, por vezes distor ­
cida por uma ligeira assimetria na região das massas moleculares 
mais reduzidas.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 134
 
O teor de espécies de baixa massa molecular é determinado a partir 
da curva. O respectivo cálculo preciso depende da reprodução do 
comportamento do polímero por parte das referidas espécies, por unidade de massa.
 
1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
A repetibilidade (desvio-padrão relativo) do volume de eluição deve 
ser superior a 0,3 %. Se um cromatograma elaborado em função do tempo não corresponder aos critérios  supra  deve assegurar-se a ne ­
cessária repetibilidade da análise mediante correcção por recurso a 
um padrão interno (1). As polidispersões dependem da massa mole ­
cular de cada padrão. No caso da utilização de padrões de poliesti ­
reno, os valores característicos são os seguintes: 
M
 p < 2 000 M  w /M n < 1,20 
2 000 ≤ M p ≤ 10 6 M w /M n < 1,05 
M p > 10  6 M w /M n < 1,20  
(M p representa a massa molecular do padrão correspondente ao má ­
ximo do pico).  
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.6.1.  Preparação das soluções-padrão de poliestireno  
Os padrões de poliestireno são dissolvidos, com agitação, no eluente 
escolhido, tendo em conta as recomendações do fabricante.  
As concentrações dos padrões dependem de vários factores, nomea ­
damente o volume de injecção, a viscosidade da solução e a sensi ­
bilidade do detector. Deve adaptar-se o volume de injecção máximo ao comprimento da coluna, de modo a evitar uma sobrecarga. Os volumes de injecção característicos de separações analíticas por cro ­
matografia de permeação em gel com uma coluna de 30 cm × 
7,8 mm situam-se, de modo geral, entre 40 e 100 μl. É possível 
injectar volumes superiores, que não devem, contudo, exceder 250 μl. Antes de calibrar a coluna, deve determinar-se o rácio adequado 
volume de injecção/concentração.
 
1.6.2.  Preparação da solução de amostra  
De modo geral, as condições atrás referidas são também aplicáveis à 
preparação das soluções de amostra. Esta última é dissolvida num 
solvente adequado, nomeadamente tetra-hidrofurano (THF), sob agi ­
tação cuidadosa. Em caso algum deverá utilizar-se um banho de ultra-sons. Se necessário, a solução de amostra pode ser purificada 
por passagem através de um filtro de membrana, cujos poros deverão 
ter dimensões compreendidas entre 0,2 e 2 μm.
 
Deve referir-se no relatório final a eventual presença de partículas 
não dissolvidas, que poderão conter espécies de massa molecular superior. Deve utilizar-se um método adequado para determinar a 
percentagem ponderal das partículas em causa. As soluções devem 
ser utilizadas nas 24 horas subsequentes à sua preparação.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 135
 
1.6.3.  Correcções determinadas pela presença de impurezas e aditivos  
No que respeita ao teor de espécies com M < 1 000, torna-se geral ­
mente necessário introduzir uma correcção destinada a ter em conta a presença de componentes específicos não poliméricos (nomeada ­
mente impurezas e aditivos), excepto no caso de o teor determinado 
ser inferior a 1 %. A referida correcção pode ser efectuada por análise directa da solução de polímero ou da solução obtida após a eluição cromatográfica.
 
Se a solução obtida por eluição cromatográfica for demasiado diluída 
para permitir a análise, deverá ser concentrada, podendo ser neces ­
sário evaporá-la à secura, redissolvendo o resíduo. A concentração deve ser efectuada em condições que assegurem a não concorrência 
de alterações na solução eluída. O tratamento desta depende do 
método analítico utilizado para a análise quantitativa.
 
1.6.4.  Equipamento  
O equipamento de cromatografia de permeação em gel inclui os 
seguintes componentes:  
— reservatório de solvente,  
— desgaseificador (se adequado),  
— bomba,  
— amortecedor de pulsações (se adequado),  
— sistema de injecção,  
— colunas cromatográficas,  
— detector,  
— medidor de caudal (se adequado),  
— sistema de registo e processamento de dados,  
— recipiente para resíduos.  
Deve assegurar-se o carácter inerte do sistema cromatográfico em 
relação aos solventes utilizados (nomeadamente no caso da utilização de capilares de aço com THF).
 
1.6.5.  Sistema de injecção e de aporte de solvente  
Introduz-se na coluna um determinado volume de solução de amos ­
tra, manualmente ou por intermédio de um amostrador automático, 
numa zona bem definida. No caso da introdução manual, a com ­
pressão do êmbolo ou a retirada da seringa demasiado rápidas po ­
derão determinar alterações na distribuição de massas moleculares obtida. O sistema de aporte de solvente deve ser uniforme, recorren ­
do, se possível, a um amortecedor de pulsações. O caudal deve ser 
da ordem de 1 ml/min.
 
1.6.6.  Coluna  
Em função do tipo de amostra, os polímeros são analisados por 
recurso a uma única coluna ou a diversas colunas ligadas em série. Encontram-se disponíveis nos circuitos comerciais colunas de mate ­
riais porosos com propriedades (por exemplo, dimensões dos poros, 
limites de exclusão) bem definidas. A selecção do gel a utilizar, bem como do comprimento da coluna, depende das propriedades da amostra (volumes hidrodinâmicos, distribuição das massas molecula ­
res) e das condições específicas de separação, nomeadamente o tipo 
de solvente utilizado, a temperatura e o caudal (1) (2) (3).
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 136
 
1.6.7.  Pratos teóricos  
Deve caracterizar-se a coluna ou sistema de colunas a utilizar na sepa ­
ração pelo respectivo número de pratos teóricos. No caso da utilização de THF como solvente de eluição, introduzir uma solução de etilbenzeno ou 
outro soluto apolar adequado numa coluna de comprimento conhecido. 
O número de pratos teóricos é dado pela equação: 
N ¼ 5; 54 Í
 V e 
W 1=2 Î 2 
ou N ¼ 16 V e 
W Í Î  2 
em que:  
N = representa o número de pratos teóricos,  
V e = representa o volume de eluição correspondente ao máximo 
do pico,  
W = representa a largura da base do pico,  
W 1/2 = representa a largura do pico a meia altura.  
1.6.8.  Eficiência de separação  
Além do número de pratos teóricos, que determina a largura das 
bandas, a eficiência de separação, obtida a partir do declive da curva 
de calibração, desempenha também um papel importante. A eficiên ­
cia de separação de uma coluna é dada por:  
V e;M x Ä V e;ð10M  x Þ 
secção transversal da coluna ≥ 6; 0 " 
cm 3 
cm 2 # 
em que  
V e, M x = representa o volume de eluição de uma fracção de 
poliestireno com massa molecular M  x e 
V e,(10M x) = representa o volume de eluição de uma fracção de 
poliestireno com massa molecular dez vezes superior.  
A resolução do sistema é geralmente definida do seguinte modo:  
R 1;2 ¼ 2 Ü V e1 Ä V e2 
W 1 þ W 2 Ü 1 
log 10 ðM 2=M 1 Þ 
em que  
V e1 , V e2 = representam os volumes de eluição dos dois padrões 
de poliestireno, correspondentes ao máximo dos pi ­
cos, 
W 1 , W  2 = representam a largura da base dos picos, e  
M 1 , M  2 = representam as massas moleculares correspondentes 
aos máximos dos picos, devendo diferir num factor 
de 10.  
O valor R do sistema de colunas deve ser superior a 1,7 (4).  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 137
 
1.6.9.  Solventes  
Todos os solventes devem possuir um elevado grau de pureza (no 
caso do THF, o grau de pureza deve ser de 99,5 %). As dimensões do reservatório de solvente (que pode, se necessário, encontrar-se 
sob atmosfera inerte) devem ser suficientes para permitir a calibração 
da coluna e a realização de diversas análises. O solvente deve ser desgaseificado antes da sua introdução na coluna por intermédio da bomba.
 
1.6.10.  Controlo da temperatura  
A temperatura dos componentes críticos internos (septo de injecção, 
colunas, detector e tubagens) deve ser constante e adequada ao sol ­
vente escolhido.  
1.6.11.  Detector  
A função do detector consiste no registo quantitativo da concentra ­
ção da amostra eluída da coluna. De modo a evitar o alargamento dos picos, o volume da célula de detecção deve ser tão reduzido quanto possível, não devendo exceder 10 μl, excepto no caso dos 
detectores de difusão de radiações e de viscosidade. O método de 
detecção mais corrente consiste na refractometria diferencial. Toda ­
via, se as propriedades específicas da amostra ou do solvente de 
eluição o justificarem, podem utilizar-se outros tipos de detectores, 
nomeadamente de radiação ultravioleta/visível, infravermelha e de ­
tectores de viscosidade.
 
2. RESULTADOS E SUA APRESENTAÇÃO  
2.1. RESULTADOS  
Para pormenores sobre os critérios de avaliação, bem como no que 
respeita às exigências em matéria de recolha e processamento de 
dados, deve consultar-se a norma DIN relevante (1).  
Devem efectuar-se duas análises independentes e individuais de cada 
amostra. Em todos os casos, devem efectuar-se também ensaios em branco, em condições idênticas.
 
Deve indicar-se explicitamente que os valores determinados cons ­
tituem valores relativos expressos em equivalentes da massa mole ­
cular do padrão utilizado.  
Após a determinação dos volumes de retenção ou tempos de reten ­
ção (eventualmente corrigidos por recurso a um padrão interno), representa-se graficamente o logaritmo de M
 p (valor correspondente 
ao máximo do pico relativo ao padrão de calibração) em função de 
um dos parâmetros referidos. São necessários pelo menos dois pon ­
tos de calibração por década de massas moleculares e pelo menos cinco pontos para a curva total, que deve abranger a massa molecular estimada da amostra. A extremidade da curva de calibração corres ­
pondente às massas moleculares mais reduzidas é definida pelo n- 
-hexilbenzeno ou outro solvente apoiar adequado. A parte da curva correspondente a massas moleculares inferiores a 1 000 determina-se e se necessário corrige-se para aditivos e impurezas. Caso se recorra 
ao tratamento manual dos mesmos, pode consultar-se a norma 
ASTM D 3536-91 (3).
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 138
 
Caso fique retido na coluna um polímero insolúvel, é provável que a 
sua massa molecular seja superior à massa molecular da fracção 
solúvel, pelo que a não tomada em conta do mesmo no cálculo do teor de espécies de baixa massa molecular determinará uma sobres ­
timativa deste último. Apresentam-se em apêndice directrizes para a 
correcção do teor de espécies de baixa massa molecular de polímeros 
insolúveis.
 
Deve apresentar-se a distribuição na forma de quadro ou de gráfico 
(percentagem da soma ou do diferencial da frequência em função de 
log M). Na representação gráfica, uma década de massas moleculares 
deve corresponder a cerca de 4 cm, devendo a altura máxima dos picos ser de cerca de 8 cm. No caso de curvas de distribuição 
integral, a diferença entre 0 e 100 % deve corresponder a cerca de 
10 cm.
 
2.2. RELATÓRIO  
O relatório do ensaio deve incluir as seguintes informações:  
2.2.1.  Substância em estudo  
— Dados disponíveis sobre a substância em estudo (identidade, 
aditivos, impurezas),  
— descrição do tratamento da amostra, observações, problemas.  
2.2.2.  Equipamento  
— Reservatório de eluente, gás inerte, desgaseificação do eluente, 
composição do eluente, impurezas,  
— bomba, amortecedor de pulsações, sistema de injecção,  
— colunas de separação (fabricante, todas as informações disponí ­
veis sobre as características das colunas, nomeadamente dimen ­
sões dos poros, tipo de material utilizado, número, comprimento e ordem de utilização das colunas),
 
— número de pratos teóricos da coluna ou sistema de colunas; 
eficiência de separação (resolução do sistema),  
— informações relativas à simetria dos picos,  
— temperatura da coluna, tipo de controlo da temperatura utilizado,  
— detector (princípio utilizado, tipo, volume da célula),  
— medidor de caudal, se utilizado (fabricante, princípio utilizado),  
— sistema de registo e processamento dos dados (equipamento e 
suporte lógico).  
2.2.3.  Calibração do sistema  
— Descrição pormenorizada do método utilizado para obter a curva 
de calibração,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 139
 
— informações relativas aos critérios de qualidade aplicáveis ao 
método (por exemplo, coeficiente de correlação, erro quadrático 
médio, etc.),  
— informações relativas às extrapolações, hipóteses e aproximações 
efectuadas no decurso do processo experimental, bem como da avaliação e processamento dos dados,
 
— devem apresentar-se na forma de quadro os dados utilizados para 
a obtenção da curva de calibração, incluindo, para cada ponto de calibração, as seguintes informações:
 
— nome da amostra,  
— fabricante da amostra,  
— valores de M  p , M  n , M  w , M  w /M n característicos dos padrões, 
fornecidos pelo fabricante ou obtidos em determinações pos ­
teriores, bem como pormenores sobre o método de determi ­
nação utilizado,  
— volume de injecção e concentração da substância injectada,  
— valor de M  p utilizado para a calibração,  
— volume de eluição ou tempo de retenção corrigido correspon ­
dentes ao máximo dos picos,  
— valores de M  p correspondentes ao máximo dos picos,  
— percentagem de erro dos valores de M  p calculados e do valor 
de calibração.  
2.2.4.  Informações sobre o teor em polímeros de baixa massa 
molecular  
— Descrição dos métodos de análise e dos procedimentos utiliza ­
dos, 
— informações relativas ao teor de espécies e baixa massa molecu ­
lar da amostra, expresso em percentagem ponderal,  
— informações relativas ao teor de impurezas, aditivos e de outras 
espécies não poliméricas da amostra, expresso em percentagem 
ponderal.  
2.2.5.  Avaliação  
— Avaliação com base no tempo: métodos utilizados para assegurar 
a reprodutibilidade requerida (método de correcção, padrão inter ­
no, etc.),  
— informações que indiquem se a avaliação foi efectuada com base 
no volume de eluição ou no tempo de retenção,  
— informações sobre os limites de avaliação, caso um pico não seja 
totalmente analisado,  
— descrição dos eventuais métodos de nivelamento de dados utili ­
zados,  
— processos de preparação e tratamento prévio da amostra,  
— eventual presença de partículas não dissolvidas,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 140
 
— volume de injecção (expresso em μl) e concentração de injecção 
(expressa em mg/ml),  
— observações que indiquem efeitos susceptíveis de induzir desvios 
relativamente às condições cromatográficas ideais,  
— descrição pormenorizada das alterações aos procedimentos de 
ensaio,  
— pormenores relativos às margens de erro,  
— quaisquer outras informações e observações que possuam impor ­
tância para a interpretação dos resultados.  
3. REFERÊNCIAS  
(1) DIN 55672 (1995). Geldpermeationschromatographie (GPC) 
mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.  
(2) Yau, W.W., Kirkland, J.J., and Bly, D.D. eds, (1979). Modern 
Size Exclusion Liquid Chromatography, J.Wiley and Sons.  
(3) ASTM D 3536-91 (1991). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid 
Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography- -GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelp ­
hia, Pennsylvania.
 
(4) ASTM D 5296-92 (1992). Standard Test Method for Molecular 
Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polys ­
tyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 141
 
Apêndice  
Directrizes para a correcção do teor de espécies de baixa massa molecular 
determinada pela presença de polímeros insolúveis  
A presença de polímeros insolúveis na amostra determina perdas de massa no 
decurso da análise por cromatografia de permeação em gel. Os polímeros inso ­
lúveis são retidos de forma irreversível na coluna ou filtro, enquanto que a 
porção solúvel da amostra prossegue o seu percurso. Se for possível estimar ou determinar o incremento do índice de refracção do polímero (dn/dc), pode calcular-se a perda de massa na coluna. Neste caso, efectua-se uma correcção por 
recurso a calibração externa do refractómetro com substâncias-padrão de concen ­
tração e dn/dc conhecidos. No exemplo que se segue, utiliza-se um padrão de poli(metacrilato de metilo) (pMMA).
 
No caso dos polímeros acrílicos, a calibração externa consiste na análise por 
cromatografia de permeação em gel de uma solução de um padrão de pMMA 
em tetra-hidrofurano, de concentração conhecida; os dados resultantes são utili ­
zados para calcular a constante do refractómetro, por recurso à fórmula:  
K = R/(C × V × dn/dc)  
em que:  
K = representa a constante do refractómetro, expressa em mV.s/ml,  
R = representa a resposta do padrão de pMMA, expressa em mV.s,  
C = representa a concentração do padrão de pMMA, expressa em mg/ml,  
V = representa o volume de injecção, expresso em ml,  
dn/dc = representa o incremento do índice de refracção relativo à solução de 
pMMA em tetra-hidrofurano, expresso em ml/mg.  
Os valores  infra  são característicos de um padrão de pMMA:  
R = 2 937 891  
C = 1,07 mg/ml  
V = 0,1 ml  
dn/dc = 9 × 10  -5 ml/mg  
O valor de K resultante (3,05 × 10  11 ) é utilizado para o cálculo da resposta 
teórica do detector no caso da eluição e detecção da totalidade do polímero injectado.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 142
 
A.20.  COMPORTAMENTO DOS POLÍMEROS DA DISSOLUÇÃO/ ­
EXTRACÇÃO AQUOSA  
1. MÉTODO  
O presente método é idêntico à versão revista do método OCDE TG 
120 (1997). As informações técnicas específicas são apresentadas na 
referência (1).  
1.1. INTRODUÇÃO  
No caso de determinados polímeros, nomeadamente polímeros de 
emulsão, pode ser necessário efectuar trabalhos preliminares antes da aplicação do método descrito  infra.  O método não é aplicável a 
polímeros líquidos e polímeros que reajam com a água nas condições 
de ensaio.
 
Nos casos em que a aplicação do método não se afigure viável, pode 
investigar-se o comportamento dos polímeros na dissolução/ ­
extracção aquosa por recurso a outros métodos, devendo apresen ­
tar-se a justificação de tal facto, bem como a descrição pormenori ­
zada dos métodos em causa.  
1.2. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Não aplicável.  
1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
O comportamento dos polímeros na dissolução/extracção aquosa é 
determinado através do método do recipiente de vidro (ver A.6 — Solubilidade em água — método do recipiente de vidro) alterado do 
modo que se descreve de seguida.
 
1.4. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
Não aplicável.  
1.5. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.5.1.  Equipamento  
O equipamento necessário à aplicação do método é o seguinte:  
— dispositivo de trituração (por exemplo, triturador que produza 
partículas de dimensões conhecidas),  
— dispositivo de agitação com possibilidade de controlo da tempe ­
ratura,  
— sistema de filtros de membrana,  
— equipamento analítico adequado,  
— crivos normalizados.  
1.5.2.  Preparação da amostra  
Por recurso a crivos adequados, reduz-se uma amostra representativa 
a uma granulometria compreendida entre 0,125 e 0,25 mm. De modo a assegurar a estabilidade da amostra ou do processo de trituração, pode ser necessário utilizar um sistema de refrigeração. Os materiais 
com consistência idêntica à da borracha podem ser triturados à tem ­
peratura do azoto líquido (1).
 
Caso não se obtenham partículas com a granulometria desejada, deve 
procurar reduzir-se tanto quanto possível as dimensões das mesmas, referindo tal facto no relatório. Este último deve também indicar o 
modo de armazenagem da amostra triturada, antes da sua utilização 
no ensaio.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 143
 
1.5.3.  Procedimento  
Pesam-se três porções de 10 g da substância em estudo, que se 
colocam em três recipientes munidos de rolhas de vidro, a cada um dos quais se adicionam 1 000 ml de água. Caso a utilização 
de 10 g de amostra se revele impraticável, deve utilizar-se a quan ­
tidade máxima possível, ajustando o volume de água proporcional ­
mente à mesma.
 
Os recipientes são hermeticamente fechados e agitados a 20  o C. 
Deve utilizar-se um dispositivo de agitação ou dissolução que fun ­
cione a temperatura constante. Após 24 horas, centrifuga-se ou filtra- -se o conteúdo de cada recipiente, determinando-se a concentração do polímero na fase aquosa límpida por recurso a um método analítico 
adequado. Caso não se encontrem disponíveis métodos analíticos 
adequados aplicáveis à fase aquosa, pode estimar-se a solubilidade ou extractividade totais com base na massa a seco do resíduo de filtração ou do precipitado obtido por centrifugação.
 
Em geral, é necessário efectuar uma distinção quantitativa entre as 
impurezas e os aditivos, por um lado, e as espécies de baixa massa molecular, por outro. No caso da determinação gravimétrica, deve também efectuar-se um ensaio em branco, de modo a avaliar a con ­
tribuição de eventuais resíduos decorrentes do processo experimental.
 
O comportamento dos polímeros na dissolução/extracção aquosa a 
37 o C, a pH 2 e pH 9 determina-se como descrito para a experiência 
a 20  o C. O pH das soluções é corrigido através da adição quer de 
tampões quer de ácidos ou bases adequados, nomeadamente ácido 
clorídrico, ácido acético, hodróxido de sódio ou de potássio de qua ­
lidade analítica e amónia.  
Em função do método analítico utilizado, devem efectuar-se um ou 
dois ensaios. Sempre que seja possível utilizar métodos suficiente ­
mente específicos que permitam a determinação directa do compo ­
nente polimérico na fase aquosa, pode efectuar-se um único ensaio, tal como descrito  supra.  Todavia, caso tal não seja possível e seja 
necessário determinar o comportamento dos polímeros na 
dissolução/extracção aquosa do polímero por um processo indirecto, nomeadamente através da determinação do teor de carbono orgânico total do extracto aquoso, deve efectuar-se um ensaio complementar 
em triplicado, utilizando amostras de polímeros dez vezes inferiores 
e volumes de água idênticos aos utilizados no primeiro ensaio.
 
1.5.4.  Análise  
1.5.4.1.  Ensaio efectuado com uma única granulometria  
Alguns métodos permitem a análise directa dos componentes poli ­
méricos na fase aquosa. Todavia, como alternativa, pode proceder-se 
à análise indirecta dos componentes poliméricos dissolvidos/ ­
extraídos mediante a determinação do teor total de componentes solúveis, aplicando uma correcção destinada a ter em conta a pre ­
sença de componentes específicos não poliméricos.
 
A determinação das espécies poliméricas totais na fase aquosa pode 
ser efectuada por recurso a um método suficientemente sensível, como por exemplo:
 
— determinação do carbono orgânico total mediante digestão com 
persulfato ou dicromato, de modo a obter CO  2 , que é seguida ­
mente doseado por espectroscopia de infravermelhos ou análise 
química,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 144
 
— espectrometria de absorção atómica ou, no caso de polímeros que 
contenham silício ou metais, de plasma indutivo,  
— espectroscopia de absorção ou espectrofluorimetria no ultraviole ­
ta, no caso de polímeros arílicos,  
— cromatografia em fase líquida acoplada com espectrometria de 
massa, no caso de amostras de baixa massa molecular.  
A referida determinação pode também ser efectuada por evaporação 
à secura, sob vácuo, do extracto aquoso, seguida de análise do resíduo por espectroscopia de infravermelhos, ultravioleta, etc., ou espectrometria de absorção atómica de plasma indutivo.
 
Caso a análise da fase aquosa não seja viável, esta última deve ser 
extraída com um solvente orgânico não miscível em água, nomea ­
damente um hidrocarboneto clorado. Procede-se em seguida à eva ­
poração do solvente e determinação do teor de polímero de acordo 
com o método descrito  supra.  Na determinação do grau de 
dissolução/extracção do polímero devem subtrair-se quaisquer com ­
ponentes do resíduo identificados como impurezas ou aditivos.  
Caso se encontrem presentes quantidades relativamente elevadas das 
referidas matérias, pode ser necessário analisar o resíduo por HPLC 
ou cromatografia em fase gasosa, com o objectivo de distinguir as 
impurezas do monómero e das espécies presentes derivadas do mes ­
mo, de modo a determinar o respectivo teor.  
Em alguns casos, poderá bastar a evaporação do solvente orgânico à 
secura e subsequente pesagem do resíduo seco.  
1.5.4.2.  Ensaio efectuado com duas granulometrias  
Determina-se o teor de carbono orgânico total dos extractos aquosos.  
Efectua-se uma determinação gravimétrica com a porção não dissol ­
vida e não extraída da amostra. Se, após a centrifugação ou filtragem do conteúdo de um determinado recipiente, permanecerem resíduos 
poliméricos nas respectivas paredes, deve lavar-se o mesmo com o 
filtrado até que não se observem quaisquer resíduos, procedendo então a uma nova centrifugação e filtragem. Os resíduos que per ­
maneçam no filtro ou no tubo de centrifugação são secos a 40
 o C, 
sob vácuo, e pesados.  
2. RESULTADOS  
2.1. ENSAIO EFECTUADO COM UMA ÚNICA GRANULOMETRIA  
Devem apresentar-se os resultados relativos a cada recipiente, bem 
como os valores médios, expressos em unidades de massa por vo ­
lume de solução (de modo geral, mg/l) ou de massa por massa de 
amostra de polímero (de modo geral, mg/g). Deve também fornecer- 
-se a perda de massa da amostra, expressa no quociente entre a massa de soluto e a massa inicial da amostra, bem como os desvios-padrão relativos. Devem apresentar-se dados relativos à totalidade da subs ­
tância (polímero + aditivos essenciais, etc.) e apenas ao polímero 
(após subtracção do teor de aditivos).
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 145
 
2.2. ENSAIO EFECTUADO COM DUAS GRANULOMETRIAS  
Os teores de carbono orgânico total dos diversos extractos aquosos 
(ensaios em triplicado), bem como o valor médio relativo a cada ensaio, devem ser expressos em unidades de massa por volume de 
solução (de modo geral, mgC/l) ou de massa por massa de amostra 
de polímero (de modo geral, mgC/g).
 
O facto de não se observarem diferenças entre os resultados relativos 
aos rácios superior e inferior amostra/água poderá indicar a extracção 
efectiva de todos os componentes extractáveis. Neste caso, não é 
geralmente necessário proceder à análise directa.  
Devem apresentar-se as massas dos diversos resíduos, expressas em 
percentagem das massas iniciais das amostras, calculando as médias relativas a cada ensaio. A diferença entre 100 % e as percentagens 
obtidas representa as percentagens de matérias solúveis e extractáveis 
nas amostras originais.
 
3. RELATÓRIO  
3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deve incluir as seguintes informações:  
3.1.1.  Substância em estudo  
— Informações disponíveis sobre a substância em estudo (identida ­
de, aditivos, impurezas, teor de espécies de baixa massa mole ­
cular).  
3.1.2.  Condições experimentais  
— Descrição dos procedimentos utilizados e das condições experi ­
mentais,  
— descrição dos métodos analíticos e de detecção utilizados.  
3.1.3.  Resultados  
— Solubilidade ou extractividade, expressas em mg/ml; valores in ­
dividuais e médios obtidos nos ensaios de extracção das diversas soluções, discriminando o teor de polímero e de impurezas, adi ­
tivos, etc.,
 
— solubilidade ou extractividade do polímero, expressas em mg/ml,  
— teor de carbono orgânico total dos extractos aquosos, massa do 
soluto e percentagens calculadas, se for caso disso,  
— pH de cada amostra,  
— resultados dos ensaios em branco,  
— sempre que necessário, referências à instabilidade química da 
substância em estudo no decurso dos processos de ensaio e ana ­
lítico,  
— quaisquer informações que possuam importância para a interpre ­
tação dos resultados.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) DIN 53733 (1976). Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen 
für Prüfzwecke.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 146
 
A.21.  PROPRIEDADES DE COMBURÊNCIA (LÍQUIDOS)  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
O presente método de ensaio destina-se à determinação do potencial 
de uma substância líquida de aumentar a velocidade ou intensidade 
de combustão de uma substância combustível, ou de formar misturas homogéneas com uma substância combustível que possam sofrer ignição espontânea. O método baseia-se no ensaio da ONU para 
líquidos comburentes (1l), ao qual é equivalente. Todavia, uma vez 
que o método A.21 se destina essencialmente a satisfazer as exigên ­
cias da Directiva 67/548/CEE, apenas é necessária a comparação 
com uma substância de referência. Caso se preveja que os resultados 
do ensaio sejam utilizados para outros fins, pode ser necessário efectuar ensaios complementares e comparações com outras substân ­
cias de referência (
 1 ). 
Não é necessário realizar o ensaio se uma análise simples da fórmula 
estrutural da substância permitir estabelecer com um grau de con ­
fiança elevado que a mesma não reage exotermicamente com maté ­
rias combustíveis.  
Antes de realizar o ensaio, é conveniente obter informações sobre 
eventuais propriedades explosivas da substância.  
O método não é aplicável a sólidos, gases e outras substâncias 
explosivas ou altamente inflamáveis, nem a peróxidos orgânicos.  
Não é necessário realizar o ensaio se existirem dados referentes à 
substância em estudo obtidos por aplicação do ensaio da ONU para líquidos comburentes (1).
 
1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES  
O tempo médio necessário para o aumento da pressão é a média dos 
tempos determinados necessários para que a pressão da mistura em 
estudo aumente de 690 kPa para 2 070 kPa acima da pressão atmos ­
férica.  
1.3. SUBSTÂNCIA DE REFERÊNCIA  
Utiliza-se como substância de referência uma solução aquosa a 
65 %, em massa, de ácido nítrico de qualidade analítica (  2 ). ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 147  
( 1 ) Por exemplo, o ensaio no âmbito da regulamentação da ONU relativa ao transporte de 
mercadorias perigosas. 
( 2 ) O ácido deve ser titulado antes do ensaio, de modo a confirmar a sua concentração.
 Caso o experimentador preveja que os resultados do ensaio sejam 
utilizados para outros fins (  1 ), pode revelar-se adequado efectuar 
ensaios com outras substâncias de referência (  2 ). 
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
O líquido em estudo é misturado, na proporção 1:1, em massa, com 
fibras de celulose, e introduzido num recipiente pressurizado. Se, durante o processo de mistura ou enchimento, ocorrer ignição espon ­
tânea, não é necessário prosseguir o ensaio.
 
Caso não ocorra ignição espontânea, realiza-se o ensaio na sua to ­
talidade. A mistura é aquecida no recipiente pressurizado, determi ­
nando-se o tempo médio necessário para que a pressão aumente de 
690 kPa para 2 070 kPa acima da pressão atmosférica. Este tempo é 
comparado com o tempo médio necessário para o aumento da pres ­
são da mistura na proporção de 1:1 da(s) substância(s) de referência com celulose.
 
1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
Os resultados de uma série de cinco ensaios com uma determinada 
substância não devem diferir em mais de 30 % da média aritmética. 
Devem desprezar-se os resultados que mostrem uma divergência superior a 30 % relativamente à média, alterando-se os procedimen ­
tos de mistura e enchimento, após o que deve repetir-se o ensaio.
 
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
1.6.1.  Preparação  
1.6.1.1.  Substância combustível  
Utilizam-se como matéria combustível fibras de celulose secas, de 
comprimento compreendido entre 50 e 250 μm e diâmetro médio 
25 μm (  3 ). As fibras são secas a massa constante, numa placa de 
espessura não superior a 25 mm, a 105  o C, durante 4 horas, e 
mantidas num exsicador com exsicante, até ao arrefecimento e utili ­
zação. O teor de humidade da celulose seca deve ser inferior a 0,5 % em relação à massa seca (
 4 ). Para tal, se necessário, deve prolongar- 
-se o tempo de secagem (  5 ). Deve utilizar-se o mesmo lote de celulose 
em todo o ensaio.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 148  
( 1 ) Por exemplo, o ensaio no âmbito da regulamentação da ONU relativa ao transporte de 
mercadorias perigosas. 
( 2 ) Na referência 1, por exemplo, utilizam-se ácido perclórico a 50 %, em massa, e clorato 
de sódio a 40 %, em massa. 
( 3 ) Por exemplo, celulose Whatman para cromatografia em coluna, referência CF 11, n.  o de 
catálogo 4021 050. 
( 4 ) Confirmado, por exemplo, através de uma titulação de Karl Fisher. 
( 5 ) Como alternativa, pode obter-se o teor de humidade em causa por aquecimento a 105  o C, 
sob vácuo, durante 24 h.
 1.6.1.2.  Equipamento  
1.6.1.2.1. D i s p o s i t i v o p r e s s u r i z a d o  
Deve utilizar-se um dispositivo constituído por um recipiente pres ­
surizado de aço de forma cilíndrica, com 89 mm de comprimento e 60 mm de diâmetro externo (ver figura 1). São maquinadas duas superfícies planas em lados opostos, reduzindo a secção local do 
recipiente para 50 mm, de modo a facilitar a imobilização durante 
a colocação dos obturadores de ignição e de ventilação. O recipiente, com um diâmetro interno de 20 mm, é rebaixado internamente em ambas as extremidades até uma profundidade de 19 mm e roscado 
para tubos normalizados BSP ( British Standard Pipe ) de 1", ou o seu 
equivalente no sistema métrico. É enroscada à superfície curva do recipiente pressurizado uma tomada de pressão, a 35 mm de uma das extremidades, perpendicularmente às superfícies planas maquinadas. 
O encaixe, roscado para receber a rosca da tomada de pressão (tubo 
normalizado BSP de 1/2", ou o seu equivalente no sistema métrico), é realizado a uma profundidade de 12 mm. Se necessário, é instalada uma junta de material inerte, de modo a assegurar estanquidade aos 
gases. A tomada de pressão tem um comprimento exterior de 55 mm 
relativamente ao corpo do dispositivo e um furo axial com 6 mm de diâmetro. A extremidade da tomada de pressão é rebaixada e roscada de forma a receber um transdutor de pressão com diafragma. Pode 
utilizar-se qualquer dispositivo de medição de pressão que não seja 
atacado pelos gases de combustão ou produtos de decomposição e seja adequado a aumentos de pressão de 690-2 070 kPa em não mais de 5 minutos.
 
A extremidade do recipiente pressurizado mais distante da tomada de 
pressão é tapada com um obturador de ignição e munida de dois 
eléctrodos, um dos quais isolado do corpo do obturador e o outro ligado à massa. A extremidade oposta do recipiente é fechada por um disco de ruptura adequado a uma pressão de ruptura de 2 200 
kPa, mantido em posição por um obturador de retenção com um furo 
axial de 20 mm de diâmetro. Se necessário, é instalada uma junta de material inerte, de modo a assegurar estanquidade aos gases. Durante a utilização, o dispositivo é mantido na posição correcta por meio de 
um suporte (figura 2), geralmente constituído por uma placa de aço 
macio com 235 mm × 184 mm × 6 mm e um tubo de 185 mm de comprimento e secção quadrada de 70 mm × 70 mm × 4 mm.
 
São cortados dois lados opostos na extremidade do tubo, de modo a 
obter uma estrutura constituída por uma secção de tubo intacto com 
86 mm de comprimento prolongada por dois lados até à base. As 
extremidades destes lados são cortadas de modo a formar um ângulo de 60
 o com a horizontal e soldadas à placa de aço macio que cons ­
titui a base. É maquinada num dos lados da extremidade superior da 
base uma fenda com 22 mm de largura e 46 mm de profundidade, de 
modo que, ao colocar o dispositivo pressurizado com o obturador de ignição para baixo, a tomada de pressão encaixe na fenda. É soldada à face interna do lado inferior do tubo um espaçador de aço com 
30 mm de largura e 6 mm de espessura. O dispositivo pressurizado é 
mantido firmemente em posição por dois parafusos de orelhas de 7 mm, colocados no lado oposto, e apoiado inferiormente por dois elementos prismáticos de aço de 12 mm de largura e 6 mm de 
espessura, soldados às peças laterais na base da porção intacta do 
tubo.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 149
 
1.6.1.2.2. S i s t e m a d e i g n i ç ã o  
O sistema de ignição é constituído por um cabo de níquel-crómio de 
25 cm de comprimento e 0,6 mm de secção, com uma resistência de 
3,85 ohm/m. O cabo é enrolado em forma de bobina por recurso a uma haste de 5 mm de secção, e ligado aos eléctrodos do obturador de ignição. A bobina deve apresentar uma das configurações que se 
ilustram na figura 3. A distância entre a extremidade inferior do 
recipiente e a superfície interior da bobina de ignição deve ser de 20 mm. Caso os eléctrodos não sejam ajustáveis, as extremidades do cabo de ignição entre a bobina e a base do recipiente devem ser 
isoladas por um elemento de cerâmica. O cabo é aquecido por acção 
de uma corrente contínua de intensidade mínima 10 A.
 
1.6.2.  Realização do ensaio  ( 1 ) 
O dispositivo completo, incluindo o transdutor de pressão e o sis ­
tema de aquecimento, mas sem o disco de ruptura na respectiva 
posição, é colocado com o obturador de ignição para baixo. Com 
o auxílio de um agitador de vidro (  2 ), misturam-se num recipiente de 
vidro 2,5 g do líquido em estudo com 2,5 g de celulose seca. Por motivos de segurança, a mistura deve ser executada com um dispo ­
sitivo de segurança interposto entre o operador e a mistura. Em caso 
de ignição durante os processos de mistura ou o enchimento, não é necessário prosseguir o ensaio. A mistura é vertida em pequenas 
porções no recipiente pressurizado, agitando ligeiramente, devendo 
assegurar-se a acumulação em torno da bobina de ignição, de forma a estabelecer um bom contacto. A bobina não deve ser distorcida durante o processo de enchimento, facto que poderia determinar 
resultados erróneos (
 3 ). O disco de ruptura é colocado na respectiva 
posição e o obturador de retenção enroscado firmemente. O reci ­
piente carregado, com o disco de ruptura no topo, é transferido para o suporte, que deve estar colocado numa chaminé ou câmara 
com protecção. A fonte de alimentação é ligada aos terminais ex ­
ternos do obturador de ignição, aplicando-se uma corrente de 10 A. O tempo decorrido entre o início da mistura e o estabelecimento da corrente eléctrica não deve exceder 10 minutos.
 
O sinal produzido pelo transdutor de pressão é transmitido a um 
sistema adequado que permita a detecção e o registo contínuos da alteração da pressão (por exemplo, um detector em contínuo aco ­
plado a um registador). A mistura é aquecida até à ruptura do disco 
de ruptura ou até terem decorrido, pelo menos, 60 segundos. Caso o disco não sofra ruptura, deve deixar-se arrefecer a mistura antes de desmontar cuidadosamente o dispositivo, tomando as precauções 
inerentes a uma eventual pressurização. Realizam-se cinco ensaios 
com a substância em estudo e a(s) substância(s) de referência. Re ­
gista-se o tempo necessário para a pressão aumentar de 690 kPa para 2 070 kPa acima da pressão atmosférica, calculando-se então o 
tempo médio necessário para o aumento da pressão.
 
Algumas substâncias produzem um aumento de pressão excessivo ou 
demasiado reduzido, determinado por reacções químicas independen ­
tes das propriedades de comburência das substâncias. Nesses casos, 
pode ser necessário repetir o ensaio, utilizando uma substância inerte, como, por exemplo, terra de diatomáceas ( kieselguhr ), em vez da 
celulose, de modo a esclarecer a natureza da reacção.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 150  
( 1 ) As misturas de substâncias comburentes com celulose devem ser consideradas potencial ­
mente explosivas, devendo manipular-se com os devidos cuidados. 
( 2 ) Na prática, pode preparar-se uma quantidade de mistura na proporção 1:1 do líquido em 
estudo com celulose superior à necessária para o ensaio, transferindo 5 ± 0,1 g da mesma 
para o recipiente pressurizado. A mistura deve ser preparada antes de cada ensaio. 
( 3 ) Deve evitar-se, em especial, o contacto entre espiras adjacentes da bobina.
 2. DADOS  
Tempos necessários para o aumento da pressão da(s) substância(s) 
em estudo e de referência. Tempos necessários para o aumento da pressão no caso dos ensaios com substâncias inertes, se for caso 
disso.
 
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS  
Calculam-se os tempos médios necessários para o aumento da pres ­
são da(s) substância(s) em estudo e de referência.  
Calcula-se o tempo médio necessário para o aumento da pressão no 
ensaio com a substância inerte, se realizado.  
O quadro 1 fornece alguns exemplos de resultados:  
Quadro 1  
Exemplos de resultados  ( a ) 
Substância (  b ) Tempo médio necessário para o aumento da pressão 
(mistura com celulose na proporção 1:1) 
(ms) 
Solução aquosa saturada de dicromato de amónio 20 800 
Solução aquosa saturada de nitrato de cálcio 6 700 
Solução aquosa saturada de nitrato férrico 4 133 Solução aquosa saturada de perclorato de lítio 1 686 Solução aquosa saturada de perclorato de magnésio 777 Solução aquosa saturada de nitrato de níquel 6 250 Ácido nítrico a 65 % 4 767 (
 c ) 
Ácido perclórico a 50 % 121 (  c ) 
Ácido perclórico a 55 % 59 Solução aquosa a 30 % de nitrato de potássio 26 690 Solução aquosa saturada de nitrato de prata (
 d ) 
Solução aquosa a 40 % de clorato de sódio 2 555 (  c ) 
Solução aquosa a 45 % de nitrato de sódio 4 133  
Substância inerte  
Água: celulose (  d ) 
( a ) Ver a referência (1) para a classificação no âmbito da regulamentação da ONU em matéria de transporte de 
mercadorias perigosas. 
( b ) As soluções saturadas devem ser preparadas à temperatura de 20  o C. 
( c ) Valor médio com base em ensaios de comparação interlaboratorial. 
( d ) Sem atingir a pressão máxima de 2 070 kPa.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 151
 
3. RELATÓRIO  
3.1. RELATÓRIO DE ENSAIO  
O relatório de ensaio deve incluir as seguintes informações:  
— identidade, composição, grau de pureza, etc., da substância em 
estudo,  
— concentração da substância em estudo,  
— procedimento utilizado para a secagem da celulose,  
— teor de humidade da celulose utilizada,  
— resultados das determinações,  
— resultados dos ensaios com substâncias inertes, se for caso disso,  
— tempos médios necessários para o aumento da pressão determi ­
nados,  
— quaisquer eventuais alterações do método e respectiva motivação,  
— quaisquer informações complementares ou observações úteis para 
a interpretação dos resultados.  
3.2. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS (  1 ) 
Os resultados do ensaio são interpretados com base nos seguintes 
critérios:  
a) Eventual ignição espontânea da mistura da substância em estudo 
com celulose; e  
b) Comparação do tempo médio necessário para o aumento da pres ­
são de 690 kPa para 2 070 kPa com idêntico parâmetro da(s) 
substância(s) de referência.  
Uma substância líquida é considerada comburente se:  
a) Uma mistura da substância com celulose na proporção 1:1, em 
massa, exibir ignição espontânea; ou  
b) Uma mistura na proporção 1:1, em massa, exibir um tempo mé ­
dio necessário para o aumento da pressão inferior ou igual ao 
tempo médio necessário para o aumento da pressão de uma mis ­
tura na proporção 1:1, em massa, de solução aquosa de ácido nítrico a 65 % (em massa) e celulose.
 
De modo a evitar falsos resultados positivos, podem ser também 
tidos em conta na interpretação dos resultados, se tal for considerado necessário, os resultados obtidos num ensaio da substância em es ­
tudo com uma substância inerte.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 152  
( 1 ) Ver a referência n.  o 1 para a interpretação dos resultados no âmbito da regulamentação 
da ONU relativa ao transporte de mercadorias perigosas, utilizando várias substâncias de 
referência.
 4. REFERÊNCIAS  
(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Ma ­
nual of Tests and Criteria , 3.  o edição revista. Publicação da 
ONU No: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, p. 342.  Test 0.2: 
Test for oxidizing liquids.  
Figura 1  
Dispositivo pressurizado
  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 153
 
Figura 2  
Suporte do dispositivo
  
Figura 3  
Sistema de ignição
  
Nota: Cada uma destas duas configurações pode ser utilizada  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 154
 
A.22.  DIÂMETRO MÉDIO GEOMÉTRICO PONDERADO EM 
FUNÇÃO DO COMPRIMENTO DE FIBRAS  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
O presente método descreve um procedimento para medição do diâ ­
metro médio geométrico ponderado em função do comprimento 
(LWGMD) de lotes de fibras minerais artificiais (FMA). Dado que o LWGMD do material terá uma probabilidade de 95 % de se encontrar no interior dos níveis de confiança a 95 % (LWGMD ± 
dois desvios-padrão) da amostra, o valor apresentado (resultado do 
teste) será o valor inferior do intervalo de confiança a 95 % da amostra (ou seja, LWGMD — 2 desvios-padrão). O método ba ­
seia-se numa actualização (Junho de 1994) de um projecto de pro ­
cedimento industrial do HSE (Departamento de Saúde e Segurança 
Britânico) adoptado numa reunião entre o ECFIA e o HSE em Chester, em 26/9/93, e desenvolvido para e por um segundo ensaio interlaboratorial (1, 2). Este método de medição pode ser utilizado 
para caracterizar o diâmetro das fibras em lotes de substâncias ou 
produtos que contenham FMA, nomeadamente fibras cerâmicas re ­
fractárias (FCR), fibras vítricas artificiais (FVA), fibras cristalinas e 
fibras policristalinas.
 
A ponderação em função do comprimento é uma forma de compen ­
sar o efeito de distribuição dos diâmetros causada pela quebra das 
fibras longas durante a amostragem ou manuseamento dos materiais. 
Na medição da distribuição por tamanhos do diâmetro das FMA utilizam-se métodos estatísticos geométricos (média geométrica), visto que essa distribuição se aproxima geralmente da distribuição 
logarítmica normal.
 
A medição do comprimento em complemento da medição do diâme ­
tro é tediosa e demorada, mas se se medirem apenas as fibras que 
tocam uma linha infinitamente fina em cada campo de visão do miscroscópio electrónico, a probabilidade de que uma determinada fibra seja seleccionada é proporcional ao seu comprimento. Na me ­
dida em que esse facto resolve a questão do comprimento e da sua 
ponderação nos cálculos, a única medição necessária é a do diâme ­
tro, e o LWGMD-2SD pode ser calculado como se descreve.
 
1.2. DEFINIÇÕES  
Partícula : Um objecto em que a relação do comprimento com a 
espessura é menor do que 3:1.  
Fibra : Um objecto em que a relação do comprimento com a espes ­
sura (razão de forma) é igual ou superior a 3:1.  
1.3. ÂMBITO E LIMITAÇÕES  
O método foi concebido para a análise da distribuição dos diâmetros 
nos casos em que o diâmetro médio varia entre 0,5 μm e 6 μm. Os 
diâmetros superiores podem ser medidos utilizando a microscopia 
electrónica com menor ampliação, mas o método terá limitações cada vez maiores quanto mais finas sejam as fibras, pelo que se recomenda, quando o diâmetro médio for inferior a 0,5 μm, a utili ­
zação de um microscópio electrónico de transmissão (MET) para a 
medição do diâmetro das fibras.
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 155
 
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Retira-se um determinado número de amostras representativas das 
mantas de fibra ou dos lotes de fibras soltas. Reduz-se o compri ­
mento das fibras através de um procedimento de esmagamento e 
dilui-se em água uma subamostra representativa. Extraem-se aliquo ­
tas que são filtradas em filtro de policarbonato com uma dimensão de poro de 0,2 μm e preparadas para serem examinadas utilizando 
técnicas de microscopia electrónica de varrimento (MEV). O diâme ­
tro das fibras é medido com uma ampliação de 10 000 x ou 
superior (
 1 ) utilizando o método da intersecção com uma linha para 
obtenção de uma estimativa do diâmetro médio não afectada de erro 
sistemático. O limite inferior do intervalo de confiança a 95 % (com 
base num teste unicaudal) é calculado para obter uma estimativa do valor inferior da média geométrica do diâmetro das fibras presentes no material.
 
1.5. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.5.1.  Segurança/precauções  
A exposição física às fibras em suspensão no ar deve ser reduzida ao 
mínimo, pelo que o manuseamento das fibras secas deve ser feito em 
câmara de fluxo laminar ( hotte ) ou caixa de luvas. A exposição física 
deve ser objecto de seguimento periódico que permita avaliar a eficácia dos métodos de controlo. Durante o manuseamento de FMA, devem ser utilizadas luvas descartáveis, para reduzir a irrita ­
ção da pele e para evitar a contaminação cruzada.
 
1.5.2.  Aparelhos / equipmento  
— Prensa (capaz de produzir 10 MPa) e cadinhos,  
— Filtros capilares de policarbonato com diâmetro de poro de 
0,2 μm (25 mm de diâmetro),  
— Filtro de membranas em éster de celulose com diâmetro de poro 
de 5 μm, para suporte durante a filtração,  
— Aparelho de filtração em vidro (ou sistema de filtração descartá ­
vel) que aceite filtros de 25 mm de diâmetro (p.ex.: sistema de 
microanálise em vidro da Millipore, tipo XX10 025 00),  
— Água recém-destilada filtrada a 0,2 μm para remoção dos micro ­
organismos,  
— Aparelho de revestimento a quente com eléctrodo em ouro ou 
ouro/paládio,  
— Microscópio electrónico de varrimento com capacidade de reso ­
lução a 10 nm e com ampliação de 10 000 x,  
— Diversos: espátulas, lâmina de bisturi tipo 24, tesouras, tubos de 
MEV, cola ou fita adesiva de carbono, prata coloidal,  
— Sonda de ultra-sons ou banho ultra-sónico de bancada,  
— Amostrador ou sonda para recolha de amostras cilíndricas das 
mantas de FMA.  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 156  
( 1 ) Esta é a ampliação indicada para as fibras de 3 μm; no caso das fibras de 6 μm poderá 
ser mais indicado utilizar uma ampliação de 5 000 x.
 1.5.3.  Procedimento de ensaio  
1.5.3.1.  Amostragem  
No caso das mantas e placas, um amostrador ou sonda de 25 mm de 
diâmetro é utilizado para a recolha de amostras em toda a secção. 
Essas amostras devem ser igualmente espaçadas por toda a largura 
nas peças pequenas ou retiradas aleatoriamente de diversas áreas quando as peças sejam longas. O mesmo equipamento pode ser utilizado para retirar amostras aleatórias no caso de fibras soltas. 
Quando possível, devem ser retiradas seis amostras, por forma a 
reflectir as variações espaciais do material.
 
Esmaga-se as seis amostras num cadinho de 50 mm de diâmetro a 
10 MPa. O material é re-homogeneizado com uma espátula e pren ­
sado uma segunda vez a 10 Mpa, podendo depois ser removido do 
cadinho e armazenado num frasco de vidro selado.  
1.5.3.2.  Preparação das amostras  
Se necessário, qualquer ligante orgânico poderá ser removido colo ­
cando a fibra numa estufa a 450 °C durante cerca de uma hora.  
Formar um cone e dividir em quatro para obter subamostras (este 
passo deve ser realizado em câmara de fluxo laminar).  
Utilizando uma espátula, adicionar uma pequena quantidade (< 0,5 
g) de amostra a 100 ml de água acabada de destilar e filtrada através 
de um filtro de membrana de 0,2 μm (poderão ser utilizadas fontes 
alternativas de água ultrapura, desde que se demonstre que a sua qualidade é satisfatória). Dispersar totalmente utilizando uma sonda 
de ultra-sons com uma potência de 100 W regulada de forma a 
produzir cavitação. (Se esse tipo de sonda não estiver disponível, utilizar o seguinte método: agitar e inverter a amostra repetidamente durante 30 segundos; passar por ultra-sons num banho ultra-sónico 
de bancada durante cinco minutos; voltar a agitar e inverter repeti ­
damente durante mais 30 segundos).
 
Imediatamente após a dispersão da fibra, remover um determinado 
número de aliquotas (p.ex.: três aliquotas de 3, 6 e 10 ml) utilizando uma pipeta de boca larga (com uma capacidade de 2 a 5 ml).
 
Filtrar todas as aliquotas em vácuo através de um filtro de policar ­
bonato com poro de 0,2 μm, suportado por um filtro de suporte 
MEC com poro de 5 μm, utilizando um funil de filtração em vidro 
de 25 mm com um reservatório cilíndrico. Colocam-se primeiro 
cerca de 5 ml da água destilada filtrada no funil e a aliquota é depois lentamente pipetada para a água com a ponta da pipeta abaixo do menisco. A pipeta e o reservatório devem ser cuidadosamente lava ­
das depois de pipetar, dado que as fibras mais finas têm tendência 
para se concentrarem perto da superfície.
 
Remover cuidadosamente o filtro e separá-lo do filtro de suporte 
antes de o colocar num recipiente para secagem.  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 157
 
Cortar uma secção de um quarto ou metade do filtrado com uma 
lâmina de bisturi de tipo 24, fazendo movimentos laterais durante o 
corte. Colar cuidadosamente a secção cortada num suporte de SEM utilizando fita ou cola de carbono. Aplicar prata coloidal em pelo menos três sítios para melhorar o contacto eléctrico entre a borda do 
filtro e o suporte. Quando a cola/prata coloidal estiverem secos, 
revestir a superfície do depósito a quente com aproximadamente 50 nm de ouro ou de ouro/paládio.
 
1.5.3.3.  Calibração e operação do MEV  
1.5.3.3.1. C a l i b r a ç ã o  
A calibração do MEV deve ser verificada pelo menos uma vez por 
semana (idealmente uma vez por dia) utilizando uma grelha de cali ­
bração normalizada. A calibração deve ser verificada utilizando uma 
amostra-padrão, e se o valor medido (MEV) não se encontrar num intervalo de ± 2 % do respectivo valor, o MEV deve ser novamente calibrado e o procedimento de verificação deve ser repetido.
 
O MEV deve ter uma resolução que permita um diâmetro mínimo de 
campo de pelo menos 0,2 μm, utilizando uma matriz de amostra real, 
com uma ampliação de 2 000 x.  
1.5.3.3.2. O p e r a ç ã o  
O MEV deve ser operado com uma ampliação de 10 000 x (  1 ) em 
condições que permitam uma boa resolução, com imagem aceitável, a baixas velocidades de varrimento, por exemplo de 5 segundos por 
imagem. Embora os parâmetros operacionais de diferentes MEV 
possam variar, em geral obtém-se a melhor visibilidade e resolução, em materiais de peso atómico relativamente baixo, utilizando volta ­
gens de aceleração de 5-10 keV e trabalhando com um pequeno 
diâmetro de feixe ( spot size ) e com uma distância de trabalho curta. 
Dado que se vai utilizar a linha mediana como referência, deve utilizar-se uma inclinação de 0
 o , para evitar a necessidade de voltar 
a focar ou, no caso de MEV com um módulo eucêntrico, utilizar a 
distância de trabalho eucêntrica. Pode trabalhar-se com menor am ­
pliação desde que o material não contenha nenhuma fibra de pe ­
queno diâmetro e que o diâmetro das fibras seja grande (> 5 μm). 
1.5.3.4.  Medição do diâmetro  
1.5.3.4.1. E x a m e c o m b a i x a a m p l i a ç ã o p a r a a v a l i a ç ã o d a 
a m o s t r a  
A amostra deve ser inicialmente examinada com baixa ampliação 
para verificar se não existem aglomerados de fibras de grandes di ­
mensões e para avaliar a densidade de fibras na amostra. Caso haja muita aglomeração, recomenda-se a preparação de uma nova amos ­
tra.
 
Para fins de exactidão estatística, é necessário proceder à medição de 
um número mínimo de fibras, pelo que poderá parecer desejável 
dispor de maior densidade de fibras, na medida em que o exame 
de campos vazios leva tempo e não contribui em nada para a análise. No entanto, se o filtro estiver sobrecarregado, torna-se difícil medir o diâmetro de todas as fibras e as fibras de menor diâmetro podem ser 
escondidas por outras de maior diâmetro.
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 158  
( 1 ) Para as fibras de 3 μm, ver a nota de pé de página anterior.
 Uma densidade de fibras superior a 150 fibras por milímetro linear 
poderá resultar numa sobreestimação do LWGMD. Por outro lado, a 
baixa concentração de fibras aumentará o tempo necessário para a análise, pelo que frequentemente é mais útil preparar uma nova amostra com uma densidade de fibras próxima da ideal do que 
persistir nas contagens de filtros em que a concentração de fibras 
é baixa. A densidade ideal das fibras deverá resultar, em média, em uma ou duas fibras que podem ser medidas por cada campo de visão, com uma ampliação de 5 000 x. A densidade ideal depende, contu ­
do, do diâmetro das fibras, pelo que é necessário que o operador 
utilize a sua experiência e discernimento para decidir se a densidade de fibras está ou não próxima do ideal.
 
1.5.3.4.2. P o n d e r a ç ã o d o d i â m e t r o d a s f i b r a s e m f u n ç ã o d o 
c o m p r i m e n t o  
Só devem ser contadas as fibras que toquem (ou interceptem) uma 
linha (infinitamente) fina traçada no ecrã do MEV. Para tal, deve ser traçada no centro do ecrã uma linha horizontal (ou vertical).
 
Em alternativa, pode colocar-se um ponto no centro do ecrã e pro ­
ceder depois a um exame linear contínuo ao longo do filtro numa determinada direcção. O diâmetro de todas as fibras com uma razão de forma superior a 3:1 que toquem ou interceptem esse ponto 
deverá ser medido e registado.
 
1.5.3.4.3. M e d i ç ã o d a s f i b r a s  
Recomenda-se que sejam medidas pelo menos 300 fibras. Cada fibra 
deve ser medida uma única vez no ponto de intersecção com o ponto 
ou linha traçados no ecrã (ou perto do ponto de intersecção se a parede exterior da fibra estiver escondida). Caso se encontrem fibras de secção irregular, deve ser feita uma medição que represente o 
diâmetro médio da fibra. Os pontos de medição na parede exterior 
da fibra devem ser cuidadosamente definidos antes da medição da distância que separa os dois pontos opostos. A medição pode ser efectuada em linha, no ecrã, ou  a posteriori , em imagens armazena ­
das ou fotografias. Recomenda-se a utilização de sistemas semi-au ­
tomáticos de medição em imagens que transferem os dados directa ­
mente para uma folha de cálculo, na medida em que permitem poupar tempo, eliminar os erros de transcrição e automatizar o pro ­
cesso de cálculo.
 
As extremidades das fibras mais longas devem ser observadas a 
baixa ampliação para verificar se não estão a encaracolar de volta para o campo de visão, por forma a garantir que só sejam medidas 
uma única vez.
 
2. DADOS  
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS  
Geralmente, os diâmetros das fibras não apresentam uma distribuição 
normal. No entanto, é possível obter uma distribuição que se apro ­
xima da normal através de uma transformação logarítmica.  
Calcular a média aritmética (lnD médio) e o desvio-padrão (SD  lnD ) 
dos valores do logaritmo neperiano (lnD) dos n diâmetros de 
fibra (D). 
médio lnD ¼ ∑ lnD 
n (1) ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 159
 
SD lnD ¼ ﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃﬃ  
∑ ðlnD – médio lnDÞ 2 
n–1 s 
(2) 
O desvio-padrão é dividido pela raíz quadrada do número de medi ­
ções (n) para obter o erro-padrão (SE  lnD ). 
SE lnD ¼ SD 
ﬃﬃﬃ n p (3) 
Substrair o dobro do erro-padrão da média e calcular o exponencial 
desse valor (média menos dois erros-padrão) para obter a média 
geométrica menos dois erros-padrão geométricos. 
LWGMD – 2SE ¼ e ðmédio lnD – 2SE  lnd Þ (4) 
3. APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS  
RELATÓRIO DE ENSAIO  
O relatório de ensaio deve incluir pelo menos a seguinte informação:  
— Valor de LWGMD-2SE.  
— Todos os desvios, em particular os que possam ter efeitos sobre a 
precisão ou a fiabilidade dos resultados, com a devida justifica ­
ção. 
4. BILBLIOGRAFIA  
1. B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. February 
1999.  
2. G. Burdett and G. Revell. Development of a standard met ­
hod to measure the length-weigthed geometric mean fibre diameter: Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/07. Project R42.75 HPD. Health and Safety 
Executive. Research and Laboratory Services Division. 1994.
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 160
 
A.23  COEFICIENTE DE PARTIÇÃO (1-OCTANOL/ÁGUA): MÉTODO 
DE AGITAÇÃO LENTA  
INTRODUÇÃO  
1. Este método é equivalente ao  Test Guideline  TG 123 (2006) da OCDE. O 
método da agitação lenta permite determinar com exatidão valores de coe ­
ficiente de partição 1-octanol/água (P  OW ) até log P  OW = 8,2 (1). É, portanto, 
um método experimental adequado para a determinação direta do P  OW de 
substâncias fortemente hidrofóbicas.  
2. Outros métodos de determinação do coeficiente de partição 1-octanol/água 
(P OW ) são o método dito "do frasco com agitação" (2) e o método de 
determinação do P  OW com base nos fenómenos de retenção em HPLC de 
inversão de fases (3). O método do frasco com agitação pode conduzir a 
resultados anómalos, devido à transferência de microgotículas de octanol 
para a fase aquosa. À medida que aumenta o valor de P  OW , a presença 
dessas gotículas na fase aquosa leva a que a concentração da substância em estudo nessa fase seja cada vez mais sobrestimada. A utilização desse mé ­
todo está, portanto, limitada a substâncias com P
 OW inferior a 4. O segundo 
método utiliza valores consistentes de P  OW , determinados diretamente, para 
calibrar a relação entre os fenómenos de retenção em HPLC e os valores medidos de P
 OW . Existia um projeto de orientações da OCDE para a deter ­
minação de coeficientes de partição 1-octanol/água de substâncias ionizá ­
veis, que foi abandonado (4).  
3. O presente método foi desenvolvido nos Países Baixos. A precisão das 
metodologias descritas neste método foi validada e otimizada num estudo 
de validação interlaboratorial em que participaram 15 laboratórios (5).  
CONSIDERAÇÕES INICIAIS  
Significado e utilização  
4. Foram identificadas relações muito significativas entre o coeficiente de par ­
tição 1-octanol/água (P  OW ) de substâncias orgânicas inertes e a bioacumu ­
lação dessas substâncias nos peixes. Além disso, demonstrou-se a existência 
de uma correlação entre o P  OW e a toxicidade para os peixes e entre o P  OW 
e a sorção dos produtos químicos por meios sólidos, como solos e sedimen ­
tos. A referência 6 descreve exaustivamente essas relações.  
5. Concluiu-se que existe uma grande variedade de relações entre o coeficiente 
de partição 1-octanol/água e outras propriedades das substâncias, com im ­
portância ao nível da química e toxicologia ambientais. Assim, o coeficiente de partição 1-octanol/água tem vindo a tornar-se um parâmetro fundamental 
na avaliação do risco ambiental dos produtos químicos e na previsão do 
destino desses produtos no ambiente.
 
Âmbito de aplicação  
6. O método da agitação lenta foi concebido para reduzir a formação de 
microgotículas de 1-octanol na fase aquosa. Nessas condições, já não se 
verifica a sobrestimação da concentração na fase aquosa, devida à associa ­
ção de moléculas da substância em estudo a essas gotículas. O método da agitação lenta é, portanto, particularmente adequado para a determinação do P
 OW de substâncias com log P  OW previsto igual ou superior a 5, caso em 
que o método do frasco com agitação (2) tende a fornecer resultados erró ­
neos. ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 161
 
DEFINIÇÃO E UNIDADES  
7. O coeficiente de partição de uma substância entre a água e um solvente 
lipofílico (1-octanol) caracteriza a distribuição no equilíbrio do produto químico entre as duas fases. O coeficiente de partição entre a água e o 1- 
-octanol (P
 OW ) é definido como a razão entre a concentração, no equilíbrio 
(C O ), da substância em estudo em 1-octanol saturado com água e a concen ­
tração, no equilíbrio (C  W ), da substância em estudo em água saturada com 
1-octanol.  
P OW ¼ C O=C W 
Como se trata de um quociente de concentrações, é uma grandeza adimen ­
sional. É mais frequentemente apresentado como logaritmo decimal (log 
P OW ). Dado que o P  OW depende da temperatura, os dados apresentados 
devem mencionar a temperatura das determinações.  
PRINCÍPIO DO MÉTODO  
8. Para a determinação do coeficiente de partição, estabelece-se um equilíbrio 
entre a água, o 1-octanol e a substância em estudo, a temperatura constante, 
determinando-se em seguida a concentração da substância em estudo nas 
duas fases.  
9. As dificuldades experimentais ligadas à formação de microgotículas 
durante o ensaio do frasco com agitação podem ser atenuadas no ensaio 
de agitação lenta aqui proposto. No ensaio de agitação lenta, estabelece-se um equilíbrio entre a água, o 1-octanol e a substância em estudo, num reator com agitação termostatizado. As transferências de uma fase para a outra são 
aceleradas pela agitação. Esta provoca um grau de turbulência limitado, que 
favorece as transferências entre o 1-octanol e a água, sem formação de microgotículas (1).
 
APLICABILIDADE DO ENSAIO  
10. Dado que a presença de substâncias diversas da substância em estudo pode 
influenciar o coeficiente de atividade desta última, a substância em estudo 
utilizada nos ensaios deve ser pura. Na determinação de coeficientes de 
partição 1-octanol/água devem ser utilizadas substâncias com o maior grau de pureza disponível no comércio.
 
11. O presente método aplica-se a substâncias puras que não se dissociem nem 
associem, nem apresentem atividade interfacial significativa. Pode utilizar-se na determinação do coeficiente de partição 1-octanol/água de substâncias com essas características ou de misturas dessas substâncias. Se o método for 
utilizado para misturas, os coeficientes de partição 1-octanol/água determi ­
nados dependerão da composição química da mistura estudada e da com ­
posição eletrolítica da fase aquosa. Desde que seja devidamente complemen ­
tado, o método também é aplicável a compostos dissociáveis ou associáveis 
(ver o ponto 12).
 
12. Devido aos equilíbrios múltiplos que se geram na água e no 1-octanol e 
influenciam a partição 1-octanol/água das substâncias dissociáveis, como os ácidos orgânicos e os fenóis, as bases orgânicas e as substâncias organo ­
metálicas, o coeficiente de partição 1-octanol/água é uma constante forte ­
mente dependente da composição eletrolítica (7)(8). A determinação deste coeficiente exige, portanto, o controlo e registo do pH e da composição eletrolítica durante o ensaio. A avaliação de coeficientes de partição cabe a 
especialistas. Com base na(s) constante(s) de dissociação, há que selecionar 
valores de pH adequados, de modo a poder determinar-se um coeficiente de partição para cada estado de ionização. O estudo de compostos organome ­
tálicos exige a utilização de tampões não complexantes (8). As condições 
experimentais devem ser escolhidas tendo em conta os conhecimentos atuais 
no domínio da química em fase aquosa (constantes de complexação, cons ­
tantes de dissociação) e de modo a poder prever-se que espécies da subs ­
tância em estudo estarão presentes nessa fase. A força iónica deverá ser a 
mesma em todos os ensaios efetuados, utilizando-se para o efeito um ele ­
trólito apropriado.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 162
 
13. As substâncias com baixa hidrossolubilidade ou P  OW elevado podem difi ­
cultar os ensaios, devido ao facto de as concentrações na fase aquosa se 
tornarem muito baixas e ser difícil a sua determinação rigorosa. Na des ­
crição deste método de ensaio explica-se como ultrapassar o problema.  
INFORMAÇÕES SOBRE A SUBSTÂNCIA EM ESTUDO  
14. Os reagentes químicos devem ser de qualidade analítica ou de grau de 
pureza superior. Recomenda-se a utilização de substâncias em estudo não marcadas, de composição química conhecida (de preferência, pelo menos 99 % puras), ou marcadas com isótopos radioativos, de composição química 
e grau de pureza radioquímica conhecidos. No caso de marcadores com 
período de semidesintegração curto, será necessário efetuar as correções devidas à desintegração. No caso de substâncias em estudo marcadas com isótopos radioativos, deve recorrer-se a um método analítico específico da 
substância, para garantir que a radioatividade medida esteja diretamente 
relacionada com a substância em causa.
 
15. Pode estimar-se o log P  OW utilizando  software  disponível no mercado para 
esse efeito, ou com base na razão entre a solubilidade em cada um dos solventes.
 
16. Antes de se proceder a um ensaio de agitação lenta para determinação de 
um P  OW , deve dispor-se das seguintes informações sobre a substância em 
estudo:  
a) fórmula estrutural;  
b) métodos analíticos adequados para determinar a concentração da subs ­
tância em água e em 1-octanol;  
c) constante(s) de dissociação, no caso das substâncias ionizáveis (Orienta ­
ções n.  o 112 da OCDE) (9);  
d) hidrossolubilidade (10);  
e) hidrólise abiótica (11);  
f) biodegradabilidade "fácil" (12);  
g) pressão de vapor (13).  
DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
Material e aparelhagem  
17. É necessário o material de laboratório de uso corrente, nomeadamente o 
seguinte:  
— agitadores magnéticos e barras magnéticas revestidas de Teflon, para 
agitar a fase aquosa,  
— aparelhagem analítica adequada para determinar as concentrações espe ­
radas da substância em estudo,  
— recipiente de agitação com uma torneira no fundo. Em função do log 
P OW previsto e do limite de deteção (LOD) do composto em estudo, 
ponderar-se-á a utilização de um recipiente de reação com a mesma 
geometria e volume superior a um litro, para se obter um volume de água suficiente para a extração e a análise químicas. Este procedimento permitirá obter concentrações mais elevadas no extrato aquoso e possi ­
bilitará, portanto, uma determinação analítica mais fiável. Figura no 
apêndice 1 um quadro de estimativas do volume mínimo necessário, em função do LOD, do log P
 OW estimado e da hidrossolubilidade do 
composto. O quadro tem por base a relação entre o log P  OW e a razão 
das solubilidades em octanol e em água, segundo Pinsuwan  et al.  (14):  
log P  OW ¼ 0; 88 log SR þ 0; 41 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 163
 
em que:  
SR ¼ S octanol =S água (em molaridade),  
bem como a relação apresentada por Lyman (15) para estimativas de 
hidrossolubilidade. As hidrossolubilidades calculadas através da equação do apêndice 1 devem considerar-se uma primeira estimativa. Note-se que 
o utilizador é livre de efetuar estimativas da hidrossolubilidade por meio 
de qualquer correspondência que se considere representar melhor a re ­
lação entre a hidrofobicidade e a solubilidade. Por exemplo, no caso dos compostos sólidos, recomenda-se que o ponto de fusão seja tido em 
conta nas previsões de solubilidade. Se for utilizada uma equação mo ­
dificada, deve garantir-se a validade da equação utilizada para o cálculo da solubilidade em octanol. A figura do apêndice 2 esquematiza um recipiente de agitação, com camisa de vidro, com cerca de um litro de 
capacidade. As proporções do recipiente ilustrado no apêndice 2 
revelaram-se favoráveis e, se forem utilizados recipientes de volume diferente, devem ser mantidas;
 
— um meio de manter a temperatura constante (aspeto essencial) durante o 
ensaio com agitação lenta.  
18. Os recipientes devem ser de um material inerte, para que a adsorção à sua 
superfície seja insignificante.  
Preparação das soluções a utilizar nos ensaios  
19. A determinação do P  OW deve ser efetuada com 1-octanol do grau de pureza 
mais elevado disponível no mercado (grau de pureza mínimo de 99 %). 
Recomenda-se a purificação do 1-octanol por extração ácida, básica e com água, seguida de secagem. Também pode purificar-se o 1-octanol por destilação. Na preparação das soluções-padrão da substância em estudo deve 
utilizar-se 1-octanol purificado. A água a utilizar na determinação do P
 OW 
deve ser destilada em material de vidro ou de quartzo ou ser proveniente de 
um sistema de purificação ou ser própria para HPLC. A água destilada deve ser filtrada através de um filtro de 0,22 μm e devem ser previstos ensaios 
em branco, para verificar se os extratos concentrados contêm impurezas que 
possam interferir com a substância em estudo. Caso se utilize um filtro de fibra de vidro, este deve ser limpo por aquecimento em estufa, durante pelo menos três horas, a 400 °C.
 
20. Antes do ensaio, os solventes são mutuamente saturados e levados ao equi ­
líbrio num recipiente suficientemente grande. Para o efeito, o sistema cons ­
tituído pelas duas fases é mantido sob agitação durante dois dias.  
21. Toma-se e dissolve-se em 1-octanol (saturado com água) um volume apro ­
priado, à concentração requerida, da substância em estudo. O coeficiente de partição 1-octanol/água tem de ser determinado em soluções diluídas em 1- -octanol e em água. A concentração da substância em estudo não deve, 
portanto, exceder 70 % da solubilidade desta, sendo 0,1 M a concentração 
máxima em cada fase (1). As soluções de 1-octanol utilizadas no ensaio não podem conter partículas sólidas, em suspensão, da substância em estudo.
 
22. Dissolve-se em 1-octanol (saturado com água) uma quantidade apropriada 
da substância em estudo. Se for previsto um log P  OW superior a cinco, as 
soluções de 1-octanol utilizadas no ensaio não devem conter partículas sólidas, em suspensão, da substância em estudo. Para o efeito, proceder-se-á do seguinte modo, no caso dos produtos químicos com log 
P
 OW superior a 5:  
— dissolve-se a substância em estudo em 1-octanol (saturado com água),  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 164
 
— deixa-se a solução em repouso durante um período suficiente para que a 
substância sólida em suspensão deposite. Durante a decantação, mede-se 
continuamente a concentração da substância em estudo,  
— depois de as concentrações medidas na solução de 1-octanol terem es ­
tabilizado, dilui-se a solução de reserva com um volume apropriado de 1-octanol,
 
— determina-se a concentração da solução de reserva diluída. Se a concen ­
tração determinada for coerente com a diluição, pode utilizar-se a solu ­
ção de reserva diluída no ensaio de agitação lenta.  
Extração e análise das amostras  
23. Na determinação da substância em estudo deve utilizar-se um método ana ­
lítico validado. Os investigadores terão de demonstrar que, durante o ensaio, 
as concentrações na fase de 1-octanol saturado em água e na fase aquosa 
saturada em 1-octanol são superiores ao limite de quantificação do método analítico utilizado. Se houver que recorrer a métodos de extração, será necessário determinar as recuperações analíticas da substância em estudo 
da fase aquosa e da fase de 1-octanol. O sinal analítico deve ser corrigido 
em função dos brancos e devem tomar-se as precauções necessárias para não haver transferências da substância em análise entre amostras.
 
24. Antes da análise, e em caso de concentrações baixas de substâncias em 
estudo hidrofóbicas na fase aquosa, é provável que seja necessário extrair 
a fase aquosa com um solvente orgânico e preconcentrar o extrato. Pela mesma razão, é necessário reduzir as concentrações finais nos brancos. Para o efeito, há que utilizar solventes de elevada pureza, de preferência solven ­
tes para análise de resíduos. Por outro lado, a utilização de material de vidro 
cuidadosamente limpo (por lavagem com solventes ou aquecimento a alta temperatura) pode ajudar a evitar contaminações cruzadas.
 
25. Para estimar o valor de log P  OW , pode utilizar-se um programa de estima ­
tivas ou recorrer-se a uma avaliação especializada. Se o valor for superior a 
6, terá de se prestar muita atenção às correções em função dos brancos e às transferências da substância em análise. Além disso, se a estimativa de log P
 OW for superior a 6, é obrigatório utilizar um padrão paralelo para corrigir 
a taxa de recuperação, de modo a obterem-se fatores de preconcentração 
elevados. Existem no mercado vários programas de  software  que fornecem 
estimativas de log P  OW , nomeadamente o Clog P (16), o KOWWIN (17), o 
ProLogP (18) e o ACD log P (19) (  1 ). As referências 20 a 22 descrevem os 
métodos de estimativa.  
26. Os limites de quantificação (LOQ) da substância em estudo em 1-octanol e 
em água determinam-se por métodos bem estabelecidos. Como regra prática, o limite de quantificação de um método corresponde à concentração em 
água ou em 1-octanol que gera um sinal dez vezes mais intenso que o 
ruído. Há que escolher um método adequado de extração e de preconcen ­
tração e também que especificar as recuperações analíticas. Deve selecionar-se um fator de preconcentração adequado, que permita obter 
sinais da intensidade requerida na determinação analítica.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 165  
( 1 ) Esta informação é prestada apenas a título indicativo. Podem ser utilizados programas 
informáticos equivalentes, desde que permitam obter resultados comprovadamente idên ­
ticos.
 27. Com base nos parâmetros do método analítico e nas concentrações espera ­
das, define-se um tamanho de amostra aproximado para a determinação 
rigorosa da concentração do composto em causa. Para se obterem sinais analíticos suficientes, deve evitar-se a utilização de amostras aquosas dema ­
siado pequenas. Também deve evitar-se utilizar amostras aquosas demasiado 
grandes; caso contrário, a água disponível pode não ser suficiente para o 
número mínimo de análises exigido (n = 5). No apêndice 1, apresenta-se o volume mínimo de amostra em função do volume do recipiente, do LOD da substância em estudo e da solubilidade desta última.
 
28. A quantificação das substâncias em estudo efetua-se por comparação com 
curvas de calibração do composto em causa. As concentrações nas amostras analisadas devem estar compreendidas entre concentrações de padrões.
 
29. No caso das substâncias cuja estimativa de log P  OW seja superior a 6, há 
que adicionar um padrão paralelo à amostra aquosa antes da extração, para contabilizar as perdas ocorridas durante a extração e a preconcentração de 
amostras aquosas. Para possibilitar uma correção rigorosa da taxa de recu ­
peração, os padrões paralelos devem ter propriedades muito próximas ou idênticas às da substância em estudo. De preferência, são utilizados análogos das substâncias em causa marcados com isótopos estáveis (por exemplo, 
análogos perdeuterados ou marcados com
 13 C). Se não for possível utilizar 
isótopos marcadores estáveis (  13 C ou  2 H), haverá que demonstrar, com base 
em dados fiáveis recolhidos na literatura científica, que as propriedades físico-químicas do padrão paralelo são muito próximas das propriedades 
da substância em estudo. Durante a extração líquido-líquido da fase aquosa, 
podem formar-se emulsões. Estas podem reduzir-se por adição de sal ou deixando-as decantar de um dia para o outro. Os métodos utilizados para extrair e preconcentrar as amostras devem ser indicados nos relatórios.
 
30. Antes de serem analisadas, as amostras tomadas da fase de 1-octanol podem, 
se necessário, diluir-se com um solvente adequado. Além disso, no caso das 
substâncias cujos ensaios de recuperação revelem grandes variações nos 
mesmos (desvio-padrão relativo superior a 10 %), recomenda-se a utilização de padrões paralelos, para corrigir as taxas de recuperação.
 
31. Os relatórios devem incluir uma descrição do método analítico que incida na 
técnica de extração, nos fatores de preconcentração e de diluição, nos pa ­
râmetros instrumentais, nas rotinas e no intervalo de calibração, na recupe ­
ração analítica da substância em estudo da fase aquosa, na adição de padrões 
paralelos para corrigir as taxas de recuperação, nos valores dos brancos e 
nos limites de deteção e de quantificação.  
Realização do ensaio  
Razões volumétricas 1-octanol/água ótimas  
32. Ao escolher os volumes de água e de 1-octanol deve ter-se em conta o 
seguinte: o limite de quantificação em 1-octanol e em água, os fatores de preconcentração aplicados às amostras de água, os volumes das amostras de 
1-octanol e de água colhidas e as concentrações previstas. Por razões ex ­
perimentais, o volume de 1-octanol no sistema em agitação lenta deve ser escolhido de forma a obter-se uma fase de 1-octanol suficientemente espessa (mais de 0,5 cm), para que seja possível colher amostras dessa fase sem a 
perturbar.
 
33. Na determinação de compostos com log P  OW igual ou superior a 4,5, a 
relação entre os volumes de cada fase habitualmente utilizados é de 20 ml a 
50 ml de 1-octanol para 950 ml a 980 ml de água, num recipiente de um 
litro. ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 166
 
Condições de realização do ensaio  
34. O recipiente de reação deve manter-se termostatizado durante o ensaio, de 
modo que as variações de temperatura sejam inferiores a 1 °C. O ensaio deve ser efetuado a 25 °C.
 
35. Deve proteger-se o dispositivo experimental da luz solar, efetuando o ensaio 
em câmara escura ou cobrindo o recipiente de reação com folha de alumí ­
nio. 
36. Deve efetuar-se o ensaio num ambiente tão isento de poeiras quanto possí ­
vel. 
37. Agita-se o sistema 1-octanol/água até se atingir o equilíbrio. O período 
necessário é determinado num ensaio-piloto com agitação lenta, recolhendo-se regularmente amostras de água e de 1-octanol. O intervalo 
mínimo entre a colheita de amostras consecutivas é de cinco horas.
 
38. A determinação de um P  OW deve basear-se em, pelo menos, três ensaios 
com agitação lenta independentes.  
Determinação do tempo necessário para atingir o equilíbrio  
39. Considera-se que se atingiu o equilíbrio quando o gráfico da razão de 
concentrações 1-octanol/água em função do tempo, num período que abranja 
4 momentos de colheita de amostras, se caracterizar por um declive não significativamente diferente de zero, para p = 0,05 (limite de confiança de 95 %). Deve atingir-se o equilíbrio pelo menos um dia antes de se iniciar a 
colheita de amostras. Como regra prática, a colheita de amostras de subs ­
tâncias cuja estimativa de log P
 OW seja inferior a 5 pode ter lugar ao 
segundo e ao terceiro dias. Caso se trate de substâncias particularmente hidrofóbicas, o período necessário para se atingir o equilíbrio pode ter de 
ser alargado. No caso de um composto com log P
 OW de 8,23 (decaclorobi ­
fenilo), bastaram 144 horas para se atingir o equilíbrio. As amostras para determinação do estado de equilíbrio colhem-se num único recipiente.
 
Início do ensaio  
40. No início do ensaio, enche-se o recipiente de reação com água saturada de 
1-octanol. Deve esperar-se tempo suficiente para atingir a temperatura ter ­
mostatizada.  
41. Adiciona-se cuidadosamente ao recipiente de reação a quantidade pretendida 
da substância em estudo dissolvida no volume requerido de 1-octanol satu ­
rado com água. Esta etapa é crucial no ensaio, havendo que evitar uma 
mistura turbulenta das duas fases. Para o efeito, pode pipetar-se lentamente o 1-octanol contra a parede do recipiente, junto à superfície da água, de modo que escorra ao longo da parede de vidro e forme um filme por cima 
da fase aquosa. É totalmente de excluir que o 1-octanol seja simplesmente 
vertido para o recipiente. É igualmente de excluir que se deixem cair gotas de 1-octanol diretamente na água.
 
42. Depois de iniciada a agitação, deve aumentar-se gradualmente a velocidade 
desta. Se o motor de agitação não puder ser convenientemente regulado, deve ponderar-se a utilização de um transformador. Importa regular a velo ­
cidade de agitação de modo a formar-se um vórtice de profundidade com ­
preendida entre 0,5 cm e 2,5 cm na interface entre a água e o 1-octanol. Se a profundidade do vórtice exceder 2,5 cm, deve reduzir-se a velocidade de agitação; caso contrário, poderão formar-se microgotículas na fase aquosa, a 
partir das gotas de 1-octanol geradas, com a consequente sobrestimação da 
concentração da substância em estudo na água. A velocidade de agitação que gera o vórtice máximo de 2,5 cm é recomendada com base nas con ­
clusões de um estudo de validação interlaboratorial (5). Constitui um com ­
promisso entre a rapidez com que se atinge o equilíbrio e a limitação da 
formação de microgotículas de 1-octanol.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 167
 
Colheita e tratamento das amostras  
43. Antes da colheita das amostras, deve desligar-se o agitador e esperar-se 
que os líquidos se imobilizem. Depois de colhidas as amostras, volta a pôr-se o agitador lentamente em movimento, conforme descrito acima, 
aumentando-se gradualmente a velocidade de agitação.
 
44. Colhem-se as amostras da fase aquosa à saída da torneira existente no fundo 
do recipiente de reação. Rejeitar sempre o volume morto de água retido na torneira (cerca de 5 ml no recipiente ilustrado no apêndice 2); a água retida 
na torneira não é agitada e, portanto, não se encontra em equilíbrio com o 
resto do líquido. Registar o volume das amostras de água e não esquecer que a quantidade de substância em estudo presente na água rejeitada deve ser tida em conta no balanço de massas. Para minimizar as perdas por 
evaporação, deve verter-se cuidadosamente a água na ampola de decantação, 
de modo a não perturbar a interface água/1-octanol.
 
45. Constituem-se amostras de 1-octanol retirando uma pequena alíquota (cerca 
de 100 μl) da fase de 1-octanol, com uma seringa de vidro e metal de 100 
microlitros. Devem tomar-se as precauções necessárias para não perturbar a 
interface. Registar o volume das amostras. É suficiente uma alíquota de pequeno volume, pois a amostra de 1-octanol vai ser diluída.
 
46. Devem evitar-se transferências desnecessárias das amostras. Para isso, deve 
determinar-se gravimetricamente o volume das amostras. No caso das amos ­
tras de água, poderá recolher-se cada amostra numa ampola de decantação que contenha já o volume de solvente necessário.
 
DADOS E RELATÓRIOS  
47. Este método de ensaio prevê a determinação do coeficiente de partição 1- 
-octanol/água (P  OW ) com base em três ensaios com agitação lenta (três 
unidades experimentais), em condições idênticas, do composto em estudo. 
A correspondência utilizada para demonstrar que o equilíbrio foi atingido deve basear-se nos resultados de, pelo menos, quatro determinações de C
 O /C W em momentos consecutivos de colheita de amostras. Pode, assim, 
calcular-se a variância, como medida da incerteza do valor médio obtido em 
cada unidade experimental.  
48. Pode caracterizar-se o valor de P  OW pela variância dos resultados obtidos 
em cada unidade experimental. Utiliza-se esta informação para calcular o 
P OW como média ponderada dos resultados obtidos em cada uma das uni ­
dades. Para isso, utiliza-se como fator de ponderação o inverso da variância dos resultados de cada unidade experimental. Consequentemente, os dados com maior variação (expressa pela variância) e, portanto, menos fiáveis têm 
menos influência no resultado final do que os dados com menor variância.
 
49. Calcula-se também, de modo análogo, um desvio-padrão ponderado. Este 
parâmetro caracteriza a repetibilidade da medição do P  OW . Um valor baixo 
de desvio-padrão ponderado indica uma repetibilidade elevada da determi ­
nação de P  OW num laboratório. Resume-se a seguir o tratamento estatístico 
formal dos dados.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 168
 
Tratamento dos resultados  
Demonstração de que se atingiu o equilíbrio  
50. Calcula-se, para cada momento de colheita de amostras, o logaritmo da 
razão entre a concentração da substância em estudo em 1-octanol e em água [log (C
 O /C W )]. Comprova-se se o equilíbrio foi atingido representado 
graficamente essa razão em função do tempo. Se, nessa representação, for 
definido um patamar que abranja pelo menos quatro momentos consecutivos 
de colheita de amostras, o equilíbrio terá sido atingido e o composto estará verdadeiramente dissolvido no 1-octanol. Caso contrário, será necessário prosseguir o ensaio, até que quatro pontos consecutivos de colheita de 
amostras gerem um declive não significativamente diferente de zero, para 
p = 0,05, indicando assim que o parâmetro log (C
 O /C W ) é independente do 
tempo.  
Cálculo de log P  OW 
51. O valor de log P  OW de cada unidade experimental corresponde ao valor 
médio ponderado de log (C  O /C W ) referente à parte da curva de log (C  O /C W ) 
em função do tempo na qual o equilíbrio foi comprovadamente atingido. 
Calcula-se essa média ponderando os dados com o inverso da variância, de modo que a influência dos dados no resultado final seja inversamente pro ­
porcional à incerteza dos mesmos.
 
Valor médio de log P  OW 
52. O valor médio do log P  OW de várias unidades experimentais corresponde à 
média dos resultados dessas unidades, ponderados com a variância da uni ­
dade respetiva.  
O cálculo a efetuar é o seguinte:  
log P  OW ;Av ¼ ðΣw i Ü log P  OW ;i Þ Ü ðΣw i Þ –1 
em que:  
log P  OW,i = valor do log P  OW da unidade experimental i;  
log P  OW,Av  = valor médio ponderado das determinações de log P  OW ; 
w i = ponderação estatística do valor de log P  OW correspondente à 
unidade experimental i.  
Como w  i utiliza-se o inverso da variância de log 
P OW,i [w i ¼ ðvar log P  OW ;i –1 Þ]. 
53. Como estimativa do erro do valor médio de log P  OW utiliza-se a repetibi ­
lidade do log (C  O /C W ) determinado para a fase de equilíbrio de cada uni ­
dade experimental. Exprime-se esse erro como o desvio-padrão ponderado de log P
 OW,Av  (σ log Pow,Av  ), o qual mede o erro associado a log P  OW,Av  . O 
desvio-padrão ponderado pode calcular-se do seguinte modo, a partir da 
variância ponderada  
var log Pow ;Av ¼ ðΣw i Ü ðlog P  OW ;i Ä log P  OW ;Av Þ 2 Þ Ü ðΣw i Ü ðn Ä 1ÞÞ –1 
σ log Pow ;Av ¼ ðvar log Pow ;Av Þ 0;5 
O símbolo "n" corresponde ao número de unidades experimentais.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 169
 
Relatório dos ensaios  
54. Elementos a constar do relatório dos ensaios:  
Substância em estudo:  
— nome comum, denominação química, número CAS, fórmula estrutural 
(indicando a posição marcada marcada com isótopos radioativos, se for esse o caso) e propriedades físico-químicas pertinentes (ver o ponto 17),
 
— grau de pureza da substância (presença de impurezas),  
— grau de pureza radioquímica da substância marcada e atividade molar (se 
for caso disso),  
— estimativa preliminar de log P  OW e método de cálculo utilizado para 
determinar esse valor.  
Condições de realização do ensaio:  
— datas da realização dos estudos,  
— temperatura durante os ensaios,  
— volumes de 1-octanol e de água no início de cada ensaio,  
— volumes das amostras de 1-octanol e de água colhidas,  
— volumes de 1-octanol e de água que permanecem nos recipientes de 
ensaio,  
— descrição dos recipientes de ensaio e das condições de agitação utiliza ­
dos (geometria da barra de agitação e do recipiente de ensaio, altura do 
vórtice, em milímetros, e, quando conhecida, velocidade de agitação),  
— métodos de análise utilizados para determinar a substância em estudo e 
limite de quantificação dos mesmos,  
— cronologia das colheitas de amostras,  
— pH da fase aquosa e tampões utilizados, quando se regula o pH devido à 
presença de moléculas ionizáveis,  
— número de replicados.  
Resultados:  
— repetibilidade e sensibilidade dos métodos de análise utilizados,  
— concentrações determinadas da substância em estudo no 1-octanol e na 
água, em função do tempo,  
— balanço de massas,  
— temperatura e desvio-padrão da temperatura, ou intervalo de temperatu ­
ras, durante o ensaio,  
— gráfico da razão das concentrações em função do tempo,  
— valor médio log P  OW,Av  e erro-padrão do mesmo,  
— discussão e interpretação dos resultados,  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 170
 
— exemplos de dados não tratados de análises representativas (os dados 
não tratados devem ser todos registados de acordo com as boas práticas 
de laboratório), incluindo recuperações de padrões paralelos, número de níveis de concentração utilizado na calibração (juntamente com os cri ­
térios do coeficiente de correlação da curva de calibração) e resultados 
de controlo/garantia de qualidade,
 
— caso exista: relatório da validação do protocolo experimental (a mencio ­
nar nas referências).  
REFERÊNCIAS:  
(1) De Bruijn J.H.M., Busser F., Seinen W., Hermens J. (1989). Determination 
of octanol/water partition coefficients with the "slow-stirring" method.  En­
viron. Toxicol. Chem.  8:499-512.  
(2) Capítulo A.8 deste anexo, "Coeficiente de partição".  
(3) Capítulo A.8 deste anexo, "Coeficiente de partição".  
(4) OCDE (2000). OECD Draft Guideline for the Testing of Chemicals: 122, 
Partition Coefficient (n-Octanol/Water): pH-Metric Method for Ionisable Substances. Paris.
 
(5) Tolls J. (2002). Partition Coefficient 1-Octanol/Water (Pow) Slow-Stirring 
Method for Highly Hydrophobic Chemicals, Validation Report. RIVM contract-Nrs 602730 M/602700/01.
 
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Schwarzenbach R.P. (1997). Aqueous speciation and 1-octanol-water parti ­
tioning of tributyl- and triphenyltin: effect of pH and ion composition.  
Environ. Sci. Technol.  31:2596-2602.  
(9) OCDE (1981). OECD Guidelines for the Testing of Chemicals: 112, Dis ­
sociation Constants in Water. Paris.  
(10) Capítulo A.6 deste anexo, "Solubilidade em água".  
(11) Capítulo C.7 deste anexo, "Degradação – Degradação abiótica: Hidrólise em 
função do pH".  
(12) Capítulo C.4, "Determinação da biodegradabilidade 'Fácil'", partes II a VII 
(métodos A a F), deste anexo.  
(13) Capítulo A.4 deste anexo, "Pressão de vapor".  
(14) Pinsuwan S., Li A., Yalkowsky S.H. (1995). Correlation of octanol/water 
solubility ratios and partition coefficients.  J. Chem. Eng. Data  40:623-626.  
(15) Lyman W.J. (1990). Solubility in water.  In: Handbook of Chemical Pro ­
perty Estimation Methods: Environmental Behavior of Organic Compounds. Lyman W.J., Reehl W.F., Rosenblatt D.H. Eds. American Chemical Socie ­
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(16) Leo A., Weininger D. (1989). Medchem Software Manual. Daylight Che ­
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(18) Compudrug L. (1992). ProLogP. Compudrug, Ltd., Budapest.  
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An extension to a 1 000 data point set.  Eur. J. Med. Chem. Chim. Ther.  
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(22) Jübermann O. (1958). Houben-Weyl, ed.,  Methoden der Organischen Che ­
mie: 386-390.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 172
 
Apêndice 1  
Tabela para o cálculo do volume mínimo de água necessário para a deteção, 
em fases aquosas, de substâncias em estudo com diferentes valores de 
log P  OW 
Pressupostos:  
— Volume máximo de cada alíquota = 10 % do volume total; 5 alíquotas = 
50 % do volume total.  
— Concentração da substância em estudo  ¼ 0; 7 Ü solubilidade em cada fase . 
Se a concentração for mais baixa, serão necessários volumes maiores.  
— Volume utilizado para determinar o limite de deteção (LOD) = 100 ml.  
— As relações log P  OW em função de log S  W e log P  OW em função de SR 
(solubilidade relativa, S  O /S W ) traduzem com razoabilidade relações eviden ­
ciadas pelas substâncias às quais o método se aplica.  
Estimativa de S  W 
log P  OW Equação log S  W S W (mg/l)  
4 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,496 3,133E+00 
4,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 0,035 1,084E+00 
5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 0,426 3,750E-01 
5,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 0,887 1,297E-01 
6 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 1,348 4,487E-02 
6,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 1,809 1,552E-02 
7 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 2,270 5,370E-03 
7,5 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 2,731 1,858E-03 
8 ð –Þ0; 922 Ü log P  ow þ 4; 184 – 3,192 6,427E-04  
Estimativa de S  O 
log P  OW Equação S  O (mg/l)  
4 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 41 3,763E+04 
4,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 42 4,816E+04 
5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 43 6,165E+04 
5,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 44 7,890E+04 
6 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 45 1,010E+05 
6,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 46 1,293E+05 
7 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 47 1,654E+05 
7,5 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 48 2,117E+05 
8 log P  ow ¼ 0; 88log SR þ 0; 49 2,710E+05  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 173
 
Massa total da 
substância em 
estudo 
(mg) Massa  octanol  / 
Massa  água Massa  água 
(mg) Concentração  água 
(mg/l) Massa  octanol  
(mg) Concentração  octanol  
(mg/l)  
1 319 526 2,5017 2,6333 1 317 26 333 
1 686 1 664 1,0127 1,0660 1 685 33 709 
2 158 5 263 0,4099 0,4315 2 157 43 149 2 762 16 644 0,1659 0,1747 2 762 55 230 3 535 52 632 0,0672 0,0707 3 535 70 691 4 524 1664 36 0,0272 0,0286 4 524 90 480 5 790 5263 16 0,0110 0,0116 5 790 115 807 
7 411 1 664 357 0,0045 0,0047 7 411 148 223 
9 486 5 263 158 0,0018 0,0019 9 486 189 713
 
Cálculo dos volumes  
Volume mínimo da fase aquosa, em função do limite de deteção (LOD)  
log K  OW LOD (microgramas/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 0,04 0,38 3,80 38 380 
4,5 0,09 0,94 9,38 94 938 
5 0,23 2,32 23,18 232 2 318 
5,5 0,57 5,73 57,26 573 5 726 
6 1,41 14,15 141 1 415 14 146 
6,5 3,50 34,95 350 3 495 34 950 
7 8,64 86,35 864 8 635 86 351 
7,5 21,33 213 2 133 21 335 213 346 
8 52,71 527 5 271 52 711 527 111 
Volume utilizado 
na determinação 
do LOD (l) 0,1 
Legenda  
Representa menos de 10 % do volume total de fase aquosa, com um recipiente 
de equilíbrio de um litro.  
Representa menos de 10 % do volume total de fase aquosa, com um recipiente 
de equilíbrio de dois litros.  
Representa menos de 10 % do volume total de fase aquosa, com um recipiente 
de equilíbrio de cinco litros.  
Representa menos de 10 % do volume total de fase aquosa, com um recipiente 
de equilíbrio de 10 litros.  
Excede 10 % do volume até do recipiente de equilíbrio de 10 litros.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 174
 
Resumo dos volumes necessários, em função da hidrossolubilidade e do log P  OW 
Volume mínimo (ml) da fase aquosa, em função do limite de deteção (LOD)  
log P  OW S W (mg/l) LOD (microgramas/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
4 10 0,01 0,12 1,19 11,90 118,99 
5 0,02 0,24 2,38 23,80 237,97 3 0,04 0,40 3,97 39,66 396,62 1 0,12 1,19 11,90 118,99 1 189,86 
4,5 5 0,02 0,20 2,03 20,34 203,37 
2 0,05 0,51 5,08 50,84 508,42 
1 0,10 1,02 10,17 101,68 1 016,83 
0,5 0,20 2,03 20,34 203,37 2 033,67 
5 1 0,09 0,87 8,69 86,90 869,01 
0,5 0,17 1,74 17,38 173,80 1 738,02 
0,375 0,23 2,32 23,18 231,75 2 317,53 
0,2 0,43 4,35 43,45 434,51 4 345,05 
5,5 0,4 0,19 1,86 18,57 185,68 1 856,79 
0,2 0,37 3,71 37,14 371,36 3 713,59 0,1 0,74 7,43 74,27 742,72 7 427,17 
0,05 1,49 14,85 148,54 1 485,43 14 854,35 
6 0,1 0,63 6,35 63,48 634,80 6 347,95 
0,05 1,27 12,70 126,96 1 269,59 12 695,91 
0,025 2,54 25,39 253,92 2 539,18 25 391,82 
0,0125 5,08 50,78 507,84 5 078,36 50 783,64 
6,5 0,025 2,17 21,70 217,02 2 170,25 21 702,46 
0,0125 4,34 43,40 434,05 4 340,49 43 404,93 
0,006 9,04 90,43 904,27 9 042,69 90 426,93 
0,003 18,09 180,85 1 808,54 18 085,39 180 853,86 
7 0,006 7,73 77,29 772,89 7 728,85 77 288,50 
0,003 15,46 154,58 1 545,77 15 457,70 154 577,01 
0,0015 23,19 231,87 2 318,66 23 186,55 231 865,51 
0,001 46,37 463,73 4 637,31 46 373,10 463 731,03 
7,5 0,002 19,82 198,18 1 981,77 19 817,73 198 177,33 
0,001 39,64 396,35 3 963,55 39 635,47 396 354,66 
0,0005 79,27 792,71 7 927,09 79 270,93 792 709,32
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 175
 
log P  OW S W (mg/l) LOD (microgramas/l) → 0,001 0,01 0,10 1,00 10  
0,00025 158,54 1 585,42 15 854,19 158 541,86 1 585 418,63 
8 0,001 33,88 338,77 3 387,68 33 876,77 338 767,72 
0,0005 67,75 677,54 6 775,35 67 753,54 677 535,44 
0,00025 135,51 1 355,07 13 550,71 135 507,09 1 355 070,89 
0,000125 271,01 2 710,14 27 101,42 271 014,18 2 710 141,77 
Volume utilizado na de ­
terminação do LOD (l) 0,1 
Apêndice 2  
Exemplo de recipiente com camisa de vidro para o ensaio com agitação 
lenta, para determinação do P  OW
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 176
 
PARTE B: MÉTODOS PARA A DETERMINAÇÃO DA TOXICIDADE E 
DE OUTROS EFEITOS NA SAÚDE  
ÍNDICE 
INTRODUÇÃO GERAL 
B.1.bis. TOXICIDADE ORAL AGUDA — PROCEDIMENTO DE DOSE 
FIXA 
B.1.tris. TOXICIDADE ORAL AGUDA — MÉTODO DE CLASSIFICA ­
ÇÃO DE TOXICIDADE AGUDA 
B.2. TOXICIDADE AGUDA POR INALAÇÃO B.3. TOXICIDADE AGUDA (DÉRMICA) B.4. TOXICIDADE AGUDA: IRRITAÇÃO/CORROSÃO DÉRMICA B.5. TOXICIDADE AGUDA: IRRITAÇÃO/CORROSÃO OCULAR B.6. SENSIBILIZAÇÃO CUTÂNEA B.7. ESTUDO DA TOXICIDADE ORAL POR DOSE REPETIDA 
DURANTE 28 DIAS EM ROEDORES 
B.8. TOXICIDADE SUBAGUDA POR INALAÇÃO: ESTUDO DE 
28 DIAS 
B.9. TOXICIDADE (DÉRMICA) DA DOSE REPETIDA (28 DIAS) B.10. MUTAGENICIDADE — ENSAIO  IN VITRO  DE ABERRA ­
ÇÕES CROMOSSÓMICAS EM MAMÍFEROS 
B.11. MUTAGENICIDADE — ENSAIO  IN VIVO  DE ABERRAÇÕES 
CROMOSSÓMICAS EM CÉLULAS DA MEDULA DE MAMÍ ­
FEROS 
B.12. MUTAGENICIDADE — ENSAIO  IN VIVO  DOS MICRONÚ ­
CLEOS EM ERITRÓCITOS DE MAMÍFEROS 
B.13/14. MUTAGENICIDADE — ENSAIO DE MUTAÇÃO REVERSA 
EM BACTÉRIAS 
B.15. TESTES DE MUTAGÉNESE E DESPISTE DE CARCINOGÉ ­
NESE MUTAÇÃO GÉNICA —  SACCHAROMYCES CEREVI ­
SIAE  
B.16. RECOMBINAÇÃO MITÓTICA —  SACCHAROMYCES CERE ­
VISIAE  
B.17. MUTAGENICIDADE — ENSAIO DE MUTAÇÃO GÉNICA 
EM CÉLULAS DE MAMÍFEROS  IN VITRO  
B.18. LESÃO E REPARAÇÃO DO ADN — SÍNTESE NÃO PRO ­
GRAMADA — CÉLULAS DE MAMÍFERO  IN VITRO  
B.19. TESTE  IN VITRO  DE TROCA ENTRE CROMÁTIDES DO 
MESMO CROMOSSOMA 
B.20. TESTE DE LETALIDADE RECESSIVA LIGADA AO SEXO 
NA DROSOPHILA MELANOGASTER
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 177
 
B.21. TESTES DE TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS DE MAMÍ ­
FERO  IN VITRO  
B.22. TESTE DE LETALIDADE DOMINANTE NO ROEDOR 
B.23. ENSAIO DE ABERRAÇÕES CROMOSSÓMICAS EM ESPER ­
MATOGÓNIAS DE MAMÍFERO 
B.24. TESTE DAS MALHAS ( SPOT-TEST ) NO RATINHO 
B.25. TRANSLOCAÇÃO HEREDITÁRIA NO RATINHO B.26. ENSAIO DE TOXICIDADE ORAL SUBCRÓNICA ESTUDO 
DE TOXICIDADE ORAL DE DOSE REPETIDA EM ROEDO ­
RES COM A DURAÇÃO DE 90 DIAS 
B.27. ENSAIO DE TOXICIDADE ORAL SUBCRÓNICA ESTUDO 
DE TOXICIDADE ORAL DE DOSE REPETIDA EM ESPÉCIES NÃO ROEDORAS COM A DURAÇÃO DE 90 DIAS 
B.28. TOXICIDADE DÉRMICA SUBCRÓNICA: TESTE DE DOSE 
REPETIDA POR VIA DÉRMICA, A NOVENTA DIAS, EM ROEDORES 
B.29. TOXICIDADE SUBCRÓNICA POR INALAÇÃO: ESTUDO DE 
90 DIAS 
B.30. ESTUDOS DE TOXICIDADE CRÓNICA 
B.31. ESTUDO DE TOXICIDADE SOBRE O DESENVOLVIMENTO 
PRÉ-NATAL 
B.32. ESTUDOS DE CARCINOGENICIDADE 
B.33. ESTUDOS COMBINADOS DE TOXICIDADE CRÓNICA E 
CARCINOGENICIDADE 
B.34. TESTE DE TOXICIDADE SOBRE A REPRODUÇÃO EM UMA 
GERAÇÃO 
B.35. ESTUDO DE TOXICIDADE SOBRE A REPRODUÇÃO EM 
DUAS GERAÇÕES 
B.36. TOXICOCINÉTICA 
B.37. NEUROTOXICIDADE RETARDADA DE SUBSTÂNCIAS OR ­
GANOFOSFORADAS POR EXPOSIÇÃO AGUDA 
B.38. NEUROTOXICIDADE RETARDADA DE SUBSTÂNCIAS OR ­
GANOFOSFORADAS POR ADMINISTRAÇÃO REPETIDA A 
28 DIAS 
B.39. ENSAIO  IN VIVO  DA SÍNTESE NÃO PROGRAMADA (UDS) 
DE ADN EM CÉLULAS DO FÍGADO DE MAMÍFEROS 
B.40. CORROSÃO DA PELE  IN VITRO : ENSAIO DA RESISTÊNCIA 
ELÉCTRICA TRANSCUTÂNEA (RET) 
B.40.A. CORROSÃO DA PELE  IN VITRO : ENSAIO EM MODELOS DE 
PELE HUMANA
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 178
 
B.41. ENSAIO DE FOTOTOXICIDADE  IN VITRO  3T3 NRU 
B.42. SENSIBILIZAÇÃO CUTÂNEA: ENSAIO DE GÂNGLIOS LIN ­
FÁTICOS LOCAIS 
B.43. ESTUDO DE NEUROTOXICIDADE EM ROEDORES 
B.44. ABSORÇÃO CUTÂNEA: MÉTODO  IN VIVO  
B.45. ABSORÇÃO CUTÂNEA: MÉTODO  IN VITRO  
B.46. IRRITAÇÃO CUTÂNEA  IN VITRO : MÉTODO DE ENSAIO 
EM EPIDERME HUMANA RECONSTRUÍDA 
B.47. MÉTODO DE ENSAIO DE OPACIDADE E PERMEABILI ­
DADE DA CÓRNEA EM BOVINOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS QUE PRODUZAM CORROSÃO OU FORTE IRRITAÇÃO OCULAR 
B.48. MÉTODO DE ENSAIO EM OLHOS DE FRANGO ISOLADOS 
PARA IDENTIFICAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS QUE PRODU ­
ZAM CORROSÃO OU FORTE IRRITAÇÃO OCULAR 
B.49. ENSAIO  IN VITRO  DE MICRONÚCLEOS EM CÉLULAS DE 
MAMÍFEROS 
B.50. SENSIBILIZAÇÃO CUTÂNEA: ENSAIO DE GÂNGLIOS 
LINFÁTICOS LOCAIS: DA 
B.51. SENSIBILIZAÇÃO CUTÂNEA: ENSAIO DE GÂNGLIOS 
LINFÁTICOS LOCAIS: BRDU-ELISA
 
▼M4 
B.52. TOXICIDADE AGUDA POR INALAÇÃO — MÉTODO DE 
CLASSIFICAÇÃO DE TOXICIDADE AGUDA  
▼M5 
B.53. ESTUDO DE NEUROTOXICIDADE DURANTE O DESEN ­
VOLVIMENTO 
B.54. BIOENSAIO UTEROTRÓFICO EM ROEDORES: ENSAIO DE 
DESPISTAGEM A CURTO PRAZO DE PROPRIEDADES ES ­
TROGÉNICAS 
B.55. BIOENSAIO DE HERSHBERGER NO RATO: ENSAIO DE 
DESPISTAGEM A CURTO PRAZO DE PROPRIEDADES (ANTI)ANDROGÉNICAS 
B.56. ESTUDO ALARGADO DE TOXICIDADE DURANTE A RE ­
PRODUÇÃO NUMA GERAÇÃO 
B.57. ENSAIO DE ESTEROIDOGÉNESE H295R B.58. ENSAIOS DE MUTAÇÕES GENÉTICAS DAS CÉLULAS 
GERMINATIVAS E SOMÁTICAS DE ROEDORES TRANS ­
GÉNICOS
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 179
 
INTRODUÇÃO GERAL  
A. CARACTERIZAÇÃO DA SUBSTÂNCIA EM ESTUDO  
Antes de iniciar qualquer estudo de toxicidade devem conhecer-se a 
composição da substância em estudo, incluindo as principais impu ­
rezas que contenha, e as propriedades físico-químicas mais impor ­
tantes, nomeadamente a estabilidade.  
As propriedades físico-químicas da substância fornecem informações 
de relevo para a escolha da via de administração e a concepção de 
cada estudo específico, bem como para o manuseamento e a arma ­
zenagem da substância.  
O estudo deve ser precedido do desenvolvimento de um método 
analítico para a determinação qualitativa e quantitativa da substância 
em estudo (incluindo, sempre que possível, as principais impurezas) no meio de administração e no material biológico.
 
Devem incluir-se no relatório de ensaio todas as informações dispo ­
níveis referentes à identificação, às propriedades físico-químicas, à 
pureza e ao comportamento da substância em estudo.  
B. CUIDADOS COM OS ANIMAIS  
Nos estudos de toxicidade é fundamental efectuar um controlo estrito 
das condições ambientais e utilizar técnicas adequadas para o cui ­
dado dos animais.  
i) Condições de alojamento  
As condições ambientais nos locais ou recintos destinados aos ani ­
mais devem ser adequadas às espécies em estudo. Para ratos, rati ­
nhos e cobaias, a temperatura do local deve ser de 22  o C ± 3  o C e a 
humidade relativa de 30 % a 70 %; no que respeita aos coelhos, a 
temperatura ambiente deve ser de 20  o C ± 3  o C e a humidade 
relativa de 30 % a 70 %.  
Algumas técnicas experimentais são particularmente sensíveis aos 
efeitos da temperatura; em tais casos, a descrição do método de 
ensaio deve incluir pormenores relativos às condições adequadas. 
Em todos os ensaios de toxicidade, a temperatura e humidade devem ser controladas, registadas e referidas no relatório final.
 
A iluminação deve ser artificial, com uma alternância de 12 horas de 
luz e 12 horas de obscuridade. Os pormenores relativos à iluminação 
devem ser registados e incluídos no relatório final.  
Salvo especificação em contrário, os animais devem ser alojados 
individualmente ou em pequenos grupos do mesmo sexo. Em caso 
de alojamento colectivo, não devem colocar-se mais de 5 animais 
numa gaiola.  
Nos relatórios de experiências com animais, é conveniente indicar o 
tipo de gaiolas utilizadas e o número de animais alojados em cada 
gaiola, tanto durante o período de exposição à substância em estudo 
como durante o eventual período de observação subsequente.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 180
 
ii) Condições de alimentação  
A dieta deve satisfazer todos os requisitos nutricionais da espécie em 
estudo. No caso de as substâncias serem administradas aos animais na respectiva dieta, o valor nutricional da mesma pode ser reduzido 
pela interacção entre a substância e determinados constituintes da 
dieta. Essa possibilidade deve ser tida em conta na interpretação dos resultados dos ensaios. Podem utilizar-se dietas convencionais de laboratório, com um fornecimento ilimitado de água para beber. A 
escolha da dieta pode ser condicionada pela necessidade de assegurar 
a administração adequada da substância em estudo, caso se recorra a esta via.
 
Os eventuais contaminantes que influenciem a toxicidade não devem 
estar presentes em concentrações que possam interferir com os re ­
sultados.  
C. ENSAIOS ALTERNATIVOS  
A União Europeia está empenhada em promover a elaboração e 
validação de técnicas alternativas que forneçam a mesma quantidade de informações que os ensaios actuais em animais, mas que utilizem 
um número inferior de animais, lhes causem menor sofrimento ou 
evitem, de todo, o recurso aos mesmos.
 
Na caracterização dos riscos e consequente classificação e rotulagem 
dos produtos e para a avaliação da segurança química devem utilizar- -se, sempre que possível, métodos deste tipo, à medida que se encon ­
trem disponíveis.
 
D. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO  
Aquando da avaliação e interpretação dos ensaios devem ter-se em 
conta as limitações apresentadas pela extrapolação directa para o homem dos resultados obtidos em estudos com animais e  in vitro,  
pelo que, para a confirmação dos referidos resultados, devem utili ­
zar-se, sempre que se encontrem disponíveis, dados referentes a 
efeitos adversos no homem.
 
E. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS  
A maioria dos métodos apresentados foram elaborados no âmbito do 
programa da OCDE das directrizes em matéria de ensaios, devendo os mesmos ser executados em conformidade com as boas práticas de 
laboratório, de modo a garantir, na medida do possível, o reconhe ­
cimento mútuo dos resultados.
 
Podem obter-se informações adicionais nas referências incluídas nas 
directrizes da OCDE, bem como em outras publicações no domínio 
em causa.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 181
 
B.1.bis.  TOXICIDADE ORAL AGUDA — PROCEDIMENTO DE 
DOSE FIXA  
1. MÉTODO  
O presente método é equivalente ao «Test Guideline» TG 420 da 
OCDE (2001).  
1.1. INTRODUÇÃO  
Os métodos tradicionais de avaliação de toxicidade aguda utilizam a 
morte dos animais como critério específico. Em 1984, foi sugerida pela British Toxicology Society uma nova abordagem ao ensaio da toxicidade aguda com base na administração de uma série de doses 
fixas (1). Esta abordagem evitava a utilização da morte dos animais 
como um critério específico. O novo método baseava-se na obser ­
vação de sinais evidentes de toxicidade ocorrentes a determinado valor de uma série de doses fixas. Em 1992 e no seguimento dos 
estudos de validação  in vivo  efectuados tanto no Reino Unido (2) 
como internacionalmente (3), o procedimento foi adoptado como método de ensaio. Subsequentemente, as propriedades estatísticas do Procedimento de Dose Fixa foram avaliadas em vários estudos 
utilizando modelos matemáticos (4)(5)(6). Em conjunto, os estudos  
in vivo  e de modelação mostraram que o procedimento é reprodutí ­
vel, utiliza um menor número de animais e causa menor sofrimento do que os métodos tradicionais, permitindo classificar as substâncias 
de um modo semelhante a outros métodos de ensaio de toxicidade 
aguda.
 
No Documento de Orientação sobre Ensaios de Toxicidade Oral 
Aguda (7) podem consultar-se as orientações sobre a selecção do método de ensaio mais apropriado a determinado fim. Este Docu ­
mento de Orientação contém igualmente informação adicional sobre 
o procedimento e interpretação do Método de Ensaio B.1.
 
Um dos princípios básicos do presente método consiste na utilização 
de doses moderadamente tóxicas no estudo principal, evitando a administração de doses previsivelmente letais. Além disso, não é 
necessário administrar doses para as quais se sabe previamente que 
causam dor e sofrimento óbvios, devido à sua acção corrosiva ou fortemente irritante. Os animais moribundos ou os animais que apre ­
sentam sinais óbvios de dor ou sofrimento grave e continuado devem 
ser sacrificados sem dor e, na interpretação dos resultados do ensaio, 
devem ser considerados do mesmo modo que os animais que mor ­
rem durante o ensaio. Os critérios sobre a decisão de sacrificar animais moribundos ou em sofrimento grave, bem como as orienta ­
ções sobre a identificação de morte previsível ou iminente, estão 
incluídos separadamente num Documento de Orientação (8).
 
O presente método permite obter informação sobre a perigosidade e 
possibilita a graduação e classificação da substância em conformidade com o Sistema Harmonizado ao Nível Mundial (GHS) para a classifi ­
cação de substâncias químicas que causam toxicidade aguda (9).
 
Antes de efectuar o estudo, o laboratório de ensaio deve ter em conta 
toda a informação disponível sobre a substância de ensaio. Esta informação incluirá a identificação e a estrutura química da subs ­
tância, as suas propriedades físico-químicas, os resultados de quais ­
quer outros ensaios de toxicidade da substância  in vitro  ou in vivo,  
dados toxicológicos sobre substâncias estruturalmente semelhantes e a(s) utilização(ões) prevista(s) para a substância. Esta informação é necessária para satisfazer todos os envolvidos em relação à relevân ­
cia do ensaio ao nível da protecção da saúde humana e será útil na 
determinação de uma dose inicial apropriada.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 182
 
1.2. DEFINIÇÕES  
Toxicidade oral aguda:  refere-se ao conjunto de efeitos adversos 
que se manifestam após a administração oral de uma dose única da substância ou de várias doses num período de 24 horas.
 
Morte retardada:  significa que o animal não morre nem aparenta 
estar moribundo num período de 48 horas, mas morre mais tarde, no 
decorrer do período de observação de 14 dias.  
Dose:  quantidade aplicada da substância de ensaio. O valor da dose 
é expresso em peso de substância de ensaio por unidade de peso do 
animal (mg/kg).  
Toxicidade evidente:  termo geral que descreve a ocorrência de 
sinais óbvios de toxicidade na sequência da administração da subs ­
tância de ensaio [consultar os exemplos descritos em (3)] no qual a dose fixa mais elevada seguinte pode induzir, na maior parte dos 
animais, dor intensa, sinais persistentes de distúrbios graves, estado 
moribundo (os respectivos critérios são apresentados no Documento de Orientação de Critérios Específicos sem Dor (8) ou, provavel ­
mente, mortalidade.
 
GHS:  Sistema Harmonizado ao Nível Mundial (Globally Harmoni ­
sed System) para a Classificação de Substâncias Químicas e Mistu ­
ras. Trata-se de um trabalho conjunto da OCDE (saúde humana e 
ambiente), do Comité de Peritos em Transporte de Mercadorias Pe ­
rigosas das Nações Unidas (propriedades físico-químicas) e da OIT (notificação de perigos) e coordenado pelo Programa Interorganiza ­
ções para a Boa Gestão das Substâncias Químicas [Interorganisation 
Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC)].
 
Morte iminente:  situação em que se prevê a ocorrência de estado 
moribundo ou morte antes da próxima observação planeada. Alguns dos sinais indicativos deste estado em roedores incluem convulsões, posição lateral, posição deitada e tremores. [Consultar o Documento 
de Orientação de Critérios Específicos sem Dor (8) para mais deta ­
lhes.]
 
DL 50 (Dose Letal Média):  dose única, calculada estatisticamente, de 
uma substância susceptível de causar a morte de 50 % dos animais quando administrada por via oral. O valor da DL
 50 é expresso em 
peso, de substância de ensaio, por unidade de peso do animal de 
ensaio (mg/kg).  
Teste-limite:  refere-se a uma dose com o valor limite superior ad ­
mitido pelo ensaio (2 000 ou 5 000 mg/kg).  
Estado moribundo:  encontrar-se num estado de morte ou de inca ­
pacidade de sobrevivência, mesmo com tratamento. [Consultar o 
Documento de Orientação de Critérios Específicos sem Dor (8) para mais detalhes.]
 
Morte previsível:  presença de sinais clínicos indicativos de ocorrên ­
cia de morte em determinada altura (antes do final planeado da experiência, por exemplo): incapacidade de alcançar água ou comida. 
[Consultar o Documento de Orientação de Critérios Específicos sem 
Dor (8) para mais detalhes.]
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 183
 
1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
São administradas doses gradualmente crescentes a grupos de ani ­
mais do mesmo sexo, usando as doses fixas de 5, 50, 300 e 2 000 mg/kg (excepcionalmente pode utilizar-se uma dose fixa adicional de 
5 000 mg/kg; consultar a secção 1.6.2). A dose inicial é escolhida 
com base num estudo preliminar de determinação de amplitude como a dose para qual é previsível obter alguns sinais de toxicidade sem causar efeitos tóxicos graves ou mortalidade. Os sinais clínicos e as 
condições associadas com dor, sofrimento e morte iminente, são 
descritos detalhadamente num Documento de Orientações da OCDE separado (8). Outros grupos de animais poderão ser sujeitos 
a dosagens, com doses fixas superiores ou inferiores, consoante a 
presença ou ausência de sinais de toxicidade ou mortalidade. Repete- -se este procedimento até identificação da dose que causa toxicidade evidente ou que provoque uma e apenas uma morte ou até à dose 
mais elevada no caso de não serem observados quaisquer efeitos. O 
procedimento é imediatamente interrompido no caso de se registarem mortes à dose mais baixa.
 
1.4. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.4.1.  Selecção de espécies animais  
A espécie preferida para ensaio é o rato, mas podem ser utilizadas 
outras espécies de roedores. Normalmente, utilizam-se fêmeas (7). Tal escolha deve-se ao facto de uma análise da literatura científica relativa aos ensaios convencionais de DL
 50 revelar que, habitualmen ­
te, a diferença de sensibilidade entre os sexos é pequena e, nos casos 
em que são observadas diferenças, as fêmeas são, de um modo geral, ligeiramente mais sensíveis (10). No entanto, devem utilizar-se ma ­
chos caso as propriedades toxicológicas ou tóxico-cinéticas descritas 
para substâncias químicas estruturalmente semelhantes indicarem que 
estes podem revelar maior sensibilidade. Quando o ensaio é efec ­
tuado com machos, deve ser apresentada uma justificação adequada.
 
Devem ser utilizados animais adultos, jovens e saudáveis e pertencen ­
tes a estirpes laboratoriais de uso corrente. As fêmeas devem ser nulí ­
paras e não grávidas. No início da administração das doses, todos os animais devem ter idades compreendidas entre as 8 e as 12 semanas e 
um peso compreendido no intervalo de ± 20 % do peso médio dos 
animais aos quais foram anteriormente administradas doses.
 
1.4.2.  Condições de alojamento e alimentação  
A temperatura do compartimento experimental dos animais deve ser 
de 22  o C (± 3  o C). A humidade relativa deverá ser 50-60 %, embora 
sejam aceitáveis valores entre um mínimo de 30 % e um máximo que, de preferência, não deverá exceder 70 %, salvo durante os períodos de limpeza do compartimento. A iluminação deve ser arti ­
ficial, com sequências de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. A 
alimentação pode basear-se em dietas de laboratório convencionais, com fornecimento ilimitado de água para beber. Os animais aos quais é administrada a mesma dose, podem ser agrupados na mesma 
gaiola desde que, o número de animais em cada gaiola não impeça a 
observação clara de cada um deles.
 
1.4.3.  Preparação dos animais  
Os animais são escolhidos ao acaso, marcados de modo a permitir 
uma identificação individualizada e mantidos nas suas gaiolas duran ­
te, pelo menos, cinco dias antes do início da administração das doses 
de modo a permitir que se aclimatem às condições laboratoriais.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 184
 
1.4.4.  Preparação das doses  
De um modo geral, as substâncias de ensaio devem ser administradas 
num volume constante ao longo de toda a gama de doses a ensaiar através da variação da concentração na preparação da dose. 
No entanto, para o caso do ensaio de um produto ou de uma mistura 
no estado líquido, pode ser mais relevante para a avaliação de risco subsequente a utilização da substância de ensaio sem qualquer dilui ­
ção, ou seja, a concentração constante, sendo este um requisito 
apresentado por algumas autoridades competentes. Em qualquer 
dos casos, não deve ser excedido o volume máximo da dose a ser administrada. O volume máximo de líquido que pode ser adminis ­
trado de cada vez depende do tamanho do animal de ensaio. No caso 
de roedores, em condições normais o volume não deve exceder 1 ml/100 g de peso corporal. Para soluções aquosas, contudo, pode ser considerada a dose de 2 ml/100 g de peso corporal. Reco ­
menda-se que, sempre que possível, seja considerada em primeiro 
lugar a utilização de uma solução/suspensão/emulsão aquosa; caso tal não seja viável, pode considerar-se o uso de uma solução/suspensão/ ­
emulsão em óleo (por exemplo, óleo de milho); em última instância, 
poderá eventualmente recorrer-se ao uso de soluções noutros exci ­
pientes. Devem conhecer-se as características tóxicas dos excipientes que não sejam a água. As doses devem ser preparadas pouco tempo antes da sua administração, a menos que a estabilidade da preparação 
ao longo do período de utilização seja conhecida e tenha sido con ­
siderada aceitável.
 
1.5. PROCEDIMENTO  
1.5.1.  Administração de doses  
A administração deve ser feita numa toma única, por sonda esofá ­
gica, usando tubo estomacal ou cânula de intubação apropriada. Nos 
casos raros em que não é possível a administração de uma toma 
única, a dose pode ser administrada em fracções menores ao longo de um período não superior a 24 horas.
 
Os animais devem ser sujeitos a jejum antes da administração das 
doses (por exemplo, no caso de ratos, não deve dar-se comida du ­
rante a noite, mas deve manter-se o fornecimento de água; no caso de ratinhos, a comida deve ser suspensa durante 3-4 horas e deve ser mantido o fornecimento de água). Após o período de jejum, os 
animais devem ser pesados e deve ser administrada a substância 
de ensaio. Após a administração da substância, pode evitar dar-se comida durante 3-4 horas para ratos e 1-2 horas para ratinhos. Nos casos de administração fraccionada da dose durante um certo lapso 
de tempo, pode ser necessário dar comida e água aos animais con ­
soante a duração do período de administração.
 
1.5.2.  Estudo de determinação de amplitude  
O objectivo do estudo de determinação de amplitude consiste em 
seleccionar a dose inicial apropriada para o estudo principal. A subs ­
tância de ensaio é administrada a um único animal de uma forma 
sequencial segundo os fluxogramas do anexo 1. O estudo de deter ­
minação de amplitude termina quando se pode seleccionar a dose inicial para o estudo principal (ou se for registada uma morte à dose 
fixa mais baixa).
 
Para o estudo de determinação de amplitude, a dose inicial é selec ­
cionada de entre as doses fixas de 5, 50, 300 e 2 000 mg/kg, como sendo a dose que se prevê poder causar toxicidade evidente com 
base, se possível, nas evidências de dados  in vivo  e in vitro  da 
mesma substância química ou de substâncias químicas estrutural ­
mente semelhantes. Na ausência de tal informação, a dose inicial será de 300 mg/kg.
 
O intervalo de aplicação de doses a cada animal será de, pelo menos, 
24 horas. Todos os animais devem ser observados durante um pe ­
ríodo de, pelo menos, 14 dias.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 185
 
Excepcionalmente e apenas quando justificado por necessidades re ­
gulamentares específicas, pode ser considerada a utilização de uma 
dose fixa superior adicional de 5 000 mg/kg (consultar o Anexo 3). Por razões de protecção dos animais, é desencorajado o ensaio de animais na Categoria 5 do SHG (2 000-5 000 mg/kg). Esta dose só 
deve ser considerada quando existe uma elevada probabilidade dos 
resultados deste ensaio terem relevância directa na protecção dos animais, da saúde humana ou do ambiente.
 
Nos casos em que o animal de ensaio morre no estudo de determi ­
nação de amplitude quando se aplica a dose fixa mais baixa (5 mg/ ­
kg), o procedimento normal consiste em terminar o estudo e classi ­
ficar a substância na Categoria 1 do GHS (tal como se indica no 
Anexo 1). No entanto, se for necessária uma confirmação adicional, pode ser efectuado um procedimento experimental suplementar, tal como se descreve seguidamente. Aplica-se uma dose de 5 mg/kg a 
um segundo animal. Se o segundo animal morrer confirma-se a 
Categoria 1 do GHS e o estudo é imediatamente terminado. Se o segundo animal sobreviver, será então administrada a dose de 5 mg/ ­
kg a um máximo de mais três animais. Dado que neste caso o risco 
de mortalidade é elevado, a administração das doses a estes animais 
deve ser feita de um modo sequencial, de modo a proteger os ani ­
mais. O intervalo, entre a aplicação da dose a cada um dos animais, deve ser suficiente para assegurar a provável sobrevivência do ani ­
mal anterior. Se ocorrer uma segunda morte, a sequência de aplica ­
ção da dose será terminada imediatamente e não serão ensaiados mais animais. Dado que, a ocorrência de uma segunda morte (inde ­
pendentemente do número de animais ensaiados até ao final do 
estudo) é classificável no resultado A (duas ou mais mortes), se ­
gue-se a regra de classificação do Anexo 2 para a dose fixa de 5 mg/kg (Categoria 1, se ocorrerem duas ou mais mortes, ou Cate ­
goria 2, se não ocorrer mais do que uma morte). Além disso, apre ­
sentam-se no Anexo 4 as orientações sobre a classificação segundo o 
sistema da UE, válido até à implementação do novo GHS.
 
1.5.3.  Estudo principal  
1.5.3.1.  Número de animais e doses  
No Anexo 2 apresentam-se os procedimentos a seguir após o ensaio 
com a dose inicial. É necessário proceder de uma das três formas seguintes: terminar os ensaios e classificar a substância na classe de perigosidade apropriada, prosseguir os ensaios como uma dose fixa 
superior, ou prosseguir os ensaios com uma dose fixa inferior. 
No entanto, por uma questão de protecção dos animais, a dose que causou morte, no estudo de determinação de amplitude, não deve ser repetida no estudo principal (consultar Anexo 2). A expe ­
riência prévia é indicativa de que o resultado mais provável da dose 
inicial será a possibilidade de classificação da substância, o que toma desnecessários quaisquer ensaios adicionais.
 
Será normalmente utilizado um total de cinco animais do mesmo 
sexo para cada dose investigada. O grupo de cinco animais será constituído por um animal do estudo prévio, ao qual foi administrada 
a dose seleccionada e de quatro outros animais (excepto, em casos 
raros, se a dose utilizada no estudo principal não tiver sido incluída no estudo de determinação de amplitude).
 
O intervalo de tempo entre a aplicação de doses em cada nível é 
determinado pelo aparecimento, duração e gravidade dos sinais de toxicidade. O tratamento dos animais com a dose seguinte deve ser 
adiado até ser possível estabelecer com segurança a sobrevivência 
dos animais previamente tratados. Recomenda-se um período de 3 ou 4 dias entre a administração das doses para cada nível de dosagem, se necessário, de modo a permitir a detecção de efeitos tóxicos 
retardados. O intervalo de tempo pode ser ajustado se necessário, 
por exemplo, em caso de resposta inconclusiva.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 186
 
No caso de se considerar a utilização da dose fixa máxima de 5 000 
mg/kg, deve proceder-se em conformidade com o procedimento des ­
crito no Anexo 3. (Consultar igualmente a secção 1.6.2.)  
1.5.3.2.  Teste-limite  
O teste-limite é utilizado, essencialmente, em situações nas quais o 
analista tem informação indicativa de o material de ensaio não ser provavelmente tóxico, ou seja, só apresenta toxicidade acima das doses-limite regulamentadas. A informação sobre a toxicidade do 
material de ensaio pode ser obtida a partir de ensaios em compostos 
semelhantes ou de ensaios de misturas ou produtos semelhantes, tendo em consideração a identificação e percentagem dos componen ­
tes cuja relevância toxicológica é conhecida. Nos casos em que a 
informação sobre a toxicidade do material de ensaio é limitada ou 
inexistente, ou nos casos em que é previsível que o material a ensaiar seja tóxico, deve ser efectuado o estudo principal.
 
Usando o procedimento normal para este ensaio, o teste-limite pode 
ser efectuado graças a um estudo de determinação de amplitude com 
uma dose inicial de 2 000 mg/kg (ou, excepcionalmente, de 5 000 mg/kg), seguido da administração da dose a mais quatro animais.
 
1.6. OBSERVAÇÕES  
Após a aplicação da dose, os animais devem ser observados indivi ­
dualmente pelo menos uma vez durante os primeiros 30 minutos e periodicamente durante as primeiras 24 horas, com especial cuidado 
nas primeiras quatro horas. Seguidamente, é necessário observar os 
animais diariamente durante um período de 14 dias, excepto se for necessário retirá-los do estudo e sacrificá-los, sem dor, por motivo do bem-estar dos animais, ou se forem encontrados mortos. 
No entanto, a duração do período de observação não deve ser esta ­
belecida de uma forma rígida, mas determinada com base nas reac ­
ções de toxicidade, velocidade do seu aparecimento e duração do período de recuperação, que pode ser prolongado, se for considerado 
necessário. O momento em que os sinais de toxicidade aparecem e 
desaparecem são importantes, sobretudo se os sinais de toxicidade tendem a aparecer de uma forma retardada (11). Todas as observa ­
ções são registadas sistematicamente, mantendo-se uma ficha indivi ­
dual para cada animal.
 
Serão necessárias observações adicionais se os animais continuaram 
a apresentar sinais de toxicidade. As observações devem incluir al ­
terações na pele e pêlos, olhos e membranas mucosas, aparelho 
respiratório, aparelho circulatório, sistema nervoso autónomo e cen ­
tral, assim como da actividade somatomotora e comportamental. Devem ser observados com especial atenção os tremores, convul ­
sões, salivação, diarreia, letargia, sono e coma. Devem ser tomados 
em consideração os princípios e critérios resumidos no Documento 
de Orientação de Critérios Específicos sem Dor (8). Os animais que forem encontrados em estado moribundo e os animais que apresen ­
tarem dores violentas ou sinais de sofrimento grave e continuado 
devem ser sacrificados sem dor. Quando os animais forem sacrifica ­
dos a fim de evitar dor ou se forem encontrados mortos, deve ser registado o momento da morte com o maior rigor possível.
 
1.6.1.  Peso corporal  
O peso individual dos animais deve ser determinado pouco antes da 
administração da substância de ensaio e, seguidamente, pelo menos uma vez por semana. Devem ser calculadas e registadas todas as 
variações de peso. No final do ensaio, os animais sobreviventes são 
pesados e, seguidamente, sacrificados sem dor.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 187
 
1.6.2.  Patologia  
Todos os animais de ensaio (incluindo os que morreram durante o 
ensaio ou que foram retirados do ensaio por motivos de preservação do seu bem-estar) devem ser sujeitos a uma autópsia pouco porme ­
norizada. Devem ser registadas as alterações patológicas principais 
observadas em cada animal. Deve também ser considerada a reali ­
zação de um exame microscópico dos órgãos que mostrem sinais de patologia grave em animais que sobreviveram, no mínimo, durante 
24 horas após a aplicação da dose inicial, já que este exame pode 
fornecer informação útil.
 
2. DADOS  
Devem ser apresentados os dados individuais para cada animal. 
Adicionalmente, todos os dados devem ser resumidos em forma 
tabular, mostrando, para cada grupo de ensaio, o número de animais 
utilizado, o número de animais que apresentaram sinais de toxicida ­
de, o número de animais que foram encontrados mortos durante o ensaio ou que foram sacrificados a fim de evitar dor, o momento da 
morte de cada um dos animais, a descrição e evolução temporal dos 
efeitos de toxicidade e sua reversibilidade, assim como os resultados da autópsia.
 
3. RELATÓRIO  
3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deverá incluir as seguintes informações:  
Substância de ensaio:  
— natureza física, pureza e propriedades físico-químicas relevantes 
(incluindo isomerização);  
— dados relativos à identificação química, incluindo número CAS.  
Excipiente (se apropriado):  
— caso o excipiente não seja água, uma justificação para a sua 
escolha.  
Animais de ensaio:  
— espécie/estirpe usada;  
— estado microbiológico do animal, caso seja conhecido;  
— número, idade e sexo dos animais (incluindo, quando necessário, 
uma justificação para o uso de machos em vez de fêmeas);  
— proveniência, condições de alojamento, dieta, etc.  
Condições do ensaio:  
— informação pormenorizada sobre a formulação da substância de 
ensaio, incluindo informação detalhada sobre a forma física do material administrado;
 
— informação pormenorizada sobre a administração da substância 
de ensaio, incluindo volume das doses e momento de aplicação;  
— informação pormenorizada sobre a qualidade dos alimentos e da 
água (incluindo tipo e origem da dieta e origem da água);  
— —justificação para a escolha da dose inicial.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 188
 
Resultados:  
— tabela dos dados de resposta e da dose para cada animal (ou seja, 
animais que apresentaram sinais de toxicidade, incluindo morta ­
lidade, natureza, gravidade e duração dos efeitos);  
— tabela com indicação do peso corporal e suas variações;  
— pesos individuais de animais no dia em que é aplicada a dose, 
uma vez por semana no restante período e na altura da sua morte 
ou sacrifício;  
— data e momento da morte, no caso de ocorrência de morte antes 
do sacrifício previsto;  
— evolução temporal do aparecimento de sintomas de toxicidade e 
sua reversibilidade, para cada animal;  
— resultados da autópsia e resultados histopatológicos para cada 
animal, caso se encontrem disponíveis.  
Análise dos resultados.  
Conclusões.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). 
Special report: a new approach to the classification of subs ­
tances and preparations on the basis of their acute toxicity.  
Biometrics,  20, 385.  
(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. e Shillaker, R.O. (1987). 
Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparations for their acute toxicity.  Human Toxicol. , 6, p. 
279-291.
 
(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, RJ., Koundakjian, 
P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson, N.J. e Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose pro ­
cedure as an alternative to the classical LD
 50 test. Fd. Chem. 
Toxicol.  28, p. 469-482.  
(4) Whitehead, A. e Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of 
the fixed-dose procedure.  Fd. Chem. Toxicol , 30, p. 313-324.  
(5) Stallard, N. e Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the 
fixed-dose procedure.  Human Exptl. Toxicol , 14, p. 315- 323.  
(6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statisti ­
cal evaluation of the revised fixed dose procedure.-Hum. Exp. Toxicol., 21, p. 183-196.
 
(7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.
 
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Asses ­
sment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmen ­
tal Health and Safety Monograph Series on Testing and As ­
sesment N. 19.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 189
 
(9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification 
for Human Health and Environmental Effects of Chemical 
Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Che ­
micals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/ 
pages/home/displaygeneral/0,3380,EN- documents-521-14-no- 
-24-no-0,FF.html].
 
(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, 
K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segai, L., Springer, J.A. e Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, 
Conventional LD
 50 , and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedu ­
res. Fd. Chem. Toxicol , 33, p. 223-231.  
(11) Chan P.K e A.W. Hayes (1994), Chapter 16 Acute Toxicity 
and Eye Irritation . Em:  Principies and Methods of Toxicology , 
3 a Edição. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd, New York, 
USA.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 190
 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 191
 ▼B 
ANEXO 1  
FLUXOGRAMA PARA O ESTUDO DE DETERMINAÇÃO DE AMPLITUDE

 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 192
 ▼B

 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 193
 ▼B 
ANEXO 2  
FLUXOGRAMA PARA O ESTUDO PRINCIPAL

 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 194
 ▼B

 
ANEXO 3  
CRITÉRIOS PARA A CLASSIFICAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS DE ENSAIO 
COM VALORES PREVISÍVEIS DE DL  50 SUPERIORES A 2 000 MG/KG 
PARA AS QUAIS NÃO É NECESSÁRIO EFECTUAR ENSAIO  
Os critérios para a Categoria 5 de perigosidade destinam-se a permitir a identi ­
ficação de substâncias de ensaio que representam um perigo de toxicidade aguda 
relativamente baixo, mas que, em certas circunstâncias, podem representar perigo para populações vulneráveis. É previsível que estas substâncias apresentem va ­
lores de DL
 50 orais ou dérmicos na gama de 2 000-5 000 mg/kg ou dose equi ­
valente para outras vias. As substâncias de ensaio podem ser classificadas na 
categoria de perigosidade definida por: 2 000 mg/kg < DL  50 < 5 000 mg/kg 
(Categoria 5 do GHS) nos seguintes casos:  
a) se classificadas nesta categoria por qualquer dos esquemas de ensaio do anexo 
2, baseados nas incidências de mortalidade;  
b) se houver prova fiável indicativa de que os valores de DL  50 se encontram na 
gama correspondente à Categoria 5 ou se outros estudos em animais ou sobre 
efeitos de toxicidade em seres humanos forem indicativos de preocupação 
acentuada em relação à salvaguarda da saúde humana;  
c) através de extrapolação, estimativa ou medição de dados, desde que não seja 
garantida a atribuição a uma classe mais perigosa, e  
— quando existe informação fiável indicativa de efeitos de toxicidade signi ­
ficativos em seres humanos, ou  
— quando não é registada mortalidade nos ensaios por via oral até doses 
correspondentes aos valores para a Categoria 4, ou  
— quando os especialistas são da opinião de que não se verificam sintomas 
clínicos de toxicidade significativos para ensaios até doses com valores 
correspondentes à Categoria 4, com excepção de diarreia, erecção pilosa ou má aparência, ou
 
— nos casos em que os especialistas confirmem a existência de informação 
fiável, proveniente de outros estudos com animais, indicativa da existência de potenciais efeitos agudos significativos.
 
ENSAIOS COM DOSES SUPERIORES A 2 000 MG/KG  
Apenas pode ser considerada a utilização de uma dose fixa superior adicional de 
5 000 mg/kg em casos excepcionais e justificados por necessidades específicas legais. Devido ao reconhecimento da necessidade de proteger o bem-estar dos 
animais, os ensaios com doses de 5 000 mg/kg são desencorajados e só devem 
ser considerados no caso de ser muito provável que os resultados desse ensaio tenham especial relevância para a protecção animal ou da saúde humana (9).
 
Estudo de determinação de amplitude  
As regras de decisão para o procedimento sequencial apresentado no anexo 1 
serão aplicadas ao ensaio com dose de 5 000 mg/kg. Assim, quando se utiliza 
uma dose de 5 000 mg/kg no estudo de determinação de amplitude, o resultado A (morte) requer o ensaio com um segundo animal com uma dose de 2 000 mg/kg. Os resultados B e C (toxicidade evidente ou sem toxicidade) permitem a selecção 
da dose de 5 000 mg/kg, como dose inicial do estudo principal. De igual modo, 
para uma dose inicial diferente de 5 000 mg/kg, o ensaio é realizado até à dose de 5 000 mg/kg se o resultado da dose de 2 000 mg/kg for B ou C. No caso de se obter um resultado A na subsequente dose de 5 000 mg/kg, a dose inicial do 
estudo principal deverá ser 2 000 mg/kg, enquanto para resultados B ou C deve 
utilizar-se uma dose inicial de 5 000 mg/kg no estudo principal.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 195
 
Estudo principal  
As regras de decisão para o procedimento sequencial apresentado no anexo 2 
serão aplicadas ao ensaio com dose de 5 000 mg/kg. Assim, quando se utiliza uma dose de 5 000 mg/kg no estudo principal, o resultado A (> duas mortes) requer o ensaio com um segundo grupo, com uma dose de 2 000 mg/kg. Os 
resultados B (toxicidade evidente e/ou < uma morte) ou C (sem toxicidade) não 
permitem a classificação da substância em conformidade com o GHS. De igual modo, para uma dose inicial diferente de 5 000 mg/kg, o ensaio é realizado até à dose de 5 000 mg/kg se o resultado da dose de 2 000 mg/kg for C. No caso de se 
obter um resultado A na subsequente dose de 5 000 mg/kg, a substância será 
classificada na Categoria 5 do GHS, enquanto um resultado B ou C não permite a classificação da substância.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 196
 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 197
 ▼B 
ANEXO 4  
MÉTODO DE ENSAIO B.1 bis  
Orientações sobre a classificação em conformidade com o esquema transitório da UE, válido até à implementação total do Sistema de Classificação Harmonizado a Nível Mundial (GHS) 
(obtido da referência (8))

 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 198
 ▼B

 
B.1.tris.  TOXICIDADE ORAL AGUDA — MÉTODO DE 
CLASSIFICAÇÃO DE TOXICIDADE AGUDA  
1. MÉTODO  
O presente método é equivalente ao «Test Guideline» TG 423 da 
OCDE (2001)  
1.1. INTRODUÇÃO  
O método de classificação de toxicidade aguda (1) estabelecido no 
presente ensaio é um procedimento gradual que utiliza três animais 
do mesmo sexo por etapa. Em média, consoante a mortalidade e/ou o 
estado moribundo dos animais, são necessárias 2-4 etapas para ava ­
liar a toxicidade aguda da substância de ensaio. O presente procedi ­
mento é reprodutível, utiliza uma quantidade muito limitada de ani ­
mais e permite classificar as substâncias de um modo semelhante a 
outros métodos de ensaio de toxicidade aguda. O método de classi ­
ficação de toxicidade aguda baseia-se na avaliação biométrica (2) (3) (4) (5) com doses fixas, separadas apropriadamente de modo a per ­
mitir a avaliação da substância para fins de classificação e avaliação 
de perigosidade. O método, adoptado inicialmente em 1996, foi amplamente validado  in vivo  relativamente aos dados de DL
 50 pu­
blicados na literatura nacional (6) e internacional (7).  
No Documento de Orientação sobre Ensaios de Toxicidade Oral 
Aguda (8) podem consultar-se as orientações sobre a selecção do método de ensaio mais apropriado a determinado fim. Este Docu ­
mento de Orientação contém igualmente informação adicional sobre 
o procedimento e interpretação do Método de Ensaio B.1.tris.
 
No presente método de ensaio não é necessário administrar doses de 
substâncias de ensaio, que comprovadamente causam dor e sofri ­
mento óbvios, devido à sua acção corrosiva ou gravemente irritante. Os animais moribundos ou que apresentam sinais óbvios de dor ou 
sofrimento grave e continuado devem ser sacrificados sem dor e, na 
interpretação dos resultados do ensaio, considerados do mesmo modo que os animais que morrem durante o ensaio. Os critérios sobre a decisão de sacrificar animais moribundos ou em sofrimento, 
bem como as orientações sobre o reconhecimento de morte previsí ­
vel ou iminente, estão incluídos separadamente num Documento de Orientação (9).
 
O presente método utiliza doses estabelecidas previamente e os re ­
sultados permitem classificar a substância em conformidade com o Sistema Harmonizado ao Nível Mundial (GHS) para a classificação de substâncias químicas que causam toxicidade aguda (10).
 
Em princípio, o método não se destina a calcular rigorosamente os 
valores de DL  50 , mas permite a determinação de gamas de exposição 
definidas, nas quais é expectável a ocorrência de mortes, dado que 
um dos principais critérios específicos do ensaio é a morte de uma 
dada proporção de animais. O método permite determinar valores de DL
 50 somente quando, pelo menos, duas das doses utilizadas resul ­
tam numa mortalidade superior a 0 % e inferior a 100 %. A utili ­
zação de uma selecção de doses, previamente estabelecidas, indepen ­
dentemente da substância de ensaio, com a classificação especifica ­
mente dependente do número de animais observados em vários es ­
tados melhora as condições de comunicação de resultados entre la ­
boratórios, bem como a consistência e a repetibilidade dos resulta ­
dos. ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 199
 
Antes de efectuar o estudo, o laboratório de ensaio deve ter em conta 
toda a informação disponível sobre a substância de ensaio. Esta 
informação incluirá a identificação e a estrutura química da subs ­
tância, as suas propriedades físico-químicas, os resultados de quais ­
quer outros ensaios de toxicidade da substância  in vitro  ou in vivo,  
dados toxicológicos sobre substâncias estruturalmente semelhantes e 
a(s) utilização(ões) prevista(s) para a substância. Esta informação é necessária para satisfazer todos os envolvidos em relação à relevân ­
cia do ensaio ao nível da protecção da saúde humana e será útil na 
determinação da dose inicial mais adequada.
 
1.2. DEFINIÇÕES  
Toxicidade oral aguda:  refere-se ao conjunto de efeitos adversos 
que se manifestam após a administração oral de uma dose única da 
substância ou de várias doses num período de 24 horas.  
Morte retardada:  significa que o animal não morre nem aparenta 
estar moribundo num período de 48 horas, mas morre mais tarde, no decorrer do período de observação de 14 dias.
 
Dose:  quantidade aplicada da substância de ensaio. O valor da dose 
é expresso em peso de substância de ensaio por unidade de peso de 
animal de ensaio (por exemplo, mg/kg).  
GHS:  Sistema Harmonizado ao Nível Mundial (Globally Harmoni ­
sed System) para a Classificação de Substâncias Químicas e Mistu ­
ras. Trata-se de um trabalho conjunto da OCDE (saúde humana e ambiente), do Comité de Peritos em Transporte de Mercadorias Pe ­
rigosas das Nações Unidas (propriedades físico-químicas) e da OIT 
(notificação de perigos) e coordenado pelo Programa Interorganiza ­
ções para a Boa Gestão das Substâncias Químicas [Interorganisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC)].
 
Morte iminente:  situação em que se prevê a ocorrência de estado 
moribundo ou morte antes da seguinte observação planeada. Alguns 
dos sinais indicativos deste estado em roedores incluem convulsões, 
posição lateral, posição deitada e tremores. [Para informação deta ­
lhada, consultar o Documento de Orientação sobre Critérios Especí ­
ficos sem Dor (9)].  
DL 50 (Dose Letal Média):  dose única, calculada estatisticamente, de 
uma substância susceptível de causar a morte de 50 % dos animais 
quando administrada por via oral. O valor da DL  50 é expresso em 
peso de substância de ensaio por unidade de peso de animal de ensaio (mg/kg).
 
Dose-limite:  refere-se a uma dose com o valor-limite superior admi ­
tido pelo ensaio (2 000 ou 5 000 mg/kg).  
Estado moribundo:  encontrar-se num estado de morte ou de inca ­
pacidade de sobrevivência, mesmo com tratamento. [Para informação 
detalhada, consultar o Documento de Orientação sobre Critérios Es ­
pecíficos sem Dor (9).]  
Morte previsível:  presença de sinais clínicos indicativos de ocorrên ­
cia de morte em determinada altura, antes do final planeado da experiência; por exemplo: incapacidade de alcançar água ou comida. 
[Consultar o Documento de Orientação de Critérios Específicos sem 
Dor (9) para mais detalhes.]
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 200
 
1.3. PRINCÍPIO DO ENSAIO  
O princípio do presente ensaio é que, com base num procedimento 
gradual com a utilização de um número mínimo de animais por etapa, é possível obter informação suficiente sobre a toxicidade 
aguda de uma substância de ensaio, de modo a permitir a sua clas ­
sificação. A substância é administrada, por via oral, a um grupo de animais de ensaio a uma das doses anteriormente definidas. A subs ­
tância é ensaiada utilizando um procedimento gradual, em que cada 
etapa utiliza três animais do mesmo sexo (normalmente fêmeas). A 
existência ou inexistência de mortalidade, relacionada com compos ­
to, dos animais tratados numa dada etapa, determinará a etapa se ­
guinte, ou seja:
 
— não são necessários mais ensaios,  
— é administrada a mesma dose a mais três animais,  
— é administrada a dose seguinte, maior ou menor, a mais três 
animais.  
No anexo 1 apresenta-se informação detalhada sobre o procedimento 
de ensaio. O método permitirá uma avaliação conducente à classifi ­
cação da substância de ensaio numa das classes de toxicidade defi ­
nidas pelos valores-limite de DL  50 . 
1.4. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.4.1.  Selecção de espécies animais  
A espécie de roedores preferida para ensaio é o rato, mas podem ser 
utilizadas outras espécies de roedores. Normalmente, utilizam-se fê ­
meas (9). Tal escolha deve-se ao facto de uma análise da literatura 
científica relativa aos ensaios convencionais de DL  50 revelar que, 
habitualmente, a diferença de sensibilidade entre os sexos é pequena e, nos casos em que são observadas diferenças, as fêmeas são, de um 
modo geral, ligeiramente mais sensíveis (11). No entanto, devem 
utilizar-se machos caso as propriedades toxicológicas ou tóxico-ci ­
néticas descritas para substâncias químicas estruturalmente semelhan ­
tes indicarem que estes podem revelar maior sensibilidade. Quando o 
ensaio é efectuado com machos, deve ser apresentada uma justifica ­
ção adequada.
 
Devem ser utilizados animais adultos, jovens e saudáveis e perten ­
centes a estirpes laboratoriais de uso corrente. As fêmeas devem ser nulíparas e não grávidas. No início da administração das doses, todos 
os animais devem ter idades compreendidas entre as 8 e as 12 
semanas e um peso compreendido no intervalo de ± 20 % do peso médio dos animais aos quais foram anteriormente administradas do ­
ses.
 
1.4.2.  Condições de alojamento e alimentação  
A temperatura do compartimento experimental dos animais deve ser 
22 o C (± 3  o C). A humidade relativa deverá ser 50 %-60 %, embora 
sejam aceitáveis valores entre um mínimo de 30 % e um máximo que, de preferência, não deverá exceder 70 %, salvo durante os períodos de limpeza do compartimento. A iluminação deve ser arti ­
ficial, com sequências de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. A 
alimentação pode basear-se em dietas de laboratório convencionais, com fornecimento ilimitado de água para beber. Os animais aos quais é administrada a mesma dose podem ser agrupados na mesma 
gaiola, desde que o número de animais em cada gaiola não impeça a 
observação clara de cada um deles.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 201
 
1.4.3.  Preparação dos animais  
Os animais são escolhidos ao acaso, marcados de modo a permitir 
uma identificação individualizada e mantidos nas suas gaiolas duran ­
te, pelo menos, cinco dias antes do início da administração das doses 
para que se aclimatem às condições laboratoriais.  
1.4.4.  Preparação das doses  
De um modo geral, as substâncias de ensaio devem ser administradas 
num volume constante ao longo de toda a gama de doses a ensaiar através da variação da concentração na preparação da dose. No entanto, para o caso do ensaio de um produto ou de uma mistura 
no estado líquido, pode ser mais relevante para a avaliação de risco 
subsequente a utilização da substância de ensaio sem qualquer dilui ­
ção, ou seja, a concentração constante, sendo este um requisito apresentado por algumas autoridades competentes. Em qualquer 
dos casos, não deve ser excedido o volume máximo da dose a ser 
administrada. O volume máximo de líquido que pode ser adminis ­
trado de cada vez depende do tamanho do animal de ensaio. No caso de roedores, o volume não deve exceder, em condições normais, 
1 ml/100 g de peso corporal. Para soluções aquosas, contudo, 
pode ser considerada a dose de 2 ml/100 g de peso corporal. Reco ­
menda-se que, sempre que possível, seja considerada em primeiro lugar a utilização de uma solução/suspensão/emulsão aquosa; caso tal 
não seja viável, pode considerar-se o uso de uma solução/suspensão/ ­
emulsão em óleo (por exemplo, óleo de milho); em última instância, poderá eventualmente recorrer-se ao uso de soluções noutros exci ­
pientes. Devem conhecer-se as características toxicológicas dos ex ­
cipientes que não sejam a água. As doses devem ser preparadas 
pouco tempo antes da sua administração, a menos que a estabilidade da preparação ao longo do período de utilização seja conhecida e tenha sido considerada aceitável.
 
1.5. PROCEDIMENTO  
1.5.1.  Administração de doses  
A administração por sonda esofágica deve ser feita, de preferência, 
numa toma única, usando um tubo estomacal ou uma cânula de 
intubação apropriada. Nos casos raros em que não é possível a administração de uma toma única, a dose pode ser administrada em fracções menores ao longo de um período não superior a 24 
horas.
 
Os animais devem ser sujeitos a jejum antes da administração das 
doses (por exemplo, no caso de ratos, não deve dar-se comida du ­
rante a noite, mas deve manter-se o fornecimento de água; no caso de ratinhos, a comida deve ser suspensa durante 3-4 horas e deve ser 
mantido o fornecimento de água). Após o período de jejum, os 
animais devem ser pesados e deve ser administrada a substância de ensaio. Após a administração da substância, pode evitar dar-se comida durante 3-4 horas para ratos e 1-2 horas para ratinhos. Nos 
casos de administração fraccionada da dose durante um certo lapso 
de tempo, pode ser necessário dar comida e água aos animais, con ­
soante a duração do período de administração.
 
1.5.2.  Número de animais e doses  
São utilizados três animais em cada etapa. A dose a utilizar inicial ­
mente deve ser seleccionada entre uma das quatro doses fixas de 5, 50, 300 e 2 000 mg/kg de peso corporal. A dose inicial deve ser 
aquela que apresenta maior probabilidade de induzir mortalidade em 
alguns dos animais tratados. Os fluxogramas do anexo 1 descrevem o procedimento a seguir para cada uma das doses iniciais. Apresen ­
tam-se ainda, no anexo 4, as orientações sobre a classificação se ­
gundo o sistema da UE, em vigor até à implementação do novo 
GHS.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 202
 
Quando a informação disponível for indicativa de que não é muito 
provável que ocorra mortalidade com a maior dose inicial (2 000 
mg/kg de peso corporal), deve efectuar-se um teste-limite. Quando não existir qualquer informação disponível sobre a substância de ensaio, recomenda-se a utilização de uma dose inicial de 300 mg/kg 
de peso corporal por razões de protecção dos animais.
 
O intervalo de tempo entre os grupos de tratamento é determinado 
pelo aparecimento, duração e gravidade dos sinais de toxicidade. O tratamento dos animais com a dose seguinte deve ser adiado até ser 
possível estabelecer com segurança a sobrevivência dos animais pre ­
viamente tratados.
 
Excepcionalmente, e apenas quando justificado por necessidades le ­
gais específicas, pode ser considerada a utilização de uma dose fixa 
superior adicional de 5 000 mg/kg (consultar o anexo 2). Por razões de protecção dos animais, é desencorajado o ensaio de animais na Categoria 5 do GHS (2 000-5 000 mg/kg) e esta dose só deve ser 
considerada quando existe uma elevada probabilidade de os resulta ­
dos deste ensaio terem relevância directa para a protecção da saúde humana ou dos animais ou do ambiente.
 
1.5.3.  Teste-limite  
O teste-limite é utilizado, essencialmente, em situações nas quais o 
analista tem informação indicativa do material de ensaio não ser 
provavelmente tóxico, ou seja, só apresenta toxicidade acima das doses limite regulamentadas. A informação sobre a toxicidade do material de ensaio pode ser obtida a partir de ensaios em compostos 
semelhantes ou de ensaios de misturas ou produtos semelhantes, 
tendo em consideração a identificação e percentagem dos componen ­
tes cuja relevância toxicológica é conhecida. Nos casos em que a informação sobre a sua toxicidade é limitada ou inexistente ou nos 
casos em que é previsível que o material a ensaiar seja tóxico, deve 
ser efectuado o estudo principal.
 
Pode ser efectuado um teste-limite a uma dose de 2 000 mg/kg de 
peso corporal com seis animais (três animais por etapa). Excepcio ­
nalmente, pode ser efectuado um teste-limite a uma dose de 5 000 mg/kg de peso corporal com três animais (consultar o anexo 2). Caso ocorra mortalidade na sequência da administração da substância de 
ensaio, pode ser necessário efectuar ensaios posteriores com a dose 
inferior seguinte.
 
1.6. OBSERVAÇÕES  
Após a aplicação da dose, os animais devem ser observados indivi ­
dualmente, pelo menos uma vez durante os primeiros trinta minutos 
e periodicamente durante as primeiras 24 horas, com especial cui ­
dado nas primeiras quatro horas. Em seguida, é necessário observar os animais diariamente, durante um período de 14 dias, excepto se for necessário retirá-los do estudo e sacrificá-los sem dor por motivo 
de bem-estar dos animais, ou se forem encontrados mortos. 
No entanto, a duração do período de observação não deve ser esta ­
belecida de uma forma rígida, mas determinada com base nas reac ­
ções de toxicidade, velocidade do seu aparecimento e duração do 
período de recuperação, que pode ser prolongado, se considerado 
necessário. O momento em que os sinais de toxicidade aparecem e desaparecem são importantes, sobretudo se os sinais de toxicidade tendem a aparecer de uma forma retardada (12). Todas as observa ­
ções são registadas sistematicamente, mantendo-se uma ficha indivi ­
dual para cada animal.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 203
 
Serão necessárias observações adicionais se os animais continuarem 
a apresentar sinais de toxicidade. As observações devem incluir al ­
terações na pele e pêlos, olhos, membranas mucosas, aparelho res ­
piratório, aparelho circulatório, sistema nervoso autónomo e central, assim como na actividade somatomotora e comportamental. Devem 
ser observados com especial atenção os tremores, convulsões, sali ­
vação, diarreia, letargia, sono e coma. Devem ser tomados em con ­
sideração os princípios e critérios resumidos no Documento de Orientação de Critérios Específicos sem Dor (9). Os animais que 
forem encontrados em estado moribundo e os animais que apresen ­
tarem dores violentas ou sinais de sofrimento intenso e continuado devem ser sacrificados sem dor. Quando os animais forem sacrifica ­
dos a fim de evitar dor ou se forem encontrados mortos, deve ser 
registado o momento da morte com o maior rigor possível.
 
1.6.1.  Peso corporal  
O peso individual dos animais deve ser determinado imediatamente 
após a administração da substância de ensaio e, seguidamente, pelo 
menos uma vez por semana. Devem ser calculadas e registadas todas 
as variações de peso. No final do ensaio, os animais sobreviventes são pesados e, seguidamente, sacrificados sem dor.
 
1.6.2.  Patologia  
Todos os animais de ensaio (incluindo aqueles que morreram durante 
o ensaio ou que foram retirados do ensaio por motivos de preserva ­
ção do bem-estar do animal) devem ser sujeitos a uma autópsia 
pouco pormenorizada. Devem ser registadas as alterações patológicas 
principais observadas em cada animal. Deve também ser considerada a realização de um exame microscópico dos órgãos que mostrem sinais de patologia grave em animais que sobreviveram, no mínimo, 
24 horas após a aplicação da dose inicial, já que este exame pode 
fornecer informação útil.
 
2. DADOS  
Devem ser apresentados os dados individuais para cada animal. 
Adicionalmente, todos os dados devem ser resumidos em forma tabular, mostrando, para cada grupo de ensaio, o número de animais utilizado, o número de animais que apresentaram sinais de toxicida ­
de, o número de animais que foram encontrados mortos durante o 
ensaio ou que foram sacrificados a fim de evitar dor, o momento da morte de cada um dos animais, a descrição e evolução temporal dos efeitos de toxicidade e sua reversibilidade, assim como os resultados 
da autópsia.
 
3. RELATÓRIO  
3.1. Relatório do ensaio  
O relatório do ensaio deverá incluir as seguintes informações:  
Substância de ensaio:  
— natureza física, pureza e propriedades físico-químicas relevantes 
(incluindo isomerização);  
— dados relativos à identificação química, incluindo o número 
CAS.  
Excipiente (se apropriado):  
— caso o excipiente não seja água, uma justificação para a sua 
escolha.  
Animais de ensaio:  
— espécie/estirpe usada;  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 204
 
— estado microbiológico do animal, caso seja conhecido;  
— número, idade e sexo dos animais (incluindo, quando necessário, 
uma justificação para o uso de machos em vez de fêmeas);  
— proveniência, condições de alojamento, dieta, etc.  
Condições do ensaio:  
— informação pormenorizada sobre a formulação da substância, 
incluindo informação pormenorizada sobre a forma física do ma ­
terial administrado;  
— informação pormenorizada sobre a administração da substância 
de ensaio, incluindo volume das doses e o momento da aplica ­
ção; 
— informação pormenorizada sobre a qualidade dos alimentos e da 
água (incluindo tipo e origem da dieta, origem da água);  
— justificação para a escolha da dose inicial.  
Resultados:  
— tabela dos dados de resposta e da dose para cada animal (ou seja, 
animais que apresentaram sinais de toxicidade, incluindo morta ­
lidade, natureza, gravidade e duração dos efeitos);  
— tabela com indicação do peso corporal e suas variações;  
— pesos individuais de animais no dia em que é aplicada a dose, 
uma vez por semana no restante período e na altura da sua morte 
ou sacrifício;  
— data e momento da morte, no caso de ocorrência de morte antes 
do sacrifício previsto;  
— evolução temporal do aparecimento de sintomas de toxicidade e 
sua reversibilidade para cada animal;  
— resultados da autópsia e resultados histopatológicos para cada 
animal, caso se encontrem disponíveis.  
Análise dos resultados.  
Conclusões.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D., (1986) New Pers ­
pectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, p. 86.
 
(2) Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D., (1989). 
Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemi ­
kalien. Bundesgesundheitsblatt 32, p. 336-341.  
(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E., 
(1994) The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 68, p. 559-610.
 
(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E., (1995) The 
Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acu ­
te-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, p. 729-734.  
(5) Diener W., and Schlede E., (1999) Acute Toxicity Class Met ­
hods: Alterations to LD/LC  50 Tests. ALTEX 16, p. 129-134.  
(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D., (1992) A Na ­
tional Validation Study of the Acute-Toxic- Class Method — An 
Alternative to the LD  50 Test. Arch. Toxicol. 66, p. 455-470.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 205
 
(7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D., (1994) The 
International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Met ­
hod (Oral). Arch. Toxicol. 69, p. 659-670.  
(8) OECD, (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity 
Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No 24. Paris.
 
(9) OECD, (2000) Guidance Document on the Recognition, Asses ­
sment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for 
Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmen ­
tal Health and Safety Monograph Series on Testing and Asses ­
sment No 19.  
(10) OECD, (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System For Human Health And Environmental Effects Of Che ­
mical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in 
November 1998, Part 2, p. 11. [http://webnet1.oecd.org/oecd/ 
pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24- no-0,FF.html].
 
(11) Lipnick R. L., Cotruvo, J. A., Hill R. N., Bruce R. D., Stitzel 
K. A., Walker A. P., Chu I.; Goddard M, Segal L., Springer J. 
A. and Myers R. C., (1995) Comparison of the Up-and Down, 
Conventional LD  50 , and Fixed Dose Acute Toxicity Procedu ­
res. Fd. Chem. Toxicol 33, p. 223-231.  
(12) Chan P.K. and A.W. Hayes., (1994) Chap. 16. Acute Toxicity 
and Eye Irritancy.  Principles and Methods of Toxicology . Third 
Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press Ltd., New York, USA.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 206
 
ANEXO 1  
PROCEDIMENTO A SEGUIR PARA CADA UMA DAS DOSES INICIAIS  
CONSIDERAÇÕES GERAIS  
Os esquemas de ensaio, descritos no presente anexo, descrevem esquematica ­
mente o procedimento a seguir para cada dose inicial.  
— Anexo 1a: a dose inicial é de 5 mg/kg p.c.  
— Anexo 1b: a dose inicial é de 50 mg/kg p.c.  
— Anexo 1c: a dose inicial é de 300 mg/kg p.c.  
— Anexo 1d: a dose inicial é de 2 000 mg/kg p.c.  
Consoante o número de animais sacrificados sem dor ou mortos, o procedimento 
de ensaio segue as setas respectivas.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 207
 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 208
 ▼B 
ANEXO 1  
A PROCEDIMENTO DE ENSAIO COM UMA DOSE INICIAL DE 5 MG/KG DE PESO CORPORAL

 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 209
 ▼B 
ANEXO 1 B  
PROCEDIMENTO DE ENSAIO COM UMA DOSE INICIAL DE 50 MG/KG DE PESO CORPORAL

 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 210
 ▼B 
ANEXO 1 C  
PROCEDIMENTO DE ENSAIO COM UMA DOSE INICIAL DE 300 MG/KG DE PESO CORPORAL

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ANEXO 1 D  
PROCEDIMENTO DE ENSAIO COM UMA DOSE INICIAL DE 2 000 MG/KG DE PESO CORPORAL

ANEXO 2  
CRITÉRIOS PARA A CLASSIFICAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS DE ENSAIO 
COM VALORES PREVISÍVEIS DE DL  50 SUPERIORES A 2 000 MG/KG 
SEM NECESSIDADE DE EFECTUAR ENSAIO  
Os critérios para a Categoria de Perigosidade 5 destinam-se a permitir a identi ­
ficação de substâncias de ensaio que representam um perigo de toxicidade aguda 
relativamente baixo, mas que, em certas circunstâncias, podem representar perigo para populações vulneráveis. É previsível que tais substâncias apresentem valores de DL
 50 por via oral ou dérmica na gama de 2 000-5 000 mg/kg ou dose equi ­
valente para outras vias. As substâncias de ensaio podem ser classificadas na 
categoria de perigosidade definida por: 2 000 mg/kg < DL  50 < 5 000 mg/kg 
(Categoria 5 do GHS) nos seguintes casos:  
a) se classificadas nesta categoria por qualquer dos esquemas de ensaio do anexo 
1a-1d, baseados nas incidências de mortalidade;  
b) se existir prova fiável indicativa de que os valores de DL  50 se encontram na 
gama correspondente à Categoria 5 ou se outros estudos em animais ou sobre 
efeitos de toxicidade em seres humanos forem indicativos de preocupação acentuada em relação à salvaguarda da saúde humana;
 
c) através de extrapolação, estimativa ou medição de dados, desde que não seja 
garantida a atribuição a uma classe mais perigosa, e  
— quando existe informação fiável indicativa de efeitos de toxicidade signi ­
ficativos em seres humanos, ou  
— quando não é registada mortalidade nos ensaios por via oral até doses 
correspondentes aos valores para a Categoria 4, ou  
— quando o perito é de opinião de que não se verificam sintomas clínicos de 
toxicidade significativos para ensaios até doses com valores corresponden ­
tes à Categoria 4, com excepção de diarreia, erecção pilosa ou má apa ­
rência, ou  
— nos casos em que o perito confirme a existência de informação fiável, 
proveniente de outros estudos em animais que seja indicativa da existência 
de potenciais efeitos agudos significativos.  
ENSAIOS COM DOSES SUPERIORES A 2 000 MG/KG  
Devido ao reconhecimento da necessidade de proteger o bem-estar dos animais, 
os ensaios de animais na Categoria 5 (5 000 mg/kg) são desencorajados e só 
devem ser considerados no caso de ser muito provável que os resultados desse ensaio tenham especial relevância para a protecção da saúde humana ou animal (10). Não devem ser efectuados ensaios a doses superiores.
 
Quando é necessário efectuar o ensaio com uma dose de 5 000 mg/kg, só é 
necessária uma etapa (ou seja, três animais). Se o primeiro animal tratado morre, 
o ensaio prossegue a uma dose de 2 000 mg/kg, em conformidade com os fluxogramas do anexo 1. Se o primeiro animal sobrevive, são tratados dois outros animais. Se somente um dos três animais morrer, é de prever que o valor de 
DL
 50 seja superior a 5 000 mg/kg. Se ambos os animais morrerem, o ensaio 
prossegue com uma dose de 2 000 mg/kg.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 212
 
ANEXO 3  
MÉTODO DE ENSAIO B.l.tris: Orientações sobre a classificação em conformidade com o 
esquema transitório da UE em vigor até à implementação total do Sistema de Classificação 
Harmonizado a Nível Mundial (GHS) [obtido da referência (8)]
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B.2. TOXICIDADE AGUDA POR INALAÇÃO  
INTRODUÇÃO  
1. Este método é equivalente ao  Test Guideline  403 (2009) da OCDE (1). O  
Test Guideline  403 (TG 403) inicial relativo à toxicidade aguda por inalação 
foi adotado em 1981. Este método B.2 revisto (equivalente à versão revista 
do Test Guideline  403) visa maior flexibilidade, reduzir a utilização de 
animais e responder às exigências da regulamentação. Compreende dois tipos de estudos: um protocolo tradicional para determinação da CL
 50 e 
um protocolo de concentração em função do tempo (C × t). As principais 
características deste método são a capacidade de estabelecer uma relação de 
resposta à concentração na gama letal e não letal, tendo em vista o cálculo da mediana da concentração letal (CL
 50 ), do limiar da concentração não 
letal (por exemplo, CL01) e do declive, bem como a capacidade de deter ­
minar se algum dos sexos tem maior sensibilidade. Deve recorrer-se ao 
protocolo C × t quando a regulamentação aplicável ou critérios científicos exigem o ensaio em animais durante vários períodos, nomeadamente para efeitos de planeamento da resposta a situações de emergência – por exem ­
plo, para determinação de níveis-guia de exposição aguda (AEGL), estabe ­
lecimento de orientações destinadas ao planeamento da resposta a situações de emergência ou cálculo de limiares de exposição aguda – ou de ordena ­
mento do território.
 
2. O  Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing  (GD 39) (2) 
contém orientações para a realização e interpretação dos estudos previstos neste método de ensaio.
 
3. No final do capítulo e no referido GD 39 (2) são definidos alguns conceitos 
utilizados neste método.  
4. Este método permite caracterizar produtos químicos, avaliar quantitativa ­
mente os riscos correspondentes e escaloná-los e classificá-los de acordo com o Regulamento (CE) n.
 o 1272/2008 (3). O documento GD 39 (2) 
fornece orientações para a escolha do método adequado para o ensaio de 
efeitos agudos. Quando apenas são necessárias informações relativas à clas ­
sificação e à rotulagem, o método normalmente recomendado é o do capítulo B.52 (4) deste anexo [ver o GD 39 (2)]. O método B.2 não se 
destina especificamente ao ensaio de materiais especiais, tais como matérias 
fibrosas ou isométricas pouco solúveis ou nanomateriais manufaturados.
 
CONSIDERAÇÕES INICIAIS  
5. Antes de proceder a ensaios segundo este método, o laboratório deve ter em 
conta os elementos disponíveis sobre o produto químico, nomeadamente estudos já efetuados [por exemplo, com base no capítulo B.52 (4) deste 
anexo] cujos resultados eventualmente dispensem a realização de mais en ­
saios, a fim de minimizar a utilização de animais. Entre os elementos úteis para a escolha da espécie, da estirpe, do sexo, do modo de exposição e das concentrações mais adequados contam-se a identidade, a estrutura química e 
as propriedades físico-químicas do produto químico em estudo, resultados 
de ensaios de toxicidade  in vitro  ou in vivo , as utilizações previstas, o 
potencial de exposição humana e dados (Q)SAR – "( quantitative) 
structure-activity relationships ", relações (quantitativas) estrutura/atividade 
– e toxicológicos disponíveis sobre substâncias estruturalmente afins [ver 
o GD 39 (2)].
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6. Deve evitar-se o mais possível ensaiar produtos químicos corrosivos e/ou 
irritantes a concentrações que presumivelmente causarão dor e/ou sofri ­
mento intensos. Para determinar se é possível renunciar a mais ensaios, deve avaliar-se o potencial corrosivo/irritante segundo critérios de especia ­
listas na matéria, designadamente com base em elementos relativos a ex ­
periências em pessoas ou animais (por exemplo, provenientes de estudos de 
dose repetida realizados a concentrações não corrosivas/não irritantes), em dados  in vitro  [por exemplo, provenientes da aplicação dos métodos des ­
critos nos capítulos B.40 (5) ou B.40.A (6) deste anexo ou do  Test Guide ­
line 435  da OCDE (7)], em valores de pH, em informações relativas a 
substâncias similares ou noutros dados pertinentes. Para determinadas ne ­
cessidades impostas pela regulamentação (por exemplo, fins de planeamento para situações de emergência), pode recorrer-se a este método para expor 
animais a matérias com essas características, pois o método permite ao 
diretor ou ao investigador principal do estudo gerir a escolha das concen ­
trações visadas. Estas não devem induzir irritação/corrosão acentuada, mas devem ser suficientes para que a curva de resposta à concentração abranja 
os níveis correspondentes aos objetivos do ensaio, nos planos científico e da 
regulamentação. É necessário justificar as concentrações escolhidas em cada caso [ver o GD 39 (2)].
 
PRINCÍPIO DO MÉTODO  
7. O método B.2 revisto visa obter informações suficientes sobre a toxicidade 
aguda de produtos químicos, a fim de permitir classificá-los e de obter os dados de letalidade (por exemplo, CL
 50, CL 01 e declive) para um ou ambos 
os sexos necessários à avaliação quantitativa dos riscos. O método contem ­
pla duas possibilidades. A primeira é um protocolo tradicional, no qual se 
expõem grupos de animais a uma concentração-limite (ensaio do limite) ou a uma série de concentrações gradualmente mais elevadas durante um pe ­
ríodo predeterminado, normalmente quatro horas. Por razões ligadas à re ­
gulamentação aplicável, a duração da exposição pode ser diferente. A se ­
gunda possibilidade é um protocolo C × t, no qual se expõem grupos de animais a uma só concentração (concentração-limite), ou a uma série de 
concentrações, durante períodos variáveis.
 
8. Os animais moribundos ou que apresentem sinais óbvios de dor ou de 
grande sofrimento continuado devem ser eutanasiados e, na interpretação 
dos resultados do ensaio, ser considerados do mesmo modo que os animais que morrem no ensaio. O documento de orientações n.
 o 19 da OCDE, 
relativo aos parâmetros eticamente mensuráveis (8), define os critérios 
que devem presidir à decisão de eutanasiar animais moribundos ou em 
grande sofrimento, bem como orientações sobre o reconhecimento da morte previsível ou iminente.
 
DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
Escolha da espécie animal  
9. Devem ser utilizados animais adultos, jovens e saudáveis de estirpes labo ­
ratoriais correntes. A espécie preferida é o rato. É necessário justificar a utilização de outras espécies.
 
Preparação dos animais  
10. As fêmeas utilizadas devem ser nulíparas e não podem estar grávidas. 
No dia da exposição, os animais devem ser adultos jovens com oito a 12 semanas, de peso corporal não desviado mais de 20 % do peso médio correspondente a cada sexo dos animais da mesma idade anteriormente 
expostos. Os animais devem ser selecionados aleatoriamente e marcados 
para identificação individual. Para aclimatação às condições laboratoriais, devem permanecer nas gaiolas durante, pelo menos, cinco dias antes do início do ensaio. Durante um curto período antes do ensaio, também devem 
ser aclimatados ao dispositivo de ensaio, para diminuir a tensão causada por 
um ambiente novo.
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Manutenção dos animais  
11. A temperatura do biotério deve ser de 22 °C ± 3 °C. O ideal será manter a 
humidade relativa entre 30 % e 70 %, embora isto possa não ser possível ao utilizar água como veículo. Antes e depois das exposições, os animais são 
geralmente engaiolados por sexo e por concentração, mas o número de 
animais por gaiola não deve dificultar a clara observação de cada animal e deve minimizar as perdas devidas a lutas ou canibalismo. Quando se opta pela exposição unicamente nasal dos animais, pode ser necessário aclimatá- 
-los aos tubos de contenção. Estes não devem provocar aos animais tensões 
físicas, térmicas ou dinâmicas excessivas. A contenção dos animais pode afetar parâmetros fisiológicos como a temperatura corporal (hipertermia) 
e/ou o volume respirado por minuto. Caso se disponha de dados genéricos 
reveladores de que nenhuma destas alterações ocorre em grau apreciável, não será necessária a preadaptação aos tubos de contenção. Os animais cujo corpo seja exposto na totalidade a um aerossol devem permanecer em 
gaiolas individuais durante a exposição, para evitar que o aerossol seja 
filtrado pela pelagem dos que com eles coabitem. Exceto nos períodos de exposição, podem utilizar-se dietas convencionais certificadas de laborató ­
rio, com fornecimento ilimitado de água potável da rede pública. A ilumi ­
nação deve ser artificial, com uma sequência de 12 horas de luz seguidas de 
12 horas de escuridão.
 
Câmaras de inalação  
12. Ao escolher-se a câmara de inalação, deve ter-se em conta a natureza do 
produto químico em estudo e o objetivo do ensaio. Privilegia-se o modo de exposição unicamente nasal, termo que abrange as exposições "unicamente da cabeça", "unicamente do nariz" e "unicamente do focinho". A exposição 
unicamente nasal é geralmente preferida no estudo de aerossóis de líquidos 
ou de sólidos, ou de vapores que possam condensar-se e formar aerossóis. Para determinados objetivos do estudo, poderá ser melhor recorrer ao modo de exposição do corpo inteiro, mas será necessário justificá-lo no relatório. 
Para garantir estabilidade atmosférica nas câmaras de corpo inteiro, o vo ­
lume de todos os animais presentes em cada câmara não deve exceder 5 % do volume da câmara. O documento GD 39 (2) descreve os princípios, vantagens e desvantagens das técnicas de exposição unicamente nasal e 
do corpo inteiro.
 
CONDIÇÕES DE EXPOSIÇÃO  
Administração das concentrações  
13. As exposições unicamente nasais de ratos podem durar até seis horas. As 
exposições unicamente nasais de ratinhos geralmente não vão além de qua ­
tro horas. Caso sejam necessários estudos mais longos, é necessário justifi ­
cá-lo [ver o GD 39 (2)]. Os animais expostos a aerossóis em câmaras de corpo inteiro devem ser alojados individualmente, para evitar que animais 
coabitantes ingiram o produto químico em estudo ao lamberem-se uns aos 
outros. Durante o período de exposição, a alimentação deve ser suspensa. Durante as exposições do corpo inteiro pode continuar a fornecer-se água.
 
14. Os animais são expostos ao produto químico em estudo sob a forma de gás, 
vapor, aerossol ou de uma mistura destes. O estado físico a ensaiar depende 
das propriedades físico-químicas do produto químico em estudo, da concen ­
tração escolhida e/ou da forma física cuja probabilidade de presença durante a manipulação e utilização do mesmo seja maior. Os produtos químicos higroscópicos ou quimicamente reativos devem ser ensaiados em atmosfera 
seca. Devem tomar-se precauções para evitar concentrações que possam 
provocar explosões.
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Distribuição granulométrica  
15. Os aerossóis e os vapores que possam condensar-se em aerossóis devem ser 
objeto de análise granulométrica. Para que todas as zonas pertinentes do aparelho respiratório sejam expostas, recomenda-se a utilização de aerossóis 
com diâmetro aerodinâmico mediano da massa (MMAD) compreendido 
entre 1 μm e 4 μm e desvio-padrão geométrico ( σ
 g ) compreendido entre 
1,5 e 3,0 (2)(9)(10). Deve fazer-se o razoavelmente possível para respeitar estas condições, sendo necessário um parecer especializado caso isso não se 
consiga. Por exemplo, as partículas dos fumos metálicos podem ser mais 
pequenas do que o limite inferior indicado, ao passo que as partículas carregadas, as fibras e as matérias higroscópicas (que aumentam de volume 
no ambiente húmido do aparelho respiratório) podem exceder o limite su ­
perior.
 
Incorporação do produto químico em estudo num veículo  
16. Pode utilizar-se um veículo para obter a concentração e a granulometria 
adequadas do produto químico na atmosfera. Regra geral, deve preferir-se 
a água. As matérias em partículas podem ser sujeitas a processos mecânicos destinados a obter a distribuição granulométrica necessária, mas tendo o cuidado de não decompor nem alterar o produto químico em estudo. 
Quando houver indícios de que um processo mecânico possa ter alterado 
a composição do produto químico em estudo (por exemplo, devido às altas temperaturas geradas pela fricção numa moagem excessiva), será necessário 
verificá-la por meios analíticos. Devem tomar-se as precauções adequadas 
para não contaminar o produto químico em estudo. Não é necessário ensaiar matérias granulosas não friáveis intencionalmente formuladas para não se ­
rem inaláveis. Para demonstrar que a manipulação de uma matéria granulosa 
não gera partículas respiráveis, efetua-se um ensaio de desgaste. Se este 
gerar substâncias respiráveis, deve realizar-se um ensaio de toxicidade por inalação.
 
Animais de controlo  
17. Não é necessário um grupo de controlo negativo (do ar) em paralelo. Caso 
se utilize um veículo diverso da água para gerar a atmosfera a ensaiar, só se utilizará um grupo de controlo do veículo se não se dispuser de dados 
históricos de toxicidade por inalação. Se um estudo de toxicidade de um 
produto químico incorporado num determinado veículo não revelar toxici ­
dade, conclui-se que o veículo em causa não é tóxico à concentração en ­
saiada, não sendo necessário nenhum grupo de controlo do veículo.
 
MONITORIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE EXPOSIÇÃO  
Caudal de ar nas câmaras  
18. Durante cada exposição, é necessário regular cuidadosamente, monitorizar 
continuamente e registar pelo menos de hora a hora o caudal de ar através de cada câmara. A monitorização da concentração (ou estabilidade) da atmosfera em estudo constitui uma medida permanente de todos os parâme ­
tros dinâmicos e um meio indireto de regular os que intervêm na geração da 
atmosfera em estudo. É necessário ter especial cuidado em evitar reinalações nas câmaras de exposição unicamente nasal, evitando que o fluxo de ar através do sistema de exposição seja incapaz de produzir uma circulação 
dinâmica da atmosfera que contém o produto químico em estudo. Existem 
metodologias a que pode recorrer-se para demonstrar que não ocorrem reinalações nas condições experimentais escolhidas (2)(11). A concentração de oxigénio não deve ser inferior a 19 % e a concentração de dióxido de 
carbono não deve exceder 1 %. Se houver razões para crer que estas con ­
centrações não são respeitadas, é necessário medi-las.
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Temperatura e humidade relativa nas câmaras  
19. Deve manter-se a temperatura nas câmaras a 22 °C ± 3 °C. Tanto no caso 
das exposições unicamente nasais como das exposições do corpo inteiro, é necessário monitorizar a humidade relativa na zona de respiração dos ani ­
mais e registá-la pelo menos três vezes (duração do ensaio até quatro horas) 
ou de hora a hora (durações mais curtas). O ideal seria manter a humidade relativa entre 30 % e 70 %, mas isso pode não ser possível – por exemplo, quando se estudam misturas aquosas – ou pode não ser mensurável (devido 
a interferências do produto químico em estudo com o método de ensaio).
 
Concentração nominal do produto químico em estudo  
20. Sempre que possível, deve calcular-se e registar-se a concentração nominal 
na câmara de exposição. Esta é dada pela divisão da massa gerada do 
produto químico em estudo pelo volume de ar total que circulou pelo sistema da câmara. A concentração nominal não é utilizada para caracterizar a exposição dos animais, mas a sua comparação com a concentração real dá 
uma indicação da eficácia de geração do sistema de ensaio, podendo ser 
utilizada para detetar problemas a esse nível.
 
Concentração real do produto químico em estudo  
21. Entende-se por "concentração real do produto químico em estudo", a con ­
centração do produto químico na zona de respiração dos animais da câmara 
de inalação. As concentrações reais podem determinar-se por métodos es ­
pecíficos (por exemplo, amostragem direta ou métodos de adsorção ou de 
reação química e posterior caracterização analítica) ou por métodos inespe ­
cíficos, tais como gravimetria após filtração. O método gravimétrico só é aceitável para aerossóis de pós com um único componente ou de líquidos pouco voláteis e deve apoiar-se em caracterizações adequadas específicas do 
produto químico em causa efetuadas antes da realização do estudo. A con ­
centração de aerossóis de pós com vários componentes também pode determinar-se por gravimetria. Todavia, são necessários para isso dados analíticos que demonstrem que a composição do produto transportado no 
aerossol é semelhante à do produto inicial. Se não se dispuser desses dados, 
pode ser necessário reanalisar periodicamente o produto químico em estudo (idealmente no aerossol) durante o ensaio. No caso dos agentes aerossoli ­
zados que possam evaporar-se ou sublimar, é necessário demonstrar que 
todas as fases são recolhidas pelo método escolhido. As concentrações 
visadas, nominais e reais devem figurar no relatório do estudo, mas apenas as concentrações reais são utilizadas na análise estatística para cálculo dos valores letais de concentração.
 
22. Deve utilizar-se, se possível, apenas um lote do produto químico em estudo 
e a amostra em estudo deve ser conservada em condições que preservem a 
sua pureza, homogeneidade e estabilidade. Antes de iniciar o estudo, deve caracterizar-se o produto químico em causa no que respeita à sua pureza e, se tecnicamente viável, à sua identidade e às quantidades dos contaminantes 
e impurezas nele identificados. Para o efeito, pode recorrer-se, entre outros, 
a tempos de retenção e áreas relativa de picos, pesos moleculares obtidos por espetrometria de massa ou cromatografia em fase gasosa ou outras estimativas. Embora a identidade da amostra a estudar não seja da respon ­
sabilidade do laboratório, pode ser aconselhável que este confirme, pelo 
menos, alguns aspetos da caracterização efetuada pelo cliente (cor, natureza física, etc.).
 
23. Deve manter-se a atmosfera de exposição tão constante quanto possível e 
proceder-se à sua monitorização continuamente e/ou intermitentemente, con ­
soante o método de análise. Caso se proceda a uma colheita de amostras 
intermitente, num estudo de quatro horas deve recolher-se uma amostra da 
atmosfera da câmara pelo menos duas vezes. Se, isso não for viável, por limitações relacionadas com o caudal de ar ou devido a concentrações baixas, pode colher-se uma amostra ao longo de todo o período de expo ­
sição. Se ocorrerem variações pronunciadas de uma amostra para outra, 
devem colher-se quatro amostras por exposição nas concentrações seguintes.
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A concentração na câmara correspondente a uma determinada amostra não 
deve desviar-se da concentração média mais de 10 %, no caso de gases e 
vapores, nem mais de 20 %, no caso de aerossóis de líquidos ou de sólidos. Deve calcular-se e registar-se o tempo necessário para a câmara atingir o equilíbrio (t
 95 ). A duração da exposição corresponde ao tempo de geração 
do produto químico em estudo, incluído o tempo necessário para atingir t  95 . 
O documento GD 39 (2) contém orientações para a estimativa do t  95 . 
24. No caso de misturas muito complexas de gases ou vapores e de aerossóis 
(por exemplo, atmosferas de combustão e produtos químicos gerados por 
produtos ou dispositivos finais específicos), o comportamento de cada fase 
na câmara de inalação pode ser diferente. Por esse motivo, deve escolher-se em cada fase (gás ou vapor e aerossol) pelo menos uma substância indica ­
dora (substância analisada), normalmente a principal substância ativa da 
mistura. Se o produto químico em estudo for uma mistura, deve 
indicar-se no relatório a concentração analítica correspondente à mistura e não apenas a concentração correspondente à substância ativa ou ao compo ­
nente (substância analisada) em causa. O documento GD 39 (2) contém 
mais informações sobre as concentrações reais.
 
Distribuição granulométrica do produto químico em estudo  
25. Deve determinar-se a distribuição granulométrica dos aerossóis pelo menos 
duas vezes durante cada exposição de quatro horas, recorrendo a um im ­
pactor de cascata ou a outro instrumento, tal como um granulómetro aero ­
dinâmico. Se for possível demonstrar a equivalência dos resultados obtidos 
pelo impactor de cascata e pelo instrumento alternativo, pode utilizar-se este 
último em todo o estudo. Em paralelo ao instrumento primário, deve utilizar-se um segundo dispositivo, tal como um filtro gravimétrico ou um borbulhador de gás/impactor  impinger , para confirmar a eficiência de cap ­
tação do primeiro. As concentrações mássicas obtidas por análise granulo ­
métrica e por análise com filtros não devem diferir entre si mais do que valores razoáveis [ver o GD 39 (2)]. Se for possível demonstrar esta equi ­
valência no início do estudo, não é necessário efetuar mais medições de 
confirmação. Por razões de bem-estar animal, devem ser tomadas medidas 
para minimizar dados inconclusivos que possam obrigar à repetição de exposições. É necessário efetuar uma análise granulométrica no caso dos vapores que possam condensar-se para formar aerossóis ou se forem dete ­
tadas partículas numa atmosfera de vapores suscetível de formar fases mis ­
tas (ver o ponto 15).
 
PROCEDIMENTO  
26. São descritos a seguir dois tipos de estudo: o protocolo tradicional e o 
protocolo C × t. Ambos podem compreender um estudo preliminar, um estudo principal e/ou um ensaio do limite (no protocolo tradicional) 
ou um ensaio a uma concentração-limite (C × t). Se um dos sexos for 
reconhecidamente mais sensível, fica ao critério do diretor do estudo efetuar estes estudos apenas a esse sexo. Se espécies que não o rato forem sujeitas a exposição unicamente nasal, pode ajustar-se a duração máxima da 
exposição para minimizar a tensão gerada na espécie em causa. Antes de 
iniciar o estudo deve atender-se a todos os dados disponíveis, a fim de minimizar a utilização de animais. Por exemplo, os dados gerados em aplicação do capítulo B.52 (4) deste anexo podem dispensar o estudo pre ­
liminar e servir para verificar se um dos sexos é mais sensível que o outro 
[ver o GD 39 (2)].
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PROTOCOLO TRADICIONAL  
Considerações gerais: protocolo tradicional  
27. No estudo tradicional, expõem-se grupos de animais ao produto químico em 
estudo, durante um período fixo (geralmente quatro horas), numa câmara de exposição unicamente nasal ou de corpo inteiro. Os animais são expostos a uma concentração-limite (ensaio do limite) ou, num processo sequencial, a, 
pelo menos, três concentrações (estudo principal). O estudo principal pode 
ser antecedido de um estudo preliminar, a menos que já se disponha de determinadas informações sobre o produto químico, tais como as provenien ­
tes de um estudo B.52 já realizado [ver o GD 39 (2)].
 
Estudo preliminar: protocolo tradicional  
28. Recorre-se a um estudo preliminar para estimar a potência do produto 
químico, identificar diferenças de sensibilidade entre sexos e facilitar a escolha dos níveis de concentração de exposição para o estudo principal ou o ensaio do limite. Ao selecionar os níveis de concentração para o estudo 
preliminar, deve atender-se a todos os dados disponíveis, nomeadamente 
dados relativos a produtos químicos similares e dados (Q)SAR eventual ­
mente disponíveis. A cada concentração, expõem-se, no máximo, três ma ­
chos e três fêmeas (podem ser necessários três animais por sexo para de ­
terminar uma diferença de sensibilidade entre sexos). O estudo preliminar 
pode incidir apenas numa concentração, mas podem ser ensaiadas mais se for necessário. Neste estudo não devem ensaiar-se tantos animais e concen ­
trações como num estudo principal. Em vez do estudo preliminar, pode 
recorrer-se a um estudo B.52 (4) efetuado anteriormente [ver o GD 39 (2)].
 
Ensaio do limite: protocolo tradicional  
29. Efetua-se este ensaio caso se saiba ou preveja que o produto químico em 
estudo é praticamente não tóxico, isto é, só induzirá toxicidade acima da concentração-limite prevista na regulamentação aplicável. No ensaio do 
limite, expõe-se a uma concentração-limite do produto químico em estudo 
um único grupo de três machos e três fêmeas. Podem obter-se informações sobre a toxicidade do produto químico em estudo a partir de ensaios já realizados com produtos químicos semelhantes, tomando em consideração a 
identidade e percentagem dos componentes de importância toxicológica 
reconhecida. Nos casos em que se disponha de pouca ou nenhuma infor ­
mação sobre a toxicidade do produto químico em estudo ou quando este for previsivelmente tóxico, deve efetuar-se o estudo principal.
 
30. A escolha das concentrações-limite depende geralmente da regulamentação 
aplicável. Quando se trata do Regulamento (CE) n.  o 1272/2008, as concen ­
trações-limite aplicáveis são 20 000 ppm para gases, 20 mg/l para vapores e 
5 mg/l para aerossóis (ou a concentração máxima atingível) (3). Pode ser 
tecnicamente difícil gerar as concentrações-limite no caso de determinados produtos químicos, em especial quando se trata de vapores ou de aerossóis. Ao ensaiar aerossóis, o principal objetivo é conseguir obter partículas de 
dimensões respiráveis (MMAD compreendido entre 1 μm e 4 μm), o que, 
com a maior parte dos produtos químicos, se consegue a uma concentração de 2 mg/l. Só deve tentar-se ensaiar aerossóis a concentrações superiores a 2 mg/l se for possível gerar partículas de dimensões respiráveis [ver o GD 39 
(2)]. Por razões de bem-estar animal, o Regulamento (CE) n.
 o 1272/2008 (3) 
desaconselha o ensaio de concentrações superiores à concentração-limite. Só importa ponderar o ensaio da concentração-limite se for elevada a probabi ­
lidade de os resultados desse ensaio terem interesse direto para a proteção 
da saúde humana (3), o que deve justificar-se no relatório do estudo. 
No caso de produtos químicos potencialmente explosivos, devem tomar-se precauções para evitar condições favoráveis à ocorrência de explosões. Para evitar a utilização desnecessária de animais, deve efetuar-se um ensaio sem 
animais antes do ensaio do limite, para verificar se é possível atingir as 
condições deste ensaio nas câmaras.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 223
 
31. Se a concentração-limite gerar mortalidade ou animais moribundos, os re ­
sultados do ensaio do limite podem servir de estudo preliminar para os 
ensaios seguintes a outras concentrações (ver o estudo principal). Se as propriedades físicas ou químicas do produto químico em estudo impossibi ­
litarem que se atinja a concentração-limite, deve ensaiar-se a concentração 
máxima que se consiga atingir. Se a letalidade verificada à concentração 
máxima atingível for inferior a 50 %, não são necessários mais ensaios. Se não for possível atingir as concentrações-limite devem constar do relatório do estudo uma explicação disso e dados corroborantes. Se a concentração 
máxima atingível de um vapor não induzir toxicidade, pode ser necessário 
gerar o produto químico em estudo sob a forma de um aerossol de líquido.
 
Estudo principal: protocolo tradicional  
32. Num estudo principal utilizam-se, normalmente, cinco machos e cinco fê ­
meas (ou cinco animais do sexo sensível, se for conhecido) por nível de concentração, sendo que o número mínimo de níveis é três. O número de 
níveis de concentração utilizado deve permitir efetuar uma análise estatística 
sólida. O intervalo de tempo entre a exposição dos diversos grupos é de ­
terminado pelo aparecimento, pela duração e pela intensidade dos sinais de toxicidade observados. Não se expõem animais ao nível de concentração 
seguinte enquanto não houver um grau razoável de confiança na sobrevi ­
vência dos últimos animais expostos. O diretor do estudo pode, então, ajustar a concentração visada para o próximo grupo a expor. Dada a de ­
pendência de tecnologias sofisticadas, este procedimento nem sempre será 
possível nos estudos por inalação, pelo que a exposição de animais ao nível 
de concentração seguinte deve basear-se na experiência adquirida e numa apreciação científica. Ao ensaiar misturas, deve consultar-se o documento GD 39 (2).
 
PROTOCOLO "CONCENTRAÇÃO EM FUNÇÃO DO TEMPO" (C × t)  
Considerações gerais: Protocolo C × t  
33. Na avaliação da toxicidade por inalação, um estudo sequencial C × t pode 
constituir alternativa ao protocolo tradicional (12)(13)(14). Neste método, 
Os animais são expostos durante diversos períodos a várias concentrações 
do produto químico em estudo. Todos os ensaios são efetuados numa câ ­
mara de exposição unicamente nasal, pois as câmaras de corpo inteiro não se prestam a este protocolo. O procedimento sequencial descrito no apên ­
dice 1 ilustra este protocolo. Uma análise de simulação mostrou que tanto o 
protocolo tradicional como o protocolo C × t podem gerar valores fiáveis de CL
 50 , embora este último seja geralmente melhor para obter valores fiáveis 
de CL  01 e CL  10 (15).  
34. Uma análise de simulação demonstrou que é geralmente adequado utilizar 
dois animais por ponto (C,t) – um animal de cada sexo, se forem utilizados ambos os sexos, ou dois animais do sexo mais sensível – para ensaiar quatro concentrações e cinco durações de exposição num estudo principal. 
Em certas circunstâncias, fica ao critério do diretor do estudo utilizar dois 
ratos de cada sexo em cada ponto (C,t) (15). A utilização de dois animais de cada sexo em cada ponto (C,t) pode reduzir os erros sistemáticos e a variabilidade das estimativas, aumentar a taxa de êxito destas últimas e 
melhorar a cobertura do intervalo de confiança. Todavia, se a correlação 
dos dados não for suficiente para possibilitar uma estimativa quando se utiliza um animal de cada sexo ou dois animais do sexo mais sensível, uma quinta concentração de exposição também poderá bastar para o efeito. 
Para mais orientações sobre o número de animais e as concentrações a 
utilizar num estudo C × t, consultar o documento GD 39 (2).
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 224
 
Estudo preliminar: Protocolo C × t  
35. Recorre-se a um estudo preliminar para estimar a potência do produto 
químico e facilitar a escolha dos níveis de concentração de exposição para o estudo principal. Para selecionar uma concentração inicial adequada 
para o estudo principal e minimizar o número de animais utilizados, pode 
ter de se efetuar um estudo preliminar com um máximo de três animais de cada sexo a cada concentração – mais elementos no apêndice III do docu ­
mento GD 39 (2). Pode ser necessário utilizar três animais de cada sexo 
para determinar a diferença de sensibilidade entre sexos. Expõem-se estes 
animais durante um período único de, geralmente, 240 minutos. A viabili ­
dade de se gerarem as atmosferas de ensaio adequadas deve ser avaliada em 
ensaios técnicos prévios realizados sem animais. Caso se disponha de dados 
de mortalidade obtidos num estudo B.52 (4), geralmente não é necessário efetuar um estudo preliminar. Para selecionar a concentração inicial visada num estudo B.2, o diretor do estudo deve atender aos perfis de mortalidade 
observados a todas as concentrações ensaiadas nos estudos B.52 (4) reali ­
zados com ambos os sexos de cujos resultados disponha [ver o GD 39 (2)].
 
Concentração inicial: protocolo C × t  
36. A concentração inicial (sessão de exposição I no apêndice 1) é uma concen ­
tração-limite ou uma concentração escolhida pelo diretor do estudo com base no estudo preliminar. Expõem-se grupos de um animal de cada sexo 
a esta concentração durante diversos períodos (por exemplo, 15, 30, 60, 120 
ou 240 minutos), num total de dez animais (sessão de exposição I no apêndice 1).
 
37. A escolha das concentrações-limite depende geralmente da regulamentação 
aplicável. Quando se trata do Regulamento (CE) n.  o 1272/2008, as concen ­
trações-limite aplicáveis são 20 000 ppm para gases, 20 mg/l para vapores e 5 mg/l para aerossóis (ou a concentração máxima atingível) (3). Pode ser tecnicamente difícil gerar as concentrações-limite no caso de determinados 
produtos químicos, em especial quando se trata de vapores ou de aerossóis. 
Ao ensaiar aerossóis, o objetivo é conseguir obter partículas de dimensões respiráveis (MMAD compreendido entre 1 μm e 4 μm) na concentração- 
-limite de 2 mg/l, o que é possível no caso da maior parte dos produtos 
químicos. Só deve tentar-se ensaiar aerossóis a concentrações superiores a 2 mg/l se for possível gerar partículas de dimensões respiráveis [ver o GD 39 (2)]. Por razões de bem-estar animal, o Regulamento (CE) n.
 o 1272/2008 (3) 
desaconselha o ensaio de concentrações superiores à concentração-limite. Só 
importa ponderar ensaios a concentrações superiores a essa concentração se for elevada a probabilidade de os resultados desses ensaios terem interesse direto para a proteção da saúde humana (3), o que deve justificar-se no 
relatório do estudo. No caso de produtos químicos potencialmente explosi ­
vos, devem tomar-se precauções para evitar condições favoráveis à ocorrên ­
cia de explosões. Para evitar a utilização desnecessária de animais, deve efetuar-se um ensaio sem animais antes de ensaiar a concentração inicial, 
para verificar se é possível atingir nas câmaras as condições correspondentes 
a essa concentração.
 
38. Se a concentração inicial gerar mortalidade ou animais moribundos, os 
resultados obtidos para esta concentração podem servir de ponto de partida 
para os ensaios seguintes a outras concentrações (ver o estudo principal). Se 
as propriedades físicas ou químicas do produto químico em estudo impos ­
sibilitarem que se atinja a concentração-limite, deve ensaiar-se a concen ­
tração máxima que se consiga atingir. Se a letalidade verificada à concen ­
tração máxima atingível for inferior a 50 %, não são necessários mais 
ensaios. Se não for possível atingir a concentração-limite, devem constar do relatório do estudo uma explicação disso e dados corroborantes. Se a concentração máxima atingível de um vapor não induzir toxicidade, pode 
ser necessário gerar o produto químico em estudo sob a forma de um 
aerossol de líquido.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 225
 
Estudo principal: protocolo C × t  
39. A concentração inicial (sessão de exposição I no apêndice 1) ensaiada no 
estudo principal é uma concentração-limite ou uma concentração escolhida pelo diretor do estudo com base no estudo preliminar. Se for observada 
mortalidade durante ou após a sessão de exposição I, deve tomar-se a 
exposição mínima (C × t) que gera mortalidade como orientação para de ­
terminar a concentração e os períodos de exposição para a sessão de ex ­
posição II. Cada sessão de exposição subsequente dependerá da sessão que 
a precede (ver o apêndice 1).
 
40. No caso de muitos produtos químicos, os resultados obtidos para a concen ­
tração inicial, juntamente com os resultados obtidos em três sessões de 
exposição suplementares menos espaçadas (sendo este espaçamento dado pelo fator que define a série geométrica de períodos de exposição, geral ­
mente √2) são suficientes para estabelecer a relação entre C × t e a mor ­
talidade (15), mas pode ser vantajoso utilizar uma quinta concentração de 
exposição – ver o apêndice 1 e o documento GD 39 (2). O apêndice 1 explica o tratamento matemático dos resultados do protocolo C × t.
 
EXAMES  
41. Os animais devem ser examinados clinicamente com frequência durante o 
período de exposição. Depois desta, deve efetuar-se um exame clínico pelo 
menos duas vezes no dia da exposição – ou mais vezes, quando a resposta dos animais à exposição o aconselhar – e pelo menos uma vez por dia em seguida, durante 14 dias. Não é fixada uma duração do período de obser ­
vação, que deve depender da natureza e do momento do aparecimento de 
sinais clínicos, assim como da duração do período de recuperação. O mo ­
mento do aparecimento e do desaparecimento dos sinais de toxicidade é importante, nomeadamente se houver uma certa demora na manifestação 
desses sinais. Todas as observações devem ser sistematicamente registadas, 
mantendo registos individuais para cada animal. Os animais moribundos ou que apresentem sinais de dor intensa e/ou de grande sofrimento continuado devem ser eutanasiados, por razões de bem-estar animal. No exame clínico 
de sinais de toxicidade, não devem confundir-se um mau aspeto inicial e 
alterações respiratórias passageiras, imputáveis ao procedimento de exposi ­
ção, com sinais de toxicidade do produto químico em estudo passíveis de aconselhar a eutanásia prematura dos animais. Devem ser tidos em conta (7) 
os princípios e critérios resumidos no documento de orientações n.
 o 19 da 
OCDE (GD 19). Se forem eutanasiados animais ou forem encontrados animais mortos, deve registar-se o momento da morte com a maior exatidão possível.
 
42. Os exames a efetuar aos animais engaiolados devem incidir, nomeadamente, 
nas alterações da pele e da pelagem, dos olhos e das mucosas, do aparelho respiratório, do sistema circulatório, dos sistemas nervosos autónomo e cen ­
tral, da atividade somatomotora e do comportamento. Se possível, registar 
as diferenças eventualmente observadas entre efeitos locais e sistémicos. Deve estar-se atento a tremores, convulsões, salivação, diarreia, letargia, sono e coma. A medição da temperatura retal pode corroborar uma bradip ­
neia reflexa ou uma hipo/hipertermia relacionadas com a exposição ou com 
o confinamento.
 
Peso corporal  
43. Regista-se o peso de cada animal uma vez durante o período de aclimata ­
ção, no dia da exposição, antes desta (dia 0), e, pelo menos, nos dias 1, 3 e 
7 (e posteriormente uma vez por semana), bem como no momento da morte 
ou da eutanásia, se posterior ao dia 1. O peso corporal é reconhecidamente um indicador crítico de toxicidade, pelo que é necessário observar atenta ­
mente os animais cujo peso decresça 20 % ou mais relativamente ao peso 
anterior ao estudo e não volte a aumentar. No final do período após a 
exposição, pesam-se e eutanasiam-se os animais sobreviventes.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 226
 
Patologia  
44. Os animais utilizados nos ensaios (incluindo os que morrerem durante o 
ensaio ou que forem eutanasiados e retirados do estudo por razões de bem-estar animal) devem ser sujeitos a uma autópsia macroscópica. Se 
não for possível realizar a autópsia imediatamente depois de detetada a 
morte do animal, este deve ser refrigerado (não congelado) a uma tempe ­
ratura suficientemente baixa para minimizar a autólise. As autópsias devem ser efetuadas o mais rapidamente possível, normalmente não mais de um ou 
dois dias após a morte. Regista-se todas as alterações patológicas macros ­
cópicas de cada animal, prestando especial atenção às alterações do aparelho respiratório.
 
45. Podem ser efetuados outros exames previamente previstos para alargar o 
valor interpretativo do estudo, tais como a pesagem dos pulmões dos ratos sobreviventes e/ou a pesquisa, por exame microscópico, de irritações do 
aparelho respiratório. Também podem examinar-se os órgãos que eviden ­
ciem macropatologias de animais que tenham sobrevivido 24 horas ou mais, bem como órgãos que se saiba serem afetados ou que se preveja serem-no. O exame microscópico de todo o aparelho respiratório pode fornecer ele ­
mentos úteis no caso dos produtos químicos que reagem com a água, tais 
como os ácidos e os produtos químicos higroscópicos.
 
DADOS E RELATÓRIOS  
Dados  
46. Devem ser indicados o peso corporal e os resultados da autópsia de cada 
animal. Devem ser resumidos os resultados dos exames clínicos num qua ­
dro, indicando, para cada grupo estudado, o número de animais utilizados, o 
número de animais que apresentaram sinais específicos de toxicidade, o 
número de animais que morreram durante o ensaio ou que foram eutana ­
siados e o momento da morte de cada animal, complementados por uma 
descrição dos efeitos tóxicos e da evolução e reversibilidade destes, bem 
como pelos resultados das autópsias.  
Relatório dos ensaios  
47. Elementos a constar, quando pertinente, do relatório dos ensaios:  
Animais estudados e condições em que são mantidos  
— descrição das condições de engaiolamento, nomeadamente: número (ou 
alteração do número) de animais por gaiola, camas, temperatura e hu ­
midade relativa ambientes, fotoperíodo e dieta,  
— espécie e estirpe utilizadas e, caso não sejam utilizados ratos, justifica ­
ção da utilização de outra espécie,  
— número, idade e sexo,  
— método de aleatorização,  
— elementos sobre a qualidade dos alimentos e da água (incluindo o tipo 
de dieta e a origem desta, bem como a origem da água),  
— descrição de eventuais condicionamentos anteriores ao ensaio, nomea ­
damente ao nível da dieta, de quarentenas e do tratamento de doenças.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 227
 
Produto químico em estudo  
— natureza física, grau de pureza e propriedades físico-químicas pertinentes 
(incluindo a isomerização),  
— dados de identificação e, se for conhecido, número de registo CAS 
(Chemical Abstract Service ). 
Veículo  
— justificação da utilização e da escolha do veículo (se não for água),  
— dados históricos ou paralelos demonstrativos de que o veículo não in ­
terfere nos resultados do estudo.  
Câmaras de inalação  
— descrição – incluindo dimensões e volume – das câmaras de inalação,  
— origem e descrição do equipamento utilizado na exposição dos animais e 
na geração da atmosfera,  
— equipamento de medição da temperatura, humidade, granulometria e 
concentração real,  
— fonte de ar, tratamento do ar fornecido/evacuado e sistema de climati ­
zação utilizado,  
— métodos utilizados para calibrar o equipamento a fim de garantir a 
homogeneidade da ensaiada,  
— subpressão ou sobrepressão,  
— pontos de exposição por câmara (de exposição unicamente nasal); loca ­
lização dos animais no sistema (câmara de exposição de corpo inteiro),  
— homogeneidade/estabilidade no tempo da atmosfera ensaiada,  
— localização nas câmaras dos sensores térmicos e higrométricos e dos 
pontos de colheita de amostras da atmosfera ensaiada,  
— caudais de ar, caudal de ar em cada ponto de exposição (exposição 
unicamente nasal) ou relação entre o volume ocupado pelos animais e o volume da câmara (câmaras de exposição de corpo inteiro),
 
— informações sobre o equipamento eventualmente utilizado para medir o 
oxigénio e o dióxido de carbono,  
— tempo necessário para as câmaras de inalação atingirem o equilíbrio 
(t 95 ), 
— número horário de substituições de volume,  
— medidores (se existirem).  
Elementos relativos à exposição  
— fundamentação da escolha da concentração visada no estudo principal,  
— concentrações nominais (dadas pela divisão da massa do produto quí ­
mico em estudo introduzido na câmara de inalação pelo volume de ar total que nela circulou),
 
— concentrações reais do produto químico em estudo obtidas na zona de 
respiração dos animais; no caso das misturas que geram formas físicas 
heterogéneas (gases, vapores, aerossóis), pode analisar-se separadamente 
cada uma delas,  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 228
 
— as concentrações no ar devem ser indicadas em unidades de massa 
(mg/l, mg/m  3 , etc.), podem igualmente indicar-se unidades de volume 
(ppm, ppb, etc.) entre parêntesis,  
— distribuição granulométrica, diâmetro aerodinâmico mediano da 
massa (MMAD) e desvio-padrão geométrico ( σ g ), incluindo os métodos 
de cálculo correspondentes; indicar também o resultado de cada análise granulométrica efetuada.
 
Condições de realização dos ensaios  
— elementos sobre a preparação do produto químico estudado, nomeada ­
mente sobre eventuais métodos de redução da granulometria de sólidos ou de preparação de soluções do produto químico. Se o recurso a processos mecânicos for passível de ter alterado a composição do pro ­
duto químico em estudo, incluir os resultados das análises efetuadas para 
verificar a composição deste,
 
— descrição (de preferência complementada por um esquema) do equipa ­
mento utilizado para gerar a atmosfera ensaiada e para expor os animais 
a essa atmosfera,  
— elementos sobre o método de análise química utilizado e sobre a vali ­
dação desse método (incluindo o rendimento da recuperação do produto químico em estudo do meio amostrado),
 
— fundamentação da escolha das concentrações utilizadas nos ensaios.  
Resultados  
— quadro com a temperatura, a humidade e o caudal de ar nas câmaras,  
— quadro com as concentrações nominais e reais nas câmaras,  
— quadro com os dados granulométricos, nomeadamente dados analíticos 
sobre a colheita de amostras, a distribuição granulométrica e os cálculos de MMAD e σ
 g , 
— quadro com os dados de resposta e as concentrações correspondentes a 
cada animal (animais que apresentaram sinais de toxicidade, incluindo mortalidade, com indicação da natureza, da intensidade, do momento do aparecimento e da duração dos efeitos),
 
— pesos corporais de cada animal registados durante o estudo; data e 
momento da morte, se anterior à eutanásia programada; aparecimento, 
evolução e eventual reversibilidade de sinais de toxicidade em cada 
animal,  
— resultados da autópsia e resultados histopatológicos correspondentes a 
cada animal, se disponíveis,  
— estimativas de letalidade (por exemplo, CL  50 e DL  01 ), incluindo os 
intervalos de confiança a 95 % e o declive (se o método de avaliação o previr),
 
— relação estatística, incluindo uma estimativa do expoente "n" (protocolo 
C × t). Indicar também o nome do  software  estatístico utilizado.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 229
 
Discussão e interpretação dos resultados  
— deve ser dada especial atenção à descrição dos métodos utilizados para 
satisfazer os critérios deste método de ensaio, nomeadamente no que respeita à concentração-limite e à granulometria,
 
— examinar em que medida, com base nos resultados globais, as partículas 
são respiráveis, em especial se os critérios granulométricos não forem satisfeitos,
 
— explicar por que razão terá sido necessário eutanasiar animais que apre ­
sentavam sinais de dor ou de grande sofrimento continuado, com base 
nos critérios do documento de orientações n.  o 19 da OCDE, relativo aos 
parâmetros eticamente mensuráveis (8),  
— explicar por que razão foram interrompidos ensaios segundo o 
capítulo B.52 (4) deste anexo para realizar ensaios segundo o método 
B.2, se assim tiver sucedido,  
— a apreciação global do estudo deve incidir igualmente na coerência dos 
métodos utilizados para determinar as concentrações nominal e real e deve dar conta da relação entre estas concentrações,
 
— referir a causa provável da morte e o modo de ação predominante 
(sistémico ou local).  
REFERÊNCIAS:  
(1) OCDE (2009). Acute Inhalation Toxicity Testing. OECD Guideline for 
Testing of Chemicals No. 403. OCDE, Paris. Disponível em http: 
//www.oecd.org/env/testguidelines.  
(2) OCDE (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assessment No. 39. OCDE, Paris. Disponível em http://www.oecd.org/env/ testguidelines.
 
(3) Regulamento (CE) n.  o 1272/2008 do Parlamento Europeu e do Conselho, de 
16 de dezembro de 2008, relativo à classificação, rotulagem e embalagem de substâncias e misturas, que altera e revoga as Diretivas 67/548/CEE e 1999/45/CE, e altera o Regulamento (CE) n.
 o 1907/2006 (JO L 353 de 
31.12.2008, p. 1).  
(4) Capítulo B.52 deste anexo, "Toxicidade aguda por inalação — Método de 
classificação de toxicidade aguda".  
(5) Capítulo B.40 deste anexo, "Corrosão da pele  in vitro : Ensaio da resistência 
elétrica transcutânea (RET)".  
(6) Capítulo B.40.A deste anexo, "Corrosão da pele  in vitro : Ensaio em mo ­
delos de pele humana".  
(7) OCDE (2005), In Vitro Membrane Barrier Test Method For Skin Corrosion. 
OECD Guideline for Testing of Chemicals No. 435. OCDE, Paris. Dispo ­
nível em http://www.oecd.org/env/testguidelines.  
(8) OCDE (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used 
in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment No. 19. OCDE, Paris. Disponível em http: //www.oecd.org/env/testguidelines.
 
(9) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, So ­
ciety of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests.  Fund. Appl. Toxicol.  18:321-327.
 
(10) Phalen R.F. (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques (2nd 
Edition). Informa Healthcare, New York.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 230
 
(11) Pauluhn J., Thiel A. (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers.  J. Appl. Toxicol.  27:160- 
-167.  
(12) Zwart J.H.E., Arts J.M., ten Berge W.F., Appelman L.M. (1992). Alterna ­
tive Acute Inhalation Toxicity Testing by Determination of the Concentration-Time-Mortality Relationship: Experimental Comparison 
with Standard LC50 Testing.  Reg. Toxicol. Pharmacol.  15:278-290.
 
(13) Zwart J.H.E., Arts J.M., Klokman-Houweling E.D., Schoen E.D. (1990). 
Determination of Concentration-Time-Mortality Relationships to Replace LC50 Values.  Inhal. Toxicol.  2:105-117.
 
(14) Ten Berge W.F., Zwart A. (1989). More Efficient Use of Animals in Acute 
Inhalation Toxicity Testing.  J. Haz. Mat.  21:65-71.  
(15) OCDE (2009). Performance Assessment: Comparison of 403 and C × t 
Protocols via Simulation and for Selected Real Data Sets. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 104. OCDE, Paris. Disponível em http://www.oecd.org/env/testguidelines.
 
(16) Finney D.J. (1977). Probit Analysis, 3rd ed. Cambridge University Press, 
London/New York.  
DEFINIÇÃO  
Produto químico em estudo:  Qualquer substância ou mistura à qual seja apli ­
cado este método de ensaio.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 231
 
Apêndice 1  
Protocolo C × t  
1. Na avaliação da toxicidade por inalação, um estudo sequencial de concen ­
tração em função do tempo (C × t) pode constituir alternativa ao protocolo tradicional utilizado (12)(13)(14). O protocolo C × t deve ser privilegiado quando a regulamentação aplicável ou critérios científicos exigem o ensaio 
em animais durante vários períodos, nomeadamente para efeitos de planea ­
mento da resposta a situações de emergência e de ordenamento do território. Este procedimento começa, normalmente, pelo ensaio de uma concentração- -limite (sessão de exposição I), expondo os animais ao produto químico em 
estudo durante cinco períodos diferentes (por exemplo, 15, 30, 60, 120 e 
240 minutos), a fim de obter várias durações de exposição numa mesma sessão (ver a figura 1). Quando se trata do Regulamento (CE) n.
 o 1272/2008, as concentrações-limite aplicáveis são 20 000 ppm para 
gases, 20 mg/l para vapores e 5 mg/l para aerossóis. Estes níveis só podem 
ser excedidos se assim o exigirem a regulamentação aplicável ou razões científicas (ver o ponto 37 do texto principal do método B.2).
 
2. Nos casos em que se disponha de pouca ou nenhuma informação sobre a 
toxicidade do produto químico em estudo, deve efetuar-se um estudo pre ­
liminar no qual, geralmente durante 240 minutos, se expõem grupos de não 
mais de três animais de cada sexo às concentrações visadas escolhidas pelo 
diretor do estudo.  
3. Se, na sessão de exposição I, se ensaiar uma concentração-limite e a mor ­
talidade observada for inferior a 50 %, não são necessários mais ensaios. Se a regulamentação aplicável ou razões científicas exigirem que seja determi ­
nada a relação entre a concentração, o tempo de exposição e a resposta a 
esta última a níveis superiores à concentração-limite indicada, a exposição 
seguinte deve ser efetuada a uma concentração superior, por exemplo, dupla daquela (2L na figura 1).
 
4. Se for observada toxicidade à concentração-limite, são necessários ensaios 
complementares (estudo principal). Essas exposições adicionais são efetua ­
das a concentrações inferiores (sessões de exposição II, III ou IV’ na figura 
1) ou a concentrações superiores com tempos de exposição mais curtos 
(sessão de exposição IV na figura 1), adaptados e não tão espaçados.  
5. Efetua-se o ensaio (concentrações inicial e seguintes) com um animal 
de cada sexo por ponto (C,t) ou com dois animais do sexo mais sensível por ponto (C,t). Em determinadas circunstâncias, fica ao critério do diretor do estudo utilizar dois ratos de cada sexo por ponto (C,t) – ou quatro 
animais do sexo mais sensível por ponto (C,t) (15). A utilização de dois 
animais de cada sexo por cada ponto (C,t) normalmente reduz os erros sistemáticos e a variabilidade das estimativas, aumenta a taxa de êxito destas últimas e melhora a cobertura do intervalo de confiança, comparativamente 
ao protocolo aqui descrito. Para mais informações, consultar o documento 
GD 39 (2).
 
6. O ideal é efetuar cada sessão de exposição no seu dia. Este procedimento 
permite adiar a exposição seguinte até existir um grau razoável de confiança na sobrevivência dos animais e possibilita que o diretor do estudo adapte a concentração visada e os tempos de exposição para a sessão seguinte. 
Recomenda-se começar cada sessão de exposição pelo grupo que será ex ­
posto durante mais tempo — no exemplo dado, pelo grupo de 240 minutos de exposição, seguindo-se o grupo de 120 minutos e assim por diante. Se, por exemplo, após 90 minutos, os animais do grupo de 240 minutos esti ­
verem a morrer ou revelarem sinais de toxicidade intensos (por exemplo, 
alterações extremas da respiração, nomeadamente dificuldades respiratórias), não fará sentido expor um grupo durante 120 minutos, pois a mortalidade dos animais seria provavelmente de 100 %. Nessas circunstâncias, o diretor 
do estudo deverá selecionar tempos de exposição mais curtos para a con ­
centração em causa (por exemplo, 90, 65, 45, 33 e 25 minutos).
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 232
 
7. Deve medir-se com frequência a concentração na câmara, para determinar a 
concentração média no tempo para cada duração de exposição. Se possível, 
deve utilizar-se na análise estatística o momento da morte de cada animal, não a duração da exposição.
 
8. Uma vez efetuadas as quatro primeiras sessões de exposição, examinam-se 
os resultados obtidos para verificar se definem suficientemente uma curva 
da concentração em função do tempo (ver a figura 1). Se isso não acontecer, pode efetuar-se uma exposição suplementar (5.
 a concentração). A concen ­
tração e os tempos de exposição utilizados na 5.  a exposição devem ser 
escolhidos de forma a obter os dados em falta.  
9. Utilizam-se todas as sessões de exposição (incluída a primeira) para calcular 
a relação entre a concentração, o tempo de exposição e a resposta a esta última por análise estatística (16). Se possível, deve utilizar-se para cada 
ponto (C,t) a concentração média no tempo e o tempo de exposição até à 
morte (se ocorrer durante a exposição).
 
Figura 1  
Exemplo hipotético de uma relação entre a concentração, o tempo de 
exposição e a mortalidade causada no rato
  
Símbolos só com contorno: animais sobreviventes; símbolos a cheio: animais 
mortos;  
Triângulos: fêmeas; círculos: machos;  
Linha a cheio: valores de CL  50 (7,5 a 240 minutos) correspondentes a machos (n 
= 1);  
Linha a tracejado: valores de CL  50 (7,5 a 240 minutos) correspondentes a fêmeas 
(n = 1);  
Linhas com tracejado e ponteado: linhas de valores hipotéticos de CL  50 para 
machos e fêmeas com n = 2 (12).  
Glossário  
concentração;  
tempo de exposição.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 233
 
10. Exemplo do procedimento sequencial:  
Sessão de exposição I — Ensaio à concentração-limite (ver a figura 1)  
— Um animal de cada sexo por ponto (C,t); 10 animais no total (  a ); 
— Concentração visada (  b ) = concentração-limite;  
— Exposição de cinco grupos de animais a esta concentração visada du ­
rante 15, 30, 60, 120 e 240 minutos, respetivamente.  
↓ 
Sessão de exposição II  ( c ) — Estudo principal  
— Um animal de cada sexo por ponto (C,t); 10 animais no total;  
— Exposição de cinco grupos de animais a uma concentração mais 
baixa (  d ) (1/2L), aumentando ligeiramente a duração das exposições 
(espaçamento de √2; ver a figura 1).  
↓ 
Sessão de exposição III — Estudo principal  
— Um animal de cada sexo por ponto (C,t); 10 animais no total;  
— Exposição de cinco grupos de animais a uma concentração mais 
baixa (  d ) (1/4L), aumentando ligeiramente a duração das exposições 
(espaçamento de √2; ver a figura 1).  
↓ 
Sessão de exposição IV —  Estudo principal  
— Um animal de cada sexo por ponto (C,t); 10 animais no total;  
— Exposição de cinco grupos de animais a uma concentração mais 
baixa (  d ) (1/8 L), aumentando ligeiramente a duração das exposições 
(espaçamento de √2; ver a figura 1).  
↓ ou ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 234  
( a ) Se não se dispuser de informações sobre a sensibilidade de cada sexo, utilizam-se ratos 
de ambos os sexos, isto é, um animal de cada sexo para cada concentração. Com base 
nas informações disponíveis, ou caso durante esta sessão de exposição se verifique que 
um dos sexos é mais sensível, utilizam-se 10 animais desse sexo – dois animais por 
ponto (C,t) – a cada concentração no resto do ensaio. 
( b ) Quando se trata do Regulamento (CE) n.  o 1272/2008, as concentrações-limite aplicáveis 
são 20 000 ppm para gases, 20 mg/l para vapores e 5 mg/l para aerossóis. Caso se 
preveja toxicidade, ou se os resultados do estudo preliminar o aconselharem, devem 
escolher-se concentrações iniciais mais baixas. Se a regulamentação aplicável o exigir ou razões científicas o aconselharem, podem utilizar-se concentrações maiores. 
(
 c ) Idealmente, não se expõem animais ao nível de concentração seguinte enquanto não 
houver um grau razoável de confiança na sobrevivência dos últimos animais expostos. 
O diretor do estudo pode, então, ajustar a concentração visada e os tempos de exposição 
para a próxima sessão de exposição. 
( d ) A dose mínima (C × t) que produz mortalidade no ensaio à concentração inicial (primeira 
sessão de exposição) utiliza-se como orientação para estabelecer a próxima combinação 
de concentração e tempos de exposição. Normalmente, reduz-se a concentração a metade 
(1/2L) e Os animais são expostos durante períodos menos espaçados, distribuídos em 
série geométrica de fator 1,4 ( √2; ver a referência 11) à volta do tempo correspondente à 
dose letal mínima (t × C) observada na primeira exposição. A figura 1 mostra que, na sessão de exposição I, se observou mortalidade pela primeira vez ao fim de 15 minutos, 
pelo que os tempos de exposição da sessão II, centrados nos 30 minutos, foram 15, 21 
30, 42 e 60 minutos. Depois das duas primeiras exposições, é fortemente recomendado 
que se representem graficamente os dados conforme se fez na figura 1, verificando se a 
relação entre a concentração e o tempo define um ângulo de 45 graus (n = 1) ou se a 
relação entre a concentração, o tempo de exposição e a resposta a esta última tem um 
declive menor (por exemplo, n = 2) ou maior (por exemplo, n = 0,8). Nestes últimos 
casos, é fortemente recomendado que se adaptem em conformidade os tempos de ex ­
posição e concentrações seguintes.
 Sessão de exposição IV — Estudo principal  
— Um animal de cada sexo por ponto (C,t); 10 animais no total;  
— Exposição de cinco grupos de animais a uma concentração mais 
elevada (  e ) (2L), diminuindo ligeiramente a duração das exposições (es ­
paçamento de √2; ver a figura 1).  
Tratamento matemático dos resultados do protocolo C × t  
11. O procedimento C × t gerará 20 ou 25 pontos, consoante se utilizem quatro 
ou cinco concentrações durante cinco períodos de exposição. Com base 
nesses pontos, pode calcular-se a relação C × t recorrendo à seguinte análise estatística (16):
 
Equação 1:  
ProbitðPÞ ¼ b 0 þ b 1 ln C þ b 2 ln t 
em que C é a concentração e t é o tempo de exposição; ou  
Equação 2:  
Resposta ¼ ƒðC n tÞ 
em que  n ¼ b 1=b 2: 
Recorrendo à equação 1, pode calcular-se o valor de CL  50 correspondente a 
um determinado período (por exemplo, 4 h, 1 h, 30 minutos ou qualquer outro período da gama de tempos de exposição ensaiados) utilizando P = 5 
(50 % de resposta). De notar que a regra de Haber só se aplica se n = 1. 
Pode calcular-se a CL
 01 utilizando P = 2,67.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 235  
( e ) Em determinados casos, pode ser necessário aumentar a concentração (2L) e associar-lhe 
novos tempos de exposição menos espaçados, distribuídos em série geométrica de fator 
1,4 (√2) à volta do tempo correspondente à concentração letal mínima observada na 
primeira exposição. É preferível que a duração mínima da exposição seja superior a 
cinco minutos, não devendo a duração máxima exceder 8 horas.
 B.3. TOXICIDADE AGUDA (DÉRMICA)  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B (ponto A).  
1.2. DEFINIÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B (ponto B).  
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Nenhumas.  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Aplica-se a substância de ensaio sobre a pele de diversos grupos de 
animais de experiência, em doses graduadas, utilizando-se uma dose por grupo. Subsequentemente, procede-se à observação dos efeitos e das mortes ocorridas. Os animais que morrem durante o ensaio são 
submetidos a autópsia e no fim do ensaio os animais sobreviventes 
são também submetidos a autópsia.
 
Pode ser necessário sacrificar os animais que apresentem manifesta ­
ções graves e permanentes de angústia e dor. Não se deve dosear as substâncias de ensaio de uma forma que se saiba provocar dor acen ­
tuada e angústia devido às suas propriedades corrosivas ou irritantes.
 
1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
Nenhum.  
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.6.1.  Preparativos  
Os animais são mantidos nas suas gaiolas sob condições de alimenta ­
ção e alojamento experimentais durante pelo menos cinco dias antes da 
experiência. Antes do ensaio os animais adultos jovens e saudáveis são 
seleccionados aleatoriamente e distribuídos por grupos de tratamento. Aproximadamente 24 horas antes do ensaio deve remover-se o pêlo da região dorsal dos animais, tosquiando-o ou rapando-o. Ao tosquiar ou 
ao rapar o pêlo é necessário tomar precauções para evitar lesões da pele 
que possam alterar a sua permeabilidade. A área destinada à aplicação da substância de ensaio não poderá ser inferior a 10 % da superfície corporal. Sempre que se procede ao ensaio de substâncias sólidas, as 
quais podem ser pulverizadas quando necessário, a substância de en ­
saio deve ser humedecida com água ou com um veículo apropriado para garantir um bom contacto com a pele. No caso de se utilizar um 
veículo, deve tomar-se em consideração a influência desse veículo 
relativamente à penetração da substância de ensaio na pele. Geralmente utilizam-se as substâncias de ensaio líquidas não diluídas.
 
1.6.2.  Condições de ensaio  
1.6.2.1.  Animais de experiência  
Pode ser utilizado o rato ou o coelho. Podem ser utilizadas outras 
espécies sendo necessário justificar a sua utilização. Devem utilizar- -se as estirpes vulgarmente utilizadas em laboratório. Para cada sexo, 
no início do ensaio, o intervalo de variação do peso para os animais 
utilizados não deverá exceder ± 20 % do valor médio apropriado.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 236
 
1.6.2.2.  Número e sexo  
Utilizam-se pelo menos cinco animais para cada dose. Devem ser 
todos do mesmo sexo. No caso de se utilizar fêmeas estas devem ser nulíparas e não devem estar grávidas. No caso de existir informação 
disponível demonstrando que um dos sexos é nitidamente mais sen ­
sível, deve fazer-se a administração das doses aos animais desse sexo.
 
Nota:  Nos ensaios de toxicidade aguda com animais de uma ordem 
superior à dos roedores deve levar-se em consideração a possibili ­
dade de utilizar um menor número de animais. As doses deverão ser 
seleccionadas cuidadosamente e deverão ser feitos todos os esforços 
possíveis para não exceder as doses moderadamente tóxicas. Nestes ensaios deve evitar-se a administração de doses letais da substância de ensaio.
 
1.6.2.3.  Doses  
Estas devem ser em número suficiente, pelo menos três, e adequa ­
damente espaçadas para originarem grupos de ensaio com uma di ­
versidade de efeitos tóxicos e de taxas de mortalidade. Ao tomar-se a decisão sobre as doses deve levar-se em consideração quaisquer 
efeitos irritantes ou corrosivos. Os dados deverão ser suficientes 
para permitirem traçar uma curva dose/resposta e, sempre que pos ­
sível, uma determinação aceitável do valor DL
 50 . 
1.6.2.4.  Teste limite  
Pode efectuar-se um teste limite com uma dose de pelo menos 2 000 
mg/kg de peso do corpo num grupo de cinco machos e de cinco 
fêmeas utilizando os procedimentos anteriormente descritos. No caso de se observar mortalidade associada ao composto é necessário con ­
siderar a hipótese de realizar um estudo completo.
 
1.6.2.5.  Período de observação  
O período de observação deve ser de pelo menos 14 dias. Contudo o 
período de duração da observação não deve ser fixo rigidamente. Deve ser determinado pelas reacções tóxicas, o momento de apare ­
cimento de sintomas e a duração do período de recuperação; em 
consequência, pode ser prolongado quando se considerar necessário. 
O momento em que as manifestações de toxicidade aparecem e desaparecem e o momento da morte são importantes, especialmente se existir uma tendência para retardar as mortes.
 
1.6.3.  Procedimento  
Os animais serão colocados em gaiolas individuais. A substância de 
ensaio será aplicada uniformemente numa área aproximadamente equivalente a 10 % da superfície total do corpo. No caso de subs ­
tâncias altamente tóxicas, a superfície a utilizar poderá ser menor 
mas a camada da substância deverá ser o mais fina e uniforme 
possível.
 
A substância de ensaio deve ser mantida em contacto com a pele por 
meio de uma gaze porosa e de um adesivo antialérgico, durante um 
período de exposição de 24 horas. A superfície tratada será por sua 
vez convenientemente coberta de maneira a manter no seu lugar a gaze e a substância de ensaio e de modo a evitar que os animais ingiram a substância. Podem ser utilizados aparelhos de contenção 
para evitar a ingestão da substância mas não se recomenda a imo ­
bilização completa,
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 237
 
No fim do período de exposição é necessário eliminar todos os 
resíduos da substância, se possível, utilizando água ou qualquer 
outro meio adequado para limpeza da pele.  
As observações devem ser feitas e registadas sistematicamente. São 
feitas fichas individuais para cada animal. As observações deverão 
ser efectuadas com frequência regular durante o primeiro dia. Deve efectuar-se um exame clínico cuidadoso pelo menos uma vez durante cada dia de trabalho, e deverão ser efectuadas outras observações 
diariamente tomando-se acções apropriadas para minimizar as perdas 
de animais submetidos a estudo, por exemplo, efectuar-se-á a autóp ­
sia ou a refrigeração dos animais encontrados mortos e efectuar-se-á o isolamento ou o sacrifício dos animais fracos ou moribundos.
 
As observações deverão incluir as modificações do pêlo, pele tratada, 
dos olhos e das mucosas, do aparelho respiratório, do aparelho cir ­
culatório, do sistema nervoso autónomo e central, bem como a ac ­
tividade somatomotora e do comportamento. Deve prestar-se parti ­
cular atenção à observação de tremores, convulsões, salivação, diar ­
reia, letargia, sono e coma. O momento da morte deve ser registado com uma exactidão tão grande quanto possível. Os animais que 
morrem durante o ensaio e os que sobrevivem até ao fim do ensaio 
são submetidos a autópsia. Deverão ser registadas todas as modifi ­
cações patológicas. Sempre que for aconselhável deverão ser prepa ­
radas amostras dos tecidos para exame histopatológico.
 
Avaliação da toxicidade no outro sexo  
Depois de se ter completado o estudo relativamente a um dos sexos, 
submete-se a ensaio pelo menos um grupo de cinco animais do sexo 
oposto para se verificar se os animais desse sexo não são nitidamente mais sensíveis à substância de ensaio. Em circunstâncias individuais pode justificar-se a utilização de menos animais. No caso de existir 
informação adequada disponível suficiente para demonstrar que os 
animais do sexo testado são nitidamente mais sensíveis, é dispensá ­
vel proceder a ensaios com animais do outro sexo.
 
2. RESULTADOS  
Os resultados deverão ser resumidos em quadros indicando-se para 
cada grupo de experiência o número de animais no início do teste, o 
momento da morte de cada animal, o número de animais que exibem outras manifestações de toxicidade, a descrição dos efeitos tóxicos e 
os resultados da autópsia. Os pesos de cada animal deverão ser 
determinados e registados imediatamente antes da administração da substância de ensaio, decorrida uma semana e no momento da morte; as variações de peso deverão ser calculadas e registadas quando o 
período de sobrevivência exceder um dia. Procede-se ao registo dos 
animais que tiverem que ser sacrificados devido à dor e à angústia provocados pela substância procedendo-se de igual modo para as mortes provocadas pela substância. O valor DL
 50 pode ser determi ­
nado por um método reconhecido.  
A avaliação dos resultados deverá incluir a relação, se existir, entre a 
exposição dos animais à substância de ensaio e a incidência e gra ­
vidade de todas as anormalidades, incluindo as anomalias de com ­
portamento e clínicas, as lesões graves, as modificações do peso do corpo, a mortalidade e quaisquer outros efeitos toxicológicos.
 
3. RELATÓRIO  
3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação se ­
guinte:  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 238
 
— espécies, estirpe, origem, condições ambientais, dieta, etc.,  
— condições experimentais (incluindo o método de limpeza da pele 
e tipo de gaze: oclusiva ou não oclusiva),  
— níveis de dosagem (com veículo, no caso de este ser utilizado, e 
as concentrações),  
— sexo dos animais submetidos à experiência,  
— quadros com os dados de resposta por sexo e por valores de 
dosagem (isto é, número de animais que morreram ou que foram 
sacrificados durante os ensaios, número de animais que apresen ­
tam manifestações de toxicidade, número de animais expostos),  
— momento da morte após a administração da dose, razões e crité ­
rios utilizados para o sacrifício dos animais,  
— todas as observações,  
— valor DL  50 para o grupo do sexo submetido ao estudo completo 
ao longo do período de 14 dias (especificando-se o método de 
determinação),  
— intervalo de confiança a 95 % para o valor DL  50 (no caso de ser 
possível obter esse valor),  
— curva dose/mortalidade e seu declive (no caso de isto ser possível 
com o método de determinação),  
— resultados da autópsia,  
— quaisquer resultados das observações histopatológicas,  
— resultados de qualquer ensaio efectuado sobre o outro sexo,  
— discussão dos resultados (deve prestar-se particular atenção ao 
efeito que o sacrifício dos animais durante o ensaio pode ter sobre o valor DL
 50 calculado),  
— interpretação dos resultados.  
3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B (ponto D).  
4. REFERÊNCIAS  
Ver Introdução Geral, parte B (ponto E).  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 239
 
B.4. TOXICIDADE AGUDA: IRRITAÇÃO/CORROSÃO DÉRMICA  
1. MÉTODO  
O presente método baseia-se na publicação OECD TG 404 (2002) 
(normas de ensaio da OCDE).  
1.1. INTRODUÇÃO  
Na preparação do presente método optimizado foi dada especial 
atenção aos possíveis melhoramentos através da avaliação de toda a informação já existente sobre a substância de ensaio, de modo a evitar testes desnecessários em animais de laboratório e assim ter em 
consideração a problemática da protecção dos animais. O presente 
método inclui a recomendação de se levar a cabo uma análise da importância das provas de todos os dados relevantes existentes antes de se efectuar o ensaio  in vivo  descrito para irritação/corrosão pela 
substância. No caso de não se encontrarem disponíveis dados sufi ­
cientes, estes podem ser obtidos através da aplicação de ensaios sequenciais (1). A estratégia de ensaio recomendada inclui a execu ­
ção de ensaios  in vitro  validados e aceites e é fornecida como anexo 
ao presente método. Além disso, quando for apropriado, recomenda- -se a aplicação sucessiva (não simultânea) de três pensos de ensaio ao animal no ensaio  in vivo  inicial.
 
Tendo em consideração o interesse científico e a protecção dos 
animais, não devem ser efectuados ensaios  in vivo  até se proceder 
a uma avaliação de todos os dados disponíveis relevantes à potencial corrosibilidade/irritabilidade dérmica de uma substância mediante 
uma análise de importância das provas. Os dados devem incluir 
resultados de estudos em humanos e/ou animais de laboratório, pro ­
vas de corrosibilidade/irritabilidade de uma ou mais substâncias es ­
truturalmente relacionadas, ou de misturas dessas substâncias, dados 
que demonstrem elevada acidez ou alcalinidade da substância (2) (3) 
e resultados de ensaios  in vitro  ou ex vivo  validados e aceites (4) (5) 
(5a). Esta análise deve reduzir a necessidade de ensaios  in vivo  da 
corrosibilidade/irritabilidade dérmica de substâncias para as quais já 
existem dados suficientes provenientes de outros estudos em relação 
a estes dois factores.
 
Junta-se em anexo ao presente método uma estratégia de ensaio 
sequencial preferível, que inclui a execução de ensaios validados e 
aceites  in vitro  ou ex vivo  para irritação/corrosão. A estratégia foi 
desenvolvida num grupo de trabalho ( workshop ) da OCDE (6), no 
qual foi recomendada por unanimidade dos participantes, tendo sido 
adoptada como estratégia de ensaio recomendada pelo sistema har ­
monizado a nível mundial para a classificação de substâncias quími ­
cas (GHS) (7). Apesar de esta estratégia de ensaio sequencial não ser parte integrante do método de ensaio B.4, recomenda-se que a 
mesma seja adoptada antes da realização de ensaios  in vivo.  
No caso de novas substâncias recomenda-se uma metodologia de ensaio por etapas para a obtenção de dados científicos sobre a corrosibilidade/irritabilidade da substância. No caso de substâncias 
já existentes, mas cujos dados insuficientes sobre irritação/corrosão 
dérmica são insuficientes, recomenda-se a adopção desta estratégia para a obtenção dos dados em falta. Caso se opte por uma estratégia ou procedimento de ensaio diferente ou se decida não aplicar uma 
metodologia de ensaio por etapas, deve apresentar-se uma justifica ­
ção para a opção feita.
 
Um ensaio  in vivo,  apenas deve ser considerado caso não seja pos ­
sível determinar a corrosibilidade, ou a irritabilidade, através da 
análise de importância das provas e de acordo com a estratégia de 
ensaio sequencial (ver anexo).  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 240
 
1.2. DEFINIÇÕES  
Irritação dérmica:  consiste na produção de danos reversíveis na 
pele após a aplicação da substância de ensaio, por um período não superior a quatro horas.
 
Corrosão dérmica:  consiste na produção de danos irreversíveis na 
pele — por exemplo, necrose visível através da epiderme e que 
atinge a derme, após a aplicação de uma substância de ensaio por 
um período não superior a quatro horas. As reacções corrosivas típicas são úlceras, sangramento, crostas ensanguentadas e, após o período de observação de 14 dias, empalidecimento devido à desco ­
loração da pele, áreas alargadas de alopecia e cicatrizes. Deve ser 
considerada uma análise histopatológica na avaliação de lesões du ­
vidosas.
 
1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
A substância de ensaio é aplicada em dose única na pele de um 
animal de experiência; as áreas de pele não tratadas do animal de 
experiência são utilizadas como controlo. O grau de irritação/ ­
corrosão é observado e registado em intervalos determinados e deta ­
lhadamente descrito de modo a permitir uma avaliação completa dos 
efeitos. A duração do estudo deve ser suficiente para avaliar a re ­
versibilidade ou irreversibilidade dos efeitos observados.  
Os animais que apresentarem sinais de se encontrarem em grave 
perigo e/ou apresentarem sinais de dor durante qualquer das etapas do ensaio devem ser abatidos e a substância deve ser classificada de acordo com estas observações. Os critérios para a decisão de abater 
animais moribundos e animais em grave sofrimento podem ser con ­
sultados na referência (8).
 
1.4. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.4.1.  Preparação do ensaio  in vivo  
1.4.1.1.  Selecção de espécies animais  
O coelho albino é o animal de laboratório mais adequado, devendo 
ser usados coelhos jovens adultos saudáveis. A utilização de outras espécies deve ser justificada.
 
1.4.1.2.  Preparação dos animais  
Aproximadamente 24 horas antes do ensaio, o pêlo deve ser remo ­
vido por corte curto da área dorsal do tronco dos animais. Deve ter- -se o cuidado de não ferir a pele do animal e só devem ser usados animais com pele saudável e intacta.
 
Algumas estirpes de coelhos têm tufos densos de pêlo, que são mais 
proeminentes em certas épocas do ano. Estas áreas de crescimento 
denso de pêlo não devem ser utilizadas como local de ensaio.  
1.4.1.3.  Condições de alojamento e alimentação  
Os animais devem ser alojados individualmente. A temperatura do 
biotério para os coelhos deve ser de 20  o C (± 3  o C). Embora a humi ­
dade relativa deva ser de pelo menos 30 % e de preferência não 
exceder os 70 %, excepto durante o período de limpezas, o valor 
pretendido deve ser de 50 %-60 %. A iluminação deve ser artificial, com uma sequência de 12 horas de luz seguida de uma de 12 horas de escuridão. Na alimentação, podem ser utilizadas dietas conven ­
cionais de laboratório e deve ser fornecida água de beber sem res ­
trições.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 241
 
1.4.2.  Protocolo de ensaio  
1.4.2.1.  Aplicação da substância de ensaio  
A substância de ensaio deve ser aplicada numa pequena área de pele 
(aproximadamente 6 cm  2 ) e coberta com um penso de gaze, colado 
com fita adesiva não irritante. Nos casos em que não é possível 
aplicação directa (por exemplo, líquidos e algumas pastas), a subs ­
tância de ensaio deve ser aplicada num penso de gaze, que é, por sua vez, aplicado à pele. Durante o período de exposição, o penso deve 
estar em contacto com a pele de uma forma ligeiramente solta atra ­
vés de uma ligadura semioclusiva adequada. Se a substância de ensaio for aplicada num penso, este deve ser mantido sobre a pele 
de modo a assegurar um bom contacto e uma distribuição uniforme 
da substância na pele. Deve ser evitado o acesso do animal ao penso e a ingestão ou inalação da substância de ensaio.
 
As substâncias de ensaio líquidas são geralmente utilizadas sem 
diluição. Quando se ensaiam sólidos (que podem ser pulverizados, 
caso tal seja considerado necessário), a substância de ensaio deve ser humedecida com a menor quantidade de água (ou, se necessário, 
com outro excipiente adequado) suficiente para assegurar um bom 
contacto com a pele. No caso de serem utilizados excipientes que não água, a influência potencial do excipiente na irritação da pele pela substância de ensaio deve ser mínima ou nula.
 
No final do período de exposição, que é normalmente de quatro 
horas, a substância de ensaio residual deve ser removida, caso tal seja praticável, utilizando água ou um solvente apropriado, que não 
altere a resposta ou a integridade da epiderme.
 
1.4.2.2.  Nível de dosagem  
Aplica-se ao local de ensaio uma dose de 0,5 ml de líquido ou de 
0,5 g de sólido ou pasta.  
1.4.2.3.  Ensaio inicial (ensaio in vivo de irritação/corrosão dérmica utili ­
zando um animal)  
Recomenda-se vivamente que o ensaio  in vivo  seja efectuado inicial ­
mente utilizando apenas um animal, sobretudo quando se suspeita que a substância é potencialmente corrosiva. Tal procedimento está em con ­
formidade com a estratégia de ensaio sequencial (ver anexo 1).
 
No caso de uma substância ter sido considerada corrosiva com base 
numa análise de importância das provas, não são necessários ensaios adicionais em animais. Para a maior parte das substâncias que se 
suspeite serem corrosivas, não são normalmente necessários ensaios  
in vivo  adicionais. No entanto, nos casos em que, devido a insufi ­
ciência de provas, se considere necessária a obtenção de dados adi ­
cionais, pode ser efectuado um número restrito de ensaios em ani ­
mais utilizando a seguinte metodologia: aplicação sequencial de até 
três pensos de ensaio ao animal. O primeiro penso é removido após três minutos. Caso não se observe qualquer reacção grave na pele, aplica-se um segundo penso, que é removido ao fim de uma hora. Se 
nesta etapa as observações indicarem que se pode aumentar o tempo 
de exposição para quatro horas em condições não agressivas para o animal, aplica-se um terceiro penso, que é removido após quatro 
horas, sendo a resposta devidamente graduada.
 
Caso seja observado um efeito corrosivo após qualquer das três 
exposições sequenciais, o ensaio é imediatamente finalizado. Caso não se observe qualquer efeito corrosivo após a remoção do último 
penso, o animal é observado durante 14 dias, excepto se desenvolver 
corrosão antes do final desse período.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 242
 
Nos casos em que a substância de ensaio não seja susceptível de 
provocar corrosão, mas que possa ser irritante, deve ser aplicado um 
único penso a um animal durante quatro horas.  
1.4.2.4.  Ensaio de confirmação (ensaio in vivo de irritação dérmica com 
animais adicionais)  
Se não for observado um efeito corrosivo no ensaio inicial, a res ­
posta irritante ou negativa deve ser confirmada utilizando até dois 
animais adicionais, cada um com um penso e por um período de exposição de quatro horas. Se for observado um efeito irritante no ensaio inicial, o ensaio de confirmação pode ser efectuado de uma 
forma sequencial ou através da exposição simultânea de dois animais 
adicionais. No caso excepcional de não ser efectuado um ensaio inicial, podem tratar-se dois ou três animais com um penso único, que é removido quatro horas após a aplicação. No caso de se utili ­
zarem dois animais e ambos apresentarem a mesma resposta, não é 
necessário efectuar mais ensaios. Caso contrário, o terceiro animal é igualmente ensaiado. Pode ser necessária a utilização de animais adicionais para confirmar respostas equívocas.
 
1.4.2.5.  Período de observação  
O período de observação deve ter uma duração suficiente para uma 
avaliação completa da reversibilidade dos efeitos observados. No entanto, a experiência deve ser interrompida em qualquer altura caso o animal apresente sintomas continuados de dor intensa ou de 
se encontrar em situação de perigo. Para a determinação da reversi ­
bilidade dos efeitos, os animais devem ser observados durante 14 dias após a remoção dos pensos. No caso de se observar reversibi ­
lidade antes do fim do período de 14 dias, deve interromper-se a 
experiência.
 
1.4.2.6.  Observações clínicas e graduação das reacções da pele  
Todos os animais devem ser examinados para sintomas de eritema e 
edema, sendo as respostas avaliadas aos 60 minutos e às 24, 48 e 72 horas após a remoção do penso. No ensaio inicial com um animal, o 
local de ensaio é igualmente examinado imediatamente após a remo ­
ção do penso. As reacções dérmicas são graduadas e registadas de acordo com a graduação da tabela infra. Caso ocorram danos na pele que não possam ser identificados como irritação ou corrosão após 72 
horas, pode ser necessário efectuar observações até ao dia 14 para 
determinar a reversibilidade dos efeitos. Além da observação de irritação, todos os efeitos tóxicos locais, tais como perda de gordura cutânea e quaisquer efeitos sistémicos adversos (por exemplo, efeitos 
em sintomas de toxicidade e efeitos no peso corporal), devem ser 
descritos e registados pormenorizadamente. Poderá ser efectuado um exame histopatológico para clarificar respostas equívocas.
 
A graduação das respostas dérmicas é necessariamente subjectiva. O 
pessoal que executa as observações deve ser treinado adequadamente 
no sistema de graduação utilizado (ver tabela infra) para se promover a harmonização da graduação da resposta dérmica e auxiliar os laboratórios de ensaio e as pessoas envolvidas na obtenção e inter ­
pretação das observações. Poderá ser útil a consulta de um guia 
ilustrado para graduação da irritação dérmica e outras lesões (9).
 
2. DADOS  
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS  
Os resultados do estudo devem ser resumidos sob a forma de tabela 
no relatório final de ensaio e devem abranger todos os itens descritos 
na secção 3.1.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 243
 
2.2. ANÁLISE DOS RESULTADOS  
Os resultados de irritação dérmica devem ser avaliados conjunta ­
mente com a natureza e a gravidade das lesões e a sua reversibili ­
dade ou ausência de reversibilidade. As respostas individuais não 
representam um padrão absoluto das propriedades irritantes do ma ­
terial, já que são também avaliados outros efeitos do material de ensaio. Pelo contrário, os resultados individuais devem ser encarados como valores de referência, que necessitam de ser avaliados conjun ­
tamente com todas as outras observações efectuadas durante o estu ­
do.
 
Deve ser considerada a reversibilidade das lesões dérmicas na ava ­
liação da resposta irritante. Nos casos em que ocorrerem respostas como alopecia (área limitada), hiperqueratose, hiperplasia e desca ­
mação persistentes no final do período de 14 dias de observação, a 
substância de ensaio deve ser considerada irritante.
 
3. RELATÓRIO  
3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deverá incluir as seguintes informações:  
Fundamentação lógica para o ensaio  in vivo : análise de importância 
das provas dos dados de ensaio preexistentes, incluindo os resultados da estratégia de ensaio sequencial:
 
— descrição dos dados relevantes disponíveis de ensaios anteriores;  
— dados obtidos em cada etapa da estratégia de ensaio;  
— descrição dos ensaios  in vitro  efectuados, incluindo detalhes so ­
bre o protocolo, resultados obtidos com substâncias de ensaio/ ­
referência;  
— análise de importância das provas para a realização do estudo  in 
vivo.  
Substância de ensaio:  
— dados de identificação (por exemplo, número CAS, origem, grau 
de pureza, impurezas conhecidas, número de lote);  
— natureza física e propriedades físico-químicas (por exemplo, pH, 
volatilidade, solubilidade, estabilidade);  
— no caso de misturas, composição e percentagens relativas dos 
componentes.  
Excipiente:  
— identificação, concentração (quando apropriado), volume utiliza ­
do; 
— justificação para a escolha do excipiente.  
Animais de ensaio:  
— espécie/estirpe utilizada, fundamentação lógica para a utilização 
de outro tipo de animais que não coelhos albinos;  
— número de animais de cada sexo;  
— peso individual dos animais no início e no final do ensaio;  
— idade no início do estudo;  
— origem dos animais, condições de alojamento, dieta, etc.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 244
 
Condições do ensaio:  
— técnica de preparação do local de aplicação do penso;  
— descrição pormenorizada dos materiais utilizados no penso e da 
técnica de aplicação do penso;  
— descrição pormenorizada da preparação, aplicação e remoção da 
substância de ensaio.  
Resultados:  
— tabelas com a classificação das respostas de irritação/corrosão 
para cada animal em cada observação;  
— descrição de todas as lesões observadas;  
— descrição pormenorizada da natureza e grau da irritação ou cor ­
rosão observadas e de quaisquer observações histopatológicas;  
— descrição de quaisquer outros efeitos adversos locais (por exem ­
plo, perda de gordura cutânea) e efeitos sistémicos, além da irritação ou corrosão dérmica.
 
Análise dos resultados.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Ver ­
haar, H.J.M., Zbinden, P. (1995) The Integrated Use of Alter ­
native Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, p. 410-429.
 
(2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on 
Animals. Toxicology  In Vitro , 2, p. 19-26.
 
(3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, p. 709-720.
 
(4) ECETOC (1990) Monograph No 15, «Skin Irritation», Euro ­
pean Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brus ­
sels. 
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. 
(1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology  In Vitro  12, p. 483-524.
 
(5a) Método de Ensaio B.40. Corrosão dérmica.  
(6) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Re ­
port of the OECD Workshop on Harmonisation of Validation 
and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test 
Methods. Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http:// www.oecd1.org/ehs/test/background.htm).
 
(7) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of Che ­
mical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the 
Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, 
November 1998 (http://www.oecd1.org/ehs/Class/HCL6.htm).  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 245
 
(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Asses ­
sment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for 
Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD En ­
vironmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No 19 (http://www.oecd1.org/ehs/test/monos. 
htm).
 
(9) EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions,  (20T-2004).  United Sta ­
tes Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990.
 
[Disponível no Secretariado da OCDE.]  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 246
 
Tabela I  
GRADUAÇÃO DE REACÇÕES DÉRMICAS  
Formação de eritema e escara  
Ausência de eritema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Eritema muito ligeiro (fracamente discernível) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Eritema bem definido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 Eritema moderado a grave . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Eritema grave (vermelhidão cor de carne) e formação de escara que 
impede a graduação do eritema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
 
Máximo possível: 4  
Formação de edema  
Ausência de edema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Edema muito ligeiro (fracamente discernível) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Edema ligeiro (bordos da área bem definidos por elevação delineada) 2 Edema moderado (com uma elevação de aproximadamente 1 mm) . . 3 Edema grave (com uma elevação superior a 1 mm e excedendo a área 
de exposição) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
 
Máximo possível: 4  
Poderá ser efectuado um exame histopatológico para clarificar respostas equívo ­
cas. ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 247
 
ANEXO  
Uma estratégia de ensaio sequencial para a irritação e corrosão dérmica  
CONSIDERAÇÕES GERAIS  
No sentido de atender aos interesses quer científicos, quer da protecção dos 
animais, torna-se importante evitar o uso desnecessário de animais e minimizar 
os ensaios que possam causar reacções graves em animais. Deve ser avaliada 
toda a informação sobre a substância que seja relevante para a sua potencial capacidade irritante/corrosibilidade dérmica antes de se considerarem os ensaios  
in vivo.  É possível que existam já dados suficientes para classificar a substância 
de ensaio segundo o seu potencial irritante ou corrosivo dérmico, sem necessi ­
dade de recorrer a ensaios em animais de laboratório. Assim, a utilização de uma análise de importância das provas e de uma estratégia de ensaio sequencial minimizará a necessidade de ensaios  in vivo,  especialmente no caso de subs ­
tâncias com elevada probabilidade de produzirem reacções graves.
 
Recomenda-se a utilização da análise de importância das provas para avaliar a 
informação existente sobre irritação e corrosão dérmica de substâncias, a fim de 
determinar a necessidade de se efectuarem estudos adicionais, diferentes dos 
estudos dérmicos  in vivo,  que sejam úteis para caracterizar o referido potencial. 
No caso de serem necessários estudos adicionais, recomenda-se a utilização de uma estratégia de ensaio sequencial para a obtenção dos dados experimentais 
relevantes. No caso de substâncias para as quais não exista nenhuma história de 
ensaios, deve ser utilizada a estratégia de ensaio sequencial para a obtenção dos dados necessários para avaliar a sua irritação/corrosão dérmica. A estratégia de ensaio descrita no presente anexo foi desenvolvida num grupo de trabalho 
(workshop ) da OCDE (1). Foi subsequentemente confirmada e ampliada no 
sistema harmonizado e integrado de classificação de perigos para a saúde humana e efeitos ambientais de substâncias químicas, tal como foi aprovado pela 28.
 a 
sessão conjunta do comité das substâncias químicas e do grupo de trabalho de 
substâncias químicas, em Novembro de 1998 (2).  
Apesar da presente estratégia de ensaio não fazer parte integrante do método de 
ensaio B.4, ela expressa a metodologia recomendada para a determinação das 
características de irritação/corrosão dérmica. Esta metodologia representa não só 
a melhor prática como também um ponto de referência ético para o ensaio  in vivo  
para irritação/corrosão dérmica. O método de ensaio fornece uma orientação para a realização do ensaio  in vivo  e resume os factores que devem ser considerados 
antes de ponderar a execução deste ensaio. A estratégia fornece uma metodologia 
para a avaliação dos dados existentes sobre as propriedades de irritação/corrosão dérmica de substâncias de ensaio e uma metodologia em séries para a obtenção de dados relevantes sobre substâncias para as quais sejam necessários estudos 
adicionais ou não tenham sido efectuados quaisquer estudos. Também se reco ­
menda a realização de ensaios  in vitro  ou ex vivo  validados e aceites para o 
estudo de irritação/corrosão dérmica em circunstâncias específicas.
 
DESCRIÇÃO DA ESTRATÉGIA DE AVALIAÇÃO E ENSAIO  
Antes da realização dos ensaios como parte da estratégia de ensaio sequencial 
(figura), deve ser avaliada toda a informação disponível de modo a determinar a necessidade de realização de ensaios dérmicos  in vivo.  Apesar de ser possível 
obter informação significativa a partir da avaliação de um só parâmetro (por 
exemplo, pH extremo), deve ser avaliada a totalidade da informação existente. Para uma decisão baseada na análise da importância das provas, devem ser avaliados todos os dados relevantes sobre os efeitos da substância em causa 
ou dos seus análogos estruturais, e deve apresentar-se uma justificação funda ­
mentada para a decisão tomada. Deve dar-se especial relevância aos dados exis ­
tentes sobre a substância relativamente a humanos e animais e, em seguida, aos resultados dos ensaios  in vitro  ou ex vivo.  Sempre que possível, devem ser 
evitados estudos  in vivo  de substâncias corrosivas. Os factores considerados na 
estratégia de ensaio incluem:
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 248
 
Avaliação dos dados existentes sobre humanos e animais (etapa 1).  Devem 
considerar-se em primeiro lugar os dados existentes sobre humanos — por 
exemplo, estudos clínicos e ocupacionais, relatórios de casos clínicos e/ou dados de ensaios em animais como, por exemplo, dados obtidos em estudos de toxici ­
dade de exposição dérmica simples ou repetida — já que estes dados fornecem 
informação directamente relacionada com os efeitos na pele. As substâncias que 
apresentem capacidade irritante ou corrosiva conhecidas, assim como aquelas para as quais existem dados claros de não serem corrosivas nem irritantes, não necessitam de ser ensaiadas em estudos  in vivo.
 
Análise de relações estrutura-actividade (SAR) (etapa 2).  Devem ser considera ­
dos os resultados de ensaios de substâncias químicas estruturalmente semelhantes desde que se encontrem disponíveis. No caso de existirem dados suficientes 
sobre humanos e/ou animais relativos aos efeitos de substâncias estruturalmente 
semelhantes, ou misturas deste tipo de substâncias, indicativos do seu potencial de irritação/corrosão dérmica, pode presumir-se que a substância de ensaio em 
avaliação produzirá as mesmas respostas. Nestes casos, poderá não ser necessário 
proceder a ensaios da substância de ensaio. Os dados negativos obtidos de estudos de substâncias estruturalmente semelhantes ou misturas dessas substân ­
cias não constituem prova suficiente de não corrosibilidade/não irritabilidade da 
substância segundo a estratégia de ensaio sequencial. Devem ser utilizadas abor ­
dagens de SAR validadas e aceites para identificação do potencial de irritação e de corrosão dérmica.
 
Propriedades físico-químicas e reactividade química (etapa 3).  As substâncias 
que apresentam um pH extremo, tal como ≤ 2,0 ou ≥ 11,5, podem ter efeitos 
locais fortes. Se o pH extremo servir como base de identificação da substância como corrosiva para a pele, a sua reserva ácida/alcalina (ou poder tampão) deve 
ser também tida em consideração (3) (4). Se o poder tampão indicar que a 
substância pode não ser corrosiva para a pele, devem ser efectuados ensaios adicionais para confirmar esta indicação, de preferência utilizando ensaios  in 
vitro  ou ex vivo  validados e aceites (ver etapas 5 e 6).
 
Toxicidade dérmica (etapa 4).  Caso se tenha provado que uma substância quí ­
mica é muito tóxica por via dérmica, pode não ser exequível um estudo  in vivo  
de irritação/corrosão dérmica por a quantidade de substância de ensaio normal ­
mente aplicada poder exceder a dose muito tóxica, resultando consequentemente na morte ou em sofrimento grave dos animais. Além disso, pode não ser neces ­
sário efectuar ensaios dérmicos de irritação/corrosão adicionais quando os estu ­
dos de toxicidade dérmica utilizando coelhos albinos tenham sido efectuados até 
um nível de dosagem limite de 2 000 mg/kg de peso corporal ou superior e não tenha sido observada qualquer irritação ou corrosão dérmica. Deve ter-se em conta uma série de considerações aquando da avaliação da toxicidade dérmica 
aguda em estudos efectuados anteriormente. Por exemplo, a informação contida 
no relatório sobre lesões dérmicas pode estar incompleta. Os ensaios e as obser ­
vações podem ter sido efectuados noutra espécie que não o coelho, podendo as 
várias espécies diferir grandemente na sensibilidade das respostas apresentadas. A 
forma como a substância de ensaio foi aplicada aos animais pode não ter sido adequada à avaliação da irritação/corrosão da pele [por exemplo, diluição das substâncias para ensaio da toxicidade dérmica (5)]. No entanto, nos casos em que 
os estudos de toxicidade dérmica em coelhos foram projectados e efectuados 
correctamente, os resultados negativos podem ser considerados prova suficiente de que a substância não é irritante nem corrosiva.
 
Resultados de ensaios  in vitro  ou ex vivo  (etapas 5 e 6).  Não é necessário 
proceder a ensaios em animais com substâncias que tenham apresentado proprie ­
dades corrosivas ou de irritação grave num ensaio  in vitro  ou ex vivo  validado e 
aceite (6) (7) que tenha sido desenvolvido para avaliar especificamente estes 
efeitos. Pode considerar-se que tais substâncias produzirão efeitos graves seme ­
lhantes  in vivo.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 249
 
Ensaio  in vivo  em coelhos (etapas 7 e 8) . Caso seja tomada a decisão de efectuar 
um ensaio  in vivo  com base numa análise da importância das provas, este deve 
começar por um ensaio inicial usando um animal. Se os resultados deste ensaio indicarem que a substância é corrosiva para a pele, não devem ser efectuados outros ensaios. Se o ensaio inicial não revelar quaisquer efeitos corrosivos, a 
resposta irritante ou negativa deve ser confirmada utilizando até dois animais 
adicionais com um período de exposição de quatro horas. No caso de se observar um efeito irritante no ensaio inicial, o ensaio de confirmação deve ser efectuado de uma forma sequencial ou através da exposição de dois animais adicionais 
simultaneamente.
 
REFERÊNCIAS  
(1) OECD, (1996) Test Guidelines Programme: Final Report on the OECD 
Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for 
Alternative Toxicological Test Methods. Held on Solna, Sweden, 
22-24 January 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).  
(2) OECD, (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as en ­
dorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the 
Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/ 
Class/HCL6.htm).  
(3) Worth, A.P., Fentem J.H., Balls M., Botham P.A., Curren R.D., Earl L.K., 
Esdaile D.J., Liebsch M., (1998) An Evaluation of the Proposed OECD 
Testing Strategy for Skin Corrosion. ATLA 26, p. 709-720.  
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth, W.M.H., (1988). Classification 
as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substances, Without Testing on Animals. Toxicology  In Vitro , 2(1), p. 19-26.
 
(5) Patil, S.M., Patrick, E., Maibach, H.I., (1996) Animal, Human, and  In 
Vitro  Test Methods for Predicting Skin Irritation, in: Francis N. Marzulli 
and Howard I. Maibach (editors): Dermatotoxicology. Fifth Edition ISBN 
1-56032-356-6, Chapter 31, p. 411-436.  
(6) Método de Ensaio B.40.  
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, 
L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M., (1998) The ECVAM 
international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 
2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology  In Vitro  
12, p. 483–524.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 250
 
Figura  
ESTRATÉGIA DE ENSAIO E AVALIAÇÃO PARA IRRITAÇÃO/CORROSÃO DÉRMICA
  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 251
 
B.5. TOXICIDADE AGUDA: IRRITAÇÃO/CORROSÃO OCULAR  
1. MÉTODO  
O presente método baseia-se na publicação OECD TG 405 (2002) 
(normas de ensaio da OCDE).  
1.1. INTRODUÇÃO  
Na preparação do presente método optimizado foi dada especial 
importância aos possíveis melhoramentos resultantes da avaliação de toda a informação já existente sobre a substância de ensaio, de 
modo a evitar ensaios desnecessários em animais de laboratório e 
assim ter em consideração a problemática da protecção dos animais. O presente método inclui a recomendação de se efectuar uma análise da importância das provas (1) dos dados relevantes existentes antes 
de se efectuar o ensaio  in vivo  descrito para irritação/corrosão ocular 
aguda. No caso de não se encontrarem disponíveis dados suficientes, recomenda-se a obtenção desses dados através da aplicação de en ­
saios sequenciais (2) (3). A estratégia de ensaio recomendada inclui a 
execução de ensaios  in vitro  validados e aceites e é fornecida como 
anexo ao método de ensaio. Além disso, recomenda-se o uso de um ensaio  in vivo  de irritação/corrosão dérmica para previsão da corro ­
são ocular antes de se considerar um ensaio ocular  in vivo.
 
Tendo em consideração o interesse científico e a protecção dos 
animais, não devem ser considerados ensaios  in vivo  até se proceder 
a uma avaliação de todos os dados disponíveis relevantes à potencial 
corrosibilidade/capacidade irritante ocular de uma substância para 
uma análise da importância das provas. Os dados devem incluir provas de estudos existentes em humanos e/ou animais de laborató ­
rio, provas de corrosibilidade/capacidade irritante de uma ou mais 
substâncias estruturalmente relacionadas, ou de misturas dessas subs ­
tâncias, dados que demonstrem elevada acidez ou alcalinidade da substância (4) (5) e resultados de ensaios  in vitro  ou ex vivo,  vali­
dados e aceites, para corrosão e irritação da pele (6) (6a). Estes 
estudos podem ter sido efectuados previamente ou como resultado 
de uma análise de importância das provas.
 
Uma análise deste tipo pode indicar, para algumas substâncias, a 
necessidade de estudos  in vivo  do potencial de irritação/corrosão 
ocular da substância. Em todos estes casos, antes de considerar a utilização de um ensaio ocular  in vivo,  deve efectuar-se preferencial ­
mente um estudo  in vivo  prévio sobre os efeitos dérmicos da subs ­
tância, avaliados de acordo com o método de ensaio B.4 (7). A 
aplicação de uma análise de importância das provas e a estratégia de ensaio sequencial deverão reduzir a necessidade de ensaios  in vivo  
para a corrosibilidade/capacidade irritante ocular de substâncias para 
as quais existem suficientes provas prévias de outros estudos. Caso a 
determinação do potencial de corrosão ou irritação ocular não possa ser efectuada utilizando a estratégia de ensaio sequencial, mesmo após a realização de um estudo  in vivo  da corrosão e irritação dér ­
mica, pode ser efectuado um ensaio  in vivo  de irritação/corrosão 
ocular.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 252
 
Junta-se ao anexo do presente método de ensaio uma estratégia de 
ensaio sequencial preferível, que inclui a execução de ensaios vali ­
dados  in vitro  ou ex vivo  para irritação/corrosão. A estratégia foi 
desenvolvida num grupo de trabalho ( workshop ) da OCDE (8), no 
qual foi recomendada por unanimidade dos participantes, tendo sido 
adoptada como estratégia de ensaio recomendada pelo sistema har ­
monizado a nível mundial para a classificação de substâncias quími ­
cas (GHS) (9). Recomenda-se que a estratégia de ensaio sequencial seja adoptada antes de realizar ensaios  in vivo.  No caso de subs ­
tâncias novas, recomenda-se uma metodologia de ensaio por etapas 
para a obtenção de dados científicos sobre a corrosibilidade/ ­
capacidade irritante da substância. No caso de substâncias já exis ­
tentes mas cujos dados sobre irritação/corrosão dérmica e ocular são 
insuficientes, recomenda-se a adopção desta estratégia para a obten ­
ção dos dados em falta. Caso se opte por uma estratégia ou protocolo de ensaio diferente ou se decida não aplicar uma metodologia de ensaio por etapas, deverá apresentar-se uma justificação fundamen ­
tada.
 
1.2. DEFINIÇÕES  
Irritação ocular:  consiste na produção de alterações oculares após a 
aplicação de uma substância de ensaio à superfície anterior do olho, alterações essas que são completamente reversíveis no intervalo de 
21 dias após a aplicação.
 
Corrosão ocular:  consiste na produção de lesões do tecido ocular 
ou enfraquecimento físico grave da visão após aplicação da subs ­
tância de ensaio à superfície anterior do olho, não reversíveis no 
intervalo de 21 dias após a aplicação.  
1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
A substância de ensaio é aplicada em dose única a um dos olhos do 
animal de experiência; o olho que não sofre tratamento é utilizado 
como controlo. O grau de irritação/corrosão ocular é avaliado pelas 
lesões de perfuração da conjuntiva, da córnea e da íris, a intervalos determinados. São também descritos outros efeitos sobre o olho e efeitos sistémicos adversos, de modo a permitir uma avaliação com ­
pleta dos efeitos. A duração do estudo deve ser suficiente para 
avaliar a reversibilidade ou irreversibilidade dos efeitos.
 
Os animais que apresentem sinais continuados de se encontrarem em 
grave perigo e/ou apresentarem sinais de dor durante qualquer das 
etapas do ensaio devem ser abatidos e a substância deve ser classi ­
ficada de acordo com estas observações. Os critérios para a decisão de abater animais moribundos e animais em grave sofrimento podem 
ser consultados na referência (10).
 
1.4. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.4.1.  Preparação para o ensaio  in vivo  
1.4.1.1.  Selecção de espécies  
O coelho albino é o animal de laboratório mais adequado, devendo 
ser usados animais adultos, jovens e saudáveis. A utilização de ou ­
tras estirpes ou espécies deve ser justificada.  
1.4.1.2.  Preparação dos animais  
Devem examinar-se ambos os olhos do animal seleccionado provi ­
soriamente para o ensaio 24 horas antes do início do ensaio. Não 
devem ser usados animais que apresentem irritação ocular, defeitos 
oculares ou lesão preexistente da córnea.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 253
 
1.4.1.3.  Condições de alojamento e alimentação  
Os animais devem ser alojados individualmente. A temperatura do 
biotério para os coelhos deve ser de 20  o C (± 3  o C). A humidade 
relativa deve ser no mínimo de 30 % e, preferivelmente, não exceder 
70 %, excepto durante a lavagem do biotério, devendo no entanto 
manter-se idealmente a valores de 50 %-60 %. A iluminação deve ser artificial, com uma sequência de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. Como alimentação, podem ser utilizadas dietas de labora ­
tório convencionais com fornecimento ilimitado de água para beber.
 
1.4.2.  Protocolo de ensaio  
1.4.2.1.  Aplicação da substância de ensaio  
A substância de ensaio deve ser colocada no saco conjuntival de um 
dos olhos de cada animal, depois de se ter separado cuidadosamente 
a pálpebra inferior do globo ocular. Fecham-se as pálpebras cuida ­
dosamente durante cerca de um segundo de modo a evitar a perda de material. O outro olho, que permanece sem tratamento, é utilizado como controlo.
 
1.4.2.2.  Irrigação  
Os olhos dos animais de ensaio não devem ser lavados pelo menos 
nas 24 horas seguintes à instilação da substância de ensaio, excepto 
para o caso de sólidos (consultar a secção 1.4.2.3.2) e no caso de ocorrência imediata de efeitos corrosivos ou irritantes. Após 24 ho ­
ras, desde que se considere apropriada, pode ser efectuada uma 
lavagem.
 
Não se recomenda a utilização de um grupo-satélite de animais para 
investigar a influência da lavagem, excepto se tal se justificar cien ­
tificamente. Se for necessário um grupo-satélite de animais, devem utilizar-se dois coelhos. As condições de lavagem devem ser cuida ­
dosamente documentadas, por exemplo, data e hora da lavagem; 
composição e temperatura da solução de lavagem; duração, volume e velocidade de aplicação.
 
1.4.2.3.  Nível de dosagem  
1.4.2.3.1.  Ensaio de líquidos  
No caso do ensaio de líquidos, usa-se uma dose de 0,1 ml. Não 
devem ser utilizados nebulizadores de bomba para instilação directa da substância no olho. O nebulizado líquido deve ser expelido e 
recolhido num recipiente antes de se instilar 0,1 ml no olho.
 
1.4.2.3.2.  Ensaio de sólidos  
No caso de ensaio de substâncias sólidas, pastas ou substâncias em 
partículas, a quantidade usada deve ter um volume de 0,1 ml ou uma massa não superior a 100 mg. O material de ensaio deve ser pulve ­
rizado a um pó fino. O volume de material sólido deve ser medido 
após compactação suave, por exemplo, através de batidas do reci ­
piente que o contém. Se ao tempo da primeira observação, 1 hora após o tratamento, a substância de ensaio sólida não tiver sido re ­
movida do olho do animal de ensaio através de mecanismos fisioló ­
gicos, o olho pode ser lavado com soro fisiológico ou água destilada.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 254
 
1.4.2.3.3.  Ensaio de aerossóis  
Recomenda-se a recolha do conteúdo de todos os nebulizadores de 
bomba e aerossóis antes de instilação no olho. A única excepção é 
para substâncias em recipientes de aerossol pressurizados, que não podem ser recolhidos devido à sua vaporização. Nestes casos, deve manter-se o olho aberto e administrar-se a substância de ensaio no 
olho numa aplicação única de duração aproximada de um segundo, 
mantendo o recipiente directamente à frente do olho a uma distância de 10 cm. Esta distância pode variar em função da pressão do nebulizador e do seu conteúdo. Devem ser tomadas precauções ade ­
quadas para não danificar o olho devido à pressão do nebulizador. 
Em casos apropriados, pode ser necessário avaliar o potencial de lesão «mecânica» do olho pela força da nebulização.
 
Pode obter-se uma estimativa da dose de um aerossol através de 
simulação do ensaio da seguinte forma: nebuliza-se a substância 
para um papel de pesagem através de uma abertura do tamanho do 
olho de coelho, colocada directamente em frente do papel. Utiliza-se o aumento de peso do papel como uma aproximação da quantidade nebulizada para o olho. Para substâncias voláteis, a dose pode ser 
estimada por pesagem do recipiente de recolha antes e após a remo ­
ção do material de ensaio.
 
1.4.2.4.  Ensaio inicial (ensaio in vivo de irritação/corrosão ocular utilizando 
um animal)  
Tal como articulado na estratégia de ensaio sequencial (ver anexo 1), 
recomenda-se vivamente que o ensaio  in vivo  seja efectuado inicial ­
mente utilizando um animal.  
Se, utilizando o protocolo descrito, os resultados deste ensaio indi ­
carem que a substância é corrosiva ou fortemente irritante para o 
olho, não devem ser efectuados outros ensaios de irritação ocular.  
1.4.2.5.  Anestesia local  
A utilização de anestesia local pode ser feita, mas analisando a sua 
necessidade caso a caso. Se a análise de importância das provas 
indicar que a substância pode causar dor ou se os ensaios iniciais revelarem ocorrência de reacção dolorosa, pode utilizar-se um anes ­
tésico local antes da instilação da substância de ensaio. A selecção 
do tipo, concentração e dose de anestésico local deve ser feita cui ­
dadosamente de modo a assegurar que a sua utilização não altere a reacção à substância de ensaio. O olho de controlo deve ser aneste ­
siado de igual forma.
 
1.4.2.6.  Ensaio de confirmação (ensaio in vivo de irritação ocular com 
animais adicionais)  
Se não for observado um efeito corrosivo no ensaio inicial, a res ­
posta irritante ou negativa deve ser confirmada utilizando até dois 
animais adicionais. Se for observado no ensaio inicial um efeito francamente irritante, indicativo de um efeito possivelmente forte (irreversível) no ensaio de confirmação, recomenda-se que se efectue 
o ensaio de confirmação de uma forma sequencial num animal de 
cada vez, em vez de expor dois animais adicionais simultaneamente. Se o segundo animal apresentar efeitos corrosivos ou fortemente irritantes, não se deve continuar o ensaio. Pode ser necessária a 
utilização de animais adicionais para confirmar respostas de irritação 
fracas ou moderadas.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 255
 
1.4.2.7.  Período de observação  
A duração do período de observação deve ser suficiente para uma 
avaliação completa da magnitude e reversibilidade dos efeitos obser ­
vados. No entanto, a experiência deve ser interrompida em qualquer 
altura se o animal apresentar sintomas continuados de dor intensa ou 
de se encontrar em situação de perigo (9). Para a determinação da reversibilidade dos efeitos, os animais devem ser examinados nor ­
malmente durante 21 dias após a administração da substância de 
ensaio. No caso de se observar reversibilidade antes do fim do 
período de 21 dias, deve interromper-se a experiência.
 
1.4.2.7.1.  Observações clínicas e graduação das reacções oculares  
Os olhos devem ser examinados 1, 24, 48 e 72 horas após a apli ­
cação da substância de ensaio. Os animais só devem ser mantidos sob ensaio durante o tempo necessário para obter informação defi ­
nitiva. Os animais que apresentem sintomas continuados de dor in ­
tensa ou de perigo devem ser abatidos sem demora, sendo a subs ­
tância classificada de acordo com estes resultados. Os animais que apresentem as seguintes lesões oculares posteriores à instilação de ­
vem ser abatidos: perfuração da córnea; ulceração significativa da 
córnea, incluindo estafiloma; sangue na câmara anterior do olho; 
opacidade da córnea de grau 4 persistente durante 48 horas; ausência de reflexo à luz (resposta da íris de grau 2) persistente durante 72 horas; ulceração da membrana conjuntival; necrose da conjuntiva ou 
da membrana nictitante; ou formação de crosta. Este procedimento é 
devido ao facto de normalmente este tipo de lesões ser irreversível.
 
Os ensaios com animais que não desenvolvam lesões oculares po ­
dem ser interrompidos, mas não antes de três dias após a instilação. 
Os animais que apresentem lesões fracas a moderadas devem per ­
manecer sob observação até cura de todas as lesões ou durante o período de 21 dias, após o qual o estudo é finalizado. As observa ­
ções devem ser efectuadas 7, 14 e 21 dias após a aplicação de modo 
a determinar o estado das lesões e a sua reversibilidade ou irrever ­
sibilidade.
 
Os graus da reacção ocular (conjuntiva, córnea e íris) devem ser 
anotados em cada exame (tabela I). Quaisquer outras lesões do 
olho (por exemplo,  pannus  da córnea, coloração) ou efeitos sistémi ­
cos adversos devem igualmente ser incluídos no relatório.  
O exame das reacções pode ser facilitado pela utilização de uma lupa 
binocular, de uma lâmpada de fenda manual, de um biomicroscópio 
ou de outro instrumento apropriado. Após anotação das observações no final de 24 horas, o exame aos olhos pode ser feito recorrendo a fluoresceína.
 
A graduação das respostas oculares é necessariamente subjectiva. O 
pessoal que executa as observações deve ser treinado adequadamente no sistema de graduação utilizado para promover a harmonização da 
graduação da resposta ocular e auxiliar os laboratórios de ensaio e as 
pessoas envolvidas na obtenção e interpretação das observações.
 
2. DADOS  
2.2. ANÁLISE DOS RESULTADOS  
Os resultados de irritação ocular devem ser avaliados conjuntamente 
com a natureza e gravidade das lesões e a sua reversibilidade ou 
ausência de reversibilidade. As respostas individuais não representam 
um padrão absoluto das propriedades irritantes do material, já que são também avaliados outros efeitos do material de ensaio. Pelo contrário, os resultados individuais devem ser encarados como valo ­
res de referência que só são significativos quando corroborados por 
uma descrição e avaliação completas de todas as observações.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 256
 
3. RELATÓRIO  
3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deverá incluir as seguintes informações:  
Fundamentação lógica para o ensaio  in vivo:  análise de importância 
das provas dos dados de ensaio preexistentes, incluindo os resultados 
da estratégia de ensaio sequencial:  
— descrição dos dados relevantes disponíveis de ensaios anteriores;  
— dados obtidos em cada etapa da estratégia de ensaio;  
— descrição dos ensaios  in vitro  efectuados, incluindo detalhes so ­
bre o protocolo, resultados obtidos com substâncias de ensaio/ ­
referência;  
— descrição do estudo efectuado  in vivo  sobre irritação/corrosão 
dérmica, incluindo os resultados obtidos;  
— análise de importância das provas para a realização do estudo  in 
vivo. 
Substância de ensaio:  
— dados de identificação (por exemplo, número CAS, origem, grau 
de pureza, impurezas conhecidas, número de lote);  
— natureza física e propriedades físico-químicas (por exemplo, pH, 
volatilidade, solubilidade, estabilidade, reactividade com água);  
— no caso de misturas, composição e percentagens relativas dos 
componentes;  
— no caso de utilização de um anestésico local, identificação, grau 
de pureza, tipo, dose e interacção potencial com a substância de 
ensaio.  
Excipiente:  
— identificação, concentração (quando apropriado), volume utiliza ­
do; 
— justificação para a escolha do excipiente.  
Animais de ensaio:  
— espécie/estirpe utilizada, fundamentação lógica para a utilização 
de outro tipo de animais que não coelhos albinos;  
— idade de cada animal no início do estudo;  
— número de animais de cada sexo no ensaio e nos grupos de 
controlo (se necessário);  
— peso individual dos animais no início e no final do ensaio;  
— origem, condições de alojamento, dieta, etc.  
Resultados:  
— descrição do método utilizado para medir a irritação em cada 
observação (por exemplo, lâmpada de fenda manual, biomicros ­
cópio, fluoresceína);  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 257
 
— disposição em tabelas dos dados sobre a resposta irritante/ ­
corrosiva para cada animal em cada observação até remoção do 
animal do ensaio;  
— descrição pormenorizada do grau e natureza da irritação ou cor ­
rosão observadas;  
— descrição de quaisquer outras lesões do olho observadas (por 
exemplo, vascularização, formação de  pannus  da córnea, ade ­
sões, coloração);  
— descrição de efeitos não oculares locais e efeitos sistémicos ad ­
versos e, caso sejam efectuadas, das observações histopatológi ­
cas. 
Análise dos resultados.  
3.2. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS  
A extrapolação dos resultados dos estudos de irritação ocular em 
animais de laboratório para humanos tem uma validade limitada. Em muitos casos, o coelho albino é mais sensível do que os huma ­
nos a substâncias irritantes ou corrosivas oculares.
 
A interpretação dos dados deve ser feita cuidadosamente de modo a 
excluir irritação resultante de infecções secundárias.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., 
Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I., Giuliani, A., Gray, 
T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., 
Verhaar, H.J.M., Zbinden, P., (1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM 
Workshop Report 8. ATLA 23, p. 410-429.
 
(2) de Silva, O., Cottin, M., Dami, N., Roguet, R., Catroux, P., 
Toufic, A., Sicard, C., Dossou, K.G., Gerner, I., Schlede, E., Spielmann, H., Gupta, K.C., Hill, R.N., (1997) Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing 
Strategies. Food Chem. Toxicol 35, p. 159-164.
 
(3) Worth A.P. and Fentem J.H., (1999) A general approach for 
evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177  
(4) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H., (1988) 
Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations 
Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicology  In Vitro , 2, p. 19-26.
 
(5) Neun, D.J., (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation 
Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. 
Ocular Toxicol. 12, p. 227-231.  
(6) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Edsaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, 
M., (1998) The ECVAM international validation study on in 
vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology  In Vitro  12, p. 483-524.
 
(6a) Método de Ensaio B.40 para corrosão da pele.  
(7) Método de Ensaio B.4. Toxicidade aguda: irritação/corrosão 
dérmica.  
(8) OECD, (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report 
of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. 
Held in Solna, Sweden, 22-24 January 1996 (http://www.oecd. 
org/ehs/test/background.htm).
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(9) OECD, (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification 
System for Human Health and Environmental Effects of Che ­
mical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).
 
(10) OECD, (2000) Guidance Document on the Recognition, 
Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints 
for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Assessment No 19 (http://www.oecd.org/ehs/test/ 
monos.htm).
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 259
 
Tabela I  
GRADUAÇÃO DE LESÕES OCULARES  
Córnea  
Opacidade: grau de densidade (as medições devem ser efectuadas na área mais 
densa) (*) 
Sem ulceração nem opacidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Áreas de opacidade escassas ou difusas (para além de uma pequena 
perda do lustre normal); detalhes da íris claramente visíveis . . . . . . . . . 1 
Área translúcida claramente discernível; detalhes da íris ligeiramente 
obscurecidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 
Área nacarada; não são visíveis os detalhes da íris; o tamanho da pupila 
é dificilmente discernível . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 
Córnea opaca; a íris não é discernível através da opacidade . . . . . . . . . 4  
Máximo possível: 4  
NOTAS  
(*) Deve ser anotada qual a área de opacidade da córnea.  
Íris 
Normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Rugas marcadamente profundas, congestão, tumefacção, hiperemia ao 
redor da córnea moderada; ou injecção; íris reactiva à luz (considera-se 
que uma reacção lenta é um efeito) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Hemorragia, destruição maciça ou ausência de reacção à luz . . . . . . . . 2  
Máximo possível: 2  
Conjuntiva  
Vermelhidão (refere-se à conjuntiva palpebral e bulbar; excluindo a córnea e a 
íris) 
Normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Alguns vasos sanguíneos com hiperemia (injectados) . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Cor carmesim difusa; vasos individuais não são claramente discerníveis 2 Cor vermelho-carne difusa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
 
Máximo possível: 3  
Quimiose  
Tumefacção (refere-se às pálpebras e/ou às membranas nictantes) 
Normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 0 
Alguma tumefacção acima do normal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 
Tumefacção óbvia, com eversão parcial das pálpebras . . . . . . . . . . . . . . . 2 
Tumefacção, com as pálpebras semicerradas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 Tumefacção, com as pálpebras mais do que semicerradas . . . . . . . . . . . . 4
 
Máximo possível: 4  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 260
 
ANEXO  
Uma estratégia de ensaio sequencial para a irritação e corrosão ocular  
CONSIDERAÇÕES GERAIS  
No sentido de atender aos interesses quer científicos, quer da protecção dos 
animais, torna-se importante evitar o uso desnecessário de animais e minimizar 
os ensaios que possam causar reacções graves em animais. Deve ser analisada 
toda a informação sobre a substância que seja relevante para a sua potencial capacidade irritante/corrosibilidade ocular antes de se considerarem os ensaios  in 
vivo.  É possível que existam já dados suficientes para classificar a substância de 
ensaio segundo o seu potencial irritante ou corrosivo ocular, sem necessidade de 
recorrer a ensaios em animais de laboratório. Assim, a utilização de uma análise de importância das provas e de uma estratégia de ensaio sequencial minimizará a necessidade de ensaios  in vivo,  especialmente no caso de substâncias susceptíveis 
de produzir reacções graves.
 
Recomenda-se a utilização da análise de importância das provas para avaliar a 
informação existente sobre irritação e corrosão ocular e determinar a necessidade 
de se efectuar estudos adicionais, diferentes dos estudos oculares  in vivo,  que sejam 
úteis para caracterizar o referido potencial. No caso de serem necessários estudos adicionais, recomenda-se a utilização de uma estratégia de ensaio sequencial para a 
obtenção dos dados experimentais relevantes. No caso de substâncias para as quais 
não exista nenhuma história de ensaios, deve ser utilizada a estratégia sequencial para a obtenção dos dados necessários para avaliar a sua irritação/corrosão ocular. A estratégia de ensaio descrita no presente anexo foi desenvolvida num grupo de 
trabalho ( workshop ) da OCDE (1). Foi subsequentemente confirmado e ampliado 
no sistema harmonizado e integrado de classificação de perigos para a saúde hu ­
mana e efeitos ambientais de substâncias químicas, tal como foi aprovado pela 28.
 a 
sessão conjunta do comité das substâncias químicas e do grupo de trabalho de 
substâncias químicas, em Novembro de 1998 (2).  
Apesar da presente estratégia de ensaio não fazer parte integrante do método de 
ensaio B.5, ela expressa a metodologia recomendada para a determinação das 
propriedades de irritação/corrosão ocular. Esta metodologia representa não só a melhor prática como também um ponto de referência ético para o ensaio  in vivo  
para irritação/corrosão ocular. O método de ensaio fornece uma orientação para a 
realização do ensaio  in vivo  e resume os factores que devem ser considerados 
antes de ponderar a execução deste ensaio. A estratégia de ensaio sequencial fornece uma metodologia de análise da importância das provas para a avaliação dos dados existentes sobre as propriedades de irritação/corrosão ocular de subs ­
tâncias e uma metodologia em séries para a obtenção de dados relevantes sobre 
substâncias para as quais sejam necessários estudos adicionais ou para os quais não tenham sido efectuados quaisquer estudos. A estratégia inclui inicialmente a realização de ensaios  in vitro  ou ex vivo  validados e aceites e, seguidamente, do 
método de ensaio B.4 para o estudo de irritação/corrosão dérmica em circuns ­
tâncias específicas (3) (4).
 
DESCRIÇÃO DA ESTRATÉGIA DE ENSAIO POR ETAPAS  
Antes da realização dos ensaios como parte da estratégia de ensaio sequencial 
(figura) deve ser avaliada toda a informação disponível de modo a determinar a necessidade de realização de ensaios oculares  in vivo.  Apesar de ser possível 
obter informação significativa a partir da avaliação de um só parâmetro (por 
exemplo, pH extremo), deve ser avaliada a totalidade da informação existente. Para uma decisão baseada na análise da importância das provas, devem ser avaliados todos os dados relevantes sobre os efeitos da substância em causa, 
bem como dos seus análogos estruturais, e deve apresentar-se uma justificação 
fundamentada para a decisão tomada. Deve dar-se especial relevância aos dados existentes sobre a substância relativamente a humanos e animais e, seguidamente, aos resultados dos ensaios  in vitro  ou ex vivo.  Sempre que possível, devem ser 
evitados estudos  in vivo  de substâncias corrosivas. Os factores considerados na 
estratégia de ensaio incluem:
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 261
 
Avaliação dos dados existentes sobre humanos e animais (etapa 1).  Devem 
considerar-se em primeiro lugar os dados existentes sobre humanos — por 
exemplo, estudos clínicos e ocupacionais, relatórios de casos clínicos e/ou dados de ensaios de estudos oculares em animais —, já que estes dados fornecem informação directamente relacionada com os efeitos nos olhos. Em seguida, 
devem ser avaliados os dados disponíveis sobre estudos de investigação da 
irritação/corrosão dérmica em humanos e/ou animais. As substâncias que apre ­
sentem evidências de corrosibilidade ou capacidade irritante grave para os olhos conhecidas não devem ser instiladas em olhos de animais. De igual forma, as 
substâncias que apresentam efeitos corrosivos ou irritantes para a pele também 
não devem ser instiladas em olhos de animais, devendo ser consideradas igual ­
mente corrosivas e/ou irritantes para os olhos. As substâncias que apresentem provas suficientes de não serem corrosivas ou irritantes em estudos oculares 
efectuados anteriormente também não devem ser ensaiadas em estudos oculares  
in vivo.
 
Análise de relações estrutura-actividade (SAR) (etapa 2).  Devem ser considera ­
dos os resultados de ensaios de substâncias químicas estruturalmente semelhan ­
tes, caso se encontrem disponíveis. No caso de existirem dados sobre humanos e/ou animais suficientes, relativos aos efeitos de substâncias estruturalmente se ­
melhantes ou a misturas deste tipo de substâncias, indicativos do seu potencial de 
irritação/corrosão ocular, pode presumir-se que a substância de ensaio produzirá as mesmas reacções. Nestes casos, poderá não ser necessário proceder a ensaios da substância. Os dados negativos obtidos de estudos de substâncias estrutural ­
mente semelhantes ou misturas dessas substâncias não constituem prova sufi ­
ciente de não-corrosibilidade/não-irritabilidade da substância sob estratégia de ensaio sequencial. Devem ser utilizadas abordagens de SAR validadas e aceites para identificação do potencial de irritação e corrosão, tanto dos efeitos dérmicos 
como oculares.
 
Propriedades físico-químicas e reactividade química (etapa 3).  As substâncias 
que apresentam pH extremos, tais como ≤ 2,0 ou ≥ 11,5, podem ter efeitos locais 
fortes. Se o pH extremo servir como base de identificação da corrosibilidade ou capacidade irritante ocular de uma substância, a sua reserva ácida/alcalina (poder tampão) também deve ser tida em consideração (5) (6). Se o poder tampão 
indicar que a substância pode
 não ser corrosiva para o olho, devem ser efectua ­
dos ensaios adicionais para confirmar esta indicação, de preferência utilizando ensaios  in vitro  ou ex vivo  validados e aceites (ver secção das etapas 5 e 6).
 
Consideração de outras informações existentes (etapa 4).  Nesta etapa, deve ser 
avaliada toda a informação disponível sobre toxicidade sistémica por via dérmica. 
Deve ser também considerada a toxicidade dérmica aguda da substância de 
ensaio. Se tiver sido demonstrado que a substância é muito tóxica por via dérmica pode não ser necessário efectuar ensaios oculares. Apesar de não existir necessariamente uma relação entre a toxicidade dérmica aguda e a irritação/ ­
corrosão ocular, pode considerar-se que se um agente é muito tóxico por via 
dérmica, também mostrará elevada toxicidade quando instilado no olho. Estes dados podem ser também considerados entre as etapas 2 e 3.
 
Resultados de ensaios  in vitro  ou ex vivo  (etapas 5 e 6).  Não é necessário 
proceder a ensaios em animais de substâncias que tenham apresentado proprie ­
dades corrosivas ou de irritação grave em ensaios  in vitro  ou ex vivo  (7) (8) que 
tenham sido validados e aceites para estimar especificamente a corrosibilidade/ ­
capacidade de irritação ocular ou dérmica. Pode considerar-se que estas subs ­
tâncias produzirão efeitos graves semelhantes  in vivo.  Se não se encontrarem 
disponíveis ensaios  in vitro/ex vivo  validados e aceites, devem ultrapassar-se as 
etapas 5 e 6 e passar-se directamente à etapa 7.  
Avaliação da capacidade irritante ou corrosibilidade dérmica  in vivo  de uma 
substância (etapa 7).  Caso não existam dados suficientes para uma análise da 
importância das provas conclusiva sobre o potencial de irritação/corrosão de uma substância baseada nos dados dos estudos supramencionados, deve proceder-se em primeiro lugar a uma avaliação do potencial de irritação/corrosão dérmica  in 
vivo,  utilizando o método de ensaio B.4 (4) e o seu anexo (9). Se a substância 
causar corrosão ou irritação grave da pele, deve ser considerada um irritante ocular corrosivo, excepto se existir outro tipo de informação que apoie uma conclusão alternativa. Assim, não há necessidade de efectuar um ensaio ocular  
in vivo.  Se a substância não for corrosiva ou gravemente irritante para a pele, 
deve efectuar-se um ensaio ocular  in vivo.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 262
 
Ensaio  in vivo  em coelhos  (etapas 8 e 9). O ensaio ocular  in vivo  deve começar 
por um ensaio inicial usando um animal. Se os resultados deste ensaio indicarem 
que a substância provoca irritação grave ou é corrosiva para os olhos, não devem ser efectuados outros ensaios. Se o ensaio não revelar quaisquer efeitos corrosi ­
vos ou de irritação grave, deve efectuar-se um ensaio de confirmação com dois 
animais adicionais.
 
REFERÊNCIAS  
(1) OECD, (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the 
OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria 
for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 
22-24 January 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).  
(2) OECD, (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for 
Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as en ­
dorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the 
Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/ 
Class/HCL6.htm).  
(3) Worth, A.P. and Fentem J.H., (1999). A General Approach for Evaluating 
Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, p. 161-177.  
(4) Método de ensaio B.4. Toxicidade aguda: irritação/corrosão dérmica.  
(5) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H., (1988) Classifica ­
tion as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or 
Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicology  In Vitro , 2, 
p. 19-26.  
(6) Neun, D.J., (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of 
Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 
p. 227-231.  
(7) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, 
L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M., (1998) The ECVAM international validation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 
2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology  In Vitro  
12, p. 483–524.
 
(8) Método de Ensaio B.40. Corrosão dérmica.  
(9) Anexo ao método de ensaio B.4: Uma estratégia de ensaio sequencial para 
irritação e corrosão dérmicas.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 263
 
Figura  
Estratégia de ensaio e avaliação para irritação/corrosão ocular
  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 264
 
▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 265
 
B.6. SENSIBILIZAÇÃO CUTÂNEA  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
Observações  
A sensibilidade e capacidade dos métodos de ensaio para detectar 
substâncias que possam induzir sensibilização cutânea considera-se 
importante num sistema de classificação em matéria de toxicidade no 
domínio da saúde pública.  
Não existe um método único que permita identificar de modo ade ­
quado todas as substâncias que possuam um potencial de sensibili ­
zação cutânea para o homem.  
Na selecção do método de ensaio devem ter-se em conta factores tais 
como as características físicas da substância, nomeadamente a sua capacidade de penetração na pele.
 
Desenvolveram-se dois tipos de ensaios em porquinhos-da-índia: 
ensaios com adjuvantes, em que a reacção alérgica é desencadeada 
por uma solução ou suspensão da substância em estudo em «adju ­
vante completo de Freunds», e os ensaios sem adjuvantes.  
Em geral, os ensaios com adjuvantes permitem determinar o poten ­
cial de sensibilização cutânea no homem com mais precisão que os 
métodos que não utilizam o «adjuvante completo de Freunds», pelo que são preferíveis.
 
O ensaio de maximização em porquinhos-da-índia constitui um mé ­
todo com adjuvante largamente utilizado. Embora possam utilizar-se vários outros métodos para determinar o potencial de sensibilização 
cutânea, o método em causa é considerado o mais adequado.
 
Os ensaios sem adjuvantes (de que o ensaio de Buehler constitui o 
mais popular) são considerados menos sensíveis quando aplicados a 
determinadas classes de substâncias.  
Em alguns casos, podem existir motivos para a selecção do ensaio de 
Buehler, em que se procede à aplicação tópica, em vez do método de maximização em porquinhos-da-índia, que utiliza a injecção intradér ­
mica. No caso do recurso ao método de Buehler, deve fornecer-se a 
respectiva justificação.
 
O presente método descreve o ensaio de maximização em porqui ­
nhos-da-índia e o método de Buehler. Pode recorrer-se a outros 
métodos devidamente validados cuja utilização seja cientificamente justificada.
 
Se um ensaio de despiste reconhecido fornecer um resultado positi ­
vo, a substância submetida ao ensaio pode ser designada potencial ­
mente sensibilizante e pode não ser necessário efectuar subsequen ­
temente um ensaio com cobaias. No entanto, se o referido ensaio 
fornecer um resultado negativo, é necessário efectuar um ensaio com cobaias segundo a metodologia aplicável ao presente método de ensaio.
 
Ver também a parte B da Introdução Geral.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 266
 
1.2. DEFINIÇÕES  
Sensibilização cutânea  (dermatite de contacto alérgica): reacção cu ­
tânea, de origem imunológica, a uma determinada substância. No homem, a reacção pode incluir pruridos, eritrema, edema, pápu ­
las, vesículas, bolhas ou uma combinação dos mesmos. Em outras 
espécies, as reacções podem diferir, embora apenas se observe eri ­
trema e edema.
 
Exposição de indução:  exposição experimental de um indivíduo a 
uma substância em estudo, com o objectivo de induzir uma reacção de hipersensibilidade.
 
Período de indução:  período de, pelo menos, uma semana após a 
exposição de indução, durante o qual pode surgir uma reacção de hipersensibilidade.
 
Exposição de desencadeamento:  exposição experimental a uma de ­
terminada substância, após o período de indução, de um indivíduo 
previamente exposto à mesma, de modo a averiguar uma eventual 
reacção de hipersensibilidade.  
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
A sensibilidade e a fiabilidade da técnica experimental utilizada 
devem ser determinadas semestralmente por recurso a substâncias 
que se saiba possuírem propriedades de sensibilização cutânea ligei ­
ras ou moderadas.  
Num ensaio realizado de forma adequada, a utilização de um sensi ­
bilizante ligeiro ou moderado deve determinar uma reacção de pelo 
menos 30 %, no caso de um ensaio com adjuvante, e de pelo menos 15 % no caso de um ensaio sem adjuvante.
 
Recomenda-se a utilização das substâncias seguintes:  
Número CAS Número EINECS Denominação EINECS Denominação comum  
101-86-0 202-983-3 α-Hexilcinamaldeído α-Hexilcinamaldeído 
149-30-4 205-736-8 Benzotiazolo-2-tiol (mercapto ­
benzotiazolo) Kaptax 
94-09-7 202-303-5 Benzocaína Norcaína  
Em determinados casos devidamente justificados podem utilizar-se 
outras substâncias que satisfaçam os critérios atrás referidos.  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Os animais utilizados são inicialmente expostos à substância em 
estudo por injecção intradérmica e/ou aplicação epidérmica (exposi ­
ção de indução). Após um período de repouso de 14 dias (período de 
indução), durante o qual poderá observar-se uma reacção imunitária, os animais são expostos a uma dose de desencadeamento. A exten ­
são e o grau da reacção cutânea à exposição de desencadeamento nos 
animais do lote de ensaio é comparada com a reacção observada nos 
animais do lote de controlo, sujeitos a um produto inactivo na fase da indução e objecto da exposição de desencadeamento.
 
1.5. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Caso se afigure aconselhável a remoção da substância em estudo, 
deve utilizar-se para tal água ou um solvente adequado que não 
altere a reacção observada, bem como a integridade da epiderme.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 267
 
1.5.1.  Ensaio de maximização nos porquinhos-da-índia  
1.5.1.1. P r e p a r a ç ã o  
Os animais (porquinhos-da-índia albinos adultos, jovens e saudáveis) 
são aclimatados às condições laboratoriais durante, pelo menos, 
cinco dias. Antes do ensaio, procede-se à respectiva distribuição 
aleatória por lotes. O pêlo é removido com o auxílio de uma tesoura ou lâmina ou, eventualmente, por depilação química, de acordo com o método utilizado. Deve evitar-se produzir feridas. Os animais são 
pesados antes do início do ensaio e após o respectivo termo.
 
1.5.1.2. C o n d i ç õ e s d e e n s a i o  
1.5.1.2.1. Animais de ensaio  
Os animais devem ser porquinhos-da-índia albinos de utilização cor ­
rente em laboratório.  
1.5.1.2.2. Número e sexo  
Podem utilizar-se animais de ambos os sexos. Caso se utilizem 
fêmeas, estas devem ser nulíparas e não grávidas.  
Utiliza-se um mínimo de 10 animais no lote de ensaio e um mínimo 
de cinco animais no lote de controlo. Caso se utilizem menos de 20 animais no lote de ensaio e menos de 10 animais no lote de controlo, 
não é possível concluir a natureza sensibilizante do produto, pelo que 
se recomenda vivamente a realização de ensaios com outros animais, até atingir os números referidos.
 
1.5.1.2.3. Doses  
A concentração de substância em estudo utilizada em cada exposição 
por indução deve apresentar uma boa tolerância sistémica e corres ­
ponder à concentração máxima que produz uma irritação cutânea ligeira a moderada. A concentração utilizada na exposição de desen ­
cadeamento deve consistir na dose máxima não irritante. Se neces ­
sário, as concentrações adequadas podem ser determinadas a partir 
de um estudo-piloto utilizando dois ou três animais. Para tal, devem utilizar-se animais objecto de ensaio com «adjuvante completo de Freunds».
 
1.5.1.3. P r o c e d i m e n t o  
1.5.1.3.1. Indução  
Dia 0 — lote de ensaio  
Administram-se três pares de injecções intradérmicas de 0,1 ml na 
região da espádua.  
1. a injecção: mistura «adjuvante completo de Freunds»/água ou soro 
fisiológico (1:1) (v/v).  
2. a injecção: substância em estudo dissolvida num veículo adequado, 
na concentração escolhida.  
3. a injecção: substância em estudo dissolvida numa mistura «adju ­
vante completo de Freunds»/água ou soro fisiológico (1:1) (v/v), na 
concentração escolhida.  
Na 3.  a injecção, as substâncias hidrossolúveis são dissolvidas na fase 
aquosa antes da mistura com «adjuvante completo de Freunds». As substâncias lipossolúveis ou insolúveis são suspensas em «adjuvante completo de Freunds» antes de adicionadas à fase aquosa. A concen ­
tração final da substância em estudo deve ser igual à utilizada na 2.
 a 
injecção.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 268
 
As 1.  a e 2.  a injecções são administradas em regiões vizinhas, tão 
próximas quanto possível do crânio, enquanto que a 3.  a injecção é 
administrada na parte posterior da zona de ensaio.  
Dia 0 — lote de controlo  
Administram-se três pares de injecções intradérmicas de 0,1 ml na 
mesma região usada no caso dos animais do lote de ensaio.  
1. a injecção: mistura «adjuvante completo de Freunds»/água ou soro 
fisiológico (1:1) (v/v).  
2. a injecção: veículo não diluído.  
3. a injecção: mistura a 50 % (m/v) do veículo numa mistura «adju ­
vante completo de Freunds»/água ou soro fisiológico (1:1) (v/v).  
5. o -7. o dias — lotes de ensaio e de controlo  
No caso de a substância não constituir um irritante cutâneo, a zona 
de ensaio, com o pêlo previamente removido, é tratada, cerca de 24 horas antes da aplicação tópica de indução, com 0,5 ml de solução a 
10 % de laurilssulfato de sódio em vaselina, de modo a produzir 
irritação local.
 
6. o -8. o dias — lote de ensaio  
O pêlo é novamente removido da zona de ensaio. Impregna-se to ­
talmente uma folha de papel de filtro (2 × 4 cm) da substância em estudo, dissolvida ou suspensa num veículo adequado, que se aplica na zona de ensaio, sendo mantida em contacto com a mesma durante 
48 horas, com o auxílio de um penso oclusivo. Deve justificar-se a 
escolha do veículo utilizado. Os sólidos devem ser finamente divi ­
didos e incorporados num veículo adequado. Os líquidos podem ser aplicados directamente, se for caso disso.
 
6. o -8. o dias — lote de controlo  
O pêlo é novamente removido da zona de ensaio. O veículo é 
aplicado de modo análogo ao anteriormente descrito, sendo também 
mantido em contacto com a referida zona durante 48 horas, com o 
auxílio de um penso oclusivo.  
1.5.1.3.2. Desencadeamento  
20. o -22.  o dias — lotes de ensaio e de controlo  
Remove-se o pêlo do flanco dos animais dos lotes de ensaio e de 
controlo. Aplica-se num dos flancos de cada animal um apósito ou uma câmara impregnados da substância em estudo; se necessário, 
pode aplicar-se no outro flanco um apósito ou uma câmara impreg ­
nados do veículo. Os sistemas em causa são mantidos em contacto com a pele com o auxílio de um penso oclusivo.
 
1.5.1.3.3. Observação e avaliação: lotes de ensaio e de controlo  
— Cerca de 21 horas após a remoção do apósito ou da câmara, a 
zona em estudo é limpa, sendo o pêlo removido com o auxílio de uma tesoura ou lâmina, se necessário.
 
— Cerca de 3 horas depois (ou seja, cerca de 48 horas após o início 
do ensaio), observa-se a reacção cutânea, que se regista de acordo com a escala indicada no apêndice.
 
— Cerca de 24 horas após a primeira observação (72 horas após o 
início do ensaio), procede-se a um novo exame, cujos resultados se registam de modo análogo.
 
Recomenda-se a realização de leituras cegas com os animais dos 
lotes de ensaio e de controlo.  
Caso seja necessário clarificar os resultados obtidos no primeiro 
ensaio de desencadeamento, pode realizar-se um segundo ensaio com um novo lote de controlo, cerca de uma semana depois. Pode 
também realizar-se um segundo ensaio de desencadeamento com o 
mesmo lote de controlo.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 269
 
Devem observar-se e registar-se de acordo com a escala de 
Magnusson/Kligman (ver apêndice) todas as reacções anormais, no ­
meadamente reacções sistémicas, resultantes dos processos de indu ­
ção e desencadeamento. Além disso, podem efectuar-se outros exa ­
mes, nomeadamente um exame histopatológico ou uma determinação 
da espessura da prega cutânea, com o objectivo de clarificar even ­
tuais reacções duvidosas.  
1.5.2.  Ensaio de Buehler  
1.5.2.1. P r e p a r a ç ã o  
Os animais (porquinhos-da-índia albinos adultos, jovens e saudáveis) 
são aclimatados às condições laboratoriais durante, pelo menos, cinco dias. Antes do ensaio, procede-se à respectiva distribuição 
aleatória por lotes. O pêlo é removido com o auxílio de uma tesoura 
ou lâmina ou, eventualmente, por depilação química, de acordo com o método utilizado. Deve evitar-se produzir feridas. Os animais são pesados antes do início do ensaio e após o respectivo termo.
 
1.5.2.2. C o n d i ç õ e s d e e n s a i o  
1.5.2.2.1. Animais de ensaio  
Os animais devem ser porquinhos-da-índia albinos de utilização cor ­
rente em laboratório.  
1.5.2.2.2. Número e sexo  
Podem utilizar-se animais de ambos os sexos. Caso se utilizem 
fêmeas, estas últimas devem ser nulíparas e não grávidas.  
Utiliza-se um mínimo de 20 animais no lote de ensaio e um mínimo 
de 10 animais no lote de controlo.  
1.5.2.2.3. Doses  
A concentração de substância em estudo utilizada em cada exposição 
por indução deve corresponder à concentração máxima que produz uma irritação cutânea moderada. A concentração utilizada na expo ­
sição de desencadeamento deve consistir na dose máxima não irri ­
tante. Se necessário, as concentrações adequadas podem ser determi ­
nadas a partir de um estudo-piloto utilizando dois ou três animais.
 
No caso de as substâncias em estudo serem hidrossolúveis, deve 
utilizar-se como veículo água ou uma solução diluída de um ten ­
sioactivo não irritante. Nos restantes casos, o veículo deve consistir numa mistura etanol/água a 80 % (ensaios de indução) ou acetona 
(ensaios de desencadeamento).
 
1.5.2.3. P r o c e d i m e n t o  
1.5.2.3.1. Indução  
Dia 0 — lote de ensaio  
Remove-se o pêlo do flanco dos animais. O sistema de apósito é 
impregnado da substância em estudo, dissolvida ou suspensa num veículo adequado (deve justificar-se a escolha do veículo; as subs ­
tâncias líquidas podem ser aplicadas sem diluição, se for caso disso)
 
e aplicado na zona de ensaio, sendo mantido em contacto com a 
mesma durante 6 horas, com o auxílio de um apósito ou de uma 
câmara e de um penso adequado.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 270
 
O sistema de apósito utilizado deve ser oclusivo. Pode utilizar-se 
uma mecha de algodão de forma circular ou quadrada, com 4 a 
6 cm  2 . De modo a garantir a oclusão, é aconselhável utilizar um 
dispositivo de imobilização adequado. Caso se utilize uma faixa, poderá ser necessário proceder a exposições adicionais.
 
Dia 0 — lote de controlo  
O pêlo é novamente removido da zona de ensaio. O veículo é 
aplicado de modo análogo ao anteriormente descrito, sendo também mantido em contacto com a referida zona durante 6 horas por in ­
termédio de um penso oclusivo ou de uma câmara. Caso se conclua 
que não é necessário efectuar um controlo simulado, poderá efectuar- 
-se um controlo mais simples.
 
6. o -8. o dias e 13.  o -15.  o dias — lotes de ensaio e de controlo  
A substância em estudo é aplicada de modo análogo ao anterior ­
mente descrito, na mesma zona e no mesmo flanco (se necessário, 
proceder à remoção do pêlo), entre o 6.  o e o 8.  o dias e, de novo, 
entre o 13.  o e o 15.  o dias. 
1.5.2.3.2. Desencadeamento  
27. o -29.  o dias — lotes de ensaio e de controlo  
Remove-se o pêlo do flanco posterior dos animais dos lotes de 
ensaio e de controlo não sujeito a exposição prévia e aplica-se um 
penso oclusivo ou câmara impregnados da quantidade adequada da substância em estudo (concentração máxima não irritante).
 
Se necessário, pode também aplicar-se um penso oclusivo ou câma ­
ra, impregnados do veículo, ao flanco anterior dos animais de ambos os lotes não sujeito a exposição prévia. Os pensos ou câmaras são 
mantidos em contacto com a pele durante 6 horas, com o auxílio de 
um dispositivo adequado.
 
1.5.2.3.3. Observação e avaliação  
— Cerca de 21 horas após a remoção do apósito ou da câmara, 
remove-se o pêlo da área em estudo.  
— Cerca de 3 horas depois (ou seja, cerca de 30 horas após o início 
do ensaio), observa-se a reacção cutânea, que se regista de acordo com a escala indicada em apêndice.
 
— Cerca de 24 horas após a primeira observação (54 horas após o 
início do ensaio), procede-se a um novo exame, cujos resultados se registam de modo análogo.
 
Recomenda-se a realização de leituras cegas com os animais dos 
lotes de ensaio e de controlo.  
Caso seja necessário clarificar os resultados obtidos no primeiro 
ensaio de desencadeamento pode realizar-se um segundo ensaio com um novo lote de controlo, cerca de uma semana depois. Pode 
também realizar-se um segundo ensaio de desencadeamento com o 
mesmo lote de controlo.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 271
 
Devem observar-se e registar-se de acordo com a escala de 
Magnusson/Kligman (ver apêndice) todas as reacções anormais, no ­
meadamente reacções sistémicas, resultantes dos processos de indu ­
ção e desencadeamento. Além disso, podem efectuar-se outros exa ­
mes, nomeadamente um exame histopatológico ou uma determinação 
da espessura da prega cutânea, com o objectivo de clarificar even ­
tuais reacções duvidosas.  
2. DADOS (GPMT E ENSAIO DE BUEHLER)  
Os dados devem ser apresentados de forma sumária num quadro, 
referindo, para cada animal, a reacção cutânea observada.  
3. RELATÓRIO (GPMT E ENSAIO DE BUEHLER)  
Caso se tenha realizado um ensaio de prospecção (por exemplo, 
ensaio ganglionar local — LLNA — ou ensaio de tumefacção do 
pavilhão auditivo no ratinho — METS) antes do ensaio em porqui ­
nhos-da-índia, deve fornecer-se, juntamente com os resultados obti ­
dos com a substância em estudo e a substância de referência, deta ­
lhes relativos ao procedimento.  
Relatório do ensaio (ensaio de maximização em porquinhos da 
índia e ensaio de Buehler)  
O relatório do ensaio deve incluir, sempre que possível, as seguintes 
informações:  
Animais utilizados no ensaio:  
— estirpe;  
— número, idade e sexo dos animais;  
— proveniência, condições de alojamento, dieta administrada, etc.;  
— massa de cada animal no início do ensaio.  
Condições de ensaio:  
— pormenores relativos à preparação da zona de ensaio;  
— pormenores relativos aos materiais e técnicas de apósito utiliza ­
das; 
— resultados dos estudos-piloto destinados a determinar as concen ­
trações de indução e de desencadeamento utilizadas no ensaio;  
— pormenores relativos à preparação, aplicação e remoção da subs ­
tância em estudo;  
— justificação da escolha do veículo;  
— concentrações do veículo e da substância em estudo utilizadas 
nos ensaios de indução e de desencadeamento; quantidade total 
de substância aplicada nos ensaios de indução e de desencadea ­
mento.  
Resultados:  
— resumo dos resultados do último controlo de sensibilidade e 
fiabilidade (ver 1.3), nomeadamente informações sobre a subs ­
tância, a respectiva concentração e o veículo utilizado;  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 272
 
— dados relativos a cada animal, incluindo o sistema de classifica ­
ção; 
— descrição da natureza e gravidade dos efeitos observados;  
— dados histopatológicos.  
Discussão dos resultados.  
Conclusões.  
4. REFERÊNCIAS  
O presente método é análogo ao método OCDE TG 406.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 273
 
Apêndice  
QUADRO  
Escala de Magnusson/Kligman para a avaliação das reacções ao ensaio de 
desencadeamento  
0 = alterações não visíveis;  
1 = eritrema discreto ou localizado;  
2 = eritrema moderado ou confluente;  
3 = eritrema intenso e tumefacção.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 274
 
B.7 ESTUDO DA TOXICIDADE ORAL POR DOSE REPETIDA 
DURANTE 28 DIAS EM ROEDORES  
INTRODUÇÃO  
1. Este método é equivalente ao  Test Guideline  407 (2008) da OCDE. O  Test 
Guideline  407 inicial foi adotado em 1981. Em 1995, adotou-se uma versão 
revista, para obter mais dados sobre os animais estudados, nomeadamente ao 
nível da neurotoxicidade e da imunotoxicidade.  
2. Em 1998, a OCDE deu início a uma ação prioritária com vista à revisão dos  
Test Guidelines  existentes e à elaboração de novos  Test Guidelines  para 
despistagem e ensaio de potenciais desreguladores do sistema endócrino 
(8). Um dos elementos dessa ação foi a atualização do  Test Guideline  da 
OCDE relativo ao estudo da toxicidade oral por dose repetida durante 28 dias em roedores (TG 407), nele introduzindo parâmetros adequados à de ­
teção da atividade endócrina de produtos químicos. O protocolo adotado foi 
então sujeito a um vasto programa internacional destinado a examinar a pertinência e viabilidade desses parâmetros adicionais, o desempenho dos mesmos relativamente a produtos químicos com atividade (anti)estrogénica, 
(anti)androgénica e (anti)tiroideia, a repetibilidade intralaboratorial e a re ­
produtibilidade interlaboratorial e as interferências dos novos parâmetros com os anteriormente previstos no TG 407. A OCDE elaborou em seguida um relatório muito completo (9) com a compilação e avaliação pormenori ­
zada dos múltiplos dados obtidos nesse exercício. A presente atualização do 
método B.7 equivale ao TG 407 e é fruto da experiência e dos resultados obtidos durante o referido programa internacional. O método permite con ­
textualizar determinados efeitos de mediação endócrina com outros efeitos 
toxicológicos.
 
CONSIDERAÇÕES INICIAIS E LIMITAÇÕES  
3. Na apreciação e avaliação das características de toxicidade de produtos 
químicos, pode determinar-se a toxicidade oral por dose repetida depois de obter informações sobre a toxicidade aguda a partir de ensaios realizados para o efeito. Este método destina-se ao estudo de efeitos tóxicos numa 
grande diversidade de alvos potenciais de toxicidade. Fornece informações 
sobre os perigos para a saúde que podem advir da exposição repetida num período relativamente curto, nomeadamente ao nível de efeitos nos sistemas nervoso, imunitário e endócrino. Nestes domínios específicos, pretende-se 
identificar os produtos químicos potencialmente neurotóxicos, passíveis de 
justificar o aprofundamento do estudo desta vertente, bem como os que interferem com a fisiologia da tiroide, podendo o método fornecer igual ­
mente dados sobre os produtos químicos que afetam os órgãos reprodutores 
de animais adultos jovens de ambos os sexos e dar indicações sobre efeitos 
imunológicos.
 
4. Os resultados obtidos por este método podem ser utilizados na identificação 
de perigos e na avaliação de riscos. Os resultados correspondentes aos 
parâmetros relacionados com o sistema endócrino devem interpretar-se 
com base no documento " Conceptual Framework for Testing and Asses ­
sment of Endocrine Disrupting Chemicals " (11), elaborado pela OCDE, que 
estabelece um quadro conceptual para o ensaio e a avaliação de produtos 
químicos desreguladores do sistema endócrino. O método compreende um 
estudo básico de toxicidade por dose repetida, que pode utilizar-se para produtos químicos que não justifiquem um estudo a 90 dias (por exemplo, se o volume de produção não exceder determinados limites) ou como etapa 
prévia para um estudo a longo prazo. O tempo de exposição previsto é de 
28 dias.
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5. O programa internacional de validação de parâmetros adequados para a 
deteção da atividade endócrina potencial de produtos químicos mostrou 
que a qualidade dos dados obtidos pelo método B.7 depende muito da experiência do laboratório que realiza os ensaios. Este problema coloca-se especificamente em relação à determinação histopatológica de alterações 
cíclicas dos órgãos reprodutores femininos e à pesagem dos pequenos ór ­
gãos hormonodependentes, difíceis de dissecar. Foi elaborado um docu ­
mento de orientações no domínio da histopatologia (19), que está disponível no sítio Web público da OCDE relativo aos  Test Guidelines  e visa ajudar os 
patologistas nos exames que realizam e contribuir para melhorar a sensibi ­
lidade do ensaio. Foram incorporados neste método diversos parâmetros que se verificou constituírem indicadores de efeitos tóxicos ao nível endócrino. Enumeram-se no apêndice 2, como parâmetros facultativos, aqueles cuja 
utilidade não está provada, por insuficiência de dados, ou cujo contributo 
para a deteção de desreguladores do sistema endócrino o programa de validação não demonstrou suficientemente.
 
6. Com base nos dados gerados no processo de validação, importa sublinhar 
que a sensibilidade deste ensaio não é suficiente para identificar todas as 
substâncias (anti)androgénicas ou (anti)estrogénicas (9). O método não é aplicado a um estádio da vida especialmente sensível à desregulação endó ­
crina. Todavia, durante o processo de validação, identificaram-se por este 
método substâncias que afetam ligeira ou fortemente a função tiroideia e 
substâncias com atividade endócrina moderada a forte através dos recetores estrogénicos ou androgénicos, embora raramente tenha sido possível identi ­
ficar substâncias com fraca atividade a esse nível. Não pode, portanto, 
considerar-se um ensaio de despistagem de atividade endócrina.
 
7. O facto de não se evidenciarem efeitos de natureza (anti)androgénica ou 
(anti)estrogénica não pode, portanto, entender-se como uma prova da ine ­
xistência de efeitos no sistema endócrino. No que respeita a efeitos media ­
dos pelo sistema endócrino, a caracterização das substâncias não deve, pois, basear-se unicamente nos resultados obtidos por aplicação deste método de ensaio. Para caracterizar uma potencial atividade endócrina, estes resultados 
devem ser examinados juntamente com todos os dados disponíveis para o 
produto químico em causa, numa perspetiva de suficiência de prova. Por conseguinte, as decisões normativas sobre atividade endócrina (ao nível da caracterização de substâncias) devem fundamentar-se numa base mais alar ­
gada, não se apoiando unicamente nos resultados obtidos pelo presente 
método.
 
8. Pressupõe-se que todos os procedimentos com animais respeitarão as nor ­
mas locais de manipulação de animais. As descrições, neste protocolo, dos 
cuidados a ter com os animais e do tratamento a dar aos animais são normas mínimas, prevalecendo, se for mais estrita, a regulamentação local. Para mais orientações sobre o tratamento ético de animais, ver o documento da 
OCDE com a referência 14.
 
9. Definem-se no apêndice 1 alguns conceitos utilizados.  
PRINCÍPIO DO MÉTODO  
10. Administra-se diariamente por via oral o produto químico em estudo a 
vários grupos de animais, em doses crescentes de grupo para grupo, durante um período de 28 dias. No decurso deste período, verifica-se atentamente 
todos os dias se os animais evidenciam sinais de toxicidade. Autopsia-se os 
animais que morrem ou são eutanasiados durante os ensaios. No final dos ensaios, eutanasiam-se e autopsia-se os animais sobreviventes. Este estudo durante 28 dias fornece informações sobre os efeitos da exposição repetida 
por via oral e pode revelar a necessidade de estudos complementares mais 
longos. Pode igualmente fornecer informações que facilitem a escolha das
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concentrações a utilizar nesses estudos durante períodos mais longos. Os 
dados gerados pela aplicação deste método devem possibilitar a caracteriza ­
ção da toxicidade do produto químico estudado, fornecer indicações sobre a resposta às doses administradas e permitir determinar o NOAEL (nível sem observação de efeitos adversos).
 
DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
Escolha da espécie animal  
11. Embora possa recorrer-se a outros roedores, a espécie preferida é o rato. Se 
os parâmetros especificados neste método forem estudados noutra espécie de roedor, é necessário justificá-lo pormenorizadamente. Embora, em termos biológicos, seja plausível que outras espécies respondam aos produtos tóxi ­
cos de modo semelhante ao rato, o recurso a espécies mais pequenas pode 
aumentar a variabilidade, devido às dificuldades técnicas que a dissecação dos órgãos mais pequenos coloca. O rato foi a única espécie utilizada no programa internacional de validação da deteção de desreguladores do sis ­
tema endócrino. Devem ser utilizados animais adultos, jovens e saudáveis de 
estirpes laboratoriais correntes. As fêmeas utilizadas devem ser nulíparas e não podem estar grávidas. A administração do produto químico em estudo deve ter início logo que possível após o desmame, mas sempre antes de os 
animais completarem nove semanas. No início do estudo, as diferenças de 
peso entre os animais utilizados devem ser mínimas, não se desviando mais de 20 % do peso médio de cada sexo. Se o estudo de toxicidade oral por 
dose repetida constituir uma etapa preliminar de um estudo a longo prazo, 
devem ser utilizados animais da mesma estirpe e proveniência em ambos os casos.
 
Condições de alojamento e de alimentação  
12. Todos os procedimentos devem respeitar as normas locais de manipulação 
de animais de laboratório. A temperatura do biotério deve ser de 22 °C (± 3 °C). A humidade relativa não deve ser inferior a 30 % e, de preferên ­
cia, não deve exceder 70 %, exceto durante a limpeza do biotério. Ideal ­
mente, deve procurar manter-se entre 50 % e 60 %. A iluminação deve ser 
artificial, com uma sequência de 12 horas de luz seguidas de 12 horas de escuridão. Na alimentação, podem utilizar-se dietas convencionais de labo ­
ratório e deve ser fornecida água de beber sem restrições. Se o produto 
químico em estudo for administrado com os alimentos, a escolha da dieta pode ser condicionada pela necessidade de assegurar uma mistura adequada. Os animais devem ser alojados em pequenos grupos do mesmo sexo, em ­
bora possam ser alojados individualmente se houver razões científicas que o 
justifiquem. Em caso de alojamento coletivo, cada gaiola não deve alojar mais de cinco animais.
 
13. Deve efetuar-se com regularidade uma pesquisa de contaminantes nos ali ­
mentos fornecidos e conservar-se uma amostra da dieta até o relatório estar 
concluído.  
Preparação dos animais  
14. Distribuem-se aleatoriamente animais adultos, jovens e saudáveis pelos gru ­
pos de controlo e pelos grupos expostos. As gaiolas devem ser dispostas de 
forma a minimizar possíveis efeitos derivados do seu posicionamento. Os animais devem ser identificados individualmente e permanecer nas gaiolas durante, pelo menos, cinco dias antes do início do ensaio, para aclimatação 
às condições laboratoriais.
 
Preparação das doses  
15. Administra-se o produto químico em estudo por meio de uma sonda esofá ­
gica ou através da dieta ou da água de beber. O método de administração 
oral depende do objetivo do estudo, bem como das propriedades físico- 
-químicas e toxicocinéticas do produto químico em causa.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 277
 
16. Se necessário, pode suspender-se ou dissolver-se o produto químico em 
estudo num veículo apropriado. Recomenda-se que, sempre que possível, 
a primeira opção seja uma solução ou suspensão aquosa; caso tal não seja viável, pode optar-se por uma solução ou suspensão num óleo (por exemplo, em óleo de milho); em último caso, poderá recorrer-se a uma solução noutro 
veículo. Se o veículo utilizado não for água, é necessário conhecer as suas 
características de toxicidade. Deve determinar-se a estabilidade do produto químico em estudo no veículo utilizado.
 
PROCEDIMENTO  
Número e sexo dos animais  
17. Para cada dose, devem ser utilizados, pelo menos, 10 animais (cinco machos 
e cinco fêmeas). Se estiver prevista a realização de eutanásias intercalares, os efetivos devem ser aumentados no número de animais a eutanasiar antes 
da conclusão do estudo. Deve ponderar-se a constituição de um grupo 
satélite de dez animais (cinco de cada sexo) paralelamente ao grupo de controlo e ao grupo exposto à dose mais elevada, a fim de observar a 
reversibilidade, a persistência e o aparecimento diferido de efeitos tóxicos 
durante, pelo menos, 14 dias após o termo da exposição.
 
Dosagem  
18. Em geral, devem ser utilizados pelo menos três grupos de ensaio e um 
grupo de controlo. Porém, se, após a avaliação de outros dados, não for 
de prever nenhum efeito com a dose de 1 000 mg/kg de peso corporal/dia, 
pode efetuar-se um ensaio do limite. Se não se dispuser de dados adequados para o efeito, pode efetuar-se um estudo exploratório, com animais da mesma estirpe e proveniência, para facilitar a determinação das doses a 
utilizar. Salvo no que respeita à exposição ao produto químico em estudo, 
os animais do grupo de controlo devem ser tratados do mesmo modo que os animais dos grupos ensaiados. Se for utilizado um veículo para administrar o produto químico em estudo, o grupo de controlo deve receber o volume 
máximo de veículo utilizado.
 
19. Na escolha das doses devem ser tidos em conta os dados eventualmente 
disponíveis sobre a toxicidade e a toxicocinética do produto químico em 
estudo ou de produtos afins. Deve escolher-se como dose mais elevada uma 
dose que induza efeitos tóxicos, mas não cause mortalidade nem sofrimento intenso. Selecciona-se a seguir uma sequência decrescente de doses que permita correlacionar as respostas observadas com as doses administradas 
e cuja dose mais baixa não produza nenhum efeito adverso 
observável (NOAEL). O intervalo ótimo entre doses consecutivas é frequen ­
temente definido por um fator de 2 a 4. A inclusão de um quarto grupo de ensaio é muitas vezes preferível ao uso de intervalos muito grandes (fatores 
superiores a 10) entre as dosagens.
 
20. Caso se observem sinais de toxicidade generalizada (por exemplo, redução 
do peso corporal, efeitos ao nível hepático, cardíaco, pulmonar ou renal, 
etc.) ou outras alterações que possam não ser reações tóxicas (por exemplo, 
diminuição da quantidade de alimentos ingerida, dilatação hepática, etc.), deverá interpretar-se com cautela qualquer efeito observado ao nível dos parâmetros imunológicos, neurológicos ou endócrinos.
 
Ensaio do limite  
21. Se o ensaio, realizado de acordo com o presente método, de uma dose não 
inferior a 1 000 mg/kg de peso corporal/dia ou, no caso da administração através da dieta ou da água de beber, de uma percentagem equivalente administrada através desses veículos (com base nos pesos corporais deter ­
minados) não produzir efeitos tóxicos observáveis e, tendo em conta dados 
referentes a substâncias estruturalmente afins, não forem de prever efeitos tóxicos, pode considerar-se que não é necessário efetuar um estudo completo com três doses. Nesses casos, justifica-se a realização de um ensaio do 
limite, exceto se os dados relativos à exposição humana aconselharem o 
ensaio de doses superiores.
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Administração das doses  
22. Administra-se diariamente a dose prevista do produto químico em estudo 
aos animais durante 28 dias. A administração forçada por meio de uma sonda esofágica deve efetuar-se numa dose única, utilizando um tubo esto ­
macal ou uma cânula de intubação adequada. O volume máximo de líquido 
que pode ser administrado de cada vez depende do tamanho do animal, não devendo exceder 1ml/100 g de peso corporal; excetuam-se as soluções aquosas, que podem ser administradas na proporção de 2 ml/100 g de 
peso corporal. Para minimizar as diferenças entre os volumes administrados, 
devem ser efetuados ajustes nas concentrações, de forma que o volume seja o mesmo para todas as doses; excetuam-se os ensaios de produtos químicos 
irritantes ou corrosivos, cujos efeitos são normalmente exacerbados a con ­
centrações mais elevadas.
 
23. É importante assegurar que as quantidades do produto químico em estudo 
administradas através da dieta ou da água de beber não interferem na nu ­
trição normal nem no equilíbrio hídrico. Se o produto químico em estudo 
for incorporado na dieta, pode optar-se por concentrações constantes nesta 
(ppm) ou por doses constantes em relação ao peso corporal de cada animal, devendo indicar-se a opção tomada. No caso dos produtos químicos admi ­
nistrados por sonda esofágica, a dose deve ser administrada todos os dias à 
mesma hora, devendo ser ajustada sempre que necessário para manter uma 
relação constante entre a dose administrada e o peso corporal do animal. Se o ensaio de toxicidade oral por dose repetida constituir uma etapa preliminar de um estudo a longo prazo, a dieta deve ser a mesma em ambos os casos.
 
Exames  
24. O período de observação é de 28 dias. Os animais incluídos nos grupos 
satélites destinados a continuarem a ser observados devem ser mantidos 
durante, pelo menos, mais 14 dias sem administração do produto químico 
em estudo, para deteção do aparecimento diferido, da persistência ou da reversibilidade de efeitos tóxicos.
 
25. Pelo menos uma vez por dia, deve efetuar-se um exame clínico geral, de 
preferência sempre à(s) mesma(s) hora(s) e tendo em conta o período pre ­
visto de efeitos mais acentuados após a administração do produto químico 
em estudo, registando o estado de saúde dos animais. Pelo menos duas vezes por dia, verificam-se os casos de morbidez ou mortalidade no con ­
junto dos animais.
 
26. Deve efetuar-se um exame clínico aprofundado a cada animal antes da 
primeira exposição (para poder fazer depois comparações com o estado 
inicial do animal) e, posteriormente, pelo menos uma vez por semana. Estes exames devem ser realizados fora das gaiolas, num recinto normalizado, de preferência sempre à mesma hora. Os resultados destes exames devem ser 
cuidadosamente registados, de preferência por recurso a um sistema de 
pontuação claramente definido pelo laboratório em causa. Deve zelar-se por que as condições de ensaio sejam o mais constantes possível e os exames devem ser efetuados, de preferência, por pessoal que não esteja a 
par do ensaio realizado. Entre os sinais a registar contam-se alterações da 
pele, da pelagem, dos olhos e das mucosas e a ocorrência de secreções, excreções ou reações neurovegetativas (por exemplo, lacrimação, horripila ­
ção, alterações da dimensão pupilar ou respiração anormal). Deve também 
registar-se qualquer alteração da maneira de o animal se mover, da postura e 
da reação à manipulação, bem como a ocorrência de movimentos clónicos ou tónicos e de comportamentos estereotipados (por exemplo, atos de hi ­
giene repetitivos ou movimentação repetitiva em círculo) ou estranhos (au ­
tomutilação, movimentação para trás, etc.) (2).
 
27. Na quarta semana de exposição deve determinar-se a reação sensorial a 
diversos tipos de estímulos (2) (nomeadamente auditivos, visuais e proprio ­
cetivos) (3)(4)(5) e avaliar-se a força de preensão (6) e a atividade motora (7). As referências indicadas contêm mais informações sobre a maneira de 
proceder em cada caso, embora possam adotar-se procedimentos distintos 
dos nelas descritos.
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28. Se o estudo constituir uma etapa preliminar de um estudo ulterior de toxi ­
cidade subcrónica (a 90 dias), podem ser omitidos os exames funcionais 
previstos para a quarta semana. Nesse caso, os exames funcionais devem realizar-se durante o estudo subsequente. Não obstante, os dados de exames funcionais realizados durante o estudo por dose repetida podem facilitar a 
escolha das doses a utilizar no estudo ulterior de toxicidade subcrónica.
 
29. Como segunda exceção, também podem omitir-se os exames funcionais no 
caso dos grupos de animais que apresentem sinais de toxicidade cuja in ­
tensidade interferiria de modo significativo com esses exames.  
30. Na autópsia, pode determinar-se (facultativamente) a fase do ciclo estral de 
cada fêmea por meio de um esfregaço vaginal. Este exame fornece infor ­
mações sobre a fase do ciclo estral no momento da eutanásia do animal e 
facilita a avaliação histológica dos tecidos sensíveis aos estrogénios – ver as 
orientações sobre histopatologia (19).  
Peso corporal e consumo de alimentos e de água  
31. Todos os animais devem ser pesados pelo menos uma vez por semana. O 
consumo de alimentos deve ser medido pelo menos uma vez por semana. Se o produto químico em estudo for administrado através da água de beber, o 
consumo de água também deve medir-se pelo menos uma vez por semana.
 
Hematologia  
32. No final do período de ensaio, devem determinar-se os seguintes parâmetros 
hematológicos: hematócrito, concentração de hemoglobina, contagem de eritrócitos, reticulócitos, contagem total de leucócitos e fórmula leucocitária, 
contagem de plaquetas e tempo e potencial de coagulação. Caso o produto 
químico em estudo ou os seus metabolitos potenciais tenham, ou se suspeite que tenham, propriedades oxidantes, devem ser efetuadas outras análises, nomeadamente a determinação da concentração de meta-hemoglobina e de 
corpos de Heinz.
 
33. As colheitas de sangue devem ser efetuadas num ponto determinado a 
indicar, imediatamente antes da eutanásia dos animais ou integradas nesta, e as amostras devem ser armazenadas em condições adequadas. Os animais 
devem jejuar na noite anterior à eutanásia (
 1 ). 
Bioquímica clínica  
34. Recorrendo a amostras de sangue de cada animal, colhidas imediatamente 
antes da eutanásia ou durante esta (com exceção dos animais moribundos e/ou eutanasiados antes do termo do estudo), devem ser efetuadas determi ­
nações bioquímicas clínicas destinadas a investigar os principais efeitos 
tóxicos nos tecidos, nomeadamente aos níveis renal e hepático. Os parâme ­
tros a determinar no plasma ou no soro são os seguintes: sódio, potássio, glucose, colesterol total, ureia, creatinina, proteínas totais e albumina, pelo 
menos duas enzimas indicadoras de efeitos hepatocelulares (tais como 
a alanina-aminotransferase, a aspartato-aminotransferase, a fosfatase alcalina, a gama-glutamil-transpeptidase e a glutamato-desidrogenase) e os ácidos biliares. Em determinados casos, a determinação de outras enzimas (de 
origem hepática ou outra origem) e da bilirrubina pode fornecer informações 
úteis.
 
35. A título facultativo, podem realizar-se na última semana do estudo as se ­
guintes determinações na urina, utilizando amostras recolhida em momentos 
determinados: aspeto, volume, osmolalidade ou densidade, pH, proteínas, 
glucose e sangue/hematócitos.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 280  
( 1 ) No caso de algumas determinações no soro e no plasma, nomeadamente da glucose, é 
aconselhável que os animais jejuem durante a noite. O principal motivo desta recomen ­
dação reside no facto de que a maior variabilidade dos resultados que inevitavelmente 
ocorreria se os animais não jejuassem poderia ocultar efeitos subtis e dificultar as inter ­
pretações. No entanto, por outro lado, o jejum durante a noite pode interferir no meta ­
bolismo geral dos animais e, particularmente nos estudos realizados com administração 
pela via alimentar, perturbar a exposição diária ao produto químico em estudo. Caso se 
opte pelo jejum durante a noite, as análises bioquímicas devem ser efetuadas após os 
exames funcionais previstos para a quarta semana do estudo.
 36. Deve ainda prever-se a pesquisa no plasma ou no soro de marcadores de 
lesões gerais dos tecidos. Caso as propriedades conhecidas do produto quí ­
mico em estudo afetem, ou se suspeite de que possam afetar, determinadas vias metabólicas, devem realizar-se outras determinações, nomeadamente as seguintes: cálcio, fosfatos, triglicéridos, hormonas específicas e colinestera ­
se. A necessidade de efetuar estas determinações é estabelecida para certas 
classes de produtos químicos ou é avaliada para cada caso concreto.
 
37. Embora na avaliação internacional dos parâmetros endócrinos não tenha 
ficado demonstrado ser claramente vantajoso determinar as hormonas tiroi ­
deias (T3 e T4) e a TSH, pode ser útil conservar amostras de plasma ou de soro para determinar (facultativamente) a T3, a T4 e a TSH, caso surjam indícios de efeitos no eixo hipofisotiroideio. Estas amostras podem ser 
congeladas a -20 °C para serem armazenadas. Os fatores a seguir indicados 
podem afetar a variabilidade dos resultados das análises hormonais e as concentrações absolutas nelas determinadas:
 
— momento da eutanásia, devido à variação das concentrações hormonais 
ao longo do dia,  
— método utilizado para eutanasiar os animais sem lhes causar tensões 
desnecessárias, que poderiam afetar as concentrações hormonais,  
— diferenças ao nível das curvas de calibração dos conjuntos ( kits) para as 
determinações hormonais.  
É mais fiável recorrer a uma análise histopatológica do que à determinação 
de níveis harmonias para identificar inequivocamente os produtos químicos com atividade na tiroide.
 
38. As amostras de plasma especificamente destinadas a determinações hormo ­
nais devem colher-se à mesma hora do dia. Recomenda-se que se pondere a realização das análises da T3, da T4 e da TSH com base nas alterações 
histopatológicas detetadas na tiroide. Os conjuntos ( kits) existentes no co ­
mércio para determinar concentrações hormonais podem dar valores diferen ­
tes. Pode, portanto, não ser possível estabelecer critérios de desempenho baseados em dados históricos homogéneos. Em alternativa, os laboratórios 
devem procurar manter os coeficientes de variação para efeitos de controlo 
abaixo de 25, no caso dos parâmetros T3 e T4, e abaixo de 35, no caso do parâmetro TSH. As concentrações devem ser registadas em ng/ml.
 
39. Se os dados históricos de base forem inadequados, deve ponderar-se a 
determinação da variabilidade dos parâmetros hematológicos e de bioquí ­
mica clínica antes de iniciar a exposição dos animais às doses previstas ou – o que será preferível – num conjunto de animais não incluídos nos grupos 
ensaiados.
 
PATOLOGIA  
Autópsia macroscópica  
40. Deve ser realizada a todos os animais estudados uma autópsia macroscópica 
completa e pormenorizada através do exame cuidadoso da superfície exterior do corpo, dos orifícios, das cavidades craniana, torácica e abdominal e do conteúdo de cada uma destas. Removem-se convenientemente os
 tecidos  
aderentes ao fígado, aos rins, às glândulas suprarrenais, aos testículos, aos  
epidídimos, ao conjunto formado pela próstata, pelas vesículas seminais e  
pelas glândulas coagulantes, ao timo, ao baço, ao encéfalo e ao coração de  
todos os animais (exceto os moribundos e os que sejam eutanasiados antes 
do termo do estudo) e pesa-se cada um destes ainda húmido o mais rapi ­
damente possível depois da dissecação, para evitar que seque. Ao remover os tecidos aderentes ao complexo prostático, há que tomar precauções para não perfurar as vesículas seminais, que têm líquido no interior. Em alterna ­
tiva, podem remover-se os tecidos aderentes à próstata e às vesículas semi ­
nais e efetuar a pesagem depois de fixar estes órgãos.
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41. A título facultativo, podem pesar-se dois outros tecidos – para evitar que 
sequem, também o mais rapidamente possível depois da dissecação: os dois 
ovários (ainda húmidos) e o útero, incluindo o colo do útero – o documento TG 440 da OCDE (18) contém orientações sobre a dissecação e a prepara ­
ção dos tecidos uterinos para a pesagem].
 
42. A pesagem (facultativa) da tiroide deve realizar-se após fixação. A remoção 
dos tecidos aderentes à tiroide deve efetuar-se com muito cuidado e também só depois da fixação, para evitar danificar tecidos – que, a ocorrer, poderia comprometer a análise histopatológica.
 
43. Os tecidos a seguir indicados devem conservar-se no meio de fixação mais 
adequado ao tipo de tecido e ao exame histopatológico previsto (ver o ponto 47):
 todas as lesões macroscópicas, o encéfalo (regiões representati ­
vas, incluindo os hemisférios cerebrais, o cerebelo e a protuberância anelar),  
a medula espinal, os olhos, o estômago, o intestino delgado e o intestino  
grosso (incluindo as placas de Peyer),  o fígado, os rins, as glândulas su ­ 
prarrenais, o baço, o coração, o timo, a tiroide, a traqueia e os pulmões (conservados por injeção de fixador, seguida de imersão),
 as gónadas (tes ­
tículos e ovários),  os órgãos sexuais secundários (útero e colo do útero, 
epidídimos, próstata + vesículas seminais e glândulas de coagulação),  a va­ 
gina, a bexiga urinária, os gânglios linfáticos – o gânglio linfático mais próximo e outro gânglio linfático, a selecionar em função da experiência 
anterior do laboratório (15) –, um
 nervo periférico (ciático ou tibial), de 
preferência na vizinhança do músculo,  músculo esquelético e osso com  
medula óssea (corte ou, em alternativa, uma punção recente de medula óssea). Recomenda-se a fixação dos testículos por imersão em fixador de 
Bouin ou em fixador de Davidson modificado (16)(17). Para que o fixador 
penetre rapidamente, deve puncionar-se superficialmente a túnica albugínea com uma agulha, com cuidado, em ambos os polos do órgão. Os resultados clínicos e outros podem aconselhar o exame de outros tecidos. Devem 
conservar-se também todos os órgãos que as propriedades conhecidas do 
produto químico em estudo indiciem que serão provavelmente afetados.
 
44. Os seguintes tecidos podem dar indicações úteis sobre efeitos ao nível do 
sistema endócrino: gónadas (ovários e testículos), órgãos sexuais secundá ­
rios (útero, incluindo o colo do útero, epidídimos, vesículas seminais e glândulas de coagulação, bem como a próstata dorsolateral e ventral), vagi ­
na, hipófise, glândulas mamárias masculinas, tiroide e glândulas suprarre ­
nais. Não há documentação suficiente de alterações das glândulas mamárias 
masculinas, mas este parâmetro pode ser muito sensível às substâncias com atividade estrogénica. A observação dos órgãos e tecidos não especificados no ponto 43 é facultativa (ver o apêndice 2).
 
45. O documento com a referência 19, que contém orientações no domínio da 
histopatologia, dá mais informações sobre a dissecação, a fixação, a colheita de amostras e a histopatologia de tecidos do sistema endócrino.
 
46. No programa de ensaios internacional obtiveram-se alguns indícios de que é 
possível detetar efeitos endócrinos subtis de produtos químicos capazes de 
afetar ligeiramente a homeostase das hormonas sexuais, não tanto com base em alterações histopatológicas claras dos órgãos sexuais femininos, mas sim através das perturbações que aqueles provocam na sincronização do ciclo 
estral em diversos tecidos. Embora esses efeitos careçam de prova definitiva, 
recomenda-se que, na interpretação do exame histopatológico dos ovários (células foliculares, tecais e da granulosa), do útero, do colo do útero e da vagina, se tenham em conta eventuais indícios de assincronias do ciclo 
estral. Caso se determine o estádio do ciclo por meio de esfregaços vaginais, 
este dado pode ser tido em conta como elemento comparativo suplementar.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 282
 
Histopatologia  
47. Deve efetuar-se um exame histopatológico completo dos órgãos e tecidos 
conservados de todos os animais dos grupos de controlo e do grupo que recebeu a dose mais elevada. Caso o exame dos animais deste último grupo 
revele alterações atribuíveis à dose do produto químico em estudo, devem 
examinar-se também os animais de todos os outros grupos a que foram administradas doses do produto químico.
 
48. Devem examinar-se todas as lesões macroscópicas.  
49. Caso se tenha constituído um grupo satélite de animais, deve efetuar-se o 
exame histopatológico dos tecidos e órgãos que tenham revelado alterações nos animais dos grupos expostos a uma dose do produto químico em estudo.
 
DADOS E RELATÓRIOS  
Dados  
50. Devem ser apresentados todos os dados individuais. Os dados devem ainda 
ser resumidos num quadro, indicando, para cada grupo estudado, o número 
de animais no início do ensaio, o número de animais que morreram durante o ensaio ou que foram eutanasiados, a hora de cada morte ou eutanásia, o número de animais que apresentaram sinais de toxicidade, os sinais de 
toxicidade observados, nomeadamente o momento do seu aparecimento e 
a sua duração e intensidade, o número de animais que apresentaram lesões, o tipo e a intensidade destas e a percentagem de animais que apresentaram cada tipo de lesão.
 
51. Se possível, devem ser avaliados os resultados numéricos por um método 
estatístico corrente adequado. Na comparação de um efeito numa gama de 
doses, deve evitar-se o recurso a múltiplos testes t. Os métodos estatísticos 
devem ser escolhidos no planeamento do estudo.  
52. Para fins de controlo de qualidade, propõe-se a compilação de dados de 
controlo históricos e o cálculo de coeficientes de variação dos dados numé ­
ricos, especialmente no caso dos parâmetros relacionados com a deteção de desreguladores do sistema endócrino. Estes dados podem ser utilizados para 
fins comparativos quando da avaliação de estudos reais.
 
Relatório dos ensaios  
53. Elementos a constar do relatório dos ensaios:  
Produto químico em estudo:  
— natureza física, grau de pureza e propriedades físico-químicas,  
— dados de identificação.  
Veículo (se for o caso):  
— justificação da escolha do veículo (se não for água).  
Animais estudados:  
— espécie e estirpe utilizadas,  
— número, idade e sexo,  
— proveniência, condições de alojamento, dieta, etc.,  
— peso de cada animal no início do ensaio,  
— caso não sejam utilizados ratos, justificação da utilização de outra espé ­
cie. 
Condições de realização dos ensaios:  
— fundamentação da escolha das doses,  
— elementos relativos à formulação do produto químico em estudo/à in ­
corporação do mesmo na dieta dos animais; concentração atingida, es ­
tabilidade e homogeneidade da preparação,  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 283
 
— elementos relativos à administração do produto químico em estudo,  
— se aplicável, equivalência entre a concentração do produto químico em 
estudo na dieta ou na água de beber, expressa em ppm, e a dose real, expressa em mg/kg de peso corporal/dia,
 
— elementos sobre a qualidade dos alimentos e da água.  
Parâmetros facultativos examinados:  
— lista desses parâmetros.  
Resultados:  
— pesos corporais e alterações de peso corporal,  
— consumo de alimentos e de água, se aplicável,  
— respostas tóxicas em função do sexo e da dose administrada, incluindo 
sinais de toxicidade,  
— natureza, intensidade e duração dos sinais clínicos observados (reversí ­
veis ou irreversíveis),  
— dados relativos à atividade sensorial, à força de preensão e à atividade 
motora,  
— resultados das análises hematológicas, acompanhados dos respetivos va ­
lores de base,  
— resultados das análises bioquímicas, acompanhados dos respetivos valo ­
res de base,  
— pesos corporais no momento da eutanásia e pesos dos órgãos,  
— resultados das autópsias,  
— descrição pormenorizada dos resultados do exame histopatológico,  
— dados de absorção, se disponíveis,  
— tratamento estatístico dos resultados, se for o caso.  
Discussão dos resultados.  
Conclusões.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 284
 
Apêndice 1  
DEFINIÇÕES  
Atividade antiandrogénica:  capacidade de um produto químico de agir como 
hormona androgénica natural (por exemplo, a testosterona) num mamífero.  
Atividade antiandrogénica:  capacidade de um produto químico de suprimir a 
ação de uma hormona androgénica natural (por exemplo, a testosterona) num mamífero.
 
Atividade antiestrogénica:  capacidade de um produto químico de suprimir a 
ação de uma hormona estrogénica natural (por exemplo, o estradiol 17ß) num mamífero.
 
Atividade antitiroideia:  capacidade de um produto químico de suprimir a ação 
de uma hormona da tiroide natural (por exemplo, a T  3 ) num mamífero.  
Dosagem:  termo geral que abrange a dose, a frequência desta e o tempo de 
aplicação da mesma.  
Dose:  quantidade de produto químico em estudo administrada. Exprime-se em 
peso diário do produto químico por unidade de peso corporal do animal ensaiado (por exemplo, mg/kg de peso corporal/dia) ou sob a forma de uma concentração constante na dieta.
 
Toxicidade evidente:  termo geral que descreve a existência de sinais claros de 
toxicidade após a administração do produto químico em estudo. Os sinais em causa devem ser suficientes para a avaliação dos perigos e devem ser tais que seja de prever que o aumento da dose administrada provoque o aparecimento de 
sinais intensos de toxicidade e provável mortalidade.
 
NOAEL:  abreviatura de " no observed adverse effect level " ("nível sem obser ­
vação de efeitos adversos"), que constitui a dose máxima que não produz efeitos 
adversos observáveis da exposição à mesma.  
Atividade estrogénica:  capacidade de um produto químico de agir como hor ­
mona estrogénica natural (por exemplo, o estradiol 17ß) num mamífero.  
Produto químico em estudo:  qualquer substância ou mistura à qual seja apli ­
cado este método de ensaio.  
Atividade tiroideia:  capacidade de um produto químico de agir como uma 
hormona da tiroide natural (por exemplo, a T  3 ) num mamífero.  
Validação:  processo científico concebido para caracterizar as limitações e os 
imperativos operacionais de um método de ensaio e para demonstrar a fiabilidade 
e pertinência do mesmo para um determinado fim.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 285
 
Apêndice 2  
Parâmetros recomendados para a deteção de desreguladores do sistema 
endócrino pelo método B.7  
Parâmetros obrigatórios Parâmetros facultativos 
Peso 
— Testículos 
— Epidídimos — Glândulas suprarrenais 
— Próstata + vesículas seminais e 
glândulas coagulantes — Ovários 
— Útero, incluindo o colo do útero — Tiroide
 
Histopatologia  
— Gónadas 
— Testículos e — Ovários 
— Órgãos sexuais secundários: 
— Epidídimos 
— Próstata + vesículas seminais e 
glândulas coagulantes 
— Útero, incluindo o colo do útero 
— Glândulas suprarrenais 
— Tiroide — Vagina — Esfregaço vaginal 
— Glândulas mamárias masculinas — Hipófise
 
Dosagens hormonais  
— Níveis circulantes de T3 e T4 
— Níveis circulantes de TSH  
REFERÊNCIAS:  
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(13) OCDE. Draft Summary record of the meeting of the Task Force on Endo ­
crine Disrupters Testing and Assessment. ENV/JM/TG/EDTA/M(2006)3.  
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(16) Hess R.A., Moore B.J. (1993). Histological Methods for the Evaluation of 
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Bouin’s fluid and conventional Davidson’s fluid.  Toxicol. Pathol.  30:524- 
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(18) OCDE (2007). OECD Guideline for Testing of Chemicals N.  o 440: Utero ­
trophic Bioassay in Rodents: A short-term screening test for oestrogenic properties.
 
(19) OCDE (2009). Guidance Document 106 on Histologic evaluation of Endo ­
crine and Reproductive Tests in Rodents. ENV/JM/Mono(2009)11.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 287
 
B.8. TOXICIDADE SUBAGUDA POR INALAÇÃO: ESTUDO DE 28 DIAS  
RESUMO  
Este método revisto visa caracterizar integralmente a toxicidade por via inalatória 
do produto químico estudado, após exposição repetida por um período limitado 
(28 dias), e obter dados para quantificar os riscos por inalação. Expõem-se durante 28 dias, seis horas por dia, grupos constituídos por dez roedores machos e dez roedores fêmeas a três ou mais concentrações do produto químico em 
estudo (a), a ar filtrado (b, controlo negativo), e/ou ao veículo (c, controlo do 
veículo). Em geral, Os animais são expostos durante cinco dias por semana, mas admite-se que sejam expostos sete dias por semana. Ensaiam-se sempre machos e fêmeas, mas cada sexo pode ser exposto a concentrações diferentes, se um deles 
for reconhecidamente mais sensível ao produto químico do que o outro. Este 
método concede ao diretor do estudo flexibilidade suficiente para incluir grupos satélites (para apreciação da reversibilidade), lavagens broncoalveolares, testes neurológicos e exames histopatológicos e de patologia clínica suplementares, a 
fim de melhor caracterizar a toxicidade do produto químico em estudo.
 
INTRODUÇÃO  
1. Este método é equivalente ao  Test Guideline  412 (2009) da OCDE. O  Test 
Guideline  412 (TG 412) inicial relativo à toxicidade subaguda por inalação 
foi adotado em 1981 (1). O presente método B.8 é equivalente ao método 
TG 412 revisto, tendo sido atualizado para refletir o estado da ciência e 
cumprir exigências atuais e futuras da regulamentação.  
2. O método permite caracterizar os efeitos adversos resultantes da exposição 
diária por inalação, durante 28 dias, ao produto químico em estudo. Os 
dados gerados pelos estudos de toxicidade subaguda por inalação durante 
28 dias podem ser utilizados para quantificar riscos (caso não se lhes siga um estudo de toxicidade subcrónica por inalação a 90 dias — capítulo B.29 deste anexo). Os dados gerados pelo presente método também podem ser 
úteis para a escolha das concentrações a utilizar em estudos mais prolon ­
gados, por exemplo, o estudo da toxicidade subcrónica por inalação a 90 dias. O método não se destina especificamente ao ensaio de nanomateriais. No final do capítulo e no documento de orientações n.
 o 39 (2) são definidos 
alguns conceitos utilizados neste método.  
CONSIDERAÇÕES INICIAIS  
3. A fim de melhorar a qualidade do estudo e de minimizar a utilização de 
animais, antes de realizar o estudo o laboratório de ensaios deve ponderar todas as informações disponíveis sobre o produto químico em causa. Entre 
os elementos úteis para a escolha das concentrações mais adequadas 
contam-se a identidade, a estrutura química e as propriedades físico-quími ­
cas do produto químico em estudo, resultados de ensaios de toxicidade  in 
vitro  ou in vivo , as utilizações previstas, o potencial de exposição humana, 
dados (Q)SAR — " (quantitative) structure-activity relationships ", relações 
(quantitativas) estrutura/atividade — e toxicológicos disponíveis sobre pro ­
dutos químicos estruturalmente afins e dados provenientes de ensaios de toxicidade aguda por inalação. Se estiver prevista a ocorrência ou ocorrerem 
manifestações de neurotoxicidade durante o estudo, fica ao critério do di ­
retor deste incluir no estudo as avaliações suplementares que considere adequadas, tais como uma bateria de observações funcionais e determina ­
ções da atividade motora. Embora o momento da exposição possa ser um 
aspeto crítico em determinados exames, a realização destes estudos suple ­
mentares não deve interferir na conceção do estudo principal.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 288
 
4. No caso dos produtos químicos corrosivos ou irritantes, podem ser ensaia ­
das diluições adequadas, a concentrações que gerem o grau de toxicidade 
pretendido [ver o GD 39 (2)]. Ao expor animais a produtos químicos com tais características, as concentrações visadas devem ser suficientemente bai ­
xas para não causarem dor ou sofrimento intensos, sem deixarem de ser 
suficientes para que a curva de resposta à concentração abranja os níveis 
correspondentes aos objetivos do ensaio, nos planos científico e da regula ­
mentação. Estas concentrações devem ser adaptadas a cada caso, de prefe ­
rência com base num estudo exploratório convenientemente concebido, que 
forneça informações sobre o parâmetro crítico, eventuais limiares de irrita ­
ção e o momento do aparecimento dos efeitos (ver os pontos 11 a 13). É necessário justificar as concentrações escolhidas em cada caso.
 
5. Os animais moribundos ou que apresentem sinais óbvios de dor ou de 
grande sofrimento continuado devem ser eutanasiados. Os animais moribun ­
dos são equiparados aos que morrem durante o ensaio. O documento de 
orientações da OCDE relativo aos parâmetros eticamente mensuráveis (3) define os critérios que devem presidir à decisão de eutanasiar animais moribundos ou em grande sofrimento, bem como orientações sobre o reco ­
nhecimento da morte previsível ou iminente.
 
DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
Escolha da espécie animal  
6. Devem ser utilizados roedores adultos, jovens e saudáveis de estirpes labo ­
ratoriais de uso corrente. A espécie preferida é o rato. É necessário justificar 
o recurso a outras espécies.  
Preparação dos animais  
7. As fêmeas utilizadas devem ser nulíparas e não podem estar grávidas. 
No dia da seleção aleatória, os animais devem ser adultos jovens com sete a nove semanas, de peso corporal não desviado mais de 20 % do 
peso médio correspondente a cada sexo. Os animais são selecionados alea ­
toriamente, marcados para identificação individual e mantidos nas suas gaiolas durante, pelo menos, cinco dias antes do início do ensaio, para aclimatação às condições laboratoriais.
 
Manutenção dos animais  
8. É necessário identificar individualmente cada animal, se possível com um 
respondedor ( transponder ) subcutâneo, para facilitar as observações e evitar 
confusões. A temperatura do biotério deve ser de 22 °C ± 3 °C. O ideal será manter a humidade relativa entre 30 % e 70 %, embora isto possa não 
ser possível ao utilizar água como veículo. Antes e depois das exposições, 
os animais são geralmente engaiolados por sexo e por concentração, mas o número de animais por gaiola não deve dificultar a clara observação de cada animal e deve minimizar as perdas devidas a lutas ou canibalismo. Quando 
se opta pela exposição unicamente nasal dos animais, pode ser necessário 
aclimatá-los aos tubos de contenção. Estes não devem provocar aos animais tensões físicas, térmicas ou dinâmicas excessivas. A contenção dos animais pode afetar parâmetros fisiológicos como a temperatura corporal (hiperter ­
mia) e/ou o volume respirado por minuto. Caso se disponha de dados 
genéricos reveladores de que nenhuma destas alterações ocorre em grau apreciável, não será necessária a adaptação prévia aos tubos de contenção. Os animais cujo corpo seja exposto na totalidade a um aerossol devem 
permanecer em gaiolas individuais durante a exposição, para evitar que o 
aerossol seja filtrado pela pelagem dos que com eles coabitem. Exceto nos períodos de exposição, podem utilizar-se dietas convencionais certificadas de laboratório, com fornecimento ilimitado de água potável da rede pública. 
A iluminação deve ser artificial, com uma sequência de 12 horas de luz 
seguidas de 12 horas de escuridão.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 289
 
Câmaras de inalação  
9. Ao escolher-se a câmara de inalação, deve ter-se em conta a natureza do 
produto químico em estudo e o objetivo do ensaio. Privilegia-se o modo de 
exposição unicamente nasal, termo que abrange as exposições "unicamente da cabeça", "unicamente do nariz" e "unicamente do focinho". A exposição unicamente nasal é geralmente preferida no estudo de aerossóis de líquidos 
ou de sólidos, ou de vapores que possam condensar-se e formar aerossóis. 
Para determinados objetivos do estudo, poderá ser melhor recorrer ao modo de exposição de corpo inteiro, mas será necessário justificá-lo no relatório. Para garantir estabilidade atmosférica nas câmaras de corpo inteiro, o vo ­
lume de todos os animais presentes em cada câmara não deve exceder 5 % 
do volume da câmara. O documento GD 39 (2) descreve os princípios, vantagens e desvantagens das técnicas de exposição unicamente nasal e de corpo inteiro.
 
ESTUDOS DA TOXICIDADE  
Concentrações-limite  
10. Contrariamente aos estudos de toxicidade aguda, nos estudos de toxicidade 
subaguda por inalação a 28 dias não está definida nenhuma concentração- -limite. Na escolha da concentração máxima a ensaiar, deve ter-se em conta a concentração máxima atingível, o nível de exposição humana mais des ­
favorável, a necessidade de manter um fornecimento adequado de oxigénio 
e/ou considerações de bem-estar animal. Se os dados disponíveis não per ­
mitirem estabelecer limites, podem utilizar-se os valores-limite de exposição aguda fixados no Regulamento (CE) n.
 o 1272/2008 (13) – concentração 
máxima até 5 mg/l para aerossóis, 20 mg/l para vapores e 20 000 ppm 
para gases; ver igualmente o GD 39 (2). Se for necessário exceder estes limites ao ensaiar gases ou produtos químicos muito voláteis (por exemplo, refrigerantes), haverá que justificá-lo. A concentração-limite deve induzir 
efeitos tóxicos inequívocos sem gerar tensões desnecessárias nos animais 
nem afetar a longevidade dos mesmos (3).
 
Estudo exploratório  
11. Antes de iniciar o estudo principal, pode ser necessário realizar um estudo 
exploratório. Um estudo exploratório com as características aqui definidas é 
mais completo do que um estudo preliminar, por não se limitar à escolha 
das concentrações. O êxito do estudo principal pode depender dos conhe ­
cimentos adquiridos num estudo exploratório. Este pode, por exemplo, fornecer informações técnicas sobre métodos de análise, granulometria, me ­
canismos de toxicidade, dados histopatológicos e de patologia clínica e 
estimativas do nível sem observação de efeitos adversos (NOAEL) e da concentração máxima tolerada no estudo principal. Fica ao critério do di ­
retor do estudo recorrer a um estudo exploratório para determinar o limite 
mínimo de irritação do aparelho respiratório (por exemplo, por meio de uma 
histopatologia do aparelho respiratório, de testes da função pulmonar ou de uma lavagem broncoalveolar), a concentração máxima que os animais tole ­
ram sem tensões excessivas e os parâmetros que melhor caracterizam a 
toxicidade do produto químico em estudo.
 
12. O estudo exploratório pode abranger uma ou mais concentrações. A cada 
concentração, expõem-se, no máximo, três machos e três fêmeas. A duração deste estudo varia entrecinco dias, no mínimo, e geralmente não mais de 14 dias. É necessário justificar no relatório as concentrações escolhidas para o 
estudo principal. O objetivo deste último é demonstrar a existência de uma 
relação entre a concentração e a resposta obtida para o parâmetro previsi ­
velmente mais sensível. Idealmente, a concentração mais baixa deve ser a concentração sem efeitos adversos observáveis e a concentração mais alta 
deve induzir efeitos tóxicos inequívocos, sem gerar tensões desnecessárias 
nos animais nem afetar a longevidade dos mesmos (3).
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 290
 
13. Ao escolher os níveis de concentração para o estudo exploratório, devem 
ponderar-se todas as informações disponíveis, incluindo relações 
estrutura-atividade e dados relativos a produtos químicos semelhantes (ver o ponto 3). O estudo exploratório pode confirmar ou refutar a escolha dos parâmetros mais sensíveis segundo critérios mecanísticos, por exemplo, a 
inibição da colinesterase por organofosfatos, a formação de 
meta-hemoglobina por agentes eritrocitotóxicos, as hormonas tiroideias (T
 3 e T 4 ), no caso dos agentes tirotóxicos, proteínas, a LDH, ou a presença 
de neutrófilos na lavagem broncoalveolar, no caso de partículas inócuas 
fracamente solúveis ou de aerossóis irritantes dos pulmões.  
Estudo principal  
14. Um estudo principal de toxicidade subaguda compreende geralmente três 
níveis de concentração, bem como, em paralelo, os controlos negativo (do 
ar) e/ou do veículo (ver o ponto 17). Para facilitar a seleção dos níveis de exposição, devem ser utilizados todos os dados disponíveis, nomeadamente resultados de estudos de toxicidade sistémica, metabólicos e cinéticos (deve 
ter-se especial cuidado em evitar níveis de concentração elevados que sa ­
turem os processos cinéticos). Cada grupo de ensaio compreende, pelo menos, a exposição de dez roedores (cinco machos e cinco fêmeas) ao produto químico em estudo, durante seis horas por dia e cinco dias por 
semana, ao longo de quatro semanas (a duração total do estudo é de 28 
dias). Os animais também podem ser expostos sete dias por semana (por exemplo, ao ensaiar produtos farmacêuticos inalados). Se um dos sexos for reconhecidamente mais sensível ao produto químico em estudo, pode 
expor-se cada sexo a concentrações diferentes das utilizadas para o outro, 
a fim de otimizar a resposta à concentração como se refere no ponto 15. Se espécies que não o rato forem sujeitas a exposição unicamente nasal, pode ajustar-se a duração máxima da exposição para minimizar a tensão gerada 
na espécie em causa. Se a duração da exposição for inferior a seis horas por 
dia ou se for necessário realizar um estudo de exposição de longa duração (por exemplo, 22 horas por dia) de corpo inteiro [ver o GD 39 (2)], será necessário justificá-lo. Durante o período de exposição, a alimentação deve 
ser suspensa, exceto se a exposição exceder seis horas. Durante as exposi ­
ções de corpo inteiro pode continuar a fornecer-se água.
 
15. As concentrações visadas escolhidas devem permitir identificar o(s) ór ­
gão(s)-alvo e evidenciar uma relação clara entre a concentração e a resposta obtida:
 
— o nível de concentração mais elevado deve gerar efeitos tóxicos, mas 
não causar sintomas deletérios nem mortalidade, que impediriam a in ­
terpretação dos resultados,  
— o espaçamento do nível ou níveis de concentração intermédios deve 
permitir uma gradação dos efeitos tóxicos entre os correspondentes 
aos das concentrações mais baixa e mais elevada,  
— o nível de concentração mais baixo não deve ter efeitos tóxicos ou, se 
os tiver, estes devem ser reduzidos.  
Estudo em grupos satélites (para apreciação da reversibilidade)  
16. Pode recorrer-se a um estudo satélite para observar a reversibilidade, a 
persistência ou o aparecimento diferido de efeitos tóxicos durante um pe ­
ríodo adequado, não inferior a 14 dias, após o termo da exposição. Com ­
põem os grupos satélites cinco machos e cinco fêmeas, que são expostos ao mesmo tempo que os animais ensaiados no estudo principal. Os animais dos grupos satélites são expostos à concentração mais elevada do produto quí ­
mico em estudo e devem ser complementados pelos grupos necessários de 
controlo do ar e/ou do veículo em paralelo (ver o ponto 17).
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 291
 
Animais de controlo  
17. Os animais de controlo negativo (do ar) em paralelo devem ser tratados do 
mesmo modo que os animais dos grupos que participam no ensaio princi ­
pal, exceto que são expostos a ar filtrado em vez de ao produto químico em estudo. Se for utilizada água ou outra substância para gerar a atmosfera ensaiada, deve incluir-se no estudo, em vez do grupo de controlo negativo 
(do ar), um grupo de controlo do veículo. Sempre que possível, o veículo 
utilizado deve ser água. Se assim for, os animais de controlo são expostos a ar com a mesma humidade relativa que o ar utilizado para os grupos expostos ao produto químico em estudo. A escolha do veículo mais ade ­
quado deve basear-se em dados históricos ou num estudo prévio convenien ­
temente realizado. Se não se conhecer bem a toxicidade do veículo, fica ao critério do diretor do estudo utilizar em simultâneo um controlo negativo (do ar) e um controlo do veículo, embora se desaconselhe fortemente este 
procedimento. Se os dados históricos revelarem que o veículo não é tóxico, 
não haverá necessidade de um grupo de controlo negativo (do ar) e apenas deve utilizar-se um controlo do veículo. Se um estudo prévio de um produto químico incorporado num determinado veículo não revelar toxicidade, 
conclui-se que o veículo em causa não é tóxico à concentração ensaiada, 
devendo utilizar-se esse controlo do veículo.
 
CONDIÇÕES DE EXPOSIÇÃO  
Administração das concentrações  
18. Os animais são expostos ao produto químico em estudo sob a forma de gás, 
vapor, aerossol ou de uma mistura destes. O estado físico a ensaiar depende 
das propriedades físico-químicas do produto químico em estudo, da concen ­
tração escolhida e/ou da forma física cuja probabilidade de presença durante a manipulação e utilização do mesmo seja maior. Os produtos químicos higroscópicos ou quimicamente reativos devem ser ensaiados em atmosfera 
seca. Devem tomar-se precauções para evitar concentrações que possam 
provocar explosões. As matérias em partículas podem ser sujeitas a proces ­
sos mecânicos para reduzir a granulometria. Para mais orientações, consultar o documento GD 39 (2).
 
Distribuição granulométrica  
19. Os aerossóis e os vapores que possam condensar-se em aerossóis devem ser 
objeto de análise granulométrica. Para que todas as zonas pertinentes do 
aparelho respiratório sejam expostas, recomenda-se a utilização de aerossóis com diâmetro aerodinâmico mediano da massa (MMAD) compreendido entre 1 μm e 3 μm e desvio-padrão geométrico ( σ
 g ) compreendido entre 
1,5 e 3,0 (4). Deve fazer-se o razoavelmente possível para respeitar estas 
condições, sendo necessário um parecer especializado caso isso não se consiga. Por exemplo, as partículas dos fumos metálicos podem ser mais pequenas do que o limite inferior indicado, ao passo que as partículas 
carregadas e as fibras podem exceder o limite superior.
 
Incorporação do produto químico em estudo num veículo  
20. Idealmente, o produto químico em estudo deve ser ensaiado sem que tenha 
sido incorporado num veículo. Se for necessário utilizar um veículo para obter a concentração e a granulometria adequadas do produto químico em causa, deve preferir-se a água. Se o produto químico for dissolvido num 
veículo, será necessário comprovar que se mantém estável.
 
MONITORIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE EXPOSIÇÃO  
Caudal de ar nas câmaras  
21. Durante cada exposição, é necessário regular cuidadosamente, monitorizar 
continuamente e registar pelo menos de hora a hora o caudal de ar através de cada câmara. A monitorização em tempo real da concentração (ou esta ­
bilidade no tempo) da atmosfera em estudo constitui uma medida per ­
manente de todos os parâmetros dinâmicos e um meio indireto de regular 
os que têm importância para a inalação. Se a concentração for monitorizada
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em tempo real, pode reduzir-se a frequência da medição do caudal de ar a 
apenas uma medição diária por exposição. É necessário ter especial cuidado 
em evitar reinalações nas câmaras de exposição unicamente nasal. A con ­
centração de oxigénio não deve ser inferior a 19 % e a concentração de dióxido de carbono não deve exceder 1 %. Se houver razões para crer que 
estas concentrações não são respeitadas, é necessário medi-las. Se as medi ­
ções efetuadas no primeiro dia de exposição mostrarem que as concentra ­
ções destes gases estão aos níveis corretos, não é necessário voltar a medi- -las.
 
Temperatura e humidade relativa nas câmaras  
22. Deve manter-se a temperatura nas câmaras a 22 °C ± 3 °C. Tanto no caso 
das exposições unicamente nasais como das exposições do corpo inteiro, é 
necessário monitorizar continuamente a humidade relativa na zona de res ­
piração dos animais e, se possível, registá-la de hora a hora durante cada exposição. É preferível manter a humidade relativa entre 30 % e 70 %, mas isso pode não ser possível (por exemplo, quando se estudam misturas 
aquosas) ou pode não ser mensurável (devido a interferências do produto 
químico em estudo com o método de ensaio).
 
Concentração nominal do produto químico em estudo  
23. Sempre que possível, deve calcular-se e registar-se a concentração nominal 
na câmara de exposição. Esta é dada pela divisão da massa gerada do produto químico em estudo pelo volume de ar total que circulou pelo 
sistema da câmara de inalação. A concentração nominal não é utilizada 
para caracterizar a exposição dos animais, mas a sua comparação com a concentração real dá uma indicação da eficácia de geração do sistema de ensaio, podendo ser utilizada para detetar problemas a esse nível.
 
Concentração real do produto químico em estudo  
24. Entende-se por "concentração real do produto químico em estudo", a con ­
centração do produto químico nas amostras colhidas na zona de respiração 
dos animais da câmara de inalação. As concentrações reais podem 
determinar-se por métodos específicos (por exemplo, amostragem direta ou métodos de adsorção ou de reação química e posterior caracterização analítica) ou por métodos inespecíficos, tais como gravimetria após filtra ­
ção. O método gravimétrico só é aceitável para aerossóis de pós com um 
único componente ou de líquidos pouco voláteis e deve apoiar-se em ca ­
racterizações adequadas específicas do produto químico em causa efetuadas antes da realização do estudo. A concentração de aerossóis de pós com 
vários componentes também pode determinar-se por gravimetria. Todavia, 
são necessários para isso dados analíticos que demonstrem que a composi ­
ção do produto transportado no aerossol é semelhante à do produto inicial. Se não se dispuser desses dados, pode ser necessário reanalisar periodica ­
mente o produto químico em estudo (idealmente no aerossol) durante o 
ensaio. No caso dos agentes aerossolizados que possam evaporar-se ou sublimar, é necessário demonstrar que todas as fases são recolhidas pelo método escolhido.
 
25. Deve utilizar-se, se possível, apenas um lote do produto químico em estudo 
durante os ensaios e a amostra em estudo deve ser conservada em condições 
que preservem a sua pureza, homogeneidade e estabilidade. Antes de iniciar 
o estudo, deve caracterizar-se o produto químico em causa no que respeita à sua pureza e, se tecnicamente viável, à sua identidade e às quantidades dos contaminantes e impurezas nele identificados. Para o efeito, pode 
recorrer-se, entre outros, aos seguintes dados: tempos de retenção e áreas 
relativas de picos, pesos moleculares obtidos por espetrometria de massa ou cromatografia em fase gasosa ou outras estimativas. Embora a identidade da amostra a estudar não seja da responsabilidade do laboratório, pode ser 
aconselhável que este confirme, pelo menos, alguns aspetos da caracteriza ­
ção efetuada pelo cliente (cor, natureza física, etc.).
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26. Deve manter-se a atmosfera de exposição tão constante quanto possível. 
Para demonstrar a estabilidade das condições de exposição, pode 
utilizar-se um dispositivo de monitorização em tempo real, tal como um fotómetro de aerossóis, para esses casos, ou, para vapores, um analisador de hidrocarbonetos totais. Deve medir-se a concentração real na câmara pelo 
menos três vezes por nível de exposição, em cada dia de exposição. Se isso 
não for viável, por limitações relacionadas com o caudal de ar ou devido a concentrações baixas, aceita-se uma amostra por período de exposição. Idealmente, essa amostra deve então ser colhida ao longo de todo o período 
de exposição. A concentração na câmara correspondente a uma determinada 
amostra não deve desviar-se da concentração média na câmara mais de 10 %, no caso de gases e vapores, nem mais de 20 %, no caso de aerossóis de líquidos ou de sólidos. Deve calcular-se e indicar-se no relatório o tempo 
necessário para a câmara atingir o equilíbrio (t
 95 ). A duração da exposição 
corresponde ao tempo de geração do produto químico em estudo, incluído o tempo necessário para a câmara atingir o equilíbrio (t
 95 ) e para o decai ­
mento da concentração. O documento GD 39 (2) contém orientações para a 
estimativa do t  95 . 
27. No caso de misturas muito complexas de gases ou vapores e de aerossóis 
(por exemplo, atmosferas de combustão e produtos químicos gerados por 
produtos ou dispositivos finais específicos), o comportamento de cada fase 
na câmara de inalação pode ser diferente. Por esse motivo, deve escolher-se em cada fase (gás ou vapor e aerossol) pelo menos uma substância indica ­
dora (substância analisada), normalmente a principal substância ativa da 
mistura. Se o produto químico em estudo for uma mistura, deve 
indicar-se no relatório a concentração analítica correspondente à mistura e não apenas a concentração correspondente ao ingrediente ativo ou à subs ­
tância indicadora (substância analisada) em causa. O documento GD 39 (2) 
contém mais informações sobre as concentrações reais.
 
Distribuição granulométrica do produto químico em estudo  
28. Deve determinar-se a distribuição granulométrica dos aerossóis pelo menos 
semanalmente por nível de concentração, recorrendo a um impactor de 
cascata ou a outro instrumento, tal como um granulómetro aerodinâmico. Se for possível demonstrar a equivalência dos resultados obtidos pelo im ­
pactor de cascata e pelo instrumento alternativo, pode utilizar-se este último 
em todo o estudo.
 
29. Em paralelo ao instrumento primário, deve utilizar-se um segundo disposi ­
tivo, tal como um filtro gravimétrico ou um borbulhador de gás/impactor  
impinger , para confirmar a eficiência de captação do primeiro. As concen ­
trações mássicas obtidas por análise granulométrica e por análise com filtros não devem diferir entre si mais do que valores razoáveis [ver o GD 39 (2)]. 
Se for possível demonstrar esta equivalência, a todas as concentrações 
ensaiadas, no início do estudo, não é necessário efetuar mais medições de confirmação. Por razões de bem-estar animal, devem tomar-se medidas para minimizar dados inconclusivos que possam obrigar à repetição do estudo.
 
30. É necessário efetuar uma análise granulométrica no caso dos vapores que 
possam condensar-se para formar aerossóis ou se forem detetadas partículas numa atmosfera de vapores suscetível de formar fases mistas.
 
EXAMES  
31. Os animais devem ser examinados clinicamente antes, durante e depois do 
período de exposição. Consoante a resposta dos animais durante a exposi ­
ção, pode ser conveniente aumentar a frequência dos exames. Se for difícil 
examinar os animais devido aos tubos de contenção utilizados, à reduzida iluminação das câmaras de corpo inteiro ou à opacidade da atmosfera, deve-se examiná-los cuidadosamente depois da exposição. Os exames rea ­
lizados antes da exposição do dia seguinte podem apreciar a eventual re ­
versibilidade ou intensificação dos efeitos tóxicos.
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32. Todos os exames devem ser registados, mantendo registos individuais para 
cada animal. Se forem eutanasiados animais ou forem encontrados animais 
mortos, deve registar-se o momento da morte com a maior exatidão possí ­
vel. 
33. Os exames a efetuar aos animais engaiolados devem incidir, nomeadamente, 
nas alterações da pele e da pelagem, dos olhos e das mucosas, do aparelho 
respiratório, do sistema circulatório, do sistema nervoso, da atividade so ­
matomotora e do comportamento. Deve estar-se atento a tremores, convul ­
sões, salivação, diarreia, letargia, sono e coma. A medição da temperatura retal pode corroborar uma bradipneia reflexa ou uma hipo/hipertermia rela ­
cionadas com a exposição ou com o confinamento. Entre as avaliações 
suplementares que podem incluir-se no protocolo de estudo contam-se as de parâmetros cinéticos ou ao nível da biomonitorização, da função pulmo ­
nar, da retenção de matérias fracamente solúveis acumuladas no tecido 
pulmonar e de alterações comportamentais.
 
PESO CORPORAL  
34. Regista-se o peso de cada animal pouco antes da primeira exposição (dia 0) 
e, em seguida, duas vezes por semana (por exemplo, às sextas-feiras e às segundas-feiras, para verificar a recuperação durante o fim de semana sem exposição, ou intervaladas de modo a possibilitar a avaliação da toxicidade 
sistémica), bem como no momento da morte ou da eutanásia. Se não se 
registarem efeitos nas duas primeiras semanas, durante o resto do estudo podem medir-se os pesos corporais apenas uma vez por semana. Os animais que integram os (eventuais) grupos satélites (para apreciação da reversibi ­
lidade) devem continuar a ser pesados semanalmente durante o período de 
recuperação. No termo do estudo, pesa-se cada animal pouco antes de ser eutanasiado, para não falsear o cálculo da relação entre o peso de cada órgão e o peso corporal.
 
CONSUMO DE ALIMENTOS E DE ÁGUA  
35. Mede-se semanalmente o consumo de alimentos, podendo também medir-se 
o consumo de água.  
PATOLOGIA CLÍNICA  
36. Efetua-se uma avaliação de patologia clínica a todos os animais depois de 
eutanasiados, incluindo os dos grupos de controlo e dos grupos satélites (para apreciação da reversibilidade). Regista-se o lapso de tempo entre o 
termo da exposição e a colheita de sangue, em especial quando a recons ­
tituição do parâmetro visado é rápida. Recomenda-se que, após o termo da exposição, sejam colhidas amostras para análise dos parâmetros com tempo de meia-vida plasmático curto – por exemplo, a carboxi-hemoglobina 
(COHb), a colinesterase (CHE), e a meta-hemoglobina (MetHb).
 
37. São enumerados no quadro 1 os parâmetros de patologia clínica normal ­
mente exigidos nos estudos toxicológicos. A análise da urina não é exigida por rotina, mas pode efetuar-se quando a toxicidade prevista ou observada o aconselharem. Fica ao critério do diretor do estudo decidir avaliar outros 
parâmetros, para melhor caracterização da toxicidade do produto químico 
(por exemplo, colinesterase, lípidos, hormonas, equilíbrio ácido-base, meta-hemoglobina ou corpos de Heinz, creatinina-cinase, relação mieloide/ /eritroide, troponinas, gases no sangue arterial, lactato-desidrogenase, 
sorbitol-desidrogenase, glutamato-desidrogenase e gama-glutamil-transpepti ­
dase).
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Quadro 1  
Parâmetros clássicos de patologia clínica  
Hematologia  
Contagem de eritrócitos 
Hematócrito 
Concentração de hemoglobina Hemoglobina corpuscular média 
Volume corpuscular médio 
Concentração de hemoglobina corpus ­
cular média 
Reticulócitos Contagem total de leucócitos 
Fórmula leucocitária 
Contagem de plaquetas Potencial de coagulação (escolher 
um): 
— tempo de protrombina — tempo de coagulação — tempo de tromboplastina par ­
cial
 
Química clínica  
Glucose (*) 
Colesterol total 
Triglicéridos Azoto ureico no sangue Bilirrubina total 
Creatinina 
Proteínas totais Albumina 
Globulina Alanina-aminotransferase 
Aspartato-aminotransferase 
Fosfatase alcalina Potássio Sódio 
Cálcio 
Fósforo Cloretos
 
Análise da urina (facultativa)  
Aspeto (cor e turvação) 
Volume 
Densidade ou osmolalidade pH Proteínas totais 
Glucose 
Sangue/células sanguíneas
 
(*) Dado que um período longo de jejum pode distorcer as determinações da glucose 
dos animais expostos relativamente aos animais dos grupos de controlo, fica ao 
critério do diretor do estudo fazer ou não os animais jejuar. Se a opção for por um período de jejum, este deve ser adaptado à espécie – no caso do rato, pode ser de 
16 horas (jejum noturno). Pode determinar-se a glucose em jejum após jejum 
noturno durante a última semana de exposição ou após jejum noturno antes da 
autópsia (neste caso, juntamente com todos os outros parâmetros de patologia 
clínica).
 
38. Se houver indícios de que a zona principal de deposição e retenção são as 
vias respiratórias inferiores (isto é, os alvéolos), a lavagem broncoalveolar pode ser a técnica mais adequada para efetuar uma análise quantitativa de parâmetros que hipoteticamente permitam avaliar a relação entre a dose e os 
efeitos por esta induzidos, com especial incidência para alveolites, inflama ­
ções pulmonares e fosfolipidose. Este processo permite estudar convenien ­
temente os efeitos nos alvéolos das doses aplicadas e a evolução das lesões alveolares daí resultantes. Podem determinar-se no fluido da lavagem bron ­
coalveolar a contagem total de leucócitos, a fórmula leucocitária, as proteí ­
nas totais e a lactato-desidrogenase. Outros parâmetros eventualmente a ponderar são os indicativos de alterações lisossómicas, fosfolipidose e fi ­
brose, bem como de irritações e reações inflamatórias alérgicas, que podem 
compreender a determinação de citocinas ou quimiocinas pró-inflamatórias. 
As determinações no fluido proveniente da lavagem broncoalveolar com ­
plementam muitas vezes os exames histopatológicos, mas não os subs ­
tituem. O documento GD 39 (2) contém orientações sobre a realização da 
lavagem pulmonar.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 296
 
MACROPATOLOGIA E PESO DO ÓRGÃOS  
39. Os animais utilizados nos ensaios (incluindo os que morrerem durante o 
ensaio ou que forem eutanasiados e retirados do estudo por razões de 
bem-estar animal) devem ser completamente sangrados (se possível) e su ­
jeitos a uma autópsia macroscópica. Deve registar-se o lapso de tempo entre o termo da última exposição de cada animal e o momento em que o animal 
é eutanasiado. Se não for possível realizar a autópsia imediatamente depois 
de detetada a morte do animal, este deve ser refrigerado (não congelado) a uma temperatura suficientemente baixa para minimizar a autólise. As au ­
tópsias devem ser efetuadas o mais rapidamente possível, normalmente não 
mais de um ou dois dias após a morte. Registam-se todas as alterações 
patológicas macroscópicas de cada animal, prestando especial atenção às alterações do aparelho respiratório.
 
40. Enumeram-se no quadro 2 os órgãos e tecidos a conservar num meio 
adequado, durante a autópsia macroscópica, para os exames histopatológi ­
cos. A preservação dos órgãos e tecidos indicados entre parênteses retos e de quaisquer outros não indicados fica ao critério do diretor do estudo. Os órgãos  indicados  a negrito devem ser separados dos tecidos aderentes e 
pesados ainda húmidos o mais rapidamente possível depois da dissecação, 
para evitar que sequem. A tiroide e os epidídimos só devem pesar-se se for necessário, porque os instrumentos utilizados para separar os tecidos ade ­
rentes podem comprometer a avaliação histopatológica. Logo depois da 
autópsia, fixam-se os tecidos e órgãos em formalina a 10 % tamponada 
ou com outro fixador adequado. A remoção dos tecidos aderentes só deve realizar-se 24 a 48 horas depois, consoante o fixador utilizado.
 
Quadro 2  
Órgãos e tecidos a conservar durante a autópsia macroscópica  
Glândulas suprarrenais  
Medula óssea (e/ou uma punção recente)  
Encéfalo  (incluindo secções dos hemisférios 
cerebrais, do cerebelo e da medula/protube ­
rância anelar)  
[Olhos (retina, nervo ótico) e pálpebras]  
Coração  
Rins  
Laringe (secção em três níveis, um dos quais 
compreendendo a base da epiglote)  
Fígado  
Pulmões  (secção de cada lobo a um só nível, 
incluindo os brônquios principais)  
Gânglios linfáticos da região hilar dos pul ­
mões, especialmente no caso de produtos quí ­
micos pouco solúveis que se apresentem sob 
a forma de partículas. Para exames e/ou es ­
tudos mais aprofundados de cariz imunológi ­
co, podem conservar-se outros gânglios linfá ­
ticos, nomeadamente os das regiões medias ­
tinal, cervical/submandibular e/ou auricular.  
Tecidos nasofaríngeos (secção pelo menos 
em quatro níveis, um dos quais compreen ­
dendo o canal nasofaríngeo e os tecidos lin ­
fáticos associados à mucosa nasal —  "nasal 
associated lymphoid tissue",  NALT).  
Esófago  
[Bolbo olfativo]  
Ovários  Vesículas seminais  Medula espinal (cervical, mediotorácica e 
lombar)  
Baço  
Estômago  
Testículos  
Timo  
Tiroide  
Traqueia (secção pelo menos em dois níveis, 
incluindo uma secção longitudinal na carina 
e uma secção transversal)  
[Bexiga urinária]  
Útero  
Todas as lesões macroscópicas  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 297
 
41. Os pulmões são removidos intactos, pesados e instila-se-lhes um fixador 
adequado, à pressão de 20 a 30 cm de coluna de água, para conservar a 
estrutura pulmonar (5). Secciona-se cada lobo a um só nível (incluindo os brônquios principais); caso se proceda a lavagem pulmonar, secciona-se o lobo não lavado em três níveis (não sequenciais).
 
42. São examinados pelo menos quatro níveis dos tecidos nasofaríngeos, um 
dos quais deve compreender o canal nasofaríngeo (5)(6)(7)(8)(9), para pos ­
sibilitar um exame adequado do epitélio escamoso, de transição (respiratório não ciliado), respiratório (respiratório ciliado) e olfativo, assim como o tecido linfático adjacente — NALT (10)(11). São examinados e três níveis 
da laringe, um dos quais deve incluir a base da epiglote (12). São exami ­
nados pelo menos dois níveis da traqueia, incluindo uma secção longitudi ­
nal na carina da bifurcação que dá origem aos brônquios extrapulmonares e uma secção transversal.
 
HISTOPATOLOGIA  
43. Deve efetuar-se uma avaliação histopatológica dos órgãos e tecidos indica ­
dos no quadro 2 a cada animal do grupo com a concentração mais elevada e 
dos grupos de controlo, bem como aos animais que morrerem ou forem eutanasiados durante o estudo. Deve prestar-se especial atenção ao aparelho respiratório, aos órgãos-alvo e às lesões macroscópicas. Os órgãos e tecidos 
que apresentem lesões nos animais do grupo com a concentração mais 
elevada devem ser examinados em todos os grupos. Fica ao critério do diretor do estudo efetuar avaliações histopatológicas a outros grupos, para evidenciar uma resposta clara à concentração. Caso se tenha constituído um 
grupo satélite de animais (para apreciação da reversibilidade), deve 
efetuar-se o exame histopatológico dos tecidos e órgãos que tenham reve ­
lado alterações nos animais dos outros grupos expostos. Se o número de 
mortes prematuras ou outros problemas no grupo com a concentração mais 
elevada for excessivo, a ponto de comprometer a significância dos dados, efetua-se um exame histopatológico dos animais expostos ao nível de con ­
centração imediatamente inferior. Deve procurar-se estabelecer correlações 
entre as observações macroscópicas e os resultados dos exames microscó ­
picos.
 
DADOS E RELATÓRIOS  
Dados  
44. Devem ser apresentados dados por animal relativos a peso corporal, con ­
sumo alimentar, patologias clínicas, macropatologias, peso dos órgãos e histopatologias. Devem ser resumidos os resultados dos exames clínicos 
num quadro, indicando, para cada grupo estudado, o número de animais 
utilizados, o número de animais que apresentaram sinais específicos de toxicidade, o número de animais que morreram durante o ensaio ou que 
foram eutanasiados e o momento da morte de cada animal, complementados 
por uma descrição dos efeitos tóxicos e da evolução e reversibilidade destes, bem como pelos resultados das autópsias. Os resultados, quantitativos ou outros, devem ser avaliados por um método estatístico adequado. Os méto ­
dos estatísticos devem ser escolhidos no planeamento do estudo, podendo 
sê-lo qualquer método estatístico corrente adequado.
 
Relatório dos ensaios  
45. Elementos a constar, quando pertinente, do relatório dos ensaios:  
Animais estudados e condições em que são mantidos  
— descrição das condições de engaiolamento, nomeadamente: número (ou 
alteração do número) de animais por gaiola, camas, temperatura e hu ­
midade relativa ambientes, fotoperíodo e dieta,  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 298
 
— espécie e estirpe utilizadas e, caso não sejam utilizados ratos, justifica ­
ção da utilização de outra espécie. Podem apresentar-se dados originá ­
rios da proveniência dos animais ou dados históricos, desde que corres ­
pondentes a animais sujeitos às mesmas condições de exposição, aloja ­
mento e jejum,  
— número, idade e sexo,  
— método de aleatorização,  
— descrição de eventuais condicionamentos anteriores ao ensaio, nomea ­
damente ao nível da dieta, de quarentenas e do tratamento de doenças.  
Produto químico em estudo  
— natureza física, grau de pureza e propriedades físico-químicas pertinen ­
tes (incluindo a isomerização),  
— dados de identificação e, se for conhecido, número de registo CAS 
(Chemical Abstract Service ). 
Veículo  
— justificação da utilização e da escolha do veículo (se não for água),  
— dados históricos ou paralelos demonstrativos de que o veículo não in ­
terfere nos resultados do estudo.  
Câmaras de inalação  
— descrição pormenorizada – incluindo o volume e um esquema – das 
câmaras de inalação,  
— origem e descrição do equipamento utilizado na exposição dos animais e 
na geração da atmosfera,  
— equipamento de medição da temperatura, humidade, granulometria e 
concentração real,  
— fonte de ar e sistema de climatização utilizado,  
— métodos utilizados para calibrar o equipamento a fim de garantir a 
homogeneidade da atmosfera ensaiada,  
— subpressão ou sobrepressão,  
— pontos de exposição por câmara (de exposição unicamente nasal); loca ­
lização dos animais na câmara (câmara de exposição de corpo inteiro),  
— estabilidade da atmosfera utilizada nos ensaios,  
— localização nas câmaras dos sensores térmicos e higrométricos e dos 
pontos de colheita de amostras da atmosfera ensaiada,  
— tratamento do ar fornecido/evacuado,  
— caudais de ar, caudal de ar em cada ponto de exposição (exposição 
unicamente nasal) ou relação entre o volume ocupado pelos animais e 
o volume da câmara (câmara de exposição de corpo inteiro),  
— tempo necessário para as câmaras de inalação atingirem o equilíbrio 
(t95),  
— número horário de substituições de volume,  
— medidores (se existirem).  
Elementos relativos à exposição  
— fundamentação da escolha da concentração visada no estudo principal,  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 299
 
— concentrações nominais (dadas pela divisão da massa do produto quí ­
mico em estudo introduzido na câmara de inalação pelo volume de ar 
total que nela circulou),  
— concentrações reais do produto químico em estudo obtidas na zona de 
respiração dos animais; no caso das misturas que geram formas físicas 
heterogéneas (gases, vapores, aerossóis), pode analisar-se separadamente 
cada uma delas,  
— as concentrações no ar devem indicar-se em unidades de massa (mg/l, 
mg/m  3 , etc.) e não de volume (ppm, ppb, etc.),  
— distribuição granulométrica, diâmetro aerodinâmico mediano da 
massa (MMAD) e desvio-padrão geométrico ( σ g ), incluindo os métodos 
de cálculo correspondentes; indicar também o resultado de cada análise 
granulométrica efetuada.  
Condições de realização dos ensaios  
— elementos sobre a preparação do produto químico estudado, nomeada ­
mente sobre eventuais métodos de redução da granulometria de sólidos 
ou de preparação de soluções do produto químico,  
— descrição (de preferência complementada por um esquema) do equipa ­
mento utilizado para gerar a atmosfera dos ensaios e para expor os 
animais a essa atmosfera,  
— elementos relativos ao equipamento de monitorização da temperatura, 
humidade e caudal de ar nas câmaras (curvas de calibração),  
— elementos relativos ao equipamento utilizado para colher as amostras 
para determinação da granulometria e da concentração nas câmaras,  
— elementos sobre o método de análise química utilizado e sobre a vali ­
dação desse método (incluindo o rendimento da recuperação do produto químico em estudo do meio amostrado),
 
— método utilizado para distribuir aleatoriamente os animais pelos grupos 
ensaiados e pelos grupos de controlo,  
— elementos sobre a qualidade dos alimentos e da água (incluindo o tipo 
de dieta e a origem desta, bem como a origem da água),  
— fundamentação da escolha das concentrações utilizadas nos ensaios.  
Resultados  
— quadro com a temperatura, a humidade e o caudal de ar nas câmaras,  
— quadro com as concentrações nominais e reais nas câmaras,  
— quadro com os dados granulométricos, nomeadamente dados analíticos 
sobre a colheita de amostras, a distribuição granulométrica e os cálculos 
de MMAD e σ g , 
— uadro com os dados de resposta e as concentrações correspondentes a 
cada animal (animais que apresentaram sinais de toxicidade, incluindo 
mortalidade, e natureza, intensidade, momento do aparecimento e dura ­
ção dos efeitos),  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 300
 
— quadro com os pesos de cada animal,  
— quadro dos consumos alimentares,  
— quadro dos dados de patologia clínica,  
— resultados da autópsia e resultados histopatológicos correspondentes a 
cada animal, se disponíveis,  
— quadros dos restantes parâmetros medidos.  
Discussão e interpretação dos resultados  
— deve ser dada especial atenção à descrição dos métodos utilizados para 
satisfazer os critérios deste método de ensaio, nomeadamente no que respeita à concentração-limite e à granulometria,
 
— examinar em que medida, com base nos resultados globais, as partículas 
são respiráveis, em especial se os critérios granulométricos não forem satisfeitos,
 
— a apreciação global do estudo deve incidir igualmente na coerência dos 
métodos utilizados para determinar as concentrações nominal e real e deve dar conta da relação entre estas concentrações,
 
— referir a causa provável da morte e o modo de ação predominante 
(sistémico ou local),  
— explicar por que razão terá sido necessário eutanasiar animais que apre ­
sentavam sinais de dor ou de grande sofrimento continuado com base nos critérios do documento de orientações da OCDE relativo aos parâ ­
metros eticamente mensuráveis (3),
 
— identificar o(s) órgão(s)-alvo,  
— determinar o NOAEL e o LOAEL (nível mínimo com observação de 
efeitos adversos).  
REFERÊNCIAS:  
(1) OCDE (1981). Subchronic Inhalation Toxicity Testing, Original Test Gui ­
deline No 412. Environment Directorate, OCDE, Paris.  
(2) OCDE (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Asses ­
sment No. 39. ENV/JM/MONO(2009)28, OCDE, Paris.  
(3) OCDE (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used 
in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment No. 19. ENV/JM/MONO(2000)7, OCDE, Paris.  
(4) Whalan J.E., Redden J.C. (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit 
Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide 
Programs, United States Environmental Protection Agency.  
(5) Dungworth D.L., Tyler W.S., Plopper C.E. (1985). Morphological Methods 
for Gross and Microscopic Pathology (Chapter 9)  in Toxicology of Inhaled 
Material. Witschi, H.P. e Brain, J.D. (eds.). Springer Verlag Heidelberg, p. 229-258.
 
(6) Young J.T. (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity.  
Fundam. Appl. Toxicol.  1:309-312.  
(7) Harkema J.R. (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in labo ­
ratory animals exposed to inhaled irritants.  Environ. Health Perspect.  
85:231-238.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 301
 
(8) Woutersen R.A., Garderen-Hoetmer A., van Slootweg P.J., Feron V.J. 
(1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and 
in humans.  In Waalkes M.P. e Ward J.M. (eds.) Carcinogenesis. Target 
Organ Toxicology Series. Raven Press, New York, 215-263.  
(9) Mery S., Gross E.A., Joyner D.R., Godo M., Morgan K.T. (1994). Nasal 
diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and mice.  Toxicol. Pathol.  22:353-372.
 
(10) Kuper C.F., Koornstra P.J., Hameleers D.M.H., Biewenga J., Spit B.J., 
Duijvestijn A.M., Breda Vriesman van P.J.C., Sminia T. (1992). The role of nasopharyngeal lymphoid tissue.  Immunol. Today  13:219-224.
 
(11) Kuper C.F., Arts J.H.E., Feron V.J. (2003). Toxicity to nasal-associated 
lymphoid tissue.  Toxicol. Lett.  140-141:281-285.  
(12) Lewis D.J. (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia.  Journal of 
Anatomy  132(3):419-428.  
(13) Regulamento (CE) n.  o 1272/2008 do Parlamento Europeu e do Conselho, de 
16 de dezembro de 2008, relativo à classificação, rotulagem e embalagem 
de substâncias e misturas, que altera e revoga as Diretivas 67/548/CEE e 
1999/45/CE, e altera o Regulamento (CE) n.  o 1907/2006 (JO L 353 de 
31.12.2008, p. 1).  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 302
 
Apêndice 1  
DEFINIÇÃO  
Produto químico em estudo:  qualquer substância ou mistura à qual seja apli ­
cado este método de ensaio.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 303
 
B.9. TOXICIDADE (DÉRMICA) DA DOSE REPETIDA (28 DIAS)  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
Ver Introdução Geral parte B (ponto A).  
1.2. DEFINIÇÕES  
Ver Introdução Geral, parte B (ponto B).  
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Nenhuma.  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Administra-se à pele diariamente a substância de ensaio, em doses 
graduadas, a diversos grupos de animais de experiência, utilizando-se 
uma dose por grupo durante um período de 28 dias. Durante o período de administração observa-se os animais diariamente para se detectar manifestações de toxicidade. Faz-se a autópsia dos ani ­
mais mortos durante o ensaio e no final do ensaio faz-se também a 
autópsia dos animais que sobreviveram ao teste.
 
1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
Nenhum.  
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.6.1.  Preparativos  
Os animais são mantidos sob as condições de alojamento e alimen ­
tação experimentais durante pelo menos cinco dias antes do ensaio. Antes do ensaio procede-se a uma escolha aleatória de animais 
adultos, jovens e saudáveis e que são distribuídos por grupos de 
tratamento. Pouco tempo antes de se iniciar o ensaio rapa-se os pêlos da região dorsal dos animais. No caso de se recorrer à tosquia esta deverá ser efectuada aproximadamente 24 horas antes do ensaio. 
Normalmente é necessário repetir estas operações todas as semanas, 
devendo tomar-se muito cuidado para não lesar a pele. A área des ­
tinada à aplicação da substância de ensaio não poderá ser inferior a 10 % da superfície corporal. O peso do animal deverá ser tomado em 
consideração na decisão da zona a expor e da dimensão da superfície 
a tratar. Sempre que se procede ao ensaio de substâncias sólidas, as quais podem ser pulverizadas se necessário, a substância de ensaio deve ser humedecida com água ou com um veículo apropriado para 
garantir um bom contacto com a pele. As substâncias de ensaio 
líquidas são geralmente utilizadas sem serem diluídas. Procede-se a uma aplicação diária durante cinco a sete dias por semana.
 
1.6.2.  Condições da experiência  
1.6.2.1.  Animais de experiência  
Podem ser utilizados ratos adultos, coelhos ou cobaias. Outras espé ­
cies poderão ser utilizadas mas a sua utilização deverá ser justificada.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 304
 
No início da experiência a diferença de peso entre os animais não 
poderá ultrapassar ± 20 % do peso médio apropriado.  
1.6.2.2.  Número e sexo  
Para cada grupo de ensaio serão utilizados pelo menos 10 animais 
(cinco fêmeas e cinco machos) com pele saudável. As fêmeas deve ­
rão ser nulíparas e não grávidas. Se for previsível sacrificar alguns 
animais durante a experiência, deve acrescentar-se ao número inicial o número de animais que se prevê vir a sacrificar. Para além destes, poderá haver um grupo-satélite de 10 animais (cinco animais de cada 
sexo) tratado com a dose mais elevada durante 28 dias e observado 
quanto à reversibilidade, persistência ou aparecimento tardio de efei ­
tos tóxicos durante 14 dias após o tratamento. Utiliza-se também um 
grupo-satélite de 10 animais de controlo (cinco animais de cada 
sexo).
 
1.6.2.3.  Doses  
São necessárias pelo menos três doses diferentes com um controlo 
ou com um veículo de controlo no caso de ser utilizado um veículo. 
O período de exposição deverá ser no mínimo de seis horas por dia. A substância de ensaio será aplicada diariamente à mesma hora e a quantidade a administrar será ajustada regularmente (semanal ou 
bissemanalmente) de modo a manter-se constante relativamente ao 
peso corporal do animal. Os animais do grupo de controlo serão tratados da mesma maneira que os animais dos grupos de experiên ­
cia, com excepção da aplicação da substância de ensaio. No caso de 
se utilizar um veículo para facilitar a administração, este será admi ­
nistrado ao grupo de controlo da mesma forma que aos grupos tratados, devendo a dose corresponder à do grupo tratado com a 
dose mais elevada. A dose mais elevada será determinada de forma 
a produzir efeitos tóxicos mas nunca, ou raramente, a morte do animal. A dose mais baixa não deverá produzir quaisquer efeitos tóxicos. No caso de se dispor de informação sobre a exposição 
humana, a dose mais baixa deverá exceder esse valor. O ideal seria 
a dose intermédia produzir o efeito tóxico mínimo observado. No caso de se utilizar várias doses intermédias, a diferença entre elas será calculada de forma a conseguir-se uma gradação dos efeitos 
tóxicos. Nos grupos das doses mais baixa e intermédia, assim como 
nos grupos de controlo, a incidência da mortalidade deverá ser baixa para permitir uma avaliação significativa dos resultados.
 
No caso de a aplicação da substância de ensaio provocar uma grave 
irritação cutânea, dever-se-á reduzir as concentrações, o que poderá originar uma diminuição ou até um desaparecimento dos outros efeitos tóxicos da dose mais elevada. Se as lesões cutâneas forem 
muito graves, pode tornar-se necessário interromper a experiência e 
recomeçá-la com concentrações mais fracas.
 
1.6.2.4.  Teste-limite  
Se já tiver sido efectuada uma experiência preliminar com uma dose 
de 1 000 mg/kg ou com uma dose mais elevada em função da possibilidade de uma exposição humana conhecida, que não tenha provocado quaisquer efeitos tóxicos, será inútil prosseguir a expe ­
riência.
 
1.6.2.5.  Período de observação  
Os animais da experiência serão observados diariamente para se 
detectar manifestações de toxicidade. Proceder-se-á ao registo do 
momento da morte e do momento do aparecimento e do desapare ­
cimento das manifestações de toxicidade.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 305
 
1.6.3.  Procedimento  
Os animais serão colocados em gaiolas individuais. Em condições 
ideais a substância de ensaio será administrada aos animais sete dias por semana durante um período de 28 dias. Os animais de todos os 
grupos-satélite que forem objecto de observações complementares 
serão mantidos vivos durante mais 14 dias, sem tratamento, para se detectar a recuperação ou a persistência dos efeitos tóxicos. O tempo de exposição será pelo menos de seis horas por dia.
 
A substância de ensaio será aplicada uniformemente numa área equi ­
valente a 10 % da superfície total do corpo. No caso de substâncias altamente tóxicas, a superfície a utilizar poderá ser menor mas a camada da substância deverá ser o mais fina e uniforme possível.
 
Durante a exposição a substância de ensaio é mantida em contacto 
com a pele por meio de uma gaze porosa e de um adesivo anti ­
alérgico. A superfície tratada será por sua vez convenientemente coberta de maneira a manter no seu lugar a gaze e a substância de 
ensaio e de modo a evitar que os animais ingiram a referida subs ­
tância. É possível utilizar aparelhos de contenção para evitar a in ­
gestão da substância, mas não se recomenda a imobilização com ­
pleta. Como alternativa pode utilizar-se uma «coleira de protecção».
 
No fim do tempo de exposição é necessário, se possível, eliminar 
todos os resíduos da substância utilizando água ou recorrendo a qualquer outro método adequado para limpeza da pele.
 
Os animais serão observados diariamente, registando-se sempre as 
manifestações de toxicidade assim como o momento do seu apare ­
cimento, a sua intensidade e a sua duração. Proceder-se-á à obser ­
vação das modificações do pêlo e da pele, dos olhos e das mucosas, do aparelho respiratório, do aparelho circulatório, do sistema nervoso autónomo e central, assim como da actividade somatomotora e do 
comportamento. Determinar-se-á semanalmente o peso dos animais. 
Recomenda-se também que se determine semanalmente o consumo alimentar. Deve observar-se regularmente os animais para se evitar perdas, tanto quanto possível, causadas por canibalismo, autólise dos 
tecidos ou condições impróprias de alojamento. No fim da experiên ­
cia todos os animais sobreviventes dos grupos tratados não satélites serão autopsiados. Os animais moribundos e os animais que apre ­
sentem graves sintomas de angústia ou dor deverão ser imediata ­
mente retirados, sacrificados e submetidos a autópsia.
 
Os exames a seguir enunciados deverão ser efectuados no fim do 
período de ensaio para todos os animais incluindo os de controlo:  
1. Um exame hematológico compreendendo os seguintes testes: he ­
matócrito, concentração de hemoglobina, contagem de eritrócitos, 
contagem de leucócitos, fórmula leucocitária, bem como um es ­
tudo sobre o potencial de coagulação.  
2. A determinação de dados bioquímicos do sangue incluindo pelo 
menos um parâmetro da função hepática e renal: alanina amino ­
transferase (inicialmente conhecida como transaminase glutâmico- -pirúvica), aspartato aminotransferase (inicialmente conhecida como transaminase glutâmico-oxalo-acética), azoto ureico, albu ­
mina, creatinina plasmática, bilirrubina total e as proteínas séricas 
totais.
 
As outras análises eventualmente necessárias para uma avaliação 
toxicológica adequada incluem as análises de cálcio, fósforo, clore ­
tos, sódio, potássio, glicose em jejum, análises de lípidos, de hor ­
monas, equilíbrio ácido-básico, meta-hemoglobina e actividade coli ­
nesterásica.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 306
 
Pode recorrer-se a outras análises bioquímicas clínicas sempre que 
necessário para melhorar a investigação dos efeitos observados.  
1.6.4.  Autópsia  
Todos os animais submetidos a experiência deverão ser submetidos a 
uma autópsia geral. Pelo menos o fígado, os rins, as glândulas supra- -renais e os testículos deverão ser pesados ainda húmidos, tão cedo quanto possível após a dissecação para se evitar a perda de líquidos 
por evaporação. Todos os órgãos e tecidos, isto é, pele normal e 
tratada, fígado, rins, baço, testículos, glândulas supra-renais, coração e órgãos-alvo (isto é, os órgãos que apresentem lesões graves ou variações de volume) deverão ser conservados num meio adequado 
para eventual exame histopatológico futuro.
 
1.6.5.  Exame histopatológico  
No grupo tratado com a dose mais elevada e no grupo de controlo 
deve efectuar-se o exame histológico dos órgãos e tecidos conserva ­
dos. Os órgãos e tecidos que apresentem efeitos susceptíveis de 
serem atribuídos à substância de ensaio administrada na dose mais 
elevada deverão ser examinados em todos os grupos tratados com doses inferiores. Deve proceder-se a um exame histológico dos ani ­
mais de qualquer grupo-satélite com particular ênfase sobre os ór ­
gãos e tecidos que apresentaram efeitos identificados nos outros 
grupos tratados.
 
2. RESULTADOS  
Os resultados serão resumidos na forma de quadros indicando, para 
cada experiência, o número de animais no início do ensaio e o 
número de animais que apresenta cada tipo de lesão.  
Todos os resultados observados deverão ser avaliados por um mé ­
todo estatístico apropriado. Pode ser utilizado qualquer método esta ­
tístico reconhecido.  
3. RELATÓRIO  
3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação se ­
guinte:  
— dados sobre os animais (espécie, estirpe, origem, condições am ­
bientais, dieta, etc.),  
— condições experimentais (incluindo o tipo de cobertura: oclusiva 
ou não oclusiva),  
— doses (incluindo o veículo, se utilizado) e concentrações,  
— dose sem efeito, se possível,  
— resposta tóxica por sexo e por dose,  
— momento da morte durante a experiência ou indicação dos ani ­
mais sobreviventes no fim da experiência,  
— efeitos tóxicos ou outros,  
— momento da observação de qualquer manifestação anormal e sua 
evolução,  
— dados relativos à alimentação e peso corporal,  
— exames hematológicos efectuados e resultados,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 307
 
— provas bioquímicas clínicas utilizadas e seus resultados,  
— resultados da autópsia,  
— descrição pormenorizada de todos os resultados histopatológicos,  
— tratamento estatístico dos resultados, se possível,  
— discussão dos resultados,  
— interpretação dos resultados.  
3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B (ponto D).  
4. REFERÊNCIAS  
Ver Introdução Geral, parte B (ponto E).  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 308
 
B.10.  MUTAGENICIDADE — ENSAIO  IN VITRO  DE ABERRAÇÕES 
CROMOSSÓMICAS EM MAMÍFEROS  
1. MÉTODO  
O presente método é idêntico ao método OCDE TG 473 — Ensaio  
in vitro  de aberrações cromossómicas em mamíferos (1997).  
1.1. INTRODUÇÃO  
O objectivo do ensaio  in vitro  de aberrações cromossómicas é iden ­
tificar os agentes que causam aberrações estruturais dos cromosso ­
mas em culturas de células de mamíferos (1) (2) (3). As aberrações 
estruturais podem ser de dois tipos, afectando os cromossomas ou os cromatídeos. A maior parte dos mutagéneos químicos induzem aber ­
rações cromatídicas, mas também podem ocorrer aberrações cromos ­
sómicas. Um aumento da taxa de poliploidia pode indicar que um 
determinado produto químico tem potencial para induzir aberrações numéricas. Contudo, este método não foi concebido para medir as aberrações numéricas nem é normalmente utilizado com esse objec ­
tivo. As mutações nos cromossomas e eventos relacionados causam 
diversas doenças genéticas humanas, existindo provas substanciais de que as alterações que causam nos oncogenes e nos genes supressores de tumores das células somáticas estão envolvidas na indução de 
cancro nos seres humanos e em animais utilizados em experiências.
 
O ensaio  in vitro de aberrações cromossómicas pode envolver cul ­
turas de linhas celulares bem estabelecidas, de uma determinada estirpe ou ainda culturas de células primárias. As células utilizadas são seleccionadas com base na sua capacidade de crescimento em 
cultura, na estabilidade do cariótipo, no número e diversidade dos 
seus cromossomas e na frequência das aberrações cromossómicas espontâneas.
 
Os ensaios  in vitro  exigem geralmente a utilização de uma fonte 
exógena de activação metabólica, que não consegue imitar inteira ­
mente as condições  in vivo  nos mamíferos. Deve ter-se o cuidado de 
evitar condições que conduzam a resultados positivos que não sejam reflexo de uma mutagenicidade intrínseca mas que possam resultar, por exemplo, de mudanças do pH, da pressão osmótica ou ainda de 
níveis elevados de citotoxicidade (4) (5).
 
O presente ensaio é utilizado para a análise de agentes eventualmente 
mutagéneos ou carcinogéneos para os mamíferos. Muitos dos com ­
postos que dão um resultado positivo no presente ensaio são carci ­
nogéneos nos mamíferos, não existindo, contudo, uma correlação 
perfeita entre o ensaio e a carcinogenicidade. A correlação depende 
da classe química e existem cada vez mais provas de que alguns agentes carcinogéneos não são detectados por este ensaio, por os seus mecanismos de actuação não passarem directamente pela dani ­
ficação do ADN.
 
Ver também a parte B da Introdução Geral.  
1.2. DEFINIÇÕES  
Aberração cromatídica:  lesão estrutural de um cromossoma ex ­
pressa na ruptura, ou na ruptura seguida de união, de cromatídeos simples.
 
Aberração cromossómica:  lesão estrutural de um cromossoma ex ­
pressa na ruptura, ou na ruptura seguida de união, de ambos os 
cromatídeos no mesmo local.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 309
 
Endorreduplicação:  processo mediante o qual, na sequência de um 
período S de replicação do ADN, o núcleo não sofre mitose, ini ­
ciando-se um novo período S, que resulta em cromossomas com 4, 8, 16, ... cromatídeos.
 
Lacuna:  lesão acromática de extensão inferior à largura de um 
cromatídeo e que determine um ligeiro desalinhamento do mesmo.  
Índice mitótico:  relação entre o número de células em metafase e o 
número total de células observadas numa população de células, que 
fornece uma indicação do grau de proliferação da população em causa.
 
Aberração numérica:  alteração do número de cromossomas relati ­
vamente ao número de cromossomas característico das células utili ­
zadas.  
Poliploidia:  número de cromossomas múltiplo do número haplóide 
(n), mas diferente do número diplóide (ou seja, 3n, 4n, etc.).  
Aberração estrutural:  alteração da estrutura dos cromossomas de ­
tectável por exame microscópico das células em metafase, na forma de supressão de segmentos, de alterações de partes da sequência ou 
da troca de segmentos num cromatídeo ou entre cromatídeos.
 
1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
As culturas celulares são expostas à substância em estudo tanto na 
presença como na ausência de um sistema de activação metabólica. 
Após um período determinado, adiciona-se um produto fixador da metafase (por exemplo, Colcemid
 ® ou colchicina); as células são 
colhidas, coradas e analisadas microscopicamente para detectar a 
presença de aberrações cromossómicas nas células em metafase.  
1.4. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.4.1.  Preparação  
1.4.1.1.  Células  
Podem utilizar-se diversas linhas celulares, estirpes ou culturas celu ­
lares primárias, incluindo células humanas (por exemplo: fibroblastos 
do hamster  da China ou linfócitos da circulação periférica do ser 
humano ou de outros mamíferos).  
1.4.1.2.  Meios e condições de cultura  
As culturas devem ser mantidas em meios de cultura e condições de 
incubação adequados (tipo de recipiente, concentração de CO  2 , tem­
peratura e humidade). As linhas celulares e estirpes devem ser pe ­
riodicamente controladas no que respeita à estabilidade do número 
modal de cromossomas e à ausência de contaminação por micoplas ­
ma, não devendo ser utilizadas se se verificar que foram contamina ­
das. Deve ser conhecida a duração do ciclo celular normal para as células e condições de cultura utilizadas.
 
1.4.1.3.  Preparação das culturas  
Linhas e estirpes de células definidas: multiplicam-se as células pro ­
venientes de culturas de arranque por incubação a 37  o C num meio 
cuja densidade não permita a confluência das culturas antes da co ­
lheita.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 310
 
Linfócitos: adiciona-se sangue total tratado com anticoagulante (por 
exemplo: heparina) ou linfóticos provenientes de indivíduos saudá ­
veis a um meio de cultura contendo um agente mitogénico (por exemplo: fito-hemoglutinina), incubando a 37
 o C. 
1.4.1.4.  Activação metabólica  
As células devem ser expostas à substância em estudo tanto na 
presença como na ausência de um sistema adequado de activação 
metabólica. O sistema mais frequentemente utilizado consiste numa 
fracção pós-mitocondrial reforçada com co-factor (S9) preparada a partir de fígados de roedores tratados com agentes de indução enzi ­
mática, como por exemplo Aroclor 1254 (6) (7) (8) (9) ou uma 
mistura de fenobarbitona e  β-naftoflavona (10) (11) (12).
 
A fracção pós-mitocondrial é geralmente utilizada em concentrações 
na gama dos 1-10 % v/v no meio de ensaio final. O estado do 
sistema de activação metabólica pode depender da classe dos produ ­
tos químicos em estudo. Em alguns casos pode revelar-se adequado utilizar várias concentrações diferentes de fracção pós-mitocondrial.
 
Progressos tais como a elaboração por engenharia genética de linhas 
celulares que exprimam enzimas de activação específicos oferecem possibilidades de activação endógena. A escolha das linhas celulares 
a utilizar terá de ser cientificamente justificada (por exemplo: pela 
relevância do isoenzima de citocromo P450 para o metabolismo da substância em estudo).
 
1.4.1.5.  Substância em estudo/preparação  
As substâncias sólidas devem ser dissolvidas ou suspensas em sol ­
ventes ou veículos adequados e, se necessário, diluídas antes de 
serem adicionadas às células. As substâncias líquidas podem ser 
adicionadas directamente aos sistemas em estudo e/ou diluídas antes de serem adicionadas às células. Devem ser utilizadas preparações frescas da substância em estudo, a menos que os dados de estabili ­
dade demonstrem que o respectivo armazenamento não coloca pro ­
blemas para o ensaio.
 
1.4.2.  Condições de ensaio  
1.4.2.1.  Solvente/veículo  
O solvente/veículo não deve reagir com a substância em estudo, 
devendo ser compatível com a sobrevivência das células e com a 
actividade da mistura S9. Caso se utilizem solventes/veículos cujas 
propriedades não se encontrem totalmente elucidadas, devem forne ­
cer-se dados que justifiquem a sua compatibilidade. Sempre que 
possível, recomenda-se a utilização de solventes/veículos aquosos. 
Quando forem realizados ensaios de substâncias instáveis na pre ­
sença de água, os solventes orgânicos utilizados devem ser anidros. A água poderá ser removida através de um filtro molecular.
 
1.4.2.2.  Concentrações de exposição  
A citotoxidade, a solubilidade no sistema de ensaio e as alterações 
do pH ou da pressão osmótica constituem alguns dos critérios a ter 
em conta na determinação da concentração máxima.  
A citotoxidade deve ser determinada na experiência principal tanto 
na presença como na ausência de um sistema de activação metabó ­
lica, por recurso a um indicador adequado da integridade e do cres ­
cimento celulares, nomeadamente o grau de confluência, as conta ­
gens de células viáveis ou o índice mitótico. Poderá ser útil deter ­
minar previamente a citotoxidade e solubilidade através de uma 
experiência preliminar.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 311
 
Devem utilizar-se pelo menos três concentrações analisáveis. 
No caso de substâncias que sejam citotóxicas, as concentrações uti ­
lizadas devem abranger uma gama compreendida entre a toxicidade máxima e uma toxicidade reduzida ou nula; o que significa geral ­
mente que as concentrações devem variar num factor de 2 a 
√10. No momento da colheita, a concentração máxima deve deter ­
minar uma redução significativa (superior a 50 %) do grau de con ­
fluência, da contagem de células viáveis e do índice mitótico. O índice mitótico constitui uma medida indirecta dos efeitos 
citotóxicos/citostáticos, dependendo do tempo decorrido após a ex ­
posição. Todavia, a sua utilização é aceitável no caso de culturas em suspensão, em que os restantes métodos de determinação da toxici ­
dade podem revelar-se fastidiosos ou impraticáveis. Os dados relati ­
vos à cinética do ciclo celular, nomeadamente o tempo médio de 
geração (TMG), podem ser utilizados como informação suplementar. O TMG constitui, no entanto, uma média global, que nem sempre permite identificar a existência de subpopulações com um cresci ­
mento menos rápido, podendo acontecer em alguns casos que ligei ­
ros aumentos do TMG possam resultar em atrasos muito substanciais no que respeita ao surgimento de aberrações.
 
No caso de substâncias sem efeitos citotóxicos consideráveis, a con ­
centração máxima do ensaio deve ser a mais baixa de 5 μl/ml, 5 mg/ ­
ml ou 0,01 M.  
Para substâncias relativamente insolúveis que não sejam tóxicas em 
concentrações inferiores à concentração insolúvel, a dose máxima a utilizar deve corresponder a uma concentração acima do limite de 
solubilidade no meio de cultura final após o período de exposição. 
Em alguns casos (por exemplo: quando a toxicidade apenas ocorre em concentrações superiores à menor concentração insolúvel) é con ­
veniente ensaiar mais de uma concentração com precipitação visível. 
Poderá ser útil avaliar a solubilidade no início e no fim da exposição, 
uma vez que a mesma se pode alterar durante a exposição no sistema de ensaio devido à presença de células, de S9, de soro, etc. A insolubilidade pode ser detectada à vista desarmada. O precipitado 
não deve interferir com as contagens necessárias.
 
1.4.2.3.  Controlos negativos e positivos  
Cada experiência deve incluir em paralelo controlos positivos e ne ­
gativos (solvente/veículo), tanto na presença como na ausência de um sistema de activação metabólica. Quando for utilizada activação metabólica, o produto químico de controlo positivo deve ser o 
mesmo que exige a activação para dar uma resposta mutagénica.
 
Para os controlos positivos deve ser utilizado um agente clastogénico 
conhecido aos níveis de exposição esperados, de forma a obter um 
aumento detectável e reprodutível ao longo do tempo que permita demonstrar a sensibilidade do sistema de ensaio.
 
As concentrações do controlo positivo devem ser escolhidas de 
modo a que os seus efeitos sejam claros, devendo ser utilizadas lâminas codificadas de forma a que não sejam imediatamente iden ­
tificáveis pela pessoa que procede à leitura. As substâncias de con ­
trolo positivo podem ser, por exemplo:
 
Condição de activação metabólica Substância N.  o CAS N.  o EINECS  
Ausência de activação metabó ­
lica exógena metanossulfonato de metilo 66-27-3 200-625-0 
metanossulfonato de etilo 62-50-0 200-536-7  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 312
 
Condição de activação metabólica Substância N.  o CAS N.  o EINECS  
etil nitrosureia 759-73-9 212-072-2 
mitomicina C 50-07-7 200-008-6 
N-óxido de 4-nitroquinolina 56-57-5 200-281-1 
Presença de activação metabó ­
lica exógena benzo[a]pireno 50-32-8 200-028-5 
ciclofosfamida 
ciclofosfamida monohidrato 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4  
Podem utilizar-se no controlo positivo outras substâncias adequadas. 
A possibilidade de utilização de produtos químicos de uma classe afim para o controlo positivo deve ser considerada, quando existam.
 
Para cada colheita, devem também realizar-se controlos negativos, 
em que as células são expostas apenas ao solvente ou veículo e ao 
meio de tratamento, procedendo-se do mesmo modo que num ensaio 
normal. Além disso, devem igualmente ser utilizados controlos não expostos à substância em estudo, a menos que já existam dados de controlo que demonstrem que o solvente escolhido não induz ne ­
nhum efeito deletério ou mutagénico.
 
1.4.3.  Procedimento  
1.4.3.1.  Exposição à substância em estudo  
As células em crescimento são expostas à substância em estudo na 
presença e na ausência de um sistema de activação metabólica. Os 
linfócitos devem ser expostos à substância em estudo cerca de 48 horas após o estímulo mitogénico.
 
1.4.3.2. Normalmente, devem ser utilizadas culturas em duplicado para cada 
concentração, sendo fortemente recomendada a utilização de culturas em duplicado também para os controlos negativos/solventes. Quando puder ser demonstrado, a partir dos dados de experiências anteriores, 
que a diferença entre as culturas duplicadas é mínima (13) (14), pode 
aceitar-se a utilização de uma única cultura para cada concentração.
 
As substâncias gasosas ou voláteis devem ser ensaiadas por métodos 
apropriados, por exemplo em recipientes selados (15) (16).  
1.4.3.3.  Intervalo de amostragem das culturas  
No primeiro ensaio, as células são expostas à substância em estudo, 
na presença e na ausência de um sistema de activação metabólica, durante 3-6 horas, sendo colhidas a intervalos equivalentes a cerca de 1,5 ciclos celulares normais, a partir do início da exposição (12). 
Se este protocolo der resultados negativos tanto na presença como na 
ausência de um sistema de activação, deve ser realizada uma expe ­
riência adicional sem activação, com exposição em contínuo até à colheita, passado um tempo equivalente a 1.5 ciclos celulares nor ­
mais. Certos produtos químicos podem ser detectados mais facil ­
mente com tempos de exposição/colheita superiores a 1,5 ciclos celulares. Os resultados negativos com activação metabólica terão de ser confirmados caso a caso. Nos casos em que a confirmação 
dos resultados negativos não seja considerada necessária, deve ser 
apresentada uma justificação.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 313
 
1.4.3.4.  Preparação dos cromossomas  
As culturas de célula são tratadas com Colcemid  ® ou colchicina, 
geralmente durante 1-3 horas antes da colheita. Procede-se à colheita individual das culturas e ao respectivo processamento, com vista à 
preparação dos cromossomas, que inclui o tratamento hipotónico das 
células, seguido de fixação e coloração.
 
1.4.3.5.  Análise  
Todas as lâminas, incluindo as provenientes dos lotes de controlo 
positivo e negativo, devem ser independentemente codificadas antes 
da análise microscópica. Uma vez que os processos de fixação dão 
frequentemente lugar à ruptura de uma determinada proporção das células em metafase, com perda dos cromossomas, as células conta ­
bilizadas devem apresentar, para todos os tipos de célula, um número 
de centrómeros igual ao número modal ± 2. Devem ser contabiliza ­
das pelo menos 200 metafases com uma boa distribuição para cada concentração e para o controlo, com boa concordância entre os replicados, quando existam. Esse número pode ser inferior caso se 
observe um número elevado de aberrações.
 
Embora o objectivo do ensaio consista na detecção de aberrações 
cromossómicas estruturais, devem registar-se os casos de poliploidia e de endorreduplicação, quando ocorram.
 
2. DADOS  
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS  
A unidade experimental é a célula, pelo que se deve avaliar a per ­
centagem de células que apresentam uma aberração cromossómica estrutural. Os diferentes tipos de aberração cromossómica estrutural devem ser enumerados e discriminados pelo seu número e frequência 
nas culturas experimentais e de controlo. A ocorrência de lacunas é 
registada em separado e incluída no relatório, mas não é geralmente contabilizada para o cálculo da frequência total das aberrações.
 
Durante a experiência principal para a detecção de aberrações, de ­
vem ser igualmente registadas as medições da citotoxidade realizadas 
em paralelo com os ensaios, para todas as culturas de controlo e para 
os casos de resposta negativa.  
Devem ser fornecidos dados individuais para cada cultura, para além 
de um quadro com o resumo dos dados globais.  
Não é necessário comprovar uma reacção positiva inequívoca. Os 
resultados ambíguos devem ser esclarecidos através de experiências adicionais, de preferência com modificação das condições experi ­
mentais. A necessidade de confirmar os resultados negativos já foi 
discutida no ponto 1.4.3.3. As experiências subsequentes devem contemplar a modificação dos parâmetros de estudo, por forma a alargar a gama de condições avaliadas. Os parâmetros de estudo 
que podem ser alterados incluem a gama e os intervalos entre as 
diferentes concentrações e as condições da activação metabólica.
 
2.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS  
Existem vários critérios para determinar um resultado positivo, no ­
meadamente o aumento do número de células com aberrações cro ­
mossómicas relacionado com a concentração ou que seja reprodutí ­
vel. Deve atender-se, antes de mais, à importância biológica dos resultados. Como auxílio para a avaliação dos resultados dos ensaios, poderão ser utilizados métodos estatísticos (3) (13), embora a signi ­
ficância estatística não deva ser o único elemento para a determina ­
ção de uma resposta positiva.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 314
 
Um aumento do número de células poliplóides pode indicar que a 
substância em estudo apresenta o potencial de inibir a mitose e de 
induzir aberrações cromossómicas numéricas. Um aumento do nú ­
mero de células com cromossomas endorreduplicados pode indicar que a substância em estudo apresenta o potencial de inibir a pro ­
gressão do ciclo celular (17) (18).
 
Uma substância cujos resultados não cumpram os critérios supra é 
considerada não mutagénica para o sistema em causa.  
Embora a maioria de experiências tenha resultados claramente posi ­
tivos ou negativos, em casos raros o conjunto dos dados não per ­
mitirá que se obtenha uma opinião inequívoca sobre a actividade da 
substância em estudo, podendo acontecer que os resultados conti ­
nuem a ser ambíguos ou duvidosos independentemente do número de vezes que a experiência seja repetida.
 
Um resultado positivo no ensaio  in vitro  de aberrações cromossómi ­
cas indica que a substância em estudo induz aberrações cromossó ­
micas estruturais nas células somáticas de mamíferos em cultura. Um resultado negativo indica que, nas condições do ensaio, a substância 
em estudo não induz aberrações cromossómicas estruturais nas célu ­
las somáticas de mamíferos em cultura.
 
3. APRESENTAÇÃO DE RELATÓRIOS  
RELATÓRIO DE ENSAIO  
O relatório de ensaio deve incluir a seguinte informação:  
Solvente/veículo:  
— justificação para a escolha do veículo,  
— solubilidade e estabilidade da substância em estudo no solvente/ ­
veículo, se conhecida.  
Células:  
— tipo e origem das células,  
— características do cariótipo e adequação do tipo de células utili ­
zado,  
— ausência de micoplasma, quando aplicável,  
— informação sobre a duração do ciclo celular,  
— sexo dos dadores de sangue, sangue completo ou linfócitos, 
agente mitogénico utilizado,  
— número de passagens, quando aplicável,  
— métodos de manutenção da cultura celular, quando aplicável,  
— número modal de cromossomas.  
Condições de ensaio:  
— identificação e concentração da substância que pára a metafase, 
duração da exposição da célula,  
— justificação para a selecção das concentrações e do número de 
culturas, incluindo, por exemplo, dados sobre a citotoxicidade e 
sobre as limitações de solubilidade, quando disponíveis,  
— concentração da substância em estudo,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 315
 
— volumes adicionados do veículo e da substância em estudo,  
— temperatura de incubação,  
— tempo de incubação,  
— duração da exposição,  
— densidade celular da cultura de arranque, quando aplicável,  
— tipo e composição do sistema de activação metabólica, incluindo 
critérios de aceitabilidade,  
— controlos positivos e negativos,  
— métodos de preparação das lâminas,  
— critérios de contabilização das aberrações,  
— número de células em metafase analisadas,  
— métodos de determinação da toxicidade,  
— critérios definidos para que o estudo seja considerado positivo, 
negativo ou não conclusivo.  
Resultados:  
— sinais de toxicidade, ou seja, grau de confluência, dados relativos 
ao ciclo celular, contagens de células, índice mitótico,  
— sinais de precipitação,  
— dados sobre o pH e a pressão osmótica do meio de tratamento, 
caso tenham sido determinados,  
— definição das aberrações observadas, incluindo as lacunas,  
— número de células em que se observa uma aberração cromossó ­
mica e tipo dessas aberrações, discriminados para cada cultura exposta e de controlo,
 
— alterações da ploidia, quando observadas,  
— relação dose-resposta, quando seja possível de determinar,  
— análise estatística, quando tenha sido realizada,  
— dados relativos ao controlo negativo (solvente/veículo) e positivo 
realizados em paralelo com o ensaio,  
— dados históricos sobre o controlo negativo (solvente/veículo) e 
positivo, com as respectivas gamas, valores médios e desvios- 
-padrão.  
Discussão dos resultados.  
Conclusões.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) Evans, H. J., (1976) Cytological Methods for Detecting Che ­
mical Mutagens. In: Chemical mutagens, Principles and Met ­
hods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed) Plenum 
Press, New York and London, p. 1-29.  
(2) Ishidate, M. Jr. and Sofuni, T., (1985) The  In Vitro  Chromo­
somal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture. In: Progress in Mutation Research, 
Vol. 5, Ashby, J. et al., (Eds) Elsevier Science Publishers, 
Amsterdam-New York-Oxford, p. 427-432.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 316
 
(3) Galloway, S.M., Armstrong, M.J., Reuben, C., Colman, S., 
Brown, B., Cannon, C., Bloom, A.D., Nakamura, F., Ahmed, 
M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, G.H., Resnick, MA, Ander ­
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(suppl. 10), p. 1-175.
 
(4) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M.Jr., 
Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C., (1991) Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res, 257, p. 147-204.
 
(5) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K., (1992) 
Clastogenicity of low pH to Various Cultured Mammalian 
Cells. Mutation Res., 268, p. 297-305.  
(6) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E., (1975) Methods 
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ ­
Mammalian Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, p. 347-364.
 
(7) Maron, D.M. and Ames, B.N., (1983) Revised Methods for the 
Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, p. 173-215.  
(8) Natarajan, A.T., Tates, A.D., van Buul, P.P.W., Meijers, M. 
and de Vogel, N., (1976) Cytogenetic Effects of Mutagen/ ­
Carcinogens after Activation in a Microsomal System in Vitro, I. Induction of Chromosome Aberrations and Sister Chromatid Exchange by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosa ­
mine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Mi ­
crosomes. Mutation Res., 37, p. 83-90.
 
(9) Matsuoka, A., Hayashi, M. and Ishidate, M. Jr., (1979) Chro ­
mosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix In Vitro . Mutation Res., 66, p. 277-290.
 
(10) Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., 
Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C., (1992) Report of 
UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alterna ­
tives to Aroclor 1254-induced S9 in  In Vitro  Genotoxicity 
Assays. Mutagenesis, 7, p. 175-177.  
(11) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T., 
(1976) A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In: de Serres, F.J., 
Fouts, J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds)  In Vitro  Me­
tabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Hol ­
land, p. 85-88.
 
(12) Galloway, S.M., Aardema, M.J., Ishidate, M. Jr., Ivett, J.L., 
Kirkland, D.J., Morita, T., Mosesso, P., Sofuni, T., (1994) 
Report from Working Group on in  In Vitro  Tests for Chromo ­
somal Aberrations. Mutation Res., 312, p. 241-261.  
(13) Richardson, C., Williams, D.A., Allen, J.A., Amphlett, G., 
Chanter, D.O. and Phillips, B., (1989) Analysis of Data from  
In Vitro  Cytogenetic Assays. In: Statistical Evaluation of Mu ­
tagenicity Test Data. Kirkland, D.J., (ed) Cambridge University 
Press, Cambridge, p. 141-154.  
(14) Soper, K.A. and Galloway, S.M., (1994) Replicate Flasks are 
not Necessary for  In Vitro  Chromosome Aberration Assays in 
CHO Cells. Mutation Res., 312, p. 139-149.  
(15) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T., (1982) CHO/ ­
HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). Ge ­
notoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, 
p. 91-103.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 317
 
(16) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L., (1983) 
Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on 
Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, p. 795-801.
 
(17) Locke-Huhle, C., (1983) Endoreduplication in Chinese hamster 
cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res., 119, p. 403-413.
 
(18) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E., (1983) Aphidicolin- 
-induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer 
Res., 43, p. 1362-1364.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 318
 
B.11.  MUTAGENICIDADE — ENSAIO  IN VIVO  DE ABERRAÇÕES 
CROMOSSÓMICAS EM CÉLULAS DA MEDULA DE 
MAMÍFEROS  
1. MÉTODO  
O presente método é idêntico ao método OCDE TG 475 — Ensaio 
de aberrações cromossómicas em células da medula de mamíferos (1977).
 
1.1. INTRODUÇÃO  
O ensaio de aberrações cromossómicas em células da medula de 
mamíferos é utilizado para a detecção de aberrações cromossómicas estruturais induzidas pela substância em estudo em células da medula 
de animais, geralmente roedores (1) (2) (3) (4). As aberrações es ­
truturais podem ser de dois tipos, afectando os cromossomas ou os cromatídeos. A maior parte dos mutagéneos químicos induzem aber ­
rações cromatídicas, mas também podem ocorrer aberrações cromos ­
sómicas. Um aumento da taxa de poliploidia pode indicar que um 
determinado produto químico tem potencial para induzir aberrações numéricas. As mutações cromossómicas e eventos relacionados cau ­
sam diversas doenças genéticas humanas, existindo provas substan ­
ciais de que as alterações que causam nos oncogenes e nos genes 
supressores de tumores das células somáticas estão envolvidas na indução de cancro nos seres humanos e em animais utilizados em 
experiências.
 
Os animais utilizados no presente ensaio são geralmente roedores. A 
medula é o tecido objectivo do ensaio, por se tratar de um tecido altamente vascularizado e que contém uma população de células com 
grande ritmo de duplicação e que podem ser facilmente isoladas e 
processadas. O presente método não se destina à aplicação noutras espécies animais ou tecidos objectivo.
 
O presente ensaio de aberrações cromossómicas é particularmente 
relevante para a avaliação dos riscos mutagénicos, uma vez que permite tomar em consideração os factores do metabolismo  in vivo  
da farmacocinética e dos processos de reparação do ADN, embora 
estes possam variar de espécie para espécie e de tecido para tecido. 
Os ensaios  in vivo  são igualmente úteis para a investigação com ­
plementar de efeitos mutagénicos detectados através de ensaios  in 
vitro .
 
Se existirem provas de que nem a substância em estudo nem nenhum 
dos seus metabolitos reactivos entram em contacto com o tecido objectivo, o presente ensaio não é apropriado.
 
Ver também a parte B da Introdução Geral.  
1.2. DEFINIÇÕES  
Aberração cromatídica:  lesão estrutural de um cromossoma ex ­
pressa na ruptura, ou na ruptura seguida de união, de cromatídeos simples.
 
Aberração cromossómica:  lesão estrutural de um cromossoma ex ­
pressa na ruptura, ou na ruptura seguida de união, de ambos os cromatídeos no mesmo local.
 
Endorreduplicação:  processo no qual, após um período S de repli ­
cação do ADN, o núcleo não entra em mitose iniciando um novo período S. O resultado são cromossomas com 4, 8, 16, ... cromatí ­
deos.
 
Lacuna:  lesão acromática de extensão inferior à largura de um 
cromatídeo e que determine um ligeiro desalinhamento do mesmo.  
Aberração numérica:  alteração do número de cromossomas relati ­
vamente ao número de cromossomas característico das células utili ­
zadas.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 319
 
Poliploidia:  número de cromossomas múltiplo do número haplóide 
(n), mas diferente do número diplóide (ou seja, 3n, 4n, etc.).  
Aberração estrutural:  alteração da estrutura dos cromossomas de ­
tectável por exame microscópico das células em metafase, na forma de supressão de segmentos, de alterações de partes da sequência ou 
da troca de segmentos num cromatídeo ou entre cromatídeos.
 
1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Os animais são expostos à substância em estudo através de um modo 
de exposição apropriado, sendo sacrificados passado o tempo neces ­
sário após a exposição. Antes do sacrifício, os animais são tratados com um produto fixador da metafase (por exemplo, colchicina ou Colcemid
 ® ). Seguidamente, são feitas preparações de cromossomas a 
partir das células de medula onde, após coloração, as células em 
metafase são analisadas para detecção de aberrações cromossómicas.  
1.4. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.4.1.  Preparação  
1.4.1.1.  Selecção das espécies animais  
Geralmente, são utilizados ratos, ratazanas ou hamsters chineses, 
embora possa ser qualquer outra espécie de mamifero apropriada. 
Devem ser utilizados animais adultos saudáveis jovens das raças 
de laboratório mais comuns. No início do estudo, a variaçao de peso entre os animais deve ser mínima, não devendo exceder ± 20 % do peso médio de cada sexo.
 
1.4.1.2.  Condições de acomodação e alimentação  
Devem ser aplicadas as condições gerais referidas na Introdução 
Geral, parte B, embora o objectivo para a humidade deva ser de 50 %-60 %.
 
1.4.1.3.  Preparação dos animais  
Os animais adultos saudáveis jovens são distribuídos aleatoriamente 
pelos grupos de controlo e pelos grupos expostos. As gaiolas devem 
ser dispostas de modo a que eventuais efeitos devidos à respectiva 
colocação sejam minimizados. Os animais são identificados de forma inequívoca, devendo ser aclimatados às condições de laboratório durante pelo menos cinco dias.
 
1.4.1.4.  Preparação das doses  
As substâncias sólidas devem ser dissolvidas ou suspensas em sol ­
ventes ou veículos adequados e, se necessário, diluídas antes de 
serem adicionadas às células. As substâncias líquidas podem ser 
adicionadas directamente aos sistemas em estudo e/ou diluídas antes de serem adicionadas às células. Devem ser utilizadas preparações frescas da substância em estudo, a menos que os dados de estabili ­
dade demonstrem que o respectivo armazenamento não coloca pro ­
blemas para o ensaio.
 
1.4.2.  Condições do ensaio  
1.4.2.1.  Solvente/veículo  
O solvente/veículo não deve reagir com a substância em estudo nem 
produzir efeitos tóxicos nas doses utilizadas. Caso se utilizem solventes/veículos cujas propriedades não se encontrem totalmente elucidadas, devem fornecer-se dados que justifiquem a sua compati ­
bilidade. Sempre que possível, recomenda-se a utilização de 
solventes/veículos aquosos.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 320
 
1.4.2.2.  Controlos  
Cada experiência deve incluir em paralelo controlos positivos e ne ­
gativos (solvente/veículo) para cada sexo. Com excepção da exposi ­
ção à substância em estudo, todos os animais, incluindo os dos 
grupos de controlo, devem ser manuseados de forma idêntica.  
Os controlos positivos devem produzir aberrações estruturais  in vivo  
aos níveis a que se espera o surgimento de um aumento detectável em relação à linha de base. A dose a administrar para o controlo 
positivo deve ser escolhida de modo a que os seus efeitos sejam 
claros mas também a que as lâminas codificadas não sejam imedia ­
tamente identificadas pela pessoa que procede às leituras. É aceitável que o controlo positivo seja administrado por uma via diferente da 
substância em estudo e que só seja realizada uma amostra. A possi ­
bilidade de utilização de produtos químicos de uma classe relacio ­
nada para o controlo positivo deve ser considerada, quando existam. As substâncias de controlo positivo podem incluir, por exemplo:
 
Substância Número CAS Número EINECS  
metanossulfonato de etilo 62-50-0 200-536-7 
etilnitrosureia 759-73-9 212-072-2 mitomicina C 50-07-7 200-008-6 ciclofosfamida 
ciclofosfamida monohidrato 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
trietilenomelamina 51-18-3 200-083-5
 
Para cada colheita devem também realizar-se controlos negativos, em 
que os animais são expostos apenas ao solvente ou veículo, proce ­
dendo-se do mesmo modo que num ensaio normal, a menos que 
existam dados históricos de controlo aceitáveis em relação à varia ­
bilidade de animal para animal e à frequência da ocorrência de células com aberrações cromossómicas. Se só estiver prevista uma amostra dos controlos negativos, a altura mais apropriada é a pri ­
meira amostra. Além disso, devem igualmente ser utilizados contro ­
los não expostos à substância em estudo, a menos que já existam dados de estudos anteriores ou publicados que mostrem que o solvente/veículo escolhido não induz nenhum efeito deletério ou 
mutagénico.
 
1.5. PROCEDIMENTO  
1.5.1.  Número e sexo dos animais  
Cada grupo de estudo e de controlo deve incluir pelo menos cinco 
animais analisáveis por sexo. Se no momento do estudo existirem 
dados disponíveis de estudos com as mesmas espécies e com utili ­
zação da mesma via de administração que demonstrem que não há qualquer diferença substancial da toxicidade entre os sexos, será 
suficiente testar um único sexo. Nos casos em que a exposição 
humana aos produtos químicos possa ser específica a cada sexo, como acontece com alguns produtos farmacêuticos, o ensaio deve ser executado com animais do sexo em causa.
 
1.5.2.  Programação do tratamento  
As substâncias de ensaio são preferivelmente administradas numa 
única exposição, podendo igualmente ser administradas numa dose dividida, ou seja, duas exposições no mesmo dia, separadas por apenas algumas horas, para facilitar a administração de grandes vo ­
lumes. Qualquer outro regime de administração terá de ser cientifi ­
camente justificado.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 321
 
Devem ser colhidas duas amostras separadas, após exposição durante 
um dia. Para os roedores, a primeira amostra deve ser colhida 1,5 
ciclos celulares normais (que é normalmente de 12-18 horas) após a exposição. Dado que o tempo necessário para a absorção e metabo ­
lismo da substância em estudo, bem como o seu efeito sobre a 
cinética do ciclo celular, podem afectar o momento óptimo para a 
detecção de uma eventual aberração cromossómica, recomenda-se a recolha de uma segunda amostra 24 horas após a primeira. Se forem utilizados regimes de administração ao longo de mais de um dia, 
deve ser colhida uma amostra 1,5 ciclos celulares normais após a 
exposição final.
 
Antes do sacrifício, os animais são injectados intraperitonealmente 
com uma dose apropriada de um agente de fixação da metafase (por 
exemplo, Colcemid  ® ou colchicina). As amostras serão colhidas a 
intervalos regulares, correspondentes a aproximadamente 3-5 horas para os ratos e a 4-5 horas para os  hamsters  chineses, a partir desse 
momento. As células da medula são colhidas e analisadas para de ­
tecção de aberrações cromossómicas.
 
1.5.3.  Doses  
Se for realizado um estudo para avaliação da gama de doses a 
administrar, por não estarem disponíveis dados apropriados, esse 
estudo deve ser executado no mesmo laboratório, utilizando as mesmas espécies, linha celular, sexo e regime de exposição a utilizar no estudo principal (5). Se a substância for tóxica, de ­
verão ser utilizadas três doses diferentes para a primeira amos ­
tragem, abrangendo uma gama compreendida entre a toxicidade máxima e uma toxicidade reduzida ou quase nula. Na segunda amostragem só será necessário avaliar a dose máxima, que é 
definida como a dose que produz sinais de toxicidade tais que 
indiquem que a utilização de doses superiores, com o mesmo regime de administração, produzirá mortalidade. As substâncias com actividade biológica específica em doses baixas e não tó ­
xicas (como acontece com as hormonas e agentes mitogénicos) 
poderão constituir uma excepção aos critérios de fixação da dose, devendo ser avaliadas caso a caso. A dose máxima pode igualmente ser definida como a dose que produz algumas 
indicações de toxicidade na medula (por exemplo, uma redução 
superior a 50 % do índice mitótico).
 
1.5.4.  Ensaio-limite  
Se um ensaio com uma dose de pelo menos 2 000 mg/kg de peso 
corporal numa única exposição ou em duas exposições no mesmo dia não produzir nenhum efeito tóxico perceptível e se, com base nos dados respeitantes a substâncias estruturalmente relacionadas, não for 
previsível a existência de toxicidade genética, poderá não ser consi ­
derado necessário um estudo completo com utilização de três doses diferentes. Para os estudos de maior duração, a dose limite é de 2 000 mg/kg de peso corporal/dia para as exposições até 14 dias e 
de 1 000 mg/kg de peso corporal/dia para as exposições de duração 
superior a 14 dias. A exposição prevista para o ser humano pode indicar a necessidade de se utilizarem doses mais elevadas nos en ­
saios-limite.
 
1.5.5.  Administração das doses  
A substância em estudo é geralmente administrada por sonda esofá ­
gica, utilizando um tubo estomacal ou cânula de intubação apropria ­
da, ou por injecção intraperitoneal. Poderão ser aceites, mediante 
justificação, outras vias de administração. O volume máximo de 
líquido que pode ser administrado de cada vez por sonda esofágica ou por injecção depende também do tamanho do animal de ensaio, não devendo exceder 2 ml/100 g de peso corporal. A utilização de 
volumes mais elevados deve ser justificada. Com excepção das subs ­
tâncias que causem irritação ou que sejam corrosivas, cujos efeitos serão normalmente agravados em concentrações mais altas, a varia ­
bilidade do volume de ensaio deve ser minimizada através do ajus ­
tamento das concentrações, por forma a garantir um volume cons ­
tante e independente da dose a administrar.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 322
 
1.5.6.  Preparação dos cromossomas  
Imediatamente após o sacrifício, a medula é colhida, exposta a uma 
solução hipotónica e fixada. As células são depois esfregadas em lâminas e coradas.
 
1.5.7.  Análise  
O índice mitótico deve ser determinado como medição da citotoxi ­
cidade em pelos menos 1 000 células por animal para todos os 
animais expostos à substância em estudo (incluindo os controlos positivos) e para os animais não expostos do controlo negativo.
 
Devem ser analisadas pelo menos 100 células de cada animal. Este 
número poderá ser menor quando se verificarem taxas elevadas de 
aberrações. Todas as lâminas, incluindo as provenientes dos lotes de 
controlo positivo e negativo, devem ser independentemente codifica ­
das antes da análise microscópica. Uma vez que os processos de fixação dão frequentemente lugar à ruptura de uma determinada 
proporção das células em metafase, com perda dos cromossomas, 
as células contabilizadas devem apresentar, para todos os tipos de célula, um número de centrómeros igual ao número modal ± 2.
 
2. DADOS  
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS  
Os dados respeitantes a cada animal devem ser apresentados num 
quadro. A unidade experimental é o animal. Para cada animal, de ­
vem ser apresentados o número de células contabilizadas, o número de aberrações por célula e a percentagem de células com aberrações cromossómicas estruturais. Os diferentes tipos de aberração cromos ­
sómica estrutural devem ser enumerados, com os respectivos núme ­
ros e frequências, para os grupos expostos à substância em estudo e para os grupos de controlo. A ocorrência de lacunas é registada em separado e incluída no relatório, mas não é geralmente contabilizada 
para o cálculo da frequência total das aberrações. Se não houver 
qualquer evidência de uma diferença na resposta entre os sexos, os dados de ambos os sexos poderão ser combinados para fins estatís ­
ticos.
 
2.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS  
Existem vários critérios para determinar um resultado positivo, no ­
meadamente o aumento do número de células com aberrações cro ­
mossómicas relacionado com a concentração ou um claro aumento do número de células com aberrações num determinado grupo ou numa determinada amostra. Deve atender-se, antes de mais, à im ­
portância biológica dos resultados. Como auxílio para a avaliação 
dos resultados dos ensaios, poderão ser utilizados métodos estatísti ­
cos (6), embora a significância estatística não deva ser o único elemento para a determinação de uma resposta positiva. Os resulta ­
dos ambíguos devem ser esclarecidos através de estudos adicionais, 
de preferência com modificação das condições experimentais.
 
Um aumento do número de células poliplóides pode indicar que a 
substância em estudo apresenta o potencial de inibir a mitose e de induzir aberrações cromossómicas numéricas. Um aumento do nú ­
mero de células com cromossomas endorreduplicados pode indicar 
que a substância em estudo apresenta o potencial de inibir a pro ­
gressão do ciclo celular (7) (8).
 
Uma substância cujos resultados não cumpram os critérios  supra  no 
presente ensaio é considerada não mutagénica.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 323
 
Embora a maioria de experiências tenha resultados claramente posi ­
tivos ou negativos, em casos raros o conjunto dos dados não per ­
mitirá que se obtenha uma opinião inequívoca sobre a actividade da substância em estudo, podendo acontecer que os resultados conti ­
nuem a ser ambíguos ou duvidosos independentemente do número 
de vezes que a experiência seja repetida.
 
Um resultado positivo no ensaio  in vitro  de aberrações cromossómi ­
cas indica que a substância em estudo induz aberrações cromossó ­
micas estruturais nas células da medula das espécies testadas. Um resultado negativo indica que, nas condições do ensaio, a substância em estudo não induz aberrações cromossómicas estruturais nas célu ­
las da medula das espécies testadas.
 
Deve ser discutida a probabilidade de a substância em estudo ou os 
seus metabolitos alcançarem o sistema circulatório geral ou especi ­
ficamente o tecido objectivo (ou seja, a toxicidade sistémica).  
3. APRESENTAÇÃO DE RELATÓRIOS  
RELATÓRIO DE ENSAIO  
O relatório de ensaio deve incluir a seguinte informação:  
Solvente/veículo:  
— justificação para a escolha do veículo,  
— solubilidade e estabilidade da substância em estudo no solvente/ ­
veículo, se conhecida.  
Animais de ensaio:  
— espécie/linha celular utilizada,  
— número, idade e sexo dos animais,  
— origem, condições de acomodação, alimentação, etc.,  
— peso de cada animal no início do ensaio, incluindo a gama de 
pesos, a respectiva média e o desvio-padrão para cada grupo.  
Condições de ensaio:  
— controlos positivos e negativos (veículo/solvente),  
— resultados do estudo para definição da gama de doses, quando 
tenha sido realizado,  
— justificação para a selecção das doses,  
— preparação da substância em estudo,  
— modo de administração da substância em estudo,  
— justificação da via de administração escolhida,  
— método para a verificação de que a substância em estudo atingiu 
a circulação geral ou o tecido objectivo, quando aplicável,  
— conversão da concentração da substância em estudo (ppm) na 
alimentação/abeberação para a dose real (mg/kg peso corporal/ ­
dia), quando aplicável,  
— qualidade dos alimentos e da água,  
— descrição pormenorizada dos calendários de exposição e amos ­
tragem,  
— métodos de medição da toxicidade,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 324
 
— substância utilizada para fixar a metafase, respectiva concentra ­
ção e duração de exposição,  
— métodos de preparação das lâminas,  
— critérios de contabilização das aberrações,  
— número de células analisadas por animal,  
— critérios definidos para que o estudo seja considerado positivo, 
negativo ou não conclusivo.  
Resultados:  
— sinais de toxicidade,  
— índice mitótico,  
— tipo e número de aberrações observadas em cada animal,  
— número total de aberrações em cada grupo, com as respectivas 
médias e desvios-padrão,  
— número de células aberrantes em cada grupo, com as respectivas 
médias e desvios-padrão,  
— alterações da ploidia, quando observadas,  
— relação dose-resposta, quando seja possível de determinar,  
— análise estatística, quando tenha sido realizada,  
— dados relativos ao controlo negativo realizado em paralelo com o 
ensaio,  
— dados históricos sobre o controlo negativo com as respectivas 
gamas, valores médios e desvios-padrão,  
— dados relativos ao controlo positivo realizado em paralelo com o 
ensaio.  
Discussão dos resultados.  
Conclusões.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) Adler, I.D., (1984) Cytogenetic Tests in Mammals. In: Muta ­
genicity Testing: a Practical Approach. S. Venitt and J.M. 
Parry (Eds). IRL Press, Oxford, Washington D.C., p. 275-306.  
(2) Preston, R.J., Dean, B.J., Galloway, S., Holden, H., McFee, 
A.F. and Shelby, M. (1987). Mammalian  In Vivo  Cytogenetic 
Assays: Analysis of Chromosome Aberrations in Bone Marrow 
Cells. Mutation Res., 189, p. 157-165.  
(3) Richold, M., Chandley, A., Ashby, J., Gatehouse, D.G., Boot ­
man, J. and Henderson, L., (1990)  In Vivo  Cytogenetic Assays. 
In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS 
Recommended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Gui ­
delines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised. Cam ­
bridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, 
Melbourne, Sydney, p. 115-141.  
(4) Tice, R.R., Hayashi, M., MacGregor, J.T., Anderson, D., Bla ­
key, D.H., Holden, H.E., Kirsch-Volders, M., Oleson Jr., F.B., 
Pacchierotti, F., Preston, R.J., Romagna, F., Shimada, H., Su ­
tou, S. and Vannier, B., (1994) Report from the Working Group on the  In Vivo  Mammalian Bone Marrow Chromosomal 
Aberration Test. Mutation Res., 312, p. 305-312.
 
(5) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., 
Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M. (1992). Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Wor ­
king Group: Dose setting in  In vivo  Mutagenicity Assays. 
Mutagenesis, 7, p. 313-319.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 325
 
(6) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and 
Savage, J.R.K. (1989). Statistical Analysis of  In Vivo  Cytoge­
netic Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report Part III. Statistical Evaluation of 
Mutagenicity Test Data. D.J. Kirkland, (Ed.) Cambridge Uni ­
versity Press, Cambridge. p. 184-232.
 
(7) Locke-Huhle, C., (1983) Endoreduplication in Chinese hamster 
cells during alpha-radiation induced G2 arrest. Mutation Res. 
119, p. 403-413.  
(8) Huang, Y., Change, C. and Trosko, J.E., (1983) Aphidicolin- 
-induced endoreduplication in Chinese hamster cells. Cancer Res., 43, p. 1362-1364.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 326
 
B.12.  MUTAGENICIDADE — ENSAIO  IN VIVO  DOS 
MICRONÚCLEOS EM ERITRÓCITOS DE MAMÍFEROS  
1. MÉTODO  
O presente método é idêntico ao método OCDE TG 474 — Ensaio 
dos micronúcleos em eritrócitos de mamíferos (1997).  
1.1. INTRODUÇÃO  
O ensaio  in vivo  dos micronúcleos de mamíferos é utilizado para a 
detecção de danos induzidos pela substância em estudo nos cromos ­
somas ou no aparelho mitótico dos eritoblastos, através da análise 
dos eritrócitos retirados da medula e/ou de células de sangue perifé ­
rico de animais, geralmente roedores.  
O objectivo do ensaio do micronúcleo é identificar substâncias que 
causam danos citogénicos, dando lugar à formação de micronúcleos 
com fragmentos de cromossoma ou com cromossomas inteiros.  
Quando um eritroblasto da medula se desenvolve para dar um eri ­
trócito policromático, o núcleo principal é expulso; qualquer micro ­
núcleo que tenha sido formado pode «ficar para atrás» ( lagging ), no 
citoplasma, onde não deveria existir qualquer material nuclear. A visualização dos micronúcleos é facilitada nestas células, uma vez 
que não existe um núcleo principal. Um aumento de frequência de 
eritrócitos policromáticos, micronucleados, nos animais expostos à substância em estudo representa uma indicação de danos cromossó ­
micos induzidos.
 
Para o presente ensaio utiliza-se normalmente a medula de roedores, 
uma vez que os eritrócitos policromáticos são produzidos nesse te ­
cido. A medição dos eritrócitos (policromáticos) imaturos micronu ­
cleados no sangue periférico é igualmente aceitável para qualquer outra espécie em que tenha sido demonstrado que o baço não tem a 
capacidade de eliminar os eritrócitos micronucleados ou que apre ­
sente uma sensibilidade adequada para a detecção de agentes que causam aberrações cromossómicas estruturais ou numéricas. Os mi ­
cronúcleos podem ser distinguidos por alguns critérios, que incluem 
a identificação da presença ou ausência de um centrómero ou de 
ADN centromérico nos micronúcleos. A frequência dos eritrócitos (policromáticos) imaturos micronucleados é o principal ponto final utilizado. A proporção de eritrócitos (normocromáticos) maturos com 
micronúcleos no sangue periférico pode igualmente ser utilizada 
como ponto final do ensaio quando os animais forem expostos à substância em estudo de forma contínua durante quatro semanas ou mais.
 
O ensaio  in vivo  do micronúcleo de mamíferos é particularmente 
relevante para a avaliação dos perigos mutagénicos, uma vez que 
permite a avaliação dos elementos metabólicos, da farmacocinética e dos processos de reparação do ADN  in vivo , embora estes possam 
variar de espécie para espécie, de tecido para tecido e em termos do 
ponto final genético. Os ensaios  in vivo  são igualmente úteis para a 
investigação suplementar de um efeito mutagénico detectado  in vitro.
 
Se existirem provas de que nem a substância em estudo nem nenhum 
dos seus metabolitos reactivos entram em contacto com o tecido objectivo, o presente ensaio não é apropriado.
 
Ver também a parte B da Introdução Geral.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 327
 
1.2. DEFINIÇÕES  
Centrómero:  Região(ões) de um cromossoma a que estão associadas 
fibras fusiformes durante a divisão celular, permitindo o movimento ordeiro dos cromossomas para os pólos da célula.
 
Micronúcleos:  Pequenos núcleos separados e adicionais dos núcleos 
das células principais, produzidos durante a telefase da mitose (meio ­
se) por fragmentos do cromossoma ou cromossomas inteiros que 
«ficam para trás» ( lagging ). 
Eritrócito normocromático:  Eritrócito maduro a que faltam ribos ­
somas e que pode, por conseguinte, distinguir-se dos eritrócitos poli ­
cromáticos imaturos por coloração selectiva dos ribossomas.  
Eritrócito policromático:  Eritrócito imaturo, numa fase de desen ­
volvimento intermediária, que ainda contém ribossomas e pode, por 
conseguinte, distinguir-se dos eritrócitos normocromáticos maturos por coloração selectiva dos ribossomas.
 
1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Os animais são expostos à substância em estudo por uma via apro ­
priada. Se for utilizada a medula, os animais são sacrificados passado 
o tempo necessário após a exposição, a medula é extraída e são feitas preparações coradas (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7). Quando é utilizado o sangue periférico, o sangue é recolhido passado o tempo necessário 
após a exposição e são preparados esfregaços corados (4) (8) (9) 
(10). Nos estudos com sangue periférico, as amostras de célula de ­
vem ser colhidas tão cedo quanto possível após a última exposição à substância em estudo. As preparações são analisadas para a presença 
de micronúcleos.
 
1.4. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.4.1.  Preparação  
1.4.1.1.  Selecção das espécies animais  
Quando se pretender utilizar preparações da medula, recomenda-se a 
utilização de ratos ou ratazanas, embora possa ser utilizada qualquer 
espécie de mamífero que seja apropriada. Quando se utilizar o san ­
gue periférico, recomenda-se a utilização de ratos. Contudo, pode ser utilizada qualquer espécie de mamífero que seja apropriada, desde 
que se trate de uma espécie em que o baço não remove os eritrócitos 
micronucleados ou que apresente uma sensibilidade adequada para a detecção de agentes que causam aberrações cromossómicas estrutu ­
rais ou numéricas. Devem ser utilizados animais saudáveis jovens de 
linhas de laboratório com características bem conhecidas. No início 
do estudo, a diferença de peso entre os animais deve ser mínima, não devendo exceder + 20 % do peso médio de cada sexo.
 
1.4.1.2.  Condições de acomodação e alimentação  
Devem ser aplicadas as condições gerais referidas na Introdução 
Geral, parte B, embora o objectivo para a humidade deva ser de 
50 %-60 %.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 328
 
1.4.1.3.  Preparação dos animais  
Os animais adultos saudáveis jovens são distribuídos aleatoriamente 
pelos grupos de controlo e pelos grupos expostos. Os animais são identificados de forma inequívoca, devendo ser aclimatados às con ­
dições de laboratório durante pelo menos cinco dias. As gaiolas 
devem ser dispostas de modo a que eventuais efeitos devidos à respectiva colocação sejam minimizados.
 
1.4.1.4.  Preparação das doses  
As substâncias sólidas devem ser dissolvidas ou suspensas em sol ­
ventes ou veículos adequados e, se necessário, diluídas antes de 
serem administradas aos animais. As substâncias líquidas podem 
ser adicionadas directamente aos sistemas em estudo e/ou diluídas antes de serem adicionadas às células. Devem ser utilizadas prepa ­
rações frescas da substância em estudo, a menos que os dados de 
estabilidade demonstrem que o respectivo armazenamento não coloca 
problemas para o ensaio.
 
1.4.2.  Condições do ensaio  
1.4.2.1.  Solvente/veículo  
O solvente/veículo não deve reagir com a substância em estudo nem 
produzir efeitos tóxicos nas doses utilizadas. Caso se utilizem solventes/veículos cujas propriedades não se encontrem totalmente 
elucidadas, devem fornecer-se dados que justifiquem a sua compati ­
bilidade. Sempre que possível, recomenda-se a utilização de solventes/veículos aquosos.
 
1.4.2.2.  Controlos  
Cada experiência deve incluir em paralelo controlos positivos e ne ­
gativos (solvente/veículo) para cada sexo. Com excepção da exposi ­
ção à substância em estudo, todos os animais, incluindo os dos 
grupos de controlo, devem ser manuseados de forma idêntica.  
Os controlos positivos devem produzir micronúcleos  in vivo  aos 
níveis de exposição a que se espera o surgimento de um aumento detectável em relação à linha de base. A dose de controlo positivo a 
administrar deve ser escolhida de modo a que os seus efeitos sejam 
claros mas também a que as lâminas codificadas não sejam imedia ­
tamente identificadas pela pessoa que procede às leituras. É aceitável que o controlo positivo seja administrado por uma via diferente da 
substância em estudo e que só seja realizada uma amostra. A possi ­
bilidade de utilização de produtos químicos de uma classe relacio ­
nada para o controlo positivo deve ser considerada, quando existam. As substâncias de controlo positivo podem incluir, por exemplo:
 
Substância Número CAS Número EINECS  
metanossulfonato de etilo 62-50-0 200-536-7 
etilnitrosureia 759-73-9 212-072-2 mitomicina C 50-07-7 200-008-6 ciclofosfamida 
ciclofosfamida monohidrato 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
trietilenomelamina 51-18-3 200-08 3-5
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 329
 
Para cada colheita devem também realizar-se controlos negativos, em 
que os animais são expostos apenas ao solvente ou veículo, proce ­
dendo-se do mesmo modo que num ensaio normal, a menos que existam dados históricos de controlo aceitáveis em relação à varia ­
bilidade de animal para animal e à frequência da ocorrência de 
células com aberrações cromossómicas. Se só estiver prevista uma 
amostra dos controlos negativos, a altura mais apropriada é a pri ­
meira amostra. Além disso, devem igualmente ser utilizados contro ­
los não expostos à substância em estudo, a menos que já existam 
dados de estudos anteriores ou publicados que mostrem que o 
solvente/veículo escolhido não induz nenhum efeito deletério ou mutagénico.
 
Se for utilizado o sangue periférico, uma amostra anterior à exposi ­
ção poderá servir para o controlo negativo, mas apenas nos estudos 
de menor duração (ou seja, 1 a 3 exposições), desde que os dados respeitantes a essa amostra estejam de acordo com o esperado em 
função de experiências anteriores.
 
1.5. PROCEDIMENTO  
1.5.1.  Número e sexo dos animais  
Cada grupo exposto e de controlo deve incluir pelo menos cinco 
animais analisáveis por sexo (11). Se no momento do estudo existi ­
rem dados disponíveis de estudos com as mesmas espécies e com 
utilização da mesma via de administração que demonstrem que não 
há qualquer diferença substancial da toxicidade entre os sexos, será suficiente testar um único sexo. Nos casos em que a exposição humana aos produtos químicos possa ser específica a cada sexo, 
como acontece com alguns produtos farmacêuticos, o ensaio deve 
ser executado com animais do sexo em causa.
 
1.5.2.  Programação do tratamento  
Não é possível recomendar qualquer programação específica para a 
exposição (ou seja, uma, duas ou mais exposições com intervalos de 
24 horas). As amostras recolhidas durante regimes de administração 
prolongada são aceitáveis, desde que o estudo demonstre a existência de um efeito positivo ou, para um estudo negativo, desde que a toxicidade seja demonstrada ou que se utilize uma dose limite, 
com administração até ao momento da colheita. As substâncias de 
ensaio podem igualmente ser administradas numa dose dividida, ou seja, duas exposições no mesmo dia, separadas por apenas algumas horas, para facilitar a administração de grandes volumes.
 
O ensaio pode ser executado de duas formas:  
a) Os animais são expostos à substância em estudo uma única vez. 
As amostras de medula são colhidas pelo menos duas vezes, a 
primeira das quais pelo menos 24 horas após a exposição, com 
intervalos apropriados entre as colheitas mas não ultrapassando as 48 horas após a exposição. Uma eventual colheita antes de 24 horas após a exposição terá de ser justificada. As amostras de 
sangue periférico são colhidas pelo menos duas vezes, a primeira 
das quais pelo menos 36 horas após a exposição, com intervalos apropriados entre as colheitas, mas não ultrapassando as 72 horas após a exposição. Quando for identificada uma resposta positiva 
numa determinada colheita, não será necessário continuar o estu ­
do;
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 330
 
b) Se forem utilizadas duas ou mais exposições diárias (por exem ­
plo, duas ou mais exposições com intervalos de 24 horas), a 
primeira amostra deve ser colhida 18 a 24 horas depois da ex ­
posição final no caso do sangue periférico (12).  
Quando necessário, poderão ser recolhidas amostras adicionais.  
1.5.3.  Doses  
Se for realizado um estudo para avaliação da gama de doses a 
administrar, por não estarem disponíveis dados apropriados, esse estudo deve ser executado no mesmo laboratório, utilizando as mes ­
mas espécies, linha celular, sexo e regime de exposição a utilizar no 
estudo principal (13). Se a substância for tóxica deverão ser utiliza ­
das três doses diferentes para a primeira amostragem, abrangendo uma gama compreendida entre a toxicidade máxima e uma toxici ­
dade reduzida ou quase nula. Na segunda amostragem só será ne ­
cessário avaliar a dose máxima, que é definida como a dose que 
produz sinais de toxicidade tais que indiquem que a utilização a doses superiores, com o mesmo regime de administração, produzirá mortalidade. As substâncias com actividade biológica específica em 
doses baixas e não tóxicas (como acontece com as hormonas e 
agentes mitogénicos) poderão constituir uma excepção aos critérios de fixação da dose, devendo ser avaliadas caso a caso. A dose máxima pode igualmente ser definida como a dose que produz al ­
gumas indicações de toxicidade na medula (por exemplo, redução da 
proporção de eritrócitos imaturos em relação aos eritrócitos totais na medula ou no sangue periférico).
 
1.5.4.  Ensaio-limite  
Se um ensaio com uma dose de pelo menos 2 000 mg/kg de peso 
corporal numa única exposição ou em duas exposições no mesmo 
dia não produzir nenhum efeito tóxico perceptível e se, com base nos dados respeitantes a substâncias estruturalmente relacionadas, não for previsível a existência de toxicidade genética, poderá não ser consi ­
derado necessário um estudo completo com utilização de três doses 
diferentes. Para os estudos de maior duração a dose limite é de 2 000 mg/kg de peso corporal/dia para as exposições até 14 dias e de 1 000 mg/kg de peso corporal/dia para as exposições de duração superior a 
14 dias. A exposição prevista para o ser humano pode indicar a 
necessidade de se utilizarem doses mais elevadas nos ensaios-limite.
 
1.5.5.  Administração das doses  
A substância em estudo é geralmente administrada por sonda esofá ­
gica, utilizando um tubo estomacal ou cânula de intubação apropria ­
da, ou por injecção intraperitoneal. Poderão ser aceites, mediante 
justificação, outras vias de administração. O volume máximo de 
líquido que pode ser administrado de cada vez por sonda esofágica ou por injecção depende também do tamanho do animal de ensaio, não devendo exceder 2 ml/100 g de peso corporal. A utilização de 
volumes mais elevados deve ser justificada. Com excepção das subs ­
tâncias que causem irritação ou que sejam corrosivas, cujos efeitos serão normalmente agravados em concentrações mais altas, a varia ­
bilidade do volume de ensaio deve ser minimizada através do ajus ­
tamento das concentrações, por forma a garantir um volume cons ­
tante e independente da dose a administrar.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 331
 
1.5.6.  Preparação da medula/sangue  
As células da medula são retiradas do fémur ou da tíbia imediata ­
mente após o sacrifício. Geralmente, as células são retiradas do fémur ou da tíbia, preparadas e coradas de acordo com métodos já 
definidos. O sangue periférico é retirado da veia caudal ou de outro 
vaso sanguíneo apropriado. As células de sangue são imediatamente sujeitas a uma coloração supravital (8) (9) (10) ou então são prepa ­
rados esfregaços que depois são corados. A utilização de uma colo ­
ração específica para o ADN [por exemplo, laranja de acridina (14) 
ou pironina-y de milho 33 258 plus da Hoechst (15)] pode eliminar 
alguns dos erros associados à utilização de uma coloração não es ­
pecífica para o ADN. Esta vantagem não impossibilita a utilização de 
colorações convencionais (por exemplo, Giemsa). Outros sistemas [por exemplo, colunas de celulose para remoção das células nuclea ­
das (16)] podem igualmente ser utilizados, desde que se demonstre 
que esses sistemas funcionam de forma adequada para a preparação 
de micronúcleos em laboratório.
 
1.5.7.  Análise  
A proporção de eritrócitos imaturos em relação aos eritrócitos totais 
(imaturos + maduros) é determinada para cada animal através da 
contagem de pelo menos 200 eritrócitos no caso da medula e de 
1 000 eritrócitos no caso do sangue periférico (17). Todas as lâmi ­
nas, incluindo as dos controlos positivos e negativos, devem ser codificadas independentemente antes da análise microscópica. A 
eventual ocorrência de eritrócitos imaturos micronucleados deve ser 
analisada em pelo menos 2 000 eritrócitos imaturos por animal. A contagem de eritrócitos maduros micronucleados poderá ser utilizada como informação adicional. Ao analisar as lâminas, a proporção de 
eritrócitos imaturos em relação aos eritrócitos totais não deve ser 
inferior a 20 % do valor de controlo. Quando os animais forem sujeitos a uma exposição contínua durante quatro semanas ou mais, poderão ser também analisados 2 000 eritrócitos maduros por animal, 
para determinação da ocorrência de micronúcleos. Os sistemas auto ­
matizados de análise (tratamento de imagens e citometria de fluxo e suspensões celulares) são alternativas aceitáveis à avaliação manual, se apropriadamente justificadas e validadas.
 
2. DADOS  
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS  
Os dados respeitantes a cada animal devem ser apresentados num 
quadro. A unidade experimental é o animal. Para cada animal, de ­
vem ser verificados separadamente o número de eritrócitos imaturos, 
o número de eritrócitos imaturos micronucleados e a proporção de 
eritrócitos imaturos em relação aos eritrócitos totais. Quando os animais tiverem sido expostos à substância em estudo em contínuo durante quatro semanas ou mais, devem também ser recolhidos da ­
dos em relação aos eritrócitos maduros. Para cada animal, deve ser 
apresentada a proporção de eritrócitos imaturos em relação aos eri ­
trócitos totais e, se for considerado necessário, de eritrócitos maduros micronucleados. Se não houver qualquer evidência de uma diferença 
na resposta entre os sexos, os dados de ambos os sexos poderão ser 
combinados para fins estatísticos.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 332
 
2.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS  
Há diversos critérios para determinar um resultado positivo, como 
por exemplo um aumento do número de células micronucleadas relacionado com a dose ou um claro aumento do número de células 
micronucleadas num determinado grupo e numa determinada amos ­
tragem. Deve ser tomada em consideração, antes de mais, a impor ­
tância biológica dos resultados. Como auxílio para a avaliação dos resultados dos ensaios poderão ser utilizados métodos estatísticos 
(18) (19), embora a significância estatística não deva ser o único 
elemento para a determinação de uma resposta positiva. Os resulta ­
dos ambíguos devem ser esclarecidos através de estudos adicionais, 
de preferência com modificação das condições experimentais.
 
Uma substância cujos resultados não cumpram os critérios acima 
indicados no presente ensaio é considerada não mutagénica.  
Embora a maioria de experiências tenha resultados claramente posi ­
tivos ou negativos, em casos raros o conjunto dos dados não per ­
mitirá que se obtenha uma opinião inequívoca sobre a actividade da 
substância em estudo, podendo acontecer que os resultados conti ­
nuem a ser ambíguos ou duvidosos independentemente do número de vezes que a experiência seja repetida.
 
Um resultado positivo no ensaio dos micronúcleos indica que a 
substância em estudo induz a ocorrência dos mesmos, como resul ­
tado de danos nos cromossomas ou no sistema mitótico dos eritro ­
blastos da espécie testada. Um resultado negativo indica que, nas 
condições do ensaio, a substância em estudo não induz a ocorrência 
de micronúcleos nos eritroblastos imaturos da espécie testada.  
Deve ser discutida a probabilidade de a substância em estudo ou os 
seus metabolitos alcançarem o sistema circulatório geral ou especi ­
ficamente o tecido objectivo (ou seja, a toxicidade sistémica).  
3. APRESENTAÇÃO DE RELATÓRIOS  
RELATÓRIO DE ENSAIO  
O relatório de ensaio deve incluir a seguinte informação:  
Solvente/veículo:  
— justificação para a escolha do veículo,  
— solubilidade e estabilidade da substância em estudo no solvente/ ­
veículo, se conhecida.  
Animais de ensaio:  
— espécie/linha celular utilizada,  
— número, idade e sexo dos animais,  
— origem, condições de acomodação, alimentação, etc.,  
— peso de cada animal no início do ensaio, incluindo a gama de 
pesos, a respectiva média e o desvio-padrão para cada grupo.  
Condições de ensaio:  
— controlos positivos e negativos (veículo/solvente),  
— resultados do estudo para definição da gama de doses, quando 
tenha sido realizado,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 333
 
— justificação para a selecção das doses,  
— preparação da substância em estudo,  
— modo de administração da substância em estudo,  
— justificação da via de administração escolhida,  
— método para a verificação de que a substância em estudo atingiu 
a circulação geral ou o tecido objectivo, quando aplicável,  
— conversão da concentração da substância em estudo (ppm) na 
alimentação/abeberação para a dose real (mg/kg peso corporal/ ­
dia), quando aplicável,  
— qualidade dos alimentos e da água,  
— descrição pormenorizada dos calendários de exposição e amos ­
tragem,  
— métodos de preparação das lâminas,  
— métodos de medição da toxicidade,  
— critérios de contabilização dos eritrócitos imaturos micronuclea ­
dos, 
— número de células analisadas por animal,  
— critérios definidos para que o estudo seja considerado positivo, 
negativo ou não conclusivo.  
Resultados:  
— sinais de toxicidade,  
— proporção de eritrócitos imaturos em relação aos eritrócitos to ­
tais, 
— número de eritrócitos imaturos micronucleados em cada animal,  
— médias e desvios-padrão dos eritrócitos imaturos micronucleados 
por grupo,  
— relação dose-resposta, quando seja possível de determinar,  
— análise estatística e respectivo método,  
— dados relativos ao controlo negativo realizado em paralelo com o 
ensaio e dados históricos sobre o controlo negativo,  
— dados relativos ao controlo positivo realizado em paralelo com o 
ensaio.  
Discussão dos resultados.  
Conclusões.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) Heddle, J.A., (1973) A Rapid  In Vivo  Test for Chromosomal 
Damage, Mutation Res., 18, p. 187-190.  
(2) Schmid, W., (1975) The Micronucleus Test, Mutation Res., 31, 
p. 9-15.  
(3) Heddle, J.A., Salamone, M.F., Hite, M., Kirkhart, B., Mavour ­
nin, K., MacGregor, J.G. and Newell, G.W., (1983) The In ­
duction of Micronuclei as a Measure of Genotoxicity. Mutation 
Res., 123, p. 61-118.  
(4) Mavournin, K.H., Blakey, D.H., Cimino, M.C., Salamone, 
M.F. and Heddle, J.A., (1990) The  In Vivo  Micronucleus As ­
say in Mammalian Bone Marrow and Peripheral Blood. A 
report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene- 
-Tox Program, Mutation Res., 239, p. 29-80.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 334
 
(5) MacGregor, J.T., Schlegel, R. Choy, W.N., and Wehr, C.M., 
(1983) Micronuclei in Circulating Erythrocytes: A Rapid 
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(6) MacGregor, J.T., Heddle, J.A. Hite, M., Margolin, G.H., Ra ­
mel, C., Salamone, M.F., Tice, R.R., and Wild, D., (1987) 
Guidelines for the Conduct of Micronucleus Assays in Mam ­
malian Bone Marrow Erytrocytes. Mutation Res., 189, p. 103- 
-112.  
(7) MacGregor, J.T., Wehr, C.M., Henika, P.R., and Shelby, M.E., 
(1990) The  in vivo  Erythrocyte Micronucleus Test: Measure ­
ment at Steady State Increases Assay Efficiency and Permits Integration with Toxicity Studies. Fund. Appl. Toxicol., 14, p. 513-522.
 
(8) Hayashi, M., Morita, T., Kodama, Y., Sofuni, T. and Ishidate, 
M. Jr., (1990) The Micronucleus Assay with Mouse Peripheral 
Blood Reticulocytes Using Acridine Orange-Coated Slides. Mutation Res., 245, p. 245-249.
 
(9) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test, 
(1992) Micronucleus Test with Mouse Peripheral Blood Eryth ­
rocytes by Acridine Orange Supravital Staining: The Summary 
Report of the 5th Collaborative Study by CSGMT/JEMMS. MMS. Mutation Res., 278, p. 83-98.
 
(10) The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test 
(CSGMT/JEMMS. MMS: The Mammalian Mutagenesis Study 
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(1995) Protocol recommended for the short-term mouse perip ­
heral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, p. 153-159.  
(11) Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blac ­
key, D.H., Kirsch-Volders, M., Oleson, Jr. F. B., Pacchierotti, 
F., Romagna, F., Shimada, H., Sutou, S. and Vannier, B., 
(1994)  In Vivo  Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay. Mu ­
tation Res., 312, p. 293-304.  
(12) Higashikuni, N. and Sutou, S., (1995) An optimal, generalized 
sampling time of 30 ± 6 h after double dosing in the mouse 
peripheral blood micronucleus test. Mutagenesis, 10, p. 313-319.  
(13) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., 
Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, D.B., Kirkland, D.J. and Rochold, M., (1992) Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Wor ­
king Group: Dose Setting in  In Vivo  Mutagenicity Assays. 
Mutagenesis, 7, p. 313-319.
 
(14) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr., (1983) An Ap ­
plication of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Mi ­
cronucleus Test. Mutation Res., 120, p. 241-247.  
(15) MacGregor, J.T., Wehr, C.M. and Langlois, R.G., (1983) A 
Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and 
RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y. Mutation Res., 120, p. 269-275.
 
(16) Romagna, F. and Staniforth, C.D., (1989) The automated bone 
marrow micronucleus test. Mutation Res., 213, p. 91-104.  
(17) Gollapudi, B. and McFadden, L.G., (1995) Sample size for the 
estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ra ­
tio in the bone marrow micronucleus test. Mutation Res., 347, 
p. 97-99.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 335
 
(18) Richold, M., Ashby, J., Bootman, J., Chandley, A., Gatehouse, 
D.G. and Henderson, L., (1990)  In Vivo  Cytogenetics Assay. 
In: D.J. Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity tests. UKEMS Re ­
commended Procedures. UKEMS Sub-Committee on Guideli ­
nes for Mutagenicity Testing. Report, Part I, revised. Cam ­
bridge University Press, Cambridge, New York, Port Chester, 
Melbourne, Sydney, p. 115-141.  
(19) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and 
Savage, J.R.K., (1989) Statistical Analysis of  In Vivo  Cytoge­
netic Assays. In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guideli ­
nes for Mutagenicity Testing. Report, Part III. Cambridge Uni ­
versity Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, 
Sydney, p. 184-232.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 336
 
B.13./14.  MUTAGENICIDADE — ENSAIO DE MUTAÇÃO REVERSA 
EM BACTÉRIAS  
1. MÉTODO  
O presente método é idêntico ao método OCDE TG 471 — Ensaio 
de mutação reversa bacteriana (1997).  
1.1. INTRODUÇÃO  
O ensaio de mutação reversa bacteriana utiliza estirpes de  Salmone ­
las typhimurium  e Escherichia coli  carentes em aminoácidos para 
detectar mutações pontuais, causadas pela substituição, adição ou 
supressão de um ou mais pares de bases do ADN (1) (2) (3). O princípio do presente ensaio de mutação reversa bacteriana é a de ­
tecção de mutações que invertem as mutações existentes nas estirpes 
de ensaio, restaurando a capacidade funcional das bactérias sinteti ­
zarem um ácido essencial. As bactérias com mutação reversa são detectadas pela sua capacidade de crescimento na ausência do ami ­
noácido em que as estirpes de ensaio eram carentes.
 
As mutações pontuais causam diversas doenças genéticas humanas, 
existindo provas substanciais de que as mutações pontuais em onco ­
genes e em genes supressores de tumores nas células somáticas estão 
envolvidas na formação de tumores nos seres humanos e em animais experimentais. O ensaio de mutação reversa bacteriana é rápido, barato e de relativamente fácil execução. Muitas das estirpes de 
ensaio têm diversas características que as tornam mais sensíveis 
para a detecção de mutações, nomeadamente sequências de ADN identificativas dos locais de inversão, aumento da permeabilidade celular a grandes moléculas e eliminação ou aumento da ocorrência 
de erros nos processos de reparação do ADN. A especificidade das 
estirpes de ensaio pode fornecer alguma informação útil sobre os tipos de mutações induzidos pelos agentes genotóxicos. Já existe uma grande base de dados com resultados respeitantes a uma vasta 
gama de ensaios de mutação reversa bacteriana, tendo sido desen ­
volvidas metodologias com características bem conhecidas e que utilizam produtos químicos com diferentes propriedades físico-quí ­
micas, nomeadamente compostos temporários.
 
Ver também a parte B da Introdução Geral.  
1.2. DEFINIÇÕES  
Ensaio de mutação reversa  com  Salmonelas typhimurium  ou Es­
cherichia coli : detecta mutações em estirpes carentes num determi ­
nado aminoácido (histidina ou triptofano, respectivamente), que tem como resultado a produção de uma estirpe independente do abaste ­
cimento externo desse aminoácido.
 
Mutagéneos de substituição de um par de bases  são os agentes 
que causam uma alteração das bases do ADN. No ensaio de mutação 
reversa essa alteração pode ocorrer no local da mutação original ou 
num local diferente do genoma bacteriano.  
Mutagéneos por deslocação do quadro de leitura  são agentes que 
causam a adição ou supressão de um ou mais pares de bases no 
ADN, modificando dessa forma o quadro de leitura do ARN.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 337
 
1.3. CONSIDERAÇÕES INICIAIS  
O ensaio de mutação reversa bacteriana utiliza células procariotas, 
que diferem das células de mamífero em características como a absorção, metabolismo, estrutura dos cromossomas e processos de 
reparação do ADN. Os ensaios conduzidos  in vitro  exigem geral ­
mente a utilização de uma fonte exógena de activação metabólica. Os sistemas de activação metabólica  in vitro  não reproduzem intei ­
ramente as condições  in vivo  nos mamíferos. O ensaio não fornece, 
por conseguinte, informação directa sobre a potência mutagénica e 
carcinogénica da substância nos mamíferos.
 
O ensaio de mutação reversa bacteriana é geralmente utilizado para a 
despistagem inicial da actividade genotóxica e, nomeadamente, para detectar a indução de mutações pontuais. Uma extensa base de dados 
demonstrou que muitos produtos químicos que dão resultados posi ­
tivos no presente ensaio apresentam uma actividade mutagénica nou ­
tros ensaios. Há exemplos de agentes mutagénicos que não são detectados pelo presente ensaio, podendo as razões para essas falhas 
ser atribuídas à natureza específica do ponto final detectado, a dife ­
renças na activação metabólica ou ainda a diferenças na biodisponi ­
bilidade. Por outro lado, elementos que aumentem a sensibilidade do ensaio de mutação reversa bacteriana podem conduzir à sobrestima ­
ção da actividade mutagénica.
 
O ensaio de mutação reversa bacteriana pode não ser apropriado para 
a avaliação de certas classes de produtos químicos, nomeadamente compostos altamente bactericidas (por exemplo, certos antibióticos) e produtos que se pensa (ou que se sabe) que interferem especifica ­
mente com o sistema de replicação das células de mamíferos (por 
exemplo, alguns inibidores da topoisomerase e alguns compostos análogos a nucleosídeos). Nesses casos, poderá ser mais apropriado utilizar ensaios de mutação em células de mamíferos.
 
Embora muitos dos compostos que dão resultados positivos no pre ­
sente ensaio sejam carcinogéneos para os mamíferos, essa correlação 
não é absoluta. Com efeito, a correlação depende da classe química e, por outro lado, alguns agentes carcinogéneos não são detectados no ensaio pelo facto de o seu mecanismo ou mecanismos de actua ­
ção, não genotóxicos, não afectarem as células bacterianas.
 
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
As suspensões bacterianas são expostas à substância em estudo tanto 
na presença como na ausência de um sistema de activação metabó ­
lico exógeno. No método de incorporação em placas, as suspensões 
são misturadas num revestimento de gelose e depois vertidas na superfície duma lâmina de gelose com meio mínimo. No método 
com incubação prévia, a mistura de tratamento é incubada e só 
depois misturada com uma cobertura de gelose e preparada em pla ­
cas com meio mínimo. Independentemente da técnica que tenha sido utilizada, as colónias com mutação reversa são contadas e compara ­
das com o número de colónias com mutação reversa espontânea em 
placas de controlo com solvente, após dois ou três dias de incubação.
 
Estão descritos diversos procedimentos para executar o ensaio de mu ­
tação reversa bacteriana. Entre os mais geralmente utilizados estão o método de incorporação em placas (1) (2) (3) (4), o método com in ­
cubação prévia (2) (3) (5) (6) (7) (8), o método em flutuação (9) (10) e o 
método em suspensão (11). As adaptações necessárias para os ensaios 
de gases ou vapores também se encontram descritas (12).
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 338
 
Os procedimentos descritos no presente método dizem principal ­
mente respeito aos métodos de incorporação em placas e com incu ­
bação prévia. Qualquer dos dois é aceitável para a realização de experiências na presença e na ausência de um sistema de activação metabólica. Algumas substâncias poderão ser detectadas de forma 
mais eficaz utilizando o método com incubação prévia. Essas subs ­
tâncias pertencem a classes químicas que incluem as nitrosaminas alifáticas de cadeia curta, os metais, os aldeídos, os corantes azóicos e compostos diazócios, os alcalóides de priolizidina, os compostos 
alílicos e os compostos nitro (3). Por outro lado, certas classes de 
mutagéneos nem sempre são detectadas quando se utilizam os pro ­
cedimentos padrão, tais como o método de incorporação em placas ou o método com incubação prévia. Esses casos são considerados 
«especiais» e recomenda-se fortemente que sejam utilizados proce ­
dimentos alternativos para a sua detecção. Estão já identificados os seguintes casos «especiais» (e exemplos dos procedimentos que po ­
dem ser utilizados para a sua detecção): corantes azóicos e compos ­
tos diazóticos (3) (5) (6) (13), gases e compostos químicos (12) (14) 
(15) (16) e glicósidos (17) (18) voláteis. Qualquer desvio do proce ­
dimento padrão terá de ser cientificamente justificado.
 
1.5. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.5.1.  Preparação  
1.5.1.1.  Bactérias  
Devem ser utilizadas culturas frescas de bactérias na fase final do 
crescimento exponencial ou no início da fase estacionária (aproxi ­
madamente 10  9 células/ml). Não devem ser utilizadas culturas em 
fase estacionária adiantada. É essencial que as culturas utilizadas na experiência contenham um título elevado de células viáveis, que pode ser demonstrado por dados históricos de controlo sobre as 
curvas de crescimento ou durante o próprio ensaio, através da deter ­
minação das células viáveis em placas.
 
A temperatura de incubação recomendada é de 37  o C. 
Devem ser utilizadas pelo menos cinco estirpes das bactérias, entre 
as quais quatro estirpes de  S. typhimurium  (TA1535; TA1537 ou 
TA97 ou TA 97a; TA98 e TA100) para as quais foi demonstrado que são fiáveis e dão resultados reprodutíveis entre laboratórios. 
Essas quatro estirpes de  S. typhimurium  têm um par com as bases 
GC no local da inversão primária e sabe-se que não permitem de ­
tectar certos agentes mutagéneos oxidantes, de ligação cruzada nem hidrazinas. Essas substâncias podem ser detectadas utilizando as es ­
tirpes  E. coli  WP2 ou  S. typhimurium  TA102 (19) que têm um par 
com as bases AT no local da inversão primária. Por conseguinte, a combinação de estirpes recomendada é:
 
— S. typhimurium  TA1535, e  
— S. typhimurium  TA1537 ou TA97 ou TA97a, e  
— S. typhimurium  TA98, e  
— S. typhimurium  TA 100, e  
— E. coli  WP2 uvrA, ou  E. coli  WP2 uvrA (pKM101), ou  S. 
typhimurium  TA102.  
Para a detecção de agentes mutagéneos causadores de ligações cru ­
zadas, poderá ser preferível incluir a estirpe TA102 ou acrescentar 
uma estirpe capaz de reparar o ADN de  E. coli  [por exemplo,  E. coli  
WP2 ou  E. coli  WP2 (pKM101)].  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 339
 
Devem ser utilizados os procedimentos estabelecidos para a prepa ­
ração de culturas de arranque, verificação dos mercadores e armaze ­
namento. As quantidades de aminoácidos necessários para o cresci ­
mento (histidina para as estirpes de  S. typhimurium  e triptofano para 
as estirpes de  E. coli ) devem ser demonstradas para cada preparação 
de cultura de arranque conservada. Outras características fenotípicas 
devem também ser verificadas, a saber: a presença ou ausência de plasmídeos de Factor-r, quando necessário [ou seja, resistência à ampicilina nas estirpes TA98, TA100 e TA97 ou TA97a, WP2 
uvrA e WP2 uvrA (pKM101) e resistência à ampicilina e à tetraci ­
clina na estirpe TA102]; presença de mutações características (ou seja, mutação rfa em  S. typhimurium,  através da sensibilização 
com violeta de cristal, e mutação uvrA em  E. coli  ou mutação 
uvrB em S.  typhimurium,  através da sensibilização com raios ultra ­
violeta) (2) (3). As estirpes devem ainda apresentar, de forma espon ­
tânea, contagens de mutações reversas nas gamas de frequência es ­
peradas em função dos dados históricos de controlo do laboratório e 
também, de preferência, da literatura.
 
1.5.1.2.  Meio  
Será utilizado um meio mímimo de gelose apropriado (por exemplo, 
contendo meio mínimo Vogel-Bonner E e glucose) e uma cobertura 
de gelose com histidina e biotina ou triptofano para permitir alguma divisão celular (1) (2) (9).
 
1.5.1.3.  Activação metabólica  
As bactérias devem ser expostas à substância em estudo tanto na 
presença como na ausência de um sistema adequado de activação 
metabólica. O sistema mais geralmente utilizado é uma fracção pós- 
-mitocondrial reforçada com co-factor (S9) preparada a partir de fí ­
gados de roedores tratados com agentes de indução enzimática, como por exemplo Aroclor 1254 (1) (2) ou uma mistura de fenobarbitona e  
β-naftoflavona (18) (20) (21). A fracção pós-mitocondrial é geral ­
mente utilizada em concentrações na gama de 5 % a 30 % v/v na mistura S9. A escolha e o estado do sistema de activação metabólico podem depender da classe dos produtos químicos em estudo. Em 
alguns casos pode revelar-se adequado utilizar várias concentrações 
diferentes de fracção pós-mitocondrial. Para os corantes azóicos para os compostos diazóicos, poderá ser mais indicado um sistema acti ­
vação metabólica redutor (6) (13).
 
1.5.1.4.  Substância em estudo/preparação  
As substâncias sólidas devem ser dissolvidas ou suspensas em sol ­
ventes ou veículos adequados e, se necessário, diluídas antes da 
exposição das bactérias. As substâncias líquidas podem ser adicio ­
nadas directamente aos sistemas em estudo e/ou diluídas antes de serem adicionadas às células. Devem ser utilizadas preparações fres ­
cas da substância em estudo, a menos que os dados de estabilidade 
demonstrem que o respectivo armazenamento não coloca problemas para o ensaio.
 
O solvente/veículo não deve reagir com a substância em estudo, 
devendo ser compatível com a sobrevivência das células e com a 
actividade da mistura S9. Caso se utilizem solventes/veículos cujas 
propriedades não se encontrem totalmente elucidadas, devem forne ­
cer-se dados que justifiquem a sua compatibilidade. Sempre que possível, recomenda-se a utilização de solventes/veículos aquosos. 
Quando forem realizados ensaios de substâncias instáveis na pre ­
sença de água, os solventes orgânicos utilizados devem ser anidros.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 340
 
1.5.2.  Condições do ensaio  
1.5.2.1.  Estirpes (ver 1.5.1.1)  
1.5.2.2.  Concentração de exposição  
A citotoxidade e a solubilidade na mistura final constituem alguns 
dos critérios a ter em conta na determinação da maior quantidade da 
substância em estudo a utilizar.  
Poderá ser útil determinar a toxicidade e insolubilidade através de 
uma experiência preliminar. A citotoxicidade pode ser detectada pela 
redução do número de colónias com mutação reversa, pela presença de colónias mais claras ou de menores dimensões ou pelo grau de 
sobrevivência das culturas expostas. A citotoxidade de uma subs ­
tância pode variar na presença de sistemas de activação metabólicos. A insolubilidade deve ser avaliada em função da precipitação veri ­
ficável a olho nu na mistura final nas condições reais do ensaio.
 
A concentração máxima de ensaio recomendada para substâncias 
solúveis não citotóxicas é de 5 mg/placa ou de 5 μl/placa. Para as 
substâncias não citotóxicas insolúveis a 5 mg/placa ou a 5 μl/placa, 
uma ou mais das concentrações ensaiadas devem ser insolúveis na 
mistura final. As substâncias de ensaio citotóxicas abaixo dos 5 mg/ ­
placa ou 5 μl/placa devem ser ensaiadas até uma concentração cito ­
tóxica. O precipitado não deve interferir com a contagem.  
Numa experiência inicial devem ser utilizadas pelo menos cinco 
concentrações analisáveis diferentes da substância em estudo, com intervalos aproximadamente semilogarítmicos (ou seja, √10) entre as 
concentrações. Para a investigação da relação concentração-resposta 
poderão ser indicados intervalos menores. Poderá ser contemplada a possibilidade de ensaiar concentrações superiores a 5 mg/placa ou 5 μl/placa quando se pretender avaliar substâncias que contenham 
quantidades substanciais de impurezas potencialmente mutagénicas.
 
1.5.2.3.  Controlos negativos e positivos  
Cada experiência deve incluir em paralelo controlos positivos e ne ­
gativos (solvente ou veículo) específicos para cada estirpe, devendo, para os controlos positivos, ser escolhidas concentrações que de ­
monstrem o desempenho eficaz de cada ensaio.
 
Para os ensaios com utilização de um sistema de activação metabó ­
lica, a substância de referência para os controlos positivos deve ser 
seleccionada com base no tipo de estirpe de bactéria utilizada.  
As seguintes substâncias são exemplos de controlos positivos apro ­
priados para os ensaios com activação metabólica:  
Substância Número CAS Número EINECS  
9,10-dimetilantraceno 781-43-1 212-308-4 
7,12-dimetilbenzo[a]antraceno 57-97-6 200-359-5 
benzo[a]pireno 50-32-8 200-028-5 
2-aminoantraceno 613-13-8 210-330-9  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 341
 
Substância Número CAS Número EINECS  
ciclofosfamida 50-18-0 200-015-4 
ciclofosfamida monohidrato 6055-19-2  
A seguinte substância é um controlo positivo apropriado para o 
método de activação metabólico redutor:  
Substância Número CAS Número EINECS  
vermelho do Congo 573-58-0 209-358-4  
O 2-aminoantraceno não deve ser utilizado como único indicador da 
eficácia da mistura S9. Se essa substância for utilizada, cada lote S9 deve ser igualmente caracterizado com um agente mutagénico que exija activação metabólica por enzimas microssómicos, como por 
exemplo o benzo[a]pireno ou o dimetilbenzo[a]an-traceno.
 
As seguintes substâncias são exemplos de controlos positivos espe ­
cíficos apropriados para cada estirpe, adequados para os ensaios sem 
utilização de um sistema exógeno de activação metabólica:  
Substância Número CAS Número EINECS Estirpe  
nitrito de sódio 26628-22-8 247-852-1 TA 1535 e TA 100 
2-nitrofluoreno 607-57-8 210-138-5 TA 98 
9-aminoacridina 90-45-9 201-995-6 TA 1537, TA 97 e TA 97A 
ICR 191 17070-45-0 241-129-4 TA 1537, TA 97 e TA 97A 
hidroperóxido de 
isopropilbenzeno 80-15-9 201-254-7 TA 102 
mitomicina C 50-07-7 200-008-6 WP2 uvrA e TA 102 
N-etil-N-nitro-N- 
-nitrosoguanidina 70-25-7 200-730-1 WP2, WP2 uvrA e WP2 uvrA 
(pKM101) 
4-nitroquinolina-l- 
-óxido 56-57-5 200-281-1 WP2, WP2 uvrA e WP2 uvrA 
(pKM101) 
furilfuramida 
(AF2) 3688-53-7 estirpes com plasmídeos  
Podem utilizar-se no controlo positivo outras substâncias adequadas. 
A possibilidade de utilização de produtos químicos de uma classe afim para o controlo positivo deve ser considerada, quando existam.
 
Devem também realizar-se controlos negativos, consistindo apenas 
em solvente ou veículo e sem a substância em estudo, que serão 
sujeitos exactamente ao mesmo procedimento que os grupos expos ­
tos. Além disso, devem igualmente ser utilizados controlos não ex ­
postos à substância em estudo, a menos que existam dados históricos 
de controlo que demonstrem que o solvente escolhido não induz 
qualquer efeito deletério ou mutagénico.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 342
 
1.5.3.  Procedimento  
Para o método de incorporação em placas (1) (2) (3) (4) sem acti ­
vação metabólica, utilizam-se geralmente 0,05 ml ou 0,1 ml da so ­
lução de ensaio, 0,1 ml de cultura bacteriana fresca (aproximada ­
mente 10  8 células viáveis) e 0,5 ml de tampão estéril, que são 
misturados com 2,0 ml de gelose de cobertura. Para o ensaio com activação metabólica, utilizam-se geralmente 0,5 ml de mistura de activação metabólica, que contém uma quantidade adequada de frac ­
ção pós-mitocondrial (entre 5 % a 30 % v/v na mistura de activação 
metabólica), misturada com a gelose de cobertura (2,0 ml), as bac ­
térias e a substância em estudo/solução de ensaio. O conteúdo de 
cada tubo é misturado e deitado sobre uma placa de meio mínimo de 
gelose. A gelose de cobertura deve solidificar antes da incubação.
 
No método com incubação prévia (2) (3) (5) (6), a substância em 
estudo/solução de ensaio é previamente incubada com a estirpe de ensaio (aproximadamente 10
 8 células viáveis) e o tampão estéril ou o 
sistema de activação metabólica (0,5 ml), geralmente durante 
20 minutos ou mais a 30-37  o C, antes de ser misturada com a gelose 
de cobertura e deitada sobre uma placa com meio mínimo de gelose. Normalmente, são utilizados 0,05 ou 0,1 ml da substância em estudo/solução de ensaio, 0,1 ml de cultura bacteriana e 0,5 ml da 
mistura S9 ou de tampão estéril, misturados com 2,0 ml de gelose de 
cobertura. Os tubos devem ser arejados durante a pré-incubação, utilizando o agitador.
 
Para uma avaliação adequada da variação, devem ser utilizadas pla ­
cas em triplicado para cada dose. A utilização de placas em dupli ­
cado é aceitável, desde que seja justificada cientificamente. A perda 
ocasional de uma placa não invalida necessariamente o ensaio.  
As substâncias gasosas ou voláteis devem ser ensaiadas por métodos 
apropriados, por exemplo em recipientes selados (12) (14) (15) (16).  
1.5.4.  Incubação  
Todas as placas de cada ensaio devem ser incubadas a 37  o C durante 
48-72 horas. Após a incubação, contam-se as colónias com mutação 
reversa em cada placa.  
2. DADOS  
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS  
Os dados devem ser apresentados sob a forma do número de coló ­
nias com mutação reversa por placa. O número de colónias com 
mutação reversa nas placas de controlo negativas (controlo do sol ­
vente e, se tiver sido utilizado, controlo não exposto) e positivas deve também ser apresentado. As contagens individuais das placas, 
o número médio de colónias com mutação reversa por placa e o 
respectivo desvio-padrão devem ser apresentados para a substância em estudo e para os controlos positivos e negativos (não expostos à substância em estudo e/ou solvente).
 
Não há nenhuma exigência concreta para a verificação de uma res ­
posta positiva clara. Os resultados ambíguos devem ser melhor es ­
clarecidos, de preferência com modificação das condições experi ­
mentais. Os resultados negativos têm de ser confirmados caso a caso. Nos casos em que a confirmação dos resultados negativos não seja considerada necessária, deve ser apresentada uma justificação. Para a 
realização de experiências adicionais, deve ser analisada a possibili ­
dade de modificação dos parâmetros do estudo, por forma a aumen ­
tar a gama de condições avaliadas. Os parâmetros que podem even ­
tualmente ser alterados incluem a gama de concentrações, o método 
de tratamento (incorporação em placas ou pré-incubação em meio 
líquido) e as condições de activação metabólica.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 343
 
2.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS  
Há diversos critérios para determinar um resultado positivo, tais 
como um aumento do número de colónias por placa com mutação reversa em pelo menos uma estirpe, com ou sem sistema de activa ­
ção metabólico, que esteja relacionado com a concentração na gama 
ensaiada e/ou que seja reprodutível numa ou mais das concentrações ensaiadas (23). Deve ser tomada em consideração, antes de mais, a importância biológica dos resultados. Como auxílio para a avaliação 
dos resultados dos ensaios, poderão ser utilizados métodos estatísti ­
cos (24). Contudo, a significância estatística não deve ser o único elemento de determinação para uma resposta positiva.
 
Uma substância cujos resultados não cumpram os critérios acima 
indicados no presente ensaio é considerada não mutagénica.  
Embora a maioria de experiências tenha resultados claramente posi ­
tivos ou negativos, em casos raros o conjunto dos dados não per ­
mitirá que se obtenha uma opinião inequívoca sobre a actividade da substância em estudo, podendo acontecer que os resultados conti ­
nuem a ser ambíguos ou duvidosos independentemente do número 
de vezes que a experiência seja repetida.
 
Um resultado positivo no ensaio de mutação reversa bacteriana in ­
dica que a substância induz mutações pontuais por substituição das 
bases ou por deslocação do quadro de leitura no genoma de  Salmon­
das typhimurium  e/ou  Escherichia coli.  Um resultado negativo indica 
que, nas condições do ensaio, a substância não é mutagénica para as espécies ensaiadas.
 
3. APRESENTAÇÃO DE RELATÓRIOS  
RELATÓRIO DE ENSAIO  
O relatório de ensaio deve incluir a seguinte informação:  
Solvente/veículo:  
— justificação para a escolha do solvente/veículo,  
— solubilidade e estabilidade da substância em estudo no solvente/ ­
veículo, se conhecida.  
Estirpes:  
— estirpes usadas,  
— número de células por cultura,  
— características da estirpe.  
Condições de ensaio:  
— quantidade da substância em estudo por placa (mg/placa ou μl/­
placa), com justificação da escolha da dose e do número de placas preparadas por concentração,
 
— meios utilizados,  
— tipo e composição do sistema de activação metabólica, incluindo 
critérios de aceitabilidade,  
— protocolo do tratamento.  
Resultados:  
— sinais de toxicidade,  
— sinais de precipitação,  
— contagens individuais das placas,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 344
 
— número médio de colónias com mutação reversa por placa e 
respectivo desvio-padrão,  
— relação dose-resposta, quando seja possível de determinar,  
— análise estatística, quando tenha sido realizada,  
— dados relativos aos controlos negativo (solvente/veículo) e posi ­
tivo realizados em paralelo com o ensaio, com as respectivas gamas, valores médios e desvios-padrão,
 
— dados históricos relativos aos controlos negativo (solvente/ ­
veículo) e positivo realizados em paralelo com o ensaio, com as respectivas gamas, valores médios e desvios-padrão.
 
Discussão dos resultados.  
Conclusões.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki E., (1975) Methods for 
Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ ­
Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 
31, p. 347-364.  
(2) Maron, D.M. and Ames, B.N., (1983) Revised Methods for the 
Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, p. 173-215.  
(3) Gatehouse, D., Haworth, S., Cebula, T., Gocke, E., Kier, L., 
Matsushima, T., Melcion, C., Nohmi, T., Venitt, S. and Zeiger, 
E., (1994) Recommendations for the Performance of Bacterial Mutation Assays. Mutation Res., 312, p. 217-233.
 
(4) Kier, L.D., Brusick D.J., Auletta, A.E., Von Halle, E.S., 
Brown, M.M., Simmon, V.F., Dunkel, V., McCann, J., Mor ­
telmans, K., Prival, M., Rao, T.K. and Ray V., (1986) The  
Salmonella typhimurium /Mammalian Microsomal Assay: A 
Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 168, p. 69-240.
 
(5) Yahagi, T., Degawa, M., Seino, Y.Y., Matsushima, T., Nagao, 
M., Sugimura, T. and Hashimoto, Y., (1975) Mutagenicity of Carcinogen Azo Dyes and their Derivatives, Cancer Letters, 1, 
p. 91-96.
 
(6) Matsushima, M., Sugimura, T., Nagao, M., Yahagi, T., Shirai, 
A. and Sawamura, M., (1980) Factors Modulating Mutageni ­
city Microbial Tests. In: Short-term Test Systems for Detecting Carcinogens. Ed. Norpoth K.H. and Garner, R.C., Springer, Berlin-Heidelberg-New York. p. 273-285.
 
(7) Gatehouse, D.G., Rowland, I.R., Wilcox, P., Callender, R.D. 
and Foster, R., (1980) Bacterial Mutation Assays. In: Basic 
Mutagenicity Tests: UKEMS Part 1 Revised. Ed. D.J. Kirk ­
land, Cambridge University Press, p. 13-61.  
(8) Aeschacher, H.U., Wolleb, U. and Porchet, L., (1987) Liquid 
Preincubation Mutagenicity Test for Foods. J. Food Safety, 8, p. 167-177.
 
(9) Green, M.H.L., Muriel, W.J. and Bridges, B.A., (1976) Use of 
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(10) Hubbard, S.A., Green, M.H.L., Gatehouse, D. and J.W. Brid ­
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-New York-Oxford, p. 141-161.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 345
 
(11) Thompson, E.D. and Melampy, P.J., (1981) An Examination 
of the Quantitative Suspension Assay for Mutagenesis with 
Strains of  Salmonella typhimurium . Environmental Mutagene ­
sis, 3, p. 453-465.  
(12) Araki, A., Noguchi, T., Kato, F. and T. Matsushima (1994) 
Improved Method for Mutagenicity Testing of Gaseous Com ­
pounds by Using a Gas Sampling Bag. Mutation Res., 307, p. 335-344.
 
(13) Prival, M.J., Bell, S.J., Mitchell, V.D., Reipert, M.D. and 
Vaughn, V.L., (1984) Mutagenicity of Benzidine and Benzidi ­
ne-Congener Dyes and Selected Monoazo Dyes in a Modified 
Salmonella Assay. Mutation Res., 136, p. 33-47.  
(14) Zeiger, E., Anderson, B.E., Haworth, S., Lawlor, T. and Mor ­
telmans, K., (1992) Salmonella Mutagenicity Tests. V. Results 
from the Testing of 311 Chemicals. Environ. Mol. Mutagen., 
19, p. 2-141.  
(15) Simmon, V., Kauhanen, K. and Tardiff, R.G., (1977) Mutage ­
nic Activity of Chemicals Identified in Drinking Water. In 
Progress in Genetic Toxicology, D. Scott, B. Bridges and F. 
Sobels (Eds.) Elsevier, Amsterdam, p. 249-258.  
(16) Hughes, T.J., Simmons, D.M., Monteith, I.G. and Claxton, 
L.D., (1987) Vaporisation Technique to Measure Mutagenic 
Activity of Volatile Organic Chemicals in the Ames/ ­
Salmonella Assay. Environmental Mutagenesis, 9, p. 421-441.  
(17) Matsushima, T., Matsumoto, A., Shirai, M., Sawamura, M., 
and Sugimura, T., (1979) Mutagenicity of the Naturally Oc ­
curring Carcinogen Cycasin and Synthetic Methylazoxy Met ­
hane Conjugates in  Salmonella typhimurium . Cancer Res., 39, 
p. 3780-3782.  
(18) Tamura, G., Gold, C., Ferro-Luzzi, A. and Ames, B.N., (1980) 
Fecalase: A Model for Activation of Dietary Glycosides to 
Mutagens by Intestinal Flora. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 
77, p. 4961-4965.  
(19) Wilcox, P., Naidoo, A., Wedd, D.J. and Gatehouse, D.G., (1990) 
Comparison of  Salmonella typhimurium  TA 102 with  Escheri­
chia coli  WP2 Tester strains. Mutagenesis, 5, p. 285-291.  
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T., 
(1976) A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an 
Inducer or Metabolic Activation Systems. In: « In vitro  meta­
bolic Activation in Mutagenesis Testing» Eds. F.J. de Serres et al. Elsevier, North Holland, p. 85-88.
 
(21) Elliot, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., 
Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C., (1992) Alterna ­
tives to Aroclor 1254-induced S9 in  in vitro  Genotoxicity As ­
says. Mutagenesis, 7, p. 175-177.  
(22) Maron, D., Katzenellenbogen, J. and Ames, B.N., (1981) Com ­
patibility of Organic Solvents with the Salmonella/Microsome 
Test. Mutation Res., 88, p. 343-350.  
(23) Claxton, L.D., Allen, J., Auletta, A., Mortelmans, K., Nes ­
tmann, E. and Zeiger, E., (1987) Guide for the  Salmonella 
typhimurium /Mammalian Microsome Tests for Bacterial Muta ­
genicity. Mutation Res. 189, p. 83-91.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 346
 
(24) Mahon, G.A.T., Green, M.H.L., Middleton, B., Mitchell, I., 
Robinson, W.D. and Tweats, D.J., (1989) Analysis of Data 
from Microbial Colony Assays. In: UKEMS Sub-Committee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Part II. Statistical Eva ­
luation of Mutagenicity Test Data. Ed. Kirkland, D.J., Cam ­
bridge University Press, p. 28-65.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 347
 
B.15.  TESTES DE MUTAGÉNESE E DESPISTE DE 
CARCINOGÉNESE MUTAÇÃO GÉNICA —  
SACCHAROMYCES CEREV1SIAE  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
1.2. DEFINIÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Nenhuma.  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Podem utilizar-se várias estirpes haplóides e diplóides do fungo  Sac­
charomyces Cerevisiae  para medir a produção de mutações génicas 
induzidas por agentes químicos em presença e na ausência de acti ­
vação metabólica.  
A medição de «mutações  forward » (forward mutations ) pode ser 
realizada nomeadamente pela medição da passagem dos mutantes 
vermelhos que exigem adenina ( ade-1, ade -2) para uma forma 
branca duplamente exigente em adenina, assim como por sistemas selectivos como a indução de resistência à canavanina e à ciclohe ­
ximida.
 
O método de mutação reversível mais frequentemente utilizado im ­
plica a utilização da estirpe haplóide XV 185-14C que inclui as mutações  nonsense  ocre  ade 2-1,  arg 4-17,  lys 1-1 e  trp 5-48, que 
são reversíveis por mutagénios que provoquem substituições de ba ­
ses induzindo mutações num  locus  específico ou mutações supressi ­
vas ocre. A estirpe XV 185-14C inclui igualmente o marcador  his 1- 
-7, uma mutação  nonsense , principalmente reversível pelas mutações 
de segundo  locus  e ainda o marcador  hom  3-10 que é reversível por 
mutagénios conduzindo à ultrapassagem do quadro de leitura do código genético ( Frameshift Mutation ).
 
Das estirpes diplóides de  S. Cerevisiae , a única cujo uso está gene ­
ralizado é a estirpe D  7 que é homozigótica para  ilv 1-92.  
1.5. CRITÉRIOS QUALITATIVOS  
Nenhum.  
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Preparativos  
As soluções das substâncias a testar bem como as das substâncias de 
controlo serão preparadas imediatamente antes do ensaio, com a 
ajuda de um veículo apropriado. Quando se tratar de substâncias 
orgânicas não solúveis na água, deverão ser utilizados os solventes orgânicos como o etanol, a acetona ou o dimetilsulfóxido (DMSO) numa concentração não ultrapassando 2 % v/v. A concentração final 
do veículo não deve afectar de forma significativa a viabilidade das 
células nem as características de crescimento.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 348
 
A c t i v a ç ã o m e t a b ó l i c a  
As células deverão ser expostas às substâncias a testar na presença e 
na ausência de um sistema exógeno de activação metabólica apro ­
priado.  
O método mais frequentemente utilizado consiste na adição da frac ­
ção pós-mitocondrial preparada a partir de fígados de roedores tra ­
tados previamente por indutores enzimáticos e adicionada de co- 
-factores. Podem utilizar-se também outras espécies, tecidos, fracções 
pós-mitocondriais ou métodos para a activação metabólica.  
Condições do ensaio  
E s t i r p e s d e e x p e r i ê n c i a  
A estirpe haplóide XV 185-14C e a estirpe diplóide D  7 são as mais 
frequentemente utilizadas em estudos de mutação génica. Podem 
também ser apropriadas outras estirpes.  
M e i o s  
Utilizam-se meios de cultura apropriados para determinar a sobrevida 
celular e o número de mutantes.  
U s o d e c o n t r o l o s n e g a t i v o s e p o s i t i v o s  
Deverão ser realizados simultaneamente controlos positivos, contro ­
los não tratados e controlos com solvente. Serão utilizadas substân ­
cias químicas apropriadas como controlos positivos para cada fenó ­
meno mutacional específico.  
C o n c e n t r a ç õ e s d e e x p o s i ç ã o  
Deverão ser utilizados pelo menos cinco concentrações conveniente ­
mente espaçadas da substância a testar. No caso de substâncias tó ­
xicas a concentração máxima testada não deverá diminuir a taxa de sobrevida abaixo de 5 % a 10 %. As substâncias relativamente insolúveis na água serão testadas até ao seu limite de solubilidade 
com métodos apropriados. No caso das substâncias não tóxicas fran ­
camente solúveis na água a concentração máxima será determinada caso a caso.
 
C o n d i ç õ e s d e i n c u b a ç ã o  
Devem incubar-se as placas no escuro à temperatura de 28-30  o C 
durante quatro a sete dias.  
F r e q u ê n c i a s d e m u t a ç õ e s e s p o n t â n e a s  
Serão utilizadas as subculturas cujas frequências de mutação espon ­
tânea estejam situadas dentro dos limites normais admitidos.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 349
 
N ú m e r o d e p l a c a s  
Deverão utilizar-se pelo menos três placas por concentração para 
determinar os prototróficos produzidos por mutação génica e obser ­
var a viabilidade das células. No caso de experiências usando mar ­
cadores com uma pequena taxa de mutação como o  hom  3-10, pode 
aumentar-se o número de placas utilizado para fornecer dados esta ­
tisticamente significativos.  
Procedimento  
As estirpes de  S. Cerevisiae  são tratadas habitualmente no curso dum 
ensaio em meio líquido, implicando a utilização de células em fase 
estacionária ou de crescimento. As experiências iniciais deveriam ser efectuadas com células em crescimento. Expõem-se à substância a testar 1-5 × 10 células/ml durante um período até 18 horas, à tem ­
peratura de 28-37
 o C, agitando-se a mistura; deve adicionar-se uma 
quantidade adequada dum sistema de activação metabólica durante o tratamento. No fim do tratamento as células serão centrifugadas, lavadas, e semeadas num meio de cultura apropriado. Depois da 
incubação as placas serão examinadas para se determinar a taxa de 
sobrevida e a indução de mutações génicas. Se a primeira experiên ­
cia der resultados negativos deve realizar-se segunda, utilizando-se células em fase estacionária. Se a primeira experiência der resultados 
positivos, estes serão confirmados por uma experiência independente 
apropriada.
 
2. RESULTADOS  
Os resultados devem ser apresentados em quadros, indicando o nú ­
mero de colónias contadas, o número de mutantes, a taxa de sobre ­
vida e a frequência de mutantes. Todos os resultados deverão ser 
confirmados por uma experiência independente. Os resultados deve ­
rão ser avaliados com métodos estatísticos adequados.  
3. RELATÓRIO  
3.1. RELATÓRIO DO TESTE  
O relatório do teste deverá incluir as seguintes informações:  
— estirpe utilizada,  
— condições do teste: células em fase estacionária ou de crescimen ­
to, composição dos meios, temperatura e duração da incubação, sistema de activação metabólica,
 
— condições do tratamento: níveis de exposição, procedimento e 
duração do tratamento, temperatura do tratamento, controlos po ­
sitivos e negativos,  
— número de colónias contadas, número de mutantes, taxa de so ­
brevida e frequência de mutantes, relação dose/resposta se pos ­
sível, avaliação estatística dos resultados.  
3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
4. REFERÊNCIAS  
Ver Introdução Geral, parte B.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 350
 
B.16.  RECOMBINAÇÃO MITÓTICA —  SACCHAROMYCES 
CEREVISIAE  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
1.2. DEFINIÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Nenhuma.  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
A recombinação mitótica no  Saccharomyces Cerevisiae  pode ser 
detectada ao nível intergénico (ou mais generalizadamente entre um gene e o seu centrómero) e ao nível intragénico. O primeiro caso denomina-se  crossing-over  mitótico e dá origem a trocas recí ­
procas, enquanto no segundo caso as trocas são não recíprocas a 
maior parte das vezes, sendo este denominado conversão génica. O  
crossing-over  é geralmente detectado pela produção de colónias ou 
de sectores recessivos homozigóticos a partir de uma estirpe hetero ­
zigótica, enquanto a conversão génica é detectada pela produção de prototróficos revertidos de uma estirpe auxotrófica heteroalélica con ­
tendo dois alelos defeituosos diferentes do mesmo gene. As estirpes 
mais correntemente utilizadas para detectar uma conversão génica 
mitótica são as D
 4 (heteroalélica para  ade 2 e trp 5), D  7 (heteroalé ­
lica para  trp 5), BZ  34 (heteroalélica para  arg 4) e JD1 (heteroalélica 
para his 4 e  trp 5 ). O crossing-over  mitótico produzindo sectores 
homozigóticos de cor vermelha e rosa pode ser determinado com D  5 
ou D  7 (que mede também a conversão génica mitótica e a mutação 
reversível para  ilv 1-92), sendo estas duas estirpes heteroalélicas 
complementares para os alelos  ade 2.  
1.5. CRITÉRIOS QUALITATIVOS  
Nenhum.  
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DO ENSAIO  
Preparativos  
As soluções das substâncias a testar assim como das substâncias de 
controlo ou de referência deverão ser preparadas imediatamente antes do ensaio, com a ajuda do veículo apropriado. No caso de subs ­
tâncias orgânicas insolúveis na água deverão utilizar-se solventes 
orgânicos como o etanol, a acetona e o dimetilsulfóxido (DMSO), em concentrações não ultrapassando 2 % v/v. A concentração final do veículo não deverá afectar de maneira significativa a viabilidade 
das células nem as características de crescimento.
 
A c t i v a ç ã o m e t a b ó l i c a  
As células serão expostas às substâncias a testar na presença e na 
ausência de um sistema exógeno de activação metabólica. O método 
mais frequentemente utilizado consiste na adição da fracção pós- -mitocondrial preparada a partir de fígados de roedores tratados pre ­
viamente com indutores enzimáticos e adicionada de co-factores. 
Podem também utilizar-se outras espécies, tecidos, fracções pós-mi ­
tocondriais ou métodos para activação metabólica.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 351
 
Condições do ensaio  
E s t i r p e s d e e x p e r i ê n c i a  
As estirpes mais frequentemente utilizadas são as diplóides D  4 , D 5 , 
D 7 e JDl. Podem também ser apropriadas outras estirpes.  
M e i o s  
Utilizam-se os meios de cultura apropriados para determinar a taxa 
de sobrevida e a frequência de recombinações mitóticas.  
U s o d e c o n t r o l o s n e g a t i v o s e p o s i t i v o s  
Deverão ser realizados simultaneamente controlos positivos, contro ­
los não tratados e controlos com solvente. Serão utilizadas substân ­
cias químicas apropriadas como controlos positivos para cada tipo 
específico de recombinação.  
C o n c e n t r a ç õ e s d e e x p o s i ç ã o  
Deverão ser utilizadas pelo menos cinco concentrações conveniente ­
mente espaçadas da substância a testar. A citotoxicidade e a solubi ­
lidade são alguns dos factores a ter em consideração. A concentração mais fraca não deve ter qualquer efeito na viabilidade das células. No caso de produtos químicos tóxicos, a concentração máxima tes ­
tada não deve diminuir a taxa de sobrevida abaixo de 5 % a 10 %. 
Os produtos químicos relativamente insolúveis na água serão testa ­
dos até ao seu limite de solubilidade por métodos apropriados. No caso de produtos químicos não tóxicos, francamente solúveis 
na água, a concentração máxima testada será determinada caso a 
caso.
 
As células podem ser expostas às substâncias a testar em fase esta ­
cionária ou em fase de crescimento durante períodos de duração até 18 horas. No entanto, no caso de um tratamento de longa duração, as culturas serão examinadas ao microscópio para se detectar a forma ­
ção de esporos, cuja presença tornará o teste nulo.
 
C o n d i ç õ e s d e i n c u b a ç ã o  
As placas serão incubadas no escuro a uma temperatura de 28-30  o C, 
durante quatro a sete dias. As placas utilizadas para a determinação 
dos sectores homozigóticos vermelho e rosa produzidos por  cros­
sing-over  mitótico serão conservadas num refrigerador a ± 4  o C 
durante mais um a dois dias antes da contagem, de modo a que a 
pigmentação das colónias interessadas possa intensificar-se.  
F r e q u ê n c i a d e r e c o m b i n a ç õ e s m i t ó t i c a s e s p o n t â ­
n e a s  
Deverão utilizar-se subculturas cujas frequências de recombinação 
mitótica se situem dentro da gama admitida normalmente.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 352
 
N ú m e r o d e p l a c a s  
Deverão ser semeadas pelo menos três placas por concentração a fim 
de determinar a viabilidade bem como o número de prototróficos produzidos por conversão génica mitótica. No caso de determinação da homozigotia recessiva produzida por  crossing-over  mitótico, o 
número de placas será aumentado para se obter um número de 
colónias adequado.
 
Procedimento  
As estirpes de  S. Cerevisiae  são tratadas habitualmente no curso de 
um ensaio em meio líquido, implicando a utilização de células em fase estacionária ou de crescimento. As experiências iniciais deve ­
riam ser efectuadas com células em crescimento. São expostas 1-5 × 
10
 7 células/ml à substância a testar durante um período até 18 horas, 
à temperatura de 28-37  o C, agitando-se a mistura; deve adicionar-se 
uma quantidade adequada de um sistema de activação metabólica durante o tratamento.
 
No fim do tratamento as células serão centrifugadas, lavadas e se ­
meadas no meio de cultura adequado. Depois da incubação, as placas serão examinadas a fim de determinar a taxa de sobrevida e a in ­
dução de recombinação mitótica.
 
Se a primeira experiência der resultados negativos deve realizar-se 
segunda, utilizando-se células em fase estacionária. Se a primeira 
experiência der resultados positivos, estes serão confirmados por uma experiência independente apropriada.
 
2. RESULTADOS  
Os resultados devem ser apresentados em quadros, indicando o nú ­
mero de colónias contadas, o número de recombinantes, a taxa de 
sobrevida e a frequência de recombinantes.  
Todos os resultados deverão ser confirmados por uma experiência 
independente.  
Os resultados deverão ser avaliados com métodos estatísticos ade ­
quados.  
3. RELATÓRIO  
3.1. RELATÓRIO DO TESTE  
O relatório do teste deverá incluir as informações seguintes:  
— estirpe utilizada,  
— condições do teste: células em fase estacionária ou em fase de 
crescimento, composição dos meios, temperatura e duração da 
incubação, sistema de activação metabólica,  
— condições de tratamento: concentração de exposição, procedi ­
mento e duração do tratamento, temperatura do tratamento, con ­
trolos positivos e negativos,  
— número de colónias contadas, número de recombinantes, taxa de 
sobrevida e frequência de recombinação, relação dose/resposta se 
possível; avaliação estatística dos resultados,  
— discussão dos resultados,  
— interpretação dos resultados.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 353
 
3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
4. REFERÊNCIAS  
Ver Introdução Geral, parte B.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 354
 
B.17.  MUTAGENICIDADE — ENSAIO DE MUTAÇÃO GÉNICA EM 
CÉLULAS DE MAMÍFEROS  IN VITRO  
1. MÉTODO  
O presente método é idêntico ao método OCDE TG 476 — Ensaio 
de mutação génica de mamíferos  in vitro  (1997).  
1.1. INTRODUÇÃO  
O ensaio de mutação génica em células de mamíferos  in vitro  pode 
ser utilizado para detectar mutações génicas induzidas por substân ­
cias químicas. As linhas celulares que podem ser utilizadas incluem as células L5178Y do linfoma do rato, as linhas celulares CHO, CHO-AS52 e V79 do  hamster  chinês e as células linfoblastóides 
humanas TK6 (1). Nessas linhas celulares, os pontos finais genéticos 
mais utilizados são as mutações da timidina quinase (TK), da hipo ­
xantina-guanina fosforibosil transferase (HPRT) e do transgene de xan-tina-guanina fosforibosil transferase (XPRT). Os ensaios de mu ­
tação TK, HPRT e XPRT detectam diferentes gamas de ocorrências 
genéticas. A localização autossómica das mutações TK e XPRT pode permitir a detecção de ocorrências genéticas (por exemplo, supressão de grandes sequências) que não são detectadas no  locus  HPRT nos 
cromossomas X (2) (3) (4) (6).
 
No ensaio de mutação génica em células de mamíferos  in vitro  
podem ser utilizadas culturas de qualquer linha celular ou estirpe de características bem conhecidas. As células utilizadas são seleccio ­
nadas com base na sua capacidade de desenvolvimento em cultura e 
na estabilidade da frequência das mutações espontâneas.
 
Os ensaios realizados  in vitro  exigem geralmente a utilização de uma 
fonte exógena de activação metabólica. Os sistemas de activação metabólicos  in vitro  não reproduzem inteiramente as condições  in 
vivo nos mamíferos. Devem portanto ser evitadas condições que 
conduzam a resultados que não reflectem uma mutagenicidade in ­
trínseca. Os eventuais resultados positivos não resultantes de muta ­
genicidade intrínseca podem ser causados por alterações do pH, da pressão osmótica ou por níveis elevados de citotoxicidade (7).
 
O presente ensaio é utilizado para o controlo de eventuais agentes 
mutagéneos e carcinogéneos em mamíferos. Embora muitos dos 
compostos que dão resultados positivos no presente ensaio sejam carcinogéneos para os mamíferos, essa correlação não é absoluta. Com efeito, a correlação depende da classe química e, por outro 
lado, há cada vez mais dados que provam que alguns agentes car ­
cinogéneos não são detectados no ensaio porque parecem actuar através de mecanismos não genotóxicos ou através de mecanismos ausentes nas células bacterianas (6).
 
Ver também a parte B da Introdução Geral.  
1.2. DEFINIÇÕES  
Mutação para diante:  mutação genética do tipo parental para a 
forma mutante que causa uma alteração ou perda de actividade en ­
zimática da função da proteína codificada.  
Mutagéneos por substituição de um par de bases:  substâncias que 
causam a substituição de um ou vários pares de bases do ADN.  
Mutagéneos por deslocação do quadro de leitura:  substâncias que 
causam a adição ou supressão de um par de bases ou de uma 
sequência de pares de bases do ADN.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 355
 
Período de expressão fenotípica:  período que decorre até que os 
produtos dos genes inalterados se esgotem nas células recentemente 
sujeitas a uma mutação.  
Frequência de mutação:  relação entre o número de células mutan ­
tes observadas e o número de células viáveis.  
Crescimento total relativo:  aumento no número de células por 
unidade de tempo, por comparação com uma população de controlo: calculado como o produto da relação entre o crescimento em sus ­
pensão e no controlo negativo com a relação entre a eficiência de 
clonagem em suspensão e no controlo negativo.
 
Crescimento relativo em suspensão:  relação entre o aumento no 
número de células durante o período de expressão em suspensão e no controlo negativo.
 
Viabilidade:  eficiência de clonagem das células expostas incubadas 
em placas, após o período de expressão, sob condições selectivas.  
Sobrevivência:  eficiência de clonagem das células expostas incuba ­
das em placas no fim do período de exposição; a sobrevivência é geralmente expressa em relação à sobrevivência da população celular de controlo.
 
1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
As células deficientes em timidina quinase (TK) devido à mutação 
TK± → TK± são resistentes aos efeitos citotóxicos do análogo de 
pirimidina da trifluorotimidina (TFT). As células que dispõem de 
timidina quinase são sensíveis ao TFT, que causa inibição do meta ­
bolismo celular e impede a divisão da célula. Logo, as células mu ­
tantes podem proliferar na presença de TFT, o que não acontece com 
as células normais, com timidina quinase. Da mesma forma, as cé ­
lulas carentes em HPRT ou XPRT são seleccionadas pela resistência à 6-tioguanina (TG) ou à 8-azaguanina (AG). As propriedades da substância em estudo devem ser cuidadosamente tomadas em consi ­
deração se o ensaio de mutação génica em células de mamíferos for 
utilizado para ensaiar uma substância análoga das bases ou um composto relacionado com o agente selectivo. Assim, por exemplo, deve ser investigada qualquer suspeita de toxicidade selectiva da 
substância em estudo para as células mutantes e não mutantes. Logo, 
o desempenho do sistema/agente selectivo deve ser confirmado quando se ensaiarem produtos químicos estruturalmente relacionados com o agente selectivo (8).
 
As células em suspensão ou em cultura em monocamada são expos ­
tas à substância em estudo tanto na presença como na ausência de 
um sistema de activação metabólica durante um período de tempo apropriado, sendo depois cultivadas para determinar a citotoxidade e para permitir a expressão fenotípica antes de seleccionar o mutante 
(9) (10) (11) (12) (13). A citotoxidade é geralmente determinada 
através da medição da eficiência relativa de clonagem (sobrevivên ­
cia) ou do crescimento total relativo das culturas após o período de exposição. As culturas expostas são mantidas em meio de cresci ­
mento durante um período de tempo suficiente, que varia em função 
do locus  seleccionado e do tipo de célula, por forma a permitir uma 
expressão fenotípica tão boa quanto possível das mutações induzidas. A frequência de mutação é determinada inoculando um número co ­
nhecido de células num meio com agente selectivo para as células 
mutantes e num meio sem agente selectivo, para determinação das respectivas eficiências de clonagem (viabilidade). Após um período de incubação apropriado, as colónias são contadas. A frequência de 
mutação é calculada a partir do número de colónias mutantes no 
meio selectivo e do número de colónias no meio não selectivo.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 356
 
1.4. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.4.1.  Preparação  
1.4.1.1.  Células  
O presente ensaio pode ser realizado com diversos tipos de células, 
nomeadamente subclones das células L5178Y, CHO, CHO-AS52, 
V79 ou TK6. Os tipos de célula utilizados no presente ensaio devem ter uma sensibilidade demonstrada a mutagéneos químicos, uma efi ­
ciência de clonagem elevada e uma frequência de mutação espontâ ­
nea estável. As células devem ser verificadas para detectar eventuais 
contaminações por microplasma, não devendo ser utilizadas se esti ­
verem contaminadas.
 
O ensaio deve ser concebido para ter uma determinada sensibilidade 
e definição. O número de células e de culturas e as concentrações da substância em estudo a utilizar serão reflexo dos parâmetros defini ­
dos (14). O número mínimo de células viáveis que devem sobreviver 
à exposição e ser utilizadas em cada fase do ensaio deve basear-se na frequência da mutação espontânea. A título indicativo, deve ser uti ­
lizado um número de células pelo menos dez vezes superior ao 
inverso da frequência de mutação espontânea, com um mínimo re ­
comendado de 10
 6 células. Para verificação da consistência do de ­
sempenho do ensaio, devem estar disponíveis dados históricos ade ­
quados sobre o sistema celular utilizado.  
1.4.1.2.  Meios e condições de cultura  
Devem ser utilizados meios de cultura e condições de incubação 
(recipientes, temperatura, CO  2 , concentração e humidade) apropria ­
dos. Os meios devem ser escolhidos de acordo com o sistema se ­
lectivo e com o tipo de células utilizados no ensaio. É particular ­
mente importante que sejam escolhidas condições de cultura que 
garantam o crescimento óptimo das células durante o período de expressão e a capacidade de formação de colónia por parte das células mutantes e não mutantes.
 
1.4.1.3.  Preparação das culturas  
As células são propagadas a partir de culturas de arranque, inocula ­
das no meio de cultura e incubadas a 37  o C. Antes da realização no 
presente ensaio, as culturas poderão ter de ser limpas de células 
mutantes eventualmente presentes.  
1.4.1.4.  Activação metabólica  
As bactérias devem ser expostas à substância em estudo tanto na 
presença como na ausência de um sistema adequado de activação metabólica. O sistema mais geralmente utilizado é uma fracção pós- 
-mitocondrial reforçada com co-factor (S9) preparada a partir de fí ­
gados de roedores tratados com agentes de indução enzimática, como por exemplo Aroclor 1254 (15) (16) (17) (18) ou uma mistura de fenobarbitona e  β-naftoflavona (19) (20).
 
A fracção pós-mitocondrial é geralmente utilizada em concentrações 
na gama de 1-10 % v/v no meio de ensaio final. A escolha e estado do sistema de activação metabólico podem depender da classe de 
produto químico em estudo. Em alguns casos, poderá ser apropriado 
utilizar mais de uma concentração de fracção pós-mitocondrial.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 357
 
Alguns desenvolvimentos, nomeadamente a produção por engenharia 
genética de linhas celulares que expressem enzimas de activação 
específicas, podem ter algum potencial em termos de activação en ­
dógena. A escolha das linhas celulares utilizadas deve ser cientifica ­
mente justificada (por exemplo, pela importância da isoenzima do 
citocromo P450 para o metabolismo da substância em estudo).  
1.4.1.5.  Substância em estudo/preparação  
As substâncias sólidas devem ser dissolvidas ou suspensas em sol ­
ventes ou veículos adequados e, se necessário, diluídas antes da exposição das células. As substâncias líquidas podem ser adicionadas directamente aos sistemas em estudo e/ou diluídas antes de serem 
adicionadas às células. Devem ser utilizadas preparações frescas da 
substância em estudo, a menos que os dados de estabilidade demons ­
trem que o respectivo armazenamento não coloca problemas para o ensaio.
 
1.4.2.  Condições de ensaio  
1.4.2.1.  Solvente/veículo  
O solvente/veículo não deve reagir com a substância em estudo, 
devendo ser compatível com a sobrevivência das células e com a actividade da mistura S9. Caso se utilizem solventes/veículos cujas propriedades não se encontrem totalmente elucidadas devem forne ­
cer-se dados que justifiquem a sua compatibilidade. Sempre que 
possível, recomenda-se a utilização de solventes/veículos aquosos. Quando forem realizados ensaios de substâncias instáveis na pre ­
sença de água, os solventes orgânicos utilizados devem ser anidros. 
A água poderá ser removida através de um filtro molecular.
 
1.4.2.2.  Concentrações de exposição  
A citotoxidade, a solubilidade no sistema de ensaio e as alterações 
do pH ou da pressão osmótica constituem alguns dos critérios a ter em conta na determinação de concentração máxima.
 
A citotoxidade deve ser determinada tanto na presença como na 
ausência de um sistema de activação metabólica na experiência prin ­
cipal, utilizando um indicador apropriado da integridade e cresci ­
mento das células, tal como a eficiência relativa de clonagem (so ­
brevivência) ou o crescimento relativo total. Poderá ser útil determi ­
nar a toxicidade e insolubilidade através de uma experiência preli ­
minar.  
Devem ser utilizadas pelo menos quatro concentrações analisáveis. 
Quando existir citotoxicidade, essas concentrações devem abranger uma gama de toxicidade que varie da toxicidade máxima a quase nula; o que significa geralmente que as concentrações devem variar 
num factor de 2 a √10. Se a concentração máxima for definida por 
razões de citotoxicidade, a sobrevivência relativa (eficiência relativa de clonagem) ou o crescimento relativo total devem ser da ordem dos 10 %-20 % (mas não inferiores a 10 %). Para as substâncias com 
citotoxidade relativamente baixa, a concentração máxima do ensaio 
deve ser a mais baixa de 5 mg/ml, 5 μl/ml ou 0,01 M.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 358
 
Para substâncias relativamente insolúveis a dose máxima a utilizar 
deve ser igual ou superior ao limite de solubilidade nas condições de 
cultura. A insolubilidade no meio final a que as células são expostas deve ser demonstrada. Poderá ser útil avaliar a solubilidade no início e no fim do tratamento, uma vez que a mesma se pode alterar 
durante a exposição no sistema de ensaio devido à presença de 
células, de S9, de soro, etc. A insolubilidade pode ser detectada à vista desarmada. O precipitado não deve interferir com as contagens necessárias.
 
1.4.2.3.  Controlos negativos e positivos  
Cada experiência deve incluir em paralelo controlos positivos e ne ­
gativos (solvente/veículo), tanto na presença como na ausência de um sistema de activação metabólica. Quando for utilizada activação 
metabólica, o produto químico de controlo positivo deve ser o 
mesmo que exige activação para dar uma resposta mutagénica.
 
As substâncias de controlo positivo podem ser, por exemplo:  
Condição de 
activação metabólica  Locus  Substância Número CAS Número EINECS  
Ausência de acti ­
vação metabólica exógena HPRT Metanossulfonato de etilo 62-50-0 200-536-7 
Etil nitrosureia 759-73-9 212-072-2 
TK (colónias 
pequenas e 
grandes) Metanossulfonato de metilo 66-27-3 200-625-0 
XPRT Metanossulfonato de etilo 62-50-0 200-536-7 
Etil nitrosureia 759-73-9 212-072-2 
Presença de acti ­
vação metabólica 
exógena HPRT 3-3-Metilcolantreno 56-49-5 200-276-4 
N-Nitrosodimetilamina 62-75-9 200-549-8 7,12-Dimetilbenzantraceno 57-97-6 200-359-5 
TK (colónias 
pequenas e 
grandes) Ciclofosfamida 50-18-0 200-015-4 
Ciclofosfamida monohidrato 6055-19-2 Benzo[a]pireno 50-32-8 200-028-5 3-3-Metilcolantreno 56-49-5 200-276-5 
XPRT N-n- Nitrosodimetilamina (níveis 
elevados de S 9) 62-75-9 200-549-8 
Benzo[a]pireno 50-32-8 200-028-5
 
Podem ser utilizadas outras substâncias de referência apropriadas 
para o controlo positivo. Assim, se um laboratório dispuser, por 
exemplo, de uma base de dados históricos sobre a utilização de 
5-bromo 2'-deoxiuridina (número CAS 59-14-3, número EINECS 200-415-9), essa substância de referência poderá também ser utiliza ­
da. Quando existam, deve ser analisada a possibilidade de utilizar 
produtos químicos de controlo positivos de classes químicas relacio ­
nadas.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 359
 
Devem também realizar-se controlos negativos, consistindo apenas 
em solvente ou veículo e sem a substância em estudo, que serão 
sujeitos exactamente ao mesmo procedimento que os grupos expos ­
tos. Além disso, devem igualmente ser utilizados controlos não ex ­
postos à substância em estudo, a menos que existam dados históricos 
de controlo que demonstrem que o solvente escolhido não induz 
qualquer efeito deletério ou mutagénico.  
1.4.3.  Procedimento  
1.4.3.1.  Exposição à substância em estudo  
As células em proliferação devem ser expostas à substância em 
estudo tanto na presença como na ausência de um sistema de acti ­
vação metabólica durante um período de tempo apropriado (três a seis horas é geralmente eficaz). O período de exposição pode ser alargado a um ou mais ciclos celulares.
 
Para cada concentração a ensaiar, podem ser utilizadas culturas ex ­
postas únicas ou em duplicado. Quando forem utilizadas culturas 
únicas, o número de concentrações deve ser aumentado, por forma 
a garantir um número de culturas adequado para a análise (por exemplo, pelo menos oito concentrações analisáveis). Devem tam ­
bém ser incluídas culturas de controlo negativas (solventes) duplica ­
das.
 
As substâncias gasosas ou voláteis devem ser ensaiadas por métodos 
apropriados, por exemplo em recipientes selados (21) (22).  
1.4.3.2.  Medição da sobrevivência, viabilidade e frequência de mutação  
No fim do período de exposição, as células são lavadas e cultivadas 
para determinar a sobrevivência e para permitir a expressão fenotí ­
pica das mutações. A medição de citotoxicidade através da determi ­
nação da eficiência relativa de clonagem (sobrevivência) ou do cres ­
cimento total relativo das culturas é geralmente iniciada após o pe ­
ríodo de exposição.  
Para cada  locus  há um tempo mínimo definido para permitir uma 
expressão fenotípica quase óptima das mutações recentemente indu ­
zidas (o HPRT e o XPRT exigem pelo menos de seis a oito dias e o 
TK pelo menos dois dias). As células são cultivadas em meios com presença e ausência do agente selectivo para determinação, respecti ­
vamente, do número de mutações e da eficiência de clonagem. A 
medição da viabilidade (utilizada para calcular a frequência de mu ­
tação) é iniciada no fim do período de expressão através de cultura em placas com meio não selectivo.
 
Se a substância em estudo der um resultado positivo no ensaio 
L5178Y TK  +/- , deve ser realizada uma medição do tamanho das 
colónias em pelo menos uma das culturas de ensaio (a concentração 
máxima com resultado positivo) e nos controlos negativos e positi ­
vos. Se a substância em estudo der um resultado negativo no ensaio L5178Y
 +/- , deve ser realizada uma medição do tamanho das colónias 
nos controlos negativos e positivos. Nos estudos que utilizem 
TK6TK  +/- a medição do tamanho das colónias poderá também ser 
realizada.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 360
 
2. DADOS  
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS  
Os dados devem incluir a determinação de citotoxicidade e da via ­
bilidade, para além da contagem das colónias e das frequências de 
mutação nas culturas expostas e nas culturas de controlo. No caso de 
um resultado positivo no ensaio L5178Y TK  +/- , as colónias devem 
ser contabilizadas utilizando o critério das colónias pequenas e gran ­
des em pelo menos uma das concentrações da substância em estudo 
(a concentração máxima com resultado positivo) e nos controlos 
negativos e positivos. A natureza molecular e citogénica das células mutantes que formam colónias grandes e pequenas já foi investigada 
em pormenor (23) (24). No ensaio TK
 +/- as colónias devem ser 
contabilizadas utilizando os critérios do crescimento normal (colónias grandes) e do crescimento lento (colónias pequenas) (25). As células mutantes que tenham sofrido danos genéticos mais extensos apresen ­
tam tempos de duplicação maiores, pelo que formam colónias mais 
pequenas. Esses danos variam tipicamente da perda da totalidade dos genes a aberrações cromossómicas só visíveis por análise do carió ­
tipo. A indução de mutações que resultam no aparecimento de co ­
lónias pequenas foi associada com produtos químicos que induzem 
aberrações cromossómicas graves (26). As células menos seriamente afectadas por mutações apresentam taxas de crescimento semelhantes às células parentais e formam colónias grandes.
 
Deve ser apresentada a sobrevivência (eficiências relativas de clona ­
gem) ou o crescimento total relativo. A frequência de mutação deve ser expressa como a relação entre o número de células mutantes e o 
número de células sobreviventes.
 
Devem ser fornecidos dados individuais das culturas. Para além 
disso, todos os dados devem ser apresentados sob a forma de um 
quadro.  
Não há nenhuma exigência concreta para a verificação de uma res ­
posta positiva clara. Os resultados ambíguos devem ser melhor es ­
clarecidos, de preferência com modificação das condições experi ­
mentais. Os resultados negativos têm de ser confirmados caso a caso. Nos casos em que a confirmação dos resultados negativos não seja 
considerada necessária, deve ser apresentada uma justificação. Para a 
realização de experiências adicionais, deve ser analisada a possibili ­
dade de modificação dos parâmetros do estudo, por forma a aumen ­
tar a gama de condições avaliadas. Os parâmetros que podem even ­
tualmente ser alterados incluem a gama de concentrações e as con ­
dições de activação metabólica.
 
2.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS  
Há diversos critérios para determinar um resultado positivo, tais 
como um aumento da frequência de mutação que esteja relacionado 
com a concentração na gama testada e/ou que seja reprodutível. Deve ser tomada em consideração, antes de mais, a importância biológica dos resultados. Como auxílio para a avaliação dos resulta ­
dos dos ensaios, poderão ser utilizados métodos estatísticos. Contu ­
do, a importância estatística não deve ser o único elemento de de ­
terminação para uma resposta positiva.
 
Uma substância cujos resultados não cumpram os critérios acima 
indicados no presente ensaio é considerada não mutagénica.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 361
 
Embora a maioria das experiências tenha resultados claramente po ­
sitivos ou negativos, em casos raros o conjunto dos dados não per ­
mitirá que se obtenha uma opinião inequívoca sobre a actividade da substância em estudo, podendo acontecer que os resultados conti ­
nuem a ser ambíguos ou duvidosos independentemente do número 
de vezes que a experiência seja repetida.
 
Um resultado positivo no ensaio de mutação génica em células de 
mamíferos  in vitro  indica que a substância induz mutações génicas 
nas culturas de células de mamíferos utilizadas. Uma resposta posi ­
tiva à concentração que seja reprodutível é mais significativa. Um 
resultado negativo indica que, nas condições do ensaio, a substância não induz mutações génicas nas culturas de células de mamífero utilizadas.
 
3. APRESENTAÇÃO DE RELATÓRIOS  
RELATÓRIO DE ENSAIO  
O relatório de ensaio deve incluir a seguinte informação:  
Solvente/veículo:  
— justificação para a escolha do veículo,  
— solubilidade e estabilidade da substância em estudo no solvente/ ­
veículo, se conhecida.  
Células:  
— tipo e origem das células,  
— número de culturas celulares,  
— número de transferências, quando aplicável,  
— métodos de manutenção da cultura celular, quando aplicável,  
— ausência de micoplasma.  
Condições de ensaio:  
— justificação para a selecção das concentrações e do número de 
culturas, incluindo, por exemplo, dados sobre a citotoxicidade e sobre as limitações de solubilidade, quando disponíveis,
 
— composição dos meios, concentração de CO  2 
— concentração da substância em estudo,  
— volumes adicionados do veículo e da substância em estudo,  
— temperatura de incubação,  
— tempo de incubação,  
— duração de tratamento,  
— densidade celular durante a exposição,  
— tipo e composição do sistema de activação metabólica, incluindo 
critérios de aceitabilidade,  
— controlos positivos e negativos,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 362
 
— duração do período de expressão (incluindo o número de células 
inoculadas e os calendários de sub-cultura e de alimentação, 
quando aplicável),  
— agentes selectivos,  
— critérios definidos para que o estudo seja considerado positivo, 
negativo ou não conclusivo,  
— métodos utilizados para a enumeração dos números de células 
mutantes e viáveis,  
— definição das colónias cuja dimensão e tipo são caracterizados 
(incluindo os critérios para a definição de colónias «pequenas» e 
«grandes», conforme apropriado).  
Resultados:  
— sinais de toxicidade,  
— sinais de precipitação,  
— dados sobre o pH e a pressão osmótica durante a exposição à 
substância de ensaio, caso tenham sido determinados,  
— dimensão das colónias, caso tenha sido medida pelo menos para 
os controlos positivos e negativos,  
— capacidade do laboratório para a detecção de pequenas colónias 
mutantes no sistema L5178Y TK  +/- , quando aplicável,  
— relação dose-resposta, quando seja possível de determinar,  
— análise estatística, quando tenha sido realizada,  
— dados relativos ao controlo negativo (solvente/veículo) e positivo 
realizados em paralelo com o ensaio,  
— dados históricos sobre o controlo negativo (solvente/veículo) e 
positivo, com as gamas, valores médios e desvios-padrão,  
— frequência das mutações.  
Discussão dos resultados.  
Conclusões.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) Moore, M.M., DeMarini, D.M., DeSerres, F.J. and Tindall, 
K.R. (Eds.), (1987) Banbury Report 28: Mammalian Cell Mu ­
tagenesis, Cold Spring Harbor Laboratory, New York.  
(2) Chu, E.H.Y. and Malling, H.V., (1968) Mammalian Cell Ge ­
netics. II. Chemical Induction of Specific Locus Mutations in 
Chinese Hamster Cells  In Vitro , Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 
61, p. 1306-1312.  
(3) Liber, H.L. and Thilly, W.G., (1982) Mutation Assay at the 
Thymidine Kinase Locus in Diploid Human Lymphoblasts. 
Mutation Res., 94, p. 467-485.  
(4) Moore, M.M., Harington-Brock, K., Doerr, C.L. and Dearfield, 
K.L., (1989) Differential Mutant Quantitation at the Mouse 
Lymphoma TK and CHO HGPRT Loci. Mutagenesis, 4, p. 
394-403.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 363
 
(5) Aaron, C.S. and Stankowski, Jr.L.F., (1989) Comparison of the 
AS52/XPRT and the CHO/HPRT Assays: Evaluation of Six 
Drug Candidates. Mutation Res., 223, p. 121-128.  
(6) Aaron, C.S., Bolcsfoldi, G., Glatt, H.R., Moore, M., Nishi, Y., 
Stankowski, Jr.L.F., Theiss, J. and Thompson, E., (1994) Mammalian Cell Gene Mutation Assays Working Group Re ­
port. Report of the International Workshop on Standardisation 
of Genotoxicity Test Procedures. Mutation Res., 312, p. 235- -239.
 
(7) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M., Bru ­
sick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C., (1991) Genotoxicity Under 
Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9. Mutation Res., 257, p. 147-204.
 
(8) Clive, D., McCuen, R., Spector, J.F.S., Piper, C. and Mavour ­
nin, K.H., (1983) Specific Gene Mutations in L5178Y Cells in 
Culture. A Report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program. Mutation Res., 115, p. 225-251.
 
(9) Li, A.P., Gupta, R.S., Heflich, R.H. and Wasson, J.S., (1988) 
A Review and Analysis of the Chinese Hamster Ovary/ ­
Hypoxanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase System to Determine the Mutagenicity of Chemical Agents: A Report of Phase III of the U.S. Environmental Protection Agency Gene- 
-Tox Program. Mutation Res., 196, p. 17-36.
 
(10) Li, A.P., Carver, J.H., Choy, W.N., Hsie, A.W., Gupta, R.S., 
Loveday, K.S., O’Neill, J.P., Riddle, J.C., Stankowski, L.F. Jr. and Yang, L.L., (1987) A Guide for the Performance of the 
Chinese Hamster Ovary Cell/Hypoxanthine-Guanine Phospho ­
ribosyl Transferase Gene Mutation Assay. Mutation Res., 189, p. 135-141.
 
(11) Liber, H.L., Yandell, D.W and Little, J.B., (1989) A Compa ­
rison of Mutation Induction at the TK and HPRT Loci in 
Human Lymphoblastoid Cells: Quantitative Differences are 
Due to an Additional Class of Mutations at the Autosomal TK Locus. Mutation Res., 216, p. 9-17.
 
(12) Stankowski, L.F. Jr., Tindall, K.R. and Hsie, A.W., (1986) 
Quantitative and Molecular Analyses of Ethyl Methanosulpho ­
nate -and ICR 191- Induced Molecular Analyses of Ethyl Met ­
hanosulphonate and ICR 191-Induced Mutation in AS52 Cells. Mutation Res., 160, p. 133-147.
 
(13) Turner, N.T., Batson, A.G. and Clive, D., (1984) Procedures 
for the L5178Y/TK  +/- — TK  +/- Mouse Lymphoma Cell Muta ­
genicity Assay. In: Kilbey, B.J. et al (eds.) Handbook of Mu ­
tagenicity Test Procedures, Elsevier Science Publishers, New 
York, p. 239-268.  
(14) Arlett, C.F., Smith, D.M., Clarke, G.M., Green, M.H.L., Cole, 
J., McGregor, D.B. and Asquith, J.C., (1989) Mammalian Cell Gene Mutation Assays Based upon Colony Formation. In: 
Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, 
D.J., Ed., Cambridge University Press, p. 66-101.
 
(15) Abbondandolo, A., Bonatti, S., Corti, G., Fiorio, R., Loprieno, 
N. and Mazzaccaro, A., (1977) Induction of 6-Thioguanine- 
-Resistant Mutants in V79 Chinese Hamster Cells by Mouse- 
-Liver Microsome-Activated Dimethylnitrosamine. Mutation Res., 46, p. 365-373.
 
(16) Ames, B.N., McCann, J. and Yamasaki, E., (1975) Methods 
for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/ ­
Mammalian-Microsome Mutagenicity Test. Mutation Res., 31, 
p. 347-364.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 364
 
(17) Clive, D., Johnson, K.O., Spector, J.F.S., Batson, A.G. and 
Brown M.M.M., (1979) Validation and Characterization of 
the L5178Y/TK  +/- Mouse Lymphoma Mutagen Assay System. 
Mutat. Res., 59, p. 61-108.  
(18) Maron, D.M. and Ames, B.N., (1983) Revised Methods for the 
Salmonella Mutagenicity Test. Mutation Res., 113, p. 173-215.  
(19) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., 
Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C., (1992) Alterna ­
tives to Aroclor 1254-Induced S9 in  In Vitro  Genotoxicity 
Assays. Mutagenesis, 7, p. 175-177.  
(20) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T., 
(1976) A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems. In:  In vitro  Metabo­
lic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J., Fouts, 
J.R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), Elsevier, North-Hol ­
land, p. 85-88.
 
(21) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T., (1982) CHO/ ­
HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile 
Liquids. In: Tice, R.R., Costa, D.L., Schaich, K.M. (eds). Ge ­
notoxic Effects of Airborne Agents. New York, Plenum, p. 91- -103.
 
(22) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L., (1983) 
Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the 
CHO/HGPRT Mutation Assay. Environmental Mutagenesis, 5, 
p. 795-801.
 
(23) Applegate, M.L., Moore, M.M., Broder, C.B., Burrell, A. and 
Hozier, J.C., (1990) Molecular Dissection of Mutations at the 
Heterozygous Thymidine Kinase Locus in Mouse Lymphoma 
Cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, p. 51-55.  
(24) Moore, M.M., Clive, D., Hozier, J.C., Howard, B.E., Batson, 
A.G., Turner, N.T. and Sawyer, J., (1985) Analysis of Trifluo ­
rothymidine-Resistant (TFT  r ) Mutants of L5178Y/TK  +/- Mouse 
Lymphoma Cells. Mutation Res., 151, p. 161-174.  
(25) Yandell, D.W., Dryja, T.P. and Little, J.B., (1990) Molecular 
Genetic Analysis of Recessive Mutations at a Heterozygous 
Autosomal Locus in Human Cells. Mutation Res., 229, p. 
89-102.  
(26) Moore, M.M. and Doerr, C.L., (1990) Comparison of Chro ­
mosome Aberration Frequency and Small-Colony TK-Defi ­
cient Mutant Frequency in L5178Y/TK  +/- -3.7.2C Mouse 
Lymphoma Cells. Mutagenesis, 5, p. 609-614.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 365
 
B.18.  LESÃO E REPARAÇÃO DO ADN — SÍNTESE NÃO 
PROGRAMADA — CÉLULAS DE MAMÍFERO  IN VITRO  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
1.2. DEFINIÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Nenhuma.  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
O Teste de Síntese Não Programada de ADN (Unscheduled DNA 
Synthesis-UDS) mede a síntese de ADN para reparação após excisão e remoção de um fragmento de ADN contendo uma região de lesão induzida por agentes químicos e físicos. O teste baseia-se na incor ­
poração da timidina marcada com trítio (
 3 H-TdR) no ADN de células 
de mamífero não se encontrando na fase S do ciclo celular. Pode determinar-se a incorporação de
 3 H-TdR examinando o ADN prove ­
niente das células tratadas por auto-radiografia ou por contagem de 
cintilação em meio líquido (LSC-Liquid Scintilation Counting). As 
células de mamífero em cultura, com a excepção dos hepatócitos primários de rato, são tratadas com a substância a testar em presença e na ausência de um sistema exógeno de activação metabólica. A 
UDS pode também ser medida por métodos  in vivo.
 
1.5. CRITÉRIOS QUALITATIVOS  
Nenhum.  
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Preparativos  
As substâncias a testar, bem como as de controlo ou de referência 
serão preparadas no meio de cultura, dissolvidas ou colocadas em 
suspensão em veículos apropriados, sendo depois diluídas em meio 
de cultura, antes de utilizadas no ensaio. A concentração final não deverá afectar a viabilidade celular.
 
Podem ser utilizadas neste ensaio culturas primárias de hepatócitos 
de rato, linfócitos humanos ou linhas celulares estabelecidas (por 
exemplo, fibroblastos humanos diplóides).  
As células serão expostas à substância a testar em presença e na 
ausência de um sistema de activação metabólica apropriado.  
Condições experimentais  
N ú m e r o d e c u l t u r a s  
São necessárias para cada ponto experimental pelo menos duas cul ­
turas celulares para a auto-radiografia e seis culturas celulares (ou 
menos se tal se justificar tecnicamente) para a contagem de cintilação 
em meio líquido.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 366
 
U s o d e c o n t r o l o s n e g a t i v o s e p o s i t i v o s  
Deverão ser incluídos em cada experiência controlos simultâneos 
(não tratados e/ou veículo) com e sem activação metabólica.  
Para o ensaio com hepatócitos de rato, por exemplo, pode utilizar-se 
como controlo positivo o 7,12 DMBA (7,12-dimetil benzantraceno) ou o 2-AAF (2-acetilaminofluoreno). No caso de linhas celulares 
estabelecidas, em ensaios com auto-radiografia ou LSC realizados 
sem activação metabólica, pode utilizar-se como controlo o 4-NQO (4-nitroquinolina N-óxido); quando se tiver recorrido a sistemas de activação metabólica, a N-dimetil-nitrosamina é um dos compostos 
utilizáveis como controlo positivo.
 
C o n c e n t r a ç õ e s d e e x p o s i ç ã o  
Deverá utilizar-se uma gama de concentrações da substância a testar 
para permitir uma boa determinação da resposta. A concentração 
máxima deverá produzir alguns efeitos citotóxicos. As substâncias 
relativamente insolúveis na água serão testadas até ao seu limite de solubilidade. No que respeita às substâncias não tóxicas francamente solúveis na água, a concentração máxima a testar deverá ser deter ­
minada caso a caso.
 
C é l u l a s  
Para a manutenção das culturas recorrer-se-á a meios de cultura, a 
uma concentração de CO  2 , a uma temperatura e a humidade apro ­
priados. As linhas celulares estabelecidas deverão ser examinadas 
periodicamente para detectar uma contaminação por  Mycoplasma.  
A c t i v a ç ã o m e t a b ó l i c a  
Não se utiliza nenhum sistema de activação metabólica nas culturas 
primárias de hepatócitos. As linhas celulares estabelecidas e os lin ­
fócitos são expostos à substância a testar em presença e na ausência 
de um sistema de activação metabólica apropriado.  
Procedimentos  
P r e p a r a ç ã o d a s c u l t u r a s  
As linhas celulares estabelecidas provenientes de culturas-mãe (por 
exemplo, por tripsinização ou por agitação) são semeadas em reci ­
pientes de cultura numa densidade adequada e incubada a 37  o C. 
As culturas de pouca duração de hepatócitos de rato são estabeleci ­
das permitindo que os hepatócitos recentemente dissociados num 
meio apropriado possam aderir à superfície de crescimento.  
As culturas de linfócitos humanos são realizadas com técnicas apro ­
priadas.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 367
 
T r a t a m e n t o d a s c u l t u r a s c o m s u b s t â n c i a a t e s t a r  
Hepatócitos primários de rato  
Tratam-se hepatócitos primários de rato, isolados recentemente, com 
a substância a testar no meio contendo  3 H-TdR, durante um período 
de tempo adequado. No fim do período de tratamento o meio será 
eliminado, as células lavadas, fixadas e secadas. As lâminas são 
mergulhadas numa emulsão de auto-radiografia [em alternativa pode usar-se uma película fotográfica ( stripping film )], passando 
depois à exposição, revelação, coloração e contagem.
 
Linhas celulares estabelecidas e linfócitos  
Técnicas auto-radiográficas:  Expõem-se as culturas celulares à subs ­
tância a testar durante períodos de tempo adequados, sendo tratadas em seguida com a
 3 H-TdR. A duração da exposição será em função 
da natureza da substância, da actividade do sistema metabólico e do 
tipo das células. Para detectar o pico da UDS, deverá acrescentar-se 
a 3 H-TdR, seja ao mesmo tempo que a substância a testar, seja nos 
minutos que se seguem à exposição à substância a testar. A escolha entre estas duas técnicas será determinada por eventuais interacções 
entre a substância testada e a
 3 H-TdR. Para se poder fazer a distinção 
entre a UDS e a replicação semiconservativa do ADN pode inibir-se esta última utilizando-se, por exemplo, um meio deficiente em argi ­
nina, um baixo teor de sódio ou acrescentando-se hidroxiureia ao 
meio de cultura.
 
Medição LSC de UDS:  Antes de proceder ao tratamento com a 
substância a testar, bloqueia-se a entrada das células na fase S da forma descrita acima; expõem-se em seguida as células à substância 
a testar, como descrito para a auto-radiografia. No fim do período de 
incubação extrai-se o ADN das células e determina-se a quantidade total de ADN, bem como a quantidade de
 3 H-TdR incorporada.  
É preciso notar que, se forem utilizados linfócitos humanos, não é 
necessário suprimir a replicação semiconservativa do ADN nas cul ­
turas não estimuladas.  
Análise  
D e t e r m i n a ç õ e s a u t o - r a d i o g r á f i c a s  
Para determinar a UDS nas células em células em cultura não se 
contam os núcleos em fase S. Deverão contar-se pelo menos 50 células por concentração. As lâminas serão codificadas antes da contagem. Em cada lâmina serão contados vários campos escolhidos 
ao acaso, suficientemente afastados uns dos outros. Determinar-se-á 
a quantidade de
 3 H-TdR incorporado no citoplasma contando-se três 
superfícies do tamanho do núcleo no citoplasma de cada célula contada.
 
D e t e r m i n a ç ã o L S C  
Nas determinações LSC-UDS deveria utilizar-se um número ade ­
quado de culturas para cada concentração e para os controlos.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 368
 
Todos os resultados serão confirmados por experiências independen ­
tes. 
2. RESULTADOS  
Os resultados deverão ser apresentados sob a forma de quadros.  
2.1. DETERMINAÇÕES AUTO-RADIOGRÁFICAS  
A quantidade de  3 H-TdR incorporada no citoplasma, bem como o 
número de grãos contados por núcleo celular, serão registados sepa ­
radamente.  
A média, a mediana e a moda podem ser utilizadas para descrever a 
distribuição da quantidade de  3 H-TdR incorporado no citoplasma, 
bem como o número de grãos por núcleo.  
2.2. DETERMINAÇÃO LSC  
Para as determinações LSC a incorporação de  3 H-TdR deverá ser 
indicada sob a forma dpm/ug do ADN. Pode utilizar-se a média dos 
dpm/ug do ADN com o seu desvio-padrão para descrever a distri ­
buição da incorporação.  
Os resultados deverão ser avaliados com métodos estatísticos apro ­
priados.  
3. RELATÓRIO  
3.1. RELATÓRIO  
O relatório deverá conter as seguintes informações:  
— células utilizadas, densidade e número de passagens na ocasião 
do tratamento, número de culturas celulares,  
— métodos utilizados na manutenção das culturas, incluindo o meio, 
a temperatura e a concentração de CO  2 , 
— substância a testar, veículo, concentrações e justificação da esco ­
lha das concentrações usadas no teste,  
— pormenores relativos aos sistemas da activação metabólica,  
— esquema do tratamento,  
— controlos positivos e negativos,  
— técnica de auto-radiografia utilizada,  
— métodos utilizados para bloquear a entrada das células na fase S,  
— técnicas utilizadas para extracção do ADN e determinação da 
quantidade total de ADN nas determinações LSC,  
— relação dose/resposta, se possível,  
— avaliação estatística,  
— discussão dos resultados,  
— interpretação dos resultados.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 369
 
3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
4. REFERÊNCIAS  
Ver Introdução Geral, parte B.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 370
 
B.19.  TESTE  IN V1TRO  DE TROCA ENTRE CROMÁTIDES DO 
MESMO CROMOSSOMA  
(Sister Chromatid Exchange — SCE)  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
1.2. DEFINIÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Nenhuma.  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
O ensaio de troca entre cromátides do mesmo cromossoma (SCE) 
constitui um teste de curto prazo que se destina a detectar as trocas recíprocas de ADN entre as cromátides de um mesmo cromossoma em duplicação. As SCE representam a troca recíproca de produtos de 
replicação do ADN em  loci  aparentemente homólogos. O processo 
de troca implica provavelmente uma cisão e uma fusão do ADN, apesar de sabermos pouco acerca da sua base molecular. Para detec ­
tar as SCE é necessário poder marcar separadamente as cromátides 
do mesmo cromossoma; isto é possível pela incorporação da bromo ­
desoxiuridina (BrdU) no ADN cromossómico durante dois ciclos celulares.
 
As células de mamífero  in vitro  são expostas à substância a testar na 
presença e na ausência de um sistema exógeno de activação meta ­
bólica de mamífero, se for caso disso, e colocadas num meio de 
cultura contendo (BrdU) durante dois ciclos de replicação. Após tratamento com um inibidor do fuso (por exemplo, colchicina) a fim de acumular as células numa fase da mitose «metafase- like» 
(c-metafase) recolhem-se as células e fazem-se preparações de cro ­
mossomas.
 
1.5. CRITÉRIOS QUALITATIVOS  
Nenhum.  
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Preparativos  
— podem ser utilizadas no ensaio culturas primárias (linfócitos hu ­
manos) ou linhas celulares estabelecidas (por exemplo, células de 
ovário de hamster chinês). As linhas celulares deverão ser exa ­
minadas para detectar uma eventual contaminação por  Mycoplas ­
ma, 
— serão utilizados meios de cultura e condições de incubação ade ­
quados (por exemplo, temperatura, recipientes de cultura, con ­
centração em CO  2 e humidade),  
— as substâncias a testar podem ser preparadas nos meios de cul ­
tura, dissolvidas ou colocadas em suspensão em veículos apro ­
priados antes de proceder ao tratamento das células. A concen ­
tração final do veículo no meio de cultura não deverá afectar nem a viabilidade das células nem a taxa de crescimento, e os 
efeitos sobre a frequência de SCE serão verificados por meio de 
um solvente de controlo,
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 371
 
— as células serão expostas à substância a testar na presença e na 
ausência de um sistema exógeno de activação metabólica de 
mamífero. Quando se utilizarem tipos celulares com actividade metabólica intrínseca, a taxa e a natureza dessa actividade deve ­
rão ser adequadas à classe química testada.
 
Condições experimentais  
N ú m e r o d e c u l t u r a s  
Serão utilizadas pelo menos duas culturas separadas para cada ponto 
experimental.  
U t i l i z a ç ã o d e c o n t r o l o s n e g a t i v o s e p o s i t i v o s  
Deverão ser incluídos em cada experiência controlos positivos utili ­
zando uma substância com acção directa e uma substância necessi ­
tando de activação metabólica; deverá também utilizar-se um con ­
trolo para o veículo.  
As substâncias seguintes podem, por exemplo, ser utilizadas como 
controlos positivos:  
— substância com acção directa:  
— etilmetanosulfonato de etilo,  
— substância com acção indirecta:  
— ciclofosfamida.  
Se for caso disso, pode incluir-se um controlo positivo suplementar 
pertencendo à mesma classe química da substância a testar.  
C o n c e n t r a ç ã o d e e x p o s i ç ã o  
Deveriam ser utilizadas pelo menos três concentrações da substância 
a testar, convenientemente espaçadas. A concentração máxima de ­
verá produzir um efeito tóxico significativo mas permitindo ainda uma replicação celular adequada. As substâncias relativamente inso ­
lúveis na água serão testadas até ao seu limite de solubilidade com 
métodos apropriados. No caso de substâncias não tóxicas franca ­
mente solúveis na água a concentração máxima da substância a testar deverá ser determinada caso a caso.
 
Procedimento  
P r e p a r a ç ã o d a s c u l t u r a s  
Utilizam-se linhas celulares estabelecidas provenientes de culturas- 
-mãe (por exemplo, por tripsinização ou por agitação), semeadas em recipientes de cultura, numa densidade adequada e incubadas a 37
 
o C. No caso de culturas em monocamada, o número de células por 
recipiente deveria ser ajustado de forma a que as culturas não este ­
jam confluentes a mais de 50 % no momento da colheita. As células podem também ser utilizadas na forma de cultura em suspensão. As 
culturas de linfócitos humanos são preparadas a partir de sangue 
heparinizado utilizando técnicas apropriadas e incubadas a 37
 o C. ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 372
 
T r a t a m e n t o  
São expostas à substância a testar células em fase exponencial de 
crescimento, durante um lapso de tempo adequado; na maior parte dos casos uma a duas horas podem ser suficientes mas, nalguns casos, o tratamento pode ser prolongado para cobrir até dois ciclos 
celulares completos. As células que não tiverem actividade metabó ­
lica intrínseca suficiente deverão ser expostas à substância a testar na presença e na ausência de um sistema de activação metabólica apro ­
priado. No fim do período de exposição, as células são lavadas de 
forma a eliminar a substância testada, e depois cultivadas na pre ­
sença de BrdU durante dois ciclos de replicação. Um outro método consiste na exposição simultânea das células à substância testada e à BrdU durante dois ciclos celulares completos.
 
As culturas de linfócitos humanos são tratadas enquanto se encon ­
trarem num estado de semi-sincronização.  
As células são analisadas no decurso da segunda divisão após trata ­
mento, garantindo assim a exposição das fases mais sensíveis de 
ciclo celular à substância a testar. Todas as culturas a que se adicio ­
nou BrdU serão manipuladas na obscuridade ou com pouca ilumi ­
nação proveniente de lâmpadas incandescentes até ao momento da 
colheita das células, para reduzir a fotólise do ADN contendo BrdU.  
C o l h e i t a d a s c é l u l a s  
As culturas de células são tratadas com um inibidor do fuso (por 
exemplo, colchicina) uma a quatro horas antes da colheita. Cada cultura é colhida e processada separadamente para a preparação 
dos cromossomas.
 
P r e p a r a ç ã o d o s c r o m o s s o m a s e c o l o r a ç ã o  
As preparações de cromossomas são feitas com métodos  Standard  de 
citogenética. Podem utilizar-se várias técnicas para corar as lâminas de forma a pôr em evidência as SCE (por exemplo, o método por 
fluorescência mais Giemsa).
 
A n á l i s e  
O número de células analisado será em função da frequência espon ­
tânea controlo de SCE. Habitualmente analisam-se pelo menos 25 metafases de boa qualidade, por cultura, para contar as SCE. As lâminas são codificadas antes da análise. Para os linfócitos hu ­
manos apenas são analisadas as metafases contendo 46 centrómeros. 
Para as linhas celulares estabelecidas apenas são analisadas as me ­
tafases com ± 2 centrómeros que o número modal. Deverá ser pre ­
cisado se uma inversão de coloração ao nível do centrómero é ou 
não considerada como SCE. Os resultados serão confirmados por 
uma experiência independente.
 
2. RESULTADOS  
Os resultados deverão ser apresentados em quadros. O número de 
SCE por metafase e o número de SCE por cromossoma são dados separadamente para todas as culturas, tratadas e controlos.
 
Os resultados serão analisados com métodos estatísticos adequados.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 373
 
3. RELATÓRIO  
3.1. RELATÓRIO DO TESTE  
O relatório deveria conter as informações seguintes:  
— células utilizadas, métodos de manutenção da cultura celular,  
— condições experimentais: composição de meios, concentração de 
CO 2 , concentração da substância a testar, veículo utilizado, tem ­
peratura de incubação, tempo de tratamento, inibidor do fuso 
utilizado, concentração e duração do tratamento com este, tipo 
de sistema de activação de mamífero utilizado, controlos positi ­
vos e negativos,  
— número de culturas celulares por ponto experimental,  
— pormenores relativos à técnica utilizada na preparação das lâmi ­
nas, 
— número de metafases analisadas (resultados indicados separada ­
mente para cada cultura),  
— número médio de SCE por célula e por cromossoma (resultados 
indicados separadamente para cada cultura),  
— critério de contagem de SCE,  
— justificação da escolha das doses,  
— relação dose/resposta, se possível,  
— avaliação estatística,  
— discussão dos resultados,  
— interpretação dos resultados.  
3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
4. REFERÊNCIAS  
Ver Introdução Geral, parte B.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 374
 
B.20.  TESTE DE LETALIDADE RECESSIVA LIGADA AO SEXO NA  
DROSOPHILA MELANOGASTER  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
1.2. DEFINIÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Nenhuma.  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
O teste de letalidade recessiva ligada ao sexo (SLRL — Sex Linked 
Recessive Letal Test) utilizando a  Drosophila melanogaster  detecta a 
ocorrência de mutações — mutações pontuais bem como pequenas 
delecções — na linha germinal do insecto. Esta prova é um ensaio de mutação  forward  capaz de detectar mutações em cerca de 800  
loci do cromossoma X, o que representa cerca de 80 % de todos os  
loci deste cromossoma. O cromossoma X representa cerca de um 
quinto do genoma haplóide completo.
 
As mutações do cromossoma X de  Drosophila melanogaster  são 
expressas fenotipicamente nos machos portadores do gene mutante. 
Quando a mutação é letal no estado hemizigótico, a sua presença é 
deduzida a partir da ausência de um dos grupos de descendência masculina, em vez dos dois habitualmente produzidos por uma fê ­
mea heterozigótica. O SLRL baseia-se nestes factos, utilizando cro ­
mossomas especificamente marcados e com rearranjos da sua estru ­
tura.
 
1.5. CRITÉRIOS QUALITATIVOS  
Nenhum.  
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Preparativos  
S t o c k s  
Podem ser utilizados machos de um  stock  de tipo selvagem bem 
definido e fêmeas do  stock  Muller-5. Podem também ser utilizados 
outros  stocks  de fêmeas marcadas adequadamente, com cromossomas 
X invertidos de forma múltipla.  
S u b s t â n c i a a t e s t a r  
As substâncias a testar devem ser dissolvidas em água. As subs ­
tâncias insolúveis na água podem ser dissolvidas ou colocadas em suspensão em veículos apropriados (por exemplo, uma mistura de etanol com Tween-60 ou 80), sendo depois diluídas em água ou 
numa solução salina antes da administração. Deve evitar-se como 
veículo o dimetilsulfóxido (DMSO).
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 375
 
N ú m e r o d e a n i m a i s  
O teste deve ser concebido com uma sensibilidade e grau de signi ­
ficância preestabelecido. A frequência de mutantes espontâneos ob ­
servada no grupo de controlo irá influenciar fortemente o número de cromossomas tratados que devem ser analisados.
 
V i a d e a d m i n i s t r a ç ã o  
A administração pode ser oral, por injecção ou por exposição a gases 
ou vapores. A ingestão da substância testada pode ser feita por intermédio de uma solução açucarada. Se necessário, as substâncias 
podem ser dissolvidas numa solução de NaCL a 0,7 % e injectadas 
no tórax ou no abdómen.
 
U s o d e c o n t r o l o s n e g a t i v o s e p o s i t i v o s  
Devem ser incluídos controlos negativos (veículo) e positivos. 
No entanto, se existirem dados apropriados de experiências anterio ­
res, não são necessários controlos simultâneos.  
N í v e i s d e e x p o s i ç ã o  
Devem utilizar-se três níveis de exposição. Para uma avaliação pre ­
liminar pode utilizar-se apenas uma única concentração da substância 
testada, podendo essa ser a concentração máxima tolerada ou a con ­
centração produzindo alguns sinais de toxicidade. No caso de subs ­
tâncias não tóxicas deverá utilizar-se a concentração máxima prati ­
cável.  
P r o c e d i m e n t o  
Tratam-se com a substância a testar machos de fenótipo selvagem 
(com três a cinco dias de idade), sendo acasalados individualmente a um maior número de fêmeas virgens do  stock  Muller-5 ou outro  
stock  marcado de forma apropriada (com cromossomas X invertidos 
de forma múltipla). Estas fêmeas serão substituídas de dois em dois ou de três em três dias por outras fêmeas virgens para se cobrir o ciclo germinal completo. A descendência destas fêmeas é examinada 
para detectar os efeitos sobre o esperma maduro, as espermátides em 
estádios precoces, intermédios ou tardios, os espermatócitos e as espermatogónias na ocasião do tratamento.
 
As fêmeas F  1 heterozigóticas provenientes dos cruzamentos mencio ­
nados acima são acasaladas individualmente (isto é, um fêmea por frasco de experiência) com os seus irmãos. Na geração F
 2 examina- 
-se cada cultura para detectar a ausência de machos do tipo selvagem. 
Se uma cultura revelar ser proveniente de uma fêmea F  1 portadora de 
um gene letal no cromossoma X paterno (isto é, quando não se observar nenhum macho portador do cromossoma tratado), devem testar-se as filhas dessa fêmea com o mesmo genotipo para verificar 
se a letalidade se repete na geração seguinte.
 
2. RESULTADOS  
Os resultados devem ser apresentados em quadros indicando o nú ­
mero de cromossomas X tratados, o número de machos não férteis e 
o número de cromossomas letais por cada concentração de exposição e por cada período de acasalamento para cada macho tratado. O número de agregados de diferentes dimensões deverá ser indicado. 
Estes resultados deverão ser confirmados por uma experiência sepa ­
rada.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 376
 
Deverão ser utilizados métodos estatísticos apropriados na avaliação 
dos testes de letalidade recessiva ligada ao sexo. O reagrupamento de 
genes letais recessivos provenientes de um único macho deverá ser considerado e avaliado com um método estatístico apropriado.
 
3. RELATÓRIO  
3.1. RELATÓRIO DO TESTE  
O relatório do teste deverá incluir as seguintes informações:  
— stock: stocks  ou estirpes de  Drosophila  utilizados, idade dos 
insectos, número de machos tratados, número de machos estéreis, número de culturas F
 2 estabelecidas, número de cromossomas 
portadores de um gene letal detectado em cada estádio das célu ­
las germinais,  
— critérios aplicados para determinar as dimensões dos grupos tra ­
tados,  
— condições experimentais: descrição pormenorizada do esquema 
de tratamento e de amostragem, níveis de exposição, dados sobre 
a toxicidade, controlos negativos (solvente) e positivos se neces ­
sário,  
— critérios aplicados na contagem das mutações letais,  
— relação exposição/efeito, se possível,  
— e avaliação estatística dos resultados,  
— discussão dos resultados,  
— interpretação dos resultados.  
3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
4. REFERÊNCIAS  
Ver Introdução Geral, parte B.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 377
 
B.21.  TESTES DE TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS DE 
MAMÍFERO  IN VITRO  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
1.2. DEFINIÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Nenhuma.  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Podem utilizar-se sistemas de cultura de células de mamífero para 
detectar  in vitro  alterações do fenótipo induzidas por substâncias 
químicas associadas com uma transformação maligna  in vivo.  Entre 
as culturas mais frequentemente utilizadas contam-se as C3H1OT 
1/2, 3T3, SHE, rato Fischer; os testes baseiam-se nas alterações da morfologia celular, formação de ninhos celulares ou alterações liga ­
das à necessidade de ancoragem a um agar semi-sólido. Existem 
outros sistemas menos frequentemente utilizados que detectam outras 
alterações fisiológicas ou morfológicas nas células depois de uma exposição a carcinogénios químicos. Nenhum dos fenómenos finais destes testes  in vitro  apresenta uma relação mecanicista estabelecida 
com o cancro. Alguns dos sistemas de testes são capazes de detectar 
promotores de tumores. Pode determinar-se a citotoxicidade medindo o efeito da substância a testar sobre a capacidade para formar uma colónia (eficácia de  cloning ) ou ainda sobre as taxas de crescimento 
das culturas. A medição da citotoxicidade tem por fim determinar se 
a exposição da substância testada foi toxicologicamente significativa mas não pode servir para calcular a frequência das transformações em todas as provas uma vez que algumas destas podem implicar uma 
incubação prolongada e/ou uma nova passagem.
 
1.5. CRITÉRIOS QUALITATIVOS  
Nenhum.  
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Preparativos  
C é l u l a s  
Podem ser utilizadas várias linhas celulares ou células primárias, 
dependendo do teste de transformação utilizado. O investigador 
deve assegurar-se de que as células do teste efectuado apresentam 
a alteração fenotípica adequada depois da exposição a carcinogénios conhecidos e que a validade e fiabilidade do teste efectuado no seu laboratório sejam comprovadas e documentadas.
 
M e i o  
Deverão utilizar-se meios e condições de ensaio adequados ao teste 
de transformação utilizado.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 378
 
S u b s t â n c i a a t e s t a r  
As substâncias a testar podem ser preparadas nos meios de cultura, e 
dissolvidas ou colocadas em suspensão em veículos apropriados an ­
tes do tratamento das células. A concentração final do veículo no sistema de cultura não deve afectar a viabilidade celular nem a taxa 
de crescimento, nem a incidência de transformações.
 
A c t i v a ç ã o m e t a b ó l i c a  
As células deverão ser expostas à substância a testar na presença e 
na ausência de um sistema de activação metabólica adequado. Alter ­
nativamente, quando se utilizar tipos de células com actividade me ­
tabólica intrínseca, a natureza dessa actividade será comprovada ­
mente apropriada à classe química testada.  
Condições do ensaio  
U t i l i z a ç ã o d e c o n t r o l o s p o s i t i v o s e n e g a t i v o s  
Serão incluídos em cada experiência controlos positivos utilizando 
uma substância com acção directa e uma substância necessitando de 
activação metabólica; utilizar-se-á igualmente um controlo negativo (veículo).
 
Podem ser utilizadas como controlos positivos as seguintes substân ­
cias: 
— substâncias químicas com acção directa:  
— etilmetanosulfonato,  
— β-propiolactona,  
— substâncias necessitando de activação metabólica:  
— 2-acetilaminofluoreno,  
— 4-dimetilaminobenzeno,  
— 7,12-dimetilbenzantraceno.  
Deverá ser incluído, quando justificado, um controlo positivo suple ­
mentar pertencendo à mesma classe química que a substância testa ­
da. 
C o n c e n t r a ç õ e s d e e x p o s i ç ã o  
Deverão ser utilizadas várias concentrações das substâncias a testar. 
Estas concentrações deverão produzir um efeito tóxico dependente da concentração; a concentração máxima deverá produzir uma baixa 
taxa de sobrevivência, a concentração mínima uma taxa de sobrevi ­
vência próxima da observada nos controlos negativos. As substâncias relativamente insolúveis na água serão testadas até ao seu limite de solubilidade com métodos apropriados. No caso de substâncias não 
tóxicas, francamente solúveis na água, a concentração máxima de ­
verá ser determinada caso a caso.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 379
 
Procedimento  
As células serão expostas durante um período de tempo dependente 
do sistema celular utilizado, que pode implicar um novo tratamento acompanhado de mudança de meio (e se necessário uma nova mis ­
tura de activação metabólica) se a exposição for prolongada. As 
células que não tenham actividade metabólica intrínseca suficiente 
deverão ser expostas à substância a testar na presença e na ausência de um sistema de activação metabólica apropriado. No fim do pe ­
ríodo de exposição, as células são lavadas de forma a eliminar a 
substância testada e cultivadas em condições que permitam o apare ­
cimento do fenótipo transformado em estudo sendo então determi ­
nada a incidência desta transformação. Todos os resultados deverão ser confirmados por uma experiência independente.
 
2. RESULTADOS  
Os resultados deverão ser apresentados em quadros e podem ser 
apresentados de várias formas consoante o método utilizado, por 
exemplo, contagem por placa, placas positivas ou número de células transformadas. Quando apropriado, a sobrevivência será expressa em percentagem das taxas de controlo e a frequência de transformação 
corresponderá ao número de células transformadas por número de 
sobreviventes. Os resultados deverão ser avaliados com métodos estatísticos apropriados.
 
3. RELATÓRIO  
3.1. RELATÓRIO DO TESTE  
O relatório do teste deverá incluir as seguintes informações:  
— tipo de célula utilizada, número de culturas de células, métodos 
de manutenção das culturas de células,  
— condições do teste: concentração da substância a testar, veículo 
usado, tempo de incubação, duração e frequência do tratamento, 
densidade celular durante o tratamento, tipo de sistema exógeno 
de activação metabólica utilizado, controlos positivos e negati ­
vos, especificação do fenótipo estudado, sistema selectivo usado (se apropriado); justificação da escolha das doses,
 
— método utilizado para contar as células viáveis e as transforma ­
das; 
— avaliação estatística,  
— discussão dos resultados,  
— interpretação dos resultados.  
3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
4. REFERÊNCIAS  
Ver Introdução Geral, parte B.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 380
 
B.22.  TESTE DE LETALIDADE DOMINANTE NO ROEDOR  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
1.2. DEFINIÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Nenhuma.  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
A letalidade dominante provoca a morte do embrião ou do feto. A 
indução de letalidade dominante por exposição a uma substância 
química indica que a substância afectou o tecido germinal da espécie estudada. Admite-se geralmente que a letalidade dominante é devida a uma lesão cromossómica (alterações estruturais e numéricas). 
No caso de os animais tratados serem fêmeas, a morte do embrião 
pode também ser devida a efeitos tóxicos.
 
Em geral, os machos são expostos à substância a testar e acasalados 
com fêmeas virgens não tratadas. Os diferentes estádios das células 
germinais podem ser testados separadamente utilizando-se períodos 
de acasalamento sequenciais. O aumento do número de implantes mortos por fêmea no grupo tratado em relação ao número de im ­
plantes mortos por fêmea no grupo de controlo reflecte as perdas 
após a implantação. As perdas antes da implantação podem ser 
calculadas por contagem dos corpos amarelos ou comparando o número total de implantes por fêmea no grupo tratado e no grupo de controlo. O efeito total de letalidade dominante é igual à soma das 
perdas antes e depois da implantação. O cálculo do efeito total da 
letalidade dominante baseia-se na comparação entre o número de implantes vivos por fêmea no grupo tratado e o registado no grupo de controlo. Uma diminuição do número dos implantes em determi ­
nados intervalos pode ser devida à destruição das células (isto é, de 
espermatócitos e/ou espermatogónias).
 
1.5. CRITÉRIOS QUALITATIVOS  
Nenhum.  
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Preparativos  
Quando for possível, as substâncias a testar serão dissolvidas ou 
colocadas em suspensão numa solução salina isotónica. As substân ­
cias químicas insolúveis na água podem ser dissolvidas ou colocadas em suspensão em veículos apropriados. O veículo utilizado não de ­
verá interferir com a substância a testar nem deverá produzir efeitos 
tóxicos. Serão utilizadas preparações frescas da substância a testar.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 381
 
Condições experimentais  
V i a d e a d m i n i s t r a ç ã o  
A substância a testar deverá ser administrada uma única vez. Pode 
ser utilizado um programa de tratamento repetido em função das informações toxicológicas disponíveis. As vias de administração ha ­
bituais são a intubação oral ou a injecção interperitoneal. Podem ser 
adequadas outras vias de administração.
 
A n i m a i s d e e x p e r i ê n c i a  
Recomenda-se a utilização de ratos ou ratinhos. Repartem-se ao 
acaso entre os grupos tratados e de controlo animais jovens e sãos 
tendo atingido a plena maturidade sexual.  
N ú m e r o e s e x o  
Utiliza-se um número adequado de machos tratados, tendo em conta 
a frequência espontânea da característica biológica que está a ser 
avaliada. O número escolhido deverá basear-se numa sensibilidade 
de detecção e grau de significação preestabelecidos. Por exemplo, num teste típico, o número de machos escolhido para cada grupo de dose deverá ser suficientemente grande para obter 30 a 50 fêmeas 
grávidas por período de acasalamento.
 
U t i l i z a ç ã o d e c o n t r o l o s n e g a t i v o s e p o s i t i v o s  
Deverão ser incluídos em cada experiência controlos positivos e 
negativos (veículos), sendo geralmente simultâneos. Se experiências recentes efectuadas no mesmo laboratório tiverem dado resultados 
aceitáveis com os controlos positivos, estes resultados poderão ser 
utilizados em vez de um controlo positivo simultâneo. No que res ­
peita às substâncias de controlo positivo deverá utilizar-se uma dose baixa apropriada (por exemplo MMS, intraperitonealmente, 10 mg/ ­
kg) para demonstrar a sensibilidade do teste.
 
D o s e s  
Normalmente usam-se três níveis de dose diferentes. A dose máxima 
deverá produzir sinais de toxicidade ou reduzir a fecundidade dos 
animais tratados. Em alguns casos pode ser suficiente uma única 
dose elevada.  
E n s a i o - l i m i t e  
As substâncias não tóxicas são testadas à razão de 5 g/kg no caso de 
administração única e de 1 g/kg/dia no caso de administração repe ­
tida. 
Procedimento  
Vários esquemas de tratamento são possíveis. O método mais fre ­
quente é o da administração única. Podem utilizar-se outros esque ­
mas de tratamento.  
Cada macho é acasalado sequencialmente com uma ou duas fêmeas 
virgens não tratadas, a intervalos de tempo apropriados após o tra ­
tamento. As fêmeas deverão ser deixadas com os machos durante pelo menos um ciclo completo do estro, ou até que o acasalamento 
seja comprovado pela presença de esperma na vagina ou pela pre ­
sença de um rolhão vaginal.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 382
 
O número de acasalamentos após tratamento é determinado pelo 
esquema de tratamento e deverá assegurar que sejam testados todos 
os estádios das células germinais tratadas.  
As fêmeas são sacrificadas durante a segunda metade da gestação e o 
conteúdo do útero é examinado para determinação do número de 
implantes vivos e mortos. Os ovários podem ser examinados para determinar o número de corpos amarelos.
 
2. RESULTADOS  
Os resultados deverão ser apresentados em quadros, indicando o 
número de machos, o número de fêmeas grávidas bem como o 
número de fêmeas não grávidas. Os resultados de cada acasalamento, incluindo a identidade de cada macho e de cada fêmea são apresen ­
tados separadamente. Serão descritos para cada fêmea a semana de 
acasalamento e a dose recebida pelos machos, bem como a frequên ­
cia dos implantes vivos e mortos.
 
O cálculo do efeito total de letalidade dominante baseia-se numa 
comparação do número de implantes vivos por fêmea no grupo tratado com o número de implantes vivos por fêmea no grupo de controlo. Compara-se a relação implantes vivos/mortos no grupo 
tratado com a mesma relação no grupo de controlo para indicação 
das perdas pós-implantação.
 
Se os resultados forem registados sob a forma de mortalidades pre ­
coces e mortalidades tardias, os quadros deverão tornar clara essa diferença. Se for avaliada a perda anterior à implantação, devem apresentar-se os resultados. Esta perda pode ser calculada como a 
discrepância entre o número de corpos amarelos e o número de 
implantes ou como a diminuição do número médio de implantes por fêmea em relação ao dos acasalamentos de controlo.
 
Os resultados serão avaliados com métodos estatísticos apropriados.  
3. RELATÓRIO  
3.1. RELATÓRIO DO TESTE  
O relatório do teste deverá incluir as informações seguintes:  
— espécies, estirpe, idade e peso dos animais utilizados, número de 
animais de cada sexo nos grupos tratados e de controlo,  
— substância a testar, veículo, doses testadas e justificação da esco ­
lha das doses, controlos negativos e positivos, dados relativos à toxicidade,
 
— via de administração e esquema do tratamento,  
— esquema de acasalamento,  
— método utilizado para comprovar o acasalamento,  
— momento do sacrifício,  
— critérios de contagem dos efeitos de letalidade dominante,  
— relação dose/resposta, se possível,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 383
 
— avaliação estatística,  
— discussão dos resultados,  
— interpretação dos resultados.  
3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
4. REFERÊNCIAS  
Ver Introdução Geral, parte B.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 384
 
B.23.  ENSAIO DE ABERRAÇÕES CROMOSSÓMICAS EM 
ESPERMATOGÓNIAS DE MAMÍFERO  
1. MÉTODO  
O presente método é idêntico ao método OCDE TG 483 — Ensaio 
de aberração cromossómica em espermatogónias de mamífero 
(1997).  
1.1. INTRODUÇÃO  
O objectivo do ensaio  in vivo  de aberrações cromossómicas em 
espermatogónias de mamífero é identificar as substâncias que cau ­
sam aberrações cromossómicas estruturais nas células espermatogó ­
nias de mamífero (1) (2) (3) (4) (5). As aberrações estruturais podem 
ser de dois tipos, cromossómicas ou cromatídicas. A maior parte dos mutagéneos químicos induzem aberrações cromatídicas, mas também podem ocorrer aberrações cromossómicas. O método não foi conce ­
bido para medir aberrações numéricas e não é normalmente utilizado 
com esse objectivo. As mutações cromossómicas e eventos relacio ­
nados causam diversas doenças genéticas humanas.
 
O presente ensaio mede eventos a nível dos cromossomas de células 
germinais espermatogónias e, por conseguinte, pressupõe-se que te ­
nha um carácter de previsão da indução de mutações transmissíveis nas células germinais.
 
No presente ensaio utilizam-se normalmente roedores. O ensaio ci ­
togénico  in vivo  detecta aberrações cromossómicas nas mitoses das 
espermatogónias. O método não diz respeito a outros tipos de célu ­
las. 
Para detectar aberrações cromatídicas em células espermatogónias 
deve examinar-se a primeira divisão mitótica da célula após a ex ­
posição, antes que as eventuais lesões sejam perdidas por via de divisões celulares subsequentes. Para obtenção de informação adicio ­
nal sobre as células germinais das espermatogónias expostas pode 
proceder-se à análise dos cromossomas durante a meiose, para de ­
tecção de aberrações cromossómicas na diacinese-metafase 1, mo ­
mento em que as células expostas passam à forma de espermatócitos.
 
O presente ensaio  in vivo  foi concebido para investigar se os agentes 
mutagéneos das células somáticas também são activos para as células 
germinais. Além disso, o ensaio das espermatogónias é relevante para a avaliação dos riscos de mutagenicidade, na medida em que permite a consideração dos elementos do metabolismo  in vivo , da 
farmacocinética e dos processos de reparação do ADN.
 
Nos testículos estão presentes diversas gerações de espermatogónias, 
com diferentes graus de sensibilidade ao tratamento químico. Logo, as aberrações detectadas representam uma resposta agregada das 
várias populações de células espermatogónias expostas, com predo ­
minância para as células espermatogónias mais diferenciadas, que são em maior número. Dependendo da sua posição no testículo, diferentes gerações de espermatogónias poderão ou não ser expostas 
à circulação geral, devido à barreira física e fisiológica constituída 
pelas células de Sertoli e à barreira sangue-testículo.
 
Se existirem provas de que nem a substância em estudo nem nenhum 
dos seus metabolitos reactivos entram em contacto com o tecido 
objectivo, o presente ensaio não é apropriado.  
Ver também a parte B da Introdução Geral.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 385
 
1.2. DEFINIÇÕES  
Aberração cromatídica:  lesão estrutural de um cromossoma ex ­
pressa na ruptura, ou na ruptura seguida de união, de cromatídeos simples.
 
Aberração cromossómica:  lesão estrutural de um cromossoma ex ­
pressa na ruptura, ou na ruptura seguida de união, de ambos os 
cromatídeos no mesmo local.  
Lacuna:  lesão acromática de extensão inferior à largura de um 
cromatídeo e que determine um ligeiro desalinhamento do mesmo.  
Aberração numérica:  alteração do número de cromossomas relati ­
vamente ao número de cromossomas característico das células utili ­
zadas.  
Poliploidia:  número de cromossomas múltiplo do número haplóide 
(n), mas diferente do diplóide (ou seja, 3n, 4n e assim por diante).  
Aberração estrutural:  alteração da estrutura dos cromossomas de ­
tectável por exame microscópico das células em metafase sob a forma de supressão de segmentos, de alterações de partes da sequên ­
cia ou da troca de segmentos num cromatídeo ou entre cromatídeos.
 
1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Os animais são expostos à substância em estudo através de um modo 
de exposição apropriado, sendo sacrificados passado o tempo neces ­
sário após a exposição. Antes do sacrifício os animais são tratados 
com um agente de fixação da metafase (por exemplo, colchicina ou Colcemid
 ® ). Seguidamente são feitas preparações de cromossomas a 
partir das células germinais e, após serem coradas, as células em 
metafase são analisadas para detecção de aberrações cromossómicas.  
1.4. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.4.1.  Preparação  
1.4.1.1.  Selecção das espécies animais  
Geralmente, são utilizados ratos ou  hamsters  chineses machos, em ­
bora possam ser utilizados machos de qualquer outra espécie de mamífero apropriada. Devem ser utilizados animais adultos saudá ­
veis jovens das raças de laboratório mais comuns. No início do 
estudo, a diferença de peso entre os animais deve ser mínima, não 
devendo exceder ± 20 % do peso médio de cada sexo.
 
1.4.1.2.  Condições de acomodação e alimentação  
Devem ser aplicadas as condições gerais referidas na Introdução 
Geral, parte B, embora o objectivo para a humidade deva ser de 
50 %-60 %.  
1.4.1.3.  Preparação dos animais  
Os animais machos adultos saudáveis jovens são distribuídos alea ­
toriamente pelos grupos de controlo e pelos grupos expostos. As 
gaiolas devem ser dispostas de modo a que eventuais efeitos devidos à respectiva colocação sejam minimizados. Os animais são identifi ­
cados de forma inequívoca, devendo ser aclimatados às condições de 
laboratório durante pelo menos cinco dias antes de se iniciar o 
estudo.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 386
 
1.4.1.4.  Preparação das doses  
As substâncias sólidas devem ser dissolvidas ou suspensas em sol ­
ventes ou veículos adequados e, se necessário, diluídas antes de serem administradas aos animais. As substâncias líquidas podem 
ser adicionadas directamente aos sistemas em estudo e/ou diluídas 
antes de serem adicionadas às células. Devem ser utilizadas prepa ­
rações frescas da substância em estudo, a menos que os dados de estabilidade demonstrem que o respectivo armazenamento não coloca 
problemas para o ensaio.
 
1.4.2.  Condições do ensaio  
1.4.2.1.  Solvente/veículo  
O solvente/veículo não deve reagir com a substância em estudo, não 
devendo produzir efeitos tóxicos nas doses utilizadas. Caso se utili ­
zem solventes/veículos cujas propriedades não se encontrem total ­
mente elucidadas, devem fornecer-se dados que justifiquem a sua compatibilidade. Sempre que possível, recomenda-se a utilização 
de um solvente/veículo aquoso.
 
1.4.2.2.  Controlos  
Cada experiência deve incluir em paralelo controlos positivos e ne ­
gativos (solvente/veículo). Com excepção da exposição à substância em estudo, todos os animais, incluindo os dos grupos de controlo, 
devem ser manuseados de forma idêntica.
 
Os controlos positivos devem produzir aberrações estruturais  in vivo  
nas células espermatogónias quando administrados aos níveis de 
exposição a que se espera o surgimento de um aumento detectável em relação à linha de base.
 
A dose de controlo positiva a administrar deve ser escolhida de 
modo a que os seus efeitos sejam claros mas também a que as lâminas codificadas não sejam imediatamente identificadas pela pes ­
soa que procede às leituras. É aceitável que o controlo positivo seja 
administrado por uma via diferente da substância em estudo e que só 
seja realizada uma amostra. A possibilidade de utilização de produtos químicos de uma classe relacionada para o controlo positivo deve ser considerada, quando existam. As substâncias de controlo positivo 
podem incluir, por exemplo:
 
Substância Número CAS Número EINECS  
Ciclofosfamida 
Ciclofosfamida monohidrato 50-18-0 
6055-19-2 200-015-4 
Ciclohexilamina 108-91-8 203-629-0 
Mitomicina C 50-07-7 200-008-6 Acrilamida monomérica 79-06-1 201-173-7 Trietilenomelamina 51-18-3 200-083-5
 
Para cada amostragem prevista devem ser incluídos controlos nega ­
tivos expostos apenas ao solvente ou veículo, que serão sujeitos exactamente ao mesmo procedimento que os grupos expostos, a menos que existam dados históricos de controlo aceitáveis em rela ­
ção à variabilidade de animal para animal e à frequência da ocor ­
rência de células com aberrações cromossómicas. Além disso, devem ser também preparados controlos não expostos à substância em es ­
tudo, a menos que existam dados de controlo históricos ou publica ­
dos que mostrem que o solvente/veículo escolhido não induz qual ­
quer efeito deletério ou mutagénico.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 387
 
1.5. PROCEDIMENTO  
1.5.1.  Número de animais  
Cada grupo exposto e de controlo deve incluir pelo menos cinco 
animais machos analisáveis.  
1.5.2.  Programação do tratamento  
As substâncias de ensaio são preferivelmente administradas numa ou 
em duas doses (ou seja, numa só exposição ou em duas exposições). 
As substâncias poderão igualmente ser administradas numa dose 
dividida, ou seja, duas exposições no mesmo dia, separadas por apenas algumas horas, para facilitar a administração de grandes vo ­
lumes. Qualquer outro regime de administração terá de ser cientifi ­
camente justificado.
 
No grupo exposto à dose mais elevada serão realizadas duas amos ­
tras após a exposição. Uma vez que a cinética celular poderá ser afectada pela substância em estudo, serão colhidas duas amostras, 
uma cerca de 24 horas após a exposição e outra cerca de 48 horas 
após a exposição. Para os restantes animais deve ser colhida uma amostra 1,5 ciclos celulares normais ou 24 horas após a exposição, a não ser nos casos em que se saiba que a utilização de outros tempos 
de amostragem é mais apropriada para a detecção dos efeitos (6).
 
Para além disso, poderão ser utilizados outros tempos de amostra ­
gem. Assim, por exemplo, no caso de produtos químicos que possam induzir  lagging  cromossómico ou efeitos independentes do factor S, 
poderá ser necessário fazer a amostragem mais cedo (1).
 
A necessidade ou não de uma repetição da exposição terá de ser 
avaliada caso a caso. Se o tratamento for repetido, os animais devem ser sacrificados 24 horas (1,5 ciclos celulares) após a última expo ­
sição. Quando necessário, poderão ser realizadas amostras adicionais.
 
Antes do sacrifício, os animais são injectados intraperitonealmente 
com uma dose apropriada de um agente de fixação da metafase (por 
exemplo, Colcemid  ® ou colchicina). As amostras serão colhidas a 
intervalos regulares a partir desse momento. Esse intervalo corres ­
ponde a aproximadamente 3-5 horas para os ratos e a 4-5 horas para 
os hamsters  chineses.  
1.5.3.  Doses  
Se for realizado um estudo para avaliação da gama de doses a 
administrar, por não estarem disponíveis dados apropriados, esse 
estudo deve ser executado no mesmo laboratório, utilizando as mes ­
mas espécies, linha celular e regime de exposição a utilizar no estudo principal (7). Se existir toxicidade, serão utilizadas três doses dife ­
rentes para a primeira amostragem. Essas doses devem abranger uma 
gama de toxicidade máxima a quase nula. Na segunda amostragem só será necessário avaliar a dose mais elevada. A dose mais elevada é definida como a dose que produz sinais de toxicidade tais que 
indiquem que a utilização de doses superiores, com o mesmo regime 
de administração, produzirá mortalidade.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 388
 
As substâncias com actividade biológica específica em doses baixas 
e não tóxicas (como acontece com as hormonas e agentes mitogéni ­
cos) poderão constituir uma excepção aos critérios de fixação da dose, devendo ser avaliadas numa base casuística. A dose mais elevada pode igualmente ser definida como uma dose que produz 
algumas indicações de toxicidade nas espermatogónias (por exemplo, 
redução da taxa de mitose das espermatogónias na primeira e se ­
gunda metafase meióticas; essa redução não deve ser superior a 50 %).
 
1.5.4.  Ensaio-limite  
Se um ensaio com uma dose de pelo menos 2 000 mg/kg de peso 
corporal numa única exposição ou em duas exposições no mesmo dia não produzir nenhum efeito tóxico perceptível e se não for 
previsível a existência de toxicidade genética com base nos dados 
respeitantes a substâncias estruturalmente relacionadas, poderá não ser considerado necessário um estudo completo com utilização de três doses diferentes. A exposição prevista para o ser humano pode 
indicar a necessidade de se utilizarem doses mais elevadas nos en ­
saios-limite.
 
1.5.5.  Administração das doses  
A substância em estudo é geralmente administrada por sonda esofá ­
gica, utilizando um tubo estomacal ou cânula de intubação apropria ­
da, ou por injecção intraperitoneal. Poderão ser aceites, mediante 
justificação, outras vias de administração. O volume máximo de líquido que pode ser administrado de cada vez por sonda esofágica 
ou por injecção depende também do tamanho do animal de ensaio, 
não devendo exceder 2 ml/100 g de peso corporal. A utilização de volumes mais elevados deve ser justificada. Com excepção das subs ­
tâncias que causem irritação ou que sejam corrosivas, cujos efeitos 
serão normalmente agravados em concentrações mais altas, a varia ­
bilidade do volume de ensaio deve ser minimizada através do ajus ­
tamento das concentrações, por forma a garantir um volume cons ­
tante para todas as doses a administrar.
 
1.5.6.  Preparação dos cromossomas  
Imediatamente após o sacrifício, devem ser preparadas suspensões 
celulares de um ou de ambos os testículos, que serão seguidamente expostas a uma solução hipotónica e fixadas. As células são depois 
esfregadas em lâminas e coradas.
 
1.5.7.  Análise  
Devem ser analisadas pelo menos 100 células em metafase avançada 
de cada animal (ou seja, um mínimo de 500 metafases por grupo). Este número poderá ser menor quando se verificarem taxas elevadas 
de aberrações. Todas as lâminas, incluindo as dos controlos positivos 
e negativos, devem ser independentemente codificadas antes da aná ­
lise microscópica. Uma vez que os procedimentos de preparação das lâminas dão frequentemente lugar à ruptura de uma certa proporção 
das células em metafase, com perda de cromossomas, as células 
contabilizadas devem conter um número de centrómeros igual a 2n ± 2.
 
2. DADOS  
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS  
Os dados respeitantes a cada animal devem ser apresentados num 
quadro. A unidade experimental é o animal. Para cada animal devem ser verificados o número de células com aberrações cromossómicas e 
o número de aberrações cromossómicas por célula. Os diferentes 
tipos de aberração cromossómica estrutural devem ser enumerados com os respectivos números e frequências para os grupos expostos à substância em estudo e de controlo. A ocorrência de lacunas é re ­
gistada em separado e incluída no relatório, mas não é geralmente 
contabilizada para o cálculo da frequência total das aberrações.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 389
 
Se para além das mitoses também se observarem meioses, a relação 
entre o número de mitoses e de metafases I ou II das espermatogó ­
nias deve ser determinada num total de 100 células em divisão por animal, para medição da citotoxicidade em todos os animais expos ­
tos à substância em estudo e do controlo negativo, de forma a poder 
estabelecer se existem efeitos citotóxicos. Se só se observarem mi ­
toses, o índice mitótico deve ser calculado utilizando pelo menos 1 000 células de cada animal.
 
2.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS  
Há diversos critérios para determinar um resultado positivo, como 
por exemplo um aumento do número de células com aberrações cromossómicas relacionado com a dose ou um claro aumento do 
número de células com aberrações num determinado grupo e numa 
determinada amostragem. Deve ser tomada em consideração, antes de mais, a importância biológica dos resultados. Como auxílio para a avaliação dos resultados dos ensaios, poderão ser utilizados métodos 
estatísticos (8), embora a significância estatística não deva ser o 
único elemento para a determinação de uma resposta positiva. Os resultados ambíguos devem ser esclarecidos através de estudos adi ­
cionais, de preferência com modificação das condições experimen ­
tais.
 
Uma substância cujos resultados não cumpram os critérios acima 
indicados no presente ensaio é considerada não mutagénica.  
Embora a maioria de experiências tenha resultados claramente posi ­
tivos ou negativos, em casos raros o conjunto dos dados não per ­
mitirá que se obtenha uma opinião inequívoca sobre a actividade da 
substância em estudo, podendo acontecer que os resultados conti ­
nuem a ser ambíguos ou duvidosos independentemente do número 
de vezes que a experiência seja repetida.  
Um resultado positivo no ensaio  in vitro  para aberrações cromossó ­
micas em espermatogónias indica que a substância em estudo induz aberrações cromossómicas estruturais nas células germinais das es ­
pécies testadas. Um resultado negativo indica que, nas condições do 
ensaio, a substância em estudo não induz aberrações cromossómicas 
estruturais nas células germinais das espécies testadas.
 
Deve ser discutida a probabilidade de a substância em estudo ou os 
seus metabolitos alcançarem o sistema circulatório geral ou especi ­
ficamente o tecido objectivo.  
3. APRESENTAÇÃO DE RELATÓRIOS  
RELATÓRIO DE ENSAIO  
O relatório de ensaio deve incluir a seguinte informação:  
Solvente/veículo:  
— justificação para a escolha do veículo,  
— solubilidade e estabilidade da substância em estudo no solvente/ ­
veículo, se conhecida.  
Animais de ensaio:  
— espécie/linha celular utilizada,  
— número e idade dos animais,  
— origem, condições de acomodação, alimentação, etc.,  
— peso de cada animal no início do ensaio, incluindo a gama de 
pesos, a respectiva média e o desvio-padrão para cada grupo.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 390
 
Condições de ensaio:  
— resultados do estudo para definição da gama de doses, quando 
tenha sido realizado,  
— justificação para a selecção das doses,  
— justificação da via de administração escolhida,  
— preparação da substância em estudo,  
— modo de administração da substância em estudo,  
— justificação do momento do sacrifício,  
— conversão da concentração da substância em estudo (ppm) na 
alimentação/abeberação para a dose real (mg/kg peso corporal/ ­
dia), quando aplicável,  
— qualidade dos alimentos e da água,  
— descrição pormenorizada dos calendários de tratamento e amos ­
tragem,  
— métodos de medição da toxicidade,  
— substância utilizada para fixar a metafase, respectiva concentra ­
ção e duração da exposição,  
— métodos de preparação das lâminas,  
— critérios de contabilização das aberrações,  
— número de células analisadas por animal,  
— critérios definidos para que o estudo seja considerado positivo, 
negativo ou não conclusivo.  
Resultados:  
— sinais de toxicidade,  
— índice mitótico,  
— proporção de células espermatogónias em mitose em relação às 
células em metafase I ou II,  
— tipo e número de aberrações, discriminados para cada animal,  
— número total de aberrações por grupo,  
— número de células aberrantes por grupo,  
— relação dose-resposta, quando seja possível de determinar,  
— análise estatística, quando tenha sido realizada,  
— dados relativos ao controlo negativo realizado em paralelo com o 
ensaio,  
— dados históricos sobre o controlo negativo, com as respectivas 
gama, valor médio e o desvio-padrão,  
— dados relativos ao controlo positivo realizado em paralelo com o 
ensaio,  
— alterações da ploidia, quando observadas.  
Discussão dos resultados.  
Conclusões.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 391
 
4. REFERÊNCIAS  
(1) Adler, I.D., (1986). Clastogenic Potential in Mouse Spermato ­
gonia of Chemical Mutagens Related to their Cell-Cycle Spe ­
cifications. In: Genetic Toxicology of Environmental Chemi ­
cals, Part B: Genetic Effects and Applied Mutagenesis, Ramel, 
C., Lambert, B. and Magnusson, J. (Eds.) Liss, New York, p. 477-484.
 
(2) Adler, I.D., (1984). Cytogenetic tests in Mammals. In: Muta ­
genicity Testing: a Practical Approach. Ed. S. Venitt and J.M. Parry. IRL Press, Oxford, Washington DC, p. 275-306.
 
(3) Evans, E.P., Breckon, G. and Ford, C.E., (1964). An Air- 
-Drying Method for Meiotic Preparations from Mammalian Tes ­
tes. Cytogenetics and Cell Genetics, 3, 289-294.  
(4) Richold, M., Ashby, J., Chandley, A., Gatehouse, D.G. and 
Henderson, L., (1990).  In Vivo  Cytogenetic Assays, In: D.J. 
Kirkland (Ed.) Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommen ­
ded Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mu ­
tagenicity Testing. Report. Part I revised. Cambridge Univer ­
sity Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, 
Sydney, p. 115-141.  
(5) Yamamoto, K. and Kikuchi, Y., (1978). A New Method for 
Preparation of Mammalian Spermatogonial Chromosomes. Mu ­
tation Res., 52, p. 207-209.  
(6) Adler, I.D., Shelby M.D., Bootman, J., Favor, J., Generoso, 
W., Pacchierotti, F., Shibuya, T. and Tanaka N., (1994). In ­
ternational Workshop on Standardisation of Genotoxicity Test Procedures. Summary Report of the Working Group on Mam ­
malian Germ Cell Tests. Mutation Res., 312, p. 313-318.
 
(7) Fielder, R.J., Allen, J.A., Boobis, A.R., Botham, P.A., Doe, J., 
Esdaile, D.J., Gatehouse, D.G., Hodson-Walker, G., Morton, 
D.B., Kirkland, D.J. and Richold, M., (1992). Report of British 
Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Wor ­
king group: Dose setting in  In Vivo  Mutagenicity Assays. Mu ­
tagenesis, 7, p. 313-319.  
(8) Lovell, D.P., Anderson, D., Albanese, R., Amphlett, G.E., 
Clare, G., Ferguson, R., Richold, M., Papworth, D.G. and Savage, J.R.K., (1989). Statistical Analysis of  In Vivo  Cytoge­
netic Assays In: D.J. Kirkland (Ed.) Statistical Evaluation of 
Mutagenicity Test Data. UKEMS Sub-Committee on Guideli ­
nes for Mutagenicity Testing, report, Part III. Cambridge Uni ­
versity Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, Sydney, p. 184-232.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 392
 
B.24.  TESTE DAS MALHAS ( SPOT-TEST ) NO RATINHO  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
1.2. DEFINIÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Nenhuma.  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Este teste é uma prova  in vivo  efectuada no ratinho, cujos embriões 
em desenvolvimento são expostos à substância a testar. As células 
visadas dos embriões em desenvolvimento são os melanoblastos e os 
genes alvo são os responsáveis pela pigmentação do pêlo. Os em ­
briões em desenvolvimento são heterozigóticos para alguns desses 
genes. Uma mutação ao nível do alelo dominante ou a perda do alelo 
dominante de um desses genes num melanoblasto (na sequência de vários fenómenos genéticos) traduz-se pela expressão do fenótipo recessivo nas células que dele descendem, do que resulta o apareci ­
mento de uma malha de cor diferente no pêlo do ratinho. Conta-se 
assim o número de descendentes portadores de malhas (mutações) e a sua frequência é comparada com a frequência observada na des ­
cendência resultante do desenvolvimento de embriões tratados ape ­
nas com o solvente. O teste das malhas no ratinho ( spot test ) detecta 
as mutações somáticas presumíveis nas células fetais.
 
1.5. CRITÉRIOS QUALITATIVOS  
Nenhum.  
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Preparativos  
Quando for possível as substâncias a testar são dissolvidas ou colo ­
cadas em suspensão numa solução salina isotónica. As substâncias insolúveis na água serão dissolvidas ou colocadas em suspensão em 
veículos apropriados. O veículo utilizado não deverá interferir com a 
substância a testar nem produzir efeitos tóxicos. Deverão utilizar-se soluções preparadas de fresco da substância a testar.
 
A n i m a i s d e e x p e r i ê n c i a  
Ratinhos da estirpe T ( nonagouti, a/a; chinchilla, pink eye,  c ch p/c ch p; 
brown,  b/b;  dilute, short ear,  d se/d se;  piebald spotting,  s/s) são 
acasalados seja com a estirpe HT ( pallid, nonagouti, brachypody,  pa 
a bp/pa a bp;  leaden fuzzy,  ln fz/ln fz;  pearl  pe/pe) ou com a C57 BL 
(nonagouti,  a/a). Podem utilizar-se outros cruzamentos apropriados 
como entre a NMRI ( nonagouti , a/a; albino, c/c) e a DBA  (nona­
gouti,  a/a; brown,  b/b;  dilute,  d/d) na condição de produzirem uma 
descendência  nonagouti.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 393
 
N ú m e r o e s e x o  
Deve tratar-se um número suficiente de fêmeas grávidas de forma a 
obter um número adequado de descendentes vivos para cada dose utilizada. A dimensão da amostra depende do número de malhas observadas nos ratinhos tratados bem como da importância dos da ­
dos dos controlos. Só se aceitará um resultado negativo se forem 
examinados pelo menos 300 descendentes das fêmeas tratadas com a dose máxima.
 
C o n t r o l o s n e g a t i v o s e p o s i t i v o s  
Deverá dispor-se de dados de controlo simultâneos respeitantes aos 
ratinhos tratados apenas com o veículo (controlos negativos). Dados 
de controlo de experiências anteriores provenientes do mesmo labo ­
ratório podem ser-lhes reunidos para se aumentar a sensibilidade do teste, no caso de estes serem homogéneos. Se a substância testada 
não se revelar mutagénica, deveriam estar disponíveis os dados ob ­
tidos recentemente pelo mesmo laboratório para um controlo positivo cuja acção mutagénica nesta prova seja conhecida.
 
V i a d e a d m i n i s t r a ç ã o  
As vias de administração habituais nas fêmeas grávidas são a intu ­
bação oral e a injecção intraperitoneal. Tratamentos por inalação ou outras vias de administração serão usados quando tal for apropriado.
 
D o s e s  
Utilizam-se pelo menos dois níveis de dose, um dos quais provo ­
cando sinais de toxicidade ou reduzindo o tamanho das ninhadas. 
No caso de substâncias não tóxicas, recorrer-se-á a um tratamento com a dose máxima praticável.
 
Procedimento  
Administra-se normalmente um tratamento único no dia 8, 9 ou 10 
de gestação, sendo o dia 1 aquele em que se observe pela primeira 
vez a presença de um rolhão vaginal. Estes dias correspondem 7,25, 8,25 e 9,25 dias após a concepção. Podem ser efectuados tratamentos 
sucessivos durante esses dias.
 
A n á l i s e  
Três a quatro semanas após o nascimento a descendência é codificada e 
examinada para se detectar a presença de malhas. Distinguem-se três classes de malhas:
 
a) Malhas brancas situadas a menos de 5 mm da linha médio-ventral 
que se presuma resultarem de morte celular (WMVS);  
b) Malhas amarelas de tipo agouti, associadas aos mamilos, aos 
órgãos genitais, à garganta, às regiões axilar e inguinal bem como no meio da região frontal, que se presuma serem devidas 
a uma diferenciação defeituosa (MDS); e
 
c) Malhas pigmentadas e brancas, distribuídas ao acaso no pêlo, que 
se presuma serem devidas a mutações somáticas (RS).  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 394
 
Contam-se as três classes mas apenas a última, isto é, a RS, tem 
relevância genética. Os problemas postos pela distinção entre as 
classes MDS e RS podem ser resolvidos examinando-se amostras de pêlos ao microscópio de fluorescência.
 
Serão anotadas as alterações macroscópicas evidentes observadas na 
descendência.  
2. RESULTADOS  
Os resultados são apresentados indicando o número total de crias 
examinadas e o número de crias apresentando uma ou várias malhas que se presuma serem devidas a uma mutação somática. Os resulta ­
dos relativos aos animais tratados e aos controlos negativos são 
comparados por métodos apropriados. Os resultados são apresenta ­
dos igualmente referindo-se a ninhada como unidade.
 
3. RELATÓRIO  
3.1. RELATÓRIO DO TESTE  
O relatório do teste deverá incluir as seguintes informações:  
— as estirpes utilizadas no cruzamento,  
— o número de fêmeas grávidas nos grupos tratados e de controlo,  
— o tamanho médio das ninhadas nos grupos tratados e de controlo 
na ocasião do nascimento e do desmame,  
— as doses da substância a testar,  
— o solvente utilizado,  
— o dia da gestação em que se administrou o tratamento,  
— a via de administração,  
— o número total de crias observadas, bem como o número das que 
apresentavam malhas WMVS, MDS e RS nos grupos tratados e de controlo,
 
— alterações morfológicas macroscópicas,  
— relação dose/efeito, se possível,  
— avaliação estatística,  
— discussão dos resultados,  
— interpretação dos resultados.  
3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
4. REFERÊNCIAS  
Ver Introdução Geral, parte B.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 395
 
B.25.  TRANSLOCAÇÃO HEREDITÁRIA NO RATINHO  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
1.2. DEFINIÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Nenhuma.  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
O teste de translocação hereditária no ratinho detecta alterações cro ­
mossómicas estruturais e numéricas nas células germinais de mamí ­
fero que são postas em evidência na descendência da primeira gera ­
ção. Os tipos de alterações cromossómicas detectadas são as trans ­
locações recíprocas e, se for incluída a descendência do sexo femi ­
nino, a perda do cromossoma X. Os portadores de translocações e as 
fêmeas XO apresentam uma fertilidade reduzida, permitindo a selec ­
ção de uma descendência F  1 para análise citogenética. Alguns tipos 
de translocação provocam esterilidade total (X-autossoma e tipo c-t). 
As translocações são observadas por métodos citogenéticos nas cé ­
lulas meióticas na diacinese-metafase I de indivíduos do sexo mas ­
culino, sejam machos F  1 ou filhos de fêmeas F  1 . As fêmeas XO são 
identificadas citogeneticamente pela presença de apenas 39 cromos ­
somas nas mitoses da medula óssea.  
1.5. CRITÉRIOS QUALITATIVOS  
Nenhum.  
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Preparativos  
As substâncias a testar são dissolvidas numa solução salina isotónica. 
Se forem insolúveis na água serão dissolvidas ou colocadas em suspensão em veículos apropriados. Utilizam-se soluções preparadas 
de fresco da substância a testar. Se se utilizar um veículo para 
facilitar a administração este não deve interferir com a substância a testar nem produzir efeitos tóxicos.
 
V i a d e a d m i n i s t r a ç ã o  
As vias de administração são habitualmente a intubação oral ou a 
injecção intraperitoneal. Podem ser adequadas outras vias de admi ­
nistração.  
A n i m a i s d e e x p e r i ê n c i a  
Estas experiências são efectuadas em ratinhos para facilitar a repro ­
dução e a verificação citológica. Não é requerida nenhuma estirpe 
específica. No entanto, o número médio de crias por ninhada da 
estirpe utilizada deverá ser superior a oito e ser relativamente cons ­
tante.  
Serão utilizados animais sãos tendo já atingido a maturidade sexual.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 396
 
N ú m e r o d e a n i m a i s  
O número de animais necessários depende da frequência de trans ­
locações espontâneas bem como da taxa de indução mínima reque ­
rida para um resultado positivo.  
O teste consiste habitualmente na análise da descendência masculina 
F 1 . Serão testados pelo menos 500 descendentes masculinos F  1 por 
cada dose. Se se incluir a descendência feminina F  1 , serão necessá ­
rios 300 machos e 300 fêmeas.  
C o n t r o l o s n e g a t i v o s e p o s i t i v o s  
Devem estar disponíveis dados de controlo adequados provenientes 
de provas realizadas simultaneamente ou de experiências anteriores. Quando existirem dados aceitáveis de controlos positivos provenien ­
tes de experiências efectuadas recentemente no mesmo laboratório, 
estes podem ser utilizados em vez de controlos positivos simultâ ­
neos.
 
D o s e s  
É testada apenas uma dose, tratando-se habitualmente da dose má ­
xima associada à produção de efeitos tóxicos mínimos mas não 
afectando o comportamento reprodutor nem a sobrevivência. Para 
estabelecer uma relação dose/resposta são necessárias duas doses adicionais, mais baixas. No caso de substâncias não tóxicas, deverá recorrer-se a uma exposição à dose máxima praticável.
 
Procedimento  
T r a t a m e n t o e a c a s a l a m e n t o  
São possíveis dois esquemas de tratamento. A administração única 
da substância a testar é o método mais frequente. A substância a testar pode também ser administrada sete dias por semana durante 35 dias. O número de acasalamentos depois do tratamento é determi ­
nado pelo esquema de tratamento e será tal que todos os estádios de 
células germinais sejam implicados. No fim do período de acasala ­
mento as fêmeas são colocadas em gaiolas individuais. Quando as 
fêmeas parirem registar-se-ão a data, o número de crias da ninhada e 
o sexo das crias. Toda a descendência do sexo masculino é desma ­
mada e toda a do sexo feminino afastada a não ser que esteja incluída na experiência.
 
P e s q u i s a d o s h e t e r o z i g ó t i c o s d e t r a n s l o c a ç ã o  
É utilizado um de dois métodos disponíveis:  
— análise da fertilidade da descendência F  1 e verificação ulterior de 
eventuais portadores de translocações por análise citogenética,  
— análise citogenética de todos os machos F  1 sem selecção prévia 
por verificação da fertilidade.  
a) Análise da fertilidade  
A diminuição de fertilidade de um indivíduo F  1 pode ser deter ­
minada observando-se o número de crias da ninhada e/ou anali ­
sando o conteúdo uterino das fêmeas com que acasalou.  
Deverão estabelecer-se critérios para determinação da fertilidade 
normal e diminuída da estirpe de ratinhos utilizada.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 397
 
Observação do número de animais por ninhada:  Os machos F  1 a 
testar são colocados em gaiolas individuais com fêmeas prove ­
nientes da mesma experiência ou da colónia. As gaiolas são inspeccionadas diariamente a partir do dia 18 após o acasalamen ­
to. O número de crias da ninhada e o sexo da descendência F
 2 
são registados na ocasião do nascimento, sendo as crias elimina ­
das em seguida. Se se testar a descendência do sexo feminino F  1 
então os descendentes F  2 provenientes de ninhadas pequenas são 
conservados com vista a uma análise mais profunda. As fêmeas 
portadoras de uma translocação serão objecto de uma verificação 
por análise citogenética de uma translocação em qualquer dos seus descendentes machos. As fêmeas XO são identificadas pela alteração da razão macho/fêmea na sua descendência que 
passa de 1/1 para 1/2 machos/fêmeas. Num método sequencial os 
animais F
 1 normais não serão objecto de outra verificação se a 
primeira ninhada F  2 atingir ou ultrapassar um valor normal prees ­
tabelecido, senão observar-se-á uma segunda ou uma terceira 
ninhada F  2 . 
Os animais F  1 que não puderem ser classificados como normais 
após uma observação de até três ninhadas F  2 no máximo, serão 
submetidos seja a um novo controlo por análise do conteúdo 
uterino das fêmeas com que acasalaram, seja directamente a 
uma análise citogenética.  
Análise do conteúdo uterino:  A redução do número de crias por 
ninhada nos portadores de translocação é devida à morte de 
embriões, de modo que um grande número de implantes mortos 
indica a presença de uma translocação no animal submetido ao teste. Cada macho F
 1 a testar é acasalado com duas ou três 
fêmeas. A concepção é confirmada pela inspecção matinal diária 
das fêmeas para detectar a presença de rolhão vaginal. As fêmeas 
são sacrificadas 14 a 16 dias mais tarde, registando-se o número de implantes vivos e mortos presentes nos seus úteros.
 
b) Análise citogenética  
As preparações de testículo são efectuadas pelo método de seca ­
gem ao ar. Os portadoras de translocações são identificados pela presença de configurações multivalentes na diacinese-metafase I 
nos espermatócitos primários. A observação de pelo menos duas 
células apresentando uma associação multivalente constitui a prova necessária de que o animal testado é portador de uma translocação.
 
Se não tiver sido efectuada nenhuma selecção por análise de 
fertilidade, todos os machos F  1 são submetidos a um exame 
citogenético. Devem ser analisadas ao microscópio um mínimo de 25 células em diacinese-metafase I por macho. É necessário o 
exame das metafases mitóticas nas espermatogónias ou na me ­
dula óssea, no caso dos machos tendo testículos pequenos ou apresentando uma paragem meiótica antes da diacinese ou no caso das fêmeas F
 1 suspeitas de serem XO. A presença de um 
cromossoma anormalmente longo e/ou curto em alguma de 10 
células é a prova de uma translocação particular acarretando a esterilidade do macho (tipo c-t). Algumas translocações X-autos ­
soma provocando a esterilidade do macho podem apenas ser 
identificadas por uma análise de bandas de cromossomas mitóti ­
cos. A presença de 39 cromossomas em 10 mitoses por cada 10 é a prova de um estado XO numa fêmea.
 
2. RESULTADOS  
Os resultados são apresentados sob a forma de quadros.  
O número médio de crias por ninhada e a razão entre os sexos são 
registados à nascença e no desmame para cada período de acasala ­
mento.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 398
 
Quando da avaliação da fertilidade dos animais F  1 deverão apresen ­
tar-se o número médio de crias por ninhada das ninhadas resultantes 
de todos os acasalamentos normais bem como o número de crias individual das ninhadas provenientes de animais F
 1 portadores de 
translocação. No que respeita à análise do conteúdo uterino serão 
anotados o número médio de implantes vivos e mortos resultantes de 
acasalamentos normais e o número de implantes vivos e mortos para cada acasalamento de animais portadores de translocação.
 
Quando da análise citogenética da diacinese-metafase I, serão regis ­
tados os diferentes tipos de configurações multivalentes e o número total de células para cada portador de translocação.
 
Para os indivíduos F  1 estéreis serão indicados o número total de 
acasalamentos e a duração do período de acasalamento. Serão indi ­
cados o peso dos testículos bem como os pormenores da análise citogenética.
 
Para as fêmeas XO indicar-se-á o número de crias médio por ninha ­
da, a razão entre os sexos na descendência F  2 , bem como os resul ­
tados da análise citogenética.  
Se forem seleccionados eventuais portadores de translocação F  1 por 
testes de fertilidade os quadros deverão mencionar quantos deles 
foram confirmados como sendo heterozigóticos de translocação.  
Serão apresentados os dados relativos aos controlos negativos bem 
como as experiências de controlo positivo.  
3. RELATÓRIO  
3.1. RELATÓRIO DO TESTE  
O relatório do teste deverá incluir as seguintes informações:  
— estirpe de ratinho utilizada, idade dos animais, peso dos animais 
tratados,  
— número de animais progenitores de cada sexo nos grupos tratados 
e de controlo,  
— condições experimentais, descrição pormenorizada do tratamento, 
doses, solventes, esquema de acasalamento,  
— número e sexo de crias por fêmea, número e sexo das crias 
mantidas para uma análise de translocação,  
— momento e critérios da análise de translocação,  
— número e descrição pormenorizada dos portadores de transloca ­
ção, incluindo dados relativos à reprodução e ao conteúdo uteri ­
no, se possível,  
— métodos citogenéticos e pormenores da análise microscópica, de 
preferência com fotografias,  
— avaliação estatística,  
— discussão dos resultados,  
— interpretação dos resultados.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 399
 
3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
4. REFERÊNCIAS  
Ver Introdução Geral, parte B.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 400
 
B.26.  ENSAIO DE TOXICIDADE ORAL SUBCRÓNICA ESTUDO DE 
TOXICIDADE ORAL DE DOSE REPETIDA EM ROEDORES 
COM A DURAÇÃO DE 90 DIAS  
1. MÉTODO  
O presente método de ensaio da toxicidade oral subcrónica é idêntico 
ao método OCDE TG 408 (1998).  
1.1. INTRODUÇÃO  
Ao avaliarem-se as características tóxicas de uma substância química 
poderá proceder-se à determinação da toxicidade oral subcrónica utilizando doses repetidas depois de se ter obtido informação inicial 
sobre a toxicidade a partir de ensaios de toxicidade aguda ou de dose 
repetida com a duração de 28 dias. O estudo de 90 dias permite obter informação sobre os perigos para a saúde susceptíveis de decorrer de uma exposição repetida ao longo de um período de tempo prolon ­
gado, abrangendo a maturação e o crescimento após o desmame e 
prolongando-se pela vida adulta. O estudo permitirá obter informa ­
ção sobre os principais efeitos tóxicos, identificar os órgãos-alvo e a 
possibilidade de acumulação, bem como fazer uma estimativa de um 
nível de exposição sem efeitos adversos observados a utilizar na selecção dos níveis de administração em estudos crónicos e na de ­
terminação de critérios de segurança para a exposição no caso de 
seres humanos.
 
O método utilizado dá um maior destaque aos terminais neurológicos 
e permite formar uma ideia sobre os efeitos imunológicos e ao nível da reprodução. Deve salientar-se a necessidade de efectuar uma ob ­
servação clínica pormenorizada dos animais, de modo a obter-se o 
máximo de informação possível. Este estudo deve permitir também identificar substâncias susceptíveis de causar efeitos neurotóxicos, imunológicos ou ao nível dos órgãos de reprodução, que poderão 
justificar uma investigação mais aprofundada.
 
Ver também a parte B da Introdução Geral.  
1.2. DEFINIÇÕES  
Dose:  quantidade de substância administrada. A dose é expressa em 
termos de massa (g, mg) ou em termos da massa da substância em estudo por massa unitária do animal estudado (por exemplo, mg/kg), 
ou em termos de concentrações dietéticas constantes (ppm).
 
Dosagem:  termo geral que abrange a dose administrada, bem como a 
frequência e duração da administração.  
NOAEL:  abreviatura de « no observed adverse effect level » («dose 
sem efeitos adversos observados»), que consiste na dose máxima ou 
no nível de exposição máximo que não produz efeitos adversos detectáveis no ensaio atribuíveis ao mesmo.
 
1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
A substância em estudo é administrada diariamente por via oral, em 
doses crescentes (uma dose por lote), a vários lotes de animais de 
ensaio, durante um período de 90 dias. No decurso deste período, os 
animais são examinados em pormenor, com vista à detecção de quaisquer sinais de toxicidade. Efectua-se a autópsia dos animais que morrem ou são sacrificados durante o ensaio e, no final do 
mesmo, procede-se ao abate dos sobreviventes e à respectiva autóp ­
sia.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 401
 
1.4. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.4.1.  Preparação dos animais  
Devem ser utilizados animais saudáveis que tenham sido aclimatados 
às condições laboratoriais durante pelo menos cinco dias e não te ­
nham sido anteriormente submetidos a procedimentos experimentais. 
Os animais utilizados no estudo devem ser caracterizados quanto à espécie, estirpe, proveniência, sexo, peso e/ou idade. Os animais devem ser repartidos aleatoriamente pelos grupos de ensaio e de 
controlo. As gaiolas devem ser dispostas de modo a reduzir ao 
mínimo os eventuais efeitos devidos à respectiva colocação. Deve ser atribuído a cada animal um número de identificação diferente.
 
1.4.2.  Preparação das doses  
A substância em estudo é administrada por intermédio de uma sonda 
gástrica ou através da alimentação ou da água de beber. O método de 
administração oral depende do objectivo do ensaio, bem como das 
propriedades físico-químicas da substância em estudo.  
Se necessário, a substância é dissolvida ou suspensa num veículo 
adequado. Sempre que possível, recomenda-se que se considere pri ­
meiramente a possibilidade de se utilizar uma solução ou suspensão 
aquosa; em segundo lugar, uma solução ou emulsão em óleo (no ­
meadamente óleo de milho); e, por último, uma solução noutro veículo. No caso de se utilizar um veículo não aquoso, devem co ­
nhecer-se as respectivas características de toxicidade. Deve também 
determinar-se a estabilidade da substância nas condições de adminis ­
tração.
 
1.4.3.  Condições de ensaio  
1.4.3.1.  Animais a utilizar no ensaio  
Embora possa recorrer-se a outros roedores, como por exemplo o 
ratinho, o rato constitui a espécie preferida. Devem utilizar-se ani ­
mais adultos, jovens e saudáveis, de estirpes correntes de laboratório. 
As fêmeas devem ser nulíparas e não grávidas. A administração da substância deve ter início logo que possível após o desmame e, em qualquer caso, antes de os animais completarem nove semanas de 
idade. No início do estudo, a variação de massa dos animais deve ser 
mínima, não excedendo ± 20 % da massa média de cada sexo. Caso o estudo preceda um estudo da toxicidade crónica a longo prazo, é conveniente utilizar em ambos os casos animais da mesma estirpe e 
proveniência.
 
1.4.3.2.  Número e sexo  
Para cada dose devem utilizar-se, pelo menos, 20 animais 
(10 machos e 10 fêmeas). Caso se preveja o sacrifício de alguns 
animais durante o ensaio, o referido número deve ser acrescido do número de animais a sacrificar. Com base em conhecimentos ante ­
riores da substância em estudo ou de um análogo próximo, deverá 
considerar-se a possibilidade de incluir um lote extra de 10 animais 
(cinco de cada sexo) no grupo de controlo e no grupo a que irá ser administrada a dose máxima, a fim de se observar, após o período de ensaio, a reversibilidade ou persistência de eventuais efeitos tóxicos. 
A duração deste período de observação deverá ser correctamente 
estabelecida tendo em conta os efeitos a observar.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 402
 
1.4.3.3.  Doses  
Devem ser utilizadas pelo menos três doses e um controlo simultâ ­
neo, excepto nos casos em que seja realizado um ensaio-limite (ver 1.4.3.4). As doses poderão basear-se nos resultados de estudos de 
dose repetida ou de determinação da gama, e deverão levar em conta 
todos os dados toxicológicos e toxicocinéticos existentes para a subs ­
tância em estudo ou substâncias afins. A dose máxima deve ser seleccionada com a finalidade de provocar toxicidade, mas não a 
morte nem um sofrimento excessivo, a não ser que a natureza físi ­
co-química ou os efeitos biológicos da substância em estudo deter ­
minem que a referida dose seja limitada. Deve seleccionar-se uma 
sequência decrescente de doses, com o objectivo de evidenciar uma 
correlação entre a dose administrada e a reacção observada, bem como a ausência de efeitos adversos associados à administração da dose mínima (NOAEL). A diferença óptima entre as doses consiste, 
frequentemente, num factor de 2 a 4; em muitos casos, a utilização 
de um quarto lote de ensaio é preferível ao recurso a intervalos de grande amplitude (por exemplo, superior a um factor de 6-10) entre as doses.
 
O grupo de controlo deve ser constituído por animais aos quais não é 
administrada a substância em estudo ou um grupo de controlo do 
veículo se for utilizado um veículo para administrar a substância em estudo. Com excepção da exposição à substância em estudo, os animais do grupo de controlo devem ser manuseados de forma idên ­
tica aos outros animais. Caso se recorra a um veículo para a admi ­
nistração da substância em estudo, deve administrar-se o volume máximo do mesmo aos animais do lote de controlo. Se a substância 
em estudo for administrada através dos alimentos e causar um menor 
consumo alimentar, será vantajoso utilizar-se um grupo de controlo alimentado aos pares para se distinguir entre as reduções que se devem à palatabilidade e a alterações toxicológicos no modelo em 
estudo.
 
Deverão considerar-se as seguintes características do veículo e outros 
aditivos, conforme aplicável; efeitos ao nível da absorção, distribui ­
ção, metabolismo ou retenção da substância em estudo; efeitos nas propriedades químicas da substância em estudo susceptíveis de alte ­
rar as suas características tóxicas; e efeitos no consumo de alimentos 
ou água ou no estado nutricional dos animais.
 
1.4.3.4.  Ensaio-limite  
Sempre que um ensaio, realizado de acordo com o presente método, 
que utilize uma dose de pelo menos 1 000 mg/kg de massa corporal/ ­
dia, não produza efeitos tóxicos observáveis, ou se, tendo em conta 
dados referentes a substâncias estruturalmente afins, não se prevejam 
efeitos tóxicos, poderá não ser necessário efectuar um ensaio com ­
pleto com três doses. Nestes casos, justifica-se a realização de um ensaio-limite, excepto se a exposição humana indicar a necessidade 
de recurso a uma dose superior.
 
1.5. PROCEDIMENTO  
1.5.1.  Administração das doses  
A substância é administrada diariamente aos animais durante um 
período de 90 dias; em casos devidamente justificados, pode proce ­
der-se à administração cinco dias por semana. A administração for ­
çada deve efectuar-se numa dose única, por intermédio de uma sonda 
gástrica ou de uma cânula de intubação adequada. O volume má ­
ximo de líquido que pode administrar-se de cada vez depende das dimensões do animal. Esse volume não deve exceder 1 ml/100 g de massa corporal, excepto no caso de soluções aquosas, em que se 
poderá utilizar um volume de 2 ml/100 g de massa corporal. Salvo 
no caso de substâncias corrosivas ou irritantes, cujos efeitos são, de modo geral, agravados em concentrações mais elevadas, devem mi ­
nimizar-se as variações no volume mediante o ajustamento da con ­
centração, de modo a assegurar um volume constante para todas as 
doses.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 403
 
Caso a substância em estudo seja administrada através dos alimentos 
ou da água de beber, deve assegurar-se que as respectivas quantida ­
des não perturbam o equilíbrio nutricional e hídrico normal. Se a substância for administrada com os alimentos, pode utilizar-se uma concentração alimentar constante, expressa em ppm, ou uma dose 
constante, expressa em relação à massa corporal dos animais; deve 
especificar-se a alternativa adoptada. No caso do recurso a uma sonda gástrica, a dose deve ser administrada diariamente à mesma hora e, se necessário, ajustada de modo a manter uma dose constante 
em relação à massa corporal do animal. Caso um ensaio de 90 dias 
preceda um estudo da toxicidade crónica a longo prazo, é conve ­
niente utilizar uma dieta semelhante em ambos os ensaios.
 
1.5.2.  Observações  
O período de observação deve ser de, pelo menos, 90 dias. Os 
animais incluídos nos lotes extra destinados a observações subse ­
quentes devem ser mantidos durante um período de tempo suficiente sem administração da substância em estudo de modo a detectar a 
persistência ou a recuperação dos efeitos tóxicos.
 
Deve efectuar-se um exame clínico pelo menos uma vez por dia, de 
preferência à mesma hora, em função do período previsto de efeitos 
mais agudos devidos à administração da substância, registando-se o estado de saúde dos animais. Todos os animais deverão ser exami ­
nados pelo menos duas vezes por dia, normalmente ao princípio e ao 
fim de cada dia, a fim de se identificarem sinais de morbilidade e 
mortalidade.
 
Deve proceder-se a um exame clínico aprofundado de todos os 
animais pelo menos uma vez antes da primeira exposição (de modo a permitir efectuar comparações para o mesmo indivíduo) e uma vez por semana após a mesma. O exame deve decorrer no 
exterior da gaiola, num recinto adequado e, de preferência, à mesma 
hora. As observações devem ser cuidadosamente registadas, de pre ­
ferência por recurso a um sistema definido em pormenor pelo labo ­
ratório em causa. Deve procurar-se assegurar que as variações nas 
condições de observação sejam mínimas. Os sinais anotados devem 
incluir, nomeadamente, alterações na pele, no pêlo, nos olhos e nas mucosas, bem como a ocorrência de secreções, excreções ou activi ­
dade autónoma (como, por exemplo, lacrimação, erecção pilosa, al ­
terações nas pupilas, respiração anormal). Devem também registar-se 
quaisquer alterações da atitude, postura e reacção à manipulação, além da ocorrência de movimentos clónicos ou tónicos e comporta ­
mentos estereotipados (por exemplo, actos de higiene repetitivos, 
movimentos circulares repetitivos) ou estranhos (automutilação, mar ­
cha para a retaguarda) (1).
 
Deve proceder-se a um exame oftalmológico, utilizando um oftal ­
moscópio ou equipamento equivalente adequado, antes de se iniciar a administração da substância em estudo e ao terminar o estudo, de preferência a todos os animais, ou pelo menos aos animais dos 
grupos de dose máxima e de controlo. Se forem detectadas alterações 
nos olhos, devem examinar-se todos os animais.
 
Na fase final do período de exposição, mas, em qualquer caso, nunca 
antes da 11.  a semana, deve proceder-se à avaliação da reactividade 
sensorial a estímulos de diferentes tipos (1) (por exemplo, estímulos auditivos, visuais e proprioceptivos) (2), (3), (4), avaliação da força 
de preensão (5) e avaliação da actividade motora (6). Para mais 
pormenores sobre os procedimentos que se podem utilizar, devem consultar-se as respectivas referências. No entanto, também se pode ­
rão adoptar procedimentos alternativos aos indicados nas referências.
 
As observações funcionais poderão ser omitidas na fase final do 
estudo quando existirem dados sobre observações funcionais de ou ­
tros estudos e os exames clínicos realizados diariamente não revela ­
rem quaisquer deficiências funcionais.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 404
 
Excepcionalmente, podem omitir-se as observações funcionais no 
caso de lotes que apresentem sinais de toxicidade cuja intensidade 
seja susceptível de interferir de modo significativo com as mesmas.  
1.5.2.1.  Massa corporal e consumo de alimentos/água  
Todos os animais devem ser pesados pelo menos uma vez por se ­
mana. O consumo de alimentos deve ser medido pelo menos uma vez por semana. Se a substância em estudo for administrada através 
da água de beber, deve também medir-se o consumo de água pelo 
menos uma vez por semana. O consumo de água também poderá ser levado em conta em estudos dietéticos ou de administração forçada em que esse consumo se possa alterar.
 
1.5.2.2.  Hematologia e bioquímica clínica  
Devem colher-se amostras de sangue de um local designado e, caso 
aplicável, essas amostras deverão ser armazenadas em condições adequadas. No final do período de estudo, serão colhidas amostras logo antes de se abaterem os animais ou como parte do procedi ­
mento de abate.
 
No final do ensaio e no caso de terem sido colhidas amostras de 
sangue intercalares, devem determinar-se os seguintes parâmetros hematológicos: hematócrito, concentração de hemoglobina, contagem 
de eritrócitos, contagem total e diferencial de leucócitos, contagem 
de plaquetas e medida do tempo/potencial de coagulação.
 
Devem também efectuar-se determinações bioquímicas destinadas a 
investigar os principais efeitos tóxicos sobre os tecidos, nomeada ­
mente renal e hepático, com amostras de sangue de todos os animais, colhidas imediatamente antes do respectivo abate ou no âmbito do mesmo (com excepção dos animais encontrados moribundos ou aba ­
tidos no decurso do ensaio). Tal como no caso de estudos hemato ­
lógicos, poderá efectuar-se uma recolha de amostras intercalares para efeito de análises bioquímicas clínicas. Recomenda-se que os ani ­
mais sejam jejuados desde a véspera da colheita de sangue (
 1 ). Os 
parâmetros a determinar no plasma ou no soro são os seguintes: 
sódio, potássio, glicose, colesterol total, ureia, creatinina, proteínas totais e albumina, além de, pelo menos, dois enzimas indicadores dos efeitos hepatocelulares (tais como a alanina-aminotransferase, a as ­
partato-aminotransferase, a fosfatase alcalina, a gama-glutamil trans ­
peptidase e a sorbitol-desidrogenase). A determinação de outras en ­
zimas de origem hepática ou diversa, bem como de ácidos biliares, 
poderá, em determinados casos, proporcionar informações úteis.
 
Em opção, podem realizar-se na última semana do ensaio as seguin ­
tes determinações na urina, recolhida de acordo com um programa previamente estabelecido: aparência, volume, osmolalidade ou gravi ­
dade específica, pH, proteínas, glicose e sangue/hematócitos.
 
Além disso, deve prever-se a pesquisa de marcadores séricos que 
forneçam indicações gerais sobre a lesão de tecidos. Caso as pro ­
priedades conhecidas da substância afectem, ou se preveja que pos ­
sam afectar, perfis metabólicos conexos, devem realizar-se outras determinações, nomeadamente de cálcio, fosfatos, triglicéridos em jejum, hormonas específicas, meta-hemoglobina e colinesterase. A 
necessidade de efectuar tais determinações é estabelecida em função 
do tipo de substância em estudo ou de cada caso específico.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 405  
( 1 ) Para a determinação de determinados parâmetros no soro e no plasma, nomeadamente a 
glicose, é preferível que os animais sejam jejuados desde a véspera, principalmente 
porque, não sendo jejuados, haverá inevitavelmente uma maior variabilidade que tenderá 
a encobrir os efeitos mais subtis e a tornar difícil a interpretação dos resultados. 
No entanto, por outro lado, o jejum desde a véspera poderá interferir no metabolismo 
geral dos animais, e, particularmente em estudos alimentares, poderá perturbar a expo ­
sição diária à substância em estudo. Se for adoptado o jejum desde a véspera, deverão 
efectuar-se determinações bioquímicas após a realização das observações funcionais do 
estudo.
 De um modo geral, deve adoptar-se uma abordagem flexível, em 
função das espécies e dos efeitos observados e/ou previstos da subs ­
tância em causa.  
Se os dados disponíveis relativos a ensaios anteriores se revelarem 
inadequados, haverá que decidir sobre a necessidade de se determi ­
narem parâmetros hematológicos e bioquímicos antes de administrar a substância. De um modo geral, não se recomenda que estes dados sejam gerados antes de se iniciar a administração (7).
 
1.5.2.3.  Autópsia geral  
Todos os animais devem ser objecto de uma autópsia geral porme ­
norizada que inclua o exame da superfície exterior do corpo, dos orifícios e das cavidades craniana, torácica e abdominal, bem como do respectivo conteúdo. Devem remover-se de modo adequado as 
membranas aderentes a órgãos tais como o fígado, os rins, as glân ­
dulas supra-renais, os testículos, os epidídimos, o timo, o baço, o cérebro e o coração, cuja massa húmida deve ser determinada logo que possível após a dissecação, de modo a evitar a respectiva des ­
secação. Este procedimento aplica-se a todos os animais (excepto os 
que estiverem moribundos ou tiverem sido abatidos no decurso do ensaio).
 
Os órgãos e tecidos que se seguem devem ser conservados num 
meio de fixação adequado aos mesmos, bem como ao tipo de exame histopatológico subsequente: todos os tecidos que apresentem lesões evidentes, encéfalo (regiões representativas, nomeadamente cérebro, 
cerebelo e protuberância), espinal medula (a três níveis: cervical, 
médio-torácico e lombar), pituitária, tiróide, paratiróide, timo, esófa ­
go, glândulas salivares, estômago, intestino delgado e cólon (in ­
cluindo as placas de Peyer), fígado, rins, glândulas supra-renais, 
baço, coração, traqueia e pulmões (conservados por insuflação com fixador seguida de imersão), aorta, gónadas, útero, órgãos genitais acessórios, glândula mamária (nas fêmeas), próstata, bexiga, vesícula 
(ratinho), gânglios linfáticos (de preferência um gânglio situado na 
via de administração e um gânglio distante da mesma, de modo a investigar possíveis efeitos sistémicos), nervos periféricos (ciático ou tibial), de preferência na proximidade de músculos, e uma secção de 
medula óssea (ou, como alternativa, um aspirado de medula óssea 
recentemente montado), pele e olhos (se tiverem sido observadas alterações no exame oftalmológico). Em função das observações clínicas ou de natureza diversa efectuadas, poderá ser necessário 
examinar outros tecidos. Devem também conservar-se quaisquer ór ­
gãos susceptíveis de constituírem alvos da substância em estudo, em virtude das propriedades conhecidas da mesma.
 
1.5.2.4.  Histopatologia  
Deve proceder-se ao exame histopatológico dos órgãos e tecidos 
conservados dos animais dos grupos de controlo, bem como dos 
lotes sujeitos a doses elevadas. Caso o exame destes últimos revele alterações atribuíveis à substância em estudo, devem examinar-se também os animais de todos os lotes restantes.
 
Devem examinar-se todas as lesões importantes.  
Sempre que se recorra a um lote extra, deve proceder-se ao exame 
histopatológico dos tecidos e órgãos que tenham revelado alterações 
nos animais dos restantes lotes.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 406
 
2. RESULTADOS E SUA APRESENTAÇÃO  
2.1. DADOS  
Devem registar-se os dados relativos a cada animal. Além disso, 
todos os dados devem ser resumidos num quadro, referindo-se, 
para cada lote de ensaio, o número de animais no início do ensaio, 
o número de animais encontrados mortos durante o ensaio ou aba ­
tidos por uma questão de humanidade, a hora da morte de cada animal, o número de animais que apresentam sinais de toxicidade, 
a descrição dos sinais de toxicidade observados, nomeadamente o 
tempo decorrido até à respectiva manifestação, bem como a sua duração e gravidade, o número de animais que apresentem lesões, 
o tipo de lesões e a percentagem de animais que apresentam cada 
tipo de lesões.
 
Caso aplicável, os resultados numéricos devem ser avaliados se ­
gundo um método estatístico adequado e geralmente aceite. Os mé ­
todos estatísticos e dados a serem analisados devem ser selecciona ­
dos durante a fase de concepção do estudo.  
2.2. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deverá incluir as seguintes informações:  
2.2.1.  Substância em estudo:  
— natureza física, pureza e propriedades físico-químicas,  
— dados de identificação,  
— veículo (caso aplicável): justificação da escolha de um veículo 
não aquoso.  
2.2.2.  Espécie submetida ao ensaio:  
— espécie e estirpe utilizada,  
— número, idade e sexo dos animais,  
— origem, condições de acomodação, alimentação, etc.,  
— massa de cada animal no início do ensaio.  
2.2.3.  Condições do ensaio:  
— justificação das doses seleccionadas,  
— pormenores relativos à preparação da substância em estudo e à 
sua eventual incorporação nos alimentos, nomeadamente a res ­
pectiva concentração, estabilidade e homogeneidade,  
— modo de administração da substância em estudo,  
— doses reais (mg/kg massa corporal/dia), e factor de conversão da 
concentração da substância em estudo na alimentação/abeberação 
(ppm) para a dose real, quando aplicável,  
— pormenores relativos à qualidade dos alimentos e da água.  
2.2.4.  Resultados:  
— massa corporal e respectivas alterações,  
— consumo de alimentos e de água, se for caso disso,  
— reacções tóxicas em função do sexo e da dose administrada, 
nomeadamente sinais de toxicidade,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 407
 
— natureza, gravidade e duração dos sinais clínicos (reversíveis ou 
não),  
— resultados do exame oftalmológico,  
— dados relativos à actividade sensorial, força de preensão e acti ­
vidade motora (caso existam),  
— resultados da análise hematológica, acompanhados dos respecti ­
vos parâmetros de base,  
— resultados da análise bioquímica, acompanhados dos respectivos 
parâmetros de base,  
— massa corporal final, massa dos órgãos e relações massas dos 
órgãos/massa corporal,  
— dados obtidos por autópsia,  
— descrição pormenorizada dos resultados do exame histopatológi ­
co, 
— dados de absorção, caso se encontrem disponíveis,  
— tratamento estatístico dos resultados, se for caso disso.  
Discussão dos resultados.  
Conclusões.  
3. REFERÊNCIAS  
(1) IPCS, (1986) Principles and Methods for the Assessment of 
Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals. Envi ­
ronmental Health Criteria Document No 60.  
(2) Tupper, D.E., Wallace, R.B., (1980) Utility of the Neurologic 
Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, p. 999-1003.  
(3) Gad, S.C., (1982) A Neuromuscular Screen for Use in Indus ­
trial Toxicology. J.Toxicol. Environ. Health, 9, p. 691-704.  
(4) Moser, V.C., Mc Daniel, K.M., Phillips, P.M., (1991) Rat 
Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observatio ­
nal Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz. Toxicol. 
Appl. Pharmacol., 108, p. 267-283.  
(5) Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C., Riley M.T., (1979) A 
Method for the Routine Assesment of Fore- and Hind-limb grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. Toxivol., 1, p. 
233-236.
 
(6) Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter 
L.W., Tilson H.A., MacPhail R.C., (1991) Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for 
Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 
p. 599-609.
 
(7) Weingand K., Brown G., Hall R.  et al.  (1996). Harmonisation 
of Animal Clinic Pathology Testing in Toxicity and Safety 
Studies, Fundam. & Appl. Toxicol, 29, pp. 198-201.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 408
 
B.27.  ENSAIO DE TOXICIDADE ORAL SUBCRÓNICA ESTUDO DE 
TOXICIDADE ORAL DE DOSE REPETIDA EM ESPÉCIES 
NÃO ROEDORAS COM A DURAÇÃO DE 90 DIAS  
1. MÉTODO  
O presente método de ensaio da toxicidade oral subcrónica é idêntico 
ao método OCDE TG 409 (1998).  
1.1. INTRODUÇÃO  
Ao avaliarem-se as características tóxicas de uma substância, poderá 
proceder-se à determinação da toxicidade oral subcrónica utilizando doses repetidas depois de se ter obtido informação inicial sobre a 
toxicidade em ensaios de toxicidade aguda ou de dose repetida com 
a duração de 28 dias. O estudo de 90 dias permite obter informação sobre os perigos para a saúde susceptíveis de decorrer de uma ex ­
posição repetida ao longo de um período de crescimento rápido e até 
ao início da vida adulta. O estudo permitirá obter informação sobre 
os principais efeitos tóxicos, identificar os órgãos-alvo e a possibili ­
dade de acumulação, bem como fazer uma estimativa de um nível de exposição sem efeitos adversos observados a utilizar na selecção dos 
níveis de administração em estudos crónicos e na determinação de 
critérios de segurança para a exposição no caso de seres humanos.
 
O método de ensaio permite identificar, em espécies não roedoras, os 
efeitos adversos da exposição a substâncias químicas e deve ser 
utilizado apenas:  
— nos casos em que os efeitos observados noutros estudos revelem 
a necessidade de clarificação/caracterização numa segunda espé ­
cie não roedora, ou  
— nos casos em que estudos toxicocinéticos revelem que uma de ­
terminada espécie não roedora é a escolha de animal laboratorial 
mais adequada, ou  
— nos casos em que outras razões específicas justifiquem a utiliza ­
ção de uma espécie não roedora.  
Ver também a parte B da Introdução Geral.  
1.2. DEFINIÇÕES  
Dose : quantidade de substância administrada. A dose é expressa em 
termos de massa (g, mg) ou em termos da massa da substância de 
ensaio por massa unitária do animal estudado (por exemplo, mg/kg), ou em termos de concentrações dietéticas constantes (ppm).
 
Dosagem : termo geral que abrange a dose administrada, bem como a 
frequência e duração da administração.  
NOAEL : abreviatura de «no  observed adverse effect level » («dose 
sem efeitos adversos observados»), que consiste na dose máxima ou no nível de exposição máximo que não produz efeitos adversos detectáveis no ensaio atribuíveis ao mesmo.
 
1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
A substância em estudo é administrada diariamente por via oral, em 
doses crescentes (uma dose por lote), a vários lotes de animais de 
ensaio, durante um período de 90 dias. No decurso deste período os 
animais são examinados em pormenor, com vista à detecção de quaisquer sinais de toxicidade. Efectua-se a autópsia dos animais que morrem ou são sacrificados durante o ensaio e, no final do 
mesmo, procede-se ao abate dos sobreviventes e à respectiva autóp ­
sia.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 409
 
1.4. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.4.1.  Selecção das espécies animais  
A espécie não roedora normalmente utilizada é o cão, que deve ser 
de uma raça específica: utiliza-se frequentemente o  beagle.  Poderão 
também utilizar-se outras espécies, como, por exemplo, suínos ou 
mini-suínos. Não se recomendam primatas, cuja utilização deve ser justificada. Devem utilizar-se animais jovens e saudáveis, e, no caso do cão, a administração deve iniciar-se de preferência aos 4-6 meses, 
o mais tardar aos 9 meses de idade. No caso de o estudo preceder 
um estudo da toxicidade crónica a longo prazo, deve utilizar-se a mesma espécie/raça em ambos os casos.
 
1.4.2.  Preparação dos animais  
Devem ser utilizados animais saudáveis que tenham sido aclimatados 
às condições laboratoriais e não tenham sido anteriormente subme ­
tidos a processos experimentais. A duração da aclimatação dependerá 
da espécie seleccionada para o ensaio e da sua proveniência. Reco ­
menda-se uma aclimatação de pelo menos cinco dias para os cães ou suínos especificamente criados para o efeito a partir de uma colónia residente, e pelo menos duas semanas para suínos de proveniência 
externa. Os animais utilizados no estudo devem ser caracterizados 
quanto à espécie, estirpe, proveniência, sexo, peso e/ou idade. Os animais devem ser repartidos aleatoriamente pelos grupos de ensaio e de controlo. As gaiolas devem ser dispostas de modo a que eventuais 
efeitos devidos à respectiva colocação sejam minimizados. Deve 
atribuir-se a cada animal um número de identificação diferente.
 
1.4.3.  Preparação das doses  
A substância em estudo pode ser administrada através dos alimentos 
ou da água de beber, por sonda gástrica ou em cápsulas. O método 
de administração oral depende do objectivo do ensaio, bem como das propriedades físico-químicas da substância em estudo.
 
Se necessário, a substância é dissolvida ou suspensa num veículo 
adequado. Sempre que possível, recomenda-se que se considere pri ­
meiramente a possibilidade de se utilizar uma solução ou suspensão 
aquosa; em segundo lugar, uma solução ou emulsão em óleo (no ­
meadamente óleo de milho); e, por último, uma solução noutro veículo. No caso de se utilizar um veículo não aquoso, devem co ­
nhecer-se as respectivas características de toxicidade. Deve também 
determinar-se a estabilidade da substância nas condições de adminis ­
tração.
 
1.5. PROCEDIMENTOS  
1.5.1.  Número e sexo dos animais  
Para cada dose devem utilizar-se, pelo menos, oito animais (quatro 
machos e quatro fêmeas). Caso se preveja o sacrifício de alguns animais durante o ensaio, o referido número deve ser acrescido do 
número de animais a sacrificar. O número de animais no final do 
estudo deve ser suficiente para permitir uma avaliação válida dos efeitos tóxicos. Com base em conhecimentos anteriores da substância em estudo ou de um análogo próximo, deverá considerar-se a pos ­
sibilidade de incluir um lote extra de oito animais (quatro por sexo) 
no grupo de controlo e no grupo a que irá ser administrada a dose máxima, a fim de se observar, após o período de ensaio, a reversi ­
bilidade ou persistência de eventuais efeitos tóxicos. A duração deste 
período de observação deverá ser correctamente estabelecida tendo 
em conta os efeitos a observar.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 410
 
1.5.2.  Dosagem  
Devem ser utilizadas pelo menos três doses e um controlo simultâ ­
neo, excepto nos casos em que seja realizado um ensaio-limite (ver 1.5.3). As doses poderão basear-se nos resultados de estudos de dose 
repetida ou de determinação da gama e deverão levar em conta todos 
os dados toxicológicos e toxicocinéticos existentes relativos ao com ­
posto em estudo ou a substâncias afins. A dose máxima deve ser seleccionada com a finalidade de provocar toxicidade, mas não a 
morte nem um sofrimento excessivo, a não ser que a natureza físi ­
co-química ou os efeitos biológicos da substância em estudo deter ­
minem que a referida dose seja limitada. Deve seleccionar-se uma 
sequência decrescente de doses, com o objectivo de evidenciar uma 
correlação entre a dose administrada e a reacção observada, bem como a ausência de efeitos adversos associados à administração da dose mínima (NOAEL). A diferença óptima entre as doses consiste, 
frequentemente, num factor de 2 a 4; em muitos casos, a utilização 
de um quarto lote de ensaio é preferível ao recurso a intervalos de grande amplitude (por exemplo, superior a um factor de 6-10) entre as doses.
 
O grupo de controlo deve ser constituído por animais aos quais não é 
administrada a substância em estudo ou um grupo de controlo do veículo se for utilizado um veículo para administrar a substância em 
estudo. Com excepção da exposição à substância em estudo, os 
animais do grupo de controlo devem ser manuseados de forma idên ­
tica aos outros animais. Caso se recorra a um veículo para a admi ­
nistração da substância em estudo, deve administrar-se o volume 
máximo do mesmo aos animais do lote de controlo. Se a substância 
em estudo for administrada através dos alimentos provocando um menor consumo alimentar, será vantajoso utilizar-se um grupo de controlo alimentado aos pares para se distinguir entre as reduções 
que se devem à palatabilidade e a alterações toxicológicos no modelo 
em estudo.
 
Deverão considerar-se as seguintes características do veículo e outros 
aditivos, conforme aplicável: efeitos ao nível da absorção, distribui ­
ção, metabolismo ou retenção da substância em estudo; efeitos nas propriedades químicas da substância em estudo susceptíveis de alte ­
rar as suas características tóxicas; e efeitos no consumo de alimentos 
ou água ou no estado nutricional dos animais.
 
1.5.3.  Ensaio-limite  
Sempre que um ensaio, realizado de acordo com o presente método, 
que utilize uma dose de, pelo menos, 1 000 mg/kg de massa 
corporal/dia, não produza efeitos tóxicos observáveis, ou se, tendo 
em conta dados referentes a substâncias estruturalmente afins, não se prevejam efeitos tóxicos, poderá não ser necessário efectuar um ensaio completo com três doses. Nestes casos justifica-se a realização 
de um ensaio-limite, excepto se a exposição humana indicar a ne ­
cessidade de recurso a uma dose superior.
 
1.5.4.  Administração das doses  
A substância é administrada diariamente aos animais durante um 
período de 90 dias; em casos devidamente justificados, pode proce ­
der-se à administração cinco dias por semana. A administração for ­
çada deve efectuar-se numa dose única, por intermédio de uma sonda gástrica ou de uma cânula de intubação adequada. O volume má ­
ximo de líquido que pode administrar-se de cada vez depende das 
dimensões do animal. Normalmente, deve administrar-se o mínimo 
volume possível. Salvo no caso de substâncias corrosivas ou irritan ­
tes, cujos efeitos são, de modo geral, agravados em concentrações mais elevadas, devem minimizar-se as variações no volume mediante 
o ajustamento da concentração, de modo a assegurar um volume 
constante para todas as doses.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 411
 
Caso a substância em estudo seja administrada através dos alimentos 
ou da água de beber, deve assegurar-se que as respectivas quantida ­
des não perturbam o equilíbrio nutricional e hídrico normal. Se a substância for administrada com os alimentos, pode utilizar-se uma concentração alimentar constante, expressa em ppm, ou uma dose 
constante, expressa em relação à massa corporal dos animais; deve 
especificar-se a alternativa adoptada. No caso de uma substância administrada por meio de uma sonda gástrica ou cápsula, a dose deve ser administrada diariamente à mesma hora e, se necessário, 
ajustada de modo a manter uma dose constante em relação à massa 
corporal do animal. Caso um ensaio de 90 dias preceda um estudo da toxicidade crónica a longo prazo, é conveniente utilizar uma dieta semelhante em ambos os ensaios.
 
1.5.5.  Observações  
O período de observação deve ser de, pelo menos, 90 dias. Os 
animais incluídos nos lotes extra destinados a observações subse ­
quentes devem ser mantidos em observação durante um período de tempo suficiente sem administração da substância em estudo, de modo a detectar a persistência ou a recuperação dos efeitos tóxicos.
 
Deve efectuar-se um exame clínico pelo menos uma vez por dia, de 
preferência à mesma hora, em função do período previsto de efeitos mais agudos devidos à administração da substância, registando-se o estado de saúde dos animais. Todos os animais deverão ser exami ­
nados pelo menos duas vezes por dia, normalmente ao princípio e ao 
fim de cada dia, a fim de se identificarem sinais de morbilidade e mortalidade.
 
Deve proceder-se a um exame clínico aprofundado de todos os 
animais pelo menos uma vez antes da primeira exposição (de modo a permitir efectuar comparações com o mesmo indivíduo) e uma vez por semana após a mesma. Estas observações devem ser 
feitas, caso possível, fora da gaiola, num recinto adequado, e de 
preferência sempre às mesmas horas. Deve procurar-se assegurar que as variações nas condições de observação sejam mínimas. Os sinais de toxicidade devem ser cuidadosamente registados, incluindo 
a hora a que se manifestaram, a sua intensidade e duração. As 
observações devem incluir alterações na pele, no pêlo, nos olhos e nas mucosas, bem como a ocorrência de secreções, excreções ou actividade autónoma (como, por exemplo, lacrimação, erecção pilo ­
sa, alterações nas pupilas, respiração anormal). Devem também re ­
gistar-se quaisquer alterações da atitude, postura e reacção à mani ­
pulação, além da ocorrência de movimentos clónicos ou tónicos e comportamentos estereotipados (por exemplo, actos de higiene repe ­
titivos, movimentos circulares repetitivos) ou estranhos.
 
Deve proceder-se a um exame oftalmológico, utilizando um oftal ­
moscópio ou equipamento equivalente adequado, antes de se iniciar a administração da substância em estudo e ao terminar o estudo, de 
preferência a todos os animais, mas pelo menos, aos animais dos 
grupos de dose máxima e de controlo. Se forem detectadas alterações nos olhos atribuíveis à substância em estudo, devem examinar-se todos os animais.
 
1.5.5.1.  Massa corporal e consumo de alimentos/água  
Todos os animais devem ser pesados pelo menos uma vez por se ­
mana. O consumo de alimentos deve ser medido pelo menos uma 
vez por semana. Se a substância em estudo for administrada através da água de beber, deve também medir-se o consumo de água pelo menos uma vez por semana. O consumo de água também poderá ser 
levado em conta em estudos dietéticos ou de administração forçada 
em que esse consumo se possa alterar.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 412
 
1.5.5.2.  Hematologia e bioquímica clínica  
Devem colher-se amostras de sangue de um local designado e, caso 
aplicável, essas amostras deverão ser armazenadas em condições adequadas. No final do período de estudo serão colhidas amostras 
mesmo antes de se abaterem os animais ou como parte do procedi ­
mento de abate.
 
No início do estudo e, posteriormente, a intervalos mensais ou a 
meio do período do estudo, e, por último, no final do estudo, devem 
determinar-se os seguintes parâmetros hematológicos: hematócrito, concentração de hemoglobina, contagem de eritrócitos, contagem total e diferencial de leucócitos, contagem de plaquetas e medida 
do potencial de coagulação, como, por exemplo, tempo de coagula ­
ção, tempo de protrombina, ou tempo do tromboplastina.
 
Devem também efectuar-se determinações bioquímicas destinadas a 
investigar os principais efeitos tóxicos sobre os tecidos, nomeada ­
mente renal e hepático, com amostras de sangue de todos os animais, colhidas no início do estudo, em seguida mensalmente ou a meio do período do estudo, e, por último, no final do período do estudo. As 
áreas de ensaio que devem ser consideradas são o equilíbrio elec ­
trolítico, o metabolismo dos hidratos de carbono, e as funções he ­
pática e renal. A selecção de ensaios específicos será feita com base 
em observações do modo de acção da substância em estudo. Reco ­
menda-se que os animais sejam jejuados durante um período de tempo adequado para a respectiva espécie antes de se proceder à colheita de amostras de sangue. Sugere-se que sejam determinados 
os seguintes parâmetros: cálcio, fósforo, cloreto, sódio, potássio, 
glicose em jejum, alanina-aminotransferase, aspartato-aminotransfera ­
se, ornitina descarboxilase, gama-glutamil-transpeptidase, nitrogénio ureico, albumina, creatinina no sangue, bilirrubina total e proteína 
sérica total.
 
Devem efectuar-se determinações na urina pelo menos no início, 
seguidamente a meio, e, por último, no final do estudo de acordo 
com um programa previamente estabelecido. As determinações a 
efectuar na urina devem incluir a aparência, volume, osmolalidade ou gravidade específica, pH, proteínas, glicose e sangue/hematócitos. Caso necessário, poderão utilizar-se outros parâmetros a fim de alar ­
gar o estudo de um ou mais efeitos observados.
 
Além disso, deve prever-se a pesquisa de marcadores séricos que 
forneçam indicações gerais sobre a lesão de tecidos. Entre outras 
determinações que poderão ser necessárias para uma avaliação toxi ­
cológica adequada referem-se análises de lípidos, hormonas, equilí ­
brio ácidos/bases, meta-hemoglobina e inibição da colinesterase. Caso necessário, poderão efectuar-se outras determinações bioquími ­
cas para alargar o estudo dos efeitos observados. A necessidade de 
efectuar tais determinações é estabelecida em função do tipo de substância em estudo ou de cada caso específico.
 
De um modo geral, deve adoptar-se uma abordagem flexível, em 
função das espécies e dos efeitos observados e/ou previstos da subs ­
tância em causa.  
1.5.5.3.  Autópsia geral  
Todos os animais devem ser objecto de uma autópsia geral porme ­
norizada que inclua o exame da superfície exterior do corpo, dos 
orifícios e das cavidades craniana, torácica e abdominal, bem como 
do respectivo conteúdo. Devem remover-se de modo adequado as membranas aderentes a órgãos tais como o fígado (com a vesícula), os rins, as glândulas supra-renais, os testículos, os epidídimos, os 
ovários, o útero, a tiróide (com paratiróides), o timo, o baço, o 
cérebro e o coração, cuja massa húmida deve ser determinada logo que possível após a dissecação, de modo a evitar a respectiva des ­
secação. Este procedimento aplica-se a todos os animais (excepto os 
que estiverem moribundos ou tiverem sido abatidos no decurso do 
ensaio).
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 413
 
Os órgãos e tecidos que se seguem devem ser conservados num 
meio de fixação adequado aos mesmos, bem como ao tipo de exame 
histopatológico subsequente: todos os tecidos que apresentem lesões evidentes, encéfalo (regiões representativas, nomeadamente cérebro, cerebelo e protuberância), espinal medula (a três níveis: cervical, 
médio-torácico e lombar), pituitária, olhos, tiróide, paratiróide, timo, 
esófago, glândulas salivares, estômago, intestino delgado e cólon (incluindo as placas de Peyer), fígado, vesícula, pâncreas, rins, glân ­
dulas supra-renais, baço, coração, timo, tiróide, traqueia e pulmões, 
aorta, gónadas, útero, órgãos genitais acessórios, glândula mamária 
feminina, bexiga, gânglios linfáticos (de preferência um gânglio si ­
tuado na via de administração e um gânglio distante da mesma, de modo a investigar possíveis efeitos sistémicos), nervos periféricos 
(ciático ou tibial), de preferência na proximidade de músculos, e 
uma secção de medula óssea (ou, como alternativa, um aspirado de medula óssea recentemente montado) e pele. Em função das observações clínicas ou de natureza diversa efectuadas, poderá ser 
necessário examinar outros tecidos. Devem também conservar-se 
quaisquer órgãos susceptíveis de constituírem alvos da substância em estudo, em virtude das propriedades conhecidas da mesma.
 
1.5.5.4.  Histopatologia  
Deve proceder-se ao exame histopatológico dos órgãos e tecidos 
conservados dos animais dos grupos de controlo, bem como dos 
lotes sujeitos a doses elevadas. Caso o exame destes últimos revele 
alterações atribuíveis à substância em estudo, devem examinar-se também os animais de todos os lotes restantes.
 
Devem examinar-se todas as lesões importantes.  
Sempre que se recorra a um lote extra, deve proceder-se ao exame 
histopatológico dos tecidos e órgãos que tenham revelado alterações 
nos animais dos restantes lotes.  
2. RESULTADOS E SUA APRESENTAÇÃO  
2.1. DADOS  
Devem registar-se os dados relativos a cada animal. Além disso, 
todos os dados devem ser resumidos num quadro, referindo-se, 
para cada lote de ensaio, o número de animais no início do ensaio, 
o número de animais encontrados mortos durante o ensaio ou aba ­
tidos por uma questão de humanidade, a hora da morte de cada animal, o número de animais que apresentam sinais de toxicidade, 
a descrição dos sinais de toxicidade observados, nomeadamente o 
tempo decorrido até à respectiva manifestação, bem como a sua duração e gravidade, o número de animais que apresentem lesões, o tipo de lesões e a percentagem de animais que apresentam cada 
tipo de lesões.
 
Caso aplicável, os resultados numéricos devem ser avaliados se ­
gundo um método estatístico adequado e geralmente aceite. Os mé ­
todos estatísticos e dados a serem analisados devem ser selecciona ­
dos durante a fase de concepção do estudo.  
2.2. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deverá incluir as seguintes informações:  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 414
 
2.2.1.  Substância em estudo:  
— natureza física, pureza e propriedades físico-químicas,  
— dados de identificação  
— veículo (caso aplicável): justificação da escolha de um veículo 
não aquoso.  
2.2.2.  Espécie submetida ao ensaio:  
— espécie e a estirpe utilizada,  
— número, idade e sexo dos animais,  
— origem, condições de acomodação, alimentação, etc.,  
— massa de cada animal no início do ensaio.  
2.2.3.  Condições do ensaio:  
— justificação para a selecção das doses,  
— pormenores relativos à preparação da substância em estudo e à 
sua eventual incorporação nos alimentos, nomeadamente a res ­
pectiva concentração, estabilidade e homogeneidade,  
— modo de administração da substância em estudo,  
— doses reais (mg/kg massa corporal/dia) e factor de conversão da 
concentração da substância em estudo na alimentação/abeberação (ppm) para a dose real, quando aplicável,
 
— pormenores relativos à qualidade dos alimentos e da água.  
2.2.4.  Resultados:  
— massa corporal e respectivas alterações,  
— consumo de alimentos e de água, se for caso disso,  
— reacções tóxicas em função do sexo e da dose administrada, 
nomeadamente sinais de toxicidade,  
— natureza, gravidade e duração dos sinais clínicos (reversíveis ou 
não),  
— exame oftalmológico,  
— resultados da análise hematológica, acompanhados dos respecti ­
vos parâmetros de base,  
— resultados da análise bioquímica, acompanhados dos respectivos 
parâmetros de base,  
— massa corporal final, massa dos órgãos e relações massas dos 
órgãos/massa corporal,  
— dados obtidos por autópsia,  
— descrição pormenorizada dos resultados do exame histopatológi ­
co, 
— dados de absorção, caso se encontrem disponíveis,  
— eventual tratamento estatístico dos resultados.  
Discussão dos resultados.  
Conclusões.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 415
 
B.28.  TOXICIDADE DÉRMICA SUBCRÓNICA: TESTE DE DOSE 
REPETIDA POR VIA DÉRMICA, A NOVENTA DIAS, EM 
ROEDORES  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
1.2. DEFINIÇÕES  
Ver Introdução Geral, parte B.  
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Nenhuma.  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
A substância a testar é aplicada diariamente em doses graduais na 
pele dos animais dos vários grupos, à razão de uma dose por grupo por um período de noventa dias. Durante o período de aplicação, os animais são observados diariamente para se detectarem manifesta ­
ções de toxicidade. Os animais que morrem durante a experiência 
são autopsiados e no fim da experiência os animais sobreviventes são igualmente autopsiados.
 
1.5. CRITÉRIOS QUALITATIVOS  
Nenhum.  
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Preparativos  
Os animais são mantidos nas condições de alojamento e de alimen ­
tação da experiência, durante pelo menos cinco dias antes do teste. Antes de começar o teste os animais jovens e sãos são distribuídos ao acaso pelos grupos submetidos ao tratamento e de controlo. 
Pouco tempo antes de se iniciar o ensaio rapam-se os pêlos da região 
dorsal dos animais. Se se recorrer à tosquia esta deverá ser efectuada mais ou menos 24 horas antes do teste. Normalmente é necessário repetir estas operações todas as semanas devendo tomar-se muito 
cuidado para não lesar a pele. A área destinada à aplicação da subs ­
tância a testar não poderá ser inferior a 10 % da superfície corporal. O peso do animal entrará em linha de conta na decisão da zona a expor e da dimensão da superfície a tratar. Sempre que se testam 
substâncias sólidas, que podem ser pulverizadas se necessário, a 
substância a testar deve ser humedecida com água ou com um veí ­
culo apropriado para garantir um bom contacto com a pele. As subs ­
tâncias a testar líquidas são geralmente usadas sem ser diluídas. 
Procede-se a uma aplicação diária durante cinco a sete dias por semana.
 
Condições experimentais  
A n i m a i s d e e x p e r i ê n c i a  
Podem ser utilizados o rato, o coelho ou a cobaia; também podem 
usar-se outras espécies, sendo necessário justificar o seu emprego. No início da experiência a diferença de peso entre os animais não poderá ultrapassar ± 20 % do peso médio. Se um estudo dérmico 
subcrónico constituir a fase preliminar de um estudo a longo prazo, 
deve utilizar-se a mesma espécie e estirpe em ambos os estudos.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 416
 
N ú m e r o e s e x o  
Para cada dose serão utilizados pelo menos 20 animais (10 fêmeas e 
10 machos) de pele sã. As fêmeas deverão ser nulíparas e não grávidas. Se for previsível sacrificar alguns animais durante a expe ­
riência devem acrescentar-se ao número inicial o número de animais 
que se prevê sacrificar. Para além destes poderá haver um grupo- 
-satélite de 20 animais (10 de cada sexo) tratado com a dose mais elevada, durante 90 dias e observado quanto à reversibilidade, à persistência ou aparecimento tardio de efeitos tóxicos durante 28 
dias após o tratamento.
 
D o s e s  
São necessárias pelo menos três doses diferentes com um controlo 
ou um veículo de controlo se for usado um veículo. O período de 
exposição deverá no mínimo ser de seis horas por dia. A substância a testar será aplicada diariamente à mesma hora e a quantidade a administrar será ajustada regularmente (semanalmente ou bissemanal ­
mente), de modo a manter-se constante relativamente ao peso cor ­
poral do animal. Os animais do grupo de controlo serão tratados da mesma maneira que os animais dos grupos de experiência com ex ­
cepção da aplicação da substância a testar. Se se utilizar um veículo 
para facilitar a administração, este será administrado ao grupo de 
controlo da mesma forma que aos grupos tratados, devendo a dose corresponder à do grupo tratado com a dose mais elevada. A dose mais elevada será determinada de forma a produzir efeitos tóxicos 
mas nunca, ou raramente, a morte do animal; a dose mais baixa não 
deverá produzir quaisquer efeitos tóxicos. Se se dispuser de infor ­
mação sobre a exposição humana, a dose mais baixa deverá exceder esse valor. O ideal seria a dose intermédia produzir o efeito tóxico 
mínimo observável. Se se utilizarem várias doses intermédias a di ­
ferença entre elas será calculada de forma a conseguir-se uma gra ­
dação dos efeitos tóxicos. Nos grupos das doses mais baixa e inter ­
média a incidência de mortalidade deverá ser baixa para permitir 
uma avaliação significativa dos resultados.
 
Se a aplicação da substância a testar provocar uma grave irritação 
cutânea, deverão reduzir-se as concentrações, o que poderá originar 
uma diminuição ou até um desaparecimento dos outros efeitos tóxi ­
cos da dose mais elevada. Se as lesões cutâneas forem muito graves, pode tornar-se necessário interromper a experiência e recomeçá-la 
com concentrações mais fracas.
 
T e s t e - l i m i t e  
Se já tiver sido efectuada uma experiência preliminar com uma dose 
de 1 000 mg/kg ou com uma dose mais elevada em função da 
possibilidade de uma exposição humana conhecida, que não tenha provocado quaisquer efeitos tóxicos, será inútil prosseguir a expe ­
riência.
 
P e r í o d o d e o b s e r v a ç ã o  
Os animais da experiência serão observados diariamente para detec ­
tar manifestações de toxicidade. Serão registados o momento da 
morte e o momento do aparecimento e desaparecimento das mani ­
festações de toxicidade.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 417
 
P r o c e d i m e n t o  
Os animais serão colocados em gaiolas individuais. Em condições 
ideais a substância a testar será administrada aos animais sete dias por semana durante um período de 90 dias.
 
Os animais de todos os grupos-satélite que forem objecto de obser ­
vações complementares serão mantidos vivos durante mais 28 dias, 
sem tratamento, para se detectar a recuperação ou a persistência dos 
efeitos tóxicos. O tempo de exposição será de seis horas por dia.  
A substância a testar será aplicada uniformemente numa área equi ­
valente a 10 % da superfície total do corpo. No caso de substâncias 
altamente tóxicas, a superfície a utilizar poderá ser menor mas a 
camada da substância deverá ser o mais fina e uniforme possível.  
Durante a exposição a substância a testar é mantida em contacto com 
a pele por meio de uma gaze porosa e de um adesivo antialérgico. A 
superfície tratada será por sua vez convenientemente coberta de ma ­
neira a manter no seu lugar a gaze e a substância a testar, e a evitar que os animais ingiram a dita substância. Podem utilizar-se aparelhos de contenção, para evitar a ingestão da substância, mas não se re ­
comenda a imobilização completa.
 
No fim do tempo de exposição, se possível, é necessário eliminar 
todos os resíduos da substância com água ou por meio de qualquer outro método adequado de limpeza da pele.
 
Os animais serão observados diariamente, sendo sempre registadas as 
manifestações de toxicidade assim como o momento do seu apare ­
cimento, a sua intensidade e duração. Durante o período de cativeiro observar-se-ão as modificações do pêlo e da pele, dos olhos e das 
mucosas, do aparelho respiratório, aparelho circulatório, do sistema 
nervoso autónomo e central, assim como da actividade somatomotora e do comportamento. O consumo alimentar e o peso dos animais serão determinados semanalmente. Devem observar-se regularmente 
os animais a fim de se evitarem perdas por canibalismo, por autólise 
dos tecidos ou por condições impróprias de alojamento. No fim da experiência todos os animais sobreviventes dos grupos tratados não satélites serão autopsiados. Os animais moribundos serão imediata ­
mente retirados e autopsiados.
 
Os exames que a seguir se enunciam são normalmente feitos a todos 
os animais incluindo os controlos:  
a) Um exame oftalmológico usando um oftalmoscópio ou equipa ­
mento adequado equivalente deve ser feito antes da administração 
da substância a testar e no fim da experiência, de preferência a 
todos os animais, ou pelo menos nos grupos da dose mais ele ­
vada e de controlo. Se se detectarem alterações oculares devem 
examinar-se todos os animais;  
b) Um exame hematológico será efectuado no fim da experiência 
compreendendo os seguintes testes: hematócrito, concentração de hemoglobina, contagem de eritrócitos, contagem de leucócitos, fórmula leucocitária, bem como um estudo da coagulação e 
tempo de coagulação, tempo de protrombina, tempo de trombo ­
plastina, ou contagem de plaquetas;
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 418
 
c) A determinação de dados bioquímicos no sangue deve ser feita 
no fim da experiência. Apresentam um interesse geral para todos 
os estudos a avaliação do equilíbrio electrolítico, do metabolismo dos hidratos de carbono, da função hepática e renal. A escolha dos testes específicos será influenciada por observações relativas 
ao modo de acção da substância a testar. Sugere-se o doseamento 
do cálcio, fósforo, cloretos, sódio, potássio, glicose em jejum (o período de jejum dependerá da espécie), transaminase glutâmico- -pirúvica sérica (
 1 ), transaminase glutâmico-oxaloacética sériea (  2 ), 
ornitina-descarboxilase, gama-glutamil transpeptidase, azoto urei ­
co, albumina, creatinina plasmática, bilirubina total e as proteínas séricas totais. As outras análises eventualmente necessárias a uma avaliação toxicológica adequada incluem análises de lípidos, hor ­
monas, equilíbrio ácido-básico, methemoglobina, e actividade co ­
linesterásica. Podem efectuar-se outras análises bioquímicas clíni ­
cas, se necessário, para aprofundar o estudo dos efeitos observa ­
dos;
 
d) Um exame regular da urina não é necessário; este exame só é 
indicado em caso de efeitos tóxicos prováveis ou manifestos.  
Se a informação de estudos anteriores não for apropriada deverá 
considerar-se a necessidade de determinação dos parâmetros hema ­
tológicos e bioquímicos clínicos antes de começar a experiência.  
A u t ó p s i a  
Todos os animais serão submetidos a uma autópsia geral que incluirá 
o exame da superfície exterior do corpo, de todos os orifícios e das cavidades craniana, torácica e abdominal e respectivos conteúdos. O 
fígado, os rins, as glândulas supra-renais e os testículos serão pesa ­
dos, ainda húmidos, o mais rapidamente possível depois da disseca ­
ção, para se evitar a perda de líquidos por evaporação. Os seguintes órgãos e tecidos deverão ser conservados num meio adequado na 
eventualidade de um exame histopatológico ulterior: todas as lesões 
macroscópicas, encéfalo, incluindo cortes da medula/protuberância, córtex cerebeloso e córtex cerebral, hipófise, tiróideia, paratiróideia, todo o tecido tímico, (traqueia), pulmões, coração, aorta, glândulas 
salivares, fígado, baço, rins, supra-renais, pâncreas, gónadas, útero, 
órgãos genitais anexos, vesícula biliar (quando presente), esófago, estômago, duodeno, jejuno, íleo, cego, cólon, recto, bexiga, gânglio linfático representativo, (glândula mamária na fêmea), (musculatura 
da coxa), nervo periférico, (olhos), (esterno com medula óssea), 
(fémur, incluindo superfície articular), (medula espinhal a três níveis: cervical, mediotorácica e lombar) e (glândulas lacrimais). Os tecidos mencionados entre parênteses só serão examinados em caso de apa ­
recimento de sinais de toxicidade ou de compromisso do órgão-alvo.
 
E x a m e h i s t o p a t o l ó g i c o  
a) Serão objecto de um exame histopatológico completo a pele nor ­
mal e a pele tratada, assim como os órgãos e tecidos de todos os animais de controlo e do grupo exposto à dose mais elevada;
 
b) Todas as lesões macroscópicas serão examinadas;  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 419  
( 1 ) Conhecida actualmente por transaminase da alanina. 
( 2 ) Conhecida actualmente por transaminase do aspartato.
 c) Os órgãos-alvo dos animais pertencentes aos grupos tratados com 
outras doses deverão ser examinados;  
d) Se se utilizarem ratos, os pulmões dos animais dos grupos ex ­
postos às doses baixa e intermédia serão submetidos a um exame 
histopatológico para se detectar qualquer sinal de infecção uma 
vez que isso nos permite uma avaliação conveniente do estado de saúde dos animais. Outros exames histopatológicos sistemáticos podem não se justificar para os animais desses grupos mas devem 
ser sempre efectuados aos órgãos que apresentem lesões no grupo 
tratado com a dose mais elevada;
 
e) Quando se usar um grupo satélite, será feito um exame histopa ­
tológico aos tecidos e órgãos que apresentem sinais de toxicidade 
nos grupos tratados.  
2. RESULTADOS  
Os resultados devem ser resumidos sob a forma de quadros, indi ­
cando, para cada grupo de experiência, o número de animais no 
início desta, o número de animais apresentando lesões, o tipo de 
lesões e a percentagem de animais apresentando cada tipo de lesão. Os resultados serão avaliados por meio de um método estatístico apropriado. Pode utilizar-se qualquer método estatístico reconhecido.
 
3. RELATÓRIO  
3.1. RELATÓRIO DO TESTE  
O relatório do teste deverá incluir as seguintes informações:  
— espécie, estirpe, origem, condições do meio ambiente, dieta,  
— doses (compreendendo veículo, se utilizado) e concentrações,  
— resposta tóxica por sexo e por dose,  
— dose sem efeitos, se possível,  
— momento de morte durante a experiência ou indicação dos ani ­
mais sobreviventes no fim da experiência,  
— descrição dos efeitos tóxicos ou outros,  
— momento da observação de qualquer manifestação anormal e sua 
evolução,  
— dados relativos à alimentação e peso do animal,  
— observações oftalmológicas,  
— exames hematológicos efectuados e seus resultados,  
— testes bioquímicos clínicos utilizados e seus resultados (incluindo 
resultados das análises de urina),  
— resultados da autópsia,  
— descrição pormenorizada de todas as observações histopatológi ­
cas, ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 420
 
— tratamento estatístico dos resultados, se possível,  
— discussão dos resultados,  
— interpretação dos resultados,  
— condições experimentais.  
3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
4. REFERÊNCIAS  
Ver Introdução Geral, parte B.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 421
 
B.29.  TOXICIDADE SUBCRÓNICA POR INALAÇÃO: ESTUDO DE 90 
DIAS  
RESUMO  
Este método B.29 revisto visa caracterizar integralmente a toxicidade por via 
inalatória do produto químico estudado, após um período de duração subcrónica 
(90 dias), e obter dados sólidos para quantificar os riscos por inalação. Expõem- 
-se durante 90 dias (13 semanas), seis horas por dia, grupos constituídos por dez roedores machos e dez roedores fêmeas a três ou mais concentrações do produto químico em estudo (a), a ar filtrado (b, controlo negativo), e/ou ao veículo (c, 
controlo do veículo). Em geral, Os animais são expostos durante cinco dias por 
semana, mas admite-se que sejam expostos sete dias por semana. Ensaiam-se sempre machos e fêmeas, mas cada sexo pode ser exposto a concentrações diferentes, se um deles for reconhecidamente mais sensível ao produto químico 
do que o outro. Este método concede ao diretor do estudo flexibilidade suficiente 
para incluir grupos satélites (para apreciação da reversibilidade), eutanásias in ­
tercalares, lavagens broncoalveolares, testes neurológicos e exames histopatoló ­
gicos e de patologia clínica suplementares, a fim de melhor caracterizar a toxi ­
cidade do produto químico em estudo.
 
INTRODUÇÃO  
1. Este método é equivalente ao  Test Guideline  413 (2009) da OCDE. O  Test 
Guideline  413 (TG 413) inicial relativo à toxicidade subcrónica por inalação 
foi adotado em 1981 (1). O presente método B.29 é equivalente ao método TG 413 revisto (2009), tendo sido atualizado para refletir o estado da 
ciência e cumprir exigências atuais e futuras da regulamentação.
 
2. Os estudos de toxicidade subcrónica por inalação destinam-se principal ­
mente a aferir das concentrações que a regulamentação deve prever para a avaliação dos riscos a que os trabalhadores estão sujeitos no local de traba ­
lho. São igualmente utilizados para avaliar os riscos de exposição humana 
nos locais de habitação, associados aos meios de transporte e no ambiente. O método permite caracterizar os efeitos adversos resultantes da exposição diária por inalação, durante 90 dias (cerca de 10 % do tempo de vida do 
rato), ao produto químico em estudo. Os dados provenientes dos estudos de 
toxicidade subcrónica por inalação podem utilizar-se para quantificar riscos e para selecionar as concentrações a utilizar em estudos de toxicidade cró ­
nica. O presente método não se destina especificamente ao ensaio de nano ­
materiais. No final do capítulo e no documento de orientações n.
 o 39 (2) 
definem-se alguns conceitos utilizados neste método.  
CONSIDERAÇÕES INICIAIS  
3. A fim de melhorar a qualidade do estudo e de minimizar a utilização a 
animais, antes de realizar o estudo o laboratório de ensaios deve ponderar todas as informações disponíveis sobre o produto químico em causa. Entre 
os elementos úteis para a escolha das concentrações mais adequadas 
contam-se a identidade, a estrutura química e as propriedades físico-quími ­
cas do produto químico em estudo, resultados de ensaios de toxicidade  in 
vitro  ou in vivo , as utilizações previstas, o potencial de exposição humana, 
dados (Q)SAR — " (quantitative) structure-activity relationships ", relações 
(quantitativas) estrutura/atividade — e toxicológicos disponíveis sobre pro ­
dutos químicos estruturalmente afins e dados provenientes de outros estudos de exposição repetida. Se estiver prevista a ocorrência ou ocorrerem mani ­
festações de neurotoxicidade durante o estudo, fica ao critério do diretor 
deste incluir no estudo as avaliações suplementares que considere adequa ­
das, tais como uma bateria de observações funcionais e determinações da atividade motora. Embora o momento da exposição possa ser um aspeto 
crítico em determinados exames, a realização destes estudos suplementares 
não deve interferir na conceção do estudo principal.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 422
 
4. No caso dos produtos químicos corrosivos ou irritantes, podem ensaiar-se 
diluições adequadas, a concentrações que gerem o grau de toxicidade pre ­
tendido. Para mais informações, ver o documento de orientações n.  o 39 (2). 
Ao expor animais a produtos químicos com tais características, as concen ­
trações visadas devem ser suficientemente baixas para não causarem dor ou 
sofrimento intensos, sem deixarem de ser suficientes para que a curva de 
resposta à concentração abranja os níveis correspondentes aos objetivos do ensaio, nos planos científico e da regulamentação. Estas concentrações de ­
vem ser adaptadas a cada caso, de preferência com base num estudo ex ­
ploratório convenientemente concebido, que forneça informações sobre o 
parâmetro crítico, eventuais limiares de irritação e o momento do apareci ­
mento dos efeitos (ver os pontos 11 a 13). É necessário justificar as concen ­
trações escolhidas em cada caso.
 
5. Os animais moribundos ou que apresentem sinais óbvios de dor ou de 
grande sofrimento continuado devem ser eutanasiados. Os animais moribun ­
dos são equiparados aos que morrem durante o ensaio. O documento de orientações da OCDE relativo aos parâmetros eticamente mensuráveis (3) 
define os critérios que devem presidir à decisão de eutanasiar animais mo ­
ribundos ou em grande sofrimento, bem como orientações sobre o reconhe ­
cimento da morte previsível ou iminente.
 
DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
Escolha da espécie animal  
6. Devem ser utilizados roedores adultos, jovens e saudáveis de estirpes labo ­
ratoriais de uso corrente. A espécie preferida é o rato. É necessário justificar o recurso a outras espécies.
 
Preparação dos animais  
7. As fêmeas utilizadas devem ser nulíparas e não podem estar grávidas. 
No dia da seleção aleatória, os animais devem ser adultos jovens com 
sete a nove semanas, de peso corporal não desviado mais de 20 % do 
peso médio correspondente a cada sexo. Selecionam-se os animais aleato ­
riamente, marcam-se para identificação individual e mantêm-se nas suas gaiolas durante, pelo menos, cinco dias antes do início do ensaio, para 
aclimatação às condições laboratoriais.
 
Manutenção dos animais  
8. É necessário identificar individualmente cada animal, de preferência com um 
respondedor ( transponder ) subcutâneo, para facilitar as observações e evitar 
confusões. A temperatura do biotério deve ser de 22 °C ± 3 °C. O ideal será manter a humidade relativa entre 30 % e 70 %, embora isto possa não ser 
possível ao utilizar água como veículo. Antes e depois das exposições, os 
animais são geralmente engaiolados por sexo e por concentração, mas o número de animais por gaiola não deve dificultar a clara observação de cada animal e deve minimizar as perdas devidas a lutas ou canibalismo. 
Quando se opta pela exposição unicamente nasal dos animais, pode ser 
necessário aclimatá-los aos tubos de contenção. Estes não devem provocar aos animais tensões físicas, térmicas ou dinâmicas excessivas. A contenção dos animais pode afetar parâmetros fisiológicos como a temperatura corporal 
(hipertermia) e/ou o volume respirado por minuto. Caso se disponha de 
dados genéricos reveladores de que nenhuma destas alterações ocorre em grau apreciável, não será necessária a adaptação prévia aos tubos de con ­
tenção. Os animais cujo corpo seja exposto na totalidade a um aerossol 
devem permanecer em gaiolas individuais durante a exposição, para evitar 
que o aerossol seja filtrado pela pelagem dos que com eles coabitem. Exceto nos períodos de exposição, podem utilizar-se dietas convencionais certifica ­
das de laboratório, com fornecimento ilimitado de água potável da rede 
pública. A iluminação deve ser artificial, com uma sequência de 12 horas 
de luz seguidas de 12 horas de escuridão.
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Câmaras de inalação  
9. Ao escolher-se a câmara de inalação, deve ter-se em conta a natureza do 
produto químico em estudo e o objetivo do ensaio. Privilegia-se o modo de exposição unicamente nasal, termo que abrange as exposições "unicamente 
da cabeça", "unicamente do nariz" e "unicamente do focinho". A exposição 
unicamente nasal é geralmente preferida no estudo de aerossóis de líquidos ou de sólidos, ou de vapores que possam condensar-se e formar aerossóis. Para determinados objetivos do estudo, poderá ser melhor recorrer ao modo 
de exposição de corpo inteiro, mas será necessário justificá-lo no relatório. 
Para garantir estabilidade atmosférica nas câmaras de corpo inteiro, o vo ­
lume de todos os animais presentes em cada câmara não deve exceder 5 % 
do volume da câmara. O documento GD 39 (2) descreve os princípios, 
vantagens e desvantagens das técnicas de exposição unicamente nasal e de corpo inteiro.
 
ESTUDOS DA TOXICIDADE  
Concentrações-limite  
10. Contrariamente aos estudos de toxicidade aguda, nos estudos de toxicidade 
subcrónica por inalação não está definida nenhuma concentração-limite. Na escolha da concentração máxima a ensaiar, deve ter-se em conta a concen ­
tração máxima atingível, o nível de exposição humana mais desfavorável, a 
necessidade de manter um fornecimento adequado de oxigénio e/ou consi ­
derações de bem-estar animal. Se os dados disponíveis não permitirem estabelecer limites, podem utilizar-se os valores-limite de exposição aguda 
fixados no Regulamento (CE) n.
 o 1272/2008 (13) — concentração máxima 
até 5 mg/l para aerossóis, 20 mg/l para vapores e 20 000 ppm para gases; ver igualmente o GD 39 (2). Se for necessário exceder estes limites ao ensaiar gases ou produtos químicos muito voláteis (por exemplo, refrigeran ­
tes), haverá que justificá-lo. A concentração-limite deve induzir efeitos tó ­
xicos inequívocos sem gerar tensões desnecessárias nos animais nem afetar a longevidade dos mesmos (3).
 
Estudo exploratório  
11. Antes de iniciar o estudo principal, é geralmente necessário realizar um 
estudo exploratório. Um estudo exploratório com as características aqui 
definidas é mais completo do que um estudo preliminar, por não se limitar à escolha das concentrações. O êxito do estudo principal pode depender dos conhecimentos adquiridos num estudo exploratório. Este pode, por exemplo, 
fornecer informações técnicas sobre métodos de análise, granulometria, me ­
canismos de toxicidade, dados histopatológicos e de patologia clínica e estimativas do nível sem observação de efeitos adversos (NOAEL) e da concentração máxima tolerada no estudo principal. Fica ao critério do dire ­
tor do estudo recorrer a um estudo exploratório para determinar o limite 
mínimo de irritação do aparelho respiratório (por exemplo, por meio de uma histopatologia do aparelho respiratório, de testes da função pulmonar ou de uma lavagem broncoalveolar), a concentração máxima que os animais tole ­
ram sem tensões excessivas e os parâmetros que melhor caracterizam a 
toxicidade do produto químico em estudo.
 
12. O estudo exploratório pode abranger uma ou mais concentrações. Consoante 
os parâmetros escolhidos, devem expor-se a cada concentração três a seis 
machos e três a seis fêmeas. A duração deste estudo varia entre cinco dias, no mínimo, e geralmente não mais de 28 dias. É necessário justificar no relatório as concentrações escolhidas para o estudo principal. O objetivo 
deste último é demonstrar a existência de uma relação entre a concentração 
e a resposta obtida para o parâmetro previsivelmente mais sensível. Ideal ­
mente, a concentração mais baixa deve ser a concentração sem efeitos adversos observáveis e a concentração mais alta deve induzir efeitos tóxicos 
inequívocos, sem gerar tensões desnecessárias nos animais nem afetar a 
longevidade dos mesmos (3).
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 424
 
13. Ao escolher os níveis de concentração para o estudo exploratório, devem 
ponderar-se todas as informações disponíveis, incluindo relações 
estrutura-atividade e dados relativos a produtos químicos semelhantes (ver o ponto 3). O estudo exploratório pode confirmar ou refutar a escolha dos parâmetros mais sensíveis segundo critérios mecanísticos, por exemplo, a 
inibição da colinesterase por organofosfatos, a formação de 
meta-hemoglobina por agentes eritrocitotóxicos, as hormonas tiroideias (T
 3 
e T  4 ), no caso dos agentes tirotóxicos, proteínas, a LDH, ou a presença de 
neutrófilos na lavagem broncoalveolar, no caso de partículas inócuas fraca ­
mente solúveis ou de aerossóis irritantes dos pulmões.  
Estudo principal  
14. Um estudo principal de toxicidade subcrónica compreende geralmente três 
níveis de concentração, bem como, em paralelo, os controlos negativo (do 
ar) e/ou do veículo (ver o ponto 18). Para facilitar a seleção dos níveis de 
exposição, devem ser utilizados todos os dados disponíveis, nomeadamente resultados de estudos de toxicidade sistémica, metabólicos e cinéticos (deve ter-se especial cuidado em evitar níveis de concentração elevados que satu ­
rem os processos cinéticos). Cada grupo de ensaio compreende a exposição 
de dez roedores machos e dez roedores fêmeas ao produto químico em estudo, durante seis horas por dia e cinco dias por semana, ao longo de treze semanas (a duração total do estudo é, pelo menos, de 90 dias). Os 
animais também podem ser expostos sete dias por semana (por exemplo, ao 
ensaiar produtos farmacêuticos inalados). Se um dos sexos for reconhecida ­
mente mais sensível ao produto químico em estudo, pode expor-se cada sexo a concentrações diferentes das utilizadas para o outro, a fim de otimizar 
a resposta à concentração como se refere no ponto 15. Se espécies que não 
o rato forem sujeitas a exposição unicamente nasal, pode ajustar-se a dura ­
ção máxima da exposição para minimizar a tensão gerada na espécie em causa. Se a duração da exposição for inferior a seis horas por dia ou se for 
necessário realizar um estudo de exposição de longa duração (por exemplo, 
22 horas por dia) de corpo inteiro [ver o GD 39 (2)], será necessário justificá-lo. Durante o período de exposição, a alimentação deve ser suspen ­
sa, exceto se a exposição exceder seis horas. Durante as exposições de corpo 
inteiro pode continuar a fornecer-se água.
 
15. As concentrações visadas escolhidas devem permitir identificar o(s) ór ­
gão(s)-alvo e evidenciar uma relação clara entre a concentração e a resposta 
obtida:  
— o nível de concentração mais elevado deve gerar efeitos tóxicos, mas 
não causar sintomas deletérios nem mortalidade, que impediriam a inter ­
pretação dos resultados,  
— o espaçamento do nível ou níveis de concentração intermédios deve 
permitir uma gradação dos efeitos tóxicos entre os correspondentes aos das concentrações mais baixa e mais elevada,
 
— o nível de concentração mais baixo não deve ter efeitos tóxicos ou, se os 
tiver, estes devem ser reduzidos.  
Eutanásias intercalares  
16. Caso esteja prevista no estudo a realização de eutanásias intercalares, os 
efetivos expostos a cada nível de concentração devem ser aumentados no número de animais a eutanasiar antes da conclusão do estudo. É necessário 
fundamentar a realização de eutanásias intercalares e as análises estatísticas 
devem tê-las devidamente em conta.
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Estudo de grupos satélites (para apreciação da reversibilidade)  
17. Pode recorrer-se a um estudo satélite para observar a reversibilidade, a 
persistência ou o aparecimento diferido de efeitos tóxicos durante um pe ­
ríodo adequado, não inferior a 14 dias, após o termo da exposição. Com ­
põem estes grupos dez machos e dez fêmeas, que são expostos ao mesmo 
tempo que os animais ensaiados no estudo principal. Os animais dos grupos satélites são expostos à concentração mais elevada do produto químico em estudo e devem ser complementados pelos grupos necessários de controlo 
do ar e/ou do veículo em paralelo (ver o ponto 18).
 
Animais de controlo  
18. Os animais de controlo negativo (do ar) em paralelo devem ser tratados do 
mesmo modo que os animais dos grupos que participam no ensaio principal, exceto que são expostos a ar filtrado em vez de ao produto químico em 
estudo. Se for utilizada água ou outra substância para gerar a atmosfera 
ensaiada, deve incluir-se no estudo, em vez do grupo de controlo negativo (do ar), um grupo de controlo do veículo. Sempre que possível, o veículo utilizado deve ser água. Se assim for, os animais são expostos a controlo a 
ar com a mesma humidade relativa que o ar utilizado para os grupos ex ­
postos ao produto químico em estudo. A escolha do veículo mais adequado deve basear-se em dados históricos ou num estudo prévio convenientemente realizado. Se não se conhecer bem a toxicidade do veículo, fica ao critério 
do diretor do estudo utilizar em simultâneo um controlo negativo (do ar) e 
um controlo do veículo, embora se desaconselhe fortemente este procedi ­
mento. Se os dados históricos revelarem que o veículo não é tóxico, não haverá necessidade de um grupo de controlo negativo (do ar) e apenas deve 
utilizar-se um controlo do veículo. Se um estudo prévio de um produto 
químico incorporado num determinado veículo não revelar toxicidade, conclui-se que o veículo em causa não é tóxico à concentração ensaiada, devendo utilizar-se esse controlo do veículo.
 
CONDIÇÕES DE EXPOSIÇÃO  
Administração das concentrações  
19. Os animais são expostos ao produto químico em estudo sob a forma de gás, 
vapor, aerossol ou de uma mistura destes. O estado físico a ensaiar depende 
das propriedades físico-químicas do produto químico em estudo, das con ­
centrações escolhidas e/ou da forma física cuja probabilidade de presença durante a manipulação e utilização do mesmo seja maior. Os produtos 
químicos higroscópicos ou quimicamente reativos devem ser ensaiados em 
atmosfera seca. Devem tomar-se precauções para evitar concentrações que possam provocar explosões. As matérias em partículas podem ser sujeitas a processos mecânicos para reduzir a granulometria. Para mais orientações, 
consultar o documento GD 39 (2).
 
Distribuição granulométrica  
20. Os aerossóis e os vapores que possam condensar-se em aerossóis devem ser 
objeto de análise granulométrica. Para que todas as zonas pertinentes do aparelho respiratório sejam expostas, recomenda-se a utilização de aerossóis com diâmetro aerodinâmico mediano da massa (MMAD) compreendido 
entre 1 μm e 3 μm e desvio-padrão geométrico ( σ
 g ) compreendido entre 
1,5 e 3,0 (4). Deve fazer-se o razoavelmente possível para respeitar estas condições, sendo necessário um parecer especializado caso isso não se consiga. Por exemplo, as partículas dos fumos metálicos são mais pequenas 
do que o limite inferior indicado, ao passo que as partículas carregadas e as 
fibras podem exceder o limite superior.
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Incorporação do produto químico em estudo num veículo  
21. Idealmente, o produto químico em estudo deve ser ensaiado sem que tenha 
sido incorporado num veículo. Se for necessário utilizar um veículo para obter a concentração e a granulometria adequadas do produto químico em 
causa, deve preferir-se a água. Se o produto químico for dissolvido num 
veículo, será necessário comprovar que se mantém estável.
 
MONITORIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE EXPOSIÇÃO  
Caudal de ar nas câmaras  
22. Durante cada exposição, é necessário regular cuidadosamente, monitorizar 
continuamente e registar pelo menos de hora a hora o caudal de ar através 
de cada câmara. A monitorização em tempo real da concentração (ou esta ­
bilidade no tempo) da atmosfera em estudo constitui uma medida per ­
manente de todos os parâmetros dinâmicos e um meio indireto de regular 
os que têm importância para a inalação. Se a concentração for monitorizada 
em tempo real, pode reduzir-se a frequência da medição do caudal de ar a apenas uma medição diária por exposição. É necessário ter especial cuidado em evitar reinalações nas câmaras de exposição unicamente nasal. A con ­
centração de oxigénio não deve ser inferior a 19 % e a concentração de 
dióxido de carbono não deve exceder 1 %. Se houver razões para crer que estas concentrações não são respeitadas, é necessário medi-las. Se as medi ­
ções efetuadas no primeiro dia de exposição mostrarem que as concentra ­
ções destes gases estão aos níveis corretos, não é necessário voltar a medi- 
-las.
 
Temperatura e humidade relativa nas câmaras  
23. Deve manter-se a temperatura nas câmaras a 22 °C ± 3 °C. Tanto no caso 
das exposições unicamente nasais como das exposições do corpo inteiro, é necessário monitorizar continuamente a humidade relativa na zona de res ­
piração dos animais e, se possível, registá-la de hora a hora durante cada 
exposição. É preferível manter a humidade relativa entre 30 % e 70 %, mas 
isso pode não ser possível (por exemplo, quando se estudam misturas aquosas) ou pode não ser mensurável (devido a interferências do produto químico em estudo com o método de ensaio).
 
Concentração nominal do produto químico em estudo  
24. Sempre que possível, deve calcular-se e registar-se a concentração nominal 
na câmara de exposição. Esta é dada pela divisão da massa gerada do 
produto químico em estudo pelo volume de ar total que circulou pelo 
sistema da câmara de inalação. A concentração nominal não é utilizada para caracterizar a exposição dos animais, mas a sua comparação com a concentração real dá uma indicação da eficácia de geração do sistema de 
ensaio, podendo ser utilizada para detetar problemas a esse nível.
 
Concentração real do produto químico em estudo  
25. Entende-se por "concentração real do produto químico em estudo", a con ­
centração do produto químico nas amostras colhidas na zona de respiração 
dos animais da câmara de inalação. As concentrações reais podem 
determinar-se por métodos específicos (por exemplo, amostragem direta ou métodos de adsorção ou de reação química e posterior caracterização analítica) ou por métodos inespecíficos, tais como gravimetria após filtração. 
O método gravimétrico só é aceitável para aerossóis de pós com um único 
componente ou de líquidos pouco voláteis e deve apoiar-se em caracteriza ­
ções adequadas específicas do produto químico em causa efetuadas antes da realização do estudo. A concentração de aerossóis de pós com vários com ­
ponentes também pode determinar-se por gravimetria. Todavia, são neces ­
sários para isso dados analíticos que demonstrem que a composição do
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produto transportado no aerossol é semelhante à do produto inicial. Se não 
se dispuser desses dados, pode ser necessário reanalisar periodicamente o 
produto químico em estudo (idealmente no aerossol) durante o ensaio. No caso dos agentes aerossolizados que possam evaporar-se ou sublimar, é necessário demonstrar que todas as fases são recolhidas pelo método 
escolhido.
 
26. Deve utilizar-se, se possível, apenas um lote do produto químico em estudo 
durante os ensaios e a amostra em estudo deve ser conservada em condições 
que preservem a sua pureza, homogeneidade e estabilidade. Antes de iniciar 
o estudo, deve caracterizar-se o produto químico em causa no que respeita à sua pureza e, se tecnicamente viável, à sua identidade e às quantidades dos 
contaminantes e impurezas nele identificados. Para o efeito, pode 
recorrer-se, entre outros, aos seguintes dados: tempos de retenção e áreas relativas de picos, pesos moleculares obtidos por espetrometria de massa ou cromatografia em fase gasosa ou outras estimativas. Embora a identidade da 
amostra a estudar não seja da responsabilidade do laboratório, pode ser 
aconselhável que este confirme, pelo menos, alguns aspetos da caracteriza ­
ção efetuada pelo cliente (cor, natureza física, etc.).
 
27. Deve manter-se a atmosfera de exposição tão constante quanto possível. 
Para demonstrar a estabilidade das condições de exposição, pode utilizar-se um dispositivo de monitorização em tempo real, tal como um 
fotómetro de aerossóis, para esses casos, ou, para vapores, um analisador 
de hidrocarbonetos totais. Deve medir-se a concentração real na câmara pelo menos três vezes por nível de exposição, em cada dia de exposição. Se isso não for viável, por limitações relacionadas com o caudal de ar ou devido a 
concentrações baixas, aceita-se uma amostra por período de exposição. 
Idealmente, essa amostra deve então ser colhida ao longo de todo o período de exposição. A concentração na câmara correspondente a uma determinada amostra não deve desviar-se da concentração média na câmara mais de 
10 %, no caso de gases e vapores, nem mais de 20 %, no caso de aerossóis 
de líquidos ou de sólidos. Deve calcular-se e indicar-se no relatório o tempo necessário para a câmara atingir o equilíbrio (t
 95 ). A duração da exposição 
corresponde ao tempo de geração do produto químico em estudo, incluído o 
tempo necessário para a câmara atingir o equilíbrio (t  95 ) e para o decaimento 
da concentração. O documento GD 39 (2) contém orientações para a esti ­
mativa do t  95 . 
28. No caso de misturas muito complexas de gases ou vapores e de aerossóis 
(por exemplo, atmosferas de combustão e produtos químicos gerados por produtos ou dispositivos finais específicos), o comportamento de cada fase 
na câmara de inalação pode ser diferente. Por esse motivo, deve escolher-se 
em cada fase (gás ou vapor e aerossol) pelo menos uma substância indica ­
dora (substância analisada), normalmente o principal ingrediente ativo da mistura. Se o produto químico em estudo for uma mistura, deve indicar-se 
no relatório a concentração analítica correspondente à mistura e não apenas 
a concentração correspondente ao ingrediente ativo ou à substância indica ­
dora (substância analisada) em causa. O documento GD 39 (2) contém mais informações sobre as concentrações reais.
 
Distribuição granulométrica do produto químico em estudo  
29. Deve determinar-se a distribuição granulométrica dos aerossóis pelo menos 
semanalmente por nível de concentração, recorrendo a um impactor de cascata ou a outro instrumento, tal como um granulómetro aerodinâmico. Se for possível demonstrar a equivalência dos resultados obtidos pelo im ­
pactor de cascata e pelo instrumento alternativo, pode utilizar-se este último 
em todo o estudo.
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30. Em paralelo ao instrumento primário, deve utilizar-se um segundo disposi ­
tivo, tal como um filtro gravimétrico ou um borbulhador de gás/impactor  
impinger , para confirmar a eficiência de captação do primeiro. As concen ­
trações mássicas obtidas por análise granulométrica e por análise com filtros não devem diferir entre si mais do que valores razoáveis [ver o GD 39 (2)]. 
Se for possível demonstrar esta equivalência, a todas as concentrações en ­
saiadas, no início do estudo, não é necessário efetuar mais medições de confirmação. Por razões de bem-estar animal, devem tomar-se medidas para minimizar dados inconclusivos que possam obrigar à repetição do 
estudo.
 
31. É necessário efetuar uma análise granulométrica no caso dos vapores que 
possam condensar-se para formar aerossóis ou se forem detetadas partículas numa atmosfera de vapores suscetível de formar fases mistas.
 
EXAMES  
32. Os animais devem ser examinados clinicamente antes, durante e depois do 
período de exposição. Consoante a resposta dos animais durante a exposi ­
ção, pode ser conveniente aumentar a frequência dos exames. Se for difícil examinar os animais devido aos tubos de contenção utilizados, à reduzida iluminação das câmaras de corpo inteiro ou à opacidade da atmosfera, 
deve-se examiná-los cuidadosamente depois da exposição. Os exames rea ­
lizados antes da exposição do dia seguinte podem apreciar a eventual re ­
versibilidade ou intensificação dos efeitos tóxicos.
 
33. Todos os exames devem ser registados, mantendo registos individuais para 
cada animal. Se forem eutanasiados animais ou forem encontrados animais 
mortos, deve registar-se o momento da morte com a maior exatidão possí ­
vel. 
34. Os exames a efetuar aos animais engaiolados devem incidir, nomeadamente, 
nas alterações da pele e da pelagem, dos olhos e das mucosas, do aparelho 
respiratório, do sistema circulatório, do sistema nervoso, da atividade soma ­
tomotora e do comportamento. Deve estar-se atento a tremores, convulsões, salivação, diarreia, letargia, sono e coma. A medição da temperatura retal 
pode corroborar uma bradipneia reflexa ou uma hipo/hipertermia relaciona ­
das com a exposição ou com o confinamento. Entre as avaliações suple ­
mentares que podem incluir-se no protocolo de estudo contam-se as de parâmetros cinéticos ou ao nível da biomonitorização, da função pulmonar, 
da retenção de matérias fracamente solúveis acumuladas no tecido pulmonar 
e de alterações comportamentais.
 
PESO CORPORAL  
35. Regista-se o peso de cada animal pouco antes da primeira exposição (dia 0) 
e, em seguida, duas vezes por semana (por exemplo, às sextas-feiras e às segundas-feiras, para verificar a recuperação durante o fim de semana sem 
exposição, ou intervaladas de modo a possibilitar a avaliação da toxicidade 
sistémica), bem como no momento da morte ou da eutanásia. Se não se registarem efeitos nas quatro primeiras semanas, durante o resto do estudo podem medir-se os pesos corporais apenas uma vez por semana. Os animais 
que integram os (eventuais) grupos satélites (para apreciação da reversibili ­
dade) devem continuar a ser pesados semanalmente durante o período de recuperação. No termo do estudo, pesa-se cada animal pouco antes de ser eutanasiado, para não falsear o cálculo da relação entre o peso de cada órgão 
e o peso corporal.
 
CONSUMO DE ALIMENTOS E DE ÁGUA  
36. Mede-se semanalmente o consumo de alimentos, podendo também medir-se 
o consumo de água.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 429
 
PATOLOGIA CLÍNICA  
37. Efetua-se uma avaliação de patologia clínica a todos os animais depois de 
eutanasiados, incluindo os dos grupos de controlo e dos grupos satélites (para apreciação da reversibilidade). Regista-se o lapso de tempo entre o 
termo da exposição e a colheita de sangue, em especial quando a recons ­
tituição do parâmetro visado é rápida. Recomenda-se que, após o termo da exposição, se colham amostras para análise dos parâmetros com tempo de meia-vida plasmático curto – por exemplo, a carboxi-hemoglobina (COHb), 
a colinesterase (CHE), e a meta-hemoglobina (MetHb).
 
38. Enumera-se no quadro 1 os parâmetros de patologia clínica normalmente 
exigidos nos estudos toxicológicos. A análise da urina não é exigida por 
rotina, mas pode efetuar-se quando a toxicidade prevista ou observada o aconselharem. Fica ao critério do diretor do estudo decidir avaliar outros parâmetros, para melhor caracterização da toxicidade do produto químico 
(por exemplo, colinesterase, lípidos, hormonas, equilíbrio ácido-base, 
meta-hemoglobina ou corpos de Heinz, creatinina-cinase, relação mieloide/ /eritroide, troponinas, gases no sangue arterial, lactato-desidrogenase, 
sorbitol-desidrogenase, glutamato-desidrogenase e gama-glutamil-transpepti ­
dase).
 
Quadro 1  
Parâmetros clássicos de patologia clínica  
Hematologia  
Contagem de eritrócitos 
Hematócrito 
Concentração de hemoglobina Hemoglobina corpuscular média 
Volume corpuscular médio 
Concentração de hemoglobina corpus ­
cular média 
Reticulócitos Contagem total de leucócitos 
Fórmula leucocitária 
Contagem de plaquetas Potencial de coagulação (escolher 
um): 
— tempo de protrombina — tempo de coagulação — tempo de tromboplastina par ­
cial
 
Química clínica  
Glucose (*) 
Colesterol total 
Triglicéridos Azoto ureico no sangue Bilirrubina total 
Creatinina 
Proteínas totais Albumina 
Globulina Alanina-aminotransferase 
Aspartato-aminotransferase 
Fosfatase alcalina Potássio Sódio 
Cálcio 
Fósforo Cloretos
 
Análise da urina (facultativa)  
Aspeto (cor e turvação) 
Volume 
Densidade ou osmolalidade 
pH Proteínas totais 
Glucose 
Sangue/células sanguíneas  
(*) Dado que um período longo de jejum pode distorcer as determinações da glucose 
dos animais expostos relativamente aos animais dos grupos de controlo, fica ao 
critério do diretor do estudo fazer ou não os animais jejuar. Se a opção for por um 
período de jejum, este deve ser adaptado à espécie — no caso do rato, pode ser de 
16 horas (jejum noturno). Pode determinar-se a glucose em jejum após jejum 
noturno durante a última semana de exposição ou após jejum noturno antes da 
autópsia (neste caso, juntamente com todos os outros parâmetros de patologia 
clínica).  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 430
 
39. Se houver indícios de que a zona principal de deposição e retenção são as 
vias respiratórias inferiores (isto é, os alvéolos), a lavagem broncoalveolar 
pode ser a técnica mais adequada para efetuar uma análise quantitativa de parâmetros que hipoteticamente permitam avaliar a relação entre a dose e os efeitos por esta induzidos, com especial incidência para alveolites, inflama ­
ções pulmonares e fosfolipidose. Este processo permite estudar convenien ­
temente os efeitos nos alvéolos das doses aplicadas e a evolução das lesões alveolares daí resultantes. Podem determinar-se no fluido da lavagem bron ­
coalveolar a contagem total de leucócitos, a fórmula leucocitária, as proteí ­
nas totais e a lactato-desidrogenase. Outros parâmetros eventualmente a 
ponderar são os indicativos de alterações lisossómicas, fosfolipidose, fibrose, bem como de irritações e reações inflamatórias alérgicas, que podem com ­
preender a determinação de citocinas ou quimiocinas pró-inflamatórias. As 
determinações no fluido proveniente da lavagem broncoalveolar comple ­
mentam muitas vezes os exames histopatológicos, mas não os substituem. O documento GD 39 (2) contém orientações sobre a realização da lavagem pulmonar.
 
EXAME OFTALMOLÓGICO  
40. Recorrendo a um oftalmoscópio ou a dispositivo equivalente, efetua-se um 
exame oftalmológico do fundo do olho, dos meios refrativos, da íris e da conjuntiva de cada animal antes de administrar o produto químico em 
estudo e, no termo do estudo, aos animais do grupo com a concentração 
mais elevada e dos grupos de controlo. Caso sejam detetadas alterações oculares, devem examinar-se os animais dos outros grupos, incluindo o grupo satélite (para apreciação da reversibilidade).
 
MACROPATOLOGIA E PESO DO ÓRGÃOS  
41. Os animais utilizados nos ensaios (incluindo os que morrerem durante o 
ensaio ou que forem eutanasiados e retirados do estudo por razões de bem-estar animal) devem ser completamente sangrados (se possível) e su ­
jeitos a uma autópsia macroscópica. Deve registar-se o lapso de tempo entre 
o termo da última exposição de cada animal e o momento em que o animal 
é eutanasiado. Se não for possível realizar a autópsia imediatamente depois de detetada a morte do animal, este deve ser refrigerado (não congelado) a uma temperatura suficientemente baixa para minimizar a autólise. As autóp ­
sias devem ser efetuadas o mais rapidamente possível, normalmente não 
mais de um ou dois dias após a morte. Registam-se todas as alterações patológicas macroscópicas de cada animal, prestando especial atenção às alterações do aparelho respiratório.
 
42. Enumeram-se no quadro 2 os órgãos e tecidos a conservar num meio ade ­
quado, durante a autópsia macroscópica, para os exames histopatológicos. A 
preservação dos órgãos e tecidos indicados entre parênteses retos e de 
quaisquer outros não indicados fica ao critério do diretor do estudo. Os órgãos indicados a  negrito  devem ser separados dos tecidos aderentes e 
pesados ainda húmidos o mais rapidamente possível depois da dissecação, 
para evitar que sequem. A tiroide e os epidídimos só devem pesar-se se for 
necessário, porque os instrumentos utilizados para separar os tecidos ade ­
rentes podem comprometer a avaliação histopatológica. Logo depois da autópsia, fixam-se os tecidos e órgãos em formalina a 10 % tamponada 
ou com outro fixador adequado. A remoção dos tecidos aderentes só deve 
realizar-se 24 a 48 horas depois, consoante o fixador utilizado.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 431
Quadro 2  
Órgãos e tecidos a conservar durante a autópsia macroscópica  
Glândulas suprarrenais  
Aorta  
Medula óssea (e/ou uma punção recente)  
Encéfalo  (incluindo secções dos hemisférios 
cerebrais, do cerebelo e da medula/protube ­
rância anelar)  
Cego  
Cólon  
Duodeno  
[Epidídimos ] 
[Olhos (retina, nervo ótico) e pálpebras]  
Fémur e articulação rotular  
Vesícula biliar (se presente)  
[Glândulas de Harder]  
Coração  
Íleo 
Jejuno  
Rins  
[Glândulas lacrimais (extraorbitais]  
Laringe (secção em três níveis, incluindo a 
base da epiglote)  
Fígado  
Pulmões  (secção de cada lobo a um só nível, 
incluindo os brônquios principais)  
Gânglios linfáticos da região hilar dos pul ­
mões, especialmente no caso de produtos quí ­
micos pouco solúveis que se apresentem sob a forma de partículas. Para exames e/ou estu ­
dos mais aprofundados de cariz imunológico, 
podem conservar-se outros gânglios linfáti ­
cos, nomeadamente os das regiões mediasti ­
nal, cervical/submandibular e/ou auricular.
 
Gânglios linfáticos (distais relativamente à 
porta de entrada)  
Glândulas mamárias (nas fêmeas)  
Músculo (coxa)  
Tecidos nasofaríngeos (secção pelo menos em 
quatro níveis, um dos quais compreendendo o 
canal nasofaríngeo e os tecidos linfáticos as ­
sociados à mucosa nasal — " nasal associated 
lymphoid tissue ", NALT). Esófago  [Bolbo olfativo]  
Ovários  
Pâncreas  
Glândulas paratiroides  
Nervo periférico (ciático ou tibial), de prefe ­
rência na vizinhança do músculo  
Hipófise  
Próstata  
Reto  
Glândulas salivares  
Vesículas seminais  
Pele 
Medula espinal (cervical, mediotorácica e 
lombar)  
Baço  
Esterno  
Estômago  
Dentes  
Testículos  
Timo  
Tiroide  
[Língua]  
Traqueia (secção pelo menos em dois níveis, 
incluindo uma secção longitudinal na carina e uma secção transversal)
 
[Ureteres]  
[Uretra]  
[Bexiga urinária]  
Útero  
Órgãos-alvo  
Todas as massas e lesões macroscópicas  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 432
 
43. Removem-se os pulmões intactos, pesam-se e instila-se-lhes um fixador 
adequado, à pressão de 20 a 30 cm de coluna de água, para conservar a 
estrutura pulmonar (5) Secciona-se cada lobo a um só nível (incluindo os brônquios principais); caso se proceda a lavagem pulmonar, secciona-se o lobo não lavado em três níveis (não sequenciais).
 
44. Examinam-se pelo menos quatro níveis dos tecidos nasofaríngeos, um dos 
quais deve compreender o canal nasofaríngeo (5)(6)(7)(8)(9), para possibi ­
litar um exame adequado do epitélio escamoso, de transição (respiratório 
não ciliado), respiratório (respiratório ciliado) e olfativo, assim como o 
tecido linfático adjacente — NALT (10)(11). Examinam-se três níveis da laringe, um dos quais deve incluir a base da epiglote (12). Examinam-se pelo menos dois níveis da traqueia, incluindo uma secção longitudinal na 
carina da bifurcação que dá origem aos brônquios extrapulmonares e uma 
secção transversal.
 
HISTOPATOLOGIA  
45. Deve efetuar-se uma avaliação histopatológica dos órgãos e tecidos indica ­
dos no quadro 2 a cada animal do grupo com a concentração mais elevada e 
dos grupos de controlo, bem como aos animais que morrerem ou forem 
eutanasiados durante o estudo. Deve prestar-se especial atenção ao aparelho respiratório, aos órgãos-alvo e às lesões macroscópicas. Os órgãos e tecidos que apresentem lesões nos animais do grupo com a concentração mais 
elevada devem ser examinados em todos os grupos. Fica ao critério do 
diretor do estudo efetuar avaliações histopatológicas a outros grupos, para evidenciar uma resposta clara à concentração. Caso se tenha constituído um grupo satélite de animais (para apreciação da reversibilidade), deve 
efetuar-se o exame histopatológico dos tecidos e órgãos que tenham reve ­
lado alterações nos animais dos outros grupos expostos. Se o número de mortes prematuras ou outros problemas no grupo com a concentração mais elevada for excessivo, a ponto de comprometer a significância dos dados, 
efetua-se um exame histopatológico dos animais expostos ao nível de con ­
centração imediatamente inferior. Deve procurar-se estabelecer correlações entre as observações macroscópicas e os resultados dos exames microscó ­
picos.
 
DADOS E RELATÓRIOS  
Dados  
46. Devem apresentar-se dados por animal relativos a peso corporal, consumo 
alimentar, patologias clínicas, macropatologias, peso dos órgãos e histopa ­
tologias. Devem resumir-se os resultados dos exames clínicos num quadro, indicando, para cada grupo estudado, o número de animais utilizados, o número de animais que apresentaram sinais específicos de toxicidade, o 
número de animais que morreram durante o ensaio ou que foram eutanasia ­
dos e o momento da morte de cada animal, complementados por uma descrição dos efeitos tóxicos e da evolução e reversibilidade destes, bem como pelos resultados das autópsias. Os resultados, quantitativos ou des ­
critivos, devem ser avaliados por um método estatístico adequado. Os mé ­
todos estatísticos devem ser escolhidos no planeamento do estudo, podendo sê-lo qualquer método estatístico corrente adequado.
 
Relatório dos ensaios  
47. Elementos a constar, quando pertinente, do relatório dos ensaios:  
Animais estudados e condições em que são mantidos  
— descrição das condições de engaiolamento, nomeadamente: número (ou 
alteração do número) de animais por gaiola, camas, temperatura e hu ­
midade relativa ambientes, fotoperíodo e dieta,  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 433
 
— espécie e estirpe utilizadas e, caso não sejam utilizados ratos, justificação 
da utilização de outra espécie. Podem apresentar-se dados originários da 
proveniência dos animais ou dados históricos, desde que corresponden ­
tes a animais sujeitos às mesmas condições de exposição, alojamento e jejum,
 
— número, idade e sexo,  
— método de aleatorização,  
— descrição de eventuais condicionamentos anteriores ao ensaio, nomeada ­
mente ao nível da dieta, de quarentenas e do tratamento de doenças.  
Produto químico em estudo  
— natureza física, grau de pureza e propriedades físico-químicas pertinentes 
(incluindo a isomerização),  
— dados de identificação e, se for conhecido, número de registo CAS 
(Chemical Abstract Service ). 
Veículo  
— justificação da utilização e da escolha do veículo (se não for água),  
— dados históricos ou paralelos demonstrativos de que o veículo não in ­
terfere nos resultados do estudo.  
Câmaras de inalação  
— descrição pormenorizada – incluindo o volume e um esquema – das 
câmaras de inalação,  
— origem e descrição do equipamento utilizado na exposição dos animais e 
na geração da atmosfera,  
— equipamento de medição da temperatura, humidade, granulometria e 
concentração real,  
— fonte de ar e sistema de climatização utilizado,  
— métodos utilizados para calibrar o equipamento a fim de garantir a 
homogeneidade da atmosfera ensaiada,  
— subpressão ou sobrepressão,  
— pontos de exposição por câmara (de exposição unicamente nasal); loca ­
lização dos animais na câmara (câmara de exposição de corpo inteiro),  
— estabilidade da atmosfera ensaiada,  
— localização nas câmaras dos sensores térmicos e higrométricos e dos 
pontos de colheita de amostras da atmosfera ensaiada,  
— tratamento do ar fornecido/evacuado,  
— caudais de ar, caudal de ar em cada ponto de exposição (exposição 
unicamente nasal) ou relação entre o volume ocupado pelos animais e 
o volume da câmara (câmara de exposição de corpo inteiro),  
— tempo necessário para as câmaras de inalação atingirem o equilíbrio 
(t95),  
— número horário de substituições de volume,  
— medidores (se existirem).  
Elementos relativos à exposição  
— fundamentação da escolha da concentração visada no estudo principal,  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 434
 
— concentrações nominais (dadas pela divisão da massa do produto quí ­
mico em estudo introduzido na câmara de inalação pelo volume de ar 
total que nela circulou),  
— concentrações reais do produto químico em estudo obtidas na zona de 
respiração dos animais; no caso das misturas que geram formas físicas 
heterogéneas (gases, vapores, aerossóis), pode analisar-se separadamente 
cada uma delas,  
— as concentrações no ar devem indicar-se em unidades de massa (mg/l, 
mg/m  3 , etc.) e não de volume (ppm, ppb, etc.),  
— distribuição granulométrica, diâmetro aerodinâmico mediano da 
massa (MMAD) e desvio-padrão geométrico ( σ g ), incluindo os métodos 
de cálculo correspondentes; indicar também o resultado de cada análise 
granulométrica efetuada.  
Condições de realização dos ensaios  
— elementos sobre a preparação do produto químico estudado, nomeada ­
mente sobre eventuais métodos de redução da granulometria de sólidos 
ou de preparação de soluções do produto químico,  
— descrição (de preferência complementada por um esquema) do equipa ­
mento utilizado para gerar a atmosfera ensaiada e para expor os animais 
a essa atmosfera,  
— elementos relativos ao equipamento de monitorização da temperatura, 
humidade e caudal de ar nas câmaras (curvas de calibração),  
— elementos relativos ao equipamento utilizado para colher as amostras 
para determinação da granulometria e da concentração nas câmaras,  
— elementos sobre o método de análise química utilizado e sobre a vali ­
dação desse método (incluindo o rendimento da recuperação do produto químico em estudo do meio amostrado),
 
— método utilizado para distribuir aleatoriamente os animais pelos grupos 
ensaiados e pelos grupos de controlo,  
— elementos sobre a qualidade dos alimentos e da água (incluindo o tipo 
de dieta e a origem desta, bem como a origem da água),  
— fundamentação da escolha das concentrações utilizadas nos ensaios.  
Resultados  
— quadro com a temperatura, a humidade e o caudal de ar nas câmaras,  
— quadro com as concentrações nominais e reais nas câmaras,  
— quadro com os dados granulométricos, nomeadamente dados analíticos 
sobre a colheita de amostras, a distribuição granulométrica e os cálculos 
de MMAD e σ g , 
— quadro com os dados de resposta e as concentrações correspondentes a 
cada animal (animais que apresentaram sinais de toxicidade, incluindo 
mortalidade, e natureza, intensidade, momento do aparecimento e dura ­
ção dos efeitos),  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 435
 
— quadro com os pesos de cada animal,  
— quadro dos consumos alimentares,  
— quadro dos dados de patologia clínica,  
— resultados da autópsia e resultados histopatológicos correspondentes a 
cada animal, se disponíveis.  
Discussão e interpretação dos resultados  
— deve ser dada especial atenção à descrição dos métodos utilizados para 
satisfazer os critérios deste método de ensaio, nomeadamente no que respeita à concentração-limite e à granulometria,
 
— examinar em que medida, com base nos resultados globais, as partículas 
são respiráveis, em especial se os critérios granulométricos não forem satisfeitos,
 
— a apreciação global do estudo deve incidir igualmente na coerência dos 
métodos utilizados para determinar as concentrações nominal e real e 
deve dar conta da relação entre estas concentrações,  
— referir a causa provável da morte e o modo de ação predominante 
(sistémico ou local),  
— explicar por que razão terá sido necessário eutanasiar animais que apre ­
sentavam sinais de dor ou de grande sofrimento continuado, com base 
nos critérios do documento de orientações da OCDE relativo aos parâ ­
metros eticamente mensuráveis (3);  
— identificar o(s) órgão(s)-alvo,  
— determinar o NOAEL e o LOAEL (nível mínimo com observação de 
efeitos adversos).  
REFERÊNCIAS:  
(1) OCDE (1981).  Subchronic Inhalation Toxicity Testing . Original Test Gui ­
deline No. 413. Environment Directorate, OCDE, Paris.  
(2) OCDE (2009).  Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing.  
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Asses ­
sment No. 39. ENV/JM/MONO(2009)28, OCDE, Paris.  
(3) OCDE (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series 
on Testing and Assessment No. 19. ENV/JM/MONO(2000)7, OCDE, Paris.
 
(4) Whalan J.E., Redden J.C. (1994). Interim Policy for Particle Size and Limit 
Concentration Issues in Inhalation Toxicity Studies. Office of Pesticide Programs, United States Environmental Protection Agency.
 
(5) Dungworth D.L., Tyler W.S., Plopper C.E. (1985). Morphological Methods 
for Gross and Microscopic Pathology (Capítulo 9),  in Toxicology of Inhaled 
Material . Witschi, H.P., Brain, J.D. (eds.). Springer Verlag Heidelberg, p. 
229-258.  
(6) Young J.T. (1981). Histopathological examination of the rat nasal cavity.  
Fundam. Appl. Toxicol.  1:309-312.  
(7) Harkema J.R. (1990). Comparative pathology of the nasal mucosa in labo ­
ratory animals exposed to inhaled irritants.  Environ. Health Perspect.  
85:231-238.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 436
 
(8) Woutersen R.A., Garderen-Hoetmer A., van Slootweg P.J., Feron V.J. 
(1994). Upper respiratory tract carcinogenesis in experimental animals and 
in humans.  In Waalkes M.P., Ward J.M. (eds.) Carcinogenesis. Target 
Organ Toxicology Series, Raven Press, New York, 215-263.  
(9) Mery S., Gross E.A., Joyner D.R., Godo M., Morgan K.T. (1994). Nasal 
diagrams: A tool for recording the distribution of nasal lesions in rats and 
mice.  Toxicol. Pathol.  22:353-372.  
(10) Kuper C.F., Koornstra P.J., Hameleers D.M.H., Biewenga J., Spit B.J., 
Duijvestijn A.M., Breda Vriesman van P.J.C., Sminia T. (1992). The role 
of nasopharyngeal lymphoid tissue.  Immunol. Today  13:219-224.  
(11) Kuper C.F., Arts J.H.E., Feron V.J. (2003). Toxicity to nasal-associated 
lymphoid tissue.  Toxicol. Lett.  140-141:281-285.  
(12) Lewis D.J. (1981). Mitotic Indices of Rat Laryngeal Epithelia.  Journal of 
Anatomy  132(3):419-428.  
(13) Regulamento (CE) n.  o 1272/2008 do Parlamento Europeu e do Conselho, de 
16 de dezembro de 2008, relativo à classificação, rotulagem e embalagem de substâncias e misturas, que altera e revoga as Diretivas 67/548/CEE e 
1999/45/CE, e altera o Regulamento (CE) n.
 o 1907/2006 (JO L 353 de 
31.12.2008, p. 1).  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 437
 
Apêndice 1  
DEFINIÇÃO  
Produto químico em estudo:  qualquer substância ou mistura à qual seja apli ­
cado este método de ensaio.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 438
 
B.30.  ESTUDOS DE TOXICIDADE CRÓNICA  
INTRODUÇÃO  
1. Este método é equivalente ao  Test Guideline  452 (2009) da OCDE. O  Test 
Guideline  452 (TG 452) inicial foi adotado em 1981. Entendeu-se necessá ­
rio rever o método B.30 para dar conta da evolução recente no domínio do 
bem-estar animal e da regulamentação (1)(2)(3)(4). A atualização do método B.30 decorreu paralelamente à revisão dos capítulos B.32 ("Estudos de carcinogenicidade") e B.33 ("Estudos combinados de toxicidade crónica e 
carcinogenicidade") deste anexo. Visa-se obter mais dados a partir dos 
animais utilizados nos estudos e dispor de mais elementos para a escolha das doses. Este método foi concebido para o ensaio de uma vasta gama de produtos químicos, nomeadamente pesticidas e produtos químicos indus ­
triais.
 
2. Na sua maioria, os estudos de toxicidade crónica são efetuados em roedores. 
Este método destina-se, portanto, a ser aplicado, preferencialmente, a estu ­
dos em espécies de roedores. Caso seja necessário efetuar estudos noutras espécies, os princípios e procedimentos descritos neste método e no 
capítulo B.27 deste anexo — "Estudo de toxicidade oral de dose repetida 
em espécies não roedoras com a duração de 90 dias" (5) — podem igual ­
mente ser aplicados, com as adaptações necessárias descritas no  Guidance 
Document on the Design and Conduct of Chronic Toxicity and Carcinoge ­
nicity Studies  (n.
 o 116) da OCDE (6).  
3. As três vias principais de administração nos estudos de toxicidade crónica 
são a via oral, a via dérmica e a via inalatória. A via de administração 
escolhida depende das características físico-químicas do produto químico em estudo e da via predominante de exposição humana. O documento de orien ­
tações n.
 o 116 da OCDE (6) contém mais informações sobre a escolha da 
via de exposição.  
4. Este método centra-se na exposição por via oral, que é a via habitualmente 
mais utilizada nos estudos de toxicidade crónica. Embora possa também ser necessário efetuar estudos de toxicidade crónica a longo prazo por via dérmica ou por inalação para avaliar o risco para a saúde humana e/ou 
isso possa mesmo ser exigido pela regulamentação aplicável, estas duas 
vias de exposição são bastante complexas do ponto de vista técnico e esses estudos têm de ser concebidos para cada caso concreto. Porém, no que diz respeito às recomendações relativas aos períodos de exposição, aos parâme ­
tros clínicos e patológicos e a outros aspetos, o método aqui descrito para 
caracterização e avaliação da toxicidade crónica por administração oral pode constituir a base de um protocolo para estudos por inalação e/ou por via dérmica. A OCDE publicou orientações relativas ao estudo da administração 
de produtos químicos por inalação (6)(7) e por via dérmica (6). Para a 
conceção de estudos a longo prazo com exposição por via inalatória, recomenda-se especificamente a consulta dos capítulos B.8 (8) e B.29 (9) deste anexo e do documento de orientações da OCDE relativo a ensaios de 
toxicidade aguda por inalação (7). No caso dos ensaios por via dérmica, 
deve consultar-se o capítulo B.9 (10) deste anexo.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 439
 
5. Os estudos de toxicidade crónica fornecem informações sobre os perigos 
para a saúde que potencialmente podem advir da exposição repetida durante 
um período considerável do tempo de vida da espécie utilizada. Estes estu ­
dos fornecem informações sobre os efeitos tóxicos do produto químico em causa, os órgãos afetados e a possibilidade de acumulação. Podem igual ­
mente servir para obter uma estimativa do nível sem observação de efeitos 
adversos (" no observed adverse effect level ", NOAEL), com base na qual se 
podem estabelecer critérios de segurança para a exposição humana. Salienta-se a necessidade de um exame clínico cuidadoso dos animais, de 
modo a obter-se o máximo de informação possível.
 
6. Entre os objetivos dos estudos efetuados por este método contam-se os 
seguintes:  
— identificação da toxicidade crónica de produtos químicos,  
— identificação de órgãos afetados,  
— caracterização de relações dose-resposta,  
— determinação de níveis sem observação de efeitos adversos (NOAEL) ou 
ponto de partida para o estabelecimento de doses de referência,  
— previsão de efeitos de toxicidade crónica aos níveis da exposição 
humana,  
— obtenção de dados para verificação de hipóteses relativas a modos de 
ação (6).  
CONSIDERAÇÕES INICIAIS  
7. Antes de efetuar um estudo com vista à caracterização e avaliação de um 
produto químico do ponto de vista toxicológico, o laboratório que efetuará 
os ensaios deve ponderar todas as informações disponíveis sobre o produto químico em causa, a fim de adaptar o estudo de modo a melhorar a efi ­
ciência da determinação do potencial de toxicidade crónica e para minimizar 
o recurso a animais. Entre os elementos que podem ser úteis na conceção do 
estudo contam-se a identidade, a estrutura química e as propriedades físico- -químicas do produto químico em causa, informações disponíveis sobre o modo de ação, resultados de ensaios de toxicidade  in vitro  ou in vivo , as 
utilizações previstas, o potencial de exposição humana, dados (Q)SAR — 
"(quantitative) structure-activity relationships ", relações (quantitativas) es ­
trutura/atividade — e toxicológicos disponíveis sobre produtos químicos estruturalmente afins, dados toxicocinéticos disponíveis (dados cinéticos as ­
sociados a uma dose única ou a doses múltiplas) e dados provenientes de 
outros estudos com exposição repetida. Só deve proceder-se à determinação da toxicidade crónica depois de obtidos dados de toxicidade preliminares 
provenientes de estudos de toxicidade com repetição da dose administrada 
durante 28 e/ou 90 dias. Deve ponderar-se uma abordagem faseada dos ensaios de toxicidade crónica no âmbito da avaliação global dos potenciais efeitos adversos na saúde do produto químico em estudo (11)(12)(13)(14).
 
8. Antes de iniciar o estudo, devem escolher-se, com base no plano 
experimental e nos objetivos estabelecidos, os métodos estatísticos mais 
adequados para a análise dos resultados. Entre outros aspetos a considerar, 
é necessário determinar se o tratamento estatístico deverá contemplar ajus ­
tamentos em função do grau de sobrevivência e que tipo de análise deve efetuar-se no caso da morte prematura de todos os animais de um ou mais 
grupos. Para orientações sobre as análises estatísticas mais adequadas e 
informação sobre as referências bibliográficas fundamentais dos métodos estatísticos internacionalmente reconhecidos, deve consultar-se o documento de orientações n.
 o 116 (6), assim como o documento de orientações n.  o 35, 
relativo à análise e avaliação de estudos de toxicidade crónica e de 
carcinogenicidade (15).  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 440
 
9. Ao realizar um estudo de toxicidade crónica, recomenda-se que sejam sem ­
pre seguidos os princípios e considerações orientadoras enunciados no  Gui­
dance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation  
(n.
 o 19) da OCDE (16), nomeadamente os expressos no ponto 62 do mes ­
mo, cuja tradução é a seguinte:  Nos estudos com repetição da dose adminis ­
trada, se um animal evidenciar sinais clínicos progressivos da deterioração do seu estado, deve tomar-se uma decisão com conhecimento de causa sobre se deve ou não ser eutanasiado. Para isso, deve ponderar-se, nomea ­
damente, o valor das informações que seriam obtidas no caso de o animal 
continuar integrado no estudo, relativamente ao estado geral do mesmo. Caso se decida manter o animal no estudo, deve aumentar-se, tanto quanto necessário, a frequência dos exames que lhe são efetuados. Também é 
possível, sem prejudicar a finalidade do ensaio, suspender temporariamente 
a administração do produto químico em estudo — se isso reduzir a dor ou o sofrimento do animal — ou reduzir a dose administrada.
 
10. Para orientações pormenorizadas sobre os princípios aplicáveis à escolha das 
doses para estudos de toxicidade crónica e de carcinogenicidade e uma discussão dos mesmos, recomenda-se a consulta do documento de orienta ­
ções n.
 o 116 (6) e das publicações com as referências 17 e 18 do Interna ­
tional Life Sciences Institute. A estratégia de base para escolha das doses depende do objetivo ou objetivos principais do estudo (ver o ponto 6). Para escolher doses adequadas, importa estabelecer um equilíbrio entre, por um 
lado, a identificação dos perigos em jogo e, por outro, a caracterização e 
importância das respostas às doses reduzidas. Este equilíbrio é especialmente necessário quando se realizam estudos combinados de toxicidade crónica e de carcinogenicidade (capítulo B.33 deste anexo) — ver o ponto 11.
 
11. Deve ponderar-se a oportunidade de efetuar um estudo combinado de toxi ­
cidade crónica e de carcinogenicidade (capítulo B.33 deste anexo), em vez 
de efetuar separadamente um estudo de toxicidade crónica (o presente mé ­
todo B.30) e um estudo de carcinogenicidade (capítulo B.32 deste anexo). O estudo combinado é mais favorável, em termos de tempo e de custos, do 
que dois estudos distintos e não prejudica a qualidade dos dados obtidos na 
etapa de toxicidade crónica nem na etapa de carcinogenicidade. Ao efetuar um estudo combinado de toxicidade crónica e de carcinogenicidade (capí ­
tulo B.33 deste anexo), é, porém, necessário prestar especial atenção aos 
princípios relativos à escolha das doses (pontos 9 e 20 a 25). Reconhece-se, 
porém, que determinadas regulamentações podem exigir a realização de estudos separados.
 
12. No final do capítulo e no documento de orientações n.  o 116 (6) definem-se 
alguns conceitos utilizados neste método.  
PRINCÍPIO DO MÉTODO  
13. Administra-se diariamente o produto químico em estudo a vários grupos de 
animais, em doses crescentes de grupo para grupo, normalmente durante doze meses, embora possam escolher-se períodos mais longos ou mais curtos em função das exigências da regulamentação (ver o ponto 33). 
Escolhe-se a duração do estudo de modo a ser suficientemente longa para 
que os eventuais efeitos de toxicidade acumulada se manifestem, mas sem que sejam perturbados por alterações ligadas ao envelhecimento dos ani ­
mais. Se o período de exposição não for de doze meses, é necessário 
fundamentá-lo, sobretudo se a duração da exposição for mais curta. Nor ­
malmente, administra-se o produto químico por via oral, embora a via inalatória ou a via dérmica também possam ser adequadas. Pode estar pre ­
vista a realização de uma ou mais eutanásias intercalares, por exemplo, após 
três ou seis meses. Nesse caso, pode aumentar-se o número de grupos de 
animais em conformidade (ver o ponto 19). No decurso do período de administração do produto químico, deve verificar-se atentamente se os ani ­
mais evidenciam sinais de toxicidade. Autopsia-se os animais que morrem 
ou são eutanasiados durante os ensaios. No final dos ensaios, eutanasiam-se 
e autopsia-se os animais sobreviventes.
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DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
Escolha da espécie animal  
14. Este método trata, em especial, da caracterização e avaliação da toxicidade 
crónica em roedores (ver o ponto 2), embora determinadas regulamentações exijam estudos similares em não roedores. É necessário justificar a escolha da espécie. Se forem exigidos estudos de toxicidade crónica em espécies que 
não sejam de roedores, a conceção e realização desses estudos deve 
basear-se nos princípios descritos no presente método e no capítulo B.27 deste anexo – "Estudo de toxicidade oral de dose repetida em espécies não roedoras com a duração de 90 dias" (5). O documento de orientações 
n.
 o 116 (6) contém mais informações sobre a escolha da espécie e da estirpe.  
15. Embora neste método se possa recorrer a outros roedores, como o ratinho, a 
espécie preferida é o rato. O rato e o ratinho constituem os modelos ex ­
perimentais preferidos devido à sua longevidade relativamente reduzida, à sua utilização generalizada em estudos farmacológicos e toxicológicos, à sua 
sensibilidade à indução de tumores e à disponibilidade de estirpes suficien ­
temente caracterizadas destas espécies. Em consequência disto, dispõe-se de numerosos dados sobre a fisiologia e patologia destes animais. Devem ser utilizados animais adultos, jovens e saudáveis de estirpes laboratoriais cor ­
rentes. O estudo de toxicidade crónica deve ser realizado com animais da 
mesma estirpe e proveniência que os utilizados no estudo ou estudos pre ­
liminares mais curtos. As fêmeas utilizadas devem ser nulíparas e não podem estar grávidas.
 
Condições de alojamento e alimentação  
16. Os animais podem ser alojados individualmente ou em pequenos grupos do 
mesmo sexo. É necessário justificar cientificamente a opção pelo alojamento 
individual (19)(20)(21). As gaiolas devem ser dispostas de forma a minimi ­
zar possíveis efeitos derivados do seu posicionamento. A temperatura do biotério deve ser de 22 °C ± 3 °C. A humidade relativa deve estar com ­
preendida entre 50 % e 60 %, embora sejam aceitáveis valores compreen ­
didos entre 30 %, no mínimo, e um valor máximo que, preferencialmente, 
não deve exceder 70 %, salvo durante os períodos de limpeza do biotério. A iluminação deve ser artificial, com uma sequência de 12 horas de luz se ­
guidas de 12 horas de escuridão. Na alimentação, podem utilizar-se dietas 
convencionais de laboratório e deve ser fornecida água de beber sem res ­
trições. A dieta deve satisfazer as necessidades nutricionais da espécie es ­
tudada. Os teores de contaminantes da dieta – resíduos de pesticidas, po ­
luentes orgânicos persistentes, fitoestrogénios, metais pesados, micotoxinas e 
outros – podem influenciar os resultados dos ensaios e devem ser os mais 
baixos possíveis. É necessário obter periodicamente dados analíticos relati ­
vos aos teores de nutrientes e de contaminantes da dieta, pelo menos no início do estudo e quando se muda de lote. Estes dados devem constar do 
relatório final. É igualmente necessário dispor de dados analíticos da água 
de beber utilizada no estudo. Quando o produto químico em estudo é administrado por via alimentar, a escolha da dieta pode ser influenciada pela necessidade de nela misturar convenientemente esse produto químico 
e de satisfazer simultaneamente as exigências nutricionais dos animais.
 
Preparação dos animais  
17. Os animais utilizados devem ser saudáveis e ter sido aclimatados às condi ­
ções laboratoriais durante, pelo menos, sete dias e não devem ter participado 
em experiências anteriores. No caso dos roedores, a administração do pro ­
duto químico em estudo deve iniciar-se logo que possível após o desmame e a aclimatação, de preferência antes de os animais completarem oito semanas. É necessário caracterizar a espécie, a estirpe, a proveniência, o sexo, o peso 
e a idade dos animais utilizados no estudo. No início do estudo, as diferen ­
ças de peso entre os animais de cada sexo devem ser mínimas, não se
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desviando mais de 20 % do peso médio de todos os animais de cada sexo 
nele utilizados. Distribuem-se aleatoriamente os animais pelos grupos de 
controlo e pelos grupos expostos. Depois da distribuição aleatória dos ani ­
mais, a média de peso corporal não deve diferir significativamente de grupo para grupo de animais do mesmo sexo. Se houver diferenças com signifi ­
cado estatístico, os animais devem, se possível, ser redistribuídos aleatoria ­
mente. Deve atribuir-se a cada animal um número de identificação único, com o qual o animal seja identificado por tatuagem, implantação de  micro­
chip ou outro método adequado.
 
PROCEDIMENTO  
Número e sexo dos animais  
18. Devem ser utilizados animais de ambos os sexos. O número de animais 
utilizados deve ser suficiente para que, no final do estudo, reste em cada 
grupo um número de animais que permita efetuar uma avaliação biológica e estatística aprofundada. Caso se utilizem roedores, normalmente cada grupo do mesmo sexo exposto a cada dose deve integrar, pelo menos, 20 animais; 
caso não se utilizem roedores, recomenda-se que o número mínimo seja de 
quatro animais do mesmo sexo por grupo, para cada dose. Nos estudos em ratinhos, pode ser necessário reforçar o número de animais em cada grupo, para cada dose, para poder realizar todas as determinações hematológicas 
previstas.
 
Eutanásias intercalares, grupos satélites e animais sentinelas  
19. Caso se justifique do ponto de vista científico, pode prever-se a realização 
de eutanásias intercalares (pelo menos dez animais de cada grupo, de cada 
um dos sexos), por exemplo, ao fim de seis meses, para obter informações 
sobre a evolução das alterações toxicológicas, bem como dados mecanísti ­
cos. Caso já se disponha desses dados, obtidos em estudos de toxicidade por dose repetida realizados com o produto químico em causa, as eutanásias em 
questão podem não se justificar cientificamente. Podem também prever-se 
grupos satélites para verificar a reversibilidade de alterações toxicológicas induzidas pelo produto químico em estudo. Nesse caso, os grupos satélites restringir-se-ão, normalmente, à dose mais elevada em estudo e aos grupos 
de controlo. Pode ainda prever-se um grupo de animais sentinelas (habitual ­
mente cinco animais de cada sexo) para verificar, se necessário, o apareci ­
mento de doenças durante o estudo (22). Caso esteja prevista a realização de eutanásias intercalares ou a inclusão de grupos satélites ou sentinelas, o 
número de animais a utilizar no estudo deve ser aumentado no número de 
animais a eutanasiar antes do termo do mesmo. Normalmente, os animais em causa devem ser objeto dos mesmos exames, nomeadamente peso cor ­
poral, consumo de alimentos e de água, análises hematológicas e de química 
clínica e exames patológicos, que os animais participantes na etapa de toxicidade crónica do estudo principal, embora também possa prever-se (no caso dos grupos com destino a eutanásia intercalar) que as determina ­
ções se limitem a parâmetros fundamentais específicos, por exemplo, de 
neurotoxicidade ou de imunotoxicidade.
 
Grupos de dose e dosagens  
20. O documento de orientações n.  o 116 (6) contém orientações relativas a todos 
os aspetos relacionados com a escolha das doses e os intervalos entre estas. 
Devem ser utilizados, pelo menos, três doses e um controlo em paralelo, 
exceto nos casos em que se realiza um ensaio do limite (ver o ponto 27). As doses baseiam-se, normalmente, nos resultados de estudos exploratórios das doses ou de estudos de dose repetida por períodos mais curtos e devem 
atender aos dados toxicológicos e toxicocinéticos disponíveis sobre o pro ­
duto químico em estudo ou produtos químicos afins.
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21. A menos que tal dose esteja limitada pelas características físico-químicas ou 
pelos efeitos biológicos do produto químico em estudo, normalmente 
escolhe-se para dose mais elevada o nível que permita identificar os prin ­
cipais órgãos afetados e os efeitos tóxicos principais sem causar sofrimento, efeitos tóxicos intensos, morbidez nem mortalidade. Tendo presente o refe ­
rido no ponto 22, deve escolher-se para dose mais elevada uma dose que 
induza efeitos tóxicos, evidenciados, por exemplo, por uma redução (apro ­
ximadamente de 10 %) do ganho de peso corporal.
 
22. Todavia, consoante os objetivos do estudo (ver o ponto 6), pode escolher-se 
uma dose máxima inferior à que evidencia efeitos tóxicos, por exemplo, se essa dose induzir um efeito adverso preocupante, mas com pouca influência 
na longevidade ou no peso corporal dos animais. A dose máxima não deve 
exceder 1 000 mg por quilograma de peso corporal por dia (relativamente à dose-limite, ver o ponto 27).
 
23. Podem escolher-se doses e intervalos entre doses que permitam estabelecer 
uma relação dose-resposta e determinar um NOAEL ou outro resultado pretendido do estudo, por exemplo, uma dose de referência (ver o 
ponto 25) ao nível de dose mais baixo. Entre os fatores a ter em conta 
na escolha das doses mais baixas, contam-se o declive esperado da curva dose-resposta, as doses às quais podem ocorrer alterações importantes ao 
nível metabólico ou do modo da ação tóxica, o nível ao qual se prevê a 
ocorrência de um limiar e o nível ao qual se prevê fixar o ponto de partida de extrapolações para doses mais baixas.
 
24. O intervalo entre as doses depende das características do produto químico 
em estudo e não pode ser prescrito neste método. Contudo, a utilização de intervalos definidos por um fator de 2 a 4 entre doses consecutivas dá 
frequentemente bons resultados nestes ensaios, sendo muitas vezes melhor 
ensaiar um quarto grupo do que recorrer a intervalos muito grandes (por exemplo, mais do que um fator de 6 a 10) entre as dosagens. Em geral, são de evitar fatores superiores a 10. Caso contrário, é necessário justificá-los.
 
25. Conforme se explica mais em pormenor no documento de orientações 
n. o 116 (6), entre os aspetos a ter em conta na escolha das doses 
contam-se os seguintes:  
— relações não lineares ou pontos de inflexão conhecidos ou de que se 
suspeite na curva dose-resposta,  
— aspetos toxicocinéticos e doses às quais ocorra, ou não ocorra, indução 
metabólica, saturação ou não linearidade entre as doses externas e as doses internas,
 
— lesões precursoras, marcadores de efeitos ou indicadores de processos 
biológicos fundamentais subjacentes em curso,  
— aspetos fundamentais (ou de que se suspeite) do modo de ação, tais 
como as doses às quais começam a manifestar-se efeitos citotóxicos, 
os níveis hormonais são perturbados, os mecanismos homeostáticos co ­
lapsam, etc.,  
— regiões da curva dose-resposta que necessitam de estimativas especial ­
mente rigorosas, por exemplo, perto da dose de referência prevista ou da dose à qual se suspeite corresponder um limiar,
 
— níveis previstos de exposição humana.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 444
 
26. O grupo de controlo deve ser um grupo não exposto ao produto químico em 
estudo ou, se for usado um veículo para administrar o produto químico, um 
grupo de controlo do veículo. Salvo no que respeita à exposição ao produto químico em estudo, os animais do grupo de controlo devem ser tratados do mesmo modo que os animais dos grupos ensaiados. Caso se utilize um 
veículo, o grupo de controlo deve receber o volume máximo de veículo 
utilizado nos grupos expostos ao produto químico em estudo. Se o produto químico for administrado por via da dieta e reduzir significativamente a quantidade desta ingerida por lhe conferir menor palatabilidade, um grupo 
de controlo adicional alimentado do mesmo modo, em paralelo, pode cons ­
tituir um grupo de controlo mais adaptado.
 
27. Se, com base em estudos preliminares, for de prever que o ensaio, realizado 
de acordo com o presente método, de uma dose equivalente a não menos de 
1 000 mg/kg de peso corporal/dia não provoque efeitos adversos e, tendo 
em conta dados referentes a produtos químicos estruturalmente afins, não forem de prever efeitos tóxicos, pode considerar-se que não é necessário efetuar um estudo completo com três doses. Nesses casos, pode justificar-se 
um limite de 1 000 mg/kg de peso corporal/dia, exceto se os dados relativos 
à exposição humana aconselharem o ensaio de doses superiores.
 
Preparação das doses e administração do produto químico em estudo  
28. O produto químico em estudo é normalmente administrado por via oral, 
através da dieta ou da água de beber ou por intermédio de uma sonda esofágica. O documento de orientações n.
 o 116 (6) contém mais informações 
sobre vias e métodos de administração. A via e o método de administração 
dependem do objetivo do estudo, bem como das propriedades físico-quími ­
cas e biodisponibilidade do produto químico em causa e da via e do método de exposição humana predominantes. É necessário fundamentar a via e o método de administração escolhidos. Por razões de bem-estar animal, nor ­
malmente só deve optar-se pela utilização de uma sonda esofágica no caso 
dos agentes relativamente aos quais a via oral e este método de adminis ­
tração representem razoavelmente a exposição humana potencial (por exem ­
plo, através da ingestão de produtos farmacêuticos). No caso dos produtos 
químicos ingeridos com os alimentos ou disseminados no ambiente, nomea ­
damente pesticidas, a administração habitual é por incorporação na dieta ou na água de beber. Todavia, para outros cenários — caso da exposição 
profissional —, pode justificar-se a administração por outras vias.
 
29. Se necessário, pode suspender-se ou dissolver-se o produto químico em 
estudo num veículo apropriado. Devem ser tidos em conta as seguintes características que se justifiquem do veículo e de outros aditivos: efeitos na absorção, na distribuição, no metabolismo ou na retenção do produto 
químico em estudo, efeitos nas propriedades químicas do produto químico 
em causa suscetíveis de alterarem as características tóxicas do mesmo e efeitos no consumo de alimentos, na ingestão de água ou no estado nutri ­
cional dos animais. Recomenda-se que, sempre que possível, a primeira 
opção seja uma solução ou suspensão aquosa; caso tal não seja viável, 
pode optar-se por uma solução ou emulsão num óleo (por exemplo, em óleo de milho); em último caso, poderá recorrer-se a uma solução noutro veículo. Se o veículo utilizado não for água, é necessário conhecer as suas 
características de toxicidade. Deve dispor-se de informações sobre a estabi ­
lidade do produto químico em estudo e a homogeneidade das soluções ou rações de dosagem (consoante o caso) nas condições de administração (por 
exemplo, por via da dieta).
 
30. É importante assegurar que a quantidade de um produto químico em estudo 
administrada através da dieta ou da água de beber não interfere nas exigên ­
cias normais de nutrição nem no equilíbrio hídrico. No caso dos estudos de toxicidade a longo prazo nos quais o produto químico seja administrado pela 
via alimentar, a concentração deste nos alimentos não deve, normalmente, 
exceder 5 % da ração total, a fim de evitar desequilíbrios nutricionais. Se o produto químico em estudo for administrado por via da dieta, pode optar-se por concentrações constantes nesta (mg/kg de alimentos ou ppm) ou por 
doses constantes em relação ao peso corporal do animal (mg/kg de peso 
corporal), calculadas semanalmente. Deve indicar-se a opção tomada.
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31. Em caso de administração por via oral, os animais recebem uma dose 
quotidiana (sete dias por semana) do produto químico em estudo, normal ­
mente durante doze meses (ver também o ponto 33), embora possa ser necessário um período mais longo, em função das exigências da regulamen ­
tação. É necessário justificar qualquer outro regime de dosagem (por exem ­
plo, cinco dias por semana). Em caso de administração por via dérmica, os 
animais são normalmente expostos ao produto químico em estudo durante, pelo menos, seis horas por dia, sete dias por semana, conforme se descreve no capítulo B.9 (10) deste anexo, ao longo de doze meses. A exposição por 
via inalatória é efetuada durante seis horas por dia, sete dias por semana. 
Todavia, caso se justifique, também podem expor-se os animais durante ­
cinco dias por semana. O período de exposição neste caso é normalmente de doze meses. Se espécies que não o rato forem sujeitas a exposição unica ­
mente nasal, pode ajustar-se a duração máxima da exposição para minimizar 
a tensão gerada na espécie em causa. Se a duração da exposição for inferior a seis horas por dia, é necessário fundamentá-lo. Ver também o capítulo B.8 (8) deste anexo.
 
32. A administração do produto químico aos animais por meio de uma sonda 
esofágica deve efetuar-se à mesma hora do dia por meio de um tubo esto ­
macal ou de uma cânula de intubação adequada. Normalmente, 
administra-se a dose diária de uma só vez. Porém, se o produto químico for, por exemplo, um irritante local, pode repartir-se a mesma dose diária por dois momentos. O volume máximo de líquido que pode ser adminis ­
trado de cada vez depende do tamanho do animal e deve ser o mínimo 
possível. No caso dos roedores, normalmente não deve exceder 1 ml/100 g de peso corporal (22). Para minimizar diferenças entre volumes administra ­
dos, devem ser efetuados ajustes nas concentrações, de forma que o volume 
seja o mesmo para todas as doses. Excetuam-se os produtos químicos po ­
tencialmente corrosivos ou irritantes, que têm de ser diluídos para evitar efeitos locais intensos. Devem evitar-se concentrações que possam provocar 
efeitos corrosivos ou irritantes no tubo digestivo.
 
Duração do estudo  
33. Embora este método tenha sido preferencialmente concebido para estudos de 
toxicidade crónica com a duração de doze meses, também está adaptado e 
pode aplicar-se a estudos mais curtos (por exemplo, 6 ou 9 meses) ou mais 
longos (por exemplo, 18 ou 24 meses), consoante o exija a regulamentação pertinente ou por razões mecanísticas determinadas. Se o período de expo ­
sição não for de doze meses, é necessário fundamentá-lo, sobretudo se a 
duração da exposição for mais curta. Os grupos satélites incluídos para 
verificar a reversibilidade de alterações toxicológicas induzidas pelo produto químico em estudo devem manter-se sem dosagem após o termo da expo ­
sição, durante um período não inferior a quatro semanas e não superior a um 
terço da duração total do estudo. O documento de orientações n.
 o 116 (6) 
contém mais orientações, nomeadamente em matéria de sobrevivência dos animais no estudo.
 
EXAMES  
34. Normalmente no início e no final de cada dia, incluindo fins de semana e 
feriados, devem verificar-se os casos de morbidez ou mortalidade no con ­
junto dos animais. Pelo menos uma vez por dia, deve efetuar-se um exame clínico geral, de preferência sempre à(s) mesma(s) hora(s) e, no caso da 
administração por sonda esofágica, tendo em conta o período previsto de 
efeitos mais acentuados após a administração do produto químico.
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35. Deve efetuar-se um exame clínico aprofundado a cada animal pelo menos 
uma vez antes da primeira exposição (para poder fazer depois comparações 
com o estado inicial do animal), no final da primeira semana do estudo e, a partir daí, mensalmente. Os exames devem respeitar um protocolo que mi ­
nimize as variações entre quem os realiza e não faça depender os resultados 
do grupo examinado. Estes exames devem ser realizados fora das gaiolas, de 
preferência num recinto normalizado e sempre à mesma hora. Os resultados destes exames devem ser cuidadosamente registados, de preferência por recurso a um sistema de pontuação claramente definido pelo laboratório 
em causa. Deve zelar-se por que as condições de exame sejam o mais 
constantes possível. Entre os sinais a registar contam-se alterações da pele, da pelagem, dos olhos e das mucosas e a ocorrência de secreções, excreções ou reações neurovegetativas (por exemplo, lacrimação, horripilação, altera ­
ções da dimensão pupilar ou respiração anormal). Deve também registar-se 
qualquer alteração da maneira de o animal se mover, da postura e da reação à manipulação, bem como a ocorrência de movimentos clónicos ou tónicos e de comportamentos estereotipados (por exemplo, atos de higiene repetiti ­
vos ou movimentação repetitiva em círculo) ou estranhos (automutilação, 
movimentação para trás, etc.) (24).
 
36. Recorrendo a um oftalmoscópio ou a dispositivo equivalente, efetua-se um 
exame oftalmológico a cada animal antes da primeira administração do produto químico em estudo. No termo do estudo, deve efetuar-se este exame 
de preferência a todos os animais, mas pelo menos aos dos grupos expostos 
à dose mais elevada e dos grupos de controlo. Se forem detetadas alterações oculares atribuíveis à exposição ao produto químico em estudo, devem examinar-se todos os animais. Se a análise estrutural ou outros elementos 
indiciarem efeitos tóxicos ao nível ocular, deve aumentar-se a frequência 
dos exames oculares.
 
37. No caso dos produtos químicos que tenham revelado potencial de indução 
de efeitos neurotóxicos em estudos anteriores de toxicidade por dose repe ­
tida a 28 dias e/ou a 90 dias, poderá, a título facultativo, verificar-se a 
reatividade sensorial a diversos tipos de estímulos (24) — por exemplo, 
estímulos auditivos, visuais ou propriocetivos (25)(26)(27) — e avaliar-se a força de preensão (28) e a atividade motora (29), antes de iniciar o estudo e, a partir daí, de três em três meses, até aos doze meses, inclusive, bem 
como no termo do estudo (se for além de doze meses). As referências 
indicadas contêm mais informações sobre a maneira de proceder em cada caso, embora possam adotar-se procedimentos distintos dos nelas descritos.
 
38. No caso dos produtos químicos que tenham revelado potencial de indução 
de efeitos imunotóxicos em estudos anteriores de toxicidade por dose repe ­
tida a 28 dias e/ou a 90 dias, poderá, a título facultativo, aprofundar-se a 
investigação deste parâmetro no termo do estudo.  
Peso corporal, consumo de alimentos e de água, eficiência alimentar  
39. Todos os animais devem ser pesados no início da exposição, pelo menos 
uma vez por semana nas primeiras treze semanas e, a partir daí, pelo menos uma vez por mês. Deve medir-se o consumo de alimentos e a eficiência alimentar pelo menos uma vez por semana nas primeiras treze semanas e, a 
partir daí, pelo menos uma vez por mês. Se o produto químico em estudo 
for administrado através da água de beber, deve medir-se o consumo de água pelo menos uma vez por semana nas primeiras treze semanas e, a partir daí, pelo menos uma vez por mês. Pode ser útil medir o consumo de água 
também no caso dos estudos em que se verifiquem alterações do compor ­
tamento dos animais a esse nível.
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Análises hematológicas e de bioquímica clínica  
40. Nos estudos com roedores, devem ser efetuadas análises hematológicas a, 
pelo menos, dez machos e dez fêmeas de cada grupo, aos três, seis e 12 meses e no termo do estudo (se for além de 12 meses), sempre aos mesmos 
animais. No caso dos ratinhos, a realização das análises hematológicas 
necessárias pode exigir o recurso a animais satélites (ver o ponto 18). No caso dos estudos em que não sejam utilizados roedores, colhem-se amostras num número mais reduzido de animais (por exemplo, se a espécie 
utilizada for o cão, quatro animais de cada sexo, por grupo) em estádios 
intermédios e no termo do estudo, tal como se indicou para os roedores. Se, num estudo anterior, a 90 dias, efetuado com doses comparáveis, não se 
tiverem detetado alterações dos parâmetros hematológicos, não é necessário 
efetuar as análises previstas ao fim de três meses, tanto no caso dos roedores como de outras espécies. As amostras de sangue devem ser colhidas, sob anestesia, num ponto determinado a indicar, por exemplo, por punção car ­
díaca ou no seio retro-orbital.
 
41. Devem ser efetuadas as seguintes análises (30): contagem total de leucóci ­
tos, fórmula leucocitária, contagem de eritrócitos, contagem de plaquetas, concentração de hemoglobina, hematócrito (volume celular sanguíneo após 
centrifugação), volume corpuscular médio, hemoglobina corpuscular média, 
concentração de hemoglobina corpuscular média, tempo de protrombina e tempo de tromboplastina parcial ativada. Se necessário, em função da toxi ­
cidade do produto químico em estudo, poderão analisar-se outros parâmetros 
hematológicos, tais como os corpos de Heinz e outras anomalias morfoló ­
gicas dos eritrócitos ou a meta-hemoglobina. Em termos gerais, deve adotar-se uma perspetiva de flexibilidade, dependendo dos efeitos observa ­
dos e/ou previstos do produto químico em causa. Se este tiver efeitos no 
sistema hematopoiético, pode ser útil efetuar também a contagem de reticu ­
lócitos e uma citologia da medula óssea, embora estas análises não sejam sistematicamente necessárias.
 
42. Com a cronologia especificada para as análises hematológicas e colhendo as 
amostras de sangue sempre nos mesmos animais — pelo menos dez machos 
e dez fêmeas de cada grupo —, devem ser efetuadas análises de bioquímica clínica para determinar os principais efeitos tóxicos nos tecidos, nomeada ­
mente ao nível dos rins e do fígado. No caso dos ratinhos, a realização das 
necessárias análises de bioquímica clínica pode exigir o recurso a animais 
satélites. No caso dos estudos em que não sejam utilizados roedores, colhem-se amostras num número mais reduzido de animais (por exemplo, se a espécie utilizada for o cão, quatro animais de cada sexo, por grupo) em 
estádios intermédios e no termo do estudo, tal como se indicou para os 
roedores. Se, num estudo anterior, a 90 dias, efetuado com doses compará ­
veis, não se tiverem detetado alterações dos parâmetros de bioquímica clí ­
nica, não é necessário efetuar as análises previstas ao fim de três meses, 
tanto no caso dos roedores como de outras espécies. Recomenda-se o jejum 
dos animais (exceto dos ratinhos) durante a noite, antes da colheita das amostras de sangue. Devem ser efetuadas as seguintes análises (30): gluco ­
se, ureia (azoto ureico), creatinina, proteínas totais, albumina, cálcio, sódio, 
potássio, colesterol total, pelo menos duas análises reveladoras de efeitos 
hepatocelulares (alanina-aminotransferase, aspartato-aminotransferase, glutamato-desidrogenase, ácidos biliares totais) (31) e, pelo menos, duas análises reveladoras de efeitos hepatobiliares (fosfatase alcalina, 
gama-glutamil-transferase, 5’-nucleotidase, bilirrubina total, ácidos biliares 
totais) (31). Se necessário, em função da toxicidade do produto químico em estudo, poderão analisar-se outros parâmetros de química clínica, tais como a colinesterase, hormonas específicas e os triglicéridos em jejum. Em termos 
gerais, deve adotar-se uma perspetiva de flexibilidade, dependendo dos 
efeitos observados e/ou previstos do produto químico em causa.
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43. Devem ser efetuadas análises de urina a, pelo menos, dez machos e dez 
fêmeas de cada grupo, em amostras colhidas com a cronologia especificada 
para as análises hematológicas e de química clínica. Se, num estudo ante ­
rior, a 90 dias, efetuado com doses comparáveis, não se tiverem detetado alterações dos parâmetros analisados na urina, não é necessário efetuar as 
análises previstas ao fim de três meses. Uma recomendação de peritos 
relativa a estudos de patologia clínica (30) inclui a seguinte lista de parâme ­
tros: aspeto, volume, osmolalidade ou densidade, pH, proteínas totais e glucose. Podem também determinar-se os seguintes parâmetros: corpos ce ­
tónicos, urobilinogénio, bilirrubina e sangue oculto. Pode ser necessário 
recorrer ainda a outros parâmetros para investigar melhor os efeitos obser ­
vados.
 
44. Em geral, considera-se que, nos estudos em cães, é necessário dispor dos 
valores de base dos parâmetros hematológicos e de bioquímica clínica antes 
de iniciar a exposição dos animais, o mesmo não sucedendo, porém, no caso 
dos estudos em roedores (30). Se os dados de base históricos (ver o ponto 50) forem inadequados, pode, no entanto, ser necessário determinar os dados em falta.
 
Patologia  
Autópsia macroscópica  
45. Normalmente, deve ser realizada a todos os animais estudados uma autópsia 
macroscópica completa e pormenorizada através do exame cuidadoso da superfície exterior do corpo, dos orifícios, das cavidades craniana, torácica 
e abdominal e do conteúdo de cada uma destas. Todavia, pode igualmente 
prever-se que (no caso dos grupos com destino a eutanásia intercalar e dos grupos satélites) as determinações se limitem a parâmetros fundamentais específicos, por exemplo, de neurotoxicidade ou de imunotoxicidade (ver 
o ponto 19). Não é necessário autopsiar esses animais nem aplicar-lhes os 
procedimentos descritos nos pontos seguintes. Fica ao critério do diretor do estudo decidir em que casos é necessário autopsiar animais sentinelas.
 
46. Deve determinar-se o peso dos órgãos de cada animal, com exceção dos 
excluídos no ponto 45. Removem-se convenientemente todos os tecidos 
aderentes às glândulas suprarrenais, ao encéfalo, aos epidídimos, ao coração, aos rins, ao fígado, aos ovários, ao baço, aos testículos, à tiroide (com as glândulas paratiroides, sendo a pesagem efetuada depois da fixação) e ao 
útero de todos os animais (exceto os moribundos e os que sejam eutanasia ­
dos durante o estudo) e pesa-se cada um destes ainda húmido o mais rapidamente possível depois da dissecação, para evitar que seque. Nos es ­
tudos em ratinhos, a pesagem das glândulas suprarrenais é facultativa.
 
47. Os tecidos a seguir indicados devem conservar-se no meio de fixação mais 
adequado ao tipo de tecido em causa e ao exame histopatológico previsto (32) — os tecidos entre parênteses retos são facultativos: 
todas as lesões 
macroscópicas coração pâncreas estômago (pré-estômago, 
estômago glandular) 
glândulas suprarrenais íleo glândulas paratiroides [dentes] aorta jejuno nervo periférico testículos encéfalo (incluindo secções 
dos hemisférios cerebrais, 
do cerebelo e da medula/ /protuberância anelar) rins hipófise timo 
cego glândulas lacrimais (exo- 
-orbitais) próstata tiroide 
colo do útero fígado reto [língua]
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 449
 
glândulas de coagulação pulmões glândulas salivares traqueia 
cólon gânglios linfáticos (su ­
perficiais e profundos) vesículas seminais bexiga urinária 
duodeno glândulas mamárias (ob ­
rigatório no caso das fê ­
meas e, nos machos, se for claramente dissecá ­
vel) músculo esquelético útero, incluindo o colo do 
útero 
epidídimo [vias respiratórias supe ­
riores, incluindo o nariz, os cornetos e os seios paranasais] pele [ureteres] 
olhos (incluindo a retina) esófago medula espinal (a três 
níveis: cervical, medio ­
torácico e lombar) [uretra] 
[fémur com articulação] [bolbo olfativo] baço vagina 
vesícula biliar (exceto no 
caso do rato) ovários [esterno] secção da medula óssea e/ou 
uma punção recente de me ­
dula óssea 
glândulas de Harder
 
No caso dos órgãos emparelhados (por exemplo, os rins e as glândulas 
suprarrenais), devem ser conservados ambos. Os resultados clínicos e outros 
podem aconselhar o exame de outros tecidos. Devem ser conservados tam ­
bém todos os órgãos que as propriedades conhecidas do produto químico em estudo indiciem que serão provavelmente afetados. Nos estudos por via 
dérmica, os órgãos a conservar são ainda os constantes da lista relativa à 
exposição por via oral, mas é essencial proceder igualmente à amostragem e à conservação de pele do local onde o produto químico em estudo foi aplicado. Nos estudos por inalação, a lista de tecidos do aparelho respira ­
tório a conservar e a examinar deve seguir as recomendações dos capítulos 
B.8 (8) e B.29 (9) deste anexo. A lista de outros órgãos e tecidos a examinar neste caso (além dos tecidos do aparelho respiratório a conservar já espe ­
cificados), é a estabelecida para a exposição por via oral.
 
Histopatologia  
48. A referência 32 contém orientações sobre as melhores práticas a seguir na 
realização de estudos de patologias toxicológicas. Os exames histopatológi ­
cos devem incidir, no mínimo, no seguinte:  
— todos os tecidos dos animais dos grupos de controlo e dos grupos 
expostos à dose mais elevada,  
— todos os tecidos dos animais que morreram ou foram eutanasiados du ­
rante o estudo,  
— todos os tecidos com anomalias macroscópicas,  
— os tecidos dos órgãos-alvo, e os tecidos que revelaram alterações atri ­
buíveis à exposição ao produto químico em estudo nos animais dos 
grupos expostos à dose mais elevada, de todos os animais de todos os outros grupos expostos a uma dose do produto químico,
 
— no caso dos órgãos emparelhados (por exemplo, os rins e as glândulas 
suprarrenais), devem examinar-se ambos.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 450
 
DADOS E RELATÓRIOS  
Dados  
49. Devem ser apresentados dados por animal relativos a todos os parâmetros 
avaliados. Esses dados devem ainda ser resumidos num quadro, indicando, para cada grupo estudado, o número de animais no início do ensaio, o número de animais que morreram durante o ensaio ou que foram eutanasia ­
dos, a hora de cada morte ou eutanásia, o número de animais que apresen ­
taram sinais de toxicidade, a descrição dos sinais de toxicidade observados, nomeadamente o momento do seu aparecimento e a sua duração e intensi ­
dade, o número de animais que apresentaram lesões, o tipo de lesões e a 
percentagem de animais que apresentaram cada tipo de lesão. Devem cons ­
tar dos quadros de resumo dos dados as médias e os desvios-padrão (no caso dos dados contínuos) correspondentes aos animais que apresentaram lesões ou efeitos tóxicos, além do grau das lesões.
 
50. Os dados históricos de controlo podem ser úteis para a interpretação dos 
resultados do estudo, por exemplo, quando houver indicações de que os dados provenientes dos grupos de controlo em paralelo divergem significa ­
tivamente de dados recentes referentes a animais de controlo da mesma 
colónia e da mesma unidade de ensaio. Caso sejam avaliados dados histó ­
ricos de controlo, estes devem provir do mesmo laboratório, reportar-se a animais da mesma idade e estirpe e ter sido gerados nos cinco anos ante ­
riores ao estudo em causa.
 
51. Quando pertinente, devem ser avaliados os resultados numéricos por um 
método estatístico corrente adequado. Os métodos estatísticos e os dados a analisar devem ser escolhidos no planeamento do estudo (ponto 8). Nessa 
escolha, devem ser previstos os ajustamentos em função do grau de sobre ­
vivência que se revelem necessários.
 
Relatório dos ensaios  
52. Dados a constar do relatório dos ensaios:  
Produto químico em estudo:  
— natureza física, grau de pureza e propriedades físico-químicas,  
— dados de identificação,  
— proveniência,  
— número de lote,  
— boletim de análises químicas.  
Veículo (se for o caso):  
— justificação da escolha do veículo (se não for água).  
Animais estudados:  
— espécie e estirpe utilizadas e justificação da opção tomada,  
— número, idade e sexo dos animais no início dos ensaios,  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 451
 
— proveniência, condições de alojamento, dieta, etc.,  
— peso de cada animal no início do ensaio.  
Condições de realização dos ensaios:  
— fundamentação da via de administração e das doses escolhidas,  
— métodos estatísticos utilizados na análise dos dados, se for o caso,  
— elementos relativos à formulação do produto químico em estudo/à in ­
corporação do mesmo na dieta fornecida aos animais,  
— dados analíticos relativos à concentração atingida, estabilidade e homo ­
geneidade da preparação,  
— via de administração e elementos relativos à administração do produto 
químico em estudo,  
— no caso dos estudos por inalação: exposição unicamente nasal ou de 
corpo inteiro,  
— doses reais (mg/kg de peso corporal/dia) e, se for caso disso, fator de 
conversão entre a concentração do produto químico em estudo na dieta ou na água de beber (mg/kg ou ppm) e a dose real,
 
— elementos sobre a qualidade dos alimentos e da água.  
Resultados (apresentar quadros de resumo dos dados e os dados por ani ­
mal):  
— dados de sobrevivência,  
— pesos corporais e alterações de peso corporal,  
— consumo de alimentos, cálculos da eficiência alimentar (se efetuados) e 
consumo de água (se for caso disso),  
— dados das respostas tóxicas em função do sexo e da dose administrada, 
incluindo os sinais de toxicidade,  
— natureza, incidência (e, se quantificada, intensidade) e duração dos sinais 
clínicos observados (transitórios ou permanentes),  
— exame oftalmológico,  
— análises hematológicas,  
— análises de bioquímica clínica,  
— análises de urina,  
— resultados dos estudos de neurotoxicidade ou de imunotoxicidade even ­
tualmente efetuados,  
— peso corporal terminal,  
— peso de cada órgão (e relação com o peso corporal, se for caso disso),  
— resultados das autópsias,  
— descrição pormenorizada dos resultados histopatológicos resultantes da 
exposição dos animais ao produto químico em estudo,  
— dados de absorção, se disponíveis.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 452
 
Tratamento estatístico dos resultados, se for caso disso.  
Discussão dos resultados, nomeadamente:  
— relações dose-resposta,  
— análise dos dados disponíveis sobre modos de ação,  
— discussão dos eventuais modelos,  
— determinação das doses de referência, do NOAEL e do LOAEL,  
— dados históricos de controlo,  
— importância para o ser humano.  
Conclusões:  
REFERÊNCIAS:  
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de 90 dias".  
(6) OCDE (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 
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Disponível no sítio Web público de  Test Guidelines  da OCDE 
(www.oecd.org/env/testguidelines).  
(7) OCDE (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Series on Testing and Assessment No. 39. ENV/JM/MONO(2009)28, OC ­
DE, Paris.  
(8) Capítulo B.8 deste anexo, "Toxicidade subaguda por inalação: estudo de 28 
dias".  
(9) Capítulo B.29 deste anexo, "Toxicidade subcrónica por inalação: Estudo de 
90 dias".  
(10) Capítulo B.9 deste anexo, "Toxicidade (dérmica) da dose repetida (28 
dias)".  
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Apêndice 1  
DEFINIÇÃO  
Produto químico em estudo:  qualquer substância ou mistura à qual seja 
aplicado este método de ensaio.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 456
 
B.31.  ESTUDO DE TOXICIDADE SOBRE O DESENVOLVIMENTO 
PRÉ-NATAL  
1. MÉTODO  
O presente método baseia-se na publicação OECD TG 414 (2001) 
(normas de ensaio da OCDE).  
1.1. INTRODUÇÃO  
O presente método de ensaio de toxicidade sobre o desenvolvimento 
destina-se a fornecer informação geral sobre os efeitos de exposição 
pré-natal no animal de ensaio prenhe e no organismo em desenvol ­
vimento no útero; pode incluir a avaliação de efeitos maternos e de morte, anomalias estruturais ou alterações no crescimento do feto. 
Apesar de constituírem uma parte importante do desenvolvimento, as 
deficiências funcionais não são contempladas neste método de en ­
saio, poderão ser testadas num estudo independente ou em comple ­
mentaridade ao presente estudo, usando o método de ensaio de neu ­
rotoxicidade sobre o desenvolvimento. Para obter informações rela ­
tivas aos ensaios sobre deficiências funcionais e outros efeitos pós- -natais, deverão consultar-se os métodos de ensaio para o estudo da toxicidade sobre a reprodução em duas gerações e o estudo da neu ­
rotoxicidade sobre o desenvolvimento, conforme seja apropriado.
 
Em situações pontuais, poderá revelar-se oportuno introduzir adap ­
tações específicas no método de ensaio com base em informações 
relativas, por exemplo, às propriedades físico-químicas ou toxicoló ­
gicas da substância de ensaio. Contudo, este procedimento só será 
aceitável quando existirem fortes razões científicas de que as altera ­
ções ao método conduzirão a um ensaio mais informativo. Nesse caso, os fundamentos científicos que justificam as adaptações intro ­
duzidas deverão ser cuidadosamente documentados no relatório do 
estudo.
 
1.2. DEFINIÇÕES  
Toxicologia sobre o desenvolvimento:  estudo dos efeitos adversos 
que se manifestam num organismo em desenvolvimento em resul ­
tado da exposição a determinada substância antes da concepção, 
durante o desenvolvimento pré-natal ou no período que decorre desde o nascimento até à maturação sexual. As principais manifes ­
tações de toxicidade sobre desenvolvimento incluem: 1) morte do 
organismo, 2) anomalia estrutural, 3) alterações no crescimento e 4) 
deficiência funcional. Anteriormente, a toxicologia sobre o desenvol ­
vimento era, em muitos casos, designada por teratologia.
 
Efeito adverso:  qualquer alteração à normalidade relacionada com o 
tratamento que diminua a capacidade de um organismo para sobre ­
viver, reproduzir-se ou adaptar-se ao meio ambiente. No que respeita 
à toxicologia sobre o desenvolvimento, esta definição abrange, no seu sentido mais lato, todos os efeitos que interfiram no desenvol ­
vimento normal do concepto, antes e após o nascimento.
 
Alterações no crescimento:  alteração de peso ou tamanho do corpo 
ou de um órgão de um descendente.  
Alterações (anomalias):  alterações estruturais no desenvolvimento, 
que incluem as malformações e as variações (28).  
Malformação/Anomalia grave:  alteração estrutural considerada pre ­
judicial para o animal (pode também ser letal), cuja ocorrência é 
normalmente rara.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 457
 
Variação/Anomalia ligeira:  alteração estrutural pouco ou nada pre ­
judicial para o animal; pode ser transiente e ocorrer com relativa 
frequência na população de controlo.  
Concepto:  conjunto dos derivados de um óvulo fertilizado em qual ­
quer estádio de desenvolvimento, desde a fertilização até ao nasci ­
mento, incluindo as membranas extraembrionárias, bem como o em ­
brião ou o feto.  
Implantação (nidação):  ligação do blastocisto ao revestimento epi ­
telial do útero, incluindo a sua penetração através do epitélio uterino e a sua implantação no endométrio.
 
Embrião:  estádio inicial ou em desenvolvimento de qualquer orga ­
nismo; mais especificamente, é o produto da fertilização de um 
óvulo nas fases de desenvolvimento que decorrem desde o apareci ­
mento da corda dorsal até à formação de todas as estruturas princi ­
pais. 
Embriotoxicidade:  conjunto dos efeitos prejudiciais sobre a estru ­
tura, desenvolvimento, crescimento e/ou viabilidade normais de um embrião.
 
Feto:  organismo em gestação no período pós-embrionário.  
Toxicidade fetal:  conjunto dos efeitos prejudiciais sobre a estrutura, 
desenvolvimento, crescimento e/ou viabilidade normais de um feto.  
Aborto:  expulsão prematura do útero dos produtos da concepção: o 
embrião ou um feto inviável.  
Reabsorção:  reabsorção (presente ou passada) de um produto de 
concepção morto depois de implantado no útero.  
Reabsorção prematura:  sinais de implantação sem existência reco ­
nhecível de embrião/feto.  
Reabsorção tardia:  embrião ou feto morto, que apresentam 
alterações degenerativas externas.  
NSEAO:  abreviatura para nível sem efeito adverso observável; cor ­
responde à maior dose ou ao maior nível de exposição para o qual 
não se observam efeitos adversos relacionados com o tratamento.  
1.3. SUBSTÂNCIA DE REFERÊNCIA  
Nenhuma.  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Normalmente, a substância de ensaio é administrada aos animais 
prenhes desde o momento da implantação (pelo menos) até ao dia anterior ao previsto para o sacrifício. O dia do sacrifício deverá ser agendado o mais próximo possível da data esperada para o parto, 
sem que seja descurada a possibilidade de ocorrerem parto prematuro 
e a consequente perda de dados. O método de ensaio não se destina apenas a examinar o período da organogénese (por exemplo, dias 5- -15 em roedores e dias 6-18 no coelho); permite também avaliar 
efeitos de toxicidade desde a pré-implantação (se apropriado) e ao 
longo de todo o período de gestação até ao dia anterior à operação cesariana. As fêmeas são sacrificadas pouco antes da operação cesa ­
riana, após o que os conteúdos uterinos são examinados e os fetos 
inspeccionados para detectar a presença de anomalias externas visí ­
veis e alterações dos tecidos moles e do esqueleto.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 458
 
1.5. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.5.1.  Selecção de espécies animais  
Recomenda-se que o ensaio seja realizado com as espécies mais 
relevantes e que se utilizem as espécies e estirpes laboratoriais 
mais vulgarmente usadas em ensaios de toxicidade sobre o desen ­
volvimento pré-natal. As espécies preferidas para ensaio são o rato, no caso de roedores, e o coelho, no caso de não roedores. O uso de outras espécies deverá ser devidamente justificado.
 
1.5.2.  Condições de alojamento e alimentação  
A temperatura do compartimento experimental dos animais deve ser 
22 o C (+ 3  o C) para roedores e 18  o C (± 3  o C) para coelhos. A 
humidade relativa deverá ser 50 %-60 %, embora sejam aceitáveis valores entre um mínimo de 30 % e um máximo que, preferivelmen ­
te, não deverá exceder 70 %, salvo durante os períodos de limpeza 
do compartimento. A iluminação deve ser artificial, com sequências 
de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. A alimentação pode basear-se em dietas de laboratório convencionais, com fornecimento ilimitado de água para beber.
 
O acasalamento deve ocorrer em gaiolas adequadas para o efeito. 
Embora seja preferível alojar individualmente os animais durante o acasalamento, considera-se aceitável o alojamento conjunto de um pequeno número de animais.
 
1.5.3.  Preparação dos animais  
Devem usar-se animais saudáveis que tenham permanecido nas con ­
dições laboratoriais durante pelo menos cinco dias antes do ensaio 
para aclimatação e que não tenham sido sujeitos a experiências 
anteriores. Os animais de ensaio devem ser caracterizados no que respeita à espécie, estirpe, proveniência, sexo, peso e/ou idade. Os 
animais de todos os grupos de ensaio devem ser, tanto quanto pos ­
sível, uniformes quanto ao peso e à idade. Devem usar-se fêmeas jovens, adultas e nulíparas em todos os níveis de dose. As fêmeas devem acasalar com machos da mesma espécie e estirpe, devendo 
evitar-se o acasalamento entre irmãos. Em roedores, considera-se o 
dia 0 de gestação aquele em que se observa um rolhão vaginal e/ou esperma. Em coelhos, o dia 0 é normalmente o dia do coito ou da inseminação artificial, caso esta técnica seja usada. As gaiolas devem 
ser dispostas de forma a minimizar possíveis efeitos derivados do seu 
posicionamento. Cada animal deve receber um número de identifi ­
cação individualizado. As fêmeas acasaladas devem ser distribuídas pelos grupos de controlo e de tratamento de forma aleatória. Caso 
tenha havido alojamento conjunto de várias fêmeas durante o acasa ­
lamento, os animais de cada conjunto devem ser distribuídos unifor ­
memente pelos grupos de ensaio. Do mesmo modo, as fêmeas inse ­
minadas pelo mesmo macho devem ser distribuídas equitativamente 
pelos vários grupos.
 
1.6. PROCEDIMENTO  
1.6.1.  Número e sexo dos animais  
Cada grupo de ensaio e de controlo deve comportar um número de 
fêmeas suficiente para que se obtenham cerca de 20 animais com locais de implantação no momento da necropsia. Os grupos com menos de 16 animais com locais de implantação poderão ser consi ­
derados como inadequados. A mortalidade materna não invalida ne ­
cessariamente o estudo, desde que não seja superior a cerca de 10 %.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 459
 
1.6.2.  Preparação das doses  
Se for usado um agente de transporte ou outro aditivo para facilitar a 
administração das doses, deverão ser tomadas em consideração as seguintes características: efeitos na absorção, distribuição, metabo ­
lismo e retenção ou excreção da substância de ensaio; efeitos nas 
propriedades químicas da substância de ensaio susceptíveis de alterar as suas características tóxicas; e efeitos no consumo de alimentos, na ingestão de água ou no estado nutricional dos animais. O agente de 
transporte não deverá apresentar toxicidade sobre o desenvolvimento 
nem exercer efeitos na reprodução.
 
1.6.3.  Dosagem  
Normalmente, a substância de ensaio deverá ser administrada diaria ­
mente, desde a implantação (por exemplo, no dia cinco pós-acasala ­
mento) até ao dia anterior ao previsto para a operação cesariana. Se estudos anteriores eventualmente disponíveis não indicarem um ele ­
vado potencial para perdas pré-implantação, o tratamento poderá 
prolongar-se de forma a abranger todo o período de gestação, desde o acasalamento até ao dia anterior ao previsto para o sacrifício. É sabido que a manipulação imprópria ou a sujeição a tensões durante 
a gravidez podem resultar em perdas pré-natais, pelo que devem 
evitar-se manipulações desnecessárias dos animais prenhes e tensões de origem externa, tais como ruído, de forma a minimizar as perdas por factores não relacionados com o tratamento.
 
Devem utilizar-se pelo menos três níveis de dose e um controlo 
simultâneo. Os animais saudáveis devem ser distribuídos aleatoria ­
mente pelos grupos de controlo e de tratamento. Os níveis de dose devem ser espaçados de forma a produzir uma gradação de efeitos tóxicos. A escolha do nível de dose máximo deve ter como objectivo 
produzir alguma toxicidade sobre o desenvolvimento e/ou sobre a 
mãe (sinais clínicos ou diminuição do peso corporal), mas não a morte ou sofrimento agudo, salvo se existirem limitações impostas pela natureza físico-química ou pelas propriedades biológicas da 
substância de ensaio. Pelo menos um dos níveis de dose intermédios 
deverá produzir efeitos tóxicos mínimos observáveis. O nível de dose mais baixo não deverá induzir qualquer sinal de toxicidade sobre a mãe ou sobre o desenvolvimento. Deve seleccionar-se uma 
sequência descendente de níveis de dose que permita detectar qual ­
quer resposta relacionada com a dosagem e determinar o nível sem efeito adverso observável (NSEAO). Frequentemente, a melhor forma de estabelecer estas sequências consiste no espaçamento das 
doses em série geométrica, usando factores de dois ou de quatro. A 
adição de um quarto grupo de ensaio é muitas vezes preferível ao uso de intervalos muito grandes entre as dosagens (ou seja, com um factor superior a 10). Embora um dos objectivos do ensaio seja a 
determinação do NSEAO materno, podem considerar-se aceitáveis 
estudos que não permitam o cálculo deste valor (1).
 
A escolha dos níveis de dose deverá tomar em consideração todos os 
dados de toxicidade existentes, bem como informações adicionais sobre o metabolismo e toxicocinética da substância de ensaio ou 
de substâncias relacionadas. Estas informações poderão ser também 
usadas para demonstrar a adequação do regime de dosagem.
 
Deve usar-se um grupo de controlo simultâneo, que poderá ser um 
grupo com tratamento simulado ou, se for usado um agente de trans ­
porte para administrar a substância de ensaio, um grupo de controlo do agente de transporte. Todos os grupos devem ser tratados com o 
mesmo volume da substância de ensaio ou do agente de transporte. 
Os animais do(s) grupo(s) de controlo devem ser manipulados de forma idêntica aos animais dos grupos de ensaio. Os grupos de controlo do agente de transporte deverão receber o volume máximo 
de agente de transporte utilizado no ensaio (ou seja, um volume 
idêntico ao do grupo do nível de dose mais baixo).
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 460
 
1.6.4.  Ensaio-limite  
Se um ensaio com um nível de dose oral de pelo menos 1 000 mg/kg 
de peso corporal/dia, realizado de acordo com os procedimentos descritos neste estudo, não provocar toxicidade observável nos ani ­
mais prenhes nem na sua descendência e se, para além disso, os 
dados existentes sobre compostos estrutural e/ou metabolicamente relacionados com a substância de ensaio não sugerirem a possível ocorrência de efeitos, poderá considerar-se desnecessário realizar um 
ensaio completo com três níveis de dose. Nos casos em que se 
preveja exposição humana, poderá ser necessário aumentar o nível de dose oral no ensaio-limite. Quando se usam outras formas de 
administração, como inalação ou aplicação cutânea, as propriedades 
físico-químicas da substância de ensaio são muitas vezes indicativas e limitantes do nível máximo de exposição praticável (por exemplo, a aplicação cutânea não deverá causar toxicidade local grave).
 
1.6.5.  Administração das doses  
Na maior parte dos casos, a substância de ensaio ou o agente de 
transporte são administrados oralmente por intubação. Se for usada outra via de administração, o experimentador deverá indicar e justi ­
ficar as razões que presidiram à sua escolha; nesse caso, poderá ser 
necessário introduzir modificações apropriadas no método de ensaio 
(2)(3)(4). A substância de ensaio deve ser administrada todos os dias aproximadamente à mesma hora.
 
Normalmente, a dose a administrar a cada animal é calculada com 
base na determinação mais recente do seu peso corporal. No entanto, o ajuste das doses durante o último terço da gravidez deve ser feito 
com precaução. A escolha da dose deve tomar em consideração 
dados de estudos anteriores para evitar um excesso de toxicidade materna; contudo, se tal suceder, as mães com indícios de toxicidade excessiva devem ser sacrificadas. Se vários animais prenhes apresen ­
tarem sinais de excesso de toxicidade, deverá considerar-se a possi ­
bilidade de pôr termo ao grupo de dose a que pertencem. A adminis ­
tração por gavagem deve ser feita, de preferência, numa toma única, usando uma sonda gástrica ou uma cânula de intubação apropriada. 
O volume máximo de líquido que pode ser administrado numa toma 
depende do tamanho do animal de ensaio, não devendo exceder 1 ml/100 g de peso corporal; exceptuam-se as soluções aquosas, que podem ser administradas na proporção de 2 ml/100 g de peso 
corporal. Quando se usa óleo de milho como agente de transporte, o 
volume máximo aceitável é de 0,4 ml/100 g de peso corporal. Deve minimizar-se a variabilidade do volume de ensaio efectuando ajustes nas concentrações, de forma a assegurar a constância do volume em 
todos os níveis de dose.
 
1.6.6.  Observação das mães  
Devem efectuar-se observações clínicas pelo menos uma vez por dia, 
de preferência sempre à(s) mesma(s) hora(s). A escolha do momento da observação deve tomar em consideração o período de efeitos 
máximos previsto que se verifica após a administração da dose. Estas 
observações devem ser descritas num registo, que deverá conter indicações sobre a condição dos animais, incluindo mortalidade, es ­
tado moribundo, alterações pertinentes do comportamento e todos os 
sinais de manifesta toxicidade.
 
1.6.7.  Peso corporal e consumo de alimento  
Os animais devem ser pesados no dia 0 de gestação (se os animais 
acasalados forem fornecidos por um criador externo, a pesagem poderá ser feita até ao dia três de gestação, o mais tardar), no 
primeiro dia de dosagem, de três em três dias (pelo menos) durante 
o período de dosagem e no dia do sacrifício.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 461
 
Devem efectuar-se registos do consumo de alimento de três em três 
dias, coincidindo com dias da determinação do peso corporal.  
1.6.8.  Inspecção pós-morte  
As fêmeas devem ser sacrificadas no dia anterior ao previsto para o 
parto. As fêmeas que apresentem sinais de aborto ou parto prematuro 
antes da data marcada para o sacrifício deverão ser mortas antecipa ­
damente e submetidas a um exame macroscópico completo.  
No momento do sacrifício ou da morte durante o estudo, as mães 
serão objecto de um exame macroscópico, a fim de se detectarem quaisquer anomalias estruturais ou modificações patológicas. A ob ­
servação das mães durante a operação de cesariana e a subsequente 
análise fetal deverão ser feitas de preferência sem que os restantes animais do grupo se apercebam para evitar perturbações.
 
1.6.9.  Exame dos conteúdos uterinos  
Imediatamente após o sacrifício ou o mais cedo possível depois da 
morte espontânea, os úteros serão retirados para se averiguar o es ­
tado de gravidez dos animais. Os úteros que não se apresentem grávidos devem ser submetidos a exames adicionais (por exemplo, 
coloração com sulfureto de amónio em roedores e coloração de 
Salewsky ou um método alternativo apropriado em coelhos) para confirmar o estado de não gravidez (5).
 
Devem pesar-se os úteros grávidos, incluindo o colo. Não serão 
considerados para pesagem os úteros grávidos provenientes de ani ­
mais encontrados mortos durante o estudo.  
Deve determinar-se o número de corpos amarelos nos animais pre ­
nhes.  
Devem examinar-se os conteúdos uterinos para determinar os núme ­
ros de embriões ou de fetos mortos, bem como o número de fetos viáveis. Deve avaliar-se o grau de reabsorção, a fim de determinar o tempo relativo da morte do concepto (ver secção 1.2).
 
1.6.10.  Exame dos fetos  
Devem determinar-se o sexo e o peso corporal de cada feto.  
Cada feto será objecto de um exame para detectar alterações ex ­
ternas (6).  
Os fetos devem ser examinados para detectar alterações do esqueleto 
e dos tecidos moles (por exemplo, variações e malformações ou 
anomalias) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) 
(19) (20) (21) (22) (23) (24). É aconselhável (mas não obrigatório) proceder à categorização das alterações fetais, explicitando clara ­
mente os critérios usados para definir cada categoria. O aparelho 
reprodutor deve ser objecto de especial atenção, devendo ser ins ­
peccionado quanto a sinais de alterações no desenvolvimento.
 
No caso de roedores, devem preparar-se e examinar-se cerca de 
metade dos animais de cada ninhada para detecção de alterações do esqueleto; os restantes animais serão preparados e examinados para determinar alterações dos tecidos moles, usando métodos apro ­
vados de seccionamento em série ou técnicas adequadas de disseca ­
ção macroscópica cuidadosa.
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No caso de não roedores (por exemplo, o coelho), todos os fetos 
serão examinados para detectar alterações dos tecidos moles e do 
esqueleto. Os corpos serão preparados por dissecação cuidadosa e examinados quanto à existência de alterações dos tecidos moles; o exame pode incluir procedimentos adicionais para avaliação da es ­
trutura cardíaca interna (25). Metade dos fetos será decapitada e as 
cabeças removidas serão processadas para avaliação de alterações de tecidos moles (incluindo olhos, cérebro, meatos nasais e língua), usando métodos correntes de seccionamento em série (26) ou outros 
métodos de sensibilidade idêntica. Os corpos dos fetos decapitados e 
os restantes fetos intactos serão processados e examinados para se detectarem alterações do esqueleto, recorrendo a métodos idênticos aos descritos para roedores.
 
2. DADOS  
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS  
Os dados relativos às mães e aos seus descendentes devem ser 
registados individualmente e resumidos em forma tabular, indicando, para cada grupo de ensaio, o número de animais no início do ensaio, o número de animais encontrados mortos durante o ensaio ou sacri ­
ficados por razões humanitárias, o momento de todas as mortes 
(espontâneas ou provocadas), o número de fêmeas grávidas, o nú ­
mero de animais com sinais de toxicidade, uma descrição dos sinais de toxicidade observados (incluindo o momento do aparecimento, a 
duração e a intensidade), os tipos de observações embrionárias/fetais 
e todos os dados relevantes sobre as ninhadas.
 
Os resultados numéricos devem ser avaliados por um método esta ­
tístico apropriado, usando a ninhada como unidade para a análise de 
dados. Deve usar-se um método estatístico geralmente aceite; a sua escolha deve fazer parte do planeamento do estudo e ser devida ­
mente justificada. Devem também registar-se os dados relativos a 
animais que não sobreviveram até à data prevista para o sacrifício. 
Quando apropriado, estes dados poderão ser incluídos nas médias de grupos; contudo, a sua importância e, consequentemente, a sua in ­
clusão ou exclusão em qualquer média de grupo devem ser avaliadas 
e justificadas caso a caso.
 
2.2. ANÁLISE DOS RESULTADOS  
Os dados recolhidos no Estudo de Toxicidade sobre o Desenvolvi ­
mento Pré-Natal deverão ser analisados em termos dos efeitos ob ­
servados. Esta análise deverá considerar a seguinte informação:  
— resultados do ensaio relativos à mãe e ao embrião/feto, incluindo 
uma avaliação da relação (ou da ausência de relação) entre a exposição dos animais à substância de ensaio e a incidência e a gravidade de todos os efeitos observados;
 
— critérios usados para a categorização das alterações externas, dos 
tecidos moles e do esqueleto dos fetos, caso tenha sido feita;  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 463
 
— dados de controlo de estudos anteriores, quando apropriado, a 
fim de consolidar a interpretação dos resultados do presente es ­
tudo;  
— números usados no cálculo de todas as percentagens ou índices;  
— análise estatística adequada dos resultados do estudo, quando 
apropriado; deverá incluir informação suficiente sobre o método 
de análise para que um examinador/estatístico independente possa reavaliar e reconstituir a análise.
 
No caso de o estudo demonstrar a inexistência de qualquer efeito 
tóxico, deverá considerar-se a possibilidade de realizar investigações 
adicionais no sentido de definir a absorção e a biodisponibilidade da 
substância de ensaio.  
2.3. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS  
A finalidade do estudo de toxicidade sobre o desenvolvimento pré- 
-natal reside na obtenção de informações relativas aos efeitos de 
exposição repetida a uma substância durante a gravidez tanto nas mães como no desenvolvimento intra-uterino dos seus descendentes. A interpretação dos resultados deve tomar em consideração dados de 
estudos subcrónicos, de reprodução e toxicocinéticos, entre outros 
eventualmente disponíveis. O estudo enfatiza de igual modo a toxi ­
cidade geral, que pode ser avaliada pela toxicidade sobre a mãe, e a toxicidade sobre o desenvolvimento. Assim, os resultados obtidos 
vão permitir estabelecer, até certo ponto, a distinção entre i) os 
efeitos sobre o desenvolvimento não associados a toxicidade geral e ii) os efeitos sobre o desenvolvimento que apenas são induzidos em níveis que também são tóxicos para a mãe (27).
 
3. RELATÓRIO  
RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deverá incluir as seguintes informações espe ­
cíficas:  
Substância de ensaio:  
— natureza física e, quando relevante, propriedades físico-químicas;  
— identificação, incluindo o número CAS, caso este seja conhecido 
ou esteja definido;  
— pureza.  
Agente de transporte (se apropriado):  
— caso o agente de transporte não seja água, uma justificação para a 
sua escolha.  
Animais de ensaio:  
— espécie e estirpe usadas;  
— número e idade dos animais;  
— proveniência, condições de alojamento, dieta, etc.;  
— pesos individuais dos animais no início do ensaio.  
Condições de ensaio:  
— razões que presidiram à escolha dos diferentes níveis de dose;  
— informação pormenorizada sobre a formulação da substância de 
ensaio/preparação da dieta, concentração atingida, estabilidade e 
homogeneidade da preparação;  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 464
 
— informação pormenorizada sobre a administração da substância 
de ensaio;  
— conversão da concentração da substância de ensaio na dieta/água 
de beber (ppm) para a dose real (mg/kg de peso corporal/dia), se 
aplicável;  
— condições ambientais;  
— informação pormenorizada sobre a qualidade dos alimentos e da 
água.  
Resultados:  
Dados de resposta tóxica materna por dose, incluindo, entre outras 
informações:  
— número de animais no início do ensaio, número de animais so ­
breviventes, número de animais prenhes, número de animais que 
abortaram, número de animais com parto prematuro;  
— dia da morte no decurso do estudo ou indicação dos animais 
sobreviventes no termo da experiência;  
— os dados relativos a animais que não sobreviveram até à data 
prevista para o sacrifício devem ser incluídos no relatório, mas não devem ser usados em comparações estatísticas entre grupos;
 
— dia da observação de cada sinal de anomalia clínica e subse ­
quente evolução dessa anomalia;  
— peso corporal, alteração do peso corporal e peso do útero grávi ­
do; opcionalmente, alteração do peso corporal corrigida em rela ­
ção ao peso do útero grávido;  
— consumo de alimento e consumo de água (caso este tenha sido 
medido);  
— resultados da necropsia, incluindo o peso uterino;  
— deverão indicar-se os valores dos NSEAO para os efeitos mater ­
nos e para os efeitos sobre o desenvolvimento.  
Desenvolvimento atingido nas ninhadas com implantes em cada ní ­
vel de dose, incluindo:  
— número de corpos amarelos;  
— número de implantações, número e percentagem de fetos vivos e 
mortos e de reabsorções;  
— número e percentagem de perdas pré e pós-implantação.  
Desenvolvimento atingido nas ninhadas com fetos vivos em cada 
nível de dose, incluindo:  
— número e percentagem de descendentes vivos;  
— proporção entre os sexos;  
— peso corporal fetal, de preferência por sexo e nos dois sexos em 
conjunto;  
— malformações externas, dos tecidos moles e do esqueleto, bem 
como outras alterações relevantes;  
— critérios usados na categorização, se apropriado;  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 465
 
— número total e percentagem de fetos e ninhadas que apresentem 
qualquer alteração externa, dos tecidos moles ou do esqueleto, 
bem como os tipos e incidências de anomalias individuais e outras alterações relevantes.
 
Análise dos resultados.  
Conclusões.  
4. REFERÊNCIAS  
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(23) Wilson, J.G. and Fraser, F.C. (eds). (1977)  Handbook of Te ­
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(25) Staples, R.E. (1974) Detection of visceral Alterations in Mam ­
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Chicago, IL, p. 126-144.
 
(27) US Environmental Protection Agency (1991) Guidelines for 
Developmental Toxicity Risk Assessment.  Federal Register , 
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(28) Wise, D.L. et al. (1997) Terminology of Developmental Ab ­
normalities in Common Laboratory Mammals (Version 1) Te ­
ratology, 55, p. 249-292.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 467
 
B.32  ESTUDOS DE CARCINOGENICIDADE  
INTRODUÇÃO  
1. Este método é equivalente ao  Test Guideline  451 (2009) da OCDE. O  Test 
Guideline  451 (TG 451) inicial relativo aos estudos de carcinogenicidade foi 
adotado em 1981. Entendeu-se necessário rever o método B.32 para dar 
conta da evolução recente no domínio do bem-estar animal e da regulamen ­
tação (2)(3)(4)(5)(6). A atualização do método B.32 decorreu paralelamente à revisão dos capítulos B.30 ("Estudos de toxicidade crónica") e B.33 ("Es ­
tudos combinados de toxicidade crónica e carcinogenicidade") deste anexo. 
Visa-se obter mais dados a partir dos animais utilizados nos estudos e dispor 
de mais elementos para a escolha das doses. O método B.32 foi concebido para o ensaio de uma vasta gama de produtos químicos, nomeadamente pesticidas e produtos químicos industriais. Alguns aspetos e requisitos po ­
dem, porém, ser diferentes no caso dos produtos farmacêuticos (ver o do ­
cumento de orientações " Guidance S1B on Testing for Carcinogenicity of 
Pharmaceuticals ", publicado pela Conferência Internacional de Harmoniza ­
ção).
 
2. Na sua maioria, os estudos de carcinogenicidade são efetuados em roedores. 
Este método destina-se, portanto, a ser aplicado, preferencialmente, a estu ­
dos em espécies de roedores. Caso seja necessário efetuar estudos noutras 
espécies, devem aplicar-se os princípios e procedimentos descritos neste método e no capítulo B.27 deste anexo — "Estudo de toxicidade oral de dose repetida em espécies não roedoras com a duração de 90 dias" (6) —, 
com as adaptações necessárias. Para mais orientações, consultar o docu ­
mento de orientações n.
 o 116 da OCDE, relativo à conceção e realização 
de estudos de toxicidade crónica e de carcinogenicidade (7).  
3. As três vias principais de administração nos estudos de carcinogenicidade 
são a via oral, a via dérmica e a via inalatória. A via de administração escolhida depende das características físico-químicas do produto químico em estudo e da via predominante de exposição humana. O documento de orien ­
tações n.
 o 116 (7) contém mais informações sobre a escolha da via de 
exposição.  
4. Este método centra-se na exposição por via oral, que é a via habitualmente 
mais utilizada nos estudos de carcinogenicidade. Embora possa também ser necessário efetuar estudos de carcinogenicidade por via dérmica ou por inalação para avaliar o risco para a saúde humana e/ou isso possa mesmo 
ser exigido pela regulamentação aplicável, estas duas vias de exposição são 
bastante complexas do ponto de vista técnico e esses estudos têm de ser concebidos para cada caso concreto. Porém, no que diz respeito às reco ­
mendações relativas aos períodos de exposição, aos parâmetros clínicos e 
patológicos e a outros aspetos, o método aqui descrito para caracterização e 
avaliação da carcinogenicidade por administração oral pode constituir a base de um protocolo para estudos por inalação e/ou por via dérmica. A OCDE publicou orientações relativas ao estudo da administração de produtos quí ­
micos por via dérmica (7) e por inalação (7)(8). Para a conceção de estudos 
a longo prazo com exposição por via inalatória, recomenda-se especifica ­
mente a consulta dos capítulos B.8 (9) e B.29 (10) deste anexo e do documento de orientações da OCDE relativo a ensaios de toxicidade aguda 
por inalação (8). No caso dos ensaios por via dérmica, deve consultar-se o 
capítulo B.9 (11) deste anexo.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 468
 
5. Os estudos de carcinogenicidade fornecem informações sobre os perigos 
para a saúde que podem potencialmente advir da exposição repetida durante 
um período que pode abranger todo o tempo de vida da espécie utilizada. Estes estudos fornecem informações sobre os efeitos tóxicos do produto químico em causa, incluindo o potencial de carcinogénese, podendo indicar 
os órgãos afetados e a possibilidade de acumulação. Podem igualmente 
servir para obter estimativas do nível sem observação de efeitos adversos ("no observed adverse effect level ", NOAEL) para efeitos tóxicos e, no caso 
dos produtos cancerígenos não genotóxicos, para respostas tumorais, com 
base nas quais se podem estabelecer critérios de segurança para a exposição 
humana. Salienta-se a necessidade de um exame clínico cuidadoso dos animais, de modo a obter-se o máximo de informação possível.
 
6. Entre os objetivos dos estudos de carcinogenicidade efetuados por este 
método contam-se os seguintes:  
— identificação das propriedades cancerígenas do produto químico em es ­
tudo suscetíveis de aumentar a incidência de neoplasias ou a proporção 
de neoplasias malignas, ou de reduzir o tempo que as neoplasias demo ­
ram a surgir, comparativamente aos grupos de controlo em paralelo,  
— identificação do órgão ou órgãos afetados pela carcinogénese,  
— identificação do tempo que as neoplasias demoram a surgir,  
— caracterização de relações entre a dose administrada e a resposta tumo ­
ral, 
— determinação de níveis sem observação de efeitos adversos (NOAEL) ou 
ponto de partida para o estabelecimento de doses de referência,  
— extrapolação de efeitos cancerígenos para doses baixas de exposição 
humana,  
— obtenção de dados para verificação de hipóteses relativas a modos de 
ação (2)(7)(12)(13)(14)(15).  
CONSIDERAÇÕES INICIAIS  
7. Antes de efetuar um estudo com vista à caracterização e avaliação da 
carcinogenicidade potencial de um produto químico, o laboratório que efe ­
tuará os ensaios deve ponderar todas as informações disponíveis sobre o produto químico em causa, a fim de adaptar o estudo de modo a melhorar a 
eficiência da determinação do potencial cancerígeno e para minimizar o 
recurso a animais. É especialmente importante conhecer e ter em conta o modo de ação do agente cancerígeno suspeito (2)(7)(12)(13)(14)(15), dado que a conceção ótima do estudo pode ser diferente consoante o produto 
químico em causa seja ou não um agente cancerígeno/genotóxico reconhe ­
cido ou se suspeite ou não de que o possa ser. Para mais orientações sobre o modo de ação, consultar o documento de orientações n.
 o 116 (9).  
8. Entre os elementos que podem ser úteis na conceção do estudo contam-se a 
identidade, a estrutura química e as propriedades físico-químicas do produto químico em causa, resultados de ensaios de toxicidade (incluindo de geno ­
toxicidade)  in vitro  ou in vivo , as utilizações previstas, o potencial de 
exposição humana, dados (Q)SAR — " (quantitative) structure-activity rela ­
tionships ", relações (quantitativas) estrutura/atividade — e dados de muta ­
genicidade/genotoxicidade, carcinogenicidade e outros dados toxicológicos 
disponíveis sobre produtos químicos estruturalmente afins, dados toxicoci ­
néticos disponíveis (dados cinéticos associados a uma dose única ou a doses
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múltiplas) e dados provenientes de outros estudos com exposição repetida. 
Só deve proceder-se à determinação da carcinogenicidade depois de obtidos 
dados de toxicidade preliminares provenientes de estudos de toxicidade com repetição da dose administrada durante 28 e/ou 90 dias. Os ensaios a curto prazo da promoção do desencadeamento de cancros também podem fornecer 
informações úteis. Deve ponderar-se uma abordagem faseada dos ensaios de 
carcinogenicidade no âmbito da avaliação global dos potenciais efeitos ad ­
versos na saúde do produto químico em estudo (16)(17)(18)(19).
 
9. Antes de iniciar o estudo, devem ser escolhidos, com base no plano expe ­
rimental e nos objetivos estabelecidos, os métodos estatísticos mais adequa ­
dos para a análise dos resultados. Entre outros aspetos a considerar, é 
necessário determinar se o tratamento estatístico deverá contemplar ajusta ­
mentos em função do grau de sobrevivência, a análise do risco tumoral acumulado em função do tempo de sobrevivência e a análise do tempo que os tumores demorar a surgir, bem como que tipo de análise deve 
efetuar-se no caso da morte prematura de todos os animais de um ou 
mais grupos. Para orientações sobre as análises estatísticas mais adequadas e informação sobre as referências bibliográficas fundamentais dos métodos estatísticos internacionalmente reconhecidos, deve consultar-se o documento 
de orientações n.
 o 116 (7), assim como o documento de orientações n.  o 35, 
relativo à análise e avaliação de estudos de toxicidade crónica e de carci ­
nogenicidade (20).  
10. Ao realizar um estudo de carcinogenicidade, recomenda-se que sejam sem ­
pre seguidos os princípios e considerações orientadores enunciados no  Gui­
dance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as 
humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation  
(n. o 19) da OCDE (21), nomeadamente os expressos no ponto 62 do mes ­
mo, cuja tradução é a seguinte:  "Nos estudos com repetição da dose admi ­
nistrada, se um animal evidenciar sinais clínicos progressivos da deterio ­
ração do seu estado, deve tomar-se uma decisão com conhecimento de 
causa sobre se deve ou não ser eutanasiado. Para isso, deve ponderar-se, nomeadamente, o valor das informações que seriam obtidas 
no caso de o animal continuar integrado no estudo, relativamente ao estado 
geral do mesmo. Caso se decida manter o animal no estudo, deve aumentar-se, tanto quanto necessário, a frequência dos exames que lhe são efetuados. Também é possível, sem prejudicar a finalidade do ensaio, 
suspender temporariamente a administração do produto químico em estudo 
– se isso reduzir a dor ou sofrimento do animal – ou reduzir a dose administrada".
 
11. Para orientações pormenorizadas sobre os princípios aplicáveis à escolha das 
doses para estudos de toxicidade crónica e de carcinogenicidade e uma discussão dos mesmos, recomenda-se a consulta do documento de orienta ­
ções n.
 o 116 (7) e das publicações com as referências 22 e 23 do  Interna­
tional Life Sciences Institute . A estratégia de base para escolha das doses 
depende do objetivo ou objetivos principais do estudo (ver o ponto 6). Para escolher doses adequadas, importa estabelecer um equilíbrio entre, por um 
lado, a identificação dos perigos em jogo e, por outro, a caracterização e 
importância das respostas às doses reduzidas. Este equilíbrio é especialmente necessário quando se realizam estudos combinados de toxicidade crónica e de carcinogenicidade (capítulo B.33 deste anexo) — ver o ponto 12.
 
12. Deve ponderar-se a oportunidade de efetuar um estudo combinado de toxi ­
cidade crónica e de carcinogenicidade (capítulo B.33 deste anexo), em vez 
de efetuar separadamente um estudo de toxicidade crónica (capítulo B.30 
deste anexo) e um estudo de carcinogenicidade (o presente método B.32). O estudo combinado é mais favorável, em termos de tempo e de custos, do que dois estudos distintos e não prejudica a qualidade dos dados obtidos na 
etapa de toxicidade crónica nem na etapa de carcinogenicidade. Ao efetuar 
um estudo combinado de toxicidade crónica e de carcinogenicidade (capí ­
tulo B.33 deste anexo), é, porém, necessário prestar especial atenção aos princípios relativos à escolha das doses (pontos 11 e 22 a 25). 
Reconhece-se, porém, que determinadas regulamentações podem exigir a 
realização de estudos separados.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 470
 
13. No final do capítulo e no documento de orientações n.  o 116 (7) definem-se 
alguns conceitos utilizados neste método.  
PRINCÍPIO DO MÉTODO  
14. Administra-se diariamente, normalmente por via oral, o produto químico em 
estudo a vários grupos de animais, em doses crescentes de grupo para grupo, 
durante grande parte do tempo de vida dos animais. A via inalatória ou a via dérmica também podem ser adequadas. Verifica-se atentamente se os ani ­
mais evidenciam sinais de toxicidade ou se neles estão a desenvolver-se 
lesões neoplásicas. Autopsia-se os animais que morrem ou são eutanasiados 
durante os ensaios. No final dos ensaios, eutanasia-se e autopsia-se os animais sobreviventes.
 
DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
Escolha da espécie animal  
15. Este método trata, em especial, da caracterização e avaliação da carcinoge ­
nicidade em roedores (ver o ponto 2). Pode ponderar-se o recurso a outras espécies se os dados disponíveis indicarem que as espécies em causa per ­
mitem prever melhor os efeitos na saúde humana. É necessário justificar a 
escolha da espécie. Embora possa recorrer-se a outras espécies de roedores, como o ratinho, a espécie preferida é o rato. Se bem que os estudos de carcinogenicidade no ratinho possam ser de pouca utilidade (24)(25)(26), 
alguns programas obrigatórios continuam a exigir ensaios de carcinogenici ­
dade nessa espécie, a menos que se demonstre que, do ponto de vista científico, este estudo não é necessário. O rato e o ratinho constituem os modelos experimentais preferidos devido à sua longevidade relativamente 
reduzida, à sua utilização generalizada em estudos farmacológicos e toxico ­
lógicos, à sua sensibilidade à indução de tumores e à disponibilidade de estirpes suficientemente caracterizadas destas espécies. Em consequência disto, dispõe-se de numerosos dados sobre a fisiologia e patologia destes 
animais. O documento de orientações n.
 o 116 (7) contém mais informações 
sobre a escolha da espécie e da estirpe.  
16. Devem ser utilizados animais adultos, jovens e saudáveis de estirpes labo ­
ratoriais correntes. De preferência, o estudo de carcinogenicidade deve ser 
realizado com animais da mesma estirpe e proveniência que os utilizados no 
estudo ou estudos preliminares mais curtos. Todavia, se os animais da estirpe e proveniência em questão não corresponderem reconhecidamente aos critérios normalmente aceites de sobrevivência em estudos de longo 
prazo — ver o documento de orientações n.
 o 116 (7) —, deve 
ponderar-se a utilização de uma estirpe animal cuja taxa de sobrevivência no estudo a longo prazo seja aceitável. As fêmeas utilizadas devem ser nulíparas e não podem estar grávidas.
 
Condições de alojamento e de alimentação  
17. Os animais podem ser alojados individualmente ou em pequenos grupos do 
mesmo sexo. É necessário justificar cientificamente a opção pelo alojamento 
individual (27)(28)(29). As gaiolas devem ser dispostas de forma a minimi ­
zar possíveis efeitos derivados do seu posicionamento. A temperatura do biotério deve ser de 22 °C ± 3 °C. A humidade relativa deve estar com ­
preendida entre 50 % e 60 %, embora sejam aceitáveis valores compreen ­
didos entre 30 %, no mínimo, e um valor máximo que, preferencialmente, não deve exceder 70 %, salvo durante os períodos de limpeza do biotério. A iluminação deve ser artificial, com uma sequência de 12 horas de luz se ­
guidas de 12 horas de escuridão. Na alimentação, podem utilizar-se dietas 
convencionais de laboratório e deve ser fornecida água de beber sem res ­
trições. A dieta deve satisfazer as necessidades nutricionais da espécie es ­
tudada. Os teores de contaminantes da dieta — resíduos de pesticidas, 
poluentes orgânicos persistentes, fitoestrogénios, metais pesados, micotoxi ­
nas e outros – podem influenciar os resultados dos ensaios e devem ser os
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mais baixos possíveis. É necessário obter periodicamente dados analíticos 
relativos aos teores de nutrientes e de contaminantes da dieta, pelo menos no 
início do estudo e quando se muda de lote. Estes dados devem constar do relatório final. É igualmente necessário dispor de dados analíticos da água de beber utilizada no estudo. Quando o produto químico em estudo é 
administrado por via alimentar, a escolha da dieta pode ser influenciada 
pela necessidade de nela misturar convenientemente esse produto químico e de satisfazer simultaneamente as exigências nutricionais dos animais.
 
Preparação dos animais  
18. Os animais utilizados devem ser saudáveis e ter sido aclimatados às condi ­
ções laboratoriais durante, pelo menos, sete dias e não devem ter participado em experiências anteriores. No caso dos roedores, a administração do pro ­
duto químico em estudo deve iniciar-se logo que possível após o desmame e 
a aclimatação, de preferência antes de os animais completarem oito semanas. 
É necessário caracterizar a espécie, a estirpe, a proveniência, o sexo, o peso e a idade dos animais utilizados no estudo. No início do estudo, as diferen ­
ças de peso entre os animais de cada sexo devem ser mínimas, não se 
desviando mais de 20 % do peso médio de todos os animais de cada 
sexo nele utilizados. Distribuem-se aleatoriamente os animais pelos grupos de controlo e pelos grupos expostos. Depois da distribuição aleatória dos animais, a média de peso corporal não deve diferir significativamente de 
grupo para grupo de animais do mesmo sexo. Se houver diferenças com 
significado estatístico, os animais devem, se possível, ser redistribuídos aleatoriamente. Deve atribuir-se a cada animal um número de identificação único, com o qual o animal seja identificado por tatuagem, implantação de  
microchip  ou outro método adequado.
 
PROCEDIMENTO  
Número e sexo dos animais  
19. Devem ser utilizados animais de ambos os sexos. O número de animais 
utilizados deve ser suficiente para uma avaliação biológica e estatística 
aprofundada. Cada grupo de dose e cada grupo de controlo em paralelo 
não deve, portanto, ter menos de 50 animais de cada sexo. Consoante a finalidade do estudo, poderá aumentar-se a representatividade estatística das principais estimativas distribuindo desigualmente os animais pelos vários 
grupos de dosagem, constituindo grupos com mais de 50 animais para as 
doses mais baixas, por exemplo, para estimar o potencial cancerígeno a doses baixas. Todavia, importa ter presente que um aumento ligeiro do tamanho dos grupos aumenta relativamente pouco a representatividade es ­
tatística do estudo. O documento de orientações n.
 o 116 (7) contém mais 
informações sobre a conceção estatística do estudo e a escolha das doses para maximizar a representatividade estatística.
 
Eutanásias intercalares e grupos satélites (sentinelas)  
20. Caso se justifique do ponto de vista científico, pode prever-se a realização 
de eutanásias intercalares, por exemplo, ao fim de doze meses, para obter informações sobre a evolução das alterações neoplásicas, bem como dados mecanísticos. Caso já se disponha desses dados, obtidos em estudos de 
toxicidade por dose repetida realizados com o produto químico em causa, 
as eutanásias em questão podem não se justificar cientificamente. Caso esteja prevista no estudo a realização de eutanásias intercalares, o número de animais a utilizar com essa finalidade em cada grupo de dose é normal ­
mente de dez de cada sexo. Nesse caso, o número total de animais utilizado 
no estudo deve ser aumentado no número de animais a eutanasiar antes da conclusão do mesmo. Pode prever-se um grupo de animais sentinelas (ha ­
bitualmente cinco animais de cada sexo) para verificar, se necessário, o 
aparecimento de doenças durante o estudo (30). Para mais informações, 
consultar o documento de orientações n.
 o 116 (7).  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 472
 
Grupos de dose e dosagens  
21. O documento de orientações n.  o 116 (7) contém orientações relativas a todos 
os aspetos relacionados com a escolha das doses e os intervalos entre estas. Devem ser utilizados pelo menos três doses e um controlo em paralelo. As 
doses baseiam-se, normalmente, nos resultados de estudos exploratórios das 
doses ou de estudos de dose repetida por períodos mais curtos e devem atender aos dados toxicológicos e toxicocinéticos disponíveis sobre o pro ­
duto químico em estudo ou produtos químicos afins.
 
22. A menos que tal dose esteja limitada pelas características físico-químicas ou 
pelos efeitos biológicos do produto químico em estudo, deve escolher-se 
para dose mais elevada o nível que permita identificar os principais órgãos afetados e os efeitos tóxicos principais sem causar sofrimento, efeitos tóxi ­
cos intensos, morbidez nem mortalidade. Tendo presente o referido no 
ponto 23, normalmente escolhe-se para dose mais elevada uma dose que 
induza efeitos tóxicos, evidenciados, por exemplo, por uma redução (apro ­
ximadamente de 10 %) do ganho de peso corporal. Todavia, consoante os objetivos do estudo (ver o ponto 6), pode escolher-se uma dose máxima 
inferior à que evidencia efeitos tóxicos, por exemplo, se essa dose induzir 
um efeito adverso preocupante, mas com pouca influência na longevidade ou no peso corporal dos animais.
 
23. Podem ser escolhidos doses e intervalos entre doses que permitam estabe ­
lecer uma relação dose-resposta e, consoante o modo de ação do produto 
químico em estudo, determinar um NOAEL ou outro resultado pretendido 
do estudo, por exemplo, uma dose de referência (ver o ponto 25) ao nível de dose mais baixo. Entre os fatores a ter em conta na escolha das doses mais baixas, contam-se o declive esperado da curva dose-resposta, as doses às 
quais podem ocorrer alterações importantes ao nível metabólico ou do modo 
da ação tóxica, o nível ao qual se prevê a ocorrência de um limiar e o nível ao qual se prevê fixar o ponto de partida de extrapolações para doses mais baixas.
 
24. O intervalo entre as doses depende das características do produto químico 
em estudo e não pode ser prescrito neste método. Contudo, a utilização de 
intervalos definidos por um fator de 2 a 4 entre doses consecutivas dá frequentemente bons resultados nestes ensaios, sendo muitas vezes melhor ensaiar um quarto grupo do que recorrer a intervalos muito grandes (por 
exemplo, mais do que um fator de 6 a 10) entre as dosagens. Em geral, são 
de evitar fatores superiores a 10. Caso contrário, é necessário justificá-los.
 
25. Conforme se explica mais em pormenor no documento de orientações 
n. o 116 (7), entre os aspetos a ter em conta na escolha das doses 
contam-se os seguintes:  
— relações não lineares ou pontos de inflexão conhecidos ou de que se 
suspeite na curva dose-resposta,  
— aspetos toxicocinéticos e doses às quais ocorra, ou não ocorra, indução 
metabólica, saturação ou não linearidade entre as doses externas e as doses internas,
 
— lesões precursoras, marcadores de efeitos ou indicadores de processos 
biológicos fundamentais subjacentes em curso,  
— aspetos fundamentais (ou de que se suspeite) do modo de ação, tais 
como as doses às quais começam a manifestar-se efeitos citotóxicos, 
os níveis hormonais são perturbados, os mecanismos homeostáticos co ­
lapsam, etc.,  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 473
 
— regiões da curva dose-resposta que necessitam de estimativas especial ­
mente rigorosas, por exemplo, perto da dose de referência prevista ou da 
dose à qual se suspeite corresponder um limiar,  
— níveis previstos de exposição humana.  
26. O grupo de controlo deve ser um grupo não exposto ao produto químico em 
estudo ou, se for usado um veículo para administrar o produto químico, um 
grupo de controlo do veículo. Salvo no que respeita à exposição ao produto químico em estudo, os animais do grupo de controlo devem ser tratados do mesmo modo que os animais dos grupos ensaiados. Caso se utilize um 
veículo, o grupo de controlo deve receber o volume máximo de veículo 
utilizado nos grupos expostos ao produto químico em estudo. Se o produto químico for administrado por via da dieta e reduzir significativamente a quantidade desta ingerida por lhe conferir menor palatabilidade, um grupo 
de controlo adicional alimentado do mesmo modo, em paralelo, pode cons ­
tituir um grupo de controlo mais adaptado.
 
Preparação das doses e administração do produto químico em estudo  
27. O produto químico em estudo é normalmente administrado por via oral, 
através da dieta ou da água de beber ou por intermédio de uma sonda 
esofágica. O documento de orientações n.  o 116 (7) contém mais informações 
sobre vias e métodos de administração. A via e o método de administração dependem do objetivo do estudo, bem como das propriedades físico-quími ­
cas e biodisponibilidade do produto químico em causa e da via e do método 
de exposição humana predominantes. É necessário fundamentar a via e o método de administração escolhidos. Por razões de bem-estar animal, nor ­
malmente só deve optar-se pela utilização de uma sonda esofágica no caso 
dos agentes relativamente aos quais a via oral e este método de adminis ­
tração representem razoavelmente a exposição humana potencial (por exem ­
plo, através da ingestão de produtos farmacêuticos). No caso dos produtos químicos ingeridos com os alimentos ou disseminados no ambiente, nomea ­
damente pesticidas, a administração habitual é por incorporação na dieta ou 
na água de beber. Todavia, para outros cenários — caso da exposição profissional —, pode justificar-se a administração por outras vias.
 
28. Se necessário, pode suspender-se ou dissolver-se o produto químico em 
estudo num veículo apropriado. Devem ser tidos em conta as seguintes 
características que se justifiquem do veículo e de outros aditivos: efeitos 
na absorção, na distribuição, no metabolismo ou na retenção do produto químico em causa, efeitos nas propriedades químicas do produto químico em estudo suscetíveis de alterarem as características tóxicas do mesmo e 
efeitos no consumo de alimentos, na ingestão de água ou no estado nutri ­
cional dos animais. Recomenda-se que, sempre que possível, a primeira opção seja uma solução ou suspensão aquosa; caso tal não seja viável, pode optar-se por uma solução ou emulsão num óleo (por exemplo, em 
óleo de milho); em último caso, poderá recorrer-se a uma solução noutro 
veículo. Se o veículo utilizado não for água, é necessário conhecer as suas características de toxicidade. Deve dispor-se de informações sobre a estabi ­
lidade do produto químico em estudo e a homogeneidade das soluções ou 
rações de dosagem (consoante o caso) nas condições de administração (por 
exemplo, por via da dieta).
 
29. É importante assegurar que a quantidade de um produto químico em estudo 
administrada através da dieta ou da água de beber não interfere nas exigên ­
cias normais de nutrição nem no equilíbrio hídrico. No caso dos estudos de toxicidade a longo prazo nos quais o produto químico seja administrado pela 
via alimentar, a concentração deste nos alimentos não deve, normalmente, 
exceder 5 % da ração total, a fim de evitar desequilíbrios nutricionais. Se o produto químico em estudo for administrado por via da dieta, pode optar-se por concentrações constantes nesta (mg/kg de alimentos ou ppm) ou por 
doses constantes em relação ao peso corporal do animal (mg/kg de peso 
corporal), calculadas semanalmente. Deve indicar-se a opção tomada.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 474
 
30. Em caso de administração por via oral, os animais recebem uma dose 
quotidiana (sete dias por semana) do produto químico em estudo, no caso 
dos roedores normalmente durante 24 meses (ver também o ponto 32), É necessário justificar qualquer outro regime de dosagem (por exemplo, cinco dias por semana). Em caso de administração por via dérmica, os animais são 
normalmente expostos ao produto químico em estudo durante, pelo menos, 
seis horas por dia, sete dias por semana, conforme se descreve no capítulo B.9 (11) deste anexo, ao longo de 24 meses. A exposição por via inalatória é efetuada durante seis horas por dia, sete dias por semana. 
Todavia, caso se justifique, também podem expor-se os animais durante ­
cinco dias por semana. O período de exposição neste caso é normalmente de 24 meses. Se espécies que não o rato forem sujeitas a exposição unicamente nasal, pode ajustar-se a duração máxima da exposição para minimizar a 
tensão gerada na espécie em causa. Se a duração da exposição for inferior 
a seis horas por dia, é necessário fundamentá-lo. Ver também o capítulo B.8 (9) deste anexo.
 
31. A administração do produto químico aos animais por meio de uma sonda 
esofágica deve efetuar-se à mesma hora do dia por meio de um tubo esto ­
macal ou de uma cânula de intubação adequada. Normalmente, administra-se a dose diária de uma só vez. Porém, se o produto químico 
for, por exemplo, um irritante local, pode repartir-se a mesma dose diária 
por dois momentos. O volume máximo de líquido que pode ser adminis ­
trado de cada vez depende do tamanho do animal e deve ser o mínimo possível. No caso dos roedores, normalmente não deve exceder 1 ml/100 g 
de peso corporal (31). Para minimizar diferenças entre volumes administra ­
dos, Devem ser efetuados ajustes nas concentrações, de forma que o volume seja o mesmo para todas as doses. Excetuam-se os produtos químicos po ­
tencialmente corrosivos ou irritantes, que têm de ser diluídos para evitar 
efeitos locais intensos. Devem evitar-se concentrações que possam provocar 
efeitos corrosivos ou irritantes no tubo digestivo.
 
Duração do estudo  
32. No caso dos roedores, normalmente a duração do estudo é de 24 meses, o 
que representa grande parte do tempo de vida dos animais utilizados. Con ­
soante o tempo de vida dos animais da estirpe de espécie utilizada no 
estudo, este pode ser mais curto ou mais longo, mas é necessário justifi ­
cá-lo. No caso de determinadas estirpes de ratinhos (por exemplo, AKR/J, C3H/J ou C57BL/6J), pode ser adequada uma duração do estudo de 18 meses. Seguem-se algumas orientações sobre a duração do estudo, o termo 
deste e a sobrevivência. Para mais orientações, nomeadamente no que res ­
peita aos critérios para considerar a carcinogenicidade negativa com base na sobrevivência dos animais estudados, consultar o documento de orientações 
n.
 o 116 da OCDE, relativo à conceção e realização de estudos de toxicidade 
crónica e de carcinogenicidade (7).  
— deve ponderar-se pôr termo ao estudo quando o número de sobreviven ­
tes do grupo exposto à dose mais baixa ou do grupo de controlo descer 
abaixo de 25 %,  
— se apenas morrerem prematuramente devido a efeitos tóxicos animais do 
grupo exposto à dose mais elevada, não deve pôr-se termo ao estudo,  
— a sobrevivência dos animais deve ser examinada separadamente para 
cada sexo,  
— o estudo não deve prolongar-se além do estádio em que os dados dele 
extraíveis deixam de ser suficientes para validar uma avaliação estatís ­
tica. ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 475
 
EXAMES  
33. Normalmente no início e no final de cada dia, incluindo fins de semana e 
feriados, devem verificar-se os casos de morbidez ou mortalidade no con ­
junto dos animais. Verifica-se igualmente, uma vez por dia, se os animais 
têm sinais com importância toxicológica, tendo em conta, no caso da ad ­
ministração por sonda esofágica, o período previsto de efeitos mais acen ­
tuados após a administração do produto químico. Deve prestar-se especial atenção ao desenvolvimento de tumores, registando-se o tempo decorrido até 
ao aparecimento destes e o local, as dimensões, o aspeto e a progressão de 
cada tumor visível na observação macroscópica ou identificável por palpa ­
ção.
 
Peso corporal, consumo de alimentos e de água, eficiência alimentar  
34. Todos os animais devem ser pesados no início da exposição, pelo menos 
uma vez por semana nas primeiras treze semanas e, a partir daí, pelo menos 
uma vez por mês. Deve medir-se o consumo de alimentos e a eficiência 
alimentar pelo menos uma vez por semana nas primeiras treze semanas e, a partir daí, pelo menos uma vez por mês. Se o produto químico em estudo for administrado através da água de beber, deve medir-se o consumo de 
água pelo menos uma vez por semana nas primeiras treze semanas e, a partir 
daí, pelo menos uma vez por mês. Pode ser útil medir o consumo de água também no caso dos estudos em que se verifiquem alterações do compor ­
tamento dos animais a esse nível.
 
Análises hematológicas e de bioquímica clínica e outras determinações  
35. A fim de extrair um máximo de informações do estudo, sobretudo no que 
respeita ao modo de ação, fica ao critério do diretor do estudo proceder à 
colheita de amostras de sangue para análises hematológicas e de bioquímica clínica. Pode também ser útil efetuar análises de urina. Para mais orientações sobre o interesse da colheita dessas amostras num estudo de carcinogenici ­
dade, consultar o documento de orientações n.
 o 116 (7). Se forem conside ­
radas úteis, pode proceder-se à colheita de amostras de sangue para análises hematológicas e de bioquímica clínica, bem como de amostras de urina para as análises respetivas, quando das eutanásias intercalares (ver o ponto 20) e 
a, pelo menos, dez animais de cada sexo, por grupo, no termo do estudo. As 
amostras de sangue devem ser colhidas, sob anestesia, num ponto determinado a indicar, por exemplo, por punção cardíaca ou no seio retro-orbital. Se for necessário conservá-las, devem sê-lo em condições 
adequadas. Podem igualmente preparar-se esfregaços de sangue para exame, 
em especial se o órgão afetado for a medula óssea. Todavia, tem sido questionada (32) a utilidade deste exame para a avaliação do potencial cancerígeno/oncogénico.
 
PATOLOGIA  
Autópsia macroscópica  
36. Deve ser realizada a todos os animais estudados — exceto os animais 
sentinelas (ver o ponto 20) e outros animais satélites — uma autópsia macroscópica completa e pormenorizada através do exame cuidadoso da 
superfície exterior do corpo, dos orifícios, das cavidades craniana, torácica 
e abdominal e do conteúdo de cada uma destas. Fica ao critério do diretor do estudo decidir em que casos é necessário autopsiar animais sentinelas ou outros animais satélites. A pesagem de órgãos normalmente não faz parte 
dos estudos de carcinogénese, dado que as alterações geriátricas e o desen ­
volvimento de tumores em fases avançadas diminuem a utilidade dessas pesagens. Todavia, estas pesagens podem ter muita importância nas avalia ­
ções baseadas na suficiência da prova, sobretudo no que respeita ao modo 
de ação. Se fizerem parte de estudos satélites, devem recolher-se estes dados 
o mais tardar um ano após o início do estudo.
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37. Os tecidos a seguir indicados devem conservar-se no meio de fixação mais 
adequado ao tipo de tecido em causa e ao exame histopatológico previsto 
(33) — os tecidos entre parênteses retos são facultativos: 
todas as lesões 
macroscópicas coração pâncreas estômago (pré-estômago, 
estômago glandular) 
glândulas suprarrenais íleo glândulas paratiroides [dentes] aorta jejuno nervo periférico testículos encéfalo (incluindo secções 
dos hemisférios cerebrais, do cerebelo e da medula/ /protuberância anelar) rins hipófise timo 
cego glândulas lacrimais (exo- 
-orbitais) próstata tiroide 
colo do útero fígado reto [língua] 
glândulas de coagulação pulmões glândulas salivares traqueia cólon gânglios linfáticos (su ­
perficiais e profundos) vesículas seminais bexiga urinária 
duodeno glândulas mamárias (ob ­
rigatório no caso das fê ­
meas e, nos machos, se for claramente dissecá ­
vel) músculo esquelético útero, incluindo o colo do 
útero 
epidídimo [vias respiratórias supe ­
riores, incluindo o nariz, 
os cornetos e os seios paranasais] pele [ureteres] 
olhos (incluindo a retina) esófago medula espinal (a três 
níveis: cervical, medio ­
torácico e lombar) [uretra] 
[fémur com articulação] [bolbo olfativo] baço vagina 
vesícula biliar (exceto no 
caso do rato) ovários [esterno] secção da medula óssea e/ou 
uma punção recente de me ­
dula óssea 
glândulas de Harder
 
No caso dos órgãos emparelhados (por exemplo, os rins e as glândulas 
suprarrenais), devem conservar-se ambos. Os resultados clínicos ou outros podem aconselhar o exame de outros tecidos. Devem conservar-se também 
todos os órgãos que as propriedades conhecidas do produto químico em 
estudo indiciem que serão provavelmente afetados. Nos estudos por via dérmica, os órgãos a conservar são ainda os constantes da lista relativa à exposição por via oral, mas é essencial proceder igualmente à amostragem e 
à conservação de pele do local onde o produto químico em estudo foi 
aplicado. Nos estudos por inalação, a lista de tecidos do aparelho respira ­
tório a conservar e a examinar deve seguir as recomendações dos capítulos B.8 e B.29 deste anexo. A lista de outros órgãos e tecidos a examinar neste 
caso (além dos tecidos do aparelho respiratório a conservar já especificados) 
é a estabelecida para a exposição por via oral.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 477
 
Histopatologia  
38. A referência 33 contém orientações sobre as melhores práticas a seguir na 
realização de estudos de patologias toxicológicas. Os exames devem incidir, no mínimo, nos seguintes tecidos:
 
— todos os tecidos dos animais dos grupos de controlo e dos grupos 
expostos à dose mais elevada,  
— todos os tecidos dos animais que morreram ou foram eutanasiados du ­
rante o estudo,  
— todos os tecidos com anomalias macroscópicas, incluindo tumores,  
— os tecidos que revelaram alterações histopatológicas atribuíveis à expo ­
sição do produto químico em estudo nos animais dos grupos expostos à 
dose mais elevada, de todos os animais de todos os outros grupos 
expostos a uma dose do produto químico,  
— no caso dos órgãos emparelhados (por exemplo, os rins e as glândulas 
suprarrenais), devem examinar-se ambos.  
DADOS E RELATÓRIOS  
Dados  
39. Deve apresentar-se os dados por animal relativos a todos os parâmetros 
avaliados. Esses dados devem ainda ser resumidos num quadro, indicando, para cada grupo estudado, o número de animais no início do ensaio, o número de animais que morreram durante o ensaio ou que foram eutanasia ­
dos, a hora de cada morte ou eutanásia, o número de animais que apresen ­
taram sinais de toxicidade, a descrição dos sinais de toxicidade observados, nomeadamente o momento do seu aparecimento e a sua duração e intensi ­
dade, o número de animais que apresentaram lesões, o tipo de lesões e a 
percentagem de animais que apresentaram cada tipo de lesão. Devem cons ­
tar dos quadros de resumo dos dados as médias e os desvios-padrão (no caso dos dados contínuos) correspondentes aos animais que apresentaram lesões ou efeitos tóxicos, além do grau das lesões.
 
40. Os dados históricos de controlo podem ser úteis para a interpretação dos 
resultados do estudo, por exemplo, quando houver indicações de que os 
dados provenientes dos grupos de controlo em paralelo divergem significa ­
tivamente de dados recentes referentes a animais de controlo da mesma colónia e da mesma unidade de ensaio. Caso sejam avaliados dados histó ­
ricos de controlo, estes devem provir do mesmo laboratório, reportar-se a 
animais da mesma idade e estirpe e ter sido gerados nos cinco anos ante ­
riores ao estudo em causa.
 
41. Quando pertinente, devem avaliar-se os resultados numéricos por um mé ­
todo estatístico corrente adequado. Os métodos estatísticos e os dados a 
analisar devem ser escolhidos no planeamento do estudo (ponto 9). Nessa 
escolha, devem prever-se os ajustamentos em função do grau de sobrevi ­
vência que se revelem necessários.  
Relatório dos ensaios  
42. Dados a constar do relatório dos ensaios:  
Produto químico em estudo:  
— natureza física, grau de pureza e propriedades físico-químicas,  
— dados de identificação,  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 478
 
— proveniência,  
— número de lote,  
— boletim de análises químicas.  
Veículo (se for o caso):  
— justificação da escolha do veículo (se não for água).  
Animais estudados:  
— espécie e estirpe utilizadas e justificação da opção tomada,  
— número, idade e sexo dos animais no início dos ensaios,  
— proveniência, condições de alojamento, dieta, etc.,  
— peso de cada animal no início do ensaio.  
Condições de realização dos ensaios:  
— fundamentação da via de administração e das doses escolhidas,  
— métodos estatísticos utilizados na análise dos dados, se for o caso,  
— elementos relativos à formulação do produto químico em estudo/à in ­
corporação do mesmo na dieta fornecida aos animais,  
— dados analíticos relativos à concentração atingida, estabilidade e homo ­
geneidade da preparação,  
— via de administração e elementos relativos à administração do produto 
químico em estudo,  
— no caso dos estudos por inalação: exposição unicamente nasal ou de 
corpo inteiro,  
— doses reais (mg/kg de peso corporal/dia) e, se for caso disso, fator de 
conversão entre a concentração do produto químico em estudo na dieta 
ou na água de beber (mg/kg ou ppm) e a dose real,  
— pormenores relativos à qualidade dos alimentos e da água.  
Resultados (apresentar quadros de resumo dos dados e os dados por ani ­
mal):  
Informações gerais  
— dados de sobrevivência,  
— pesos corporais e alterações de peso corporal,  
— consumo de alimentos, cálculos da eficiência alimentar (se efetuados) e 
consumo de água (se for caso disso),  
— dados toxicocinéticos, se disponíveis,  
— resultados oftalmoscópicos, se disponíveis,  
— resultados hematológicos, se disponíveis,  
— resultados de química clínica, se disponíveis.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 479
 
Resultados dos exames clínicos  
— sinais de toxicidade,  
— incidência (e, se quantificada, intensidade) das anomalias observadas,  
— natureza, intensidade e duração dos sinais clínicos observados (reversí ­
veis ou irreversíveis).  
Dados das autópsias  
— peso corporal terminal,  
— peso de cada órgão (e relação com o peso corporal, se for caso disso),  
— resultados das autópsias; incidência e intensidade das anomalias.  
Histopatologia  
— observação de efeitos histopatológicos não neoplásicos,  
— observação de efeitos histopatológicos neoplásicos,  
— correlação entre as observações macroscópicas e os resultados micros ­
cópicos,  
— descrição pormenorizada dos resultados histopatológicos resultantes da 
exposição dos animais ao produto químico em estudo, incluindo a clas ­
sificação de intensidade,  
— relatórios do eventual exame das lâminas por pares especialistas.  
Tratamento estatístico dos resultados, se for caso disso.  
Discussão dos resultados, nomeadamente:  
— discussão dos eventuais modelos,  
— relações dose-resposta,  
— dados históricos de controlo,  
— análise dos dados disponíveis sobre modos de ação,  
— determinação das doses de referência, do NOAEL e do LOAEL,  
— importância para o ser humano.  
Conclusões  
REFERÊNCIAS:  
(1) OCDE (1995). Report of the Consultation Meeting on Sub-chronic and 
Chronic Toxicity/Carcinogenicity Testing (Rome, 1995). Documento de 
trabalho interno. Environment Directorate, OCDE, Paris.  
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32:163-208.
 
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(6) Capítulo B.27 deste anexo, "Ensaio de toxicidade oral subcrónica – Estudo 
de toxicidade oral de dose repetida em espécies não roedoras com a duração 
de 90 dias".  
(7) OCDE (2012). Guidance Document on the Design and Conduct of Chronic 
Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 – segunda edição. Series on Testing and Assessment No. 116. Disponível no sítio Web público de  Test Guidelines  da OCDE 
(www.oecd.org/env/testguidelines).
 
(8) OCDE (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Series on Testing and Assessment No. 39. ENV/JM/MONO(2009)28, OC ­
DE, Paris.  
(9) Capítulo B.8 deste anexo, "Toxicidade subaguda por inalação: Estudo de 28 
dias".  
(10) Capítulo B.29 deste anexo, "Toxicidade subcrónica por inalação: Estudo de 
90 dias".  
(11) Capítulo B.9 deste anexo, "Toxicidade (dérmica) da dose repetida (28 
dias)".  
(12) Boobis A.R., Cohen S.M., Dellarco V., McGregor D., Meek M.E., Vickers 
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(21) OCDE (2000). Guidance Document on the recognition, assessment, and use 
of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in 
safety evaluation. Series on Testing and Assessment No. 19. ENV/JM/MO ­
NO(2000)7, OCDE, Paris.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 481
 
(22) Rhomberg L.R., Baetcke K., Blancato J., Bus J., Cohen S., Conolly R., 
Dixit R., Doe J., Ekelman K., Fenner-Crisp P., Harvey P., Hattis D., Jacobs 
A., Jacobson-Kram D., Lewandowski T., Liteplo R., Pelkonen O., Rice J., Somers D., Turturro A., West, W., Olin S. (2007). Issues in the Design and Interpretation of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies in Rodents: 
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(23) ILSI (International Life Sciences Institute) (1997). Principles for the Selec ­
tion of Doses in Chronic Rodent Bioassays. Foran J.A. (Ed.). ILSI Press, Washington, DC.
 
(24) Griffiths S.A., Parkinson C., McAuslane J.A.N., Lumley C.E. (1994). The 
utility of the second rodent species in the carcinogenicity testing of phar ­
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(25) Usui T., Griffiths S.A., Lumley C.E. (1996). The utility of the mouse for 
the assessment of the carcinogenic potential of pharmaceuticals.  In D’Arcy 
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rence on Harmonisation. Queen’s University Press, Belfast, p. 279-284.  
(26) Carmichael N.G., Enzmann H., Pate I., Waechter F. (1997). The Signifi ­
cance of Mouse Liver Tumor Formation for Carcinogenic Risk Assessment: 
Results and Conclusions from a Survey of Ten Years of Testing by the Agrochemical Industry.  Environ Health Perspect.  105:1196-1203.
 
(27) Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu e do Conselho, de 22 de 
setembro de 2010, relativa à proteção dos animais utilizados para fins científicos (JO L 276 de 20.10.2010, p. 33).
 
(28) National Research Council (1985). Guide for the care and use of laboratory 
animals. NIH Publication No. 86-23. Washington, D.C., US Dept. of Health 
and Human Services.  
(29) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für 
Versuchstierkunde, 1988). Publication on the Planning and Structure of 
Animal Facilities for Institutes Performing Animal Experiments. ISBN 
3-906255-04-2.  
(30) GV-SOLAS (Society for Laboratory Animal Science, Gesellschaft für Ver ­
suchstierkunde, 2006). Microbiological monitoring of laboratory animals in 
various housing systems.  
(31) Diehl K.-H., Hull R., Morton D., Pfister R., Rabemampianina Y., Smith D., 
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(32) Weingand K.,  et al.  (1996). Harmonization of Animal Clinical Pathology 
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(33) Crissman J., Goodman D., Hildebrandt P.,  et al.  (2004). Best 
Practices Guideline: Toxicological Histopathology.  Toxicologic Pathology  
32:126-131.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 482
 
Apêndice 1  
DEFINIÇÃO  
Produto químico em estudo:  qualquer substância ou mistura à qual seja 
aplicado este método de ensaio.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 483
 
B.33.  ESTUDOS COMBINADOS DE TOXICIDADE CRÓNICA E 
CARCINOGENICIDADE  
INTRODUÇÃO  
1. Este método é equivalente ao  Test Guideline  453 (2009) da OCDE. O  Test 
Guideline  TG 453 inicial foi adotado em 1981. Entendeu-se necessário 
atualizar o método B.33 para dar conta da evolução recente no domínio do bem-estar animal e da regulamentação (1)(2)(3)(4)(5). A atualização do método B.33 decorreu paralelamente à revisão dos capítulos B.32 ("Estudos 
de carcinogenicidade") e B.30 ("Estudos de toxicidade crónica") deste ane ­
xo. Visa-se obter mais dados a partir dos animais utilizados nos estudos e dispor de mais elementos para a escolha das doses. Este método foi conce ­
bido para o ensaio de uma vasta gama de produtos químicos, nomeadamente 
pesticidas e produtos químicos industriais. Alguns aspetos e requisitos po ­
dem, porém, ser diferentes no caso dos produtos farmacêuticos (ver o do ­
cumento de orientações " Guidance S1B on Testing for Carcinogenicity of 
Pharmaceuticals ", publicado pela Conferência Internacional de Harmoniza ­
ção).
 
2. Na sua maioria, os estudos de toxicidade crónica e de carcinogenicidade são 
efetuados em roedores. Este método destina-se, portanto, a ser aplicado, 
preferencialmente, a estudos em espécies de roedores. Caso seja necessário efetuar estudos noutras espécies, os princípios e procedimentos descritos neste método e no capítulo B.27 deste anexo — "Estudo de toxicidade 
oral de dose repetida em espécies não roedoras com a duração de 90 dias" 
(6) — podem igualmente ser aplicados, com as adaptações necessárias e em observância das orientações do  Guidance Document on the Design and 
Conduct of Chronic Toxicity and Carcinogenicity Studies  (n.
 o 116) da 
OCDE (7).  
3. As três vias principais de administração nos estudos de toxicidade crónica e 
carcinogenicidade são a via oral, a via dérmica e a via inalatória. A via de administração escolhida depende das características físico-químicas do pro ­
duto químico em estudo e da via predominante de exposição humana. O 
documento de orientações n.
 o 116 (7) contém mais informações sobre a 
escolha da via de exposição.  
4. Este método centra-se na exposição por via oral, que é a via habitualmente 
mais utilizada nos estudos de toxicidade crónica e de carcinogenicidade. Embora possa também ser necessário efetuar estudos a longo prazo por via dérmica ou por inalação para avaliar o risco para a saúde humana 
e/ou isso possa mesmo ser exigido pela regulamentação aplicável, estas 
duas vias de exposição são bastante complexas do ponto de vista técnico e esses estudos têm de ser concebidos para cada caso concreto. Porém, no que diz respeito às recomendações relativas aos períodos de exposição, aos 
parâmetros clínicos e patológicos e a outros aspetos, o método aqui descrito 
para caracterização e avaliação da toxicidade crónica e da carcinogenicidade por administração oral pode constituir a base de um protocolo para estudos por inalação e/ou por via dérmica. A OCDE publicou orientações relativas 
ao estudo da administração de produtos químicos por inalação (7)(8) e por 
via dérmica (7). Para a conceção de estudos a longo prazo com exposição por via inalatória, recomenda-se especificamente a consulta dos capítulos B.8 (9) e B.29 (10) deste anexo e do documento de orientações da OCDE 
relativo a ensaios de toxicidade aguda por inalação (8). No caso dos ensaios 
por via dérmica, deve consultar-se o capítulo B.9 (11) deste anexo.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 484
 
5. Os estudos combinados de toxicidade crónica e carcinogenicidade fornecem 
informações sobre os perigos para a saúde que podem advir potencialmente 
da exposição repetida durante um período que pode abranger todo o tempo de vida da espécie utilizada. Estes estudos fornecem informações sobre os efeitos tóxicos do produto químico em causa, incluindo o potencial de 
carcinogenicidade, bem como indicações sobre os órgãos afetados e a pos ­
sibilidade de acumulação. Podem igualmente servir para obter estimativas do nível sem observação de efeitos adversos (" no observed adverse effect 
level", NOAEL) para efeitos tóxicos e, no caso dos produtos cancerígenos 
não genotóxicos, para respostas tumorais, com base nas quais se podem 
estabelecer critérios de segurança para a exposição humana. Salienta-se a necessidade de um exame clínico cuidadoso dos animais, de modo a obter- -se o máximo de informação possível.
 
6. Entre os objetivos dos estudos de toxicidade crónica e carcinogenicidade 
efetuados por este método contam-se os seguintes:  
— identificação das propriedades cancerígenas do produto químico em es ­
tudo suscetíveis de aumentar a incidência de neoplasias ou a proporção de neoplasias malignas, ou de reduzir o tempo que as neoplasias demo ­
ram a surgir, comparativamente aos grupos de controlo em paralelo,
 
— identificação do tempo que as neoplasias demoram a surgir,  
— identificação da toxicidade crónica de produtos químicos,  
— identificação do órgão ou órgãos afetados pela toxicidade crónica e pela 
carcinogenicidade,  
— caracterização de relações dose-resposta,  
— determinação de níveis sem observação de efeitos adversos (NOAEL) ou 
ponto de partida para o estabelecimento de doses de referência,  
— extrapolação de efeitos cancerígenos para doses baixas de exposição 
humana,  
— previsão de efeitos de toxicidade crónica aos níveis da exposição huma ­
na, 
— obtenção de dados para verificação de hipóteses relativas a modos de 
ação (2)(7)(12)(13)(14)(15).  
CONSIDERAÇÕES INICIAIS  
7. Antes de efetuar um estudo com vista à caracterização e avaliação da 
carcinogenicidade e da toxicidade crónica potenciais de um produto quími ­
co, o laboratório que efetuará os ensaios deve ponderar todas as informações disponíveis sobre o produto químico em causa, a fim de adaptar o estudo de modo a melhorar a eficiência da determinação das propriedades toxicológi ­
cas do mesmo e para minimizar o recurso a animais. É especialmente 
importante conhecer e ter em conta o modo de ação do agente cancerígeno suspeito (2)(7)(12)(13)(14)(15), dado que a conceção ótima do estudo pode ser diferente consoante o produto químico em causa seja ou não um agente 
cancerígeno/genotóxico reconhecido ou se suspeite ou não de que o possa 
ser. Para mais orientações sobre o modo de ação, consultar o documento de orientações n.
 o 116 (7).  
8. Entre os elementos que podem ser úteis na conceção do estudo contam-se a 
identidade, a estrutura química e as propriedades físico-químicas do produto químico em causa, informações disponíveis sobre o modo de ação, resulta ­
dos de ensaios de toxicidade (incluindo de genotoxicidade)  in vitro  ou in 
vivo, as utilizações previstas, o potencial de exposição humana, 
dados (Q)SAR — " (quantitative) structure-activity relationships ", relações 
(quantitativas) estrutura/atividade — e dados de mutagenicidade/genotoxici ­
dade, carcinogenicidade e outros dados toxicológicos disponíveis sobre pro ­
dutos químicos estruturalmente afins, dados toxicocinéticos disponíveis (da ­
dos cinéticos associados a uma dose única ou a doses múltiplas) e dados
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 485
 
provenientes de outros estudos com exposição repetida. Só deve proceder-se 
à determinação da toxicidade crónica e da carcinogenicidade depois de 
obtidos dados de toxicidade preliminares provenientes de estudos de toxici ­
dade com repetição da dose administrada durante 28 e/ou 90 dias. Os ensaios a curto prazo da promoção do desencadeamento de cancros também 
podem fornecer informações úteis. Deve ponderar-se uma abordagem fa ­
seada dos ensaios de carcinogenicidade no âmbito da avaliação global dos potenciais efeitos adversos na saúde do produto químico em estudo (16)(17)(18)(19).
 
9. Antes de iniciar o estudo, devem escolher-se, com base no plano experi ­
mental e nos objetivos estabelecidos, os métodos estatísticos mais adequados para a análise dos resultados. Entre outros aspetos a considerar, é necessário 
determinar se o tratamento estatístico deverá contemplar ajustamentos em 
função do grau de sobrevivência, a análise do risco tumoral acumulado em função do tempo de sobrevivência e a análise do tempo que os tumores demorar a surgir, bem como que tipo de análise deve efetuar-se no caso da 
morte prematura de todos os animais de um ou mais grupos. Para orienta ­
ções sobre as análises estatísticas mais adequadas e informação sobre as referências bibliográficas fundamentais dos métodos estatísticos internacio ­
nalmente reconhecidos, deve consultar-se o documento de orientações 
n.
 o 116 (7), assim como o documento de orientações n.  o 35, relativo à 
análise e avaliação de estudos de toxicidade crónica e de carcinogenicidade (20).
 
10. Ao realizar um estudo de carcinogenicidade, recomenda-se que sejam sem ­
pre seguidos os princípios e considerações orientadores enunciados no  Gui­
dance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluation  da 
OCDE (21), nomeadamente os expressos no ponto 62 do mesmo, cuja 
tradução é a seguinte:  "Nos estudos com repetição da dose administrada, 
se um animal evidenciar sinais clínicos progressivos da deterioração do seu estado, deve tomar-se uma decisão com conhecimento de causa sobre se 
deve ou não ser eutanasiado. Para isso, deve ponderar-se, nomeadamente, 
o valor das informações que seriam obtidas no caso de o animal continuar integrado no estudo, relativamente ao estado geral do mesmo. Caso se 
decida manter o animal no estudo, deve aumentar-se, tanto quanto neces ­
sário, a frequência dos exames que lhe são efetuados. Também é possível, sem prejudicar a finalidade do ensaio, suspender temporariamente a admi ­
nistração do produto químico em estudo – se isso reduzir a dor ou sofri ­
mento do animal – ou reduzir a dose administrada".
 
11. Para orientações pormenorizadas sobre os princípios aplicáveis à escolha das 
doses para estudos de toxicidade crónica e de carcinogenicidade e uma 
discussão dos mesmos, recomenda-se a consulta do documento de orienta ­
ções n.  o 116 (7) e das publicações com as referências 22 e 23 do Interna ­
tional Life Sciences Institute. A estratégia de base para escolha das doses depende do objetivo ou objetivos principais do estudo (ver o ponto 6). Para 
escolher doses adequadas, importa estabelecer um equilíbrio entre, por um 
lado, a identificação dos perigos em jogo e, por outro, a caracterização e importância das respostas às doses reduzidas. Este equilíbrio é especialmente necessário quando se realizam estudos combinados de toxicidade crónica e 
de carcinogenicidade.
 
12. Deve ponderar-se a oportunidade de efetuar este estudo combinado de to ­
xicidade crónica e de carcinogenicidade, em vez de efetuar separadamente 
um estudo de toxicidade crónica (capítulo B.30 deste anexo) e um estudo de 
carcinogénese (capítulo B.32 deste anexo). O estudo combinado é mais favorável, em termos de tempo e de custos e de alguma redução do recurso a animais, do que dois estudos distintos e não prejudica a qualidade dos 
dados obtidos na etapa de toxicidade crónica nem na etapa de carcinogeni ­
cidade. Ao efetuar um estudo combinado de toxicidade crónica e de carci ­
nogenicidade, é, porém, necessário prestar especial atenção aos princípios relativos à escolha das doses (pontos 11 e 22 a 26). Reconhece-se, porém, 
que determinadas regulamentações podem exigir a realização de estudos 
separados. Para mais orientações sobre a otimização dos estudos combina ­
dos de toxicidade crónica e de carcinogenicidade, ao nível das possibilida ­
des de redução do número de animais utilizados e através da racionalização 
dos procedimentos experimentais, consultar o documento de orientações 
n.
 o 116 (7).  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 486
 
13. No final do capítulo e no documento de orientações n.  o 116 (7) define-se 
alguns conceitos utilizados neste método.  
PRINCÍPIO DO MÉTODO  
14. O estudo consiste em duas etapas em paralelo, uma relativa à toxicidade 
crónica e outra relativa à carcinogenicidade (ver as durações respetivas nos 
pontos 34 e 35). Normalmente, administra-se o produto químico por via 
oral, embora a via inalatória ou a via dérmica também possam ser adequa ­
das. Na etapa relativa à toxicidade crónica, administra-se diariamente o produto químico em estudo a vários grupos de animais, em doses crescentes 
de grupo para grupo, normalmente durante doze meses, embora possam 
escolher-se períodos mais longos ou mais curtos em função das exigências da regulamentação (ver o ponto 34). Escolhe-se a duração do estudo de modo a ser suficientemente longa para que os eventuais efeitos de toxici ­
dade acumulada se manifestem, mas sem que sejam perturbados por altera ­
ções ligadas ao envelhecimento dos animais. Pode estar prevista a realização de uma ou mais eutanásias intercalares, por exemplo, após três ou seis meses. Nesse caso, pode aumentar-se o número de grupos de animais em 
conformidade (ver o ponto 20). Na etapa relativa à carcinogenicidade, 
administra-se diariamente o produto químico em estudo a vários grupos de animais, durante grande parte do tempo de vida dos animais. Verifica-se atentamente, relativamente a ambas as etapas, se os animais 
evidenciam sinais de toxicidade ou se neles estão a desenvolver-se lesões 
neoplásicas. Autopsia-se os animais que morrem ou são eutanasiados du ­
rante os ensaios. No final dos ensaios, eutanasia-se e autopsia-se os animais sobreviventes.
 
DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
Escolha da espécie animal  
15. Este método trata, em especial, da caracterização e avaliação da toxicidade 
crónica e da carcinogenicidade em roedores (ver o ponto 2). Pode ponderar-se o recurso a outras espécies se os dados disponíveis indicarem que as espécies em causa permitem prever melhor os efeitos na saúde 
humana. É necessário justificar a escolha da espécie. Embora possa 
recorrer-se a outras espécies de roedores, como o ratinho, a espécie preferida é o rato. Se bem que os estudos de carcinogenicidade no ratinho possam ser de pouca utilidade (24)(25)(26), alguns programas obrigatórios continuam a 
exigir ensaios de carcinogenicidade nessa espécie, a menos que se demons ­
tre que, do ponto de vista científico, este estudo não é necessário. O rato e o ratinho constituem os modelos experimentais preferidos devido à sua lon ­
gevidade relativamente reduzida, à sua utilização generalizada em estudos 
farmacológicos e toxicológicos, à sua sensibilidade à indução de tumores e à 
disponibilidade de estirpes suficientemente caracterizadas destas espécies. Em consequência disto, dispõe-se de numerosos dados sobre a fisiologia e patologia destes animais. Se forem exigidos estudos de toxicidade crónica e 
carcinogenicidade em espécies que não sejam de roedores, a conceção e 
realização desses estudos deve basear-se nos princípios descritos no presente método e no capítulo B.27 deste anexo — "Estudo de toxicidade oral de dose repetida em espécies não roedoras com a duração de 90 dias" (6). O 
documento de orientações n.
 o 116 (7) contém mais informações sobre a 
escolha da espécie e da estirpe.  
16. Devem ser utilizados animais adultos, jovens e saudáveis de estirpes labo ­
ratoriais correntes. De preferência, o estudo combinado de toxicidade cró ­
nica e carcinogenicidade deve ser realizado com animais da mesma estirpe e proveniência que os utilizados no estudo ou estudos preliminares mais cur ­
tos de toxicidade. Todavia, se os animais da estirpe e proveniência em 
questão não corresponderem reconhecidamente aos critérios normalmente aceites de sobrevivência em estudos de longo prazo — ver o documento de orientações n.
 o 116 (7) —, deve ponderar-se a utilização de uma estirpe 
animal cuja taxa de sobrevivência no estudo a longo prazo seja aceitável. As 
fêmeas utilizadas devem ser nulíparas e não podem estar grávidas.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 487
 
Condições de alojamento e alimentação  
17. Os animais podem ser alojados individualmente ou em pequenos grupos do 
mesmo sexo. É necessário justificar cientificamente a opção pelo alojamento individual (27)(28)(29). As gaiolas devem ser dispostas de forma a minimi ­
zar possíveis efeitos derivados do seu posicionamento. A temperatura do 
biotério deve ser de 22 °C ± 3 °C. A humidade relativa deve estar com ­
preendida entre 50 % e 60 %, embora sejam aceitáveis valores compreen ­
didos entre 30 %, no mínimo, e um valor máximo que, preferencialmente, 
não deve exceder 70 %, salvo durante os períodos de limpeza do biotério. A 
iluminação deve ser artificial, com uma sequência de 12 horas de luz se ­
guidas de 12 horas de escuridão. Na alimentação, podem utilizar-se dietas 
convencionais de laboratório e deve ser fornecida água de beber sem res ­
trições. A dieta deve satisfazer as necessidades nutricionais da espécie es ­
tudada. Os teores de contaminantes da dieta — resíduos de pesticidas, poluentes orgânicos persistentes, fitoestrogénios, metais pesados, micotoxi ­
nas e outros — podem influenciar os resultados dos ensaios e devem ser os 
mais baixos possíveis. É necessário obter periodicamente dados analíticos relativos aos teores de nutrientes e de contaminantes da dieta, pelo menos no início do estudo e quando se muda de lote. Estes dados devem constar do 
relatório final. É igualmente necessário dispor de dados analíticos da água 
de beber utilizada no estudo. Quando o produto químico em estudo é administrado por via alimentar, a escolha da dieta pode ser influenciada pela necessidade de nela misturar convenientemente esse produto químico 
e de satisfazer simultaneamente as exigências nutricionais dos animais.
 
Preparação dos animais  
18. Os animais utilizados devem ser saudáveis e ter sido aclimatados às condi ­
ções laboratoriais durante, pelo menos, sete dias e não devem ter participado em experiências anteriores. No caso dos roedores, a administração do pro ­
duto químico em estudo deve iniciar-se logo que possível após o desmame e 
a aclimatação, de preferência antes de os animais completarem oito semanas. É necessário caracterizar a espécie, a estirpe, a proveniência, o sexo, o peso e a idade dos animais utilizados no estudo. No início do estudo, as diferen ­
ças de peso entre os animais de cada sexo devem ser mínimas, não se 
desviando mais de 20 % do peso médio de todos os animais de cada sexo nele utilizados. Distribuem-se aleatoriamente os animais pelos grupos de controlo e pelos grupos expostos. Depois da distribuição aleatória dos 
animais, a média de peso corporal não deve diferir significativamente de 
grupo para grupo de animais do mesmo sexo. Se houver diferenças com significado estatístico, os animais devem, se possível, ser redistribuídos aleatoriamente. Deve atribuir-se a cada animal um número de identificação 
único, com o qual o animal seja identificado por tatuagem, implantação de  
microchip  ou outro método adequado.
 
PROCEDIMENTO  
Número e sexo dos animais  
19. Devem ser utilizados animais de ambos os sexos. O número de animais 
utilizados deve ser suficiente para uma avaliação biológica e estatística aprofundada. No caso dos roedores, cada grupo de dose (ver o ponto 22) 
e grupo de controlo em paralelo destinado à etapa de carcinogenicidade do 
estudo não deve, portanto, ter menos de 50 animais de cada sexo. Consoante a finalidade do estudo, poderá aumentar-se a representatividade estatística das principais estimativas distribuindo desigualmente os animais pelos vá ­
rios grupos de dose, constituindo grupos com mais de 50 animais para as 
doses mais baixas, por exemplo, para estimar o potencial cancerígeno a doses baixas. Todavia, importa ter presente que um aumento ligeiro do tamanho dos grupos aumenta relativamente pouco a representatividade es ­
tatística do estudo. No caso dos roedores, cada grupo de dose (ver o 
ponto 22) e grupo de controlo em paralelo destinado à etapa de toxicidade
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 488
 
crónica do estudo deve ser constituído por, pelo menos, 10 animais de cada 
sexo, número que é inferior ao utilizado no estudo de toxicidade crónica 
(capítulo B.30 deste anexo). Todavia, na interpretação dos dados provenien ­
tes de grupos com menos animais na etapa de toxicidade crónica deste estudo combinado, são tidos em conta os dados provenientes da etapa de 
carcinogenicidade, na qual os efetivos são maiores. Nos estudos com rati ­
nhos, pode ser necessário reforçar o número de animais em cada grupo exposto na etapa de toxicidade crónica, para poder realizar todas as deter ­
minações hematológicas previstas. O documento de orientações n.
 o 116 (7) 
contém mais informações sobre a conceção estatística do estudo e a escolha 
das doses para maximizar a representatividade estatística.  
Eutanásias intercalares, grupo satélite e animais sentinelas  
20. Caso se justifique do ponto de vista científico, pode prever-se a realização 
de eutanásias intercalares – por exemplo, ao fim de seis meses, na etapa de toxicidade crónica — para obter informações sobre a evolução das altera ­
ções neoplásicas, bem como dados mecanísticos. Caso já se disponha desses 
dados, obtidos em estudos de toxicidade por dose repetida realizados com o 
produto químico em causa, as eutanásias em questão podem não se justificar cientificamente. Os animais utilizados na etapa de toxicidade crónica do estudo — que, normalmente, se prolonga por doze meses (ponto 34) — 
fornecem dados equiparados aos de uma eutanásia intercalar para a etapa de 
carcinogenicidade do mesmo, reduzindo-se assim o número total de animais utilizados. Podem também prever-se grupos satélites na etapa de toxicidade crónica do estudo, para verificar a reversibilidade de alterações toxicológicas 
induzidas pelo produto químico em estudo. Nesse caso, os grupos satélite 
podem restringir-se à dose mais elevada em estudo e aos grupos de controlo. Pode prever-se um grupo de animais sentinelas (habitualmente cinco animais de cada sexo) para verificar, se necessário, o aparecimento de doenças 
durante o estudo (30). O documento de orientações n.
 o 116 (7) contém 
mais informações sobre a maneira de, minimizando o número total de animais utilizados, incluir no estudo eutanásias intercalares e animais saté ­
lites e sentinelas.
 
21. Caso esteja prevista no estudo a existência de animais satélites e/ou a 
realização de eutanásias intercalares, o número de animais a utilizar com 
essas finalidades em cada grupo de dose é normalmente de dez de cada sexo. Nesse caso, o número total de animais utilizado no estudo deve ser aumentado no número de animais a eutanasiar antes da conclusão do mes ­
mo. Normalmente, os animais satélites e os animais sujeitos à eutanásia 
intercalar devem ser objeto do mesmo exame, nomeadamente peso corporal, consumo de alimentos e de água, análises hematológicas e de bioquímica clínica e exames patológicos, que os animais participantes na etapa de 
toxicidade crónica do estudo principal, embora também possa prever-se 
(no caso dos grupos com destino a eutanásia intercalar) que as determina ­
ções se limitem a parâmetros fundamentais específicos, por exemplo, de neurotoxicidade ou de imunotoxicidade.
 
Grupos de dose e dosagens  
22. O documento de orientações n.  o 116 (7) contém orientações relativas a todos 
os aspetos relacionados com a escolha das doses e os intervalos entre estas. 
Devem ser utilizados pelo menos três doses e um controlo em paralelo, para 
as etapas de toxicidade crónica e de carcinogenicidade. As doses baseiam-se, normalmente, nos resultados de estudos exploratórios das doses ou de estudos de dose repetida por períodos mais curtos e devem atender 
aos dados toxicológicos e toxicocinéticos disponíveis sobre o produto quí ­
mico em estudo ou produtos químicos afins.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 489
 
23. Se for de prever que o ensaio, na etapa de toxicidade crónica do estudo, de 
uma dose não inferior a 1 000 mg/kg de peso corporal/dia não provoque 
efeitos adversos, pode considerar-se que não é necessário efetuar um estudo completo com três doses. Esta decisão deve basear-se nos resultados de estudos preliminares e, tendo em conta dados referentes a produtos químicos 
estruturalmente afins, na provável ausência de efeitos tóxicos. Nesses casos, 
pode justificar-se um limite de 1 000 mg/kg de peso corporal/dia, exceto se os dados relativos à exposição humana aconselharem o ensaio de uma dose superior.
 
24. A menos que tal dose esteja limitada pelas características físico-químicas ou 
pelos efeitos biológicos do produto químico em estudo, deve escolher-se para dose mais elevada o nível que permita identificar os principais órgãos 
afetados e os efeitos tóxicos principais sem causar sofrimento, efeitos tóxi ­
cos intensos, morbidez nem mortalidade. Normalmente, escolhe-se para dose mais elevada uma dose que induza efeitos tóxicos, evidenciados, por exem ­
plo, por uma redução (aproximadamente de 10 %) do ganho de peso cor ­
poral. Todavia, consoante os objetivos do estudo (ver o ponto 6), pode 
escolher-se uma dose máxima inferior à que evidencia efeitos tóxicos, por exemplo, se essa dose induzir um efeito adverso preocupante, mas com pouca influência na longevidade ou no peso corporal dos animais.
 
25. Podem escolher-se doses e intervalos entre doses que permitam estabelecer 
uma relação dose-resposta e, consoante o modo de ação do produto químico 
em estudo, determinar um NOAEL ou outro resultado pretendido do estudo, 
por exemplo, uma dose de referência (ver o ponto 27). Entre os fatores a ter em conta na escolha das doses mais baixas, contam-se o declive esperado da curva dose-resposta, as doses às quais podem ocorrer alterações importantes 
ao nível metabólico ou do modo da ação tóxica, o nível ao qual se prevê a 
ocorrência de um limiar e o nível ao qual se prevê fixar o ponto de partida de extrapolações para doses mais baixas. O objetivo principal de um estudo combinado de carcinogenicidade e de toxicidade crónica é obter informações 
destinadas à avaliação do risco de carcinogenicidade, sendo a recolha de 
dados relativos à toxicidade crónica um objetivo normalmente secundário. É importante ter isto presente ao escolher as doses e os intervalos entre doses para o estudo a realizar.
 
26. O intervalo entre as doses depende dos objetivos do estudo e das caracte ­
rísticas do produto químico em estudo e não pode ser particularizado neste 
método. Contudo, a utilização de intervalos definidos por um fator de 2 a de 
4 entre doses consecutivas dá frequentemente bons resultados nestes ensaios, sendo muitas vezes melhor ensaiar um quarto grupo do que recorrer a intervalos muito grandes (por exemplo, mais do que um fator de 6 a 10) 
entre as dosagens. Em geral, são de evitar fatores superiores a 10. Caso 
contrário, é necessário justificá-los.
 
27. Conforme se explica mais em pormenor no documento de orientações 
n. o 116 (7), entre os aspetos a ter em conta na escolha das doses 
contam-se os seguintes:  
— relações não lineares ou pontos de inflexão conhecidos ou de que se 
suspeite na curva dose-resposta,  
— aspetos toxicocinéticos e doses às quais ocorra, ou não ocorra, indução 
metabólica, saturação ou não linearidade entre as doses externas e as doses internas,
 
— lesões precursoras, marcadores de efeitos ou indicadores de processos 
biológicos fundamentais subjacentes em curso,  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 490
 
— aspetos fundamentais (ou de que se suspeite) do modo de ação, tais 
como as doses às quais começam a manifestar-se efeitos citotóxicos, 
os níveis hormonais são perturbados, os mecanismos homeostáticos co ­
lapsam, etc.,  
— regiões da curva dose-resposta que necessitam de estimativas especial ­
mente rigorosas, por exemplo, perto da dose de referência prevista ou da 
dose à qual se suspeite corresponder um limiar,  
— níveis previstos de exposição humana, sobretudo na escolha das doses 
baixas e intermédias.  
28. O grupo de controlo deve ser um grupo não exposto ao produto químico em 
estudo ou, se for usado um veículo para administrar o produto químico, um grupo de controlo do veículo. Salvo no que respeita à exposição ao produto 
químico em estudo, os animais do grupo de controlo devem ser tratados do 
mesmo modo que os animais dos grupos ensaiados. Caso se utilize um veículo, o grupo de controlo deve receber o volume máximo de veículo utilizado nos grupos expostos ao produto químico em estudo. Se o produto 
químico for administrado por via da dieta e reduzir significativamente a 
quantidade desta ingerida por lhe conferir menor palatabilidade, um grupo de controlo adicional alimentado do mesmo modo, em paralelo, pode cons ­
tituir um grupo de controlo mais adaptado.
 
Preparação das doses e administração do produto químico em estudo  
29. O produto químico em estudo é normalmente administrado por via oral, 
através da dieta ou da água de beber ou por intermédio de uma sonda 
esofágica. O documento de orientações n.  o 116 (7) contém mais informações 
sobre vias e métodos de administração. A via e o método de administração dependem do objetivo do estudo, bem como das propriedades físico-quími ­
cas e biodisponibilidade do produto químico em causa e da via e do método 
de exposição humana predominantes. É necessário fundamentar a via e o método de administração escolhidos. Por razões de bem-estar animal, nor ­
malmente só deve optar-se pela utilização de uma sonda esofágica no caso 
dos agentes relativamente aos quais a via oral e este método de adminis ­
tração representem razoavelmente a exposição humana potencial (por exem ­
plo, através da ingestão de produtos farmacêuticos). No caso dos produtos químicos ingeridos com os alimentos ou disseminados no ambiente, nomea ­
damente pesticidas, a administração habitual é por incorporação na dieta ou 
na água de beber. Todavia, para outros cenários – caso da exposição pro ­
fissional –, pode justificar-se a administração por outras vias.
 
30. Se necessário, pode suspender-se ou dissolver-se o produto químico em 
estudo num veículo apropriado. Devem ser tidos em conta as seguintes características que se justifiquem do veículo e de outros aditivos: efeitos na absorção, na distribuição, no metabolismo ou na retenção do produto 
químico em causa, efeitos nas propriedades químicas do produto químico 
em estudo suscetíveis de alterarem as características tóxicas do mesmo e efeitos no consumo de alimentos, na ingestão de água ou no estado nutri ­
cional dos animais. Recomenda-se que, sempre que possível, a primeira 
opção seja uma solução ou suspensão aquosa; caso tal não seja viável, 
pode optar-se por uma solução ou emulsão num óleo (por exemplo, em óleo de milho); em último caso, poderá recorrer-se a uma solução noutro veículo. Se o veículo utilizado não for água, é necessário conhecer as suas 
características de toxicidade. Deve dispor-se de informações sobre a estabi ­
lidade do produto químico em estudo e a homogeneidade das soluções ou rações de dosagem (consoante o caso) nas condições de administração (por exemplo, por via da dieta).
 
31. É importante assegurar que a quantidade de um produto químico em estudo 
administrada através da dieta ou da água de beber não interfere nas exigên ­
cias normais de nutrição nem no equilíbrio hídrico. No caso dos estudos de toxicidade a longo prazo nos quais o produto químico seja administrado pela 
via alimentar, a concentração deste nos alimentos não deve, normalmente, 
exceder 5 % da ração total, a fim de evitar desequilíbrios nutricionais. Se o produto químico em estudo for administrado por via da dieta, pode optar-se por concentrações constantes nesta (mg/kg de alimentos ou ppm) ou por 
doses constantes em relação ao peso corporal do animal (mg/kg de peso 
corporal), calculadas semanalmente. Deve indicar-se a opção tomada.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 491
 
32. Em caso de administração por via oral, os animais recebem uma dose 
quotidiana (sete dias por semana) do produto químico em estudo, ao longo 
de 12 meses (na etapa de toxicidade crónica) ou de 24 meses (na etapa de carcinogenicidade) — ver também os pontos 33 e 34. É necessário justificar qualquer outro regime de dosagem (por exemplo, cinco dias por semana). 
Em caso de administração por via dérmica, os animais são normalmente 
expostos ao produto químico em estudo durante, pelo menos, seis horas por dia, sete dias por semana, conforme se descreve no capítulo B.9 (11) deste anexo, ao longo de 12 meses (na etapa de toxicidade crónica) ou de 24 
meses (na etapa de carcinogenicidade). A exposição por via inalatória é 
efetuada durante seis horas por dia, sete dias por semana. Todavia, caso se justifique, também podem expor-se os animais durantecinco dias por semana. O período de exposição neste caso é normalmente de 12 meses 
(na etapa de toxicidade crónica) ou de 24 meses (na etapa de carcinogeni ­
cidade). Se espécies que não o rato forem sujeitas a exposição unicamente nasal, pode ajustar-se a duração máxima da exposição para minimizar a tensão gerada na espécie em causa. Se a duração da exposição for inferior 
a seis horas por dia, é necessário fundamentá-lo. Ver também o capítulo B.8 
(9) deste anexo.
 
33. A administração do produto químico aos animais por meio de uma sonda 
esofágica deve efetuar-se à mesma hora do dia por meio de um tubo esto ­
macal ou de uma cânula de intubação adequada. Normalmente, administra-se a dose diária de uma só vez. Porém, se o produto químico for, por exemplo, um irritante local, pode repartir-se a mesma dose diária 
por dois momentos. O volume máximo de líquido que pode ser adminis ­
trado de cada vez depende do tamanho do animal e deve ser o mínimo possível. No caso dos roedores, normalmente não deve exceder 1 ml/100 g de peso corporal (31). Para minimizar diferenças entre volumes administra ­
dos, devem ser efetuados ajustes nas concentrações, de forma que o volume 
seja o mesmo para todas as doses. Excetuam-se os produtos químicos po ­
tencialmente corrosivos ou irritantes, que têm de ser diluídos para evitar efeitos locais intensos. Devem evitar-se concentrações que possam provocar 
efeitos corrosivos ou irritantes no tubo digestivo.
 
Duração do estudo  
34. Embora o período de exposição e a etapa de toxicidade crónica deste estudo 
se prolonguem, normalmente, por 12 meses, este método também está adap ­
tado e pode aplicar-se a estudos mais curtos (por exemplo, seis ou nove 
meses) ou mais longos (por exemplo, 18 ou 24 meses), consoante o exija a 
regulamentação pertinente ou por razões mecanísticas determinadas. Se o período de exposição não for de 12 meses, é necessário fundamentá-lo, sobretudo se a duração da exposição for mais curta. A exposição de todos 
os grupos que participam nesta etapa termina no momento previsto para as 
avaliações de toxicidade crónica e de patologias não neoplásicas. Os grupos satélites incluídos para verificar a reversibilidade de alterações toxicológicas induzidas pelo produto químico em estudo devem manter-se sem dosagem 
após o termo da exposição, durante um período não inferior a quatro sema ­
nas e não superior a um terço da duração total do estudo.
 
35. No caso dos roedores, a duração da etapa de carcinogenicidade deste estudo 
é normalmente de 24 meses, o que representa grande parte do tempo de vida 
dos animais utilizados. Consoante o tempo de vida dos animais da estirpe de espécie utilizada no estudo, este pode ser mais curto ou mais longo, mas é necessário justificá-lo. No caso de determinadas estirpes de ratinhos (por 
exemplo, AKR/J, C3H/J ou C57BL/6J), pode ser adequada uma duração do 
estudo de 18 meses. Seguem-se algumas orientações sobre a duração do estudo, o termo deste e a sobrevivência. Para mais orientações, nomeada ­
mente no que respeita aos critérios para considerar a carcinogenicidade 
negativa com base na sobrevivência dos animais estudados, consultar o 
documento de orientações n.
 o 116. ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 492
 
— deve ponderar-se pôr termo ao estudo quando o número de sobreviven ­
tes do grupo exposto à dose mais baixa ou do grupo de controlo descer 
abaixo de 25 %.  
— se apenas morrerem prematuramente devido a efeitos tóxicos animais do 
grupo exposto à dose mais elevada, não deve pôr-se termo ao estudo.  
— a sobrevivência dos animais deve ser examinada separadamente para 
cada sexo.  
— o estudo não deve prolongar-se além do estádio em que os dados dele 
extraíveis deixam de ser suficientes para validar uma avaliação estatís ­
tica. 
EXAMES (ETAPA DE TOXICIDADE CRÓNICA)  
36. Normalmente no início e no final de cada dia, incluindo fins de semana e 
feriados, deve verificar-se os casos de morbidez ou mortalidade no conjunto dos animais. Pelo menos uma vez por dia, deve efetuar-se um exame clínico 
geral, de preferência sempre à(s) mesma(s) hora(s) e, no caso da adminis ­
tração por sonda esofágica, tendo em conta o período previsto de efeitos mais acentuados após a administração do produto químico.
 
37. Deve efetuar-se um exame clínico aprofundado a cada animal pelo menos 
uma vez antes da primeira exposição (para poder fazer depois comparações com o estado inicial do animal), no final da primeira semana do estudo e, a 
partir daí, mensalmente. Os exames devem respeitar um protocolo que mi ­
nimize as variações entre quem os realiza e não faça depender os resultados do grupo examinado. Estes exames devem ser realizados fora das gaiolas, de preferência num recinto normalizado e sempre à mesma hora. Os resultados 
destes exames devem ser cuidadosamente registados, de preferência por 
recurso a um sistema de pontuação claramente definido pelo laboratório em causa. Deve zelar-se por que as condições de exame sejam o mais constantes possível. Entre os sinais a registar contam-se alterações da pele, 
da pelagem, dos olhos e das mucosas e a ocorrência de secreções, excreções 
ou reações neurovegetativas (por exemplo, lacrimação, horripilação, altera ­
ções da dimensão pupilar ou respiração anormal). Deve também registar-se qualquer alteração da maneira de o animal se mover, da postura e da reação 
à manipulação, bem como a ocorrência de movimentos clónicos ou tónicos 
e de comportamentos estereotipados (por exemplo, atos de higiene repetiti ­
vos ou movimentação repetitiva em círculo) ou estranhos (automutilação, movimentação para trás, etc.) (32).
 
38. Recorrendo a um oftalmoscópio ou a dispositivo equivalente, efetua-se um 
exame oftalmológico a cada animal antes da primeira administração do 
produto químico em estudo. No termo do estudo, deve efetuar-se este exame 
de preferência a todos os animais, mas pelo menos aos dos grupos expostos à dose mais elevada e dos grupos de controlo. Se forem detetadas alterações oculares atribuíveis à exposição ao produto químico em estudo, devem 
examinar-se todos os animais. Se a análise estrutural ou outros elementos 
indiciarem efeitos tóxicos ao nível ocular, deve aumentar-se a frequência dos exames oculares.
 
39. No caso dos produtos químicos que tenham revelado potencial de indução 
de efeitos neurotóxicos em estudos anteriores de toxicidade por dose repe ­
tida a 28 dias e/ou a 90 dias, poderá, a título facultativo, verificar-se a reatividade sensorial a diversos tipos de estímulos (32) — por exemplo, 
estímulos auditivos, visuais ou propriocetivos (33)(34)(35) — e avaliar-se 
a força de preensão (36) e a atividade motora (37), antes de iniciar o estudo e, a partir daí, de três em três meses, até aos doze meses, inclusive, bem como no termo do estudo (se for além de doze meses). As referências 
indicadas contêm mais informações sobre a maneira de proceder em cada 
caso, embora possam adotar-se procedimentos distintos dos nelas descritos.
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40. No caso dos produtos químicos que tenham revelado potencial de indução 
de efeitos imunotóxicos em estudos anteriores de toxicidade por dose repe ­
tida a 28 dias e/ou a 90 dias, poderá, a título facultativo, aprofundar-se a investigação deste parâmetro no termo do estudo.
 
Peso corporal, consumo de alimentos e de água, eficiência alimentar  
41. Todos os animais devem ser pesados no início da exposição, pelo menos 
uma vez por semana nas primeiras treze semanas e, a partir daí, pelo menos uma vez por mês. Deve medir-se o consumo de alimentos e a eficiência 
alimentar pelo menos uma vez por semana nas primeiras treze semanas e, a 
partir daí, pelo menos uma vez por mês. Se o produto químico em estudo for administrado através da água de beber, deve medir-se o consumo de água pelo menos uma vez por semana nas primeiras treze semanas e, a partir 
daí, pelo menos uma vez por mês. Pode ser útil medir o consumo de água 
também no caso dos estudos em que se verifiquem alterações do compor ­
tamento dos animais a esse nível.
 
Análises hematológicas e de bioquímica clínica  
42. Nos estudos com roedores, devem ser efetuadas análises hematológicas a 
todos os animais estudados (dez machos e dez fêmeas de cada grupo) aos 
três, seis e 12 meses e no termo do estudo (se for além de 12 meses). 
No caso dos ratinhos, a realização das análises hematológicas necessárias pode exigir o recurso a animais satélites (ver o ponto 19). No caso dos estudos em que não sejam utilizados roedores, colhem-se amostras num 
número mais reduzido de animais (por exemplo, se a espécie utilizada for 
o cão, quatro animais de cada sexo, por grupo) em estádios intermédios e no termo do estudo, tal como se indicou para os roedores. Se, num estudo anterior, a 90 dias, efetuado com doses comparáveis, não se tiverem dete ­
tado alterações dos parâmetros hematológicos, não é necessário efetuar as 
análises previstas ao fim de três meses, tanto no caso dos roedores como de outras espécies. As amostras de sangue devem ser colhidas, sob anestesia, num ponto determinado a indicar, por exemplo, por punção cardíaca ou no 
seio retro-orbital.
 
43. Devem ser efetuadas as seguintes análises (38): contagem total de leucóci ­
tos, fórmula leucocitária, contagem de eritrócitos, contagem de plaquetas, concentração de hemoglobina, hematócrito (volume celular sanguíneo após centrifugação), volume corpuscular médio, hemoglobina corpuscular média, 
concentração de hemoglobina corpuscular média, tempo de protrombina e 
tempo de tromboplastina parcial ativada. Se necessário, em função da toxi ­
cidade do produto químico em estudo, poderão analisar-se outros parâmetros 
hematológicos, tais como os corpos de Heinz e outras anomalias morfoló ­
gicas dos eritrócitos ou a meta-hemoglobina. Em termos gerais, deve adotar-se uma perspetiva de flexibilidade, dependendo dos efeitos observa ­
dos e/ou previstos do produto químico em causa. Se este tiver efeitos no 
sistema hematopoiético, pode ser útil efetuar também a contagem de reticu ­
lócitos e uma citologia da medula óssea, embora estas análises não sejam sistematicamente necessárias.
 
44. Com a mesma cronologia especificada para as análises hematológicas, 
Devem ser efetuadas análises de bioquímica clínica a amostras de sangue 
colhidas em todos os animais estudados (dez machos e dez fêmeas de cada 
grupo), para determinar os principais efeitos tóxicos nos tecidos, nomeada ­
mente ao nível dos rins e do fígado. No caso dos ratinhos, a realização das necessárias análises de bioquímica clínica pode exigir o recurso a animais 
satélites. No caso dos estudos em que não sejam utilizados roedores, 
colhem-se amostras num número mais reduzido de animais (por exemplo, se a espécie utilizada for o cão, quatro animais de cada sexo, por grupo) em estádios intermédios e no termo do estudo, tal como se indicou para os 
roedores. Se, num estudo anterior, a 90 dias, efetuado com doses compará ­
veis, não se tiverem detetado alterações dos parâmetros de bioquímica
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 494
 
clínica, não é necessário efetuar as análises previstas ao fim de três 
meses, tanto no caso dos roedores como de outras espécies. 
Recomenda-se o jejum dos animais (exceto dos ratinhos) durante a noite, antes da colheita das amostras de sangue (
 1 ). Devem ser efetuadas as se ­
guintes análises (38): glucose, ureia (azoto ureico), creatinina, proteínas 
totais, albumina, cálcio, sódio, potássio, colesterol total, pelo menos duas 
análises reveladoras de efeitos hepatocelulares (alanina-aminotransferase, aspartato-aminotransferase, glutamate-desidrogenase, ácidos biliares totais) (39) e, pelo menos, duas análises reveladoras de efeitos hepatobiliares (fos ­
fatase alcalina, gama-glutamil-transferase, 5’-nucleotidase, bilirrubina total, 
ácidos biliares totais) (39). Se necessário, em função da toxicidade do pro ­
duto químico em estudo, poderão analisar-se outros parâmetros de química clínica, tais como a colinesterase, hormonas específicas e os triglicéridos em 
jejum. Em termos gerais, deve adotar-se uma perspetiva de flexibilidade, 
dependendo dos efeitos observados e/ou previstos do produto químico em causa.
 
45. Devem ser efetuadas análises de urina a todos os animais estudados (dez 
machos e dez fêmeas de cada grupo), em amostras colhidas com a mesma cronologia especificada para as análises hematológicas e de química clínica. Se, num estudo anterior, a 90 dias, efetuado com doses comparáveis, não se 
tiverem detetado alterações dos parâmetros analisados na urina, não é ne ­
cessário efetuar as análises previstas ao fim de três meses. Uma recomen ­
dação de peritos relativa a estudos de patologia clínica (38) inclui a seguinte lista de parâmetros: aspeto, volume, osmolalidade ou densidade, pH, proteí ­
nas totais e glucose. Podem também determinar-se os seguintes parâmetros: 
corpos cetónicos, urobilinogénio, bilirrubina e sangue oculto. Pode ser ne ­
cessário recorrer ainda a outros parâmetros para investigar melhor os efeitos observados.
 
46. Em geral, considera-se que, nos estudos em cães, é necessário determinar os 
valores de base dos parâmetros hematológicos e de bioquímica clínica antes de iniciar a exposição dos animais, o mesmo não sucedendo, porém, no caso 
dos estudos em roedores (38). Se os dados de base históricos (ver o 
ponto 58) forem inadequados, pode, no entanto, ser necessário determinar os dados em falta.
 
PATOLOGIA  
Autópsia macroscópica  
47. Normalmente, deve ser realizada a todos os animais estudados uma autópsia 
macroscópica completa e pormenorizada através do exame cuidadoso da 
superfície exterior do corpo, dos orifícios, das cavidades craniana, torácica 
e abdominal e do conteúdo de cada uma destas. Todavia, pode igualmente prever-se que (no caso dos grupos com destino a eutanásia intercalar e dos grupos satélites) as determinações se limitem a parâmetros fundamentais 
específicos, por exemplo, de neurotoxicidade ou de imunotoxicidade (ver 
o ponto 21). Não é necessário autopsiar esses animais nem aplicar-lhes os procedimentos descritos nos pontos seguintes. Fica ao critério do diretor do 
estudo decidir em que casos é necessário autopsiar animais sentinelas.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 495  
( 1 ) No caso de algumas determinações no soro e no plasma, nomeadamente da glucose, é 
aconselhável que os animais jejuem durante a noite. O principal motivo deste recomen ­
dação reside no facto de que a maior variabilidade dos resultados que inevitavelmente 
ocorreria se os animais não jejuassem poderia ocultar efeitos subtis e dificultar as inter ­
pretações. No entanto, por outro lado, o jejum durante a noite pode interferir no meta ­
bolismo geral dos animais, e, particularmente nos estudos realizados com administração 
pela via alimentar, perturbar a exposição diária ao produto químico em estudo. Os 
animais devem ser todos avaliados no mesmo estado fisiológico, pelo que é preferível 
programar as avaliações pormenorizadas e as avaliações neurológicas para um dia dife ­
rente do da colheita das amostras para as análises de bioquímica clínica.
 48. Deve determinar-se o peso dos órgãos de cada animal, com exceção dos 
excluídos no ponto 47. Removem-se convenientemente os tecidos aderentes 
às glândulas suprarrenais, ao encéfalo, aos epidídimos, ao coração, aos rins, ao fígado, aos ovários, ao baço, aos testículos, à tiroide (com as glândulas paratiroides, sendo a pesagem efetuada depois da fixação) e ao útero de 
todos os animais (exceto os moribundos e/ou os que sejam eutanasiados 
durante o estudo) e pesa-se cada um destes ainda húmido o mais rapida ­
mente possível depois da dissecação, para evitar que seque.
 
49. Os tecidos a seguir indicados devem conservar-se no meio de fixação mais 
adequado ao tipo de tecido em causa e ao exame histopatológico previsto (40) – os tecidos entre parênteses retos são facultativos: 
todas as lesões 
macroscópicas coração pâncreas estômago (pré-estômago, 
estômago glandular) 
glândulas suprarrenais íleo glândulas paratiroides [dentes] aorta jejuno nervo periférico testículos encéfalo (incluindo secções 
dos hemisférios cerebrais, do cerebelo e da medula/ /protuberância anelar) rins hipófise timo 
cego glândulas lacrimais (exo- 
-orbitais) próstata tiroide 
colo do útero fígado reto [língua] 
glândulas de coagulação pulmões glândulas salivares traqueia cólon gânglios linfáticos (su ­
perficiais e profundos) vesículas seminais bexiga urinária 
duodeno glândulas mamárias (ob ­
rigatório no caso das fê ­
meas e, nos machos, se for claramente dissecá ­
vel) músculo esquelético útero, incluindo o colo do 
útero 
epidídimo [vias respiratórias supe ­
riores, incluindo o nariz, 
os cornetos e os seios 
paranasais] pele [ureteres] 
olhos (incluindo a retina) esófago medula espinal (a três 
níveis: cervical, medio ­
torácico e lombar) [uretra] 
[fémur com articulação] [bolbo olfativo] baço vagina 
vesícula biliar (exceto no 
caso do rato) ovários [esterno] secção da medula óssea e/ou 
uma punção recente de me ­
dula óssea 
glândulas de Harder
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No caso dos órgãos emparelhados (por exemplo, os rins e as glândulas 
suprarrenais), devem ser ambos conservados. Os resultados clínicos ou ou ­
tros podem aconselhar o exame de outros tecidos. Devem ser conservados também todos os órgãos que as propriedades conhecidas do produto químico em estudo indiciem que serão provavelmente afetados. Nos estudos por via 
dérmica, os órgãos a examinar são ainda os constantes da lista relativa à 
exposição por via oral, mas é necessário proceder igualmente à amostragem e à conservação de pele do local onde o produto químico em estudo foi aplicado. Nos estudos por inalação, a lista de tecidos do aparelho respira ­
tório a conservar e a examinar deve seguir as recomendações dos capítulos 
B.8 (9) e B.29 (10) deste anexo. A lista de outros órgãos e tecidos a examinar neste caso (além dos tecidos do aparelho respiratório a conservar já especificados) é a estabelecida para a exposição por via oral.
 
Histopatologia  
50. A referência 40 contém orientações sobre as melhores práticas a seguir na 
realização de estudos de patologias toxicológicas. Os exames histopatológi ­
cos devem incidir, no mínimo, no seguinte:  
— todos os tecidos dos animais dos grupos de controlo e dos grupos 
expostos à dose mais elevada,  
— todos os tecidos dos animais que morreram ou foram eutanasiados du ­
rante o estudo,  
— todos os tecidos com anomalias macroscópicas,  
— os tecidos dos órgãos afetados, e os tecidos que revelaram alterações 
atribuíveis à exposição ao produto químico em estudo nos animais dos 
grupos expostos à dose mais elevada, de todos os animais de todos os outros grupos expostos a uma dose do produto químico,
 
— no caso dos órgãos emparelhados (por exemplo, os rins e as glândulas 
suprarrenais), devem examinar-se ambos.  
EXAMES (ETAPA DE CARCINOGENICIDADE)  
51. Normalmente no início e no final de cada dia, incluindo fins de semana e 
feriados, devem verificar-se os casos de morbidez ou mortalidade no con ­
junto dos animais. Verifica-se igualmente, uma vez por dia, se os animais 
têm sinais com importância toxicológica. No caso dos estudos que recorrem 
à administração por sonda esofágica, os animais devem ser verificados imediatamente após a administração do produto químico. Deve prestar-se especial atenção ao desenvolvimento de tumores, registando-se o tempo 
decorrido até ao aparecimento destes e o local, as dimensões, o aspeto e 
a progressão de cada tumor visível na observação macroscópica ou identi ­
ficável por palpação.
 
52. Todos os animais devem ser pesados no início da exposição, pelo menos 
uma vez por semana nas primeiras treze semanas e, a partir daí, pelo menos uma vez por mês. Deve medir-se o consumo de alimentos e a eficiência alimentar pelo menos uma vez por semana nas primeiras treze semanas e, a 
partir daí, pelo menos uma vez por mês. Se o produto químico em estudo 
for administrado através da água de beber, deve medir-se o consumo de água pelo menos uma vez por semana nas primeiras treze semanas e, a partir daí, pelo menos uma vez por mês. Pode ser útil medir o consumo de água 
também no caso dos estudos em que se verifiquem alterações do compor ­
tamento dos animais a esse nível.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 497
 
Análises hematológicas e de bioquímica clínica e outras determinações  
53. A fim de extrair um máximo de informações do estudo, sobretudo no que 
respeita ao modo de ação, fica ao critério do diretor do estudo proceder à colheita de amostras de sangue para análises hematológicas e de bioquímica 
clínica. Pode também ser útil efetuar análises de urina. Os dados relativos 
aos animais utilizados na etapa de toxicidade crónica do estudo — a qual normalmente tem a duração de doze meses (ponto 34) — fornecem infor ­
mações sobre os parâmetros destas análises. Para mais orientações sobre o 
interesse da colheita das referidas amostras num estudo de carcinogenicida ­
de, consultar o documento de orientações n.
 o 116 (7). Se forem colhidas 
amostras de sangue com essa finalidade, deve efetuar-se a colheita no final 
do período de ensaio, imediatamente antes da eutanásia dos animais ou 
integrada nesta. As amostras devem ser colhidas, sob anestesia, num ponto determinado a indicar, por exemplo, por punção cardíaca ou no seio retro-orbital. Podem igualmente preparar-se esfregaços de sangue para 
exame, em especial se o órgão afetado for a medula óssea. Todavia, tem 
sido questionada (38) a utilidade deste exame de esfregaços de sangue na etapa de carcinogenicidade para a avaliação do potencial cancerígeno/onco ­
génico.
 
PATOLOGIA  
Autópsia macroscópica  
54. Deve ser realizada a todos os animais estudados — exceto os animais 
sentinelas e outros animais satélites (ver o ponto 20) — uma autópsia 
macroscópica completa e pormenorizada através do exame cuidadoso da superfície exterior do corpo, dos orifícios, das cavidades craniana, torácica e abdominal e do conteúdo de cada uma destas. Fica ao critério do diretor 
do estudo decidir em que casos é necessário autopsiar animais sentinelas ou 
outros animais satélites. A pesagem de órgãos normalmente não faz parte dos estudos de carcinogénese, dado que as alterações geriátricas e o desen ­
volvimento de tumores em fases avançadas diminuem a utilidade dessas 
pesagens. Todavia, estas pesagens podem ter muita importância nas avalia ­
ções baseadas na suficiência da prova, sobretudo no que respeita ao modo de ação. Se fizerem parte de estudos satélites, deve recolher-se estes dados o mais tardar um ano após o início do estudo.
 
55. Os tecidos a seguir indicados devem conservar-se no meio de fixação mais 
adequado ao tipo de tecido em causa e ao exame histopatológico previsto 
(40) — os tecidos entre parênteses retos são facultativos: 
todas as lesões 
macroscópicas coração pâncreas estômago (pré-estômago, 
estômago glandular) 
glândulas suprarrenais íleo glândulas paratiroides [dentes] 
aorta jejuno nervo periférico testículos encéfalo (incluindo secções 
dos hemisférios cerebrais, 
do cerebelo e da medula/ 
/protuberância anelar) rins hipófise timo 
cego glândulas lacrimais (exo- 
-orbitais) próstata tiroide 
colo do útero fígado reto [língua] 
glândulas de coagulação pulmões glândulas salivares traqueia cólon gânglios linfáticos (su ­
perficiais e profundos) vesículas seminais bexiga urinária
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 498
 
duodeno glândulas mamárias (ob ­
rigatório no caso das fê ­
meas e, nos machos, se 
for claramente dissecá ­
vel) músculo esquelético útero, incluindo o colo do 
útero 
epidídimo [vias respiratórias supe ­
riores, incluindo o nariz, 
os cornetos e os seios paranasais] pele [ureteres] 
olhos (incluindo a retina) esófago medula espinal (a três 
níveis: cervical, medio ­
torácico e lombar) [uretra] 
[fémur com articulação] [bolbo olfativo] baço vagina 
vesícula biliar (exceto no 
caso do rato) ovários [esterno] secção da medula óssea e/ou 
uma punção recente de me ­
dula óssea 
glândulas de Harder
 
No caso dos órgãos emparelhados (por exemplo, os rins e as glândulas 
suprarrenais), devem conservar-se ambos. Os resultados clínicos ou outros podem aconselhar o exame de outros tecidos. Devem conservar-se também 
todos os órgãos que as propriedades conhecidas do produto químico em 
estudo indiciem que serão provavelmente afetados. Nos estudos por via dérmica, os órgãos a examinar são ainda os constantes da lista relativa à exposição por via oral, mas é necessário proceder igualmente à amostragem 
e à conservação de pele do local onde o produto químico em estudo foi 
aplicado. Nos estudos por inalação, a lista de tecidos do aparelho respira ­
tório a conservar e a examinar deve seguir as recomendações dos capítulos B.8 (8) e B.29 (9) deste anexo. A lista de outros órgãos e tecidos a examinar 
neste caso (além dos tecidos do aparelho respiratório a conservar já espe ­
cificados) é a estabelecida para a exposição por via oral.
 
Histopatologia  
56. A referência 40 contém orientações sobre as melhores práticas a seguir na 
realização de estudos de patologias toxicológicas. Os exames devem incidir, no mínimo, nos seguintes tecidos:
 
— todos os tecidos dos animais dos grupos de controlo e dos grupos 
expostos à dose mais elevada,  
— todos os tecidos dos animais que morreram ou foram eutanasiados du ­
rante o estudo,  
— todos os tecidos com anomalias macroscópicas, incluindo tumores,  
— os tecidos que revelaram alterações histopatológicas atribuíveis à expo ­
sição ao produto químico em estudo nos animais dos grupos expostos à 
dose mais elevada, de todos os animais de todos os outros grupos 
expostos a uma dose do produto químico,  
— no caso dos órgãos emparelhados (por exemplo, os rins e as glândulas 
suprarrenais), devem examinar-se ambos.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 499
 
DADOS E RELATÓRIOS (TOXICIDADE CRÓNICA E CARCINOGENI ­
CIDADE)  
Dados  
57. Deve apresentar-se os dados por animal relativos a todos os parâmetros 
avaliados. Esses dados devem ainda ser resumidos num quadro, indicando, para cada grupo estudado, o número de animais no início do ensaio, o 
número de animais que morreram durante o ensaio ou que foram eutanasia ­
dos, a hora de cada morte ou eutanásia, o número de animais que apresen ­
taram sinais de toxicidade, a descrição dos sinais de toxicidade observados, nomeadamente o momento do seu aparecimento e a sua duração e intensi ­
dade, o número de animais que apresentaram lesões, o tipo de lesões e a 
percentagem de animais que apresentaram cada tipo de lesão. Devem cons ­
tar dos quadros de resumo dos dados as médias e os desvios-padrão (no caso dos dados contínuos) correspondentes aos animais que apresentaram 
lesões ou efeitos tóxicos, além do grau das lesões.
 
58. Os dados históricos de controlo podem ser úteis para a interpretação dos 
resultados do estudo, por exemplo, quando houver indicações de que os 
dados provenientes dos grupos de controlo em paralelo divergem significa ­
tivamente de dados recentes referentes a animais de controlo da mesma colónia e da mesma unidade de ensaio. Caso sejam avaliados dados histó ­
ricos de controlo, estes devem provir do mesmo laboratório, reportar-se a 
animais da mesma idade e estirpe e ter sido gerados nos cinco anos ante ­
riores ao estudo em causa.
 
59. Quando pertinente, deve avaliar-se os resultados numéricos por um método 
estatístico corrente adequado. Os métodos estatísticos e os dados a analisar 
devem ser escolhidos no planeamento do estudo (ponto 9). Nessa escolha, 
deve prever-se os ajustamentos em função do grau de sobrevivência que se revelem necessários.
 
60. Dados a constar do relatório dos ensaios:  
Produto químico em estudo:  
— natureza física, grau de pureza e propriedades físico-químicas,  
— dados de identificação,  
— proveniência,  
— número de lote,  
— boletim de análises químicas.  
Veículo (se for o caso):  
— justificação da escolha do veículo (se não for água).  
Animais estudados:  
— espécie e estirpe utilizadas e justificação da opção tomada,  
— número, idade e sexo dos animais no início dos ensaios,  
— proveniência, condições de alojamento, dieta, etc.,  
— peso de cada animal no início do ensaio.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 500
 
Condições de realização dos ensaios:  
— fundamentação da via de administração e das doses escolhidas,  
— métodos estatísticos utilizados na análise dos dados, se for o caso,  
— elementos relativos à formulação do produto químico em estudo/à in ­
corporação do mesmo na dieta fornecida aos animais,  
— dados analíticos relativos à concentração atingida, estabilidade e homo ­
geneidade da preparação,  
— via de administração e elementos relativos à administração do produto 
químico em estudo,  
— no caso dos estudos por inalação: exposição unicamente nasal ou de 
corpo inteiro,  
— doses reais (mg/kg de peso corporal/dia) e, se for caso disso, fator de 
conversão entre a concentração do produto químico em estudo na dieta 
ou na água de beber (mg/kg ou ppm) e a dose real,  
— elementos sobre a qualidade dos alimentos e da água.  
Resultados (apresentar quadros de resumo dos dados e os dados por ani ­
mal):  
Informações gerais  
— dados de sobrevivência,  
— pesos corporais e alterações de peso corporal,  
— consumo de alimentos, cálculos da eficiência alimentar (se efetuados) e 
consumo de água (se for caso disso),  
— dados toxicocinéticos, se disponíveis,  
— resultados oftalmoscópicos, se disponíveis,  
— resultados hematológicos, se disponíveis,  
— resultados de química clínica, se disponíveis.  
Resultados dos exames clínicos  
— sinais de toxicidade,  
— incidência (e, se quantificada, intensidade) das anomalias observadas,  
— natureza, intensidade e duração dos sinais clínicos observados (reversí ­
veis ou irreversíveis).  
Dados das autópsias  
— peso corporal terminal,  
— peso de cada órgão (e relação com o peso corporal, se for caso disso),  
— resultados das autópsias; incidência e intensidade das anomalias.  
Histopatologia  
— observação de efeitos histopatológicos não neoplásicos,  
— observação de efeitos histopatológicos neoplásicos,  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 501
 
— correlação entre as observações macroscópicas e os resultados micros ­
cópicos,  
— descrição pormenorizada dos resultados histopatológicos resultantes da 
exposição dos animais ao produto químico em estudo, incluindo a clas ­
sificação de intensidade,  
— relatórios do eventual exame das lâminas por pares especialistas.  
Tratamento estatístico dos resultados, se for caso disso.  
Discussão dos resultados, nomeadamente:  
— discussão dos eventuais modelos,  
— relações dose-resposta,  
— dados históricos de controlo,  
— análise dos dados disponíveis sobre modos de ação,  
— determinação das doses de referência, do NOAEL e do LOAEL,  
— importância para o ser humano.  
Conclusões.  
REFERÊNCIAS:  
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(6) Capítulo B.27 deste anexo, "Ensaio de toxicidade oral subcrónica — Estudo 
de toxicidade oral de dose repetida em espécies não roedoras com a duração 
de 90 dias".  
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Toxicity and Carcinogenicity Studies, Supporting Test Guidelines 451, 452 and 453 — segunda edição. Series on Testing and Assessment No. 116. Disponível no sítio  web  público de  Test Guidelines  da OCDE 
(www.oecd.org/env/testguidelines).
 
(8) OCDE (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Series on Testing and Assessment No. 39. ENV/JM/MONO(2009)28, OC ­
DE, Paris.  
(9) Capítulo B.8 deste anexo, "Toxicidade subaguda por inalação: Estudo de 28 
dias".  
(10) Capítulo B.29 deste anexo, "Toxicidade subcrónica por inalação: Estudo de 
90 dias".  
(11) Capítulo B.9 deste anexo, "Toxicidade (dérmica) da dose repetida (28 
dias)".  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 502
 
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Apêndice 1  
DEFINIÇÃO  
Produto químico em estudo:  qualquer substância ou mistura à qual seja 
aplicado este método de ensaio.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 505
 
B.34.  TESTE DE TOXICIDADE SOBRE A REPRODUÇÃO EM UMA 
GERAÇÃO  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
1.2. DEFINIÇÕES  
Ver Introdução Geral, parte B.  
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Nenhuma.  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Administra-se a substância a testar em várias doses graduais a vários 
grupos de animais, machos e fêmeas. Os machos deverão ser tratados 
durante o crescimento e pelo menos um ciclo espermatogénico com ­
pleto (cerca de 56 dias no ratinho e 70 dias no rato) de forma a que a 
substância testada provoque um efeito nocivo eventual na esperma ­
togénese.  
As fêmeas da geração progenitora (P) deverão ser tratadas durante 
pelo menos dois ciclos do estro para permitir que a substância tes ­
tada provoque alguns efeitos nocivos no estro. Os animais são em seguida acasalados. Administra-se a substância testada aos animais 
de ambos os sexos durante o período de acasalamento, e depois 
unicamente às fêmeas durante a gestação e o período de aleitamento. Se se administrar a substância por inalação será necessário modifi ­
car-se o método.
 
1.5. CRITÉRIOS QUALITATIVOS  
Nenhum.  
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Preparativos  
Antes do ensaio, os animais adultos jovens e sãos são distribuídos ao 
acaso pelos grupos tratados e de controlo. Os animais são mantidos 
nas condições de alojamento e alimentação da experiência pelo me ­
nos durante cinco dias antes do início do teste. Recomenda-se a administração da substância a testar na alimentação ou na água de 
beber. Podem aceitar-se igualmente outras vias de administração. 
Deve utilizar-se o mesmo método de administração em todos os animais e durante toda a experiência. Se for utilizado um veículo ou outros aditivos para facilitar a administração devem estes ser 
comprovadamente isentos de efeitos tóxicos. O tratamento deverá 
ser efectuado durante os sete dias da semana.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 506
 
A n i m a i s d e e x p e r i ê n c i a  
Selecção da espécie  
As espécies preferidas são o rato ou o ratinho. Devem utilizar-se 
animais sãos, não sujeitos a experiências anteriores. As estirpes com taxas de fecundidade baixa não deverão ser utilizadas. Serão especi ­
ficadas a espécie, a estirpe, o sexo, o peso e/ou a idade dos animais 
de experiência.
 
Para avaliar a fecundidade de modo adequado deverão ser estudados 
tanto machos como fêmeas. Todos os animais tratados e de controlo 
deverão estar desmamados antes do início do tratamento.  
Número e sexo  
Cada grupo tratado e cada grupo de controlo deve comportar um 
número de animais suficientes para obter cerca de 20 fêmeas grávi ­
das de termo ou próximas deste.  
O objectivo é a obtenção de um número de gestações e de ninhadas 
suficientes para permitir uma avaliação significativa do efeito da substância sobre a fecundidade, a gestação, o comportamento mater ­
nal dos animais da geração P bem como o aleitamento, o cresci ­
mento e o desenvolvimento da geração F
 1 desde a concepção até ao 
desmame.  
C o n d i ç õ e s e x p e r i m e n t a i s  
A alimentação e a água serão fornecidas  ad libitum.  Quando as 
fêmeas grávidas estiverem próximas do termo deverão ser colocadas 
em gaiolas individuais de parto ou de maternidade podendo ser-lhes fornecidos os materiais de nidificação necessários.
 
D o s e s  
Devem utilizar-se pelo menos três grupos tratados e um grupo de 
controlo. Se for utilizado um veículo para a administração da subs ­
tância a testar, o grupo de controlo deverá receber o volume máximo de veículo que tenha sido utilizado. Se uma substância testada causar 
diminuição da ingestão de alimentos e da sua assimilação, pode 
tornar-se necessário um grupo de controlo negativo. Nas condições ideais, a não ser que existam limitações devidas à natureza físico- -química ou efeitos biológicos da substância testada, a dose máxima 
deverá produzir um efeito tóxico mas não a morte dos animais 
progenitores (P). A(s) dose(s) intermédia(s) deverá (deverão) induzir os efeitos tóxicos mínimos atribuíveis à substância a testar e a dose mínima não deverá produzir nenhum efeito nocivo observável nos 
progenitores ou na sua descendência. Quando a substância for admi ­
nistrada por  gavage  ou cápsula, a dose administrada a cada animal 
deverá ser calculada em função do peso corporal de cada um e ajustada semanalmente, tendo em conta modificações desse peso. 
No caso das fêmeas durante a gravidez, as doses podem ser calcu ­
ladas em função do peso corporal no dia 0 ou 6, se desejado.
 
T e s t e l i m i t e  
No caso de substâncias pouco tóxicas, se uma dose de pelo menos 
1 000 mg/kg de peso não provocar nenhuns sinais de interferência 
com a capacidade de reprodução, podem considerar-se desnecessá ­
rios estudos com outras doses. Se um estudo preliminar da dose máxima, com toxicidade materna evidente, não mostrar efeitos no ­
civos na fertilidade, poderão considerar-se desnecessários estudos 
com outras doses.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 507
 
Procedimentos do teste  
P l a n o d e e x p e r i ê n c i a  
A substância a testar deverá ser administrada diariamente aos machos 
progenitores (P) assim que atingirem a idade de cinco a nove sema ­
nas depois do desmame e de um período de adaptação de, pelo 
menos, cinco dias. Nos ratos o tratamento é prosseguido durante 
10 semanas antes do período de acasalamento (nos ratinhos durante oito semanas). Os machos deverão ser sacrificados e examinados ou no fim do período de acasalamento ou em alternativa mantidos vivos 
prosseguindo-se com a administração da substância na comida, com 
vista à produção eventual de uma segunda ninhada, devendo neste caso ser sacrificados e examinados um pouco antes do fim do estu ­
do. No caso das fêmeas (P) o tratamento deverá começar depois de, 
pelo menos, cinco dias de adaptação e ser prosseguido durante, pelo 
menos, duas semanas antes do acasalamento. As fêmeas P deverão continuar a receber o seu tratamento diário durante as três semanas do período de acasalamento e gestação até ao desmame dos filhos 
F
 1 . Poderão admitir-se modificações do esquema de administração 
no caso de se disporem de outras informações sobre a substância testada, como a indução do metabolismo ou bioacumulação.
 
P r o c e s s o d e a c a s a l a m e n t o  
Nos estudos de toxicidade sobre a reprodução, os acasalamentos 
poderão ser feitos seja 1:1 (um macho com uma fêmea) seja 1:2 
(um macho com duas fêmeas).  
No caso de um acasalamento 1:1 deve colocar-se a fêmea sempre 
com o mesmo macho até ficar grávida ou durante três semanas. Deverão examinar-se as fêmeas todas as manhãs para verificar a presença de esperma ou de rolhão vaginal. O dia 0 da gestação é 
definido como o dia em que se verifique a presença de rolhão 
vaginal ou de esperma.
 
Os casais em que o acasalamento não tiver sucesso devem ser ava ­
liados para determinar as causas da aparente esterilidade.  
Isto pode implicar procedimentos como novo acasalamento com 
animais que já tenham procriado, proceder a um exame microscópico dos órgãos de reprodução ou ao exame do ciclo do estro ou da 
espermatogénese.
 
N ú m e r o d e a n i m a i s p o r n i n h a d a  
Permite-se que os animais usados no estudo de fertilidade dêem à luz 
normalmente e criem a sua descendência até ao desmame sem ho ­
mogeneização das ninhadas.  
Se se fizer uma homogeneização das ninhadas sugere-se o seguinte 
método: entre o dia 1 e o dia 4 depois do nascimento, o número de 
animais por ninhada pode ser ajustado eliminando-se por selecção as crias suplementares a fim de obter, na medida do possível, quatro fêmeas e quatro machos por ninhada.
 
Se o número de machos e de fêmeas não permitir obter quatro crias 
de cada sexo por ninhada pode aceitar-se um ajustamento parcial 
(por exemplo cinco machos e três fêmeas). Não são possíveis ajus ­
tamentos nas ninhadas com menos de oito crias.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 508
 
O b s e r v a ç õ e s  
Deve observar-se cada animal pelo menos uma vez por dia durante 
todo o período do ensaio. Deverão registar-se as modificações de comportamento significativas, sinais de parto difícil ou prolongado, bem como qualquer sinal de toxicidade incluindo a mortalidade. 
Durante os períodos de pré-acasalamento e acasalamento deve deter ­
minar-se diariamente o consumo alimentar. Depois do parto e du ­
rante o aleitamento deverá determinar-se o consumo alimentar (e o consumo de água quando o teste da substância for administrado na 
água para beber) no dia de se pesarem as crias. Os machos e fêmeas 
progenitores deverão ser pesados no primeiro dia do tratamento e, em seguida, uma vez por semana. Estas observações serão registadas individualmente para cada animal adulto.
 
Calcula-se a duração da gestação a partir do dia 0 da gravidez. Cada 
ninhada deverá ser examinada o mais cedo possível, após o parto, 
para se determinar o número e o sexo das crias, os nado-mortos, os nado-vivos e a presença de anomalias macroscópicas.
 
As crias mortas e as crias sacrificadas no dia 4 deverão ser conser ­
vadas e examinadas para detectar eventuais anomalias. Devem con ­
tar-se as crias vivas e pesar as ninhadas na manhã após o nascimen ­
to, bem como no 4.  o e 7.  o dias e, em seguida, semanalmente até ao 
fim do estudo, sendo os animais nessa altura pesados individualmen ­
te. 
Deverão ser registadas as alterações físicas ou de comportamento nos 
progenitores do sexo feminino e na sua descendência.  
P a t o l o g i a  
A u t ó p s i a  
No momento do sacrifício ou da morte, no decurso do estudo, os 
animais da geração P deverão ser examinados macroscopicamente para se detectar qualquer anomalia estrutural ou alteração patológica, 
dedicando-se uma atenção especial aos órgãos do aparelho reprodu ­
tor. Devem procurar-se eventuais malformações nas crias mortas ou moribundas.
 
H i s t o p a t o l o g i a  
Devem conservar-se para exame microscópico os ovários, o útero, o 
colo uterino, a vagina, os testículos, os epidídimos, as vesículas 
seminais, a próstata, a glândula coagulante, a hipófise e o(s) ór ­
gão(s)-alvo de todos os animais P. No caso de estes órgãos não 
terem sido examinados noutros estudos com doses repetidas, deverão 
ser feitos exames histológicos a todos os animais do grupo tratados com dose mais elevada, do grupo de controlo e aos animais mortos durante o estudo, quando tal for praticável.
 
Os órgãos que apresentarem alterações nestes animais serão também 
examinados em todos os outros animais P. Neste caso deverá efec ­
tuar-se um exame microscópico de todos os tecidos que apresenta ­
rem alterações patológicas macroscópicas. Como foi já sugerido no procedimento para o acasalamento, os órgãos reprodutores dos ani ­
mais suspeitos de esterilidade poderão ser submetidos a um exame 
microscópico.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 509
 
2. RESULTADOS  
Os resultados podem ser resumidos em quadros, indicando para cada 
grupo experimental o número de animais no início do estudo, o número de machos férteis, o número de fêmeas grávidas, os diversos 
tipos de alterações, e a percentagem de animais apresentando cada 
tipo de alteração.
 
Se possível, os resultados numéricos deverão ser avaliados com um 
método estatístico apropriado. Pode ser utilizado qualquer método 
estatístico reconhecido.  
3. RELATÓRIO  
3.1. RELATÓRIO DO TESTE  
O relatório do teste deverá também incluir as seguintes informações:  
— espécie/estirpe utilizada,  
— resposta tóxica por sexo e por dose, incluindo fertilidade, gesta ­
ção e viabilidade,  
— momento da morte no decurso do estudo ou indicação dos ani ­
mais sobreviventes no fim do estudo,  
— quadro apresentando os pesos de cada ninhada, o peso médio das 
crias e os pesos individuais das crias no fim do estudo,  
— efeito tóxico ou outro sobre a reprodução, a descendência e o 
crescimento pós-natal,  
— dia da observação de qualquer manifestação anormal e sua evo ­
lução subsequente,  
— peso corporal dos animais P,  
— resultados da autópsia,  
— descrição pormenorizada das observações microscópicas,  
— tratamento estatístico dos resultados, se necessário,  
— discussão dos resultados,  
— interpretação dos resultados.  
3.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO  
Ver Introdução Geral, parte B.  
4. REFERÊNCIAS  
Ver Introdução Geral, parte B.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 510
 
B.35.  ESTUDO DE TOXICIDADE SOBRE A REPRODUÇÃO EM 
DUAS GERAÇÕES  
1. MÉTODO  
O presente método baseia-se na publicação OECD TG 416 (2001) 
(normas de ensaio da OCDE).  
1.1. INTRODUÇÃO  
O presente método de ensaio de toxicidade sobre a reprodução em 
duas gerações destina-se a fornecer informação geral sobre os efeitos 
de uma substância de ensaio na integridade e no desempenho dos sistemas reprodutores de machos e fêmeas, incluindo a função go ­
nadal, o ciclo do estro, o comportamento de acasalamento, a con ­
cepção, a gestação, a parturição, a lactação e o desmame, bem como 
sobre o crescimento e o desenvolvimento dos descendentes. O estudo pode também dar informações sobre os efeitos da substância de ensaio na morbidade e na mortalidade neonatais e fornecer dados 
preliminares relativos à toxicidade sobre o desenvolvimento pré-natal 
e pós-natal, podendo ainda servir de guia para ensaios subsequentes. Além de estudar o crescimento e o desenvolvimento da geração F
 l , 
este método de ensaio destina-se também a avaliar a integridade e o 
desempenho dos sistemas reprodutores dos machos e fêmeas dessa 
geração, bem como o crescimento e o desenvolvimento da geração F
 2 . Caso seja necessário obter informações suplementares relativas à 
toxicidade sobre o desenvolvimento e às deficiências de desempe ­
nho, o presente protocolo pode ser complementado pela introdução 
de partes de outros estudos descritos em métodos para avaliar a toxicologia sobre o desenvolvimento e/ou a neurotoxicidade sobre o desenvolvimento, conforme o caso; em alternativa, aqueles tópicos 
podem ser investigados em estudos independentes, com recurso aos 
métodos de ensaio adequados.
 
1.2. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
A substância de ensaio é administrada em doses graduais a vários grupos 
de machos e fêmeas. Os machos da geração P devem ser tratados durante 
o crescimento e durante pelo menos um ciclo espermatogénico completo (cerca de 56 dias no ratinho e 70 dias no rato), de forma a permitir a detecção de quaisquer efeitos nocivos na espermatogénese. Os efeitos 
sobre os espermatozóides são determinados por uma série de parâmetros 
(por exemplo, morfologia e mobilidade) e por exame histopatológico detalhado de preparações de tecidos. Caso tenham sido previamente 
realizados estudos de dose repetida de duração adequada (por exemplo, 
um estudo de 90 dias) que forneçam dados sobre a espermatogénese, não será necessário incluir os machos da geração P na avaliação. No entanto, recomenda-se que sejam guardadas amostras ou gravações digitais do 
esperma da geração P para possibilitar uma avaliação posterior. As fê ­
meas da geração P devem ser tratadas durante o crescimento e durante vários ciclos estrais completos, para permitir a detecção de quaisquer efeitos adversos causados pela substância de ensaio na normalidade do 
ciclo do estro. A substância de ensaio é administrada aos animais pro ­
genitores (P) durante o acasalamento, durante os períodos de gravidez resultantes e até ao desmame da descendência F
 1 . Nesta altura, a subs ­
tância de ensaio passa a ser administrada aos descendentes F  1 , que a 
deverão receber durante o crescimento até à idade adulta, o acasalamento 
e a produção da geração F  2 , até ao desmame da geração F  2 . 
Todos os animais devem ser objecto de observações clínicas e exa ­
mes patológicos para se detectarem sinais de toxicidade, devendo dedicar-se atenção especial aos efeitos sobre a integridade e o de ­
sempenho dos sistemas reprodutores masculino e feminino, bem 
como aos efeitos sobre o crescimento e o desenvolvimento da des ­
cendência.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 511
 
1.3. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.3.1.  Selecção da espécie animal  
A espécie preferida para ensaio é o rato. Caso se utilizem outras 
espécies, será necessário justificar o seu emprego e introduzir no 
método de ensaio as modificações apropriadas. Deve evitar-se a 
utilização de estirpes de fecundidade baixa ou em que se verifique frequentemente uma incidência elevada de deficiências de desenvol ­
vimento. No início do estudo, a diferença de peso entre os animais 
deverá ser mínima, não podendo ultrapassar 20 % do peso médio de 
cada sexo.
 
1.3.2.  Condições de alojamento e alimentação  
A temperatura do compartimento experimental dos animais deve ser 
de 22  o C (± 3  o C). A humidade relativa deverá ser de 50 %-60 %, 
embora sejam aceitáveis valores entre um mínimo de 30 % e um máximo que, preferivelmente, não deverá exceder 70 %, salvo du ­
rante os períodos de limpeza do compartimento. A iluminação deve 
ser artificial, com sequências de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. A alimentação pode basear-se em dietas de laboratório convencionais, com fornecimento ilimitado de água para beber. 
Quando a substância de ensaio for administrada pela alimentação, 
a escolha da dieta poderá ser condicionada pela necessidade de assegurar a dosagem adequada.
 
Os animais podem ser alojados individualmente ou em pequenos 
grupos do mesmo sexo. O acasalamento deve ocorrer em gaiolas 
adequadas para o efeito. Quando houver sinais de cópula, as fêmeas 
acasaladas devem ser colocadas em gaiolas individuais de parto ou de maternidade. Em alternativa, os ratos acasalados podem ser man ­
tidos em grupos pequenos, separando-se apenas um ou dois dias 
antes do parto. As fêmeas grávidas próximas do termo devem dispor 
dos materiais de nidificação apropriados e reconhecidos.
 
1.3.3.  Preparação dos animais  
Devem usar-se animais jovens e saudáveis, que tenham permanecido 
nas condições experimentais durante pelo menos cinco dias antes do ensaio para aclimatação e que não tenham sido sujeitos a experiên ­
cias anteriores. Os animais de ensaio devem ser caracterizados no 
que respeita à espécie, estirpe, proveniência, sexo, peso e/ou idade. 
Devem conhecer-se as relações de parentesco directo entre os ani ­
mais, de modo a evitar o acasalamento entre irmãos. Os animais devem ser distribuídos ao acaso pelos grupos de controlo e de tra ­
tamento (recomenda-se a estratificação por peso corporal). As gaiolas 
devem ser dispostas de forma a minimizar possíveis efeitos derivados do seu posicionamento. Cada animal deve receber um número de identificação individualizado. Estes procedimentos devem ser leva ­
dos a efeito antes do início da dosagem dos animais da geração P e 
por ocasião do desmame dos animais da geração F
 1 seleccionados 
para acasalamento. Devem manter-se registos da ninhada de origem de todos os animais seleccionados da geração F
 1 . Quando o ensaio 
envolve pesagem individual das crias ou quaisquer testes de desem ­
penho, as crias devem ser identificadas individualmente o mais cedo possível depois do nascimento.
 
No início da dosagem, os animais progenitores (P) devem ter cerca 
de cinco a nove semanas de idade. Os animais de todos os grupos de 
ensaio deverão ser, tanto quanto possível, uniformes quanto ao peso 
e à idade.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 512
 
1.4. PROCEDIMENTO  
1.4.1.  Número e sexo dos animais  
Cada grupo de ensaio e controlo deve comportar um número de 
animais suficiente para que se obtenham preferivelmente 20 ou 
mais fêmeas grávidas de termo ou próximas deste. Nos casos em 
que se utilizem substâncias que causam efeitos indesejáveis relacio ­
nados com o tratamento (por exemplo, esterilidade, toxicidade ex ­
cessiva na dose mais elevada), poderá não ser possível cumprir este 
requisito. O objectivo é a obtenção de um número de fêmeas grávi ­
das suficiente para garantir uma avaliação significativa do potencial da substância para afectar a fecundidade, a gravidez e o comporta ­
mento maternal, bem como o aleitamento, o crescimento e o desen ­
volvimento da prole F
 1 , desde a concepção até à maturidade, e o 
desenvolvimento da sua descendência (F  2 ) até ao desmame. Por esse 
motivo, a impossibilidade de obter o número desejado de animais 
prenhes (isto é, 20) não invalida necessariamente o estudo e deve ser 
avaliada caso a caso.  
1.4.2.  Preparação das doses  
Recomenda-se que a substância de ensaio seja administrada oral ­
mente (através da alimentação, na água de beber ou por  gavage ), 
excepto nos casos em que se considere mais apropriado utilizar outra 
via de administração (por exemplo, aplicação cutânea ou inalação).  
Se for necessário, a substância de ensaio pode ser dissolvida ou 
suspensa num agente de transporte apropriado. Recomenda-se que, sempre que possível, seja considerada em primeiro lugar a utilização 
de uma solução/suspensão aquosa; caso tal não seja viável, pode 
considerar-se o uso de uma solução/emulsão em óleo (por exemplo, óleo de milho); em última instância, poderá eventualmente recorrer- -se ao uso de soluções noutros agentes de transporte. Devem conhe ­
cer-se as características tóxicas dos agentes de transporte que não 
sejam a água. Deve determinar-se a estabilidade da substância de ensaio no agente de transporte.
 
1.4.3.  Dosagem  
Devem utilizar-se pelo menos três níveis de dose e um controlo 
simultâneo. A escolha do nível de dose máximo deve ter como 
objectivo produzir um efeito tóxico, mas não a morte ou sofrimento 
forte, salvo se existirem limitações impostas pela natureza físico- -química ou pelas propriedades biológicas da substância de ensaio. Normalmente, consideram-se aceitáveis estudos com mortalidade 
inesperada, desde que a taxa de mortalidade dos animais progenitores 
(P) seja inferior a cerca de 10 %. Deve seleccionar-se uma sequência descendente de níveis de dose que permita detectar qualquer efeito relacionado com a dosagem e determinar o nível sem efeitos adver ­
sos observáveis (NSEAO). Em muitos casos, a melhor forma de 
estabelecer estas sequências consiste no espaçamento das doses em série geométrica, usando factores de dois ou de quatro. A adição de um quarto grupo de ensaio é muitas vezes preferível ao uso de 
intervalos muito grandes entre as dosagens (ou seja, com um factor 
superior a 10). Quando a substância de ensaio é administrada na alimentação, o espaçamento entre as doses não deve ser superior a um factor de três. A escolha dos níveis de dose deverá considerar 
todos os dados de toxicidade existentes, em especial os resultados de 
estudos de dose repetida, devendo ainda levar em conta quaisquer informações relativas ao metabolismo e à cinética dá substância de ensaio ou de substâncias relacionadas. Estas informações poderão 
também ser usadas para demonstrar a adequação do regime de do ­
sagem.
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O grupo de controlo deve ser um grupo não sujeito a tratamento ou, 
se for usado um agente de transporte para administrar a substância de 
ensaio, um grupo de controlo do agente de transporte. Os animais do grupo de controlo devem ser tratados da mesma maneira que os animais dos grupos de ensaio, com excepção do tratamento com a 
substância de ensaio. Se for usado um agente de transporte, o grupo 
de controlo deverá receber o volume máximo de agente de transporte utilizado no ensaio. Se a substância de ensaio for administrada na alimentação e causar uma diminuição da ingestão de alimentos e da 
sua assimilação, poderá ser necessário utilizar um grupo de controlo 
negativo (submetido ao mesmo regime alimentar reduzido); em al ­
ternativa, poderão usar-se os dados de estudos controlados destinados a avaliar os efeitos da diminuição do consumo de alimento nos 
parâmetros reprodutores.
 
Deverão ser tomadas em consideração as seguintes características do 
agente de transporte e outros aditivos: efeitos na absorção, distribui ­
ção, metabolismo ou retenção da substância de ensaio; efeitos nas 
propriedades químicas da substância de ensaio susceptíveis de alterar 
as suas características tóxicas; e efeitos no consumo de alimentos, na ingestão de água ou no estado nutricional dos animais.
 
1.4.4.  Ensaio-limite  
Se um estudo com um nível de dose oral de pelo menos 1 000 
mg/kg de peso corporal/dia (ou uma percentagem equivalente nos 
alimentos ou na água de beber, caso se recorra a um destes tipos de 
administração), realizado de acordo com os procedimentos descritos neste estudo, não provocar efeitos tóxicos observáveis nos animais progenitores nem na sua prole e se, para além disso, os dados exis ­
tentes sobre compostos estrutural e/ou metabolicamente relacionados 
com a substância de ensaio não sugerirem a possível ocorrência de toxicidade, poderá considerar-se desnecessário realizar um ensaio completo com vários níveis de dose. O ensaio-limite é sempre váli ­
do, excepto nos casos em que se preveja exposição humana e em 
que seja necessário testar um nível de dose oral mais elevado. Quando se usam outras formas de administração, como inalação ou aplicação cutânea, as propriedades físico-químicas da substância 
de ensaio (por exemplo, a solubilidade) são muitas vezes indicativas 
e limitantes do nível máximo de exposição praticável.
 
1.4.5.  Administração das doses  
Os animais devem ser tratados com a substância de ensaio durante os 
sete dias da semana. A forma de administração preferida é a via oral (alimentação, água de beber ou  gavage ). Se for usada outra via de 
administração, deverão ser indicadas as razões subjacentes à sua 
escolha; neste caso, poderá ser necessário introduzir modificações apropriadas no método de ensaio. Deve utilizar-se o mesmo método de administração em todos os animais durante o período experimen ­
tal apropriado. A administração por  gavage  deve ser feita com uma 
sonda gástrica. O volume de líquido administrado numa toma não deve exceder 1 ml/100 g de peso corporal (o volume máximo para óleo de milho é de 0,4 ml/100 g de peso corporal); exceptuam-se as 
soluções aquosas, que podem ser administradas na proporção de 
2 ml/100 g de peso corporal. Deve minimizar-se a variabilidade do volume de ensaio efectuando ajustes nas concentrações, de forma a assegurar a constância do volume em todos os níveis de dose; ex ­
ceptuam-se os casos em que se utilizam substâncias irritantes ou 
corrosivas, que normalmente exercem efeitos exacerbados quando aplicadas em concentrações mais elevadas. Normalmente, nos estu ­
dos com administração por  gavage , as crias amamentadas só rece ­
bem a substância de ensaio de forma indirecta, através do leite; a 
dosagem directa inicia-se apenas na altura do desmame. Nos estudos em que a substância de ensaio é administrada na alimentação ou na água de beber, as crias podem receber uma quantidade adicional da 
substância de ensaio quando, na última semana do período de lac ­
tação, começam a comer por si próprias.
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É importante assegurar que as quantidades de substância de ensaio 
administradas através da alimentação ou da água de beber não in ­
terferem nas exigências normais de nutrição ou de consumo de água. Quando a substância de ensaio for incorporada na alimentação, pode utilizar-se uma concentração alimentar constante (ppm) ou, alterna ­
tivamente, um nível de dose constante em relação ao peso corporal 
dos animais; deve especificar-se o método escolhido para o ensaio. No caso de uma substância administrada por  gavage , a dose deve ser 
administrada todos os dias à mesma hora, devendo ser ajustada pelo 
menos uma vez por semana a fim de se manter uma dose constante 
em relação ao peso corporal do animal; estes ajustes deverão ser feitos tendo em conta os dados relativos à distribuição placentária.
 
1.4.6.  Plano da experiência  
A substância de ensaio começa a ser administrada diariamente aos 
machos e fêmeas progenitores (P) ao atingirem entre cinco e nove 
semanas de idade. A dosagem diária dos machos e fêmeas F  1 deve 
começar na altura do desmame; importa ter presente que, quando a substância de ensaio é administrada através da alimentação ou na 
água de beber, pode ocorrer exposição directa das crias da geração 
F
 1 à substância de ensaio durante o período de lactação. O trata ­
mento de ambos os sexos das gerações P e F  1 deve decorrer durante 
pelo menos 10 semanas antes do acasalamento, prosseguindo nas 
duas semanas do período de acasalamento. Os machos devem ser 
sacrificados e examinados quando deixam de ser necessários para avaliação de efeitos sobre o aparelho reprodutor. A dosagem das fêmeas progenitoras (P) deve continuar durante a gravidez, prolon ­
gando-se até ao desmame da prole F
 1 . O esquema de administração 
poderá ser modificado com base em informações relativas à subs ­
tância de ensaio, incluindo dados sobre toxicidade, indução de me ­
tabolismo ou bioacumulação. Normalmente, a dose a administrar a 
cada animal é calculada com base na determinação mais recente do 
seu peso corporal. No entanto, o ajuste das doses durante o último terço da gravidez deve ser feito com precaução.
 
O tratamento dos machos e fêmeas P e F  1 deve continuar até ao 
momento do sacrifício. Todos os machos e fêmeas adultos P e F  1 
devem ser sacrificados quando deixarem de ser necessários para 
avaliação de efeitos sobre a reprodução. Os animais da descendência 
F l não seleccionados para acasalamento e todos os descendentes F  2 
deverão ser sacrificados após o desmame.  
1.4.7.  Processo de acasalamento  
1.4.7.1.  Acasalamento dos progenitores (P)  
Para o acasalamento, cada fêmea deve ser colocada juntamente com 
um único macho pertencente ao mesmo nível de dosagem (acasala ­
mento 1:1) até que ocorra cópula ou tenham decorrido duas semanas. As fêmeas devem ser examinadas diariamente para verificar a pre ­
sença de esperma ou um rolhão vaginal. Considera-se o dia 0 de 
gravidez aquele em que se observa um rolhão vaginal e/ou esperma. 
Quando a tentativa de acasalamento for mal sucedida, poderá tentar- -se um novo acasalamento das fêmeas com machos do mesmo grupo comprovadamente aptos a procriar. Os pares acasalados devem ser 
identificados nos dados do ensaio de forma inequívoca. Deve evitar- 
-se o acasalamento entre irmãos.
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1.4.7.2.  Acasalamento de F  1 
Para o acasalamento da descendência F  1 e produção da geração F  2 , 
devem seleccionar-se pelo menos um macho e uma fêmea de cada ninhada, em altura de desmame, para acasalamento com outras crias 
pertencentes ao mesmo nível de dose mas provenientes de ninhadas 
diferentes. A selecção das crias de cada ninhada deve ser feita de forma aleatória, desde que não se verifiquem diferenças significativas no peso corporal ou na aparência dos animais. Caso se observem 
essas diferenças, devem seleccionar-se os animais mais representati ­
vos de cada ninhada. Embora a forma mais correcta de selecção seja aquela que se baseia no peso corporal, em determinadas circunstân ­
cias poderá ser mais conveniente recorrer à aparência. A descendên ­
cia F
 1 só deve acasalar depois de ter atingido a maturidade sexual 
completa.  
Os casais sem descendência devem ser avaliados para determinar 
as causas da aparente esterilidade. Esta avaliação pode envolver novas tentativas de acasalamento com outros machos ou fêmeas 
comprovadamente aptos a procriar, o exame microscópico dos 
órgãos reprodutores e a observação dos ciclos do estro ou da espermatogénese.
 
1.4.7.3.  Segundo acasalamento  
Em determinadas circunstâncias, tais como situações em que se ve ­
rifiquem alterações na dimensão da ninhada relacionadas com o tratamento ou em que se observe um efeito ambíguo no primeiro 
acasalamento, recomenda-se que os adultos P ou F
 1 acasalem de 
novo para produzir uma segunda ninhada. O segundo acasalamento de fêmeas ou machos que não tenham produzido ninhadas deverá ser feito com reprodutores comprovados do sexo oposto. Se numa das 
gerações for estritamente necessário produzir uma segunda ninhada, 
os animais devem acasalar novamente cerca de uma semana depois do desmame da última ninhada.
 
1.4.7.4.  Dimensão das ninhadas  
Os animais devem poder parir normalmente e criar os seus descen ­
dentes até ao desmame. A uniformização do tamanho das ninhadas é opcional; caso seja feita, deve descrever-se pormenorizadamente o 
método usado.
 
1.5. OBSERVAÇÕES  
1.5.1.  Observações clínicas  
Deve efectuar-se diariamente uma observação clínica geral; nos casos 
em que a dose é administrada por  gavage , a escolha do momento da 
observação deve tomar em consideração o período de efeitos máximos previsto que se verifica após a administração da dose. Devem registar-se quaisquer modificações de comportamento, sinais de parto difícil ou 
prolongado e todos os sinais de toxicidade. Deverá efectuar-se uma ins ­
pecção adicional mais pormenorizada de cada animal pelo menos uma vez por semana, que por conveniência poderá coincidir com o momento da pesagem. Para além disso, cada animal deve ser observado duas vezes 
por dia (ou uma vez por dia durante o fim-de-semana, quando for con ­
veniente) para avaliar morbidade e mortalidade.
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1.5.2.  Peso corporal e consumo de alimento/água dos animais progeni ­
tores  
Os animais progenitores (P e F  1 ) devem ser pesados no primeiro dia de 
tratamento e, em seguida, pelo menos uma vez por semana. O peso das 
fêmeas progenitoras (P e F  1 ) deve ser determinado, no mínimo, nos dias 
0, 7, 14 e 20 ou 21 da gestação, durante a lactação (nos dias coincidentes com a pesagem das crias) e no dia do sacrifício. Estas observações devem ser registadas individualmente para cada animal adulto. Durante 
os períodos de pré-acasalamento e gestação, o consumo de alimento deve 
ser medido pelo menos semanalmente. Se a substância de ensaio for administrada na água, o consumo de água deve ser determinado pelo 
menos uma vez por semana.
 
1.5.3.  Ciclo do estro  
A duração e a normalidade do ciclo do estro nas fêmeas P e F  1 são 
avaliadas por observação de esfregaços vaginais obtidos antes do acasalamento, durante o acasalamento (opcional) e até existirem evi ­
dências de cópula. A remoção de células vaginais/cervicais deve ser 
feita cuidadosamente, de modo a evitar o distúrbio da mucosa e a subsequente indução de uma gravidez fictícia (1).
 
1.5.4.  Parâmetros dos espermatozóides  
No momento do sacrifício, deverá registar-se o peso dos testículos e 
do epidídimo de todos os machos P e F  1 após o sacrifício. Deve 
reservar-se um exemplar de cada tipo de órgão para exame histopa ­
tológico (ver secções 1.5.7 e 1.5.8.1). Para a contagem de esperma ­
tídios e de espermatozóides das reservas do conduto epididimário 
resistentes a homogeneização, deverão usar-se, respectivamente, os testículos e os epidídimos de subgrupos de pelo menos 10 machos de cada grupo P e F
 1 . Deve colher-se o esperma do conduto epididi ­
mário ou do canal deferente dos animais desses subgrupos para 
avaliar a mobilidade e a morfologia dos espermatozóides. Se forem detectados efeitos relacionados com o tratamento ou se estudos an ­
teriores indicarem possíveis efeitos na espermatogénese, deverão 
analisar-se os espermatozóides de todos os machos de cada grupo 
de dose; caso contrário, a contagem pode restringir-se aos machos P e F
 1 dos grupos de controlo e de dose máxima.  
Deve proceder-se à contagem do número total de espermatídios tes ­
ticulares e de espermatozóides do conduto epididimário resistentes a homogeneização (2) (3). O número de espermatozóides das reservas 
do conduto pode ser determinado considerando o volume e a con ­
centração de esperma na suspensão usada para a análise qualitativa e efectuando a contagem de espermatozóides após maceração e/ou homogeneização do restante tecido do conduto. As contagens devem 
ser feitas nos subgrupos de machos seleccionados de todos os grupos 
de dosagem e ser levadas a efeito imediatamente após o sacrifício dos animais, excepto se forem feitas gravações de vídeo ou digitais ou se os animais forem congelados para análise posterior. Nestes 
casos, podem analisar-se primeiro os grupos de controlo e de dose 
máxima; se não se observarem efeitos relacionados com o tratamento (por exemplo, efeitos na contagem, mobilidade ou morfologia dos espermatozóides), não será necessário avaliar os restantes grupos de 
dose; caso contrário, deverão analisar-se também os grupos de do ­
sagem inferior.
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A mobilidade dos espermatozóides do epidídimo (ou do canal defe ­
rente) deve ser analisada ou gravada em vídeo imediatamente após o 
sacrifício. O esperma deve ser retirado o mais rapidamente possível, enquanto os danos são mínimos; seguidamente, deve ser diluído para uma análise de mobilidade usando métodos aprovados (4). A deter ­
minação da percentagem de espermatozóides progressivamente mó ­
veis poderá ser tanto subjectiva como objectiva. Quando se realiza uma análise de mobilidade assistida por computador (5) (6) (7) (8) (9) (10), a determinação da mobilidade progressiva baseia-se em 
valores críticos definidos pelo utilizador em relação à velocidade 
média e à rectitude da trajectória, ou índice linear. Se existirem gravações em vídeo de amostras (11) ou outras imagens obtidas durante a necropsia, pode efectuar-se posteriormente a análise dos 
machos P e F
 1 dos grupos de controlo e de dose máxima. Se não se 
observarem efeitos relacionados com o tratamento, será desnecessá ­
rio avaliar os restantes grupos de dose; caso contrário, deverão ana ­
lisar-se também os grupos de dosagem inferior. Caso não existam 
imagens de vídeo ou digitais, todas as amostras de todos os grupos 
de tratamento devem ser analisadas no momento da necropsia.  
Deve efectuar-se a análise morfológica de uma amostra de espermato ­
zóides epididimários (ou do canal deferente). Depois de fixados, os 
espermatozóides (pelo menos 200 por amostra) são examinados em 
preparações húmidas (12) e classificados como normais ou anormais. As anomalias morfológicas em espermatozóides incluem fusão, cabeças isoladas e ausência de cabeças e/ou de caudas. A avaliação deve ser feita 
nos subgrupos de machos seleccionados de todos os grupos de dose, quer 
imediatamente após o sacrifício dos animais, quer posteriormente, usando gravações de vídeo ou digitais. Depois de fixados, os esfregaços podem também ser guardados para análise posterior. Nestas situações, 
podem analisar-se primeiro os grupos de controlo e de dose máxima. Se 
não se observarem efeitos relacionados com o tratamento (por exemplo, efeitos na morfologia dos espermatozóides), não será necessário analisar os restantes grupos de dose; caso contrário, deverão analisar-se também 
os grupos de dosagem inferior.
 
Caso um dos parâmetros de avaliação de espermatozóides acima 
mencionados tenha sido examinado anteriormente num estudo sisté ­
mico de toxicidade de pelo menos 90 dias, poderá considerar-se 
desnecessário repetir a sua avaliação no estudo em duas gerações. 
Recomenda-se, no entanto, que se guardem amostras ou gravações digitais de espermatozóides da geração P para possibilitar uma ava ­
liação posterior, caso esta venha a ser necessária.
 
1.5.5.  Descendência  
Cada ninhada deve ser examinada o mais cedo possível após o parto 
(dia 0 de lactação) para se determinar o número e o sexo das crias, 
os nados-mortos, os nados-vivos e a presença de anomalias macros ­
cópicas. Caso não se encontrem maceradas, as crias encontradas mortas no dia 0 devem ser examinadas para determinar eventuais malformações e a causa da morte; estes animais devem manter-se 
conservados. As crias vivas devem ser contadas e pesadas indivi ­
dualmente no momento do nascimento (dia 0 de lactação) ou no dia 1; a partir daí, os pesos devem ser avaliados em dias regulares de pesagem, por exemplo, nos dias 4, 7, 14 e 21 de lactação. Devem 
registar-se as alterações físicas ou de comportamento observadas nas 
mães ou nos descendentes.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 518
 
A avaliação do desenvolvimento físico da descendência deve basear- 
-se principalmente no aumento do peso corporal. Outros parâmetros 
físicos (por exemplo, abertura dos olhos e ouvidos, erupção dos dentes, crescimento de pêlo) poderão dar informações suplementares. No entanto, estes dados deverão ser considerados preferencialmente 
no contexto da maturação sexual (por exemplo, idade e peso corporal 
no momento da abertura vaginal ou da separação bálano-prepucial) (13). Devem efectuar-se avaliações de desempenho (por exemplo, actividade motora, função sensorial e ontogenia dos reflexos) da 
descendência F
 1 antes e/ou depois do desmame, dedicando especial 
atenção aos aspectos relacionados com a maturação sexual, caso não tenham sido incluídas em estudos independentes. Deve determinar-se a idade da abertura vaginal e da separação do prepúcio nos animais 
recém-desmamados seleccionados para acasalamento. Se forem de ­
tectadas alterações na proporção entre os sexos ou no tempo de maturação sexual dos animais F
 1 , deverá medir-se a distância ano ­
genital das crias F  2 no dia 0 pós-natal.  
As observações de desempenho poderão ser omitidas em grupos que 
revelem claramente outros sinais de efeitos adversos (por exemplo, 
um decréscimo significativo na progressão do peso, etc.). Caso se realizem, as avaliações de desempenho não devem ser efectuadas em crias seleccionadas para acasalamento.
 
1.5.6.  Necropsia macroscópica  
Todos os animais progenitores (P e F  1 ), bem como todas as crias 
apresentando anomalias externas ou sinais clínicos e uma cria selec ­
cionada aleatoriamente das gerações F  1 e F  2 , escolhida ao acaso 
quanto ao sexo e à ninhada de origem, devem ser analisados ma ­
croscopicamente no momento do sacrifício ou da morte no decurso do estudo para se detectar qualquer anomalia estrutural ou alteração patológica; deverá dedicar-se uma atenção especial aos órgãos do 
aparelho reprodutor. Caso não se encontrem maceradas, as crias 
sacrificadas, em estado moribundo ou encontradas mortas devem ser examinadas para se determinarem eventuais malformações e/ou a causa da morte; estes animais devem manter-se conservados.
 
Devem examinar-se os úteros de todas as fêmeas primíparas a fim de 
se detectarem a presença e o número de locais de implantação; este 
exame deverá ser feito de forma a não comprometer a avaliação histopatológica.
 
1.5.7.  Pesagem dos órgãos  
No momento do sacrifício, deverá determinar-se o peso do corpo e 
dos seguintes órgãos de todos os animais progenitores P e F  1 (os 
órgãos pares devem ser pesados individualmente):  
— útero, ovários,  
— testículos, epidídimo (total e conduto),  
— próstata,  
— vesículas seminais, glândulas coagulantes e respectivos fluidos e 
próstata (como uma unidade),  
— cérebro, fígado, rins, baço, glândula pituitária, tiróide, glândulas 
supra-renais e órgãos-alvo conhecidos.  
Devem determinar-se os pesos corporais terminais das crias F  1 e F 2 
seleccionadas para necropsia, devendo ainda pesar-se o cérebro, o 
baço e o timo de uma cria seleccionada aleatoriamente quanto ao 
sexo e à ninhada de origem (ver secção 1.5.6).  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 519
 
Sempre que possível, a avaliação dos resultados da necropsia ma ­
croscópica e da pesagem de órgãos deverá ser efectuada tendo em 
conta os dados de outros estudos de dose repetida.  
1.5.8.  Histopatologia  
1.5.8.1.  Animais progenitores  
Devem ser fixados e conservados em meio adequado para exame 
histopatológico os seguintes órgãos e tecidos de animais progenitores 
(P e F  1 ) (ou amostras representativas):  
— vagina, útero com colo e ovários (preservados em fixador ade ­
quado);  
— um testículo (preservado em fixador de Bouin ou equivalente), 
um epidídimo, vesículas seminais, próstata e glândula coagulante;  
— órgão(s)-alvo previamente identificado(s) de todos os animais P e 
F 1 seleccionados para acasalamento.  
Serão objecto de um exame histopatológico completo os órgãos e 
tecidos conservados acima mencionados de todos os animais P e F  1 
dos grupos de controlo e de dose máxima seleccionados para acasa ­
lamento. A inspecção dos ovários dos animais P é opcional. Serão 
examinados os órgãos que apresentem alterações relacionadas com o tratamento dos animais dos grupos de doses média e baixa, a fim de auxiliar a determinação do NSEAO. Adicionalmente, deverá efec ­
tuar-se a avaliação histopatológica dos órgãos reprodutores de ani ­
mais dos grupos de dose média e baixa suspeitos de fertilidade reduzida (por exemplo, animais com insucesso no acasalamento, concepção, geração ou parto de uma descendência saudável, ou ani ­
mais com alterações nos ciclos do estro ou no número, mobilidade 
ou morfologia dos espermatozóides). Deverão examinar-se todas as lesões macroscópicas, tais como atrofias ou tumores.
 
Os testículos devem ser objecto de um exame histopatológico por ­
menorizado (por exemplo, usando fixador de Bouin, inclusão em 
parafina e secções transversais com 4-5 μm de espessura) a fim de 
se detectarem efeitos relacionados com o tratamento, tais como re ­
tenção de espermatídios, ausência de camadas ou tipos de células germinais, células gigantes multinucleadas ou perda de células es ­
permatogénicas para o lúmen (14). O exame do epidídimo intacto 
deve abranger a cabeça, o corpo e o conduto e pode efectuar-se por observação de uma secção longitudinal. A análise do epidídimo destina-se a detectar infiltração de leucócitos, alteração na prevalên ­
cia de tipos de células, tipos de células aberrantes e fagocitose de 
espermatozóides. Os órgãos reprodutores masculinos podem ser exa ­
minados recorrendo ao uso de PAS (ácido p-aminossalicílico) e co ­
loração com hematoxilina.
 
Os ovários no período pós-lactação devem conter folículos primor ­
diais e folículos em crescimento, bem como os grandes corpos ama ­
relos da lactação. O exame histopatológico deverá detectar uma di ­
minuição qualitativa da população de folículos primordiais. As fê ­
meas F  1 devem ser submetidas a uma avaliação quantitativa dos 
folículos primordiais; o número de animais, a selecção da secção 
do ovário e o tamanho da amostra seccionada devem ser adequados, 
do ponto de vista estatístico, para o procedimento de avaliação usa ­
do. O exame deve incluir a contagem do número de folículos pri ­
mordiais (que poderão estar combinados com pequenos folículos em 
crescimento) em ovários de tratamento e em ovários de controlo, 
para posterior comparação de resultados (15) (16) (17) (18) (19).  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 520
 
1.5.8.2.  Animais recém-desmamados  
Devem ser fixados e conservados em meio apropriado para exame 
histopatológico os tecidos e órgãos-alvo com anomalias macroscópi ­
cas de todas as crias que apresentem anomalias externas ou sinais 
clínicos, bem como de uma cria seleccionada aleatoriamente das 
gerações F  1 e F  2 , escolhida ao acaso quanto ao sexo e à ninhada 
de origem e que não tenha sido seleccionada para acasalamento. Deve efectuar-se a caracterização histopatológica completa do tecido 
conservado, dando especial atenção aos órgãos do aparelho reprodu ­
tor.
 
2. DADOS  
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS  
Os dados devem ser registados individualmente e resumidos na 
forma de quadros, indicando, em relação a cada grupo de ensaio e 
cada geração, o número de animais no início do ensaio, o número de animais encontrados mortos durante o ensaio ou sacrificados, o mo ­
mento de todas as mortes ou sacrifícios, o número de animais férteis, 
o número de fêmeas grávidas, o número de animais com manifesta ­
ções de toxicidade, uma descrição dos sinais de toxicidade observa ­
dos (incluindo o momento do aparecimento, a duração e a intensi ­
dade), os tipos de observações feitas nos progenitores e nos descen ­
dentes, os tipos de alterações histopatológicas e todos os dados relevantes relativos às ninhadas.
 
Os resultados numéricos devem ser avaliados com um método esta ­
tístico adequado e geralmente aceite; a escolha do método estatístico deve constar do planeamento do estudo e ser devidamente justifica ­
da. Os modelos estatísticos dose-resposta podem ser úteis para a 
análise dos dados. O relatório deve incluir informação suficiente 
sobre o método de análise e o programa informático usados para que um examinador/estatístico independente possa reavaliar e recons ­
tituir a análise.
 
2.2. ANÁLISE DOS RESULTADOS  
Os dados recolhidos no estudo de toxicidade sobre a reprodução em 
duas gerações, incluindo os relativos aos exames microscópicos e necropsias, deverão ser analisados em termos dos efeitos observados. A análise deverá considerar a relação (ou a ausência de relação) 
entre a dose da substância de ensaio e a presença ou ausência, 
incidência e gravidade de anomalias, incluindo lesões macroscópicas, órgãos identificados como alvos, alterações da fertilidade, anomalias clínicas, alterações da reprodução e procriação, alterações do peso 
corporal, efeitos na mortalidade e quaisquer outros efeitos tóxicos. A 
análise dos resultados do ensaio deve ainda ter em conta as proprie ­
dades físico-químicas da substância de ensaio, assim como informa ­
ção toxicocinética, se disponível.
 
Um ensaio de toxicidade sobre a reprodução bem elaborado deverá 
fornecer uma estimativa satisfatória do nível sem efeito e dar conhe ­
cimento dos efeitos adversos na reprodução, parturição, lactação e 
desenvolvimento pós-natal, incluindo o crescimento e o desenvolvi ­
mento sexual.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 521
 
2.3. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS  
A finalidade de um estudo de toxicidade sobre a reprodução em duas 
gerações consiste na obtenção de informações relativas aos efeitos de exposição repetida a uma substância durante todas as fases do ciclo 
reprodutor. Mais especificamente, o estudo fornece informações so ­
bre os parâmetros reprodutores, bem como sobre o desenvolvimento, o crescimento, a maturação e a sobrevivência da descendência. A interpretação dos resultados deve tomar em consideração dados de 
estudos subcrónicos, de desenvolvimento pré-natal e toxicocinéticos, 
entre outros eventualmente disponíveis. Os resultados deste estudo podem ser usados para avaliar a necessidade de realizar ensaios 
suplementares sobre uma substância química. A extrapolação dos 
resultados para a espécie humana tem uma validade limitada; mais adequado será usar os dados do ensaio para obter informação sobre níveis sem efeito e níveis toleráveis de exposição humana (20) (21) 
(22) (23).
 
3. RELATÓRIO  
3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deverá incluir as seguintes informações:  
Substância de ensaio:  
— natureza física e, se relevante, propriedades físico-químicas;  
— dados de identificação;  
— pureza.  
Agente de transporte (se apropriado):  
— caso o agente de transporte não seja água, uma justificação para a 
sua escolha.  
Animais de ensaio:  
— espécie/estirpe usada;  
— número, idade e sexo dos animais;  
— proveniência, condições de alojamento, dieta, materiais de nidi ­
ficação, etc.;  
— pesos individuais dos animais no início do ensaio.  
Condições de ensaio:  
— razões que presidiram à escolha dos diferentes níveis de doses;  
— informação pormenorizada sobre a formulação da substância de 
ensaio/preparação da dieta, concentrações atingidas;  
— estabilidade e homogeneidade da preparação;  
— informação pormenorizada sobre a administração da substância 
de ensaio;  
— conversão da concentração da substância de ensaio na dieta/água 
de beber (ppm) para a dose real (mg/kg de peso corporal/dia), se 
aplicável;  
— informação pormenorizada sobre a qualidade dos alimentos e da 
água.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 522
 
Resultados:  
— consumo de alimentos, consumo de água (se disponível), eficiên ­
cia do regime alimentar (aumento do peso corporal por grama de 
alimento consumido) e consumo da substância de ensaio pelos 
animais P e Fl, excepto durante o período de coabitação e du ­
rante pelo menos o último terço do período de lactação;  
— dados de absorção (se disponíveis);  
— dados dos pesos corporais dos animais P e F  1 seleccionados para 
acasalamento;  
— pesos das ninhadas e das crias;  
— peso corporal no momento do sacrifício e pesos absolutos e 
relativos dos órgãos dos animais progenitores;  
— natureza, gravidade e duração de efeitos detectados em observa ­
ções clínicas (reversíveis ou não);  
— momento da morte no decurso do estudo ou indicação dos ani ­
mais sobreviventes no termo da experiência;  
— dados de resposta tóxica por sexo e por dose, incluindo índices 
de acasalamento, fertilidade, gestação, nascimento, viabilidade e 
lactação; os números usados para calcular estes índices devem 
constar do relatório;  
— efeitos tóxicos (ou outros) na reprodução, descendência, cresci ­
mento pós-natal, etc.;  
— resultados da necropsia;  
— descrição pormenorizada de todas as observações histopatológi ­
cas; 
— número de fêmeas P e F  1 com ciclos normais e duração dos 
ciclos;  
— número total de espermatozóides no conduto epididimário; per ­
centagem de espermatozóides progressivamente móveis; percen ­
tagem de espermatozóides morfologicamente normais e percen ­
tagem de espermatozóides que apresentam cada uma das anoma ­
lias identificadas;  
— duração do acasalamento, incluindo o número de dias até à sua 
concretização;  
— duração do período de gestação;  
— número de implantações, corpos amarelos, dimensão da ninhada;  
— número de nados-vivos e de perdas pós-implantação;  
— número de crias com anomalias macroscópicas visíveis; deve 
indicar-se o número de animais de tamanho inferior ao normal, 
caso tenha sido determinado;  
— dados sobre aspectos físicos característicos das crias e outros 
dados de desenvolvimento pós-natal; deve ser dada uma justifi ­
cação relativamente à escolha dos aspectos físicos analisados;  
— dados sobre observações de desempenho nas crias e adultos, se 
aplicável;  
— tratamento estatístico dos resultados, se apropriado.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 523
 
Análise dos resultados.  
Conclusões, incluindo os valores dos NSEAO para efeitos sobre as 
mães e os descendentes.  
4. REFERÊNCIAS  
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B.36.  TOXICOCINÉTICA  
INTRODUÇÃO  
1. Este método é equivalente ao  Test Guideline  417 da OCDE (2010). Os 
estudos toxicocinéticos realizados aos produtos químicos visam obter infor ­
mações adequadas sobre a absorção, distribuição, biotransformação (meta ­
bolismo) e excreção dos mesmos, facilitar o estabelecimento de uma relação 
entre a concentração ou dose e a toxicidade observada e contribuir para a compreensão do mecanismo através do qual os produtos químicos em causa exercem a sua toxicidade. A toxicocinética pode ajudar a elucidar os estudos 
toxicológicos, ao demonstrar que a exposição dos animais ao produto quí ­
mico em estudo é de natureza sistémica e ao revelar quais são as entidades circulantes (produto químico parental ou metabolitos deste). Os parâmetros toxicocinéticos básicos extraídos destes estudos também fornecem informa ­
ções sobre o potencial de acumulação do produto químico em questão nos 
tecidos e/ou órgãos e sobre o potencial de indução de biotransformações devidas à exposição ao produto químico em causa.
 
2. Os dados toxicocinéticos podem ser úteis para apreciar a adequação e per ­
tinência da extrapolação de dados de toxicidade em animais com vista à 
avaliação de perigos e/ou riscos para o ser humano. Os estudos toxicociné ­
ticos também podem proporcionar informações úteis para a determinação das doses a utilizar em estudos de toxicidade (cinética linear ou não linear), bem como da relação entre a via de administração e os efeitos produzidos, 
da biodisponibilidade e de outros aspetos, relativos à conceção do estudo. 
Determinados tipos de dados toxicocinéticos podem servir para construir modelos toxicocinéticos de base fisiológica.
 
3. Os dados toxicocinéticos e metabólicos são importantes a diversos títulos. 
Podem, por exemplo, dar indicações acerca de possíveis efeitos tóxicos e 
modos de ação, bem como sobre a relação destes com as doses e com a via 
de exposição. Por outro lado, os dados metabólicos podem proporcionar informações úteis para avaliar a importância, no plano toxicológico, da exposição a metabolitos exógenos do produto químico em estudo.
 
4. Dispor de dados toxicocinéticos adequados ajudará a confirmar a aceitabi ­
lidade e aplicabilidade de métodos baseados em relações estrutura-atividade, 
interpolações e agrupamentos para avaliar a segurança de produtos quími ­
cos. Os dados cinéticos também podem servir para avaliar a pertinência toxicológica de outros estudos (por exemplo,  in vivo  e in vitro ).
 
5. Salvo indicação em contrário (ver, nomeadamente, os pontos 74 a 78), este 
método pressupõe a administração por via oral do produto químico em 
estudo.  
CONSIDERAÇÕES INICIAIS  
6. As diversas regulamentações estabelecem exigências e necessidades diferen ­
tes quanto aos efeitos e parâmetros toxicocinéticos a medir relativamente a cada classe de produtos químicos (pesticidas, biocidas, produtos químicos industriais, etc.). Contrariamente à maioria dos outros métodos, este método 
descreve ensaios toxicocinéticos que compreendem múltiplas medições e 
múltiplos efeitos observados. Futuramente, poderão vir a ser elaborados novos métodos de ensaio e/ou documentos de orientação que individualizem e pormenorizem mais cada efeito observado. No que respeita ao presente 
método, cada regulamentação estabelece as exigências e/ou necessidades ao 
nível dos ensaios e avaliações a realizar.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 526
 
7. São numerosos os estudos que podem ser realizados para avaliar o compor ­
tamento toxicocinético de produtos químicos para efeitos da regulamentação 
aplicável. Todavia, consoante as necessidades ou situações concretas ao nível da regulamentação, nem todos esses estudos poderão ser necessários para avaliar o produto químico em causa. Na conceção de estudos toxico ­
cinéticos é necessário ser flexível e ter em conta as características do pro ­
duto químico em causa. Em alguns casos, pode ser suficiente explorar um determinado conjunto de questões para atender aos perigos e riscos associa ­
dos ao produto químico em causa. Por vezes, podem obter-se dados toxi ­
cocinéticos no âmbito da avaliação efetuada no quadro de outros estudos 
toxicológicos. Noutros casos, podem ser necessários estudos toxicocinéticos suplementares e/ou mais aprofundados, se a regulamentação o exigir e/ou ou se a avaliação do produto químico em causa suscitar novas interrogações.
 
8. A fim de melhorar a qualidade do estudo e de evitar o recurso desnecessário 
a animais, antes de realizar o estudo o laboratório deve ponderar todas as 
informações disponíveis sobre o produto químico em causa e os metabolitos e análogos deste. Entre essas informações podem contar-se dados obtidos por outros métodos de ensaio pertinentes (estudos  in vivo  ou in vitro  e/ou 
avaliações  in silico  — ou seja, por simulação computacional). 
No planeamento do estudo e na interpretação dos resultados pode ser útil ter presente as propriedades físico-químicas (tais como o coeficiente de partição octanol/água, expresso em log P
 OW , o pKa, a hidrossolubilidade, 
a pressão de vapor e o peso molecular) do produto químico em causa. Estas 
propriedades podem determinar-se pelos métodos adequados descritos nos métodos de ensaio correspondentes.
 
LIMITAÇÕES  
9. Este método não se adapta a casos especiais, tais como fêmeas grávidas ou 
em lactação e progenituras, nem à avaliação de eventuais resíduos em 
animais destinados à alimentação humana expostos. Todavia, os dados pro ­
venientes de estudos pelo método B.36 podem fornecer informações susce ­
tíveis de orientar a conceção de estudos específicos para esses casos. O presente método não se destina ao ensaio de nanomateriais. Um relatório 
do exame preliminar da aplicabilidade das  Test Guidelines  da OCDE aos 
nanomateriais (1) indica que a  Test Guideline 417  (equivalente ao presente 
método) pode não se aplicar a estes materiais.
 
DEFINIÇÕES  
10. Definem-se no apêndice alguns conceitos utilizados neste método.  
CONSIDERAÇÕES DE BEM-ESTAR ANIMAL  
11. O documento de orientações n.  o 19 da OCDE (2) contém orientações sobre 
o tratamento ético dos animais. Recomenda-se a consulta deste documento da OCDE relativamente a todos os estudos  in vivo  e in vitro  referidos no 
presente método de ensaio.
 
DESCRIÇÃO DOS MÉTODOS  
Estudos-piloto  
12. Recomenda-se e incentiva-se a realização de estudos-piloto para escolher os 
parâmetros experimentais para os estudos de toxicocinética (por exemplo, metabolismo, balanço de massas, protocolos analíticos, dosagens, exalação 
de CO
 2 , etc.). A caracterização de alguns destes parâmetros pode dispensar 
o recurso a produtos químicos com marcação radioativa.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 527
 
Escolha dos animais  
Espécie  
13. De preferência, a espécie e a estirpe dos animais utilizados nos ensaios de 
toxicocinética devem ser idênticas às utilizadas nos outros estudos toxico ­
lógicos realizados com o produto químico em causa. Normalmente utiliza-se o rato, espécie amplamente usada nos estudos toxicológicos. Pode 
justificar-se o recurso a outras espécies ou a utilização de espécies adicionais 
se estudos toxicológicos importantes evidenciarem efeitos tóxicos significa ­
tivos nessas espécies ou se a toxicidade/toxicocinética nessas espécies for comprovadamente mais pertinente para o ser humano. É necessário justificar 
a escolha da espécie e da estirpe de animal.
 
14. Salvo menção em contrário, este método pressupõe que a espécie ensaiada é 
o rato. Se forem utilizadas outras espécies, pode ser necessário alterar de ­
terminados aspetos do método.  
Idade e estirpe  
15. Devem ser utilizados animais adultos, jovens e saudáveis, normalmente com 
6 a 12 semanas na altura da exposição (ver também os pontos 13 e 14). É 
necessário justificar o recurso a animais que não sejam adultos jovens. 
No início do estudo, os animais devem ter todos idades aproximadas. As diferenças de peso de animal para animal não devem desviar-se mais de 20 % do peso médio de todos os animais do grupo. Idealmente, a estirpe 
utilizada deve ser idêntica à utilizada para constituir a base de dados toxi ­
cológicos do produto químico em causa.
 
Número e sexo dos animais  
16. Para cada dose ensaiada, o número mínimo de animais é de quatro de um 
dos sexos, sendo necessário justificar o sexo dos animais utilizados. Deve 
ponderar-se a utilização de animais de ambos os sexos (quatro machos e 
quatro fêmeas) caso haja indícios de diferenças significativas de toxicidade entre os sexos.
 
Condições de alojamento e de alimentação  
17. Normalmente, os animais são alojados individualmente durante o ensaio. 
Em circunstâncias especiais, pode justificar-se um alojamento agrupado. A 
iluminação deve ser artificial, com uma sequência de 12 horas de luz se ­
guidas de 12 horas de escuridão. A temperatura do biotério deve ser de 22 °C ± 3 °C; a humidade relativa de 30 % a 70 %. Na alimentação, podem 
utilizar-se dietas convencionais de laboratório e deve ser fornecida água de 
beber sem restrições.
 
Produto químico em estudo  
18. Em todos os aspetos do estudo relacionados com o balanço de massas e com 
a identificação dos metabolitos, o produto químico utilizado deve estar 
marcado com o isótopo radioativo  14 C. Todavia, se puder demonstrar-se 
que: 
— é possível efetuar o balanço de massas e identificar os metabolitos 
utilizando o produto químico sem marcação radioativa,  
— a especificidade e a sensibilidade analíticas do método sem o produto 
químico com marcação radioativa são iguais ou superiores às que se 
obteriam com marcação radioativa,  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 528
 
não será necessário utilizar um produto químico com marcação radioativa. 
Por outro lado, podem utilizar-se outros isótopos radioativos ou estáveis, 
especialmente se o elemento em questão for a causa da toxicidade ou integrar a parte tóxica do produto químico em estudo. Se possível, o mar ­
cador radioativo deve localizar-se numa parte central da molécula que seja 
estável ao metabolismo (não permutável, não metabolizada em CO
 2 nem 
passa a fazer parte dos radicais monocarbonados do organismo). Para dis ­
cernir o destino metabólico do produto químico em estudo, pode ser neces ­
sário marcar vários pontos ou determinadas regiões da sua molécula.  
19. É necessário determinar o grau de pureza e identificar os produtos químicos 
com e sem marcação radioativa recorrendo a métodos de análise adequados. 
A pureza radiológica de um produto químico radioativo deve ser a máxima 
atingível no caso desse produto químico (idealmente superior a 95 %) e deve fazer-se um esforço razoável para identificar as impurezas cuja concen ­
tração seja igual ou superior a 2 %. O grau de pureza, bem como a iden ­
tidade e a proporção das impurezas identificadas, devem constar do relató ­
rio. Determinados programas obrigatórios podem optar por fornecer orien ­
tações suplementares para a definição e caracterização dos produtos quími ­
cos constituídos por misturas, bem como de métodos para determinação da 
pureza.
 
Escolha das doses  
Estudo-piloto  
20. Normalmente, é suficiente no estudo-piloto uma dose única por via oral. A 
dose não deve ser tóxica, mas deve ser suficientemente elevada para possi ­
bilitar a identificação dos metabolitos nas excreções (e no plasma, se for 
caso disso), assim como para a consecução dos objetivos do estudo-piloto, 
expressos no ponto 12.  
Estudos principais  
21. Nos estudos principais, é preferível ensaiar pelo menos duas doses, dado 
que as informações obtidas a partir desse número mínimo de grupos de dose podem facilitar a escolha das doses a ensaiar noutros estudos de toxicidade, bem como a avaliação da relação dose-resposta em ensaios de toxicidade já 
realizados.
 
22. Se forem administradas duas doses, ambas devem ser suficientemente ele ­
vadas para possibilitar a identificação dos metabolitos nas excreções (e no 
plasma, se for caso disso). Na escolha das doses devem ponderar-se as informações extraíveis dos dados de toxicidade disponíveis. Caso não se disponha de informações (provenientes, por exemplo, de estudos de toxici ­
dade aguda por via oral nos quais se registem sinais clínicos de toxicidade 
ou de estudos de toxicidade por dose repetida), pode ponderar-se, para dose mais elevada, um valor inferior à estimativa da DL
 50 (vias oral e dérmica) 
ou à estimativa da CL  50 (via inalatória) ou um valor inferior ao valor mais 
baixo do intervalo de toxicidade aguda estimado. A dose mais baixa deve 
ser uma fração da dose mais elevada.  
23. Caso o estudo incida apenas numa dose, idealmente esta deve ser suficien ­
temente elevada para possibilitar a identificação dos metabolitos nas excre ­
ções (e no plasma, se for caso disso), sem gerar efeitos tóxicos visíveis. Se 
não for ensaiada uma segunda dose, é necessário justificá-lo.  
24. Se for necessário determinar o efeito da dose nos processos cinéticos, duas 
doses podem não ser suficientes e pelo menos uma das doses utilizadas deve 
ser suficientemente elevada para saturar esses processos. Uma evolução não linear da área abaixo da curva da concentração no plasma em função do tempo (AUC) entre duas doses utilizadas no estudo principal constitui in ­
dício forte da saturação de um ou mais processos cinéticos algures entre 
essas duas doses.
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25. No caso dos produtos químicos de baixa toxicidade, deve utilizar-se uma 
dose máxima de 1 000 mg/kg de peso corporal pelas vias oral ou dérmica; 
se a administração for por via inalatória, ver orientações no capítulo B.2 deste anexo, mas normalmente a dose máxima não excederá 2 mg/l. Por razões específicas ligadas ao produto químico em estudo, pode ser necessá ­
ria uma dose mais elevada, consoante o exija a regulamentação aplicável. É 
sempre necessário justificar as doses escolhidas.
 
26. Os dados toxicocinéticos e de distribuição pelos tecidos obtidos a partir de 
uma dose única podem ser suficientes para determinar o potencial de acu ­
mulação e/ou de persistência. Todavia, em determinadas circunstâncias, pode ser necessário administrar repetidamente a dose, para melhor avaliar o potencial de acumulação e/ou de persistência ou a evolução dos parâme ­
tros toxicocinéticos (por exemplo, a indução e a inibição enzimáticas) ou 
para responder às exigências da regulamentação aplicável. Nos estudos com repetição de doses, é normalmente suficiente utilizar doses baixas, mas, em determinadas circunstâncias, também pode ser necessário utilizar doses ele ­
vadas (ver também o ponto 57).
 
Administração do produto químico em estudo  
27. Deve dissolver-se o produto químico em estudo, ou preparar-se uma sus ­
pensão homogénea do mesmo, no mesmo veículo utilizado nos outros es ­
tudos de toxicidade oral com administração por sonda esofágica efetuados 
com o produto químico em causa, se esse veículo for conhecido. É neces ­
sário justificar o veículo escolhido. A escolha do veículo e do volume de dosagem são aspetos a considerar na conceção do estudo. O método habitual de administração é por sonda esofágica. Todavia, em determinadas situa ­
ções, pode ser vantajoso proceder à administração por meio de uma cápsula 
de gelatina ou por incorporação na dieta, sendo necessário justificar ambas as opções. É igualmente necessário dispor de meios de verificação da dose efetivamente administrada a cada animal.
 
28. O volume máximo de líquido a administrar de cada vez por meio de sonda 
esofágica depende do tamanho do animal, do tipo de veículo de dosagem e da suspensão ou não da alimentação antes da administração do produto 
químico em estudo. É necessário explicar por que razão se mantém ou se 
restringe a alimentação antes da administração das doses. Normalmente, o volume utilizado deve ser o menor possível, tanto no caso dos veículos aquosos como dos veículos não aquosos. No caso dos roedores, o volume 
das doses não deve, normalmente, exceder 10 mg/kg de peso corporal. 
No caso dos produtos químicos mais lipofílicos, o volume do veículo pode ser de 4 ml/kg de peso corporal ou superior. Nos casos de adminis ­
tração repetida das doses, em que o jejum diário seria contraindicado, pode 
ponderar-se utilizar volumes de dose inferiores (por exemplo, 2 a 4 ml/kg de 
peso corporal). Se possível, deve procurar utilizar-se volumes de dose coe ­
rentes com os administrados noutros estudos orais por sonda esofágica do produto químico em causa.
 
29. A administração intravenosa do produto químico em estudo e a medição do 
teor deste no sangue e/ou nas excreções pode servir para determinar a biodisponibilidade ou a absorção oral relativa. Nos estudos por via intrave ­
nosa, administra-se uma dose única (normalmente equivalente à dose mais 
baixa por via oral, sem a exceder — ver a escolha das doses) do produto químico num veículo adequado. Administra-se a dose num volume ade ­
quado (por exemplo, 1 ml/kg de peso corporal), no local de administração 
escolhido, a, pelo menos, quatro animais do sexo adequado (caso se justi ­
fique, podem utilizar-se animais de ambos os sexos — ver o ponto 16). É necessário dissolver completamente ou preparar uma suspensão integral da dose do produto químico em estudo a administrar por via intravenosa. O 
veículo utilizado nesta via de administração não deve interferir no fluxo 
sanguíneo nem afetar as células sanguíneas. Se o produto químico em estudo for injetado por meio de bombagem, é necessário indicar no relatório a velocidade de perfusão e esta deve ser normalizada para todos os animais. 
Caso se proceda à encanulação da veia jugular (para administração do 
produto químico em estudo e/ou para colheita de sangue) ou se utilize a
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 530
 
artéria femoral para a administração do produto químico, é necessário anes ­
tesiar o animal. Há que ponderar bem o tipo de anestesia, dado que esta 
pode influenciar a toxicocinética. Os animais devem poder restabelecer-se convenientemente antes de lhes ser administrado o produto químico em estudo incorporado no veículo.
 
30. No caso de determinados produtos químicos, pode recorrer-se a outras vias 
de administração, como as vias dérmica ou inalatória (ver os pontos 74 a 78), em função das propriedades físico-químicas do produto químico em 
causa e da utilização ou exposição humanas previsíveis.
 
Medições  
Balanço de massas  
31. Estabelece-se o balanço de massas somando as quantidades correspondentes 
às percentagens da dose (radioativa) administrada excretadas na urina, nas fezes e no ar expirado e as quantidades correspondentes às percentagens 
presentes nos tecidos, na carcaça restante e nas águas de lavagem da gaiola 
(ver o ponto 46). Em geral, consideram-se adequadas recuperações totais do produto químico (radioatividade) administrado superiores a 90 %.
 
Absorção  
32. Pode efetuar-se uma primeira estimativa da absorção excluindo do balanço 
de massas as quantidades correspondentes à percentagem da dose presente no trato gastrointestinal e/ou nas fezes. Para o cálculo da percentagem de absorção, ver o ponto 33. Para a análise das excreções, ver os pontos 44 a 
49. Se não for possível determinar com exatidão, por meio de um balanço 
de massas, a absorção subsequente a uma administração por via oral (por exemplo, se mais de 20 % da dose administrada estiver presente nas fezes), podem ser necessários estudos mais aprofundados. Estes estudos podem 
compreender a administração oral do produto químico e a determinação 
deste na bílis ou a administração oral e intravenosa do produto químico e a determinação da diferença entre as quantidades deste presentes na urina, no ar expirado e na carcaça, depois de administrado por cada uma destas 
vias. Em ambos os casos, mede-se a radioatividade em vez de efetuar uma 
análise química específica do produto químico em estudo e dos seus meta ­
bolitos.
 
33. Para estudar a excreção biliar, normalmente procede-se à administração por 
via oral. Neste estudo, insere-se uma cânula no ducto biliar de, pelo menos, quatro animais do sexo adequado (ou, caso se justifique, de ambos os 
sexos), procedendo-se à administração de uma única dose do produto quí ­
mico em estudo. Depois desta administração, deve monitorizar-se a excreção de radioatividade/do produto químico em estudo na bílis durante o tempo necessário para estimar a percentagem da dose administrada que é excretada 
por esta via, a qual se pode utilizar para calcular, em seguida, a percentagem 
de absorção por via oral:
 
Percentagem de absorção  ¼ ðquantidade presente na bílis  þ na urina þ no ar expirado þ 
na carcaça ; com exclusão da quantidade presente no trato 
gastrointestinalÞ=quantidade administrada  Ü 100  
34. No caso de determinadas classes de produtos químicos, a dose absorvida 
pode ser diretamente segregada através das membranas intestinais. Nesses 
casos, a determinação da percentagem da dose administrada presente nas 
fezes após administração de uma dose por via oral a ratos com uma cânula inserida no ducto biliar não se considera representativa da dose não absor ­
vida. Recomenda-se que, nos casos em que se preveja secreção intestinal, se 
calcule a percentagem da dose que é absorvida a partir de um cálculo da 
absorção por comparação da excreção após administração por via oral e por via intravenosa (ratos intactos ou com uma cânula inserida no ducto biliar) — ver o ponto 35. Recomenda-se igualmente que, se for considerado ne ­
cessário quantificar a secreção intestinal, se meça a excreção após adminis ­
tração por via intravenosa em ratos com uma cânula inserida no ducto biliar.
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Biodisponibilidade  
35. Pode determinar-se a biodisponibilidade a partir da cinética no plasma/no 
sangue dos grupos expostos por via oral e por via intravenosa, conforme se descreve nos pontos 50 a 52, efetuando análises químicas específicas do 
produto químico em estudo e/ou do(s) metabolito(s) correspondente(s) e 
dispensando-se, portanto, a marcação radioativa do produto químico em causa. Pode então calcular-se a biodisponibilidade (F) do produto químico em estudo ou do(s) metabolito(s) correspondente(s) do seguinte modo:
 
F ¼ ðAUC  exp=AUC  IV Þ Ü ðDose  IV=Dose  exp Þ 
em que AUC é a área abaixo da curva de concentração no plasma em 
função do tempo e "exp" é a via experimental (oral, dérmica ou inalatória).  
36. A fim de avaliar o risco de efeitos sistémicos, é geralmente preferível 
recorrer à biodisponibilidade do componente tóxico, em vez da percentagem 
de absorção, para comparar as concentrações sistémicas em estudos efetua ­
dos em animais com dados análogos de biomonitorização provenientes de estudos de exposição profissional. A situação pode tornar-se mais complexa se as doses se situarem numa zona de resposta não linear, pelo que é 
importante que um estudo toxicocinético prévio permita escolher uma 
gama de doses com resposta linear.
 
Distribuição pelos tecidos  
37. O conhecimento da distribuição pelos tecidos do produto químico em estudo 
e/ou dos metabolitos do mesmo é importante para a identificação dos tecidos-alvo e para a compreensão dos mecanismos subjacentes à toxicidade, bem como para obter informações sobre o potencial de acumulação e per ­
sistência do produto químico e dos metabolitos. Pelo menos no termo do 
estudo de excreção (normalmente até sete dias após a administração da dose, em função do comportamento do produto químico em estudo), deve medir-se a percentagem da dose (radioativa) total presente nos tecidos e 
na carcaça restante. Caso não se detete o produto químico nos tecidos no 
final do estudo (por exemplo, por aquele ter sido eliminado anteriormente, devido a uma meia vida curta), importa não interpretar mal os dados. Nessas 
situações, é necessário examinar a distribuição pelos tecidos quando se 
atinge a concentração máxima do produto químico (e/ou dos metabolitos) no plasma/no sangue (T
 max ) ou a taxa máxima de excreção urinária (ver o 
ponto 38). Além disso, pode ser necessário colher tecidos noutros momentos 
para determinar a distribuição do produto químico em estudo (e/ou dos 
metabolitos) pelos tecidos, para avaliar a eventual dependência do tempo, para facilitar o balanço de massas e/ou se a autoridade competente o exigir. Entre os tecidos a colher contam-se o fígado, gordura, o trato gastrointes ­
tinal, os rins, o baço, o sangue total, a carcaça restante, os órgãos-alvo e 
quaisquer outros (por exemplo, a tiroide, eritrócitos, os órgãos reprodutores, a pele e — sobretudo em animais pigmentados — os olhos) potencialmente importantes para a avaliação toxicológica do produto químico em estudo. 
Deve-se procurar examinar o máximo de tecidos nos mesmos momentos, 
para otimizar a utilização dos animais e no caso de, em estudos de toxici ­
dade crónica ou subcrónica, se observarem efeitos tóxicos em órgãos-alvo. Deve indicar-se igualmente no relatório as concentrações do resíduo (radio ­
ativo) e a relação entre essas concentrações nos tecidos e no plasma (no 
sangue).
 
38. A avaliação da distribuição pelos tecidos noutros momentos, tais como o 
momento em que são atingidos o pico de concentração no plasma/no sangue (por exemplo, T
 max ) ou a taxa máxima de excreção urinária, obtida, respe ­
tivamente, nos ensaios cinéticos do plasma/do sangue e nos ensaios de 
excreção urinária, também pode ser uma exigência das autoridades compe ­
tentes. As informações neste domínio podem facilitar a compreensão da toxicidade e do potencial de acumulação e persistência do produto químico 
em estudo e dos metabolitos. É necessário justificar a escolha das amostras. 
As amostras a analisar são geralmente as já indicadas (ver o ponto 37).
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39. Nos estudos da distribuição pelos tecidos, pode quantificar-se a radioativi ­
dade procedendo à dissecação, homogeneização, combustão e/ou solubiliza ­
ção dos órgãos e depois à contagem da cintilação em fase líquida dos resíduos retidos. Determinadas técnicas, atualmente em diversos estádios de desenvolvimento — por exemplo, a autorradiografia quantitativa de 
corpo inteiro e a autorradiografia microscópica dos recetores —, podem 
ser úteis para determinar a distribuição do produto químico em estudo pelos órgãos e/ou tecidos (3)(4).
 
40. Se a via de exposição não for a via oral, deve colher-se e analisar-se 
determinados tecidos específicos, tais como os pulmões, nos estudos por 
inalação, e a pele, nos estudos por via dérmica. Ver os pontos 74 a 78.  
Metabolismo  
41. É necessário recolher as excreções (e, se for caso disso, colher amostras de 
plasma) para proceder à identificação e quantificação do produto químico inalterado e dos metabolitos do mesmo, como se descreve nos pontos 44 a 49. Para facilitar a identificação dos metabolitos, aceita-se a reunião das 
excreções de um determinado grupo de dose. Recomenda-se que se estabe ­
leça o perfil dos metabolitos correspondente a cada período do estudo. Todavia, se a falta de amostras e/ou de radioatividade o inviabilizar, aceita-se a reunião da urina e das fezes correspondentes a diversos momen ­
tos do estudo, mas não das correspondentes aos dois sexos ou a doses 
diferentes. Na análise da urina, das fezes, da radioatividade presente no ar expirado pelos animais expostos e da bílis devem ser utilizados métodos qualitativos e quantitativos adequados.
 
42. Deve fazer-se um esforço razoável para identificar os metabolitos presentes 
em concentrações iguais ou superiores a 5 % da dose administrada e para 
traçar um esquema metabólico do produto químico em estudo. Se a quan ­
tidade do produto químico em estudo nas excreções representar 5 % ou mais da dose administrada, é necessário que o produto químico seja aí identifi ­
cado. Entende-se por "identificação" a determinação da estrutura exata dos 
componentes. Normalmente, procede-se à identificação efetuando simulta ­
neamente um traçado cromatográfico (cocromatografia) do metabolito e de padrões conhecidos, por dois sistemas diferentes, ou recorrendo a técnicas 
que permitam determinar a estrutura, tais como a espetrometria de massa, a 
ressonância magnética nuclear e outras. No caso da cocromatografia, não se considera que o recurso a técnicas cromatográficas que utilizem a mesma 
fase estacionária com dois sistemas de solventes diferentes constitua uma 
verificação por dois métodos adequada da identidade dos metabolitos, dado que os métodos não seriam independentes. A identificação por cocromato ­
grafia deve processar-se mediante o recurso a dois sistemas diferentes e 
independentes no plano analítico, tais como a cromatografia em camada 
fina normal ou com inversão de fases e a HPLC (cromatografia em fase líquida de alta eficiência). Se a qualidade da separação cromatográfica for adequada, não é necessária uma confirmação por meios espetroscópicos. 
Para uma identificação inequívoca, também pode recorrer-se a métodos 
que forneçam informações estruturais, tais como cromatografia em fase líquida/espetrometria de massa, cromatografia em fase líquida/espetrometria de massa, seguida de nova espetrometria de massa (em tandem), cromato ­
grafia em fase gasosa/espetrometria de massa e espetrometria de ressonância 
magnética nuclear.
 
43. Se não for possível identificar os metabolitos que representem, individual ­
mente, 5 % ou mais da dose administrada, deve constar do relatório final uma justificação ou explicação disso. Pode ser útil identificar metabolitos 
que representem menos de 5 % da dose administrada, para melhorar a 
compreensão da via metabólica com vista à avaliação dos perigos e/ou riscos associados ao produto químico em estudo. Sempre que possível, deve apresentar-se uma confirmação da estrutura. Para isso, pode ser neces ­
sário estabelecer o perfil metabólico no plasma, no sangue ou noutros teci ­
dos.
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Excreção  
44. Para conhecer a taxa e o grau de excreção da dose administrada, 
determina-se a percentagem da dose (radioativa) recuperada na urina, nas fezes e no ar expirado, dados que também são necessários para o balanço de 
massas. Devem determinar-se as quantidades do produto químico em estudo 
(radioatividade) eliminadas na urina, nas fezes e no ar expirado a intervalos de tempo adequados (ver os pontos 47 a 49). Os ensaios por dose repetida devem ser concebidos de maneira a possibilitarem a recolha de dados de 
excreção para cumprir convenientemente os objetivos descritos no ponto 26, 
o que permitirá efetuar comparações com os ensaios de dose única.
 
45. Se um estudo-piloto tiver revelado que não são excretadas no ar 
expirado quantidades significativas (de acordo com o ponto 49) do produto químico (radioatividade), não é necessário recolher o ar expirado no estudo 
definitivo.
 
46. Para a recolha das excreções (urina, fezes e ar expirado), coloca-se cada 
animal numa unidade individual de estudo do metabolismo. No final de cada período de recolha (ver os pontos 47 a 49), lavam-se essas unidades 
com um solvente adequado ("lavagem da gaiola"), para máxima recuperação 
do produto químico em estudo (da radioatividade). A recolha das excreções deve terminar ao sétimo dia ou quando tiverem sido recolhidos 90 % da dose administrada, consoante o que ocorrer primeiro.
 
47. Deve determinar-se a quantidade total do produto químico em estudo (radio ­
atividade) na urina em dois momentos, pelo menos, do primeiro dia de 
recolha — um dos quais 24 horas após a administração da dose — e posteriormente uma vez por dia, até ao termo do estudo. Incentiva-se que, no primeiro dia, haja mais de dois momentos de recolha (por exemplo, às 6, 
12 e 24 horas). Devem analisar-se os resultados dos estudos-piloto a fim de 
tirar ilações sobre momentos de recolha diferentes ou suplementares. É necessário fundamentar os programas de recolha.
 
48. Deve determinar-se diariamente a quantidade total do produto químico em 
estudo (radioatividade) nas fezes, com início 24 horas após a administração 
da dose e até ao termo do estudo, a menos que os estudos-piloto aconselhem 
momentos de recolha diferentes ou suplementares. É necessário fundamentar programas de recolha diferentes.
 
49. Caso se detete menos de 1 % da dose administrada no ar expirado num 
período de 24 horas, pode cessar-se a recolha do CO  2 expirado e de outros 
produtos voláteis no estudo em curso.  
Estudos em função do tempo  
Cinética no plasma/no sangue  
50. Estes estudos visam obter estimativas dos principais parâmetros toxicociné ­
ticos – por exemplo, C  max , T max , meia vida (t  1/2 ) e AUC – do produto 
químico em estudo. Podem efetuar-se com a administração de uma dose 
única, mas geralmente administram-se duas ou mais doses. A escolha das 
doses depende da natureza do ensaio e/ou do aspeto em estudo. Os dados cinéticos podem ser necessários para resolver questões como a da biodispo ­
nibilidade do produto químico e/ou para elucidar o efeito da dose na elimi ­
nação (por exemplo, para verificar se a saturação da eliminação depende ou 
não da dose).
 
51. O número mínimo de animais a utilizar nestes estudos é de quatro animais 
de um dos sexos por grupo de dose. É necessário justificar o sexo dos animais utilizados. Deve ponderar-se a utilização de animais de ambos os 
sexos (quatro machos e quatro fêmeas) caso haja indícios de diferenças 
significativas de toxicidade entre os sexos.
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52. Após a administração do produto químico em estudo (com marcação radio ­
ativa), devem colher-se amostras de sangue de cada animal em momentos 
adequados e segundo um método apropriado. O volume e o número de amostras de sangue que podem colher-se em cada animal podem estar limitados pelos efeitos potenciais de colheitas sucessivas na saúde/fisiologia 
do animal e/ou pela sensibilidade do método analítico. Devem analisar-se 
amostras correspondentes a cada animal. Em determinadas circunstâncias (por exemplo, a caracterização de metabolitos), pode ser necessário reunir amostras colhidas em diversos animais. Essa reunião de amostras deve ser 
justificada e as amostras dela resultantes devem ser claramente identificadas. 
Caso se utilize um produto químico com marcação radioativa, pode justificar-se determinar a radioatividade total presente. Se assim for, deve determinar-se a radioatividade total no sangue total e no plasma, ou no 
plasma e nos eritrócitos, para cálculo da razão sangue/plasma. Noutras 
situações, podem ser necessários estudos mais específicos que passem pela identificação de compostos parentais e/ou de metabolitos ou pela ava ­
liação da fixação a proteínas.
 
Outros estudos cinéticos em tecidos  
53. Estes estudos visam obter informações sobre a evolução no tempo, para 
elucidar questões relacionadas com aspetos como o modo da ação tóxica, a bioacumulação e a biopersistência, mediante a determinação dos níveis do produto químico em estudo em diversos tecidos. A escolha dos tecidos e o 
número de momentos a avaliar dependerão do aspeto a elucidar e da base de 
dados toxicológicos disponível para o produto químico. Na conceção destes estudos cinéticos complementares em tecidos, devem ser tidos em conta as informações reunidas conforme se descreveu nos pontos 37 a 40. Estes 
estudos podem efetuar-se com uma única dose ou repetindo a dose. É 
necessário justificar pormenorizadamente as opções tomadas.
 
54. Entre as razões que podem justificar a realização de outros estudos cinéticos 
em tecidos contam-se as seguintes:  
— meia vida prolongada no sangue, indiciadora da possível acumulação do 
produto químico em estudo em diversos tecidos,  
— interesse em verificar se foi atingido um estado estacionário em deter ­
minados tecidos (por exemplo, em estudos por dose repetida, embora a concentração do produto químico em estudo no sangue possa aparente ­
mente ter atingido um estado estacionário, pode ser útil confirmar se 
também se atingiu uma concentração estacionária nos tecidos-alvo).
 
55. Neste tipo de estudos em função do tempo, deve administrar-se por via oral 
uma dose adequada do produto químico em causa a, pelo menos, quatro 
animais por dose e por ponto temporal, medindo-se a distribuição ao longo 
do tempo nos tecidos escolhidos. Podem utilizar-se animais todos do mesmo sexo, a menos que os efeitos tóxicos observados evidenciem alguma espe ­
cificidade sexual. Também consoante o aspeto a elucidar, assim se analisa ­
rão ou não a radioatividade total ou o produto químico parental e/ou os 
metabolitos. Avalia-se a distribuição pelos tecidos recorrendo a técnicas adequadas.
 
Indução/inibição enzimáticas  
56. Num ou mais dos seguintes casos pode ser necessário estudar eventuais 
efeitos de indução/inibição enzimáticas ou a biotransformação do produto químico em estudo:
 
1) Se houver indícios de uma relação entre a biotransformação do produto 
químico e o aumento da toxicidade do mesmo;  
2) Se os dados de toxicidade disponíveis revelarem uma relação não linear 
entre a dose e o metabolismo;  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 535
 
3) Se os estudos de identificação dos metabolitos tiverem identificado um 
metabolito potencialmente tóxico que possa ter sido produzido por uma 
via enzimática induzida pelo produto químico em estudo;  
4) Para explicar efeitos supostamente ligados a fenómenos de indução en ­
zimática;  
5) No caso de experiências  in vitro  ou in vivo  com espécies e condições 
diferentes, se forem observadas alterações toxicológicas significativas do perfil metabólico do produto químico em estudo, situação em que pode ser necessário caracterizar a(s) enzima(s) em causa (por exemplo, enzi ­
mas da fase I, tais como as isoenzimas do sistema das mono-oxigenases 
dependentes do citocromo P450, enzimas da fase II, tais como isoenzi ­
mas da sulfotransferase ou da uridina-difosfato-glucoronosiltransferase, ou qualquer outra enzima pertinente). Estas informações podem ser uti ­
lizadas para avaliar a pertinência da espécie em causa para extrapolações 
interespécies.
 
57. Para avaliar variações toxicocinéticas ligadas ao produto químico em estudo, 
devem ser utilizados protocolos de estudo adequados, devidamente valida ­
dos e fundamentados. Constituem exemplos desses estudos a administração 
repetida de doses do produto químico não marcado, seguida de uma dose única com marcação radioativa ao décimo quarto dia, ou a administração repetida de doses do produto químico com marcação radioativa, seguida da 
colheita de amostras ao primeiro, sétimo e décimo quarto dias para deter ­
minação dos perfis metabólicos. A administração repetida de doses do pro ­
duto químico em estudo com marcação radioativa também pode fornecer informações sobre a bioacumulação (ver o ponto 26).
 
OUTRAS ABORDAGENS  
58. Além das experiências  in vivo  descritas no presente método, há outras 
possibilidades de obter informações úteis sobre a absorção, a distribuição, 
o metabolismo ou a eliminação de produtos químicos em determinadas espécies.
 
Utilização de dados obtidos  in vitro  
59. Utilizando sistemas de ensaio adequados, podem estudar-se  in vitro  diversos 
aspetos relativos ao metabolismo de um produto químico. Podem utilizar-se 
hepatócitos recentemente isolados ou de cultura ou frações subcelulares (por 
exemplo, microssomas e citosol ou a fração S9) hepáticas para estudar possíveis metabolitos. O metabolismo local no órgão-alvo — por exemplo, os pulmões — pode ter interesse para a avaliação dos riscos. As frações 
microssómicas de tecidos-alvo podem ser úteis para esse efeito. Os estudos 
com microssomas podem ter utilidade para investigar eventuais diferenças entre os sexos ou relacionadas com o estádio vital e para caracterizar parâ ­
metros enzimáticos (K
 m e V  max ) que podem facilitar a avaliação de depen ­
dências entre o metabolismo e as doses de exposição. Por outro lado, os 
microssomas podem ser úteis na identificação das enzimas microssomáticas que participam no metabolismo do produto químico em estudo, aspeto que pode ser importante para as extrapolações interespécies (ver também o 
ponto 56). Pode igualmente examinar-se o potencial de indução de biotrans ­
formação utilizando frações subcelulares hepáticas (por exemplo, os micros ­
somas e o citosol) de animais pré-expostos ao produto químico em causa, através de estudos de indução de hepatócitos  in vitro  ou a partir de linha ­
gens celulares específicas que exprimam as enzimas pertinentes. Em deter ­
minadas circunstâncias e em condições adequadas, pode ponderar-se a uti ­
lização de frações subcelulares provenientes de tecidos humanos para deter ­
minar eventuais diferenças entre espécies ao nível da biotransformação. Os 
resultados de estudos  in vitro  também podem ter utilidade no desenvolvi ­
mento de modelos toxicocinéticos de base fisiológica (5).
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60. A partir de estudos  in vitro  de absorção por via dérmica podem obter-se 
informações suplementares para caracterização da absorção (6).  
61. Pode utilizar-se culturas primárias de células hepáticas e cortes recentes de 
tecidos para estudar aspetos semelhantes aos estudados com os microssomas 
hepáticos. Em certos casos, poderão elucidar-se determinadas questões uti ­
lizando linhagens celulares que exprimam especificamente a enzima em 
causa, ou linhagens celulares geneticamente modificadas. Noutros casos, 
pode ser útil estudar  in vitro  a inibição e indução de isozimas específicas 
do citocromo P450 (por exemplo, CYP1A1, 2E1, 1A2, etc.), e/ou de enzi ­
mas da fase II, pelo composto parental. As informações obtidas podem ser 
úteis para compostos com estrutura semelhante.  
Utilização como informação complementar de dados toxicocinéticos 
provenientes de estudos de toxicidade  
62. A análise de amostras de sangue, tecidos e/ou excreções obtidas noutros 
estudos de toxicidade pode fornecer dados sobre a biodisponibilidade, a 
evolução da concentração no plasma ao longo do tempo (AUC, C  max ), o 
potencial de bioacumulação, as velocidades de eliminação e diferenças me ­
tabólicas ou cinéticas ligadas ao sexo ou ao estádio vital.  
63. Pode efetuar-se adaptações ao nível da conceção do estudo para elucidar 
questões relacionadas com a saturação das vias de absorção, de biotrans ­
formação e de excreção a doses elevadas, com o funcionamento de novas vias metabólicas a essas doses ou com o confinamento dos metabolitos 
tóxicos a tais doses.
 
64. Outros aspetos ligados à avaliação dos perigos que podem ser examinados:  
— sensibilidade dependente da idade, devido a diferenças no estado da 
barreira hemato-encefálica, ao nível renal e/ou nas capacidades de de ­
sintoxicação,  
— sensibilidade de determinadas subpopulações devido a diferentes capa ­
cidades de biotransformação ou a outras diferenças toxicocinéticas,  
— grau de exposição fetal por transferência transplacentária do produto 
químico ou grau de exposição neonatal através da lactação.  
Utilização de modelos toxicocinéticos  
65. Os modelos toxicocinéticos podem ser úteis para diversos aspetos da ava ­
liação dos perigos e dos riscos, por exemplo, na previsão da exposição 
sistémica e da dose transmitida aos tecidos internos. Estes modelos também 
podem ter utilidade para elucidar determinadas questões relativas ao modo de ação, podendo servir de base para extrapolações interespécies, vias de exposição e perfis de dosagem, bem como para avaliar o risco para o ser 
humano. Entre os dados úteis para o desenvolvimento de modelos toxico ­
cinéticos de base fisiológica para um produto químico numa determinada espécie contam-se 1) os coeficientes de partição, 2) as constantes bioquími ­
cas e os parâmetros fisiológicos, 3) os parâmetros de absorção específicos da 
via de exposição e 4) dados cinéticos  in vivo  para aferição dos modelos – 
por exemplo, parâmetros de eliminação para as vias de excreção pertinentes (> 10 %) ou K
 m e V  max para o metabolismo. Os dados experimentais 
utilizados no desenvolvimento de modelos devem ser obtidos por métodos 
cientificamente consistentes e os resultados da aplicação dos modelos devem 
ser validados. Para facilitar o desenvolvimento de modelos não comparti ­
mentais ou de base fisiológica, determinam-se frequentemente parâmetros específicos do produto químico em estudo ou da espécie em causa, tais 
como taxas de absorção, o coeficiente de repartição entre o sangue e os 
tecidos e as constantes metabólicas.
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DADOS E RELATÓRIOS  
66. Recomenda-se que o relatório do estudo tenha um índice.  
Corpo do relatório  
67. O corpo do relatório deve estar organizado nas seguintes secções e subsec ­
ções e conter as informações previstas no presente método:  
Resumo  
68. Deve resumir a conceção do estudo e descrever os métodos utilizados. Deve 
igualmente salientar os principais resultados, nomeadamente os relativos ao 
balanço de massas, à natureza e importância dos metabolitos, aos resíduos nos tecidos, à taxa de eliminação, ao potencial de bioacumulação e às diferenças entre os sexos. Deve ser suficientemente pormenorizado para 
possibilitar a avaliação dos resultados.
 
Introdução  
69. Deve compreender os objetivos, os fundamentos e a conceção do estudo, 
bem como as referências pertinentes e os eventuais elementos históricos.  
Objetos e métodos do estudo  
70. Deve descrever pormenorizadamente todas as informações pertinentes, no ­
meadamente:  
a) Produto químico em estudo  
Relativamente à identificação do produto químico, deve compreender a 
denominação química, a estrutura molecular, a composição química qua ­
litativa e quantitativa, o grau de pureza química e, se possível, o tipo e a 
quantidade de cada impureza. Deve compreender igualmente informações 
sobre as propriedades físico-químicas, nomeadamente o estado físico, a cor, a solubilidade bruta e/ou o coeficiente de partição, a estabilidade e, se for caso disso, a corrosividade. Se aplicável, devem ser fornecidos 
elementos relativos aos isómeros. Se o produto químico em estudo tiver 
marcação radioativa, deve indicar-se o tipo de radionuclídeo, a posição do marcador, a atividade específica e o grau de pureza radioquímica.
 
É igualmente necessário indicar o tipo de cada veículo, diluente, agente 
de suspensão, emulsionante ou qualquer outra matéria utilizada para 
administrar o produto químico em estudo, ou descrevê-los.  
b) Animais estudados  
Deve compreender informações sobre os animais estudados, nomeada ­
mente: escolha da espécie e da estirpe e justificação da escolha, idade no 
início do estudo, sexo, peso corporal, estado de saúde e manutenção dos 
animais.  
c) Métodos  
Deve explicar a conceção do estudo e o método utilizado e incidir nos 
seguintes elementos:  
1) Justificação das alterações da via ou das condições de exposição 
eventualmente efetuadas;  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 538
 
2) Justificação das doses escolhidas;  
3) Descrição dos estudos-piloto eventualmente utilizados na conceção 
experimental dos estudos subsequentes, incluindo os dados de base 
provenientes dos primeiros;  
4) Modo de preparação da solução administrada e tipo de solvente ou 
veículo, se tiver sido utilizado algum;  
5) Número de grupos expostos e número de animais por grupo;  
6) Nível e volume das doses (e a atividade correspondente, caso se 
utilize marcação radioativa);  
7) Via(s) e métodos de administração;  
8) Frequência da administração;  
9) Período de jejum (se for o caso);  
10) Radioatividade total por animal;  
11) Manipulação dos animais;  
12) Colheita e tratamento das amostras;  
13) Métodos analíticos utilizados na separação, quantificação e identifi ­
cação de metabolitos;  
14) Limites de deteção dos métodos utilizados;  
15) Outras medições e protocolos experimentais utilizados (incluindo a 
validação dos métodos de análise dos metabolitos).  
d) Análise estatística  
Caso os resultados do estudo sejam objeto de análise estatística, devem 
incluir-se informações suficientes sobre o método de análise estatística e 
o programa informático utilizados para o efeito, para que um avaliador 
ou perito estatístico independente possa reexaminar e reconstituir a aná ­
lise. 
Se o estudo recorrer a modelos sistémicos, por exemplo, modelos toxi ­
cocinéticos de base fisiológica, os modelos utilizados devem ser descritos em pormenor, para que possam ser reconstituídos e validados de forma 
independente (ver o ponto 65 e o apêndice "Definições").
 
Resultados  
71. Os dados devem ser resumidos e ser apresentados em quadros, juntamente 
com uma avaliação estatística adequada, e ser complementados por uma 
explicação no campo de texto correspondente. Os dados das contagens de 
radioatividade devem ser resumidos e ser apresentados da maneira mais adequada ao estudo – normalmente em microgramas ou miligramas equiva ­
lentes por massa de amostra, embora possam utilizar-se outras unidades. 
Devem inserir-se gráficos ilustrativos dos resultados, reproduzir-se os dados 
cromatográficos e espetrométricos representativos, identificar-se e quantificar-se os metabolitos, especificando a estrutura molecular dos mes ­
mos, e propor-se as vias metabólicas correspondentes. Esta secção deve 
ainda conter os seguintes elementos que se justifiquem:
 
1) Quantidade e percentagem de recuperação de radioatividade na urina, nas 
fezes, no ar expirado e na lavagem (urina e fezes) da gaiola;  
— nos estudos por via dérmica, devem incluir-se igualmente dados 
relativos à recuperação do produto químico em estudo na pele ex ­
posta e nas lavagens da pele, dados relativos à radioatividade residual na cobertura de proteção da pele e na unidade metabólica e os 
resultados do estudo de lavagem da pele. Para mais informações, 
ver os pontos 74 a 77,
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 539
 
— nos estudos por via inalatória, devem incluir-se igualmente dados 
relativos à recuperação do produto químico em estudo nos pulmões 
e nos tecidos nasais (8). Para mais informações, ver o ponto 78;  
2) Distribuição pelos tecidos, expressa em percentagem da dose adminis ­
trada e em concentração (microgramas equivalentes por grama de tecido), e razões tecido/sangue e tecido/plasma;
 
3) Balanço de matérias referente a cada estudo no qual sejam analisados os 
tecidos corporais e as excreções;  
4) Concentrações no plasma e parâmetros toxicocinéticos (biodisponibilida ­
de, AUC, C  max , T max , eliminação, meia vida) depois da administração 
pela(s) via(s) de exposição correspondente(s);  
5) Taxa e grau de absorção do produto químico em estudo depois da 
administração pela(s) via(s) de exposição correspondente(s);  
6) Quantidades do produto químico em estudo e de metabolitos (em per ­
centagem da dose administrada) recolhidas nas excreções;  
7) Referência aos dados por animal apresentados em apêndice para todos os 
parâmetros medidos (por exemplo, dose administrada, percentagem de recuperação, concentrações, parâmetros toxicocinéticos, etc.);
 
8) Figura com as vias metabólicas propostas e com as estruturas molecula ­
res dos metabolitos.  
Discussão e conclusões  
72. Elementos a constar desta secção:  
1) Proposta de via metabólica baseada nos resultados do metabolismo e da 
eliminação do produto químico em estudo;  
2) Discussão das eventuais diferenças ligadas à espécie ou ao sexo no que 
respeita à eliminação e/ou biotransformação do produto químico em estudo;
 
3) Quadros e discussão relativos à identificação e importância dos metabo ­
litos, às taxas de eliminação, ao potencial de bioacumulação e ao nível 
de resíduos do composto parental e/ou do(s) metabolito(s) deste nos tecidos, bem como a eventuais alterações dos parâmetros toxicocinéticos em função da dose;
 
4) Dados toxicocinéticos pertinentes obtidos em estudos de toxicidade;  
5) Conclusão concisa, fundamentada nos resultados do estudo;  
6) As subsecções suplementares eventualmente necessárias.  
73. Pode inserir-se outras secções para incluir informações bibliográficas, qua ­
dros, figuras, apêndices, etc. complementares.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 540
 
VIAS ALTERNATIVAS DE EXPOSIÇÃO  
Via dérmica  
Exposição por via dérmica  
74. Esta secção é dedicada aos estudos toxicocinéticos de produtos químicos 
administrados por via dérmica. No que respeita à absorção por esta via, 
consultar o capítulo B.44, "Absorção cutânea: método  in vivo " (9) deste 
anexo. Para outros critérios, como a distribuição e o metabolismo, pode recorrer-se ao presente método. Na exposição por via dérmica pode 
utilizar-se um ou mais níveis de dose do produto químico em estudo. 
Este (por exemplo, o produto químico puro, uma diluição do mesmo ou uma formulação que o contenha, a aplicar na pele) deve ser o produto químico ao qual as pessoas ou outras espécies potencialmente afetadas 
poderão estar expostas, ou um substituinte realista do mesmo. O nível ou 
níveis de dose devem escolher-se conforme foi explicado nos pontos 20 a 26. São fatores a ter em conta na escolha da(s) dose(s) a administrar por via dérmica a exposição humana prevista e/ou as doses que se revelaram tóxicas 
noutros estudos de toxicidade por via dérmica. Se necessário, a dose ou 
doses a administrar por via dérmica devem ser dissolvidas num veículo adequado, sendo em seguida administrado(s) o(s) volume(s) adequado(s) da(s) dose(s). Pouco antes do início do ensaio, cortam-se os pelos da região 
dorsal dos animais. Caso se rapem os pelos com uma lâmina, esta operação 
deve ser efetuada cerca de 24 horas antes do ensaio. Ao cortar ou rapar os pelos do animal, é necessário tomar precauções para evitar lesões da pele que possam alterar a permeabilidade desta. A percentagem da superfície do 
corpo do animal da qual se devem eliminar os pelos para a aplicação do 
produto químico em estudo é de aproximadamente 10 %. Se o produto químico em causa for muito tóxico, a superfície exposta pode ser inferior a 10 %, mas deve cobrir-se com uma camada fina e uniforme o máximo 
possível de superfície. A superfície exposta deve ser a mesma para todos os 
grupos de animais que participam no ensaio por via dérmica. As superfícies expostas devem ser protegidas com uma cobertura adequada que não saia do 
lugar. Os animais devem ser alojados separadamente.
 
75. Para determinar a quantidade da dose do produto químico em estudo apli ­
cada que pode remover-se da pele lavando a superfície de pele exposta com um sabão suave e água, efetua-se um estudo de lavagem da pele. Este 
estudo também pode ser útil para estabelecer o balanço de massas quando 
o produto químico for administrado por via dérmica. Para realizar um estudo de lavagem da pele, aplica-se uma dose única do produto químico em causa 
a dois animais. Escolhe-se a dose de acordo com o ponto 23 do presente 
método (relativamente ao tempo de contacto com a pele, ver o ponto 76). Para avaliar a eficácia da remoção do produto químico em estudo por este método de lavagem, determinam-se as quantidades do mesmo nas águas de 
lavagem.
 
76. A menos que a corrosividade o inviabilize, uma vez aplicado, o produto 
químico em estudo deve manter-se em contacto com a pele durante, pelo menos, seis horas. Uma vez retirada a cobertura de proteção, lava-se a 
superfície exposta conforme se explicou para o estudo de lavagem da pele 
no ponto 75. Em seguida, pesquisam-se resíduos do produto químico em estudo na cobertura de proteção e nas águas de lavagem. No final dos 
ensaios, eutanasiam-se os animais de acordo com a referência 2 e 
remove-se-lhes a pele exposta. Em seguida, analisa-se uma secção adequada dessa pele para determinar os resíduos do produto químico em estudo (a radioatividade) nela presentes.
 
77. Para a avaliação toxicocinética de produtos farmacêuticos, podem ser neces ­
sários protocolos diferentes, em observância da regulamentação aplicável.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 541
 
Via inalatória  
78. Deve utilizar-se uma concentração única do produto químico em estudo, 
embora possam utilizar-se mais, se for necessário. A concentração ou con ­
centrações devem escolher-se conforme foi explicado nos pontos 20 a 26. A 
exposição por inalação deve efetuar-se com um cone nasal ou com um 
capacete, para evitar absorções por outras vias (8). Se as condições de exposição por inalação forem diferentes, é necessário justificar e documentar as alterações. Deve precisar-se a duração da exposição (normalmente de 
quatro a seis horas).
 
REFERÊNCIAS:  
(1) OCDE (2009). Preliminary Review of OECD Test Guidelines for their 
Applicability to Manufactured Nanomaterials. Series on the Safety of Ma ­
nufactured Nanomaterials No. 15. ENV/JM/MONO(2009)21, OCDE, Paris.  
(2) OCDE (2000). Guidance Document on Recognition, Assessment and Use of 
Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 19. ENV/JM/MONO(2000), OCDE, Paris.
 
(3) Solon E.G., Kraus L. (2002). Quantitative whole-body autoradiography in 
the pharmaceutical industry; Survey results on study design, methods, and regulatory compliance.  J. Pharm. and Tox. Methods  46:73-81.
 
(4) Stumpf W.E. (2005). Drug localization and targeting with receptor micros ­
copic autoradiography.  J. Pharmacological and Toxicological Methods  
51:25-40.  
(5) Loizou G., Spendiff M., Barton H.A., Bessems J., Bois F.Y., d’Yvoire 
M.B., Buist H., Clewell H.J. 3rd, Meek B., Gundert-Remy U., Goerlitz 
G., Schmitt W. (2008). Development of good modelling practice for phy ­
siologically based pharmacokinetic models for use in risk assessment: The first steps.  Regulatory Toxicology and Pharmacology  50:400 – 411.
 
(6) Capítulo B.45 deste anexo, "Absorção cutânea: Método  in vitro ". 
(7) IPCS (2010). Characterization and application of Physiologically-Based 
Pharmacokinetic Models in Risk Assessment. IPCS Harmonization Project Document No. 9. Geneva, World Health Organization, International Pro ­
gramme on Chemical Safety.
 
(8) OCDE (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Series on Testing and Assessment No. 39. ENV/JM/MONO(2009)28, OC ­
DE, Paris.  
(9) Capítulo B.44 deste anexo, "Absorção cutânea: Método  in vivo ". 
(10) Barton H.A.,  et al.  (2006). The Acquisition and Application of Absorption, 
Distribution, Metabolism, and Excretion (ADME) Data in Agricultural Che ­
mical Safety Assessments.  Critical Reviews in Toxicology  36:9-35.  
(11) Gibaldi M., Perrier D., (1982), Pharmacokinetics, 2.  a edição. Marcel Dek ­
ker, Inc., New York.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 542
 
Apêndice  
DEFINIÇÕES  
Absorção : processo ou processos através dos quais um produto químico atra ­
vessa tecidos ou neles penetra. Diz respeito ao composto parental e a todos os 
metabolitos deste. Não confundir com "biodisponibilidade".  
Acumulação  (bioacumulação):  aumento ao longo do tempo da quantidade do 
produto químico presente nos tecidos (em geral tecidos adiposos, após exposição 
repetida). Se a quantidade do produto químico que penetra no corpo exceder a quantidade que dele é eliminada, o produto químico acumula-se no organismo e pode atingir concentrações tóxicas.
 
ADME : acrónimo de "Absorção, Distribuição, Metabolismo e Excreção".  
AUC  (área abaixo da curva de concentração no plasma em função do tem ­
po): área abaixo da curva que representa a evolução da concentração do produto 
químico no plasma ao longo do tempo. Corresponde à quantidade do produto químico absorvida pelo corpo num período determinado. Em condições de linea ­
ridade, esta área (do tempo zero a infinito) é proporcional à quantidade total do 
produto químico absorvida pelo corpo, independentemente da taxa de absorção.
 
Autorradiografia  (autorradiografia de corpo inteiro):  esta técnica, que serve 
para determinar quantitativa e/ou qualitativamente a localização nos tecidos de 
um produto químico radioativo, utiliza películas de raios X ou, mais recentemen ­
te, recorre à imagiologia digital com placas fotoluminescentes para visualizar moléculas ou fragmentos de moléculas com marcação radioativa através do re ­
gisto da radiação emitida no interior do objeto estudado. Comparativamente à 
dissecação de órgãos, a autorradiografia quantitativa de corpo inteiro pode apre ­
sentar algumas vantagens na determinação da distribuição do produto químico em estudo e na avaliação da resolução e da recuperação total das matérias radioativas nos tecidos. Uma vantagem significativa, por exemplo, é que esta 
técnica pode ser utilizada num modelo com animais pigmentados para avaliar a 
eventual associação do produto químico em estudo à melanina, que pode ligar-se a certas moléculas. Todavia, embora constitua um meio cómodo de visualizar globalmente os sítios de fixação de grande capacidade e baixa afinidade em todo 
o corpo, esta técnica pode ter limitações na identificação de sítios-alvo específi ­
cos como os da fixação ao recetor, cuja deteção exige resolução e sensibilidade relativamente elevadas. Quando se recorre à autorradiografia, as experiências destinadas a estabelecer o balanço de massas do composto administrado devem 
realizar-se num grupo ou estudo distintos, separadamente do estudo da distribui ­
ção pelos tecidos, procedendo-se à homogeneização de todas as excreções (in ­
cluindo, eventualmente, o ar expirado) e das carcaças completas e à análise das mesmas por contagem da cintilação em fase líquida.
 
Excreção biliar : excreção pelas vias biliares.  
Bioacumulação : ver "acumulação".  
Biodisponibilidade : fração de uma dose administrada que atinge a circulação 
sistémica ou é disponibilizada no sítio da atividade fisiológica. Em geral, a biodisponibilidade de um produto químico refere-se ao composto parental, mas 
pode igualmente referir-se a metabolitos deste. Diz respeito apenas a uma forma 
química.  Nota importante : biodisponibilidade e absorção não são sinónimos. A 
diferença entre, por exemplo, a absorção oral (isto é, presença na parede intes ­
tinal e na circulação portal) e a biodisponibilidade (isto é, presença no sangue 
sistémico e nos tecidos) pode, entre outros fatores, advir da degradação química 
devida ao metabolismo da parede intestinal, ao efluxo para o lúmen intestinal ou ao metabolismo pré-sistémico no fígado (10). A biodisponibilidade do compo ­
nente tóxico (composto parental ou metabolito) é um parâmetro essencial na 
avaliação dos riscos para a saúde humana (extrapolação de doses elevadas para 
doses baixas, extrapolação de uma via para outra) para a determinação do valor interno correspondente a um NOAEL (nível sem observação de efeitos adversos) externo ou a uma dose de referência externa (dose aplicada). Para estudar os 
efeitos no fígado em caso de administração oral, é suficiente a absorção oral. 
Todavia, para estudar efeitos não localizados na porta de entrada, a biodisponi ­
bilidade é geralmente um parâmetro mais fiável para a avaliação dos riscos do 
que a absorção.
 
Biopersistência : ver "persistência".  
Biotransformação : conversão química (geralmente enzimática) no corpo do pro ­
duto químico em causa num produto químico diferente. É sinónimo de "meta ­
bolismo".  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 543
 
C max : concentração máxima (pico de concentração) no sangue (plasma/soro) 
após a administração ou excreção máxima (pico de excreção urinária ou fecal) 
após a administração.  
Velocidade de eliminação : medição quantitativa da taxa, por unidade de tempo, 
à qual o produto químico em estudo é removido do sangue, do plasma ou de 
determinado tecido.  
Compartimento : porção (ou unidade) estrutural ou bioquímica de um corpo, 
tecido ou célula separada do resto do corpo, do resto do tecido ou do resto da 
célula.  
Vias de desintoxicação : séries de etapas conducentes à eliminação de produtos 
químicos tóxicos do corpo, seja por transformação metabólica seja por excreção.  
Distribuição : dispersão de um produto químico e dos seus derivados num orga ­
nismo.  
Enzimas/isozimas : proteínas que catalisam reações químicas. As isozimas são 
enzimas que catalisam reações químicas semelhantes, mas diferem na sequência de aminoácidos.
 
Parâmetros enzimáticos : K m , constante de Michaelis; e V  max , velocidade máxi ­
ma. 
Excreção : processo ou processos através dos quais um produto químico admi ­
nistrado e/ou os metabolitos deste são eliminados do corpo.  
Exógeno : de origem exterior ao organismo ou sistema ou produzido fora dele.  
Extrapolação : inferência de um ou mais valores desconhecidos com base no que 
é conhecido ou se observou.  
Meia vida (t  1/2 ): tempo necessário para que a concentração do produto químico 
em estudo num compartimento diminua para metade. Refere-se geralmente à concentração no plasma ou à quantidade do produto químico em estudo presente 
em todo o corpo.
 
Indução/Indução enzimática : síntese de enzimas em resposta a um estímulo 
ambiental ou a uma molécula indutora.  
Linearidade/Cinética linear : um processo diz-se de cinética "linear" se todas as 
transferências entre compartimentos forem proporcionais às quantidades ou con ­
centrações presentes, isto é, forem de primeira ordem. Os volumes de eliminação 
e de distribuição, bem como as meias-vidas, são, portanto, constantes. As con ­
centrações atingidas são proporcionais à dose (exposição) e a acumulação é mais facilmente previsível. Pode aferir-se da linearidade/não linearidade comparando os parâmetros pertinentes — por exemplo, a área abaixo da curva — após doses 
diferentes ou após uma exposição única e repetidas exposições. A inexistência de 
uma dependência da dose pode indicar a saturação das enzimas que intervêm no metabolismo do composto em causa; o aumento da área abaixo da curva após exposição repetida, comparativamente a uma exposição única, pode indicar ini ­
bição metabólica; a diminuição da área abaixo da curva pode indicar indução 
metabólica (ver também a referência 11).
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 544
 
Balanço de massas : contabilidade das entradas e saídas do sistema do produto 
químico em estudo.  
Balanço material : ver "balanço de massas".  
Mecanismo (modo) de toxicidade/Mecanismo (modo) de ação : o mecanismo de 
ação refere-se às interações bioquímicas específicas através das quais o produto químico em estudo produz os seus efeitos. O modo de ação refere-se aos fenó ­
menos mais gerais através dos quais se manifesta a toxicidade do produto quí ­
mico.
 
Metabolismo : é sinónimo de "biotransformação".  
Metabolitos : produtos do metabolismo ou de processos metabólicos.  
Absorção oral : percentagem da dose do produto químico em estudo absorvida a 
partir do sítio de administração (trato gastrointestinal). Este parâmetro essencial 
pode servir para compreender que fração do produto químico administrado atinge a veia porta e, a seguir, o fígado.
 
Coeficiente de partição : também conhecido por "coeficiente de distribuição", 
mede a diferença de solubilidades do produto químico em dois solventes.  
Níveis sanguíneos (plasmático/sérico) máximos : concentração máxima (pico de 
concentração) no sangue (plasma/soro) após a administração do produto químico (ver também "C
 max "). 
Persistência (biopersistência) : presença duradoura de um produto químico (num 
sistema biológico) devido a resistência deste à degradação/eliminação.  
Interpolação : utilização dos dados relativos a um determinado parâmetro dispo ­
níveis para um ou mais produtos químicos na previsão do resultado referente ao mesmo parâmetro para o produto químico em estudo.
 
Autorradiografia microscópica dos recetores  (ou microautorradiografia dos re ­
cetores):  técnica que pode servir para estudar interações xenobióticas com deter ­
minados sítios de tecidos ou populações celulares, por exemplo, em estudos de fixação ao recetor ou de modo de ação específico que possam necessitar de resolução e sensibilidade elevadas, impossíveis de obter por técnicas como a 
autorradiografia de corpo inteiro.
 
Via de administração  (oral, intravenosa, dérmica, inalatória, etc.):  refere-se aos 
meios pelos quais os produtos químicos são administrados ao corpo (por exem ­
plo, por via oral através de sonda esofágica, por via oral através da dieta, por via 
dérmica, por inalação, por via intravenosa, etc.).  
Saturação : estado no qual um ou mais processos cinéticos (por exemplo, a 
absorção, o metabolismo ou a eliminação) estão no máximo (ou seja, saturados).  
Sensibilidade : capacidade de um método ou de um instrumento de distinguir 
medições correspondentes a níveis diferentes de resposta da variável em causa.  
Estado estacionário dos níveis sanguíneos (plasmáticos) : estado fora do equilí ­
brio de um sistema aberto no qual todas as forças exercidas no sistema são exatamente contrabalançadas por forças opostas, de maneira que todos os com ­
ponentes do sistema têm uma concentração estacionária, embora fluam matérias 
pelo sistema.
 
Modelação sistémica  (modelo toxicocinético de base fisiológica, modelo de base 
farmacocinética, modelo farmacocinético de base fisiológica, modelo de base biológica, etc.):  modelo abstrato que utiliza linguagem matemática para descre ­
ver o comportamento de um sistema.
 
Tecidos-alvo : tecido no qual se manifesta o principal efeito adverso do produto 
tóxico.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 545
 
Produto químico em estudo : qualquer produto químico ou mistura ao qual seja 
aplicado este método de ensaio.  
Distribuição nos tecidos : circulação reversível do produto químico em estudo de 
um ponto para outro do corpo. Esta distribuição pode estudar-se por dissecação, homogeneização, combustão ou contagem da cintilação em fase líquida dos 
órgãos ou por autorradiografia qualitativa e/ou quantitativa de corpo inteiro. A 
primeira via é útil para determinar concentrações e percentagens de recuperação em tecidos e na restante carcaça de um animal, mas pode não ter resolução suficiente em todos os tecidos e a recuperação global pode não ser a ideal 
(< 90 %). Ver abaixo a definição da outra via.
 
T max :tempo necessário para atingir C  max . 
Toxicocinética  (farmacocinética):  Estudo de absorção, da distribuição, do meta ­
bolismo e da excreção de produtos químicos ao longo do tempo.  
Validação de modelos : processo de avaliar se um modelo descreve convenien ­
temente os dados toxicocinéticos disponíveis. Pode avaliar-se modelos por com ­
paração estatística ou visual, com valores experimentais, das previsões que per ­
mitem fazer, em função de uma variável independente comum (por exemplo, o 
tempo). A amplitude da avaliação deve ser compatível com a utilização preten ­
dida do modelo.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 546
 
B.37.  NEUROTOXICIDADE RETARDADA DE SUBSTÂNCIAS 
ORGANOFOSFORADAS POR EXPOSIÇÃO AGUDA  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
Na determinação e avaliação dos efeitos tóxicos das substâncias deve 
ter-se em conta o potencial de certos grupos, de determinarem tipos específicos de neurotoxicidade não detectáveis noutros ensaios de toxicidade. Verifica-se, assim, que algumas substâncias organofosfo ­
radas induzem neurotoxicidade retardada, constituindo potenciais al ­
vos para avaliação.
 
Os ensaios de rastreio  in vitro  podem ser utilizados para identificar 
substâncias susceptíveis de induzir polineuropatias retardadas; toda ­
via, a obtenção de resultados negativos nos ensaios  in vitro  não 
comprova que as referidas substâncias não possuem efeitos neurotó ­
xicos.  
Ver a parte B da Introdução Geral.  
1.2. DEFINIÇÕES  
As substâncias organofosforadas  incluem os ésteres, tioésteres e 
anidridos não ionizados de ácidos organofosfóricos, organofosfóni ­
cos e organofosforamídicos ou de ácidos fosforotióicos, fosfonotiói ­
cos e fosforotioamídicos afins, bem como quaisquer outras substân ­
cias que possam causar o tipo de neurotoxicidade retardada que se observa por vezes nas referidas classes de substâncias.
 
Neurotoxicidade retardada  é o síndroma associado à manifestação 
retardada de ataxia e de axonopatias distais na espinal medula e nos nervos periféricos, bem como à inibição e à redução da actividade da esterase envolvida na neuropatia, presente no tecido nervoso.
 
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Pode utilizar-se uma substância de referência com um lote de con ­
trolo positivo, de modo a demonstrar que, nas condições de ensaio, 
não existe uma alteração significativa da reacção da espécie em 
causa.  
O fosfato de tris- o-tolilo [n.  o CAS: 78-30-8; n.  o EINECS: 201-103-5; 
designado éster tris (2-metilfe-nílico) do ácido fosfórico na nomen ­
clatura CAS e também conhecido por fosfato de tris- o-cresilo] cons ­
titui uma substância neurotóxica largamente utilizada.  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
A substância em estudo é administrada por via oral, numa única 
dose, a galinhas domésticas eventualmente protegidas de efeitos co ­
linérgicos agudos. Os animais são observados durante 21 dias, re ­
gistando-se a manifestação de quaisquer perturbações do comporta ­
mento, bem como de ataxia e paralisia. As determinações bioquími ­
cas, nomeadamente da inibição da esterase envolvida na neuropatia, são efectuadas com aves seleccionadas de modo aleatório em cada lote, em geral 24 e 48 horas após a administração. 21 dias após a 
exposição, procede-se ao abate dos restantes animais, seguido do 
exame histopatológico de determinados tecidos do sistema nervoso.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 547
 
1.5. DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
1.5.1.  Preparação  
Seleccionam-se de modo aleatório galinhas adultas, jovens e saudá ­
veis, isentas de afecções virais e medicação concomitantes, bem 
como de anomalias da marcha, que se repartem pelos lotes de ensaio 
e de controlo. Os animais são aclimatados às condições de labora ­
tório durante pelo menos cinco dias antes do início do ensaio.  
Devem utilizar-se gaiolas ou recintos cujas dimensões permitam a 
livre mobilidade das aves e a fácil observação da respectiva marcha.  
A substância em estudo é administrada por via oral, por intermédio 
de uma sonda gástrica, de cápsulas de gelatina ou de um método 
comparável. Os líquidos podem ser administrados sem diluição ou 
dissolvidos num veículo adequado, nomeadamente óleo de milho; os sólidos devem ser dissolvidos sempre que possível, uma vez que a absorção de doses elevadas de sólidos dispersos em cápsulas de 
gelatina poderá não ser eficaz. No caso de se utilizar um veículo 
não aquoso, devem conhecer-se, ou determinar-se antes do ensaio, as respectivas características de toxicidade.
 
1.5.2.  Condições de ensaio  
1.5.2.1.  Animais de ensaio  
Recomenda-se a utilização de galinhas poedeiras, adultas e jovens 
(Gallus gallus domesticus ), com idades compreendidas entre 8 e 
12 meses. Devem utilizar-se raças e variedades correntes, manten ­
do-se os animais em condições que permitam a sua livre mobilidade.  
1.5.2.2.  Número e sexo  
Além do lote de ensaio, devem utilizar-se um lote de controlo com o 
veículo e um lote de controlo positivo. Os animais incluídos no lote 
de controlo com o veículo devem ser tratados de modo análogo aos 
animais do lote de ensaio, omitindo-se apenas a administração da substância em estudo.
 
Deve utilizar-se um número suficiente de animais em cada lote, de 
modo a que possam ser abatidos pelo menos seis animais para as 
determinações bioquímicas (três em dois momentos diferentes), so ­
brevivendo seis para o período de observação de 21 dias.  
Pode efectuar-se um controlo positivo em paralelo ou, como alter ­
nativa, utilizar dados obtidos em controlos positivos anteriores. O lote de controlo positivo deve ser constituído por um mínimo de seis aves a que se administra uma substância com actividade neurotóxica 
retardada conhecida, destinando-se três animais às determinações 
bioquímicas e os restantes a observação. Recomenda-se a actualiza ­
ção periódica dos dados obtidos. Caso um laboratório altere algum elemento essencial do protocolo experimental (por exemplo, varie ­
dade de animais utilizada, condições de alimentação ou alojamento), 
deve efectuar-se novo controlo positivo.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 548
 
1.5.2.3.  Doses  
Para estabelecer a dose a utilizar no ensaio, deve realizar-se um 
estudo prévio com um número adequado de aves e de doses, que poderá implicar a morte de alguns animais. Todavia, de modo a 
evitar a mortalidade devida a efeitos colinérgicos agudos, pode uti ­
lizar-se atropina ou outro agente protector que se saiba não interferir com as reacções neurotóxicas retardadas. Na estimativa da dose máxima não letal da substância em estudo podem utilizar-se diversos 
métodos de ensaio (ver o método B.1. bis).
 
A dose de substância em estudo a utilizar no ensaio deve ser tão 
elevada quanto possível, em função dos resultados do estudo prévio 
de selecção, não excedendo 2 000 mg/kg de massa corporal. O nú ­
mero de animais mortos durante o ensaio não deve interferir com o número mínimo de animais a utilizar para as determinações bioquí ­
micas e para o exame histopatológico a 21 dias (seis em ambos os 
casos). De modo a evitar a mortalidade devida a efeitos colinérgicos 
agudos, pode utilizar-se atropina ou outro agente protector que se saiba não interferir com as reacções neurotóxicas retardadas.
 
1.5.2.4.  Ensaio-limite  
Sempre que um ensaio, realizado de acordo com o presente método, 
que utilize uma dose de, pelo menos, 2 000 mg/kg de massa 
corporal/dia, não produza efeitos tóxicos observáveis, ou se, tendo em conta dados referentes a substâncias estruturalmente afins, não se preveja o surgimento de efeitos tóxicos, poderá não ser necessário 
efectuar um ensaio com uma dose mais elevada. Nestes casos, jus ­
tifica-se a realização de um ensaio-limite, excepto se a exposição humana indicar a necessidade de recurso a uma dose superior.
 
1.5.2.5.  Período de observação  
O período de observação deve ser de 21 dias.  
1.5.3  Procedimento  
Após a administração de um agente destinado a evitar a mortalidade 
devida a efeitos colinérgicos agudos, administra-se a substância em 
estudo numa única dose.  
1.5.3.1.  Observações gerais  
Devem iniciar-se as observações logo após a administração da subs ­
tância. Os animais devem ser cuidadosamente observados várias 
vezes nos dois dias subsequentes à administração e pelo menos 
diariamente até perfazer o período de 21 dias ou até ao abate pre ­
visto. Devem registar-se todos os sinais de toxicidade, incluindo o momento da manifestação, o tipo, a gravidade e a duração das ano ­
malias de comportamento. A ataxia deve determinar-se de acordo 
com uma escala numérica constituída por um mínimo de quatro níveis, devendo também registar-se os casos de paralisia. Pelo menos duas vezes por semana, devem retirar-se das gaiolas os animais 
seleccionados para observação patológica, submetendo-os a um pe ­
ríodo de actividade motora forçada, nomeadamente a subida de uma escada, de modo a facilitar a observação de efeitos tóxicos mínimos. Os animais moribundos, bem como aqueles que mostrem sinais de 
dor e sofrimento intensos, devem ser removidos, abatidos por inter ­
venção humana e autopsiados.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 549
 
1.5.3.2.  Massa corporal  
As aves devem ser pesadas imediatamente antes da administração da 
substância em estudo e, pelo menos, uma vez por semana na sequên ­
cia da mesma.  
1.5.3.3.  Determinações bioquímicas  
Alguns dias após a administração da substância, devem abater-se seis 
aves seleccionadas de modo aleatório dos lotes de ensaio e de con ­
trolo com o veículo, bem como três aves do lote de controlo positivo (caso este último seja efectuado em paralelo), preparando-se os res ­
pectivos cérebros e espinais medulas com vista a determinar a ini ­
bição da actividade da esterase envolvida na neuropatia. Além disso, 
pode também revelar-se útil preparar, para o mesmo fim, tecidos provenientes dos nervos ciáticos. Em geral, abatem-se três animais do lote de controlo e de cada lote de ensaio 24 horas após a admi ­
nistração da substância e três 48 horas após a mesma; os três animais 
dos lotes de controlo positivos devem ser abatidos 24 horas após a administração. Caso os sinais clínicos de intoxicação (que pode ser avaliada em função do momento da manifestação dos efeitos coli ­
nérgicos) observados indicarem que o agente tóxico é eliminado de 
forma bastante lenta, poderá ser preferível recolher tecidos de três animais em dois momentos compreendidos entre 24 horas e, no máximo, 72 horas após a administração.
 
Se for caso disso, podem também efectuar-se determinações de ace ­
tilcolinesterase com as amostras em causa. Todavia, a possível ocor ­
rência  in vivo  de reactivação espontânea da mesma poderá levar a 
subestimar a capacidade de inibição da acetilcolinesterase da subs ­
tância em estudo.  
1.5.3.4.  Autópsia  
A autópsia dos animais abatidos (abates previstos e abates de ani ­
mais moribundos) deve incluir o exame macroscópico do cérebro e 
da espinal-medula.  
1.5.3.5.  Exame histopatológico  
O tecido nervoso dos animais sobreviventes após o período de ob ­
servação, que não for utilizado para as determinações bioquímicas deve ser objecto de exame microscópico. Os tecidos devem ser fixados  in situ , por recurso a técnicas de perfusão. As secções a 
examinar incluem o cerebelo (ao nível meio-longitudinal), a  medulla 
oblongata , a espinal medula e os nervos periféricos. Devem recolher- 
-se secções da espinal medula provenientes do segmente cervical superior e das regiões mediotorácica e lombo-sagrada. Devem tam ­
bém recolher-se secções provenientes da região distal do nervo tibial 
e das respectivas ramificações para o músculo gastroenémio, bem como do nervo ciático. As secções em causa devem ser coradas com corantes adequados à mielina e corantes específicos dos axónios.
 
2. DADOS  
A obtenção de resultados negativos para os parâmetros bioquímicos, 
histopatológicos e de comportamento investigados no âmbito do 
presente ensaio não implica, de modo geral, a realização de ensaios 
complementares de neurotoxicidade retardada. A obtenção de resul ­
tados duvidosos ou não conclusivos poderá requerer a realização de estudos complementares.
 
Devem registar-se os dados relativos a cada animal. Além disso, 
todos os dados devem ser resumidos num quadro, referindo-se, 
para cada lote de ensaio, o número de animais utilizados, o número de animais que apresentam lesões e alterações de comportamento ou dos parâmetros bioquímicos, bem como o tipo e a gravidade das 
referidas lesões, e a percentagem de animais que apresentam cada 
tipo de lesões e alterações, em função da respectiva gravidade.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 550
 
Os resultados do ensaio devem ser avaliados em termos de incidên ­
cia, gravidade e correlação das alterações de comportamento, bem 
como dos efeitos bioquímicos, histopatológicos e outros efeitos ob ­
servados nos lotes de ensaio e de controlo.  
Sempre que possível, os resultados numéricos devem ser avaliados 
por recurso a um método estatístico de aceitação geral, cuja escolha 
deve ser efectuada na fase de concepção do ensaio.  
3. RELATÓRIO  
RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deve incluir, sempre que possível, as seguintes 
informações:  
3.1. Animais utilizados no ensaio:  
— estirpe utilizada;  
— número e idade dos animais;  
— proveniência, condições de alojamento, etc.;  
— massa de cada animal no início do ensaio.  
3.2. Condições de ensaio:  
— pormenores relativos à preparação da substância em estudo e à 
respectiva estabilidade e homogeneidade, se for caso disso;  
— justificação da escolha do veículo;  
— pormenores relativos à administração da substância em estudo;  
— pormenores relativos à qualidade dos alimentos e da água;  
— motivo da selecção da dose utilizada;  
— especificação das doses administradas, incluindo pormenores re ­
lativos ao veículo, bem como ao volume utilizado e às caracte ­
rísticas físicas da substância administrada;  
— identidade do agente protector eventualmente utilizado e porme ­
nores relativos à respectiva administração.  
3.3. Resultados:  
— dados relativos à massa corporal;  
— consumo de alimentos e de água, se for caso disso;  
— reacções tóxicas observadas em cada lote, incluindo a mortalida ­
de; 
— natureza, gravidade e duração dos sinais clínicos (reversíveis ou 
não);  
— descrição pormenorizada dos ensaios bioquímicos realizados e 
respectivos resultados;  
— dados obtidos por autópsia;  
— descrição pormenorizada dos resultados do exame histopatológi ­
co; 
— tratamento estatístico dos resultados, se for caso disso.  
Discussão dos resultados.  
Conclusões.  
4. REFERÊNCIAS  
O presente método é análogo ao método OCDE TG 418.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 551
 
B.38.  NEUROTOXICIDADE RETARDADA DE SUBSTÂNCIAS 
ORGANOFOSFORADAS POR ADMINISTRAÇÃO REPETIDA 
A 28 DIAS  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
Na determinação e avaliação dos efeitos tóxicos das substâncias deve 
ter-se em conta o potencial de certas classes das mesmas de deter ­
minarem tipos específicos de neurotoxicidade não detectáveis nou ­
tros ensaios de toxicidade. Verifica-se, assim, que algumas substân ­
cias organofosforadas induzem neurotoxicidade retardada, cons ­
tituindo potenciais alvos para avaliação.  
Os ensaios de rastreio  in vitro  podem ser utilizados para identificar 
substâncias susceptíveis de induzir polineuropatias retardadas; toda ­
via, a obtenção de resultados negativos nos ensaios  in vitro  não 
comprova que as referidas substâncias não possuem efeitos neurotó ­
xicos.  
O presente ensaio de toxicidade retardada a 28 dias fornece infor ­
mações sobre os eventuais riscos para a saúde decorrentes da expo ­
sição repetida num período limitado, nomeadamente a relação dose 
administrada-efeito, bem como uma estimativa das doses sem efeitos 
observados, a utilizar no estabelecimento de critérios de segurança na exposição à substância.
 
Ver a parte B da Introdução Geral.  
1.2. DEFINIÇÕES  
As substâncias organofosforadas  incluem os ésteres, tioésteres e 
anidridos não ionizados de ácidos organofosfóricos, organofosfóni ­
cos e organofosforamídicos ou de ácidos fosforotióicos, fosfonotiói ­
cos e fosforotioamídicos afins, bem como quaisquer outras substân ­
cias que possam causar o tipo de neurotoxicidade retardada que se 
observa por vezes nas referidas classes de substâncias.  
Neurotoxicidade retardada  é a síndrome associada à manifestação 
retardada de ataxia e de axonopatias distais na espinal medula e nos 
nervos periféricos, bem como à inibição e a redução da actividade da esterase envolvida na neuropatia, presente no tecido nervoso.
 
1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
A substância em estudo é administrada por via oral a galinhas do ­
mésticas, durante 28 dias. Os animais são observados pelo menos 
diariamente, registando-se a manifestação de quaisquer perturbações do comportamento, bem como de ataxia e paralisia, até 14 dias após a administração da última dose. As determinações bioquímicas, no ­
meadamente da inibição da esterase envolvida na neuropatia, são 
efectuadas com aves seleccionadas de modo aleatório em cada lote, em geral 24 e 48 horas após a administração da última dose. Duas semanas após esta última, procede-se ao abate dos restantes animais, 
seguido do exame histopatológico de determinados tecidos do sis ­
tema nervoso.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 552
 
1.4. DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
1.4.1.  Preparação  
Seleccionam-se de modo aleatório galinhas adultas, jovens e saudá ­
veis, isentas de afecções virais e medicação concomitantes, bem 
como de anomalias da marcha, que se repartem pelos lotes de ensaio 
e de controlo. Os animais são aclimatados às condições de labora ­
tório durante pelo menos cinco dias antes do início do ensaio.  
Devem utilizar-se gaiolas ou recintos cujas dimensões permitam a 
livre mobilidade das aves e a fácil observação da respectiva marcha.  
A substância em estudo é administrada por via oral, por intermédio 
de uma sonda gástrica, de cápsulas de gelatina ou de um método comparável. Os líquidos podem ser administrados sem diluição ou 
dissolvidos num veículo adequado, nomeadamente óleo de milho; os 
sólidos devem ser dissolvidos sempre que possível, uma vez que a absorção de doses elevadas de sólidos dispersos em cápsulas de gelatina poderá não ser eficaz. No caso de se utilizar um veículo 
não aquoso, devem conhecer-se, ou determinar-se antes do ensaio, as 
respectivas características de toxicidade.
 
1.4.2.  Condições de ensaio  
1.4.2.1.  Animais de ensaio  
Recomenda-se a utilização de galinhas poedeiras, adultas e jovens 
(Gallus gallus domesticus ), com idade compreendida entre 8 e 
12 meses. Devem utilizar-se raças e variedades correntes, manten ­
do-se os animais em condições que permitam a sua livre mobilidade.  
1.4.2.2.  Número e sexo  
Devem utilizar-se pelo menos três lotes de ensaio e um lote de 
controlo com o veículo. Os animais incluídos no lote de controlo 
com o veículo devem ser tratados de modo análogo aos animais do lote de ensaio, omitindo-se apenas a administração da substância em estudo.
 
Deve utilizar-se um número suficiente de animais em cada lote, de 
modo a que possam ser abatidos pelo menos seis animais para as determinações bioquímicas (três em dois momentos diferentes), so ­
brevivendo seis para o período de observação de 14 dias após a 
administração da última dose.
 
1.4.2.3.  Doses  
Na selecção das doses devem ter-se em conta os resultados dos 
ensaios de neurotoxicidade retardada por administração aguda, bem 
como quaisquer outros dados disponíveis em matéria de toxicidade e cinética referentes à substância em causa. A dose mais elevada deve ser escolhida com o objectivo de induzir efeitos tóxicos, nomeada ­
mente de neurotoxicidade retardada, evitando contudo a morte e o 
sofrimento intenso. Posteriormente, deve seleccionar-se uma sequên ­
cia decrescente de doses, com o objectivo de evidenciar uma corre ­
lação entre a dose administrada e a reacção observada, bem como a 
ausência de efeitos nocivos associados à administração da dose mais 
reduzida.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 553
 
1.4.2.4.  Ensaio-limite  
Sempre que um ensaio, realizado de acordo com o presente método, 
que utilize uma dose de, pelo menos, 1 000 mg/kg de massa corporal/dia, não produza efeitos tóxicos observáveis, ou se, tendo 
em conta dados referentes a substâncias estruturalmente afins, não se 
preveja a manifestação de efeitos tóxicos, poderá não ser necessário efectuar um ensaio com uma dose mais elevada. Nestes casos, jus ­
tifica-se a realização de um ensaio-limite, excepto se a exposição 
humana indicar a necessidade de recurso a uma dose superior.
 
1.4.2.5.  Período de observação  
Os animais devem ser observados com uma frequência pelo menos 
diária no decurso do período de exposição e nos 14 dias subsequen ­
tes à administração da última dose, salvo no caso de se proceder a 
autópsias intermédias.  
1.4.3.  Procedimento  
Deve administrar-se a substância aos animais sete dias por semana, 
num período de 28 dias.  
1.4.3.1.  Observações gerais  
Devem iniciar-se as observações logo após a administração da pri ­
meira dose. Os animais devem ser cuidadosamente observados com 
uma frequência diária mínima, no decurso do período de exposição e 
nos 14 dias subsequentes à administração da última dose, ou até ao abate previsto. As observações devem incluir, nomeadamente, as anomalias de comportamento. A ataxia deve determinar-se de acordo 
com uma escala numérica constituída por um mínimo de quatro 
níveis, devendo também registar-se os casos de paralisia. Pelo menos duas vezes por semana, devem retirar-se das gaiolas os animais seleccionados para observação patológica, submetendo-os a um pe ­
ríodo de actividade motora forçada, nomeadamente a subida de uma 
escada, de modo a facilitar a observação de efeitos tóxicos mínimos. Os animais moribundos, bem como aqueles que mostrem sinais de dor e sofrimento intensos, devem ser removidos, abatidos por inter ­
venção humana e autopsiados.
 
1.4.3.2.  Massa corporal  
As aves devem ser pesadas imediatamente antes da administração da 
primeira dose e, pelo menos, uma vez por semana na sequência da mesma.
 
1.4.3.3.  Determinações bioquímicas  
Alguns dias após a administração da última dose, devem abater-se 
seis aves seleccionadas de modo aleatório dos lotes de ensaio e de 
controlo com o veículo, preparando-se os respectivos cérebros e espinais medulas com vista a determinar a inibição da actividade da esterase envolvida na neuropatia. Além disso, pode também re ­
velar-se útil preparar, para o mesmo fim, tecidos provenientes dos 
nervos ciáticos. Em geral, abatem-se três animais do lote de controlo e de cada lote de ensaio 24 horas após a administração da última 
dose e três 48 horas após a mesma. Podem utilizar-se outros inter ­
valos de abate, apresentando a respectiva justificação, caso os dados provenientes de ensaios de toxicidade aguda ou de outro tipo de estudos (nomeadamente de toxicocinética) mostrem que esses inter ­
valos são mais adequados.
 
Se for caso disso, podem também efectuar-se determinações de ace ­
tilcolinesterase com as amostras em causa. Todavia, a possível ocor ­
rência  in vivo  de reactivação espontânea da mesma poderá levar a 
subestimar a capacidade de inibição da acetilcolinesterase da subs ­
tância em estudo.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 554
 
1.4.3.4.  Autópsia  
A autópsia dos animais abatidos (abates previstos e abates de ani ­
mais moribundos) deve incluir o exame macroscópico do cérebro e da espinal medula.
 
1.4.3.5.  Exame histopatológico  
O tecido nervoso dos animais sobreviventes após o período de observa ­
ção que não for utilizado para as determinações bioquímicas deve ser objecto de exame microscópico. Os tecidos devem ser fixados  in situ,  por 
recurso a técnicas de perfusão. As secções a examinar incluem o cerebelo 
(ao nível meio-longitudinal), a  medulla oblongata,  a espinal medula e os 
nervos periféricos. Devem recolher-se secções da espinal medula prove ­
nientes do segmento cervical superior e das regiões médio-torácica e 
lombo-sagrada. Devem também recolher-se secções provenientes da re ­
gião distal do nervo tibial e das respectivas ramificações para o músculo gastroenémio, bem como do nervo ciático. As secções em causa devem ser coradas com corantes adequados à mielina e corantes específicos dos 
axónios. Inicialmente, o exame microscópico deve abranger apenas os 
tecidos conservados dos animais do lote de controlo e do lote a que foi administrada a dose mais elevada; se, neste último caso, se observarem efeitos tóxicos, deve efectuar-se também o exame microscópico dos 
tecidos provenientes dos animais dos lotes a que foram administradas 
doses reduzidas e intermédias.
 
2. DADOS  
A obtenção de resultados negativos para os parâmetros bioquímicos, 
histopatológicos e de comportamento investigados no âmbito do 
presente ensaio não implica, de modo geral, a realização de ensaios complementares de neurotoxicidade retardada. A obtenção de resul ­
tados duvidosos ou não conclusivos poderá requerer a realização de 
estudos complementares.
 
Devem registar-se os dados relativos a cada animal. Além disso, 
todos os dados devem ser resumidos num quadro, referindo-se, 
para cada lote de ensaio, o número de animais utilizados, o número 
de animais que apresentem lesões e alterações de comportamento ou dos parâmetros bioquímicos, bem como o tipo e a gravidade das referidas lesões, e a percentagem de animais que apresentam cada 
tipo de lesões e alterações, em função da respectiva gravidade.
 
Os resultados do ensaio devem ser avaliados em termos de incidên ­
cia, gravidade e correlação das alterações de comportamento, bem 
como dos efeitos bioquímicos, histopatológicos e outros efeitos ob ­
servados nos lotes de ensaio e de controlo.  
Sempre que possível, os resultados numéricos devem ser avaliados 
por recurso a um método estatístico de aceitação geral, cuja escolha deve ser efectuada na fase de concepção do ensaio.
 
3. RELATÓRIO  
RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deve incluir, sempre que possível, as seguintes 
informações:  
3.1. Animais utilizados no ensaio:  
— estirpe utilizada;  
— número e idade dos animais;  
— proveniência, condições de alojamento, etc.;  
— massa de cada animal no início do ensaio.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 555
 
3.2. Condições de ensaio:  
— pormenores relativos à preparação da substância em estudo e à 
respectiva estabilidade e homogeneidade, se for caso disso;  
— justificação da escolha do veículo;  
— pormenores relativos à administração da substância em estudo;  
— pormenores relativos à qualidade dos alimentos e da água;  
— motivo da selecção das doses utilizadas;  
— especificação das doses administradas, incluindo pormenores re ­
lativos ao veículo, bem como ao volume utilizado e às caracte ­
rísticas físicas da substância administrada;  
— motivos da selecção de outros intervalos para as determinações 
bioquímicas que não 24 ou 48 horas após a administração da 
última dose.  
3.3. Resultados:  
— dados relativos à massa corporal;  
— reacções tóxicas observadas por dose administrada, incluindo a 
mortalidade;  
— nível sem efeitos adversos observáveis;  
— natureza, gravidade e duração dos sinais clínicos (reversíveis ou 
não);  
— descrição pormenorizada dos ensaios bioquímicos realizados e 
respectivos resultados;  
— dados obtidos por autópsia;  
— descrição pormenorizada dos resultados do exame histopatológi ­
co; 
— tratamento estatístico dos resultados, se for caso disso.  
Discussão dos resultados.  
Conclusões.  
4. REFERÊNCIAS  
O presente método é análogo ao método OCDE TG 419.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 556
 
B.39.  ENSAIO  IN VIVO  DA SÍNTESE NÃO PROGRAMADA (UDS) 
DE ADN EM CÉLULAS DO FÍGADO DE MAMÍFEROS  
1. MÉTODO  
O presente método é idêntico ao método OCDE TB 486 — Ensaio  
in vivo  da síntese não programada (UDS) de ADN em células do 
fígado de mamíferos (1997).  
1.1. INTRODUÇÃO  
O objectivo do ensaio  in vivo  da síntese não programada (UDS) de 
ADN em células do fígado de mamíferos é identificar as substâncias que induzem a reparação do ADN nas células do fígado de animais 
expostos à substância em estudo (1) (2) (3) (4).
 
O presente ensaio  in vivo  apresenta um método para investigação dos 
efeitos dos produtos químicos genotóxicos sobre o fígado. O valor 
limite medido é indicativo dos danos e da subsequente reparação do 
ADN em células do fígado. O fígado é geralmente o local principal de metabolização dos compostos absorvidos, pelo que é particular ­
mente apropriado para avaliar os danos do ADN  in vivo.
 
Se existirem provas de que nem a substância em estudo nem nenhum 
dos seus metabolitos reactivos entram em contacto com o tecido objectivo, o presente ensaio não é apropriado.
 
O ponto final da síntese não programada (UDS) de ADN é medido 
através da determinação da incorporação de nucleótidos marcados 
por células que não se encontram numa fase de síntese programada de ADN (fase S). A técnica mais utilizada é a determinação da incorporação de timidina marcada com trítio (
 3 H-TdR) por autora ­
diografia. Nos ensaios UDS  in vivo  são geralmente utilizados fígados 
de rato. Podem também ser utilizados outros tecidos, mas não é esse o objectivo do presente método.
 
A detecção de uma resposta UDS depende do número de bases do 
ADN excizadas e substituídas no local danificado. Por conseguinte, o ensaio UDS é particularmente válido para a detecção de «reparação de cadeias longas» (20-30 bases) induzida pela substância. A «repa ­
ração de cadeias curtas» (1-3 bases) é, pelo contrário, detectada com 
uma sensibilidade muito mais baixa. Além disso, podem existir even ­
tos mutagénicos decorrentes da não reparação, reparação incorrecta ou de problemas de replicação das lesões do ADN. A extensão da 
resposta UDS não dá qualquer indicação em relação à fidelidade do 
processo de reparação. Além disso, é possível que um agente muta ­
géneo reaja com o ADN mas que os danos do ADN não sejam posteriormente reparados através de um processo de reparação da 
excisão. A ausência de informação específica sobre a actividade 
mutagénica do ensaio UDS é compensada pela potencial sensibili ­
dade do seu ponto final, uma vez que é medido na totalidade do genoma.
 
Ver também a parte B da Introdução Geral.  
1.2. DEFINIÇÕES  
Células em reparação:  apresentam uma granulação nuclear líquida 
(NNG) superior a um valor pré-determinado, a justificar pelo labo ­
ratório que conduz o ensaio.  
Granulação nuclear líquida (NNG):  medida quantitativa da activi ­
dade celular UDS em ensaios autoradiográficos UDS, calculada pela 
subtracção do número médio de grânulos citoplásmicos em sectores citoplásmicos equivalentes ao núcleo (CG) ao número de grânulos nucleares (NG): NNG = NG — CG. As contagens NNG são calcu ­
ladas para cada célula e são depois ponderadas para as células de 
uma cultura, em culturas paralelas, etc.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 557
 
Síntese não programada (UDS) de ADN:  síntese de reparação do 
ADN após excisão e remoção de uma sequência de ADN que con ­
tém uma região danificada por indução de substâncias químicas ou de agentes físicos.
 
1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
O ensaio UDS  in vivo  em células do fígado de mamíferos indica a 
ocorrência de uma síntese de reparação do ADN após excisão e 
remoção de uma sequência de ADN que continha uma região dani ­
ficada por indução de substâncias químicas ou de agentes físicos. O ensaio baseia-se geralmente na incorporação de
 3 H-TdR no ADN de 
células do fígado com uma baixa proporção de células na fase S do 
ciclo celular. A incorporação de  3 H-TdR é geralmente determinada 
por autoradiografia, uma vez que esta técnica não é tão sensível à interferência das células em fase S como, por exemplo, a contagem de cintilação em meio líquido.
 
1.4. DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
1.4.1.  Preparação  
1.4.1.1.  Selecção das espécies animais  
Geralmente são utilizados ratos, embora possa ser utilizada qualquer 
outra espécie de mamífero apropriada. Devem ser utilizados animais 
adultos saudáveis jovens das raças de laboratório mais comuns. 
No início do estudo, a diferença de peso entre os animais deve ser mínima, não devendo exceder ± 20 % do peso médio de cada sexo.
 
1.4.1.2.  Condições de acomodação e alimentação  
Devem ser aplicadas as condições gerais referidas na Introdução 
Geral, parte B, embora o objectivo para a humidade deva ser de 
50 %-60 %.  
1.4.1.3.  Preparação dos animais  
Os animais adultos saudáveis jovens são distribuídos aleatoriamente 
pelos grupos de controlo e pelos grupos expostos. As gaiolas devem 
ser dispostas de modo a que eventuais efeitos devidos à respectiva 
colocação sejam minimizados. Os animais são identificados de forma inequívoca, devendo ser aclimatados às condições de laboratório durante pelo menos cinco dias antes de se iniciar o estudo.
 
1.4.1.4.  Preparação das doses  
As substâncias sólidas devem ser dissolvidas ou suspensas em sol ­
ventes ou veículos adequados e, se necessário, diluídas antes de serem administradas aos animais. As substâncias líquidas podem ser adicionadas directamente aos sistemas em estudo e/ou diluídas 
antes de serem adicionadas às células. Devem ser utilizadas prepa ­
rações frescas da substância em estudo, a menos que os dados de estabilidade demonstrem que o respectivo armazenamento não coloca problemas para o ensaio.
 
1.4.2.  Condições do ensaio  
1.4.2.1.  Solvente/veículo  
O solvente/veículo não deve reagir com a substância em estudo, não 
devendo produzir efeitos tóxicos nas doses utilizadas. Caso se utili ­
zem solventes/veículos cujas propriedades não se encontrem total ­
mente elucidadas, devem fornecer-se dados que justifiquem a sua 
compatibilidade. Sempre que possível, recomenda-se a utilização 
de um solvente/veículo aquoso.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 558
 
1.4.2.2.  Controlos  
Cada experiência deve incluir em paralelo controlos positivos e ne ­
gativos (solvente/veículo). Com excepção da exposição à substância em estudo, todos os animais, incluindo os dos grupos de controlo, 
devem ser manuseados de forma idêntica.
 
Os controlos positivos devem ser substâncias comprovadamente cau ­
sadoras de UDS quando administradas aos níveis de exposição a que se espera o surgimento de um aumento detectável em relação à linha 
de base. Os controlos positivos que exijam activação metabólica 
devem ser utilizados em doses que desencadeiem uma resposta mo ­
derada (4). A dose de controlo positiva a administrar deve ser esco ­
lhida de modo a que os seus efeitos sejam claros mas também a que 
as lâminas codificadas não sejam imediatamente identificadas pela 
pessoa que procede às leituras. As substâncias de controlo positivo podem incluir, por exemplo:
 
Tempo de amostragem Substância Número CAS Número EINECS  
Amostragens iniciais (2-4 horas) N-nitrosodimetilamina 62-75-9 200-249-8 
Amostragens finais (12-16 horas) N-2-fluorenilacetamida (2-AAF) 53-96-3 200-188-6  
Podem ser utilizadas outras substâncias de controlo positivo apro ­
priadas. O controlo positivo pode ser administrado por uma via diferente da substância em estudo.
 
1.5. PROCEDIMENTO  
1.5.1.  Número e sexo de animais  
Deve ser utilizado um número de animais suficiente para que a 
variação biológica natural seja tomada em consideração nos resulta ­
dos do ensaio, com pelo menos três animais analisáveis por grupo. Se já existir uma base de dados históricos significativa, os grupos de controlo positivo e negativo poderão conter apenas um ou dois ani ­
mais.
 
Se no momento do estudo existirem dados disponíveis de estudos 
com as mesmas espécies e com utilização da mesma via de adminis ­
tração que demonstrem que não há qualquer diferença substancial de 
toxicidade entre os sexos, será suficiente testar um único sexo, de 
preferência o sexo masculino. Nos casos em que a exposição humana aos produtos químicos possa ser específica a cada sexo, como acon ­
tece com alguns produtos farmacêuticos, o ensaio deve ser executado 
com animais do sexo em causa.
 
1.5.2.  Programação do tratamento  
As substâncias de ensaio são preferivelmente administradas numa 
única exposição.  
1.5.3.  Doses  
Normalmente, são utilizadas pelo menos duas doses diferentes. A 
dose mais elevada é definida como a dose que produz sinais de toxicidade tais que indiquem que a utilização de doses superiores, com o mesmo regime de administração, produzirá mortalidade. Em 
termos gerais, a dose inferior deve ser de 25 %-50 % da dose mais 
elevada.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 559
 
As substâncias com actividade biológica específica em doses baixas 
e não tóxicas (como acontece com as hormonas e agentes mitogéni ­
cos) poderão constituir uma excepção aos critérios de fixação da dose, devendo ser avaliadas caso a caso. Se for realizado um estudo para avaliação da gama de doses a administrar, por não estarem 
disponíveis dados apropriados, esse estudo deve ser executado no 
mesmo laboratório, utilizando as mesmas espécies, linha celular, sexo e regime de exposição a utilizar no estudo principal.
 
A dose mais elevada pode igualmente ser definida como uma dose 
que produz algumas indicações de toxicidade no fígado (por exem ­
plo, núcleos picnóticos).  
1.5.4.  Ensaio-limite  
Se um ensaio com uma dose de pelo menos 2 000 mg/kg de peso 
corporal numa única exposição ou em duas exposições no mesmo 
dia não produzir nenhum efeito tóxico perceptível e se não for previsível a existência de toxicidade genética com base nos dados 
respeitantes a substâncias estruturalmente relacionadas, poderá não 
ser considerado necessário um estudo completo. A exposição pre ­
vista para o ser humano pode indicar a necessidade de se utilizarem doses mais elevadas nos ensaios-limite.
 
1.5.5.  Administração das doses  
A substância em estudo é geralmente administrada por sonda esofá ­
gica, utilizando um tubo estomacal ou cânula de intubação apropria ­
da. Poderão ser aceites, mediante justificação, outras vias de admi ­
nistração, mas a via intraperitoneal não é recomendada, uma vez que poderá expor o fígado à substância em estudo directamente e não através do sistema circulatório. O volume máximo de líquido que 
pode ser administrado de cada vez por sonda esofágica ou por in ­
jecção depende também do tamanho do animal de ensaio, não de ­
vendo exceder 2 ml/100 g de peso corporal. A utilização de volumes mais elevados deve ser justificada. Com excepção das substâncias 
que causem irritação ou que sejam corrosivas, cujos efeitos serão 
normalmente agravados em concentrações mais altas, a variabilidade do volume de ensaio deve ser minimizada através do ajustamento das concentrações, por forma a garantir um volume constante para 
todas as doses a administrar.
 
1.5.6.  Preparação das células de fígado  
As células do fígado são normalmente preparadas a partir dos animais 
expostos à substância em estudo 12-16 horas após a administração da 
substância em estudo. Geralmente será necessário realizar uma pri ­
meira amostra (normalmente 2-4 horas após a exposição), que só não terá de ser utilizada quando haja uma resposta positiva clara às 12-16 
horas. Contudo, podem ser utilizados outros tempos de amostragem, 
desde que sejam justificados com base em dados toxicocinéticos.
 
As culturas celulares de curta duração do fígado de mamíferos são 
geralmente preparadas irrigando o fígado  in situ  com colagenase e dei ­
xando que algumas células livres separadas do fígado há pouco tempo se 
fixem a uma superfície apropriada. As células do fígado de animais do controlo negativo devem ter uma viabilidade de pelo menos 50 % (5).
 
1.5.7.  Determinação da UDS  
As células de fígado de mamífero isoladas há pouco tempo são 
geralmente incubadas num meio que contém  3 H-TdR durante um 
período adequado, por exemplo 3-8 horas. No final do período de 
incubação, as células são lavadas para remover o meio residual e 
depois incubadas num meio com excesso de timidina não rotulada para diminuir a radioactividade não incorporada («lavagem a frio»). As células são então enxaguadas, fixadas e secas. Para os tempos de 
incubação mais prolongados, pode não ser necessária a lavagem a 
frio. As lâminas são mergulhadas na emulsão autoradiográfica, ex ­
postas na obscuridade (ou seja, refrigeradas durante 7-14 dias), re ­
veladas e coradas, após o que se procede à contagem dos grânulos de 
prata expostos. Devem ser preparadas duas ou três lâminas de cada 
animal.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 560
 
1.5.8.  Análise  
As preparações devem conter um número suficiente de células com 
morfologia normal para permitir uma avaliação significativa da UDS. As preparações são examinadas microscopicamente para sinais de 
citotoxicidade evidente (por exemplo, picnose, níveis diminuídos 
de radiação proveniente da timina rotulada).
 
As lâminas devem ser codificadas antes da contagem dos grânulos. 
Normalmente são contadas 100 células de cada animal, de pelo menos 
duas lâminas; se forem contadas menos de 100 células/animal, deve ser 
fornecida uma justificação. As contagens dos grânulos dos núcleos em fase S não são tomadas em consideração, mas a proporção de células em fase S pode ser registada.
 
O grau de incorporação da  3 H-TdR nos núcleos e citoplasma das 
células morfologicamente normais, evidenciado pelo depósito de grâ ­
nulos de prata, deve ser determinado por métodos apropriados.  
As contagens de grânulos são determinadas nos núcleos (grânulos 
nucleares, NG) e em sectores do citoplasma equivalentes ao núcleo 
(grânulos citoplásmicos, CG). As contagens de CG são feitas no 
sector do citoplasma mais rotulado ou fazendo a média de dois ou três locais com grânulos citoplásmicos escolhidos aleatoriamente junto à região do núcleo. Outros métodos de contagem (por 
exemplo, contagem de células inteiras) podem ser utilizados, se se 
justificarem (6).
 
2. DADOS  
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS  
Devem ser apresentados dados relativos a cada lâmina e a cada 
animal. Para além disso, todos os dados devem ser apresentados sob a forma de um quadro. As contagens de granulação nuclear 
líquida (NNG) devem ser calculadas para cada célula, para cada 
animal, para cada dose e para cada tempo de colheita subtraindo as contagens CG das contagens NG. Se forem contadas as «células em reparação», os critérios para definir essas células devem ser 
justificados e baseados em dados históricos ou dos controlos nega ­
tivos realizados em paralelo com o ensaio. Os resultados numéricos podem ser avaliados através de métodos estatísticos. Os métodos estatísticos a utilizar eventualmente devem ser escolhidos e justifica ­
dos antes da realização do estudo.
 
2.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS  
Os exemplos de critérios para a definição de uma resposta como 
positiva/negativa incluem: 
positiva i) Valores de NNG positivos, acima de um li ­
miar pré-definido justificado com base nos 
dados históricos do laboratório; ou 
ii) Valores de NNG significativamente superiores 
aos do controlo em paralelo; 
negativa i) Valores de NNG iguais/inferiores ao limiar de 
controlo histórico; ou 
ii) Valores de NNG não significativamente supe ­
riores aos do controlo em paralelo.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 561
 
A importância biológica dos dados deve ser considerada, ou seja, 
devem ser tomados em consideração parâmetros como a variação de 
animal para animal, a relação dose/resposta e a citotoxicidade. Como auxílio para a avaliação dos resultados dos ensaios, poderão ser utilizados métodos estatísticos, embora a significância estatística 
não deva ser o único elemento para a determinação de uma resposta 
positiva.
 
Embora a maioria de experiências tenha resultados claramente posi ­
tivos ou negativos, em casos raros o conjunto dos dados não per ­
mitirá que se obtenha uma opinião inequívoca sobre a actividade da substância em estudo, podendo acontecer que os resultados conti ­
nuem a ser ambíguos ou duvidosos independentemente do número 
de vezes que a experiência seja repetida.
 
Um resultado positivo no ensaio UDS em células do fígado de 
mamíferos  in vivo  indica que a substância em estudo induz danos 
no ADN das células do fígado de mamíferos  in vivo  que podem ser 
reparados por síntese não programada de ADN  in vitro.  Um resul ­
tado negativo indica que, nas condições do ensaio, a substância em estudo não induz danos no ADN que sejam detectáveis pelo presente ensaio.
 
Deve ser discutida a probabilidade de a substância em estudo ou os 
seus metabolitos alcançarem o sistema circulatório geral ou especi ­
ficamente o tecido objectivo (ou seja, a toxicidade sistémica).  
3. APRESENTAÇÃO DE RELATÓRIOS  
RELATÓRIO DE ENSAIO  
O relatório de ensaio deve incluir a seguinte informação:  
Solvente/veículo:  
— justificação para a escolha do veículo,  
— solubilidade e estabilidade da substância em estudo no solvente/ ­
veículo, se conhecida.  
Animais de ensaio:  
— espécie/linha celular utilizada,  
— número, idade e sexo dos animais,  
— origem, condições de acomodação, alimentação, etc.,  
— peso de cada animal no início do ensaio, incluindo a gama de 
pesos, a respectiva média e o desvio-padrão para cada grupo.  
Condições de ensaio:  
— controlos positivos e negativos veículo/solvente,  
— resultados do estudo para definição da gama de doses, quando 
tenha sido realizado,  
— justificação para a selecção das doses,  
— preparação da substância em estudo,  
— modo de administração da substância em estudo,  
— justificação da via de administração escolhida,  
— métodos usados para verificar se o agente em estudo atingiu o 
sistema circulatório geral, caso tenham sido utilizados,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 562
 
— conversão da concentração da substância em estudo na 
alimentação/abeberação (ppm) para a dose real (mg/kg peso 
corporal/dia), quando aplicável,  
— qualidade dos alimentos e da água,  
— descrição pormenorizada dos calendários de tratamento e amos ­
tragem,  
— métodos de medição da toxicidade,  
— método de preparação e cultura das células do fígado,  
— técnica de autoradiografia utilizada,  
— número de lâminas preparadas e número de células contabiliza ­
das, 
— critérios de avaliação,  
— critérios definidos para que o estudo seja considerado positivo, 
negativo ou não conclusivo.  
Resultados:  
— valores médios das contagens de grânulos nucleares, grânulos 
citoplásmicos e da granulação nuclear líquida para cada lâmina, 
animal e grupo,  
— relação dose-resposta, quando seja possível de determinar,  
— análise estatística, quando tenha sido realizada,  
— sinais de toxicidade,  
— dados relativos aos controlos positivos e negativos (solvente/ ­
veículo) realizados em paralelo com o ensaio,  
— dados históricos relativos aos controlos positivos e negativos 
(solvente/veículo) realizados em paralelo com o ensaio, com as 
respectivas gama, valor médio e desvio-padrão,  
— número de células «em reparação», caso tenham sido contabili ­
zadas,  
— número de células em fase S, caso tenham sido contadas,  
— viabilidade das células.  
Discussão dos resultados.  
Conclusões.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) Ashby, J., Lefevre, P.A., Burlinson, B. and Penman, M.G., 
(1985) An Assessment of the  In Vivo  Rat Hepatocyte DNA 
Repair Assay. Mutation Res., 156, p. 1-18.  
(2) Butterworth, B.E., Ashby, J., Bermudez, E., Casciano, D., Mir ­
salis, J., Probst, G. and Williams, G., (1987) A Protocol and 
Guide for the  In Vivo  Rat Hepatocyte DNA-Repair Assay. 
Mutation Res. 189, p. 123-133.  
(3) Kennelly, J.C., Waters, R., Ashby, J., Lefevre, P.A., Burlinson, 
B., Benford, D.J., Dean, S.W. and Mitchell, I. de G., (1993)  In 
Vivo Rat Liver UDS Assay. In: Kirkland D.J. and Fox M., 
(Eds) Supplementary Mutagenicity Tests: UKEM Recommen ­
ded Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mu ­
tagenicity Testing. Report. Part II revised. Cambridge Univer ­
sity Press, Cambridge, New York, Port Chester, Melbourne, 
Sydney, p. 52-77.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 563
 
(4) Madle, S., Dean, S.W., Andrae, U., Brambilla, G., Burlinson, 
B., Doolittle, D.J., Furihata, C., Hertner, T., McQueen, C.A. 
and Mori, H., (1993) Recommendations for the Performance of UDS Tests  In Vitro  and  In Vivo . Mutation Res., 312, 
p. 263-285.
 
(5) Fautz, R., Hussain, B., Efstathiou, E. and Hechenberger-Freudl, 
C., (1993) Assessment of the Relation Between the Initial Viability and the Attachment of Freshly Isolated Rat Hepato ­
cytes Used for the  In Vivo/In Vitro  DNA Repair Assay (UDS). 
Mutation Res., 291, p. 21-27.
 
(6) Mirsalis, J.C., Tyson, C.K. and Butterworth, B.E., (1982) De ­
tection of Genotoxic Carcinogens in the  In Vivo/In Vitro  He­
patocyte DNA Repair Assay. Environ. Mutagen, 4, p. 553-562.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 564
 
B.40.  CORROSÃO DA PELE  IN VITRO : ENSAIO DA RESISTÊNCIA 
ELÉCTRICA TRANSCUTÂNEA (RET)  
1. MÉTODO  
Este método de ensaio é equivalente ao OECD TG 430 (2004).  
1.1. INTRODUÇÃO  
Entende-se por corrosão da pele a produção de danos irreversíveis 
nos tecidos cutâneos por aplicação de uma matéria em estudo (defi ­
nida de acordo com o sistema harmonizado global de classificação e 
rotulagem das misturas e substâncias químicas) (1). O presente mé ­
todo permite determinar a corrosividade sem recorrer a animais vi ­
vos. 
A determinação da corrosividade cutânea tem normalmente feito uso 
de animais de laboratório (2). A preocupação com a dor e o sofri ­
mento inerentes a esse processo levou à revisão do método de ensaio B.4, tendo passado a ser possível determinar a corrosão da pele por métodos alternativos ( in vitro ), que evitam a dor e o sofrimento de 
animais.
 
A primeira etapa com vista à definição de ensaios alternativos que 
pudessem ser utilizados na determinação da corrosividade cutânea num contexto legislativo foi a realização de estudos de pré-validação (3). Seguidamente, foi realizado um estudo com vista à validação 
formal de métodos  in vitro  para a determinação da corrosão da pele 
(4) (5) (6) (7) (8). O resultado desses estudos e outra literatura publicada conduziram à recomendação de que poderiam ser utiliza ­
dos para determinar a corrosividade cutânea  in vivo  (9) (10) (11) o 
ensaio em modelos de pele humana (ver o método de ensaio B.40.A) 
e o presente ensaio (ensaio da resistência eléctrica transcutânea).
 
Um estudo de validação e outros estudos publicados concluíram que 
o ensaio da resistência eléctrica transcutânea (RET) em pele de rato (12) (13) permite distinguir com fiabilidade as substâncias reconhe ­
cidamente corrosivas da pele das que o não são (5) (9).
 
O ensaio descrito no presente método permite identificar misturas e 
substâncias químicas corrosivas. Permite igualmente identificar mis ­
turas e substâncias químicas não-corrosivas, quando associado a ou ­
tras informações disponíveis (por exemplo, pH, relações estrutura- 
-actividade, dados humanos ou em animais) que corroborem tais 
características (1) (2) (11) (14). O método não dá informações sobre a irritação da pele, nem permite dividir as substâncias corrosivas em categorias (como as previstas no sistema de classificação harmoni ­
zado global) (1).
 
Para uma avaliação completa dos efeitos locais na pele após uma 
exposição única por via dérmica recomenda-se a aplicação da estra ­
tégia de ensaio sequencial apensa ao método de ensaio B.4 (2) e associada ao sistema harmonizado global (1). Essa estratégia de ensaio inclui a realização de ensaios de corrosão da pele (descritos 
no presente método) e de irritação da pele  in vitro  antes de ser 
ponderada a realização de ensaios em animais vivos.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 565
 
1.2. DEFINIÇÕES  
Corrosão da pele  in vivo : Produção de danos irreversíveis à pele, 
nomeadamente a necrose visível da epiderme, prolongando-se para a derme, após a aplicação de uma substância em estudo durante um 
máximo de quatro horas. São exemplos típicos de reacções corrosi ­
vas as úlceras, hemorragias e escaras sanguinolentas e, para o final do período de observação de 14 dias, a descoloração, devido à perda de pigmentação da pele, a formação de zonas de alopecia total e a 
ocorrência de cicatrizes. As lesões duvidosas poderão ser esclareci ­
das por métodos histopatológicos.
 
Resistência eléctrica transcutânea (RET):  Valor da resistência em 
kΩ medido para a impedância eléctrica da pele. Trata-se de um 
método simples e robusto de avaliação da função de barreira por 
meio do registo do fluxo iónico através da pele com uma ponte de 
Wheatstone.  
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Quadro 1  
Substâncias químicas de referência  
Denominação Número EINECS Número CAS  
1,2-Diaminopropano 201-155-9 78-90-0 Extremamente corrosivo 
Ácido acrílico 201-177-9 79-10-7 Extremamente corrosivo 2-terc-Butilfenol 201-807-2 88-18-6 Corrosivo Hidróxido de potássio (10 %) 215-181-3 1310-58-3 Corrosivo Ácido sulfúrico (10 %) 231-639-5 7664-93-9 Corrosivo Ácido octanóico (ácido caprílico) 204-677-5 124-07-02 Corrosivo 
4-Amino-1,2,4-triazole 209-533-5 584-13-4 Não corrosivo 
Eugenol 202-589-1 97-53-0 Não corrosivo Brometo de fenetilo 203-130-8 103-63-9 Não corrosivo Tetracloroetileno 204-825-9 27-18-4 Não corrosivo Ácido isoesteárico 250-178-0 30399-84-9 Não corrosivo 4-(Metiltio)-benzaldeído 222-365-7 3446-89-7 Não corrosivo
 
A maioria das substâncias químicas constantes do quadro foi reto ­
mada da lista seleccionada para o estudo de validação internacional do ECVAM (4). A selecção baseia-se nos seguintes critérios:
 
i) Número idêntico de substâncias corrosivas e não corrosivas;  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 566
 
ii) Substâncias disponíveis no comércio e da maioria das classes 
químicas pertinentes;  
iii) Inclusão de substâncias extremamente corrosivas e de substân ­
cias menos corrosivas, para possibilitar uma diferenciação com base no poder corrosivo;
 
iv) Escolha de substâncias químicas que podem ser manuseadas no 
laboratório sem outros perigos graves além da corrosividade.  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Aplica-se a matéria em estudo, durante 24 horas, sobre a superfície 
epidérmica de discos cutâneos num sistema de ensaio com dois compartimentos, no qual o disco estabelece a separação entre os compartimentos. Os discos cutâneos são retirados de ratos com 28 
a 30 dias de idade, mortos sem crueldade. As matérias corrosivas são 
identificadas pela sua capacidade de causarem uma perda da integri ­
dade normal do  stratum corneum  e da função de barreira, perda essa 
que é medida pela descida da RET abaixo de um determinado limite 
(12). Para determinação da RET na pele do rato, foi seleccionado um 
valor-limite de 5 k Ω, com base numa multiplicidade de dados obti ­
dos com uma vasta gama de substâncias químicas, situando-se a grande maioria dos valores claramente muito acima (frequentemente 
> 10 kΩ) ou muito abaixo (frequentemente < 3 k Ω) desse valor (12). 
Em geral, as matérias não corrosivas para os animais, mas simples ­
mente irritantes (ou não irritantes), não reduzem a RET abaixo da ­
quele valor-limite. A utilização de outras preparações cutâneas ou de 
outros equipamentos pode alterar o valor-limite, necessitando da 
correspondente validação.
 
O método inclui uma etapa de ligação de um corante, para a con ­
firmação dos resultados positivos na determinação da RET (incluindo 
próximos de 5 k Ω). A etapa de ligação do corante esclarece se o 
aumento de permeabilidade iónica se deve à destruição física do  
stratum corneum.  O método de determinação da RET em pele de 
rato revelou-se capaz de prever a corrosividade  in vivo  no coelho, 
determinada pelo método de ensaio B.4 (2). De referir que o ensaio  
in vivo  da corrosividade para a pele e da irritação da pele no coelho 
é fortemente conservador, comparativamente ao ensaio do emplastro 
cutâneo em pessoas (15).  
1.5. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
7.5.7.  Os animais  
O rato é a espécie escolhida por ter sido demonstrada a sensibilidade 
da pele desses animais às substâncias químicas utilizadas no ensaio (10). A linhagem e idade do rato (no momento da colheita da pele) assumem particular importância, devendo os folículos pilosos encon ­
trar-se na fase de dormência, antes do crescimento da pilosidade 
adulta.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 567
 
Com uma pequena tosquiadora, cortam-se cuidadosamente os pêlos 
dorsais e dos flancos de ratos fêmeas ou machos jovens (linhagem 
Wistar ou comparável), com aproximadamente 22 dias de idade. Os animais são depois lavados, esfregando cuidadosamente, devendo a zona tosquiada da pele ser mergulhada numa solução antibiótica 
(contendo, por exemplo, estreptomicina, penicilina, cloranfenicol e 
anfotericina em concentrações suficientes para inibir o crescimento bacteriano). Os animais voltam a ser lavados com solução antibiótica no terceiro ou quarto dia após a primeira lavagem e são utilizados 
nos três dias seguintes à segunda lavagem, quando o  stratum cor ­
neum  tiver recuperado da tosquia.
 
1.5.2.  Preparação dos discos cutâneos  
Os animais são mortos sem crueldade entre a idade de 28 e 30 dias 
(esta idade é muito importante). Em seguida, retira-se a pele dorsal 
lateral dos animais e remove-se a gordura subcutânea em excesso, 
raspando cuidadosamente. Cortam-se discos cutâneos de aproxima ­
damente 20 mm de diâmetro. A pele pode ser guardada antes da utilização dos discos, desde que se demonstre que os dados de con ­
trolo (positivos e negativos) são equivalentes aos obtidos com pele 
fresca.
 
Cada disco cutâneo é colocado numa das extremidades de um tubo 
de politetrafluoroetileno (PTFE), com a superfície epidérmica em contacto com o tubo. A pele é bem fixada na extremidade do tubo com uma anilha tórica tensa de borracha, eliminando-se o tecido em 
excesso. As dimensões do tubo e da anilha são as indicadas na figura 
2. A anilha é a seguir envolvida em vaselina, de forma a garantir a estanquidade da sua união com o tubo de PTFE. O tubo é depois 
suspenso, com uma tampa-suporte de molas, dentro de uma câmara 
receptora com uma solução de sulfato de magnésio (MgSO
 4 ) 
154 mM (figura 1). O disco cutâneo deve ficar totalmente imerso na solução de MgSO
 4 . Cada pele de rato pode fornecer de 10 a 15 
discos cutâneos.  
Como procedimento de controlo de qualidade, antes de se iniciar o 
ensaio mede-se a resistência eléctrica de dois discos cutâneos de 
cada pele de animal. Para que os restantes discos possam ser utili ­
zados no ensaio, ambos os discos devem permitir obter valores de resistência superiores a 10 k Ω. Se o valor da resistência for inferior a 
10 kΩ os discos restantes da pele em causa serão rejeitados.
 
1.5.3.  Aplicação das substâncias em estudo e de controlo  
Para garantir a adequabilidade do modelo experimental, devem uti ­
lizar-se em paralelo, em cada estudo, uma amostra de controlo po ­
sitiva e uma amostra de controlo negativa. Devem ser utilizados para 
o efeito discos cutâneos de um só animal. Como substâncias de 
controlo sugerem-se o ácido clorídrico 10 M (positivo) e a água destilada (negativo).
 
As substâncias em estudo líquidas são aplicadas uniformemente (150 
μl) na superfície epidérmica no interior do tubo. Quando a matéria 
ensaiada for sólida, aplicar-se-á uniformemente no disco uma quan ­
tidade suficiente da mesma, de modo a cobrir toda a superfície 
epidérmica. Em seguida, deita-se água desionizada (150 μl) por 
cima do sólido e agita-se suavemente o tubo. Para garantir um con ­
tacto máximo com a pele, pode ser necessário aquecer as matérias 
sólidas a 30  o C, para fundir ou amolecer a substância em estudo, ou 
moê-las, para produzir um pó ou granulado.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 568
 
Para cada substância em estudo e substância de controlo serão uti ­
lizados três discos cutâneos. A substância em estudo é aplicada a 
uma temperatura compreendida entre 20  o C e 23  o C durante 24 
horas. Em seguida, a substância em estudo é removida por lavagem em água corrente a uma temperatura máxima de 30
 o C, até remoção 
completa.  
1.5.4.  Medições de RET  
Mede-se a impedância (RET) da pele utilizando uma ponte de 
Wheatstone de baixa tensão de corrente alternada (13). As especifi ­
cações gerais da ponte de Wheatstone são as seguintes: tensão ope ­
racional de 1 V a 3 V, corrente alternada sinusoidal ou rectangular 
de 50 Hz a 1 000 Hz e gama de medição de pelo menos 0,1 k Ω a 30 
kΩ. A ponte utilizada no estudo de validação media valores de 
indutância, capacitância e resistência até 2 000 H, 2 000 μF e 2 
MΩ, respectivamente, a frequências de 100 Hz ou 1 kHz, utilizando 
valores em série ou em paralelo. Para o ensaio RET de corrosivida ­
de, as medições são registadas em resistência, à frequência de 
100 Hz, utilizando valores em série. Antes da medição da resistência 
eléctrica, reduz-se a tensão superficial da pele adicionando um vo ­
lume de etanol a 70 % suficiente para cobrir toda a epiderme. Após alguns segundos, remove-se o etanol do tubo e hidrata-se o tecido 
adicionando 3 ml de solução de sulfato de magnésio 154 mM. Para 
medir a resistência do disco cutâneo em k Ω, colocam-se os eléctro ­
dos da ponte de Wheatstone de cada um dos lados do disco (figura 1). As dimensões dos eléctrodos e o comprimento de cada eléctrodo 
abaixo da pinça tipo crocodilo são indicados na figura 2. A pinça 
aplicada ao eléctrodo interno deve ficar apoiada no rebordo do tubo de PTFE durante a medição da resistência, de forma a garantir que o comprimento de eléctrodo mergulhado na solução de sulfato de 
magnésio seja constante. O eléctrodo externo deve ser colocado 
dentro da câmara receptora de forma a tocar no fundo da mesma. A distância entre a tampa-suporte de molas ( spring clip ) e o fundo 
do tubo de PTFE deve ser mantida constante (figura 2), porque 
afecta o valor de resistência medido. A distância entre o eléctrodo 
interno e o disco cutâneo deve ser mínima (1 mm a 2 mm) e cons ­
tante.
 
Se o valor de resistência medido exceder 20 k Ω, tal pode dever-se à 
presença de restos da substância em estudo na superfície epidérmica do disco cutâneo. Para eliminar essas matérias, poderá, por exemplo, 
tapar-se o tubo de PTFE com o polegar, usando luvas de borracha, e 
agitar-se durante cerca de 10 segundos. Rejeita-se a solução de sul ­
fato de magnésio e repete-se a medição da resistência com solução fresca de MgSO
 4 . 
As propriedades e dimensões da montagem de ensaio e o procedi ­
mento experimental aplicado podem influenciar os valores de RET 
obtidos. O limite de corrosão de 5 k Ω foi estabelecido a partir de 
dados obtidos com a montagem e segundo os procedimentos espe ­
cificamente descritos no presente método. Poderão ser aplicáveis outros valores-limite e de controlo se as condições de ensaio forem 
alteradas ou for utilizada uma montagem diferente. É, portanto, ne ­
cessário calibrar a metodologia e os valores-limite de resistência ensaiando uma série de padrões de referência seleccionados das substâncias químicas utilizadas no estudo de validação (4) (5), ou 
de classes químicas similares às das substâncias químicas em estudo. 
Figuram no quadro 1 uma série de substâncias químicas adequadas.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 569
 
1.5.5.  Métodos da ligação de corante  
A exposição a determinadas matérias não corrosivas pode originar 
uma redução da resistência para valores inferiores ao limite de 5 k Ω, 
ao permitir a passagem de iões através do  stratum corneum,  que se 
traduz numa redução da resistência eléctrica (5). Determinados com ­
postos orgânicos neutros e substâncias químicas tensioactivas (deter ­
gentes, emulsionantes e outras substâncias tensioactivas), por exem ­
plo, podem remover os lípidos cutâneos, daí resultando uma maior 
permeabilidade iónica da barreira. Por esta razão, se os valores de 
RET das substâncias em estudo forem inferiores a 5 kV ou próximos deste limite, sem que haja danos visíveis, deve ser efectuada uma 
avaliação da penetração de um corante nos tecidos de controlo e nos 
tecidos tratados, para determinar se os valores de RET obtidos se deveram a uma maior permeabilidade cutânea ou à corrosão da pele (3) (5). Neste último caso, se o  stratum corneum  estiver danificado, 
o corante sulforrodamina B, uma vez aplicado na superfície da pele, 
penetrará rapidamente e colorará o tecido subjacente. Este corante específico é estável a uma grande variedade de substâncias químicas e não é afectado pelo processo de extracção acima referido.
 
1.5.5.1.  Aplicação e eliminação do corante sulforrodamina B  
Depois da determinação da RET, a solução de sulfato de magnésio é 
removida do tubo e verifica-se cuidadosamente se a pele apresenta danos evidentes. Se a pele não apresentar danos importantes eviden ­
tes, aplica-se um volume de 150 μl de uma solução a 10 % (m/v) de 
corante sulforrodamina B (vermelho ácido 52; C.I. 45100; n.
 o EINECS 222-529-8; n.  o CAS 3520-42-1), em água destilada, à 
superfície epidérmica de cada disco cutâneo, durante duas horas. 
Lavam-se em seguida os discos em água corrente, à temperatura ambiente, durante cerca de 10 segundos, a fim de remover o corante em excesso/não fixado. Retiram-se cuidadosamente os discos cutâ ­
neos de cada tubo de PTFE e colocam-se num recipiente (por exem ­
plo, um frasco de vidro de 20 ml) com água desionizada (8 ml). Agitam-se cuidadosamente os frascos durante 5 minutos, para remo ­
ver os restos de corante que eventualmente não se tenham fixado. 
Repete-se este procedimento de lavagem e transferem-se os discos 
cutâneos para frascos que contenham 5 ml de uma solução a 30 % (m/v) de dodecilsulfato de sódio em água destilada, incubando-se a 60
 o C de um dia para o outro.  
Depois da incubação, os discos cutâneos são retirados e rejeitados e 
a solução remanescente em cada frasco é centrifugada durante 
8 minutos a 21  o C (força relativa de centrifugação: ~175 x g). 
Dilui-se então 1:5 (v/v- ou seja, 1 ml + 4 ml) uma amostra de 1 ml do líquido sobrenadante com uma solução a 30 % (m/v) de 
dodecilsulfato de sódio em água destilada. Mede-se a densidade 
óptica da solução resultante a 565 nm.
 
1.5.5.2.  Cálculo da concentração de corante  
A concentração do corante sulforrodamina B por disco é calculada a 
partir dos valores de densidade óptica (5) (coeficiente de extinção molar do corante sulforrodamina B a 565 nm = 8,7 x10
 4 ; massa 
molecular = 580). Utilizando uma curva de calibração apropriada, 
determina-se a concentração de corante correspondente a cada disco 
cutâneo, calculando-se em seguida uma concentração média de co ­
rante para os replicados.  
2. RESULTADOS  
Os valores de resistência (em k Ω) e os valores médios da concen ­
tração de corante ( μg/disco), se for caso disso, correspondentes à 
matéria em estudo e às amostras de controlo positiva e negativa devem ser apresentados num quadro recapitulativo de resultados 
individuais e de médias ± desvio-padrão (incluindo resultados dos 
replicados/repetições e os valores individuais e médios).
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 570
 
2.1. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS  
Os valores médios de RET obtidos serão aceites se os valores das 
amostras de controlo positiva e negativa correspondentes se encon ­
trarem dentro dos intervalos aceitáveis para o método no laboratório 
de ensaio. Os intervalos de resistência aceitáveis para o método e a 
montagem acima descritos são indicados no quadro seguinte:  
Amostra de 
controlo Substância Intervalo de 
resistência (k Ω) 
Positiva Ácido clorídrico 10 M 0,5-1,0 
Negativa Água destilada 10-25  
Os valores médios obtidos para a ligação do corante serão aceites se 
os valores das amostras de controlo correspondentes se encontrarem dentro dos intervalos aceitáveis para o método. Os intervalos aceitá ­
veis de concentração de corante que se sugerem para as substâncias 
de controlo, para o método e a montagem acima descritos, são 
indicados no quadro seguinte:
 
Amostra de 
controlo Substância Intervalo de 
concentração de 
corante 
(μg/disco)  
Positiva Ácido clorídrico 10 M 40-100 
Negativa Água destilada 15-35  
A substância em estudo será considerada não corrosiva da pele:  
i) Se o valor médio de RET obtido para a substância em estudo 
exceder 5 k Ω, ou 
ii) Se o valor médio de RET foi inferior ou igual a 5 k Ω, e 
— o disco cutâneo não apresentar danos evidentes, e  
— a concentração média de corante do disco for bastante inferior 
à concentração média de corante do disco da amostra de 
controlo positiva de HC1 10 M correspondente.  
A substância em estudo será considerada corrosiva da pele:  
i) Se o valor médio de RET foi inferior ou igual a 5 k Ω e o disco 
cutâneo apresentar danos evidentes, ou  
ii) Se o valor médio de RET foi inferior ou igual a 5 k Ω, e 
— o disco cutâneo não apresentar danos evidentes, mas  
— a concentração média de corante do disco for igual ou supe ­
rior à concentração média de corante do disco da amostra de 
controlo positiva de HC1 10 M correspondente.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 571
 
3. RELATÓRIOS  
3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deve incluir as seguintes informações:  
Substâncias em estudo e de controlo:  
— Denominação ou denominações químicas (como as denomina ­
ções IUPAC ou CAS e o n.  o CAS, se forem conhecidos);  
— Grau de pureza e composição da substância ou preparação (em 
percentagem ponderai), natureza física;  
— Propriedades físico-químicas (estado físico, pH, estabilidade, hi ­
drossolubilidade) relevantes para o estudo;  
— Tratamento das substâncias em estudo/de controlo antes do en ­
saio, se for o caso (por exemplo, aquecimento, moagem);  
— Estabilidade, se for conhecida.  
Animais utilizados no ensaio:  
— Linhagem e sexo utilizados;  
— Idade dos animais no momento em que foram dadores;  
— Proveniência, condições de alojamento, alimentação, etc.;  
— Pormenores sobre a preparação da pele.  
Condições de ensaio:  
— Curvas de calibração da montagem de ensaio;  
— Curvas de calibração para o ensaio de ligação do corante;  
— Pormenores sobre o método de ensaio utilizado na medição das 
RET;  
— Pormenores sobre o método de ensaio utilizado na medição da 
ligação do corante, se tiver sido o caso;  
— Descrição de eventuais modificações dos métodos de ensaio;  
— Descrição dos critérios de avaliação utilizados.  
Resultados:  
— Quadro recapitulativo dos resultados dos ensaios de determinação 
das RET e da ligação do corante (se tiver sido o caso), por animal e amostra de pele;
 
— Descrição dos efeitos eventualmente observados.  
Discussão dos resultados.  
Conclusões.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) OECD, (2001) Harmonised Integrated Classification System 
for Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Assessment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. 
http://www.olis.oecd.org/olis/2001doc.nsf/LinkTo/env-jm-mo ­
no(2001)6.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 572
 
(2) Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal Irritation/ ­
Corrosion.  
(3) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, 
M., Regnier, J.F., Steiling, W., Walker, A.P., and Balls, M., 
(1995) A prevalidation study on  in vitro  skin corrosivity tes ­
ting. The report and recommendations of ECVAM Workshop 6. ATLA 23, p. 219-255.
 
(4) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, 
A.P., and Worth, A.P., (1998) The ECVAM international va ­
lidation study on  in vitro  tests for skin corrosivity. 1. Selection 
and distribution of the test chemicals. Toxicology  In Vitro  12, 
p. 471-482.  
(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhütter, H.-G., and Liebsch, M., (1998) The ECVAM international validation study on  in 
vitro  tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the 
Management Team. Toxicology  In Vitro  12, p. 483-524.
 
(6) OECD, (1996) Final Report of the OECD Workshop on Har ­
monisation of Validation and Acceptance Criteria for Alterna ­
tive Toxicological Test Methods, p. 62  
(7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem. J.H., Bruner. L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder. R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., Lovell, D.P., Reinhardt, C.A., Repetto, G., Sladowski. D., 
Spielmann, H., and Zucco, F., (1995) Practical aspects of the 
validation of toxicity test procedures. The report and recom ­
mendations of ECVAM workshops. ATLA 23, p. 129-147.
 
(8) ICCVAM, (Interagency Coordinating Committee on the 
Validation of Alternative Methods)., (1997) Validation and Regulatory Acceptance of Toxicological Test Methods. NIH Publication No 97-3981. National Institute of Environ ­
mental Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. 
http://iccvam.niehs.nih.gov/docs/guidelines/validate.pdf
 
(9) ECVAM, (1998) ECVAM News & Views. ATLA 26, p. 275- 
-280.  
(10) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Vali ­
dation of Alternative Methods)., (2002) ICCVAM evaluation of EpiDerm
 TM , EPISKIN  TM (EPI-200), and the Rat Skin 
Transcutaneous Electrical Resistance (TER) assay: In Vitro 
test methods for assessing dermal corrosivity potential of 
chemicals. NIH Publication No 02-4502. National Toxicology Program Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods, National Institute of Environmental 
Health Sciences, Research Triangle Park, NC, USA. 
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/epiddocs/epis_brd.pdf.
 
(11) OECD (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The 
In Vitro Skin Corrosion Test Guideline Proposal, Berlin, 1st - 
2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27  th 
March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from 
the Secretariat  
(12) Oliver, G.J.A., Pemberton, M.A., and Rhodes, C., (1986) An  
in vitro  skin corrosivity test -modificationsand validation. Fd. 
Chem. Toxicol. 24, p. 507-512.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 573
 
(13) Botham, P.A., Hall, T.J., Dennett, R., McCall, J.C., Basketter, 
D.A., Whittle, E., Cheeseman, M., Esdaile, D.J., and Gardner, 
J., (1992) The skin corrosivity test  in vitro:  results of an in ­
terlaboratory trial. Toxic.  In Vitro  6, p. 191-194.  
(14) Worth A.P., Fentem J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile D.J., Liebsch, M., (1998) An Evalua ­
tion of the Proposed OECD Testing Strategy for Skin Corro ­
sion. ATLA 26, p. 709-720.  
(15) Basketter, D.A., Chamberlain, M., Griffiths, H.A., Rowson, 
M., Whittle, E., York, M., (1997) The classification of skin 
irritants by human patch test. Fd. Chem. Toxicol. 35, p. 845-852.
 
(16) Oliver G.J.A, Pemberton M.A and Rhodes C., (1988) An  In 
Vitro  model for identifying skin-corrosive chemicals. I. Initial 
Validation. Toxicology  In Vitro . 2, p. 7-17.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 574
 
Figura 1  
Montagem para o ensaio da RET em pele de rato
  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 575
 
Figura 2  
Dimensões do tubo de politetrafluoroetileno (PTFE) e do tubo receptor, bem como 
dos eléctrodos utilizados
  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 576
 
Factores críticos da montagem ilustrada:  
— Diâmetro interno do tubo de PTFE;  
— Comprimento dos eléctrodos em relação ao tubo de PTFE e ao 
tubo receptor, para que os eléctrodos não toquem no disco cutâ ­
neo e de modo que um comprimento fixo de eléctrodo esteja em 
contacto com a solução de MgSO  4 ; 
— A quantidade de solução de MgSO  4 no tubo receptor deve pro ­
porcionar um nível de líquido, em relação ao nível no tubo de PTFE, conforme o ilustrado na figura 1;
 
— O disco cutâneo deve ser convenientemente fixado ao tubo de 
PTFE, para que a resistência eléctrica seja uma medida fiável das propriedades da pele.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 577
 
B.40.A.  CORROSÃO DA PELE  IN VITRO : ENSAIO EM MODELOS 
DE PELE HUMANA  
1. MÉTODO  
Este método de ensaio é equivalente ao OECD TG 431 (2004).  
1.1. INTRODUÇÃO  
Entende-se por corrosão da pele a produção de danos irreversíveis 
nos tecidos cutâneos por aplicação de uma matéria em estudo (defi ­
nida de acordo com o sistema harmonizado global de classificação e rotulagem das misturas e substâncias químicas) (1). O presente mé ­
todo de ensaio não requer a utilização de animais vivos, nem de 
tecidos animais, para a determinação da corrosividade cutânea.
 
A determinação da corrosividade cutânea tem normalmente feito uso 
de animais de laboratório (2). A preocupação com a dor e o sofri ­
mento inerentes a esse processo levou à revisão do método de ensaio 
B.4, tendo passado a ser possível determinar a corrosão da pele por métodos alternativos ( in vitro ), que evitam a dor e o sofrimento de 
animais.
 
A primeira etapa com vista à definição de ensaios alternativos que 
pudessem ser utilizados na determinação da corrosividade cutânea num contexto legislativo foi a realização de estudos de pré-validação (3). Seguidamente, foi realizado um estudo com vista à validação 
formal de métodos  in vitro  para a determinação da corrosão da pele 
(4) (5) (6) (7) (8). O resultado desses estudos e outra literatura publicada (9) conduziram à recomendação de que poderiam ser uti ­
lizados para determinar a corrosividade cutânea  in vivo  (10) (11) (12) 
(13) o ensaio em modelos de pele humana (o presente método) e o 
ensaio da resistência eléctrica transcutânea (ver o método de ensaio B.40).
 
Os estudos de validação concluíram que os ensaios em modelos de 
pele humana (3) (4) (5) (9) permitem distinguir com fiabilidade as substâncias reconhecidamente corrosivas da pele das que o não são. O protocolo de ensaio pode estabelecer igualmente uma primeira 
distinção entre substâncias muito corrosivas e menos corrosivas 
da pele.
 
O ensaio descrito no presente método permite identificar misturas e 
substâncias químicas corrosivas. Permite igualmente identificar mis ­
turas e substâncias químicas não corrosivas, quando associado a 
outras informações disponíveis (por exemplo, pH, relações estrutu ­
ra-actividade, dados humanos ou em animais) que corroborem tais características (1) (2) (13) (14). O método não permite normalmente 
obter informações adequadas sobre a irritação da pele, nem permite 
dividir as substâncias corrosivas em categorias (como as previstas no sistema de classificação harmonizado global) (1).
 
Para uma avaliação completa dos efeitos locais na pele após uma 
exposição única por via dérmica recomenda-se a aplicação da estra ­
tégia de ensaio sequencial apensa ao método de ensaio B.4 (2) e associada ao sistema harmonizado global (1). Essa estratégia de ensaio inclui a realização de ensaios de corrosão da pele (descritos 
no presente método) e de irritação da pele  in vitro  antes de ser 
ponderada a realização de ensaios em animais vivos.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 578
 
1.2. DEFINIÇÕES  
Corrosão da pele  in vivo : Produção de danos irreversíveis à pele, 
nomeadamente a necrose visível da epiderme, prolongando-se para a derme, após a aplicação de uma substância em estudo durante um 
máximo de quatro horas. São exemplos típicos de reacções corrosi ­
vas as úlceras, hemorragias e escaras sanguinolentas e, para o final do período de observação de 14 dias, a descoloração, devido à perda de pigmentação da pele, a formação de zonas de alopecia total e a 
ocorrência de cicatrizes. As lesões duvidosas poderão ser esclareci ­
das por métodos histopatológicos.
 
Viabilidade celular:  Parâmetro que mede a actividade total de uma 
população celular (por exemplo, capacidade das desidrogenases mi ­
tocondriais celulares de reduzirem o pigmento vital MTT); consoante o parâmetro determinado e o tipo de ensaio realizado, é possível 
correlacionar a viabilidade celular com o número total e/ou a vitali ­
dade das células.
 
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Quadro 1  
Substâncias químicas de referência  
Denominação Número EINECS Número CAS  
1,2-Diaminopropano 201-155-9 78-90-0 Extremamente corrosivo 
Ácido acrílico 201-177-9 79-10-7 Extremamente corrosivo 2-terc-Butilfenol 201-807-2 88-18-6 Corrosivo 
Hidróxido de potássio (10 %) 215-181-3 1310-58-3 Corrosivo 
Ácido sulfúrico (10 %) 231-639-5 7664-93-9 Corrosivo Ácido octanóico (ácido caprílico) 204-677-5 124-07-02 Corrosivo 4-Amino-1,2,4-triazole 209-533-5 584-13-4 Não corrosivo Eugenol 202-589-1 97-53-0 Não corrosivo Brometo de fenetilo 203-130-8 103-63-9 Não corrosivo 
Tetracloroetileno 204-825-9 27-18-4 Não corrosivo 
Ácido isoesteárico 250-178-0 30399-84-9 Não corrosivo 4-(Metiltio)-benzaldeído 222-365-7 3446-89-7 Não corrosivo
 
A maioria das substâncias químicas constantes do quadro foi reto ­
mada da lista seleccionada para o estudo de validação internacional 
do ECVAM (4). A selecção baseia-se nos seguintes critérios:  
i) Número idêntico de substâncias corrosivas e não corrosivas;  
ii) Substâncias disponíveis no comércio e da maioria das classes 
químicas pertinentes;  
iii) Inclusão de substâncias extremamente corrosivas e de substân ­
cias menos corrosivas, para possibilitar uma diferenciação com 
base no poder corrosivo;  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 579
 
iv) Escolha de substâncias químicas que podem ser manuseadas no 
laboratório sem outros perigos graves além da corrosividade.  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
A matéria em estudo é aplicada localmente num modelo tridimen ­
sional de pele humana que inclua, pelo menos, uma epiderme re ­
construída, com um  stratum corneum  funcional. As matérias corro ­
sivas são identificadas pela sua capacidade de diminuição da viabi ­
lidade celular [determinada, por exemplo, pelo ensaio de redução do MTT (15)] para valores inferiores a limites definidos após períodos de exposição especificados. O princípio do ensaio em modelos de 
pele humana baseia-se na hipótese de as substâncias químicas cor ­
rosivas conseguirem penetrar o  stratum corneum  por difusão 
ou erosão, revelando-se citotóxicas para as camadas celulares subjacentes.
 
1.4.1.  Método  
1.4.1.1.  Modelos de pele humana  
Os modelos de pele humana podem ser construídos ou obtidos co ­
mercialmente (por exemplo, os modelos EpiDerm™ e EPISKIN™) (16) (17) (18) (19) ou ser desenvolvidos ou construídos no labora ­
tório de ensaio (20) (21). É sabido que a utilização de pele humana 
está sujeita a condições e considerações nacionais e internacionais de natureza ética. Os novos modelos devem ser sempre validados (pelo menos na perspectiva descrita no ponto 1.4.1.1.2). Os modelos de 
pele humana utilizados no presente ensaio devem respeitar obrigato ­
riamente as seguintes condições:
 
1.4.1.1.1. C o n d i ç õ e s g e r a i s d o m o d e l o  
Na construção do epitélio devem ser utilizados queratinócitos huma ­
nos. Devem estar presentes múltiplas camadas de células epiteliais viáveis, sob um  stratum corneum  funcional. O modelo cutâneo tam ­
bém pode compreender uma camada estromática. O  stratum corneum  
deve ter múltiplas camadas com o perfil lipídico necessário para 
produzir uma barreira funcional suficientemente robusta para resistir a uma penetração rápida de marcadores citotóxicos. As propriedades de contenção do modelo devem impedir a passagem de matéria para 
o tecido viável por contorno do  stratum corneum.  O contorno do  
stratum corneum  pelas substâncias químicas em estudo redundaria 
numa modelização deficiente da exposição cutânea. O modelo cutâ ­
neo não deve estar contaminado por bactérias (incluindo micoplas ­
mas) ou fungos.
 
1.4.1.1.2. C o n d i ç õ e s f u n c i o n a i s d o m o d e l o  
O grau de viabilidade é normalmente quantificado utilizando MTT 
ou outros corantes vitais convertidos por via metabólica. Nesses 
casos, a densidade óptica do corante (solubilizado) extraído da amos ­
tra de controlo negativa de tecido deve ser, pelo menos, vinte vezes maior do que a densidade óptica do solvente de extracção isolada ­
mente [ver mais pormenores em (22)]. A amostra de controlo nega ­
tiva de tecido deve ser estável em cultura (deve permitir obter me ­
dições de viabilidade similares) durante o período de exposição do ensaio. O  stratum corneum  deve ser suficientemente robusto para 
resistir à penetração rápida de determinadas substâncias químicas 
marcadoras citotóxicas (por exemplo, o Triton X-10 a 1 %). Esta propriedade pode ser estimada através do tempo de exposição neces ­
sário para reduzir a viabilidade celular em 50 % (TE50) (no caso dos 
modelos EpiDerm e EPISKIN, por exemplo, esse tempo é superior a 
2 horas). O tecido deve ser reprodutível ao longo do tempo e, de preferência, de laboratório para laboratório. Deve, além disso, per ­
mitir prever o poder corrosivo das substâncias químicas de referência 
(ver o quadro 1), quando utilizado no protocolo de ensaio seleccio ­
nado.
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1.4.1.2.  Aplicação das substâncias em estudo e de controlo  
Em cada tratamento (tempo de exposição), incluindo no caso das 
amostras de controlo, é utilizado um duplicado de tecido. No caso das matérias líquidas, aplica-se uma quantidade de substância em 
estudo suficiente para cobrir uniformemente toda a superfície de 
pele (no mínimo 25 μl/cm
 2 ). No caso das matérias sólidas, aplica- 
-se uniformemente uma quantidade de substância em estudo suficiente para cobrir toda a pele, sendo a mesma depois humidificada, com 
água desionizada ou destilada, para garantir um bom contacto com a 
pele. Se necessário, os sólidos serão reduzidos por moagem a uma forma pulverulenta antes da aplicação. O método de aplicação deve 
ser adequado à substância em estudo [ver, por exemplo, (5)]. Após o 
período de exposição, a matéria em estudo deve ser cuidadosamente removida da superfície da pele, por lavagem com uma solução-tam ­
pão adequada ou NaCl a 0,9 %.
 
Para garantir a adequabilidade do modelo experimental, devem uti ­
lizar-se em paralelo, em cada estudo, uma amostra de controlo po ­
sitiva e uma amostra de controlo negativa. As substâncias sugeridas 
para as amostras de controlo positivas são o ácido acético glacial ou KOH 8N. Para as amostras de controlo negativas são sugeridos NaCl a 0,9 % ou água.
 
1.4.1.3.  Medição da viabilidade celular  
Na medição da viabilidade celular só poderão utilizar-se métodos 
quantitativos validados. O tipo de medição de viabilidade deve, além disso, poder ser utilizado num tecido de construção tridimen ­
sional. Não deve haver interferências de ligações inespecíficas de 
corantes na medição de viabilidade. Os corantes que se liguem a proteínas e os que não sofram conversão metabólica (por exemplo, o vermelho neutro) não são, portanto, adequados. O ensaio mais 
frequentemente utilizado é o da redução do MTT (brometo de 
3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio, azul de tiazolil; n.
 o EINECS 206-069-5; n.  o CAS 298-93-1), que se demonstrou per ­
mitir obter resultados rigorosos e reprodutíveis (5), embora possam 
ser utilizados outros. Coloca-se a amostra de pele numa solução de 
MTT de concentração apropriada (por exemplo, 0,3-1 mg/ml), a uma temperatura de incubação adequada, durante 3 horas. O precipitado 
azul do derivado formazan é depois extraído com um solvente (iso ­
propanol), medindo-se a concentração do formazan por determinação da densidade óptica a um comprimento de onda compreendido entre 540 nm e 595 nm.
 
A acção química da matéria em estudo no corante vital pode asse ­
melhar-se à do metabolismo celular, daí resultando uma estimativa 
falsa de viabilidade. Demonstrou-se a ocorrência deste fenómeno 
quando uma matéria em estudo com tais características não fora completamente removida da pele por lavagem (9). Se a matéria em estudo agir directamente sobre o corante vital, será necessário utilizar 
amostras de controlo suplementares para detectar e corrigir a 
interferência das substâncias em estudo na medição da viabilidade (9)(23).
 
2. RESULTADOS  
Para cada tecido, os valores de densidade óptica e as percentagens 
calculadas de viabilidade celular correspondentes à matéria em es ­
tudo e às amostras de controlo positiva e negativa devem ser apre ­
sentados num quadro recapitulativo, incluindo os resultados dos re ­
plicados ou repetições, consoante o caso, e os valores individuais e 
médios.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 581
 
2.1. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS  
Os valores de densidade óptica obtidos para cada amostra em estudo 
podem ser utilizados para calcular uma percentagem de viabilidade em relação à amostra de controlo negativa (que é arbitrariamente 
fixada em 100 %). A percentagem de viabilidade celular que esta ­
belece a diferenciação entre as matérias em estudo corrosivas e não corrosivas (ou entre diferentes classes de corrosividade) ou o(s) mé ­
todo(s) estatístico(s) utilizado(s) para avaliar os resultados e identi ­
ficar as matérias corrosivas devem ser claramente definidos e docu ­
mentados e deve ser demonstrado que são adequados. Em geral, esses valores-limite de diferenciação são estabelecidos durante a op ­
timização dos ensaios, testados durante uma fase de pré-validação e 
confirmados num estudo de validação. A título de exemplo, a previsão de corrosividade associada ao modelo EpiDerm
 TM é a 
seguinte (9):  
A substância em estudo será considerada corrosiva da pele:  
i) Se a viabilidade após uma exposição de 3 minutos for inferior a 
50 %; ou  
ii) Se a viabilidade após uma exposição de 3 minutos for igual ou 
superior a 50 % e a viabilidade após uma exposição de 1 hora for 
inferior a 15 %.  
A substância em estudo será considerada não corrosiva da pele:  
i) Se a viabilidade após uma exposição de 3 minutos for igual ou 
superior a 50 % e a viabilidade após uma exposição de 1 hora for 
igual ou superior a 15 %.  
3. RELATÓRIOS  
3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deve incluir as seguintes informações:  
Substância em estudo e de controlo:  
— Denominação ou denominações químicas (como as denomina ­
ções IUPAC ou CAS e o n.  o CAS, se forem conhecidos);  
— Grau de pureza e composição da substância ou preparação (em 
percentagem ponderal);  
— Propriedades físico-químicas (estado físico, pH, estabilidade, hi ­
drossolubilidade) relevantes para o estudo;  
— Tratamento das substâncias em estudo/de controlo antes do en ­
saio, se for o caso (por exemplo, aquecimento, moagem);  
— Estabilidade, se for conhecida.  
Justificação do modelo cutâneo e do protocolo utilizados.  
Condições de ensaio:  
— Sistema celular utilizado;  
— Informações sobre a calibração do equipamento de medição uti ­
lizado para medir a viabilidade celular (por exemplo, espectrofo ­
tómetro);  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 582
 
— Informações completas que substanciem o modelo cutâneo espe ­
cífico utilizado, incluindo sobre a validade do mesmo;  
— Pormenores sobre o método de ensaio utilizado;  
— Doses de ensaio utilizadas;  
— Descrição de eventuais modificações do método de ensaio;  
— Referência a dados anteriormente publicados sobre o modelo;  
— Descrição dos critérios de avaliação utilizados.  
Resultados:  
— Quadro recapitulativo dos resultados correspondentes a cada 
amostra de ensaio;  
— Descrição de outros efeitos eventualmente observados.  
Discussão dos resultados.  
Conclusão.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) OECD (2001) Harmonised Integrated Classification System 
for Human Health and Environmental Hazards of Chemical Substances and Mixtures. OECD Series on Testing and Asses ­
sment Number 33. ENV/JM/MONO(2001)6, Paris. http://www. 
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(2) Testing Method B.4. Acute Toxicity: Dermal Irritation/ 
Corrosion.  
(3) Botham, P.A., Chamberlain, M., Barratt, M.D., Curren, R.D., 
Esdaile, D.J., Gardner, J.R., Gordon, V.C., Hildebrand, B., Lewis, R.W., Liebsch, M., Logemann, P., Osborne, R., Ponec, 
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(4) Barratt, M.D., Brantom, P.G., Fentem, J.H., Gerner, I., Walker, 
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(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
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Management Team. Toxicology  In Vitro  12, p. 483-524.
 
(6) OECD, (1996) Final Report of the OECD Workshop on Har ­
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(7) Balls, M., Blaauboer, B.J., Fentem, J.H., Bruner, L., Combes, 
R.D., Ekwall, B., Fielder, R.J., Guillouzo, A., Lewis, R.W., 
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 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 583
 
(9) Liebsch, M., Traue, D., Barrabas, C., Spielmann, H., Uphill, 
P., Wilkins, S., McPherson, J.P., Wiemann, C., Kaufmann, T., 
Remmele, M. and Holzhutter, H.G., (2000) The ECVAM pre ­
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(10) ECVAM, (1998) ECVAM News & Views. ATLA 26, 
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(11) ECVAM, (2000) ECVAM News & Views. ATLA 28, 
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(12) ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the 
Validation of Alternative Methods), (2002) ICCVAM evalua ­
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(13) OCDE (2002) Extended Expert Consultation Meeting on The 
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2nd November 2001, Secretariat's Final Summary Report, 27  th 
March 2002, OECD ENV/EHS, available upon request from 
the Secretariat  
(14) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, 
R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M., (1998) An Eva ­
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(16) Cannon, C.L., Neal, P.J., Southee, J.A., Kubilus, J., and Klaus ­
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(17) Ponec, M., Boelsma, E., Weerheim, A., Mulder, A., Boutwstra, 
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(18) Tinois, E., Gaetani, Q., Gayraud, B., Dupont, D., Rougier, A., 
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(19) Tinois, E., Tiollier, J., Gaucherand, M., Dumas, H., Tardy, M., 
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(23) Fentem, J.H., Briggs, D., Chesne’, C., Elliot, G.R., Harbell, 
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vitro  tests for acute skin irritation: results and evaluation by the 
Management Team. Toxicology  In Vitro  15, p. 57-93.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 585
 
B.41.  ENSAIO DE FOTOTOXICIDADE  IN VITRO  3T3 NRU  
l. MÉTODO  
Este método é equivalente ao OECD TG 432 (2004).  
1.1. INTRODUÇÃO  
A fototoxicidade é definida como uma reacção tóxica a uma subs ­
tância aplicada ao corpo que é desencadeada ou intensificada 
(quando já se manifeste a doses inferiores) pela exposição subse ­
quente à luz, ou induzida pela irradiação da pele depois da adminis ­
tração sistémica da substância.  
O ensaio de fototoxicidade  in vitro  3T3 NRU é utilizado para definir 
o potencial fototóxico de uma substância em estudo, induzido pela substância química excitada por exposição à luz. O ensaio avalia a fototoxicidade através da redução relativa da viabilidade de células 
expostas à substância química na presença de luz, comparativamente 
à obscuridade. As substâncias que respondam a este ensaio serão provavelmente fototóxicas  in vivo , após aplicação sistémica e difusão 
pela pele ou após aplicação tópica.
 
Têm sido referidos os efeitos fototóxicos induzidos por muitos tipos 
de substâncias químicas (1) (2) (3) (4). A característica comum dessas substâncias é a capacidade de absorverem energia luminosa da radiação solar. De acordo com a primeira lei da fotoquímica (lei 
de Grotthaus-Draper), é necessária a absorção de uma quantidade 
suficiente de quanta de luz para que se observe uma fotorreacção. Antes de ser ponderada a realização de ensaios biológicos é, portan ­
to, necessário determinar, pelo método OECD TG 101, o espectro de 
absorção no UV/visível da substância química em estudo. Tem sido 
referido que, se o coeficiente de absorção/extinção molar for inferior a 10 l.mol
 -1 .cm  -1 , a substância química não será provavelmente 
fotorreactiva. Uma substância química com tais características poderá 
não necessitar de ser submetida ao ensaio de fototoxicidade  in vitro  
3T3 NRU ou a qualquer outro ensaio biológico para a determinação de efeitos fotoquímicos adversos (1) (5). Ver igualmente o anexo 1.
 
A fiabilidade e pertinência do ensaio de fototoxicidade  in vitro  3T3 
NRU foram recentemente avaliadas (6) (7) (8) (9). O ensaio de fototoxicidade  in vitro  3T3 NRU revelou-se capaz de prever efeitos 
fototóxicos agudos em animais e pessoas  in vivo.  O ensaio não se 
destina a prever outros efeitos adversos que possam resultar da acção 
combinada de uma substância química e da luz — não trata, por exemplo, da fotogenotoxicidade, da fotoalergia ou da fotocareinoge ­
nicidade —, nem permite determinar o poder fototóxico. O ensaio 
também não cobre mecanismos indirectos de fototoxicidade, efeitos 
de metabolitos das substâncias em estudo ou efeitos de misturas.
 
Embora, de modo geral, seja necessário recorrer a sistemas de acti ­
vação metabólica em todos os ensaios  in vitro  de previsão de po ­
tenciais genotóxicos ou carcinogénicos, no domínio da fototoxicolo ­
gia são ainda raros os exemplos de substâncias químicas que neces ­
sitem de transformação metabólica para agirem como fototoxina  in 
vivo ou in vitro.  Não é, portanto, considerado necessário, nem cien ­
tificamente justificado, utilizar um sistema de activação metabólica 
no presente ensaio.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 586
 
1.2. DEFINIÇÕES  
Irradiância:  Intensidade da radiação ultravioleta (UV) ou da luz 
visível que incide numa superfície, expressa em W/m  2 ou mW/cm  2 . 
Dose de radiação:  Quantidade (= intensidade x tempo) de radiação 
ultravioleta (UV) ou de luz visível que incide numa superfície, ex ­
pressa em joules (= W x s) por unidade de superfície (por exemplo, J/m ou J/cm
 2 ). 
Bandas de comprimento de onda de radiação UV:  As designa ­
ções recomendadas pela CIE ( Commission Internationale de l'Éclai ­
rage) são: UVA (315-400 nm), UVB (280-315 nm) e UVC (100- 
-280 nm). Também se utilizam outras designações: a separação entre os UVB e os UVA é frequentemente situada a 320 nm, podendo as radiações UVA subdividir-se em UV-A1 e UV-A2, com a separação 
a cerca de 340 nm.
 
Viabilidade celular:  Parâmetro que mede a actividade total de uma 
população celular (por exemplo, absorção do pigmento vital verme ­
lho neutro pelos lisossomas celulares); consoante a variável determi ­
nada e o tipo de ensaio realizado, é possível correlacionar a viabi ­
lidade celular com o número total e/ou a vitalidade das células.  
Viabilidade celular relativa:  Viabilidade celular expressa em rela ­
ção a amostras de controlo (negativas) constituídas pelo solvente e submetidas a todo o procedimento de ensaio (+ Irr ou - Irr), excluído o tratamento com a substância em estudo.
 
PIF (photo irritation factor  — factor de fotoirritação):  Factor 
obtido por comparação entre duas concentrações citotóxicas igual ­
mente eficazes (CI50) da substância química em estudo, respectiva ­
mente sem (- Irr) e com (+ Irr) exposição a uma dose não citotóxica 
de radiação UVA/luz visível.  
CI 50 : Concentração da substância química em estudo que reduz a 
viabilidade celular em 50 %.  
MPE ( mean photo effect  — fotoefeito médio):  Parâmetro obtido 
por tratamento matemático das duas curvas de concentração obtidas sem (- Irr) e com (+ Irr) exposição a uma dose não citotóxica de 
radiação UVA/luz visível.
 
Fototoxicidade:  Reacção tóxica aguda desencadeada pela primeira 
exposição da pele a determinadas substâncias químicas, seguida de exposição à luz, ou analogamente induzida por irradiação da pele depois da administração sistémica da substância.
 
1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
O ensaio de fototoxicidade  in vitro  3T3 NRU baseia-se na compa ­
ração da citotoxicidade de uma substância química com ou sem 
exposição a uma dose não citotóxica de luz solar simulada. 
No âmbito deste ensaio, a citotoxicidade é expressa pela redução, função da concentração, da absorção do pigmento vital vermelho neutro, medida 24 horas depois do tratamento com a substância 
química em estudo e da irradiação (10). O vermelho neutro (Neutral 
Red, NR) é um corante catiónico fraco que penetra facilmente nas membranas celulares por um mecanismo distinto da difusão, acumu ­
lando-se nos lisossomas intracelulares. As alterações da superfície da 
sensível membrana dos lisossomas fragilizam estes últimos e origi ­
nam outras alterações, que se tornam gradualmente irreversíveis. Essas alterações resultantes da acção dos xenobióticos reduzem a absorção e ligação do vermelho neutro. Pode, portanto, estabelecer- 
-se uma distinção entre células viáveis, danificadas ou mortas, base 
do presente ensaio.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 587
 
Efectua-se uma cultura de células Balb/c 3T3 durante 24 h, para 
formação de monocamadas. Para cada substância química em estudo, 
procede-se à pré-incubação, durante 1 h, de duas placas de 96 al ­
véolos com oito concentrações diferentes da substância. A seguir, expõe-se uma das placas à mais elevada dose de irradiação não 
citotóxica e mantém-se a outra na obscuridade. Seguidamente, subs ­
titui-se o meio de tratamento por meio de cultura em ambas as placas; após nova incubação de 24 horas, determina-se a viabilidade celular através da absorção do vermelho neutro. A viabilidade celular 
é expressa em percentagem das amostras de solvente não tratadas de 
controlo e é calculada para cada concentração de ensaio. Para a previsão do potencial fototóxico, comparam-se as reacções, função da concentração, obtidas com e sem irradiação, em geral ao nível 
CI
 50 (concentração que reduz a viabilidade celular a 50 %, relativa ­
mente às amostras de controlo não tratadas).  
1.4. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.4.1.  Preparações  
1.4.1.1.  Células  
No estudo de validação, foi utilizada uma linhagem celular per ­
manente de fibroblastos de ratinho (Balb/c 3T3, clone 31) prove ­
niente da ATCC ( American Type Culture Collection , Manassas, 
VA, EUA) ou da ECACC ( European Collection of Cell Cultures , 
Salisbury, Wiltshire, Reino Unido), a qual é, portanto, recomendada, 
devendo ser obtida de uma colecção de células adequadamente qua ­
lificada. Podem utilizar-se outras células ou linhagens celulares, apli ­
cando o mesmo procedimento de ensaio, se as condições de cultura 
forem adaptadas às necessidades específicas das células em causa, 
embora deva, nesse caso, ser demonstrada a equivalência.  
Deve comprovar-se regularmente que as células não estão contami ­
nadas por micoplasmas, só devendo as mesmas ser utilizadas se esse 
tipo de microrganismo não for detectado (11).  
É importante comprovar periodicamente a sensibilidade das células 
às radiações UV por aplicação do procedimento de controlo de qua ­
lidade descrito no presente método. Uma vez que a sensibilidade das células às radiações UVA pode aumentar com o número de repica ­
gens, devem utilizar-se células Balb/c 3T3 que tenham sido objecto 
do menor número possível de repicagens (de preferência menos de 100). (Ver o ponto 1.4.2.2.2 e o anexo 2.)
 
1.4.1.2.  Meios e condições de cultura  
Nas repicagens celulares de rotina e na execução do ensaio, devem 
utilizar-se meios de cultura e condições de incubação adequados; por 
exemplo, no caso das células Balb/c 3T3, recomenda-se a utilização de DMEM ( Dulbecco's Modified Eagle's Medium ), enriquecido com 
soro de bovino recém-nascido (10 %), glutamina (4 mM), penicilina 
(100 UI) e estreptomicina (100 μg/ml), e a incubação em atmosfera 
húmida a 37
 o C, com 5 % a 7,5 % de CO  2 , dependendo do tampão 
(ver o segundo parágrafo do ponto 1.4.1.4). É particularmente im ­
portante que as condições de cultura celular permitam manter o ciclo 
celular dentro dos valores normais publicados das células ou linha ­
gem celular utilizadas.  
1.4.1.3.  Preparação das culturas  
Inoculam-se num meio de cultura com a densidade adequada células 
provenientes de culturas-mãe congeladas, efectuando-se pelo menos 
uma subcultura antes de as utilizar no ensaio de fototoxicidade  in 
vitro  3T3 NRU.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 588
 
Para o ensaio de fototoxicidade, inoculam-se as células num meio de 
cultura com a densidade apropriada, de modo que as culturas não 
confluam durante o ensaio, ou seja, até à determinação da viabilidade celular, 48 h após a inoculação das células. No caso das células Balb/c 3T3 cultivadas em placas de 96 alvéolos, recomenda-se 
uma densidade de inoculação de 1 x 10 células por alvéolo.
 
Para cada substância química em estudo, inoculam-se as células de 
modo idêntico em duas placas de 96 alvéolos, mantendo-se depois as condições de cultura de ambas ao longo de todo o ensaio, excepto 
durante o período de irradiação de uma das placas (+ Irr), durante o 
qual a outra é mantida na obscuridade (- Irr).
 
1.4.1.4.  Preparação da substância em estudo  
As substâncias em estudo devem preparar-se de fresco, imediata ­
mente antes da utilização, excepto se se mantiverem comprovada ­
mente estáveis na armazenagem. Recomenda-se que a manipulação 
da substância química e o tratamento inicial das células decorram 
sob condições de luz que evitem a fotoactivação ou degradação da substância em estudo antes da irradiação.
 
Dissolvem-se as substâncias em estudo em tampões salinos, como o 
EBSS ( Earle's Balanced Salt Solution ) ou outra solução-tampão fi ­
siologicamente equilibrada, isentos de componentes proteicos e de componentes que absorvam a luz (por exemplo, corantes indicadores de pH ou vitaminas), para evitar interferências durante a irradiação. 
Dado que, durante a irradiação, as células são mantidas cerca de 
50 minutos fora do incubador sob atmosfera de CO
 2 , é necessário 
tomar precauções para evitar a alcalinização. Se forem utilizados tampões fracos, como o EBSS, poderão, para o efeito, incubar-se 
as células sob uma atmosfera com 7,5 % de CO
 2 . Se as células 
forem incubadas sob uma atmosfera com apenas 5 % de CO  2 , será 
necessário utilizar um tampão mais forte.  
As substâncias químicas em estudo fracamente solúveis em água 
devem ser dissolvidas num solvente adequado. Caso se utilize um 
solvente, a sua concentração volúmica deve ser constante em todas as culturas, tanto nas amostras de controlo negativas (solvente) como a todas as concentrações da substância química em estudo, e o 
solvente não deve ser citotóxico àquela concentração. As concentra ­
ções da substância química em estudo devem ser escolhidas de modo a evitar precipitados ou turvações.
 
Recomenda-se a utilização de dimetilsulfóxido (DMSO) e de etanol 
como solventes. Podem utilizar-se outros solventes de baixa citoto ­
xicidade. Antes de serem utilizados, devem, porém, avaliar-se deter ­
minadas propriedades específicas, nomeadamente a reactividade com a substância química em estudo, a atenuação do efeito fototóxico, 
propriedades de eliminação de radicais e/ou a estabilidade química 
no solvente.
 
Se necessário, pode recorrer-se a um agitador mecânico e/ou a ultra- 
-sons e/ou a aquecimento a temperaturas apropriadas para facilitar a 
dissolução, salvo se tal afectar a estabilidade da substância química 
em estudo.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 589
 
1.4.1.5.  Condições de irradiação  
1.4.1.5.1. F o n t e l u m i n o s a  
A escolha de uma fonte luminosa e de filtros adequados é crucial nos 
ensaios de fototoxicidade. As regiões do visível e do UVA encon ­
tram-se normalmente associadas a reacções fototóxicas  in vivo  (3) 
(12), ao passo que os UVB são, em geral, menos importantes a esse 
nível, apresentando em contrapartida elevada citotoxicidade; esta au ­
menta de um factor de 1 000 ao passar de um comprimento de onda de 313 nm para 280 nm (13). Os critérios de selecção de uma fonte luminosa adequada devem incluir os requisitos da emissão de com ­
primentos de onda que a substância química em estudo absorva 
(espectro de absorção) e da obtenção, num período de exposição razoável, de doses de luz suficientes para a detecção das substâncias químicas fotocitotóxicas conhecidas. Além disso, os comprimentos 
de onda e as doses utilizadas não devem causar danos desnecessários 
ao sistema em estudo, nomeadamente devido à emissão de calor (região do infravermelho).
 
Considera-se que a melhor fonte luminosa artificial é constituída por 
simuladores de luz solar. A distribuição da potência de irradiação do 
simulador de luz solar com filtros deve ser próxima da correspon ­
dente à luz solar ao ar livre descrita em (14). Como simuladores de luz solar são utilizados arcos de xénon e arcos de mercúrio (dopado)- -halogeneto metálico (15). Estes últimos apresentam a vantagem de 
emitirem menos calor e de serem mais económicos, mas não repro ­
duzem a luz solar tão bem como os arcos de xénon. Dado que todos os simuladores de luz solar emitem quantidades significativas de radiação UVB, devem utilizar-se filtros adequados para atenuar os 
comprimentos de onda UVB, altamente citotóxicos. Dado que o 
material de plástico utilizado nas culturas celulares contém estabili ­
zadores de UV, o espectro deve ser medido através do mesmo tipo de cobertura das placas de 96 alvéolos utilizado no ensaio. Indepen ­
dentemente das medidas tomadas para atenuar partes do espectro 
com filtros e dos efeitos de filtro inevitáveis do equipamento, o espectro registado após os filtros utilizados não deve desviar-se do espectro normalizado da luz solar ao ar livre (14). As referências (8) 
e (16) contêm um exemplo da distribuição espectral da irradiância do 
simulador de luz solar com filtros utilizado no estudo de validação do ensaio de fototoxicidade  in vitro  3T3 NRU. Ver igualmente a 
figura 1 do anexo 2.
 
1.4.1.5.2. D o s i m e t r i a  
Regularmente, antes de cada ensaio de fototoxicidade, deve compro ­
var-se a intensidade luminosa (irradiância) com um medidor de UV 
de banda larga adequado. A intensidade deve ser medida através do mesmo tipo de cobertura das placas de 96 alvéolos utilizado no ensaio. O medidor de UV deve ter sido previamente calibrado para 
a fonte luminosa. Deve comprovar-se o desempenho do medidor de 
UV, recomendando-se para tal a utilização de um segundo medidor de UV de referência do mesmo tipo, calibrado do mesmo modo. O ideal seria utilizar, mais espaçadamente, um espectrorradiómetro para 
medir o espectro de irradiação da fonte luminosa filtrada e compro ­
var a calibração do medidor de UV de banda larga.
 
Verificou-se que uma dose de 5 J/cm  2 (medida na região UVA) não 
é citotóxica para as células Balb/c 3T3 e é suficientemente potente para excitar as substâncias químicas, desencadeando reacções foto ­
tóxicas (6)(17); por exemplo, para obter 5 J/cm
 2 em 50 minutos, 
ajustou-se a irradiância a 1,7 mW/cm  2 . Ver igualmente a figura 2 
do anexo 2. Caso se utilize outra linhagem celular ou outra fonte luminosa, pode ser necessário regular a dose irradiante, seleccionan ­
do-a de modo a que seja suficiente para excitar as fototoxinas de 
referência sem danificar as células. A duração da exposição luminosa 
é calculada do seguinte modo:
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 590
 
tðminÞ ¼ dose de irradiação ðJ=cm 2 Þ Ü 1000 
irradiância ðmW =cm 2 Þ Ü 60 (1 J = 1 W.s)  
1.4.2.  Condições de ensaio  
1.4.2.1.  Concentrações da substância em estudo  
As gamas de concentração da substância química em estudo com 
(+ Irr) e sem (- Irr) irradiação devem ser determinadas de forma adequada, em ensaios de determinação da gama de concentrações. Pode ser útil determinar a solubilidade de início e aos 60 minutos 
(ou após um período correspondente ao tempo de tratamento a uti ­
lizar), pois esse parâmetro pode variar ao longo do tempo ou durante a exposição. Para evitar efeitos tóxicos induzidos por condições de cultura inadequadas ou por substâncias químicas muito ácidas ou 
muito alcalinas, o pH das culturas celulares com a substância quí ­
mica em estudo deve situar-se entre 6,5 e 7,8.
 
A concentração mais elevada da substância química em estudo deve 
situar-se na gama de condições fisiológicas de ensaio; devem, no ­
meadamente, ser evitadas situações de tensão osmótica ou de pH. 
Consoante a substância química em estudo, pode ser necessário ter 
em conta outras propriedades físico-químicas como factor limitante da concentração de ensaio mais elevada. No caso das substâncias relativamente insolúveis que não sejam tóxicas a concentrações até 
ao ponto de saturação, deve ser ensaiada a concentração máxima 
possível. Em geral, deve ser evitada a precipitação da substância química em estudo a qualquer concentração de ensaio. A concen ­
tração máxima de uma substância em estudo não deve exceder 1 000 
μg/ml; a osmolaridade não deve exceder 10 mmolar. Deve ser utili ­
zada uma série geométrica de diluições constituída por oito concen ­
trações da substância em estudo, com um factor de diluição cons ­
tante (ver segundo parágrafo do ponto 2.1).
 
Se existirem dados (obtidos num ensaio de determinação da gama de 
concentrações) que revelem que a substância química em estudo não 
é citotóxica até à concentração-limite no ensaio sem irradiação (- Irr), 
mas é fortemente citotóxica quando irradiada (+ Irr), a gama de concentrações a seleccionar para o ensaio com irradiação (+ Irr) pode diferir da gama de concentrações seleccionada para o ensaio 
sem irradiação, para satisfazer os requisitos de adequabilidade da 
qualidade dos dados.
 
1.4.2.2.  Amostras de controlo  
1.4.2.2.1. S e n s i b i l i d a d e c e l u l a r à r a d i a ç ã o , e s t a b e l e c i ­
m e n t o d e d a d o s d e r e f e r ê n c i a  
A sensibilidade das células à fonte luminosa deve ser verificada 
regularmente (aproximadamente todas as cinco repicagens) determi ­
nando a viabilidade celular após exposição a doses crescentes de irradiação. Nessa determinação, devem ser utilizadas várias doses de irradiação, incluindo níveis substancialmente superiores aos utili ­
zados no ensaio de fototoxicidade 3T3 NRU. Essas doses são mais 
facilmente quantificadas através de medições na região do ultravio ­
leta da fonte luminosa. A densidade de inoculação das células deve ser idêntica à que será irradiada no dia seguinte no ensaio de foto ­
toxicidade  in vitro  3T3 NRU. A viabilidade celular é determinada no 
dia imediato com base na absorção do vermelho neutro. Deve ser demonstrado que a dose não citotóxica mais elevada resultante [5 J/cm
 2 (UVA) no estudo de validação, por exemplo] se revelou sufi ­
ciente para classificar correctamente as substâncias químicas de re ­
ferência (quadro 1).  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 591
 
1.4.2.2.2. S e n s i b i l i d a d e à r a d i a ç ã o n o e n s a i o e m c u r s o  
O ensaio satisfaz os critérios de qualidade se as amostras de controlo 
negativas (solvente) irradiadas revelarem uma taxa de viabilidade 
superior a 80 %, comparativamente à amostra de controlo negativa (solvente) não irradiada.
 
1.4.2.2.3. V i a b i l i d a d e a s s o c i a d a à s a m o s t r a s d e c o n t r o l o 
c o n s t i t u í d a s p e l o s o l v e n t e  
A densidade óptica absoluta (DO  540 NRU  ) do vermelho neutro ex ­
traído das amostras de controlo constituídas pelo solvente indica se 
as 1x10  4 células inoculadas em cada alvéolo se reproduziram com 
um tempo de duplicação normal durante os dois dias do ensaio. Um ensaio satisfaz os critérios de aceitação se a DO
 540 NRU  média das 
amostras de controlo não tratadas for > 0,4 (ou seja, cerca de vinte 
vezes a absorvância de fundo do solvente).  
1.4.2.2.4. A m o s t r a s d e c o n t r o l o p o s i t i v a s  
Paralelamente a cada ensaio de fototoxicidade  in vitro  3T3 NRU 
deve efectuar-se um ensaio com uma substância química fototóxica conhecida. Recomenda-se a clorpromazina (CPZ). Foram definidos os seguintes critérios de aceitação do ensaio para a utilização de 
clorpromazina de acordo com o protocolo normalizado do ensaio 
de fototoxicidade  in vitro  3T3 NRU: CPZ irradiada (+ Irr), CI
 50 = 
0,1 a 2,0 μg/ml; CPZ não irradiada (- Irr), CI  50 = 7,0 a 90,0 μg/ml. 
O factor de fotoirritação (PIF) deve ser superior a 6. Os resultados 
obtidos para as amostras de controlo positivas devem ser acompa ­
nhados ao longo do tempo.  
Em vez da clorpromazina podem utilizar-se nas amostras de controlo 
positivas submetidas em paralelo ao ensaio outras substâncias quí ­
micas fototóxicas adequadas à categoria química ou às características de solubilidade da substância química em estudo.
 
1.4.3.  Procedimento de ensaio (6) (7) (8) (16) (17)  
1.4.3.1.  Primeiro dia  
Introduzir 100 μl de meio de cultura nos alvéolos periféricos de uma 
placa de microtitulação com 96 alvéolos para a cultura de tecidos (brancos). Nos restantes alvéolos, introduzir 100 μl de uma suspen ­
são celular de 1 × 10
 5 células/ml em meio de cultura (1 × 10  4 células 
por alvéolo). Devem ser preparadas duas placas para cada série de concentrações da substância em estudo e as amostras de controlo 
constituídas pelo solvente e positivas.
 
Incubar as células durante 24 h (ver o ponto 1.4.1.2), até à formação 
de uma monocamada semiconfluente. Este período de incubação 
permite a recuperação, a aderência e o crescimento exponencial das células.
 
1.4.3.2.  Segundo dia  
Após a incubação, decantar o meio de cultura das células e lavar 
cuidadosamente com 150 μl da solução tamponada utilizada na in ­
cubação. Adicionar 100 μl de tampão, com a concentração adequada 
da substância química em estudo ou do solvente (amostra de con ­
trolo constituída pelo solvente). Constituir oito concentrações dife ­
rentes da substância química em estudo. Incubar as células com a 
substância química em estudo, na obscuridade, durante 60 minutos (ver o ponto 1.4.1.2 e o segundo parágrafo do ponto 1.4.1.4).
 
Das duas placas preparadas para cada série de concentrações da 
substância química em estudo e amostras de controlo, uma é selec ­
cionada, em geral de forma aleatória, para a determinação da cito ­
toxicidade (- Irr), constituindo a placa de controlo, e a outra (a placa 
de tratamento) para a determinação da fototoxicidade (+ Irr).  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 592
 
No ensaio + Irr irradiam-se as células durante 50 minutos, à tempe ­
ratura ambiente, através da cobertura da placa de 96 alvéolos, com a 
dose mais elevada de radiação não citotóxica (ver também o anexo 2). Manter as placas não irradiadas (- Irr) na obscuridade, à tempe ­
ratura ambiente, durante 50 minutos (período idêntico ao da exposi ­
ção luminosa).
 
Decantar a solução de ensaio e lavar cuidadosamente duas vezes 
com 150 μl da solução tamponada utilizada na incubação, mas 
sem a matéria em estudo. Substituir o tampão por meio de cultura e incubar (ver o ponto 1.4.1.2) de um dia para o outro (18 h a 22 h).
 
1.4.3.3.  Terceiro dia  
1.4.3.3.1. E x a m e m i c r o s c ó p i c o  
Utilizando um microscópio de contraste de fase examinam-se o cres ­
cimento e a morfologia das células e a integridade da monocamada celular. Registar as alterações morfológicas das células e os efeitos ao nível do crescimento celular.
 
1.4.3.3.2. E n s a i o d e a b s o r ç ã o d o v e r m e l h o n e u t r o  
Lavar as células com 150 μl de tampão pré-aquecido. Remover a 
solução de lavagem batendo levemente. Adicionar 100 μl de verme ­
lho neutro (NR, cloridrato de 3-amino-7-dimetilamino-2-metilfenazi ­
na, número EINECS 209-035-8, número CAS 553-24-2; C.I. 50040) 
com a concentração de 50 μg/ml em meio sem soro (16) e incubar 
conforme descrito no ponto 1.4.1.2 durante 3 horas. Depois da in ­
cubação, remover o meio com vermelho neutro e lavar as células com 150 μl de tampão. Decantar e remover o excesso de tampão por 
uma técnica de  blotting  ou por centrifugação.
 
Adicionar exactamente 150 μl de solução de dessorção do vermelho 
neutro (solução preparada de fresco constituída por 49 partes de água, 50 partes de etanol e uma parte de ácido acético).
 
Agitar cuidadosamente a placa de microtitulação num agitador pró ­
prio para esse tipo de placas, durante 10 minutos, até ao vermelho 
neutro ser extraído das células e formar uma solução homogénea.  
Medir a densidade óptica do extracto de vermelho neutro a 540 nm 
num espectrofotómetro, utilizando os brancos como referência. Ar ­
mazenar os resultados num ficheiro electrónico de formato adequado, 
para tratamento posterior.  
2. RESULTADOS  
2.1. QUALIDADE E QUANTIDADE DOS RESULTADOS  
Os resultados do ensaio devem permitir uma análise significativa da 
resposta obtida às variações de concentração com e sem irradiação, bem como, se possível, da concentração da substância química em estudo que reduz a viabilidade celular a 50 % (CI
 50 ). Caso se ob ­
serve citotoxicidade, a gama de concentrações e o intervalo entre as 
concentrações devem ser fixados de modo a possibilitar a adaptação de uma curva aos dados experimentais.
 
No caso de resultados claramente positivos ou claramente negativos 
(ver o primeiro parágrafo do ponto 2.3), pode bastar o ensaio pri ­
mário, apoiado num ou mais ensaios preliminares de determinação 
da gama de concentrações.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 593
 
Os resultados duvidosos, no limite ou pouco claros devem ser es ­
clarecidos por novos ensaios (ver também o segundo parágrafo do 
ponto 2.4). Nesses casos, deve ser ponderada a modificação das condições experimentais. Entre as condições experimentais susceptí ­
veis de ser modificadas contam-se a gama de concentrações ou o 
intervalo entre concentrações, o tempo de pré-incubação e o tempo 
de exposição à irradiação. No caso das substâncias químicas ins ­
táveis na água, pode ser adequado um tempo de exposição mais curto.
 
2.2. AVALIAÇÃO DOS RESULTADOS  
Para possibilitar a avaliação dos resultados, pode ser calculado um 
factor de fotoirritação (PIF) ou um fotoefeito médio (MPE).  
Para que os cálculos baseados nas medições de fototoxicidade pos ­
sam ser efectuados (ver abaixo), o conjunto das respostas individuais obtidas em função da concentração deve ser traduzido por uma curva (modelo) contínua de concentrações apropriada. O ajustamento da 
curva aos resultados é normalmente efectuado por um método de 
regressão não linear (18). Para avaliar a influência da variabilidade dos resultados na curva ajustada recomenda-se uma técnica de  boots­
trap.
 
O cálculo do factor de fotoirritação (PIF) é efectuado do seguinte 
modo:  
PIF ¼ IC 50 ðÄIrrÞ 
IC 50 ðþIrrÞ 
Se não for possível calcular a CI  50 com irradiação ou a CI  50 sem 
irradiação, não se poderá determinar o factor de fotoirritação (PIF) para a matéria em estudo. O fotoefeito médio (MPE) baseia-se na 
comparação das curvas de concentração completas (19). É definido 
como a média ponderada de um conjunto representativo de valores de fotoefeito:
 
MPE ¼ Σ n 
i ¼ 1 w i PE c i 
Σ n 
i ¼ 1 w i 
O fotoefeito PE  C à concentração C é definido como o produto do efeito 
de resposta RE  C pelo efeito de dose DE  C , ou seja: PE  C = RE  C × DE  C . O 
efeito de resposta RE  C é a diferença entre as respostas observadas com e 
sem irradiação, isto é: RE  C = R  c (- Irr) — R  c (+ Irr). O efeito de dose é 
calculado do seguinte modo:  
DE  c ¼ C=C ä Ä 1 
C=C ä þ 1 Æ Æ Æ Æ Æ Æ Æ Æ
 
em que C* representa a concentração de equivalência, ou seja, a 
concentração à qual a resposta + Irr é igual à resposta - Irr à concen ­
tração C. Se não for possível determinar C* por os valores de resposta da curva + Irr serem sistematicamente superiores ou infe ­
riores à curva de resposta - Irr, o efeito de dose será fixado no valor 
«1». Os factores de ponderação w
 i são dados pelo valor de resposta 
mais elevado, ou seja: w  i = MAX {R  i (+ Irr), R  i (- Irr)}. Os valores 
C i de concentração são escolhidos de modo que cada intervalo de 
concentração definido pelos valores de concentração utilizados no 
ensaio contenha o mesmo número de pontos. O cálculo do MPE está limitado ao valor máximo de concentração ao qual pelo menos uma das duas curvas exiba ainda um valor de resposta mínimo de 
10 %. Se essa concentração máxima exceder a concentração máxima 
utilizada no ensaio + Irr, a parte residual da curva + Irr será con ­
vertida no valor de resposta «0». Consoante o valor de MPE for maior ou menor do que um valor-limite de diferenciação convenien ­
temente escolhido (MPE
 C = 0,15), assim a substância química será 
ou não classificada de fototóxica.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 594
 
Em (20) está disponível um programa para o cálculo do PIF e do 
MPE.  
2.3. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS  
Com base nas previsões do estudo de validação (8), se o PIF for 
inferior a 2 ou o MPE menor do que 0,1 a substância em estudo será não fototóxica. Se o PIF for superior a 2 e inferior a 5 ou o MPE maior do que 0,1 e menor do que 0,15, a substância em estudo será 
provavelmente fototóxica. Se o PIF for superior a 5 ou o MPE maior 
do que 0,15, a substância será fototóxica.
 
Os laboratórios que comecem a utilizar o presente método de ensaio 
devem ensaiar as matérias de referência constantes do quadro 1 antes 
de submeterem outras substâncias a determinações de fototoxicidade. 
Os valores de PIF e MPE devem ser próximos dos indicados no quadro 1.
 
Quadro 1  
Denominação 
química Número 
EINECS Número CAS PIF MPE Pico de 
absorção Solvente (  1 ) 
Amiodarona 
HC1 243-293-2 [19774-82-4] > 3,25 0,27 - 0,54 242 nm 
300 nm 
(ombro) Etanol 
Cloropromazina 
HC1 200-701-3 [69-09-0] > 14,4 0,33 - 0,63 309 nm Etanol 
Norfloxacina 274-614-4 [70458-96-7] > 71,6 0,34 - 0,90 316 nm Acetonitrilo 
Antraceno 204-371-1 [120-12-7] > 18,5 0,19 - 0,81 356 nm Acetonitrilo Protoporfirina 
IX, dissódio 256-815-9 [50865-01-5] > 45,3 0,54 - 0,74 402 nm Etanol 
L-Histidina [7006-35-1] Não de ­
terminá­
vel 0,05 - 0,10 211nm Água 
Hexaclorofeno 200-733-8 [70-30-4] 1,1 - 1,7 0,00 - 0,05 299 nm 
317nm 
(ombro) Etanol 
Laurilsulfato de 
sódio 205-788-1 [151-21-3] 1,0 - 1,9 0,00 - 0,05 Não se veri ­
fica absor ­
ção Água
 
( 1 ) Solvente utilizado nas medições de absorção.  
2.4. INTERPRETAÇÃO DE DADOS  
Se os efeitos fototóxicos só forem observados para a concentração de 
ensaio mais elevada (sobretudo no caso das substâncias químicas 
hidrossolúveis), poderá ser necessário ponderar outros factores na avaliação dos perigos da substância. Pode ser o caso de dados de absorção ou acumulação cutâneas da substância química e/ou de 
outros ensaios, por exemplo do ensaio  in vitro  da substância química 
em pele humana ou de animal ou em modelos cutâneos.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 595
 
Se não for demonstrada a existência de toxicidade (+ Irr e - Irr) e se 
uma baixa solubilidade limitar as concentrações susceptíveis de se ­
rem ensaiadas, poderá ser posta em causa a compatibilidade da subs ­
tância em estudo com o ensaio e deverá ser ponderada a realização de ensaios de confirmação, por exemplo com base noutro modelo.
 
3. RELATÓRIOS  
RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deve incluir, pelo menos, as seguintes infor ­
mações:  
Substância em estudo:  
— Dados identificativos, denominações genéricas comuns e núme ­
ros IUPAC e CAS, se forem conhecidos;  
— Natureza física e grau de pureza;  
— Propriedades físico-químicas relevantes para o estudo;  
— Espectro de absorção no visível/UV;  
— Estabilidade e fotoestabilidade, se forem conhecidas.  
Solvente:  
— Justificação da escolha do solvente;  
— Solubilidade da substância em estudo no solvente;  
— Percentagem de solvente no meio de tratamento.  
Células:  
— Tipo e origem das células;  
— Ausência de micoplasmas;  
— Número de repicagens celulares, se for conhecido;  
— Sensibilidade celular à radiação, determinada com o equipamento 
de irradiação utilizado no ensaio de fototoxicidade  in vitro  3T3 
NRU.  
Condições de ensaio — 1)  Incubação antes e depois do tratamento:  
— Tipo e composição do meio de cultura;  
— Condições de incubação (concentração de CO  2 , temperatura e 
humidade);  
— Duração da incubação (antes e depois do tratamento).  
Condições de ensaio — 2)  Tratamento com a substância química:  
— Fundamentação da escolha das concentrações da substância quí ­
mica em estudo utilizadas nos ensaios com e sem irradiação;  
— Caso a substância química em estudo seja fracamente solúvel e 
não citotóxica, fundamentação da escolha da maior concentração ensaiada;
 
— Tipo e composição do meio de tratamento (tampão salino);  
— Duração do tratamento químico.  
Condições de ensaio — 3)  Irradiação:  
— Fundamentação da escolha da fonte luminosa utilizada;  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 596
 
— Fabricante e tipo da fonte luminosa e do radiómetro;  
— Características de irradiância espectral da fonte luminosa;  
— Características de transmissão e absorção do filtro ou filtros uti ­
lizados;  
— Características do radiómetro e condições de calibração do mes ­
mo; 
— Distância entre a fonte luminosa e o sistema de ensaio;  
— Irradiância UVA a essa distância, expressa em mW/cm  2 ; 
— Duração da exposição à radiação UV/luz visível;  
— Dose de radiação UVA (irradiância x tempo), expressa em J/cm  2 ; 
— Temperatura das culturas celulares durante a irradiação e das 
culturas celulares mantidas paralelamente na obscuridade.  
Condições de ensaio — 4)  Ensaio de viabilidade com o vermelho 
neutro:  
— Composição do meio de tratamento com vermelho neutro;  
— Duração da incubação com vermelho neutro;  
— Condições de incubação (concentração de CO  2 , temperatura e 
humidade);  
— Condições de extracção do vermelho neutro (agente de extracção, 
duração);  
— Comprimento de onda utilizado na leitura espectrofotométrica da 
densidade óptica do vermelho neutro;  
— Segundo comprimento de onda (referência), se for utilizado;  
— Composição do branco eventualmente utilizado no espectrofotó ­
metro.  
Resultados:  
— Viabilidade celular obtida para cada concentração da substância 
química em estudo, expressa em percentagem da viabilidade mé ­
dia das amostras de controlo paralelas;  
— Curvas de concentração (viabilidade celular relativa em função 
da concentração da substância química em estudo) obtidas nos 
ensaios + Irr e - Irr paralelos;  
— Análise das curvas de concentração: se possível, cálculo 
automático/cálculo manual de CI  50 (+ Irr) e de CI  50 (- Irr);  
— Comparação das duas curvas de concentração obtidas com e sem 
irradiação, por cálculo do factor de fotoirritação (PIF) ou do 
fotoefeito médio (MPE);  
— Critérios de aceitação do ensaio — amostra de controlo cons ­
tituída pelo solvente paralela;  
— Viabilidade absoluta (densidade óptica do extracto de vermelho 
neutro) das células irradiadas e não irradiadas;  
— Dados de referência das amostras de controlo negativas (solven ­
te); médias e desvios-padrão;  
— Critérios de aceitação do ensaio — amostra de controlo positiva 
paralela;  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 597
 
— CI  50 (+ Irr) e CI  50 (- Irr) e PIF/MPE da substância química da 
amostra de controlo positiva;  
— Dados de referência da substância química da amostra de con ­
trolo positiva: CI  50 (+ Irr) e CI  50 (- Irr) e PIF/MPE; médias e 
desvios-padrão.  
Discussão dos resultados.  
Conclusões.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) Lovell W.W., (1993) A scheme for  in vitro  screening of subs ­
tances for photoallergenic potential. Toxicology  In Vitro  7, p. 
95-102.  
(2) Santamaria, L. and Prino, G., (1972) List of the photodynamic 
substances. In «Research Progress in Organic, Biological and 
Medicinal Chemistry» Vol. 3 part 1. North Holland Publishing 
Co. Amsterdam. p. XI-V.  
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(8) Spielmann, H., Balls, M., Dupuis, J., Pape, W.J.W., Pecho ­
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Pfannenbecker, U., Potthast, J. M., Csato, M., Sladowski, D., 
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_1_1_1_1,00.html  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 599
 
ANEXO 1  
Papel do ensaio de fitotoxicidade 3T3 NRU numa abordagem sequencial da determinação da 
fitotoxicidade de substâncias químicas
  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 600
 
ANEXO 2  
Figura 1  
Distribuição espectral da potência de um simulador de luz solar com filtros
  
(Ver segundo parágrafo do ponto 1.4.1.5.)  
A figura 1 apresenta um exemplo de uma distribuição espectral de irradiância aceitável de um 
simulador de luz solar com filtros, proveniente da fonte de halogeneto metálico dopada utilizada no estudo de validação do ensaio de fototoxicidade 3T3 NRU (6)(8)(17). Mostra-se o efeito de dois filtros diferentes e o efeito filtrante suplementar da cobertura da placa de cultura celular com 96 
alvéolos. O filtro H2 só foi utilizado com sistemas de ensaio que toleram doses mais elevadas de 
UVB (ensaio em modelo cutâneo e ensaio da foto-hemólise de glóbulos vermelhos). No ensaio de fototoxicidade 3T3 NRU foi utilizado o filtro H1. A figura mostra que o efeito filtrante adicional da cobertura da placa é sobretudo observado nos UVB e que o espectro de irradiação continua a ter 
radiação UVB suficiente para excitar as substâncias químicas que absorvem sobretudo nessa região 
espectral, como a Amiodarona (ver quadro 1).
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 601
 
Figura 2  
Sensibilidade das células Balb/c 3T3 à irradiação (medida nos UVA)  
Viabilidade celular (percentagem de absorção do vermelho neutro em relação às amostras de 
controlo mantidas na obscuridade)
  
(Ver segundo parágrafo do ponto 1.4.1.5.2 e os pontos 1.4.2.2.1 e 1.4.2.2.2.)  
Sensibilidade das células Balb/c 3T3 à irradiação com o simulador de luz solar utilizado no estudo 
de validação do ensaio de fototoxicidade 3T3 NRU, medida nos UVA. A figura mostra os resul ­
tados obtidos no estudo de pré-validação em sete laboratórios distintos (1). As cinco curvas com símbolos a cheio dizem respeito a células com tolerância aceitável à irradiação; as outras duas 
curvas foram obtidas com células envelhecidas (resultantes de numerosas repicagens), que foi 
necessário substituir por novas células-mãe.
 
Com base nestes dados, foi determinada para dose mais elevada de irradiação não citotóxica (linha 
vertical a tracejado) o valor 5 J/cm. A linha horizontal a tracejado corresponde ao efeito máximo 
aceitável da irradiação a que se refere o ponto 1.4.2.2.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 602
 
B.42.  SENSIBILIZAÇÃO CUTÂNEA: ENSAIO DE GÂNGLIOS 
LINFÁTICOS LOCAIS  
INTRODUÇÃO  
1. As Diretrizes da OCDE para o ensaio de produtos químicos ( OECD Gui ­
delines for the Testing of Chemicals ) e os métodos de ensaio da UE nelas 
baseados são revistos periodicamente à luz do progresso científico, das necessidades normativas em evolução e de considerações de bem-estar 
animal. Foi adotada anteriormente a versão original do método de ensaio 
de gânglios linfáticos locais para determinação da sensibilização cutânea no rato (método LLNA, de « Local Lymph Node Assay », Test Guideline  
429 da OCDE, capítulo B.42 deste anexo) (1). Foram publicados em (2) 
(3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) elementos pormenorizados sobre a 
validação do referido método, bem como uma revisão dos trabalhos co ­
nexos. Com base na avaliação da experiência adquirida e dos dados cien ­
tíficos, procedeu-se à atualização do método LLNA (12). O presente en ­
saio é o segundo método concebido para avaliar o potencial de sensibili ­
zação da pele de animais por produtos químicos (substâncias e misturas). O outro método ( Test Guideline  406 da OCDE, capítulo B.6 deste anexo) 
recorre a ensaios em cobaias, nomeadamente o ensaio de maximização na 
cobaia e o ensaio de Buehler (13). No que respeita ao bem-estar animal, o método LLNA é melhor do que o método B.6 e o  Test Guideline  406 da 
OCDE (13). O presente método LLNA atualizado inclui uma série de 
normas de desempenho (apêndice 1), que podem ser utilizadas como 
elemento de validação de métodos de ensaio novos ou modificados, fun ­
cional e mecanisticamente similares ao método LLNA, em conformidade com os princípios do documento de orientação ( Guidance Document ) 
n.
 o 34 da OCDE (14).  
2. O método LLNA estuda a fase de indução da sensibilização cutânea e fornece 
dados quantitativos adequados para a avaliação da resposta à dosagem. 
Note-se que os sensibilizantes ligeiros/moderados recomendados como pro ­
dutos químicos de controlo positivo adequados para métodos de ensaio em cobaias (método B.6,  Test Guideline  406 da OCDE) (13) também o são para 
o método LLNA (6) (8) (15). Neste método descreve-se, como possibilidade 
alternativa, uma abordagem LLNA reduzida (método rLLNA) que permite diminuir o número de animais utilizados numa percentagem que pode ir até 40 % (16) (17) (18). Pode recorrer-se a este método reduzido quando a 
regulamentação exigir que seja confirmada uma previsão negativa de poten ­
cial de sensibilização cutânea, desde que sejam observadas todas as outras especificações do protocolo LLNA aqui descritas. Uma previsão de resultado negativo deve basear-se em todas as informações disponíveis, como se refere 
no ponto 4. Antes de se recorrer ao método rLLNA, é necessário justificar 
claramente e fundamentar cientificamente a utilização do método. Se, con ­
trariamente ao esperado, o método rLLNA der resultados positivos ou incon ­
clusivos, pode ser necessário efetuar mais ensaios para interpretar ou clari ­
ficar os resultados obtidos. O método rLLNA não deve ser utilizado em 
estudos de identificação de perigos associados a substâncias sensibilizantes da pele quando forem necessárias informações de resposta à dosagem, como na subcategorização para efeitos do Regulamento (CE) n.
 o 1272/2008, rela ­
tivo à classificação, rotulagem e embalagem de substâncias e misturas, e do 
Sistema Mundial Harmonizado de Classificação e Rotulagem de Produtos Químicos da ONU.
 
DEFINIÇÕES  
3. As definições utilizadas figuram no apêndice 2.  
CONSIDERAÇÕES INICIAIS E LIMITAÇÕES  
4. O método LLNA constitui um método alternativo a utilizar na identifica ­
ção de produtos químicos potencialmente sensibilizantes da pele. Isso não 
implica, necessariamente, que o método deve ser sempre utilizado em 
substituição de ensaios em cobaias (método B.6,  Test Guideline  406 da 
OCDE) (13), mas apenas que é equivalente aos segundos e pode ser utilizado em alternativa, gerando normalmente resultados positivos ou ne ­
gativos que dispensam confirmação. Antes de efetuar o estudo, o labora ­
tório deve examinar todas as informações disponíveis sobre a substância
 ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 603
 
em causa, nomeadamente a identificação e a estrutura química, as proprie ­
dades físico-químicas, os resultados de quaisquer outros ensaios de toxi ­
cidade  in vitro  ou in vivo  da substância e dados toxicológicos sobre 
produtos químicos com estrutura semelhante. Esse exame destina-se a determinar se o método LLNA se adequa à substância (dada a incompa ­
tibilidade de alguns tipos de produtos químicos com o método LLNA – 
ver o ponto 5), bem como a facilitar a escolha das dosagens.
 
5. O método LLNA é um método  in vivo , não eliminando, portanto, a uti ­
lização de animais na avaliação da atividade sensibilizante alérgica por 
contacto. Pode, no entanto, reduzir o número de animais utilizados para 
estes fins. Além disso, proporciona melhorias substanciais (menos dor e sofrimento) no modo como os animais são utilizados nos ensaios de sen ­
sibilização alérgica por contacto. O método LLNA baseia-se na observação 
de ocorrências imunológicas estimuladas por produtos químicos durante a 
fase indutora da sensibilização. Contrariamente aos ensaios em cobaias (método B.6,  Test Guideline  406 da OCDE) (13), não exige a indução 
de reações de hipersensibilidade dérmica por agentes externos. Também 
não implica a utilização de nenhum adjuvante, ao contrário do que sucede no ensaio de maximização na cobaia (13), reduzindo assim a dor e so ­
frimento causados aos animais. Apesar das vantagens do método LLNA 
em relação ao método B.6 e ao  Test Guideline  406 da OCDE, importa 
reconhecer que o método tem limitações que podem exigir o recurso a estes últimos (13) (por exemplo, falsos negativos no método LLNA para certos metais, falsos positivos para certos irritantes cutâneos – como no 
caso de alguns produtos químicos tensioativos (19) (20) – ou problemas de 
solubilidade da substância em estudo). Por outro lado, no caso das subs ­
tâncias ou classes de substâncias químicas com grupos funcionais que, comprovadamente, suscitem dúvidas (21), pode ser necessário recorrer a 
ensaios em cobaias (método B.6;  Test Guideline  406 da OCDE) (13). 
Além disso, tendo em conta a base de dados de validação – limitada e essencialmente constituída por formulações pesticidas –, é mais provável que o método LLNA dê resultados positivos para este tipo de substância 
em estudo do que o ensaio na cobaia (22). Todavia, ao testar formulações, 
pode encarar-se a possibilidade de incluir, como substâncias de referência, substâncias similares com resultados conhecidos, para demonstrar que o método LLNA funciona bem (ver o ponto 16). Salvaguardadas estas limi ­
tações, o método LLNA é potencialmente aplicável ao estudo de qualquer 
substância, a menos que esta possua alguma propriedade passível de com ­
prometer a exatidão do método.
 
PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
6. O princípio básico subjacente ao método LLNA é que os sensibilizantes 
induzem uma proliferação de linfócitos nos gânglios linfáticos drenantes do local de aplicação da substância em estudo. Esta proliferação é propor ­
cional à dosagem e à potência do alergénio aplicado e constitui um modo 
simples de obter uma medida quantitativa da sensibilização. Mede-se a proliferação e compara-se a proliferação média em cada grupo estudado com a proliferação média no grupo de controlo tratado com o excipiente. 
Determina-se a razão entre a proliferação média em cada grupo tratado e a 
proliferação observada em paralelo no grupo de controlo tratado com o excipiente; essa razão é denominada índice de estimulação (IE). Para que uma substância em estudo possa ser classificada de sensibilizante cutânea 
potencial, este índice deve ser ≥ 3. O presente método baseia-se no recurso 
à marcação radioativa  in vivo  para medir o aumento de número de células 
em proliferação nos gânglios linfáticos drenantes do sistema auricular. Podem, no entanto, utilizar-se outros indicadores para determinar o número 
de células em proliferação, desde que as normas de desempenho sejam 
totalmente cumpridas (apêndice 1).
 ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 604
 
DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Escolha da espécie animal  
7. O rato é a espécie escolhida para este ensaio. Utilizam-se fêmeas adultas 
das estirpes CBA/Ca ou CBA/J, nulíparas e não grávidas. No início do 
estudo, os animais devem ter entre 8 e 12 semanas; a variação de peso dos animais entre si deve ser mínima e não deve exceder 20 % do peso médio 
dos mesmos. Podem ser utilizadas outras estirpes, bem como machos, 
quando houver dados suficientes que demonstrem não existirem diferenças significativas na resposta ao método LLNA relacionadas com a estirpe e/ou o sexo do animal.
 
Condições de alojamento e de alimentação  
8. Os ratos devem ser alojados em grupo (23), a menos que se justifique 
cientificamente o seu alojamento individual. A temperatura do biotério deve ser de 22 °C ± 3 °C. A humidade relativa não deve ser inferior a 
30 % e, de preferência, não deve exceder 70 %, exceto durante a limpeza 
do biotério. Idealmente, deve procurar manter-se entre 50 % e 60 %. A iluminação deve ser artificial, com uma sequência de 12 horas de luz seguidas de 12 horas de escuridão. Na alimentação, podem utilizar-se 
dietas convencionais de laboratório e deve ser fornecida água de beber 
sem restrições.
 
Preparação dos animais  
9. Os animais são selecionados aleatoriamente, marcados de modo a permitir 
a identificação individual (mas não por marcação nas orelhas) e mantidos 
em gaiolas durante, pelo menos, cinco dias antes da aplicação das doses, para permitir a aclimatação às condições do laboratório. Antes do início do tratamento, examinam-se os animais, de modo a assegurar que não apre ­
sentam lesões cutâneas visíveis.
 
Preparação das soluções a aplicar  
10. Os produtos químicos sólidos dissolvem-se ou suspendem-se em solventes/ 
/excipientes e, se necessário, diluem-se, antes da aplicação nas orelhas dos 
ratos. Os produtos líquidos podem ser aplicados tal e qual ou ser diluídos antes da aplicação. Os produtos químicos insolúveis, como os geralmente presentes nos dispositivos médicos, devem ser sujeitos a um processo de 
extração exaustivo com um solvente apropriado, a fim de nele concentrar 
para o ensaio todos os componentes extraíveis, antes da aplicação nas orelhas dos ratos. As substâncias em estudo devem ser preparadas diaria ­
mente, a menos que haja dados de estabilidade que demonstrem ser acei ­
tável o seu armazenamento.
 
Verificação da fiabilidade  
11. Utilizam-se produtos químicos de controlo positivo para demonstrar o 
desempenho adequado do ensaio, devendo obter-se uma resposta quanti ­
tativamente bem caracterizada, com sensibilidade adequada e reprodutível, 
a essas substâncias sensibilizantes. Recomenda-se a inclusão, em paralelo, de um produto químico de controlo positivo, para demonstrar a compe ­
tência do laboratório na execução de cada ensaio e possibilitar a avaliação 
da reprodutibilidade e comparabilidade intra e interlaboratoriais. Algumas 
autoridades reguladoras exigem também um produto químico de controlo positivo em cada estudo, pelo que os laboratórios devem consultar as autoridades competentes antes de executarem o método LLNA. 
Aconselha-se, portanto, a utilização rotineira, em paralelo, de um produto 
químico de controlo positivo, para evitar a eventual necessidade de ensaios suplementares em animais decorrente do recurso apenas periódico a esses produtos químicos de controlo (ver o ponto 12). No método LLNA, o 
produto químico de controlo positivo deve induzir uma resposta positiva a 
um nível de exposição do qual se espere um aumento do índice de esti ­
mulação superior a 3 em relação ao grupo de controlo negativo. Deve escolher-se a dosagem do produto químico de controlo positivo de 
modo que este não cause irritação cutânea excessiva nem toxicidade 
sistémica e que a indução seja reprodutível, mas não excessiva
 ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 605
 
(considera-se excessivo um índice de estimulação superior a 20). Os pro ­
dutos químicos de controlo positivo preferidos são aldeído hexilcinâmico 
(n. o CAS 101-86-0) a 25 % numa mistura de acetona e azeite na proporção 
volúmica 4:1 e mercaptobenzotiazol (n.  o CAS 149-30-4) a 5 % em  N,N - 
-dimetilformamida (ver o apêndice 1, quadro 1). Em certas circunstâncias, e 
perante justificação adequada, podem utilizar-se outros produtos químicos 
de controlo positivo que cumpram os critérios atrás referidos.  
12. Embora seja recomendada a inclusão, em paralelo, de um grupo de con ­
trolo positivo, em algumas situações pode justificar-se que um laboratório que aplique o método LLNA regularmente (isto é, pelo menos uma vez por mês) efetue ensaios de controlo positivo apenas periódicos (a interva ­
los não superiores a seis meses) e mantenha uma base de dados histórica 
dos produtos químicos de controlo positivo que comprove a capacidade do laboratório de obter resultados reprodutíveis e exatos com esses produtos. A competência na execução do método LLNA pode demonstrar-se ob ­
tendo resultados positivos constantes com um produto químico de controlo 
positivo em pelo menos 10 ensaios independentes efetuados num período razoável (menos de um ano).
 
13. Deve incluir-se em paralelo um grupo de controlo positivo sempre que 
haja alguma alteração processual do método LLNA (por exemplo, altera ­
ções do pessoal formado, das matérias e/ou dos reagentes utilizados no 
método de ensaio, do equipamento utilizado neste último ou da origem dos 
animais estudados), devendo essas alterações ser documentadas nos rela ­
tórios laboratoriais. Deve analisar-se a incidência dessas alterações na adequação da base de dados históricos anteriormente estabelecida, ponde ­
rando a necessidade de criar uma nova base de dados históricos para 
documentar a coerência dos resultados obtidos com os produtos químicos de controlo positivo.
 
14. Os investigadores devem ter presente que a decisão de efetuar o estudo de 
produtos químicos de controlo positivo periodicamente, e não em paralelo, tem implicações na adequação e aceitabilidade dos resultados negativos 
dos estudos efetuados sem produto químico de controlo positivo em pa ­
ralelo, no intervalo entre cada estudo de controlo positivo periódico. Por exemplo, se for obtido um resultado falso negativo num estudo de controlo positivo periódico, podem questionar-se os resultados negativos eventual ­
mente obtidos para as substâncias em estudo no período compreendido 
entre o último estudo periódico aceitável de controlo positivo e o estudo periódico inaceitável de controlo positivo. Ao optar entre a inclusão em paralelo de produtos químicos de controlo positivo e um controlo positivo 
apenas periódico, devem ponderar-se cuidadosamente as consequências. 
Deve também ponderar-se a utilização de menos animais no grupo de controlo positivo em paralelo, se houver justificação científica para isso e o laboratório demonstrar, com base em dados históricos próprios, que 
podem ser utilizados menos ratos (12).
 
15. Embora se deva ensaiar o produto químico de controlo positivo num 
excipiente que reconhecidamente garanta coerência nas respostas (por 
exemplo, acetona e azeite na proporção volúmica 4:1), em determinadas situações regulamentares poderá ser também necessário efetuar o ensaio num excipiente não convencional (formulação clínica ou quimicamente 
pertinente) (24). Se o ensaio em paralelo de um produto químico de 
controlo positivo for efetuado com um excipiente diverso do da substância em estudo, deve incluir-se um controlo de excipiente para o produto químico de controlo positivo ensaiado em paralelo.
 
16. Se o estudo consistir na avaliação de substâncias de uma determinada 
classe química ou gama de respostas, o recurso a substâncias de referência 
pode ser útil para demonstrar que o método de ensaio funciona correta ­
mente na deteção do potencial de sensibilização cutânea do tipo de subs ­
tância em causa. Para que seja considerada adequada, uma substância de referência deve possuir as seguintes propriedades:
 
— semelhança estrutural e funcional com a classe de substâncias em 
estudo,  
— características físico-químicas conhecidas,  
— dados corroborantes do método LLNA,  
— dados corroborantes de outros modelos animais e/ou de ensaios em 
pessoas.  ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 606
 
PROCEDIMENTO DE ENSAIO  
Número de animais e níveis de dosagem  
17. Utilizam-se, no mínimo, quatro animais por grupo de dosagem e um 
mínimo de três concentrações da substância em estudo, além de um grupo 
de controlo negativo em paralelo, tratado apenas com o excipiente da substância em estudo, e de um produto químico de controlo positivo 
(ensaiado em paralelo ou recentemente, consoante a política do laboratório 
acerca dos pontos 11 a 14). Deve ponderar-se o ensaio de várias doses do produto químico de controlo positivo, sobretudo quando este for ensaiado com intermitência. Os animais dos grupos de controlo devem ser manu ­
seados e tratados de modo idêntico ao dos animais dos grupos tratados, 
exceto no que respeita à administração da substância em estudo.
 
18. A escolha da dosagem e do excipiente deve basear-se nas recomendações 
das referências (3) e (5). Selecionam-se normalmente doses consecutivas 
numa série de concentrações adequada, por exemplo, 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 %, etc. A seleção das séries de concentração utilizadas deve ter fundamentação científica. Na escolha de três concen ­
trações consecutivas de modo que a concentração mais elevada maximize 
a exposição, evitando ao mesmo tempo a ocorrência de toxicidade sisté ­
mica e irritação cutânea local excessiva, devem ser tidas em conta as informações toxicológicas (por exemplo, referentes a toxicidade aguda e 
irritação dérmica), bem como estruturais e físico-químicas, disponíveis 
sobre a substância em estudo (e/ou sobre substâncias estruturalmente afins) (3) (25). Na ausência de tais informações, pode ser necessário um ensaio exploratório prévio (ver os pontos 21 a 24).
 
19. O excipiente não deve interferir no resultado do ensaio nem distorcê-lo, 
devendo ser escolhido de modo a maximizar a solubilidade e a obter a 
maior concentração possível numa solução ou suspensão adequada para 
aplicação da substância em estudo. Constituem excipientes adequados uma mistura de acetona e azeite na proporção volúmica 4:1, a  N,N -dimetilfor ­
mamida, a metiletilcetona, o propilenoglicol e o sulfóxido dimetílico (19), 
mas podem utilizar-se outros, desde que com fundamentação científica. 
Em certas situações, pode ser necessário efetuar um controlo adicional com um solvente utilizado na prática clínica ou a formulação na qual a substância em estudo é comercializada. Deve ter-se especial cuidado em 
assegurar que as substâncias hidrófilas sejam incorporadas num sistema 
(excipiente) que molhe a pele e não escorra de imediato, acrescentando solubilizadores adequados (por exemplo, Pluronic® L92 a 1 %). Devem, portanto, evitar-se os excipientes totalmente aquosos.
 
20. A utilização de gânglios linfáticos de ratos distintos possibilita a avaliação 
da variabilidade de animal para animal e a comparação estatística da diferença entre as medições relativas à substância em estudo e ao grupo 
de controlo do excipiente (ver o ponto 35). Por outro lado, se se dispuser 
de dados por animal, pode ponderar-se a redução do número de ratos no grupo de controlo positivo (12). Além disso, há autoridades reguladoras que exigem a apresentação de dados por animal. Todavia, algumas auto ­
ridades reguladoras podem aceitar a agregação de dados relativos a vários 
animais, caso em que os utentes podem optar por dados individualizados por animal ou pela agregação de dados relativos a séries de animais.
 
Ensaio exploratório prévio  
21. Na ausência de informações que permitam determinar a dosagem máxima 
a ensaiar (ver o ponto 18), é necessário efetuar um ensaio exploratório prévio, a fim de definir a dosagem adequada a ensaiar pelo método LLNA. O objetivo deste ensaio exploratório consiste em fornecer orientações para 
a escolha da dosagem máxima a utilizar no estudo principal pelo método 
LLNA, caso não se disponha de informações sobre a concentração que induz toxicidade sistémica (ver o ponto 24) e/ou irritação cutânea local excessiva (ver o ponto 23). A dosagem máxima estudada deve ser uma 
concentração de 100 % da substância em estudo, no caso dos líquidos, ou 
a concentração máxima possível, no caso dos sólidos e das suspensões.
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22. O ensaio exploratório prévio é efetuado em condições idênticas às do 
estudo principal pelo método LLNA, mas não se avalia a proliferação 
nos gânglios linfáticos e podem utilizar-se menos animais por grupo de dosagem. Sugere-se o recurso a um ou dois animais por grupo de dosa ­
gem. Observam-se diariamente todos os ratos para verificar se apresentam 
sinais clínicos de toxicidade sistémica ou de irritação no local de aplica ­
ção. Regista-se o peso corporal de cada rato antes do ensaio e antes de o eutanasiar (dia 6). Observam-se as orelhas para verificar se têm eritema e atribui-se-lhes uma pontuação de acordo com o quadro 1 (25). Mede-se a 
espessura das orelhas com um instrumento adequado – por exemplo, um 
micrómetro digital ou um leitor de espessuras da Peacock – no dia 1 (antes da primeira dose), no dia 3 (cerca de 48 horas após a primeira dose) e no dia 6. Complementarmente, no dia 6 pode determinar-se a espessura das 
orelhas por pesagem de punções auriculares efetuadas depois da eutanásia 
dos animais. Uma pontuação de eritema ≥ 3 e/ou o aumento da espessura 
auricular em 25 % ou mais, em qualquer dia de medição, constituem indicadores de irritação cutânea local excessiva (26) (27). Para dosagem 
mais elevada no estudo principal pelo método LLNA, deve ser escolhida a 
dosagem da série de concentrações do ensaio exploratório prévio (ver o ponto 18) imediatamente inferior à que induz toxicidade sistémica e/ou irritação cutânea local excessiva.
 
Quadro 1  
Pontuações de eritema  
Observação Pontuação  
Ausência de eritema 0 
Eritema muito ligeiro (quase impercetível) 1 Eritema bem definido 2 Eritema moderado a intenso 3 Eritema intenso (vermelhidão roxa) ou formação de escara 
que impede a pontuação do eritema 4
 
23. Além do referido acerca do aumento de 25 % da espessura auricular (26) 
(27), também se recorreu a aumentos estatisticamente significativos da 
espessura auricular dos ratos tratados, comparativamente aos ratos de con ­
trolo, para identificar produtos irritantes pelo método LLNA (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Os aumentos estatisticamente significativos da espes ­
sura auricular inferiores a 25 % não foram, porém, especificamente asso ­
ciados a irritação excessiva (30) (32) (33) (34).
 
24. Quando efetuadas no âmbito de uma avaliação integrada, as seguintes 
observações clínicas podem indiciar toxicidade sistémica (35) (36), po ­
dendo assim indicar a dosagem máxima a utilizar no método LLNA prin ­
cipal: alterações do funcionamento do sistema nervoso (por exemplo, pi ­
loereção, ataxia, tremores e convulsões); alterações comportamentais (por 
exemplo, agressividade, alterações das atividades higiénicas, alterações pronunciadas de atividade); alterações respiratórias (alterações da frequên ­
cia e da intensidade da respiração, como dispneia, arfar e pieira) e da 
ingestão de alimentos e de água. Devem ainda ser tidos em conta na 
avaliação os sinais de letargia e/ou de apatia e quaisquer sinais clínicos de dor ou sofrimento mais do que ligeiros ou momentâneos, ou reduções de peso corporal superiores a 5 % entre o dia 1 e o dia 6, bem como a 
mortalidade. Os animais moribundos e os animais que manifestem sofri ­
mento ou sinais de dor intensa e continuada devem ser eutanasiados (37).
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Sequência experimental do estudo principal  
25. A sequência experimental do ensaio é a seguinte:  
— Dia 1:  Identificar individualmente e anotar o peso de cada animal e 
todas as observações clínicas. Aplicar no dorso de cada orelha 25 μl 
da diluição adequada da substância em estudo, do excipiente sozinho ou do produto químico de controlo positivo (ensaiado em paralelo ou recentemente, consoante a política do laboratório acerca dos pontos 11 
a 15).
 
— Dias 2 e 3:  Repetir o procedimento de aplicação efetuado no dia 1.  
— Dias 4 e 5:  Nenhum tratamento.  
— Dia 6:  Anotar o peso de cada animal. Injetar, através da veia caudal, 
250 μl de tampão salino de fosfato (PBS) esterilizado contendo 20 μCi 
(7,4 × 10  5 Bq) de  3 H-metiltimidina em todos os ratos do estudo e de 
controlo. Em alternativa, injetar 250 μl de PBS esterilizado, contendo 
2 μCi (7,4 × 10  4 Bq) de  125 I-iododesoxiuridina numa concentração 
10 –5 M em fluorodesoxiuridina, em todos os ratos, através da veia 
caudal. Eutanasiar os animais 5 horas depois. Excisar os gânglios linfáticos auriculares de drenagem, das orelhas de cada rato, e colo ­
cá-los em PBS, separadamente para cada animal (procedimento por 
animal); em alternativa, excisar os gânglios linfáticos de cada orelha e 
colocá-los agrupados em PBS, por grupo de tratamento (procedimento do tratamento agrupado). Para pormenores e esquemas da identificação e dissecação dos gânglios linfáticos, ver a referência (12). A fim de 
melhor avaliar a resposta cutânea local no estudo principal, podem ser 
incluídos no protocolo de estudo parâmetros suplementares, como a pontuação do eritema auricular ou medições da espessura auricular (com um medidor de espessura ou por pesagem de punções auriculares  
post mortem ).
 
Preparação das suspensões celulares  
26. Preparar suspensões unicelulares de células dos gânglios linfáticos, exci ­
sados bilateralmente, aplicando o procedimento por animal ou, em alter ­
nativa, o procedimento do tratamento agrupado, por desagregação mecâ ­
nica suave através de um peneiro de aço inoxidável com malha de 200 μm, ou recorrendo a outra técnica aceitável para obtenção de suspensões 
unicelulares. Lavar duas vezes as células com PBS em excesso e precipitar 
o ADN com ácido tricloroacético a 5 %, a 4 °C, durante 18 horas (3). Ressuspender os sedimentos em 1 ml de ácido tricloroacético e transferir a suspensão para frascos de contador de cintilações contendo 10 ml de 
fluido de cintilação, para contagem de
 3 H, ou diretamente para tubos de 
contagem gama, para contagem de  125 I. 
Determinação da proliferação celular (radioatividade incorporada)  
27. Medir a incorporação de  3 H-metiltimidina por contagem de cintilação β, 
em desintegrações por minuto (DPM). Medir a incorporação de  125 I-iodo­
desoxiuridina por contagem de  125 I, exprimindo-a igualmente em DPM. 
Consoante o procedimento seguido, a incorporação é expressa em DPM/ 
/rato (procedimento por animal) ou em DPM/grupo de tratamento (proce ­
dimento do tratamento agrupado).  
Método LLNA reduzido  
28. Em determinadas situações, quando a regulamentação exigir que se con ­
firme uma previsão negativa de potencial de sensibilização cutânea, pode recorrer-se a um protocolo rLLNA facultativo (16) (17) (18) que utiliza 
menos animais, desde que sejam observadas todas as outras especificações 
do protocolo LLNA aqui descritas. Antes de se recorrer ao método rLLNA, é necessário justificar claramente com base em argumentos cien ­
tíficos a utilização do método. Se forem obtidos resultados positivos ou 
inconclusivos, pode ser necessário efetuar mais ensaios para interpretar ou 
clarificar esses resultados.
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29. A redução numérica dos grupos de dosagem é a única diferença entre os 
protocolos de ensaio dos métodos LLNA e rLLNA, razão pela qual este 
último não permite obter informações de resposta à dosagem. Não deve, portanto, recorrer-se ao método rLLNA quando essas informações forem necessárias. Tal como no método de multidosagem LLNA, no método 
rLLNA avalia-se a concentração máxima da substância em estudo que 
não induz toxicidade sistémica manifesta nem irritação cutânea local ex ­
cessiva no rato (ver o ponto 18).
 
OBSERVAÇÕES  
Observações clínicas  
30. Observar cuidadosamente cada rato pelo menos uma vez por dia, com 
vista à deteção de sinais clínicos, quer de irritação local no ponto de aplicação, quer de toxicidade sistémica. Anotar todas as observações, 
mantendo um registo para cada rato. Os planos de controlo devem incluir 
critérios para identificar prontamente os ratos que evidenciem níveis de toxicidade sistémica, irritação cutânea local excessiva ou corrosão da pele passíveis de justificarem a eutanásia do animal (37).
 
Pesos corporais  
31. Tal como referido no ponto 25, mede-se o peso corporal de cada animal 
no início do ensaio e quando da eutanásia programada.  
CÁLCULO DOS RESULTADOS  
32. Os resultados correspondentes a cada grupo de tratamento exprimem-se em 
índice de estimulação. Caso se utilize o procedimento por animal, determina-se o índice de estimulação dividindo a média de DPM/rato, 
correspondente a cada grupo tratado com a substância em estudo e ao 
grupo de controlo positivo, pela média de DPM/rato do grupo de controlo do solvente/excipiente. O índice de estimulação médio para o grupo de controlo tratado com o excipiente é igual a 1. Caso se utilize o tratamento 
agrupado, determina-se o índice de estimulação dividindo a incorporação 
radioativa agregada correspondente a cada grupo de tratamento pela in ­
corporação agregada do grupo de controlo do excipiente. O valor obtido é um índice de estimulação médio.
 
33. Para efeitos de decisão, consideram-se positivos os resultados de índice de 
estimulação ≥ 3. Todavia, ao ponderar se um resultado próximo do limite 
deve ou não ser considerado positivo, podem ter-se também em conta o 
grau de resposta à dosagem, a significância estatística e a coerência das 
respostas correspondentes ao solvente/excipiente e à substância de controlo positivo (4) (5) (6).
 
34. Se for necessário clarificar os resultados obtidos, devem examinar-se as 
propriedades da substância em estudo, nomeadamente se esta possui es ­
trutura semelhante a sensibilizantes cutâneos conhecidos ou causa irritação cutânea local excessiva nos ratos, bem como a natureza da resposta à dosagem observada. Na referência (7) analisam-se em pormenor estes e 
outros aspetos.
 
35. A recolha de dados de radioatividade para cada rato possibilita uma análise 
estatística da existência, nos dados, de indicações de resposta à dosagem e 
do grau desta resposta. A avaliação estatística pode incluir uma avaliação 
da resposta à dosagem e comparações, convenientemente adaptadas, de grupos estudados (por exemplo, comparações par a par de um grupo correspondente a uma determinada dosagem com o grupo de controlo 
tratado com o excipiente ensaiado em paralelo). As análises estatísticas 
podem incluir, por exemplo, regressões lineares ou testes de William, para analisar tendências de resposta à dosagem, e testes de Dunnett, para com ­
parações par a par. Na escolha de um método de análise estatística apro ­
priado, o investigador deve estar atento a possíveis divergências das va ­
riâncias e a outros problemas conexos passíveis de exigirem uma trans ­
formação dos dados ou uma análise estatística não paramétrica. O inves ­
tigador pode ainda ter de efetuar os cálculos de índice de estimulação e as 
análises estatísticas considerando alguns pontos e descartando outros (por 
vezes denominados «aberrantes»).
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DADOS E RELATÓRIOS  
Dados  
36. Os dados devem ser resumidos em quadros. Quando se seguir o procedi ­
mento por animal, indicar os valores de DPM correspondentes a cada 
animal, a média de DPM/animal do grupo, o parâmetro estatístico asso ­
ciado (desvio-padrão ou erro-padrão da média, por exemplo) e o índice de 
estimulação médio para cada grupo de dosagem, comparativamente ao 
grupo de controlo do excipiente ensaiado em paralelo. Quando se recorrer ao tratamento agrupado, indicar a média ou a mediana das desintegrações por minuto e o índice de estimulação médio de cada grupo de dosagem, 
comparativamente ao grupo de controlo do excipiente ensaiado em para ­
lelo.
 
Relatório do ensaio  
37. O relatório do ensaio deve incluir as seguintes informações:  
Substâncias em estudo e de controlo:  
— dados de identificação (por exemplo, números CAS e CE – caso 
existam –, origem, grau de pureza, impurezas conhecidas, número de 
lote),  
— natureza física e propriedades físico-químicas (por exemplo, volatilida ­
de, estabilidade, solubilidade),  
— no caso das misturas, composição e percentagens relativas dos com ­
ponentes;  
Solvente/excipiente:  
— dados de identificação (grau de pureza, concentração – se adequado –, 
volume utilizado),  
— justificação da escolha do excipiente;  
Animais utilizados nos ensaios:  
— origem dos ratos CBA,  
— estado microbiológico dos animais, caso seja conhecido,  
— número e idade dos animais,  
— origem dos animais, condições de alojamento, dieta, etc.;  
Condições de ensaio:  
— elementos sobre a preparação e aplicação da substância em estudo,  
— justificação das dosagens escolhidas, incluindo os resultados do ensaio 
exploratório prévio eventualmente efetuado,  
— concentrações do excipiente e da substância em estudo utilizadas e 
quantidade total desta aplicada,  
— elementos sobre a qualidade dos alimentos e da água (incluindo o tipo 
de dieta e a origem desta, bem como a origem da água),  
— elementos sobre a organização cronológica dos tratamentos e da co ­
lheita das amostras,  
— métodos de medição da toxicidade,  
— critérios definidos para que o estudo seja considerado positivo ou 
negativo,  
— elementos sobre eventuais desvios ao protocolo e explicação do modo 
como estes afetam a realização e os resultados do estudo;  
Verificação da fiabilidade:  
— resumo dos resultados da última verificação de fiabilidade, incluindo 
informações sobre a substância em estudo, a concentração e o exci ­
piente utilizados,  
— dados do laboratório relativos a controlos positivos ensaiados em pa ­
ralelo e/ou históricos e a controlos negativos ensaiados em paralelo,  ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 611
 
— se não tiver sido efetuado em paralelo um controlo positivo, a data do 
controlo positivo periódico mais recente e o relatório laboratorial cor ­
respondente, bem como um relatório que especifique os dados histó ­
ricos de controlos positivos do laboratório nos quais se baseou a decisão de não efetuar um controlo positivo paralelo;
 
Resultados:  
— peso de cada rato no início da dosagem e na altura da sua morte 
programada, bem como a média e o parâmetro estatístico associado (desvio-padrão ou erro-padrão da média, por exemplo) para cada grupo de tratamento,
 
— surgimento e evolução de sinais de toxicidade, incluindo irritação dér ­
mica no local da aplicação (caso ocorra), para cada animal,  
— quadro de valores de DPM e de índices de estimulação para cada 
grupo de tratamento, por rato (procedimento por animal) ou em valor médio/da mediana (procedimento do tratamento agrupado),
 
— média e parâmetro estatístico associado (desvio-padrão ou erro-padrão 
da média, por exemplo) de DPM/rato, para cada grupo de tratamento, e 
resultados da análise dos pontos aberrantes, também para cada grupo 
de tratamento, quando se aplica o procedimento por animal,  
— índice de estimulação calculado e medida adequada da variabilidade de 
animal para animal, relativamente à substância em estudo e nos grupos de controlo, quando se aplica o procedimento por animal,
 
— resposta à dosagem,  
— análises estatísticas que se justifiquem;  
Análise dos resultados:  
— comentário breve sobre os resultados obtidos; análise da resposta à 
dosagem, análises estatísticas que se justifiquem e conclusão sobre a classificação, ou não, da substância em estudo como sensibilizante cutânea.
 
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(36) ICCVAM (2009). Report on the ICCVAM-NICEATM/ECVAM/JaCVAM 
Scientific Workshop on Acute Chemical Safety Testing: Advancing In Vitro 
Approaches and Humane Endpoints for Systemic Toxicity Evaluations. Research Triangle Park, NC. National Institute of Environmental Health Sciences. Disponível em: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/acutetox/ 
/Tox_workshop.htm].
 
(37) OCDE (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph, Series 
on Testing and Assessment, No. 19, ENV/JM/MONO(2000)7. OCDE, Pa ­
ris. Disponível em: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].
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Apêndice 1  
Normas de desempenho para avaliação de métodos similares ou modificados 
propostos para ensaios LLNA de sensibilização cutânea  
INTRODUÇÃO  
1. O objetivo das normas de desempenho consiste em comunicar os termos 
com base nos quais é possível determinar se um método novo, sujeito ou 
não a direitos de propriedade (direitos de autor, marca comercial ou registo), é suficientemente exato e fiável para certas finalidades de ensaio. Estas normas baseiam-se em métodos de ensaio validados e aceites e podem 
ser utilizadas para avaliar a fiabilidade e exatidão de métodos similares 
(designados coloquialmente em inglês por «métodos “ me-too ” »), baseados 
em princípios científicos semelhantes e que medem ou preveem o mesmo efeito biológico ou tóxico (14).
 
2. Antes da adoção de métodos modificados (ou seja, aperfeiçoamentos a 
métodos de ensaio aprovados), deve avaliar-se o efeito das alterações pro ­
postas no desempenho do ensaio e em que medida essas alterações afetam 
as informações disponíveis para os outros componentes do processo de validação. Em função do número e da natureza das alterações propostas, dos dados de que se disponha e da documentação de apoio às alterações em 
causa, os métodos modificados devem ser sujeitos a um processo de vali ­
dação idêntico ao descrito para um novo ensaio ou, se for caso disso, a uma avaliação limitada de fiabilidade e adequação com base em normas de desempenho estabelecidas (14).
 
3. Os métodos similares ou modificados cuja utilização no âmbito do presente 
método de ensaio seja proposta devem ser avaliados, com vista à determi ­
nação da sua fiabilidade e exatidão, utilizando produtos químicos represen ­
tativos de toda a gama da escala de pontuação do método LLNA. Para evitar que sejam utilizados animais sem necessidade, recomenda-se viva ­
mente que as entidades que desenvolvam os modelos consultem as autori ­
dades competentes antes de iniciarem os estudos de validação com base nas 
normas de desempenho e orientações constantes do presente método.
 
4. Estas normas baseiam-se nas normas de desempenho harmonizadas dos 
E.U.A. (ICCVAM), da UE (ECVAM) e do Japão (JaCVAM) (12) para 
avaliação da validade de versões similares ou modificadas do método LLNA. As normas de desempenho são constituídas pelos componentes essenciais do método de ensaio, pelos produtos químicos de referência 
recomendados e por normas de exatidão e de fiabilidade que o método 
proposto deve cumprir ou suplantar.
 
I. Componentes essenciais do método de ensaio  
5. Para garantir que um método LLNA similar ou modificado é funcional e 
mecanisticamente análogo ao método LLNA e mede o mesmo efeito bio ­
lógico, devem constar do protocolo do método de ensaio os seguintes componentes:
 
— Aplicação tópica da substância em estudo em ambas as orelhas dos 
ratos;  
— Medição da proliferação de linfócitos nos gânglios linfáticos drenantes 
do local de aplicação da substância em estudo;  
— Medição da proliferação de linfócitos durante a fase indutora da sensi ­
bilização cutânea;  ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 616
 
— Escolha, como dosagem mais elevada da substância em estudo, da 
concentração máxima desta que não induz toxicidade sistémica nem 
irritação cutânea local excessiva nos ratos. Escolha, como dosagem mais elevada de um produto químico de referência de controlo positivo, de uma dose deste pelo menos tão elevada quanto a da estimativa da 
concentração necessária para gerar um índice de estimulação 3 (ver o 
quadro 1) sem causar toxicidade sistémica nem irritação cutânea local excessiva nos ratos;
 
— Inclusão em cada estudo, em paralelo, de um controlo do excipiente e, 
quando se justifique, também de um controlo positivo em paralelo;  
— Utilização de pelo menos quatro animais por grupo de dosagem;  
— Recolha de dados por animal ou agregados.  
Se algum destes critérios não for preenchido, não é possível validar o 
método similar ou modificado com base nestas normas de desempenho.  
II. Lista mínima de produtos químicos de referência  
6. As normas de desempenho harmonizadas dos E.U.A. (ICCVAM), da 
UE (ECVAM) e do Japão (JaCVAM) (12) estabelecem uma lista mínima 
de 18 produtos químicos de referência a utilizar e quatro produtos químicos 
de referência facultativos (substâncias que geram resultados positivos falsos ou negativos falsos no método LLNA, comparativamente aos resultados obtidos em cobaias ou em pessoas – método B.6 ou  Test Guideline  406 
da OCDE – (13), podendo assim ser utilizados para demonstrar desempe ­
nhos iguais ao do método LLNA ou melhores) que são incluídos nas normas de desempenho do método LLNA. Os critérios de seleção desses produtos químicos foram os seguintes:
 
— A lista de produtos químicos de referência representa os tipos de subs ­
tâncias normalmente utilizados para determinar potenciais de sensibili ­
zação cutânea e a gama de respostas que o método LLNA é capaz de medir ou de prever;
 
— A estrutura química das substâncias está bem definida;  
— Dispõe-se para cada substância de dados de ensaios de gânglios linfá ­
ticos locais (método B.6 ou  Test Guideline  406 da OCDE) (13) e, 
quando possível, de dados de ensaios em pessoas; e  
— As substâncias estão facilmente disponíveis nos circuitos comerciais.  
Os produtos químicos de referência recomendados constam do quadro 1. 
Nos estudos que recorram aos produtos químicos de referência propostos 
devem utilizar-se os excipientes correspondentes indicados no mesmo qua ­
dro. Se uma substância constante do quadro não estiver disponível, podem utilizar-se outras que preencham os critérios de escolha referidos, funda ­
mentando devidamente esta opção.
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Quadro 1  
Produtos químicos de referência recomendados para efeitos das normas de desempenho de métodos LLNA  
Número Produto químico (  1 ) N.  o CAS Estado Excipiente (  2 ) EC3 (%) (  3 ) N (  4 ) 0,5x – 2,0x EC3 Intervalo 
efetivo da 
EC3 Método 
LLNA versus 
ensaio em 
cobaias Método 
LLNA versus 
sensibi­
lização 
humana  
1 Mistura de 5-cloro2-metil4-isotiazolin3- 
-ona (CMI) e 2-metil4-isotiazolin3-ona (MI) (  5 ) 26172-55-4/ 
2682-20-4 Líquido DMF 0,009 1 0,0045-0,018 NC +/+ +/+ 
2 DNCB 97-00-7 Sólido AAZ 0,049 15 0,025-0,099 0,02-0,094 +/+ +/+ 
3 4-Fenilenodiamina 106-50-3 Sólido AAZ 0,11 6 0,055-0,22 0,07-0,16 +/+ +/+ 4 Cloreto de cobalto 7646-79-9 Sólido DMSO 0,6 2 0,3-1,2 0,4-0,8 +/+ +/+ 
5 Isoeugenol 97-54-1 Líquido AAZ 1,5 47 0,77-3,1 0,5-3,3 +/+ +/+ 
6 2-Mercaptobenzotiazole 149-30-4 Sólido DMF 1,7 1 0,85-3,4 NC +/+ +/+ 7 Citral 5392-40-5 Líquido AAZ 9,2 6 4,6-18,3 5,1-13 +/+ +/+ 8 HCA 101-86-0 Líquido AAZ 9,7 21 4,8-19,5 4,4-14,7 +/+ +/+ 9 Eugenol 97-53-0 Líquido AAZ 10,1 11 5,05-20,2 4,9-15 +/+ +/+ 
10 Benzoato de fenilo 93-99-2 Sólido AAZ 13,6 3 6,8-27,2 1,2-20 +/+ +/+ 
11 Álcool cinamílico 104-54-1 Sólido AAZ 21 1 10,5-42 NC +/+ +/+ 
12 Imidazolidinilureia 39236-46-9 Sólido DMF 24 1 12-48 NC +/+ +/+ 13 Metacrilato de metilo 80-62-6 Líquido AAZ 90 1 45-100 NC +/+ +/+ 14 Clorobenzeno 108-90-7 Líquido AAZ 25 1 NA NA –/– –/ (*) 15 Isopropanol 67-63-0 Líquido AAZ 50 1 NA NA –/– –/+
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Número Produto químico (  1 ) N.  o CAS Estado Excipiente (  2 ) EC3 (%) (  3 ) N (  4 ) 0,5x – 2,0x EC3 Intervalo 
efetivo da 
EC3 Método 
LLNA versus 
ensaio em 
cobaias Método 
LLNA versus 
sensibi­
lização 
humana  
16 Ácido láctico 50-21-5 Líquido DMSO 25 1 NA NA –/– –/ (*) 
17 Salicilato de metilo 119-36-8 Líquido AAZ 20 9 NA NA –/– –/– 18 Ácido salicílico 69-72-7 Sólido AAZ 25 1 NA NA –/– –/– 
Substâncias facultativas para demonstração de melhor desempenho relativamente ao LLNA 
19 Laurilsulfato de sódio 151-21-3 Sólido DMF 8,1 5 4,05-16,2 1,5-17,1 +/– +/– 20 Dimetacrilato de etilenoglicol 97-90-5 Líquido MEK 28 1 14-56 NC +/– +/+ 
21 Xileno 1330-20-7 Líquido AAZ 95,8 1 47,9-100 NC +/ (**) +/– 
22 Cloreto de níquel 7718-54-9 Sólido DMSO 5 2 NA NA –/+ –/+
 
Abreviaturas: AAZ = mistura de acetona e azeite na proporção volúmica 4:1; N.  o CAS = Número de registo do  Chemical Abstracts Service ; DMF =  N,N-dimetilformamida; DMSO = sulfóxido dimetílico; DNCB = 2,4- 
-dinitroclorobenzeno; EC3 = estimativa da concentração necessária para gerar um índice de estimulação 3; Ensaio em cobaias = re sultado do ensaio em cobaias (método B6 ou  Test Guideline  406 da OCDE) (13); HCA = aldeído 
hexilcinâmico; LLNA = resultado do ensaio de gânglios linfáticos locais em ratos (método B.42 ou  Test Guideline  429 da OCDE) (2); MEK = metiletilcetona; NA = não aplicável, visto o índice de estimulação ser inferior a 3; 
NC = não calculado, visto os dados provirem de um único estudo; Excipiente = excipiente utilizado no ensaio. 
(*) Considerado não sensibilizante do ser humano, por não terem sido localizados resultados de ensaios clínicos de emplastros, por não figurar nas séries de alergénios para ensaios com emplastros e por não terem sido 
localizados casos registados de sensibilização de pessoas. 
(**) Não estão disponíveis dados na cobaia. 
( 1 ) Os produtos químicos devem ser preparados diariamente, a menos que haja dados de estabilidade que demonstrem ser aceitável o seu armazenamento. 
( 2 ) Dados os efeitos potenciais dos diversos excipientes no desempenho do método LLNA, deve utilizar-se o excipiente recomendado para cada produto químico de referência (24) (32). 
( 3 ) Valor médio quando se dispõe de mais do que um valor de EC3. No caso das substâncias com resultado negativo (índice de estimu lação < 3), indica-se a maior concentração ensaiada. 
( 4 ) Número de estudos pelo método LLNA de que provêm os dados. 
( 5 ) Disponível comercialmente sob a designação «Kathon CG» (n.  o CAS 55965-84-9), que é uma mistura 3:1 de CMI e de MI. A concentração de cada componente varia de 1,1 % a 1,25 % (CMI) e de 0,3  % a 0,45 % (MI). Os 
componentes inativos são sais de magnésio (21,5 % a 24 %) e nitrato de cobre (0,15 % a 0,17 %), sendo o restante constituído po r água (74 % a 77 %). O Kathon CG é fornecido pela Sigma-Aldrich e pela Rohm and Haas 
(agora Dow Chemical Corporation).
 III. Normas de fiabilidade e de exatidão  
7. A exatidão de um método LLNA similar ou modificado, avaliada com base 
na lista mínima prevista de 18 produtos químicos de referência, deve cor ­
responder à das normas de desempenho de métodos LLNA, ou suplantá-la. O novo método ou o método modificado deve permitir uma decisão de classificação («sim» ou «não») correta. O novo método ou o método mo ­
dificado pode, porém, não permitir classificar corretamente todos os produ ­
tos químicos de referência constantes da lista mínima. Se, por exemplo, a classificação atribuída a um dos sensibilizantes fracos for incorreta, poderá ponderar-se a demonstração de desempenho equivalente com base numa 
explicação da classificação incorreta e em dados suplementares adequados 
(por exemplo, resultados experimentais conducentes à classificação correta de outras substâncias, com propriedades físico-químicas e sensibilizantes similares às do produto químico de referência classificado incorretamente). 
Nessas circunstâncias, a validação de um método de ensaio LLNA similar 
ou modificado será apreciada caso a caso.
 
Reprodutibilidade intralaboratorial  
8. Para determinar a reprodutibilidade intralaboratorial de um método de en ­
saio LLNA novo ou modificado, deve utilizar-se uma substância sensibili ­
zante bem caracterizada pelo método LLNA. As normas de desempenho do método LLNA baseiam-se, para esse efeito, na variabilidade dos resultados de ensaios repetidos com aldeído hexilcinâmico. Para avaliar a fiabilidade 
intralaboratorial, devem obter-se estimativas de concentrações-limite (ECl) 
para o aldeído hexilcinâmico, em quatro ocasiões diferentes, com pelo menos uma semana de intervalo entre os ensaios. Considera-se a reprodu ­
tibilidade intralaboratorial aceitável se o laboratório for capaz de obter, em 
cada ensaio de aldeído hexilcinâmico, valores de ECl compreendidos entre 
5 % e 20 %, correspondentes ao intervalo definido pela multiplicação por 0,5 e 2,0 da EC3 média especificada para o aldeído hexilcinâmico (10 %) no método LLNA (ver o quadro 1).
 
Reprodutibilidade interlaboratorial  
9. Para determinar a reprodutibilidade interlaboratorial de um método de en ­
saio LLNA novo ou modificado, devem utilizar-se duas substâncias sensi ­
bilizantes bem caracterizadas pelo método LLNA. As normas de desempe ­
nho do método LLNA baseiam-se na variabilidade dos resultados de ensaios 
efetuados com aldeído hexilcinâmico e 2,4-dinitroclorobenzeno em labora ­
tórios diferentes. Devem determinar-se valores de ECl a partir de um único estudo efetuado independentemente em, pelo menos, três laboratórios dis ­
tintos. Para que fique demonstrada uma reprodutibilidade interlaboratorial 
aceitável, cada laboratório deve obter valores de ECl compreendidos entre 5 % e 20 %, para o aldeído hexilcinâmico, e entre 0,025 % e 0,1 %, para o 2,4-dinitroclorobenzeno, que correspondem ao intervalo definido, respetiva ­
mente, pela multiplicação por 0,5 e 2,0 das concentrações EC3 médias 
especificadas para o aldeído hexilcinâmico (10 %) e para o 2,4-dinitroclo ­
robenzeno (0,05 %) no método LLNA (ver o quadro 1).
 ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 620
Apêndice 2  
Definições  
Exatidão:  Grau de acordo entre os resultados do método de ensaio e os valores 
de referência aceites. Constitui uma medida do desempenho do método e um dos 
aspetos da adequação. Este termo e o termo «concordância» são muitas vezes 
utilizados indistintamente para indicar a proporção de resultados corretos de um método de ensaio (14).
 
Substância de referência:  Substância (sensibilizante ou não) utilizada como 
termo de comparação com a substância em estudo. Deve ter as seguintes pro ­
priedades: i) origem ou origens uniformes e fiáveis; ii) similaridade estrutural e funcional com a classe de substâncias em estudo; iii) características físico-quí ­
micas conhecidas; iv) disponibilidade de dados sobre os efeitos conhecidos; e v) 
potência conhecida situada na gama de reação pretendida.
 
Estimativa de concentração estabelecida como limite (ECl):  Concentração de 
uma substância em estudo que se estima necessária para gerar um índice de estimulação indicativo de resposta positiva.
 
Estimativa de concentração «índice 3» (EC3):  Concentração de uma substância 
em estudo que se estima necessária para gerar um índice de estimulação 3.  
Falso negativo:  Substância em estudo incorretamente considerada negativa ou 
inativa pelo método de ensaio, quando na realidade é positiva ou ativa.  
Falso positivo:  Substância em estudo incorretamente considerada positiva ou 
ativa pelo método de ensaio, quando na realidade é negativa ou inativa.  
Perigo:  Potencial de efeitos adversos na saúde ou no ambiente que só se mani ­
festam se o grau de exposição for suficiente.  
Reprodutibilidade interlaboratorial:  Medida do grau em que laboratórios quali ­
ficados diferentes, utilizando o mesmo protocolo para ensaiar a mesma substância 
em estudo, conseguem obter resultados qualitativa e quantitativamente similares. 
Determina-se durante os processos de pré-validação e de validação. Indica em que medida um ensaio pode ser transferido com êxito para outro laboratório e também é designada por «reprodutibilidade entre laboratórios» (14).
 
Reprodutibilidade intralaboratorial:  Medida do grau em que pessoal qualificado 
do mesmo laboratório nele consegue repetir resultados com êxito, em momentos diferentes, utilizando o mesmo protocolo. Também se designa por «reprodutibi ­
lidade no laboratório» (14).
 
Ensaio «me-too»:  Expressão coloquial em inglês que designa um método de 
ensaio estrutural e funcionalmente similar a um método de referência validado 
e aceite. Um método com estas características é candidato a validação por simi ­
litude. O termo é sinónimo de «método de ensaio similar» (14).  
Ponto aberrante:  Observação que difere marcadamente dos outros valores de 
uma amostra aleatória de uma população.  
Normas de desempenho:  Normas associadas a um método de ensaio validado 
com base nas quais pode ser avaliada a comparabilidade de um método de ensaio proposto que lhe seja funcional e mecanisticamente similar. Integram essas nor ­
mas: i) os componentes essenciais do método de ensaio, ii) uma lista mínima de 
produtos químicos de referência, selecionados entre os produtos químicos utili ­
zados para demonstrar a aceitabilidade do desempenho do método de ensaio validado, e iii) os níveis de exatidão e de fiabilidade, comparáveis aos obtidos com o método de ensaio validado, que o método de ensaio proposto deve 
evidenciar ao ser avaliado utilizando a lista mínima de produtos químicos de 
referência (14).
 
Método de ensaio sujeito a direitos de propriedade:  Método de ensaio cujas 
manufatura e distribuição são abrangidas por patentes, direitos de autor, marcas 
comerciais, etc.  ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 621
 
Garantia de qualidade:  Processo de gestão no âmbito do qual a observância das 
normas de ensaio, das exigências e dos procedimentos de conservação de registos 
laboratoriais, bem como a exatidão dos dados transferidos, são avaliadas por pessoas independentes das que efetuam os ensaios.
 
Produtos químicos de referência:  Produtos químicos selecionados para serem 
utilizados no processo de validação, cujas respostas aos sistemas de ensaio de 
referência  in vitro  ou in vivo , ou na espécie em causa, já são conhecidas. Estes 
produtos químicos devem ser representativos das classes de produtos químicos para as quais está prevista a utilização do método de ensaio e devem traduzir toda a gama de respostas (forte, fraca, negativa) que são de esperar dos produtos 
químicos aos quais o método se destina. Fases diferentes do processo de valida ­
ção, métodos de ensaio diferentes e utilizações diferentes do mesmo ensaio podem exigir séries diferentes de produtos químicos de referência (14).
 
Adequação:  Relação do ensaio com o efeito em causa; pertinência e utilidade do 
ensaio para o fim em vista. Traduz a medida em que o ensaio mede ou prevê 
corretamente o efeito biológico em causa. A adequação compreende a exatidão 
(concordância) do método de ensaio (14).  
Fiabilidade:  Medida em que, utilizando o mesmo protocolo, um método de 
ensaio pode ser continuadamente reproduzido no mesmo laboratório e em labo ­
ratórios diferentes. A fiabilidade é avaliada com base nos valores calculados das 
reprodutibilidades intralaboratorial e interlaboratorial (14).  
Sensibilização cutânea:  Processo imunológico que se manifesta quando um in ­
divíduo sensível é exposto, por via tópica, a um alergénio químico indutor de uma resposta imunológica cutânea passível de gerar sensibilização por contacto.
 
Índice de estimulação (IE):  Valor calculado para quantificar o potencial de 
sensibilização cutânea das substâncias estudadas; corresponde à razão entre a proliferação nos grupos tratados e a proliferação no grupo de controlo do ex ­
cipiente ensaiado em paralelo.
 
Substância em estudo (ou produto químico em estudo):  Qualquer substância ou 
mistura à qual seja aplicado o presente método de ensaio.  
Método de ensaio validado:  Método de ensaio relativamente ao qual foram 
concluídos estudos de validação com vista a determinar a sua adequação (in ­
cluída a exatidão) e fiabilidade para um determinado fim. É importante referir 
que um método de ensaio validado pode não ser suficientemente exato e fiável 
para ser considerado aceitável para o fim pretendido (14).  ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 622
 
B.43.  ESTUDO DE NEUROTOXICIDADE EM ROEDORES  
1. MÉTODO  
O presente método é equivalente ao «Test Guideline» TG 424 da 
OCDE (1997).  
O presente Método de Ensaio foi concebido para obter a informação 
necessária para confirmar ou conseguir uma melhor caracterização da 
potencial neurotoxicidade de substâncias químicas em animais adul ­
tos. Pode ser combinado com Métodos de Ensaio para estudos de toxicidade de dose repetida ou efectuado como um estudo indepen ­
dente. Recomenda-se a consulta do Documento de Orientação da 
OCDE sobre Estratégias e Métodos de Ensaios de Neurotoxicidade (1) para a concepção dos estudos baseados no presente Método de Ensaio. Este facto é particularmente importante no caso de se con ­
siderarem alterações das observações ou dos procedimentos de en ­
saio recomendados para uso rotineiro do presente método. O Docu ­
mento de Orientação foi preparado para facilitar a selecção de outros procedimentos de ensaio para uso em circunstâncias específicas.
 
A avaliação de neurotoxicidade em relação ao desenvolvimento não 
é abrangida pelo presente método.  
1.1. INTRODUÇÃO  
Na avaliação das características tóxicas das substâncias químicas, é 
importante considerar o potencial de efeitos neurotóxicos. O Método de Ensaio para toxicidade sistémica de dose repetida inclui observa ­
ções conducentes ao rastreio de neurotoxicidade potencial. O pre ­
sente Método de Ensaio pode ser utilizado na concepção de um 
estudo para obtenção de informação suplementar ou para confirma ­
ção dos efeitos observados nos estudos de toxicidade sistémica de dose repetida. No entanto, uma ponderação da neurotoxicidade po ­
tencial de certo tipo de substâncias químicas pode ser indicativa de 
esta ser avaliada mais apropriadamente utilizando o presente método, mesmo na ausência de indicações prévias de existência de neuroto ­
xicidade potencial provenientes de estudos de toxicidade sistémica de 
dose repetida. Tal ponderação pode incluir, por exemplo:
 
— observação dos sinais neurológicos ou lesões neuropatológicas 
em estudos de toxicidade diferentes dos estudos de toxicidade 
sistémica de dose repetida, ou  
— relação estrutural ou outra informação que estabeleça uma liga ­
ção com outros neurotóxicos conhecidos.  
Além disso, podem existir outras circunstâncias para as quais é 
apropriada a utilização do presente Método de Ensaio. Para informa ­
ção detalhada, consultar a referência (1).  
O presente método foi desenvolvido de modo a poder ser adaptado 
às necessidades específicas para a confirmação da neurotoxicidade histopatológica e comportamental de uma substância química, bem 
como a permitir uma caracterização e quantificação das respostas 
neurotóxicas.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 623
 
No passado, a neurotoxicidade foi identificada como neuropatia en ­
volvendo lesões neuropatológicas ou anomalias neurológicas, tais 
como convulsão, paralisia ou tremores. Apesar da neuropatia ser uma importante manifestação de neurotoxicidade, é actualmente claro que existem muitos outros sinais de toxicidade no sistema 
nervoso (por exemplo, perda de coordenação motora, deficiências 
sensoriais, disfunções da aprendizagem e da memória) que podem não se reflectir em neuropatia ou noutro tipo de estudos.
 
O presente Método de Ensaio de neurotoxicidade foi concebido para 
detectar os principais efeitos neurocomportamentais e neuropatológi ­
cos em roedores adultos. Apesar de os efeitos comportamentais, mesmo na ausência de alterações morfológicas, poderem reflectir 
um impacto nefasto no organismo, nem todas as alterações compor ­
tamentais são específicas do sistema nervoso. Assim, quaisquer al ­
terações observadas devem ser avaliadas em conjunto com os dados histopatológicos, hematológicos ou bioquímicos relacionados, bem 
como com dados provenientes de outros tipos de toxicidade sistémi ­
ca. O ensaio utilizado, no presente método, para fornecer uma ca ­
racterização e quantificação das respostas neurotóxicas inclui proce ­
dimentos histopatológicos e comportamentais específicos que podem 
ser confirmados por investigações electrofisiológicas e/ou bioquími ­
cas (1) (2) (3) (4).
 
Os neurotóxicos podem actuar sobre o sistema nervoso em vários 
alvos e por diversos mecanismos. Dado que não é possível utilizar 
uma única série de ensaios para avaliar completamente o potencial neurotóxico de todas as substâncias, pode ser necessário utilizar outros ensaios  in vivo  ou in vitro  específicos para o tipo de neuro ­
toxicidade observada ou prevista.
 
O presente Método de Ensaio, pode também ser utilizado em con ­
junto com as orientações estabelecidas pelo Documento de Orienta ­
ção da OCDE sobre Estratégias e Métodos de Ensaios de Neuroto ­
xicidade (1), para a concepção de estudos destinados a uma carac ­
terização suplementar ou um aumento da sensibilidade da quantifi ­
cação da curva dose-efeito, de modo a obter uma melhor estimativa 
do nível sem efeito adverso observável ou a confirmar a perigosidade 
conhecida ou prevista de uma substância química. Por exemplo, os estudos podem ser concebidos para identificar e avaliar o(s) meca ­
nismo(s) neurotóxico(s) ou para obter informação suplementar sobre 
dados previamente disponíveis a partir do uso de procedimentos de 
observação neurocomportamental e neuropatológica básicos. Tais es ­
tudos necessitam de dados não replicados que seriam obtidos pelo uso dos procedimentos padronizados recomendados no presente mé ­
todo, caso esses dados não se encontrem já disponíveis e não sejam 
considerados necessários para a interpretação dos resultados do es ­
tudo.
 
O presente estudo de neurotoxicidade, quer utilizado independente ­
mente, quer em conjunto com outros métodos, permite obter infor ­
mação para:  
— identificar se o sistema nervoso central é afectado permanente ou 
reversivelmente pela substância química ensaiada;  
— contribuir para a caracterização das alterações do sistema nervoso 
central associadas à exposição à substância química e para a 
compreensão do mecanismo subjacente;  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 624
 
— determinar as curvas dose-efeito e tempo-efeito, de modo a obter 
uma estimativa do nível sem efeito adverso observável (que pode 
ser utilizado para estabelecer critérios de segurança para a subs ­
tância química).  
O presente método utiliza a administração oral da substância de 
ensaio. Podem ser mais apropriadas outras vias de administração (por exemplo, dérmica ou por inalação), pelo que podem ser neces ­
sárias modificações dos procedimentos recomendados. A selecção 
ponderada, da via de administração, depende do perfil de exposição 
humana e da informação toxicológica e cinética disponível.
 
1.2. DEFINIÇÕES  
Efeito adverso:  qualquer alteração à normalidade relacionada com o 
tratamento que diminua a capacidade de um organismo para sobre ­
viver, reproduzir-se ou adaptar-se ao meio ambiente.  
Dose:  quantidade aplicada da substância de ensaio. O valor da dose 
é expresso em peso (g, mg) de substância de ensaio por unidade de 
peso de animal de ensaio (por exemplo, mg/kg) ou em concentrações 
dietéticas constantes (ppm).  
Dosagem:  termo geral que inclui a dose, a sua frequência e a dura ­
ção da aplicação da dose.  
Neurotoxicidade:  alteração adversa na estrutura ou função do sis ­
tema nervoso que resulta da exposição a um agente químico, bioló ­
gico ou físico.  
Neurotóxico : agente químico, biológico ou físico que apresenta po ­
tencial para causar neurotoxicidade.  
NSEAO:  abreviatura para nível sem efeito adverso observável; cor ­
responde à maior dose ou ao maior nível de exposição para o qual não se observam efeitos adversos relacionados com o tratamento.
 
1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
A substância química de ensaio é administrada por via oral ao longo 
de uma gama de doses a vários grupos de roedores de laboratório. 
São normalmente necessárias doses repetidas e o regime de dosagem 
pode ser de 28 dias, subcrónico (90 dias) ou crónico (1 ano ou mais). Os procedimentos estabelecidos no presente Método de Ensaio po ­
dem também ser usados para um estudo de neurotoxicidade aguda. 
Os animais são ensaiados de modo a permitir a detecção ou a ca ­
racterização de anomalias comportamentais e/ou neurológicas. Du ­
rante cada período de observação é avaliada uma gama de compor ­
tamentos que podem ser afectados por neurotóxicos. No final do 
ensaio, um subconjunto de animais de cada sexo e de cada grupo é submetido a perfusão  in situ  e são preparadas e examinadas sec ­
ções do cérebro, medula espinal e nervos periféricos.
 
No caso do estudo ser efectuado independentemente para rastreio de 
neurotoxicidade ou caracterização dos efeitos neurotóxicos, os ani ­
mais de cada grupo que não são utilizados para perfusão e histopa ­
tologia subsequente (consultar tabela 1) podem ser utilizados em 
procedimentos neurocomportamentais, neuropatológicos, neuroquí ­
micos e electrofisiológicos específicos que podem complementar os dados obtidos nos exames padronizados necessários ao presente mé ­
todo (1). Estes procedimentos suplementares podem ser particular ­
mente úteis nos casos em que as observações empíricas ou os efeitos previstos revelam um tipo ou alvo específicos de neurotoxicidade de determinado agente químico. Alternativamente, os restantes animais 
podem ser utilizados em avaliações, tais como as necessárias aos 
Métodos de Ensaio para estudos de dose repetida em roedores.
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No caso de se combinarem os procedimentos do presente Método de 
Ensaio, com os de outros Métodos de Ensaio, é necessário um 
número suficiente de animais para satisfazer as necessidades de ob ­
servações de ambos os estudos.  
1.4. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.4.1.  Selecção de espécies animais  
A espécie preferida de roedores para ensaio é o rato, mas, caso seja 
apresentada uma justificação, podem ser utilizadas outras espécies de roedores. Devem ser utilizadas estirpes laboratoriais de uso corrente e animais adultos, jovens e saudáveis. As fêmeas devem ser nulípa ­
ras e não devem estar grávidas. A aplicação da dose deve começar o 
mais rapidamente possível após o desmame, preferencialmente com animais que não tenham completado ainda seis semanas e sempre com animais com menos de nove semanas. No entanto, nos casos em 
que o estudo é combinado com outros estudos, pode ser necessário 
ajustar este requisito de idade. No início do estudo a diferença de peso entre os animais deverá ser mínima, não podendo ultrapassar 20 % do peso médio de cada sexo. No caso de se efectuar um estudo 
de dose repetida de curta duração, como estudo preliminar do estudo 
de longo prazo, os animais utilizados em ambos os estudos devem ser da mesma estirpe e da mesma proveniência.
 
1.4.2.  Condições de alojamento e alimentação  
A temperatura do compartimento experimental dos animais deve ser 
de 22  o C (± 3  o C). A humidade relativa deverá ser 50 %-60 %, 
embora sejam aceitáveis valores entre um mínimo de 30 % e um 
máximo que, de preferência, não deverá exceder 70 %, salvo durante 
os períodos de limpeza do compartimento. A iluminação deve ser artificial, com sequências de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. Os ruídos intensos intermitentes devem ser minimizados. A alimen ­
tação pode basear-se em dietas de laboratório convencionais, com 
fornecimento ilimitado de água para beber. Quando a substância de ensaio for administrada pela alimentação, a escolha da dieta poderá ser condicionada pela necessidade de assegurar a dosagem adequada. 
Os animais podem ser alojados individualmente ou em pequenos 
grupos do mesmo sexo.
 
1.4.3.  Preparação dos animais  
Os animais jovens e saudáveis são distribuídos aleatoriamente pelos 
grupos de tratamento e de controlo. As gaiolas devem ser dispostas 
de forma a minimizar possíveis efeitos derivados do seu posiciona ­
mento. Os animais são marcados de modo a permitir uma identifi ­
cação individualizada e mantidos nas suas gaiolas durante, pelo me ­
nos, cinco dias antes do início da administração das doses, de modo 
a permitir que se aclimatem às condições laboratoriais.  
1.4.4.  Via de administração e preparação das doses  
O presente Método de Ensaio aborda especificamente a administra ­
ção oral da substância de ensaio. A forma de administração pode ser 
por sonda esofágica, através da alimentação ou da água de beber ou por cápsulas. Podem ser mais apropriadas outras vias de adminis ­
tração (por exemplo, dérmica ou por inalação), pelo que podem ser 
necessárias modificações dos procedimentos recomendados. A selec ­
ção ponderada da via de administração depende do perfil de expo ­
sição humana e da informação toxicológica e cinética disponível. Devem ser apresentadas uma justificação para a selecção da via de 
administração, bem como as modificações dos procedimentos do 
Método de Ensaio daí resultantes.
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Se for necessário, a substância de ensaio pode ser dissolvida ou 
suspensa num excipiente apropriado. Recomenda-se que, sempre 
que possível, seja considerada em primeiro lugar a utilização de uma solução/suspensão aquosa; caso tal não seja viável, pode con ­
siderar-se o uso de uma solução/suspensão em óleo (por exemplo, 
óleo de milho); em último caso, poderá eventualmente recorrer-se ao 
uso de soluções/suspensões noutros excipientes. Devem conhecer-se as características tóxicas dos excipientes. Deverão ser tomadas em consideração as seguintes características do excipiente: efeitos na 
absorção, distribuição, metabolismo ou retenção da substância de 
ensaio, que possam modificar as suas características tóxicas e efeitos no consumo de alimentos, na ingestão de água ou no estado nutri ­
cional dos animais.
 
1.5. PROCEDIMENTOS  
1.5.1.  Número e sexo dos animais  
No caso de o estudo ser efectuado independentemente, devem ser 
utilizados pelo menos 20 animais (10 fêmeas e 10 machos) em cada grupo de dose e de controlo para a avaliação das observações clínicas e funcionais detalhadas. Pelo menos cinco machos e cinco fêmeas, se ­
leccionados dos grupos de 10 machos e 10 fêmeas, devem ser sujeitos a 
perfusão e utilizados para neuro-histopatologia detalhada no final do estudo. Nos casos em que apenas é observado um número limitado de animais, num determinado grupo de dose, para detecção de efeitos 
neurotóxicos, deve considerar-se a inclusão destes animais no grupo 
seleccionado para perfusão. No caso de o estudo ser efectuado em conjunto com um estudo de toxicidade de dose repetida, deve ser utilizado um número de animais adequado de modo a cumprir os 
objectivos de ambos os estudos. Na tabela 1 apresentam-se os números 
mínimos de animais por grupo para vários estudos combinados. No caso de se planearem grupos de mortes intermédias ou de recupe ­
ração para observação da reversibilidade, persistência ou ocorrência 
retardada de efeitos tóxicos pós-tratamento ou quando são consideradas 
observações suplementares, o número de animais deve ser aumentado de modo a assegurar que se encontra disponível o número de animais necessário para observação e histopatologia.
 
1.5.2.  Grupos de ensaio e de controlo  
Em geral devem ser utilizados pelo menos três grupos de dose e um 
grupo de controlo, mas se pela avaliação de outros dados não forem previstos quaisquer efeitos a uma dose repetida de 1 000 mg/kg de peso corporal/dia pode ser efectuado um teste-limite. Caso não se 
encontrem disponíveis dados adequados, pode ser efectuado um es ­
tudo preliminar de avaliação da gama, de modo a permitir a deter ­
minação das doses a utilizar. Os animais do grupo de controlo de ­
vem ser tratados da mesma maneira que os animais dos grupos de 
ensaio, com excepção do tratamento com a substância de ensaio. 
Caso seja utilizado um excipiente, o grupo de controlo deverá rece ­
ber o volume máximo de excipiente utilizado no ensaio.
 
1.5.3.  Teste de fiabilidade  
O laboratório que efectua o estudo deve apresentar dados comprovati ­
vos da sua capacidade para efectuar o estudo e relativos à sensibilidade 
dos procedimentos utilizados. Tais dados devem provar a capacidade de detectar e quantificar, como apropriadas, alterações nos diferentes critérios específicos recomendados para observação, tais como sinais 
autonómicos, reactividade sensorial, força de preensão dos membros e 
actividade motora. Podem ser consultadas as referências 2 a 9 para informações sobre substâncias químicas que provocam diferentes res ­
postas neurotóxicas e que podem ser utilizadas como controlos positi ­
vos. Podem ser utilizados dados históricos desde que os procedimentos 
experimentais não sejam alterados. Recomenda-se uma actualização periódica dos dados históricos. Caso o laboratório executante modifi ­
que alguns elementos essenciais da execução do ensaio ou procedi ­
mentos, devem obter-se novos dados comprovativos de que a sensibi ­
lidade dos procedimentos não foi alterada.
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1.5.4.  Selecção da dose  
A escolha dos níveis de dose deverá tomar em consideração todos os 
dados de toxicidade e cinética existentes para a substância de ensaio ou as substâncias relacionadas. Deve ser seleccionado o nível de 
dose mais elevado que induza efeitos neurotóxicos ou efeitos tóxicos 
sistémicos evidentes. Deve seleccionar-se uma sequência descen ­
dente de níveis de dose que permita detectar qualquer resposta rela ­
cionada com a dose e determinar o nível sem efeito adverso obser ­
vável (NSEAO) ao nível de dose mais baixo. Em princípio, os níveis 
de dose devem ser estabelecidos de modo a permitir distinguir entre os efeitos tóxicos primários no sistema nervoso e os efeitos relacio ­
nados com toxicidade sistémica. Em muitos casos, a melhor forma 
de estabelecer estas sequências consiste no espaçamento das doses em dois a três intervalos. A adição de um quarto grupo de ensaio é muitas vezes preferível ao uso de intervalos muito grandes entre as 
dosagens (ou seja, com um factor superior a 10). Nos casos em que 
existe uma estimativa razoável da exposição humana, esta deve tam ­
bém ser tomada em consideração.
 
1.5.5.  Teste-limite  
Se um ensaio com um nível de dose oral de pelo menos 1 000 mg/kg de 
peso corporal/dia, realizado de acordo com os procedimentos descritos neste estudo, não provocar efeitos neurotóxicos observáveis e se, além disso, os dados existentes sobre compostos estruturalmente relaciona ­
dos com a substância de ensaio não sugerirem a possível ocorrência de 
toxicidade, poderá considerar-se desnecessário realizar um ensaio com ­
pleto com três níveis de dose. Nos casos em que se preveja exposição humana poderá ser necessário aumentar o nível de dose oral no ensaio- 
-limite. Quando se usam outras formas de administração, como inalação 
ou aplicação cutânea, as propriedades físico-químicas da substância de ensaio são muitas vezes indicativas e limitativas do nível máximo de exposição praticável. Para a execução do estudo oral agudo, a dose para 
o teste-limite deve ser, no mínimo, de 2 000 mg/kg.
 
1.5.6.  Administração de doses  
A aplicação da dose da substância de ensaio nos animais é efectuada 
diariamente, sete dias por semana, durante um período de pelo me ­
nos 28 dias. O uso de um período de dosagem de cinco dias ou 
inferior deve ser justificado. A administração por sonda esofágica deve ser feita, de preferência, numa toma única, usando um tubo estomacal ou uma cânula de intubação apropriada. O volume má ­
ximo de líquido que pode ser administrado de cada vez depende do 
tamanho do animal de ensaio. O volume não deve exceder 1 ml/100 g de peso corporal. Para soluções aquosas, contudo, pode ser conside ­
rada a dose de 2 ml/100 g de peso corporal. Deve minimizar-se a 
variabilidade do volume de ensaio efectuando ajustes nas concen ­
trações, de forma a assegurar a constância do volume em todos os níveis de dose; exceptuam-se os casos em que se utilizam substân ­
cias irritantes ou corrosivas, que normalmente exercem efeitos exa ­
cerbados quando aplicadas em concentrações mais elevadas.
 
É importante assegurar que as quantidades da substância de ensaio 
administradas através da alimentação ou da água de beber não interfe ­
rem nas exigências normais de nutrição ou de consumo de água. 
Quando a substância de ensaio for incorporada na alimentação pode utilizar-se uma concentração alimentar constante (ppm) ou, alternati ­
vamente, um nível de dose constante em relação ao peso corporal dos 
animais; deve especificar-se o método escolhido para o ensaio. No caso 
de uma substância administrada por sonda esofágica, a dose deve ser administrada todos os dias à mesma hora, devendo ser ajustada pelo menos uma vez por semana a fim de se manter uma dose constante em 
relação ao peso corporal do animal. No caso de se efectuar um estudo 
de dose repetida, como estudo preliminar de um estudo de longo prazo, deve utilizar-se uma dieta semelhante em ambos os estudos. Nos estu ­
dos de toxicidade aguda, se não for possível a administração de uma 
toma única, a dose pode ser administrada em fracções menores ao 
longo de um período não superior a 24 horas.
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1.6. OBSERVAÇÕES  
1.6.1.  Frequência das observações e ensaios  
Nos estudos de dose repetida, o período de observação deve abran ­
ger o período de dosagem. Nos estudos de toxicidade aguda deve ser observado um período de 14 dias após o tratamento. As observações devem também abranger este período para os animais em grupos- 
-satélite que foram mantidos sem exposição durante o período após o 
tratamento.
 
As observações devem ser efectuadas com uma frequência suficiente 
para maximizar a probabilidade de detecção de qualquer anomalia comportamental e/ou neurológica. As observações devem ser, prefe ­
rencialmente, efectuadas à mesma hora, todos os dias, tendo em 
conta o período de pico previsto de efeitos após aplicação da dose. 
Na tabela 2 apresenta-se resumida a frequência das observações clínicas, bem como dos ensaios funcionais. No caso de existirem dados cinéticos ou outros dados obtidos em estudos prévios indica ­
tivos da necessidade de se utilizarem diferentes momentos de obser ­
vação, ensaios ou períodos de observação posteriores, deve adoptar- -se um calendário alternativo de modo a obter o máximo de infor ­
mação. Deve apresentar-se uma justificação para as alterações intro ­
duzidas no calendário.
 
1.6.1.1.  Observações do estado de saúde geral e da mortalidade/morbilidade  
Todos os animais devem ser observados cuidadosamente, pelo me ­
nos uma vez por dia, para avaliar o seu estado de saúde geral, bem 
como, pelo menos duas vezes por dia, para avaliar a mortalidade e 
morbilidade.  
1.6.1.2.  Observações clínicas pormenorizadas  
Devem ser efectuadas observações clínicas pormenorizadas em todos 
os animais seleccionados para este fim (consultar a tabela 1), uma 
vez antes da primeira exposição (de modo a permitir a comparação entre os diferentes animais) e, posteriormente, a diferentes intervalos, consoante a duração do estudo (consultar a tabela 2). Devem ser 
também efectuadas observações clínicas pormenorizadas nos gru ­
pos-satélite de recuperação no final do período de recuperação. As observações clínicas pormenorizadas devem ser efectuadas no exte ­
rior do compartimento experimental, numa arena-padrão. Devem ser 
registadas cuidadosamente utilizando sistemas de pontuação que in ­
cluam escalas de critérios ou de pontuação para cada medição das observações. Os critérios ou escalas utilizados devem ser explicita ­
mente definidos pelo laboratório de ensaio. Deve assegurar-se que as 
variações das condições de ensaio são mínimas (não sistematica ­
mente relacionadas com o tratamento) e que as observações são efectuadas por pessoal especializado sem conhecimento do trata ­
mento efectuado.
 
Recomenda-se que as observações sejam efectuadas de um modo 
estruturado, em que se aplicam sistematicamente critérios bem defi ­
nidos (incluindo a definição de «gama» normal) a cada animal, em 
cada observação. A «gama normal» deve ser apropriadamente docu ­
mentada. Devem ser registados todos os sinais observados. Sempre que possível, deve também ser registada a intensidade dos sinais 
observados. As observações clínicas devem incluir, entre outros as ­
pectos, alterações na pele, pêlo, olhos, membranas mucosas, ocor ­
rência de secreções e excreções e actividade autónoma (por exemplo, lacrimação, erecção pilosa, tamanho da pupila, padrão respiratório 
anormal e/ou respiração pela boca, quaisquer sinais pouco usuais 
de urina ou defecação e urina descorada).
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Devem ser registadas quaisquer respostas pouco usuais relativas à 
posição corporal, nível de actividade (por exemplo, maior ou menor 
exploração da arena-padrão) e coordenação dos movimentos. Tam ­
bém devem ser registadas alterações na marcha (por exemplo, mar ­
cha bamboleante, ataxia), postura (por exemplo, dorso arqueado) e 
reactividade ao manuseamento, colocação ou outros estímulos am ­
bientais, bem como a presença de movimentos clónicos ou tónicos, convulsões ou tremores, estereótipos (por exemplo, higiene excessi ­
va, movimentos de cabeça pouco usuais, locomoção em círculos 
repetitiva) ou comportamento anómalo (por exemplo, morder ou 
lamber excessivamente, automutilação, andar para trás, vocalização) ou agressão.
 
1.6.1.3.  Ensaios funcionais  
Tal como para o caso das observações clínicas pormenorizadas, 
devem ser efectuados ensaios funcionais uma vez antes da exposição 
e frequentemente após a exposição nos animais seleccionados para este fim (consultar a tabela 1). A frequência dos ensaios funcionais depende também da duração do estudo (consultar a tabela 2). Além 
dos períodos de observação, estabelecidos na tabela 2, as observa ­
ções funcionais dos grupos-satélite de recuperação devem também ser efectuadas o mais próximo possível da morte terminal. Os en ­
saios funcionais devem incluir a reactividade sensorial a estímulos de 
várias tipos [por exemplo, estímulos auditivos, visuais e propriocep ­
tivos (5) (6) (7)], a avaliação da força de preensão dos membros (8) e a avaliação da actividade motora (9). A actividade motora deve ser medida com um dispositivo automático capaz de detectar tanto au ­
mentos como diminuições de actividade. Caso seja utilizado outro 
sistema definido, este deve ser quantitativo e a sua sensibilidade e fiabilidade devem ser comprovadas. Cada dispositivo deve ser en ­
saiado para assegurar a fiabilidade ao longo do tempo e a consis ­
tência entre os diferentes dispositivos. Nas respectivas referências 
apresenta-se informação detalhada sobre os procedimentos a seguir. Caso não existam quaisquer dados (por exemplo, relações estrutura- -actividade, dados epidemiológicos, outros estudos toxicológicos) in ­
dicativos dos potenciais efeitos neurológicos, deve ser considerada a 
inclusão de ensaios mais especializados de função sensorial e motora ou de aprendizagem e memória de modo a que estes possíveis efeitos sejam examinados mais pormenorizadamente. Na referência (1) apre ­
sentam-se informações adicionais sobre os ensaios especializados e 
sua utilização.
 
Excepcionalmente, os animais que apresentem sinais de toxicidade 
numa extensão que afecte significativamente o ensaio funcional po ­
dem ser excluídos deste ensaio. Deve ser apresentada uma justifica ­
ção para a exclusão de animais do ensaio funcional.  
1.6.2.  Peso corporal e consumo de alimento/água  
Para estudos com duração até 90 dias, todos os animais devem ser 
pesados, pelo menos, uma vez por semana, e devem ser feitas me ­
dições do consumo de alimentos (consumo de água, caso a subs ­
tância de ensaio seja administrada por este meio) pelo menos sema ­
nalmente. Para estudos de longo prazo, todos os animais devem ser pesados pelo menos uma vez por semana durante as 13 primeiras semanas e seguidamente pelo menos de 4 em 4 semanas. Devem ser 
feitas medições do consumo de alimentos (consumo de água, caso a 
substância de ensaio seja administrada por este meio), pelo menos semanalmente, nas primeiras 13 semanas, e seguidamente com um intervalo de cerca de três meses, excepto se o estado de saúde ou as 
variações de peso corporal indicarem que se deve fazer com outra 
periodicidade.
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1.6.3.  Oftalmologia  
Para estudos de duração superior a 28 dias deve ser efectuado um 
exame oftalmológico, utilizando um oftalmoscópio ou um instru ­
mento equivalente adequado, antes da administração da substância 
de ensaio e no final do estudo. Preferencialmente este exame deve 
ser feito a todos os animais ou, pelo menos, aos animais dos grupos de doses elevadas e dos grupos de controlo. Todos os animais devem ser examinados caso sejam detectadas alterações oculares ou caso os 
sintomas clínicos assim o indiquem. Para estudos de longo prazo, o 
exame oftalmológico deve também ser efectuado no final de 13 semanas. Não é necessário efectuar os exames oftalmológicos se 
existirem dados disponíveis de outros estudos com duração seme ­
lhante e com níveis de dose semelhantes.
 
1.6.4.  Hemograma e química clínica  
Se o estudo de neurotoxicidade for efectuado em conjunto com um 
estudo de toxicidade sistémica de dose repetida, devem ser efectua ­
das análises clínicas (hemograma e química clínica), tal como esta ­
belecido no respectivo método do estudo de toxicidade sistémica. A 
recolha das amostras deve ser efectuada de modo a minimizar quais ­
quer potenciais efeitos no comportamento neuronal.  
1.6.5.  Histopatologia  
O exame neuropatológico deve ser concebido a fim de complementar 
e aprofundar as observações efectuadas durante a fase  in vivo  do 
estudo. Os tecidos provenientes de, pelo menos, cinco animais de cada grupo do mesmo sexo (consultar a tabela 1 e o parágrafo seguinte) devem ser fixados  in situ  por utilização de técnicas de 
perfusão e fixação comummente adoptadas (consultar a referência 
3, capítulo 5, e a referência 4, capítulo 50). Devem ser registadas quaisquer alterações importantes que sejam observadas. No caso de o estudo ser efectuado independentemente para rastreio de neurotoxi ­
cidade ou para caracterizar efeitos neurotóxicos, os animais que não 
sejam utilizados podem sê-lo em procedimentos neurocomportamen ­
tais (10) (11), neuropatológicos (10) (11) (12) (13), neuroquímicos (10) (11) (14) (15) e electrofisiológicos específicos que podem com ­
plementar os procedimentos e exames descritos ou podem ser acres ­
centados aos animais sujeitos a exame histopatológico. Estes proce ­
dimentos complementares têm um interesse especial quando as ob ­
servações empíricas ou os efeitos previstos são indicativos de um 
tipo ou alvo específicos para a neurotoxicidade (2) (3). Os animais 
não utilizados podem, alternativamente, sê-lo em avaliações patoló ­
gicas de rotina tal como descritas no método para estudos de dose repetida.
 
Deve ser utilizada uma técnica de coloração convencional, tal como 
hematoxilina ou eosina (H&E), em todas as amostras de tecidos, que 
devem ser fixadas em parafina e examinadas ao microscópio. Caso sejam observados sintomas de neuropatia periférica ou haja suspeitas nesse sentido, devem ser examinadas amostras de tecido nervoso 
periférico fixado em plástico. Os sintomas clínicos podem igual ­
mente sugerir o exame a locais adicionais ou a utilização de técnicas de coloração especiais. Podem obter-se orientações sobre os locais adicionais a examinar em (3) e (4). Pode também ser útil a utilização 
de técnicas de coloração especiais apropriadas à demonstração de 
alterações patológicas específicas (18).
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Os segmentos representativos dos sistemas nervosos central e peri ­
férico devem ser sujeitos a exame histopatológico (consultar a refe ­
rência 3, capítulo 5, e a referência 4, capítulo 50). As áreas a exa ­
minar devem normalmente incluir: o cérebro anterior, o centro do cérebro, incluindo uma secção através do hipocampo, o mesencéfalo, 
o cerebelo, a ponte de Varolio, a  medulla oblongata , o olho, in ­
cluindo o nervo óptico e a retina, a espinal medula ao nível das protuberâncias cervical e lombar, os gânglios da raiz dorsal, as fibras das raízes dorsal e ventral, o nervo ciático proximal, o nervo tibial 
proximal (no joelho) e as ramificações do nervo tibial nos gémeos. 
Devem ser examinadas as secções coronal, transversal e longitudinal da espinal medula e dos nervos periféricos. Deve ser dada especial atenção à vasculatura do sistema nervoso. Deve ser igualmente ana ­
lisada uma amostra de músculo esquelético, nomeadamente, gémeos. 
Deve ser prestada especial atenção aos locais com estrutura e padrão celular e fibroso bi SNC e SNP que se saiba serem particularmente vulneráveis a substâncias neurotóxicas.
 
Podem obter-se orientações sobre as alterações neuropatológicas que 
resultam tipicamente da exposição a substâncias tóxicas nas referên ­
cias (3) e (4). Recomenda-se um exame minucioso das amostras de 
tecidos, no qual são inicialmente comparados os cortes seccionais obtidos no grupo de dose mais elevada com os obtidos no grupo de controlo. Caso não sejam observadas quaisquer alterações neuropa ­
tológicas nas amostras provenientes desses grupos, não é necessário 
efectuar quaisquer análises subsequentes. Caso sejam observadas alterações neuropatológicas no grupo de dose mais elevada, as amos ­
tras de cada um dos tecidos potencialmente afectados provenientes 
dos grupos de doses intermédia e reduzida devem ser codificadas e 
analisadas sequencialmente.
 
Caso sejam detectados, no decorrer do exame qualitativo, quaisquer 
sintomas de alterações neuropatológicas, deve ser efectuado um se ­
gundo exame a todas as regiões do sistema nervoso que apresentem tais alterações. Cortes seccionais provenientes de todos os grupos de 
dosagem de cada uma das regiões potencialmente afectadas devem 
ser codificados e examinados ao acaso, sem conhecimento do res ­
pectivo código. Devem ser registadas a frequência e gravidade de cada lesão detectada. Após a classificação de todas as regiões em 
todos os grupos de dosagem, o código pode ser revelado e pode ser 
efectuada a análise estatística de modo a avaliar as relações dose- -efeito. Devem descrever-se exemplos para os diferentes graus de gravidade das várias lesões.
 
Os dados neuropatológicas devem ser avaliados no contexto das 
observações comportamentais e das medidas efectuadas, assim 
como de quaisquer outros dados provenientes de estudos de toxici ­
dade sistémica da substância de ensaio efectuados anterior ou simul ­
taneamente.  
2. DADOS  
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS  
Devem apresentar-se os dados individuais. Além disso, todos os 
dados devem ser resumidos em forma tabular, indicando, para cada grupo de ensaio ou de controlo, o número de animais no início do ensaio, o número de animais encontrados mortos durante o ensaio ou 
sacrificados a fim de evitar dor, o momento de todas as mortes 
(espontâneas ou provocadas), o número de animais apresentando sintomas de toxicidade, uma descrição dos sintomas de toxicidade observados (incluindo o momento do aparecimento, a duração, o tipo 
e a gravidade), o número de animais que apresentam lesões, in ­
cluindo o tipo e a gravidade de tais lesões.
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2.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS  
Os resultados do estudo devem ser avaliados em termos da incidên ­
cia, gravidade e correlação entre os efeitos observados aos níveis neurocomportamental e neuropatológico (assim como os efeitos neu ­
roquímicos e electrofisiológicos, caso sejam efectuados quaisquer 
exames complementares) e quaisquer outros efeitos adversos obser ­
vados. Sempre que possível, os resultados numéricos devem ser avaliados através de um método estatístico adequado e de utilização 
comum. Os métodos estatísticos devem ser determinados durante o 
planeamento do estudo.
 
3. RELATÓRIO  
RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deverá incluir as seguintes informações:  
Substância de ensaio:  
— natureza física (incluindo isómeros, pureza e propriedades físico- 
-químicas);  
— dados de identificação.  
Excipiente (se apropriado):  
— justificação para escolha do excipiente.  
Animais de ensaio:  
— espécie/estirpe usada;  
— número, idade e sexo dos animais;  
— proveniência, condições de alojamento, aclimatização, dieta, etc.;  
— peso individual dos animais no início do ensaio.  
Condições do ensaio:  
— informação pormenorizada sobre a formulação da substância de 
ensaio/preparação da dieta, concentração atingida, estabilidade e 
homogeneidade da preparação;  
— especificação das doses administradas, incluindo dados pormeno ­
rizados sobre o excipiente, volume e forma física do material 
administrado;  
— informação pormenorizada sobre a administração da substância 
de ensaio;  
— justificações para a escolha dos diferentes níveis de dosagem;  
— justificações para a escolha da via de administração e a duração 
do ensaio;  
— conversão da concentração da substância de ensaio na dieta/água 
de beber (ppm) para a dose real (mg/kg de peso corporal/dia), se 
aplicável;  
— informação pormenorizada sobre a qualidade dos alimentos e da 
água.  
Observações e procedimentos de ensaio:  
— informação pormenorizada sobre a atribuição dos animais de 
cada grupo aos diferentes subgrupos de perfusão;  
— informação pormenorizada sobre os sistemas de classificação, 
incluindo escalas de classificação e critérios para cada medida 
efectuada nas observações clínicas aprofundadas;  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 633
 
— informação pormenorizada sobre os ensaios funcionais da reac ­
ção sensorial aos estímulos de diferentes origens (por exemplo, 
auditivos, visuais e proprioceptivos); da avaliação da força de preensão dos membros e da actividade motora (incluindo infor ­
mação pormenorizada sobre dispositivos automáticos de detecção 
de actividade); e de outros procedimentos efectuados;
 
— informação pormenorizada sobre os exames oftalmológicos e, 
caso seja adequado, análises clínicas (hemograma e química clí ­
nica) com valores relevantes de linha de base;  
— informação pormenorizada sobre os procedimentos neurocompor ­
tamentais, neuropatológicos, neuroquímicos e electrofisiológicos específicos.
 
Resultados:  
— peso corporal/alterações do peso corporal, incluindo o peso cor ­
poral na altura da morte;  
— consumo de alimento e consumo de água, sempre que necessário;  
— dados sobre a resposta à toxicidade para cada sexo e nível de 
dosagem, incluindo sintomas de toxicidade ou mortalidade;  
— natureza, gravidade e duração (momento do aparecimento e de ­
senvolvimento subsequente) dos efeitos detectados em observa ­
ções clínicas aprofundadas (reversíveis ou não);  
— descrição pormenorizada de todos os resultados dos ensaios fun ­
cionais;  
— resultados da autópsia;  
— descrição pormenorizada de todos os dados neurocomportamen ­
tais, neuropatológicos e neuroquímicos ou electrofisiológicos, caso estejam disponíveis;
 
— dados de absorção e metabolismo, caso estejam disponíveis;  
— tratamento estatístico dos resultados, se apropriado.  
Análise dos resultados:  
— informação sobre a resposta à dosagem;  
— relação entre quaisquer outros efeitos tóxicos de modo a tirar 
conclusões sobre o potencial neurotóxico da substância química de ensaio;
 
— nível sem efeito adverso observável.  
Conclusões:  
— aconselha-se a inclusão de uma declaração específica sobre a 
neurotoxicidade global da substância química de ensaio.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) OECD Guidance Document on Neurotoxicity Testing Strate ­
gies and Test Methods. OECD, Paris (em preparação).  
(2) Test Guideline for a Developmental Neurotoxicity Study, OECD 
Guidelines for the Testing of Chemicals (em Teratology).  
(3) World Health Organisation (WHO) (1986) Environmental 
Health Criteria document 60: Principles and Methods for the 
Assessment of Neurotoxicity associated with Exposure to Che ­
micals.  
(4) Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H., (1980) Experimental and 
Clinical Neurotoxicology. Eds. Spencer, P.S. and Schaumburg, 
H.H. eds. Williams and Wilkins, Baltimore/London.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 634
 
(5) Tupper, D.E. and Wallace, R.B., (1980) Utility of the Neuro ­
logical Examination in Rats. Acta Neurobiol. Exp., 40, p. 999- 
-1003.  
(6) Gad, S.C., (1982) A Neuromuscular Screen for Use in Indus ­
trial Toxicology. J. Toxicol. Environ. Health, 9, p. 691-704.  
(7) Moser, V.C., McDaniel, K.M. and Phillips, P.M., (1991) Rat 
Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observatio ­
nal Battery: Baseline Values and Effects of amitraz. Toxic. Appl. Pharmacol., 108, p. 267-283.
 
(8) Meyer, O.A., Tilson, H.A., Byrd, W.C. and Riley, M.T., 
(1979) A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hind- limb Grip Strength of Rats and Mice. Neurobehav. To ­
xicol., 1, p. 233-236.
 
(9) Crofton, K.M., Haward, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reirer, 
L.W., Tilson, H.A. and MacPhail, R.C., (1991) Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments. Neurotoxicol. Teratol., 13, 
p. 599-609.
 
(10) Tilson, H.A., and Mitchell, C.L. eds., (1992) Neurotoxicology 
Target Organ Toxicology Series. Raven Press, New York.  
(11) Chang, L.W., ed., (1995) Principles of Neurotoxicology. Mar ­
cel Dekker, New York.  
(12) Broxup, B., (1991) Neuopathology as a screen for Neurotoxi ­
city Assessment. J. Amer. Coll. Toxicol., 10, p. 689-695.  
(13) Moser, V.C., Anthony, D.C., Sette, W.F. and MacPhail, R.C., 
(1992) Comparison of Subchronic Neurotoxicity of 2-Hydro ­
xyethyl Acrylate and Acrylamide in Rats. Fund. Appl.Toxicol., 18, p. 343-352.
 
(14) O'Callaghan, J.P., (1988) Neurotypic and Gliotypic Proteins as 
Biochemical Markers of Neurotoxicity. Eurotoxicol. Teratol., 10, p. 445-452.
 
(15) O'Callaghan J.P. and Miller, D.B., (1988) Acute Exposure of 
the Neonatal Rat to Triethyltin Results in Persistent Changes in 
Neurotypic and Gliotypic Proteins. J. Pharmacol. Exp. Ther., 244, p. 368-378.
 
(16) Fox. D.A., Lowndes, H.E. and Birkamper, G.G., (1982) Elec ­
trophysiological Techniques in Neurotoxicology. In: Nervous System Toxicology. Mitchell, C.L. ed. Raven Press, New York, p. 299-335.
 
(17) Johnson, B.L., (1980) Electrophysiological Methods in neuro ­
toxicity Testing. In: Experimental and Clinical Neurotoxicolo ­
gy. Spencer, P.S. and Schaumburg, H.H. eds., Williams and Wilkins Co., Baltimore/London, p. 726-742.
 
(18) Bancroft, J.D. and Steven A., (1990) Theory and Pratice of 
Histological Techniques. Chapter 17, Neuropathological Tech ­
niques. Lowe, James and Cox, Gordon eds. Churchill Livings ­
tone. ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 635
 
Tabela 1  
Número mínimo de animais necessários, em cada grupo, para se realizar o ensaio de neurotoxicidade de forma 
independente ou em conjunto com outros estudos  
MODO DE REALIZAÇÃO DO ESTUDO DE TOXICIDADE 
Estudo independente Em combinação com o 
estudo de 28 dias Em combinação com o 
estudo de 90 dias Em combinação com o 
estudo de toxicidade 
crónica  
Número total de animais 
por grupo 10 machos e 10 
fêmeas 10 machos e 10 
fêmeas 15 machos e 15 
fêmeas 25 machos e 25 fê ­
meas 
Número de animais esco ­
lhidos para ensaios funcio ­
nais, incluindo observações clínicas pormenorizadas 10 machos e 10 
fêmeas 10 machos e 10 
fêmeas 10 machos e 10 
fêmeas 10 machos e 10 fê ­
meas 
Número de animais esco ­
lhidos para perfusão  in situ  
e neuro-histopatologia 5 machos e 5 fê ­
meas 5 machos e 5 fê ­
meas 5 machos e 5 fê ­
meas 5 machos e 5 fêmeas 
Número de animais esco ­
lhidos para observações de toxicidade crónica, subcró ­
nica ou relativa à dose, 
análises clínicas (hemogra ­
ma, química clínica), histo ­
patologia, etc., tal como descrito nas respectivas  
Orientações  5 machos e 5 fê ­
meas 10 machos † e 10 
fêmeas † 20 machos † e 20 
fêmeas † 
Observações complementa ­
res, se apropriado 5 machos e 5 fê ­
meas
 
† Inclui cinco animais escolhidos para ensaios funcionais e observações clínicas pormenorizadas como parte integrante do estudo  de 
neurotoxicidade.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 636
 
Tabela 2  
Frequência das observações clínicas e dos ensaios funcionais  
Tipo de observações Duração do estudo 
Aguda 28 dias 90 dias Crónica  
Em todos os ani ­
mais Estado geral de 
saúde diária diária diária diária 
Mortalidade/ 
/morbilidade duas vezes ao 
dia duas vezes ao 
dia duas vezes ao 
dia duas vezes ao dia 
Nos animais esco ­
lhidos para as ob ­
servações funcio ­
nais Observações clí ­
nicas pormenori ­
zadas — antes do iní ­
cio do es ­
tudo 
— após 8 horas 
da adminis ­
tração da dose, no momento em 
que se es ­
pera uma resposta má ­
xima 
— nos dias 7 e 
14 após a administra ­
ção da dose — antes do iní ­
cio do es ­
tudo 
— uma vez por 
semana, daí 
em diante — antes do iní ­
cio do es ­
tudo 
— uma vez, 
durante a 
primeira ou segunda se ­
mana, após 
o início do 
ensaio 
— uma vez por 
mês, daí em 
diante — antes do iní ­
cio do estudo 
— uma vez de ­
corrido um 
mês após o 
início do en ­
saio 
— de três em 
três meses, 
daí em diante 
Ensaios funcio ­
nais — antes do iní ­
cio do es ­
tudo 
— após 8 horas 
da adminis ­
tração da 
dose, no momento em que se es ­
pera uma 
resposta má ­
xima 
— nos dias 7 e 
14 após a 
administra ­
ção da dose — antes do iní ­
cio do es ­
tudo 
— durante a 
quarta se­
mana de tra ­
tamento e tão próximo quanto pos ­
sível do final 
do período de ensaio — antes do iní ­
cio do es ­
tudo 
— uma vez, 
durante a 
primeira ou 
segunda se ­
mana, após o início do 
ensaio 
— uma vez por 
mês, daí em diante — antes do iní ­
cio do estudo 
— uma vez de ­
corrido um mês após o 
início do en ­
saio 
— de três em 
três meses, 
daí em diante
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 637
 
B.44.  ABSORÇÃO CUTÂNEA: MÉTODO  IN VIVO  
1. MÉTODO  
O presente método de ensaio é equivalente ao método OECD TG 
427 (2004).  
1.1. INTRODUÇÃO  
Embora a exposição a numerosas substâncias químicas envolva so ­
bretudo a pele, na maior parte dos estudos toxicológicos em animais 
de laboratório é utilizada a via de administração oral. O estudo de absorção percutânea  in vivo  a que se refere o presente método cons ­
titui o elo necessário para a extrapolação dos resultados de estudos 
orais para a avaliação da inocuidade em caso de exposição cutânea.
 
Para atingir a corrente sanguínea, uma substância tem que atravessar 
numerosas camadas celulares da pele. A camada limitante da velo ­
cidade de penetração é o estrato córneo, constituído por células 
mortas. A permeabilidade da pele depende da lipofilia da substância química e da espessura da camada externa da epiderme, e ainda de outros factores, como o peso molecular e a concentração da subs ­
tância. A pele dos ratos e dos coelhos é, em geral, mais permeável 
do que a do homem, ao passo que a permeabilidade da pele das cobaias e dos macacos se assemelha mais à da pele humana.
 
Os métodos de medição da absorção percutânea podem ser divididos 
em duas categorias:  in vivo  e in vitro.  O método  in vivo  permite 
obter informações fiáveis sobre a absorção cutânea em várias espé ­
cies de laboratório. Mais recentemente foram desenvolvidos métodos  
in vitro  baseados no transporte através de pele total ou de pele de 
clivagem, humana ou de animais, para um reservatório de fluido. O método  in vitro  encontra-se descrito num método de ensaio distinto 
(1). Na escolha do método mais apropriado para determinada situa ­
ção recomenda-se a consulta do documento de orientação da OCDE 
para a realização de ensaios de absorção cutânea (2), no qual é tratada em mais pormenor a utilidade dos métodos  in vivo  e in vitro.
 
O método  in vivo  aqui descrito permite determinar a penetração da 
substância ensaiada no compartimento sistémico através da pele. A técnica tem sido amplamente utilizada desde há muitos anos (3) (4) (5) (6) (7). Embora os estudos de absorção percutânea  in vitro  sejam 
muitas vezes adequados, pode haver situações em que só um estudo  
in vivo  permitirá obter os dados necessários.
 
As vantagens do método  in vivo  são a utilização de um sistema 
fisiológica e metabolicamente intacto, o uso da mesma espécie em 
muitos estudos de toxicidade e a possibilidade de adaptação para utilização com outras espécies. As desvantagens são a utilização de animais vivos, a necessidade de marcadores radioactivos para facili ­
tar a obtenção de resultados fiáveis, a dificuldade de determinação da 
fase inicial da absorção e as diferenças de permeabilidade cutânea entre a espécie mais utilizada (rato) e o homem. A pele dos animais é normalmente mais permeável, o que pode levar a sobrestimar a 
absorção percutânea no homem (6) (8) (9). As substâncias cáusticas 
ou corrosivas não devem ser ensaiadas em animais vivos.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 638
 
1.2. DEFINIÇÕES  
Dose não absorvida:  a que é removida da superfície cutânea após a 
exposição, por lavagem, ou que esteja eventualmente presente na cobertura não oclusiva, incluindo a que eventualmente se demonstre 
ter-se volatilizado da pele durante a exposição.
 
Dose absorvida ( in vivo ): inclui a que está presente na urina, nos 
resíduos de lavagem das gaiolas, nas fezes, no ar expirado (se tiver sido determinada), no sangue, nos tecidos (caso se proceda à sua 
colheita) e no resto da carcaça, uma vez retirada a pele do local de 
aplicação.
 
Dose absorvível:  a que permanece na pele, ou à superfície desta, 
após a lavagem.  
1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
A substância a ensaiar, de preferência marcada com um radioisótopo, 
é aplicada na pele tosquiada em dose(s) adequada(s) na forma de uma preparação representativa, tal como é normalmente utilizada. A 
preparação ensaiada é deixada em contacto com a pele durante um 
período determinado, coberta de forma adequada (não oclusiva, se ­
mioclusiva ou oclusiva) para evitar que seja ingerida. Terminado o 
tempo de exposição, a pele é descoberta e limpa com um agente de 
limpeza adequado, conservando-se para análise a cobertura e os materiais utilizados na limpeza e tornando a aplicar-se uma cobertura limpa. Antes, durante e após o período de exposição, os animais são 
alojados em gaiolas de metabolismo individuais, devendo as excre ­
ções e o ar expirado durante esse período ser recolhidos para análise. A recolha do ar expirado pode ser omitida se os dados existentes permitirem concluir que a formação de metabolito radioactivo volátil 
é reduzida ou nula. Em cada estudo, vários grupos de animais serão 
normalmente expostos à preparação ensaiada. Um dos grupos será sacrificado no final do período de exposição. Os restantes grupos serão sacrificados posteriormente, a intervalos predeterminados (2). 
No final do período de amostragem, os animais restantes são sacri ­
ficados, procedendo-se à colheita de sangue e remoção do local de aplicação, para análise, e à pesquisa de material não excretado na carcaça. Após análise das amostras por meios adequados é feita a 
estimativa do grau de absorção cutânea (6) (8) (9).
 
1.4. DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
1.4.1.  Escolha da espécie animal  
O rato é a espécie mais utilizada, mas podem igualmente usar-se 
estirpes glabras e espécies com taxas de absorção cutânea mais se ­
melhantes às do homem (3) (6) (7) (8) (9). Devem utilizar-se adultos 
saudáveis, todos do mesmo sexo (por defeito, machos), das estirpes 
correntemente utilizadas em laboratório. No início do estudo, a va ­
riação no peso dos animais não deve exceder ± 20 % do peso médio. Podem utilizar-se, por exemplo, ratos machos de 200 g a 250 g, 
sobretudo aqueles cujo peso se situe na metade superior deste inter ­
valo.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 639
 
1.4.2.  Número e sexo dos animais  
Deve utilizar-se um grupo de pelo menos quatro animais, todos do 
mesmo sexo, por cada preparação ensaiada e por cada um dos pontos terminais previstos. Cada grupo de animais será sacrificado após um 
intervalo diferente, por exemplo, no termo do período de exposição 
(geralmente, 6 ou 24 horas) e de subsequentes períodos equivalentes (48 e 72 horas, por exemplo). Caso existam dados comprovativos de diferenças substanciais entre machos e fêmeas, no que diz respeito à 
toxicidade cutânea, deve escolher-se o sexo mais sensível. Caso não 
existam tais dados, pode ser utilizado qualquer um dos sexos.
 
1.4.3.  Condições de alojamento e alimentação  
A temperatura do compartimento experimental dos animais deve ser 
de 22  o C (± 3  o C). A humidade relativa deverá ser de 50 %-60 %, 
embora sejam aceitáveis valores entre um mínimo de 30 % e um máximo que, preferivelmente, não deverá exceder 70 %, salvo du ­
rante os períodos de limpeza do compartimento. A iluminação deve 
ser artificial, com sequências de 12 horas de luz e 12 horas de 
escuridão. A alimentação, que deve ser fornecida sem restrições, pode basear-se em dietas de laboratório convencionais, com forneci ­
mento ilimitado de água para beber. Durante o estudo e, de prefe ­
rência, também durante a aclimatação, os animais serão alojados em 
gaiolas de metabolismo individuais. Uma vez que o derrame de alimentos e água pode comprometer os resultados do estudo, é con ­
veniente reduzir ao mínimo a probabilidade da sua ocorrência.
 
1.4.4.  Preparação dos animais  
Os animais são marcados de forma a poderem ser identificados 
individualmente e mantidos nas gaiolas pelo menos nos cinco dias anteriores ao início do estudo, para se aclimatarem às condições do 
laboratório.
 
Após o período de aclimatação, e cerca de 24 horas antes da admi ­
nistração, os animais serão tosquiados na região dos ombros e do 
dorso. Uma vez que as propriedades de permeação da pele lesada e 
da pele intacta são diferentes, deve tomar-se cuidado para não lesar a pele. Após a tosquia, e cerca de 24 horas antes de aplicar a subs ­
tância a ensaiar (ver ponto 1.4.7), a superfície da pele deve ser limpa 
com acetona, para retirar o sebo. Não é aconselhável lavar nova ­
mente com água e sabão, já que quaisquer resíduos de sabão poderão favorecer a absorção da substância ensaiada. A área deve ser sufi ­
ciente para permitir uma estimativa fiável da quantidade de subs ­
tância ensaiada que é absorvida por cm
 2 de pele — de preferência, 
10 cm  2 , pelo menos, o que é praticável em ratos com peso vivo entre 
200 e 250 g. Após a preparação, os animais voltam a ser colocados nas gaiolas de metabolismo.
 
1.4.5.  Substância a ensaiar  
A substância a ensaiar é a entidade de que se pretendem estudar as 
propriedades de penetração. De preferência, a substância a ensaiar deve ser marcada com um radioisótopo.
 
1.4.6.  Preparação a ensaiar  
A preparação com a substância a ensaiar (por exemplo, material 
puro, diluído ou formulado contendo a substância a ensaiar e que se aplica na pele) deve ser aquela a que poderão estar expostos o homem ou outras espécies potencialmente visadas, ou um subs ­
tituinte realista da mesma. Qualquer mudança em relação à prepara ­
ção tal como é utilizada deve ser justificada. Se for necessário, a substância a ensaiar pode ser dissolvida ou suspensa num excipiente apropriado. As características de absorção dos excipientes — excepto 
a água — e a sua eventual interacção com a substância ensaiada 
devem ser conhecidos.
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1.4.7.  Aplicação na pele  
Definir na superfície da pele um local de aplicação com uma área 
determinada. Aplicar em seguida nesse local, uniformemente, uma quantidade conhecida da preparação a ensaiar. Normalmente, a quan ­
tidade aplicada deve simular a exposição humana potencial, geral ­
mente 1-5 mg/cm
 2 para os sólidos e 10 μl/cm  2 para os líquidos. A 
utilização de outras quantidades deve ser justificada com base nas condições de utilização previstas, nos objectivos do estudo ou nas 
características físicas da preparação a ensaiar. Após a aplicação, o 
sítio tratado deve ser protegido, de forma a impedir que o animal se limpe. A figura 1 mostra um exemplo de dispositivo típico. O local 
de aplicação é normalmente protegido por uma cobertura não oclu ­
siva (gaze de nylon permeável, por exemplo). Contudo, para aplica ­
ções infinitas, a cobertura do local de aplicação deve ser oclusiva. Em caso de ensaio de substâncias semivoláteis é necessário, se a 
evaporação provocar uma diminuição inaceitável da taxa de recupe ­
ração da substância ensaiada (ver também o primeiro parágrafo do ponto 1.4.10), captar a substância evaporada num filtro de carvão que cubra o dispositivo de aplicação (ver figura 1). É importante que 
o dispositivo não danifique a pele, nem absorva a preparação en ­
saiada ou reaja com ela. Os animais são depois novamente colocados nas gaiolas de metabolismo individuais, para recolha das excreções.
 
1.4.8.  Duração da exposição e da amostragem  
A duração da exposição é o tempo que decorre entre a aplicação e a 
remoção da preparação ensaiada por lavagem da pele. O período de 
exposição utilizado (geralmente, 6 ou 24 horas) deve ser adequado à 
duração provável da exposição humana. Terminado o período de exposição, os animais são mantidos nas gaiolas de metabolismo até ao termo previsto do ensaio. Os animais devem ser observados 
regularmente durante toda a duração do estudo, para detecção de 
sinais de toxicidade ou de reacções anormais. No final do período de exposição, a pele tratada deve ser observada para detecção de sinais visíveis de irritação.
 
As gaiolas de metabolismo devem permitir a recolha individual da 
urina e das fezes durante todo o estudo. É também conveniente que 
possibilitem a recolha do dióxido de carbono e compostos voláteis marcados com
 14 C, que devem ser analisados caso sejam produzidos 
em quantidade (> 5 %). A urina, as fezes e os fluidos captados 
(dióxido de carbono e compostos de carbono voláteis marcados 
com  14 C, por exemplo) devem ser recolhidos individualmente em 
cada grupo, aquando de cada amostragem. Se os dados existentes permitirem concluir que a formação de metabolito radioactivo é 
reduzida ou nula podem ser utilizadas gaiolas abertas.
 
As excreções são recolhidas durante o período de exposição, até 24 
horas após o contacto inicial com a pele e, em seguida, diariamente até ao final da experiência. Embora três intervalos de recolha de excreções sejam normalmente suficientes, pode ser conveniente dis ­
por de pontos experimentais mais adequados, ou mais numerosos, 
atendendo à finalidade a que se destina a preparação ensaiada ou aos dados cinéticos existentes.
 
No final do período de exposição, o dispositivo de protecção de cada 
animal é retirado e conservado separadamente, para análise. Em 
todos os animais, a pele tratada deve ser lavada pelo menos três 
vezes com um agente de limpeza, utilizando zaragatoas apropriadas. Deve ter-se cuidado para evitar contaminar outras partes do corpo. O agente de limpeza deve ser representativo das práticas usuais de 
higiene — uma solução aquosa de sabão, por exemplo. Por fim, a 
pele deve ser enxugada. Todas as zaragatoas e resíduos da lavagem devem ser conservados para análise. Nos animais dos grupos corres ­
pondentes aos pontos experimentais mais tardios, o sítio tratado 
deve, antes do regresso às gaiolas individuais, tornar a ser protegido 
com uma cobertura limpa.
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1.4.9.  Procedimentos finais  
Em cada grupo, os animais devem ser sacrificados no momento 
previsto, procedendo-se à colheita de sangue para análise. A cober ­
tura de protecção deve ser retirada para análise. A pele do local de 
aplicação, bem como uma área semelhante de pele tosquiada não 
tratada, devem ser removidas de cada animal para serem analisadas separadamente. A pele do local de aplicação pode ser clivada, para separar o estrato córneo da epiderme subjacente, a fim de se obterem 
mais informações sobre a distribuição da substância em estudo. A 
determinação da evolução desta distribuição ao longo do tempo, após o período de exposição, deveria dar alguma indicação quanto ao 
destino da substância química em estudo eventualmente presente 
no estrato córneo. Para facilitar a clivagem da pele (após a lavagem final da pele e o sacrifício do animal), a cobertura de protecção é removida. A pele do local de aplicação, incluindo a coroa circular 
circundante, é excisada do rato e fixada com alfinetes numa placa. 
Aplicar uma fita adesiva sobre a pele, pressionando suavemente, e retirar a fita adesiva, que trará consigo parte do estrato córneo. Repetir o processo com novas fitas adesivas até ao momento em 
que, uma vez removido inteiramente o estrato córneo, a fita deixa 
de aderir à pele. Todas as fitas adesivas utilizadas para cada animal podem ser depositadas no mesmo recipiente, adicionando-se-lhes em seguida um digestor de tecidos para solubilização do estrato córneo. 
Os tecidos-alvo potenciais podem ser removidos para medições se ­
paradas, antes da análise do resto da carcaça para determinação da dose absorvida na carcaça. As carcaças dos animais devem ser con ­
servadas individualmente para análise. A análise do teor total será, 
normalmente, suficiente. Os órgãos-alvo podem ser retirados para 
serem analisados individualmente (se outros estudos assim o indica ­
rem). A urina presente na bexiga aquando do sacrifício programado deve ser adicionada à urina recolhida anteriormente. Após a recolha 
das excreções presentes nas gaiolas de metabolismo no momento do 
sacrifício programado, as gaiolas e os sistemas de captação devem ser lavados com um solvente adequado. O restante equipamento potencialmente contaminado deve também ser analisado.
 
1.4.10.  Análise  
Em todos os estudos, deve obter-se uma taxa de recuperação ade ­
quada (a média a obter será de 100 ± 10 % da radioactividade). Taxas de recuperação fora desse intervalo devem ser justificadas. A quantidade da dose administrada presente em cada amostra deve 
ser determinada por processos devidamente validados.
 
A análise estatística deve incluir a determinação da variância para as 
repetições de cada aplicação.  
2. DADOS  
Em relação a cada animal, e em cada amostragem para pesquisa da 
substância ensaiada ou dos seus metabolitos, devem ser feitas as 
seguintes determinações (além de serem apresentados individualmen ­
te, os dados devem também ser agrupados por tempos de amostra ­
gem e apresentados sob forma de médias):  
— quantidade associada aos dispositivos de protecção,  
— quantidade que pode ser retirada da pele,  
— quantidade presente na pele que não pode ser removida por 
lavagem,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 642
 
— quantidade presente no sangue colhido,  
— quantidade presente nas excreções e no ar expirado (se for caso 
disso),  
— quantidade restante na carcaça e em órgãos eventualmente reti ­
rados para serem analisados separadamente.  
Com base na quantidade de substância ensaiada e/ou dos seus me ­
tabolitos nas excreções, no ar expirado, no sangue e na carcaça 
poder-se-á determinar a quantidade total absorvida em cada um dos pontos experimentais. Pode também ser calculada a quantidade de substância ensaiada que foi absorvida por cm
 2 de pele exposta, ao 
longo do período de exposição.  
3. RELATÓRIOS  
3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deve incluir os requisitos especificados no 
protocolo, nomeadamente a justificação da escolha do sistema expe ­
rimental utilizado, devendo conter os seguintes elementos:  
Substância ensaiada:  
— dados relativos à identificação [número CAS, se existir; prove ­
niência; pureza (pureza radioquímica); impurezas conhecidas; nú ­
mero do lote; etc.],  
— natureza física, propriedades físico-químicas (por exemplo, pH, 
volatilidade, solubilidade, estabilidade, peso molecular e log P  oa ). 
Preparação ensaiada:  
— formulação e justificação da utilização,  
— informações sobre a preparação ensaiada, quantidade aplicada, 
concentração atingida, excipiente, estabilidade e homogeneidade.  
Animais experimentais:  
— espécie/estirpe usada;  
— número, idade e sexo dos animais;  
— proveniência, condições de alojamento, dieta, etc.,  
— peso de cada animal no início do ensaio.  
Condições experimentais:  
— informações relativas à administração da preparação ensaiada 
(local de aplicação, métodos de determinação, oclusão ou não, 
volume, extracção, detecção),  
— informações sobre a qualidade dos alimentos e da água.  
Resultados:  
— quaisquer sinais de toxicidade,  
— quadro dos valores de absorção (expressos em taxa, quantidade 
ou percentagem),  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 643
 
— taxas de recuperação globais do ensaio,  
— interpretação dos resultados, comparação com dados eventual ­
mente existentes sobre a absorção percutânea do composto en ­
saiado.  
Discussão dos resultados.  
Conclusões.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) Método de ensaio B.45. Absorção cutânea: método  in vitro.  
(2) OECD (2002). Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris.  
(3) ECETOC, (1993) Percutaneous Absorption. European Centre 
for Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals, Monograph 
No 20.  
(4) Zendzian, R.P., (1989) Skin Penetration Method suggested for 
Environmental Protection Agency Requirements.  J. Am. Coll. 
Toxicol . 8(5), p. 829-835.  
(5) Kemppainen, B.W., Reifenrath WG (1990) Methods for skin 
absorption. CRC Press Boca Raton, FL, USA.  
(6) EPA, (1992) Dermal Exposure Assessment: Principles and Ap ­
plications. Exposure Assessment Group, Office of Health and Environmental Assessment.
 
(7) EPA, (1998) Health Effects Test Guidelines, OPPTS 870-7600, 
Dermal Penetration. Office of Prevention, Pedsticides and To ­
xic Substances.  
(8) Bronaugh, R.L., Wester, R.C., Bucks, D., Maibach H.I. and 
Sarason, R., (1990)  In vivo  percutaneous absorption of fra ­
grance ingredients in reshus monkeys and humans.  Fd. Chem. 
Toxic . 28, p. 369-373.  
(9) Feldman, R.J. and Maibach, H.I., (1970) Absorption of some 
organic compounds through the skin in man.  J. Invest Derma ­
tol. 54, p. 399-404.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 644
 
Figura 1  
Exemplo de esquema de dispositivo tipicamente utilizado para definir e proteger o 
local de aplicação cutânea nos estudos de absorção percutânea  in vivo
  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 645
 
B.45.  ABSORÇÃO CUTÂNEA: MÉTODO  IN VITRO  
1. MÉTODO  
O presente método de ensaio é equivalente ao método OECD TG 
428 (2004).  
1.1. INTRODUÇÃO  
O presente método foi concebido para a obtenção de informações 
sobre a absorção de uma substância a ensaiar quando aplicada em 
pele excisada; pode ser combinado com o «Método de absorção cutânea: método  in vivo » (1) ou utilizado separadamente. 
No delineamento de estudos baseados no presente método, recomen ­
da-se a consulta do documento de orientação da OCDE para a rea ­
lização de ensaios de absorção cutânea (2). O referido documento de orientação foi elaborado no intuito de facilitar a escolha de processos  
in vitro  adequados para utilização em circunstâncias específicas, de 
forma a garantir a fiabilidade dos resultados obtidos pelo presente método.
 
Os métodos de medição da absorção cutânea e da transferência 
através da pele podem dividir-se em duas categorias:  in vivo  e in 
vitro.  Os métodos de absorção cutânea  in vivo  estão já consagrados, 
permitindo obter dados farmacocinéticos em diversas espécies ani ­
mais. Num método de ensaio distinto (1) é feita a descrição de um 
método  in vivo.  Os métodos  in vitro  são também utilizados há mui ­
tos anos para medir a absorção cutânea. Embora não tenham sido efectuados estudos de validação formal dos métodos  in vitro  abran­
gidos pelo presente método de ensaio, os peritos da OCDE acorda ­
ram em 1999 em que os dados avaliados existentes eram suficientes para apoiar o método  in vitro  (3). No documento de orientação (2) 
são fornecidos elementos comprovativos adicionais, incluindo diver ­
sas comparações directas de métodos  in vitro  e in vivo.  O assunto foi 
também tratado em diversas monografias, que contêm informações básicas pormenorizadas sobre o uso de um método  in vitro  (4) (5) 
(6) (7) (8) (9) (10) (11) (12). Os métodos  in vitro  medem a difusão 
de substâncias químicas para a pele e, através desta, para um reser ­
vatório de fluido, podendo ser utilizada pele não viável, apenas para medir a difusão, ou pele fresca, metabolicamente activa, para medir simultaneamente a difusão e o metabolismo cutâneo. Estes métodos 
revelaram-se muito úteis na triagem de diferentes formulações quanto 
à sua utilidade na transferência de substâncias químicas para a pele e através dela, podendo também constituir modelos úteis na avaliação da absorção percutânea no homem.
 
O método  in vitro  pode não ser aplicável em todas as situações e a 
todos os tipos de substâncias químicas. Por vezes pode utilizar-se o método de ensaio  in vitro  para uma avaliação qualitativa inicial da 
penetração cutânea. Em certos casos, poderá ser necessário completar 
esta avaliação com dados  in vivo.  Para mais pormenores sobre as 
situações em que a utilização do método  in vitro  poderá ser adequa ­
da, consultar o documento de orientação (2). A referência (3) contém 
informações pormenorizadas adicionais de apoio à decisão.
 
No presente método são apresentados os princípios gerais em que 
assenta a medição da absorção cutânea e subsequente transferência 
através da pele de uma substância a ensaiar, utilizando pele excisada. 
Pode ser utilizada pele de muitas espécies de mamíferos, incluindo o homem. As propriedades de permeabilidade da pele mantêm-se após a excisão, porque o principal obstáculo à difusão é o estrato córneo 
não viável, não tendo sido detectado o transporte percutâneo activo 
de substâncias químicas. Apesar de ter sido demonstrado que a pele é capaz de metabolizar algumas substâncias durante a absorção per ­
cutânea (6), trata-se de um processo que não é limitante em termos 
de dose efectivamente absorvida, embora possa afectar a natureza 
das substâncias introduzidas na corrente sanguínea.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 646
 
1.2. DEFINIÇÕES  
Dose não absorvida:  a que é removida da superfície cutânea após a 
exposição, por lavagem, ou que esteja eventualmente presente na cobertura não oclusiva, incluindo a que eventualmente se demonstre 
ter-se volatilizado da pele durante a exposição.
 
Dose absorvida ( in vitro ): massa de substância a ensaiar que atinge 
o fluido receptor ou a circulação sistémica num período especificado.  
Dose absorvível ( in vitro ): a que permanece na pele, ou à superfície 
desta, após a lavagem.  
1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
A substância a ensaiar, que pode ser marcada com um radioisótopo, 
é aplicada na superfície de uma amostra de pele que separa as duas câmaras de uma célula de difusão. A substância química permanece sobre a pele por um período e em condições especificados, antes de 
ser retirada por um processo de limpeza adequado. A intervalos 
determinados ao longo da experiência colhem-se amostras do fluido receptor, que são depois analisadas para detecção da substância a ensaiar e/ou dos seus metabolitos.
 
Caso se utilizem sistemas metabolicamente activos, os metabolitos 
da substância a ensaiar podem ser analisados por métodos adequa ­
dos. No final da experiência quantifica-se, se for caso disso, a dis ­
tribuição da substância a ensaiar e dos seus metabolitos.  
Utilizando condições adequadas, descritas no presente método e no 
documento de orientação (2), a absorção durante determinado pe ­
ríodo da substância ensaiada é medida por análise do fluido receptor e da pele tratada. A substância ensaiada que permanece na pele deve 
ser considerada como absorvida, excepto se for possível demonstrar 
que a absorção pode ser determinada com base apenas nos valores relativos ao fluido receptor. A análise dos outros elementos (material removido da pele por lavagem, ou que permanece nas camadas da 
pele) permite uma avaliação complementar dos resultados, nomeada ­
mente por determinação da distribuição total da substância ensaiada e da taxa de recuperação.
 
Os resultados obtidos com substâncias de referência pertinentes de ­
vem encontrar-se disponíveis e estar em conformidade com a biblio ­
grafia relativa ao método utilizado, a fim de demonstrar a eficiência e fiabilidade do sistema de ensaio no laboratório executante. Para o preenchimento desta condição pode ser efectuado concomitantemente 
o ensaio de uma substância de referência adequada (de preferência, 
com uma lipofilia próxima da da substância em ensaio) e da subs ­
tância a ensaiar, ou ser fornecidos dados anteriores adequados para várias substâncias de referência de lipofilias diferentes (por exemplo, 
cafeína, ácido benzóico e testosterona).
 
1.4. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.4.1.  Célula de difusão  
Uma célula de difusão é constituída por uma câmara dadora e uma 
câmara receptora, estando a pele colocada entre as duas câmaras (na 
figura 1 apresenta-se um exemplo de esquema típico deste disposi ­
tivo). A célula deve garantir uma boa vedação em torno da pele e permitir uma amostragem fácil e uma mistura eficaz da solução receptora em contacto com a face interna da pele, e um bom controlo 
da temperatura da célula e do seu conteúdo. Podem ser utilizadas 
células de difusão estáticas ou de fluxo. Normalmente, o comparti ­
mento dador é deixado descoberto durante a exposição a uma dose finita da preparação a ensaiar. Contudo, para aplicações infinitas e 
em certos casos de aplicações finitas, as câmaras dadoras podem ser 
fechadas.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 647
 
1.4.2.  Fluido receptor  
É preferível a utilização de um fluido receptor fisiologicamente com ­
patível, embora possam também utilizar-se outros, desde que a sua utilização seja fundamentada. Deve ser dada a composição exacta do 
fluido receptor. Deve ser demonstrada a solubilidade adequada da 
substância a ensaiar no fluido receptor, de forma a que este não constitua um obstáculo à absorção. Além disso, o fluido receptor não deve afectar a integridade da preparação de pele. Num sistema 
de fluxo, o débito não deve dificultar a difusão da substância a 
ensaiar no fluido receptor. Num sistema de célula estática, o fluido deve ser agitado continuamente, devendo colher-se amostras a inter ­
valos regulares. Caso esteja a ser estudado o metabolismo, o fluido 
receptor deve permitir manter a viabilidade da pele durante toda a experiência.
 
1.4.3.  Preparações de pele  
Pode ser utilizada pele de origem humana ou animal. Reconhece-se 
que a utilização de pele humana está sujeita a considerações e con ­
dições éticas nacionais e internacionais. Embora seja preferível pele viável, pode ser também utilizada pele não viável, desde que a sua integridade possa ser demonstrada. Podem utilizar-se membranas 
epidérmicas (separadas por métodos enzimáticos, térmicos ou quími ­
cos) ou pele de clivagem (geralmente com 200-400 μm de espessura) 
preparada com um dermátomo. Pode ser utilizada pele total, mas deve evitar-se uma espessura excessiva (superior a cerca de 
1 mm), excepto quando seja especificamente exigida para a determi ­
nação da substância a ensaiar nas camadas da pele. A escolha da espécie, do local anatómico e da técnica de preparação deve ser justificada. Exigem-se dados aceitáveis de um mínimo de quatro 
repetições por preparação ensaiada.
 
1.4.4.  Integridade da preparação de pele  
É essencial que a pele seja convenientemente preparada. Um manu ­
seio incorrecto pode danificar o estrato córneo, sendo necessário, por conseguinte, verificar a integridade da pele depois de preparada. 
Caso esteja em estudo o metabolismo cutâneo, a pele recém-excisada 
deve ser utilizada o mais depressa possível, em condições que per ­
mitam comprovadamente manter a actividade metabólica. A título de orientação, a pele recém-excisada deve em geral ser utilizada no 
prazo de 24 horas, embora o período de armazenagem aceitável varie 
em função do sistema enzimático que intervém na metabolização e das temperaturas de armazenagem (13). Caso as preparações de pele tenham estado armazenadas antes de serem utilizadas, deverão apre ­
sentar-se provas de que a função de barreira se mantém.
 
1.4.5.  Substância a ensaiar  
A substância a ensaiar é a entidade de que se pretendem estudar as 
propriedades de penetração. De preferência, a substância a ensaiar deve ser marcada com um radioisótopo.
 
1.4.6.  Preparação a ensaiar  
A preparação com a substância a ensaiar (por exemplo, material 
puro, diluído ou formulado contendo a substância a ensaiar e que se aplica na pele) deve ser aquela a que poderão estar expostos o homem ou outras espécies potencialmente visadas, ou um subs ­
tituinte realista da mesma. Qualquer mudança relativamente à prepa ­
ração tal como é utilizada deve ser justificada.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 648
 
1.4.7.  Concentrações e formulações das substâncias a ensaiar  
Utilizam-se normalmente várias concentrações da substância a en ­
saiar, de forma a cobrir os valores mais elevados de exposição humana potencial. Da mesma maneira, deve ser considerado o ensaio 
de várias formulações típicas.
 
1.4.8.  Aplicação na pele  
Em condições normais, o homem é exposto a doses finitas de subs ­
tâncias químicas. Deve utilizar-se, por conseguinte, uma aplicação 
que simule as condições de exposição do homem, ou seja, normal ­
mente, de 1-5 mg/cm  2 de pele para os sólidos e de até 10 μl/cm  2 
para os líquidos. A quantidade deve ser justificada com base nas 
condições de utilização previstas, nos objectivos do estudo ou nas características da preparação a ensaiar. Por exemplo, com a aplicação de grandes volumes por unidade de superfície as aplicações à super ­
fície da pele podem ser infinitas.
 
1.4.9.  Temperatura  
A temperatura afecta a difusão passiva das substâncias químicas — e 
também, por conseguinte, a sua absorção pela pele. A câmara de 
difusão e a pele devem ser mantidas a temperatura constante, pró ­
xima da temperatura normal da pele, de 32 +/-1  o C. A temperatura do 
banho-maria ou da manta de aquecimento que é necessária para 
manter o fluido receptor e a pele à temperatura fisiológica dependerá 
da concepção da célula. A humidade deve, de preferência, ser man ­
tida entre 30 % e 70 %.  
1.4.10.  Duração da exposição e da amostragem  
A exposição da pele à preparação a ensaiar pode manter-se durante 
todo o ensaio ou limitar-se a períodos mais curtos (para simular um tipo específico de exposição do homem). A lavagem da pele para 
remover o excesso de preparação a ensaiar deve ser feita com um 
agente de limpeza adequado, recolhendo-se o líquido de lavagem para análise. A forma de retirar a preparação a ensaiar dependerá das condições de utilização previstas, e deve ser justificada. O pe ­
ríodo de amostragem exigido é normalmente de 24 h, período que 
permite caracterizar convenientemente o perfil de absorção. Uma vez que a integridade da pele pode começar a deteriorar-se uma vez excedidas 24 horas, a colheita de amostras não deve normalmente 
prolongar-se para além deste prazo. Para substâncias de rápida pene ­
tração cutânea, esse período pode não ser necessário, mas para subs ­
tâncias de penetração lenta podem ser necessários períodos mais longos. A frequência de amostragem do fluido receptor deve permitir 
a representação gráfica do perfil de absorção da substância a ensaiar.
 
1.4.11.  Procedimentos finais  
Todos os componentes do sistema de ensaio devem ser analisados, 
devendo determinar-se a taxa de recuperação. Os componentes in ­
cluem a câmara dadora, o líquido de lavagem superficial da pele, a preparação de pele, o fluido receptor e a respectiva câmara. Nalguns casos, a pele pode ser fraccionada em pele com a superfície exposta 
e pele sob a flange da célula, e em estrato córneo, epiderme e derme, 
analisando-se cada fracção separadamente.
 
1.4.12.  Análise  
Em todos os estudos, deve obter-se uma taxa de recuperação ade ­
quada (a média a obter será de 100 +/- 10 % da radioactividade, devendo os eventuais desvios ser justificados). A quantidade de substância a ensaiar presente no fluido receptor, na preparação de 
pele, no líquido de lavagem superficial da pele e no líquido de 
lavagem do aparelho deve ser determinada por método adequado.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 649
 
2. RESULTADOS  
Deve apresentar-se a análise do fluido receptor, a distribuição da 
substância química ensaiada no sistema de ensaio e a evolução da absorção ao longo do tempo. Caso sejam utilizadas condições de 
exposição a uma dose finita, deve ser calculada a quantidade remo ­
vida da pele por lavagem, a quantidade associada à pele (e às suas diferentes camadas, caso sejam analisadas) e a quantidade presente no fluido receptor (taxa, e quantidade ou percentagem da dose apli ­
cada). A absorção cutânea pode por vezes ser expressa utilizando 
apenas os dados do fluido receptor. Contudo, caso a substância ensaiada permaneça na pele no final do ensaio, pode ser necessário 
incluí-la na quantidade total absorvida [ver ponto 66 da referência 
(3)]. Quando se utilizem condições de exposição a uma dose infinita os dados podem permitir o cálculo de uma constante de permeabi ­
lidade (Kp). Nestas últimas condições, a percentagem absorvida é 
irrelevante.
 
3. RELATÓRIOS  
3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deve incluir os requisitos especificados no 
protocolo, nomeadamente a justificação da escolha do sistema de 
ensaio utilizado, devendo conter os seguintes elementos:  
Substância a ensaiar:  
— natureza física, propriedades físico-químicas (pelo menos, peso 
molecular e log P  oa ), pureza (pureza radioquímica),  
— dados relativos à identificação (por exemplo, número do lote),  
— solubilidade no fluido receptor.  
Preparação a ensaiar:  
— formulação e justificação da utilização,  
— homogeneidade.  
Condições do ensaio:  
— origem e local de proveniência da pele, método de preparação, 
condições de armazenagem antes da utilização, eventuais pré- -tratamentos (limpeza, tratamentos antibióticos, etc.), medições 
da integridade da pele, estado metabólico, justificação da utiliza ­
ção,
 
— concepção da célula, composição do fluido receptor, débito do 
fluido receptor ou intervalos e processos de amostragem,  
— informações pormenorizadas quanto à aplicação da preparação a 
ensaiar e à quantificação da dose aplicada,  
— duração da exposição,  
— informações sobre a remoção da preparação a ensaiar da pele, 
por exemplo, por lavagem,  
— informações sobre a análise da pele e as técnicas de clivagem 
eventualmente utilizadas na demonstração da distribuição cutâ ­
nea, ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 650
 
— processos de lavagem da célula e do equipamento,  
— métodos de determinação analítica, técnicas de extracção, limites 
de detecção e validação do método analítico.  
Resultados:  
— taxas de recuperação globais do ensaio (Dose aplicada = Líquido 
de lavagem da pele + Pele + Fluido receptor + Líquido de 
lavagem da célula),  
— quadro das taxas de recuperação em cada compartimento da 
célula,  
— perfil de absorção,  
— quadro dos valores de absorção (expressos em taxa, quantidade 
ou percentagem).  
Discussão dos resultados.  
Conclusões.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) Método de ensaio B.44. Absorção cutânea: Método  in vivo.  
(2) OECD, (2002) Guidance Document for the Conduct of Skin 
Absorption Studies. OECD, Paris.  
(3) OECD, (2000) Report of the Meeting of the OECD Extended 
Steering Committee for Percutaneous Absorption Testing, An ­
nex 1 to ENV/JM/TG(2000)5. OECD, Paris.  
(4) Kemppainen B.W. and Reifenrath W.G., (1990) Methods for 
skin absorption. CRC Press, Boca Raton.  
(5) Bronaugh R.L. and Collier, S.W., (1991) Protocol for  In vitro  
Percutaneous Absorption Studies, in  In vitro Percutaneous Ab ­
sorption: Principles, Fundamentals and Application s, RL Bro ­
naugh and HI Maibach, Eds., CRC Press, Boca Raton, p. 237- -241.
 
(6) Bronaugh, R.L. and Maibach H.I., (1991)  In vitro Percuta ­
neous Absorption: Principles, Fundamentals and Application s. 
CRC Press, Boca Raton.  
(7) European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemi ­
cals, (1993) Monograph No 20, Percutaneous Absorption, ECETOC, Brussels.
 
(8) Diembeck, W., Beck, H., Benech-Kieffer, F., Courtellemont, 
P., Dupuis J, Lovell W, Paye M, Spengler J, Steiling W 
(1999). Test Guidelines for  In Vitro  Assessment of Dermal 
Absorption and Percutaneous Penetration of Cosmetic Ingre ­
dients, Fd Chem Tox, 37, p. 191-205.  
(9) Recommended Protocol for  In vitro  Percutaneous Absorption 
Rate Studies (1996). US Federal Register, Vol. 61, No 65.  
(10) Howes, D., Guy, R., Hadgraft, J., Heylings, J.R. et al. (1996). 
Methods for assessing Percutaneous absorption. ECVAM 
Workshop Report ATLA 24, 81 R10.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 651
 
(11) Schaefer, H. and Redelmeier, T.E., (1996). Skin barrier: prin ­
ciples of percutaneous absorption. Karger, Basel.  
(12) Roberts, M.S. and Walters, K.A., (1998). Dermal absorption 
and toxicity assessment. Marcel Dekker, New York.  
(13) Jewell, C., Heylings, J.R., Clowes, H.M. and Williams, F.M. 
(2000). Percutaneous absorption and metabolism of dinitroch ­
lorobenzene in vitro. Arch Toxicol 74, p. 356-365.  
Figura 1  
Exemplo de esquema típico de uma célula de difusão estática para estudos de 
absorção percutânea  in vitro
  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 652
 
B.46.  IRRITAÇÃO CUTÂNEA  IN VITRO : MÉTODO DE ENSAIO EM 
EPIDERME HUMANA RECONSTRUÍDA  
INTRODUÇÃO  
1. Entende-se por irritação cutânea a produção de danos reversíveis na pele 
por aplicação de um produto químico em estudo durante, no máximo, 
quatro horas – definição do Sistema Mundial Harmonizado de Classifica ­
ção e Rotulagem de Produtos Químicos da ONU (GHS) e do Regulamento (CE) n.
 o 1272/2008 do Parlamento Europeu e do Conselho, 
de 16 de dezembro de 2008, relativo à classificação, rotulagem e emba ­
lagem de substâncias e misturas (1) (3). O presente método de ensaio descreve uma técnica  in vitro  que pode ser utilizada para identificar os 
perigos associados a produtos químicos (substâncias e misturas) irritantes 
da categoria 2 dos sistemas GHS da ONU e CRE da UE (1) (2) (3). Na 
UE e noutras zonas geográficas que não adotaram a categoria 3 facultativa do sistema GHS da ONU (irritantes ligeiros), pode também utilizar-se este 
método para identificar produtos químicos não classificados (rubrica «ne ­
nhuma categoria» nos sistemas GHS da ONU e CRE da UE) (1) (3). O presente método pode ser utilizado para determinar o poder de irritação cutânea de produtos químicos e constitui um ensaio independente alterna ­
tivo a estudos de irritação cutânea  in vivo , no âmbito de uma estratégia de 
ensaio sequencial por etapas [(4) e capítulo B.4 deste anexo].
 
2. A determinação da irritação cutânea tem normalmente utilizado animais de 
laboratório ( Test Guideline  404 da OCDE, capítulo B.4 do presente anexo) 
(4). No contexto da preocupação com o bem-estar animal, o método B.4 
foi revisto em 2004 e permite determinar a corrosão/irritação cutânea por aplicação de uma estratégia de ensaio sequencial, por etapas, com base em métodos  in vitro  e ex vivo  validados, assim se evitando o sofrimento de 
animais. A OCDE adotou, como  Test Guidelines , três métodos de ensaio  
in vitro  validados, com os números 430, 431 e 435 (5) (6) (7), cons ­
tituindo dois deles os capítulos B.40 e B.40A do presente anexo. Destinam-se a ser utilizados para a componente «corrosividade» da estra ­
tégia de ensaio por etapas do método B.4 ou do  Test Guideline  404 da 
OCDE (4).
 
3. O presente método dá indicações quanto à irritação cutânea no ser huma ­
no. Baseia-se em epiderme humana reconstruída, cuja conceção geral (uti ­
lização de queratinócitos de epiderme humana não transformados como 
fonte celular, tecido representativo e citoarquitectura) reproduz com muita fidelidade as propriedades bioquímicas e fisiológicas das camadas superio ­
res da pele humana, isto é, da epiderme. O método inclui ainda uma série 
de normas de desempenho (apêndice 2) para avaliação de métodos simi ­
lares ou modificados que utilizam epiderme humana reconstruída, desen ­
volvidos pela ECVAM da UE (8) de acordo com os princípios do docu ­
mento de orientação ( Guidance Document ) n.
 o 34 da OCDE (9).  
4. Estão validados três métodos conformes com o presente método de ensaio. 
Concluíram-se os estudos de pré-validação, otimização e validação de um método  in vitro  (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) 
baseado num modelo de epiderme humana reconstruída, comercializado 
com a designação EpiSkin
 TM (método de referência validado). Dois outros 
métodos  in vitro , comercializados com as designações EpiDerm  TM SIT 
(EPI-200) e SkinEthic  TM RHE (22), destinados a determinações de irrita ­
ção cutânea e que utilizam epiderme humana reconstruída, deram resulta ­
dos similares ao do método de referência validado, por aplicação das 
normas de desempenho estabelecidas para efeitos de validação (21).  ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 653
 
5. Antes de se poder utilizar, numa perspetiva normativa, um ensaio  in vitro  
proposto, similar ou modificado, baseado em epiderme humana recons ­
truída, diverso do método de referência validado, do método EpiDerm  TM 
SIT (EPI-200) e do método SkinEthic  TM RHE, importa determinar a fia ­
bilidade, a adequação (exatidão) e as limitações do método em causa na 
utilização proposta, para garantir a similitude com o método de referência 
validado, em conformidade com as normas de desempenho estabelecidas no presente método (apêndice 2). Recomenda-se a consulta do  Explana ­
tory Background Document on in vitro skin irritation testing  da OCDE 
(documento explicativo de base dos ensaios de irritação cutânea  in vitro ) 
antes do desenvolvimento e da validação de métodos  in vitro  similares ou 
modificados que utilizam epiderme humana reconstruída e de se solicitar a adoção dos mesmos com caráter normativo (23).
 
DEFINIÇÕES  
6. As definições utilizadas figuram no apêndice 1.  
CONSIDERAÇÕES INICIAIS E LIMITAÇÕES  
7. Uma limitação do método de ensaio, demonstrada no estudo de validação 
(16), reside no facto de não permitir classificar produtos químicos na 
categoria 3 facultativa do sistema GHS da ONU (irritantes ligeiros) (1). Quando é utilizado como ensaio alternativo parcial, pode ser necessário complementá-lo com ensaios  in vivo , a fim de caracterizar completamente 
o potencial de irritação cutânea [(4) e capítulo B.4 do presente anexo]. É 
sabido que a utilização de pele humana está sujeita a condições e consi ­
derações nacionais e internacionais de natureza ética.
 
8. Este método de ensaio incide na componente  in vitro  da irritação cutânea 
da estratégia de ensaio sequencial por etapas no domínio da irritação/cor ­
rosão dérmica do método B.4 ( Test Guideline  404 da OCDE) (4). Embora 
o presente método não forneça informações adequadas sobre corrosão cutânea, importa referir que o método B.40A ( Test Guideline  431 da 
OCDE) relativo à corrosão da pele se baseia no mesmo sistema de ensaio 
de epiderme humana reconstruída, embora utilize outro protocolo (capítulo 
B.40A). O presente método baseia-se em modelos de epiderme humana reconstruída com queratinócitos humanos, a qual representa, portanto,  in 
vitro , o órgão-alvo da espécie em causa. O método cobre ainda, direta ­
mente, a fase inicial do mecanismo de ação/processo inflamatório (lesões 
celulares e dos tecidos que originam traumatismos localizados) que ocorre na irritação  in vivo . Durante a validação do método, ensaiou-se uma vasta 
gama de produtos químicos, contando a base de dados empírica do estudo 
de validação com 58 produtos químicos (16) (18) (23). O método é apli ­
cável a sólidos, líquidos, semissólidos e ceras. Os líquidos podem ser aquosos ou não e os sólidos podem ser solúveis ou insolúveis em água. Sempre que possível, os sólidos devem ser finamente moídos antes da 
aplicação. Não é necessário nenhum outro pré-tratamento das amostras. 
O estudo de validação ainda não incidiu em gases e aerossóis (24). Em ­
bora se admita que uns e outros possam ser ensaiados recorrendo à tec ­
nologia da epiderme humana reconstruída, a versão atual do método não 
está vocacionada para ensaios de gases nem de aerossóis. É também de referir que os produtos químicos fortemente corados podem interferir com as medições de viabilidade celular, sendo necessário utilizar controlos 
corretivos adequados (ver os pontos 24 a 26).
 
9. Quando a classificação do produto químico em estudo é inequívoca, é 
normalmente suficiente uma série de ensaios constituída por um triplicado 
dos tecidos. Porém, nos casos inconclusivos (por exemplo, medições dis ­
cordantes dos replicados e/ou percentagem de viabilidade média igual a 50 % ± 5 %), é de ponderar a realização de uma segunda série de ensaios, 
bem como de uma terceira se os resultados das duas primeiras séries forem 
discordantes.
 ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 654
 
PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
10. O produto químico em estudo é aplicado localmente num modelo tridi ­
mensional de epiderme humana reconstruída, constituído por queratinóci ­
tos de epiderme humana não transformados, cultivados de modo a forma ­
rem um modelo de epiderme humana com várias camadas e altamente diferenciado. O modelo é constituído por uma camada basal, uma camada 
espinhosa e uma camada granulosa organizadas e por um  stratum corneum  
em várias camadas, com uma estrutura lipídica lamelar intercelular repre ­
sentativa das principais classes de lípidos, semelhante ao observado  in 
vivo.
 
11. A irritação cutânea induzida por produtos químicos, manifestada por eri ­
tema e edema, resulta de uma série de acontecimentos iniciada com a 
penetração do  stratum corneum  e lesão das camadas subjacentes de que ­
ratinócitos. Ao começarem a morrer, os queratinócitos libertam mediadores que desencadeiam o processo inflamatório, o qual afeta as células da 
derme, em especial as células estromáticas e endoteliais. A dilatação e 
permeabilidade crescente das células endoteliais origina o eritema e o edema observados (24). Os métodos que utilizam epiderme humana re ­
construída medem os acontecimentos iniciais deste processo.
 
12. A viabilidade celular nos modelos de epiderme humana reconstruída é 
medida pela conversão enzimática do corante vital MTT – brometo de 
3-(4,5-dimetiltiazol2-il)-2,5-difeniltetrazólio, azul de tiazolilo, n.  o CAS 
298-93-1 – num sal azul de formazano, que é determinado quantitativa ­
mente depois de extraído dos tecidos (25). Os produtos químicos irritantes são identificadas com base na sua capacidade de redução da viabilidade 
celular para valores inferiores a limites definidos ( ≤ 50 % no caso das 
substâncias irritantes classificadas na categoria 2 dos sistemas GHS da ONU e CRE da UE). Consoante o quadro regulamentar no qual os resul ­
tados obtidos por este método sejam utilizados, os produtos químicos a 
que estejam associadas viabilidades celulares acima do limite definido 
podem ser considerados não-irritantes (> 50 %, nenhuma categoria).
 
DEMONSTRAÇÃO DE COMPETÊNCIA  
13. Antes de passarem a utilizar, por rotina, algum dos três métodos validados 
em conformidade com o presente método de ensaio, cada laboratório terá de demonstrar a sua competência técnica, utilizando para o efeito os 10 
produtos químicos de referência indicados no quadro 1. No caso de mé ­
todos similares ao presente método ou de modificações de algum dos três métodos validados, é necessário cumprir as normas de desempenho espe ­
cificadas no apêndice 2 antes de utilizar o método em causa em ensaios 
normativos.
 
14. No âmbito da confirmação de competência, recomenda-se que o utilizador 
verifique, após a receção dos tecidos, as propriedades de barreira dos mesmos especificadas pelo fabricante do modelo de epiderme humana reconstruída. Este aspeto é especialmente importante se os tecidos forem 
expedidos a longas distâncias ou demorarem muito tempo a chegar. A 
partir do momento em que o método esteja implantado e tenha sido demonstrada competência para utilizá-lo, não é necessário efetuar por rotina a referida verificação. Recomenda-se, contudo, que, ao utilizar um 
método por rotina, se continue a avaliar periodicamente as propriedades de 
barreira.
 
Quadro 1  
Produtos químicos de referência  ( 1 ) 
Produto químico N.  o CAS Pontuação  in 
vivo ( 2 ) Estado Categoria GHS da 
ONU/CRE da UE  
Ácido naftalenoacético 86-87-3 0 Sólido Nenhuma 
Isopropanol 67-63-0 0,3 Líquido Nenhuma  ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 655
 
Produto químico N.  o CAS Pontuação  in 
vivo ( 2 ) Estado Categoria GHS da 
ONU/CRE da UE  
Estearato de metilo 112-61-8 1 Sólido Nenhuma 
Butirato de heptilo 5870-93-9 1,7 Líquido Nenhuma 
(categoria 3 
facultativa ) ( 3 ), ( 4 ) 
Salicilato de hexilo 6259-76-3 2 Líquido Nenhuma 
(categoria 3 facul ­
tativa ) ( 3 ), ( 4 ) 
Ciclamenaldeído 103-95-7 2,3 Líquido Categoria 2 
1-Bromo-hexano 111-25-1 2,7 Líquido Categoria 2 
Hidróxido de potássio (solução aquosa 
a 5 %) 1310-58-3 3 Líquido Categoria 2 
1-Metil3-fenil1-piperazina 5271-27-2 3,3 Sólido Categoria 2 
Heptanal 111-71-7 3,4 Líquido Categoria 2  
( 1 ) Os produtos químicos de referência constantes desta lista fazem parte da série utilizada no estudo de validação. 
( 2 ) Pontuação  in vivo  de acordo com o método B.4 e com o  Test Guideline  404 da OCDE (4). 
( 3 ) No âmbito do presente método, a categoria 3 facultativa do sistema GHS da ONU (irritantes ligeiros) (1) é referida como 
«nenhuma categoria». 
( 4 ) A categoria 3 facultativa do sistema GHS da ONU não é aplicável no âmbito do sistema CRE da UE.  
PROCEDIMENTO DE ENSAIO  
15. Descrevem-se a seguir os componentes e procedimentos de um método 
baseado em epiderme humana reconstruída para avaliação da irritação 
cutânea. O modelo de epiderme humana reconstruída pode ser preparado 
no laboratório ou obtido no comércio. Estão disponíveis procedimentos operacionais normalizados para o EpiSkin
 TM , o EpiDerm  TM SIT (EPI- 
-200) e o SkinEthic  TM RHE (26)(27)(28). Na realização dos ensaios deve 
ter-se em conta o seguinte:  
Componentes do método de ensaio de epiderme humana reconstruída  
Condições gerais  
16. Na reconstrução do epitélio, utilizam-se queratinócitos humanos não trans ­
formados. Devem estar presentes várias camadas de células epiteliais viá ­
veis (camada basal, camada espinhosa, camada granulosa), sob um  stratum 
corneum  funcional. Este deve ter várias camadas e possuir um perfil 
lipídico que permita estabelecer uma barreira funcional suficientemente 
robusta para resistir a uma penetração rápida de produtos químicos mar ­
cadores citotóxicos, por exemplo, dodecilsulfato de sódio (SDS) ou Triton X-100. A função de barreira deve ser demonstrada e pode ser avaliada 
determinando a concentração à qual o produto químico marcador reduz a 
viabilidade dos tecidos em 50 % (CI
 50 ), após um tempo de exposição fixo, 
ou determinando o tempo de exposição necessário para reduzir a viabili ­
dade celular em 50 % (TE  50 ), após ser aplicada uma dada concentração 
fixa do produto químico marcador. As propriedades de contenção do 
modelo de epiderme humana reconstruída devem impedir a passagem de matéria para o tecido viável por contorno do  stratum corneum , que redun ­
daria numa modelação deficiente da exposição cutânea. O modelo de 
epiderme humana reconstruída não deve estar contaminado por bactérias, 
vírus, micoplasmas ou fungos.
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Condições funcionais  
Viabilidade  
17. Para quantificar a viabilidade recorre-se ao método do MTT (25). Os 
utilizadores do modelo de epiderme humana reconstruída devem garantir 
que cada lote do modelo utilizado preenche os critérios definidos para o controlo negativo. A densidade ótica do solvente de extração isolado deve 
ser suficientemente baixa (< 0,1). As entidades que desenvolvem/fornecem 
o modelo de epiderme humana reconstruída estabeleceram intervalos de aceitabilidade (limites superior e inferior) para os valores de densidade ótica dos controlos negativos (nas condições do método de ensaio de 
irritação cutânea), que se indicam no quadro 2 para os três métodos 
validados. Os tecidos tratados com o produto químico de controlo negativo devem, comprovadamente, manter-se estáveis em cultura durante todo o período de exposição do ensaio (medições de viabilidade semelhantes).
 
Quadro 2  
Intervalos de aceitabilidade para os valores de densidade ótica dos controlos negativos  
Limite inferior de aceitabilidade Limite superior de aceitabilidade  
EpiSkin  TM (SM) ≥ 0,6 ≤ 1,5 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) ≥ 1,0 ≤ 2,5 
SkinEthic  TM RHE ≥ 1,2 ≤ 2,5 
Função de barreira  
18. O  stratum corneum  e a sua composição lipídica devem ser suficientes para 
resistir a uma penetração rápida de produtos químicos marcadores citotó ­
xicos (por exemplo, SDS ou Triton X-100), estimada com base na CI  50 ou 
no TE  50 (quadro 3).  
Morfologia  
19. O exame histológico do modelo de epiderme humana reconstruída deve 
revelar uma estrutura de epiderme humana (incluindo um  stratum corneum  
com várias camadas).  
Reprodutibilidade  
20. Os resultados obtidos por aplicação do método ao produto químico de 
controlo positivo e aos controlos negativos devem mostrar-se continuada ­
mente reprodutíveis.  
Controlo de qualidade  
21. As entidades que desenvolvem/fornecem o modelo de epiderme humana 
reconstruída devem assegurar e demonstrar que todos os lotes do modelo preenchem os critérios de liberação da produção estabelecidos, dos quais os mais importantes são os de  viabilidade  (ponto 17),  função de barreira  
(ponto 18) e  morfologia  (ponto 19). Estes dados devem ser facultados aos 
utilizadores do método, para que estes possam fazer constar tais informa ­
ções dos seus relatórios. A entidade que desenvolve/fornece o modelo de epiderme humana reconstruída (ou o investigador, quando utilize modelo 
próprio) deve definir um intervalo de aceitabilidade (limites inferior e 
superior) para a CI
 50 ou o TE  50 . Apenas podem ser utilizados com fiabi ­
lidade na previsão de classificações de irritação resultados obtidos com tecidos que possuam as características exigidas. A título de exemplo, 
apresentam-se no quadro 3 os intervalos de aceitabilidade dos três métodos 
validados.
 ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 657
 
Quadro 3  
Exemplos de critérios de controlo de qualidade para a liberação de lotes  
Limite inferior de aceitabilidade Limite superior de aceitabilidade  
EpiSkin  TM (SM) 
(18 horas de tratamento com 
SDS)(26) CI 50 = 1,0 mg/ml CI  50 = 3,0 mg/ml 
EpiDerm  TM SIT (EPI-200) 
(Triton X-100 a 1 %)(27) TE 50 = 4,8 h TE  50 = 8,7 h 
SkinEthic  TM RHE 
(Triton X-100 a 1 %)(28) TE 50 = 4,0 h TE  50 = 9,0 h  
Aplicação das substâncias em estudo e de controlo  
22. Devem utilizar-se em cada série pelo menos três replicados de cada pro ­
duto químico em estudo e dos produtos químicos de controlo. Tanto no 
caso das substâncias líquidas como das substâncias sólidas, deve aplicar-se uma quantidade do produto químico em estudo suficiente para cobrir uniformemente a superfície da epiderme, evitando uma dose infinita, ou 
seja, no mínimo 25 μl/cm
 2 ou 25 mg/cm  2 . No caso dos sólidos, a super ­
fície da epiderme deve ser humidificada, com água desionizada ou desti ­
lada, antes da aplicação, para melhorar o contacto entre o produto químico em estudo e a superfície epidérmica. Sempre que possível, os sólidos 
devem ser ensaiados na forma de pó fino. Após o período de exposição, 
o produto químico em estudo deve ser cuidadosamente removido da su ­
perfície da epiderme, por lavagem com uma solução-tampão aquosa ou uma solução a 0,9 % de NaCl. Consoante o método de epiderme humana 
reconstruída que for utilizado, dos três validados, o período de exposição 
pode variar entre 15 minutos e 60 minutos e a temperatura de incubação entre 20 °C e 37 °C. Estes períodos de exposição e temperaturas estão 
otimizados para cada método de epiderme humana reconstruída e refletem 
as diferentes propriedades intrínsecas dos métodos – ver os procedimentos operacionais normalizados dos métodos em (26) (27) (28).
 
23. Devem utilizar-se em cada série de ensaios produtos químicos de controlo 
negativos e positivos, para demonstrar que a viabilidade (com o controlo negativo), a função de barreira e a sensibilidade resultante (com o controlo 
positivo) dos tecidos se situam no intervalo histórico de aceitabilidade 
definido. Sugere-se a utilização de solução aquosa a 5 % de SDS como produto químico de controlo positivo. Como produto químico de controlo negativo, sugere-se a utilização de água ou de solução-tampão de 
fosfato (PBS).
 
Medição da viabilidade celular  
24. O elemento mais importante do procedimento de ensaio é que as medições 
de viabilidade não sejam efetuadas imediatamente após a exposição aos 
produtos químicos em estudo, mas sim após um período suficientemente 
longo de incubação dos tecidos lavados em meio fresco, depois do trata ­
mento. Esse período permite, tanto a recuperação de efeitos citotóxicos 
fracos, como a manifestação de efeitos citotóxicos claros. Na fase de 
otimização do ensaio (11) (12) (13) (14) (15), verificou-se que a duração ótima do período de incubação depois do tratamento é de 42 horas.
 
25. Para medir a viabilidade celular no âmbito do presente método, deve 
utilizar-se o método quantitativo validado do MTT, que é compatível com a arquitetura tridimensional dos tecidos. Coloca-se a amostra destes 
numa solução de MTT de concentração apropriada (por exemplo, 0,3-1 
mg/ml), durante três horas. O precipitado azul de formazano é depois extraído dos tecidos com um solvente (por exemplo, isopropanol ou iso ­
propanol acidificado), determinando-se a concentração de formazano por 
medição da densidade ótica ao comprimento de onda de 570 nm, utili ­
zando um filtro de banda passante de ± 30 nm, no máximo.
 ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 658
 
26. As propriedades óticas do produto químico em estudo, ou a reação quí ­
mica deste com o MTT, podem interferir no ensaio, gerando estimativas 
erróneas de viabilidade (caso o produto químico em estudo evite ou reverta a coloração ou produza coloração). Isto pode suceder se o produto químico em estudo não for completamente removido dos tecidos por lavagem ou se 
penetrar na epiderme. Se o produto químico em estudo agir diretamente no 
MTT (redutor do MTT), for naturalmente corado ou adquirir coloração durante o tratamento dos tecidos, devem ser utilizados produtos químicos de controlo suplementares, que permitam detetar interferências do produto 
químico em estudo na técnica de medição da viabilidade e corrigir esse 
efeito. Os procedimentos operacionais normalizados descrevem pormeno ­
rizadamente, para os três métodos validados, o modo como podem corrigir-se a redução direta do MTT e as interferências de agentes corantes 
(26) (27) (28).
 
Critérios de aceitabilidade  
27. Em cada método que utilize lotes válidos do modelo de epiderme humana 
reconstruída (ver o ponto 21), a densidade ótica dos tecidos tratados com o 
produto químico de controlo negativo deve refletir a qualidade de tecidos sujeitos a expedição, às etapas de receção e a todos os processos do protocolo. A densidade ótica dos produtos químicos de controlo não 
deve ser inferior aos limites históricos estabelecidos. Analogamente, os 
tecidos tratados com o produto químico de controlo positivo – ou seja, com solução aquosa a 5 % de SDS – devem manifestar a capacidade de reação dos tecidos ao produto químico irritante nas condições do método 
de ensaio (26) (27) (28). Devem definir-se estimativas conexas adequadas 
da variabilidade dos resultados dos replicados de tecidos (por exemplo, se se recorrer a desvios-padrão, devem estar dentro do intervalo de tolerância de 95 % calculado em teste assimétrico a partir dos dados históricos; para 
o método de referência validado, o desvio-padrão é inferior a 18 %).
 
Interpretação dos resultados e modelo de previsão  
28. Os valores de densidade ótica obtidos para cada produto químico em 
estudo podem ser utilizados para calcular a percentagem de viabilidade 
normalizada em relação à correspondente ao controlo negativo, que é 
fixada em 100 %. Importa definir claramente e documentar a percentagem de viabilidade celular que estabelece a diferenciação entre os produtos 
químicos em estudo irritantes e não classificados e o(s) método(s) estatís ­
tico(s) utilizado(s) para avaliar os resultados e identificar os produtos químicos irritantes, devendo ainda demonstrar-se que são adequados. Indicam-se a seguir os valores limite de diferenciação para a previsão de 
efeitos irritantes:
 
— Considera-se o produto químico em estudo irritante da pele, da cate ­
goria 2 dos sistema GHS da ONU/CRE da UE, se a viabilidade dos tecidos depois da exposição e da incubação subsequente ao tratamento for inferior ou igual a 50 %.
 
— Consoante o quadro regulamentar no qual os resultados deste método 
de ensaio forem utilizados, o produto químico em estudo pode ser considerado não irritante da pele, correspondendo-lhe a classificação de «nenhuma categoria» nos termos dos sistema GHS da ONU/CRE da 
UE, se a viabilidade dos tecidos depois da exposição e da incubação 
subsequente ao tratamento for superior a (>) 50 %.
 
DADOS E RELATÓRIOS  
Dados  
29. Para cada série de ensaios, devem ser apresentados num quadro os dados 
respeitantes a cada replicado de tecidos (por exemplo, valores de densi ­
dade ótica e percentagens de viabilidade celular calculadas para cada 
produto químico em estudo, bem como a classificação correspondente), incluindo os dados relativos às repetições de ensaios eventualmente efe ­
tuadas. Deve igualmente ser indicada para cada série de ensaios a média ± 
desvio-padrão. Devem referir-se ainda, para cada produto químico estuda ­
do, as interações observadas com o MTT e se é corado.
 ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 659
 
Relatório do ensaio  
30. O relatório do ensaio deve incluir as seguintes informações:  
Produtos químicos em estudo e de controlo:  
— Denominação ou denominações químicas – denominação e número 
CAS, denominação e número CE, etc. –, se forem conhecidas;  
— Grau de pureza e composição do produto químico (em percentagem 
ponderal);  
— Propriedades físico-químicas (por exemplo, estado, estabilidade, vola ­
tilidade, pH e hidrossolubilidade, se forem conhecidos) pertinentes para 
o estudo;  
— Pré-tratamento dos produtos químicos em estudo/de controlo, se for o 
caso (aquecimento ou moagem, por exemplo);  
— Condições de armazenagem.  
Justificação do modelo de epiderme humana reconstruída e do protocolo 
utilizados.  
Condições de ensaio:  
— Sistema celular utilizado;  
— Informações completas que substanciem o modelo específico de epi ­
derme humana reconstruída utilizado, incluindo dados sobre o desem ­
penho do mesmo, por exemplo:  
i) viabilidade,  
ii) função de barreira,  
iii) morfologia,  
iv) reprodutibilidade e previsibilidade,  
v) controlo de qualidade do modelo;  
— Elementos sobre o procedimento de ensaio seguido;  
— Dosagens de ensaio utilizadas e duração da exposição e do período de 
incubação depois do tratamento;  
— Descrição de eventuais modificações na execução do ensaio;  
— Referência a dados históricos sobre o modelo, por exemplo:  
i) aceitabilidade dos dados de controlo de qualidade relativamente a 
dados históricos de lotes,  
ii) aceitabilidade dos valores obtidos para os produtos químicos de 
controlo positivo e negativo relativamente a médias e intervalos correspondentes a tais produtos;
 
— Descrição dos critérios de avaliação utilizados, incluindo a justificação 
do(s) ponto(s) de diferenciação selecionado(s) para o modelo preditivo;  
— Referência a dados históricos de controlo.  ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 660
 
Resultados:  
— Quadro dos dados correspondentes a cada produto químico estudado, 
por série de ensaios e medição de replicados;  
— Indicação dos controlos utilizados no caso dos redutores diretos do 
MTT e/ou dos produtos químicos estudados que apresentem coloração;  
— Descrição de outros efeitos eventualmente observados.  
Discussão dos resultados.  
Conclusões.  
REFERÊNCIAS  
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and Labelling of Chemicals (GHS). Third revised edition. ONU, Nova Iorque e Genebra. Disponível em: [http://www.unece.org/trans/danger/publi/ /ghs/ghs_rev03/03files_e.html].
 
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three  in vitro  assays for skin irritation testing and the adaptation of the 
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irritation Performance Standards». Publicado pelo ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC30), 9 de abril de 2009. Disponível em: [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu].
 
(3) Regulamento (CE) n.  o 1272/2008 do Parlamento Europeu e do Conselho, de 
16 de dezembro de 2008, relativo à classificação, rotulagem e embalagem de substâncias e misturas, que altera e revoga as Diretivas 67/548/CEE e 
1999/45/CE, e altera o Regulamento (CE) n.
 o 1907/2006, JO L 353 de 
31.12.2008, p. 1.  
(4) OCDE (2004). Acute Dermal Irritation/Corrosion. OECD Guideline for the 
Testing of Chemicals No. 404. OCDE, Paris. Disponível em: [http: //www.oecd.org/env/testguidelines].
 
(5) OCDE (2004).  In Vitro  Skin Corrosion: Transcutaneous Electrical 
Resistance (TER). OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 430. OCDE, Paris. Disponível em: [http://www.oecd.org/env/testguide ­
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(6) OCDE (2004).  In Vitro  Skin Corrosion: Human Skin Model Test. OECD 
Guideline for the Testing of Chemicals No. 431. OCDE, Paris. Disponível 
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(7) OCDE (2006).  In Vitro  Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. 
OECD Guideline for the Testing of Chemicals No. 435. OCDE, Paris. 
Disponível em: [http://www.oecd.org/env/testguidelines].  
(8) CE-ECVAM (2009). Performance Standards for  in vitro  skin irritation test 
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[http://ecvam.jrc.ec.europa.eu].  
(9) OCDE (2005). Guidance Document on the Validation and International 
Acceptance of New or Updated Test Methods for Hazard Assessment. 
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progresso técnico pela vigésima oitava vez a Diretiva 67/548/CEE do Con ­
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administrativas respeitantes à classificação, embalagem e rotulagem das substâncias perigosas (JO L 225 de 21.8.2001, p. 1).
 
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data with  in vitro  skin irritation assays and animal data.  Contact Dermatitis , 
62, 109-116.  ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 663
 
Apêndice 1  
Definições  
Exatidão:  Grau de acordo entre os resultados do método de ensaio e os valores 
de referência aceites. Constitui uma medida do desempenho do método e um dos aspetos da adequação. Este termo e o termo «concordância» são muitas vezes 
utilizados indistintamente para indicar a proporção de resultados corretos de um 
método de ensaio (9).
 
Viabilidade celular:  Parâmetro que mede a atividade total de uma população 
celular (por exemplo, em termos de capacidade das desidrogenases mitocondriais 
celulares para reduzirem o corante vital MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol2- -il)-2,5-difeniltetrazólio, azul de tiazolilo); consoante o indicador determinado e o tipo de ensaio realizado, é possível correlacionar a viabilidade celular com o 
número total de células vivas e/ou a vitalidade dessas células.
 
Concordância:  Mede o desempenho do método de ensaio no caso dos métodos 
cujos resultados sejam estabelecidos em função de categorias e constitui um dos aspetos da adequação. Este termo e o termo «exatidão» são utilizados indistin ­
tamente; é definido como a proporção dos produtos químicos ensaiados que são 
classificados corretamente positivos ou negativos (9).
 
TE 50 : Pode ser estimado determinando o tempo de exposição necessário para 
reduzir a viabilidade celular em 50 %, após aplicação de uma dada concentração 
fixa de um marcador químico; ver também CI  50 . 
Sistema CRE da UE (Regulamento (CE) n.  o 1272/2008 do Parlamento Europeu e 
do Conselho, de 16 de dezembro de 2008, relativo à classificação, rotulagem e 
embalagem de substâncias e misturas:  Aplica na União Europeia o sistema GHS 
da ONU de classificação e rotulagem de produtos químicos (substâncias e mis ­
turas) (3).  
GHS (Sistema Mundial Harmonizado de Classificação e Rotulagem de Produtos 
Químicos, da Organização das Nações Unidas – ONU):  Sistema (designado em 
inglês por « Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Che ­
micals ») que propõe a classificação dos produtos químicos (substâncias e mistu ­
ras) em função de tipos e níveis normalizados de perigos físicos, sanitários e 
ambientais e trata ainda dos elementos de comunicação correspondentes, como pictogramas, palavras-sinal, advertências de perigo, recomendações de prudência 
e fichas de dados de segurança, de modo a transmitir informações sobre os 
efeitos indesejáveis do produto em causa com vista à proteção das pessoas (empregadores, trabalhadores, transportadores, consumidores, pessoal dos servi ­
ços de emergência, etc.) e do ambiente (1).
 
CI 50 : Pode ser estimada determinando a concentração à qual um produto químico 
marcador reduz a viabilidade dos tecidos em 50 % (CI  50 ), após um tempo de 
exposição fixo; ver também TE  50 . 
Dose infinita:  Quantidade do produto químico em estudo aplicado à epiderme 
que excede a quantidade necessária para recobrir completa e uniformemente a superfície epidérmica.
 
Ensaio «me-too»:  Expressão coloquial em inglês que designa um método de 
ensaio estrutural e funcionalmente similar a um método de referência validado e aceite. Um método com tais características é candidato a validação por simi ­
litude. O termo é sinónimo de «método de ensaio similar» (9).
 
Normas de desempenho:  Normas associadas a um método de ensaio validado 
com base nas quais pode ser avaliada a comparabilidade de um método de ensaio proposto que lhe seja funcional e mecanisticamente similar. Integram essas nor ­
mas: i) os componentes essenciais do método de ensaio, ii) uma lista mínima de 
produtos químicos de referência, selecionados entre os produtos químicos utili ­
zados para demonstrar a aceitabilidade do desempenho do método de ensaio validado e iii) os níveis de exatidão e de fiabilidade, comparáveis aos obtidos com o método de ensaio validado, que o método de ensaio proposto deve 
evidenciar ao ser avaliado utilizando a lista mínima de produtos químicos de 
referência (9).
 ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 664
 
Produto químico de referência:  Produto químico selecionado para ser utilizado 
no processo de validação, cujas respostas aos sistemas de ensaio de referência  in 
vitro  ou in vivo , ou na espécie em causa, já são conhecidas. Estes produtos 
químicos devem ser representativos das classes de produtos químicos para as quais está prevista a utilização do método de ensaio e devem traduzir toda a 
gama de respostas (forte, fraca, negativa) que são de esperar dos produtos quí ­
micos aos quais o método se destina. Fases diferentes do processo de validação, métodos de ensaio diferentes e utilizações diferentes do mesmo ensaio podem exigir séries diferentes de produtos químicos de referência (9).
 
Adequação:  Relação do ensaio com o efeito em causa; pertinência e utilidade do 
ensaio para o fim em vista. Traduz a medida em que o ensaio mede ou prevê corretamente o efeito biológico em causa. A adequação compreende a exatidão (concordância) do método de ensaio (9).
 
Fiabilidade:  Medida em que, utilizando o mesmo protocolo, um método de 
ensaio pode ser continuadamente reproduzido no mesmo laboratório e em labo ­
ratórios diferentes. A fiabilidade é avaliada com base nos valores calculados das reprodutibilidades intralaboratorial e interlaboratorial (9).
 
Ensaio alternativo:  Ensaio destinado a substituir um ensaio de rotina aceite para 
identificação de perigos e/ou avaliação de riscos, que se concluiu proporcionar proteção equivalente, ou melhorar a proteção, da saúde pública e animal ou do ambiente, consoante o caso, comparativamente ao ensaio de rotina aceite, no que 
respeita a todos os produtos químicos e situações de ensaio possíveis (9).
 
Sensibilidade:  Proporção dos produtos químicos em estudo positivos/ativos que 
são corretamente classificadas pelo ensaio. Constitui uma medida da exatidão de um método de ensaio cujos resultados sejam estabelecidos em função de cate ­
gorias e é um aspeto importante a ter em conta na avaliação da adequação do 
método de ensaio (9).
 
Irritação cutânea:  Produção de danos reversíveis na pele por aplicação de um 
produto químico em estudo durante um máximo de quatro horas. A irritação 
cutânea é uma reação local, não imunogénica, que surge pouco depois do estí ­
mulo (29). A sua característica principal é a reversibilidade do processo, no qual se produzem reações inflamatórias e surge a maior parte dos sinais clínicos 
característicos das irritações associadas a processos inflamatórios (eritema, ede ­
ma, prurido e dor).
 
Especificidade:  Proporção dos produtos químicos em estudo negativos/inativos 
que são corretamente classificadas pelo ensaio. Constitui uma medida da exatidão 
de um método de ensaio cujos resultados sejam estabelecidos em função de 
categorias e é um aspeto importante a ter em conta na avaliação da adequação do método de ensaio (9).
 
Estratégia de ensaio sequencial por etapas:  Utilização sequencial de vários 
métodos de ensaio num ensaio. A escolha do método de ensaio a utilizar em 
cada etapa da sequência é decidida com base nos resultados obtidos na etapa de ensaio anterior (9).
 
Produto químico em estudo (ou substância química em estudo):  Qualquer subs ­
tância ou mistura à qual seja aplicado o presente método de ensaio.  ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 665
 
Apêndice 2  
Normas de desempenho para avaliação de métodos similares ou modificados 
propostos para ensaios  in vitro  de irritação cutânea em epiderme humana 
reconstruída  
INTRODUÇÃO  
1. O objetivo das normas de desempenho consiste em comunicar os termos 
com base nos quais é possível determinar se um método novo, sujeito ou não a direitos de propriedade (direitos de autor, marca comercial ou re ­
gisto), é suficientemente exato e fiável para certas finalidades de ensaio. 
Estas normas baseiam-se em métodos de ensaio validados e aceites e podem 
ser utilizadas para avaliar a fiabilidade e exatidão de métodos análogos (designados coloquialmente em inglês por «métodos “ me-too ” »), baseados 
em princípios científicos semelhantes e que medem ou preveem o mesmo 
efeito biológico ou tóxico (9).
 
2. Antes da adoção de métodos modificados (ou seja, aperfeiçoamentos a mé ­
todos aprovados), deve avaliar-se o efeito das alterações propostas no de ­
sempenho do ensaio e em que medida essas alterações afetam as informações disponíveis para os outros componentes do processo de validação. Em função 
do número e da natureza das alterações propostas, dos dados de que se 
disponha e da documentação de apoio às alterações em causa, estas devem ser sujeitas a um processo de validação idêntico ao descrito para um novo ensaio ou, se for caso disso, a uma avaliação limitada de fiabilidade e ade ­
quação com base em normas de desempenho estabelecidas (9).
 
3. Os métodos similares (« me-too ») a algum dos três métodos validados – 
EpiSkin™ (método de referência validado), EpiDerm™ SIT (EPI-200) e SkinEthic™ RHE] –, ou as modificações destes, cuja utilização no âmbito do presente método de ensaio seja proposta, devem ser avaliados com vista 
à determinação da sua fiabilidade e exatidão, utilizando produtos químicos 
representativos de toda a gama da escala de irritação de Draize. Na sua avaliação por recurso aos 20 produtos químicos de referência recomenda ­
dos nas normas de desempenho (quadro 1), os métodos de ensaio similares 
ou modificados propostos devem exibir valores de fiabilidade e exatidão 
comparáveis aos do método de referência validado, ou melhores do que os deste (quadro 2) (2) (16). Os valores de fiabilidade e de exatidão preten ­
didos figuram nos pontos 8 a 12 do presente apêndice. Fazem parte da 
lista produtos químicos não classificados (rubrica «nenhuma categoria» no 
sistema GHS da ONU/CRE da UE) e classificados (categoria 2 do sistema GHS da ONU/CRE da UE), representativos de diversas classes químicas, 
para que a fiabilidade e a exatidão (sensibilidade, especificidade e exatidão 
global) do método proposto possam ser comparadas com as do método de referência validado. Antes de se utilizar o método para o ensaio de novos produtos químicos, há que determinar a sua fiabilidade e a sua capacidade 
para identificar corretamente produtos químicos irritantes da categoria 2 do 
sistema GHS da ONU/CRE da UE e – consoante o quadro regulamentar a que se destinem os dados – também a sua capacidade para identificar corretamente produtos químicos a que corresponda a classificação «ne ­
nhuma categoria» do sistema GHS da ONU/CRE da UE.
 
4. Estas normas baseiam-se nas normas de desempenho da UE (ECVAM) (8), 
atualizadas em função dos sistemas de classificação e rotulagem GHS da ONU e CRE da UE (1) (3). As normas de desempenho originais foram definidas após o estudo de validação (21) e baseiam-se no sistema de clas ­
sificação da UE estabelecido na Diretiva 2001/59/CE da Comissão, de 6 de 
agosto de 2001, que adapta ao progresso técnico pela vigésima oitava vez a Diretiva 67/548/CEE do Conselho, relativa à aproximação das disposições legislativas, regulamentares e administrativas respeitantes à classificação, 
embalagem e rotulagem das substâncias perigosas (
 1 ). Uma vez que, entre  ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 666  
( 1 ) JO L 225 de 21.8.2001, p. 1.
 a conclusão do estudo de validação e o termo da elaboração do presente 
método, se adotou o sistema GHS da ONU para a classificação e a rotulagem 
na UE (sistema CRE da UE) (3), atualizaram-se as normas de desempenho (8). A atualização incide, sobretudo, i) na lista de produtos químicos de referência prevista nas normas de desempenho e ii) nos valores definidos de fiabilidade 
e exatidão (2) (23).
 
NORMAS DE DESEMPENHO PARA MÉTODOS DE ENSAIO  IN VITRO  DE 
IRRITAÇÃO CUTÂNEA EM EPIDERME HUMANA RECONSTRUÍDA  
5. As normas de desempenho compreendem os seguintes três elementos 
principais:  
I) Componentes essenciais do método de ensaio  
II) Lista mínima de produtos químicos de referência  
III) Valores definidos de fiabilidade e de exatidão  
I) Componentes essenciais do método de ensaio  
6. Trata-se dos elementos essenciais, de natureza estrutural, funcional e pro ­
cessual, dos métodos validados, que têm de constar do protocolo dos métodos propostos, mecanística e funcionalmente similares ou modifica ­
dos. Estes componentes incluem as especificidades do método, elementos 
críticos do procedimento de ensaio e medidas de controlo de qualidade. A incorporação dos componentes essenciais do método de ensaio contribui para garantir que um método similar ou modificado proposto se baseia em 
conceitos idênticos aos do método de referência validado (9). Nos pontos 
16 a 21 deste método, descrevem-se em pormenor os componentes essen ­
ciais do método de ensaio. Na realização dos ensaios deve ter-se em conta o seguinte:
 
— Condições gerais (ponto 16).  
— Condições funcionais, que incluem:  
— viabilidade (ponto 17),  
— função de barreira (ponto 18),  
— morfologia (ponto 19),  
— reprodutibilidade (ponto 20),  
— controlo de qualidade (ponto 21).  
II) Lista mínima de produtos químicos de referência  
7. Utilizam-se produtos químicos de referência para determinar se a fiabili ­
dade e a exatidão de um método de ensaio similar ou modificado proposto, 
que comprovadamente tenha uma semelhança suficiente, em termos estru ­
turais e funcionais, ao método de referência validado, ou que constitua uma modificação menor de um dos três métodos validados, são compará ­
veis ou melhores do que as do método de referência validado (2) (8) (16) 
(23). Os 20 produtos químicos de referência recomendados que constam 
do quadro 1 são representativos de várias classes químicas (categorias químicas definidas com base em grupos funcionais) e de toda a gama da escala de irritação de Draize (de não irritante a fortemente irritante). 
Os produtos químicos constantes da lista compreendem 10 da categoria 2 
do sistema GHS da ONU/CRE da UE e 10 «não classificados», dos quais três pertencentes à categoria 3 facultativa do sistema GHS da ONU. No âmbito do presente método, a categoria 3 facultativa é referida como 
«nenhuma categoria». Os produtos químicos que constam do quadro 1 
foram selecionados entre os utilizados na fase de otimização que se seguiu à pré-validação, bem como no estudo de validação do método de referên ­
cia, no que respeita aos grupos funcionais e ao estado físico (14) (18). Para 
avaliar a exatidão e a fiabilidade de métodos similares ou modificados 
propostos, devem utilizar-se, no mínimo, os produtos químicos de
 ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 667
 
referência; todavia, estes não devem ser utilizados no desenvolvimento de 
novos métodos. Se um produto químico constante da lista não estiver 
disponível, podem utilizar-se outros produtos químicos para os quais se disponha de dados  in vivo  de referência adequados, preferencialmente dos 
produtos químicos utilizados na fase de otimização que se seguiu à pré- 
-validação ou no estudo de validação do método de referência. Para avaliar 
melhor a exatidão de um método proposto, podem acrescentar-se à lista mínima de produtos químicos de referência outros produtos químicos, que sejam representativos de outras classes químicas e para os quais se dispo ­
nha de dados de referência  in vivo  adequados.
 
Quadro 1  
Lista mínima de produtos químicos de referência para quantificação da exatidão e fiabilidade de métodos 
similares ou modificados de irritação cutânea em epiderme humana reconstruída  ( 1 ). 
Produto químico Número CAS Estado Pontuação  in vivo  Categoria no 
método de 
referência 
validado in vitro Categoria GHS da 
ONU/CRE da UE,  
in vivo  
1-Bromo4-clorobutano 6940-78-9 Líquido 0 Categoria 2 Nenhuma 
Ftalato de dietilo 84-66-2 Líquido 0 Nenhuma Nenhuma 
Ácido naftalenoacético 86-87-3 Sólido 0 Nenhuma Nenhuma 
Fenoxiacetato de alilo 7493-74-5 Líquido 0,3 Nenhuma Nenhuma 
Isopropanol 67-63-0 Líquido 0,3 Nenhuma Nenhuma 4-(Metiltio)benzaldeído 3446-89-7 Líquido 1 Categoria 2 Nenhuma 
Estearato de metilo 112-61-8 Sólido 1 Nenhuma Nenhuma 
Butirato de heptilo 5870-93-9 Líquido 1,7 Nenhuma Nenhuma 
Salicilato de hexilo 6259-76-3 Líquido 2 Nenhuma Nenhuma 
Cinamaldeído 104-55-2 Líquido 2 Categoria 2 Nenhuma 
(categoria 3 
facultativa ) (
 3 ) 
1-Decanol  ( 2 ) 112-30-1 Líquido 2,3 Categoria 2 Categoria 2  
Ciclamenaldeído 103-95-7 Líquido 2,3 Categoria 2 Categoria 2 
1-Bromo-hexano 111-25-1 Líquido 2,7 Categoria 2 Categoria 2 
Cloridrato de 2-clorome ­
til3,5-dimetil4-metoxipiridina 86604-75-3 Sólido 2,7 Categoria 2 Categoria 2  
Dissulfureto de di- n-propilo 629-19-6 Líquido 3 Nenhuma Categoria 2  
Hidróxido de potássio (solu ­
ção aquosa a 5 %) 1310-58-3 Líquido 3 Categoria 2 Categoria 2 
5-(1,1-Dimetiletil)-2-metil ­
benzenotiol 7340-90-1 Líquido 3,3 Categoria 2 Categoria 2 
1-Metil3-fenil1-piperazina 5271-27-2 Sólido 3,3 Categoria 2 Categoria 2  ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 668
 
Produto químico Número CAS Estado Pontuação  in vivo  Categoria no 
método de 
referência 
validado in vitro Categoria GHS da 
ONU/CRE da UE,  
in vivo  
Heptanal 111-71-7 Líquido 3,4 Categoria 2 Categoria 2 
Tetracloroetileno 127-18-4 Líquido 4 Categoria 2 Categoria 2  
( 1 ) Critérios de seleção dos produtos químicos: i) disponibilidade comercial, ii) representatividade no que respeita a toda a gam a da 
escala de irritação de Draize (de não irritante a fortemente irritante), iii) estrutura química bem definida, iv) representativ idade ao 
nível das classes funcionais utilizadas no processo de validação e v) exclusão de perfis extremamente tóxicos (por exemplo, 
carcinogenicidade ou toxicidade para o aparelho reprodutor) e de custos de eliminação proibitivos. 
( 2 ) Produtos químicos irritantes no coelho, mas comprovadamente não irritantes do ser humano (31) (32) (33). 
( 3 ) No âmbito do sistema GHS da ONU, mas não do sistema CRE da UE.  
III) Valores definidos de fiabilidade e de exatidão  
8. A fim de se determinar a fiabilidade e adequação de métodos similares ou 
modificados propostos, a transferir entre laboratórios, é necessário ensaiar 
os 20 produtos químicos de referência constantes do quadro 1 em, pelo 
menos, três laboratórios. Todavia, se o método proposto se destinar a ser utilizado apenas num laboratório, a validação não carece do ensaio em vários laboratórios. É, no entanto, essencial que os estudos de validação 
sejam avaliados de forma independente por organismos de validação reco ­
nhecidos a nível internacional, em observância das diretrizes internacionais (9). É necessário ensaiar em cada laboratório os 20 produtos químicos de referência, em três séries de ensaios independentes, com lotes de tecidos 
diferentes e suficientemente intervalados em termos cronológicos. Cada 
série consiste no ensaio em paralelo de, pelo menos, três replicados de tecidos por produto químico, controlo negativo e controlo positivo.
 
9. O cálculo dos valores de fiabilidade e de exatidão do método proposto 
deve ter em conta os quatro critérios a seguir indicados, a fim de garantir o cálculo coerente dos valores de fiabilidade e de adequação do modo pre ­
viamente definido.
 
1. No cálculo da capacidade de previsão (exatidão) e da variabilidade intra 
e interlaboratoriais do método, apenas podem utilizar-se dados de séries 
de ensaios completas.  
2. Para se estabelecer a classificação final da cada produto químico de 
referência em cada laboratório participante, utiliza-se o valor médio de 
viabilidade correspondente aos vários ensaios das séries de ensaios 
completas.  
3. No cálculo da variabilidade interlaboratorial do método, apenas podem 
ser utilizados dados correspondentes a produtos químicos para os quais tenham sido completadas séries de ensaios em todos os laboratórios participantes.
 
4. O cálculo dos valores de exatidão é efetuado com base nas previsões 
efetuadas em cada laboratório participante, para os 20 produtos quími ­
cos de referência.  
Neste contexto, entende-se por « série de ensaios » três ensaios indepen ­
dentes efetuados num laboratório a um produto químico em estudo. 
Entende-se por « série de ensaios completa » uma sequência de três en ­
saios válidos, efetuada num laboratório, a um produto químico em estudo. Significa isto que um ensaio inválido invalida toda a série de três ensaios efetuados em sequência.
 
Reprodutibilidade intralaboratorial  
10. Ao determinar a reprodutibilidade intralaboratorial num laboratório, a con ­
cordância, nesse laboratório, das classificações (categoria 2 do sistema GHS da ONU/CRE da UE e nenhuma categoria) obtidas em séries de 
ensaios diferentes e independentes realizadas aos 20 produtos químicos 
de referência deve ser igual ou superior a 90 %.
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Reprodutibilidade interlaboratorial  
11. Se o método de ensaio proposto se destinar a ser utilizado num único labo ­
ratório, não é necessário determinar a reprodutibilidade interlaboratorial. 
No caso dos métodos a transferir para outros laboratórios, a concordância entre – de preferência – pelo menos três laboratórios nas classificações (ca ­
tegoria 2 do sistema GHS da ONU/CRE da UE e nenhuma categoria) obtidas 
em séries de ensaios diferentes e independentes realizadas aos 20 produtos 
químicos de referência deve ser igual ou superior a 80 %.
 
Capacidade de previsão (exatidão)  
12. A exatidão (sensibilidade, especificidade e exatidão global) do método 
similar ou modificado proposto deve ser comparável à do método de referência validado ou melhor do que a deste, tendo em conta dados 
adicionais sobre a adequação à espécie em causa (quadro 2). A sensibili ­
dade deve ser igual ou superior a 80 % (2) (8) (23). Todavia, a sensibi ­
lidade do método  in vitro  proposto é objeto de uma restrição suplementar 
específica: a classificação «nenhuma categoria» só pode ser erradamente 
atribuída por mais de um laboratório participante a dois produtos químicos 
da categoria 2  in vivo  (1-decanol  e dissulfureto de di-n-propilo ). A espe ­
cificidade deve ser igual ou superior a 70 % (2) (8) (23). Não há outras 
restrições à especificidade do método  in vitro  proposto, ou seja, qualquer 
laboratório participante pode classificar erradamente um produto químico na rubrica «nenhuma categoria» in vivo , desde que a especificidade final do 
método de ensaio se situe no intervalo aceitável. A exatidão global deve 
ser igual ou superior a 75 % (2) (8) (23). Embora a sensibilidade do 
método de referência validado, calculada para os 20 produtos químicos de referência constantes da lista do quadro 1, seja de 90 %, fixou-se em 80 % a sensibilidade mínima exigida a qualquer método similar ou modi ­
ficado para que se considere válido, pois tanto o  1-decanol  (produto 
químico inconclusivo) como o  dissulfureto de di-n-propilo  (falso negativo 
no método de referência validado) são reconhecidamente não-irritantes para o ser humano (31) (32) (33), apesar de os resultados do ensaio no 
coelho levarem a considerá-los irritantes. Uma vez que os modelos de 
epiderme humana reconstruída se baseiam em células humanas, podem considerar ambos os produtos químicos «não-irritantes» (rubrica «nenhuma categoria» no sistema GHS da ONU/CRE da UE).
 
Quadro 2  
Valores de capacidade de previsão exigidos, em termos de sensibilidade, especificidade e 
exatidão global, para que um método similar ou modificado seja considerado válido.  
Sensibilidade Especificidade Exatidão global  
≥ 80 % ≥ 70 % ≥ 75 %  
Critérios de aceitação do estudo  
13. Pode dar-se o caso de um ou mais ensaios, relativos a um ou mais 
produtos químicos em estudo, não cumprirem os critérios de aceitação 
dos ensaios no que respeita ao(s) produto(s) químico(s) em estudo ou de 
controlo ou não serem aceitáveis por outras razões. Para substituir os dados em falta, é admissível a realização de, no máximo, dois ensaios suplementares («reensaio») por produto químico em estudo. Assim, uma 
vez que, em caso de reensaio, também é necessário ensaiar em paralelo os 
produtos químicos de controlo positivo e negativo, pode efetuar-se um máximo de duas séries de ensaios suplementares por cada produto químico em estudo.
 
14. Pode também dar-se o caso de, mesmo depois do reensaio, não ser pos ­
sível obter o mínimo de três séries válidas, exigido para cada produto 
químico estudado, no respeitante a todos os produtos químicos de referên ­
cia e a todos os laboratórios participantes, daí resultando uma matriz de dados incompleta. Nessa eventualidade, os dados obtidos poderão ser 
considerados aceitáveis se forem cumpridos os três critérios seguintes:
 
1. Foi completada pelo menos uma série de ensaios para cada um dos 20 
produtos químicos de referência.  ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 670
 
2. Em todos os laboratórios participantes (no mínimo três), foram com ­
pletadas, pelo menos, 85 % das séries de ensaios (sendo 20 o número 
de produtos químicos, admitem-se 3 séries de ensaios inválidas por laboratório).
 
3. Foram completadas, no mínimo, 90 % de todas as séries de ensaios 
possíveis em, pelo menos, três laboratórios (sendo 20 o número de 
produtos químicos ensaiados em 3 laboratórios, admitem-se no total 6 séries de ensaios inválidas).
 ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 671
 
B.47  MÉTODO DE ENSAIO DE OPACIDADE E PERMEABILIDADE DA 
CÓRNEA EM BOVINOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE SUBSTÂN ­
CIAS QUE PRODUZAM CORROSÃO OU FORTE IRRITAÇÃO 
OCULAR  
INTRODUÇÃO  
1. O método de ensaio de opacidade e permeabilidade da córnea em 
bovinos (BCOP) é um método  in vitro  que, em determinadas circunstân ­
cias e dentro de certos limites, pode ser utilizado para atribuir a subs ­
tâncias e misturas a classificação de «substância corrosiva ou fortemente 
irritante ocular» (1) (2) (3). Para efeitos do presente método, considera-se «substância fortemente irritante» uma substância irritante que induz no coelho lesões oculares que permanecem durante pelo menos 21 dias 
após a aplicação. Embora não esteja validado para substituir completa ­
mente o ensaio ocular  in vivo  no coelho, recomenda-se a integração do 
método BCOP numa estratégia de ensaio por etapas para a classificação e rotulagem regulamentares, dentro do domínio de aplicabilidade especifi ­
cado (4) (5). Sem necessidade de ensaios complementares no coelho, pode 
atribuir-se às substâncias e misturas em estudo (6) a classificação de subs ­
tância corrosiva ou fortemente irritante ocular. Uma substância que dê resultado negativo terá de ser ensaiada no coelho pela estratégia de ensaio 
sequencial descrita no  Test Guideline 405  da OCDE (7) (capítulo B.5 do 
presente anexo).
 
2. Pretende-se na descrição deste método de ensaio explicar o processo uti ­
lizado para avaliar o potencial de corrosão ou forte irritação ocular de uma 
substância, medido pela sua capacidade de indução de opacidade e de 
aumento de permeabilidade em córneas de bovino isoladas. Medem-se os efeitos tóxicos na córnea do seguinte modo: i) redução da transmissão de luz (opacidade) e ii) aumento da passagem do corante fluoresceína 
sódica (permeabilidade). Combinam-se os resultados das determinações 
de opacidade e de permeabilidade da córnea após exposição à substância em estudo, de modo a obter a pontuação de irritação  in vitro  (IVIS) 
correspondente, que é utilizada para classificar o nível de irritação causado 
pela substância.
 
3. Também foram ensaiados pelo método BCOP substâncias irritantes ocu ­
lares indutoras de lesões que desaparecem em menos de 21 dias, assim como substâncias não-irritantes. A exactidão e a fiabilidade do método 
BCOP não foram, porém, formalmente avaliadas na aplicação do método 
a substâncias destas categorias.
 
4. Estabelecem-se definições no apêndice 1.  
CONSIDERAÇÕES INICIAIS E LIMITAÇÕES  
5. Este método de ensaio baseia-se no protocolo do método BCOP do ICC ­
VAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alterna ­
tive Methods) (8), que foi elaborado no seguimento de um estudo de 
validação internacional (4) (5) (9) e contou com contributos do ECVAM (European Centre for the Validation of Alternative Methods) e do JaC ­
VAM (Japanese Center for the Validation of Alternative Methods). O 
protocolo baseia-se na informação obtida do Institute for In Vitro 
Sciences (IIVS) e no Protocolo 124 do INVITTOX (10), utilizado no estudo de prevalidação do ensaio BCOP que foi efectuado em 1997- -1998 com o patrocínio da Comunidade Europeia. Ambos os protocolos 
se baseiam na metodologia de ensaio BCOP, descrita pela primeira vez por 
Gautheron  et al.  (11).
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6. As limitações identificadas deste método de ensaio decorrem das elevadas 
taxas de falsos positivos no caso dos álcoois e das cetonas e da elevada 
taxa de falsos negativos no caso dos sólidos, observadas na base de dados de validação (ver o ponto 44) (5). Excluindo da base de dados as subs ­
tâncias dessas classes físico-químicas, aumenta substancialmente a exacti ­
dão do método BCOP nos sistemas de classificação UE, EPA e GHS (5). 
Atendendo aos objectivos do ensaio (apenas a identificação de substâncias corrosivas/fortemente irritantes oculares), a taxa de falsos negativos não é um aspecto crítico, pois as substâncias seriam a seguir ensaiadas no coelho 
ou por outros métodos  in vitro  adequadamente validados, conforme as 
disposições regulamentares, por recurso a uma estratégia de ensaio sequen ­
cial baseada na ponderação da suficiência da prova. Acresce que a base de dados de validação actualmente disponível não permite uma avaliação 
adequada de algumas classes químicas ou classes de produtos (por exem ­
plo, misturas). Os investigadores podem, no entanto, ponderar o recurso a este método para todos os tipos de matérias (incluindo misturas), aceitando um resultado positivo como um indício de reacção corrosiva ou fortemente 
irritante ocular. Porém, os resultados positivos obtidos no caso de álcoois 
ou cetonas devem ser interpretados com cautela, devido ao risco de não serem efectivamente positivos em todos os casos que o indiciem.
 
7. Na manipulação de olhos e córneas de bovino devem seguir-se as regras e 
procedimentos estabelecidos no laboratório para a manipulação de matérias 
de origem animal (tecidos, fluidos biológicos, etc.). Recomenda-se a apli ­
cação das precauções gerais inerentes à prática laboratorial (12).  
8. Uma limitação deste método de ensaio é o facto de que, embora tenha em 
conta alguns efeitos oculares avaliados pelo método de ensaio da irritação ocular no coelho e, em certa medida, a gravidade desses efeitos, não tem em conta as lesões na conjuntiva ou na íris. Por outro lado, embora a 
reversibilidade das lesões da córnea não possa ser avaliada  per se  no 
ensaio BCOP, foi proposta, com base em estudos oculares no coelho, a possibilidade de se recorrer à avaliação da profundidade inicial da lesão da córnea para estabelecer uma distinção entre efeitos reversíveis e efeitos 
irreversíveis (13). Finalmente, o método BCOP não permite avaliar o 
potencial de toxicidade sistémica associado à exposição ocular.
 
9. Prosseguem os trabalhos com vista à melhor caracterização da utilidade e 
das limitações do ensaio BCOP na identificação de matérias não forte ­
mente irritantes ou não-irritantes (ver também o ponto 45). Incentiva-se os 
utilizadores do método a fornecerem espécimes e/ou dados a organizações de validação, para que seja avaliada formalmente a possibilidade de outras utilizações futuras do método BCOP, designadamente na identificação de 
matérias não fortemente irritantes e de matérias não-irritantes.
 
10. Os laboratórios que comecem a utilizar este ensaio devem recorrer às 
substâncias químicas para demonstração de competência técnica recomen ­
dadas no apêndice 2. Antes de apresentarem dados obtidos pelo método 
BCOP para efeitos da classificação regulamentar de perigosidade, os la ­
boratórios podem recorrer às referidas substâncias para demonstrar a sua competência técnica na execução deste método.
 
PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
11. O método BCOP assenta num modelo organotípico de manutenção  in vitro  
das funções fisiológicas e bioquímicas normais da córnea de bovino por um período curto. Neste método de ensaio, as lesões provocadas pela substância em estudo são avaliadas por meio de medições quantitativas, 
respectivamente com um opacímetro e um espectrofotómetro de luz visí ­
vel, das alterações de opacidade e permeabilidade da córnea. Ambas as medições são utilizadas para calcular uma IVIS, com base na qual se atribui uma categoria de classificação de perigo de irritação  in vitro , uti­
lizada como previsão do potencial de irritação ocular  in vivo  da substância 
em estudo (ver Critérios de decisão).
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12. O método BCOP utiliza córneas retiradas de olhos de bovinos acabados de 
abater. Determina-se quantitativamente a opacidade da córnea medindo a 
quantidade de luz transmitida através da mesma. Determina-se quantitati ­
vamente a permeabilidade da córnea medindo a quantidade do corante fluoresceína sódica, detectada no meio de ensaio da câmara posterior, 
que atravessa totalmente a córnea. Aplicam-se as substâncias em estudo 
na superfície epitelial da córnea introduzindo-as na câmara anterior do suporte de córnea. Figura no apêndice 3 uma descrição e um diagrama de um suporte de córnea utilizado no método BCOP. Os suportes de 
córnea podem ser adquiridos no comércio, de origens diversas, ou podem 
ser construídos.
 
Origem e idade dos olhos de bovino e selecção da espécie animal  
13. O gado enviado para os matadouros é normalmente abatido para consumo 
humano ou outras utilizações comerciais. Só podem ser utilizados na 
colheita de córneas para o método BCOP animais saudáveis considerados 
adequados para entrarem na cadeia alimentar humana. Dado que o peso dos bovinos é muito variável, consoante a raça, a idade e o sexo, não é recomendado qualquer peso do animal no momento do abate.
 
14. As córneas podem apresentar variações dimensionais devido à utilização 
de animais de idades diversas. As córneas de bovinos com mais de oito anos têm geralmente um eixo horizontal superior a 30,5 mm e espessura central (CCT) ≥ 1 100 μm; de bovinos com menos de cinco anos, têm 
geralmente um eixo horizontal inferior a 28,5 mm e CCT < 900 μm (14). 
Por essa razão, não são habitualmente utilizados olhos de bovinos com mais de 60 meses. Normalmente também não se utilizam olhos de bovinos com menos de doze meses, dado que os olhos se encontram ainda em 
desenvolvimento e a espessura e o diâmetro da córnea são bastante infe ­
riores aos registados para olhos de gado adulto. Porém, admite-se a utili ­
zação de córneas de animais jovens (6 a 12 meses de idade), por haver algumas vantagens, como maior facilidade de obtenção, um intervalo etá ­
rio estreito e menor perigo de exposição potencial dos trabalhadores à 
encefalopatia espongiforme bovina (BSE) (15). Dado que seria útil avaliar melhor o efeito da dimensão ou espessura da córnea na reacção a subs ­
tâncias corrosivas ou irritantes, incentivam-se os utilizadores a indicarem a 
idade e/ou o peso estimados dos animais de origem das córneas utilizadas 
no estudo.
 
Colheita e transporte dos olhos para o laboratório  
15. A colheita dos olhos é efectuada por empregados do matadouro. Para 
minimizar lesões mecânicas ou outros danos aos olhos, estes devem ser 
retirados das órbitas o mais rapidamente possível depois da morte. Para 
evitar que os olhos sejam expostos a substâncias potencialmente irritantes, os empregados do matadouro não devem utilizar detergentes na lavagem da cabeça do animal.
 
16. Utilizando um recipiente de tamanho adequado, mergulham-se os olhos 
completamente em solução HBSS (Hanks’ Balanced Salt Solution) e transportam-se para o laboratório de uma maneira que minimize a dete ­
rioração e a contaminação bacteriana. Como são colhidos durante o pro ­
cesso de abate, os olhos podem ser expostos a sangue e outras substâncias 
biológicas, incluindo bactérias e outros microrganismos. Importa, pois, minimizar o risco de contaminação (por exemplo, mantendo o recipiente dos olhos em gelo fundente, adicionando antibióticos – tais como penici ­
lina a 100 UI/ml e estreptomicina a 100 mg/ml – ao HBSS utilizado para 
mergulhar os olhos durante o transporte).
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17. O intervalo entre a colheita dos olhos e a utilização das córneas no método 
BCOP deve ser mínimo (normalmente os olhos devem ser colhidos e 
utilizados no mesmo dia) e não deve, comprovadamente, comprometer os resultados do ensaio. Os resultados dos ensaios estão relacionados com os critérios de selecção dos olhos e com as reacções às amostras 
de controlo positivas e negativas. Os olhos utilizados num ensaio devem 
ser todos do mesmo grupo de colheita num determinado dia.
 
Critérios de selecção dos olhos utilizados no método BCOP  
18. Uma vez chegados ao laboratório, examinam-se cuidadosamente os olhos 
para detectar eventuais defeitos, nomeadamente aumento de opacidade, 
escoriações e neovascularização. Só podem ser utilizadas córneas de olhos sem estes defeitos.
 
19. Também se avalia a qualidade da córnea em fases posteriores do ensaio. 
Descartam-se as córneas que, após um período inicial de uma hora para estabelecimento do equilíbrio, apresentem opacidade superior a sete uni ­
dades (NOTA: calibrar o opacímetro com os padrões de opacidade utili ­
zados para estabelecer as unidades de opacidade – ver o apêndice 3).
 
20. Cada grupo de tratamento (substância em estudo e amostras de controlo 
positivas e negativas correspondentes) é constituído por um mínimo de três 
olhos. Utilizam-se três córneas para amostras de controlo negativas de córnea no ensaio BCOP. Como as córneas são excisadas do globo ocular e colocadas nas câmaras, há potencial para a formação de artefactos re ­
sultantes da manipulação, com incidência nos valores individuais de opa ­
cidade e permeabilidade da córnea (incluindo as amostras de controlo negativas). Os valores de opacidade e permeabilidade das córneas das 
amostras de controlo negativas são utilizados para corrigir os valores de 
opacidade e permeabilidade da córnea da matéria em estudo e das amos ­
tras tratadas para controlo positivo utilizados no cálculo da IVIS.
 
PROCEDIMENTO  
Preparação dos olhos  
21. Dissecam-se córneas sem defeitos, deixando uma orla de 2-3 mm de 
esclerótica, para facilitar o manuseamento, e tomando as precauções ne ­
cessárias para não danificar o epitélio e o endotélio da córnea. Coloca-se 
cada córnea num suporte especialmente desenhado, constituído por um 
compartimento anterior e um compartimento posterior. O primeiro estabe ­
lece uma interface com a superfície epitelial da córnea; o segundo, com a superfície endotelial da mesma. Enchem-se as duas câmaras, até transbor ­
dar, com Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM), previamente aque ­
cido, começando pela câmara posterior e evitando a formação de bolhas. Coloca-se em seguida a dispositivo à temperatura de 32 ± 1 °C durante uma hora, para que as córneas fiquem em equilíbrio com o meio e, tanto 
quanto possível, readquiram a sua actividade metabólica normal (a tempe ­
ratura aproximada da superfície da córnea  in vivo  é de 32 °C).
 
22. Depois de terminado o período previsto para se atingir o equilíbrio, 
adiciona-se EMEM fresco pré-aquecido a ambas as câmaras e efectua-se 
a leitura da linha de base de opacidade para cada córnea. Descartam-se as córneas que evidenciem lesões macroscópicas dos tecidos (por exemplo, escoriações, pigmentação ou neovascularização) ou opacidade superior a 
7 unidades. Calcula-se a opacidade média de todas as córneas equilibradas. 
Seleccionam-se para córneas de controlo negativas (ou de controlo do solvente) pelo menos três córneas cujo valor de opacidade seja próximo do valor da mediana de todas as córneas. Distribuem-se a seguir as córneas 
restantes em dois grupos: córneas a submeter ao tratamento e córneas de 
controlo positivas.
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23. Dado que a sua capacidade calorífica é superior à do ar, a água oferece 
condições de temperatura mais estáveis para incubação. Recomenda-se, 
portanto, a utilização de um banho-maria para manter o suporte de córnea e o seu conteúdo a 32 ± 1 °C. Admite-se, porém, a utilização de incuba ­
dores a ar, tomando as precauções necessárias para manter a temperatura 
estável (por exemplo, aquecendo previamente os suportes e o meio de 
ensaio).
 
Aplicação da substância em estudo  
24. Utiliza-se um protocolo de tratamento para líquidos e matérias tensioacti ­
vas (sólidas ou líquidas) e outro para sólidos não-tensioactivos.  
25. Os líquidos são ensaiados sem diluição; as matérias tensioactivas são 
ensaiadas à concentração de 10 % (m/v) numa solução a 0,9 % de cloreto 
de sódio, em água destilada ou noutro solvente comprovadamente sem 
efeitos adversos no sistema de ensaio. Os semi-sólidos, cremes e ceras são normalmente ensaiados como se fossem líquidos. É necessário justifi ­
car convenientemente o recurso a outra diluição. Expõem-se as córneas aos 
líquidos e matérias tensioactivas durante 10 minutos. Se forem utilizados 
tempos de exposição diferentes, será necessário justificá-lo em termos científicos.
 
26. Os sólidos não-tensioactivos são normalmente ensaiados em solução ou 
suspensão, à concentração de 20 %, numa solução a 0,9 % de cloreto de 
sódio, em água destilada ou noutro solvente comprovadamente sem efeitos adversos no sistema de ensaio. Em determinadas circunstâncias e mediante 
justificação científica adequada, também pode ensaiar-se um sólido tal e 
qual, por aplicação directa na superfície da córnea pelo método da câmara aberta (ponto 29). Expõem-se as córneas aos sólidos durante quatro horas, mas, tal como no caso dos líquidos e dos produtos tensioactivos, podem 
utilizar-se tempos de exposição diferentes, que será necessário justificar 
em termos científicos.
 
27. Podem utilizar-se diversos métodos de tratamento, consoante a natureza 
física e as características químicas (sólidos, líquidos, líquidos viscosos ou 
não-viscosos, etc.) da substância em estudo. O aspecto crítico é garantir 
que a substância cobre adequadamente a superfície epitelial e é adequa ­
damente removida na fase de lavagem. Utiliza-se normalmente um método 
de câmara fechada para o ensaio de líquidos não-viscosos ou ligeiramente 
viscosos e um método de câmara aberta para o ensaio de líquidos semi-viscosos ou viscosos, bem como para sólidos tal e qual.
 
28. No método da câmara fechada, introduz-se na câmara anterior, através dos 
orifícios de dosagem existentes na parte de cima desta, uma quantidade de 
substância em estudo suficiente para cobrir a superfície epitelial da córnea (750 μl), fechando em seguida os orifícios com as tampas respectivas 
durante a exposição. É importante que cada córnea seja exposta à subs ­
tância em estudo durante o período adequado.
 
29. No método da câmara aberta, removem-se antes do tratamento a janela de 
vidro e o anel de fixação da janela da câmara anterior. Com uma micro ­
pipeta, aplica-se a substância em estudo ou de controlo directamente na 
superfície epitelial da córnea (750 μl ou um volume de substância em 
estudo suficiente para cobrir completamente a córnea). Se for difícil pipe ­
tar a substância em estudo, pode introduzir-se esta sob pressão numa 
pipeta volumétrica, para facilitar a dosagem. Para que a matéria em causa 
possa ser introduzida sob pressão na ponta da pipeta volumétrica, insere-se esta ponta na ponta da seringa. Pressiona-se o êmbolo da seringa e, simultaneamente, puxa-se o pistão da pipeta para cima. Se se formarem 
bolhas de ar na ponta da pipeta, remove-se (expulsa-se) a matéria em 
estudo e repete-se o processo, até a ponta da pipeta ficar cheia sem bolhas de ar. Se necessário, pode utilizar-se uma seringa normal (sem agulha), pois permite medir um volume exacto da substância em estudo e facilita a 
aplicação na superfície epitelial da córnea. Depois da dosagem, recoloca-se 
a janela de vidro na câmara anterior, para recriar um sistema fechado.
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Incubação após a exposição  
30. Após o período de exposição, removem-se da câmara anterior a substância 
em estudo, a amostra de controlo negativa ou a substância de controlo 
positiva e lava-se o epitélio pelo menos três vezes (ou até deixar de se ver substância em estudo) utilizando EMEM com vermelho de fenol. Utiliza-se na lavagem meio de ensaio com vermelho de fenol porque 
pode seguir-se a evolução cromática do vermelho de fenol para determinar 
a eficácia de lavagem de matérias ácidas ou alcalinas. Lavam-se as córneas mais de três vezes se a cor do vermelho de fenol continuar alterada (amarelo ou púrpura) ou a substância em estudo ainda for visível. Quando 
o meio já não contiver a substância em estudo, lavam-se as córneas uma 
última vez utilizando EMEM sem vermelho de fenol, para garantir a remoção deste último da câmara anterior antes da medição de opacidade. Volta então a encher-se a câmara anterior com EMEM fresco sem verme ­
lho de fenol.
 
31. No caso dos líquidos ou das matérias tensioactivas, após a lavagem, 
incubam-se as córneas durante mais duas horas a 32 ± 1 °C. Em deter ­
minadas circunstâncias, pode ser útil um tempo de incubação mais longo 
depois da exposição, a ponderar caso a caso. As córneas tratadas com 
sólidos são bem lavadas no final do período de exposição de quatro horas, mas não é necessária incubação suplementar.
 
32. Regista-se a opacidade e permeabilidade de cada córnea logo que terminar 
o período de incubação após a exposição, no caso dos líquidos e das 
matérias tensioactivas, ou o período de exposição de quatro horas, no 
caso dos sólidos não-tensioactivos. Examina-se ainda visualmente cada córnea e registam-se as observações pertinentes (descamação de tecidos, 
resíduos da substância em estudo, perfil de opacidade não-uniforme, etc.). 
Estas observações podem ser importantes, pois são passíveis de se tradu ­
zirem em variações nas leituras do opacímetro.
 
Substâncias de controlo  
33. Incluem-se em cada ensaio amostras de controlo positivas e negativas (ou 
do solvente/veículo) correspondentes.  
34. Ao ensaiar pelo método BCOP substâncias líquidas a 100 %, utiliza-se 
uma amostra de controlo negativa correspondente (por exemplo, solução a 0,9 % de cloreto de sódio ou água destilada), para possibilitar a detecção de alterações inespecíficas do sistema de ensaio e estabelecer uma linha de 
base para os parâmetros a determinar no ensaio. Essa amostra de controlo 
visa igualmente evitar que as condições do ensaio provoquem, inadequa ­
damente, uma reacção de irritação.
 
35. Ao ensaiar líquidos, matérias tensioactivas ou sólidos diluídos, inclui-se no 
método BCOP um grupo correspondente de amostras de controlo do 
veículo/solvente, para possibilitar a detecção de alterações inespecíficas do sistema de ensaio e estabelecer uma linha de base para os parâmetros a determinar no ensaio. Só podem utilizar-se solventes/veículos que, com ­
provadamente, não tenham efeitos adversos no sistema de ensaio.
 
36. Para verificar se é induzida uma reacção apropriada, inclui-se em cada 
ensaio uma substância irritante ocular conhecida, para servir de amostra de controlo positiva correspondente. Como o ensaio BCOP é utilizado neste 
método de ensaio para identificar substâncias corrosivas ou fortemente 
irritantes, idealmente a amostra de controlo positiva deverá ser uma subs ­
tância de referência que induza uma reacção forte ao aplicar-se-lhe o método. Porém, para que possa determinar-se a variabilidade no tempo 
da reacção à referida amostra de controlo positiva, a reacção de irritação 
não deve ser excessivamente forte.
 
37. Podem ser utilizadas como amostras de controlo positivas para substâncias 
em estudo líquidas, por exemplo, dimetilformamida ou solução a 1 % de hidróxido de sódio. Como amostra de controlo positiva para substâncias 
em estudo sólidas pode ser utilizada, por exemplo, solução a 0,9 % de 
cloreto de sódio.
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38. As substâncias de referência são úteis para avaliar o potencial de irritação 
ocular de produtos químicos desconhecidos de uma determinada classe 
química, ou classe de produtos, ou para avaliar o potencial de irritação relativo de uma substância irritante ocular numa determinada gama de reacções de irritação.
 
Parâmetros medidos  
39. Determina-se a opacidade com base na quantidade de luz transmitida 
através da córnea. Determina-se quantitativamente a opacidade da córnea medindo-a com um opacímetro numa escala contínua de valores de opa ­
cidade.
 
40. Determina-se a permeabilidade com base na quantidade do corante fluo ­
resceína sódica que penetra em todas as camadas celulares da córnea (ou seja, desde o epitélio da superfície exterior da córnea até ao endotélio da 
superfície interior da mesma). Coloca-se 1 ml de solução de fluoresceína 
sódica (4 ou 5 mg/ml, consoante se ensaiem líquidos ou matérias tensioac ­
tivas, por um lado, ou sólidos não-tensioactivos, por outro) na câmara anterior do suporte de córnea, que estabelece uma interface com a super ­
fície epitelial da córnea. Enche-se com EMEM fresco a câmara posterior, 
que estabelece uma interface com a superfície endotelial da córnea. Incuba-se a seguir o suporte, em posição horizontal, durante 90±5 minutos, a 32±1 °C. Determina-se quantitativamente, por espectrofotometria UV/ ­
VIS, a quantidade de fluoresceína sódica que atravessa a córnea para a 
câmara posterior. Os valores das medições espectrofotométricas a 490 nm são registados numa escala contínua de absorvância ou densidade óptica (DO
 490 ). Determinam-se os valores de permeabilidade à fluoresceína uti ­
lizando os valores de DO  490 obtidos com um espectrofotómetro de luz 
visível num percurso óptico normalizado de 1 cm.  
41. Em alternativa, pode utilizar-se um dispositivo de leitura constituído por 
uma placa de microtitulação de 96 alvéolos, desde que: i) seja possível 
estabelecer uma gama de linearidade do leitor de placa para a determina ­
ção de valores de DO  490 da fluoresceína; e ii) se utilize na placa de 96 
alvéolos o volume de amostras de fluoresceína que permite obter correc ­
tamente valores de DO  490 equivalentes aos obtidos com o percurso óptico 
normalizado de 1 cm (normalmente 360 ml, podendo ser necessário encher completamente os alvéolos).
 
DADOS E RELATÓRIOS  
Avaliação dos dados  
42. Depois de se corrigirem os valores de opacidade e de permeabilidade 
média (DO  490 ) em função dos valores da opacidade de fundo e da per ­
meabilidade (DO  490 ) correspondente à amostra de controlo negativa, 
combinam-se numa fórmula empírica os valores médios de opacidade e 
de permeabilidade (DO  490 ) correspondentes a cada grupo de tratamento, a 
fim de calcular a respectiva pontuação de irritação  in vitro  (IVIS), do 
seguinte modo:  
IVIS = valor médio de opacidade + 15 × valor médio de permeabilidade 
(DO  490 ) 
Sina et al. (16) referiram que esta fórmula foi estabelecida com base em 
estudos no seu laboratório e interlaboratoriais. A fim de determinar a 
equação que melhor correlacionava os dados  in vivo  e in vitro , fez-se 
uma análise multivariada dos dados obtidos num estudo interlaboratorial de uma série de 36 compostos. Essa análise foi efectuada por cientistas de 
duas empresas distintas, que chegaram a duas equações praticamente idên ­
ticas.
 
43. Os valores de opacidade e de permeabilidade devem ser também avaliados 
independentemente uns dos outros, para determinar se a substância em 
estudo induz corrosividade ou irritação forte com base em apenas um 
dos dois parâmetros medidos.  ▼M2 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 678
 
Critérios de decisão  
44. Consideram-se corrosivas ou fortemente irritantes as substâncias que apre ­
sentem IVIS ≥ 55,1. Como referido no ponto 1, se não for possível atribuir 
a uma substância a classificação de substância corrosiva ou fortemente irritante ocular, será necessário efectuar mais ensaios para efeitos de clas ­
sificação e rotulagem. O método BCOP tem as seguintes características: 
exactidão global de 79 % (113/143) a 81 % (119/147), taxa de falsos 
positivos de 19 % (20/103) a 21 % (22/103) e taxa de falsos negativos de 16 % (7/43) a 25 % (10/40), comparativamente aos dados obtidos pelo método de ensaio ocular  in vivo  no coelho, classificados de acordo com os 
sistemas de classificação EPA (1), UE (2) ou GHS (3). Excluindo da base 
de dados determinadas substâncias de certas classes químicas (álcoois, cetonas) ou físicas (sólidos), a exactidão do método BCOP nos sistemas de classificação EPA, UE e GHS situa-se entre 87 % (72/83) e 92 % 
(78/85), a taxa de falsos positivos entre 12 % (7/58) e 16 % (9/56) e a 
taxa de falsos negativos entre 0 % (0/27) e 12 % (3/26).
 
45. Mesmo que não seja possível atribuir à substância em estudo a classifica ­
ção de corrosiva ou fortemente irritante ocular, os dados obtidos pelo método BCOP podem ser úteis, em conjugação com dados de ensaios 
oculares  in vivo  no coelho ou de ensaios  in vitro  adequadamente valida ­
dos, para melhor avaliar a utilidade e limitações do método de ensaio BCOP na identificação de matérias não fortemente irritantes ou não-irri ­
tantes (está em curso a elaboração de um documento de orientações sobre 
a utilização de métodos de ensaio de toxicidade ocular  in vitro ).
 
Critérios de aceitação do estudo  
46. Considera-se o ensaio aceitável se a IVIS correspondente à amostra de 
controlo positiva não se desviar da média histórica vigente mais que o dobro do desvio-padrão. Essa média deve ser actualizada pelo menos de três em três meses ou sempre que seja efectuado um ensaio aceitável num 
laboratório que não efectue estes ensaios com frequência (menos de uma 
vez por mês). Os valores de opacidade e permeabilidade correspondentes às amostras de controlo negativas ou do solvente/veículo devem ser in ­
feriores aos limites superiores estabelecidos para os valores de opacidade e 
permeabilidade de fundo de córneas de bovino tratadas com a matéria de 
controlo negativa e o solvente/veículo respectivos.
 
Relatório do ensaio  
47. O relatório do ensaio deve incluir as informações seguintes que sejam 
pertinentes na realização do estudo em causa:  
Substâncias em estudo e de controlo  
Denominação ou denominações químicas, como a denominação estrutural 
utilizada pelo Chemical Abstracts Service (CAS), seguida de outras deno ­
minações, se existirem;  
Número de registo CAS, se for conhecido;  
Grau de pureza e composição da substância ou mistura (em percentagem 
ponderal), se forem conhecidas;  
Propriedades físico-químicas (por exemplo, estado físico, volatilidade, pH, 
estabilidade, classe química, hidrossolubilidade) relevantes para a realiza ­
ção do estudo;  
Pré-tratamento das substâncias em estudo/de controlo, se for o caso (aque ­
cimento ou moagem, por exemplo);  
Estabilidade, se for conhecida.  ▼M2 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 679
 
Informações relativas ao patrocinador e ao laboratório  
Nome e endereço do patrocinador, do laboratório e do director do estudo;  
Indicação da origem dos olhos (ou seja, da instalação na qual foram 
colhidos);  
Condições de armazenagem e de transporte dos olhos (data-hora da co ­
lheita dos olhos, tempo decorrido até ao início dos ensaios, meios de 
transporte e condições de temperatura durante o transporte, antibióticos eventualmente utilizados, etc.);
 
Se forem conhecidas, especificidades dos animais nos quais os olhos 
foram colhidos (idade, sexo, peso, etc. do animal dador).  
Justificação do método de ensaio e do protocolo utilizados  
Integridade do método de ensaio  
Processo utilizado para garantir a integridade (exactidão e fiabilidade) do 
método de ensaio ao longo do tempo (por exemplo, ensaio periódico das substâncias para a demonstração de competência, utilização de dados his ­
tóricos das amostras de controlo positivas e negativas, etc.).
 
Critérios de aceitação de um ensaio  
Amostras de controlo positivas e negativas correspondentes situadas num 
intervalo aceitável, com base nos dados históricos;  
Se for aplicável, intervalos aceitáveis das amostras de referência de con ­
trolo correspondentes, com base nos dados históricos.  
Condições de ensaio  
Descrição do sistema de ensaio utilizado;  
Tipo de suporte de córnea utilizado;  
Informações sobre a calibração dos dispositivos utilizados para medir a opa ­
cidade e a permeabilidade (por exemplo, opacímetro e espectrofotómetro);  
Informações sobre as córneas de bovino utilizadas, incluindo declarações 
sobre a qualidade das mesmas;  
Pormenores sobre a execução do ensaio;  
Concentração ou concentrações das substâncias em estudo utilizadas;  
Descrição de eventuais modificações na execução do ensaio;  
Referência a dados históricos do modelo (amostras de controlo positivas e 
negativas, substâncias para a demonstração de competência, substâncias de referência, etc.);
 
Descrição dos critérios de avaliação utilizados.  
Resultados  
Quadro dos resultados correspondentes a cada amostra em estudo (por 
exemplo, valores de opacidade e de DO  490 e valor calculado da IVIS 
para a substância em estudo e para as amostras de controlo positivas, negativas e de referência (se for o caso), sob a forma de quadro, incluindo os dados correspondentes aos replicados efectuados, e médias ± 
desvio-padrão para cada ensaio);
 
Descrição de outros efeitos eventualmente observados.  
Discussão dos resultados  
Conclusões  
REFERÊNCIAS  
1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B- 
-96-001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.  ▼M2 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 680
 
2) Regulamento (CE) n.  o 1272/2008 do Parlamento Europeu e do Con ­
selho, de 16 de Dezembro de 2008, relativo à classificação, rotula ­
gem e embalagem de substâncias e misturas, que altera e revoga as Directivas 67/548/CEE e 1999/45/CE, e altera o Regulamento (CE) n.
 o 1907/2006, JO L 353 de 31.12.2008, p. 1.  
3) ONU (2007). Globally Harmonized System of Classification and 
Labelling of Chemicals (GHS). Second revised edition, New York 
& Geneva: United Nations Publications, 2007. Acessível em:  
http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_ 
e.html  
4) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retros ­
pective study on organotypic  in vitro  assays as screening tests to 
identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Acessível em:
 
http://ecvam.jrc.it/index.htm  
5) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and 
Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. 
Acessível em:
 
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm  
6) Regulamento (CE) n.  o 1907/2006 do Parlamento Europeu e do Con ­
selho, de 18 de Dezembro de 2006, relativo ao registo, avaliação, autorização e restrição dos produtos químicos (REACH), que cria a 
Agência Europeia dos Produtos Químicos, que altera a Directiva 
1999/45/CE e revoga o Regulamento (CEE) n.
 o 793/93 do Conselho 
e o Regulamento (CE) n.  o 1488/94 da Comissão, bem como a 
Directiva 76/769/CEE do Conselho e as Directivas 91/155/CEE, 
93/67/CEE, 93/105/CE e 2000/21/CE da Comissão, JO L 396 de 
30.12.2006, p. 1.  
7) OCDE (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of 
Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Acessível em:  
http://www.oecd.org/document/40/0,2340,en_2649_34377_37051 368 
_1_1_1_1,00.html  
8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Pro ­
tocol. Em: ICCVAM Test Method Evaluation Report -  In Vitro  
Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants 
and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Valida ­
tion of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. 
Acessível em:
 
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm  
9) ICCVAM (2006). Current Status of  In Vitro  Test Methods for Iden ­
tifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opa ­
city and Permeability Test Method. NIH Publication No.: 06-4512. 
Research Triangle Park: National Toxicology Program. Acessível 
em: 
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ 
ice.htm  
10) INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and Per ­
meability Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, 
Itália: European Centre for the Validation of Alternative 
Methods (ECVAM).  ▼M2 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 681
 
11) Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D., Sina, J. F. (1992). Bovine cor ­
neal opacity and permeability test: An  in vitro  assay of ocular irri ­
tancy.  Fundam. Appl. Toxicol.  18:442-449.  
12) Siegel, J. D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the 
Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). 
Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of In ­
fectious Agents in Healthcare Settings. Acessível em:  
http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf  
13) Maurer, J. K., Parker, R. D., Jester, J. V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and 
recommendations for the development of alternative assays.  Reg. 
Tox. Pharmacol.  36:106-117.  
14) Doughty, M. J., Petrou, S., Macmillan, H. (1995). Anatomy and 
morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse.  
Can. J. Zool.  73:2159-2165.  
15) Collee, J., Bradley, R. (1997). BSE: A decade on - Part I.  The 
Lancet  349:636-641.  
16) Sina, J. F., Galer, D. M., Sussman, R. S., Gautheron, P. D., Sargent, 
E. V., Leong, B., Shah, P. V., Curren, R. D., Miller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irri ­
tation test using pharmaceutical intermediates.  Fundam. Appl. Toxi ­
col. 26:20-31.
 
17) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of 
In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test 
Method. Acessível em:  
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm.  
18) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of 
In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
Irritants: Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Acessível em:  
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm  ▼M2 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 682
 
Apêndice 1  
DEFINIÇÕES  
Exactidão:  Grau de acordo entre os resultados do método de ensaio e os valores 
de referência aceites. Constitui uma medida da eficiência do método e um dos 
aspectos da «adequação». Este termo e o termo «concordância» são muitas vezes utilizados indistintamente para indicar a proporção de resultados correctos do método de ensaio.
 
Substância de referência:  Substância utilizada como padrão de comparação com 
a substância em estudo. Deve ter as seguintes propriedades: i) origem ou origens 
uniformes e fiáveis; ii) similaridade estrutural e funcional com a classe de subs ­
tâncias em estudo; iii) características físico-químicas conhecidas; iv) disponibili ­
dade de dados sobre os efeitos conhecidos; e v) potência conhecida situada na gama de reacção pretendida.
 
Córnea:  Parte transparente anterior do globo ocular que recobre a íris e a pupila 
e deixa passar a luz para o interior.  
Opacidade da córnea:  Medição do grau de opacidade da córnea depois de 
exposta à substância em estudo. Um aumento de opacidade da córnea é indicador de lesão da córnea. A opacidade pode ser avaliada subjectivamente, como é feito 
no ensaio ocular no coelho pelo método de Draize, ou objectivamente, utilizando 
um instrumento como um «opacímetro».
 
Permeabilidade da córnea:  Medição quantitativa da lesão epitelial da córnea 
por determinação da quantidade do corante fluoresceína sódica que atravessa 
todas as camadas celulares da córnea.  
Categoria 1 EPA:  Acção corrosiva (destruição irreversível do tecido ocular) ou 
afecção ou irritação da córnea que se mantêm durante mais de 21 dias (1).  
Categoria R41 UE:  Lesão do tecido ocular ou degradação grave da visão em 
consequência da aplicação da substância em estudo na superfície anterior do 
olho, não totalmente reversível nos 21 dias após a aplicação (2).  
Taxa de falsos negativos:  Proporção das substâncias positivas que o método de 
ensaio considera erradamente negativas. É um dos indicadores de eficiência dos 
métodos de ensaio.  
Taxa de falsos positivos:  Proporção das substâncias negativas que o método de 
ensaio considera erradamente positivas. É um dos indicadores de eficiência dos métodos de ensaio.
 
GHS (Sistema Mundial Harmonizado de Classificação e Rotulagem de Pro ­
dutos Químicos):  Sistema (designado em inglês por  Globally Harmonized Sys ­
tem of Classification and Labelling of Chemicals ) que propõe a classificação dos 
produtos químicos (substâncias e misturas) em função de tipos e níveis norma ­
lizados de perigos físicos, sanitários e ambientais e trata ainda dos elementos de 
comunicação correspondentes, como pictogramas, palavras-sinal, advertências de perigo, recomendações de prudência e fichas de dados de segurança, de modo a transmitir informações sobre os efeitos indesejáveis do produto em causa com 
vista à protecção das pessoas (empregadores, trabalhadores, transportadores, con ­
sumidores, pessoal dos serviços de emergência, etc.) e do ambiente (3).
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Categoria 1 GHS:  Lesão do tecido ocular ou degradação grave da visão na 
consequência da aplicação da substância em estudo na superfície anterior do 
olho, não totalmente reversível nos 21 dias após a aplicação (3).  
Perigo:  Propriedade intrínseca de um agente, ou de uma situação, susceptível de 
causar efeitos adversos num organismo, sistema ou (sub)população que lhe seja exposta.
 
Pontuação de irritação  in vitro  (IVIS):  Fórmula empírica utilizada no ensaio 
BCOP que combina os valores médios de opacidade e de permeabilidade refe ­
rentes a um grupo de tratamento numa pontuação  in vitro  única para esse grupo.  
IVIS = valor médio de opacidade + (15 x valor médio de permeabilidade).  
Amostra de controlo negativa:  Replicado não-tratado que contém todos os 
componentes do sistema de ensaio. Esta amostra é ensaiada juntamente com as amostras tratadas com a substância em estudo e as outras amostras de controlo, para determinar se o solvente interage com o sistema de ensaio.
 
Substância não-irritante:  Substância não classificada nas categorias I, II ou III 
EPA nem nas categorias R41 ou R36 UE nem nas categorias 1, 2A ou 2B GHS 
de irritantes oculares.  
Substância corrosiva ocular:  a) Substância que provoca lesões irreversíveis dos 
tecidos do olho; b) Substância classificada na categoria 1 GHS, na categoria I EPA ou na categoria R41 UE de irritantes oculares (1) (2) (3).
 
Substância irritante ocular:  a) Substância que, aplicada na superfície anterior 
do olho, provoca alterações reversíveis no mesmo. b) Substância classificada nas 
categorias II ou III EPA, na categoria R36 UE ou nas categorias 2A ou 2B GHS 
de irritantes oculares (1) (2) (3).  
Substância fortemente irritante ocular:  a) Substância que, aplicada na super ­
fície anterior do olho, provoca lesões dos tecidos do olho que não desaparecem nos 21 dias após a aplicação ou que provoca uma degradação grave da visão; b) Substância classificada na categoria 1 GHS, na categoria I EPA ou na categoria 
R41 UE de irritantes oculares (1) (2) (3).
 
Opacímetro:  Instrumento utilizado para medir a «opacidade da córnea» por 
determinação quantitativa da luz transmitida através da córnea. Normalmente, o instrumento tem dois compartimentos, dispondo cada um deles de uma fonte luminosa e de uma célula fotoeléctrica. Um compartimento é utilizado para a 
córnea tratada e o outro para calibrar o instrumento e para regular o zero deste. 
Envia-se luz de uma lâmpada de halogénio, através de um compartimento de controlo (câmara vazia, sem janelas nem líquido), para uma célula fotoeléctrica e compara-se com a luz igualmente enviada para uma célula fotoeléctrica através 
do compartimento experimental, que compreende a câmara na qual se colocou a 
córnea. O dispositivo compara a luz transmitida para as células fotoeléctricas, determina a diferença e exibe o valor numérico da opacidade num visor digital.
 
Amostra de controlo positiva:  Replicado que contém todos os componentes do 
sistema de ensaio e foi tratado com uma substância que, comprovadamente, induz reacção positiva. Para que possa determinar-se a variabilidade no tempo da 
reacção a esta amostra de controlo, essa reacção não deve ser excessivamente 
forte.
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Fiabilidade:  Medida em que, utilizando o mesmo protocolo, um método de 
ensaio pode ser continuadamente reproduzido no mesmo laboratório e em labo ­
ratórios diferentes. A fiabilidade é avaliada com base nos valores calculados das reprodutibilidades intralaboratorial e interlaboratorial, bem como da repetibilidade intralaboratorial.
 
Amostra de controlo do solvente/veículo:  Amostra não-tratada que contém 
todos os componentes do sistema de ensaio, incluindo o solvente ou veículo, e é ensaiada, juntamente com as amostras tratadas com a substância em estudo e as outras amostras de controlo, para estabelecer a linha de base de reacção para as 
amostras tratadas com a substância em estudo, dissolvida no mesmo solvente ou 
veículo. Quando ensaiada com uma amostra de controlo negativa correspondente, esta amostra também permite determinar se o solvente ou veículo interage com o sistema de ensaio.
 
Ensaio por etapas:  Estratégia sequencial de ensaio em que, seguindo uma ordem 
estabelecida, se avalia toda a informação disponível sobre a substância em estu ­
do, por um processo baseado na ponderação da suficiência de prova em cada etapa, com o objectivo de determinar se existe informação suficiente para uma 
decisão de classificação de perigosidade antes de passar à etapa seguinte. Se a 
informação existente possibilitar a atribuição de um potencial de irritação à subs ­
tância em estudo, não serão necessários mais ensaios. Se a informação existente não possibilitar a atribuição de um potencial de irritação à substância em estudo, 
proceder-se-á a uma série de ensaios sequenciais em animais até ser possível 
atribuir uma classificação inequívoca.
 
Método de ensaio validado:  Método de ensaio relativamente ao qual foram 
concluídos estudos de validação com vista a determinar a adequação (incluída 
a exactidão) e fiabilidade para uma finalidade específica. É importante referir que 
um método de ensaio validado pode não ser suficientemente exacto e fiável para ser considerado aceitável para a finalidade pretendida.
 
Ponderação da suficiência da prova:  Processo que consiste em ponderar os 
pontos fortes e os pontos fracos dos vários elementos de informação com vista a chegar-se a uma conclusão fundamentada sobre o potencial de perigosidade da substância.
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Apêndice 2  
Substâncias recomendadas para a demonstração de competência técnica no 
método de ensaio de opacidade e permeabilidade da córnea em 
bovinos (BCOP)  
Antes de um método de ensaio conforme ao presente método passar a ser 
utilizado por rotina, os laboratórios podem pretender comprovar a sua competên ­
cia técnica identificando correctamente a classificação de corrosividade ocular 
das dez substâncias recomendadas no quadro 1. Estas substâncias foram selec ­
cionadas de modo a representarem a gama de reacções de irritação/corrosão ocular local obtida no ensaio ocular  in vivo  no coelho (TG 405) (ou seja, as 
categorias 1, 2A, 2B ou não classificado nem rotulado do sistema GHS da ONU 
(3) (7)). Porém, atendendo à utilização destes ensaios que se encontra validada 
(unicamente a identificação de substâncias corrosivas/fortemente irritantes ocula ­
res), apenas há que demonstrar competência em relação a dois resultados classi ­
ficativos obtidos no ensaio (corrosivo/fortemente irritante ou não-corrosivo/não 
fortemente irritante). Outros critérios de selecção foram a disponibilidade da 
substância no comércio, a existência de dados de referência  in vivo  de alta 
qualidade e a existência de dados de alta qualidade relativos aos dois métodos  
in vitro  para os quais estão a ser elaboradas directrizes de ensaio ( test guidelines ). 
Foi nesta base que se seleccionaram substâncias irritantes da lista recomendada pelo ICCVAM de 122 substâncias de referência para a validação de métodos de ensaio de toxicidade ocular  in vitro  (ver o apêndice H:  ICCVAM Recommended 
Reference Substances ) (5). Os  Background Review Documents  do ICCVAM (17) 
(18) contêm dados de referência relativos aos métodos BCOP e ICE (método de ensaio em olhos de frango isolados).
 
Quadro 1  
Substâncias recomendadas para a demonstração de competência técnica no método BCOP  
Substância química N.  o CAS (CASRN) Classe química (  1 ) Fase Classificação  in 
vivo ( 2 ) Classificação  in vitro  ( 3 ) 
Cloreto de benzal ­
cónio (5 %) 8001-54-5 Sal de amónio 
quaternário Líquida Categoria 1 Corrosivo/Fortemente 
irritante 
Clorexidina 55-56-1 Amina, Amidina Sólida Categoria 1 Corrosivo/Fortemente 
irritante 
Ácido dibenzoil-l- 
-tartárico 2743-38-6 Ácido carboxíli ­
co, Éster Sólida Categoria 1 Corrosivo/Fortemente 
irritante 
Imidazole 288-32-4 Composto hete ­
rocíclico Sólida Categoria 1 Corrosivo/Fortemente 
irritante 
Ácido tricloroacé ­
tico (30 %) 76-03-9 Ácido carboxí ­
lico Líquida Categoria 1 Corrosivo/Fortemente 
irritante 
Cloreto de 2,6-di ­
clorobenzoílo 4659-45-4 Halogeneto de 
acilo Líquida Categoria 
2A Não-corrosivo/Não 
fortemente irritante 
2-Metilacetoace ­
tato de etilo 609-14-3 Cetona, Éster Líquida Categoria 
2B Não-corrosivo/Não 
fortemente irritante 
Nitrato de amónio 6484-52-2 Sal inorgânico Sólida Categoria 
2A Não-corrosivo/Não 
fortemente irritante  ▼M2 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 686
 
Substância química N.  o CAS (CASRN) Classe química (  1 ) Fase Classificação  in 
vivo ( 2 ) Classificação  in vitro  ( 3 ) 
Glicerol 56-81-5 Álcool Líquida Não atri ­
buída Não-corrosivo/Não forte ­
mente irritante  
n-Hexano 110-54-3 Hidrocarboneto 
(acíclico) Líquida Não atri ­
buída Não-corrosivo/Não forte ­
mente irritante  
Abreviaturas: CASRN = Número de registo do Chemical Abstracts Service. 
( 1 ) As substâncias foram classificadas em classes químicas segundo um sistema normalizado, com base nos Medical Subject Headings 
(«classificadores de temas médicos», MeSH) da Biblioteca Nacional de Medicina dos Estados Unidos da América (http//www.nlm. 
nih.gov/mesh). 
( 2 ) Com base nos resultados do ensaio ocular  in vivo  no coelho (TG 405 da OCDE) e no sistema GHS da ONU (3) (7). 
( 3 ) Com base nos resultados obtidos pelos métodos BCOP e ICE.  ▼M2 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 687
 
Apêndice 3  
SUPORTE DE CÓRNEA PARA O ENSAIO BCOP  
1. Os suportes de córnea utilizados no método BCOP são feitos de um material 
inerte (por exemplo, polipropileno) e constituídos por duas metades (uma 
anterior e outra posterior), possuindo duas câmaras cilíndricas internas se ­
melhantes. Cada câmara tem o volume de 5 ml e termina numa janela de 
vidro, através da qual são efectuadas as medições de opacidade. As dimen ­
sões interiores de cada câmara são 1,7 cm de diâmetro e 2,2 cm de pro ­
fundidade (  1 ). Para evitar fugas, aplica-se uma anilha na câmara posterior. 
Coloca-se a córnea sobre a anilha da câmara posterior, com a parte endo ­
telial voltada para esse lado, e aplica-se a câmara anterior sobre a parte 
epitelial da córnea. As câmaras são fixadas com três parafusos periféricos de aço inoxidável. Na extremidade de cada câmara existe uma janela de vidro, que pode ser retirada para facilitar o acesso à córnea. Novamente para 
evitar fugas, coloca-se uma anilha entre cada câmara e a janela de vidro. 
Para se poder introduzir e remover o meio de ensaio e os compostos em estudo, existem dois orifícios na parte superior de cada câmara, que são fechados com tampas de borracha durante os períodos de tratamento e 
incubação.
 
Legenda  
Glass disc: disco de vidro;  
PTFE-O-ring: anilha de PTFE;  
Refill: câmara para reenchimento;  
Hanger: suspensor;  
Cap: tampa;  
Nut: porca;  
O-ring: anilha;  
Posterior compartment: câmara posterior;  
Anterior compartment: câmara anterior;  
Fixing screws: parafusos de fixação.  ▼M2 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 688  
( 1 ) Estas dimensões referem-se a suportes de córnea utilizados para vacas com idade com ­
preendida entre 12 e 60 meses. Se se tratar de animais com idade compreendida entre 6 e 
12 meses, cada câmara terá de ter um volume de 4 ml e de medir internamente 1,5 cm de 
diâmetro e 2,2 cm de profundidade. É muito importante que, em qualquer suporte de 
córnea que venha a ser desenhado, a razão entre a superfície de córnea exposta e o 
volume da câmara posterior seja idêntica à que se verifica nos suportes de córnea 
convencionais. Isto é necessário para garantir que os valores de permeabilidade são 
determinados correctamente para o cálculo do IVIS pela fórmula proposta.
 OPACÍMETRO  
2. Trata-se de um dispositivo que mede a transmissão de luz. Envia-se luz de 
uma lâmpada de halogénio, através de um compartimento de controlo (câ ­
mara vazia, sem janelas nem líquido), para uma célula fotoeléctrica e compara-se com a luz igualmente enviada para uma célula fotoeléctrica através do compartimento experimental, que compreende a câmara na qual 
se colocou a córnea. O dispositivo compara a luz transmitida para as células 
fotoeléctricas, determina a diferença e exibe o valor numérico da opacidade num visor digital. Estabelecem-se as unidades de opacidade.
 
3. O opacímetro deve responder linearmente num intervalo de valores de opa ­
cidade que cubra os limites utilizados para todas as classificações descritas 
no modelo de previsão (ou seja, até ao limite de corrosão/forte irritação). Para obter uma escala de leitura linear e exacta até 75-80 unidades de opacidade, é necessário calibrar o opacímetro com uma série de calibrado ­
res. Para isso, colocam-se calibradores (placas opacas de poliéster) na câ ­
mara de calibração (câmara de suporte de córnea desenhada para a inserção de calibradores) e efectuam-se as leituras correspondentes com o opacíme ­
tro. A câmara de calibração é desenhada para que os calibradores nela sejam 
inseridos a uma distância entre a fonte de luz e a célula fotoeléctrica apro ­
ximadamente igual à utilizada nas medições de opacidade com córneas. Começa por se calibrar o zero do opacímetro utilizando a câmara de cali ­
bração sem nenhum calibrador. Em seguida, colocam-se sucessivamente 
nessa câmara três calibradores diferentes, medindo-se as opacidades respec ­
tivas. As leituras de opacidade correspondentes aos calibradores 1, 2 e 3 devem ser iguais aos valores estabelecidos respectivos de 75, 150 e 225 unidades de opacidade, com um desvio de ± 5 %.
 ▼M2 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 689
 
B.48  MÉTODO DE ENSAIO EM OLHOS DE FRANGO ISOLADOS 
PARA IDENTIFICAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS QUE PRODUZAM 
CORROSÃO OU FORTE IRRITAÇÃO OCULAR  
INTRODUÇÃO  
1. O método de ensaio em olhos de frango isolados é um método  in vitro  
que, em determinadas circunstâncias e dentro de certos limites, pode ser utilizado para atribuir a substâncias e misturas a classificação de «subs ­
tância corrosiva ou fortemente irritante ocular» (1) (2) (3). Para efeitos do 
presente método, considera-se «substância fortemente irritante» uma subs ­
tância irritante que induz no coelho lesões oculares que permanecem du ­
rante pelo menos 21 dias após a aplicação. Embora não esteja validado 
para substituir completamente o ensaio ocular  in vivo  no coelho, 
recomenda-se a integração do método ICE numa estratégia de ensaio por etapas para a classificação e rotulagem regulamentares, dentro do domínio de aplicabilidade especificado (4) (5). Sem necessidade de ensaios 
complementares, pode atribuir-se a uma substância ou mistura em estudo 
(6) que dê resultado positivo neste método a classificação de substância corrosiva ou fortemente irritante ocular. Uma substância que dê resultado 
negativo terá de ser ensaiada no coelho pela estratégia de ensaio sequen ­
cial descrita no  Test Guideline 405  da OCDE (7) (capítulo B.5 do presente 
anexo).
 
2. Pretende-se na descrição deste método de ensaio explicar o processo uti ­
lizado para avaliar o potencial de corrosão ou forte irritação ocular de uma 
substância, medido pela sua capacidade de indução tóxica em olhos de frango desorbitados. Medem-se os efeitos tóxicos na córnea do seguinte modo: i) avaliação qualitativa da opacidade; ii) avaliação qualitativa das 
lesões epiteliais após aplicação de fluoresceína ao olho (retenção da fluo ­
resceína); iii) determinação quantitativa do espessamento (edema); iv) ava ­
liação qualitativa das lesões morfológicas macroscópicas na superfície. Após exposição à substância em estudo, avaliam-se separadamente a opa ­
cidade, o edema e as lesões da córnea; em seguida, combinam-se os 
resultados a fim de obter a classificação de irritação ocular.
 
3. Também foram ensaiados pelo método ICE substâncias irritantes oculares 
indutoras de lesões que desaparecem em menos de 21 dias, assim como 
substâncias não-irritantes. A exactidão e a fiabilidade do método ICE não 
foram, porém, formalmente avaliadas na aplicação do método a substân ­
cias destas categorias.  
4. Estabelecem-se definições no apêndice 1.  
CONSIDERAÇÕES INICIAIS E LIMITAÇÕES  
5. Este método de ensaio baseia-se no protocolo do método ICE do ICC ­
VAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alterna ­
tive Methods) (8), que foi elaborado no seguimento de um estudo de validação internacional (4) (5) (9) e contou com contributos do ECVAM 
(European Centre for the Validation of Alternative Methods), do JaCVAM 
(Japanese Center for the Validation of Alternative Methods) e do Quality of Life Department of Toxicology and Applied Pharmacology do TNO (Países Baixos). O protocolo baseia-se na informação obtida nos protoco ­
los publicados e no protocolo que está a ser utilizado pelo TNO (10) (11) 
(12) (13) (14).
 ▼M2 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 690
 
6. As limitações identificadas deste método decorrem da taxa de falsos po ­
sitivos no caso dos álcoois e das taxas de falsos negativos no caso dos 
sólidos e das matérias tensioactivas (ver o ponto 47) (4). Excluindo da base de dados as substâncias dessas classes físico-químicas, aumenta subs ­
tancialmente a exactidão do método ICE nos sistemas de classificação UE, 
EPA e GHS. Atendendo aos objectivos do ensaio (apenas a identificação 
de substâncias corrosivas/fortemente irritantes oculares), as taxas de falsos negativos não são um aspecto crítico, pois as substâncias seriam a seguir ensaiadas no coelho ou por outros métodos  in vitro  adequadamente vali ­
dados, conforme as disposições regulamentares, por recurso a uma estra ­
tégia de ensaio sequencial baseada na ponderação da suficiência da prova. Acresce que a base de dados de validação actualmente disponível não permite uma avaliação adequada de algumas classes químicas ou classes 
de produtos (por exemplo, misturas). Os investigadores podem, no entanto, 
ponderar o recurso a este método para ensaiar todos os tipos de matérias (incluindo misturas), aceitando um resultado positivo como um indício de reacção corrosiva ou fortemente irritante ocular. Porém, os resultados po ­
sitivos obtidos no caso de álcoois devem ser interpretados com cautela, 
devido ao risco de não serem efectivamente positivos em todos os casos que o indiciem.
 
7. Na manipulação de olhos de frango devem seguir-se as regras e procedi ­
mentos estabelecidos no laboratório para a manipulação de matérias de origem humana ou animal (tecidos, fluidos biológicos, etc.). Recomenda-se 
a aplicação das precauções gerais inerentes à prática laboratorial (15).
 
8. Uma limitação deste método de ensaio é o facto de que, embora tenha em 
conta alguns efeitos oculares avaliados pelo método de ensaio da irritação 
ocular no coelho e, em certa medida, a gravidade desses efeitos, não tem em conta as lesões na conjuntiva ou na íris. Por outro lado, embora a reversibilidade das lesões da córnea não possa ser avaliada  per se  no 
método ICE, foi proposta, com base em estudos oculares no coelho, a 
possibilidade de se recorrer à avaliação da profundidade inicial da lesão da córnea para estabelecer uma distinção entre efeitos reversíveis e efeitos irreversíveis (16). Finalmente, o método ICE não permite avaliar o poten ­
cial de toxicidade sistémica associado à exposição ocular.
 
9. Prosseguem os trabalhos com vista à melhor caracterização da utilidade e 
das limitações do método de ensaio ICE na identificação de matérias não 
fortemente irritantes ou não-irritantes (ver também o ponto 48). Incentiva-se os utilizadores do método a fornecerem espécimes e/ou dados 
a organizações de validação, para que seja avaliada formalmente a possi ­
bilidade de outras utilizações futuras do método ICE, designadamente na identificação de matérias não fortemente irritantes oculares e de matérias não-irritantes.
 
10. Os laboratórios que comecem a utilizar este ensaio devem recorrer às 
substâncias químicas para demonstração de competência técnica recomen ­
dadas no apêndice 2. Antes de apresentarem dados obtidos pelo método 
ICE para efeitos da classificação regulamentar de perigosidade, os labora ­
tórios podem recorrer às referidas substâncias para demonstrar a sua com ­
petência técnica na execução deste método.  
PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
11. O método ICE assenta num modelo organotípico de manutenção de olhos 
de frango  in vitro  por um período curto. Neste método de ensaio, as lesões 
provocadas pela substância em estudo são avaliadas por determinação do 
edema e da opacidade da córnea e da retenção de fluoresceína na córnea. A avaliação dos dois últimos parâmetros é qualitativa, enquanto a análise do edema da córnea é quantitativa. Converte-se cada medida numa pon ­
tuação quantitativa, utilizada para calcular um índice global de irritação, ou 
é atribuída a cada medida uma categoria qualitativa, utilizada para estabe ­
lecer uma classificação de corrosão e forte irritação ocular  in vitro . Com 
base num ou noutro desses resultados, pode em seguida prever-se o po ­
tencial de corrosão ou forte irritação ocular  in vivo  da substância em 
estudo (ver Critérios de decisão).
 ▼M2 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 691
 
Origem e idade dos olhos de frango  
12. Os olhos utilizados neste ensaio são normalmente colhidos em matadouros, 
de frangos abatidos para consumo humano, eliminando assim a necessi ­
dade de animais de laboratório. Só podem ser utilizados olhos de animais saudáveis considerados adequados para entrarem na cadeia alimentar hu ­
mana.
 
13. Embora não tenha sido efectuado um estudo destinado a avaliar a idade 
óptima dos frangos, as aves utilizadas neste método de ensaio têm habi ­
tualmente a idade e o peso dos frangos normalmente abatidos nos mata ­
douros de aves de capoeira (aproximadamente 7 semanas e 1,5 a 2,5 kg).  
Colheita e transporte dos olhos para o laboratório  
14. Imediatamente após o atordoamento dos frangos, normalmente por des ­
carga eléctrica, e incisão no pescoço para sangramento, corta-se-lhes a cabeça. A origem dos frangos deve ser próxima do laboratório, para que 
as cabeças possam ser para aí transferidas do matadouro com suficiente 
rapidez, a fim de minimizar a deterioração e/ou as contaminações bacte ­
riológicas. O intervalo entre a colheita das cabeças de frango e a utilização dos olhos no método ICE deve ser mínimo (normalmente duas horas) e 
não deve, comprovadamente, comprometer os resultados do ensaio. Os 
resultados dos ensaios estão relacionados com os critérios de selecção dos olhos e com as reacções às amostras de controlo positivas e negativas. Os olhos utilizados num ensaio devem ser todos do mesmo grupo de 
colheita num determinado dia.
 
15. Os olhos são dissecados no laboratório, pelo que se transportam as cabeças 
intactas do matadouro em caixas de plástico, à temperatura ambiente, 
humedecidas com toalhas embebidas em solução salina isotónica.  
Critérios de selecção dos olhos utilizados no método ICE  
16. Rejeitam-se os olhos que, depois de desorbitados, apresentem uma linha de 
base elevada de reacção cromática à fluoresceína (> 0,5) ou de pontuação de opacidade da córnea (> 0,5).
 
17. Cada grupo de tratamento e a amostra de controlo positiva correspondente 
é constituído por um mínimo de três olhos. O grupo de controlo negativo ou a amostra de controlo do solvente (caso se utilize um solvente que não 
seja a solução salina) é constituído por, pelo menos, um olho.
 
PROCEDIMENTO  
Preparação dos olhos  
18. Excisam-se cautelosamente as pálpebras, tomando as precauções necessá ­
rias para não danificar a córnea. Para avaliar a integridade desta, deita-se na sua superfície uma gota de solução a 2 % (m/v) de fluoresceína sódica, espera-se alguns segundos e lava-se com solução salina isotónica. Para 
garantir que a córnea está isenta de lesões (retenção de fluoresceína e 
pontuação de opacidade da córnea ≤ 0,5), examinam-se a seguir os olhos 
tratados com fluoresceína por meio de um microscópio equipado com uma lâmpada de fenda.
 
19. Se o olho não apresentar lesões, disseca-se completamente do crânio, 
tomando as precauções necessárias para não danificar a córnea. Para retirar 
o globo ocular da órbita, prende-se firmemente a membrana nictante com 
uma pinça cirúrgica e cortam-se os músculos oculares com uma tesoura encurvada de pontas rombas. É importante evitar lesões da córnea provo ­
cadas por pressão excessiva (ditas artefactos de compressão).
 
20. Ao remover o olho da órbita, deve deixar-se agarrada àquele uma porção 
visível do nervo óptico. Uma vez desorbitado, coloca-se o olho numa 
compressa absorvente e cortam-se a membrana nictante e os restantes 
tecidos de ligação.  ▼M2 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 692
 
21. Coloca-se o olho desorbitado num suporte de aço inoxidável, com a cór ­
nea na vertical, e transfere-se o conjunto para uma das câmaras do apare ­
lho de superfusão (16). Colocam-se os suportes no aparelho de superfusão de tal modo que a solução salina isotónica goteje sobre toda a córnea. As câmaras do aparelho de superfusão devem ser termostatizadas a 
32 ± 1,5 °C. Apresenta-se no apêndice 3 um diagrama de um aparelho 
de superfusão típico e dos suportes oculares, que podem ser adquiridos no comércio ou construídos. O aparelho pode ser modificado para correspon ­
der às necessidades do laboratório (por exemplo, para nele ser introduzido 
outro número de olhos).
 
22. Após serem colocados no aparelho de superfusão, examinam-se novamente 
os olhos ao microscópio com lâmpada de fenda, para garantir que não 
foram danificados durante a dissecação. Mede-se também nessa ocasião a espessura da córnea no seu ápice, utilizando o dispositivo de medição de profundidade incorporado no microscópio. Devem substituir-se os olhos 
que apresentem i) pontuação de retenção de fluoresceína > 0,5, ii) opaci ­
dade da córnea > 0,5 ou iii) qualquer outro sinal de dano. Rejeitam-se ainda os olhos que, não tendo sido rejeitados com base em nenhum destes 
critérios, apresentem uma espessura de córnea que se desvie mais de 10 % 
do valor médio correspondente a todos os olhos. Alertam-se os utilizadores para o facto de os microscópios com lâmpada de fenda poderem dar resultados diferentes para as medições de espessura da córnea se a regu ­
lação da fenda for outra. A largura da fenda deve ser regulada a 
0,095 mm.
 
23. Os olhos examinados e aprovados são incubados durante 45 a 60 minutos, 
para estabelecer o equilíbrio com o sistema de ensaio antes das determi ­
nações. Depois de terminado o período previsto para se atingir o equilí ­
brio, regista-se como linha de base (tempo = 0) uma determinação de 
referência «zero» de opacidade e de espessura da córnea. A pontuação 
de retenção de fluoresceína determinada na dissecação é utilizada para linha de base desse parâmetro.
 
Aplicação da substância em estudo  
24. Imediatamente após as determinações de referência «zero», remove-se o 
olho (mantendo-o no suporte) do aparelho de superfusão e coloca-se na 
horizontal, aplicando-se na córnea a substância em estudo.  
25. As substâncias líquidas são normalmente ensaiadas sem diluição, mas, se 
for considerado necessário (devido ao modo como o estudo foi concebido, por exemplo), podem ser diluídas. O solvente preferido para diluir as substâncias é soro fisiológico. Embora possam utilizar-se outros solventes, 
em condições controladas, será necessário demonstrar que são adequados.
 
26. As substâncias em estudo líquidas aplicam-se na córnea de modo a 
cobri-la uniformemente. O volume normal é 0,03 ml.  
27. Se possível, as substâncias sólidas devem ser moídas o máximo possível 
com um pilão num almofariz, ou com um dispositivo de moagem com ­
parável. O pó é depois aplicado na córnea de modo a cobrir uniforme ­
mente a superfície desta com a substância em estudo. A quantidade normal 
é 0,03 g.  
28. Mantém-se a substância em estudo (líquida ou sólida) aplicada na córnea 
durante 10 segundos e, em seguida, lava-se o olho, para a remover, com solução salina isotónica à temperatura ambiente (cerca de 20 ml). Recoloca-se em seguida o olho (no seu suporte) no aparelho de superfu ­
são, na posição vertical original.
 
Substâncias de controlo  
29. Incluem-se em cada ensaio amostras de controlo positivas e negativas (ou 
do solvente/veículo) correspondentes.  ▼M2 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 693
 
30. Ao ensaiar pelo método ICE substâncias líquidas a 100 % ou sólidos, 
utiliza-se soro fisiológico como amostra de controlo negativa correspon ­
dente, para possibilitar a detecção de alterações inespecíficas do sistema de ensaio e evitar que as condições do ensaio provoquem, inadequadamente, uma reacção de irritação.
 
31. Ao ensaiar líquidos diluídos, inclui-se no método de ensaio um grupo 
correspondente de amostras de controlo do veículo/solvente, para possibi ­
litar a detecção de alterações inespecíficas do sistema de ensaio e evitar que as condições do ensaio provoquem, inadequadamente, uma reacção de irritação. Como se referiu no ponto 25, só podem utilizar-se solventes/ ­
veículos que, comprovadamente, não tenham efeitos adversos no sistema 
de ensaio.
 
32. Para verificar se é induzida uma reacção apropriada, inclui-se em cada 
ensaio uma substância irritante ocular conhecida, para servir de amostra de controlo positiva correspondente. Como o ensaio ICE é utilizado neste 
método de ensaio para identificar substâncias corrosivas ou fortemente 
irritantes, a amostra de controlo positiva deverá ser uma substância de referência que induza uma reacção forte ao aplicar-se-lhe o método. Po ­
rém, para que possa determinar-se a variabilidade no tempo da reacção à 
referida amostra de controlo positiva, essa reacção não deve ser excessi ­
vamente forte. Os dados  in vitro  obtidos no caso das amostras de controlo 
positivas devem ser suficientes para calcular um intervalo aceitável, esta ­
tisticamente definido, respeitante à amostra de controlo positiva. Caso não 
se disponha de dados históricos adequados do método ICE para uma 
determinada amostra de controlo positiva, pode ser necessário efectuar estudos para obter tais informações.
 
33. Podem ser utilizados como amostras de controlo positivas para substâncias 
em estudo líquidas, por exemplo, ácido acético a 10 % ou cloreto de 
benzalcónio a 5 %. Como amostras de controlo positivas para substâncias 
em estudo sólidas podem ser utilizados, por exemplo, o hidróxido de sódio ou o imidazole.
 
34. As substâncias de referência são úteis para avaliar o potencial de irritação 
ocular de produtos químicos desconhecidos de uma determinada classe 
química, ou classe de produtos, ou para avaliar o potencial de irritação 
relativo de uma substância irritante ocular numa determinada gama de reacções de irritação.
 
Parâmetros medidos  
35. Avaliam-se as córneas tratadas antes do tratamento e decorridos 30, 75, 
120, 180 e 240 minutos (± 5 minutos) após a lavagem subsequente ao 
tratamento. Obtém-se, assim, um número adequado de determinações no período de quatro horas que se segue ao tratamento, garantindo ainda um intervalo entre determinações suficiente para a realização das observações 
necessárias em todos os olhos.
 
36. Os parâmetros avaliados são a opacidade e o edema da córnea, a retenção 
de fluoresceína na córnea e efeitos morfológicos na córnea (picado epite ­
lial ou perda de epitélio, por exemplo). Com excepção da retenção de fluoresceína (que só é determinada antes do tratamento e 30 minutos 
após a exposição à substância em estudo), todos estes parâmetros são 
determinados nos tempos acima referidos.
 
37. Recomenda-se o recurso a fotografias para documentar a opacidade da 
córnea, a retenção de fluoresceína na córnea, os efeitos morfológicos e, se for efectuada, a histopatologia.
 
38. Recomenda-se aos utilizadores que, depois do último exame, iniciado 4 
horas após o tratamento, conservem os olhos num fixador adequado (por 
exemplo, formol tamponado neutro), para eventual exame histopatológico.  ▼M2 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 694
 
39. Determina-se o edema da córnea medindo a espessura da córnea com o 
paquímetro óptico do microscópio com lâmpada de fenda. O resultado é 
expresso em percentagem e é calculado a partir das determinações de espessura da córnea, por meio da seguinte fórmula:
 
" 
espessura da cúrnea em t  Ä espessura da cúrnea em  ¼ 0 
espessura da cúrnea em  ¼ 0 # 
Ü 100  
40. Calcula-se a média percentual dos edemas da córnea de todos os olhos 
ensaiados em cada instante «t» considerado. Com base na pontuação mé ­
dia mais elevada de edema da córnea, observada em qualquer dos instantes 
considerados, atribui-se, em seguida, a pontuação global desta categoria a cada substância em estudo.
 
41. Calcula-se a opacidade da córnea atribuindo uma pontuação à superfície 
que se encontre mais densamente opacificada em cada córnea. Calcula-se o valor médio de opacidade da córnea de todos os olhos ensaiados em cada instante considerado. Com base na pontuação média mais elevada de 
opacidade da córnea, observada em qualquer dos instantes considerados, 
atribui-se em seguida a pontuação global desta categoria a cada substância em estudo (quadro 1).
 
Quadro 1  
Pontuações de opacidade da córnea  
Pontuação Observações  
0 Ausência de opacidade 
0,5 Opacidade muito ligeira 1 Zonas dispersas ou difusas; detalhes da íris claramente visíveis 2 Zona translúcida claramente discernível; detalhes da íris ligeiramente obscureci ­
dos 
3 Forte opacidade da córnea; nenhum detalhe da íris visível; tamanho da pupila 
dificilmente discernível 
4 Opacidade completa da córnea; íris invisível
 
42. O valor médio da retenção de fluoresceína de todos os olhos ensaiados só 
é calculado para a observação efectuada aos 30 minutos, tempo utilizado 
para a atribuição de uma pontuação global desta categoria a cada subs ­
tância em estudo (quadro 2).  
Quadro 2  
Pontuações de retenção da fluoresceína  
Pontuação Observações  
0 Ausência de retenção de fluoresceína 
0,5 Número muito reduzido de células isoladas coradas 
1 Células isoladas coradas dispersas pela zona tratada da córnea 2 Focos ou confluência densa de células isoladas coradas 3 Retenção de fluoresceína em zonas extensas confluentes da córnea
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43. Incluem-se nos efeitos morfológicos o «picado» das células epiteliais da 
córnea, a «perda» de epitélio, a «aspereza» da superfície da córnea e a 
«colagem» da substância em estudo à córnea. Estes efeitos podem ser concomitantes e de intensidade variável. A sua classificação é subjectiva e depende da interpretação do investigador.
 
DADOS E RELATÓRIOS  
Avaliação dos dados  
44. Avaliam-se separadamente os resultados de opacidade da córnea, edema da 
córnea e retenção de fluoresceína na córnea para determinar a classe 
correspondente a cada um destes parâmetros pelo método ICE. Combinam-se depois essas classes de modo a obter a classificação de irritação correspondente à substância em estudo.
 
Critérios de decisão  
45. Uma vez efectuada a avaliação de cada parâmetro, podem atribuir-se as 
classes ICE com base em intervalos preestabelecidos. Estabelece-se a cor ­
respondência entre os valores de espessura da córnea (quadro 3), opaci ­
dade da córnea (quadro 4) e retenção de fluoresceína na córnea (quadro 5) e quatro classes ICE, de acordo com as seguintes escalas:
 
Quadro 3  
Critérios de classificação ICE de espessura da córnea  
Valor médio de edema da córnea (%) (*) Classe ICE  
0 a 5 I 
> 5-12 II > 12-18 (> 75 minutos após tratamento) II > 12-18 ( ≤ 75 minutos após tratamento) III 
> 18-26 III > 26-32 (> 75 minutos após tratamento) III 
> 26-32 ( ≤ 75 minutos após tratamento) IV 
> 32 IV
 
(*) Esta pontuação de edema da córnea só é aplicável se a espessura for medida por meio de um microscópio 
com lâmpada de fenda Haag-Streit BP900 dotado do dispositivo n.  o I de medição de profundidade e com 
a largura da fenda regulada a 9½, correspondente a 0,095 mm. Alertam-se os utilizadores para o facto de os microscópios com lâmpada de fenda poderem dar resultados diferentes para as medições de espessura 
da córnea se a regulação da fenda for outra.
 
Quadro 4  
Critérios de classificação ICE de opacidade  
Valor médio da pontuação máxima de opacidade (*) Classe ICE  
0,0-0,5 I 
0,6-1,5 II 1,6-2,5 III 2,6-4,0 IV
 
(*) Ver o quadro 1.  ▼M2 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 696
 
Quadro 5  
Critérios de classificação ICE da retenção média de fluoresceína  
Valor médio da pontuação de retenção de fluores ­
ceína 30 minutos após o tratamento (*) Classe ICE  
0,0-0,5 I 
0,6-1,5 II 1,6-2,5 III 2,6-3,0 IV
 
(*) Ver o quadro 2.  
46. Para determinar a classificação global de irritação  in vitro  da substância 
em estudo, utiliza-se o quadro 6 para estabelecer a correspondência entre a 
classificação na escala de irritação e a combinação das categorias obtidas para o edema da córnea, a opacidade da córnea e a retenção de fluores ­
ceína na córnea.
 
Quadro 6  
Classificação global de irritação  in vitro  
Classificação Combinações dos três parâmetros medidos  
Corrosivo/Fortemente irritante 3 × IV 
2 × IV, 1 × III 2 × IV, 1 × II (*) 2 × IV, 1 × I (*) 
Opacidade da córnea ≥ 3 aos 30 minutos (pelo 
menos 2 olhos) Opacidade da córnea = 4 em qualquer momento (pelo menos 2 olhos) 
Perda substancial de epitélio (pelo menos 1 
olho)
 
(*) Combinações menos prováveis.  
47. Como referido no ponto 1, se não for possível atribuir a uma substância a 
classificação de substância corrosiva ou fortemente irritante ocular, será 
necessário efectuar mais ensaios para efeitos de classificação e rotulagem. O método ICE tem as seguintes características no que respeita à identifi ­
cação de substâncias corrosivas ou fortemente irritantes oculares: exactidão 
global de 83 % (120/144) a 87 % (134/154), taxa de falsos positivos de 
6 % (7/122) a 8 % (9/116) e taxa de falsos negativos de 41 % (13/32) a 50 % (15/30), comparativamente aos dados obtidos pelo método de ensaio ocular  in vivo  no coelho, classificados de acordo com os sistemas de 
classificação EPA (1), UE (2) ou GHS (3). Excluindo da base de dados 
determinadas substâncias de certas classes químicas (álcoois e substâncias tensioactivas) ou físicas (sólidos), a exactidão do método ICE nos sistemas de classificação EPA, UE e GHS situa-se entre 91 % (75/82) e 92 % 
(69/75), a taxa de falsos positivos entre 5 % (4/73) e 6 % (4/70) e a 
taxa de falsos negativos entre 29 % (2/7) e 33 % (3/9) (4).
 
48. Mesmo que não seja possível atribuir à substância em estudo a classifica ­
ção de corrosiva ou fortemente irritante ocular, os dados obtidos pelo 
método ICE podem ser úteis, em conjugação com dados de ensaios ocu ­
lares  in vivo  no coelho ou de ensaios  in vitro  adequadamente validados, 
para melhor avaliar a utilidade e limitações do método de ensaio ICE na identificação de matérias não fortemente irritantes ou não-irritantes (está 
em curso a elaboração de um documento de orientações sobre a utilização 
de métodos de ensaio de toxicidade ocular  in vitro )
 ▼M2 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 697
 
Critérios de aceitação do estudo  
49. Considera-se o ensaio aceitável se as amostras de controlo negativas ou do 
veículo/solvente correspondentes e as amostras de controlo positivas cor ­
respondentes derem lugar a uma classificação de irritação nas classes não- -irritante e corrosivo/fortemente irritante, respectivamente.
 
Relatório do ensaio  
50. O relatório do ensaio deve incluir as informações seguintes que sejam 
pertinentes na realização do estudo em causa:  
Substâncias em estudo e de controlo  
Denominação ou denominações químicas, como a denominação estrutural 
utilizada pelo Chemical Abstracts Service (CAS), seguida de outras deno ­
minações, se existirem;  
Número de registo CAS, se for conhecido;  
Grau de pureza e composição da substância ou mistura (em percentagem 
ponderal), se forem conhecidas;  
Propriedades físico-químicas (por exemplo, estado físico, volatilidade, pH, 
estabilidade, classe química, hidrossolubilidade) relevantes para a realiza ­
ção do estudo;  
Pré-tratamento das substâncias em estudo/de controlo, se for o caso (aque ­
cimento ou moagem, por exemplo);  
Estabilidade, se for conhecida.  
Informações relativas ao patrocinador e ao laboratório  
Nome e endereço do patrocinador, do laboratório e do director do estudo;  
Indicação da origem dos olhos (por exemplo, da instalação na qual foram 
colhidos);  
Condições de armazenagem e de transporte dos olhos (data-hora da co ­
lheita dos olhos, tempo decorrido até ao início dos ensaios, etc.);  
Se forem conhecidas, especificidades dos animais nos quais os olhos 
foram colhidos (idade, sexo, peso, etc. do animal dador).  
Justificação do método de ensaio e do protocolo utilizados  
Integridade do método de ensaio  
Processo utilizado para garantir a integridade (exactidão e fiabilidade) do 
método de ensaio ao longo do tempo (por exemplo, ensaio periódico das substâncias para a demonstração de competência, utilização de dados his ­
tóricos das amostras de controlo positivas e negativas, etc.).
 
Critérios de aceitação de um ensaio  
Se for aplicável, intervalos aceitáveis das amostras de referência de con ­
trolo correspondentes, com base nos dados históricos.  
Condições de ensaio  
Descrição do sistema de ensaio utilizado;  
Microscópio com lâmpada de fenda utilizado (modelo, etc.);  
Regulações do microscópio com lâmpada de fenda utilizado;  
Informações sobre as córneas de frango utilizadas, incluindo declarações 
sobre a qualidade das mesmas;  ▼M2 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 698
 
Pormenores sobre a execução do ensaio;  
Concentração ou concentrações das substâncias em estudo utilizadas;  
Descrição de eventuais modificações na execução do ensaio;  
Referência a dados históricos do modelo (amostras de controlo positivas e 
negativas, substâncias para a demonstração de competência, substâncias de referência, etc.);
 
Descrição dos critérios de avaliação utilizados.  
Resultados  
Descrição de outros efeitos eventualmente observados;  
Se adequado, fotografias dos olhos;  
Discussão dos resultados  
Conclusões  
REFERÊNCIAS  
1) U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96- 
-001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.  
2) Regulamento (CE) n.  o 1272/2008 do Parlamento Europeu e do Con ­
selho, de 16 de Dezembro de 2008, relativo à classificação, rotulagem e embalagem de substâncias e misturas, que altera e revoga as Di ­
rectivas 67/548/CEE e 1999/45/CE, e altera o Regulamento (CE) 
n.
 o 1907/2006, JO L 353 de 31.12.2008, p. 1.  
3) United nations (UN) (2007). Globally Harmonized System of Classi ­
fication and Labelling of Chemicals (GHS), Second revised edition, UN New York and Geneva, 2007. Acessível em:
 
http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html  
4) ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report -  In Vitro Ocular 
Toxicity  Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and 
Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology 
Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Acessível em:
 
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm  
5) ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospec ­
tive study on organotypic  in vitro  assays as screening tests to identify 
potential ocular corrosives and severe eye irritants. Acessível em:  
http://ecvam.jrc.it/index.htm  
6) Regulamento (CE) n.  o 1907/2006 do Parlamento Europeu e do Con ­
selho, de 18 de Dezembro de 2006, relativo ao registo, avaliação, 
autorização e restrição dos produtos químicos (REACH), que cria a 
Agência Europeia dos Produtos Químicos, que altera a Directiva 1999/45/CE e revoga o Regulamento (CEE) n.
 o 793/93 do Conselho 
e o Regulamento (CE) n.  o 1488/94 da Comissão, bem como a Direc ­
tiva 76/769/CEE do Conselho e as Directivas 91/155/CEE, 93/67/ ­
CEE, 93/105/CE e 2000/21/CE da Comissão. JO L 396 de 30.12.2006, p. 1.
 
7) OCDE (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of 
Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Acessível em:  
http://www.oecd.org/document/40/0, 2340, en_2649_34377_37051368 
_1_1_1_1,00.html  ▼M2 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 699
 
8) ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended ICE Test Method Proto ­
col. Em: ICCVAM Test Method Evaluation Report -  In Vitro  Ocular 
Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology 
Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative 
Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Acessível em:
 
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm  
9) ICCVAM (2006). Current Status of  In Vitro  Test Methods for Iden ­
tifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye 
Test Method. NIH Publication No.: 06-4513. Research Triangle Park: 
National Toxicology Program. Acessível em:  
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm  
10) Prinsen, M. K. Koëter, B. W. M. (1993). Justification of the enucleated 
eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits.  Fd. Chem. Toxicol.  31:69-76.
 
11) INVITTOX (1994). Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET). 
Acessível em:  
http://ecvam.jrc.it/index.htm  
12) Balls, M., Botham, P. A., Bruner, L. H., Spielmann H. (1995). The 
EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test.  Toxicol. In Vitro  9:871-929.
 
13) Prinsen, M. K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A 
practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion 
potential of test materials.  Food Chem. Toxicol . 34:291-296.  
14) Chamberlain, M., Gad, S. C., Gautheron, P., Prinsen, M. K. (1997). 
IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/ ­
prediction of ocular irritation.  Food Chem. Toxicol.  35:23-37.  
15) Siegel, J. D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the 
Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). 
Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of In ­
fectious Agents in Healthcare Settings. Acessível em:  
http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf  
16) Maurer, J. K., Parker, R. D., Jester J. V. (2002). Extent of corneal 
injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays.  Reg. Tox. 
Pharmacol.  36:106-117.
 
17) Burton, A. B. G., M. York, R. S. Lawrence (1981). The  in vitro  
assessment of severe irritants.  Fd. Cosmet. Toxicol.  19:471-480.  ▼M2 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 700
 
18) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of  In 
Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Met ­
hod. Acessível em:  
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm  
19) ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of  In 
Vitro  Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe 
Irritants. Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Acessível em:  
http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm  ▼M2 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 701
 
Apêndice 1  
DEFINIÇÕES  
Exactidão:  Grau de acordo entre os resultados do método de ensaio e os valores 
de referência aceites. Constitui uma medida da eficiência do método e um dos 
aspectos da «adequação». Este termo e o termo «concordância» são muitas vezes utilizados indistintamente para indicar a proporção de resultados correctos do método de ensaio.
 
Substância de referência:  Substância utilizada como padrão de comparação com 
a substância em estudo. Deve ter as seguintes propriedades: i) origem ou origens uniformes e fiáveis; ii) similaridade estrutural e funcional com a classe de subs ­
tâncias em estudo; iii) características físico-químicas conhecidas; iv) disponibili ­
dade de dados sobre os efeitos conhecidos; e v) potência conhecida situada na gama de reacção pretendida.
 
Córnea:  Parte transparente anterior do globo ocular que recobre a íris e a pupila 
e deixa passar a luz para o interior.  
Opacidade da córnea:  Medição do grau de opacidade da córnea depois de 
exposta à substância em estudo. Um aumento de opacidade da córnea é indicador 
de lesão da córnea.  
Edema da córnea:  Medição objectiva no ensaio ICE da dilatação da córnea após 
exposição à substância em estudo. É expressa em percentagem e calculada em relação às medições da linha de base de espessura da córnea efectuadas antes da 
aplicação da substância em estudo. A espessura é registada a intervalos regulares 
após exposição à matéria em estudo no ensaio ICE. O grau de edema da córnea é indicador do grau de lesão da córnea.
 
Categoria 1 EPA:  Acção corrosiva (destruição irreversível do tecido ocular) ou 
afecção ou irritação da córnea que se mantêm durante mais de 21 dias (1).  
Categoria R41 UE:  Lesão do tecido ocular ou degradação grave da visão em 
consequência da aplicação da substância em estudo na superfície anterior do 
olho, não totalmente reversível nos 21 dias após a aplicação (2).  
Taxa de falsos negativos:  Proporção das substâncias positivas que o método de 
ensaio considera erradamente negativas. É um dos indicadores de eficiência dos métodos de ensaio.
 
Taxa de falsos positivos:  Proporção das substâncias negativas que o método de 
ensaio considera erradamente positivas. É um dos indicadores de eficiência dos métodos de ensaio.
 
Retenção de fluoresceína:  Medição subjectiva no ensaio ICE da proporção de 
fluoresceína sódica que, após exposição à substância em estudo, é retida pelas células epiteliais da córnea. O grau de retenção da fluoresceína é indicador do grau de lesão do epitélio da córnea.
 
GHS (Sistema Mundial Harmonizado de Classificação e Rotulagem de Pro ­
dutos Químicos):  Sistema (designado em inglês por  Globally Harmonized Sys ­
tem of Classification and Labelling of Chemicals ) que propõe a classificação dos 
produtos químicos (substâncias e misturas) em função de tipos e níveis norma ­
lizados de perigos físicos, sanitários e ambientais e trata ainda dos elementos de 
comunicação correspondentes, como pictogramas, palavras-sinal, advertências de perigo, recomendações de prudência e fichas de dados de segurança, de modo a transmitir informações sobre os efeitos indesejáveis do produto em causa com 
vista à protecção das pessoas (empregadores, trabalhadores, transportadores, con ­
sumidores, pessoal dos serviços de emergência, etc.) e do ambiente (3).
 ▼M2 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 702
 
Categoria 1 GHS:  Lesão do tecido ocular ou degradação grave da visão em 
consequência da aplicação da substância em estudo na superfície anterior do 
olho, não totalmente reversível nos 21 dias após a aplicação (3).  
Perigo:  Propriedade intrínseca de um agente, ou de uma situação, susceptível de 
causar efeitos adversos num organismo, sistema ou (sub)população que lhe seja exposta.
 
Amostra de controlo negativa:  Replicado não-tratado que contém todos os 
componentes do sistema de ensaio. Esta amostra é ensaiada juntamente com as 
amostras tratadas com a substância em estudo e as outras amostras de controlo, 
para determinar se o solvente interage com o sistema de ensaio.  
Substância não-irritante:  Substância não classificada nas categorias I, II ou III 
EPA nem nas categorias R41 ou R36 UE nem nas categorias 1, 2A ou 2B GHS de irritantes oculares (1) (2) (3).
 
Substância corrosiva ocular:  a) Substância que provoca lesões irreversíveis dos 
tecidos do olho. b) Substância classificada na categoria 1 GHS, na categoria I 
EPA ou na categoria R41 UE de irritantes oculares (1) (2) (3).  
Substância irritante ocular:  a) Substância que, aplicada na superfície anterior 
do olho, provoca alterações reversíveis no olho. b) Substância classificada nas categorias II ou III EPA, na categoria R36 UE ou nas categorias 2A ou 2B GHS de irritantes oculares (1) (2) (3).
 
Substância fortemente irritante ocular:  a) Substância que, aplicada na super ­
fície anterior do olho, provoca lesões dos tecidos do mesmo que não são rever ­
síveis nos 21 dias após a aplicação ou que provoca uma degradação grave da visão. b) Substância classificada na categoria 1 GHS, na categoria I EPA ou na categoria R41 UE de irritantes oculares (1) (2) (3).
 
Amostra de controlo positiva:  Replicado que contém todos os componentes do 
sistema de ensaio e foi tratado com uma substância que comprovadamente induz 
reacção positiva. Para que possa determinar-se a variabilidade no tempo da 
reacção a esta amostra de controlo, essa reacção não deve ser excessivamente forte.
 
Fiabilidade:  Medida em que, utilizando o mesmo protocolo, um método de 
ensaio pode ser continuadamente reproduzido no mesmo laboratório e em labo ­
ratórios diferentes. A fiabilidade é avaliada com base nos valores calculados das 
reprodutibilidades intralaboratorial e interlaboratorial, bem como da repetibilidade intralaboratorial.
 
Microscópio com lâmpada de fenda:  Instrumento utilizado para examinar di ­
rectamente uma imagem estereoscópica saliente do olho com a ampliação de um 
microscópio binocular. No método de ensaio ICE, este instrumento é utilizado 
para observar as estruturas anteriores dos olhos de frango e para medir objecti ­
vamente a espessura da córnea com um dispositivo de medição de profundidade incorporado.
 
Amostra de controlo do solvente/veículo:  Amostra não-tratada que contém 
todos os componentes do sistema de ensaio, incluindo o solvente ou veículo, e 
é ensaiada, juntamente com as amostras tratadas com a substância em estudo e as 
outras amostras de controlo, para estabelecer a linha de base de reacção para as amostras tratadas com a substância em estudo, dissolvida no mesmo solvente ou veículo. Quando ensaiada com uma amostra de controlo negativa correspondente, 
esta amostra também permite determinar se o solvente ou veículo interage com o 
sistema de ensaio.
 ▼M2 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 703
 
Ensaio por etapas:  Estratégia sequencial de ensaio em que, seguindo uma ordem 
estabelecida, se avalia toda a informação disponível sobre a substância em estu ­
do, por um processo baseado na ponderação da suficiência de prova em cada etapa, com o objectivo de determinar se existe informação suficiente para uma decisão de classificação de perigosidade antes de passar à etapa seguinte. Se a 
informação existente possibilitar a atribuição de um potencial de irritação à subs ­
tância em estudo, não serão necessários mais ensaios. Se a informação existente não possibilitar a atribuição de um potencial de irritação à substância em estudo, proceder-se-á a uma série de ensaios sequenciais em animais até ser possível 
atribuir uma classificação inequívoca.
 
Método de ensaio validado:  Método de ensaio relativamente ao qual foram 
concluídos estudos de validação com vista a determinar a adequação (incluída a exactidão) e fiabilidade para uma finalidade específica. É importante referir que 
um método de ensaio validado pode não ser suficientemente exacto e fiável para 
ser considerado aceitável para a finalidade pretendida.
 
Ponderação da suficiência da prova:  Processo que consiste em ponderar os 
pontos fortes e os pontos fracos dos vários elementos de informação com vista a 
chegar-se a uma conclusão fundamentada sobre o potencial de perigosidade da 
substância.  ▼M2 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 704
 
Apêndice 2  
SUBSTÂNCIAS RECOMENDADAS PARA A DEMONSTRAÇÃO DE COM ­
PETÊNCIA TÉCNICA NO MÉTODO DE ENSAIO EM OLHOS DE FRANGO 
ISOLADOS (ICE)  
Antes de um método de ensaio conforme ao presente método passar a ser 
utilizado por rotina, os laboratórios podem pretender comprovar a sua competên ­
cia técnica identificando correctamente a classificação de corrosividade ocular 
das dez substâncias recomendadas no quadro 1. Estas substâncias foram selec ­
cionadas de modo a representarem a gama de reacções de irritação/corrosão ocular local obtida no ensaio ocular  in vivo  no coelho (TG 405) (ou seja, as 
categorias 1, 2A, 2B ou não classificado nem rotulado do sistema GHS da ONU 
(3) (7)). Porém, atendendo à utilização destes ensaios que se encontra validada 
(unicamente a identificação de substâncias corrosivas/fortemente irritantes ocula ­
res), apenas há que demonstrar competência em relação a dois resultados classi ­
ficativos obtidos no ensaio (corrosivo/fortemente irritante ou não-corrosivo/não 
fortemente irritante). Outros critérios de selecção foram a disponibilidade da 
substância no comércio, a existência de dados de referência  in vivo  de alta 
qualidade e a existência de dados de alta qualidade relativos aos dois métodos  
in vitro  para os quais estão a ser elaboradas directrizes de ensaio ( test guidelines ). 
Foi nesta base que se seleccionaram substâncias irritantes da lista recomendada pelo ICCVAM de 122 substâncias de referência para a validação de métodos de ensaio de toxicidade ocular  in vitro  (ver o apêndice H:  ICCVAM Recommended 
Reference Substances List ) (4). Os  Background Review Documents  do ICCVAM 
(18) (19) contêm dados de referência relativos aos métodos BCOP (método de ensaio de opacidade e permeabilidade da córnea em bovinos) e ICE.
 
Quadro 1  
Substâncias recomendadas para a demonstração de competência técnica no método ICE  
Substância química N.  o CAS (CASRN) Classe química (  1 ) Fase Classificação  in vi­
vo ( 2 ) Classificação  in vitro  ( 3 ) 
Cloreto de benzalcó ­
nio (5 %) 8001-54-5 Sal de amónio 
quaternário Líquida Categoria 1 Corrosivo/Forte ­
mente irritante 
Clorexidina 55-56-1 Amina, Ami ­
dina Sólida Categoria 1 Corrosivo/Forte ­
mente irritante 
Ácido dibenzoil-L- 
-tartárico 2743-38-6 Ácido carboxí ­
lico, Éster Sólida Categoria 1 Corrosivo/Forte ­
mente irritante 
Imidazole 288-32-4 Composto hete ­
rocíclico Sólida Categoria 1 Corrosivo/Forte ­
mente irritante 
Ácido tricloroacético 
(30 %) 76-03-9 Ácido carboxí ­
lico Líquida Categoria 1 Corrosivo/Forte ­
mente irritante 
Cloreto de 2,6-diclo ­
robenzoílo 4659-45-4 Halogeneto de 
acilo Líquida Categoria 2A Não-corrosivo/Não 
fortemente irritante 
2-Metilacetoacetato 
de etilo 609-14-3 Cetona, Éster Líquida Categoria 2B Não-corrosivo/Não 
fortemente irritante 
Nitrato de amónio 6484-52-2 Sal inorgânico Sólida Categoria 2A Não-corrosivo/Não 
fortemente irritante  ▼M2 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 705
 
Substância química N.  o CAS (CASRN) Classe química (  1 ) Fase Classificação  in vi­
vo ( 2 ) Classificação  in vitro  ( 3 ) 
Glicerol 56-81-5 Álcool Líquida Não atribuída Não-corrosivo/Não 
fortemente irritante  
n-Hexano 110-54-3 Hidrocarboneto 
(acíclico) Líquida Não atribuída Não-corrosivo/Não 
fortemente irritante  
Abreviaturas: CASRN = Número de registo do Chemical Abstracts Service. 
( 1 ) As substâncias foram classificadas em classes químicas segundo um sistema normalizado, com base nos Medical Subject Headings 
(«classificadores de temas médicos», MeSH) da Biblioteca Nacional de Medicina dos Estados Unidos da América 
(http//www.nlm.nih.gov/mesh). 
( 2 ) Com base nos resultados do ensaio ocular  in vivo  no coelho (TG 405 da OCDE) e no sistema GHS da ONU (3) (7). 
( 3 ) Com base nos resultados obtidos pelos métodos BCOP e ICE.  ▼M2 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 706
 
Apêndice 3  
Diagramas dos suportes oculares e do aparelho de superfusão para 
o método ICE  
(Ver em Burton et al. (17) uma descrição genérica dos suportes 
oculares e do aparelho de superfusão para o método ICE)
  ▼M2 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 707
 
B.49.  ENSAIO  IN VITRO  DE MICRONÚCLEOS EM CÉLULAS DE 
MAMÍFEROS  
INTRODUÇÃO  
1. O ensaio  in vitro  de micronúcleos é um ensaio de genotoxicidade para a 
deteção de micronúcleos no citoplasma de células em interfase. Os micro ­
núcleos podem provir de fragmentos cromossómicos acêntricos (ou seja, sem centrómero) ou de cromossomas completos incapazes de migrar para os pólos durante a anáfase da divisão celular. O ensaio deteta a atividade 
de produtos químicos (substâncias e misturas) clastogénicos e aneugénicos 
(1) (2) em células que se tenham dividido durante ou após a exposição à substância em estudo. Este método de ensaio admite a utilização de pro ­
tocolos que recorrem ou não ao inibidor de polimerização da actina «ci ­
tocalasina B». A adição de citocalasina B antes da mitose visada permite a 
identificação e a análise seletiva da frequência de micronúcleos nas células que sofreram uma mitose, visto que são células binucleadas (3) (4). Este 
método de ensaio também admite a utilização de protocolos sem a parte de 
citocinese, desde que a população celular analisada tenha comprovada ­
mente sofrido mitose.
 
2. Além da utilização do ensaio  in vitro  de micronúcleos para identificar 
produtos químicos (substâncias e misturas) indutores da formação de mi ­
cronúcleos, o recurso ao bloqueio da citocinese, à marcação imunoquímica 
dos cinetócoros ou à hibridação com sondas centroméricas/teloméricas 
(hibridação fluorescente  in situ  ou «FISH») pode também fornecer infor ­
mações sobre os mecanismos de indução de danos cromossomáticos e de formação de micronúcleos (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) 
(16). É possível recorrer-se à marcação ou à hibridação referidas sempre 
que se verifique um aumento da formação de micronúcleos e o investiga ­
dor pretenda determinar se este se deve a clastogénese, a aneugénese ou a ambas.
 
3. Os micronúcleos representam danos transmitidos às células-filhas, ao passo 
que as aberrações cromossomáticas contadas nas células em metáfase po ­
dem não ser transmitidas. Uma vez que é possível determinar, com relativa 
objetividade, os micronúcleos das células em interfase, o pessoal do labo ­
ratório apenas precisa de determinar se as células se dividiram ou não e quantas contêm micronúcleos. Por conseguinte, as contagens das prepara ­
ções podem ser feitas com relativa rapidez e as análises podem ser auto ­
matizadas. É assim possível efetuar contagens a milhares – e já não centenas – de células por tratamento, aumentando as potencialidades do 
ensaio. Por outro lado, uma vez que podem formar-se micronúcleos devido 
a cromossomas que ficam para trás (« lagging »), é possível detetar agentes 
indutores de aneuploidia, que são difíceis de estudar em ensaios conven ­
cionais de aberrações cromossomáticas, por exemplo, o  Test Guideline  473 
da OCDE (capítulo B.10 deste anexo) (17). Todavia, sem recurso a téc ­
nicas especiais, como o método FISH referido no ponto 2, o ensaio  in 
vitro  de micronúcleos não permite distinguir os produtos químicos indu ­
tores de poliploidia dos indutores de clastogenicidade.
 
4. O ensaio  in vitro  de micronúcleos utiliza normalmente células de cultura, 
humanas ou de roedores. O método proporciona uma base alargada para a 
investigação  in vitro  de potenciais de indução de danos cromossomáticos, 
pois permite detetar aneugénios e clastogénios.  
5. O ensaio  in vitro  de micronúcleos funciona bem numa grande variedade de 
tipos de células, na presença ou na ausência de citocalasina B. Há nume ­
rosos dados que confirmam a validade deste ensaio com várias linhagens de células de roedores (CHO, V79, CHL/IU e L5178Y) e de linfócitos 
humanos (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) 
(31). É o caso, nomeadamente, dos estudos internacionais de validação coordenados pela  Société Française de Toxicologie Génétique  (SFTG) (18) 
(19) (20) (21) (22) e dos relatórios do  International Workshop on Geno ­
toxicity Testing  (4) (16). Os dados disponíveis foram também reavaliados 
num estudo de validação retrospetivo de suficiência de prova efetuado pelo
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Centro Europeu de Validação de Métodos Alternativos (ECVAM) da Co ­
missão Europeia, tendo o ESAC (Comité Científico Consultivo do EC ­
VAM) (32) (33) (34) considerado o método de ensaio cientificamente válido. Embora não tenham sido utilizadas nos estudos de validação, está descrita a utilização da linhagem de linfoblastóides humanos TK6 
(35), de células HepG2 (36) (37) e de células embrionárias primárias de 
hámster sírio ( Mesocricetus auratus ) (38).
 
DEFINIÇÕES  
6. As definições utilizadas figuram no apêndice 1.  
CONSIDERAÇÕES INICIAIS  
7. Os ensaios  in vitro  necessitam, normalmente, de uma fonte exógena de 
ativação metabólica, a menos que as células sejam metabolicamente com ­
petentes em relação às substâncias em estudo. O sistema exógeno de 
ativação metabólica não reproduz inteiramente as condições  in vivo . 
Deve ter-se também o cuidado de evitar condições passíveis de gerarem resultados falsos positivos que não sejam reflexo de mutagenicidade in ­
trínseca, mas que possam resultar, por exemplo, de fatores como mudanças 
pronunciadas do pH ou da pressão osmótica, bem como de níveis elevados de citotoxicidade (39) (40) (41). Se a adição do produto químico em estudo modificar o pH do meio, este deve ser regulado, de preferência 
tamponando a solução de reserva, a fim de que o volume seja sempre o 
mesmo, sejam quais forem as concentrações em estudo e os controlos utilizados.
 
8. Para analisar a indução de micronúcleos, é essencial que tanto as culturas 
tratadas como as culturas não tratadas tenham sofrido mitose. A etapa mais informativa para a contagem de micronúcleos corresponde às células que tenham sofrido uma mitose durante ou após o tratamento com a substância 
em estudo.
 
PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
9. Expõem-se culturas de células humanas ou de mamíferos à substância em 
estudo, juntamente com uma fonte exógena de ativação metabólica e sem 
essa fonte, a menos que se utilizem células com capacidade metabólica 
adequada. Incluem-se em todos os ensaios, em paralelo, produtos químicos de controlo positivo e controlos do solvente/excipiente.
 
10. Durante ou após a exposição à substância em estudo, cultivam-se as cé ­
lulas por um período suficiente para que ocorram danos nos cromossomas ou nos fusos que levem à formação de micronúcleos nas células em interfase. Para indução de aneuploidia, a substância em estudo deve nor ­
malmente estar presente durante a mitose. Colhem-se células em interfase, 
coloram-se e analisam-se, para pesquisar a presença de micronúcleos. Idealmente, só devem contar-se micronúcleos em células que tenham so ­
frido mitose completa durante a exposição à substância em estudo ou 
durante o período pós-exposição, caso exista. Para o efeito, nas culturas 
que tenham sido tratadas com um bloqueador da citocinese, a contagem só é feita nas células binucleadas. Na ausência de um bloqueador da citoci ­
nese, é importante demonstrar a probabilidade elevada de que as células 
analisadas se tenham dividido durante ou após a exposição à substância 
em estudo. Em todos os protocolos, é importante demonstrar a ocorrência de proliferação celular tanto nas culturas tratadas como nas culturas de controlo, procedendo-se à contagem de micronúcleos para determinar o 
grau de citotoxicidade ou de citóstase induzido pela substância em estudo 
nas culturas (ou culturas em paralelo).
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DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Preparação  
11. Podem utilizar-se linfócitos primários cultivados de sangue humano peri ­
férico (5) (19) (42) (43) e uma série de linhagens celulares de roedores, 
como CHO, V79, CHL/IU e L5178Y (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Se forem utilizadas outras linhagens celulares ou outros tipos de células, será necessário justificá-lo com base no seu desempenho 
comprovado no ensaio, em conformidade com a secção «Critérios de 
aceitabilidade». Uma vez que a frequência de fundo de micronúcleos influencia a sensibilidade do ensaio, recomenda-se a utilização de tipos de células cuja frequência de fundo de formação de micronúcleos seja 
baixa e estável.
 
12. Os linfócitos de sangue humano periférico devem provir de indivíduos 
jovens (18 a 35 anos), saudáveis e não fumadores, em relação aos quais 
não haja notícia de terem estado expostos recentemente a radiações ou 
produtos químicos genotóxicos. Se forem reunidas para utilização células de mais do que um dador, deve indicar-se o número de dadores. A fre ­
quência de micronúcleos aumenta com a idade, sendo esta tendência mais 
pronunciada no sexo feminino do que no sexo masculino (44), o que deve 
ser tido em conta na seleção de células de dadores para um banco de células.
 
Meios e condições de cultura  
13. Devem manter-se as culturas em meios de cultura e condições de incuba ­
ção adequados, no que respeita ao tipo de recipiente, à concentração de CO
 2 , à temperatura e à humidade. As linhagens celulares e estirpes esta ­
belecidas devem ser periodicamente verificadas quanto à estabilidade do 
número modal de cromossomas e à ausência de contaminação por mico ­
plasmas, não devendo ser utilizadas se se verificar que foram contamina ­
das ou que o número modal de cromossomas se alterou. Deve conhecer-se o tempo normal do ciclo celular nas condições de cultivo utilizadas no 
laboratório. Caso se recorra ao método do bloqueio da citocinese, deve 
otimizar-se a concentração do inibidor de citocinese para o tipo de célula em causa e demonstrar-se que a mesma produz um bom rendimento de células bionucleadas para contagem.
 
Preparação das culturas  
14. Linhagens e estirpes de células estabelecidas: repicam-se células de cultu ­
ras de reserva, inoculam-se num meio de cultura, com uma densidade que evite a confluência das colónias, no caso das monocamadas, ou de modo a 
não se atingirem densidades excessivas antes da colheita, no caso das 
culturas em suspensão, e incuba-se a 37 °C.
 
15. Linfócitos: cultiva-se sangue integral, tratado com um anticoagulante (por 
exemplo, heparina), ou linfócitos separados, na presença de um agente 
mitogénico (por exemplo, fito-hemaglutinina – PHA), antes da exposição 
à substância em estudo e à citocalasina B.  
Ativação metabólica  
16. Se forem utilizadas células com capacidade metabólica endógena inade ­
quada, será necessário utilizar sistemas metabolizantes exógenos. O sis ­
tema mais geralmente utilizado é uma fração pós-mitocondrial reforçada com cofator (S9), preparada a partir de fígados de roedores tratados com agentes de indução enzimática, por exemplo, Aroclor 1254 (45) (46), ou 
uma mistura de fenobarbitona e β-naftoflavona (46) (47) (48) (49). Esta 
última combinação não é contrária à Convenção de Estocolmo sobre Po ­
luentes Orgânicos Persistentes (50) nem ao Regulamento (CE) n.
 o 850/2004 relativo a poluentes orgânicos persistentes (66) e 
comprovou-se ser tão eficaz na indução de oxidases de função mista 
como o Aroclor 1254 (46) (47) (48) (49). A fração S9 é habitualmente utilizada em concentrações na gama dos 1 % a 10 % (v/v) no meio de ensaio final. O estado do sistema de ativação metabólica pode depender da 
classe do produto químico em estudo. Em alguns casos, pode revelar-se 
adequado utilizar várias concentrações da fração S9.
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17. As células utilizadas no estudo podem provir de linhagens celulares mo ­
dificadas por engenharia genética que exprimam enzimas de ativação es ­
pecíficos, humanos ou de roedores, e dispensem, assim, um sistema de ativação metabólica exógeno. Nesses casos, a escolha das linhagens celu ­
lares utilizadas terá de ser justificada cientificamente – por exemplo, pela 
adequação das oxidases de função mista ao metabolismo da substância em 
estudo (51) e pela resposta das mesmas a clastogénios e aneugénios co ­
nhecidos (ver a secção «Critérios de aceitabilidade»). Deve ter-se presente que a substância em estudo pode não ser metabolizada pela(s) oxidase(s) 
de função mista expressa(s), caso no qual a ocorrência de resultados 
negativos não indicaria que a substância em estudo não é indutora de micronúcleos.
 
Preparação da substância em estudo  
18. Os produtos químicos sólidos devem ser dissolvidos em solventes ou 
excipientes adequados e, se necessário, ser diluídos antes do tratamento das células. Os produtos químicos líquidos podem ser adicionados direta ­
mente aos sistemas em estudo e/ou ser diluídos antes do tratamento. Para o 
ensaio de gases e produtos químicos voláteis, devem efetuar-se alterações 
adequadas aos protocolos normalizados, como o tratamento em recipiente fechado (52) (53). Devem utilizar-se preparações frescas da substância em estudo, a menos que haja dados de estabilidade que demonstrem a acei ­
tabilidade do seu armazenamento.
 
Condições de ensaio  
Solventes/excipientes  
19. O solvente/excipiente não deve reagir com a substância em estudo nem ser 
incompatível com a sobrevivência das células ou com a manutenção da 
atividade da fração S9 à concentração utilizada. Caso se utilizem solven ­
tes/excipientes cujas propriedades não se encontrem totalmente elucidadas (em vez de, por exemplo, água, meio de cultura celular ou sulfóxido de 
dimetilo), devem fornecer-se dados que comprovem a respetiva compati ­
bilidade com a substância em estudo e a inexistência de genotoxicidade por parte do mesmo. Recomenda-se, sempre que possível, a utilização prioritária de solventes/excipientes aquosos.
 
Utilização de citocalasina B como bloqueador da citocinese  
20. Um dos aspetos mais importantes a ponderar no desempenho do ensaio  in 
vitro  de micronúcleos é a necessidade de garantir que as células sujeitas à 
contagem sofreram mitose durante o tratamento ou durante o período de 
incubação após o tratamento, caso exista. A citocalasina B tem sido o 
agente mais utilizado para bloquear a citocinese, pois inibe a agregação da actina e impede assim a separação das células-filhas após a mitose, conduzindo à formação de células binucleadas (5) (54) (55). Pode, deste 
modo, circunscrever-se a contagem de micronúcleos às células que sofre ­
ram mitose durante ou após o tratamento. Pode medir-se simultaneamente o efeito da substância em estudo na cinética da proliferação celular. Quando se utilizam linfócitos humanos, é necessário recorrer a citocalasina 
B como bloqueador da citocinese, porque, caso contrário, os tempos do 
ciclo celular variariam de cultura para cultura e de dador para dador e nem todos os linfócitos responderiam ao PHA. Têm sido utilizados outros métodos – que são objeto do ponto 26 –, no ensaio de linhagens celulares, 
para determinar se as células sujeitas à contagem se dividiram.
 
21. O laboratório determina, para cada tipo de célula, a concentração neces ­
sária de citocalasina B para otimizar a frequência de células binucleadas 
nas culturas de controlo do solvente/excipiente. A concentração adequada 
de citocalasina B situa-se normalmente entre 3 e 6 μg/ml. ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 711
 
Medição da proliferação celular e da citotoxicidade e escolha das concen ­
trações de exposição  
22. Ao determinar a concentração máxima a ensaiar da substância em estudo, 
devem evitar-se concentrações capazes de gerar respostas falsas positivas, como as que produzam citotoxicidade excessiva, precipitações no meio de cultura e alterações pronunciadas do pH ou da pressão osmótica (39) (40) (41).
 
23. Efetuam-se medições da proliferação celular para garantir que as células 
tratadas sofreram mitose durante o ensaio e que os tratamentos são efe ­
tuados a níveis adequados de citotoxicidade (ver o ponto 29). Se não se utilizar citocalasina B, determina-se a citotoxicidade com e sem ativação 
metabólica, nas células que exijam essa ativação, calculando o aumento 
relativo da contagem celular (RICC) ou a duplicação da população em termos relativos (RPD) – ver as fórmulas no apêndice 2. Caso se utilize citocalasina B, pode determinar-se a citotoxicidade calculando o índice de 
replicação (IR) – ver a fórmula no apêndice 2.
 
24. O tratamento das culturas com citocalasina B e a determinação das fre ­
quências relativas de células mononucleadas, binucleadas e plurinucleadas na cultura celular constituem um método rigoroso de quantificação do 
efeito do tratamento na proliferação celular e da atividade citotóxica e 
citostática do mesmo (5), garantindo que apenas são contadas células que se dividiram durante ou após o tratamento.
 
25. Nos estudos com citocalasina B, a atividade citotóxica/citostática pode 
quantificar-se com base no índice de proliferação com bloqueio da 
citocinese (CBPI) (5) (26) (56) ou ser determinada a partir do índice de replicação (IR) de, pelo menos, 500 células por cultura (ver as fórmulas no apêndice 2). Quando se utiliza citocalasina B para determinar a prolifera ­
ção celular, o cálculo do CBPI ou do IR deve basear-se em, pelo menos, 
500 células por cultura. A determinação destes parâmetros, entre outros, pode ser utilizada para estimar a citotoxicidade, comparando os valores correspondentes às culturas tratadas e de controlo. A avaliação de outros 
indicadores de citotoxicidade (grau de confluência, número de células, 
apóptoses, necroses, contagem das células em metáfase, etc.) pode fornecer informações úteis.
 
26. Nos estudos em que não se recorra à citocalasina B, é necessário demons ­
trar que as células contadas na cultura sofreram divisão durante ou após o 
tratamento com a substância em estudo, pois, caso contrário, podem surgir respostas falsas negativas. Entre os métodos que têm sido utilizados para garantir que a contagem incide em células que se dividiram contam-se a 
incorporação e a deteção subsequente de bromodesoxiuridina (BrdU), para 
identificar as células que se replicaram (57), a formação de clones, quando se tratam e contam  in situ , numa lâmina de microscópio, células de li ­
nhagens permanentes – índice de proliferação (IP) – (25) (26) (27) (28), a 
medição da duplicação da população em termos relativos (RPD) ou do 
aumento relativo da contagem celular (RICC) e outros métodos de eficácia comprovada (16) (56) (58) (59) (ver as fórmulas no apêndice 2). A ava ­
liação de outros indicadores de citotoxicidade ou de citóstase (grau de 
confluência, número de células, apóptoses, necroses, contagem das células 
em metáfase, etc.) pode fornecer informações úteis.
 
27. Devem avaliar-se, pelo menos, três concentrações de ensaio analisáveis. 
Para isso, pode ser necessário efetuar o ensaio utilizando um número 
maior de concentrações próximas e examinar a formação de micronúcleos 
nas concentrações que proporcionem a gama apropriada de citotoxicidades. Alternativamente, pode efetuar-se um ensaio preliminar de citotoxicidade, para reduzir o intervalo a utilizar no ensaio definitivo.
 
28. A concentração mais elevada deve gerar 55 % ± 5 % de citotoxicidade. 
Níveis mais elevados podem induzir, como efeito secundário da citotoxi ­
cidade, danos cromossomáticos (60). Caso esta ocorra, as concentrações escolhidas para o ensaio devem abranger a gama compreendida entre a 
concentração que produz 55 % ± 5 % de citotoxicidade e uma concentra ­
ção que gere pouca ou nenhuma citotoxicidade.
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29. Se não se observar citotoxicidade nem precipitação, a maior concentração 
ensaiada deve corresponder à menor das seguintes concentrações: 0,01 M, 
5 mg/ml ou 5 μl/ml. As concentrações escolhidas para análise devem, 
normalmente, estar separadas por um intervalo não superior a 10. No caso das substâncias cuja curva de resposta à concentração tenha um 
declive acentuado, pode ser necessário aproximar mais as concentrações da 
substância em estudo, a fim de se contarem também culturas sujeitas a toxicidade moderada e baixa.
 
30. Se a solubilidade constituir um fator limitante, a concentração máxima, 
caso o limite não seja imposto pela citotoxicidade, deve ser a menor 
concentração à qual se observe precipitação nas culturas, devendo esta ser mínima e não interferir na contagem. A avaliação da precipitação deve ser feita por métodos como a microscopia ótica, procurando 
detetar-se a persistência de precipitados (no final do tratamento) ou a 
formação de precipitados durante a cultura.
 
Controlos  
31. Cada experiência deve incluir, em paralelo, controlos positivos e do sol ­
vente/excipiente, com e sem ativação metabólica.  
32. São necessários controlos positivos para comprovar a capacidade das cé ­
lulas e do protocolo de ensaio utilizados para identificar clastogénios e aneugénios e para garantir a capacidade metabólica da preparação S9. 
Devem utilizar-se no controlo positivo indutores reconhecidos da formação 
de micronúcleos, a concentrações que previsivelmente produzirão aumen ­
tos pequenos, mas reprodutíveis, em relação à linha de base e comprova ­
rão a sensibilidade do sistema de ensaio. As concentrações do controlo 
positivo devem ser escolhidas de modo que os seus efeitos sejam claros, 
mas não permitam à pessoa que procede às leituras identificar imediata ­
mente as lâminas codificadas.
 
33. Deve utilizar-se um clastogénio que necessite de ativação metabólica (por 
exemplo, ciclofosfamida ou benzo[ a]pireno) para demonstrar a competên ­
cia metabólica e a capacidade de deteção de clastogénios do sistema de ensaio. Caso se justifique, poderão ser utilizados outros controlos positi ­
vos. Uma vez que algumas substâncias de controlo positivo que necessi ­
tam de ativação metabólica podem ativar-se, sem recurso a fatores exóge ­
nos, em determinadas condições de tratamento ou com determinadas li ­
nhagens celulares, deve pesquisar-se a necessidade de ativação metabólica e a atividade da preparação S9 na linhagem celular escolhida e às concen ­
trações selecionadas.
 
34. Presentemente, não se conhecem aneugénios que necessitem de ativação 
metabólica para manifestarem atividade genotóxica (16). A colchicina e a vimblastina são dois exemplos de substâncias atualmente aceites para con ­
trolo positivo da atividade aneugénica. Podem utilizar-se outros produtos 
químicos cuja indução de micronúcleos se deva apenas, ou essencialmente, à atividade aneugénica. Para evitar a necessidade de dois controlos posi ­
tivos – de clastogenicidade e de aneugenicidade – sem ativação metabó ­
lica, o controlo de aneugenicidade pode servir de controlo positivo sem S9 
e o controlo de clastogenicidade pode servir para verificar a adequação do sistema de ativação metabólica utilizado. No caso das células que não necessitem de S9, deve utilizar-se um controlo positivo para a clastogeni ­
cidade e outro para a aneugenicidade. Figuram no apêndice 3 algumas 
sugestões de produtos químicos de controlo positivo.
 
35. Se estiverem disponíveis produtos químicos adequados, é admissível a 
utilização de controlos positivos específicos das classes químicas corres ­
pondentes. Todos os produtos químicos de controlo positivo utilizados 
devem adequar-se ao tipo de célula e às condições de ativação em causa.  ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 713
 
36. Devem incluir-se controlos do solvente/excipiente para cada período trans ­
corrido até à colheita. Também deve incluir-se um controlo negativo (sem 
solvente/excipiente), não-tratado, a menos que estejam publicados dados ou que o laboratório disponha de dados históricos de controlo demons ­
trativos de que, às concentrações do solvente escolhido utilizadas, este não 
induz efeitos genotóxicos nem outros efeitos deletérios.
 
PROCEDIMENTO DE ENSAIO  
Esquema de tratamento  
37. A fim de maximizar a probabilidade de deteção de ações aneugénicas ou 
clastogénicas num determinado estádio do ciclo celular, é importante tratar com a substância em estudo um número suficiente de células em todos os 
estádios do respetivo ciclo celular. O esquema de tratamento aplicado às 
linhagens celulares e às culturas de células primárias pode, portanto, diferir um pouco do aplicado aos linfócitos, que necessitam de estimulação mi ­
togénica para iniciarem o seu ciclo celular. Este assunto é tratado nos 
pontos 41 a 43 (16).
 
38. De acordo com modelos teóricos e dados publicados (18), a maioria dos 
aneugénios e dos clastogénios é detetada com um tratamento curto durante três a seis horas, na presença ou ausência de S9, seguido da remoção da 
substância em estudo e de um período de cultura de 1,5 a 2,0 ciclos 
celulares (6). Procede-se à colheita de células decorrido um período cor ­
respondente a cerca de 1,5 a 2,0 ciclos celulares normais (isto é, sem tratamento) após o início ou o termo do tratamento (ver o quadro 1). A 
cronologia da colheita das células e os tempos de recuperação podem ser 
dilatados, caso se saiba ou se suspeite que a substância em estudo afeta a duração do ciclo celular (por exemplo, ao ensaiar compostos nucleosídi ­
cos).
 
39. Devido à citotoxicidade potencial das preparações de S9 para as culturas 
de células de mamíferos, só na ausência deste se dilata o tempo de trata ­
mento a um período correspondente a 1,5 a 2,0 ciclos celulares normais. No caso desse tratamento prolongado, apresentam-se duas possibilidades 
de tratamento das células com o produto químico em estudo, na ausência 
ou na presença de citocalasina B. Essas possibilidades alternativas destinam-se a superar as situações em que se tema a eventual interação da substância em estudo com a citocalasina B.
 
40. Os esquemas propostos para o tratamento das células apresentam-se no 
quadro 1. Estes esquemas de tratamento gerais podem ser alterados em função da estabilidade ou reatividade da substância em estudo, ou das especificidades de crescimento das células utilizadas. Os tratamentos de ­
vem começar e terminar sempre durante a fase de crescimento exponencial 
das células. Para informações mais pormenorizadas sobre estes esquemas de tratamento, ver os pontos 41 a 47.
 
Quadro 1  
Tratamento das células e cronologia da colheita de células no ensaio  in vitro  de micronúcleos  
Linfócitos, células primárias e linhagens ce ­
lulares tratados com citocalasina B + S9 Tratamento de três a seis horas, na presença 
de S9; 
Remoção do S9 e do meio de tratamento; Adição de meio fresco e de citocalasina B; 
Colheita após 1,5 a 2,0 ciclos celulares nor ­
mais. 
– S9 
Exposição curta Tratamento de três a seis horas; 
Remoção do meio de tratamento; 
Adição de meio fresco e de citocalasina B; 
Colheita após 1,5 a 2,0 ciclos celulares nor ­
mais.
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– S9 
Exposição prolongada  Opção A:  Tratamento durante 1,5 a 2,0 ciclos 
celulares normais, na presença de citocalasina B; 
Colheita no termo do período de exposição;  
Opção B:  Tratamento durante 1,5 a 2,0 ciclos 
celulares normais; 
Remoção da substância em estudo; 
Adição de meio fresco e de citocalasina B; Colheita após 1,5 a 2,0 ciclos celulares normais. 
Linhagens celulares tratadas sem citocalasina B 
(Procede-se de modo idêntico ao acima descrito, exceto que não se adiciona citocalasina B.)
 
Linfócitos, células primárias e linhagens celulares tratadas com citocalasina B  
41. Relativamente aos linfócitos, a melhor prática é iniciar a exposição à 
substância em estudo 44 a 48 horas após a estimulação com PHA, quando tiver desaparecido a sincronização de ciclos (5). No ensaio inicial, 
tratam-se as células durante três a seis horas com a substância em estudo, 
na ausência e na presença de S9. Remove-se o meio de tratamento e substitui-se este por meio fresco, ao qual se juntou citocalasina B. Procede-se à colheita de células depois de decorrido o período correspon ­
dente a 1,5 a 2,0 ciclos celulares normais.
 
42. Se ambos os ensaios iniciais de tratamento curto (três a seis horas) derem 
resultados negativos ou inconclusivos, procede-se, a seguir, a um trata ­
mento sem S9 com um período de exposição dilatado. Existem duas possibilidades de tratamento com o mesmo grau de aceitabilidade. Toda ­
via, pode ser mais adequado seguir a opção A no caso dos linfócitos 
estimulados, cujo crescimento exponencial pode registar um abrandamento 
96 horas após a estimulação. Por outro lado, no caso da opção B, as culturas de células não devem ainda coalescer quando da colheita de células final.
 
— Opção A: Tratamento das células com a substância em estudo durante 
1,5 a 2,0 ciclos celulares normais; colheita de células no final do tempo de tratamento.
 
— Opção B: Tratamento das células com a substância em estudo durante 
1,5 a 2,0 ciclos celulares normais. Remoção do meio de tratamento e 
substituição deste por meio fresco; colheita de células depois de trans ­
corridos 1,5 a 2,0 ciclos celulares normais suplementares.  
43. O tratamento de células primárias e de linhagens celulares é idêntico ao 
descrito para os linfócitos, exceto que não é necessário estimulá-los com 
PHA durante 44 a 48 horas. As células que não sejam linfócitos devem ser expostas de maneira que, no final do estudo, o seu crescimento ainda seja 
exponencial.
 
Linhagens celulares tratadas sem citocalasina B  
44. Tratam-se as células durante três a seis horas, na ausência e na presença de 
S9. Remove-se o meio de tratamento e substitui-se este por meio fresco. 
Procede-se à colheita de células depois de decorrido o período correspon ­
dente a 1,5 a 2,0 ciclos celulares normais.  ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 715
 
45. Se ambos os ensaios iniciais de tratamento curto (três a seis horas) derem 
resultados negativos ou inconclusivos, procede-se a seguir a um tratamento 
(sem S9) com um período de exposição dilatado. Existem duas possibili ­
dades de tratamento com o mesmo grau de aceitabilidade:  
— Opção A: Tratamento das células com a substância em estudo durante 
1,5 a 2,0 ciclos celulares normais; colheita de células no final do tempo de tratamento.
 
— Opção B: Tratamento das células com a substância em estudo durante 
1,5 a 2,0 ciclos celulares normais. Remoção do meio de tratamento e 
substituição deste por meio fresco; colheita de células depois de de ­
corridos 1,5 a 2,0 ciclos celulares normais.  
46. No final do tratamento de três a seis horas, podem estar presentes células 
mitóticas em monocamadas (identificáveis pela sua forma arredondada e 
por se destacarem da superfície). Por se destacarem com facilidade, estas 
células podem perder-se quando da remoção do meio com a substância em estudo. Devem tomar-se as precauções necessárias para recolher essas células ao lavar as culturas e para as repor com estas, de modo a evitar 
perdas de células que se encontrem em mitose, e eventualmente em pro ­
cesso de formação de micronúcleos, no processo de colheita de células.
 
Número de culturas  
47. Devem utilizar-se culturas em duplicado para cada concentração da subs ­
tância em estudo, assim como para o excipiente/solvente e o controlo negativo. Quando os dados históricos do laboratório mostrarem que a 
diferença entre os duplicados das culturas é mínima, admite-se a utilização 
de uma só cultura. Nesse caso, recomenda-se a análise de mais concen ­
trações.
 
Colheita de células e preparação das lâminas  
48. As células de cada cultura são colhidas e manipuladas separadamente. A 
preparação das células pode incluir um tratamento hipotónico, mas tal não 
é necessário de for possível obter uma dilatação adequada das células por 
outra via. Podem utilizar-se várias técnicas na preparação das lâminas, desde que se obtenham preparações celulares de alta qualidade para a contagem. Deve conservar-se o citoplasma das células, a fim de possibi ­
litar a deteção dos micronúcleos e (no método com bloqueio da citocinese) 
uma identificação fiável das células binucleadas.
 
49. A coloração das lâminas pode fazer-se por vários métodos, por exemplo, 
com o corante Giemsa ou corantes fluorescentes específicos do ADN. A utilização de um corante específico do ADN – por exemplo, laranja de 
acridina (61) ou uma combinação do corante 33258 da Hoechst e de 
pironina-Y (62) – pode eliminar alguns erros associados à utilização de corantes inespecíficos do ADN. Se houver interesse em obter informações sobre os mecanismos de formação dos micronúcleos, podem utilizar-se na 
identificação do conteúdo destes (cromossomas/fragmentos de cromosso ­
mas) anticorpos anticinetócoros, o método FISH com sondas pancentro ­
méricas de ADN ou a marcação  in situ  com iniciadores pancentroméricos 
específicos, em combinação com uma coloração de contraste adequada do 
ADN (15) (16). Na diferenciação entre clastogénios e aneugénios, podem 
utilizar-se outros métodos cuja eficácia tenha sido demonstrada.
 
Análise  
50. Antes da análise microscópica, codificam-se todas as lâminas independen ­
temente, incluindo as do solvente/excipiente e as dos controlos. Outra possibilidade de análise das amostras codificadas consiste em utilizar um 
sistema automático validado de análise de imagens, ou de citometria em 
fluxo.
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51. Nas culturas de células tratadas com citocalasina B, analisa-se a frequência 
de micronúcleos em, pelo menos, 2 000 células binucleadas por concen ­
tração (havendo duas culturas por concentração, examinam-se no mínimo 1 000 células binucleadas por cultura). Se houver apenas uma cultura por concentração, deve proceder-se à contagem em, pelo menos, 2 000 células 
binucleadas dessa cultura. Se o número de células disponível para conta ­
gem, em cada concentração, for substancialmente inferior a 1 000 células binucleadas por cultura – ou substancialmente inferior a 2 000 células binucleadas, se houver apenas uma cultura – e não se detetar um aumento 
significativo de micronúcleos, deve repetir-se o ensaio, utilizando mais 
células ou a concentrações menos tóxicas, conforme seja mais convenien ­
te. Devem ser tomadas precauções para não se contarem células binuclea ­
das com formas irregulares ou cujos núcleos tenham dimensões muito 
diferentes. Também não devem tomar-se células plurinucleadas com dila ­
tação insuficiente por células binucleadas. Não devem pesquisar-se micro ­
núcleos em células com mais de dois núcleos principais, cuja frequência normal de micronúcleos pode ser mais elevada (63) (64). Admite-se a 
contagem em células mononucleadas se a substância em estudo interferir 
comprovadamente com a atividade da citocalasina B.
 
52. Nas linhagens celulares ensaiadas sem tratamento com citocalasina B, 
procede-se à contagem de micronúcleos em, pelo menos, 2 000 células 
por concentração (havendo duas culturas por concentração, examinam-se no mínimo 1 000 células binucleadas por cultura). Se houver apenas uma cultura por concentração, deve proceder-se à contagem em, pelo menos, 
2 000 células dessa cultura.
 
53. Quando se utiliza citocalasina B, devem utilizar-se, pelo menos, 500 cé ­
lulas por cultura para calcular o CBPI ou o índice de replicação, a fim de 
determinar a proliferação celular (ver o apêndice 2). Se os tratamentos forem efetuados sem citocalasina B, é essencial demonstrar que as células contadas passaram pelo processo de proliferação, como se referiu nos 
pontos 24 a 27.
 
Critérios de aceitabilidade  
54. Os laboratórios que pretendam utilizar o ensaio  in vitro  de micronúcleos 
descrito no presente método devem demonstrar ser capazes de detetar, com 
fiabilidade e exatidão, produtos químicos com atividade aneugénica ou clastogénica reconhecida, com ou sem ativação metabólica, bem como produtos químicos com reação reconhecidamente negativa, utilizando os 
produtos químicos de referência do apêndice 3. Como prova de capacidade 
de execução do presente método, caso o ensaio seja realizado sem adição de citocalasina B, o laboratório deve demonstrar que as células nas quais se efetua a contagem de micronúcleos completaram uma divisão celular.
 
55. Recomendam-se como produtos de referência os produtos químicos indi ­
cados no apêndice 3. Podem substituir-se produtos químicos da lista, ou 
nela incluir outros, se a atividade desses produtos for conhecida, se indu ­
zirem a formação de micronúcleos pelos mesmos mecanismos de ação e também se forem comprovadamente adequados aos produtos químicos a ensaiar pelo método de ensaio  in vitro  de micronúcleos. A justificação a 
apresentar pode incluir um estudo de validação com uma vasta gama de 
substâncias ou centrado numa gama mais estreita, baseada na classe quí ­
mica da substância ou no mecanismo indutor de danos em estudo.
 
56. As frequências de micronúcleos no controlo do solvente/excipiente e nas 
culturas não tratadas devem ser constantemente baixas e reprodutíveis (normalmente 5 a 25 micronúcleos por milhar de células, para os tipos de células referidos no ponto 11). Outros tipos de células podem apresen ­
tar outras gamas de resposta, a determinar no processo de validação dos 
mesmos para o método de ensaio  in vitro  de micronúcleos. Os dados dos 
controlos positivo, negativo e do solvente devem ser utilizados para esta ­
belecer gamas históricas para os controlos. Esses valores são utilizados 
para decidir se um controlo negativo/positivo efetuado em paralelo é ou 
não adequado a uma determinada experiência.
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57. Se forem propostas pequenas alterações do protocolo para o ensaio (por 
exemplo, recurso a técnicas automáticas de contagem, em vez de técnicas 
não automáticas, ou utilização de um novo tipo de células), o protocolo modificado só pode considerar-se aceitável depois de se demonstrar que a alteração é adequada. Essa demonstração inclui prova da possibilidade de 
detetar os principais mecanismos de cisão, aquisição ou perda cromosso ­
mática, bem como de obter resultados positivos e negativos adequados para a classe da substância – ou a gama alargada de substâncias – a estudar.
 
DADOS E RELATÓRIOS  
Tratamento dos resultados  
58. Se for utilizada a técnica do bloqueio da citocinese, a avaliação da indução 
de micronúcleos deve basear-se apenas na frequência de células binuclea ­
das que possuam micronúcleos, independentemente do número de micro ­
núcleos por célula. A contagem do número de células com um, dois ou mais micronúcleos pode fornecer informações úteis, mas não é obrigatória.
 
59. Também devem ser medidas, em paralelo, a citotoxicidade e/ou a citóstase 
em todas as culturas tratadas e nas culturas de controlo do solvente/ex ­
cipiente (58). Para medir o atraso do ciclo celular quando se recorre ao 
método do bloqueio da citocinese, calcula-se o CBPI e o índice de repli ­
cação de todas as culturas tratadas e de controlo. Se não se adicionar citocalasina B, determina-se a duplicação da população em termos 
relativos (RPD), o aumento relativo da contagem celular (RICC) ou o 
índice de proliferação (PI) – ver o apêndice 2.
 
60. Os dados devem ser fornecidos por cultura e resumidos em quadros.  
61. A indução de micronúcleos, por produtos químicos com esse efeito, nos 
ensaios  in vitro  pode dever-se a cisão ou perda cromossomática ou a 
ambos os efeitos. Para aprofundar se o mecanismo da indução de micro ­
núcleos se deve a uma atividade clastogénica e/ou aneugénica, pode recorrer-se a métodos de análise que utilizam anticorpos anticinetócoros, 
sondas centroméricas específicas  in situ  ou outros.
 
Avaliação e interpretação dos resultados  
62. No caso de resultados claramente positivos ou negativos, não são exigidos 
ensaios adicionais de confirmação. Os resultados inconclusivos podem ser 
clarificados analisando mais 1 000 células, de todas as culturas, para que os ensaios não percam o seu caráter cego. Se, ainda assim, não for pos ­
sível esclarecer o resultado, será necessário efetuar mais ensaios. Nessa 
eventualidade, será de ponderar a modificação dos parâmetros do estudo, 
alargando ou estreitando a gama de condições, conforme se justifique. Os parâmetros do estudo que podem ser alterados incluem o espaçamento das concentrações ensaiadas, a cronologia do tratamento e da colheita de cé ­
lulas e/ou as condições da ativação metabólica.
 
63. Existem vários critérios para determinar se um resultado é positivo, no ­
meadamente um aumento do número de células com micronúcleos em 
função da concentração ou com significado estatístico. O primeiro aspeto a ponderar é o significado biológico dos resultados. Ao avaliar se a res ­
posta obtida tem significado em termos biológicos, pode constituir fator de 
orientação verificar se os valores observados se situam dentro ou fora da 
gama historicamente abrangida pelos controlos. Para facilitar a avaliação dos resultados dos ensaios, podem utilizar-se métodos estatísticos adequa ­
dos (65). Todavia, devem avaliar-se resultados estatísticos associados à 
resposta à dosagem. Também devem ser tidos em conta os dados históri ­
cos e de reprodutibilidade.
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64. Embora a maior parte dos ensaios dê resultados claramente positivos ou 
negativos, em alguns casos os dados obtidos não permitem tirar conclusões 
definitivas acerca da atividade da substância em estudo. Essas respostas inconclusivas ou questionáveis podem ocorrer independentemente do nú ­
mero de vezes que o ensaio for repetido.
 
65. Um resultado positivo num ensaio  in vitro  de micronúcleos indica que a 
substância em estudo induz cisões ou perdas cromossomáticas em células de mamíferos em cultura. Um resultado negativo indica que, nas condições do ensaio, a substância em estudo não induz cisões, aquisições ou perdas 
cromossomáticas em células de mamíferos em cultura.
 
Relatório do ensaio  
66. O relatório do ensaio deve incluir, pelo menos, as informações seguintes 
que sejam pertinentes no estudo realizado:  
Produto químico em estudo:  
— dados de identificação, número de registo CAS ( Chemical Abstract 
Service ) e número CE,  
— natureza física e grau de pureza,  
— propriedades físico-químicas pertinentes para o estudo,  
— reatividade do produto com o solvente/excipiente ou com o meio de 
cultura das células;  
Solvente/excipiente:  
— justificação da escolha do solvente/excipiente,  
— solubilidade e estabilidade do produto químico em estudo no solvente/ 
/excipiente;  
Células:  
— tipo e origem das células utilizadas,  
— adequação do tipo de célula utilizado,  
— ausência de micoplasmas, quando aplicável,  
— dados relativos à duração do ciclo celular, ao tempo de duplicação e ao 
índice de proliferação,  
— caso sejam utilizados linfócitos, sexo, idade e número dos dadores de 
sangue, se pertinente,  
— caso sejam utilizados linfócitos, utilização de sangue integral ou de 
linfócitos separados,  
— número de repicagens, quando aplicável,  
— métodos de manutenção das culturas celulares, quando aplicável,  
— número modal de cromossomas,  
— duração normal (correspondente ao controlo negativo) do ciclo celular;  
Condições de ensaio:  
— identificação da substância bloqueante da citocinese eventualmente 
utilizada (por exemplo, citocalasina B), concentração da mesma e du ­
ração da exposição das células,  
— justificação da seleção das concentrações e do número de culturas, 
incluindo, quando disponíveis, dados de citotoxicidade e limitações de solubilidade,
 
— composição dos meios e, quando aplicável, concentração de CO  2 , 
— concentrações da substância em estudo,  ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 719
 
— concentração (e/ou volume) do excipiente e da substância em estudo 
adicionados,  
— tempo e temperatura de incubação,  
— duração do tratamento,  
— tempo decorrido entre o tratamento e a colheita das células,  
— densidade celular da sementeira, quando aplicável,  
— tipo e composição do sistema de ativação metabólica; critérios de 
aceitabilidade,  
— produtos químicos de controlo positivo e controlos negativos,  
— métodos de preparação das lâminas e técnica de coloração utilizada,  
— critérios de identificação dos micronúcleos,  
— números de células analisados,  
— métodos de medição da citotoxicidade,  
— outros dados pertinentes relativos à citotoxicidade,  
— critérios definidos para que os resultados do estudo sejam considerados 
positivos, negativos ou inconclusivos,  
— método(s) de análise estatística utilizado(s),  
— métodos (como a utilização de anticorpos anticinetócoros) para deter ­
minar se os micronúcleos contêm cromossomas inteiros ou fragmentos 
de cromossomas, quando aplicável;  
Resultados:  
— métodos de medição da citotoxicidade utilizados, por exemplo, CBPI 
ou índice de replicação, no caso do recurso ao método do bloqueio da 
citocinese, ou RICC, RPD ou índice de proliferação, no caso contrário; 
outras observações, se pertinente (por exemplo, grau de confluência celular, apóptoses, necroses, contagem das células em metáfase, fre ­
quência de células binucleadas),
 
— sinais de precipitação,  
— dados de pH e de pressão osmótica do meio de tratamento, caso 
tenham sido determinados,  
— definição das células aceitáveis para análise,  
— distribuição das células mono, bi e plurinucleadas, se for utilizado um 
método de bloqueio da citocinese,  
— número de células com micronúcleos, para cada cultura tratada e de 
controlo, especificando, caso se justifique, se se trata de células binu ­
cleadas ou mononucleadas,  
— relação concentração-resposta, quando for possível determiná-la,  
— dados (concentrações e solventes) do controlo negativo (solvente/ex ­
cipiente) e do produto químico de controlo positivo,  
— dados históricos do controlo negativo (solvente/excipiente) e do pro ­
duto químico de controlo positivo, indicando intervalos, médias, desvios-padrão e intervalos de confiança (por exemplo, 95 %),
 
— análise estatística; valores p (probabilidade de significância), caso se ­
jam conhecidos;  
Discussão dos resultados;  
Conclusões.  ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 720
 
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(66) Regulamento (CE) n.  o 850/2004 do Parlamento Europeu e do Conselho, de 
29 de abril de 2004, relativo a poluentes orgânicos persistentes e que altera 
a Diretiva 79/117/CEE, JO L 229 de 30.4.2004, p. 5.  ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 725
 
Apêndice 1  
Definições  
Aneugénio:  Substância ou processo que, por interação com os componentes do 
ciclo mitótico ou meiótico de divisão celular, origina aneuploidia em células ou organismos.
 
Aneuploidia:  Desvio, num único ou em mais cromossomas, mas não por séries 
completas de cromossomas (poliploidia), do número diploide (ou haploide) nor ­
mal de cromossomas.  
Apóptose:  Morte celular programada, caracterizada por uma série de etapas con ­
ducentes à desintegração das células em partículas envolvidas por membranas, 
que são em seguida eliminadas por fagocitose ou excreção.  
Proliferação celular:  Aumento do número de células por divisão celular mitótica.  
Centrómero:  Região do ADN de um cromossoma na qual os dois cromatídeos se 
juntam e à qual os dois cinetócoros estão ligados lado a lado.  
Clastogénio:  Substância ou processo causador de aberrações cromossomáticas 
estruturais em populações celulares ou organismos.  
Citocinese:  Processo de divisão celular imediatamente após a mitose, conducente 
à formação de duas células-filhas, cada uma com o seu núcleo.  
Índice de proliferação com bloqueio da citocinese (em inglês «CBPI», de «cy ­
tokinesis-block proliferation index»):  Proporção de células «segunda divisão» na 
população tratada, relativamente ao controlo não tratado (ver a fórmula no apên ­
dice 2).  
Citóstase:  Inibição do crescimento celular (ver a fórmula no apêndice 2).  
Citotoxicidade:  Efeitos nocivos na estrutura ou na função celular que acabam por 
causar a morte da célula.  
Genotóxico:  Termo geral que abrange todos os tipos de danos ao ADN ou aos 
cromossomas, incluindo fratura, rearranjos por adução, mutações, aberrações cromossomáticas e aneuploidia. Nem todos os tipos de efeitos genotóxicos ori ­
ginam mutações ou danos cromossomáticos estáveis.
 
Célula em interfase:  Célula que não está na fase mitótica.  
Cinetócoro:  Estrutura proteica formada no centrómero de um cromossoma, à qual 
se ligam as fibras fusiformes durante a divisão celular, permitindo o movimento 
organizado dos cromossomas-filhos para os pólos das células-filhas.  
Micronúcleo:  Pequeno núcleo separado dos núcleos principais das células e que 
se adicionam a estes, formados durante a telófase da mitose ou meiose por 
fragmentos de cromossoma ou cromossomas inteiros que ficam para trás.  
Mitose:  Divisão do núcleo celular, habitualmente subdividida em prófase, pro ­
metáfase, metáfase, anáfase e telófase.  
Índice mitótico:  Relação entre o número de células em metáfase e o número total 
de células observadas numa população celular, que fornece uma indicação do grau de proliferação da população em causa.
 
Mutagénico:  Que produz uma alteração hereditária de sequências de pares de 
bases do ADN em genes, ou da estrutura dos cromossomas (aberrações cromos ­
somáticas).  ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 726
 
Não disjunção:  Falha de separação de cromatídeos emparelhados, que não são 
adequadamente segregados para as células-filhas em formação, originando célu ­
las-filhas com número anormal de cromossomas.  
Poliploidia:  Aberrações cromossomáticas numéricas em células ou organismos, 
que abrangem uma ou mais séries completas de cromossomas – por oposição à 
aneuploidia, que abrange um ou mais cromossomas.  
Índice de proliferação (IP):  Método de medição da citotoxicidade quando não se 
utiliza citocalasina B (ver a fórmula no apêndice 2).  
Aumento relativo da contagem celular (em inglês «RICC», de «relative increase 
in cell count»):  Método de medição da citotoxicidade quando não se utiliza 
citocalasina B (ver a fórmula no apêndice 2).  
Duplicação da população em termos relativos (em inglês «RPD», de «relative 
population doubling»):  Método de medição da citotoxicidade quando não se 
utiliza citocalasina B (ver a fórmula no apêndice 2).  
Índice de replicação (IR):  Proporção de ciclos de divisão celular completados 
numa cultura tratada, relativamente ao controlo não-tratado, durante o período de exposição e de recuperação (ver a fórmula no apêndice 2).
 
Produto químico em estudo (ou substância química em estudo):  Qualquer subs ­
tância ou mistura à qual seja aplicado o presente método de ensaio.  ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 727
 
Apêndice 2  
Fórmulas de quantificação da citotoxicidade  
1. Caso se utilize citocalasina B , a avaliação da citotoxicidade é feita com 
base no índice de proliferação com citocinese bloqueada (CBPI) ou no índice de 
replicação (IR) (16) (58). O primeiro indica o número médio de ciclos celulares por célula durante o período de exposição à citocalasina B, podendo ser utilizado para calcular a proliferação celular. O índice de replicação indica a relação entre 
o número de núcleos nas culturas tratadas e o número de núcleos nas culturas de 
controlo e pode ser utilizado para calcular a percentagem de citóstase:
 
Percentagem de citóstase = 100 – 100{(CBPI  T – 1) ÷ (CBPI  C – 1)}  
em que:  
T = se refere à cultura tratada com o produto químico em estudo,  
C = se refere à cultura com o excipiente, de controlo,  
e: 
CBPI ¼ ððn: o de células mononucleadas Þ þ 
ð2 Ü n: o de células binucleadas Þ þ ð3 Ü n: o de células plurinucleadas ÞÞ 
ðnëmero total de células Þ 
Por conseguinte, se o CBPI for igual a 1 (todas as células mononucleadas), a 
citóstase é de 100 %.  
Citóstase = 100 – IR  
RI ¼ ððn: o de células binucleadas Þ þ ð2 Ü n: o de células plurinucleadas ÞÞ ö ðn: o total de célulasÞ T 
ððn: o de células binucleadas Þ þ ð2 Ü n: o de células plurinucleadas ÞÞ ö ðn: o total de célulasÞ C Ü 100  
T = culturas tratadas,  
C = culturas de controlo.  
2. Por conseguinte, se o IR for de 53 %, em termos numéricos apenas 53 % 
das células que se dividiram para formar células binucleadas e plurinucleadas na cultura de controlo se dividiram na cultura tratada – o que corresponde a 47 % de 
citóstase.
 
3. Caso não se utilize citocalasina B , recomenda-se a avaliação da citotoxi ­
cidade com base no aumento relativo da contagem celular (RICC) ou na dupli ­
cação da população em termos relativos (RPD) (58), pois ambos os parâmetros 
têm em conta a proporção de células que sofreu divisão na população celular.  
RICC ¼ ðAumento do número de células nas culturas tratadas  ðfinal – inicialÞÞ 
ðAumento do número de células nas culturas de controlo  ðfinal – inicialÞÞ Ü 100  
RPD ¼ ðNúmero de duplicações de população nas culturas tratadas Þ 
ðNúmero de duplicações de população nas culturas decontrolo Þ Ü 100 ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 728
 
em que:  
Duplicação da população = [log (n.  o de células após tratamento ÷ n.  o inicial de 
células)] ÷ log 2  
4. A um RICC ou RPD de 53 % corresponde, pois, uma citotoxicidade/citós ­
tase de 47 %.  
5. Com base no índice de proliferação (IP), pode quantificar-se a citotoxici ­
dade por contagem do número de clones constituídos por uma célula (cl1), duas células (cl2), 3 a 4 células (cl4) e 5 a 8 células (cl8):
 
IP ¼ ðð1 Ü cl1Þ þ ð2 Ü cl2Þ þ ð3 Ü cl4Þ þ ð4 Ü cl8ÞÞ 
ðcl1 þ cl2 þ cl4 þ cl8Þ 
6. O índice de proliferação também tem sido utilizado como parâmetro fiável 
e efetivo de citotoxicidade para linhagens celulares cultivadas  in situ  sem cito ­
calasina B (25) (26) (27) (28).  ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 729
 
Apêndice 3  
Produtos químicos de referência recomendados para avaliação de desempenhos  ( 1 ) 
Categoria Produto químico N.  o CAS N.  o CE 
1. Clastogénios ativos sem ativação metabólica 
Arabinósido de citosina 147-94-4 205-705-9 
Mitomicina C 50-07-7 200-008-6 
2. Clastogénios que necessitam de ativação metabólica 
Benzo[ a]pireno 50-32-8 200-028-5 
Ciclofosfamida 50-18-0 200-015-4 
3. Aneugénios 
Colchicina 64-86-8 200-598-5 
Vimblastina 143-67-9 205-606-0 
4. Substâncias negativas 
Ftalato de bis(2-etil-hexilo) 117-81-7 204-211-0 Ácido nalidíxico 389-08-2 206-864-7 Pireno 129-00-0 204-927-3 Cloreto de sódio 7647-14-5 231-598-3
 
( 1 ) Os produtos químicos de referência indicados são os produtos químicos que se recomendam. Só podem substituir-se produtos 
químicos da lista, ou nela incluir outros, se a atividade desses produtos for conhecida, se induzirem a formação de micronúcleo s 
pelos mesmos mecanismos de ação e também se forem comprovadamente adequados aos produtos químicos a ensaiar pelo método 
de ensaio  in vitro  de micronúcleos. Consoante a finalidade em vista, a justificação pode incluir também um estudo de validação 
com uma vasta gama de substâncias ou centrado numa gama mais estreita, baseada na classe química da substância ou no 
mecanismo indutor de danos em estudo.  ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 730
 
B.50.  SENSIBILIZAÇÃO CUTÂNEA: ENSAIO DE GÂNGLIOS 
LINFÁTICOS LOCAIS: DA  
INTRODUÇÃO  
1. As Diretrizes da OCDE para o ensaio de produtos químicos ( OECD Gui ­
delines for the Testing of Chemicals ) e os métodos de ensaio da UE são 
revistos periodicamente à luz do progresso científico, das necessidades 
normativas em evolução e de considerações de bem-estar animal. O pri ­
meiro método de ensaio utilizado para determinar a sensibilização cutânea no rato – o ensaio de gânglios linfáticos locais (método LLNA, « Local 
Lymph Node Assay », Test Guideline  429 da OCDE, capítulo B.42 deste 
anexo) foi revisto (1). Foram publicados em (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) 
elementos pormenorizados sobre a validação do método LLNA, bem como uma revisão dos trabalhos conexos. No método LLNA utiliza-se iodo radioativo ou timidina radioativa para medir a proliferação de linfócitos, 
pelo que o recurso a este ensaio está limitado sempre que a aquisição, 
utilização e eliminação de matérias radioativas seja problemática. O mé ­
todo «LLNA: DA» (desenvolvido pela Daicel Chemical Industries, Ltd.) é uma versão modificada do método LLNA: não utiliza matérias radioativas 
e permite determinar quantitativamente, por bioluminescência, o teor de 
trifosfato de adenosina (ATP) como indicador da proliferação de linfócitos. O método foi validado e examinado, tendo sido recomendado por um 
painel de avaliação internacional constituído por peritos devido à sua 
utilidade para a identificação de produtos químicos sensibilizantes e não sensibilizantes da pele, com algumas limitações (10) (11) (12) (13). O método foi concebido para avaliar o potencial de sensibilização da pele 
de animais por produtos químicos (substâncias e misturas). O capítulo B.6 
deste anexo e o  Test Guideline  406 da OCDE recorrem a ensaios em 
cobaias, nomeadamente o ensaio de maximização na cobaia e o ensaio de Buehler (14). O método LLNA (capítulo B.42 deste anexo,  Test Gui ­
deline  429 da OCDE) e as duas alterações do mesmo que não recorrem a 
matérias radioativas (LLNA: DA – capítulo B.50 deste anexo,  Test Gui ­
deline  442 A da OCDE – e LLNA: BrdU-ELISA – capítulo B.51 deste 
anexo,  Test Guideline  442 B da OCDE) apresentam vantagens em relação 
aos ensaios na cobaia descritos no capítulo B.6 e no  Test Guideline  406 da 
OCDE (14), traduzidas na redução e no aperfeiçoamento do recurso a animais.
 
2. O método LLNA: DA é similar ao método LLNA. Estuda a fase indutora 
da sensibilização cutânea e fornece dados quantitativos adequados para a avaliação da resposta à dosagem. Por outro lado, o facto de permitir detetar sensibilizantes cutâneos sem necessidade de utilizar marcadores 
radioativos do ADN elimina as questões potenciais em matéria de expo ­
sição profissional à radioatividade e de eliminação de resíduos. O presente método possibilita a utilização crescente de ratos na deteção de sensibili ­
zantes cutâneos, o que facilita a redução do recurso a cobaias em ensaios 
de potencial de sensibilização cutânea (método B6,  Test Guideline  406 da 
OCDE) (14).
 
DEFINIÇÕES  
3. As definições utilizadas figuram no apêndice 1.  
CONSIDERAÇÕES INICIAIS E LIMITAÇÕES  
4. O método LLNA: DA é um método LLNA modificado para a identifica ­
ção de produtos químicos potencialmente sensibilizantes da pele, com 
determinadas limitações. Isso não implica, necessariamente, que o método 
LLNA: DA deva ser sempre utilizado em substituição do método LLNA ou de ensaios em cobaias (método B.6,  Test Guideline  406 da OCDE) 
(14), mas apenas que é equivalente aos segundos e pode ser utilizado em 
alternativa, gerando normalmente resultados positivos ou negativos que 
dispensam confirmação (10) (11). Antes de efetuar o estudo, o laboratório deve examinar todas as informações disponíveis sobre a substância em causa, nomeadamente a identificação e a estrutura química, as proprieda ­
des físico-químicas, os resultados de quaisquer outros ensaios de 
toxicidade  in vitro  ou in vivo  da substância e dados toxicológicos sobre
 ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 731
 
produtos químicos com estrutura semelhante. Esse exame destina-se a 
determinar se o método LLNA: DA se adequa à substância em estudo 
(dada a incompatibilidade de alguns tipos de produtos químicos com o método LLNA: DA – ver o ponto 5), bem como a facilitar a escolha das dosagens.
 
5. O método LLNA: DA é um método  in vivo , não eliminando, portanto, a 
utilização de animais na avaliação da atividade sensibilizante alérgica por 
contacto. Pode, no entanto, reduzir o recurso a animais para estes fins, 
quando comparado com os ensaios na cobaia (método B.6 e  Test Guide ­
line 406 da OCDE) (14). Além disso, proporciona melhorias substanciais 
(menos dor e sofrimento) no modo como os animais são utilizados nos 
ensaios de sensibilização alérgica por contacto, uma vez que, ao contrário 
do método B.6 e do  Test Guideline  406 da OCDE, não exige a indução de 
reações de hipersensibilidade dérmica por agentes externos. Apesar das vantagens do método LLNA: DA em relação ao método B.6 e ao  Test 
Guideline  406 da OCDE (14), existem limitações que podem exigir o 
recurso a estes últimos, por exemplo, para ensaiar determinados metais, em virtude dos resultados falsos positivos que se obtêm com certos irri ­
tantes cutâneos (como algumas substâncias tensioativas) (6) – 1 e 
capítulo B.42 do presente anexo – ou devido a problemas de solubilidade 
da substância em estudo. Por outro lado, no caso das substâncias ou classes de substâncias químicas com grupos funcionais que, comprovada ­
mente, suscitem dúvidas (16), pode ser necessário recorrer a ensaios em 
cobaias – método B.6,  Test Guideline  406 da OCDE (14). Relativamente 
ao método LLNA: DA, foi recomendado que se ponderem também as limitações identificadas para o método LLNA (1 e capítulo B.42 do pre ­
sente anexo) (10). Acresce que o método LLNA: DA pode não ser ade ­
quado para ensaiar substâncias que afetem os níveis de ATP (por exemplo, 
substâncias inibidoras do ATP) ou que afetem a exatidão da medição do ATP intracelular (por exemplo, presença de enzimas que degradem o ATP ou de ATP extracelular no gânglio linfático). Salvaguardadas estas limita ­
ções, o método LLNA: DA é potencialmente aplicável ao ensaio de qual ­
quer substância, a menos que esta possua alguma propriedade passível de comprometer a exatidão do método. Deve ainda ser ponderada a possibi ­
lidade de obtenção de resultados positivos próximos do limite caso os 
valores de índice de estimulação (IE) estejam compreendidos entre 1,8 e 
2,5 (ver os pontos 31 e 32). Estas reticências baseiam-se nos dados de validação de 44 substâncias com índice de estimulação igual ou superior a 1,8 (ver o ponto 6), nas quais o método LLNA: DA identificou correta ­
mente todas as 32 substâncias classificadas de sensibilizantes pelo método 
LLNA, mas identificou incorretamente três das 12 substâncias com índice de estimulação compreendido entre 1,8 e 2,5 (resultado positivo próximo do limite) classificadas de não sensibilizantes pelo método LLNA (10). 
Todavia, como se utilizou o mesmo conjunto de dados para fixar os 
valores de índice de estimulação e calcular as propriedades de previsão do ensaio, os resultados referidos podem traduzir uma sobrestimação das 
reais propriedades de previsão do método.
 
PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
6. O princípio básico subjacente ao método LLNA: DA é que os sensibili ­
zantes induzem uma proliferação de linfócitos nos gânglios linfáticos dre ­
nantes do local de aplicação da substância em estudo. Esta proliferação é proporcional à dosagem e à potência do alergénio aplicado e constitui um modo simples de obter uma medida quantitativa da sensibilização. 
Mede-se a proliferação e compara-se a proliferação média em cada grupo 
estudado com a proliferação média no grupo de controlo tratado com o excipiente. Determina-se a razão entre a proliferação média em cada grupo tratado e a proliferação observada em paralelo no grupo de controlo tra ­
tado com o excipiente; essa razão é denominada índice de 
estimulação (IE). Para que uma substância em estudo possa ser classificada
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de sensibilizante cutânea potencial, este índice deve ser ≥ 1,8. O presente 
método baseia-se na medição do teor de ATP por bioluminescência (reco ­
nhecidamente correlacionado com o número de células vivas) (17) como indicador do aumento do número de células em proliferação nos gânglios linfáticos drenantes do sistema auricular (18) (19). O método de biolumi ­
nescência utiliza a enzima luciferase para catalisar a emissão de luz a partir 
de ATP e luciferina, de acordo com a seguinte reação:
 
ATP + luciferina  + O 2
 oxiluciferina  + AMP  + PP i + CO  2 + luz 
A intensidade da luz emitida é medida com um luminómetro e é direta ­
mente proporcional à concentração de ATP. O ensaio luciferina-luciferase 
é um método sensível de determinação quantitativa do ATP utilizado numa grande variedade de aplicações (20).
 
DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Escolha da espécie animal  
7. O rato é a espécie escolhida para este ensaio. Os estudos de validação do 
método LLNA: DA foram efetuados exclusivamente com a estirpe CBA/J, que é portanto considerada a estirpe preferida (12) (13). Utilizam-se fê ­
meas adultas jovens, nulíparas e não grávidas. No início do estudo, os 
animais devem ter entre oito e 12 semanas; a variação de peso dos animais entre si deve ser mínima e não deve exceder 20 % do peso médio dos mesmos. Podem ser utilizadas outras estirpes, bem como machos, quando 
houver dados suficientes que demonstrem não existirem diferenças signi ­
ficativas na resposta ao método LLNA: DA relacionadas com a estirpe e/ou o sexo do animal.
 
Condições de alojamento e alimentação  
8. Os ratos devem ser alojados em grupo (21), a menos que se justifique 
cientificamente o seu alojamento individual. A temperatura do biotério deve ser de 22 °C ± 3 °C. A humidade relativa não deve ser inferior a 30 % e, de preferência, não deve exceder 70 %, exceto durante a limpeza 
do biotério. Idealmente, deve procurar manter-se entre 50 % e 60 %. A 
iluminação deve ser artificial, com uma sequência de 12 horas de luz seguidas de 12 horas de escuridão. Na alimentação, podem utilizar-se dietas convencionais de laboratório e deve ser fornecida água de beber 
sem restrições.
 
Preparação dos animais  
9. Os animais são selecionados aleatoriamente, marcados de modo a permitir 
a identificação individual (mas não por marcação nas orelhas) e mantidos em gaiolas durante, pelo menos, cinco dias antes da aplicação das doses, 
para permitir a aclimatação às condições do laboratório. Antes do início do 
tratamento, examinam-se os animais, de modo a assegurar que não apre ­
sentam lesões cutâneas visíveis.
 
Preparação das soluções a aplicar  
10. Antes da aplicação nas orelhas dos ratos, os produtos químicos sólidos 
dissolvem-se ou suspendem-se em solventes/excipientes e, se necessário, diluem-se. Os produtos líquidos podem ser aplicados tal e qual ou ser diluídos antes da aplicação. Os produtos químicos insolúveis, como os 
geralmente presentes nos dispositivos médicos, devem ser sujeitos a um 
processo de extração exaustivo com um solvente apropriado, a fim de nele concentrar para o ensaio todos os componentes extraíveis, antes da apli ­
cação nas orelhas dos ratos. As substâncias em estudo devem ser prepa ­
radas diariamente, a menos que haja dados de estabilidade que demons ­
trem ser aceitável o seu armazenamento.
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Verificação da fiabilidade  
11. Utilizam-se produtos químicos de controlo positivo para demonstrar o 
desempenho adequado do ensaio, devendo obter-se uma resposta quanti ­
tativamente bem caracterizada, com sensibilidade adequada e reprodutível, a essas substâncias sensibilizantes. Recomenda-se a inclusão, em paralelo, de um produto químico de controlo positivo, para demonstrar a compe ­
tência do laboratório na execução de cada ensaio e possibilitar a avaliação 
da reprodutibilidade e comparabilidade intra e interlaboratoriais. Algumas autoridades reguladoras exigem também um produto químico de controlo positivo em cada estudo, pelo que os laboratórios devem consultar as 
autoridades competentes antes de aplicarem o método LLNA: DA. 
Aconselha-se, portanto, a utilização rotineira, em paralelo, de um produto químico de controlo positivo, para evitar a eventual necessidade de ensaios suplementares em animais decorrente do recurso apenas periódico a esses 
produtos químicos de controlo (ver o ponto 12). No método LLNA: DA, o 
produto químico de controlo positivo deve induzir uma resposta positiva a um nível de exposição do qual se espere um aumento do índice de esti ­
mulação ≥ 1,8 em relação ao grupo de controlo negativo. Deve escolher-se 
a dosagem do produto químico de controlo positivo de modo que este não 
cause irritação cutânea excessiva nem toxicidade sistémica e que a indução seja reprodutível, mas não excessiva (considera-se excessivo um índice de estimulação superior a 10). Os produtos químicos de controlo positivo 
preferidos são aldeído hexilcinâmico (n.
 o CAS 101-86-0) a 25 % e eugenol 
(n. o CAS 97-53-0) a 25 % numa mistura de acetona e azeite na proporção 
volúmica 4:1. Em certas circunstâncias, e perante justificação adequada, podem utilizar-se outros produtos químicos de controlo positivo que cum ­
pram os critérios atrás referidos.
 
12. Embora seja recomendada a inclusão, em paralelo, de um grupo de con ­
trolo positivo, em algumas situações pode justificar-se que um laboratório 
que aplique o método LLNA: DA regularmente (isto é, pelo menos uma vez por mês) efetue ensaios de controlo positivo apenas periódicos (a intervalos não superiores a seis meses) e mantenha uma base de dados 
histórica dos produtos químicos de controlo positivo que comprove a 
capacidade do laboratório de obter resultados reprodutíveis e exatos com esses produtos. A competência na execução do método LLNA: DA pode demonstrar-se obtendo resultados positivos constantes com um produto 
químico de controlo positivo em pelo menos 10 ensaios independentes 
efetuados num período razoável (menos de um ano).
 
13. Deve incluir-se em paralelo um grupo de controlo positivo sempre que 
haja alguma alteração processual do método LLNA: DA (por exemplo, 
alterações do pessoal formado, das matérias e/ou dos reagentes utilizados no método de ensaio, do equipamento utilizado neste último ou da origem dos animais estudados), devendo essas alterações ser documentadas nos 
relatórios laboratoriais. Deve analisar-se a incidência dessas alterações na 
adequação da base de dados históricos anteriormente estabelecida, ponde ­
rando a necessidade de criar uma nova base de dados históricos para documentar a coerência dos resultados obtidos com os produtos químicos 
de controlo positivo.
 
14. Os investigadores devem ter presente que a decisão de efetuar o estudo de 
produtos químicos de controlo positivo periodicamente, e não em paralelo, 
tem implicações na adequação e aceitabilidade dos resultados negativos 
dos estudos efetuados sem produto químico de controlo positivo em pa ­
ralelo, no intervalo entre cada estudo de controlo positivo periódico. Por exemplo, se for obtido um resultado falso negativo num estudo de controlo 
positivo periódico, podem questionar-se os resultados negativos eventual ­
mente obtidos para as substâncias em estudo no período compreendido entre o último estudo periódico aceitável de controlo positivo e o estudo periódico inaceitável de controlo positivo. Ao optar entre a inclusão em 
paralelo de produtos químicos de controlo positivo e um controlo positivo 
apenas periódico, devem ponderar-se cuidadosamente as consequências. Deve também ponderar-se a utilização de menos animais no grupo de controlo positivo em paralelo, se houver justificação científica para isso 
e se o laboratório demonstrar, com base em dados históricos próprios, que 
podem ser utilizados menos ratos (22).
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15. Embora se deva ensaiar o produto químico de controlo positivo num 
excipiente que reconhecidamente garanta coerência nas respostas (por 
exemplo, acetona e azeite na proporção volúmica 4:1), em determinadas situações regulamentares poderá ser também necessário efetuar o ensaio num excipiente não convencional (formulação clínica ou quimicamente 
pertinente) (23). Se o ensaio em paralelo de um produto químico de 
controlo positivo for efetuado com um excipiente diverso do da substância em estudo, deve incluir-se um controlo de excipiente para o produto químico de controlo positivo ensaiado em paralelo.
 
16. Se o estudo consistir na avaliação de substâncias de uma determinada 
classe química ou gama de respostas, o recurso a substâncias de referência pode ser útil para demonstrar que o método de ensaio funciona correta ­
mente na deteção do potencial de sensibilização cutânea do tipo de subs ­
tância em causa. Para que seja considerada adequada, uma substância de referência deve possuir as seguintes propriedades:
 
— semelhança estrutural e funcional com a classe de substâncias em 
estudo;  
— características físico-químicas conhecidas;  
— dados corroborantes do método LLNA: DA;  
— dados corroborantes de outros modelos animais e/ou de ensaios em 
pessoas.  
PROCEDIMENTO DE ENSAIO  
Número de animais e níveis de dosagem  
17. Utilizam-se, no mínimo, quatro animais por grupo de dosagem e um 
mínimo de três concentrações da substância em estudo, além de um grupo 
de controlo negativo em paralelo, tratado apenas com o excipiente da 
substância em estudo, e de um produto químico de controlo positivo (ensaiado em paralelo ou recentemente, consoante a política do laboratório acerca dos pontos 11 a 15). Deve ponderar-se o ensaio de várias doses do 
produto químico de controlo positivo, sobretudo quando este for ensaiado 
com intermitência. Os animais dos grupos de controlo devem ser manu ­
seados e tratados de modo idêntico ao dos animais dos grupos tratados, exceto no que respeita à administração da substância em estudo.
 
18. A escolha da dosagem e do excipiente deve basear-se nas recomendações 
das referências (2) e (24). Selecionam-se normalmente as doses consecu ­
tivas numa série de concentrações adequada, por exemplo, 100 %, 50 %, 
25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 %, etc. A seleção das séries de concen ­
tração utilizadas deve ter fundamentação científica. Na escolha de três concentrações consecutivas de modo que a concentração mais elevada 
maximize a exposição, evitando ao mesmo tempo a ocorrência de toxici ­
dade sistémica e irritação cutânea local excessiva, devem ser tidas em conta as informações toxicológicas (por exemplo, referentes a toxicidade aguda e irritação dérmica), bem como estruturais e físico-químicas, dispo ­
níveis sobre a substância em estudo (e/ou sobre substâncias estrutural ­
mente afins) (24) (25). Na ausência de tais informações, pode ser neces ­
sário um ensaio exploratório prévio (ver os pontos 21 a 24).
 
19. O excipiente não deve interferir no resultado do ensaio nem distorcê-lo, 
devendo ser escolhido de modo a maximizar a solubilidade e a obter a maior concentração possível numa solução ou suspensão adequada para aplicação da substância em estudo. Constituem excipientes adequados uma 
mistura de acetona e azeite na proporção volúmica 4:1, a  N,N -dimetilfor ­
mamida, a metiletilcetona, o propilenoglicol e o sulfóxido dimetílico (6), mas podem utilizar-se outros, desde que com fundamentação científica. Em certas situações, pode ser necessário efetuar um controlo adicional 
com um solvente utilizado na prática clínica ou a formulação na qual a 
substância em estudo é comercializada. Deve ter-se especial cuidado em assegurar que as substâncias hidrófilas sejam incorporadas num sistema (excipiente) que molhe a pele e não escorra de imediato, acrescentando 
solubilizadores adequados (por exemplo, Pluronic® L92 a 1 %). Devem, 
portanto, evitar-se os excipientes totalmente aquosos.
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20. A utilização de gânglios linfáticos de ratos distintos possibilita a avaliação 
da variabilidade de animal para animal e a comparação estatística da 
diferença entre as medições relativas à substância em estudo e ao grupo de controlo do excipiente (ver o ponto 33). Por outro lado, só pode ponderar-se a redução do número de ratos no grupo de controlo positivo 
se os dados forem obtidos por animal (22). Além disso, algumas autori ­
dades reguladoras exigem a apresentação de dados por animal. A recolha regular de dados por animal é vantajosa segundo critérios de bem-estar animal, evitando a duplicação de ensaios que seria necessária se os resul ­
tados relativos à substância em estudo anteriormente recolhidos de outro 
modo (por exemplo, agregação de dados relativa a séries de animais) tivessem de ser examinados ulteriormente por autoridades reguladoras com outras exigências (por exemplo, dados individualizados por animal).
 
Ensaio exploratório prévio  
21. Na ausência de informações que permitam determinar a dosagem máxima 
a ensaiar (ver o ponto 18), é necessário efetuar um ensaio exploratório 
prévio, a fim de definir a dosagem adequada a ensaiar pelo método LLNA: DA. O objetivo deste ensaio exploratório consiste em fornecer orientações 
para a escolha da dosagem máxima a utilizar no estudo principal pelo 
método LLNA: DA, caso não se disponha de informações sobre a concen ­
tração que induz toxicidade sistémica (ver o ponto 24) e/ou irritação cutânea local excessiva (ver o ponto 23). A dosagem máxima estudada 
deve ser uma concentração de 100 % da substância em estudo, no caso dos 
líquidos, ou a concentração máxima possível, no caso dos sólidos e das suspensões.
 
22. O ensaio exploratório prévio é efetuado em condições idênticas às do 
estudo principal pelo método LLNA: DA, mas não se avalia a proliferação 
nos gânglios linfáticos e podem utilizar-se menos animais por grupo de 
dosagem. Sugere-se o recurso a um ou dois animais por grupo de dosa ­
gem. Observam-se diariamente todos os ratos para verificar se apresentam sinais clínicos de toxicidade sistémica ou de irritação no local de aplica ­
ção. Regista-se o peso corporal de cada rato antes do ensaio e antes de o 
eutanasiar (dia 8). Observam-se as orelhas para verificar se têm eritema e atribui-se-lhes uma pontuação de acordo com o quadro 1 (25). Mede-se a espessura das orelhas com um instrumento adequado – por exemplo, um 
micrómetro digital ou um leitor de espessuras da Peacock – no dia 1 (antes 
da primeira dose), no dia 3 (cerca de 48 horas após a primeira dose), no dia 7 (24 horas antes do termo do ensaio) e no dia 8. Complementarmente, no dia 8 pode determinar-se a espessura das orelhas por pesagem de 
punções auriculares efetuadas depois da eutanásia dos animais. Uma pon ­
tuação de eritema ≥ 3 e/ou o aumento da espessura auricular em 25 % ou 
mais em qualquer dia de medição constituem indicadores de irritação local excessiva (26) (27). Para dosagem mais elevada no estudo principal pelo 
método LLNA: DA, deve ser escolhida a dosagem da série de concen ­
trações do ensaio exploratório prévio (ver o ponto 18) imediatamente inferior à que induz toxicidade sistémica e/ou irritação cutânea local ex ­
cessiva.
 
Quadro 1  
Pontuações de eritema  
Observação Pontuação  
Ausência de eritema 0 
Eritema muito ligeiro (quase impercetível) 1 Eritema bem definido 2
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Observação Pontuação  
Eritema moderado a intenso 3 
Eritema intenso (vermelhidão roxa) ou formação de escara que impede a 
pontuação do eritema 4 
23. Além do referido acerca do aumento de 25 % da espessura auricular (26) 
(27), também se recorreu a aumentos estatisticamente significativos da 
espessura auricular dos ratos tratados, comparativamente aos ratos de con ­
trolo, para identificar produtos irritantes pelo método LLNA (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). Os aumentos estatisticamente significativos da espes ­
sura auricular inferiores a 25 % não foram, porém, especificamente asso ­
ciados a irritação excessiva (30) (31) (32) (33) (34).
 
24. Quando efetuadas no âmbito de uma avaliação integrada, as seguintes 
observações clínicas podem indiciar toxicidade sistémica (35), podendo 
assim indicar a dosagem máxima a utilizar no método LLNA: DA prin ­
cipal: alterações do funcionamento do sistema nervoso (por exemplo, pi ­
loereção, ataxia, tremores e convulsões); alterações comportamentais (por 
exemplo, agressividade, alterações das atividades higiénicas, alterações 
pronunciadas de atividade); alterações respiratórias (alterações da frequên ­
cia e da intensidade da respiração, como dispneia, arfar e pieira) e da ingestão de alimentos e de água. Devem ainda ser tidos em conta na 
avaliação os sinais de letargia e/ou de apatia e quaisquer sinais clínicos 
de dor ou sofrimento mais do que ligeiros ou momentâneos, ou reduções de peso corporal superiores a 5 % entre o dia 1 e o dia 8, bem como a mortalidade. Os animais moribundos e os animais que manifestem grande 
sofrimento ou sinais de dor intensa devem ser eutanasiados (36).
 
Sequência experimental do estudo principal  
25. A sequência experimental do ensaio é a seguinte:  
— Dia 1:  Identificar individualmente e anotar o peso de cada animal e todas 
as observações clínicas. Aplicar no dorso de cada orelha solução aquosa 
a 1 % de laurilsulfato de sódio, utilizando uma escova molhada nessa 
solução, de modo a cobrir a totalidade do dorso de cada orelha com quatro ou cinco pinceladas. Uma hora após o tratamento com esta solu ­
ção de laurilsulfato de sódio, aplicar no dorso de cada orelha 25 μl da 
diluição adequada da substância em estudo, do excipiente sozinho ou do 
produto químico de controlo positivo (ensaiado em paralelo ou recente ­
mente, consoante a política do laboratório acerca dos pontos 11 a 15).
 
— Dias 2, 3 e 7:  Repetir o pré-tratamento com a solução aquosa a 1 % de 
laurilsulfato de sódio e o procedimento de aplicação da substância em estudo efetuados no dia 1.
 
— Dias 4, 5 e 6:  Nenhum tratamento.  
— Dia 8:  Anotar o peso de cada animal e todas as observações clínicas. 
Eutanasiar os animais 24 a 30 horas, aproximadamente, após o início 
da aplicação no dia 7. Excisar os gânglios linfáticos auriculares de drenagem, das orelhas de cada rato, e colocá-los em solução-tampão de fosfato (PBS), separadamente para cada animal. Para pormenores e 
esquemas da identificação e dissecação dos gânglios linfáticos, ver a 
referência (22). A fim de melhor avaliar a resposta cutânea local no estudo principal, podem ser incluídos no protocolo de estudo parâme ­
tros suplementares como a pontuação do eritema auricular ou medi ­
ções da espessura auricular (com um medidor de espessura ou por 
pesagem de punções auriculares  post mortem ).
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Preparação das suspensões celulares  
26. Preparar suspensões unicelulares de células dos gânglios linfáticos colo ­
cando os gânglios excisados bilateralmente de cada rato entre duas lâminas 
de vidro e aplicando uma pressão ligeira, para os esmagar. Depois de confirmar que os tecidos exsudaram dos gânglios, separar cuidadosamente as duas lâminas. Colocar os tecidos de ambas as lâminas em suspensão em 
PBS, inclinando cada lâmina por cima de uma placa de Petri e lavando 
com PBS, enquanto se raspam os tecidos da lâmina com um raspador de células. Os gânglios linfáticos dos animais de controlo negativo são pe ­
quenos, pelo que é necessário proceder com cuidado para evitar efeitos 
artificiais nos valores do índice de estimulação. Deve utilizar-se 1 ml de 
PBS para lavar as duas lâminas. Utilizando o raspador de células, homo ­
geneizar com cuidado a suspensão de células de gânglios linfáticos na placa de Petri. Com uma micropipeta, colher uma alíquota de 20 μl da 
suspensão dessas células, tendo o cuidado de não incluir a membrana, 
visível a olho nu. Misturar com 1,98 ml de PBS, para obter uma amostra de 2 ml. Preparar do mesmo modo uma segunda amostra de 2 ml, de maneira que se obtenham duas amostras por animal.
 
Determinação da proliferação celular (medição do teor de ATP dos linfócitos)  
27. Mede-se o aumento do teor de ATP dos gânglios linfáticos recorrendo ao 
método da luciferina/luciferase utilizando um conjunto de medição de ATP, que mede a bioluminescência em unidades de luminescência 
relativa (ULR). O tempo que decorre entre a eutanásia do animal e a 
medição do teor de ATP que lhe corresponde deve ser uniforme, não devendo exceder cerca de 30 minutos, pois considera-se que o teor de ATP decresce gradualmente após a morte do animal (12). Assim, o pro ­
cesso compreendido entre a excisão dos gânglios linfáticos auriculares e a 
medição do ATP deve estar concluído ao fim de 20 minutos, seguindo uma cronologia pré-estabelecida idêntica para todos os animais. Mede-se a luminescência de ATP em cada amostra de 2 ml, obtendo-se, portanto, 
duas medições de ATP por animal. Determina-se então a luminescência 
média de ATP, cujo valor é subsequentemente utilizado nos cálculos (ver o ponto 30).
 
OBSERVAÇÕES  
Observações clínicas  
28. Observar cuidadosamente cada rato pelo menos uma vez por dia, com 
vista à deteção de sinais clínicos, quer de irritação local no ponto de aplicação, quer de toxicidade sistémica. Anotar todas as observações, 
mantendo um registo para cada rato. Os planos de controlo devem incluir 
critérios para identificar prontamente os ratos que evidenciem níveis de toxicidade sistémica, irritação cutânea local excessiva ou corrosão da pele passíveis de justificarem a eutanásia do animal (36).
 
Pesos corporais  
29. Tal como referido no ponto 25, mede-se o peso corporal de cada animal 
no início do ensaio e quando da eutanásia programada.  
CÁLCULO DOS RESULTADOS  
30. Os resultados correspondentes a cada grupo de tratamento exprimem-se em 
índice de estimulação (EI) médio. Determina-se o índice de estimulação 
dividindo a média das unidades de luminescência relativa/rato, correspon ­
dente a cada grupo tratado com a substância em estudo e ao grupo de controlo positivo, pela média das unidades de luminescência relativa/rato 
do grupo de controlo do solvente/excipiente. O índice de estimulação 
médio para o grupo de controlo tratado com o excipiente é igual a 1.
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31. Para efeitos de decisão, consideram-se positivos os resultados de índice de 
estimulação ≥ 1,8 (10). Todavia, ao ponderar se um resultado próximo do 
limite (índice de estimulação compreendido entre 1,8 e 2,5) deve ou não ser considerado positivo, podem ter-se também em conta o grau de res ­
posta à dosagem, a significância estatística e a coerência das respostas 
correspondentes ao solvente/excipiente e à substância de controlo positivo 
(2), (3) (37).
 
32. No caso das respostas positivas próximas do limite, com índice de esti ­
mulação compreendido entre 1,8 e 2,5, pode ser útil aos utilizadores terem 
em conta, juntamente com os valores de índice de estimulação, informa ­
ções adicionais como a resposta à dosagem, sinais de toxicidade sistémica ou de irritação excessiva e, se for caso disso, a significância estatística, para confirmar se os resultados obtidos são positivos (10). Devem 
examinar-se também as propriedades da substância em estudo, nomeada ­
mente se esta possui estrutura semelhante a sensibilizantes cutâneos co ­
nhecidos ou causa irritação cutânea excessiva nos ratos, bem como a natureza da resposta à dosagem observada. Na referência (4) analisam-se 
em pormenor estes e outros aspetos.
 
33. A recolha de dados para cada rato possibilita uma análise estatística da 
existência, nos dados, de indicações de resposta à dosagem e do grau desta 
resposta. A avaliação estatística pode incluir uma avaliação da resposta à 
dosagem e comparações, convenientemente adaptadas, de grupos estuda ­
dos (por exemplo, comparações par a par de um grupo correspondente a uma determinada dosagem com o grupo de controlo tratado com o sol ­
vente/excipiente ensaiado em paralelo). As análises estatísticas podem in ­
cluir, por exemplo, regressões lineares ou testes de William, para analisar tendências de resposta à dosagem, e testes de Dunnett, para comparações par a par. Na escolha de um método de análise estatística apropriado, o 
investigador deve estar atento a possíveis divergências das variâncias e a 
outros problemas conexos passíveis de exigirem uma transformação dos dados ou uma análise estatística não-paramétrica. O investigador pode ainda ter de efetuar os cálculos de índice de estimulação e as análises 
estatísticas considerando alguns pontos e descartando outros (por vezes 
denominados «aberrantes»).
 
DADOS E RELATÓRIOS  
Dados  
34. Os dados devem ser resumidos em quadros, indicando os valores de ULR 
correspondentes a cada animal, a média de ULR/animal do grupo, o pa ­
râmetro estatístico associado (desvio-padrão ou erro-padrão da média, por exemplo) e o índice de estimulação médio para cada grupo de dosagem, 
comparativamente ao grupo de controlo do solvente/excipiente ensaiado 
em paralelo.
 
Relatório do ensaio  
35. O relatório do ensaio deve incluir as seguintes informações:  
Produtos químicos em estudo e de controlo:  
— dados de identificação (por exemplo, números CAS e CE – caso 
existam –, origem, grau de pureza, impurezas conhecidas, número de lote),
 
— natureza física e propriedades físico-químicas (por exemplo, volatilida ­
de, estabilidade, solubilidade),  
— no caso de misturas, composição e percentagens relativas dos compo ­
nentes;  
Solvente/excipiente:  
— dados de identificação (grau de pureza, concentração – se adequado –, 
volume utilizado),  
— justificação da escolha do excipiente;  ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 739
 
Animais utilizados nos ensaios:  
— origem dos ratos CBA,  
— estado microbiológico dos animais, caso seja conhecido,  
— número e idade dos animais,  
— origem dos animais, condições de alojamento, dieta, etc.;  
Condições de ensaio:  
— origem, número de lote e dados de garantia de qualidade/controlo de 
qualidade do fabricante para o conjunto de medição do ATP,  
— elementos sobre a preparação e aplicação da substância em estudo,  
— justificação das dosagens escolhidas, incluindo os resultados do ensaio 
exploratório prévio, caso tenha sido efetuado,  
— concentrações do excipiente e da substância em estudo utilizadas e 
quantidade total desta aplicada,  
— elementos sobre a qualidade dos alimentos e da água (incluindo o tipo 
de dieta e a origem desta, bem como a origem da água),  
— elementos sobre a organização cronológica dos tratamentos e da co ­
lheita das amostras,  
— métodos de medição da toxicidade,  
— critérios definidos para que o estudo seja considerado positivo ou 
negativo,  
— elementos sobre eventuais desvios ao protocolo e explicação do modo 
como estes afetam a realização e os resultados do estudo;  
Verificação da fiabilidade:  
— resumo dos resultados da última verificação de fiabilidade, incluindo 
informações sobre a substância em estudo, a concentração e o exci ­
piente utilizados,  
— dados do laboratório relativos a controlos positivos ensaiados em pa ­
ralelo e/ou históricos e a controlos negativos (solvente/excipiente) en ­
saiados em paralelo,  
— se não tiver sido efetuado em paralelo um controlo positivo, a data do 
controlo positivo periódico mais recente e o relatório laboratorial cor ­
respondente, bem como um relatório que especifique os dados histó ­
ricos de controlos positivos do laboratório nos quais se baseou a decisão de não efetuar um controlo positivo paralelo;
 
Resultados:  
— peso de cada rato no início da dosagem e na altura da sua morte 
programada, bem como a média e o parâmetro estatístico associado (desvio-padrão ou erro-padrão da média, por exemplo), para cada grupo de tratamento,
 
— surgimento e evolução de sinais de toxicidade, incluindo irritação dér ­
mica no local da aplicação (caso ocorra), para cada animal,  
— cronologia da morte e da medição do ATP, para cada animal,  
— quadro de valores de ULR e de índices de estimulação para cada grupo 
de dosagem, por rato,  
— média e parâmetro estatístico associado (desvio-padrão ou erro-padrão 
da média, por exemplo) de ULR/rato, para cada grupo de tratamento, e 
resultados da análise dos pontos aberrantes, também para cada grupo 
de tratamento,  ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 740
 
— índice de estimulação calculado e medida adequada da variabilidade de 
animal para animal, relativamente à substância em estudo e nos grupos 
de controlo,  
— resposta à dosagem,  
— análises estatísticas que se justifiquem;  
Análise dos resultados:  
— comentário breve sobre os resultados obtidos; análise da resposta à 
dosagem, análises estatísticas que se justifiquem e conclusão sobre a 
classificação, ou não, da substância em estudo como sensibilizante 
cutânea.  
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 ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 743
 
Apêndice 1  
DEFINIÇÕES  
Exatidão:  Grau de acordo entre os resultados do método de ensaio e os valores 
de referência aceites. Constitui uma medida do desempenho do método e um dos aspetos da adequação. Este termo e o termo «concordância» são muitas vezes 
utilizados indistintamente para indicar a proporção de resultados corretos de um 
método de ensaio (38).
 
Substância de referência:  Substância (sensibilizante ou não) utilizada como 
termo de comparação com a substância em estudo. Deve ter as seguintes pro ­
priedades: i) origem ou origens uniformes e fiáveis; ii) similaridade estrutural e 
funcional com a classe de substâncias em estudo; iii) características físico-quí ­
micas conhecidas; iv) disponibilidade de dados sobre os efeitos conhecidos; e v) potência conhecida situada na gama de reação pretendida.
 
Falso negativo:  Substância incorretamente considerada negativa ou inativa pelo 
método de ensaio, quando na realidade é positiva ou ativa.  
Falso positivo:  Substância incorretamente considerada positiva ou ativa pelo 
método de ensaio, quando na realidade é negativa ou inativa.  
Perigo:  Potencial de efeitos adversos na saúde ou no ambiente, que só se ma ­
nifestam se o grau de exposição for suficiente.  
Reprodutibilidade interlaboratorial:  Medida do grau em que laboratórios quali ­
ficados diferentes, utilizando o mesmo protocolo para ensaiar a mesma substância 
em estudo, conseguem obter resultados qualitativa e quantitativamente similares. Determina-se durante os processos de pré-validação e de validação. Indica em que medida um ensaio pode ser transferido com êxito para outro laboratório e 
também se designa por «reprodutibilidade entre laboratórios» (38).
 
Reprodutibilidade intralaboratorial:  Medida do grau em que pessoal qualificado 
do mesmo laboratório nele consegue repetir resultados com êxito, em momentos diferentes, utilizando o mesmo protocolo. Também se designa por «reprodutibi ­
lidade no laboratório» (38).
 
Ponto aberrante:  Observação que difere marcadamente dos outros valores de 
uma amostra aleatória de uma população.  
Garantia de qualidade:  Processo de gestão no âmbito do qual a observância das 
normas de ensaio, das exigências e dos procedimentos de conservação de registos laboratoriais, bem como a exatidão dos dados transferidos, são avaliadas por pessoas independentes das que efetuam os ensaios.
 
Fiabilidade:  Medida em que, utilizando o mesmo protocolo, um método de 
ensaio pode ser continuadamente reproduzido no mesmo laboratório e em labo ­
ratórios diferentes. A fiabilidade é avaliada com base nos valores calculados das reprodutibilidades intralaboratorial e interlaboratorial (38).
 
Sensibilização cutânea:  Processo imunológico que se manifesta quando um in ­
divíduo sensível é exposto, por via tópica, a um alergénio químico indutor de uma resposta imunológica cutânea passível de gerar sensibilização por contacto.
 
Índice de estimulação (IE):  Valor calculado para quantificar o potencial de 
sensibilização cutânea das substâncias estudadas; corresponde à razão entre a 
proliferação nos grupos tratados e a proliferação no grupo de controlo do ex ­
cipiente ensaiado em paralelo.  
Substância em estudo (ou produto químico em estudo):  Qualquer substância ou 
mistura à qual seja aplicado o presente método de ensaio.  ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 744
 
B.51.  SENSIBILIZAÇÃO CUTÂNEA: ENSAIO DE GÂNGLIOS 
LINFÁTICOS LOCAIS: BRDU-ELISA  
INTRODUÇÃO  
1. As Diretrizes da OCDE para o ensaio de produtos químicos ( OECD Gui ­
delines for the Testing of Chemicals ) e os métodos de ensaio da UE são 
revistos periodicamente à luz do progresso científico, das necessidades 
normativas em evolução e de considerações de bem-estar animal. O pri ­
meiro método de ensaio utilizado para determinar a sensibilização cutânea no rato – o ensaio de gânglios linfáticos locais (método LLNA, « Local 
Lymph Node Assay », Test Guideline  429 da OCDE, capítulo B.42 deste 
anexo) foi revisto (1 e capítulo B.42 deste anexo). Foram publicados em 
(2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) elementos pormenorizados sobre a validação do método LLNA, bem como uma revisão dos trabalhos conexos. No método LLNA utiliza-se iodo radioativo ou timidina radioativa para 
medir a proliferação de linfócitos, pelo que o recurso a este ensaio está 
limitado sempre que a aquisição, utilização e eliminação de matérias radio ­
ativas for problemática. O método «LLNA: BrdU-ELISA» (ELISA: « En­
zyme-Linked Immunosorbent Assay ») é uma versão modificada do método 
LLNA: não utiliza matérias radioativas, recorrendo à 5-bromo2-desoxiuri ­
dina (BrdU) não-radioativa (n.
 o CAS 59-14-3) num sistema de ensaio 
ELISA para medir a proliferação de linfócitos. O método foi validado e 
examinado, tendo sido recomendado por um painel de avaliação científica 
internacional constituído por peritos independentes devido à sua utilidade para a identificação de produtos químicos sensibilizantes e não sensibili ­
zantes da pele, com algumas limitações (10) (11) (12). O método foi 
concebido para avaliar o potencial de sensibilização da pele de animais 
por produtos químicos (substâncias e misturas). O capítulo B.6 deste anexo e o  Test Guideline  406 da OCDE recorrem a ensaios em cobaias, 
nomeadamente o ensaio de maximização na cobaia e o ensaio de Buehler 
(13). O método LLNA (capítulo B.42 deste anexo,  Test Guideline  429 da 
OCDE) e as duas alterações do mesmo que não recorrem a matérias radioativas (LLNA: BrdU-ELISA – capítulo B.51 deste anexo,  Test Gui ­
deline  442 B da OCDE – e LLNA: DA – capítulo B.50 deste anexo,  Test 
Guideline  442 A da OCDE) apresentam vantagens em relação aos ensaios 
na cobaia descritos no capítulo B.6 e no  Test Guideline  406 da OCDE 
(13), traduzidas na redução e no aperfeiçoamento do recurso a animais.
 
2. O método LLNA: BrdU-ELISA é similar ao método LLNA. Estuda a fase 
indutora da sensibilização cutânea e fornece dados quantitativos adequados 
para a avaliação da resposta à dosagem. Por outro lado, o facto de permitir detetar sensibilizantes cutâneos sem necessidade de utilizar marcadores radioativos do ADN elimina as questões potenciais em matéria de expo ­
sição profissional à radioatividade e de eliminação de resíduos. O presente 
método possibilita a utilização crescente de ratos na deteção de sensibili ­
zantes cutâneos, o que facilita a redução do recurso a cobaias em ensaios de potencial de sensibilização cutânea (capítulo B6,  Test Guideline  406 da 
OCDE) (13).
 
DEFINIÇÕES  
3. As definições utilizadas figuram no apêndice 1.  
CONSIDERAÇÕES INICIAIS E LIMITAÇÕES  
4. O método LLNA: BrdU-ELISA é um método LLNA modificado para a 
identificação de produtos químicos potencialmente sensibilizantes da pele, com determinadas limitações. Isso não implica, necessariamente, que o método LLNA: BrdU-ELISA deva ser sempre utilizado em substituição 
do método LLNA ou de ensaios em cobaias (método B.6,  Test Guideline  
406 da OCDE) (13), mas apenas que é equivalente aos segundos e pode ser utilizado em alternativa, gerando normalmente resultados positivos ou negativos que dispensam confirmação (10) (11). Antes de efetuar o estudo, 
o laboratório deve examinar todas as informações disponíveis sobre a 
substância em causa, nomeadamente a identificação e a estrutura química,
 ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 745
 
as propriedades físico-químicas, os resultados de quaisquer outros ensaios  
in vitro  ou in vivo  de toxicidade da substância e dados toxicológicos sobre 
produtos químicos com estrutura semelhante. Esse exame destina-se a determinar se o método LLNA: BrdU-ELISA se adequa à substância em estudo (dada a incompatibilidade de alguns tipos de produtos químicos 
com o método LLNA: BrdU-ELISA – ver o ponto 5), bem como a facilitar 
a escolha das dosagens.
 
5. O método LLNA: BrdU-ELISA é um método  in vivo , não eliminando, 
portanto, a utilização de animais na avaliação da atividade sensibilizante 
alérgica por contacto. Pode, no entanto, reduzir o recurso a animais para 
estes fins, quando comparado com os ensaios na cobaia (método B.6 e  
Test Guideline  406 da OCDE) (13). Além disso, proporciona melhorias 
substanciais no modo como os animais são utilizados nos ensaios de 
sensibilização alérgica por contacto, uma vez que, ao contrário do método 
B.6 e do  Test Guideline  406 da OCDE, não exige a indução de reações de 
hipersensibilidade dérmica por agentes externos. Também não implica a utilização de nenhum adjuvante, ao contrário do que sucede no ensaio de 
maximização na cobaia (capítulo B.6 do presente anexo, 13), reduzindo a 
dor e o sofrimento causados aos animais. Apesar das vantagens do método LLNA: BrdU-ELISA em relação ao método B.6 e ao  Test Guideline  406 
da OCDE (13), existem limitações que podem exigir o recurso a estes 
últimos, por exemplo, para ensaiar certos metais, em virtude dos resultados 
falsos positivos que se obtêm com certos irritantes cutâneos (como algu ­
mas substâncias tensioativas) (6) – 1 e capítulo B.42 do presente anexo – ou devido a problemas de solubilidade da substância em estudo. Por outro 
lado, no caso das substâncias ou classes de substâncias químicas com 
grupos funcionais que, comprovadamente, suscitem dúvidas (15), pode ser necessário recorrer a ensaios em cobaias – método B.6,  Test Guideline  
406 da OCDE (13). Relativamente ao método LLNA: BrdU-ELISA, foi 
recomendado que se ponderam também as limitações identificadas para o 
método LLNA (1 e capítulo B.42 do presente anexo) (10). Salvaguardadas estas limitações, o método LLNA: BrdU-ELISA é potencialmente aplicá ­
vel ao ensaio de qualquer produto químico, a menos que este possua 
alguma propriedade passível de comprometer a exatidão do método. 
Deve ainda ser ponderada a possibilidade de obtenção de resultados posi ­
tivos próximos do limite caso os valores de índice de estimulação (IE) estejam compreendidos entre 1,6 e 1,9 (ver os pontos 31 e 32). Estas 
reticências baseiam-se nos dados de validação de 43 substâncias com 
índice de estimulação igual ou superior a 1,6 (ver o ponto 6), nas quais o método LLNA: BrdU-ELISA identificou corretamente todas as 32 subs ­
tâncias classificadas de sensibilizantes pelo método LLNA, mas identificou 
incorretamente duas das 11 substâncias com índice de estimulação com ­
preendido entre 1,6 e 1,9 (resultado positivo próximo do limite) classifi ­
cadas de não-sensibilizantes pelo método LLNA (10). Todavia, como se utilizou o mesmo conjunto de dados para fixar os valores de índice de 
estimulação e calcular as propriedades de previsão do ensaio, os resultados 
referidos podem traduzir uma sobrestimação das reais propriedades de previsão do método.
 
PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
6. O princípio básico subjacente ao método LLNA: BrdU-ELISA é que os 
sensibilizantes induzem uma proliferação de linfócitos nos gânglios linfá ­
ticos drenantes do local de aplicação da substância em estudo. Esta pro ­
liferação é proporcional à dosagem e à potência do alergénio aplicado e 
constitui um modo simples de obter uma medida quantitativa da sensibi ­
lização. Mede-se a proliferação e compara-se a proliferação média em cada grupo estudado com a proliferação média no grupo de controlo tratado com o excipiente. Determina-se a razão entre a proliferação média em cada 
grupo tratado e a proliferação observada em paralelo no grupo de controlo 
tratado com o excipiente; esta razão é denominada índice de estimulação (IE). Para que uma substância em estudo possa ser classificada de sensibilizante cutânea potencial, este índice deve ser ≥ 1,6. O presente 
método baseia-se na medição do teor de bromodesoxiuridina como indi ­
cador do aumento do número de células em proliferação nos gânglios
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linfáticos drenantes do sistema auricular. A bromodesoxiuridina é um 
composto análogo da timidina e é similar o modo como se processa a 
sua incorporação no ADN das células em proliferação. Mede-se a incor ­
poração da bromodesoxiuridina pelo método ELISA, que utiliza um anti ­
corpo específico daquela também marcado com peroxidase. Ao 
adicionar-se o substrato, a peroxidase reage com este produzindo um 
produto corado, que é determinado quantitativamente, a uma absorvância específica, por meio de um leitor de placas de microtitulação.
 
DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Escolha da espécie animal  
7. O rato é a espécie escolhida para este ensaio. Os estudos de validação do 
método LLNA: BrdU-ELISA foram efetuados exclusivamente com a es ­
tirpe CBA/JN, que é portanto considerada a estirpe preferida (10) (12). 
Utilizam-se fêmeas adultas jovens, nulíparas e não grávidas. No início do estudo, os animais devem ter entre oito e 12 semanas; a variação de peso dos animais entre si deve ser mínima e não deve exceder 20 % do peso 
médio dos mesmos. Podem ser utilizadas outras estirpes, bem como ma ­
chos, quando houver dados suficientes que demonstrem não existirem diferenças significativas na resposta ao método LLNA: BrdU-ELISA rela ­
cionadas com a estirpe e/ou o sexo do animal.
 
Condições de alojamento e alimentação  
8. Os ratos devem ser alojados em grupo (16), a menos que se justifique 
cientificamente o seu alojamento individual. A temperatura do biotério 
deve ser de 22 °C ± 3 °C. A humidade relativa não deve ser inferior a 
30 % e, de preferência, não deve exceder 70 %, exceto durante a limpeza do biotério. Idealmente, deve procurar manter-se entre 50 % e 60 %. A iluminação deve ser artificial, com uma sequência de 12 horas de luz 
seguidas de 12 horas de escuridão. Na alimentação, podem utilizar-se 
dietas convencionais de laboratório e deve ser fornecida água de beber sem restrições.
 
Preparação dos animais  
9. Os animais são selecionados aleatoriamente, marcados de modo a permitir 
a identificação individual (mas não por marcação nas orelhas) e mantidos em gaiolas durante, pelo menos, cinco dias antes da aplicação das doses, 
para permitir a aclimatação às condições do laboratório. Antes do início do 
tratamento, examinam-se os animais, de modo a assegurar que não apre ­
sentam lesões cutâneas visíveis.
 
Preparação das soluções a aplicar  
10. Antes da aplicação nas orelhas dos ratos, os produtos químicos sólidos 
dissolvem-se ou suspendem-se em solventes/excipientes e, se necessário, 
diluem-se. Os produtos líquidos podem ser aplicados tal e qual ou ser 
diluídos antes da aplicação. Os produtos químicos insolúveis, como os geralmente presentes nos dispositivos médicos, devem ser sujeitos a um processo de extração exaustivo com um solvente apropriado, a fim de nele 
concentrar para o ensaio todos os componentes extraíveis, antes da apli ­
cação nas orelhas dos ratos. As substâncias em estudo devem ser prepa ­
radas diariamente, a menos que haja dados de estabilidade que demons ­
trem ser aceitável o seu armazenamento.
 
Verificação da fiabilidade  
11. Utilizam-se produtos químicos de controlo positivo para demonstrar o 
desempenho adequado do ensaio, devendo obter-se uma resposta quanti ­
tativamente bem caracterizada, com sensibilidade adequada e reprodutível, 
a essas substâncias sensibilizantes. Recomenda-se a inclusão, em paralelo, de um produto químico de controlo positivo, para demonstrar a compe ­
tência do laboratório na execução de cada ensaio e possibilitar a avaliação 
da reprodutibilidade e comparabilidade intra e interlaboratoriais. Algumas 
autoridades reguladoras exigem também um produto químico de controlo
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positivo em cada estudo, pelo que os laboratórios devem consultar as 
autoridades competentes antes de aplicarem o método LLNA: 
BrdU-ELISA. Aconselha-se, portanto, a utilização rotineira, em paralelo, de um produto químico de controlo positivo, para evitar a eventual neces ­
sidade de ensaios suplementares em animais decorrente do recurso apenas 
periódico a esses produtos químicos de controlo (ver o ponto 12). 
No método LLNA: BrdU-ELISA, o produto químico de controlo positivo deve induzir uma resposta positiva a um nível de exposição do qual se espere um aumento do índice de estimulação ≥ 1,6 em relação ao grupo de 
controlo negativo. Deve escolher-se a dosagem do produto químico de 
controlo positivo de modo que este não cause irritação cutânea excessiva nem toxicidade sistémica e que a indução seja reprodutível, mas não excessiva (considera-se excessivo um índice de estimulação superior a 
14). Os produtos químicos de controlo positivo preferidos são aldeído 
hexilcinâmico (n.
 o CAS 101-86-0) a 25 % e eugenol (n.  o CAS 97-53-0) 
a 25 % numa mistura de acetona e azeite na proporção volúmica 4:1. Em certas circunstâncias, e perante justificação adequada, podem utilizar-se 
outros produtos químicos de controlo positivo que cumpram os critérios 
atrás referidos.
 
12. Embora seja recomendada a inclusão, em paralelo, de um grupo de con ­
trolo positivo, em algumas situações pode justificar-se que um laboratório que aplique o método LLNA: BrdU-ELISA regularmente (isto é, pelo menos uma vez por mês) efetue ensaios de controlo positivo apenas pe ­
riódicos (a intervalos não superiores a seis meses) e mantenha uma base de 
dados histórica dos produtos químicos de controlo positivo que comprove a capacidade do laboratório de obter resultados reprodutíveis e exatos com esses produtos. A competência na execução do método LLNA: 
BrdU-ELISA pode demonstrar-se obtendo resultados positivos constantes 
com um produto químico de controlo positivo em pelo menos 10 ensaios independentes efetuados num período razoável (menos de um ano).
 
13. Deve incluir-se em paralelo um grupo de controlo positivo sempre que 
haja alguma alteração processual do método LLNA: BrdU-ELISA (por 
exemplo, alterações do pessoal formado, das matérias e/ou dos reagentes 
utilizados no método de ensaio, do equipamento utilizado neste último ou da origem dos animais estudados), devendo essas alterações ser documen ­
tadas nos relatórios laboratoriais. Deve analisar-se a incidência dessas 
alterações na adequação da base de dados históricos anteriormente estabe ­
lecida, ponderando a necessidade de criar uma nova base de dados histó ­
ricos para documentar a coerência dos resultados obtidos com os produtos químicos de controlo positivo.
 
14. Os investigadores devem ter presente que a decisão de efetuar o estudo de 
produtos químicos de controlo positivo periodicamente, e não em paralelo, 
tem implicações na adequação e aceitabilidade dos resultados negativos dos estudos efetuados sem produto químico de controlo positivo em pa ­
ralelo, no intervalo entre cada estudo de controlo positivo periódico. Por 
exemplo, se for obtido um resultado falso negativo num estudo de controlo 
positivo periódico, podem questionar-se os resultados negativos eventual ­
mente obtidos para as substâncias em estudo no período compreendido entre o último estudo periódico aceitável de controlo positivo e o estudo 
periódico inaceitável de controlo positivo. Ao optar entre a inclusão em 
paralelo de produtos químicos de controlo positivo e um controlo positivo apenas periódico, devem ponderar-se cuidadosamente as consequências. Deve também ponderar-se a utilização de menos animais no grupo de 
controlo positivo em paralelo, se houver justificação científica para isso 
e se o laboratório demonstrar, com base em dados históricos próprios, que podem ser utilizados menos ratos (17).
 
15. Embora se deva ensaiar o produto químico de controlo positivo num 
excipiente que reconhecidamente garanta coerência nas respostas (por exemplo, uma mistura de acetona e azeite na proporção volúmica 4:1), 
em determinadas situações regulamentares poderá ser também necessário 
efetuar o ensaio num excipiente não convencional (formulação clínica ou quimicamente pertinente) (18). Se o ensaio em paralelo de um produto químico de controlo positivo for efetuado com um excipiente diverso do 
da substância em estudo, deve incluir-se um controlo de excipiente para o 
produto químico de controlo positivo ensaiado em paralelo.
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16. Se o estudo consistir na avaliação de substâncias de uma determinada 
classe química ou gama de respostas, o recurso a substâncias de referência 
pode ser útil para demonstrar que o método de ensaio funciona correta ­
mente na deteção do potencial de sensibilização cutânea do tipo de subs ­
tância em causa. Para que seja considerada adequada, uma substância de 
referência deve possuir as seguintes propriedades:  
— semelhança estrutural e funcional com a classe de substâncias em 
estudo;  
— características físico-químicas conhecidas;  
— dados corroborantes do método LLNA: BrdU-ELISA;  
— dados corroborantes de outros modelos animais e/ou de ensaios em 
pessoas.  
PROCEDIMENTO DE ENSAIO  
Número de animais e níveis de dosagem  
17. Utilizam-se, no mínimo, quatro animais por grupo de dosagem e um 
mínimo de três concentrações da substância em estudo, além de um grupo de controlo negativo em paralelo, tratado apenas com o excipiente da 
substância em estudo, e de um grupo de controlo positivo (ensaiado em 
paralelo ou recentemente, consoante a política do laboratório acerca dos pontos 11 a 15). Deve ponderar-se o ensaio de várias doses do produto 
químico de controlo positivo, sobretudo quando este for ensaiado com 
intermitência. Os animais dos grupos de controlo devem ser manuseados e tratados de modo idêntico ao dos animais dos grupos tratados, exceto no que respeita à administração da substância em estudo.
 
18. A escolha da dosagem e do excipiente deve basear-se nas recomendações 
das referências (2) e (19). Selecionam-se normalmente as doses consecu ­
tivas numa série de concentrações adequada, por exemplo, 100 %, 50 %, 
25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 %, etc. A seleção das séries de concen ­
tração utilizadas deve ter fundamentação científica. Na escolha de três concentrações consecutivas de modo que a concentração mais elevada maximize a exposição, evitando ao mesmo tempo a ocorrência de toxici ­
dade sistémica e irritação cutânea local excessiva, devem ser tidas em 
conta as informações toxicológicas (por exemplo, referentes a toxicidade aguda e irritação dérmica), bem como estruturais e físico-químicas, dispo ­
níveis sobre a substância em estudo (e/ou sobre substâncias estrutural ­
mente afins) (19) (referência 20 e capítulo B.4 do presente anexo). Na 
ausência de tais informações, pode ser necessário um ensaio exploratório prévio (ver os pontos 21 a 24).
 
19. O excipiente não deve interferir no resultado do ensaio nem distorcê-lo, 
devendo ser escolhido de modo a maximizar a solubilidade e a obter a maior concentração possível numa solução ou suspensão adequada para aplicação da substância em estudo. Constituem excipientes adequados uma 
mistura de acetona e azeite na proporção volúmica 4:1, a  N,N -dimetilfor ­
mamida, a metiletilcetona, o propilenoglicol e o sulfóxido dimetílico (6), mas podem utilizar-se outros, desde que com fundamentação científica. Em certas situações, pode ser necessário efetuar um controlo adicional 
com um solvente utilizado na prática clínica ou a formulação na qual a 
substância em estudo é comercializada. Deve ter-se especial cuidado em assegurar que as substâncias hidrófilas sejam incorporadas num sistema (excipiente) que molhe a pele e não escorra de imediato, acrescentando 
solubilizadores adequados (por exemplo, Pluronic® L92 a 1 %). Devem, 
portanto, evitar-se os excipientes totalmente aquosos.
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20. A utilização de gânglios linfáticos de ratos distintos possibilita a avaliação 
da variabilidade de animal para animal e a comparação estatística da 
diferença entre as medições relativas à substância em estudo e ao grupo de controlo do excipiente (ver o ponto 33). Por outro lado, só pode ponderar-se a redução do número de ratos no grupo de controlo positivo 
se forem obtidos dados por animal (17). Além disso, algumas autoridades 
reguladoras exigem a apresentação de dados por animal. A recolha regular de dados por animal é vantajosa segundo critérios de bem-estar animal, evitando a duplicação de ensaios que seria necessária se os resultados 
relativos à substância em estudo anteriormente recolhidos de outro modo 
(por exemplo, agregação de dados relativa a séries de animais) tivessem de ser examinados ulteriormente por autoridades reguladoras com outras exi ­
gências (por exemplo, dados individualizados por animal).
 
Ensaio exploratório prévio  
21. Na ausência de informações que permitam determinar a dosagem máxima 
a ensaiar (ver o ponto 18), é necessário efetuar um ensaio exploratório 
prévio, a fim de definir a dosagem adequada a ensaiar pelo método LLNA: BrdU-ELISA. O objetivo deste ensaio exploratório consiste em fornecer orientações para a escolha da dosagem máxima a utilizar no estudo prin ­
cipal pelo método LLNA: BrdU-ELISA, caso não se disponha de infor ­
mações sobre a concentração que induz toxicidade sistémica (ver o ponto 24) e/ou irritação cutânea local excessiva (ver o ponto 23). A dosagem máxima estudada deve ser uma concentração de 100 % da subs ­
tância em estudo, no caso dos líquidos, ou a concentração máxima possí ­
vel, no caso dos sólidos e das suspensões.
 
22. O ensaio exploratório prévio é efetuado em condições idênticas às do 
estudo principal pelo método LLNA: BrdU-ELISA, mas não se avalia a proliferação nos gânglios linfáticos e podem utilizar-se menos animais por 
grupo de dosagem. Sugere-se o recurso a um ou dois animais por grupo de 
dosagem. Observam-se diariamente todos os ratos para verificar se apre ­
sentam sinais clínicos de toxicidade sistémica ou de irritação no local de aplicação. Regista-se o peso corporal de cada rato antes do ensaio e antes 
de o eutanasiar (dia 6). Observam-se as orelhas para verificar se têm 
eritema e atribui-se-lhes uma pontuação de acordo com o quadro 1 (20 e capítulo B.4 do presente anexo). Mede-se a espessura das orelhas com um instrumento adequado – por exemplo, um micrómetro digital ou um 
leitor de espessuras da Peacock – no dia 1 (antes da primeira dose), no dia 
3 (cerca de 48 horas após a primeira dose) e no dia 6. Complementar ­
mente, no dia 6 pode determinar-se a espessura das orelhas por pesagem de punções auriculares efetuadas depois da eutanásia dos animais. Uma 
pontuação de eritema ≥ 3 e/ou o aumento da espessura auricular em 25 % 
ou mais em qualquer dia de medição constituem indicadores de irritação local excessiva (21) (22). Para dosagem mais elevada no estudo principal pelo método LLNA: BrdU-ELISA, deve ser escolhida a dosagem da série 
de concentrações do ensaio exploratório prévio (ver o ponto 18) imedia ­
tamente inferior à que induz toxicidade sistémica e/ou irritação cutânea local excessiva.
 
Quadro 1  
Pontuações de eritema  
Observação Pontuação  
Ausência de eritema 0 
Eritema muito ligeiro (quase impercetível) 1 Eritema bem definido 2
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Observação Pontuação  
Eritema moderado a intenso 3 
Eritema intensa (vermelhidão roxa) ou formação de escara que 
impede a pontuação do eritema 4 
23. Além do referido acerca do aumento de 25 % da espessura auricular (21) 
(22), também se recorreu a aumentos estatisticamente significativos da espessura auricular dos ratos tratados, comparativamente aos ratos de con ­
trolo, para identificar produtos irritantes pelo método LLNA (22) (23) (24) 
(25) (26) (27) (28). Os aumentos estatisticamente significativos da espes ­
sura auricular inferiores a 25 % não foram, porém, especificamente asso ­
ciados a irritação excessiva (25) (26) (27) (28) (29).
 
24. Quando efetuadas no âmbito de uma avaliação integrada, as seguintes 
observações clínicas podem indiciar toxicidade sistémica (30), podendo assim indicar a dosagem máxima a utilizar no método LLNA: 
BrdU-ELISA principal: alterações do funcionamento do sistema nervoso 
(por exemplo, piloereção, ataxia, tremores e convulsões); alterações com ­
portamentais (por exemplo, agressividade, alterações das atividades higié ­
nicas, alterações pronunciadas de atividade); alterações respiratórias (alte ­
rações da frequência e da intensidade da respiração, como dispneia, arfar e 
pieira) e da ingestão de alimentos e de água. Devem ainda ser tidos em conta na avaliação os sinais de letargia e/ou de apatia e quaisquer sinais clínicos de dor ou sofrimento mais do que ligeiros ou momentâneos ou 
reduções de peso corporal superiores a 5 % entre o dia 1 e o dia 6, bem 
como a mortalidade. Os animais moribundos e os animais que manifestem grande sofrimento ou sinais de dor intensa devem ser eutanasiados (31).
 
Sequência experimental do estudo principal  
25. A sequência experimental do ensaio é a seguinte:  
— Dia 1:  Identificar individualmente e anotar o peso de cada animal e 
todas as observações clínicas. Aplicar no dorso de cada orelha 25 μl 
da diluição adequada da substância em estudo, do excipiente sozinho 
ou do produto químico de controlo positivo (ensaiado em paralelo ou 
recentemente, consoante a política do laboratório acerca dos pontos 11 a 15).
 
— Dias 2 e 3:  Repetir o procedimento de aplicação efetuado no dia 1.  
— Dia 4:  Nenhum tratamento.  
— Dia 5:  Injetar intraperitonealmente 0,5 ml (5 mg/rato) de solução de 
bromodesoxiuridina (10 mg/ml).  
— Dia 6:  Anotar o peso de cada animal e todas as observações clínicas. 
Eutanasiar os animais 24 horas, aproximadamente, após a injeção de 
bromodesoxiuridina. Excisar os gânglios linfáticos auriculares de dre ­
nagem, das orelhas de cada rato, e colocá-los em solução-tampão de fosfato (PBS), separadamente para cada animal. Para pormenores e 
esquemas da identificação e dissecação dos gânglios linfáticos, ver a 
referência (17). A fim de melhor avaliar a resposta cutânea local no estudo principal, podem ser incluídos no protocolo de estudo parâme ­
tros suplementares como a pontuação do eritema auricular ou medi ­
ções da espessura auricular (com um medidor de espessura ou por 
pesagem de punções auriculares  post mortem ).
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Preparação das suspensões celulares  
26. Preparar suspensões unicelulares de células dos gânglios linfáticos de cada 
rato, excisados bilateralmente, por desagregação mecânica suave através de 
um peneiro de aço inoxidável com malha de 200 μm ou recorrendo a outra 
técnica aceitável para obtenção de suspensões unicelulares (por exemplo, utilizando um almofariz de plástico descartável para esmagar os gânglios 
linfáticos, seguindo-se a passagem através de um peneiro de  nylon  com 
malha de 70 μm). O processo de preparação da suspensão de células de 
gânglios linfáticos é um aspeto crítico deste ensaio, pelo que os operadores devem adestrar-se previamente. Os gânglios linfáticos dos animais de con ­
trolo negativo são pequenos, pelo que é necessário proceder com cuidado 
para evitar efeitos artificiais nos valores do índice de estimulação. O volume da suspensão de células de gânglios linfáticos deve ser o volume ótimo determinado para cada caso (aproximadamente 15 ml). O volume 
ótimo é o que permite obter uma absorvância média do grupo de controlo 
negativo compreendida entre 0,1 e 0,2.
 
Determinação da proliferação celular (medição do teor de bromodesoxiuri ­
dina do ADN dos linfócitos)  
27. Determina-se o teor de bromodesoxiuridina pelo método ELISA com um 
conjunto comercial (por exemplo, o n.  o de catálogo 11 647 229 001 da 
Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha). Adicionar rapidamente, 
em triplicado, 100 μl da suspensão de células de gânglios linfáticos a 
uma placa de microtitulação com alvéolos de fundo plano. Depois da fixação e da desnaturação das células, adicionar anticorpos anti-BrdU a cada alvéolo e deixar reagir. A seguir, remover por lavagem os anticorpos 
anti-BrdU e adicionar a solução do substrato, deixando formar-se o cro ­
mogénio. Medir a absorvância a 370 nm, utilizando como referência o comprimento de onda de 492 nm. As condições experimentais do ensaio devem ser sempre otimizadas (ver o ponto 26).
 
OBSERVAÇÕES  
Observações clínicas  
28. Observar cuidadosamente cada rato pelo menos uma vez por dia, com 
vista à deteção de sinais clínicos, quer de irritação local no ponto de 
aplicação, quer de toxicidade sistémica. Anotar todas as observações, 
mantendo um registo para cada rato. Os planos de controlo devem incluir critérios para identificar prontamente os ratos que evidenciem níveis de toxicidade sistémica, irritação cutânea local excessiva ou corrosão da pele 
passíveis de justificarem a eutanásia do animal (31)
 
Pesos corporais  
29. Tal como referido no ponto 25, mede-se o peso corporal de cada animal 
no início do ensaio e quando da eutanásia programada.  
CÁLCULO DOS RESULTADOS  
30. Os resultados correspondentes a cada grupo de tratamento exprimem-se em 
índice de estimulação (IE) médio. Determina-se o índice de estimulação 
dividindo o valor médio do índice de marcação com bromodesoxiuridina/ 
/rato, correspondente a cada grupo tratado com a substância em estudo e ao grupo de controlo positivo, pelo valor médio do índice de marcação com bromodesoxiuridina do grupo de controlo do solvente/excipiente. O índice 
de estimulação médio para o grupo de controlo tratado com o excipiente é 
igual a 1.
 
O índice de marcação com bromodesoxiuridina é definido do seguinte 
modo:  
Índice de marcação com bromodesoxiuridina = (ABS  em – ABS branco  em ) – 
(ABS  ref – ABS branco  ref ) 
em que: em = comprimento de onda emitido; ref = comprimento de onda 
de referência.  ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 752
 
31. Para efeitos de decisão, consideram-se positivos os resultados de índice de 
estimulação ≥ 1,6 (10). Todavia, ao ponderar se um resultado próximo do 
limite (índice de estimulação compreendido entre 1,6 e 1,9) deve ou não ser considerado positivo, podem ter-se também em conta o grau de res ­
posta à dosagem, a significância estatística e a coerência das respostas 
correspondentes ao solvente/excipiente e à substância de controlo positivo 
(3) (6) (32).
 
32. No caso das respostas positivas próximas do limite, com índice de esti ­
mulação compreendido entre 1,6 e 1,9, pode ser útil aos utilizadores terem em conta, juntamente com os valores de índice de estimulação, informa ­
ções adicionais como a resposta à dosagem, sinais de toxicidade sistémica 
ou de irritação excessiva e, se for caso disso, a significância estatística, para confirmar se os resultados obtidos são positivos (10). Devem examinar-se também as propriedades da substância em estudo, nomeada ­
mente se esta possui estrutura semelhante a sensibilizantes cutâneos co ­
nhecidos ou causa irritação cutânea excessiva nos ratos, bem como a natureza da resposta à dosagem observada. Na referência (4) analisam-se em pormenor estes e outros aspetos.
 
33. A recolha de dados para cada rato possibilita uma análise estatística da 
existência, nos dados, de indicações de resposta à dosagem e do grau desta 
resposta. A avaliação estatística pode incluir uma avaliação da resposta à dosagem e comparações, convenientemente adaptadas, de grupos estuda ­
dos (por exemplo, comparações par a par de um grupo correspondente a 
uma determinada dosagem com o grupo de controlo tratado com o sol ­
vente/excipiente ensaiado em paralelo). As análises estatísticas podem in ­
cluir, por exemplo, regressões lineares ou testes de William, para analisar tendências de resposta à dosagem, e testes de Dunnett, para comparações 
par a par. Na escolha de um método de análise estatística apropriado, o 
investigador deve estar atento a possíveis divergências das variâncias e a outros problemas conexos passíveis de exigirem uma transformação dos dados ou uma análise estatística não paramétrica. O investigador pode 
ainda ter de efetuar os cálculos de índice de estimulação e as análises 
estatísticas considerando alguns pontos e descartar outros (por vezes de ­
nominados «aberrantes»).
 
DADOS E RELATÓRIOS  
Dados  
34. Os dados devem ser resumidos em quadros, indicando os valores de índice 
de marcação com bromodesoxiuridina correspondentes a cada animal, a 
média do índice de marcação com bromodesoxiuridina/animal do grupo, o parâmetro estatístico associado (desvio-padrão ou erro-padrão da média, por exemplo) e o índice de estimulação médio para cada grupo de dosa ­
gem, comparativamente ao grupo de controlo do solvente/excipiente en ­
saiado em paralelo.
 
Relatório do ensaio  
35. O relatório do ensaio deve incluir as seguintes informações:  
Produtos químicos em estudo e de controlo:  
— dados de identificação (por exemplo, números CAS e CE – caso 
existam –, origem, grau de pureza, impurezas conhecidas, número de lote),
 
— natureza física e propriedades físico-químicas (por exemplo, volatilida ­
de, estabilidade, solubilidade),  
— no caso de misturas, composição e percentagens relativas dos compo ­
nentes;  
Solvente/excipiente:  
— dados de identificação (grau de pureza, concentração – se adequado –, 
volume utilizado),  
— justificação da escolha do excipiente;  ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 753
 
Animais utilizados nos ensaios:  
— origem dos ratos CBA,  
— estado microbiológico dos animais, caso seja conhecido,  
— número e idade dos animais,  
— origem dos animais, condições de alojamento, dieta, etc.;  
Condições de ensaio:  
— origem, número de lote e dados de garantia de qualidade/controlo de 
qualidade do fabricante (sensibilidade e especificidade dos anticorpos e 
limite de deteção) para o conjunto ELISA,  
— elementos sobre a preparação e aplicação da substância em estudo,  
— justificação das dosagens escolhidas, incluindo os resultados do ensaio 
exploratório prévio, caso tenha sido efetuado,  
— concentrações do excipiente e da substância em estudo utilizadas e 
quantidade total desta aplicada,  
— elementos sobre a qualidade dos alimentos e da água (incluindo o tipo 
de dieta e a origem desta, bem como a origem da água),  
— elementos sobre a organização cronológica dos tratamentos e da co ­
lheita das amostras,  
— métodos de medição da toxicidade,  
— critérios definidos para que o estudo seja considerado positivo ou 
negativo,  
— elementos sobre eventuais desvios ao protocolo e explicação do modo 
como estes afetam a realização e os resultados do estudo;  
Verificação da fiabilidade:  
— resumo dos resultados da última verificação de fiabilidade, incluindo 
informações sobre a substância em estudo, a concentração e o exci ­
piente utilizados,  
— dados do laboratório relativos a controlos positivos ensaiados em pa ­
ralelo e/ou históricos e a controlos negativos (solvente/excipiente) en ­
saiados em paralelo,  
— se não tiver sido efetuado em paralelo um controlo positivo, a data do 
controlo positivo periódico mais recente e o relatório laboratorial cor ­
respondente, bem como um relatório que especifique os dados histó ­
ricos de controlos positivos do laboratório nos quais se baseou a decisão de não efetuar um controlo positivo em paralelo;
 
Resultados:  
— peso de cada rato no início da dosagem e na altura da sua eutanásia 
programada, bem como a média e o parâmetro estatístico associado 
(desvio-padrão ou erro-padrão da média, por exemplo) para cada grupo de tratamento,
 
— surgimento e evolução de sinais de toxicidade, incluindo irritação dér ­
mica no local da aplicação (caso ocorra), para cada animal,  
— quadro de valores de índices de marcação com bromodesoxiuridina e 
de índices de estimulação para cada grupo de tratamento, por rato,  
— média e parâmetro estatístico associado (desvio-padrão ou erro-padrão 
da média, por exemplo) do índice de marcação com bromodesoxiuri ­
dina/rato, para cada grupo de tratamento, e resultados da análise dos 
pontos aberrantes, também para cada grupo de tratamento,  ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 754
 
— índice de estimulação calculado e medida adequada da variabilidade de 
animal para animal, relativamente à substância em estudo e nos grupos 
de controlo,  
— resposta à dosagem,  
— análises estatísticas que se justifiquem;  
Análise dos resultados:  
— comentário breve sobre os resultados obtidos; análise da resposta à 
dosagem, análises estatísticas que se justifiquem e conclusão sobre a classificação, ou não, da substância em estudo como sensibilizante cutânea.
 
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 ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 757
 
Apêndice 1  
DEFINIÇÕES  
Exatidão:  Grau de acordo entre os resultados do método de ensaio e os valores 
de referência aceites. Constitui uma medida do desempenho do método e um dos aspetos da adequação. Este termo e o termo «concordância» são muitas vezes utilizados indistintamente para indicar a proporção de resultados corretos de um 
método de ensaio (33).
 
Substância de referência:  Substância (sensibilizante ou não) utilizada como 
termo de comparação com a substância em estudo. Deve ter as seguintes pro ­
priedades: i) origem ou origens uniformes e fiáveis; ii) similaridade estrutural e 
funcional com a classe de substâncias em estudo; iii) características físico-quí ­
micas conhecidas; iv) disponibilidade de dados sobre os efeitos conhecidos; e v) potência conhecida situada na gama de reação pretendida.
 
Falso negativo:  Substância incorretamente considerada negativa ou inativa pelo 
método de ensaio, quando na realidade é positiva ou ativa (33).  
Falso positivo:  Substância incorretamente considerada positiva ou ativa pelo 
método de ensaio, quando na realidade é negativa ou inativa (33).  
Perigo:  Potencial de efeitos adversos na saúde ou no ambiente, que só se ma ­
nifestam se o grau de exposição for suficiente.  
Reprodutibilidade interlaboratorial:  Medida do grau em que laboratórios quali ­
ficados diferentes, utilizando o mesmo protocolo para ensaiar a mesma substância 
em estudo, conseguem obter resultados qualitativa e quantitativamente similares. 
Determina-se durante os processos de pré-validação e de validação. Indica em que medida um ensaio pode ser transferido com êxito para outro laboratório e também se designa por «reprodutibilidade entre laboratórios» (33).
 
Reprodutibilidade intralaboratorial:  Medida do grau em que pessoal qualificado 
do mesmo laboratório nele consegue repetir resultados com êxito, em momentos diferentes, utilizando o mesmo protocolo. Também se designa por «reprodutibi ­
lidade no laboratório» (33).
 
Ponto aberrante:  Observação que difere marcadamente dos outros valores de 
uma amostra aleatória de uma população.  
Garantia de qualidade:  Processo de gestão no âmbito do qual a observância das 
normas de ensaio, das exigências e dos procedimentos de conservação de registos 
laboratoriais, bem como a exatidão dos dados transferidos, são avaliadas por pessoas independentes das que efetuam os ensaios.
 
Fiabilidade:  Medida em que, utilizando o mesmo protocolo, um método de 
ensaio pode ser continuadamente reproduzido no mesmo laboratório e em labo ­
ratórios diferentes. A fiabilidade é avaliada com base nos valores calculados das reprodutibilidades intralaboratorial e interlaboratorial (33).
 
Sensibilização cutânea:  Processo imunológico que se manifesta quando um in ­
divíduo sensível é exposto, por via tópica, a um alergénio químico indutor de 
uma resposta imunológica cutânea passível de gerar sensibilização por contacto.  
Índice de estimulação (IE):  Valor calculado para quantificar o potencial de 
sensibilização cutânea das substâncias estudadas; corresponde à razão entre a 
proliferação nos grupos tratados e a proliferação no grupo de controlo do ex ­
cipiente ensaiado em paralelo.  
Substância em estudo (ou produto químico em estudo):  Qualquer substância ou 
mistura à qual seja aplicado o presente método de ensaio.  ▼M3 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 758
 
B.52.  TOXICIDADE AGUDA POR INALAÇÃO — MÉTODO DE 
CLASSIFICAÇÃO DE TOXICIDADE AGUDA  
INTRODUÇÃO  
1. Este método é equivalente ao  Test Guideline  436 (2009) da OCDE. O 
primeiro método relativo à toxicidade aguda por inalação ( Test Guideline  
TG 403) foi adotado em 1981 e posteriormente revisto — ver o capítulo B.2 
(1) deste anexo. Depois da adoção de uma revisão do Método de Classifi ­
cação de Toxicidade Aguda — capítulo B.1.tris deste anexo (5) —, justificava-se dispor de um método de classificação de toxicidade aguda 
por inalação (2)(3)(4). Uma avaliação retrospetiva deste método de classifi ­
cação de toxicidade aguda por inalação revelou que o mesmo se adequa à utilização para efeitos de classificação e rotulagem (6). Neste método se ­
quencial recorre-se a séries de concentrações visadas fixas para classificar a 
toxicidade de produtos químicos. Embora o parâmetro fundamental seja a 
letalidade, os animais que apresentem sinais de dor intensa, de grande aflição, em sofrimento ou moribundos devem ser eutanasiados, para lhes minimizar o sofrimento. O  Guidance Document  n.
 o 19 da OCDE (7) contêm 
orientações sobre os parâmetros eticamente mensuráveis.  
2. O  Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing  (GD 39) (8) 
contém orientações para a realização e interpretação deste método de ensaio.  
3. No apêndice 1 e no referido GD 39 (8) definem-se alguns conceitos utili ­
zados neste método.  
4. Este método permite obter informações sobre as propriedades perigosas e 
possibilita o escalonamento e a classificação de acordo com o 
Regulamento (CE) n.  o 1272/2008 de produtos químicos causadores de to ­
xicidade aguda (9). Caso sejam necessárias estimativas numéricas de valores de CL
 50 ou análises da resposta à concentração, o método adequado a 
utilizar é o descrito no capítulo B.2 (1) este anexo. Para mais orientações 
sobre a escolha do método de ensaio, consultar o documento GD 39 (8). 
Este método não se destina especificamente ao ensaio de materiais especiais, tais como matérias fibrosas ou isométricas pouco solúveis ou nanomateriais manufaturados.
 
CONSIDERAÇÕES INICIAIS  
5. Antes de proceder a ensaios segundo este método, o laboratório deve ter em 
conta os elementos disponíveis sobre o produto químico, nomeadamente 
estudos já efetuados cujos resultados eventualmente dispensem a realização de mais ensaios, a fim de minimizar a utilização de animais. Entre os elementos úteis para a escolha da espécie, da estirpe, do sexo, do modo 
de exposição e das concentrações mais adequados contam-se a identidade, a 
estrutura química e as propriedades físico-químicas do produto químico em estudo, resultados de ensaios de toxicidade  in vitro  ou in vivo , as utilizações 
previstas, o potencial de exposição humana e dados (Q)SAR — "( quantita­
tive) structure-activity relationships ", relações (quantitativas) estrutura/ativi ­
dade — e toxicológicos disponíveis sobre produtos químicos estruturalmente afins. Não deve ensaiar-se por este método concentrações que presumivel ­
mente causarão dor ou sofrimento intensos, devido a efeitos corrosivos (
 1 ) 
ou fortemente irritantes [ver o GD 39 (8)].  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 759  
( 1 ) A avaliação da corrosividade pode basear-se na apreciação de especialistas na matéria, 
tendo designadamente em conta elementos relativos a experiências em pessoas ou ani ­
mais, dados  in vitro  disponíveis — por exemplo, provenientes dos capítulos B.40 (10) ou 
B.40.  A (11) deste anexo ou do  Test Guideline 425  da OCDE (12) —, valores de pH, 
informações relativas a produtos químicos similares ou outros dados pertinentes.
 PRINCÍPIO DO MÉTODO  
6. Com base num processo sequencial, obtêm-se informações sobre a toxici ­
dade aguda do produto químico em estudo por inalação durante um período de exposição de quatro horas que são suficientes para o classificar. Por 
razões ligadas à regulamentação aplicável, a duração da exposição pode 
ser diferente. São ensaiados três animais de cada sexo em cada uma das etapas de concentração definidas. Consoante a mortalidade e/ou o número de animais moribundos, podem bastar duas etapas para ajuizar da toxicidade 
aguda do produto químico em estudo. Caso se verifique que um dos sexos é 
mais sensível do que o outro, pode prosseguir-se o ensaio apenas com o sexo mais sensível. O resultado de uma etapa determina o que fazer a 
seguir:
 
a) Não são necessários mais ensaios;  
b) Ensaia-se três animais de cada sexo; ou  
c) Ensaia-se seis animais apenas do sexo mais sensível — a estimativa do 
limite inferior da classe de toxicidade deve basear-se no ensaio de seis animais (independentemente do sexo) por grupo de concentração em estudo.
 
7. Os animais moribundos ou que apresentem sinais óbvios de dor ou de 
grande sofrimento continuado devem ser eutanasiados e, na interpretação 
dos resultados do ensaio, ser considerados do mesmo modo que os animais que morrem no ensaio. O documento de orientações n.
 o 19, relativo aos 
parâmetros eticamente mensuráveis (7), define os critérios que devem pre ­
sidir à decisão de eutanasiar animais moribundos ou em grande sofrimento, 
bem como orientações sobre o reconhecimento da morte previsível ou imi ­
nente.  
DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
Escolha da espécie animal  
8. Devem ser utilizados animais adultos, jovens e saudáveis de estirpes labo ­
ratoriais correntes. A espécie preferida é o rato. É necessário justificar a 
utilização de outras espécies.  
Preparação dos animais  
9. As fêmeas utilizadas devem ser nulíparas e não podem estar grávidas. 
No dia da exposição, os animais devem ser adultos jovens com oito a 12 semanas, de peso corporal não desviado mais de 20 % do peso médio correspondente a cada sexo dos animais da mesma idade anteriormente 
expostos. Os animais devem ser selecionados aleatoriamente e marcados 
para identificação individual. Para aclimatação às condições laboratoriais, devem permanecer nas gaiolas durante, pelo menos, cinco dias antes do início do ensaio. Durante um curto período antes do ensaio, também devem 
ser aclimatados ao dispositivo de ensaio, para diminuir a tensão causada por 
um ambiente novo.
 
Manutenção dos animais  
10. A temperatura do biotério deve ser de 22 °C ± 3 °C. O ideal será manter a 
humidade relativa entre 30 % e 70 %, embora isto possa não ser possível ao utilizar água como veículo. Antes e depois das exposições, os animais são geralmente engaiolados por sexo e por concentração, mas o número de 
animais por gaiola não deve dificultar a clara observação de cada animal 
e deve minimizar as perdas devidas a lutas ou canibalismo. Quando se opta pela exposição unicamente nasal dos animais, pode ser necessário aclimatá- -los aos tubos de contenção. Estes não devem provocar aos animais tensões 
físicas, térmicas ou dinâmicas excessivas. A contenção dos animais pode 
afetar parâmetros fisiológicos como a temperatura corporal (hipertermia)
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 760
 
e/ou o volume respirado por minuto. Caso se disponha de dados genéricos 
reveladores de que nenhuma destas alterações ocorre em grau apreciável, 
não será necessária a preadaptação aos tubos de contenção. Os animais cujo corpo seja exposto na totalidade a um aerossol devem permanecer em gaiolas individuais durante a exposição, para evitar que o aerossol seja 
filtrado pela pelagem dos que com eles coabitem. Exceto nos períodos de 
exposição, podem utilizar-se dietas convencionais certificadas de laboratório, com fornecimento ilimitado de água potável da rede pública. A iluminação deve ser artificial, com uma sequência de 12 horas de luz seguidas de 12 
horas de escuridão.
 
Câmaras de inalação  
11. Ao escolher-se a câmara de inalação, deve ter-se em conta a natureza do 
produto químico em estudo e o objetivo do ensaio. Privilegia-se o modo de exposição unicamente nasal, termo que abrange as exposições "unicamente 
da cabeça", "unicamente do nariz" e "unicamente do focinho". A exposição 
unicamente nasal é geralmente preferida no estudo de aerossóis de líquidos ou de sólidos, ou de vapores que possam condensar-se e formar aerossóis. Para determinados objetivos do estudo, poderá ser melhor recorrer ao modo 
de exposição de corpo inteiro, mas será necessário justificá-lo no relatório. 
Para garantir estabilidade atmosférica nas câmaras de corpo inteiro, o vo ­
lume de todos os animais presentes em cada câmara não deve exceder 5 % do volume da câmara. O documento GD 39 (8) descreve os princípios, 
vantagens e desvantagens das técnicas de exposição unicamente nasal e 
de corpo inteiro.
 
CONDIÇÕES DE EXPOSIÇÃO  
Administração das concentrações  
12. Recomenda-se que a exposição tenha uma duração fixa de quatro horas, 
excluído o tempo para se estabelecer o equilíbrio. Em determinadas circuns ­
tâncias, podem ser necessários outros tempos de exposição, havendo que 
justificá-lo no relatório do estudo [ver o GD 39 (8)]. Os animais expostos 
em câmaras de corpo inteiro devem ser alojados individualmente, para evitar que animais coabitantes ingiram o produto químico em estudo ao lamberem-se uns aos outros. Durante o período de exposição, a alimentação 
deve ser suspensa. Durante as exposições de corpo inteiro pode continuar 
a fornecer-se água.
 
13. Os animais são expostos ao produto químico em estudo sob a forma de gás, 
vapor, aerossol ou de uma mistura destes. O estado físico a ensaiar depende 
das propriedades físico-químicas do produto químico em estudo, da concen ­
tração escolhida e/ou da forma física cuja probabilidade de presença durante a manipulação e utilização do mesmo seja maior. Os produtos químicos 
higroscópicos ou quimicamente reativos devem ser ensaiados em atmosfera 
seca. Deve tomar-se precauções para evitar concentrações que possam pro ­
vocar explosões.
 
Distribuição granulométrica  
14. Os aerossóis e os vapores que possam condensar-se em aerossóis devem ser 
objeto de análise granulométrica. Para que todas as zonas pertinentes do 
aparelho respiratório sejam expostas, recomenda-se a utilização de aerossóis com diâmetro aerodinâmico mediano da massa (MMAD) compreendido entre 1 μm e 4 μm e desvio-padrão geométrico ( σ
 g ) compreendido entre 
1,5 e 3,0 (8)(13)(14). Deve fazer-se o razoavelmente possível para respeitar 
estas condições, sendo necessário um parecer especializado caso isso não se consiga. Por exemplo, as partículas dos fumos metálicos podem ser mais pequenas do que o limite inferior indicado e as partículas carregadas, as 
fibras e as matérias higroscópicas (que aumentam de volume no ambiente 
húmido do aparelho respiratório) podem exceder o limite superior.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 761
 
Incorporação do produto químico em estudo num veículo  
15. Pode utilizar-se um veículo para obter a concentração e a granulometria 
adequadas do produto químico na atmosfera. Regra geral, deve preferir-se a água. As matérias em partículas podem ser sujeitas a processos mecânicos 
destinados a obter a distribuição granulométrica necessária, mas tendo o 
cuidado de não decompor nem alterar o produto químico em estudo. Quando houver indícios de que um processo mecânico possa ter alterado a composição do produto químico em estudo (por exemplo, devido às altas 
temperaturas geradas pela fricção numa moagem excessiva), será necessário 
verificá-la por meios analíticos. Devem tomar-se as precauções adequadas para não contaminar o produto químico em estudo. Não é necessário ensaiar 
matérias granulosas não friáveis intencionalmente formuladas para não se ­
rem inaláveis. Para demonstrar que a manipulação de uma matéria granulosa não gera partículas respiráveis, efetua-se um ensaio de desgaste. Se este gerar partículas respiráveis, deve realizar-se um ensaio de toxicidade por 
inalação.
 
Animais de controlo  
16. Não é necessário um grupo de controlo negativo (do ar) em paralelo. Caso 
se utilize um veículo diverso da água para gerar a atmosfera a ensaiar, só se utilizará um grupo de controlo do veículo se não se dispuser de dados 
históricos de toxicidade por inalação. Se um estudo de toxicidade de um 
produto químico incorporado num determinado veículo não revelar toxici ­
dade, conclui-se que o veículo em causa não é tóxico à concentração en ­
saiada, não sendo necessário nenhum grupo de controlo do veículo.
 
MONITORIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE EXPOSIÇÃO  
Caudal de ar nas câmaras  
17. Durante cada exposição, é necessário regular cuidadosamente, monitorizar 
continuamente e registar pelo menos de hora a hora o caudal de ar através de cada câmara. A monitorização da concentração (ou estabilidade) da atmosfera em estudo constitui uma medida permanente de todos os parâme ­
tros dinâmicos e um meio indireto de regular os que intervêm na geração da 
atmosfera em estudo. É necessário ter especial cuidado em evitar reinalações nas câmaras de exposição unicamente nasal, evitando que o fluxo de ar através do sistema de exposição seja incapaz de produzir uma circulação 
dinâmica da atmosfera que contém o produto químico em estudo. Existem 
metodologias a que pode recorrer-se para demonstrar que não ocorrem reinalações nas condições experimentais escolhidas (8)(15). A concentração de oxigénio não deve ser inferior a 19 % e a concentração de dióxido de 
carbono não deve exceder 1 %. Se houver razões para crer que estas con ­
centrações não são respeitadas, é necessário medi-las.
 
Temperatura e humidade relativa nas câmaras  
18. Deve manter-se a temperatura nas câmaras a 22 °C ± 3 °C. Tanto no caso 
das exposições unicamente nasais como das exposições do corpo inteiro, é 
necessário monitorizar a humidade relativa na zona de respiração dos ani ­
mais e registá-la pelo menos três vezes (duração do ensaio até quatro horas) ou de hora a hora (durações mais curtas). O ideal seria manter a humidade relativa entre 30 % e 70 %, mas isso pode não ser possível (por exemplo, 
quando se estudam misturas aquosas) ou pode não ser mensurável (devido a 
interferências do produto químico em estudo com o método de ensaio).
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Concentração nominal do produto químico em estudo  
19. Sempre que possível, deve calcular-se e registar-se a concentração nominal 
na câmara de exposição. Esta é dada pela divisão da massa gerada do produto químico em estudo pelo volume de ar total que circulou pela 
câmara. A concentração nominal não é utilizada para caracterizar a exposi ­
ção dos animais, mas a sua comparação com a concentração real dá uma indicação da eficácia de geração do sistema de ensaio, podendo ser utilizada para detetar problemas a esse nível.
 
Concentração real do produto químico em estudo  
20. Entende-se por "concentração real do produto químico em estudo", a con ­
centração do produto químico na zona de respiração dos animais da câmara de inalação. As concentrações reais podem determinar-se por métodos es ­
pecíficos (por exemplo, amostragem direta ou métodos de adsorção ou de 
reação química e posterior caracterização analítica) ou por métodos inespe ­
cíficos, tais como gravimetria após filtração. O método gravimétrico só é aceitável para aerossóis de pós com um único componente ou de líquidos pouco voláteis e deve apoiar-se em caracterizações adequadas específicas do 
produto químico em causa efetuadas antes da realização do estudo. A con ­
centração de aerossóis de pós com vários componentes também pode determinar-se por gravimetria. Todavia, são necessários para isso dados analíticos que demonstrem que a composição do produto transportado no 
aerossol é semelhante à do produto inicial. Se não se dispuser desses dados, 
pode ser necessário reanalisar periodicamente o produto químico em estudo (idealmente no aerossol) durante o ensaio. No caso dos agentes aerossoli ­
zados que possam evaporar-se ou sublimar, é necessário demonstrar que 
todas as fases são recolhidas pelo método escolhido. As concentrações 
visadas, nominais e reais devem figurar no relatório do estudo, mas apenas as concentrações reais são utilizadas na análise estatística para cálculo dos valores letais de concentração.
 
21. Deve utilizar-se, se possível, apenas um lote do produto químico em estudo 
e a amostra em estudo deve ser conservada em condições que preservem a sua pureza, homogeneidade e estabilidade. Antes de iniciar o estudo, deve 
caracterizar-se o produto químico em causa no que respeita à sua pureza e, 
se tecnicamente viável, à sua identidade e às quantidades dos contaminantes e impurezas nele identificados. Para o efeito, pode recorrer-se, entre outros, aos seguintes dados: tempos de retenção e áreas relativas de picos, pesos 
moleculares obtidos por espetrometria de massa ou cromatografia em fase 
gasosa ou outras estimativas. Embora a identidade da amostra a estudar não seja da responsabilidade do laboratório, pode ser aconselhável que este confirme, pelo menos, alguns aspetos da caracterização efetuada pelo cliente 
(cor, natureza física, etc.).
 
22. Deve manter-se a atmosfera de exposição tão constante quanto possível e 
proceder-se à sua monitorização continuamente e/ou intermitentemente, con ­
soante o método de análise. Caso se proceda a uma colheita de amostras 
intermitente, num estudo de quatro horas deve recolher-se uma amostra da 
atmosfera da câmara pelo menos duas vezes. Se isso não for viável, por limitações relacionadas com o caudal de ar ou devido a concentrações baixas, pode colher-se uma amostra ao longo de todo o período de exposi ­
ção. Se ocorrerem variações pronunciadas de uma amostra para outra, de ­
vem colher-se quatro amostras por exposição nas concentrações seguintes. A concentração na câmara correspondente a uma determinada amostra não deve desviar-se da concentração média na câmara mais de 10 %, no caso 
de gases e vapores, nem mais de 20 %, no caso de aerossóis de líquidos ou 
de sólidos. Deve calcular-se e registar-se o tempo necessário para a câmara atingir o equilíbrio (t
 95 ). A duração da exposição corresponde ao tempo de 
geração do produto químico em estudo, incluído o tempo necessário para 
atingir t  95 . O documento GD 39 (8) contém orientações para a estimativa do 
t 95 . ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 763
 
23. No caso de misturas muito complexas de vapores ou gases e de aerossóis 
(por exemplo, atmosferas de combustão e produtos químicos gerados por 
produtos ou dispositivos finais específicos), o comportamento de cada fase na câmara de inalação pode ser diferente. Por esse motivo, deve escolher-se em cada fase (vapor ou gás e aerossol) pelo menos uma substância indica ­
dora (substância analisada), normalmente a principal substância ativa da 
mistura. Se o produto químico em estudo for uma mistura, deve indicar-se no relatório a concentração analítica correspondente à mistura e não apenas a concentração correspondente ao ingrediente ativo ou ao com ­
ponente (substância analisada) em causa. O documento GD 39 (8) contém 
mais informações sobre as concentrações reais.
 
Distribuição granulométrica do produto químico em estudo  
24. Deve determinar-se a distribuição granulométrica dos aerossóis pelo menos 
duas vezes durante cada exposição de quatro horas, recorrendo a um im ­
pactor de cascata ou a outro instrumento, tal como um granulómetro aero ­
dinâmico. Se for possível demonstrar a equivalência dos resultados obtidos pelo impactor de cascata e pelo instrumento alternativo, pode utilizar-se este último em todo o estudo. Em paralelo ao instrumento primário, deve 
utilizar-se um segundo dispositivo, tal como um filtro gravimétrico ou um 
borbulhador de gás/impactor  impinger , para confirmar a eficiência de cap ­
tação do primeiro. As concentrações mássicas obtidas por análise granulo ­
métrica e por análise com filtros não devem diferir entre si mais do que 
valores razoáveis [ver o GD 39 (8)]. Se for possível demonstrar esta equi ­
valência no início do estudo, não é necessário efetuar mais medições de confirmação. Por razões de bem-estar animal, devem tomar-se medidas para minimizar dados inconclusivos que possam obrigar à repetição de exposi ­
ções. É necessário efetuar uma análise granulométrica no caso dos vapores 
que possam condensar-se para formar aerossóis ou se forem detetadas par ­
tículas numa atmosfera de vapores suscetível de formar fases mistas (ver o ponto 14).
 
PROCEDIMENTO  
Ensaio principal  
25. Utiliza-se em cada etapa três animais de cada sexo ou seis animais do sexo 
mais sensível. Se espécies que não o rato forem sujeitas a exposição uni ­
camente nasal, pode ajustar-se a duração máxima da exposição para mini ­
mizar a tensão gerada na espécie em causa. Para dose inicial, escolhe-se, das 
quatro concentrações fixas, a que tenha mais probabilidade de produzir 
efeitos tóxicos em alguns dos animais expostos. Os esquemas de ensaio para gases, vapores e aerossóis constantes dos apêndices 2 a 4 representam o procedimento a seguir em função dos valores-limite das categorias de 
classificação, rotulagem e embalagem 1 a 4 estabelecidos (9) para gases 
(100, 500, 2 500, 20 000 ppm durante 4 h, apêndice 2), vapores (0,5, 2, 10, 20 mg/l durante 4 h, apêndice 3) e aerossóis (0,05, 0,5, 1, 5 mg/l durante 4 h, apêndice 4). A categoria 5, que o Regulamento (CE) 
n.
 o 1272/2008 (9) não prevê, aplica-se às concentrações acima do limite 
correspondente. A cada concentração inicial aplica-se o esquema de ensaio respetivo. O procedimento de ensaio consiste em seguir no fluxograma as setas correspondentes ao número de animais eutanasiados ou que morreram, 
até ser possível atribuir uma categoria.
 
26. O intervalo de tempo entre a exposição dos diversos grupos é determinado 
pelo aparecimento, pela duração e pela intensidade dos sinais de toxicidade 
observados. Não se expõem animais ao nível de concentração seguinte 
enquanto não houver um grau razoável de confiança na sobrevivência dos últimos animais expostos. Recomenda-se um período de três ou quatro dias entre a exposição a cada nível de concentração, de modo a permitir a 
observação de efeitos tóxicos retardados. Se necessário, o intervalo de 
tempo pode ser ajustado, por exemplo, em caso de respostas inconclusivas.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 764
 
Ensaio do limite  
27. Efetua-se este ensaio caso se saiba ou preveja que o produto químico em 
estudo é praticamente não tóxico, isto é, só induzirá toxicidade acima da concentração-limite prevista na regulamentação aplicável. Podem obter-se 
informações sobre a toxicidade do produto químico em estudo a partir de 
ensaios já realizados com substâncias ou misturas semelhantes, tomando em consideração a identidade e percentagem dos componentes de importância toxicológica reconhecida. Nos casos em que se disponha de pouca ou ne ­
nhuma informação sobre a toxicidade do produto químico em estudo ou 
quando este for previsivelmente tóxico, deve efetuar-se o estudo principal — o documento GD 39 (8) contém mais orientações.
 
28. Seguindo o procedimento normal, constitui ensaio do limite neste método de 
ensaio expor três animais de cada sexo, ou seis animais do sexo mais 
sensível, às concentrações de 20 000 ppm (gases), 20 mg/l (vapores) e 5 mg/l (poeiras e nebulizados), se for possível atingi-las. Ao ensaiar aerossóis, o principal objetivo é conseguir obter partículas de dimensões respiráveis 
(MMAD compreendido entre 1 μm e 4 μm), o que, com a maior parte dos 
produtos químicos, se consegue a uma concentração de 2 mg/l. Só deve tentar-se ensaiar aerossóis a concentrações superiores a 2 mg/l se for pos ­
sível gerar partículas de dimensões respiráveis [ver o GD 39 (8)]. Por razões 
de bem-estar animal, o sistema GHS (16) desaconselha o ensaio de concen ­
trações superiores à concentração-limite. Só importa ponderar a realização de ensaios relativos à categoria 5 do sistema GHS (16), não prevista no Regulamento (CE) n.
 o 1272/2008 (9), se for elevada a probabilidade de os 
resultados desses ensaios terem interesse direto para a proteção da saúde 
humana, o que deve justificar-se no relatório do estudo. No caso de produtos químicos potencialmente explosivos, deve tomar-se precauções para evitar 
condições favoráveis à ocorrência de explosões. Para evitar a utilização 
desnecessária de animais, deve efetuar-se um ensaio sem animais antes do ensaio do limite, para verificar se é possível atingir as condições deste ensaio nas câmaras.
 
EXAMES  
29. Os animais devem ser examinados clinicamente com frequência durante o 
período de exposição. Depois desta, deve efetuar-se um exame clínico pelo 
menos duas vezes no dia da exposição — ou mais vezes, quando a resposta 
dos animais à exposição o aconselhar — e pelo menos uma vez por dia em seguida, durante 14 dias. Não é fixada uma duração do período de obser ­
vação, que deve depender da natureza e do momento do aparecimento de 
sinais clínicos, assim como da duração do período de recuperação. O mo ­
mento do aparecimento e do desaparecimento dos sinais de toxicidade é importante, nomeadamente se houver uma certa demora na manifestação desses sinais. Todas as observações devem ser sistematicamente registadas, 
mantendo registos individuais para cada animal. Os animais moribundos ou 
que apresentem sinais de dor intensa e/ou de grande sofrimento continuado devem ser eutanasiados, por razões de bem-estar animal. No exame clínico de sinais de toxicidade, não devem confundir-se um mau aspeto inicial e 
alterações respiratórias passageiras, imputáveis ao procedimento de exposi ­
ção, com efeitos decorrentes da exposição propriamente dita. Devem ser tidos em conta os princípios e critérios resumidos no documento de orien ­
tações relativo aos parâmetros eticamente mensuráveis (7). Se forem euta ­
nasiados animais ou forem encontrados animais mortos, deve registar-se o 
momento da morte com a maior exatidão possível.
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30. Os exames a efetuar aos animais engaiolados devem incidir, nomeadamente, 
nas alterações da pele e da pelagem, dos olhos e das mucosas, do aparelho 
respiratório, do sistema circulatório, dos sistemas nervosos autónomo e cen ­
tral, da atividade somatomotora e do comportamento. Se possível, registar as diferenças eventualmente observadas entre efeitos locais e sistémicos. Deve 
estar-se atento a tremores, convulsões, salivação, diarreia, letargia, sono e 
coma. A medição da temperatura retal pode corroborar uma bradipneia reflexa ou uma hipo/hipertermia relacionadas com a exposição ou com o confinamento.
 
Peso corporal  
31. Regista-se o peso de cada animal uma vez durante o período de aclimatação, 
no dia da exposição, antes desta (dia 0), e, pelo menos, nos dias 1, 3 e 7 (e posteriormente uma vez por semana), bem como no momento da morte ou 
da eutanásia, se posterior ao dia 1. O peso corporal é reconhecidamente um 
indicador crítico de toxicidade, pelo que é necessário observar atentamente os animais cujo peso decresça 20 % ou mais relativamente ao peso anterior ao estudo e não volte a aumentar. No final do período após a exposição, 
pesa-se e eutanasia-se os animais sobreviventes.
 
Patologia  
32. Os animais utilizados nos ensaios (incluindo os que morrerem durante o 
ensaio ou que forem eutanasiados e retirados do estudo por razões de bem-estar animal) devem ser sujeitos a uma autópsia macroscópica. Se 
não for possível realizar a autópsia imediatamente depois de detetada a 
morte do animal, este deve ser refrigerado (não congelado) a uma tempe ­
ratura suficientemente baixa para minimizar a autólise. As autópsias devem 
ser efetuadas o mais rapidamente possível, normalmente não mais de um ou 
dois dias após a morte. Regista-se todas as alterações patológicas macros ­
cópicas de cada animal, prestando especial atenção às alterações do aparelho respiratório.
 
33. Pode efetuar-se outros exames previamente previstos para alargar o valor 
interpretativo do estudo, tais como a pesagem dos pulmões dos ratos sobre ­
viventes e/ou a pesquisa, por exame microscópico, de irritações do aparelho 
respiratório. Também podem examinar-se os órgãos que evidenciem macro ­
patologias de animais que tenham sobrevivido 24 horas ou mais, bem como órgãos que se saiba serem afetados ou que se preveja serem-no. O exame 
microscópico de todo o aparelho respiratório pode fornecer elementos úteis 
no caso dos produtos químicos que reagem com a água, tais como os ácidos e os produtos químicos higroscópicos.
 
DADOS E RELATÓRIOS  
Dados  
34. Devem ser indicados o peso corporal e os resultados da autópsia de cada 
animal. Deve resumir-se os resultados dos exames clínicos num quadro, 
indicando, para cada grupo estudado, o número de animais utilizados, o 
número de animais que apresentaram sinais específicos de toxicidade, o número de animais que morreram durante o ensaio ou que foram eutanasia ­
dos e o momento da morte de cada animal, complementados por uma 
descrição dos efeitos tóxicos e da evolução e reversibilidade destes, bem 
como pelos resultados das autópsias.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 766
 
Relatório dos ensaios  
35. Elementos a constar, quando pertinente, do relatório dos ensaios:  
Animais estudados e condições em que são mantidos  
— descrição das condições de engaiolamento, nomeadamente: número (ou 
alteração do número) de animais por gaiola, camas, temperatura e hu ­
midade relativa ambientes, fotoperíodo e dieta,  
— espécie e estirpe utilizadas e, caso não sejam utilizados ratos, justificação 
da utilização de outra espécie,  
— número, idade e sexo,  
— método de aleatorização,  
— elementos sobre a qualidade dos alimentos e da água (incluindo o tipo 
de dieta e a origem desta, bem como a origem da água),  
— descrição de eventuais condicionamentos anteriores ao ensaio, nomeada ­
mente ao nível da dieta, de quarentenas e do tratamento de doenças.  
Produto químico em estudo  
— natureza física, grau de pureza e propriedades físico-químicas pertinentes 
(incluindo a isomerização),  
— dados de identificação e, se for conhecido, número de registo CAS 
(Chemical Abstract Service ). 
Veículo  
— justificação da utilização e da escolha do veículo (se não for água),  
— dados históricos ou paralelos demonstrativos de que o veículo não in ­
terfere nos resultados do estudo.  
Câmaras de inalação  
— descrição – incluindo dimensões e volume – das câmaras de inalação,  
— origem e descrição do equipamento utilizado na exposição dos animais e 
na geração da atmosfera,  
— equipamento de medição da temperatura, humidade, granulometria e 
concentração real,  
— fonte de ar, tratamento do ar fornecido/evacuado e sistema de climati ­
zação utilizado,  
— métodos utilizados para calibrar o equipamento a fim de garantir a 
homogeneidade da atmosfera ensaiada,  
— subpressão ou sobrepressão,  
— pontos de exposição por câmara (de exposição unicamente nasal); loca ­
lização dos animais no sistema (câmara de exposição de corpo inteiro),  
— homogeneidade/estabilidade no tempo da atmosfera ensaiada,  
— localização nas câmaras dos sensores térmicos e higrométricos e dos 
pontos de colheita de amostras da atmosfera ensaiada,  
— caudais de ar, caudal de ar em cada ponto de exposição (exposição 
unicamente nasal) ou relação entre o volume ocupado pelos animais e 
o volume da câmara (câmara de exposição de corpo inteiro),  
— informações sobre o equipamento eventualmente utilizado para medir o 
oxigénio e o dióxido de carbono,  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 767
 
— tempo necessário para as câmaras de inalação atingirem o equilíbrio 
(t 95 ), 
— número horário de substituições de volume,  
— medidores (se existirem).  
Elementos relativos à exposição  
— fundamentação da escolha da concentração visada no estudo principal,  
— concentrações nominais (dadas pela divisão da massa do produto quí ­
mico em estudo introduzido na câmara de inalação pelo volume de ar total que nela circulou),
 
— concentrações reais do produto químico em estudo obtidas na zona de 
respiração dos animais; no caso das misturas estudadas que geram for ­
mas físicas heterogéneas (gases, vapores, aerossóis), pode analisar-se 
separadamente cada uma delas,  
— as concentrações no ar devem indicar-se em unidades de massa (mg/l, 
mg/m  3 , etc.); podem igualmente indicar-se unidades de volume (ppm, 
ppb, etc.) entre parêntesis,  
— distribuição granulométrica, diâmetro aerodinâmico mediano da 
massa (MMAD) e desvio-padrão geométrico ( σ g ), incluindo os métodos 
de cálculo correspondentes; indicar também o resultado de cada análise 
granulométrica efetuada.  
Condições de realização dos ensaios  
— elementos sobre a preparação do produto químico estudado, nomeada ­
mente sobre eventuais métodos de redução da granulometria de sólidos ou de preparação de soluções do produto químico. Se o recurso a pro ­
cessos mecânicos for passível de ter alterado a composição do produto 
químico em estudo, incluir os resultados das análises efetuadas para 
verificar a composição deste,
 
— descrição (de preferência complementada por um esquema) do equipa ­
mento utilizado para gerar a atmosfera ensaiada e para expor os animais 
a essa atmosfera,  
— elementos sobre o método de análise química utilizado e sobre a vali ­
dação desse método (incluindo o rendimento da recuperação do produto 
químico em estudo do meio amostrado),  
— Fundamentação da escolha das concentrações utilizadas nos ensaios.  
Resultados  
— quadro com a temperatura, a humidade e o caudal de ar nas câmaras,  
— quadro com as concentrações nominais e reais nas câmaras,  
— quadro com os dados granulométricos, nomeadamente dados analíticos 
sobre a colheita de amostras, a distribuição granulométrica e os cálculos 
de MMAD e σ g , 
— quadro com os dados de resposta e as concentrações correspondentes a 
cada animal (animais que apresentaram sinais de toxicidade, incluindo 
mortalidade, e natureza, intensidade e duração dos efeitos),  
— pesos corporais de cada animal registados durante os dias do estudo, 
bem como a data e o momento da morte, se anterior à eutanásia pro ­
gramada; aparecimento, evolução e eventual reversibilidade de sinais de 
toxicidade em cada animal,  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 768
 
— resultados da autópsia e resultados histopatológicos correspondentes a 
cada animal, se disponíveis,  
— categoria no sistema de classificação, embalagem e rotulagem e 
valor-limite da CL  50 . 
Discussão e interpretação dos resultados  
— deve ser dada especial atenção à descrição dos métodos utilizados para 
satisfazer os critérios deste método de ensaio, nomeadamente no que respeita à concentração-limite e à granulometria,
 
— examinar em que medida, com base nos resultados globais, as partículas 
são respiráveis, em especial se os critérios granulométricos não forem 
satisfeitos,  
— a apreciação global do estudo deve incidir igualmente na coerência dos 
métodos utilizados para determinar as concentrações nominal e real e deve dar conta da relação entre estas concentrações,
 
— referir a causa provável da morte e o modo de ação predominante 
(sistémico ou local),  
— explicar por que razão terá sido necessário eutanasiar animais que apre ­
sentavam sinais de dor ou de grande sofrimento continuado, com base nos critérios do documento de orientações da OCDE relativo aos parâ ­
metros eticamente mensuráveis (7).
 
REFERÊNCIAS:  
1) Capítulo B.2 deste anexo, "Toxicidade aguda (inalação)".  
2) Holzhütter H.-G., Genschow E., Diener W., Schlede E. (2003). Dermal and 
Inhalation Acute Toxicity Class Methods: Test Procedures and Biometric 
Evaluations for the Globally Harmonized Classification System.  Arch. Toxi ­
col. 77:243-254.  
3) Diener W., Kayser D., Schlede E. (1997). The Inhalation Acute-Toxic-Class 
Method; Test Procedures and Biometric Evaluations.  Arch. Toxicol.  
71:537-549.  
4) Diener W., Schlede E. (1999). Acute Toxic Class Methods: Alternatives to 
LD/LC  50 Tests.  ALTEX  1:129-134.  
5) Capítulo B.1.tris deste anexo, "Toxicidade oral aguda – Método de classifi ­
cação de toxicidade aguda".  
6) OCDE (2009). Report on Biostatistical Performance Assessment of the Draft 
TG 436 Acute Toxic Class Testing Method for Acute Inhalation Toxicity. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Asses ­
sment No. 105. OCDE, Paris. Disponível em http://www.oecd.org/env/ testguidelines.
 
7) OCDE (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and 
Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals 
Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph 
Series on Testing and Assessment No. 19. Disponível em http://www. oecd.org/env/testguidelines.
 
8) OCDE (2009). Guidance Document on Acute Inhalation Toxicity Testing. 
Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and 
Assessment No. 39. OCDE, Paris. Disponível em http://www.oecd.org/env/ 
testguidelines.  
9) Regulamento (CE) n.  o 1272/2008 do Parlamento Europeu e do Conselho, de 
16 de dezembro de 2008, relativo à classificação, rotulagem e embalagem de substâncias e misturas, que altera e revoga as Diretivas 67/548/CEE e 
1999/45/CE, e altera o Regulamento (CE) n.
 o 1907/2006 (JO L 353 de 
31.12.2008, p. 1).  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 769
 
10) Capítulo B.40 deste anexo, "Corrosão da pele  in vitro : Ensaio da resistência 
elétrica transcutânea (RET)".  
11) Capítulo B.40.A deste anexo, "Corrosão da pele  in vitro : Ensaio em modelos 
de pele humana".  
12) OCDE (2005). In Vitro Membrane Barrier Test Method for Skin Corrosion. 
OCDE Guideline for testing of chemicals No. 435. OCDE, Paris. Disponível 
em http://www.oecd.org/env/testguidelines.  
13) Phalen R.F. (2009). Inhalation Studies: Foundations and Techniques (2.  a 
edição). Informa Healthcare, New York.  
14) SOT (1992). Technical Committee of the Inhalation Specialty Section, So ­
ciety of Toxicology (SOT). Recommendations for the Conduct of Acute Inhalation Limit Tests.  Fund. Appl. Toxicol.  18:321-327.
 
15) Pauluhn J., Thiel A. (2007). A Simple Approach to Validation of 
Directed-Flow Nose-Only Inhalation Chambers.  J. Appl. Toxicol.  
27:160-167.  
16) ONU (2007). United Nations Globally Harmonized System of Classification 
and Labelling of Chemicals (GHS). ST/SG/AC.10/30, ONU, Nova Iorque e 
Genebra. Disponível em http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ /ghs_welcome_e.html.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 770
 
Apêndice 1  
DEFINIÇÃO  
Produto químico em estudo:  qualquer substância ou mistura à qual seja apli ­
cado este método de ensaio.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 771
 
Apêndice 2  
Procedimento a seguir para gases em função da concentração (ppm) 
INICIAL (4 h)  
Observações gerais (  1 ) 
Esquematiza-se neste apêndice o procedimento de ensaio a seguir consoante a 
concentração inicial.  
Apêndice 2a: concentração inicial de 100 ppm;  
Apêndice 2b: concentração inicial de 500 ppm;  
Apêndice 2c: concentração inicial de 2 500 ppm;  
Apêndice 2d: concentração inicial de 20 000 ppm.  
O procedimento de ensaio segue as setas correspondentes ao número de animais 
eutanasiados ou que morreram.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 772  
( 1 ) Os quadros seguintes reportam-se ao sistema GHS (Sistema Mundial Harmonizado de 
Classificação e Rotulagem de Produtos Químicos). O equivalente na União Europeia é o 
Regulamento (CE) n.  o 1272/2008 (9), que não prevê a categoria 5 para a toxicidade 
aguda por inalação.
 Apêndice 2a  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test Procedure with a starting concentration of 100 ppm/4 h for gases
  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 773
 
Apêndice 2b  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test Procedure with a starting concentration of 500 ppm/4h for gases
  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 774
 
Apêndice 2c  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test Procedure with a starting concentration of 2 500 ppm/4h for gases
  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 775
 
Apêndice 2d  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test Procedure with a starting concentration of 20 000 ppm/4h for gases
  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 776
 
Apêndice 3  
Procedimento a seguir para vapores em função da concentração (mg/l) 
inicial (4 h)  
Observações gerais (  1 ) 
Esquematiza-se neste apêndice o procedimento de ensaio a seguir consoante a 
concentração inicial.  
Apêndice 3a: concentração inicial de 0,5 mg/l;  
Apêndice 3b: concentração inicial de 2,0 mg/l;  
Apêndice 3c: concentração inicial de 10 mg/l;  
Apêndice 3d: concentração inicial de 20 mg/l.  
O procedimento de ensaio segue as setas correspondentes ao número de animais 
eutanasiados ou que morreram.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 777  
( 1 ) Os quadros seguintes reportam-se ao sistema GHS (Sistema Mundial Harmonizado de 
Classificação e Rotulagem de Produtos Químicos). O equivalente na União Europeia é o 
Regulamento (CE) n.  o 1272/2008 (9), que não prevê a categoria 5 para a toxicidade 
aguda por inalação.
 Apêndice 3a  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 0,5 mg/L/4h for vapours
  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 778
 
Apêndice 3b  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 2 mg/L/4h for vapours
  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 779
 
Apêndice 3c  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 10 mg/L/4h for vapours
  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 780
 
Apêndice 3d  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 20 mg/L/4h for vapours
  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 781
 
Apêndice 4  
procedimento a seguir para aerossóis em função da concentração (mg/l) 
inicial (4 h)  
Observações gerais (  1 ) 
Esquematiza-se neste apêndice o procedimento de ensaio a seguir consoante a 
concentração inicial.  
Apêndice 4a: concentração inicial de 0,05 mg/l;  
Apêndice 4b: concentração inicial de 0,5 mg/l;  
Apêndice 4c: concentração inicial de 1 mg/l;  
Apêndice 4d: concentração inicial de 5 mg/l.  
O procedimento de ensaio segue as setas correspondentes ao número de animais 
eutanasiados ou que morreram.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 782  
( 1 ) Os quadros seguintes reportam-se ao sistema GHS (Sistema Mundial Harmonizado de 
Classificação e Rotulagem de Produtos Químicos). O equivalente na União Europeia é o 
Regulamento (CE) n.  o 1272/2008 (9), que não prevê a categoria 5 para a toxicidade 
aguda por inalação.
 Apêndice 4a  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 0,05 mg/L/4h for vapours
  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 783
 
Apêndice 4b  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 0,5 mg/L/4h for aerosols
  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 784
 
Apêndice 4c  
Acute inhalation toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 1 mg/L/4h for aerosols
  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 785
 
Apêndice 4d  
Acute Inhalation Toxicity:  
Test procedure with a starting concentration of 5 mg/L/4h for aerosols
  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 786
 
B.53.  ESTUDO DE NEUROTOXICIDADE DURANTE O 
DESENVOLVIMENTO  
INTRODUÇÃO  
1. Este método é equivalente ao  Test Guideline  TG 426 (2007) da OCDE. Em 
junho de 1995, um grupo de trabalho da OCDE que se ocupa dos efeitos 
tóxicos durante a reprodução e o desenvolvimento debateu em Copenhaga a necessidade de atualizar os  Test Guidelines  relativos à toxicidade durante a 
reprodução e o desenvolvimento existentes à data, bem como de elaborar 
novas orientações para parâmetros ainda não abrangidos (1). Esse grupo de 
trabalho recomendou que se elaborasse um  Test Guideline  relativo à neu ­
rotoxicidade durante o desenvolvimento, com base nas orientações da Agência de Proteção do Ambiente (EPA) dos E.U.A., as quais foram en ­
tretanto revistas (2). Em junho de 1996, realizou-se em Copenhaga uma 
segunda reunião de consultas com o objetivo de fornecer ao Secretariado orientações sobre as linhas gerais de um novo  Test Guideline  relativo à 
neurotoxicidade durante o desenvolvimento, designadamente acerca dos 
principais elementos do mesmo, como a escolha da espécie animal, o pe ­
ríodo de administração, o período de ensaio, os parâmetros a avaliar e os critérios de avaliação dos resultados. Em 1998, foram publicadas orienta ­
ções da referida agência para a avaliação do risco de neurotoxicidade (3). 
Em outubro de 2000, realizaram-se paralelamente uma reunião de consulta 
de peritos da OCDE e jornadas do Instituto de Ciências do Risco do  
International Life Sciences Institute  (ILSI). Em 2005, realizou-se em Tóquio 
uma reunião de consulta de peritos. Estas reuniões visaram debater as 
questões científicas e técnicas relativas ao  Test Guideline  em causa, tendo 
as recomendações delas emanadas (4)(5)(6)(7) sido tidas em conta na ela ­
boração do presente método. Os documentos de orientações da OCDE 
n.
 o 43 (ensaio e avaliação de efeitos tóxicos na reprodução) (8) e n.  o 20 
(ensaios de neurotoxicidade) (9) contêm informações adicionais sobre a execução do presente método, a interpretação dos resultados do mesmo e a terminologia nele utilizada.
 
CONSIDERAÇÕES INICIAIS  
2. É sabido que diversos produtos químicos têm efeitos neurotóxicos durante o 
desenvolvimento, na espécie humana e noutras espécies (10)(11)(12)(13). A 
fim de se determinarem e avaliarem as características tóxicas de um produto químico, pode ser necessário determinar a neurotoxicidade potencial do mesmo durante o desenvolvimento. Os estudos de neurotoxicidade durante 
o desenvolvimento visam gerar dados, nomeadamente de caracterização da 
resposta à dosagem, relativos aos efeitos funcionais e morfológicos poten ­
ciais no sistema nervoso em desenvolvimento da progenitura, após exposi ­
ção intrauterina ou nos primeiros estádios de vida após o nascimento.
 
3. Os estudos de neurotoxicidade durante o desenvolvimento podem realizar-se 
separadamente, ser integrados em estudos de toxicidade durante a reprodu ­
ção e/ou de neurotoxicidade em indivíduos adultos — por exemplo, os métodos B.34 (14), B.35 (15), B.43 (16) — ou ser complementares de estudos de toxicidade durante o desenvolvimento pré-natal (por exemplo, 
o método B.31 — (17). Se o estudo de neurotoxicidade durante o desen ­
volvimento for incorporado noutro estudo ou o complementar. é imperativo manter a integridade de ambos os tipos de estudos. Os ensaios devem respeitar a legislação ou as orientações estatais ou institucionais aplicáveis 
no que respeita à utilização de animais de laboratório em investigação — 
por exemplo (18).
 
4. Antes de efetuarem o estudo, os laboratórios devem ponderar todas as 
informações disponíveis sobre o produto químico em causa, nomeadamente a identidade e a estrutura do mesmo, as propriedades físico-químicas do 
produto químico, os resultados de outros ensaios de toxicidade  in vitro  ou 
in vivo  deste, dados toxicológicos disponíveis sobre produtos químicos 
estruturalmente afins e ainda a utilização ou utilizações previstas do produto químico em questão. Estas informações ajudarão a escolher uma dose inicial 
adequada e são necessárias para comprovar a pertinência do ensaio para a 
proteção da saúde humana.
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 787
 
PRINCÍPIO DO MÉTODO  
5. Administra-se o produto químico em estudo a animais durante os períodos 
de gestação e de lactação. Efetuam-se ensaios nas progenitoras para avaliar 
os efeitos nas fêmeas grávidas e em lactação, podendo igualmente obter-se informações comparativas entre aquelas e a sua progenitura. Procede-se à avaliação de neurotoxicidade em progenitura selecionada aleatoriamente das 
ninhadas. A avaliação consiste em exames destinados a detetar anomalias 
neurológicas macroscópicas e comportamentais, nomeadamente ao nível do desenvolvimento físico, da ontogenia comportamental, da atividade motora, das funções motoras e sensoriais, da aprendizagem e da memória, bem 
como na determinação da evolução ponderal do cérebro e na avaliação 
de neuropatologias durante o desenvolvimento pós-natal e na idade adulta.
 
6. Se a aplicação deste método constituir um estudo separado, podem 
submeter-se animais disponíveis em cada grupo a protocolos neurocompor ­
tamentais, neuropatológicos, neuroquímicos ou eletrofisiológicos específicos 
suscetíveis de complementar os dados fornecidos pelos exames recomenda ­
dos no presente método (16)(19)(20)(21). Esses protocolos podem revelar-se particularmente úteis se observações empíricas, efeitos previstos ou o mecanismo ou modo de ação apontarem para um determinado tipo de 
neurotoxicidade. Os protocolos em questão podem ser aplicados às proge ­
nitoras ou à progenitura. Podem igualmente executar-se protocolos  ex vivo  
ou in vitro  complementares, desde que estes não alterem a integridade dos 
protocolos  in vivo .
 
PREPARATIVOS PARA O ENSAIO  
Escolha da espécie animal  
7. A espécie preferida é o rato, mas podem utilizar-se outras espécies adequa ­
das. Importa, porém, salientar que os dias de gestação e de desenvolvimento pós-natal especificados neste método correspondem às estirpes de ratos mais utilizadas, devendo escolher-se durações comparáveis se forem utilizadas 
estirpes inabituais de ratos ou espécies diferentes. Se forem utilizadas outras 
espécies, será necessário justificá-lo com base em dados toxicológicos, farmacocinéticos e/ou outros. A justificação da opção tomada deve 
apoiar-se em avaliações neurocomportamentais e neuropatológicas pós-na ­
tais já disponíveis, específicas da espécie em causa. Se um ensaio anterior tiver gerado resultados preocupantes, deve ser ponderada a utilização da espécie ou estirpe que os gerou. Dado que as diversas estirpes de ratos têm 
desempenhos diferentes, importa comprovar a adequação da fecundidade e 
da reatividade da estirpe selecionada. Se forem utilizadas outras espécies, é necessário documentar a fiabilidade e sensibilidade da deteção da neuroto ­
xicidade durante o desenvolvimento das espécies em causa.
 
Condições de alojamento e de alimentação  
8. A temperatura do biotério deve ser de 22 °C ± 3 °C. A humidade relativa 
deve estar compreendida entre 50 % e 60 %, embora sejam aceitáveis va ­
lores compreendidos entre 30 %, no mínimo, e um valor máximo que, preferencialmente, não deve exceder 70 %, salvo durante os períodos de limpeza do biotério. A iluminação deve ser artificial, com uma sequência de 
12 horas de luz seguidas de 12 horas de escuridão. Também se pode 
inverter o ciclo de iluminação antes do acasalamento e durante todo o estudo, a fim de se proceder à avaliação dos parâmetros funcionais e com ­
portamentais durante o período de obscuridade (sob luz vermelha), isto é, 
durante o período de atividade normal dos animais (22). As alterações do 
ciclo iluminação-obscuridade devem ter um período de aclimatação adequa ­
do, que permita aos animais adaptarem-se ao novo ciclo. Na alimentação, podem utilizar-se dietas convencionais de laboratório e deve ser fornecida 
água de beber sem restrições. Deve indicar-se no relatório o tipo de ali ­
mentação e de água e analisar-se a presença de contaminantes em ambos.
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 788
 
9. Os animais podem ser alojados individualmente ou em pequenos grupos do 
mesmo sexo. O acasalamento deve ocorrer em gaiolas adequadas para o 
efeito. Uma vez comprovado o acasalamento ou, o mais tardar, no 15.  o dia 
de gestação, as fêmeas cobertas devem ser alojadas separadamente em gaiolas de maternidade. As gaiolas devem ser dispostas de forma a mini ­
mizar possíveis efeitos derivados do seu posicionamento. As fêmeas cober ­
tas que se aproximem do termo da gestação devem dispor de materiais de nidificação definidos apropriados. É sabido que manipulações inadequadas ou agitação durante a gravidez podem ter efeitos indesejados, nomeada ­
mente abortos espontâneos ou alterações do desenvolvimento fetal ou 
pós-natal. A fim de evitar mortalidade fetal devida a fatores não relaciona ­
dos com a exposição, os animais devem ser cuidadosamente manipulados durante a gestação e deve evitar-se qualquer agitação provocada por fatores 
exteriores, como ruído excessivo
 
Preparação dos animais  
10. Os animais utilizados devem ser saudáveis, ter sido aclimatados às condi ­
ções laboratoriais e não devem ter participado em experiências anteriores, salvo se o estudo estiver integrado noutro (ver o ponto 3). É necessário 
caracterizar a espécie, a estirpe, a proveniência, o sexo, o peso e a idade dos 
animais utilizados no estudo. Deve atribuir-se a cada animal um número de identificação único, com o qual o animal seja marcado. Os animais de todos os grupos estudados devem, tanto quanto possível, ter peso e idade unifor ­
mes e pertencer à gama normal da espécie e estirpe em estudo. As fêmeas 
utilizadas para todos os níveis de dosagem devem ser jovens adultas nulí ­
paras. Não devem acasalar-se entre si animais da mesma ninhada, sendo necessário tomar precauções para o evitar. Considera-se dia 0 de gravidez 
aquele em que se observa um rolhão vaginal e/ou esperma. No caso de se 
comprarem fêmeas grávidas a um fornecedor, deve proporcionar-se-lhes um período de aclimatação adequado (2 a 3 dias, por exemplo). As fêmeas cobertas devem ser distribuídas aleatória e, o mais possível, uniformemente 
pelos grupos de controlo e pelos grupos expostos (recomenda-se, por exem ­
plo, a aplicação de um protocolo de distribuição aleatória estratificada, nomeadamente baseado no peso corporal, para uniformizar a distribuição por todos os grupos). Devem repartir-se as fêmeas cobertas pelo mesmo 
macho uniformemente por todos os grupos.
 
PROCEDIMENTO DE ENSAIO  
Número e sexo dos animais  
11. Cada grupo exposto e cada grupo de controlo deve compreender um nú ­
mero de fêmeas grávidas a expor ao produto químico em estudo suficiente 
para que a progenitura por elas gerada seja em número adequado para a 
avaliação de toxicidade. Para cada nível de dosagem recomendam-se 20 ninhadas. Admite-se o recurso a modelos de grupos escalonados ou de administração em replicado, desde que se atinja o número total previsto 
de ninhadas por grupo e se utilizem modelos estatísticos adequados para 
tratar os replicados.
 
12. O mais tardar ao quarto dia após o nascimento, deve ajustar-se o tamanho 
de cada ninhada eliminando aleatoriamente as crias em excesso, de modo 
que todas as ninhadas tenham o mesmo número de animais (23). As ni ­
nhadas não devem ter mais crias do que a média da estirpe de roedor utilizada (8-12). Tanto quanto possível, as ninhadas devem ter o mesmo número de machos e de fêmeas. Não é admissível uma eliminação seletiva 
de crias, por exemplo, baseada no peso corporal. Após a normalização das 
ninhadas por eliminação de crias e antes de passar ao ensaio dos parâmetros funcionais, é necessário identificar individualmente as crias destinadas aos ensaios a decorrer antes ou depois do desmame, recorrendo a um método 
não-agressivo de identificação que lhes seja aplicável (ver, por exemplo, a 
referência 24).
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 789
 
Afetação dos animais aos ensaios funcionais e comportamentais, às 
determinações do peso cerebral e às avaliações neuropatológicas  
13. O presente método admite várias abordagens no que respeita à afetação dos 
animais expostos  in utero  e por via do aleitamento aos ensaios funcionais e 
comportamentais, à determinação da maturidade sexual, à pesagem do cére ­
bro e às avaliações neuropatológicas (25). Desde que a integridade dos 
ensaios iniciais exigidos não fique comprometida, é possível acrescentar 
os outros ensaios — da função neurocomportamental (por exemplo, do comportamento social), neuroquímicos ou neuropatológicos — que em cada caso se justifiquem.
 
14. Selecionam-se em cada grupo de dosagem as crias a destinar às avaliações 
de parâmetros ao quarto dia após o nascimento ou posteriormente. Tanto quanto possível, a seleção das crias deve ser de molde a que participe em 
cada ensaio o mesmo número de machos e de fêmeas de cada ninhada 
integrada em cada grupo de dosagem. No caso dos ensaios da atividade motora, deve utilizar-se o mesmo par macho e fêmea em todas as idades anteriores ao desmame (ver o ponto 35). Em todos os outros ensaios, 
podem afetar-se a cada ensaio comportamental o mesmo par de animais 
ou pares diferentes. Para evitar a confusão dos efeitos da idade com treino adquirido nas medições já efetuadas, pode ser necessário utilizar crias di ­
ferentes nos ensaios de comparação da função cognitiva entre animais re ­
centemente desmamados e animais adultos (26)(27). Na ocasião do des ­
mame (ao 21.
 o dia após o nascimento), as crias não selecionadas para os 
ensaios podem ser eutanasiadas. As alterações de afetações de crias devem ser mencionadas no relatório. A unidade de medida estatística deve ser a 
ninhada (ou a progenitora) e não a cria.
 
15. Há diferentes maneiras de afetar crias aos exames anteriores ou posteriores 
ao desmame, aos testes cognitivos, aos exames patológicos, etc. (ver um modelo geral na figura 1 e exemplos no apêndice 1). É o seguinte o número 
mínimo de animais recomendado em cada grupo de dosagem para os exa ­
mes anteriores ou posteriores ao desmame: 
Exames clínicos e peso corporal Todos os animais 
Exames clínicos aprofundados 20 de cada sexo (1 de cada 
sexo por ninhada) 
Pesagem cerebral (após fixação) 11 a 22 
dias após o nascimento 10 de cada sexo (1 de cada 
ninhada) 
Pesagem cerebral (sem fixação) aproxima ­
damente 70 dias após o nascimento 10 de cada sexo (1 de cada 
ninhada) 
Neuropatologia (fixação por perfusão ou 
imersão) 11 a 22 dias após o nascimento 10 de cada sexo (1 de cada 
ninhada) 
Neuropatologia (fixação por perfusão) apro ­
ximadamente 70 dias após o nascimento 10 de cada sexo (1 de cada 
ninhada) 
Maturidade sexual 20 de cada sexo (1 de cada 
sexo por ninhada) 
Outros indicadores do desenvolvimento (fa ­
cultativo) Todos os animais 
Ontogenia comportamental 20 de cada sexo (1 de cada 
sexo por ninhada) 
Atividade motora 20 de cada sexo (1 de cada 
sexo por ninhada) 
Funções motoras e sensoriais 20 de cada sexo (1 de cada 
sexo por ninhada) 
Aprendizagem e memória 10 de cada sexo (
 a ) (1 de 
cada ninhada)  
( a ) Consoante a sensibilidade dos testes da função cognitiva, pode ponderar-se utilizar 
no estudo um número maior de animais, por exemplo, um macho e uma fêmea de 
cada ninhada (ver a afetação dos animais no apêndice 1). O documento de 
orientações n.  o 43 da OCDE (8) fornece mais indicações sobre a dimensão das 
amostras.  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 790
 
Dosagem  
16. Devem utilizar-se pelo menos três níveis de dosagem e um grupo de con ­
trolo em paralelo. Os níveis de dosagem devem ser espaçados de forma a 
produzir uma gradação de efeitos tóxicos. Salvo se as doses estiverem limitadas pela natureza físico-química ou pelas propriedades biológicas do produto químico, deve selecionar-se para dose mais elevada um nível que 
induza alguma toxicidade nas progenitoras (por exemplo, sinais clínicos, 
diminuição do ganho de peso corporal — mas não mais de 10 % — e/ou indícios de toxicidade limitada pela dose num órgão-alvo). Com algumas exceções, a dose mais elevada não deve exceder 1 000 mg/kg de peso 
corporal/dia. Por exemplo, a exposição humana previsível pode aconselhar 
uma dose mais elevada. Em alternativa, podem efetuar-se estudos-piloto ou estudos exploratórios preliminares para determinar a dosagem mais elevada que deve ser utilizada para produzir um determinado nível mínimo de 
toxicidade nas progenitoras. Se tiver sido demonstrado, num estudo normal 
de toxicidade durante o desenvolvimento ou num estudo-piloto, que o pro ­
duto químico em estudo tem efeitos tóxicos durante o desenvolvimento, a dose mais elevada deve ser a dose máxima que não induz na progenitura 
níveis excessivos de toxicidade, nem malformações ou mortalidade intrau ­
terina ou neonatal, passíveis de impedir uma avaliação significativa da neurotoxicidade. A dose mais baixa não deve gerar nenhum indício de toxicidade, incluindo neurotoxicidade, nas progenitoras nem durante o de ­
senvolvimento. Devem selecionar-se uma sequência decrescente de doses, 
que permita correlacionar as respostas observadas com as doses adminis ­
tradas e evidenciar um nível sem observação de efeitos adversos (NOAEL), ou doses próximas do limite de deteção, que permitam determinar uma dose 
de referência. O intervalo ótimo entre doses consecutivas é frequentemente 
definido por um fator de 2 a 4. A inclusão de um quarto grupo de dosagem é muitas vezes preferível ao uso de intervalos muito grandes (por exemplo, fatores superiores a 10) entre as dosagens.
 
17. Na escolha das doses devem ter-se em conta os dados disponíveis sobre a 
toxicidade do produto químico em estudo ou de matérias afins, bem como 
informações adicionais sobre o metabolismo e a toxicocinética dos mesmos. 
Estas informações também poderão servir para demonstrar a adequação do programa de dosagem. Deve ponderar-se a possibilidade de administração direta às crias, com base nas informações relativas à exposição e nos dados 
farmacocinéticos disponíveis (28)(29). Antes de efetuar estudos por admi ­
nistração direta das doses, é necessário pesar cuidadosamente os prós e os contras (30).
 
18. O grupo de controlo em paralelo deve ser um grupo ficticiamente exposto 
ao produto químico em estudo ou, se for usado um veículo para administrar o produto químico, um grupo de controlo do veículo. Normalmente, deve 
administrar-se a todos os animais o mesmo volume do produto químico em 
estudo ou do veículo, proporcionalmente ao peso corporal. Se for usado um veículo ou outro aditivo para facilitar a administração das doses, devem ter-se em conta as seguintes características do veículo ou aditivo: efeitos na 
absorção, na distribuição, no metabolismo ou na retenção do produto quí ­
mico em estudo, efeitos nas propriedades químicas do produto químico em estudo suscetíveis de alterarem as características tóxicas do mesmo e efeitos no consumo de alimentos, na ingestão de água ou no estado nutricional dos 
animais. O veículo não deve ter efeitos que possam interferir na interpre ­
tação do estudo, ter toxicidade neurocomportamental ou ter efeitos na re ­
produção ou no desenvolvimento. Ao utilizarem-se veículos novos, o grupo de controlo do veículo deve ser complementado por um grupo ficticiamente 
exposto ao produto químico em estudo. Os animais do(s) grupo(s) de con ­
trolo devem ser tratados de forma idêntica aos animais dos grupos expostos.
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 791
 
Administração das doses  
19. O produto químico em estudo e o veículo devem ser administrados pela via 
mais representativa da exposição humana potencial e com base nos dados 
metabólicos e de distribuição relativos aos animais utilizados no estudo. Prefere-se, em geral, a via oral (por exemplo sonda esofágica, incorporação na dieta ou incorporação na água de beber), mas podem utilizar-se outras 
vias (por exemplo via dérmica ou inalação), justificáveis por determinadas 
características ou pelas vias conhecidas ou previsíveis de exposição humana — para mais orientações, ver o documento de orientações n.
 o 43 (8). É 
necessário justificar a via de administração escolhida. O produto químico 
em estudo deve ser administrado todos os dias aproximadamente à mesma 
hora.  
20. Normalmente, a dose administrada a cada animal é calculada com base na 
determinação mais recente do peso corporal do animal. O ajustamento das 
doses durante o último terço da gravidez deve, porém, ser feito com pre ­
caução. Se for observada toxicidade excessiva em progenitoras expostas, os animais em questão devem ser eutanasiados.
 
21. No mínimo, o produto químico em estudo e o veículo devem ser adminis ­
trados diariamente às fêmeas cobertas, desde a implantação (sexto dia de 
gravidez) até ao final da lactação (21 dias após o nascimento), a fim de expor as crias ao mesmo durante o desenvolvimento neurológico pré-natal e pós-natal. A idade à qual se inicia a administração das doses e a duração e a 
frequência desta podem ser ajustadas se os dados disponíveis evidenciarem 
que outro modelo experimental corresponde melhor à exposição humana. No caso de outras espécies, as durações da administração das doses devem ser ajustadas de modo a garantir a exposição ao produto químico em todos 
os períodos precoces do desenvolvimento do cérebro (nos períodos equiva ­
lentes ao crescimento pré-natal e pós-natal precoce do cérebro humano). A administração das doses pode começar no início da gravidez (dia zero de gravidez), embora deva ponderar-se a possibilidade de o produto químico 
em estudo provocar mortalidade antes mesmo da implantação. O início da 
administração das doses ao sexto dia de gravidez evitará esse risco, mas não haverá então exposição ao produto químico em estudo nos estádios de desenvolvimento compreendidos entre o dia zero e o sexto dia de gravidez. 
Se o laboratório comprar fêmeas cobertas em data determinada, não será 
possível iniciar a administração do produto químico no dia zero de gravi ­
dez, pelo que o sexto dia de gravidez se afigura uma boa opção. O labo ­
ratório que efetua os ensaios deve estabelecer o programa de administração 
das doses em função das informações pertinentes de que disponha sobre os 
efeitos do produto químico em estudo, da experiência adquirida e de con ­
siderações logísticas. Nessa ótica, o programa definido pode prever que a 
administração das doses se prolongue para além do desmame. O produto 
químico em estudo não deve ser administrado no dia do parto aos animais que ainda não tenham parido toda a progenitura. Em geral, presume-se que as crias são expostas através do leite materno. Todavia, deve ponderar-se a 
administração direta de doses às crias, se faltarem indícios de que a proge ­
nitura está continuamente exposta. Esses indícios podem provir, por exem ­
plo, de dados farmacocinéticos, da toxicidade eventualmente detetada na progenitura ou de alterações de biomarcadores (28).
 
EXAMES  
Exame das progenitoras  
22. Pelo menos uma vez por dia, deve verificar-se cuidadosamente o estado de 
saúde de todas as progenitoras, incluindo os casos de morbidez ou de mortalidade.
 
23. Durante os períodos de exposição e de observação, devem efetuar-se com 
regularidade exames clínicos mais aprofundados (pelo menos duas vezes 
durante o período de administração durante a gestação e duas vezes durante o período de administração durante a lactação) a, pelo menos, dez proge ­
nitoras por nível de dose. Os animais devem ser examinados fora da gaiola 
onde se encontram alojados, por pessoal formado que não esteja a par da 
exposição a que os animais foram sujeitos. Os técnicos em causa devem aplicar protocolos normalizados de minimização dos erros de apreciação induzidos pela agitação dos animais e de maximização da reprodutibilidade 
de técnico para técnico. Tanto quanto possível, é recomendável que os 
exames realizados num determinado estudo o sejam pelo mesmo técnico.
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 792
 
24. Os sinais observados devem ser mencionados no relatório. Sempre que 
possível, também deve ser mencionada no relatório a intensidade desses 
sinais. Entre os exames a realizar, contam-se a observação de alterações da pele, da pelagem, dos olhos e das mucosas, bem como da ocorrência de secreções ou de reações neurovegetativas (por exemplo, lacrimação, horri ­
pilação, alterações da dimensão pupilar, respiração anormal e/ou respiração 
pela boca e sinais inabituais ao nível da micção ou da defecação).
 
25. Devem igualmente ser indicadas no relatório quaisquer respostas inabituais 
relativas à posição corporal, ao nível de atividade (por exemplo maior ou 
menor exploração da zona-padrão) e à coordenação dos movimentos. Tam ­
bém devem ser mencionadas no relatório as alterações na marcha (por exemplo, marcha bamboleante ou ataxia), na postura (por exemplo, dorso arqueado) e na reatividade à manipulação, à colocação ou a outros estímu ­
los ambientais, bem como a ocorrência de movimentos clónicos ou tónicos, 
de convulsões ou tremores, de comportamentos estereotipados (por exem ­
plo, atos de higiene demasiado repetitivos, movimentos de cabeça pouco usuais ou movimentação repetitiva em círculo) ou estranhos (por exemplo, 
lamber excessivamente ou morder, automutilação, movimentação para trás, 
vocalização) ou de atos de agressão.
 
26. Devem indicar-se no relatório os sinais de toxicidade observados, o grau e a 
duração destes e o dia e a hora em que apareceram.  
27. Os animais devem ser pesados, quando da administração da dose, pelo 
menos semanalmente durante o estudo, no dia do parto ou próximo deste e 21 dias após o nascimento (dia do desmame). Nos estudos que recorram a 
sonda gástrica, as progenitoras devem ser pesadas, pelo menos, duas vezes 
por semana. As doses devem ser ajustadas quanto seja necessário quando de cada pesagem. O consumo de alimentos durante a gestação e a lactação deve determinar-se pelo menos semanalmente. Se a exposição se fizer 
através da água de beber, o consumo de água deve ser determinado pelo 
menos semanalmente.
 
Exame da progenitura  
28. Deve examinar-se cuidadosamente toda a progenitura pelo menos uma vez 
por dia para detetar eventuais sinais de toxicidade, incluindo casos de 
morbidez ou de mortalidade.  
29. Durante os períodos de exposição e de observação, devem efetuar-se exa ­
mes clínicos mais aprofundados da progenitura. A progenitura (pelo menos 
uma cria de cada sexo por ninhada) deve ser examinada por pessoal for ­
mado que não esteja a par da exposição a que os animais foram sujeitos. Os técnicos em causa devem aplicar protocolos normalizados de minimização dos erros de apreciação e de maximização da reprodutibilidade de técnico 
para técnico. Tanto quanto possível, é recomendável que os exames sejam 
realizados pelo mesmo técnico. No mínimo, devem examinar-se os parâme ­
tros referidos nos pontos 24 e 25 adequados ao estádio de desenvolvimento em observação.
 
30. Devem indicar-se no relatório os sinais de toxicidade observados na proge ­
nitura, o grau e a duração destes e o dia e a hora em que apareceram.  
Indicadores físicos e de desenvolvimento  
31. As alterações dos indicadores de desenvolvimento anteriores ao desmame 
(abertura do pavilhão auditivo, abertura dos olhos, nascimento dos incisi ­
vos) estão estreitamente correlacionadas com o peso corporal (30)(31). Muitas vezes, o peso corporal é, portanto, o melhor indicador do desenvol ­
vimento físico. Só se recomenda a medição de outros indicadores do de ­
senvolvimento quando haja indícios anteriores de que os parâmetros em 
causa proporcionarão informações adicionais. Indica-se no quadro 1 quando esses parâmetros devem ser avaliados. Consoante os efeitos previstos e os resultados das primeiras medições, pode ser aconselhável aumentar o nú ­
mero de ocasiões de avaliação ou efetuar as medições noutros estádios do 
desenvolvimento.
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32. Ao avaliar o desenvolvimento físico, é preferível utilizar a idade pós-coital 
em vez da idade pós-natal (33). Se as crias forem examinadas no dia do 
desmame, recomenda-se que o exame seja efetuado antes daquele, para evitar confusões com o efeito de agitação associado ao desmame. Além disso, os exames a realizar após o desmame não devem ser realizados nos 
dois dias imediatos.
 
Quadro 1  
Ocasiões da avaliação dos indicadores físicos e de desenvolvimento e parâmetros 
funcionais e comportamentais  ( a ) 
Faixas etárias 
Parâmetros Pré-desmame (  b ) Adolescência (  b ) Adultos jovens (  b ) 
Indicadores físicos e de desenvolvimento  
Peso corporal e exames 
clínicos Semanalmente (  c ) pelo menos de duas 
em duas semanas pelo menos de duas 
em duas semanas 
Peso cerebral 22 dias após o nascimento (  d ) no termo 
Neuropatologia 22 dias após o nascimento (  d ) no termo 
Maturidade sexual — oportunamente — Outros indicadores de 
desenvolvimento (
 e ) oportunamente — —  
Parâmetros funcionais e comportamentais  
Ontogenia comporta ­
mental pelo menos duas me ­
dições 
Atividade motora (in ­
cluindo a habituação) 1-3 vezes (  f ) — uma vez 
Funções motoras e sen ­
soriais — uma vez uma vez 
Aprendizagem e me ­
mória — uma vez uma vez  
( a ) Este quadro apresenta o número mínimo de vezes que as medições devem ser realizadas. Consoante os 
efeitos previstos e os resultados das primeiras medições, pode ser aconselhável aumentar o número de 
ocasiões de avaliação (por exemplo de animais mais velhos) ou efetuar as medições noutros estádios de desenvolvimento. 
(
 b ) Recomenda-se que as crias não sejam examinadas nos dois dias após o desmame (ver o ponto 32). As 
idades de avaliação do estádio da adolescência são as seguintes: aprendizagem e memória = 25 ± 2 dias 
após o nascimento; funções motoras e sensoriais = 25 ± 2 dias após o nascimento. A idade recomendada 
para avaliar adultos jovens é de 60 a 70 dias após o nascimento. 
( c ) Nos períodos de aumento rápido do peso corporal, este deve ser determinado, pelo menos, duas vezes 
por semana nos casos em que as doses sejam administradas diretamente às crias, para que possam 
ajustar-se as doses. 
( d ) Se necessário, o peso cerebral pode ser determinado e as manifestações neuropatológicas podem ser 
avaliadas mais cedo (por exemplo 11 dias após o nascimento — ver o ponto 39). 
( e ) Se for caso disso, indicar-se-ão os outros indicadores de desenvolvimento utilizados, além do peso 
corporal (por exemplo, a abertura dos olhos — ver o ponto 31). 
( f ) Ver o ponto 35.  
33. Depois de contadas as crias vivas, determina-se o sexo das mesmas, por 
exemplo por exame visual ou medição da distância anogenital (34)(35), e 
pesa-se cada cria de cada ninhada à nascença ou pouco depois, pelo menos 
uma vez por semana durante a lactação e, em seguida, pelo menos de duas em duas semanas. Quando da avaliação da maturidade sexual, deve determinar-se a idade e o peso corporal de, pelo menos, uma fêmea com 
permeabilidade vaginal (36) e um macho com descolamento do prepúcio 
(37) de cada ninhada.
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Ontogenia comportamental  
34. Deve medir-se a ontogenia dos comportamentos escolhidos em, pelo menos, 
uma cria de cada sexo por ninhada durante o período etário adequado. As 
crias utilizadas para avaliar os comportamentos em causa devem ser sempre as mesmas em todos os dias de avaliação. Os dias em que se procede a medições devem ser distribuídos uniformemente ao longo do período de 
avaliação, a fim de determinar se a ontogenia de cada comportamento 
avaliado é normal ou se há nela alterações decorrentes da exposição (38). Seguem-se alguns exemplos de comportamentos cuja ontogenia pode ser avaliada: reflexo postural labiríntico, geotaxia negativa e atividade motora 
(38)(39)(40).
 
Atividade motora  
35. Deve monitorizar-se a atividade motora (41)(42)(43)(44)(45) antes do des ­
mame e na idade adulta. No tocante ao dia do desmame, ver o ponto 32. A duração de cada sessão de avaliação deve ser suficiente para revelar a habituação dos animais não-expostos, de controlo, durante a sessão. 
Recomenda-se vivamente o recurso à atividade motora para avaliar a onto ­
genia comportamental. No caso de as observações terem essa finalidade, os animais utilizados nas sessões anteriores ao desmame devem ser sempre os mesmos. A frequência das sessões deve ser suficiente para avaliar a onto ­
genia da habituação em cada sessão (44). Para isso, até ao desmame, 
inclusive, podem ser necessárias três ou mais sessões de avaliação (por exemplo, 13, 17 e 21 dias após o nascimento). Devem examinar-se os mesmos animais, ou animais da mesma ninhada, também na idade adulta, 
perto do termo do estudo (por exemplo, 60 a 70 dias após o nascimento). 
Se necessário, podem efetuar-se sessões de avaliação noutros dias. Deve monitorizar-se a atividade motora recorrendo a um aparelho de registo automático com capacidade para detetar aumentos e decréscimos de ativi ­
dade (a atividade de base mensurável com o dispositivo não deve ser 
demasiado reduzida — ao ponto de inviabilizar a deteção de decréscimos de atividade — nem demasiado elevada — ao ponto de inviabilizar a deteção de acréscimos de atividade). Deve aplicar-se a cada dispositivo 
um protocolo normalizado que, tanto quanto possível, assegure a reprodu ­
tibilidade entre dispositivos e entre sessões de avaliação. Os grupos expos ­
tos devem ser distribuídos pelos vários dispositivos da maneira mais equili ­
brada possível. Cada animal deve ser avaliado individualmente. Os grupos 
expostos devem ser distribuídos ao longo de cada sessão, para evitar con ­
fusões com os ritmos de atividade circadianos. As variações das condições experimentais devem ser reduzidas ao mínimo e não devem ter nenhuma relação sistemática com a exposição dos animais. Entre as variáveis que 
podem afetar muitas medições do comportamento, incluindo as da atividade 
motora, contam-se o nível sonoro, a dimensão e a forma da gaiola de ensaio, a temperatura, a humidade relativa, as condições de luminosidade, os cheiros, a utilização no ensaio da gaiola de alojamento ou de outra gaiola 
e distrações ambientais.
 
Funções motoras e sensoriais  
36. Devem examinar-se aprofundadamente as funções motoras e sensoriais pelo 
menos uma vez no período da adolescência e uma vez na idade adulta jovem (por exemplo, 60 a 70 dias após o nascimento). No tocante ao dia do desmame, ver o ponto 32. O número de experiências deve ser suficiente 
para que se disponha de uma quantidade adequada de amostras dos modos 
sensoriais (por exemplo, somatossensorial e vestibular) e das funções mo ­
toras (por exemplo força e coordenação). Alguns exemplos de testes das funções motoras e sensoriais: resposta ao estiramento (46), reflexo postural 
labiríntico (47)(48), habituação ao sobressalto auditivo (40)(49)(50)(51) 
(52)(53)(54) e potenciais evocados (55).
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Testes de aprendizagem e memória  
37. Deve efetuar-se um teste de memória e aprendizagem associativa depois do 
desmame (por exemplo 25 ± 2 dias após o nascimento) e a adultos jovens 
(60 ou mais dias após o nascimento). No tocante ao dia do desmame, ver o ponto 32. Podem utilizar-se o mesmo teste ou testes distintos nestes dois estádios de desenvolvimento. Existe uma certa flexibilidade na escolha do 
teste ou testes de aprendizagem e de memória a realizar nos ratos recente ­
mente desmamados e nos ratos adultos, mas o(s) teste(s) escolhido(s) de ­
ve(m) satisfazer dois critérios. O primeiro é que a avaliação da aprendiza ­
gem deve ser efetuada em termos das alterações ocorridas ao longo de 
diversas experiências, ou sessões, repetidas de aprendizagem ou, caso o 
teste compreenda uma única experiência, relativamente a uma condição que controle os efeitos não associativos do treino. O segundo é que o teste ou testes devem compreender uma medição da memória (de curto ou de 
longo prazo) além da aprendizagem inicial (aquisição), mas esta medição da 
memória só deve ser incluída no relatório se for acompanhada de uma medição da aquisição obtida no mesmo teste. Se o teste ou testes de apren ­
dizagem e memória revelar(em) efeitos do produto químico em estudo, 
importa ponderar a realização de outros testes, que permitam excluir qual ­
quer interpretação fundada em alterações das capacidades sensoriais, de motivação e/ou motoras. Além destes dois critérios, recomenda-se que a escolha do teste de aprendizagem e memória se baseie na sensibilidade 
comprovada do mesmo à classe de produtos químicos em estudo, se tal 
informação estiver disponível nas fontes bibliográficas. Na falta dessa in ­
formação, seguem-se alguns exemplos de testes que podem satisfazer os critérios referidos: evitação passiva (43)(56)(57), adaptação espacial retar ­
dada no rato adulto (58) e no rato não desmamado (59), condicionamento 
olfativo (43)(60), labirinto aquático de Morris (61)(62)(63), labirinto de Biel ou de Cincinnati (64)(65), labirinto de braços radiais (66), labirinto em T (43) e aquisição e conservação de comportamentos programados 
(26)(67)(68). As referências bibliográficas descrevem outros testes para 
ratos recentemente desmamados (26)(27) e ratos adultos (19)(20).
 
Autópsia  
38. As progenitoras podem ser eutanasiadas depois do desmame da progenitura.  
39. Procede-se à avaliação neuropatológica da progenitura utilizando tecidos de 
animais eutanasiados 22 dias após o nascimento ou anteriormente, entre 11 
e 22 dias após o nascimento, bem como no termo do estudo. No caso da progenitura eutanasiada até 22 dias após o nascimento, inclusive, examinam-se tecidos cerebrais. No caso dos animais eutanasiados no termo 
do estudo, examinam-se tecidos do sistema nervoso central e tecidos do 
sistema nervoso periférico. Os animais eutanasiados até 22 dias após o nascimento, inclusive, podem ser fixados por imersão ou perfusão. Os animais eutanasiados no termo do estudo devem ser fixados por perfusão. 
Todos os aspetos da preparação das amostras de tecidos, desde a perfusão 
dos animais à dissecação das amostras, ao tratamento dos tecidos e à coloração das lâminas devem inserir-se num modelo experimental equili ­
brado, em que cada lote contenha amostras representativas de cada grupo de 
dosagem. O documento de orientações n.
 o 20 (9) contém mais orientações 
sobre neuropatologias; ver igualmente a referência 103.  
Tratamento das amostras de tecidos  
40. Devem registar-se todas as anomalias macroscópicas detetadas na autópsia. 
As amostras de tecidos colhidas devem representar as principais regiões do sistema nervoso. As amostras de tecidos devem ser conservadas num fixa ­
dor adequado e ser tratadas segundo protocolos histológicos normalizados já 
publicados (69)(70)(71)(103). A incorporação em parafina é aceitável para 
tecidos do sistema nervoso central e do sistema nervoso periférico. Se for
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necessária maior resolução (por exemplo no caso dos nervos periféricos, 
quando se suspeite de neuropatias periféricas, ou para a análise morfomé ­
trica de nervos periféricos), pode ser melhor utilizar ósmio na pós-fixação, juntamente com a incorporação numa resina epoxídica. Os tecidos cerebrais colhidos para análises morfométricas devem ser incorporados num meio 
adequado ao mesmo tempo para todos os níveis de dosagem, a fim de 
evitar os erros de contração por vezes decorrentes da conservação prolon ­
gada em fixadores (6).
 
Exame neuropatológico  
41. Os objetivos deste exame qualitativo são os seguintes:  
i) Identificar as regiões do sistema nervoso que evidenciam alterações 
neuropatológicas;  
ii) Identificar os tipos de alterações neuropatológicas resultantes da expo ­
sição ao produto químico em estudo;  
iii) Determinar a gravidade das alterações neuropatológicas.  
Um patologista convenientemente formado deve examinar ao microscópio 
cortes histológicos representativos das amostras de tecidos, a fim de detetar 
alterações neuropatológicas. Deve ser atribuído a cada uma dessas altera ­
ções um grau subjetivo de gravidade. A coloração com hematoxilina e eosina pode ser suficiente para o exame dos cortes cerebrais de animais eutanasiados até 22 dias após o nascimento, inclusive. No entanto, para 
examinar cortes de tecidos dos sistemas nervosos central e periférico de 
animais eutanasiados no termo do estudo, recomenda-se a coloração da mielina (por exemplo, com azul rápido de luxol/violeta de cresilo) e uma coloração com prata (por exemplo a coloração de Bielschowsky ou de 
Bodians). Cabe ao patologista avaliar, com base na sua experiência profis ­
sional e no tipo das alterações observadas, se é conveniente utilizar outros tipos de coloração para identificar e caracterizar determinados tipos de alterações — por exemplo proteína ácida fibrilar glial (GFAP) ou histoquí ­
mica da lecitina para examinar alterações gliais e microgliais (72), 
fluoro-jade para deteção de necroses (73)(74) ou colorações com prata específicas da degenerescência neural (75).
 
42. Deve efetuar-se uma avaliação morfométrica (quantitativa), pois esses dados 
podem contribuir para detetar efeitos da exposição e são úteis na interpre ­
tação das diferenças no peso cerebral ou morfológicas devidas à exposição (76)(77). Devem colher-se amostras dos tecidos nervosos e os tecidos de ­
vem ser preparados para esta avaliação. As avaliações morfométricas podem 
compreender, por exemplo, medições lineares ou da superfície de determi ­
nadas regiões do cérebro (78). Ambos os tipos de medições devem ser praticados em cortes homólogos cuidadosamente selecionados com base em localizadores microscópicos fiáveis (6). O recurso à estereologia pode 
permitir identificar efeitos da exposição em parâmetros como o volume ou o 
número de células de determinadas regiões neuroanatómicas (79)(80)(81) (82)(83)(84).
 
43. Devem examinar-se os cérebros para localizar eventuais indícios de altera ­
ções neuropatológicas relacionadas com a exposição, colhendo amostras 
adequadas das principais regiões cerebrais — por exemplo, bolbos olfativos, córtex cerebral, hipocampo, núcleos da base, tálamo, hipotálamo, mesencé ­
falo (teto, tegumento e pedúnculos cerebrais), protuberância anelar, bolbo 
raquidiano, cerebelo) — para assegurar um exame aprofundado. É impor ­
tante que os cortes sejam efetuados no mesmo plano em todos os animais. Devem constituir-se amostras representativas de cortes da medula espinal e do sistema nervoso periférico dos animais adultos eutanasiados no termo do 
estudo. As zonas examinadas devem compreender os olhos, com o nervo 
ótico e a retina, a medula espinal, ao nível das dilatações cervical e lombar, fibras das raízes dorsal e ventral, o nervo ciático proximal, o nervo tibial proximal (ao nível do joelho) e as ramificações do nervo tibial ao nível dos 
músculos da barriga da perna. Devem ser examinados cortes transversais e 
longitudinais da medula espinal e dos nervos periféricos.
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44. A avaliação neuropatológica deve compreender um exame com vista à 
deteção de indícios de alterações do desenvolvimento do sistema nervoso 
(6)(85)(86)(87)(88)(89), além das alterações ao nível celular (por exemplo vacuolização neuronal, degeneração ou necrose) e dos tecidos (por exemplo gliose, infiltração leucocitária ou formação de quistos). Para isto, é impor ­
tante distinguir os efeitos relacionados com a exposição, por um lado, das 
ocorrências reconhecidamente normais do desenvolvimento no estádio cor ­
respondente à idade do animal no momento da eutanásia, por outro (90). Seguem-se alguns exemplos de alterações significativas indicadoras de que 
o desenvolvimento foi prejudicado:
 
— alterações das dimensões ou da forma dos bolbos olfativos, dos hemis ­
férios cerebrais ou do cerebelo;  
— alterações das dimensões relativas das diversas regiões do cérebro, de ­
signadamente aumento ou diminuição das dimensões de regiões em consequência da perda ou da persistência de populações normalmente 
transitórias de células ou de projeções axónicas (por exemplo camada 
germinal externa do cerebelo, corpo caloso);
 
— alterações de proliferação, migração ou diferenciação reveladas por zo ­
nas de apoptose ou necrose excessivas, agregados ou populações dis ­
persas de neurões etópicos, mal orientados ou mal formados ou altera ­
ções das dimensões relativas das diversas camadas das estruturas 
corticais;  
— alterações dos padrões de mielinização, nomeadamente redução dimen ­
sional global ou alterações da coloração das estruturas mielinizadas;  
— indícios de hidrocefalia, nomeadamente dilatação ventricular, estenose 
do aqueduto cerebral e emagrecimento dos hemisférios cerebrais.  
Análise da relação entre as alterações neuropatológicas e a dosagem  
45. Recomenda-se o seguinte protocolo sequencial para os exames neuropato ­
lógicos qualitativos e quantitativos: Começa-se por comparar cortes do grupo exposto à dose mais elevada com cortes do grupo de controlo. Se não se detetarem indícios de alterações neuropatológicas nos animais do 
grupo exposto à dose mais elevada, não são necessários mais exames. Caso 
se detetem alterações neuropatológicas nesse grupo, examinam-se animais dos grupos expostos às doses intermédia e mais baixa. Se o estudo do grupo exposto à dose mais elevada for interrompido devido à morte dos animais 
ou a efeitos tóxicos não relacionados com a exposição ao produto químico 
em estudo, devem examinar-se os grupos expostos à dose mais elevada e à dose intermédia para verificar se existem alterações neuropatológicas. Se forem detetados indícios de neurotoxicidade nos grupos expostos às doses 
mais baixas, esses grupos devem ser objeto de exames neuropatológicos. 
Se, nos exames qualitativos ou quantitativos, for detetada alguma alteração neuropatológica relacionada com a exposição ao produto químico em estu ­
do, deve determinar-se, com base na avaliação de todos os animais de todos 
os grupos de dosagem, a relação entre a dose e a incidência, frequência e 
gravidade das lesões ou das alterações morfométricas. Esta avaliação deve incidir em todas as regiões do cérebro que evidenciem alguma alteração neuropatológica. Para cada tipo de lesão, devem descrever-se as caracterís ­
ticas em que se baseiam os vários graus de gravidade, indicando os critérios 
utilizados para os diferenciar. Devem ser registados a frequência de cada tipo de lesão e o respetivo grau de gravidade e deve ser efetuada uma análise estatística de avaliação da natureza da resposta à dosagem. 
Recomenda-se o uso de lâminas codificadas (91).
 
DADOS E RELATÓRIOS  
Dados  
46. Os dados devem ser individualizados e também resumidos em quadros, 
indicando, para cada grupo estudado, os tipos de alterações e o número de progenitoras, progenitura, por sexo, e ninhadas que apresentam cada tipo 
de alteração. Caso se tenha procedido à exposição pós-natal direta da pro ­
genitura, devem indicar-se a via, a duração e o período de exposição.
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Avaliação e interpretação dos resultados  
47. O objetivo dos estudos de neurotoxicidade durante o desenvolvimento é 
fornecer informações sobre os efeitos da exposição repetida ao produto 
químico durante o desenvolvimento intrauterino e pós-natal. Uma vez que o estudo incide tanto na toxicidade geral como na neurotoxicidade durante o desenvolvimento, os resultados obtidos permitem estabelecer uma distinção 
entre efeitos neurotóxicos durante o desenvolvimento não associados a 
toxicidade materna em geral e efeitos neurotóxicos durante o desenvolvi ­
mento apenas induzidos a níveis também tóxicos para as progenitoras. Em virtude da complexidade das interdependências entre o modelo do estudo, a 
análise estatística e o significado biológico dos dados, a interpretação cor ­
reta de dados de neurotoxicidade durante o desenvolvimento exige a apre ­
ciação de um especialista na matéria (107)(109). A interpretação dos resul ­
tados dos ensaios deve basear-se na ponderação da suficiência da prova 
(20)(92)(93)(94). Devem discutir-se os tipos de efeitos comportamentais ou 
morfológicos eventualmente observados, bem como os indícios de uma relação entre a dose e a resposta. Esta caracterização deve ter em conta os dados de todos os estudos disponíveis pertinentes para a avaliação da 
neurotoxicidade durante o desenvolvimento, nomeadamente estudos epide ­
miológicos no ser humano ou relatórios de casos paradigmáticos, bem como estudos experimentais em animais (por exemplo, dados toxicocinéticos, informações de relações estrutura-atividade e dados de outros estudos de 
toxicidade). Deve igualmente ser contemplada a relação entre as doses do 
produto químico em estudo e a presença, ausência, incidência e intensidade dos eventuais efeitos neurotóxicos em cada sexo (20)(95).
 
48. A avaliação dos dados deve compreender uma discussão do significado 
biológico e do significado estatístico. A análise estatística deve ser enten ­
dida como um instrumento mais orientador do que determinante na inter ­
pretação dos dados. A falta de significado estatístico não deve ser o único 
fundamento para concluir pela ausência de efeitos ligados à exposição, tal como a existência de significado estatístico não deve constituir a única justificação para concluir pela ocorrência de efeitos ligados à exposição. 
Para evitar resultados falsos negativos e as dificuldades inerentes à demons ­
tração de resultados negativos, devem incluir-se na discussão dados histó ­
ricos de controlo e dados de controlo positivos, sobretudo se não ocorrerem efeitos relacionados com a exposição (102)(106). A probabilidade da ob ­
tenção de resultados falsos positivos deve ser discutida no âmbito da ava ­
liação estatística geral dos resultados (96). A avaliação deve abranger a relação eventualmente existente entre as alterações neuropatológicas e com ­
portamentais observadas.
 
49. Os resultados devem ser todos analisados com base em modelos estatísticos 
adaptados ao modelo experimental (108). A opção por uma análise paramé ­
trica ou não-paramétrica deve fundamentar-se na ponderação de fatores 
como a natureza dos dados (transformados ou não) e a distribuição dos mesmos, assim como na robustez relativa da análise estatística escolhida. O objetivo e o modelo do estudo devem orientar a escolha de uma análises 
estatística que minimize os erros do tipo I (falsos positivos) e do tipo II 
(falsos negativos) (96)(97)(104)(105). Nos estudos do desenvolvimento em espécies multíparas nos quais se estudem várias crias por ninhada, o modelo estatístico deve incluir a ninhada, para evitar uma inflação de erros do tipo I 
(98)(99)(100)(101). A unidade de medida estatística deve ser a ninhada e 
não a cria e as experiências devem ser concebidas de modo que crias da mesma ninhada não sejam consideradas observações independentes. Os parâmetros que sejam medidos várias vezes no mesmo sujeito devem ser 
analisados por recurso a modelos estatísticos que tenham em conta o facto 
de essas medições não serem independentes.
 
Relatório dos ensaios  
50. Elementos a constar do relatório dos ensaios:  
Produto químico em estudo:  
— natureza física e propriedades físico-químicas pertinentes;  
— dados de identificação, incluindo a proveniência;  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 799
 
— grau de pureza da preparação e impurezas conhecidas e/ou previsíveis.  
Veículo (se for o caso):  
— justificação da escolha do veículo, se não for água nem soro fisiológico.  
Animais estudados:  
— espécie e estirpe utilizadas e, caso não sejam utilizados ratos, justifica ­
ção da utilização de outra espécie;  
— fornecedor dos animais;  
— número, idade no início do estudo e sexo dos animais;  
— proveniência, condições de alojamento, dieta, água de beber, etc.;  
— peso de cada animal no início do ensaio.  
Condições de realização dos ensaios:  
— fundamentação da escolha das doses;  
— fundamentação da via e do período de administração;  
— caracterização das doses administradas, incluindo elementos sobre o 
veículo, o volume e a forma física do administrado;  
— elementos relativos à formulação do produto químico em estudo/à in ­
corporação do mesmo na dieta dos animais; concentração atingida, es ­
tabilidade e homogeneidade da preparação;  
— método utilizado para identificar individualmente as progenitoras e a 
progenitura;  
— descrição pormenorizada do(s) protocolo(s) de aleatorização utilizados 
para integrar as progenitoras nos grupos expostos, selecionar as crias a eliminar das ninhadas e integrar as crias restantes nos grupos estudados;
 
— elementos relativos à administração do produto químico em estudo;  
— se aplicável, equivalência entre a concentração do produto químico em 
estudo na dieta/na água de beber ou inalado, expressa em ppm, e a dose 
real, expressa em mg/kg de peso corporal/dia;  
— condições ambientais;  
— elementos relativos à qualidade dos alimentos e da água (por exemplo, 
da torneira ou destilada);  
— datas de início e termo do estudo.  
Protocolos de exame e protocolos experimentais:  
— descrição pormenorizada dos protocolos utilizados para normalizar exa ­
mes e protocolos; definições utilizadas na pontuação das observações;  
— lista dos protocolos experimentais utilizados e justificação da escolha 
dos mesmos;  
— elementos relativos aos protocolos comportamentais/funcionais, patoló ­
gicos, neuroquímicos e eletrofisiológicos utilizados, incluindo informa ­
ções e demais elementos sobre os aparelhos automáticos;  
— protocolos de calibração e de verificação da equivalência dos aparelhos 
utilizados; protocolos utilizados para garantir o equilíbrio dos grupos expostos na execução experimental;
 
— breve justificação das eventuais decisões fundamentadas na experiência 
profissional.  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 800
 
Resultados (individualizados e resumidos, incluindo a média e a variância, 
quando se justifique):  
— número de animais no início do estudo e número de animais no final do 
estudo;  
— número de animais e de ninhadas utilizados em cada método de ensaio;  
— número de identificação de cada animal e da ninhada de que provém;  
— número de animais e peso médio por sexo à nascença, de cada ninhada;  
— peso corporal e alterações de peso corporal, incluindo o peso corporal 
das progenitoras e da progenitura no termo dos ensaios;  
— dados do consumo de alimentos e, se pertinente, do consumo de água 
(por exemplo se o produto químico em estudo for administrado pela 
água de beber);  
— dados das respostas tóxicas por sexo e por nível de dosagem, incluindo 
sinais de toxicidade ou mortalidade (e, se for o caso, o momento e a causa da morte);
 
— natureza, gravidade, duração, dia do aparecimento, hora do dia e evo ­
lução ulterior das observações dos exames clínicos aprofundados;  
— pontuação de cada indicador de desenvolvimento (peso, maturidade 
sexual e ontogenia comportamental) em cada ocasião de observação;  
— descrição pormenorizada das observações comportamentais, funcionais, 
neuropatológicas, neuroquímicas e eletrofisiológicas efetuadas, por sexo, 
incluindo os acréscimos e as reduções em relação ao(s) grupo(s) de 
controlo;  
— resultados das autópsias;  
— pesos cerebrais;  
— diagnósticos decorrentes dos sinais e lesões neurológicos, incluindo 
doenças ou estados naturais;  
— imagens de observações representativas;  
— imagens pouco aumentadas que permitiram aferir da homologia dos 
cortes utilizados para a morfometria;  
— dados de absorção e metabólicos, incluindo dados complementares de 
estudos toxicocinéticos realizados separadamente, se disponíveis;  
— tratamento estatístico dos resultados (incluindo os modelos estatísticos 
utilizados para analisar os dados) e resultados, sejam estes significativos 
ou não;  
— lista do pessoal participante no estudo, incluindo a respetiva formação 
profissional.  
Discussão dos resultados:  
— informações relativas à relação entre a dose e a resposta, por sexo e por 
grupo;  
— relação entre quaisquer outros efeitos tóxicos e as conclusões acerca do 
potencial neurotóxico do produto químico em estudo, por sexo e por 
grupo;  
— influência de eventuais informações toxicocinéticas nas conclusões;  
— similitude de efeitos com os de qualquer neurotóxico conhecido;  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 801
 
— dados corroborantes da fiabilidade e sensibilidade do método de ensaio 
(dados históricos de controlo e dados de controlo positivos);  
— eventuais relações entre efeitos neuropatológicos e funcionais;  
— nível sem observação de efeitos adversos (NOAEL) ou doses de refe ­
rência para as progenitoras e a progenitura, por sexo e por grupo.  
Conclusões:  
— discussão da interpretação geral dos dados com base nos resultados, 
incluindo o NOAEL e uma conclusão sobre a neurotoxicidade, ou não, durante o desenvolvimento, do produto químico em estudo.
 
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 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 807
 
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 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 808
 
Figura 1  
Diagrama de resumo dos ensaios funcionais e comportamentais, da avaliação neuropatológica 
e da pesagem cerebral. Baseia-se na descrição constante dos pontos 13 a 15. O apêndice 1 
contém exemplos da repartição dos animais
  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 809
 
Apêndice 1  
1. Descrevem-se a seguir e resumem-se em quadros alguns exemplos de re ­
partição dos animais. Estes exemplos visam ilustrar que os animais estuda ­
dos podem ser integrados de diversas maneiras nos vários modelos de ensaio.
 
Exemplo 1  
2. Utilizam-se 20 crias de cada sexo por nível de dose (um macho e uma 
fêmea de cada ninhada) nos testes da ontogenia comportamental anteriores 
ao desmame. Destes animais, eutanasiam-se 10 crias de cada sexo por nível de dose (um macho ou uma fêmea de cada ninhada) 22 dias após o nas ­
cimento. Remove-se o cérebro dos animais eutanasiados, após o que se pesa 
cada cérebro e se prepara o mesmo para a avaliação histopatológica. 
Registam-se ainda os dados ponderais dos cérebros não fixados dos restan ­
tes 10 machos e 10 fêmeas por nível de dose.
 
3. Utilizam-se outros 20 animais de cada sexo por nível de dose (um macho e 
uma fêmea de cada ninhada) nos testes funcionais/comportamentais poste ­
riores ao desmame (exames clínicos aprofundados, atividade motora, so ­
bressalto auditivo e ensaio da função cognitiva na adolescência) e na de ­
terminação da idade da maturidade sexual. Destes, no termo do estudo 
(aproximadamente 70 dias após o nascimento), anestesiam-se 10 dos ani ­
mais de cada sexo expostos a cada nível de dose (um macho ou uma fêmea de cada ninhada) e fixam-se por perfusão. Após nova fixação  in situ , 
remove-se o cérebro de cada um destes animais e prepara-se o mesmo 
para a avaliação neuropatológica.
 
4. Utilizam-se outras 20 crias de cada sexo por nível de dose (um macho e 
uma fêmea de cada ninhada) nos testes da função cognitiva em adultos 
jovens (por exemplo, 60 a 70 dias após o nascimento). Destes, no termo 
do estudo, eutanasiam-se 10 dos animais de cada sexo expostos a cada nível de dose (um macho ou uma fêmea de cada ninhada), removem-se os seus cérebros e pesam-se estes últimos.
 
5. Os restantes 20 animais de cada sexo por grupo ficam de reserva para 
outros testes eventualmente a realizar.  
Quadro 1  
N. o da cria (  a ) N. o de crias integradas no 
ensaio Exame/teste 
m F  
1 5 20 m + 20 f Ontogenia comportamental 
10 m + 10 f Peso cerebral/neuropatologia/ 
/morfometria 22 dias após o nas ­
cimento 
10 m + 10 f Peso cerebral 22 dias após o 
nascimento 
2 6 20 m + 20 f Exames clínicos aprofundados 
20 m + 20 f Atividade motora 
20 m + 20 f Maturidade sexual 20 m + 20 f Funções motoras e sensoriais 20 m + 20 f Aprendizagem e memória (25 
dias após o nascimento) 
10 m + 10 f Peso cerebral/neuropatologia/ 
/morfometria em adultos jovens 
(aproximadamente 70 dias após 
o nascimento)
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 810
 
N. o da cria (  a ) 
N. o de crias integradas no 
ensaio Exame/teste 
m F  
3 7 20 m + 20 f Aprendizagem e memória (adul ­
tos jovens) 
10 m + 10 f Peso cerebral em adultos jovens 
(aproximadamente 70 dias após 
o nascimento) 
4 8 — Animais de reserva para subs ­
tituições ou outros testes  
( a ) Neste exemplo, as ninhadas são reduzidas a 4 machos e 4 fêmeas, por eliminação 
dos restantes animais; as crias do sexo masculino são numeradas de 1 a 4; as do 
sexo feminino, de 5 a 8.  
Exemplo 2  
6. Utilizam-se 20 crias de cada sexo por nível de dose (um macho e uma 
fêmea de cada ninhada) nos testes de ontogenia comportamental anteriores 
ao desmame. Destes animais, eutanasiam-se 10 crias de cada sexo por nível de dose (um macho ou uma fêmea de cada ninhada) 11 dias após o nas ­
cimento. Remove-se o cérebro dos animais eutanasiados, após o que se pesa 
cada cérebro e se prepara o mesmo para a avaliação histopatológica.
 
7. Utilizam-se outros 20 animais de cada sexo por nível de dose (um macho e 
uma fêmea de cada ninhada) nos exames posteriores ao desmame (exames clínicos aprofundados, atividade motora, determinação da idade da maturi ­
dade sexual e funções motoras e sensoriais). Destes, no termo do estudo 
(aproximadamente 70 dias após o nascimento), anestesiam-se 10 dos ani ­
mais de cada sexo expostos a cada nível de dose (um macho ou uma fêmea de cada ninhada) e fixam-se por perfusão. Após nova fixação  in situ , 
remove-se o cérebro de cada um destes animais e prepara-se o mesmo 
para a avaliação neuropatológica.
 
8. Utilizam-se 10 crias de cada sexo por nível de dose (um macho ou uma 
fêmea de cada ninhada) nos testes da função cognitiva na adolescência e em 
adultos jovens. Utilizam-se animais diferentes nos testes da função cogni ­
tiva efetuados 23 dias após o nascimento e a adultos jovens. No termo do estudo, eutanasiam-se 10 animais de cada sexo em cada grupo de animais adultos ensaiados, removem-se os seus cérebros e pesam-se estes últimos.
 
9. Os restantes 20 animais de cada sexo por grupo, não selecionados para os 
testes, são eutanasiados e eliminados quando do desmame.  
Quadro 2  
N. o da cria (  i ) N. o de crias integradas no 
ensaio Exame/teste 
m f  
1 5 20 m + 20 f Ontogenia comportamental 
10 m + 10 f Peso cerebral/neuropatologia/ 
/morfometria 11 dias após o nas ­
cimento 
2 6 20 m + 20 f Exames clínicos aprofundados 
20 m + 20 f Atividade motora 
20 m + 20 f Maturidade sexual 20 m + 20 f Funções motoras e sensoriais 10 m + 10 f Peso cerebral/neuropatologia/ 
/morfometria em adultos jovens (aproximadamente 70 dias após 
o nascimento)
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 811
 
N. o da cria (  i ) N. o de crias integradas no 
ensaio Exame/teste 
m f  
3 7 10 m + 10 f (  j ) Aprendizagem e memória (23 
dias após o nascimento) 
3 7 10 m + 10 f (  j ) Aprendizagem e memória (adul ­
tos jovens) 
Peso cerebral em adultos jovens 
4 8 — Eutanásia e eliminação dos ani ­
mais 21 dias após o nascimento  
( i ) Neste exemplo, as ninhadas são reduzidas a 4 machos e 4 fêmeas, por eliminação 
dos restantes animais; as crias do sexo masculino são numeradas de 1 a 4; as do 
sexo feminino, de 5 a 8. 
( j ) As crias utilizadas nos testes cognitivos efetuados 23 dias após o nascimento não 
são as mesmas utilizadas na realização desses testes em adultos jovens (por 
exemplo, ninhadas pares num caso e ímpares no outro, do total de 20).  
Exemplo 3  
10. Utilizam-se 20 crias de cada sexo por nível de dose (um macho e uma 
fêmea de cada ninhada) na determinação dos pesos cerebrais e na avaliação 
neuropatológica realizadas 11 dias após o nascimento. Destes animais, 
eutanasiam-se 10 crias de cada sexo por nível de dose (um macho ou uma fêmea de cada ninhada) 11 dias após o nascimento. Remove-se-lhes o cérebro, após o que se pesa cada cérebro e se prepara o mesmo para a 
avaliação histopatológica. Registam-se ainda os dados ponderais dos cére ­
bros não fixados dos restantes 10 machos e 10 fêmeas por nível de dose.
 
11. Utilizam-se outros 20 animais de cada sexo por nível de dose (um macho e 
uma fêmea de cada ninhada) nos testes de ontogenia comportamental (ati ­
vidade motora), nas avaliações após o desmame (atividade motora e deter ­
minação da idade de maturidade sexual) e no ensaio da função cognitiva na adolescência.
 
12. Utilizam-se outros 20 animais de cada sexo por nível de dose (um macho e 
uma fêmea de cada ninhada) nos testes das funções motoras e sensoriais 
(sobressalto auditivo) e para os exames clínicos aprofundados. Destes, no termo do estudo (aproximadamente 70 dias após o nascimento), anestesiam-se 10 dos animais de cada sexo expostos a cada nível de dose 
(um macho ou uma fêmea de cada ninhada) e fixam-se por perfusão. Após 
nova fixação  in situ , remove-se o cérebro de cada um destes animais, 
pesa-se e prepara-se o mesmo para a avaliação neuropatológica.
 
13. Utilizam-se outras 20 crias de cada sexo por nível de dose (um macho e 
uma fêmea de cada ninhada) nos testes da função cognitiva em adultos jovens. Destes, no termo do estudo, eutanasiam-se 10 animais de cada sexo por grupo (um macho ou uma fêmea de cada ninhada), removem-se 
os seus cérebros e pesam-se estes últimos.
 
Quadro 3  
N. o da cria (  a ) N. o de crias integradas no 
ensaio Exame/teste 
m f  
1 5 10 m + 10 f Peso cerebral/neuropatologia/ 
/morfometria 11 dias após o nas ­
cimento 
10 m + 10 f Peso cerebral 11 dias após o 
nascimento 
2 6 20 m + 20 f Ontogenia comportamental (ati ­
vidade motora) 
20 m + 20 f Atividade motora 
20 m + 20 f Maturidade sexual 20 m + 20 f Aprendizagem e memória (27 
dias após o nascimento)
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 812
 
N. o da cria (  a ) N. o de crias integradas no 
ensaio Exame/teste 
m f  
3 7 20 m + 20 f Sobressalto auditivo (adolescen ­
tes e adultos jovens) 
20 m + 20 f Exames clínicos aprofundados 10 m + 10 f Peso cerebral/neuropatologia/ 
/morfometria em adultos jovens 
(aproximadamente 70 dias após o nascimento) 
4 8 20 m + 20 f Aprendizagem e memória (adul ­
tos jovens) 
10 m + 10 f Peso cerebral em adultos jovens
 
( a ) Neste exemplo, as ninhadas são reduzidas a 4 machos e 4 fêmeas, por eliminação 
dos restantes animais; as crias do sexo masculino são numeradas de 1 a 4; as do sexo feminino, de 5 a 8. ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 813
 
Apêndice 2  
Definições  
Produto químico: substância ou mistura.  
Produto químico em estudo: qualquer substância ou mistura à qual seja aplicado 
este método de ensaio.  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 814
 
B.54.  BIOENSAIO UTEROTRÓFICO EM ROEDORES: ENSAIO DE 
DESPISTAGEM A CURTO PRAZO DE PROPRIEDADES 
ESTROGÉNICAS  
INTRODUÇÃO  
1. Este método é equivalente ao  Test Guideline  TG 440 (2007) da OCDE. Em 
1998, a OCDE deu início a uma ação prioritária com vista à revisão das orientações existentes e à elaboração de novas orientações para despistagem 
e ensaio de potenciais desreguladores do sistema endócrino (1). Um dos 
elementos dessa ação foi a elaboração de um  Test Guideline  para o bio ­
ensaio uterotrófico em roedores. Este bioensaio foi, em seguida, objeto de um vasto programa de validação, que incluiu a compilação de um 
documento-base pormenorizado (2)(3) e a realização de amplos estudos 
intra e interlaboratoriais destinados a examinar a pertinência e a reproduti ­
bilidade do bioensaio com um estrogéneo de referência muito ativo, ago ­
nistas fracos de recetores de estrogénios, um antagonista forte de recetores 
de estrogénios e um produto químico de referência negativo 
(4)(5)(6)(7)(8)(9). O presente método B.54 constitui o corolário da expe ­
riência adquirida durante o programa de validação do ensaio, bem como dos 
resultados nele obtidos relativamente aos agonistas de estrogénios.
 
2. O bioensaio uterotrófico constitui um ensaio de despistagem a curto prazo 
que remonta aos anos 30 (27)(28) e foi pela primeira vez normalizado para efeitos de despistagem, por uma comissão de peritos, em 1962 (32)(35). O ensaio baseia-se no aumento do peso uterino, designado por «resposta 
uterotrófica» (ver a referência 29). Avalia-se a capacidade de um determi ­
nado produto químico de induzir uma atividade biológica análoga à dos agonistas ou antagonistas dos estrogéneos naturais (por exemplo, o 17ß- 
-estradiol), mas o ensaio é muito menos utilizado na deteção de antagonistas 
do que de agonistas. O útero responde aos estrogéneos de duas maneiras. A resposta inicial é um aumento do peso, devido à absorção de água. Segue-se um aumento de peso causado pelo crescimento dos tecidos (30). A reação 
do útero na fêmea de rato é comparável à que se verifica na ratinha.
 
3. Este bioensaio serve de ensaio de despistagem  in vivo , enquadrando-se a 
sua aplicação no contexto do  Quadro conceptual da OCDE para ensaio e 
avaliação de produtos químicos desreguladores do sistema endócrino  
(apêndice 2). Nesse quadro conceptual, o bioensaio uterotrófico 
inscreve-se no nível 3, enquanto ensaio  in vivo  que fornece dados acerca 
de um único mecanismo endócrino, a atividade estrogénica.  
4. O bioensaio uterotrófico destina-se a ser incluído numa série de ensaios  in 
vitro  e in vivo  que visam identificar produtos químicos suscetíveis de in ­
teragir com o sistema endócrino, tendo em vista a avaliação dos riscos para 
a saúde humana e para o ambiente. No programa de validação realizado pela OCDE, utilizaram-se agonistas fortes e fracos de estrogénios para avaliar a eficácia do ensaio na identificação de produtos químicos estrogé ­
nicos (4)(5)(6)(7)(8). Foi assim possível comprovar a sensibilidade do pro ­
tocolo experimental aos agonistas de estrogénios, bem como a boa repro ­
dutibilidade intra e interlaboratorial do mesmo.
 
5. No que respeita a produtos químicos «negativos», apenas foi incluído no 
programa de validação um produto químico de referência «negativo» já 
identificado como tal num ensaio uterotrófico e em ensaios  in vitro  de 
recetores e de ligação a recetores. No entanto, avaliaram-se outros dados experimentais, não relacionados com o programa de validação da OCDE, 
que corroboraram a especificidade do bioensaio uterotrófico para a despis ­
tagem de agonistas de estrogénios (16).
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 815
 
CONSIDERAÇÕES INICIAIS E LIMITAÇÕES  
6. Os agonistas e antagonistas de estrogénios agem como ligandos dos rece ­
tores dos estrogénios a e b e podem ativar ou inibir, respetivamente, a 
atividade de transcrição dos recetores. Daí podem advir consequências ne ­
gativas para a saúde, nomeadamente efeitos com incidências na reprodução e no desenvolvimento. É, pois, necessário poder determinar e avaliar rapi ­
damente a capacidade agonista ou antagonista de estrogénios revelada pelos 
produtos químicos. Embora constituam informações úteis, a afinidade de um ligando por um recetor de estrogénios e a ativação da transcrição de genes relatores  in vitro  são apenas dois dos fatores determinantes de even ­
tuais perigos. Outros fatores determinantes possíveis são a ativação ou 
desativação metabólicas após a entrada no organismo, a distribuição do produto químico pelos tecidos-alvo e a eliminação do produto químico do organismo, as quais, pelo menos em parte, dependem da via de adminis ­
tração e do produto químico em estudo. Daqui decorre a necessidade de 
despistar a eventual atividade dos produtos químicos  in vivo  em condições 
adequadas, a não ser que as características ADME (absorção, distribuição, metabolismo e eliminação) do produto químico já forneçam informações 
suficientes. Os tecidos uterinos reagem com um crescimento rápido e vigo ­
roso à estimulação com estrogénios, designadamente em roedores de labo ­
ratório, cujo ciclo estral dura aproximadamente 4 dias. Os roedores, nomea ­
damente o rato, também são amplamente utilizados nos estudos de toxici ­
dade para caracterização de perigos. O útero dos roedores é, portanto, um 
órgão-alvo adequado para a despistagem  in vivo  de agonistas e antagonistas 
de estrogénios.
 
7. O presente método baseia-se nos protocolos utilizados no estudo de valida ­
ção realizado pela OCDE que se revelaram fiáveis e reprodutíveis nos estudos intra e interlaboratoriais efetuados (5)(7). Estão disponíveis dois métodos: um método no qual se utilizam fêmeas adultas ovariectomizadas 
e um método no qual se utilizam fêmeas imaturas não-ovariectomizadas. O 
programa de validação realizado pela OCDE mostrou que a sensibilidade e a reprodutibilidade dos dois métodos são comparáveis. Todavia, o método que utiliza fêmeas imaturas, cujo eixo hipotálamo-hipófise-gónadas está 
intacto, é um pouco menos específico, embora o seu campo de investigação 
seja mais amplo do que o do método que utiliza fêmeas ovariectomizadas, pois o método com fêmeas imaturas é sensível aos produtos químicos que interagem com o referido eixo e não unicamente aos produtos químicos que 
interagem com os recetores de estrogénios. No rato, o eixo hipotálamo- 
-hipófise-gónadas está funcional aproximadamente aos 15 dias de idade. Antes desta idade, não é possível acelerar a puberdade com tratamentos como o da GnRH. Com a aproximação da puberdade, antes da abertura da 
vagina, as fêmeas têm vários ciclos silenciosos, sem abertura vaginal nem 
ovulação, mas que se manifestam por flutuações hormonais. Se um produto químico estimular direta ou indiretamente o eixo hipotálamo-hipófise-góna ­
das, a puberdade e a ovulação são antecipadas e dá-se uma aceleração da 
abertura da vagina. Os produtos químicos que agem sobre o referido eixo 
produzem este efeito, mas algumas dietas, com níveis de energia metabo ­
lizável mais elevados do que o normal, embora não sejam estrogénicas, estimulam o crescimento e aceleram a abertura vaginal. Esses produtos 
químicos não induzem respostas uterotróficas em animais adultos ovariec ­
tomizados, cujo eixo hipotálamo-hipófise-gónadas não funciona.
 
8. Numa perspetiva de bem-estar animal, deve privilegiar-se o método que 
utiliza animais imaturos, para evitar o pré-tratamento cirúrgico dos mesmos 
e a eventual impossibilidade de utilizar os animais que evidenciem sinais de 
entrada no ciclo estral (ver o ponto 30).  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 816
 
9. A resposta uterotrófica não é inteiramente de origem estrogénica, pois de ­
terminados produtos químicos, que não são agonistas nem antagonistas de 
estrogénios, podem igualmente provocá-la. Por exemplo, doses relativa ­
mente elevadas de progesterona, testosterona ou diversas progestinas sinté ­
ticas também podem induzir uma estimulação (30). Pode efetuar-se uma 
análise histológica das respostas obtidas para pesquisar sinais de queratini ­
zação ou de cornificação da vagina (30). Independentemente da possível origem da resposta, um resultado positivo num bioensaio uterotrófico deve normalmente dar lugar a uma pesquisa mais aprofundada. O poder estro ­
génico pode ser confirmado por ensaios  in vitro , como os ensaios de ligação 
aos recetores dose estrogénios e os ensaios de ativação da transcrição, ou por outros ensaios  in vivo , como o ensaio de puberdade em fêmeas.
 
10. Atendendo a que o bioensaio uterotrófico constitui um ensaio de despista ­
gem in vivo , o método de validação adotado favoreceu o bem-estar animal e 
optou por uma estratégia de ensaio por etapas. Para o efeito, o esforço concentrou-se na validação rigorosa da reprodutibilidade e da sensibilidade da despistagem da atividade estrogénica — o principal problema associado 
a muitos produtos químicos –, mas pouco trabalho foi consagrado à com ­
ponente antiestrogénica do ensaio. Dado que o número de produtos quími ­
cos claramente antiestrogénicos (com atividade não dissimulada por ativi ­
dade estrogénica) é muito reduzido, só foi ensaiado um produto químico 
antiestrogénico (com forte atividade). O presente método é, pois, dedicado 
ao protocolo estrogénico, enquanto o protocolo que descreve o modo anta ­
gonista do ensaio consta de um documento de orientações (37). A repro ­
dutibilidade e a sensibilidade do ensaio para produtos químicos com ativi ­
dade puramente antiestrogénica serão definidas com maior clareza ulterior ­
mente, depois da aplicação regular do correspondente protocolo durante algum tempo e de se terem identificado mais produtos químicos com este modo de ação.
 
11. Pressupõe-se que todos os procedimentos com animais respeitarão as nor ­
mas locais de manipulação de animais. As descrições, neste protocolo, dos cuidados a ter com os animais e do tratamento a dar aos animais são 
normas mínimas, prevalecendo, se for mais estrita, a regulamentação local, 
como a decorrente da Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu e do Conselho, de 22 de setembro de 2010, relativa à proteção dos animais utilizados para fins científicos (38). Para mais orientações sobre o trata ­
mento ético de animais, ver o documento da OCDE com a referência 25.
 
12. Tal como em qualquer ensaio com animais vivos, é essencial que, antes de 
se iniciar este ensaio, se tenha a certeza de que os dados pretendidos são realmente necessários. Seguem-se dois exemplos de situações nas quais 
podem sê-lo:
 
— potencial de exposição elevado (nível 1 do quadro conceptual descrito 
no apêndice 2) ou indícios de atividade estrogénica (nível 2) que justi ­
fiquem a necessidade de investigar o ocorrência de tais efeitos  in vivo ; 
— efeitos reveladores de atividade estrogénica em ensaios  in vivo  dos 
níveis 4 ou 5, que justifiquem a necessidade de investigar se os efeitos em causa se relacionam com um mecanismo estrogénico não elucidável 
em ensaios  in vitro .
 
13. No apêndice 1 definem-se alguns conceitos utilizados neste método.  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 817
 
PRINCÍPIO DO MÉTODO  
14. A sensibilidade do bioensaio uterotrófico assenta num dispositivo experi ­
mental constituído por animais cujo eixo hipotálamo-hipófise-ovários não 
funciona, daí resultando baixos níveis endógenos de estrogéneos em circu ­
lação. Esta situação proporciona pesos uterinos baixos à partida e maximiza a amplitude possível da resposta aos estrogénios administrados. Os roedores 
fêmeas preenchem estas condições nos seguintes estados de sensibilidade 
aos estrogénios:
 
i) Fêmeas imaturas após o desmame, mas antes da puberdade;  
ii) Fêmeas adultas jovens ovariectomizadas, transcorrido um período ade ­
quado para a regressão dos tecidos uterinos.  
15. Administra-se diariamente o produto químico em estudo por sonda esofá ­
gica ou injeção subcutânea. Administram-se doses crescentes constantes do 
produto químico em estudo a, pelo menos, dois grupos de animais (ver 
orientações no ponto 35), expondo cada grupo a um nível de dose. O período de administração é de três dias consecutivos, no caso do método com fêmeas imaturas, e de, pelo menos, três dias consecutivos, no caso do 
método com fêmeas adultas ovariectomizadas. Autopsiam-se os animais 
cerca de 24 horas após lhes ser administrada a última dose. Para o despiste de agonistas de estrogénios, compara-se o peso uterino médio dos grupos de animais expostos com o do grupo de animais aos quais foi administrado 
apenas o veículo, para determinar se ocorreu algum aumento com signifi ­
cado estatístico. Um aumento com significado estatístico do peso uterino médio de um grupo de animais expostos ao produto químico em estudo é revelador de uma resposta positiva neste bioensaio.
 
DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
Escolha da espécie animal  
16. Podem utilizar-se as estirpes habituais de roedores de laboratório, por exem ­
plo as estirpes de ratos Sprague-Dawley e Wistar a que se recorreu na 
validação. Não devem utilizar-se estirpes cuja resposta uterina seja com ­
provadamente menor ou no caso de se suspeitar disso. O laboratório deve demonstrar a sensibilidade da estirpe utilizada conforme se explica nos pontos 26 e 27.
 
17. Desde os anos 30 que se têm utilizado fêmeas de rato e ratinhas nos 
bioensaios uterotróficos. Os estudos de validação realizados pela OCDE foram-no apenas em ratos, com base no pressuposto da equivalência entre essas espécies e, portanto, na boa probabilidade de que a utilização de 
apenas uma delas seria suficiente para a validação a nível mundial, per ­
mitindo economizar recursos e preservar animais. O rato é a espécie esco ­
lhida na maior parte dos estudos relativos à reprodução e ao desenvolvi ­
mento. Atendendo a que se dispõe de uma vasta base de dados históricos 
relativos ao ratinho e, portanto, para alargar o campo de aplicação do 
bioensaio uterotrófico nos roedores à utilização dessa espécie, efetuou-se um estudo de validação complementar limitado em ratinhas (16). Mantendo o propósito inicial de economizar recursos e preservar animais, adotou-se 
uma abordagem comparativa, no âmbito da qual se utilizou um número 
reduzido de produtos químicos, participou um pequeno número de labora ­
tórios e as amostras não foram codificadas. Esse estudo de validação com ­
parativo mostrou que existe uma boa correspondência, qualitativa e quanti ­
tativa, entre os dados obtidos nos bioensaios uterotróficos realizados em 
ratinhas adultas jovens ovariectomizadas e os dados obtidos em bioensaios análogos com fêmeas de rato. Quando os resultados do bioensaio uterotró ­
fico se inserirem numa etapa preliminar de um estudo a longo prazo, 
torna-se possível utilizar animais da mesma estirpe e proveniência em am ­
bos os estudos. A abordagem comparativa circunscreveu-se a ratinhas ova ­
riectomizadas e o respetivo relatório não contém um conjunto de dados suficientemente sólido para validar o modelo que utiliza animais imaturos, 
razão pela qual a aplicação desse modelo a ratinhas não é abrangida pelo 
presente método.
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18. Conclui-se que, em alguns casos, podem ser utilizadas ratinhas em vez de 
fêmeas de rato. Nessa eventualidade, haverá que justificar a utilização dessa 
outra espécie, com base em critérios toxicológicos, farmacocinéticos e/ou outros. Poderá ser necessário alterar o protocolo se forem utilizadas rati ­
nhas. Por exemplo, o consumo alimentar do ratinho, relativamente ao peso 
corporal, é superior ao do rato, pelo que o teor de fitoestrogénios dos 
alimentos dos ratinhos deve ser menor do que o teor de fitoestrogénios dos alimentos dos ratos (9)(20)(22).
 
Condições de alojamento e de alimentação  
19. Todos os procedimentos devem respeitar as normas locais de manipulação 
de animais de laboratório. As descrições, neste protocolo, dos cuidados a ter 
com os animais e do tratamento a dar aos animais são normas mínimas, prevalecendo, se for mais estrita, a regulamentação local, como a decorrente da Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu e do Conselho, de 22 de 
setembro de 2010, relativa à proteção dos animais utilizados para fins 
científicos (38). A temperatura do biotério deve ser de 22 °C (± 3 °C). A humidade relativa não deve ser inferior a 30 % e, de preferência, não deve exceder 70 %, exceto durante a limpeza do biotério. Idealmente, deve pro ­
curar manter-se a humidade relativa entre 50 % e 60 %. A iluminação deve 
ser artificial, com uma sequência de 12 horas de luz seguidas de 12 horas de escuridão.
 
20. Os animais devem receber  ad libitum  uma dieta de laboratório e água de 
beber. Os animais adultos jovens podem ser alojados individualmente ou 
em pequenos grupos de não mais de três por gaiola. Por serem juvenis, recomenda-se que os animais imaturos sejam alojados em gaiolas coletivas.
 
21. Sabe-se que teores elevados de fitoestrogénios nas dietas de laboratório 
aumentam o peso uterino em roedores num grau passível de interferir 
com os bioensaios uterotróficos (13)(14)(15). Teores elevados de fitoestro ­
génios nas dietas de laboratório e níveis elevados de energia metabolizável nas mesmas também podem induzir puberdade precoce, se forem utilizados animais imaturos. A presença de fitoestrogénios resulta, sobretudo, da in ­
corporação de produtos de soja e de luzerna nas dietas de laboratório, 
tendo-se verificado que as concentrações de fitoestrogénios variam de lote para lote das dietas de laboratório (23). O peso corporal é uma variável importante, dado que a quantidade de alimentos ingerida está relacionada 
com este parâmetro. Por conseguinte, a dose de fitoestrogénio proveniente 
do consumo da mesma dieta pode variar de espécie para espécie e depen ­
dem da faixa etária (9). Proporcionalmente ao peso corporal, o consumo de alimentos de fêmeas de rato imaturas pode ser aproximadamente duplo do 
consumo de alimentos de fêmeas adultas jovens ovariectomizadas. Ainda 
proporcionalmente ao peso corporal, o consumo de alimentos de ratinhas adultas jovens pode ser aproximadamente quádruplo do consumo de ali ­
mentos de fêmeas adultas jovens de rato ovariectomizadas.
 
22. Os resultados dos bioensaios uterotróficos (9)(17)(18)(19) mostram, porém, 
que são aceitáveis pequenas quantidades de fitoestrogénios na dieta, as quais não reduzem a sensibilidade do ensaio. A título indicativo, no caso das fêmeas imaturas de rato das estirpes Sprague-Dawley e Wistar, o teor de 
fitoestrogénios da dieta de laboratório não deve exceder 350 μg de equiva ­
lente de genisteína por grama de dieta (6)(9). Uma dieta com tais caracte ­
rísticas deve ser igualmente adequada para o estudo de fêmeas adultas jovens de rato ovariectomizadas, uma vez que, proporcionalmente ao peso 
corporal, o consumo de alimentos dos adultos jovens é inferior ao dos 
animais imaturos. Se forem utilizadas ratinhas adultas ovariectomizadas ou fêmeas de rato mais sensíveis aos fitoestrogénios, importará reduzir proporcionalmente os níveis de fitoestrogénios da dieta (20). Por outro lado, 
diferenças entre dietas ao nível da energia metabolizável disponível podem 
gerar desfasamentos no início da puberdade (21)(22).
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23. Antes de iniciar o estudo, é necessário escolher cuidadosamente uma dieta 
cujo nível de fitoestrogénios não seja elevado (ver orientações nas referên ­
cias 6 e 9) e cujo nível de energia metabolizável não seja excessivo, dado que, caso contrário, os resultados podem ser falseados (15)(17)(19)(22)(36). A confirmação de que o dispositivo de ensaio utilizado pelo laboratório 
satisfaz os critérios de desempenho como se refere nos pontos 26 e 27 
constitui uma verificação importante destes dois fatores. A título cautelar, em aplicação das boas práticas de laboratório, deve colher-se, para eventual análise do teor de fitoestrogénios, uma amostra representativa de cada lote 
de dieta fornecido durante o estudo — por exemplo, no caso de o peso 
uterino dos animais do grupo de controlo exceder os valores históricos de controlo ou se a resposta ao estrogénio de referência (17 α-etinilestradiol) for 
inadequada. As partes alíquotas constituídas devem ser integradas no estudo 
e analisadas ou ser congeladas a –20 °C ou conservadas de um modo que 
permita evitar a decomposição da amostra antes da análise.
 
24. Algumas camas podem conter produtos químicos estrogénicos ou antiestro ­
génicos naturais (por exemplo, é sabido que as maçarocas de milho afetam os ciclos das fêmeas de rato e são antiestrogénicas). As camas utilizadas 
devem conter o mínimo de fitoestrogénios possível.
 
Preparação dos animais  
25. Distribuem-se aleatoriamente animais de laboratório sem indícios de qual ­
quer doença ou anomalia física pelos grupos de controlo e pelos grupos expostos. As gaiolas devem ser dispostas de forma a minimizar possíveis 
efeitos derivados do seu posicionamento. Os animais devem ser identifica ­
dos individualmente. Durante o período de aclimatação, os animais imaturos devem permanecer em gaiolas acompanhados das respetivas mães ou de outras fêmeas aleitantes, até serem desmamados. O período de aclimatação 
antes do início do estudo deve ser de cerca de 5 dias, no caso dos animais 
adultos jovens e dos animais imaturos acompanhados das respetivas mães ou de outras fêmeas aleitantes. Se os animais imaturos a utilizar já tiverem sido desmamados e não estiverem acompanhados das respetivas mães ou de 
outras fêmeas aleitantes, pode ser necessário reduzir o período de aclima ­
tação, dado que a administração das doses deve iniciar-se imediatamente após o desmame (ver o ponto 29).
 
PROCEDIMENTO DE ENSAIO  
Verificação da competência técnica do laboratório  
26. A competência dos laboratórios pode ser verificada de duas maneiras:  
— Através de uma verificação periódica, por referência a um estudo de 
base inicial de controlo positivo (ver o ponto 27). Pelo menos de seis em seis meses e sempre que ocorram alterações suscetíveis de influen ­
ciar os resultados do ensaio (por exemplo, nova formulação da dieta, 
mudança do pessoal que faz as dissecações, mudança da estirpe ou do 
fornecedor dos animais, etc.), deve verificar-se a resposta do dispositivo de ensaio (o modelo animal) a uma dose adequada (baseada no estudo de base inicial de controlo positivo referido no ponto 27) de um estro ­
génio de referência: o 17a-etinilestradiol (n.
 o CAS 57-63-6).  
— Através da utilização de grupos de controlo paralelos, incluindo em cada 
ensaio um grupo ao qual é administrada uma dose adequada do estro ­
génio de referência.  
Se o dispositivo não responder como previsto, devem examinar-se as con ­
dições experimentais, adaptando-as em conformidade. Recomenda-se, em 
ambos os casos, que a dose do estrogénio de referência corresponda a 
DE 70-80 (DE: dose eficaz).  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 820
 
27. Estudo de base inicial de controlo positivo  — Antes de um determinado 
laboratório efetuar um estudo no qual aplique o presente método pela 
primeira vez, é necessário demonstrar a competência técnica do laboratório determinando a resposta do modelo animal a um mínimo de quatro doses de um estrogénio de referência: 17a-etinilestradiol (n.
 o CAS 57-63-6). 
Compara-se o efeito no peso uterino com dados históricos atestados (ver 
a referência 5). Se os resultados deste estudo de base inicial não forem os previstos, devem examinar-se as condições experimentais, adaptando-as em conformidade.
 
Número e estado dos animais  
28. O número mínimo de animais de cada grupo exposto ou de controlo é de 
seis, tanto no caso do protocolo com fêmeas imaturas como do protocolo 
com fêmeas adultas ovariectomizadas.  
Idade dos animais imaturos  
29. É necessário indicar o dia de nascimento dos animais utilizados na variante 
do bioensaio uterotrófico que recorre a animais imaturos. A administração 
das doses deve iniciar-se suficientemente cedo, para garantir que, no final da administração do produto químico em estudo, ainda não tenha ocorrido o aumento fisiológico dos estrogénios endógenos associado à puberdade. Por 
outro lado, há indícios de que os animais muito jovens podem ser menos 
sensíveis. Para definir a idade ótima, cada laboratório deve atender aos seus dados históricos sobre a maturidade sexual dos animais.
 
Como regra geral, a administração das doses às fêmeas de rato pode 
iniciar-se imediatamente após um desmame precoce, 18 dias após o nasci ­
mento (para este efeito, o dia do nascimento é o dia 0). A administração de doses a fêmeas de rato deve terminar, de preferência, 21 dias após o 
nascimento, mas sempre antes do 25.
 o dia após o nascimento. Com efeito, 
depois disso, o eixo hipotálamo-hipófise-ovários torna-se funcional e os níveis de estrogénios endógenos podem começar a subir, aumentado con ­
comitantemente os pesos uterinos médios de base e aumentando também os 
desvios-padrão dos grupos (2)(3)(10)(11)(12).
 
Ovariectomia  
30. A ovariectomia das ratinhas e das fêmeas de rato dos grupos expostos e de 
controlo deve ocorrer entre a sexta e a oitava semanas de idade. No caso 
das fêmeas de rato, o período mínimo entre a ovariectomia e o primeiro dia de administração das doses é de 14 dias, a fim de permitir que o útero readquira um peso mínimo de base estável. No caso das ratinhas, o período 
mínimo entre a ovariectomia e o primeiro dia de administração das doses é 
de 7 dias. Uma vez que bastam pequenas quantidades de tecido dos ovários para gerar níveis significativos de estrogénios em circulação (3), os animais 
devem ser testados antes de serem utilizados, mediante a observação de 
células epiteliais de esfregaços vaginais obtidos em, pelo menos, cinco dias consecutivos (por exemplo, no caso das fêmeas de rato, do décimo ao décimo quarto dia após a ovariectomia). Os animais que apresentarem 
algum indício de entrada no ciclo estral não devem ser utilizados. Poste ­
riormente, quando da autópsia, deve verificar-se se está presente algum tecido dos ovários nos cotos cicatriciais da ovariectomia. Se assim for, os dados relativos ao animal em causa não devem ser utilizados nos cálculos 
(3).
 
31. A ovariectomia é efetuada com o animal apoiado no ventre, depois de 
convenientemente anestesiado. Efetua-se uma incisão na zona dorsal lateral 
da parede abdominal, com cerca de 1 cm de extensão, no ponto intermédio 
entre o limite costal inferior e a crista ilíaca, afastada lateralmente alguns milímetros da orla lateral do músculo lombar. Extraem-se os ovários da cavidade abdominal, depositam-se num campo assético e efetua-se o corte 
na junção entre o oviduto e o corpo uterino. Depois de confirmar que não 
se verifica nenhuma hemorragia importante, sutura-se a parede abdominal e fecha-se a abertura na pele com agrafos ou com uma sutura adequada. A figura 1 ilustra esquematicamente os pontos de laqueação. Deve efetuar-se 
uma analgesia pós-operatória adequada, recomendada por um veterinário 
com experiência em roedores.
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Peso corporal  
32. No método da ovariectomização de fêmeas adultas, não existe uma corre ­
lação entre o peso corporal e o peso uterino, porque este é afetado por 
hormonas como os estrogénios, mas não pelos fatores de crescimento que regulam o tamanho do corpo. No modelo que utiliza fêmeas imaturas, em contrapartida, durante o período de maturação o peso corporal está relacio ­
nado com o peso uterino (34). Por conseguinte, no início do estudo por 
aplicação do modelo que recorre a fêmeas imaturas, as diferenças de peso entre os animais utilizados devem ser mínimas, não se desviando mais de 20 % do peso médio. Para isso, o criador deve normalizar o tamanho das 
ninhadas, a fim de garantir que a progenitura das diversas progenitoras é 
alimentada sensivelmente do mesmo modo. Integram-se os animais nos grupos expostos e de controlo procedendo a uma distribuição aleatória de pesos, de maneira que o peso corporal médio de cada grupo não difira 
estatisticamente do peso corporal médio de qualquer outro grupo. Deve 
evitar-se integrar animais da mesma ninhada no mesmo grupo exposto, tanto quanto possível sem aumentar o número de ninhadas utilizadas no estudo.
 
Dosagem  
33. Normalmente, dois grupos de dosagem e um grupo de controlo são sufi ­
cientes para determinar se um produto químico pode ter atividade estrogé ­
nica in vivo . Por razões de bem-estar animal, privilegia-se, portanto, este 
modelo. No caso de se pretender traçar uma curva da relação entre a dose 
administrada e a resposta obtida ou efetuar uma extrapolação para doses 
mais baixas, são necessários, pelo menos, três grupos de dosagem. No caso de se pretender obter informações que vão além de uma identificação de atividade estrogénica (como, por exemplo, uma estimativa do poder estro ­
génico), deve ponderar-se um regime de dosagem diferente. Salvo no que 
respeita à exposição ao produto químico em estudo, os animais do grupo de controlo devem ser tratados do mesmo modo que os animais dos grupos 
ensaiados. Se for utilizado um veículo para administrar o produto químico 
em estudo, os animais do grupo de controlo devem receber a mesma quan ­
tidade de veículo utilizada nos grupos expostos (ou a maior quantidade de veículo utilizada nos grupos ensaiados, se aquela variar de grupo para 
grupo).
 
34. O objetivo, no caso do bioensaio uterotrófico, é selecionar doses que ga ­
rantam a sobrevivência dos animais e não lhes provoquem efeitos tóxicos nem sofrimento significativos após três dias consecutivos de administração do produto químico, até à dose máxima diária de 1 000 mg/kg. Na escolha 
das doses devem ter-se em conta os dados eventualmente disponíveis sobre 
a toxicidade e a (toxico)cinética do produto químico em estudo ou de matérias afins. Para se estabelecer o nível de dose mais elevado, deve atender-se, em primeiro lugar, à DL
 50 e/ou aos dados sobre toxicidade 
aguda de que se disponha, a fim de evitar a morte dos animais e de os 
poupar a grande sofrimento ou aflição (24)(25)(26). A dose mais elevada deve ser a dose máxima tolerada (DMT), podendo também ser aceite um 
estudo realizado a um nível de dosagem que tenha induzido uma resposta 
uterotrófica positiva. A título exploratório, aceitam-se geralmente intervalos largos (por exemplo, meia unidade logarítmica, correspondente a um fator de progressão das doses de 3,2, ou mesmo uma unidade logarítmica) entre 
as doses administradas. Se não se dispuser de dados adequados para o 
efeito, pode efetuar-se um estudo exploratório, para facilitar a determinação das doses a utilizar.
 
35. Em alternativa, se for possível estimar a atividade estrogénica de um ago ­
nista com base em dados  in vitro  (ou in silico ), esses dados podem ser tidos 
em conta na escolha das doses. Por exemplo, obtém-se uma estimativa da 
quantidade do produto químico em estudo que gerará respostas uterotróficas equivalentes às do agonista de referência (etinilestradiol) determinando a correspondente atividade  in vitro  relativamente à do etinilestradiol. A dose 
mais elevada a ensaiar resultará da multiplicação dessa dose equivalente por 
um fator adequado (10 ou 100, por exemplo).
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Estudo exploratório  
36. Se necessário, pode efetuar-se um estudo exploratório preliminar com pou ­
cos animais. Para o efeito, pode utilizar-se o documento de orientações 
n. o 19 da OCDE (25), que define os sinais clínicos da toxicidade ou do 
sofrimento provocados em animais. Se for possível fazê-lo nesse estudo exploratório após três dias de administração das doses, procede-se à excisão 
e pesagem dos úteros cerca de 24 horas após a administração da última 
dose. Estes dados podem ser depois utilizados para afinar o estudo principal (escolha de uma dose máxima e de uma dose inferior aceitáveis e recomen ­
dação do número de grupos de dosagem).
 
Administração das doses  
37. Administra-se o produto químico em estudo por sonda esofágica ou por 
injeção subcutânea. Ao escolher a via de administração, é necessário atender 
aos aspetos do bem-estar animal e a aspetos toxicológicos como a relação com a via de exposição humana ao produto químico (por exemplo, sonda esofágica para exposição por ingestão e injeção subcutânea para exposição 
por inalação ou por adsorção cutânea), tendo ainda em conta as proprieda ­
des físico-químicas do produto químico em estudo e, em especial, as in ­
formações toxicológicas e os dados metabólicos e cinéticos disponíveis (por exemplo, a necessidade de evitar metabolismos de primeira passagem ou 
melhor eficiência de uma determinada via de administração).
 
38. Sempre que possível, deve começar por ponderar-se a possibilidade de se 
utilizarem soluções/suspensões aquosas. Porém, dado que os ligandos de estrogénios ou os precursores metabólicos dos mesmos são geralmente hidrófobos, normalmente utiliza-se uma solução ou suspensão oleosa (por 
exemplo, em óleo de milho, de amendoim ou de gergelim ou em azeite). 
No entanto, uma vez que estes óleos têm valores calóricos e teores de gorduras diferentes, o veículo pode influenciar a absorção total de energia metabolizável e, em consequência disso, pode alterar as medições dos pa ­
râmetros determinados, designadamente o peso uterino, em especial no 
protocolo que utiliza fêmeas imaturas (33). Antes da realização do estudo é, portanto, necessário ensaiar o veículo previsto relativamente a grupos de controlo sem veículo. Pode dissolver-se o produto químico em estudo numa 
quantidade mínima de etanol a 95 % ou de outro solvente adequado, 
diluindo-se depois até à concentração final no veículo a utilizar nos ensaios. É necessário conhecer as características de toxicidade do solvente e verificá- -las num grupo de controlo apenas exposto ao solvente. Se o produto quí ­
mico em estudo for considerado estável, pode favorecer-se a sua dissolução 
aquecendo ligeiramente e agitando vigorosamente. Deve determinar-se a estabilidade do produto químico em estudo no veículo utilizado. Se o produto químico em estudo se mantiver estável durante todo o estudo, 
podem preparar-se uma alíquota inicial do mesmo e, diariamente, as dilui ­
ções às doses necessárias.
 
39. A cronologia da administração das doses depende do modelo experimental 
(ver o ponto 29 para o protocolo com fêmeas imaturas e o ponto 30 para o protocolo com fêmeas adultas ovariectomizadas). No caso das fêmeas de 
rato imaturas, administra-se o produto químico em estudo três dias conse ­
cutivos. No caso das fêmeas de rato ovariectomizadas, também se recomen ­
dam exposições de três dias, mas são aceitáveis exposições mais longas, que podem melhorar a deteção de produtos químicos fracamente ativos. 
No caso das ratinhas ovariectomizadas, três dias de exposição são normal ­
mente suficientes, sem que haja vantagens significativas no prolongamento da mesma até sete dias quando se trate de agonistas fortes de estrogéneos. Todavia, no caso dos estrogéneos fracos, tal não ficou demonstrado no 
estudo de validação (16), pelo que a administração das doses a ratinhas 
adultas ovariectomizadas deve prolongar-se por sete dias consecutivos.As doses devem ser administradas à mesma hora do dia e ser adaptadas de modo a manter um nível de dose constante em relação ao peso corporal de 
cada animal (por exemplo miligramas diários do produto químico em estudo 
por quilograma de peso corporal. Deve ainda minimizar-se a variabilidade do volume administrado proporcionalmente ao peso corporal, ajustando a concentração das soluções utilizadas de modo que, proporcionalmente ao 
peso corporal, o volume administrado seja o mesmo para todos os níveis de 
dose e todas as vias de administração.
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40. A administração forçada aos animais através de sonda esofágica deve 
efetuar-se numa dose diária única, por meio de um tubo estomacal ou de 
uma cânula de intubação adequada. O volume máximo de líquido que pode ser administrado de cada vez depende do tamanho do animal. Devem respeitar-se as normas locais de manipulação de animais, mas o volume 
administrado não deve exceder 5 ml por quilograma de peso corporal, salvo 
no caso das soluções aquosas, em que se permitem 10 ml por quilograma de peso corporal.
 
41. Se o produto químico em estudo for administrado por injeção subcutânea, 
deve ser injetada nos animais uma dose diária única. As doses devem ser administradas na região escapular dorsal ou na região lombar, por meio de 
uma seringa do tipo utilizado no teste da tuberculina (calibre 23 ou 25), 
dotada de uma agulha esterilizada. É facultativo rapar a pelagem dos ani ­
mais no local da injeção. Devem registar-se as perdas ou escorrimentos nesse local, bem como todas as administrações incompletas de doses. O 
volume injetado diariamente a um rato não deve exceder 5 ml por quilo ­
grama de peso corporal, divididos por dois locais de injeção, salvo no caso das soluções aquosas, em que se permitem 10 ml por quilograma de peso corporal.
 
Exames  
Exames gerais e clínicos  
42. Deve efetuar-se um exame clínico geral pelo menos uma vez por dia; se 
forem detetados sinais de toxicidade, o exame deve ser mais frequente. De preferência, os exames devem ser efetuados à mesma hora ou às mesmas 
horas do dia, tendo em atenção o período previsto de efeitos mais acentua ­
dos após a administração do produto químico. Devem examinar-se todos os animais de modo a detetar os casos de mortalidade e morbilidade e sinais clínicos gerais como mudanças de comportamento, alterações da pele, da 
pelagem, dos olhos ou das mucosas e a ocorrência de secreções ou excre ­
ções e de reações neurovegetativas (por exemplo lacrimação, horripilação, alterações da dimensão pupilar, respiração anormal, etc.).
 
Peso corporal e consumo de alimentos  
43. Deve pesar-se diariamente cada animal com a aproximação de 0,1 g, co ­
meçando imediatamente antes do início da exposição, isto é, quando da repartição dos animais pelos grupos. A quantidade de alimentos consumida em cada gaiola durante o período de exposição pode também ser determi ­
nada por gaiola, a título facultativo, pesando os distribuidores de alimentos. 
Os resultados de consumo de alimentos devem ser expressos em gramas diários por animal.
 
Dissecação e pesagem dos úteros  
44. Os animais devem ser eutanasiados 24 h após a última exposição. Ideal ­
mente, a ordem das autópsias deve ser aleatória no universo dos grupos, evitando seguir uma ordem crescente ou decrescente das doses, método que poderia afetar subtilmente os resultados. Constitui objetivo deste bioensaio 
determinar o peso do útero fresco e do útero enxuto. O peso fresco inclui o 
útero e o fluido luminal; o peso enxuto determina-se depois de pesado e removido o fluido luminal do útero.
 
45. Antes da dissecação, examina-se a vagina da cada animal imaturo, para 
determinar em que estado de abertura se encontra. A dissecação começa pela abertura da parede abdominal, com início na sínfise púbica. Em segui ­
da, separam-se os cornos uterinos e os ovários (se presentes) da parede 
abdominal dorsal. Separam-se também a bexiga urinária e os ureteres das faces laterais e ventral do útero e da vagina. Libertam-se as aderências fibrosas entre o reto e a vagina, até ser possível identificar a junção do 
orifício vaginal e da pele perineal. Separam-se o útero e a vagina do resto 
do corpo efetuando uma incisão na parede vaginal imediatamente acima da
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junção com a pele perineal, conforme se ilustra na figura 2. Retira-se o 
útero do corpo cortando cuidadosamente a ligação do mesentério uterino ao 
longo da face dorsal lateral de cada corno uterino. Uma vez extraído o útero do corpo, a manipulação destes tecidos deve ser suficientemente rápida para evitar que os mesmos sequem. A perda de peso por secagem adquire maior 
importância no caso de tecidos pequenos, como o útero (23). Se presentes, 
retiram-se os ovários, por corte ao nível do oviduto, procedendo de modo a evitar perdas de fluido luminal pelos cornos uterinos. Se o animal tiver sido ovariectomizado, deve verificar-se se os cotos cicatriciais contêm vestígios 
de tecido dos ovários. Devem eliminar-se os restos de gordura e de tecido 
conjuntivo. Separa-se a vagina do útero imediatamente abaixo do colo do útero, de modo que este fique solidário com o corpo uterino, como se ilustra na figura 2.
 
46. Deposita-se cada útero num recipiente tarado e com uma marcação indivi ­
dualizada (por exemplo uma placa de Petri ou uma cápsula de pesagem de plástico), continuando a tomar as precauções necessárias para impedir a 
secagem antes da pesagem (por exemplo, pode pôr-se em cada recipiente 
um papel de filtro ligeiramente embebido em soro fisiológico). Pesam-se o útero e o fluido luminal com a aproximação de 0,1 mg (peso húmido do 
útero).
 
47. Procede-se em seguida à eliminação do fluido luminal de cada útero. 
Furam-se ambos os cornos uterinos ou cortam-se os mesmos longitudinal ­
mente. Coloca-se cada útero sobre papel de filtro (por exemplo, Whatman 
n. o 3) ligeiramente humedecido e comprime-se cuidadosamente com um 
segundo papel de filtro, também ligeiramente humedecido, para remover completamente o fluido luminal. Pesa-se o útero sem o fluido luminal 
com a aproximação de 0,1 mg (peso enxuto do útero).
 
48. Pode utilizar-se o peso do útero no termo do ensaio para verificar se a idade 
adequada das fêmeas de rato imaturas não foi excedida, embora os dados 
históricos da estirpe de ratos utilizada pelo laboratório sejam determinantes quanto a este aspeto (para a interpretação dos resultados, ver o ponto 56).
 
Estudos facultativos  
49. Após pesagem, pode colocar-se cada útero em formol a 10 % tamponado a 
pH neutro, para posterior exame histopatológico após coloração com hema ­
toxilina e eosina. Pode examinar-se também a vagina (ver o ponto 9). Podem efetuar-se ainda medições morfométricas do epitélio do endométrio, para comparações quantitativas.
 
DADOS E RELATÓRIOS  
Dados  
50. Dados do estudo a fornecer:  
— número de animais no início do ensaio;  
— número e identidade dos animais que morreram ou foram eutanasiados 
durante o ensaio e data e hora de cada morte ou eutanásia;  
— número e identidade dos animais com sinais de toxicidade e descrição 
dos sinais de toxicidade observados, nomeadamente o momento do seu aparecimento e a duração e intensidade dos efeitos tóxicos detetados;
 
— número e identidade dos animais com lesões e descrição dos tipos de 
lesões.  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 825
 
51. Registam-se os dados correspondentes a cada animal no que respeita a peso 
corporal, peso uterino húmido e peso uterino enxuto. Deve recorrer-se a 
análises estatísticas unilaterais para determinar se a administração do pro ­
duto químico em estudo provocou um aumento com significado estatístico (p < 0,05) do peso do útero, provocado por um agonista. Devem efetuar-se 
análises estatísticas que permitam determinar se o peso húmido e o peso 
enxuto do útero sofreram alterações em consequência da exposição. Por exemplo, pode efetuar-se uma análise de covariância dos dados (ANCOVA), sendo o peso corporal na autópsia a covariável. Antes 
da análise dos dados, pode efetuar-se uma transformação logarítmica de 
estabilização da variância dos dados uterinos. O teste de Dunnett e Hsu pode servir para estabelecer comparações par a par entre cada grupo ex ­
posto e os grupos de controlo do veículo e para calcular os intervalos de 
confiança. Pode recorrer-se a traçados de resíduos estudantizados para de ­
tetar eventuais valores aberrantes e avaliar a homogeneidade das variâncias. Aplicaram-se estes métodos no programa de validação realizado pela OC ­
DE, com recurso ao processo dos modelos lineares gerais (PROC GLM) do 
sistema de análise estatística (SAS Institute, Cary, NC, EUA), versão 8 
(6)(7).
 
52. Informações a constar do relatório final:  
Instalações nas quais se realizaram os ensaios:  
— pessoal responsável e responsabilidades de cada um no estudo;  
— dados do estudo de base inicial de controlo positivo e dados periódicos 
de controlo positivo (ver os pontos 26 e 27).  
Produto químico em estudo:  
— caracterização dos produtos químicos em estudo;  
— natureza física e propriedades físico-químicas pertinentes;  
— método e frequência de preparação de diluições;  
— dados obtidos sobre a estabilidade;  
— análises das soluções administradas.  
Veículo:  
— caracterização do veículo utilizado no estudo (natureza, fornecedor e 
lote);  
— justificação da escolha do veículo (se não for água).  
Animais estudados:  
— espécie e estirpe utilizadas e justificação das opções tomadas;  
— fornecedor e instalações específicas do fornecedor;  
— idades na entrega e datas de nascimento;  
— no caso dos animais imaturos, se são fornecidos com as mães ou outras 
fêmeas aleitantes e data do desmame;  
— elementos relativos ao processo de aclimatação dos animais;  
— número de animais por gaiola;  
— método e elementos relativos à identificação de cada animal e de cada 
grupo.  
Condições de realização dos ensaios:  
— elementos relativos ao processo de aleatorização (método utilizado);  
— fundamentação da escolha das doses;  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 826
 
— elementos relativos à formulação, concentrações obtidas, estabilidade e 
homogeneidade do produto químico em estudo;  
— elementos relativos à administração do produto químico em estudo e 
fundamentação da via de exposição escolhida;  
— dieta (nome, tipo, fornecedor, composição e, se conhecidos, níveis de 
fitoestrogénios);  
— água fornecida (por exemplo, água da torneira ou água filtrada) e modo 
de fornecimento (tubagem a partir de um reservatório grande, garrafas, 
etc.);  
— camas (nome, tipo, fornecedor e composição);  
— registos das condições de engaiolamento, do período de iluminação, da 
temperatura e humidade ambientes, da limpeza do biotério;  
— descrição pormenorizada das autópsias e da pesagem dos úteros;  
— descrição dos métodos estatísticos utilizados.  
Resultados  
Por animal:  
— todos os pesos corporais diários (desde a integração num grupo até à 
autópsia do animal), com a aproximação de 0,1 g;  
— idade do animal (em dias, considerando dia 0 o do nascimento) no 
início da administração do produto químico em estudo;  
— data e hora da administração de cada dose;  
— volume e dose calculados administrados e registos de eventuais perdas 
durante ou depois da administração das doses;  
— estado diário do animal, incluindo os exames efetuados e os sintomas 
detetados;  
— causa presumida de morte (se o animal for encontrado moribundo ou 
morto durante o estudo);  
— data e hora da eutanásia e período decorrido desde a administração da 
última dose;  
— peso uterino húmido (com a aproximação de 0,1 mg) e eventuais regis ­
tos de perdas de fluido luminal durante a dissecação e a preparação para a pesagem;
 
— peso uterino enxuto (com a aproximação de 0,1 mg).  
Por grupo de animais:  
— pesos corporais médios diários (com a aproximação de 0,1 mg) e res ­
petivos desvios-padrão (desde a integração nos grupos até às autópsias);  
— pesos uterinos húmidos médios e pesos uterinos enxutos médios (com a 
aproximação de 0,1 mg) e respetivos desvios-padrão;  
— se for determinado, consumo diário de alimentos (calculado em gramas 
de alimentos consumidos por animal);  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 827
 
— resultados das análises estatísticas comparativas dos pesos uterinos hú ­
mido e enxuto dos grupos expostos com as determinações correspon ­
dentes nos grupos de controlo do veículo;  
— resultados das análises estatísticas comparativas do peso corporal total e 
do ganho de peso corporal dos grupos expostos com as determinações correspondentes nos grupos de controlo do veículo.
 
53. Resumo das principais orientações deste método de ensaio  
Rato Ratinho  
Animais  
Estirpe Estirpe habituais de roedores de laboratório Número de animais Pelo menos seis animais por grupo de dosagem Número de grupos Pelo menos dois grupos expostos (ver orientações no ponto 33) 
e um grupo de controlo negativo 
Ver orientações relativas aos grupos de controlo positivo nos 
pontos 26 e 27  
Condições de alojamento e de alimentação  
Temperatura do biotério 22 °C ± 3 °C 
Humidade relativa 50-60 %; não inferior a 30 % nem superior a 70 % Sequência de luz e de es ­
curidão 12 horas de luz seguidas de 12 horas de escuridão 
Dieta e água de beber Ad libitum 
Alojamento Individual ou em grupos de não mais de três animais (recomen ­
da-se que os animais imaturos sejam alojados em grupo) 
Dieta e camas Baixo nível de fitoestrogénios recomendado na dieta e nas ca ­
mas 
Protocolo  
Método Método (preferido) que recorre 
a fêmeas imaturas não ovariec ­
tomizadas 
Método que recorre a fêmeas 
adultas ovariectomizadas Método que recorre a fêmeas 
adultas ovariectomizadas 
Idade da exposição dos 
animais imaturos Não antes de 18 dias após o 
nascimento. Administração das doses a completar antes de 
transcorridos 25 dias após o 
nascimento. Não se aplica à presente versão 
do método. 
Idade da ovariectomia Entre 6 e 8 semanas 
Idade da exposição dos 
animais ovariectomizados Pelo menos 14 dias entre a 
ovariectomia e o primeiro dia de administração das doses Pelo menos 7 dias entre a ova ­
riectomia e o primeiro dia de administração das doses 
Peso corporal A variação deste parâmetro deve ser mínima, não devendo ex ­
ceder 20 % do peso médio
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 828
 
Rato Ratinho  
Administração das doses  
Via de administração Sonda esofágica ou injeção subcutânea 
Frequência da administra ­
ção Uma dose diária 
Volume administrado por 
sonda esofágica ou por in ­
jeção ≤ 5 ml/kg de peso corporal (ou até 10 ml/kg de peso corporal no 
caso das soluções aquosas) (injetados em dois locais, no caso da 
via subcutânea) 
Duração da administração 3 dias consecutivos no caso do 
modelo que recorre a fêmeas imaturas 
Pelo menos 3 dias consecuti ­
vos no caso do modelo que 
recorre a fêmeas adultas ova ­
riectomizadas 7 dias consecutivos no caso do 
modelo que recorre a fêmeas adultas ovariectomizadas 
Autópsia Cerca de 24 horas após a última dose  
Resultados  
Resposta positiva Aumento estatisticamente significativo do peso uterino médio 
(húmido e/ou enxuto) 
Estrogénio de referência 17 α-etinilestradiol
 
ORIENTAÇÕES PARA INTERPRETAÇÃO E ACEITAÇÃO DOS RE ­
SULTADOS  
54. Em geral, deve considerar-se que um estudo de atividade estrogénica deu 
resultado positivo se, pelo menos no grupo exposto à dose mais elevada, 
ocorrer um aumento do peso uterino estatisticamente significativo (p< 0,05), 
comparativamente ao grupo de controlo do solvente. Corrobora ainda um resultado positivo a demonstração de uma relação biologicamente plausível entre a dose e a intensidade da resposta, tendo em atenção que a conjugação 
dos efeitos estrogénicos e antiestrogénicos do produto químico em estudo 
pode afetar a forma da curva de resposta à dosagem.
 
55. A dose máxima tolerada não deve ser excedida, a fim de possibilitar uma 
interpretação com significado dos dados. Nessa perspetiva, devem avaliar-se cuidadosamente as reduções de peso corporal, os sinais clínicos e outros 
dados obtidos.
 
56. Um aspeto importante a ponderar para a aceitação dos dados de um bio ­
ensaio uterotrófico é a questão dos pesos uterinos dos animais do grupo de controlo do veículo. Se forem detetados pesos elevados no grupo de con ­
trolo, podem ficar comprometidas a sensibilidade do bioensaio e a capaci ­
dade de deteção de agonistas muito fracos de estrogénios. As referências 
bibliográficas e os dados obtidos na validação do bioensaio uterotrófico indicam a possibilidade de ocorrência espontânea de pesos médios elevados nos grupos de controlo, em especial quando se trata de animais imaturos 
(2)(3)(6)(9). Uma vez que o peso uterino das fêmeas de rato imaturas 
depende de muitas variáveis, como a estirpe e o peso corporal, não é possível estabelecer um limite superior preciso para esse parâmetro. A título indicativo, se o peso do útero enxuto das fêmeas de rato imaturas de 
controlo estiver compreendido entre 40 e 45 mg, os resultados devem ser 
considerados suspeitos; se esse peso exceder 45 mg, o ensaio poderá ter de ser repetido. Todavia, este aspeto tem de ser analisado caso a caso (3)(6)(8). No ensaio de fêmeas de rato adultas, uma ovariectomia incompleta deixará 
restos de tecidos dos ovários, que podem produzir estrogénios endógenos e 
atrasar a regressão do peso uterino.
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 829
 
57. A obtenção de pesos uterinos enxutos no grupo de controlo do veículo 
inferiores a 0,09 % do peso corporal, para fêmeas de rato imaturas, e 
inferiores a 0,04 % do peso corporal, para fêmeas adultas jovens ovariec ­
tomizadas, parece gerar resultados aceitáveis (ver o quadro 31 da referência 2). Se os pesos uterinos dos animais do grupo de controlo excederem estes 
valores, devem examinar-se vários fatores, nomeadamente a idade dos ani ­
mais, a qualidade da ovariectomia, a ocorrência de fitoestrogénios na dieta, etc., e deve encarar-se com precaução um resultado negativo no ensaio (nenhuma indicação de atividade estrogénica).
 
58. Os laboratórios devem conservar dados históricos dos grupos de controlo do 
veículo. Devem conservar igualmente dados históricos das respostas a es ­
trogénios de referência positivos, como o 17a-etinilestradiol. Os laboratórios podem igualmente ensaiar a resposta a agonistas reconhecidamente fracos de estrogénios. Para garantir que os métodos do laboratório em causa têm 
sensibilidade suficiente, podem comparar-se todos estes dados com os dados 
disponíveis (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8).
 
59. No estudo de validação realizado pela OCDE, os pesos uterinos enxutos 
evidenciaram menos variabilidade do que os pesos uterinos húmidos (6)(7). 
Todavia, considera-se que uma resposta significativa em qualquer destes 
parâmetros indica que o produto químico em estudo tem atividade estrogé ­
nica.  
60. A resposta uterotrófica não é inteiramente de origem estrogénica. Porém, 
um resultado positivo num bioensaio uterotrófico deve, geralmente, ser 
interpretado como prova de atividade estrogénica  in vivo  e, normalmente, 
deve dar lugar a uma pesquisa mais aprofundada (ver o ponto 9 e o  Quadro 
conceptual da OCDE para ensaio e avaliação de produtos químicos des ­
reguladores do sistema endócrino  — apêndice 2).  
Figura 1  
Desenho esquemático ilustrativo da ablação dos ovários
  
Começa-se por efetuar uma incisão na zona dorsal lateral da parede abdo ­
minal, no ponto intermédio entre o limite costal inferior e a crista ilíaca, 
afastada lateralmente alguns milímetros da orla lateral do músculo lombar. 
Localizam-se os ovários na cavidade abdominal. Retiram-se os ovários da cavidade abdominal para um campo assético, laqueia-se o canal entre cada ovário e o útero, para conter a hemorragia, e separam-se os ovários efe ­
tuando uma incisão acima do ponto de laqueação situado na junção de cada 
oviduto com o corno uterino. Depois de confirmar que não se verifica nenhuma hemorragia importante, sutura-se a parede abdominal e fecha-se a abertura na pele, por exemplo com agrafos ou por sutura. Os animais 
devem poder restabelecer-se e o peso do útero deve poder regredir durante, 
pelo menos, 14 dias, antes da utilização.
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 830
 
Figura 2  
Remoção e preparação dos tecidos uterinos para a pesagem
  
Começa-se por abrir a parede abdominal na sínfise púbica. Em seguida, 
separam-se ambos os ovários (se estiverem presentes) e os cornos uterinos da parede abdominal dorsal. Separam-se também a bexiga urinária e os ureteres das faces laterais e ventral do útero e da vagina. Libertam-se as aderências fibrosas 
entre o reto e a vagina, até ser possível identificar a junção do orifício vaginal e 
da pele perineal. Separam-se o útero e a vagina do resto do corpo efetuando uma incisão na parede vaginal imediatamente acima da junção com a pele perineal, conforme se ilustra na figura. Retira-se o útero do corpo cortando cuidadosa ­
mente a ligação do mesentério uterino ao longo da face dorsal lateral de cada 
corno uterino. Uma vez extraído o útero do corpo, eliminam-se os restos de gordura e de tecido conjuntivo. Se presentes, retiram-se os ovários por corte ao nível do oviduto, procedendo de modo a evitar perdas de fluido luminal pelos 
cornos uterinos. Se o animal tiver sido ovariectomizado, deve verificar-se se os 
cotos cicatriciais contêm vestígios de tecido dos ovários. Separa-se a vagina do útero imediatamente abaixo do colo do útero, de modo que este fique solidário com o corpo uterino, como se ilustra na figura. Pode então pesar-se o útero.
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 831
 
Apêndice 1  
DEFINIÇÕES  
Atividade antiestrogénica : capacidade do produto químico de suprimir a ação 
do 17ß-estradiol num mamífero.  
Produto químico : substância ou mistura.  
Data de nascimento : dia 0 após o nascimento.  
Dosagem : termo geral que abrange a dose, a frequência desta e a duração da 
administração da mesma.  
Dose : quantidade de produto químico em estudo administrada. No bioensaio 
uterotrófico, exprime-se em peso diário do produto químico em estudo por uni ­
dade de peso corporal do animal ensaiado (por exemplo mg/kg de peso corporal/ 
/dia).  
Dose máxima tolerável (DMT) : quantidade máxima do produto químico que, 
quando introduzida no organismo, não mata os animais em estudo (indicada por 
DL 0 ) (IUPAC, 1993).  
Atividade estrogénica : capacidade do produto químico de agir como o 17ß- 
-estradiol num mamífero.  
X dias após o nascimento : número X de dias de vida após o dia de nascimento.  
Sensibilidade : proporção dos produtos químicos positivos/ativos que são corre ­
tamente classificados pelo ensaio. Constitui uma medida da exatidão dos métodos de ensaio que geram resultados categóricos e é um aspeto importante a ter em 
conta na avaliação da pertinência de um método de ensaio.
 
Especificidade : proporção dos produtos químicos negativos/inativos que são 
corretamente classificados pelo ensaio. Constitui uma medida da exatidão dos métodos de ensaio que geram resultados categóricos e é um aspeto importante a 
ter em conta na avaliação da pertinência de um método de ensaio.
 
Produto químico em estudo : qualquer substância ou mistura à qual seja apli ­
cado este método de ensaio.  
Uterotrófico : termo usado para designar uma influência positiva no crescimento 
dos tecidos uterinos.  
Validação : processo científico concebido para caracterizar as limitações e as 
condições operatórias dos métodos de ensaio e para demonstrar a fiabilidade e a pertinência dos mesmos para determinado fim.
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 832
 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 833
 ▼M5 
Apêndice 2

 
NOTAS EXPLICATIVAS DO QUADRO CONCEPTUAL  
Nota 1:  É possível entrar no quadro e dele sair em qualquer nível, con ­
soante a natureza das informações necessárias para a avaliação dos 
perigos e dos riscos.  
Nota 2:  No nível 5, os métodos ecotoxicológicos devem integrar parâme ­
tros indicativos dos mecanismos dos efeitos indesejados e dos me ­
canismos das consequências negativas potenciais nas populações.  
Nota 3:  Se um modelo multimodal abranger vários dos ensaios de parâme ­
tro único, esse modelo substituirá estes últimos.  
Nota 4:  A avaliação de cada produto químico deve basear-se numa análise 
caso a caso que tenha em conta todas as informações disponíveis, 
tendo presente a função dos níveis do quadro.  
Nota 5:  Esta versão do quadro não deve ser considerada exaustiva. Nos 
níveis 3, 4 e 5, integra ensaios já disponíveis ou em validação. 
Estes últimos são incluídos a título provisório. Logo que estejam afinados e validados, serão formalmente integrados no quadro.
 
Nota 6:  Os ensaios integrados no nível 5 não devem considerar-se unica ­
mente de caráter definitivo. Os ensaios em questão contribuem para 
a avaliação geral dos perigos e dos riscos.  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 834
 
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B.55.  BIOENSAIO DE HERSHBERGER NO RATO: ENSAIO DE 
DESPISTAGEM A CURTO PRAZO DE PROPRIEDADES 
(ANTI)ANDROGÉNICAS  
INTRODUÇÃO  
1. Este método é equivalente ao  Test Guideline  TG 441 (2009) da OCDE. Em 
1998, a OCDE deu início a uma ação prioritária com vista à revisão das orientações existentes e à elaboração de novas orientações para despistagem 
e ensaio de potenciais desreguladores do sistema endócrino (1). Um dos 
elementos dessa ação foi a elaboração de um  Test Guideline  para o bio ­
ensaio de Hershberger no rato. Após várias décadas de utilização pela indústria farmacêutica, este ensaio foi pela primeira vez normalizado em 
1962, por uma comissão de peritos oficiais, como meio de despistagem de 
produtos químicos androgénicos (2). Entre 2001 e 2007, o bioensaio de Hershberger no rato foi objeto de um vasto programa de validação, que incluiu a elaboração de um documento-base de recensão (23), a compilação 
de um artigo pormenorizado sobre o método (3), a elaboração de um guia 
de dissecação (21) e a realização de amplos estudos intra e interlaboratoriais para verificar a fiabilidade e reprodutibilidade deste bioensaio. Os estudos 
de validação realizaram-se com um androgénio de referência muito ativo (o 
propionato de testosterona), dois androgénios sintéticos muito ativos (o acetato de trembolona e a metiltestosterona), um produto farmacêutico anti ­
androgénico muito ativo (a flutamida), um inibidor muito ativo da síntese 
da di-hidrotestosterona, o androgénio natural (a finasterida), vários pestici ­
das com fraca atividade antiandrogénica (linurão, vinclozolina, procimidona, p,p'-DDE), um inibidor muito ativo da 5 α-redutase (a finasterida) e dois 
produtos químicos reconhecidamente inativos (dinitrofenol e nonilfenol) 
(4)(5)(6)(7)(8). O presente método de ensaio resulta da longa experiência 
histórica na aplicação do bioensaio de Hershberger, da experiência adqui ­
rida no programa de validação do mesmo e da apreciação dos resultados obtidos nesse programa.
 
2. O bioensaio de Hershberger constitui um ensaio de despistagem  in vivo  a 
curto prazo em tecidos acessórios do aparelho reprodutor masculino. O ensaio remonta aos anos 30 e foi modificado nos anos 40 pela inclusão 
dos músculos do referido aparelho que respondem aos androgénios (2)(9- 
-15). Nos anos 60, avaliaram-se mais de 700 androgénios potenciais, recor ­
rendo a uma versão normalizada do protocolo (2)(14). Ainda nos anos 60, o 
método foi considerado um ensaio normalizado para androgénios e anti ­
androgénios (2)(15). O bioensaio atual baseia-se nas variações ponderais de cinco tipos de tecido dependentes dos androgénios em ratos peripúberes castrados. Avalia-se a capacidade de um produto químico de induzir uma 
atividade biológica análoga às dos agonistas ou antagonistas de androgénios 
ou dos inibidores da 5 α-redutase. Os cinco tipos de tecido dependentes dos 
androgénios utilizados neste método são a próstata ventral, as vesículas seminais (incluindo os fluidos e as glândulas coagulantes), o complexo 
formado pelos músculos elevatórios do ânus e bulbocavernosos, o par de 
glândulas de Cowper e a glande peniana. No rato peripúbere castrado, estes cinco tipos de tecido reagem aos androgénios aumentando de peso absoluto. Quando se estimulam os mesmos tecidos a aumentarem de peso por meio 
da administração de um androgénio de referência muito ativo, todos eles 
reagem aos antiandrogénios diminuindo de peso absoluto. O modelo pri ­
mário do bioensaio de Hershberger, validado nas fases 1, 2 e 3 do programa de validação do método, é o macho peripúbere castrado cirurgicamente.
 
3. O bioensaio de Hershberger serve de ensaio de despistagem mecanístico  in 
vivo de agonistas de androgénios, antagonistas de androgénios e inibidores 
da 5a-redutase, enquadrando-se a sua aplicação no contexto do  Quadro 
conceptual da OCDE para ensaio e avaliação de produtos químicos des ­
reguladores do sistema endócrino  (apêndice 2). Nesse quadro conceptual, o  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 838
 
bioensaio de Hershberger inscreve-se no nível 3, enquanto ensaio  in vivo  
que fornece dados acerca de um único mecanismo endócrino, a (anti)an ­
drogenicidade. O bioensaio de Hershberger destina-se a ser incluído numa série de ensaios  in vitro  e in vivo  que visam identificar produtos químicos 
suscetíveis de interagir com o sistema endócrino, tendo em vista a avaliação 
dos riscos para a saúde humana e para o ambiente.
 
4. Devido aos problemas de bem-estar animal colocados pela castração e a fim 
de evitar essa etapa, estudou-se como modelo alternativo para o ensaio de Hershberger o macho completo (não castrado) recentemente desmamado 
estimulado. O método com animais estimulados a seguir ao desmame foi 
validado (24). Porém, nos estudos de validação, a versão do ensaio de Hershberger que recorre a animais recentemente desmamados não se reve ­
lou adequada para detetar capazmente os efeitos ponderais das doses de 
antiandrogénios fracos ensaiadas em órgãos dependentes dos androgénios, 
não tendo, portanto, sido incluída no presente método. Todavia, conside ­
rando que a sua utilização pode ser vantajosa, não apenas no plano do bem-estar animal, mas também como fonte de informação sobre outros 
modos de ação, a referida versão do método de Hershberger consta do 
documento de orientações n.
 o 115 da OCDE (25).  
CONSIDERAÇÕES INICIAIS E LIMITAÇÕES  
5. Os agonistas e os antagonistas de androgénios agem como ligandos do 
recetor de androgénios e podem ativar ou inibir, respetivamente, a trans ­
crição de genes controlada pelo recetor. Por outro lado, alguns produtos 
químicos (inibidores da 5a-redutase) inibem a conversão da testosterona no androgénio natural mais ativo di-hidrotestosterona em alguns tecidos-alvo 
dos androgénios. Desses produtos químicos podem advir consequências 
negativas para a saúde, nomeadamente efeitos com incidências na reprodu ­
ção e no desenvolvimento. É, pois, necessário, do ponto de vista da regu ­
lamentação, poder determinar e avaliar rapidamente a capacidade agonista 
ou antagonista de androgénios, ou inibidora da 5a-redutase, revelada pelos 
produtos químicos. Embora constituam informações úteis, a afinidade de um ligando por um recetor de androgénios, medida pela ligação ao recetor, e a ativação da transcrição de genes relatores  in vitro  não são os únicos 
fatores determinantes de eventuais perigos. Constituem outros fatores deter ­
minantes a ativação ou desativação metabólicas após a entrada no organis ­
mo, a distribuição do produto químico pelos tecidos-alvo e a eliminação do produto químico do organismo. Daqui decorre a necessidade de despistar a 
eventual atividade dos produtos químicos  in vivo  em condições experimen ­
tais e de exposição adequadas. As avaliações  in vivo  são menos críticas se 
forem conhecidas as características ADME (absorção, distribuição, metabo ­
lismo e eliminação) do produto químico. Os tecidos dependentes dos an ­
drogénios reagem com um crescimento rápido e vigoroso à estimulação 
com androgénios, designadamente em ratos peripúberes castrados. Os roe ­
dores, nomeadamente o rato, também são amplamente utilizados nos estu ­
dos de toxicidade para caracterização de perigos. A versão do ensaio em 
ratos peripúberes castrados e nos cinco tecidos-alvo indicados adequa-se, 
pois, à despistagem  in vivo  de agonistas e antagonistas de androgénios e de 
inibidores da 5a-redutase.
 
6. O presente método baseia-se nos protocolos utilizados no estudo de valida ­
ção realizado pela OCDE que se revelaram fiáveis e reprodutíveis nos 
estudos intra e interlaboratoriais efetuados (4)(5)(6)(7)(8). O presente mé ­
todo contempla um protocolo para androgénios e um protocolo para anti ­
androgénios  
7. Embora a dose de propionato de testosterona utilizada para detetar anti ­
androgénios no programa de validação do bioensaio de Hershberger reali ­
zado pela OCDE tenha sido diferente de laboratório para laboratório (0,2 e 0,4 mg diários por quilograma, por injeção subcutânea), a capacidade de 
deteção de atividade antiandrogénica fraca ou forte pouco diferiu nestas 
duas variantes do protocolo. Todavia, é evidente que a dose de propionato de testosterona não deve ser tão elevada que bloqueie os efeitos dos anta ­
gonistas fracos de recetores de androgénios nem tão baixa que os tecidos 
androgénicos pouco cresçam, mesmo sem coadministração de um antiandro ­
génio.
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 839
 
8. A reação de crescimento de cada tecido dependente dos androgénios não é 
inteiramente de origem androgénica, pois há outros produtos químicos, além 
dos agonistas de androgénios, que podem alterar o peso de determinados tecidos. Porém, uma reação concomitante de crescimento de vários tecidos corrobora a hipótese de um mecanismo mais específico dos androgénios. 
Por exemplo, doses elevadas de estrogénios muito ativos podem aumentar o 
peso das vesículas seminais, mas os outros tecidos dependentes dos andro ­
génios, utilizados no ensaio, não reagirão da mesma maneira. Os produtos químicos antiandrogénicos podem agir como antagonistas dos recetores de 
androgénios ou como inibidores da 5a-redutase. Os efeitos dos inibidores da 
5a-redutase são variáveis, porque a conversão na di-hidrotestosterona, mais ativa, depende do tecido. Os antiandrogénios que inibem a 5 α — redutase, 
como a finasterida, têm efeitos mais pronunciados na próstata ventral do 
que noutros tecidos, comparativamente a antagonistas muito ativos de rece ­
tores de androgénios, como a flutamida. Esta diferença na resposta dos tecidos pode ser utilizada para distinguir modos de ação mediados por recetores de androgénios de modos de ação mediados pela 5 α — redutase. 
Além disso, os recetores de androgénios estão relacionados, em termos 
evolutivos, com os recetores de outras hormonas esteroides e outras hor ­
monas há que, quando administradas em doses suprafisiológicas elevadas, podem ligar-se a eles e desempenhar um papel antagonista dos efeitos do 
propionato de testosterona como ativador do crescimento (13). É ainda 
plausível que o reforço do metabolismo dos esteroides e a consequente diminuição da testosterona sérica reduzam o crescimento dos tecidos depen ­
dente dos androgénios. Por conseguinte, um resultado positivo no bioensaio 
de Hershberger deve, normalmente, ser avaliado com base na ponderação da 
suficiência de prova também em ensaios  in vitro , como ensaios de ligação 
aos recetores de androgénios e aos recetores de estrogénios e os correspon ­
dentes ensaios de ativação da transcrição, ou noutros ensaios  in vivo , nos 
quais se examinem tecidos-alvo similares dos androgénios, como o ensaio 
no macho púbere, o ensaio de 15 dias no macho adulto completo ou estudos com repetição da dose a 28 dias ou a 90 dias.
 
9. A experiência adquirida revela que os androgénios xenobióticos são mais 
raros do que os antiandrogénios xenobióticos. Consequentemente, é de prever que o bioensaio de Hershberger seja utilizado com maior frequência 
na despistagem de antiandrogénios. Todavia, pode recomendar-se a aplica ­
ção do protocolo de ensaio relativo aos androgénios a esteroides e a pro ­
dutos químicos análogos dos esteroides, bem como a produtos químicos para os quais a aplicação de métodos dos níveis 1 ou 2 do quadro concep ­
tual (apêndice 2) tenha dado indicações de possíveis efeitos androgénicos. 
Analogamente, os ensaios do nível 5 podem permitir observar efeitos in ­
desejáveis associados a perfis (anti)androgénicos, que aconselhem uma ava ­
liação destinada a verificar se o produto químico em causa age por via 
endócrina.
 
10. Pressupõe-se que todos os procedimentos com animais respeitarão as nor ­
mas locais de manipulação de animais. As descrições, nestes protocolos, dos cuidados a ter com os animais e do tratamento a dar aos animais são normas mínimas, prevalecendo, se for mais estrita, a regulamentação local, 
como a decorrente da Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu e do 
Conselho, de 22 de setembro de 2010, relativa à proteção dos animais utilizados para fins científicos (26). Para mais orientações sobre o trata ­
mento ético de animais, ver o documento da OCDE com a referência 17.
 
11. Tal como em qualquer bioensaio no qual se utilizem animais, deve 
ponderar-se cuidadosamente a necessidade de efetuar o presente estudo. 
São fundamentalmente duas as razões em que pode fundamentar-se a deci ­
são de realizar o estudo:  
— potencial de exposição elevado (nível 1 do quadro conceptual) ou in ­
dícios de atividade (anti)androgénica em ensaios  in vitro  (nível 2) que 
justifiquem a necessidade de investigar a ocorrência de tais efeitos  in 
vivo; 
— efeitos de natureza (anti)androgénica em ensaios  in vivo  dos níveis 4 ou 
5, que justifiquem a necessidade de investigar o modo de ação, por 
exemplo a fim de determinar se os efeitos em causa se devem a um 
mecanismo (anti)androgénico.  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 840
 
12. No apêndice 1 definem-se alguns conceitos utilizados neste método.  
PRINCÍPIO DO MÉTODO  
13. A sensibilidade do bioensaio de Hershberger radica na utilização de machos 
cuja produção de androgénios endógenos é mínima. Utilizam-se, para isso, 
machos castrados, prevendo um período adequado após a castração para que 
os tecidos visados readquiram um peso de base mínimo uniforme. Nestas circunstâncias, ao efetuar a despistagem da eventual atividade androgénica, os níveis de androgénios endógenos em circulação são baixos, o eixo hi ­
potálamo-hipófise-gónadas é incapaz de os repor por mecanismos de retro ­
ação, a capacidade de resposta dos tecidos é máxima e a variabilidade do peso inicial dos tecidos é mínima. Ao efetuar a despistagem da eventual atividade antiandrogénica, consegue-se que o ganho de peso dos tecidos 
seja maior se estes forem estimulados com um androgénio de referência. 
Em consequência disto, no bioensaio de Hershberger só são necessários seis animais por grupo de dosagem, ao passo que noutros ensaios, que recorram 
a machos púberes ou adultos completos, se recomendam 15 machos por 
grupo de dosagem.
 
14. A castração dos ratos peripúberes deve realizar-se de um modo adequado, 
mediante a aplicação de técnicas de anestesia e de assepsia aprovadas. Para eliminar o desconforto pós-operatório, devem administrar-se analgésicos nos primeiros dias após a cirurgia. Ao eliminar os mecanismos de retroação 
endócrinos compensatórios presentes no animal completo, que podem ate ­
nuar os efeitos dos androgénios e antiandrogénios administrados, e conco ­
mitantemente também a grande variabilidade dos níveis séricos de testoste ­
rona que se verificam de indivíduo para indivíduo, a castração melhora a 
precisão do ensaio na deteção de androgénios e antiandrogénios fracos. A 
castração reduz, portanto, o número dos animais necessários à despistagem das atividades endócrinas em apreço.
 
15. Na despistagem de uma possível atividade androgénica, administra-se o 
produto químico em estudo diariamente, por sonda esofágica ou injeção 
subcutânea, durante dez dias consecutivos, a, pelo menos, dois grupos de 
animais, sendo cada grupo exposto a um nível de dose diferente. Eutanasiam-se os animais cerca de 24 horas após lhes ser administrada a última dose. Um aumento com significado estatístico do peso de dois ou 
mais órgãos-alvo no caso dos grupos expostos ao produto químico em 
estudo, comparativamente ao grupo de controlo do veículo, constitui uma indicação de atividade androgénica potencial do produto químico em causa (ver o ponto 60). Androgénios como a trembolona, que não sofrem os 
efeitos da 5 α — redutase, afetam mais o complexo formado pelos músculos 
elevatórios do ânus e bulbocavernosos e a glande peniana do que o pro ­
pionato de testosterona, mas todos os tecidos devem aumentar de peso.
 
16. No rastreio de uma possível atividade antiandrogénica, administra-se o 
produto químico em estudo diariamente, por sonda esofágica ou injeção subcutânea, durante dez dias consecutivos, juntamente com doses diárias 
de propionato de testosterona (0,2 ou 0,4 mg diários por quilograma), por 
injeção subcutânea. Determinou-se no programa de validação que podem utilizar-se 0,2 ou 0,4 mg diários de propionato de testosterona por quilo ­
grama, dado que ambas as quantidades permitem detetar os antiandrogénios, 
devendo escolher-se uma destas doses para o ensaio. Administram-se doses 
crescentes constantes do produto químico em estudo a, pelo menos, três grupos de animais, sendo cada grupo exposto a um nível de dose diferente. Eutanasiam-se os animais cerca de 24 horas após lhes ser administrada a 
última dose. Um decréscimo com significado estatístico do peso de dois ou 
mais órgãos-alvo no caso dos grupos expostos ao produto químico em estudo e ao propionato de testosterona, comparativamente ao grupo de controlo ao qual apenas é administrado propionato de testosterona, constitui 
uma indicação de atividade antiandrogénica potencial do produto químico 
em causa (ver o ponto 61).
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 841
 
DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
Escolha da espécie e da estirpe  
17. Desde os anos 30 que se tem utilizado o rato nos bioensaios de Hers ­
hberger. Embora, em termos biológicos, seja plausível que as respostas 
do rato e do ratinho sejam semelhantes, optou-se pelo rato para os ensaios de Hershberger para tirar partido de 70 anos de experiência com o modelo do rato. Além disso, dado que os resultados do bioensaio de Hershberger 
podem constituir os preliminares de um estudo plurigeracional a longo 
prazo, torna-se possível utilizar animais da mesma espécie, estirpe e prove ­
niência em ambos os estudos.
 
18. Este protocolo permite que os laboratórios escolham a estirpe de rato que 
utilizam no ensaio, em geral a que cada laboratório utiliza normalmente. 
Podem utilizar-se as estirpes habituais de ratos de laboratório, mas não 
devem utilizar-se estirpes que atinjam a maturidade substancialmente mais tarde do que aos 42 dias de idade, dado que a castração de animais com 42 dias poderia inviabilizar a pesagem da glande peniana, que só pode ser 
efetuada depois da descolagem do prepúcio do resto de pénis. Por conse ­
guinte, salvo raras exceções, não devem utilizar-se estirpes derivadas do rato Fisher 344, cujo desenvolvimento sexual tem uma cronologia diferente 
da de outras estirpes mais frequentemente utilizadas, como a Sprague-Daw ­
ley ou a Wistar (16). Se for utilizada uma estirpe derivada do rato Fisher 344, o laboratório deve castrar os ratos com uma idade ligeiramente maior e terá de demonstrar a sensibilidade da estirpe por que tiver optado. Compete 
a cada laboratório justificar com clareza a escolha da estirpe de rato. Se o 
ensaio de despistagem constituir uma etapa preliminar de um estudo por via oral com repetição da dose, de um estudo dos efeitos na reprodução ou no desenvolvimento ou de um estudo a longo prazo, devem utilizar-se animais 
da mesma estirpe e proveniência em todos os casos.
 
Condições de alojamento e de alimentação  
19. Todos os procedimentos devem respeitar as normas locais de manipulação 
de animais de laboratório. As descrições, nestes protocolos, dos cuidados a ter com os animais e do tratamento a dar aos animais são normas mínimas, prevalecendo, se for mais estrita, a regulamentação local, como a decorrente 
da Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu e do Conselho, de 22 de 
setembro de 2010, relativa à proteção dos animais utilizados para fins científicos (26). A temperatura do biotério deve ser de 22 °C (± 3 °C). A humidade relativa não deve ser inferior a 30 % e, de preferência, não deve 
exceder 70 %, exceto durante a limpeza do biotério. Idealmente, deve pro ­
curar manter-se a humidade relativa entre 50 % e 60 %. A iluminação deve ser artificial, com uma sequência de 12 horas de luz seguidas de 12 horas de escuridão.
 
20. Por serem juvenis e porque os ratos são animais sociais, recomenda-se o 
alojamento em gaiolas coletivas e não individualmente. O alojamento de 
dois ou três animais por gaiola evita a concentração e as tensões que lhe estão associadas, as quais podem interferir no controlo hormonal do desen ­
volvimento dos tecidos acessórios do aparelho sexual. As gaiolas devem ser 
cuidadosamente limpas para remover eventuais contaminantes e ser dispos ­
tas de forma a minimizar possíveis efeitos derivados do seu posicionamento. Devem ter tamanho suficiente para os animais que nelas se alojam (super ­
fície de aproximadamente 2 000 cm
 2 ). 
21. Deve identificar-se individualmente cada animal recorrendo a um método 
não-agressivo (por exemplo por marcação ou etiqueta auricular). O método 
de identificação deve ser mencionado no relatório.  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 842
 
22. Os animais devem receber  ad libitum  uma dieta de laboratório e água de 
beber. O laboratório deve utilizar no bioensaio de Hershberger a dieta de 
laboratório a que normalmente recorre no seu trabalho experimental com produtos químicos. Nos estudos de validação deste bioensaio, não se dete ­
taram efeitos nem variabilidades atribuíveis à dieta. A dieta utilizada deve 
ser referida no relatório. Deve conservar-se uma amostra dessa dieta para a 
realização das análises que possam vir a ser necessárias.
 
Requisitos aplicáveis ao peso dos órgãos dependentes dos androgénios  
23. No estudo de validação, não houve indícios de que uma diminuição do peso 
corporal tivesse incidências no aumento ou na diminuição do ganho de peso dos tecidos-alvo (os tecidos que está previsto pesar neste estudo).
 
24. O peso dos órgãos dependentes dos androgénios das várias estirpes de rato 
utilizadas com êxito no programa de validação revelou-se maior nas estirpes mais corpulentas do que nas estirpes mais leves. Por conseguinte, não se 
incluem nos requisitos do bioensaio de Hershberger pesos absolutos previ ­
síveis dos órgãos dos animais de controlo positivo e negativo.
 
25. Uma vez que o coeficiente de variação de um tecido é inversamente pro ­
porcional ao poder estatístico, os requisitos do bioensaio de Hershberger 
baseiam-se em coeficientes de variação máximos admissíveis para cada tecido (quadro 1). Os coeficientes de variação indicados no quadro resul ­
taram dos estudos de validação realizados pela OCDE. No caso de resul ­
tados negativos, o laboratório deve examinar os coeficientes de variação do 
grupo de controlo e do grupo exposto à dose mais elevada, a fim de determinar se os requisitos de coeficiente de variação máximo foram excedidos.
 
26. Deve repetir-se o estudo nos seguintes casos: 1) três ou mais dos dez 
coeficientes de variação possíveis no grupo de controlo e no grupo exposto 
à dose mais elevada excedem os máximos indicados nos quadros 1 para os 
estudos de agonistas e de antagonistas e 2) pelo menos dois tecidos-alvo são marginalmente não-significativos, isto é, apresentam valores de r compreen ­
didos entre 0,05 e 0,10.
 
Quadro 1  
Coeficientes de variação máximos admissíveis, determinados nos 
estudos de validação realizados pela OCDE, para os tecidos-alvo acessórios do aparelho sexual, aplicáveis ao modelo com ratos 
castrados  (
 1 ) 
Tecido Efeitos antiandrogéni ­
cos Efeitos androgénicos  
Vesículas seminais 40 % 40 % 
Próstata ventral 40 % 45 % 
Complexo formado pelos 
músculos elevatórios do ânus 
e bulbocavernosos 20 % 30 % 
Glândulas de Cowper 35 % 55 % 
Glande peniana 17 % 22 %  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 843  
( 1 ) Determinou-se o limite máximo de coeficiente de variação correspondente a cada tecido 
a partir de um gráfico dos valores dos coeficientes de variação — organizados sequen ­
cialmente do menor ao maior — correspondentes a todas as médias de todas as expe ­
riências realizadas a um determinado modelo (agonista ou antagonista) durante os estu ­
dos de validação. Considerou-se que o coeficiente de variação máximo correspondia ao 
ponto — dito «de viragem» — a partir do qual os incrementos entre os coeficientes de 
variação mais elevados imediatos da série passavam a ser claramente maiores do que os 
existentes entre os coeficientes de variação imediatamente anteriores na série. Importa 
referir que, embora esta análise tenha permitido identificar pontos de viragem relativa ­
mente fiáveis para o modelo «antagonista» do ensaio, as curvas dos coeficientes de 
variação dos ensaios de agonistas revelaram incrementos mais uniformes, pelo que os 
coeficientes de variação máximos identificados por este método são algo arbitrários neste 
último caso.
 PROCEDIMENTO DE ENSAIO  
Respeito da regulamentação e verificações no laboratório  
27. Ao contrário do que se passa com o ensaio uterotrófico (capítulo B.54 deste 
anexo), no caso do bioensaio de Hershberger é desnecessário demonstrar a 
competência do laboratório antes do início do estudo, porque este ensaio compreende, em paralelo, o ensaio de um controlo positivo (propionato de testosterona e flutamida) e de um controlo negativo.
 
Número e estado dos animais  
28. O número mínimo de animais de cada grupo exposto ou de controlo é de 
seis, tanto no caso do protocolo para androgénios como do protocolo para 
antiandrogénios.  
Castração  
29. Após a receção dos animais, deve existir um período inicial de aclimatação 
de vários dias, para verificar se os mesmos se encontram em boas condições de saúde e de vitalidade. Dado que, nos animais castrados com menos de 42 dias de idade (ou antes de transcorridos 42 dias após o nascimento), o 
descolamento do prepúcio pode não ter ocorrido, a castração deve 
realizar-se 42 dias após o nascimento ou em data posterior. Os animais são castrados sob anestesia. Efetua-se uma incisão no escroto, removem-se os testículos e os epidídimos e laqueiam-se os vasos sanguí ­
neos e os canais seminíferos. Depois de confirmar que não há sangramento, 
fecha-se o escroto por sutura ou com agrafos. Para eliminar o desconforto pós-operatório, devem administrar-se analgésicos aos animais nos primeiros dias após a cirurgia. Se os animais forem adquiridos a um fornecedor já 
castrados, este deve garantir a idade e o estádio de maturidade sexual dos 
mesmos.
 
Aclimatação após castração  
30. Para possibilitar a regressão do peso dos tecidos-alvo, os animais devem 
prosseguir a aclimatação às condições do laboratório durante um período mínimo de sete dias após a castração. Devem ser examinados diariamente e 
os que apresentem sinais de doenças ou de anomalias físicas devem ser 
retirados. A exposição às doses em estudo pode, portanto, iniciar-se 49 dias após o nascimento, mas não depois dos 60 dias de idade. A idade dos animais no dia da autópsia não deve ser superior a 70 dias. Esta flexibili ­
dade permite que os laboratórios programem com eficiência o trabalho 
experimental.
 
Aleatorização do peso corporal e dos grupos  
31. As diferenças de peso corporal de rato para rato são uma fonte de variabi ­
lidade do peso dos tecidos em cada grupo e entre os grupos de animais. O aumento da variabilidade do peso dos tecidos faz aumentar o coeficiente de variação e diminui o poder estatístico do ensaio (por vezes designado 
«sensibilidade do ensaio»). Importa, portanto, limitar as variações de peso 
corporal, tanto no plano experimental como no plano estatístico.
 
32. No plano experimental, é necessário reduzir as diferenças de peso corporal 
em cada grupo e entre os grupos em estudo. Em primeiro lugar, os animais anormalmente pequenos ou anormalmente grandes não devem participar no estudo. No início do estudo, as diferenças de peso entre animais não devem 
exceder ± 20 % do peso médio (por exemplo, 175 g ± 35 g no caso dos 
ratos peripúberes castrados). Em segundo lugar, integram-se os animais nos grupos expostos e de controlo procedendo a uma distribuição aleatória de pesos, de maneira que o peso corporal médio de cada grupo não difira 
estatisticamente do peso corporal médio de qualquer outro grupo. Deve 
mencionar-se no relatório o protocolo de aleatorização por blocos utilizado.
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33. Dado que a toxicidade pode diminuir o peso corporal dos animais dos 
grupos expostos comparativamente ao dos animais dos grupos de controlo, 
pode utilizar-se como covariável estatística o peso corporal no primeiro dia de administração do produto químico em estudo — e não o peso corporal no dia da autópsia.
 
Dosagem  
34. Normalmente, dois grupos de dosagem do produto químico em estudo, 
juntamente com um grupo de controlo positivo e um grupo de controlo do veículo (negativo) (ver o ponto 43), são suficientes para determinar se o produto químico pode ter atividade androgénica  in vivo . Por razões de 
bem-estar animal, privilegia-se, portanto, este modelo. No caso de se pre ­
tender traçar uma curva da relação entre a dose administrada e a resposta obtida ou efetuar uma extrapolação para doses mais baixas, são necessários, pelo menos, três grupos de dosagem. No caso de se pretender obter infor ­
mações que vão além de uma identificação de atividade androgénica (como, 
por exemplo, uma estimativa do poder androgénico), deve ponderar-se um regime de dosagem diferente. Na despistagem de antiandrogénios, administra-se o produto químico em estudo juntamente com um agonista 
de androgénios de referência. Neste caso, devem utilizar-se, pelo menos, 
três grupos, expostos a doses diferentes do produto químico em estudo, juntamente com um grupo de controlo positivo e um grupo de controlo negativo (ver o ponto 44). Salvo no que respeita à exposição ao produto 
químico em estudo, os animais dos grupos de controlo devem ser tratados 
do mesmo modo que os animais dos grupos ensaiados. Se for utilizado um veículo para administrar o produto químico em estudo, os animais do grupo de controlo devem receber o volume máximo de veículo utilizado nos 
grupos ensaiados.
 
35. Na escolha das doses devem ter-se em conta os dados eventualmente dis ­
poníveis sobre a toxicidade e a (toxico)cinética do produto químico em estudo ou de matérias afins. Para se estabelecer o nível de dose mais 
elevado, deve atender-se, em primeiro lugar, à DL
 50 e/ou aos dados sobre 
toxicidade aguda de que se disponha, a fim de evitar a morte dos animais e de os poupar a grande sofrimento ou aflição (17)(18)(19)(20), e, em se ­
gundo lugar, às informações disponíveis sobre as doses utilizadas em estu ­
dos de toxicidade subcrónica ou crónica. Em geral, a dose mais elevada não 
deve provocar uma redução do peso corporal final dos animais superior a 10 % do peso dos animais do grupo de controlo. A dose mais elevada deve ser 1) a dose máxima à qual os animais sobrevivem e que não lhes causa 
efeitos tóxicos nem sofrimento significativos após dez dias consecutivos de 
administração, sem exceder a dose máxima diária de 1 000 mg/kg (ver o ponto 36), ou 2) uma dose inferior indutora de efeitos (anti)androgénicos. A título exploratório, aceitam-se intervalos largos (por exemplo, meia unidade 
logarítmica, correspondente a um fator de progressão das doses de 3,2, ou 
mesmo uma unidade logarítmica) entre as doses administradas. Se não se dispuser de dados adequados para o efeito, pode efetuar-se um estudo exploratório (ver o ponto 37), para facilitar a determinação das doses a 
utilizar.
 
Dose-limite  
36. Se o ensaio da dose-limite de 1 000 mg diários por quilograma de peso 
corporal e de uma dose inferior a esta, aplicando os protocolos descritos para este estudo, não gerar uma diferença estatisticamente significativa entre 
os pesos correspondentes dos órgãos reprodutores, pode considerar-se des ­
necessário ensaiar outras doses. A dose-limite aplica-se a todos os casos, exceto se os dados relativos à exposição humana aconselharem o ensaio de doses superiores.
 
Estudo exploratório  
37. Se necessário, pode efetuar-se um estudo exploratório preliminar com pou ­
cos animais, para escolher os grupos de dosagem apropriados [recorrendo aos métodos de ensaio da toxicidade aguda — capítulos B.1.bis e B.1.tris deste anexo (27),  Test Guideline  425 da OCDE (19)]. O objetivo, no caso 
do bioensaio de Hershberger, é selecionar doses que garantam a sobrevi ­
vência dos animais e não lhes provoquem efeitos tóxicos nem sofrimento
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significativos após dez dias consecutivos de administração do produto quí ­
mico, até à dose-limite diária de 1 000 mg/kg como referido nos pontos 35 
e 36. Para o efeito, pode utilizar-se um documento de orientações da OCDE (17) que define os sinais clínicos da toxicidade ou do sofrimento provoca ­
dos em animais. Se for possível fazê-lo nesse estudo exploratório, após dez 
dias de administração das doses procede-se à excisão e pesagem dos 
tecidos-alvo cerca de 24 horas após a última dose. Estes dados podem ser depois utilizados para escolher as doses a utilizar no estudo principal.
 
Produtos químicos de referência e veículo  
38. O agonista de androgénios de referência é o propionato de testosterona 
(n. o CAS 57-82-5). A dose deste agonista de referência pode ser 0,2 mg 
ou 0,4 mg diários por quilograma de peso corporal. O antagonista de 
androgénios de referência é a flutamida (n.  o CAS 1311-84-7). A dose deste 
antagonista de referência, coadministrada com a dose do propionato de testosterona de referência, deve ser de 3 mg diários por quilograma de peso corporal.
 
39. Sempre que possível, deve começar por ponderar-se a possibilidade de se 
utilizarem soluções/suspensões aquosas. Porém, dado que os ligandos de androgénios ou os precursores metabólicos dos mesmos são geralmente 
hidrófobos, normalmente utiliza-se uma solução ou suspensão oleosa (por 
exemplo, em óleo de milho, de amendoim ou de gergelim ou em azeite). Pode dissolver-se o produto químico em estudo numa quantidade mínima de etanol a 95 % ou de outro solvente adequado, diluindo-se depois até à 
concentração final no veículo a utilizar nos ensaios. É necessário conhecer 
as características de toxicidade do solvente e verificá-las num grupo de controlo apenas exposto ao solvente. Se o produto químico em estudo for considerado estável, pode favorecer-se a sua dissolução aquecendo ligeira ­
mente e agitando vigorosamente. Deve determinar-se a estabilidade do pro ­
duto químico em estudo no veículo utilizado. Se o produto químico em estudo se mantiver estável durante todo o estudo, podem preparar-se uma alíquota inicial do mesmo e, diariamente, as diluições às doses necessárias, 
tomando as precauções necessárias para evitar a contaminação ou a dete ­
rioração das amostras.
 
Administração das doses  
40. Administra-se o propionato de testosterona por injeção subcutânea e a 
flutamida por sonda esofágica.  
41. Administra-se o produto químico em estudo por sonda esofágica ou por 
injeção subcutânea. Ao escolher a via de administração, é necessário atender aos aspetos do bem-estar animal e ter em conta as propriedades físico- -químicas do produto químico em estudo. Além disso, caso se obtenham 
resultados positivos por injeção, deve atender-se a aspetos toxicológicos 
como a relação com a via de exposição humana ao produto químico (por exemplo, sonda esofágica para exposição por ingestão e injeção subcutânea para exposição por inalação ou por adsorção cutânea), bem como às infor ­
mações toxicológicas e aos dados metabólicos e cinéticos disponíveis (por 
exemplo, a necessidade de evitar metabolismos de primeira passagem ou melhor eficiência de uma determinada via de administração), antes de efe ­
tuar ensaios aprofundados a longo prazo.
 
42. Devem administrar-se as doses aos animais da mesma maneira e com a 
mesma cronologia durante dez dias consecutivos, com intervalos de apro ­
ximadamente 24 horas. A dosagem deve ajustar-se diariamente com base 
nas determinações quotidianas concomitantes do peso corporal. Deve 
registar-se o volume e o momento da administração de cada dose em cada dia de exposição A dose máxima indicada no ponto 35 não deve ser excedida, a fim de possibilitar uma interpretação com significado dos 
dados. Nessa perspetiva, devem avaliar-se cuidadosamente as reduções de 
peso corporal, os sinais clínicos e outros dados obtidos. A administração
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forçada aos animais através de sonda esofágica deve efetuar-se por meio de 
um tubo estomacal ou de uma cânula de intubação adequada. O volume 
máximo de líquido que pode ser administrado de cada vez depende do tamanho do animal. Devem respeitar-se as normas locais de manipulação de animais, mas o volume administrado não deve exceder 5 ml por quilo ­
grama de peso corporal, salvo no caso das soluções aquosas, em que se 
permitem 10 ml por quilograma de peso corporal. No caso das injeções subcutâneas, as doses devem ser administradas na região escapular dorsal ou na região lombar, por meio de uma seringa do tipo utilizado no teste da 
tuberculina (calibre 23 ou 25), dotada de uma agulha esterilizada. É facul ­
tativo rapar a pelagem dos animais no local da injeção. Devem registar-se as perdas ou escorrimentos nesse local, bem como todas as administrações incompletas de doses. O volume injetado diariamente a um rato não deve 
exceder 0,5 ml por quilograma de peso corporal.
 
Protocolo específico para agonistas de androgénios  
43. No ensaio de agonistas de androgénios, o veículo deve ser utilizado como 
controlo negativo e o grupo exposto ao propionato de testosterona como controlo positivo. Verifica-se se o produto químico em estudo tem atividade biológica de agonista de androgénios administrando as doses escolhidas do 
mesmo a grupos de animais durante dez dias consecutivos. Compara-se o 
peso de cada um dos cinco tecidos acessórios do aparelho sexual dos animais dos grupos expostos ao produto químico em estudo com o dos animais do grupo de controlo do veículo, a fim de determinar se houve 
algum aumento de peso com significado estatístico.
 
Protocolo específico para antagonistas de androgénios e inibidores da 
5α-redutase  
44. No ensaio de antagonistas de androgénios e de inibidores da 5 α-redutase, o 
grupo exposto ao propionato de testosterona constitui o controlo negativo e o grupo coadministrado com doses de referência de propionato de testos ­
terona e flutamida constitui o controlo positivo. Verifica-se a existência de 
atividade biológica de antagonista de androgénios e de inibidor da 5 α-re­
dutase administrando o produto químico em estudo durante dez dias con ­
secutivos, juntamente com uma dose de referência de propionato de testos ­
terona. Compara-se o peso de cada um dos cinco tecidos acessórios do 
aparelho sexual dos animais dos grupos expostos ao produto químico em estudo e ao propionato de testosterona com o dos animais do grupo exposto unicamente ao propionato de testosterona de referência, a fim de determinar 
se houve alguma diminuição de peso com significado estatístico.
 
EXAMES  
Exames clínicos  
45. Deve efetuar-se um exame clínico geral pelo menos uma vez por dia; se 
forem detetados sinais de toxicidade, o exame deve ser mais frequente. De preferência, os exames devem ser efetuados à mesma hora ou às mesmas horas do dia, tendo em atenção o período previsto de efeitos mais acentua ­
dos após a administração do produto químico. Devem examinar-se todos os 
animais de modo a detetar os casos de mortalidade e morbilidade e sinais clínicos gerais como mudanças de comportamento, alterações da pele, da pelagem, dos olhos ou das mucosas e a ocorrência de secreções ou excre ­
ções e de reações neurovegetativas (por exemplo lacrimação, horripilação, 
alterações da dimensão pupilar, respiração anormal, etc.).
 
46. Os animais que morram devem ser retirados e eliminados sem análise de 
dados. Devem indicar-se no relatório do estudo a mortalidade de animais antes da autópsia e as razões aparentes de cada morte. Os animais mori ­
bundos devem ser eutanasiados. Os animais eutanasiados por estarem mo ­
ribundos devem ser indicados no relatório do estudo, juntamente com as 
razões aparentes da morbilidade.
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Peso corporal e consumo de alimentos  
47. Deve pesar-se diariamente cada animal com a aproximação de 0,1 g, co ­
meçando imediatamente antes do início da exposição, isto é, quando da 
repartição dos animais pelos grupos. A quantidade de alimentos consumida em cada gaiola durante o período de exposição pode também ser determi ­
nada por gaiola, a título facultativo, pesando os distribuidores de alimentos. 
Os resultados de consumo de alimentos devem ser expressos em gramas 
diários por animal.
 
Dissecação e pesagem dos tecidos e órgãos  
48. Aproximadamente 24 horas após a última administração do produto quí ­
mico em estudo, eutanasiam-se e sangram-se os ratos pelo procedimento 
normal do laboratório, passando-se em seguida à autópsia. O método de eutanásia deve ser referido no relatório do laboratório.
 
49. Idealmente, a ordem das autópsias deve ser aleatória no universo dos gru ­
pos, evitando seguir uma ordem crescente ou decrescente das doses, método que poderia afetar os resultados. As constatações da autópsia, por exemplo modificações patológicas e lesões visíveis, devem ser anotadas e posterior ­
mente referidas no relatório.
 
50. Devem pesar-se os cinco tecidos dependentes dos androgénios (próstata 
ventral, vesículas seminais, incluindo as glândulas coagulantes, complexo 
formado pelos músculos elevatórios do ânus e bulbocavernosos, glândulas 
de Cowper e glande peniana). Para isso, excisam-se os tecidos em causa, retiram-se cuidadosamente os outros tecidos e a gordura aderentes e determinam-se os respetivos pesos em fresco (tecidos não fixados). Cada 
tecido deve ser manipulado com cuidados especiais para evitar perdas de 
fluidos e a secagem do mesmo, que, ao reduzirem os pesos registados, podem introduzir erros e variabilidade significativos. Alguns tecidos podem ter dimensões muito reduzidas ou ser difíceis de dissecar, ambas as circuns ­
tâncias fonte de variabilidade. É, portanto, importante que os dissecadores 
dos tecidos acessórios do aparelho sexual estejam familiarizados com pro ­
cedimentos normalizados de dissecação dos mesmos. A OCDE publicou um manual de procedimentos normalizados de dissecação (21). Uma formação 
cuidadosa baseada nesse manual minimizará esta fonte potencial de varia ­
bilidade no estudo. Idealmente, o prossector de um dado tecido deve ser sempre o mesmo, para eliminar as diferenças de pessoa para pessoa no tratamento dos tecidos. Se isso não for possível, o programa das autópsias 
deve ser organizado de modo que cada prossector fique incumbido de 
dissecar um determinado tecido de todos os grupos expostos e não de modo que um prossector fique incumbido de dissecar todos os tecidos do(s) grupo(s) de controlo, ficando outro incumbido dos grupos expostos. Deve 
pesar-se cada tecido acessório do aparelho sexual com a aproximação de 0,1 
mg, sem o desumedecer previamente, registando os pesos obtidos para cada animal.
 
51. Alguns tecidos podem ter dimensões muito reduzidas ou ser difíceis de 
dissecar, ambas as circunstâncias fonte de variabilidade. Estudos anteriores revelaram que o intervalo dos coeficientes de variação obtidos parece de ­
pender da competência do laboratório. Em alguns casos, obtiveram-se gran ­
des diferenças nos pesos absolutos dos tecidos, nomeadamente da próstata 
ventral e das glândulas de Cowper, determinados no mesmo laboratório.
 
52. A pesagem do fígado, dos rins e das glândulas suprarrenais é facultativa. 
Novamente, devem retirar-se todas as aderências de tecidos fasciais ou de 
gordura. O fígado deve ser pesado e o seu peso registado com a aproxi ­
mação de 0,1 g; os rins e as glândulas suprarrenais, com a aproximação de 0,1 mg. O fígado, os rins e as glândulas suprarrenais não são influenciadas 
pelos androgénios, mas também fornecem indicadores úteis de toxicidade 
sistémica.
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53. A determinação dos teores séricos de hormona luteinizante (LH), de hor ­
mona foliculoestimulante (FSH) e de testosterona (T) é facultativa. Os 
teores séricos de testosterona são úteis para determinar se o produto quí ­
mico em estudo induz o metabolismo hepático da testosterona, baixando os níveis séricos desta. Sem estes dados relativos à testosterona, esse efeito 
poderia parecer advir de um mecanismo antiandrogénico. Os teores de 
hormona luteinizante dão informações acerca da capacidade de um anti ­
androgénio, não apenas de reduzir o peso dos órgãos, mas também de afetar a função do eixo hipotálamo-hipófise, o que, segundo estudos a longo 
prazo, pode induzir tumores nos testículos. A hormona foliculoestimulante 
é importante na espermatogénese. A determinação dos teores séricos de T4 e T3 são igualmente análises facultativas capazes de fornecer informações complementares úteis acerca da capacidade de desregulação da homeostase 
das hormonas tiroideias. No caso de se pretender efetuar análises hormo ­
nais, anestesiam-se os ratos antes da autópsia e colhem-se amostras de sangue por punção cardíaca. O método de anestesia deve ser escolhido com cuidado, para que não afete as análises hormonais. Devem indicar-se 
no relatório o método de preparação do soro, a proveniência dos  kits para os 
ensaios radioimunológicos ou para outras técnicas de medição, os protoco ­
los analíticos e os resultados obtidos. Os teores de hormona luteinizante e de testosterona devem ser indicados em nanogramas por mililitro de soro.
 
54. Descreve-se a seguir o modo de proceder à dissecação dos tecidos, baseado 
no guia pormenorizado da dissecação, com fotografias, que foi publicado 
como suplemento no âmbito do programa de validação (21). A página Web 
da Food and Drug Administration  da Coreia contém igualmente uma hi ­
perligação para uma filmagem de uma dissecação (22).  
— Com o ventre do animal voltado para cima, verificar se o prepúcio está 
descolado da glande peniana. Se assim for, recolher o prepúcio e cortar a glande, pesando-a com a aproximação de 0,1 mg e registando o peso 
determinado.
 
— Efetuar um corte na pele e na parede abdominais, de modo a expor as 
vísceras. Se estiver prevista a pesagem dos órgãos facultativos, retirar o 
fígado, pesando-o com a aproximação de 0,1 g; em seguida, retirar o estômago e os intestinos e depois os rins e as glândulas suprarrenais, pesando-as aos pares com a aproximação de 0,1 mg. Esta dissecação 
expõe a bexiga e constitui o início da dissecação dos tecidos-alvo aces ­
sórios do aparelho sexual.
 
— Para dissecar a próstata ventral, separar a bexiga da camada muscular 
ventral cortando o tecido conjuntivo ao longo da linha mediana. Des ­
locar a bexiga no sentido anterior, para o lado das vesículas seminais, de modo a mostrar os lóbulos esquerdo e direito da próstata ventral (co ­
bertos por uma camada de gordura). Raspar cuidadosamente a gordura 
dos lóbulos esquerdo e direito da próstata ventral. Afastar cuidadosa ­
mente da uretra o lóbulo direito, dissecando-o daquela. Segurando o lóbulo direito da próstata ventral, afastar cuidadosamente da uretra o 
lóbulo esquerdo, dissecando-o igualmente daquela. Pesar com a aproxi ­
mação de 0,1 mg e registar o peso.
 
— Para dissecar as vesículas seminais juntamente com as glândulas coa ­
gulantes, deslocar a bexiga no sentido caudal, expondo os canais defe ­
rentes e os lóbulos esquerdo e direito do conjunto formado pelas vesí ­
culas seminais e pelas glândulas coagulantes. Para evitar fugas de flui ­
dos, aplicar uma pinça homeostática na base deste conjunto, na con ­
fluência com a uretra. Dissecar cuidadosamente as vesículas seminais e as glândulas coagulantes; mantendo as pinças aplicadas, remover a gor ­
dura e os tecidos aderentes; colocar os tecidos-alvo numa cápsula de 
pesagem previamente tarada, retirar as pinças e pesar com a aproxima ­
ção de 0,1 mg, registando o peso obtido.
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— Para dissecar o complexo formado pelos músculos elevatórios do ânus e 
bulbocavernosos, é necessário expor esses músculos e a base do pénis. 
Os músculos elevatórios do ânus rodeiam o cólon, ao passo que a parte anterior dos mesmos e os músculos bulbocavernosos estão ligados aos bolbos penianos. Remove-se a pele e os tecidos aderentes da região 
perianal que se estende da base do pénis à extremidade anterior do 
ânus. Dissecam-se gradualmente os músculos bulbocavernosos dos bol ­
bos penianos e dos outros tecidos. Corta-se o cólon em dois, podendo assim dissecar-se e remover-se todo o complexo formado pelos múscu ­
los elevatórios do ânus e bulbocavernosos. Removem-se a gordura e os 
tecidos aderentes a esses músculos e pesam-se estes últimos com a aproximação de 0,1 mg, registando o peso obtido.
 
— Depois de removido o complexo formado pelos músculos elevatórios do 
ânus e bulbocavernosos, ficam visíveis as glândulas de Cowper ou 
bulbouretrais, de forma arredondada, situadas na base dos bolbos penia ­
nos, em posição ligeiramente dorsal. É necessário proceder cuidadosa ­
mente à dissecação, para evitar danificar a cápsula, cuja superfície é fina, e assim impedir a fuga de fluidos. Pesar o conjunto das duas 
glândulas de Cowper com aproximação de 0,1 mg e registar o peso 
obtido.
 
— Se houver alguma perda de fluidos de alguma glândula durante a au ­
tópsia e a dissecação é necessário referi-lo no relatório.  
55. Se a avaliação de um produto químico exigir a autópsia de mais animais do 
que é razoável programar para um só dia, o início do estudo pode ser estendido por dois dias consecutivos, o mesmo sucedendo às autópsias e 
às operações conexas destas. No caso de se proceder deste modo, deve 
utilizar-se por dia metade dos animais de cada grupo exposto.
 
56. Depois da autópsia, as carcaças devem ser eliminadas de modo adequado.  
RELATÓRIOS  
Dados  
57. Os dados devem ser individualizados (isto é, devem ser indicados por 
animal o peso corporal, o peso de cada tecido acessório do aparelho sexual, 
as medições facultativas e as outras respostas e observações) e por grupo de 
animais (com indicação das médias e dos desvios-padrão de todas as me ­
dições efetuadas). Devem ser resumidos em quadros e deles devem constar o número de animais no início do ensaio, o número de animais que mor ­
reram ou apresentaram sinais de toxicidade durante o ensaio e uma des ­
crição dos sinais de toxicidade observados, nomeadamente o momento do seu aparecimento e a sua duração e intensidade.
 
58. Informações a constar do relatório final:  
Instalações nas quais se realizaram os ensaios  
— nome e localização das instalações;  
— diretor do estudo e outro pessoal e responsabilidades de cada um no 
estudo;  
— datas de início e termo do estudo, isto é, primeiro dia de administração 
do produto químico e último dia de autópsia.  
Produto químico em estudo  
— proveniência, número de lote, identidade, grau de pureza, endereço 
completo do fornecedor e caracterização do produto ou produtos quími ­
cos em estudo;  
— natureza física e propriedades físico-químicas pertinentes;  
— condições de armazenagem; método e frequência de preparação de di ­
luições;  
— dados obtidos sobre a estabilidade;  
— análises das soluções ou suspensões administradas.  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 850
 
Veículo  
— caracterização do veículo utilizado no estudo (identidade, fornecedor e 
número do lote);  
— justificação da escolha do veículo (se não for água).  
Animais estudados e condições em que são mantidos  
— espécie e estirpe utilizadas e justificação das opções tomadas;  
— proveniência ou fornecedor dos animais, incluindo o endereço completo;  
— número e idade dos animais fornecidos;  
— condições de alojamento (temperatura, iluminação, etc.);  
— dieta (nome, tipo, fornecedor, número de lote, composição e, se conhe ­
cidos, níveis de fitoestrogénios);  
— camas (nome, tipo, fornecedor e composição);  
— condições de engaiolamento e número de animais por gaiola.  
Condições de realização dos ensaios  
— idade dos animais no momento da castração e duração da aclimatação 
após a castração;  
— peso de cada animal no início do estudo (com a aproximação de 0,1 g);  
— processo de aleatorização, registo da integração dos animais nos grupos 
do veículo, do produto químico de referência e do produto químico em 
estudo e registo da distribuição dos animais pelas gaiolas;  
— média e desvio-padrão dos pesos corporais correspondentes a cada gru ­
po, para cada dia de pesagem ao longo do estudo;  
— fundamentação da escolha das doses;  
— via de administração do produto químico em estudo e fundamentação da 
via de exposição escolhida;  
— ensaios de antiandrogenicidade: dose e volume utilizados de propionato 
de testosterona;  
— doses e volumes utilizados para a exposição ao produto químico em 
estudo;  
— cronologia da administração das doses;  
— procedimentos de autópsia, incluindo os meios de sangramento e as 
anestesias;  
— se forem efetuadas análises do soro, elementos relativos aos métodos 
utilizados; por exemplo, caso seja utilizado um método radioimunométrico (RIA), indicar a proveniência dos  kits , a data de 
validade destes, o método de contagem da cintilação e o método de 
normalização.
 
Resultados  
— Exame diário da cada animal durante o período de administração das 
doses, incluindo, nomeadamente:  
— peso corporal (com a aproximação de 0,1 g),  
— eventuais sinais clínicos,  
— medições ou anotações relativas ao consumo de alimentos;  
— Autópsia de cada animal, incluindo, nomeadamente:  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 851
 
— data da autópsia,  
— grupo de exposição no qual o animal estava integrado,  
— identificação do animal,  
— prossector,  
— hora da realização da autópsia e da dissecação,  
— idade do animal,  
— peso corporal final no momento da autópsia (anotar algum aumento ou 
diminuição com significado estatístico),  
— ordem de sangramento e dissecação dos animais na autópsia,  
— peso de cada um dos cinco tecidos-alvo dependentes dos androgénios:  
— próstata ventral (com a aproximação de 0,1 mg),  
— vesículas seminais e glândulas coagulantes, incluindo os fluidos (o par, 
com a aproximação de 0,1 mg),  
— complexo dos músculos elevatórios do ânus e bulbocavernosos (com a 
aproximação de 0,1 mg),  
— glândulas de Cowper (peso fresco — o par, com a aproximação de 0,1 
mg), 
— glande peniana (peso fresco, com a aproximação de 0,1 mg),  
— peso de cada tecido facultativo, se determinado:  
— fígado (com a aproximação de 0,1 g),  
— rins (o par, com a aproximação de 0,1 mg),  
— glândulas suprarrenais (o par, com a aproximação de 0,1 mg),  
— comentários e observações gerais;  
— Análises das hormonas séricas, se efetuadas:  
— hormona luteinizante sérica (facultativa, ng por ml de soro),  
— testosterona sérica (facultativa, ng por ml de soro),  
— comentários e observações gerais.  
Resumo dos dados  
Os dados devem ser resumidos em quadros que indiquem a dimensão da 
amostra para cada grupo, o valor médio e o desvio-padrão ou o erro-padrão da média. Os quadros devem incluir os pesos corporais na autópsia, as variações do peso corporal desde o início da exposição até à autópsia, os 
pesos dos tecidos-alvo acessórios do aparelho sexual e os eventuais pesos 
de órgãos facultativos.
 
Discussão dos resultados  
Análise dos resultados  
59. Os pesos corporais e dos órgãos apurados na autópsia devem ser objeto de 
uma análise estatística destinada a determinar características como a homo ­
geneidade da variância, se necessário mediante uma transformação ade ­
quada dos dados. Devem comparar-se os grupos expostos com um grupo 
de controlo, recorrendo a técnicas como a ANOVA (análise da variância), 
seguida de comparações par a par (por exemplo, o teste unilateral de Dun ­
nett) e da aplicação de um critério de diferença estatística, por exemplo p ≤ 
0,05. Devem identificar-se os grupos com significado estatístico. Devem 
evitar-se pesos de órgãos «relativos», dada a invalidade dos pressupostos 
estatísticos em que se fundamenta esta manipulação de dados.  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 852
 
60. O grupo de controlo a utilizar no estudo do agonismo de androgénios deve 
ser um grupo exposto unicamente ao veículo. As características do modo de 
ação de um determinado produto químico podem gerar respostas relativas diferentes de tecido para tecido. A trembolona, por exemplo, que não sofre os efeitos da 5 α-redutase, afeta mais o complexo formado pelos músculos 
elevatórios do ânus e bulbocavernosos e a glande peniana do que o pro ­
pionato de testosterona. Um aumento com significado estatístico (p ≤ 0,05) 
do peso de quaisquer dois ou mais dos cinco tecidos-alvo dependentes dos androgénios (próstata ventral, complexo formado pelos músculos elevatórios 
do ânus e bulbocavernosos, glande peniana, glândulas de Cowper e vesí ­
culas seminais, com as glândulas coagulantes) deve ser considerado um resultado positivo de agonista de androgénios (nesse caso, todos os tecidos-alvo devem apresentar algum grau de aumento do crescimento). 
Pode realizar-se uma avaliação combinada das respostas dos tecidos dos 
órgãos acessórios do aparelho sexual efetuando uma análise multivariada dos dados. Este método pode servir para afinar as conclusões, sobretudo nos casos em que apenas um tipo de tecido dê uma resposta com significado 
estatístico.
 
61. O grupo de controlo a utilizar no estudo do antagonismo de androgénios 
deve ser um grupo exposto ao androgénio de referência (unicamente pro ­
pionato de testosterona). As características do modo de ação de um deter ­
minado produto químico podem gerar respostas relativas diferentes de te ­
cido para tecido. Comparativamente a antagonistas muito ativos de recetores 
de androgénios, como a flutamida, os inibidores da 5 α-redutase, como a 
finasterida, afetam mais a próstata ventral do que os outros tecidos. Uma redução com significado estatístico (p ≤ 0,05) do peso de quaisquer dois ou 
mais dos cinco tecidos-alvo dependentes dos androgénios (próstata ventral, 
complexo formado pelos músculos elevatórios do ânus e bulbocavernosos, glande peniana, glândulas de Cowper e vesículas seminais, com as glându ­
las coagulantes), comparativamente à exposição unicamente ao propionato 
de testosterona, deve ser considerada um resultado positivo de antagonista 
de androgénios (nesse caso, todos os tecidos-alvo devem apresentar algum grau de diminuição do crescimento). Pode realizar-se uma avaliação com ­
binada das respostas dos tecidos dos órgãos acessórios do aparelho sexual 
efetuando uma análise multivariada dos dados. Este método pode servir para 
afinar as conclusões, sobretudo nos casos em que apenas um tipo de tecido dê uma resposta com significado estatístico.
 
62. Os dados devem ser resumidos em quadros que indiquem o valor médio, o 
erro-padrão da média (o desvio-padrão também é aceitável) e a dimensão da 
amostra para cada grupo. Devem ser igualmente facultados quadros com os 
dados individualizados. Devem analisar-se os valores individualizados, as médias, os erros-padrão (ou desvios-padrão) e os coeficientes de variação dos dados relativos aos grupos de controlo, para determinar se satisfazem 
critérios aceitáveis de coerência com os valores históricos correspondentes. 
Se os coeficientes de variação excederem os valores indicados no quadro 1 (ver os pontos 25 e 26) para o peso de cada órgão, deve verificar-se se há erros no registo ou na transcrição dos dados ou se o laboratório ainda não 
domina a dissecação correta dos tecidos dependentes dos androgénios, 
sendo necessária mais prática ou mais formação. Em geral, os coeficientes de variação (quociente do desvio-padrão pelo peso médio do órgão) são reprodutíveis de laboratório para laboratório e de estudo para estudo. Os 
dados apresentados devem ser, pelo menos, os seguintes: pesos da próstata 
ventral, das vesículas seminais, do complexo formado pelos músculos ele ­
vatórios do ânus e bulbocavernosos, das glândulas de Cowper, da glande peniana e do fígado, peso corporal e variação deste entre o início da 
exposição e a autópsia. Os dados também podem ser apresentados depois 
de um ajustamento de covariância em função do peso corporal, mas tal não dispensa a apresentação dos dados não-ajustados. Além disso, se em algum dos grupos não tiver ocorrido o descolamento do prepúcio, deve registar-se 
a incidência desse descolamento e comparar-se estatisticamente esta última 
com a do grupo de controlo, utilizando um teste exato de Fisher.
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 853
 
63. Ao verificar a concordância entre os dados inseridos no computador e os 
constantes das folhas de dados originais, deve estar-se especialmente atento 
a valores de pesos de órgãos que não sejam biologicamente plausíveis ou se afastem mais de três desvios-padrão da média pertinente do grupo exposto em causa, podendo ser necessário rejeitá-los por serem provavelmente erros 
de registo.
 
64. A comparação dos resultados do estudo com os valores de coeficiente de 
variação determinados pela OCDE (quadro 1) constitui frequentemente uma etapa importante na interpretação da validade dos resultados do estudo. Os 
laboratórios devem conservar dados históricos dos grupos de controlo do 
veículo. Devem conservar igualmente dados históricos das respostas a pro ­
dutos químicos de referência positivos, como o propionato de testosterona e a flutamida. Os laboratórios podem determinar periodicamente a resposta a 
agonistas e antagonistas reconhecidamente fracos de androgénios, devendo, 
nesse caso, conservar também tais dados. Estes dados podem ser compara ­
dos com dados disponíveis da OCDE, para garantir que os métodos apli ­
cados pelo laboratório têm precisão e poder estatísticos suficientes.
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 854
 
Apêndice 1  
DEFINIÇÕES  
Androgénico:  termo usado para designar uma influência positiva no crescimento 
de tecidos dependentes dos androgénios.  
Antiandrogénico:  produto químico capaz de suprimir a ação do propionato de 
testosterona num mamífero.  
Produto químico:  substância ou mistura.  
Data de nascimento:  dia 0 após o nascimento.  
Dose:  quantidade de produto químico em estudo administrada. No bioensaio de 
Hershberger, exprime-se em peso diário do produto químico em estudo por 
unidade de peso corporal do animal ensaiado (por exemplo, mg/kg de peso 
corporal/dia).  
Dosagem:  termo geral que abrange a dose, a frequência desta e a duração da 
administração da mesma.  
Moribundo:  termo usado para designar um animal que está quase a morrer.  
X dias após o nascimento:  número X de dias de vida após o dia de nascimento.  
Sensibilidade:  capacidade de um método de ensaio de identificar corretamente 
produtos químicos que possuam a propriedade em estudo.  
Especificidade:  capacidade de um método de ensaio de identificar corretamente 
produtos químicos que não possuam a propriedade em estudo.  
Produto químico em estudo:  qualquer substância ou mistura à qual seja apli ­
cado este método de ensaio.  
Validação:  processo científico concebido para caracterizar as limitações e as 
condições operatórias dos métodos de ensaio e para demonstrar a fiabilidade e a pertinência dos mesmos para determinado fim.
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 855
 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 856
 ▼M5 
Apêndice 2

 
NOTAS EXPLICATIVAS DO QUADRO CONCEPTUAL  
Nota 1:  É possível entrar no quadro e dele sair em qualquer nível, consoante 
a natureza das informações necessárias para a avaliação dos perigos 
e dos riscos.  
Nota 2:  No nível 5, os métodos ecotoxicológicos devem integrar parâmetros 
indicativos dos mecanismos dos efeitos indesejáveis e dos mecanis ­
mos das consequências negativas potenciais nas populações.  
Nota 3:  Se um modelo multimodal abranger vários dos ensaios de parâmetro 
único, esse modelo substituirá estes últimos.  
Nota 4:  A avaliação de cada produto químico deve basear-se numa análise 
caso a caso que tenha em conta todas as informações disponíveis, tendo presente a função dos níveis do quadro.
 
Nota 5:  Esta versão do quadro não deve ser considerada exaustiva. Nos 
níveis 3, 4 e 5, integra ensaios já disponíveis ou em validação. 
Estes últimos são incluídos a título provisório. Logo que estejam 
afinados e validados, serão formalmente integrados no quadro.  
Nota 6:  Os ensaios integrados no nível 5 não devem considerar-se unica ­
mente de caráter definitivo. Os ensaios em questão contribuem para a avaliação geral dos perigos e dos riscos.
 
REFERÊNCIAS  
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5. OCDE (2008). Report of the OECD Validation of the Rat Hershberger 
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and Assessment N.
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1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized 
protocol.  Env. Health Persp.  114:1265-1269.
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 857
 
8. Owens W., Gray L.E., Zeiger E., Walker M., Yamasaki K., Ashby J., 
Jacob E. (2007). The OECD program to validate the rat Hershberger 
bioassay to screen compounds for in vivo androgen and antiandrogen responses: phase 2 dose-response studies.  Environ Health Perspect.  
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9. Korenchevsky V. (1932). The assay of testicular hormone preparations.  
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10. Korenchevsky V., Dennison M., Schalit R. (1932). The response of cas ­
trated male rats to the injection of the testicular hormone.  Biochem J.  
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14. Hilgar A.G., Vollmer E.P. (1964). Endocrine bioassay data: Androgenic 
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15. Dorfman R.I. (1969). Androgens and anabolic agents. Em: Methods in 
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18. OCDE (1982). Organization for Economic Co-operation and Development 
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21. Supplemental materials for Owens et al. (2006). The OECD programme to 
validate the rat Hershberger bioassay to screen compounds for in vivo 
androgen and antiandrogen responses. Phase 1: Use of a potent agonist and a potent antagonist to test the standardized protocol.  Env. Health 
Persp.  114:1265-1269. Ver a secção II: The dissection guidance provided 
to the laboratories: http://www.ehponline.org/docs/2006/8751/suppl.pdf
 
22. Korea Food and Drug Administration. Visual reference guide on Hers ­
hberger assay procedure, including a dissection video: http: 
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23. OCDE (2008). Background Review Document on the Rodent Hershberger 
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24. OCDE (2008). Draft Validation report of the Intact, Stimulated, Weanling 
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25. OCDE (2009). Guidance Document on the Weanling Hershberger Bio ­
assay in rats: A shortterm screening assay for (anti)androgenic properties. 
Series on Testing and Assessment, Number 115.  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 858
 
26. Diretiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu e do Conselho, de 22 de 
setembro de 2010, relativa à proteção dos animais utilizados para fins 
científicos (JO L 276 de 20.10.2010, p. 33).  
27. Os seguintes capítulos do presente anexo:  
B.1.bis: Toxicidade oral aguda — Procedimento de dose fixa.  
B.1.tris: Toxicidade oral aguda — Método de classificação de toxicidade 
aguda  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 859
 
B.56  ESTUDO ALARGADO DE TOXICIDADE DURANTE A 
REPRODUÇÃO NUMA GERAÇÃO  
INTRODUÇÃO  
1. Este método de ensaio é equivalente ao  Test Guideline  TG 443 (2012) da 
OCDE. Baseia-se na proposta do Comité Técnico para a Avaliação da Segurança dos Produtos Químicos Agrícolas (ACSA) do  International 
Life Science Institute  (ILSI) —  Health and Environmental Sciences 
Institute  (HESI), para um estudo alargado da reprodução numa geração, 
no estádio do ciclo de vida F
 1 , como o publicado por Cooper  et al ., 
2006 (1). O protocolo seguido no estudo foi melhorado e esclarecido de modo a proporcionar flexibilidade e a salientar a importância de se partir 
dos conhecimentos existentes, utilizando observações em vida para orientar 
e adaptar os ensaios. Este método de ensaio fornece uma descrição deta ­
lhada da realização prática de um estudo alargado de toxicidade durante a reprodução numa geração. O método de ensaio descreve três coortes de 
animais da geração F
 1 : 
Coorte 1: avalia os parâmetros( endpoints ) de reprodução/desenvolvimento; 
esta coorte pode ser alargada para incluir uma geração F  2 . 
Coorte 2: avalia o potencial impacto da exposição a produtos químicos no 
desenvolvimento do sistema nervoso.  
Coorte 3: avalia o potencial impacto da exposição a produtos químicos no 
desenvolvimento do sistema imunitário.  
2. As decisões sobre a avaliação ou não da segunda geração e sobre a eventual 
omissão das coortes para estudo dos efeitos da neurotoxicidade e/ou da 
imunotoxicidade durante o desenvolvimento devem refletir o conhecimento 
existente quanto aos produtos químicos a avaliar, bem como as necessida ­
des das diferentes autoridades reguladoras. O objetivo do método de ensaio é apresentar detalhes sobre a forma como o estudo poderá ser realizado e 
como cada coorte deverá ser avaliada.
 
3. O procedimento para decidir sobre o desencadeamento interno da produção 
de uma 2.  a geração encontra-se descrito no documento de orientações 
n. o 117 da OCDE (39), para as autoridades reguladoras que utilizem desen ­
cadeadores internos.  
OBJETIVOS E CONSIDERAÇÕES INICIAIS  
4. O principal objetivo do estudo alargado de toxicidade durante a reprodução 
numa geração é avaliar estádios específicos do ciclo de vida não cobertos 
por outros tipos de estudos de toxicidade e testar os efeitos que podem 
ocorrer em resultado da exposição pré- e pós-natal a produtos químicos. No que se refere aos parâmetros da reprodução, a expetativa é que, numa primeira fase e quando disponível, a informação proveniente de estudos de 
dosagem repetida [incluindo estudos de despistagem de toxicidade durante a 
reprodução — p. ex.: TG 422 da OCDE (32)] ou de ensaios de despistagem de desreguladores endócrinos a curto prazo [p. ex.: ensaio uterotrófico — método de ensaio B.54 (36), e ensaio de Hershberger — método de ensaio 
B.55 (37)] seja utilizada para detetar efeitos nos órgãos reprodutores de 
machos e fêmeas. Isso pode incluir a espermatogénese (histopatologia tes ­
ticular) nos machos e os ciclos éstricos, as contagens de folículos/maturação dos ovócitos e integridade dos ovários (histopatologia) para as fêmeas. O 
estudo alargado de toxicidade durante a reprodução numa geração funcio ­
nará portanto como um ensaio de parâmetros da reprodução que requerem a interação de machos com fêmeas, fêmeas com conceptos e fêmeas com a descendência e com a geração F
 1 até depois da maturidade sexual [consultar 
o documento de orientações n.  o 151 da OCDE (40), que apoia o presente 
método de ensaio].  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 860
 
5. O método de ensaio é concebido para permitir uma avaliação dos efeitos 
pré- e pós-natais de produtos químicos no desenvolvimento, bem como uma 
avaliação rigorosa da toxicidade sistémica em fêmeas grávidas e em lacta ­
ção, assim como na descendência jovem e adulta. A análise detalhada dos principais parâmetros de desenvolvimento, como a viabilidade da descen ­
dência, a saúde neonatal, o estado de desenvolvimento à nascença e o 
desenvolvimento físico e funcional até à idade adulta, deverá permitir iden ­
tificar os órgãos a analisar na descendência. Além disso, o estudo fornecerá e/ou confirmará informações sobre os efeitos de um determinado produto 
químico sobre a integridade e o funcionamento do sistema reprodutor dos 
machos e fêmeas adultos. São analisados, especificamente mas não exclu ­
sivamente, os seguintes parâmetros: função das gónadas, ciclo éstrico, ma ­
turação dos espermatozóides no epidídimo, comportamento de acasalamen ­
to, conceção, gravidez, parto e lactação. Além disso, a informação obtida 
nas avaliações da neurotoxicidade no desenvolvimento e imunotoxicidade no desenvolvimento permitirá caracterizar os potenciais efeitos nesses sis ­
temas. Os dados derivados destes ensaios deverão permitir a determinação 
dos níveis sem efeitos adversos observáveis (NOAEL), dos níveis mínimos 
com efeitos adversos observáveis (LOAEL) e/ou das doses de referência para os vários parâmetros e/ou ser utilizados para caracterizar efeitos dete ­
tados em anteriores estudos de dose repetida e/ou funcionar como orienta ­
ção para ensaios subsequentes.
 
6. Na figura 1 é apresentado um esquema do protocolo. O produto químico em 
estudo é administrado continuamente em doses graduadas a vários grupos 
de machos e fêmeas na maturidade sexual. Esta geração parental (P) recebe doses do produto durante um período definido pré-acasalamento (selecio ­
nado com base na informação disponível sobre o produto químico em 
estudo, mas com um mínimo de duas semanas) e durante um período de 
acasalamento de duas semanas. Os machos P continuam a receber trata ­
mento pelo menos até ao desmame da descendência F
 1 . Devem ser tratados 
durante um mínimo de 10 semanas. Podem ser tratados durante mais tempo, 
se necessário para esclarecer certos efeitos sobre a reprodução. O tratamento 
das fêmeas P é continuado durante a gravidez e a amamentação, terminando após o desmame das respetivas ninhadas (ou seja, 8 a 10 semanas de tratamento). A descendência F
 1 continua a ser tratada com o produto quí ­
mico em estudo desde o desmame até à idade adulta. Se se pretender avaliar 
uma segunda geração [consultar o documento de orientações 117 da OCDE (39)], a descendência F
 1 será mantida em tratamento até ao desmame da 
geração F  2 , ou até à conclusão do estudo.  
7. As observações clínicas e os exames patológicos são realizados em todos os 
animais para deteção de sinais de toxicidade, com especial ênfase sobre a 
integridade e o funcionamento dos sistemas reprodutores masculino e femi ­
nino e sobre a saúde, crescimento, desenvolvimento e funções da descen ­
dência. No momento do desmame, a descendência selecionada é atribuída a subgrupos específicos (coortes 1-3; ver os pontos 33 e 34 e a figura 1) para 
a continuação dos estudos, incluindo a maturação sexual, as funções e 
integridade dos órgãos reprodutores, os parãmetros neurológicos e compor ­
tamentais ou as funções imunitárias.
 
8. Na realização do estudo, deverão ser seguidos os princípios de orientação e 
as considerações descritas no documento de orientações 19 da OCDE quanto ao reconhecimento, avaliação e utilização dos sinais clínicos como 
parâmetros de tratamento humano para experiências com animais utilizados 
em avaliações de segurança (34).
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 861
 
9. Quando estiver disponível um número suficiente de estudos para verificar o 
impacto deste novo protocolo, o método de ensaio será reanalisado e, se 
necessário, revisto à luz da experiência adquirida.  
Figura 1  
Esquema do «Estudo alargado de toxicidade durante a reprodução numa geração»
  
DESCRIÇÃO DO MÉTODO/PREPARAÇÃO PARA O ENSAIO  
Animais  
Seleção da estirpe e espécie animal  
10. A escolha da espécie para o ensaio de toxicidade durante a reprodução deve 
ser cuidadosamente considerada à luz de todas as informações disponíveis. Contudo, tendo em conta a grande quantidade de dados contextuais e a 
comparabilidade com ensaios de toxicidade geral, o rato é normalmente a 
espécie preferida, pelo que os critérios e recomendações fornecidos neste método de ensaio se referem a esta espécie. Se for utilizada outra espécie, deve ser fornecida uma justificação e será necessário proceder às modifica ­
ções adequadas ao protocolo. As estirpes com níveis baixos de fecundidade 
ou com elevada incidência bem conhecida de defeitos de desenvolvimento espontâneos não devem ser utilizadas.
 
Idade, peso corporal e critérios de inclusão  
11. Devem ser utilizados animais progenitores saudáveis, que não tenham sido 
sujeitos a procedimentos experimentais anteriores. Os estudos deverão in ­
cluir machos e fêmeas, sendo que as fêmeas devem ser nulíparas e não devem estar grávidas. Os animais P devem ser animais maturos, de peso semelhante (considerando o respetivo sexo) no início da administração do 
produto químico, com uma idade semelhante (aproximadamente 90 dias) no 
momento do acasalamento e representativos da espécie e estirpe em estudo. Os animais devem ser aclimatizados durante pelo menos 5 dias após a chegada. Os animais são aleatoriamente distribuídos pelos grupos de con ­
trolo e tratamento, de tal forma que resulte em valores médios de peso 
corporal comparáveis entre os grupos (ou seja, ± 20 % da média).
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 862
 
Condições de alojamento e alimentação  
12. A temperatura na sala onde se encontram os animais do estudo deve ser de 
22 °C (± 3 °C). A humidade relativa deve estar entre 30-70 %, com uma gama ideal de 50-60 %. A iluminação artificial deve seguir um regime de 
12 horas com luz e 12 horas sem luz. Podem ser usadas dietas convencio ­
nais de laboratório, com acesso ilimitado a água potável. Deve ser dada especial atenção ao teor de fitoestrogénios na dieta, uma vez que um ele ­
vado nível de fitoestrogénios na dieta poderá afetar alguns dos parâmetros 
de reprodução. Recomendam-se dietas normalizadas de fórmula aberta com 
utilização reduzida de produtos químicos estrogénicos (2) (30). A escolha da dieta pode ser influenciada pela necessidade de garantir uma mistura 
adequada do produto químico em estudo, quando administrado por essa via. 
Devem verificar-se o teor, a homogeneidade e a estabilidade do produto químico em estudo na dieta. Os alimentos e a água potável devem ser analisados regulamente para detetar eventuais contaminantes. Devem ser 
mantidas amostras de cada lote da dieta utilizada durante o estudo, em 
condições adequadas (p. ex.: congeladas a –20 °C), até à finalização do relatório, para o caso de os resultados exigirem análises mais aprofundadas dos ingredientes da dieta.
 
13. Os animais devem ser colocados em gaiolas em pequenos grupos do mesmo 
sexo e grupo de tratamento. Podem ser alojados individualmente para evitar potenciais ferimentos (p. ex.: machos após o período de acasalamento). O 
acasalamento deve ocorrer em gaiolas adequadas. Constatada a copulação, 
as fêmeas que se presuma estarem grávidas devem ser alojadas em separa ­
do, em gaiolas de maternidade ou parto, onde lhes devem ser fornecidos materiais adequados e definidos para nidificação. As ninhadas devem ser 
alojadas com as respetivas progenitoras até ao desmame. Os animais F
 1 
devem ser alojados em pequenos grupos do mesmo sexo e grupo de trata ­
mento, desde o desmame até à conclusão do estudo. Caso se justifique do ponto de vista científico, os animais podem ser alojados individualmente. O 
nível de fitoestrogénios presente no material para nidificação deve ser mí ­
nimo.
 
Número e identificação dos animais  
14. Normalmente, cada grupo de ensaio e de controlo deve conter um número 
de pares de animais em fase de acasalamento suficiente para gerar, pelo 
menos, 20 fêmeas grávidas por grupo de dosagem. O objetivo é produzir gravidezes suficientes para assegurar uma avaliação significativa do poten ­
cial que o produto químico tem para afetar a fertilidade, a gravidez e o 
comportamento materno da geração P e o crescimento e desenvolvimento 
da descendência F
 1 , desde a conceção até à maturidade. O facto de não se 
obter o número desejado de fêmeas grávidas não invalida necessariamente o estudo, decisão que deverá ser tomada caso a caso, tendo em consideração 
uma potencial relação causal com o produto químico em estudo.
 
15. Cada animal P recebe um número de identificação único, antes do início da 
administração da dose prevsta do produto. Se existirem dados de histórico 
laboratorial que sugiram que uma percentagem significativa de fêmeas po ­
derá não apresentar ciclos éstricos regulares (4 ou 5 dias), aconselha-se a realização de uma avaliação dos ciclos éstricos antes do início do tratamen ­
to. Em alternativa, a dimensão do grupo pode ser aumentada de modo a 
assegurar que pelo menos 20 fêmeas em cada grupo apresentem ciclos 
éstricos regulares (4 ou 5 dias) no início do tratamento. Todos os idivíduos da geração F
 1 são identificados com um número único quando os neonatos 
são examinados pela primeira vez no dia 0 ou 1 após o nascimento (PND). 
Devem ser mantidos registos com indicação das ninhadas e da sua origem 
para todos os animais F  1 , e F  2 , quando aplicável, durante todo o estudo.  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 863
 
Produto químico em estudo  
Informações disponíveis sobre o produto químico em estudo  
16. A análise das informações existentes é importante para as decisões sobre a 
via de administração, a escolha do veículo, a seleção da espécie animal, a 
seleção das dosagens e as potenciais modificações do esquema de dosagem. 
Assim, ao planear o «Estudo alargado de toxicidade durante a reprodução numa geração», devem ser tidas em consideração todas as informações disponíveis relevantes sobre o produto químico em estudo, ou seja, pro ­
priedades físico-químicas, toxicocinéticas (incluindo o metabolismo especí ­
fico da espécie) e toxicodinâmicas, relações estrutura/atividade (SAR), pro ­
cessos metabólicos  in vitro , resultados de estudos de toxicidade anteriores e 
informações relevantes sobre produtos com uma estrutura análoga. As in ­
formações preliminares sobre a absorção, distribuição, metabolismo e 
eliminação (ADME) e sobre a bioacumulação podem ser derivadas a partir da estrutura química, de dados físico-químicos, da importância das ligações às proteínas plasmáticas ou de estudos toxicocinéticos (TK), ao passo que 
os resultados de estudos de toxicidade poderão fornecer informações adi ­
cionais, por exemplo, sobre os NOAEL, o metabolismo ou a indução desse mesmo metabolismo.
 
Consideração de dados de toxicocinética  
17. Embora não sejam necessários, os dados de toxicocinética de estudos an ­
teriormente realizados para a determinação de intervalos de dosagem ou outros são extremamente úteis para o planeamento da conceção do estudo, 
escolha dos níveis de dosagem e interpretação de resultados. Têm especial 
utilidade os dados que: 1) confirmam a exposição dos fetos em desenvol ­
vimento e das crias ao produto químico em estudo (ou aos metabolitos relevantes); 2) fornecem uma estimativa da dosimetria interna; e 3) avaliam 
a potencial saturação dependente da dosagem dos processos cinéticos. Os 
dados toxicocinéticos adicionais, tais como perfis de metabolitos, dados de concentração ao longo do tempo, etc., devem também ser considerados, se 
disponíveis. Podem ainda ser recolhidos dados toxicocinéticos suplementa ­
res durante o estudo principal, desde que tal não interfira com a recolha e interpretação dos parâmetros do estudo principal.
 
Como orientação geral, o seguinte conjunto de dados toxicocinéticos seria 
útil no planeamento do «Estudo alargado de toxicidade durante a reprodu ­
ção numa geração»:  
— Fase final da gravidez (p. ex.: 20.  o dia de gestação) — sangue materno e 
sangue fetal;  
— Fase intermédia de amamentação (10.  o dia após o nascimento) — san ­
gue materno, sangue da cria e/ou leite;  
— Fase inicial do pós-desmame (p. ex.: 28.  o dia após o nascimento) — 
amostras de sangue em fase de desmame.  
Deve haver flexibilidade na determinação das substâncias específicas a 
analisar (p. ex.: produto químico principal e/ou metabolitos) e do regime de amostragem. Por exemplo, o número e o momento de colheita das 
amostras num determinado dia de amostragem dependerão da via de expo ­
sição e do conhecimento prévio das propriedades toxicocinéticas em ani ­
mais não grávidos. Em estudos sobre a dieta, será suficiente uma amostra sempre à mesma hora em cada dia, ao passo que a administração por 
gavagem poderá exigir amostragens adicionais de modo a obter uma melhor 
estimativa do intervalo de dosagem interna. Contudo, não é necessário produzir um gráfico completo da dosagem ao longo do tempo para todos os dias em que são recolhidas amostras. Se necessário, o sangue pode ser 
agregado por sexo dentro de cada ninhada para as análises fetais e 
neonatais.
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 864
 
Via de administração  
18. A seleção da via deve ter em consideração a(s) vias(s) mais relevante(s) 
para a exposição humana. Embora o protocolo seja concebido para adminis ­
tração do produto químico em estudo através da dieta, pode ser modificado 
para administração por outras vias (água potável, gavagem, inalação, der ­
me), dependendo das características do produto químico e das informações que se pretendem obter.
 
Escolha do veículo  
19. Quando necessário, o produto químico em estudo pode ser dissolvido ou 
suspenso num veículo adequado. Recomenda-se que, quando possível, seja considerada primeiro a utilização de uma solução/suspensão aquosa, antes da possibilidade de uma solução/suspensão oleosa (p. ex., óleo de milho). 
No que se refere a outros veículos que não a água, devem ser conhecidas as 
características tóxicas do veículo. Deve ser evitada a utilização de veículos com potencial toxicidade intrínseca (p. ex., acetona, DMSO). A estabilidade do produto químico em estudo no veículo deve ser determinada. Se for 
utilizado um veículo ou outro aditivo para facilitar a dosagem, devem 
consideradar-se as seguintes características: efeitos na absorção, distribui ­
ção, metabolismo ou retenção do produto químico em estudo; efeitos sobre as propriedades químicas do produto químico em estudo que possam alterar 
as respetivas características de toxicidade; e efeitos sobre o consumo de 
alimentos ou água ou o estado nutricional dos animais.
 
Seleção da dose  
20. Normalmente, o estudo deve incluir, pelo menos, três níveis de dosagem e 
um controlo simultâneo. Ao selecionar os níveis de dosagem adequados, o 
investigador deve considerar todas as informações disponíveis, incluindo as 
informações de dosagem de estudos anteriores, dados toxicocinéticos em animais grávidos ou não grávidos, importância da transferência na amamen ­
tação e estimativas da exposição humana. Se estiverem disponíveis dados 
de toxicocinética que indiquem uma saturação dos processos toxicocinéticos 
dependente da dosagem, deve ter-se o cuidado de evitar dosagens elevadas que resultem claramente em saturação, desde que, como é evidente, se 
preveja que a exposição dos seres humanos seja muito inferior ao 
ponto de saturação. Nesses casos, a dosagem mais elevada deverá ser igual ou ligeiramente superior ao ponto de inflexão na transição para um com ­
portamento toxicocinético não-linear.
 
21. Na ausência de dados toxicocinéticos relevantes, as dosagens devem 
basear-se nos efeitos tóxicos, salvo quando existam limitações devidas à natureza físico-química do produto químico em estudo. Se os níveis de 
dosagem se basearem na toxicidade, a dose mais elevada deve ser escolhida 
com o objetivo de induzir alguma toxicidade sistémica, mas não a morte ou grande sofrimento dos animais.
 
22. Deve ser selecionada uma sequência descendente de níveis de dosagem para 
demonstrar qualquer efeito relacionado com a dose e para estabelecer os NOAEL ou dosagens próximas do limite de deteção que permitam deduzir 
uma dose de referência para o(s) parâmetro(s) mais sensíveis. Para evitar 
um grande espaçamento de doses entre os NOAEL e os LOAEL, o ideal será normalmente utilizar intervalos com uma ordem de grandeza do dobro ou do quádruplo. Em geral, será preferível acrescentar um quarto grupo de 
ensaio do que utilizar intervalos demasiado grandes (p. ex.: com um fator 
de multiplicação superior a 10) entre as doses.
 
23. Exceto no que se refere ao tratamento com o produto químico em estudo, os 
animais no grupo de controlo são tratados de forma idêntica aos indivíduos 
no grupo de ensaio. O grupo de controlo não deverá receber tratamento, deverá receber um tratamento similado ou constituirá um grupo de controlo do veículo em caso de utilização de um veículo para administração do 
produto químico em estudo. Se for utilizado um veículo, o grupo de con ­
trolo deve receber o volume mais elevado desse veículo utilizado no estudo.
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 865
 
Ensaio de limite  
24. Caso não haja evidência de toxicidade com uma dose de pelo menos 1 000 
mg/kg de peso corporal/dia em estudos de dose repetida, ou se não for esperada toxicidade com base nos dados de produtos químicos estrutural 
e/ou metabolicamente relacionados, indicando similaridade nas propriedades 
metabólicas  in vivo/in vitro , poderá não ser necessário realizar um estudo 
com várias dosagens. Nesses casos, o «Estudo alargado de toxicidade du ­
rante a reprodução numa geração» pode ser realizado utilizando um grupo 
de controlo e uma dose única pelo menos igual a 1 000 mg/kg de peso 
corporal/dia. Contudo, caso sejam detetadas evidências de toxicidade du ­
rante a reprodução ou no desenvolvimento com este limite de dosagem, 
serão necessários mais estudos com dosagens inferiores para identificação 
de um NOAEL. Estas considerações sobre os ensaios de limite aplicam-se apenas quando a exposição humana não indicar a necessidade de ensaiar uma dosagem superior.
 
PROCEDIMENTOS  
Exposição da descendência  
25. A exposição na dieta é o método de administração preferencial. Se forem 
realizados estudos com gavagem, importa notar que normalmente as crias apenas receberão o produto químico em estudo de forma indireta, através do leite, até ao início da respetiva administração direta, a partir do desmame. 
Em estudos com administração na dieta ou na água potável, as crias rece ­
berão adicionalmente o produto químico em estudo de forma direta quando começarem a alimentar-se por si próprias, durante a última semana do 
período de amamentação. Devem ser consideradas modificações à conceção 
do estudo nos casos em que a excreção do produto químico em estudo no leite for fraca e em que haja falta de evidência para uma exposição contínua da descendência. Nestes casos, a dosagem direta às crias durante o período 
de amamentação deve ser considerada com base nas informações de toxi ­
cocinética disponíveis, toxicidade na descendência ou alterações em biomar ­
cadores (3) (4). Os benefícios e as desvantagens d evem ser cuidadosamente considerados antes da realização de estudos de dosagem direta em crias em 
aleitamento (5).
 
Esquema de dosagem e administração das doses  
26. Poderão existir informações disponíveis sobre ciclos éstricos, histopatologia 
do aparelho reprodutor masculino e feminino e análise de esperma nos testículos/epidídimo de estudos anteriores de toxicidade de dose repetida 
com duração adequada. A duração do tratamento pré-acasalamento no «Es ­
tudo alargado de toxicidade durante a reprodução numa geração» visa, portanto, detetar os efeitos de alterações funcionais que possam interferir com o comportamento de acasalamento e fertilização. O tratamento pré- 
-acasalamento deve ser suficientemente longo para atingir condições de ex ­
posição em estado de equilíbrio nos machos e fêmeas da geração P. Um tratamento pré-acasalamento de 2 semanas para ambos os sexos é conside ­
rado adequado na maioria dos casos. Para as fêmeas, esse período abrange 
3-4 ciclos éstricos completos e deve ser suficiente para detetar quaisquer 
efeitos adversos nesses ciclos. Para os machos, equivale ao tempo necessá ­
rio para o trânsito dos espermatozóides em maturação pelo epidídimo e deverá permitir detetar efeitos pós-testiculares no esperma (durante as fases 
finais da espermiação e maturação dos espermatozóides no epidídimo) no 
acasalamento. No momento terminal, para o qual estejam programados os parâmetros de análise do esperma e de histopatologia dos testículos e epi ­
dídimo, os machos P e F
 1 terão estado expostos durante pelo menos um 
ciclo espermatogénico completo [(6) (7) (8) (9) e documento de orientações 
151 da OCDE (40)].  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 866
 
27. Os cenários de exposição pré-acasalamento para os machos podem ser 
adaptados se estudos anteriores tiverem identificado claramente toxicidade 
testicular (espermatogénese negativamente afetada) ou efeitos na integridade e função do esperma. Da mesma forma, para as fêmeas, os efeitos conhe ­
cidos do produto químico em estudo sobre o ciclo éstrico e, por conseguin ­
te, sobre a recetividade sexual, poderão justificar diferentes cenários de 
exposição pré-acasalamento. Em casos especiais, poderá ser aceitável que o tratamento das fêmeas P seja iniciado apenas após a obtenção de um esfregaço com presença de esperma [ver documento de orientações 151 da 
OCDE (40)].
 
28. Quando o período de dosagem pré-acasalamento estiver estabelecido, os 
animais devem ser tratados continuamente com o produto químico em estudo 7 dias/semana até à autópsia. Todos os animais devem receber a 
dosagem pelo mesmo método. A dosagem deve prosseguir durante o pe ­
ríodo de acasalamento de 2 semanas e, no caso das fêmeas P, ao longo da gestação e da amamentação até ao dia do término após o desmame. Os machos devem ser tratados da mesma forma até ao término, no momento 
em que os animais F
 1 são desmamados. Para a autópsia, deve ser dada 
prioridade às fêmeas, que devem ser autopsiadas no próprio dia ou próximo do dia da lactação. A autópsia dos machos pode ser distribuída por vários dias, em função das instalações laboratoriais. Salvo nos casos em que já 
tenha sido iniciada durante o período de amamentação, a dosagem direta 
dos machos e fêmeas F
 1 selecionados deve ser iniciada aquando do des ­
mame e continuar até à autópsia programada, dependendo da distribuição pelas coortes.
 
29. No caso de produtos químicos administrados através da dieta ou da água 
potável, é importante assegurar que as quantidades do produto químico em estudo envolvidas não interferem com a nutrição normal ou com a compo ­
sição da água. Quando o produto químico em estudo é administrado na 
dieta, pode aplicar-se uma concentração constante (ppm) ou um nível cons ­
tante de dosagem em termos do peso corporal do animal; a opção escolhida deve ser especificada.
 
30. Quando o produto químico em estudo é administrado por gavagem, o 
volume de líquido administrado de uma só vez não deverá normalmente exceder 1 ml/100 g de peso corporal (0,4 ml/100 g de peso corporal é o máximo no caso de utilização de óleos, por exemplo óleo de milho). Exceto 
no caso de produtos químicos irritantes ou corrosivos, que normalmente 
revelam efeitos exacerbados em concentrações superiores, a variabilidade no volume de ensaio deve ser minimizada ajustando a concentração de modo a garantir um volume constante em todos os níveis de dosagem. O 
tratamento deve ser fornecido aproximadamente à mesma hora em cada dia. 
Normalmente, a dose para cada animal deve basear-se na determinação mais recente do peso corporal de cada indivíduo e decverá ser ajustada pelo menos uma vez por semana nos machos adultos e nas fêmeas adultas não 
grávidas, e a cada dois dias para as fêmeas grávidas e os animais F
 1 , 
quando a administração for efetuada antes do desmame e durante as 2 semanas após o desmame. Se os dados de toxicocinética indicarem uma baixa transferência placentária do produto químico em estudo, poderá ser 
necessário ajustar a dose de gavagem durante a última semana da gravidez, 
de modo a evitar a administração de uma dose excessivamente tóxica à progenitora. As fêmeas não devem ser tratadas por gavagem ou por qual ­
quer outra via de tratamento em que o animal tenha de ser manuseado, no 
dia do parto; a omissão da administração do produto químico em estudo 
nesse dia é preferível à perturbação do processo de parto.
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 867
 
Acasalamento  
31. Cada fêmea P deve ser colocada com um único macho não aparentado e 
escolhido aleatoriamente do mesmo grupo de dosagem (emparelhamento 
1:1) até que seja observada evidência de copulação ou que tenham passado 2 semanas. Se não houver machos suficientes, por exemplo devido a morte de machos antes do emparelhamento, o(s) macho(s) que já tenha(m) acasa ­
lado pode(m) ser emparelhado(s) (1:1) com outra(s) fêmea(s), de modo a 
que todas as fêmeas sejam emparelhadas. O dia 0 da gravidez é definido como o dia em que é confirmada a evidência de acasalamento (deteção de rolhão vaginal ou esperma). Os animais devem ser separados logo que 
possível após observação da evidência de copulação. Se não tiver ocorrido 
acasalamento após 2 semanas, os animais devem ser separados sem que haja mais oportunidade de acasalamento. Os pares acasalados devem ser claramente identificados nos dados.
 
Dimensão da ninhada  
32. No 4.  o dia após o nascimento, a dimensão de cada ninhada pode ser ajus ­
tada eliminando as crias em excesso por seleção aleatória, de modo a obter 
o valor mais próximo possível de cinco machos e cinco fêmeas por ninhada. 
A eliminação seletiva de crias, por exemplo com base no peso corporal, não será adequada. Sempre que o número de crias macho ou fêmea não permitir a existência de cinco de cada sexo por ninhada, poderá proceder-se a um 
ajuste parcial (p. ex.: seis machos e quatro fêmeas).
 
Seleção de crias para estudos pós-desmame (ver Figura 1)  
33. Aquando do desmame (cerca do 21.  o dia após o nascimento), são selecio ­
nadas para exames posteriores crias de todas as ninhadas disponíveis, até 20 
por grupo de controlo e dose, que serão mantidas até à maturação sexual (a não ser que sejam necessários ensaios mais precoces). As crias são selecio ­
nadas aleatoriamente, com a exceção de que não devem ser incluídos ani ­
mais de tamanho claramente inferior ao normal (animais com peso corporal 
mais de dois desvios padrão abaixo do peso corporal médio das crias da respetiva ninhada), na medida em que não serão provavelmente representa ­
tivos do grupo de tratamento.
 
No 21.  o dia após o nascimento, as crias F  1 selecionadas são atribuídas 
aleatoriamente a uma das três coortes de animais, da seguinte forma:  
Coorte 1 (1A e 1B) = Ensaio de toxicidade durante a reprodução/no de ­
senvolvimento  
Coorte 2 (2A e 2B) = Ensaio de neurotoxicidade no desenvolvimento  
Coorte 3 = Ensaio de imunotoxicidade no desenvolvimento  
Coorte 1A:  Um macho e uma fêmea/ninhada/grupo (20/sexo/grupo): seleção 
prioritária para avaliação primária dos efeitos sobre os sistemas reprodutivos 
e da toxicidade geral.  
Coorte 1B: Um macho e uma fêmea/ninhada/grupo (20/sexo/grupo): seleção 
prioritária para avaliação e seguimento do comportamento reprodutivo atra ­
vés do acasalamento de animais F  1 , quando avaliados [consultar o docu ­
mento de orientações 117 da OCDE (39)] e para obtenção de dados adi ­
cionais de histopatologia em casos de suspeita de tóxicos para o sistema 
reprodutivo ou endócrino, ou quando os resultados da coorte 1A não forem 
inequívocos.  
Coorte 2A: Total de 20 crias por grupo (10 machos e 10 fêmeas por grupo; 
um macho ou uma fêmea por ninhada) destinadas a ensaios neurocompor ­
tamentais, seguidos de avaliação neuro-histopatológica quando chegados à fase adulta.
 
Coorte 2B: Total de 20 crias por grupo (10 machos e 10 fêmeas por grupo; 
um macho ou uma fêmea por ninhada) destinadas a avaliação neuro-histopatológica no desmame (21.
 o ou 22.  o dia após o nascimento). 
Se o número de animais for insuficiente, deve dar-se preferência à coloca ­
ção dos animais na Coorte 2A.  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 868
 
Coorte 3: Total de 20 crias por grupo (10 machos e 10 fêmeas por grupo; 
um por ninhada, quando possível). Poderá ser necessário utilizar mais crias 
do grupo de controlo como animais de controlo positivo no ensaio de resposta de anticorpos dependentes de células T (TDAR) no 56.
 o ± 3 dia 
após o nascimento.  
34. Caso não exista um número insuficiente de crias numa ninhada para atri ­
buição a todas as coortes, a coorte 1 tem precedência, já que poderá ser 
conservada para produzir uma geração F  2 . Podem ser atribuídas mais crias a 
qualquer uma das coortes em caso de preocupações específicas; por exem ­
plo, se houver suspeita de que um produto químico é para o sistema 
nervoso, imunitário ou reprodutivo. Estas crias podem ser utilizadas para 
exames em diferentes momentos ou para a avaliação de parâmetros suple ­
mentares. As crias não afetadas a uma dterminada coorte serão analisadas na ótica da bioquímica clínica (parágrafo 55) e sujeitas a uma autópsia 
macroscópica (parágrafo 68).
 
Segundo acasalamento dos animais P  
35. Normalmente, não se recomenda um segundo acasalamento dos animais P, 
já que isso poderá implicar a perda de informações importantes sobre o número de locais de implantação (e, portanto, de dados sobre as perdas pós- -implantação e perinatais, indicadoras de um possível potencial teratogénico) 
na primeira ninhada. A necessidade de verificar ou elucidar um determinado 
efeito em fêmeas expostas terá uma melhor resposta alargando o estudo de modo a incluir um acasalamento da geração F
 1 . Contudo, um segundo 
acasalamento dos machos P com fêmeas não tratadas será sempre uma 
opção para esclarecer os resultados que não sejam inequívocos ou para 
uma caracterização mais aprofundada dos efeitos sobre a fertilidade obser ­
vados no primeiro acasalamento.  
OBSERVAÇÕES EM VIDA  
Observações clínicas  
36. Para os animais P e os animais F  1 selecionados, é realizada uma observação 
clínica geral uma vez por dia. Em caso de administração por gavagem, as 
observações clínicas deverão ter lugar antes e depois da administração (para possíveis sinais de toxicidade associada ao pico de concentração plasmáti ­
ca). Registam-se as alterações comportamentais pertinentes, os sinais de 
parto difícil ou prolongado e todos os sinais de toxicidade. Duas vezes 
por dia (durante o fim de semana, uma vez por dia), todos os animais devrão ser observados em termos de toxicidade grave, morbilidade e mortalidade.
 
37. Além disso, deverá realizar-se semanalmente um exame mais detalhado de 
todos os animais P e F  1 (após o desmame), que para maior conveniência 
poderá realizar-se numa ocasião em que o animal seja pesado, o que mini ­
miza o  stress  do manuseamento. As observações deverão ser cuidadosa ­
mente realizadas e registadas utilizando sistemas de classificação definidos 
pelo laboratório de ensaio. Devem ser envidados esforços para garantir um 
mínimo de variação nas condições de ensaio. Os sinais a ter em conta devem incluir, sem caráter limitativo, alterações na pele, pêlo, olhos, mem ­
branas mucosas, ocorrência de secreções e excreções e as atividades autó ­
nomas (p. ex., lacrimação, piloereção, tamanho das pupilas, padrão respira ­
tório anómalo). Devem também ser registadas as alterações na marcha, postura, resposta ao manuseamento, bem como a presença de movimentos clónicos ou tónicos, estereotipia (p. ex., excesso de limpeza, movimentos 
repetitivos em círculo) ou comportamentos estranhos (p. ex., automutilação, 
marcha para a retaguarda).
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Peso corporal e consumo de alimentos/água  
38. Os animais P são pesados no primeiro dia da dosagem e, depois disso, pelo 
menos uma vez por semana. Adicionalmente, as fêmeas P são pesadas 
durante a amamentação nos mesmos dias da pesagem das crias das respe ­
tivas ninhadas (ver parágrafo 44). Todos os animais F  1 são pesados indi ­
vidualmente no desmame (21.  o dia após o nascimento) e, depois disso, pelo 
menos uma vez por semana. O peso corporal deverá também ser registado 
no dia em que atingem a puberdade (conclusão da separação prepucial ou abertura da vagina). Todos os animais são pesados aquando do sacrifício.
 
39. Durante o estudo, o consumo de alimentos e água (caso a administração do 
produto químico em estudo seja feita na água potável) é registado pelo 
menos uma vez por semana, nos mesmos dias das pesagens dos animais 
(exceto durante a coabitação). O consumo de alimentos de cada gaiola de animais F
 1 é registado semanalmente, a partir da colocação numa determi ­
nada coorte.  
Ciclos éstricos  
40. Poderão já estar disponíveis informações preliminares sobre os efeitos rela ­
cionados com o produto químico em estudo no ciclo éstrico, obtidas em anteriores estudos de toxicidade de dose repetida, que podem ser utilizadas na conceção de um protocolo de ensaio específico para o «Estudo alargado 
de toxicidade durante a reprodução numa geração» do produto químico em 
estudo. Normalmente, a avaliação do ciclo éstrico (por citologia vaginal) começará no início do período de tratamento e continuará até confirmação do acasalamento ou até ao final do período de acasalamento de 2 semanas. 
Se as fêmeas tiverem sido sujeitas a despistagem para determinar se o seu 
ciclo éstrico é normal antes do tratamento, será útil continuar a obter es ­
fregaços após o início do tratamento, mas se existirem preocupações quanto a efeitos não específicos no início do tratamento (nomeadamente uma re ­
dução inicial marcada no consumo de alimentos), pode permitir-se que os 
animais se adaptem ao tratamento durante um período máximo de duas semanas antes de iníciar o período de recolha de esfregaços nas 2 semanas anteriores ao emparelhamento. Se o período de tratamento da fêmea for 
alargado desta forma (ou seja, com um tratamento pré-acasalamento de 4 
semanas), deve considerar-se a aquisição de animais mais jovens e o alar ­
gamento do período de tratamento dos machos antes do emparelhamento. Ao obter células vaginais/cervicais, deve ter-se o cuidado de evitar pertur ­
bações na mucosa e, por consequência, a indução de pseudogravidezes (10) 
(11).
 
41. Os esfregaços vaginais devem ser examinados diariamente para todas as 
fêmeas F  1 da coorte 1A, desde o início da abertura da vagina até que se 
registe o primeiro esfregaço cornificado, de modo a determinar o período 
entre os dois eventos. Os ciclos éstricos de todas as fêmeas F  1 na coorte 1A 
devem também ser acompanhados durante um período de duas semanas, iniciado por volta do 75.
 o dia após o nascimento. Além disso, caso seja 
necessário o acasalamento da geração F  1 , a citologia vaginal na coorte 1B 
será seguida desde o momento do emparelhamento até que seja detetada evidência de acasalamento.
 
Acasalamento e gravidez  
42. Além dos parâmetros padrão (p. ex., peso corporal, consumo de alimentos, 
observações clínicas, incluindo verificações da mortalidade/morbilidade), 
são registadas as datas de emparelhamento, a data de inseminação e a 
data de parto, e calculados o intervalo pré-coital (do emparelhamento até à inseminação) e a duração da gravidez (da inseminação até ao parto). As fêmeas P devem ser examinadas cuidadosamente para sinais de distócia na 
altura prevista para o parto. Quaisquer anomalias no comportamento de 
nidificação ou no aleitamento devem ser registadas.
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43. O dia do parto é o dia 0 de amamentação (LD 0) para a progenitora e o dia 
0 após o nascimento (PND 0) para a descendência. Em alternativa, todas as 
comparações poderão também basear-se no tempo pós-coital, para evitar que os dados do desenvolvimento pós-natal sejam afetados por diferenças na duração da gravidez; contudo, deve também ser registado o período 
decorrido desde o parto. Isso será especialmente importante quando o pro ­
duto químico em estudo tem influência sobre a duração da gravidez.
 
Parâmetros de descendência  
44. Cada ninhada deve ser examinada o mais cedo possível após o nascimento 
(dia 0 ou 1 após o nascimento) de modo a estabelecer o número e o sexo 
das crias, de nados-mortos, de nados-vivos e a presença de anomalias 
graves (anomalias visíveis externamente, incluindo fenda palatina, hemor ­
ragias subcutâneas, textura ou cor anómala da pele, presença de cordão umbilical, ausência de leite no estômago, presença de secreções secas). 
Além disso, o primeiro exame clínico dos neonatos deve incluir uma ava ­
liação qualitativa da temperatura corporal, do estado de atividade e da reação ao manuseamento. As crias que sejam encontradas mortas no dia 0 após o nascimento ou mais tarde devem ser examinadas quanto a possí ­
veis deficiências e às causas de morte. As crias vivas devem ser contadas e 
pesadas individualmente no dia 0 ou 1 após o nascimento e, depois disso, regularmente, pelo menos no 4.
 o , 7. o , 14.  o e 21.  o dia após o nascimento. Os 
exames clínicos aplicáveis à idade dos animais devem ser repetidos quando 
a descendência for pesada ou com maior frequência caso tenham sido feitas 
constatações específicas à nascença. Os sinais a ter em conta incluem, sem caráter limitativo: anomalias externas, alterações na pele, pelo, olhos, mem ­
branas mucosas, ocorrência de secreções e excreções e atividade autónoma. 
Também devem ser registadas as alterações na marcha, postura, resposta ao 
manuseamento, bem como a presença de movimentos clónicos ou tónicos, estereotipia ou comportamento estranho.
 
45. A distância anogenital (AGD) de cada cria deve ser medida pelo menos 
uma vez entre o dia 0 após o nascimento e o dia 4 após o nascimento. O peso corporal da cria deve ser recolhido no dia em que a AGD for medida e as AGD devem ser normalizadas de acordo com uma medida do tamanho 
da cria, preferencialmente a raiz cúbica do peso corporal (12). A presença 
de mamilos/auréolas nas crias macho deve ser verificada no 12.
 o ou 13.  o dia 
após o nascimento.  
46. Todos os animais F  1 selecionados são avaliados diariamente quanto à se ­
paração balanoprepucial ou abertura da vagina nos machos e fêmeas, res ­
petivamente, com início antes do dia previsto para o surgimento desses sinais, de modo a detetar se a maturação sexual ocorre prematuramente. Devem ter-se em atenção quaisquer anomalias dos órgãos genitais, tais 
como filamentos vaginais persistentes, hipospadia ou epispádia do pénis. 
A maturidade sexual dos animais F
 1 é comparada com o desenvolvimento 
físico através da determinação da idade e do peso corporal aquando da separação balanoprepucial ou da abertura da vagina nos machos e fêmeas, 
respetivamente (13).
 
Avaliação da potencial neurotoxicidade no desenvolvimento (coortes 2A 
e 2B)  
47. Os animais da coorte 2A (10 machos e 10 fêmeas) e da coorte 2B (10 
machos e 10 fêmeas) de cada grupo de tratamento (para cada coorte: 1 
macho ou 1 fêmea por ninhada; todas as ninhadas representadas por pelo 
menos 1 cria; seleção aleatória) devem ser utilizados para avaliações de neurotoxicidade. Os animais da coorte 2A devem ser sujeitos a avaliações da resposta auditiva, de um conjunto de observações funcionais, da ativi ­
dade motora (ver parágrafos 48-50) e da neuropatologia (ver parágrafos 
74-75). Devem ser envidados esforços para garantir que as variações em
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todas as condições de ensaio sejam mínimas e não estejam sistematicamente 
relacionadas com o tratamento. Entre as variáveis que podem afetar o 
comportamento encontram-se o nível sonoro (p. ex., ruído intermitente), a temperatura, a humidade, a iluminação, os odores, a hora do dia e os fatores ambientais. Os resultados dos ensaios de neurotoxicidade devem ser inter ­
pretados em relação a valores de referência histórica de controlo adequados. 
Os animais da coorte 2B devem ser utilizados para avaliação neuropatoló ­
gica no 21.
 o ou 22.  o dia após o nascimento (ver parágrafos 74-75).  
48. Deve ser realizado um ensaio de resposta auditiva no 24.  o dia após o 
nascimento (± 1 dia) utilizando animais da coorte 2A. O dia do ensaio deve ser distribuído de forma equilibrada no interior dos grupos tratados e de controlo. Cada sessão é constituída por 50 ensaios. Na realização do 
ensaio de resposta auditiva, deve ser determinada a amplitude média de 
resposta em cada bloco de 10 ensaios (5 blocos de 10 ensaios), com condições de ensaio otimizadas para produzir habituação entre sessões. Estes procedimentos devem estar em conformidade com o método de ensaio 
B.53 (35).
 
49. Num momento adequeado, entre o 63.  o e o 75.  o dia após o nascimento, os 
animais da coorte 2A são sujeitos a um conjunto de observações funcionais 
e a um ensaio automatizado da atividade motora. Estes procedimentos 
devem ser conformes com os métodos de ensaio B.43 (33) e B.53 (35). O conjunto de observações funcionais inclui uma descrição aprofundada do aspeto, comportamento e integridade funcional do indivíduo. Esses elemen ­
tos são avaliados através de observações na gaiola onde o animal é con ­
servado, após remoção para uma área padrão de observação (campo aberto) em que o animal se move livremente e através de ensaios com manipulação. 
Devem ser examinados primeiro os animais menos interativos, acabando 
nos mais interativos. No apêndice 1 é apresentada uma lista das medições. Todos os animais devem ser observados cuidadosamente, por observadores formados que desconheçam o seu estado de tratamento e utilizando proce ­
dimentos normalizados, para minimizar a variabilidade devida ao observa ­
dor. Quando possível, aconselha-se que seja sempre o mesmo observador a avaliar os animais num determinado ensaio. Se isso não for possível, é necessário demonstrar a fiabilidade entre observadores. Para cada parâmetro 
do conjunto de ensaios comportamentais, devem ser utilizadas escalas e 
critérios de classificação explícitos e definidos em termos operacionais. Se possível, devem ser desenvolvidas medidas quantitativas objetivas para os parâmetros observáveis que envolvem uma classificação subjetiva. 
No que se refere à atividade motora, cada animal é sujeito ao ensaio 
individualmente. A sessão de ensaio deve ser suficientemente longa para revelar a habituação entre sessões para efeitos de controlo. A atividade motora deve ser monitorizada por um aparelho automático de registo de 
atividade, capaz de detetar tanto aumentos como diminuições na atividade 
(ou seja, a atividade basal conforme medida pelo dispositivo não deve ser tão baixa a ponto de impedir a deteção de diminuições, nem tão elevada a ponto de impedir a deteção de aumentos na atividade). Cada dispositivo 
deve ser testado através de procedimentos padrão para assegurar, tanto 
quanto possível, a fiabilidade do funcionamento entre dispositivos e nos vários dias. Sempre que possível, os grupos de tratamento devem ser dis ­
tribuídos de forma equilibrada pelos diferentes dispositivos. Os grupos de 
tratamento devem ser ensaiados de acordo com uma distribuição equilibrada 
ao longo do dia, de modo a evitar influências devidas aos ritmos circadia ­
nos de atividade.
 
50. Se as informações existentes indicarem a necessidade de outros ensaios 
funcionais (p. ex., sensoriais, sociais ou cognitivos), estes devem ser inte ­
grados sem comprometer a integridade das outras avaliações realizadas no estudo. Se este ensaio for realizado nos mesmos animais utilizados para os 
ensaios de resposta auditiva padrão, do conjunto de observações funcionais 
e da atividade motora, os diferentes ensaios devem ser programados de modo a minimizar o risco de comprometer a sua integridade. Estes proce ­
dimentos suplementares poderão ser particularmente úteis quando a obser ­
vação empírica, os efeitos previstos ou os dados mecanísticos/modo de ação 
indicarem um tipo específico de neurotoxicidade.
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Avaliação de potencial imunotoxicidade no desenvolvimento (coorte 3)  
51. No 56.  o dia após o nascimento (± 3 dias), 10 machos e 10 fêmeas dos 
animais da coorte 3 de cada grupo de tratamento (1 macho ou 1 fêmea por 
ninhada; todas as ninhadas representadas por, pelo menos, 1 cria; seleção aleatória) devem ser usados num ensaio da resposta dos anticorpos depen ­
dente das células T, ou seja, da primeira resposta dos anticorpos IgM a um 
antigénio dependente de células T, como o ensaio com glóbulos vermelhos 
de ovelha (SRBC) ou o ensaio com hemocianina de lapa californiana (KLH), em conformidade com os atuais procedimentos de en ­
saio da imunotoxicidade (14) (15). A resposta pode ser avaliada através da 
contagem de células formadoras de placa (PFC) no baço ou da determina ­
ção do título de anticorpos IgM específicos para SRBC ou KLH no soro ELISA, no pico da resposta. O pico da resposta ocorre normalmente 4 (resposta PFC) ou 5 (ELISA) dias após a imunização intravenosa. Se a 
primeira resposta dos anticorpos for analisada através da contagem de cé ­
lulas formadoras de placa, poderão avaliar-se subgrupos de animais em dias separados, desde que: a imunização e sacrifício do subgrupo sejam planea ­
dos de modo a que as PFC sejam contadas no pico da resposta; esses 
subgrupos contenham um número igual de descendentes do género mascu ­
lino e feminino de todos os grupos de dose, incluindo os grupos de con ­
trolo; e esses subgrupos sejam avaliados aproximadamente com a mesma idade após o nascimento.A exposição ao produto químico em estudo con ­
tinuará até ao dia anterior à colheita dos baços para o ensaio PFC ou de 
soro para o ensaio ELISA.
 
Avaliação de acompanhamento de potencial toxicidade durante a re ­
produção (coorte 1B)  
52. Os animais da coorte 1B podem ser mantidos em tratamento para além do 
90. o dia após o nascimento e, se necessário, procriados para obter uma 
geração F  2 . Os machos e as fêmeas do mesmo grupo de admnistração 
devem coabitar (evitando o acasalamento entre irmãos) durante duas sema ­
nas, com início no 90.  o dia após o nascimento ou após esse dia, mas não 
ultrapassando o 120.  o dia após o nascimento. Os procedimentos devem ser 
os mesmos que para os animais P. No entanto, com base na suficiência de 
prova, poderá ser suficiente terminar as ninhadas no 4.  o dia após o nasci ­
mento em vez de continuar a acompanhá-las até ao desmame ou para além disso.
 
OBSERVAÇÕES FINAIS  
Bioquímica clínica/Hematologia  
53. Os efeitos sistémicos devem ser monitorizados nos animais P. No término 
do estudo, são colhidas amostras de sangue em jejum de um local definido 
de dez machos e fêmeas P de cada grupo de dosagem, selecionados alea ­
toriamente. Essas amostras são armazenadas em condições adequadas e sujeitas a hematologia parcial ou exaustiva, bioquímica clínica, ensaio de T4 e TSH ou outros exames sugeridos pelo perfil de efeitos conhecido do 
produto químico em estudo [ver documento de orientações 151 da OCDE 
(40)]. Devem ser examinados os seguintes parâmetros hematológicos: he ­
matócrito, concentração de hemoglobina, contagem de eritrócitos, contagem total e diferencial de leucócitos, contagem de plaquetas e tempo/potencial 
de coagulação sanguínea. Os exames ao plasma ou soro devem incluir: 
glicose, colesterol total, ureia, creatinina, proteína total, albumina e pelo menos duas enzimas indicativas dos efeitos hepatocelulares (tais como ala ­
nina aminotransferase, aspartato aminotransferase, fosfatase alcalina, gama ­
glutamiltranspeptidase e sorbitol desidrogenase). Em algumas circunstân ­
cias, a medição de enzimas adicionais e ácidos biliares pode providenciar
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informações úteis. Para além disso, deve proceder-se à colheita e armaze ­
namento de sangue de todos os animais para possíveis análises posteriores, 
de forma a ajudar a clarificar efeitos ambíguos ou a gerar dados internos de exposição. Se não se pretender um segundo acasalamento dos animais P, as amostras de sangue devem ser obtidas imediatamente antes do sacrifício 
programado ou durante esse procedimento. Se os animais envolvidos no 
estudo forem conservados, as amostras de sangue devem ser colhidas alguns dias antes de os animais acasalarem pela segunda vez. A não ser que os dados existentes dos estudos com dose repetida indiquem que o parâmetro 
não é afetado pelo produto químico em estudo, a análise à urina deve ser 
realizada antes do término e os seguintes parâmetros avaliados: aspeto, volume, osmolalidade ou gravidade específica, pH, proteína, glicose, sangue e células sanguíneas, vestígios celulares. Também se pode proceder à co ­
lheita de urina para monitorizar a excreção do produto químico em estudo 
e/ou do(s) seu(s) metabolito(s).
 
54. Os efeitos sistémicos também devem ser monitorizados nos animais F  1 . 
No término do estudo, são colhidas amostras de sangue em jejum de um 
local definido de dez machos e fêmeas da coorte 1A de cada grupo de 
dosagem, selecionados aleatoriamente. As amostras são armazenadas em condições adequadas e sujeitas a bioquímica clínica padrão, incluindo a avaliação de níveis séricos para hormonas da tiróide (T4 e TSH), hemato ­
logia (contagem total e diferencial de leucócitos e eritrócitos) e avaliações 
da análise à urina.
 
55. As crias excedentes no 4.  o dia após o nascimento devem ser sujeitas a uma 
autópsia macroscópica e deve considerar-se a medição das concentrações 
séricas das hormonas tiroideias (T4). Se necessário, pode proceder-se à 
colheita de sangue neonatal (4.  o dia após o nascimento) por ninhadas 
para análises bioquímicas/da tiróide. Também é colhido sangue para análi ­
ses T4 e TSH de animais desmamados sujeitos a autópsia macroscópica no 
22. o dia após o nascimento (crias F  1 não selecionadas para coortes).  
Parâmetros do esperma  
56. Os parâmetros do esperma devem ser medidos em todos os machos da 
geração P, a não ser que existam dados que demonstrem que os parâmetros do esperma não são afetados num estudo de 90 dias. O exame dos parâme ­
tros do esperma deve ser realizado em todos os machos da coorte 1A.
 
57. No término do estudo, é registado o peso dos testículos e do epidídimo de 
todos os machos P e F  1 (coorte 1A). Pelo menos um testículo e um epidí ­
dimo são reservados para exame histopatológico. O outro epidídimo é 
utilizado para a contagem das reservas de esperma na cauda do epidídimo 
(16) (17). Além disso, é colhido esperma da cauda do epidídimo (ou ducto deferente) utilizando métodos que minimizem os danos na avaliação da mobilidade e morfologia dos espermatozóides (18).
 
58. A mobilidade dos espermatozóides pode ser avaliada imediatamente após o 
sacrifício ou registada para análise posterior. A percentagem de espermato ­
zóides com mobilidade progressiva pode ser determinada de forma subjetiva ou objetiva, através da análise de movimento assistida por computador (19) 
(20) (21) (22) (23) (24). Para a avaliação da morfologia dos espermatozói ­
des, deve examinar-se uma amostra de esperma do epidídimo (ou ducto deferente) com preparações fixas ou húmidas (25) e, pelo menos, 200 espermatozóides por amostra classificados como normais (a cabeça e o 
flagelo/cauda têm uma aparência normal) ou anormais. São exemplo de 
anomalias morfológicas dos espermatozóides a fusão, cabeças isoladas e cabeças e/ou caudas disformes (26). Cabeças de espermatozóides disformes ou grandes podem indicar defeitos na espermiação.
 
59. Se as amostras de esperma forem congeladas, os esfregaços fixos e as 
imagens para a análise de mobilidade dos espermatozóides registadas na altura da autópsia (27), as análises subsequentes podem limitar-se aos ma ­
chos dos grupos de controlo e das dosagens mais elevadas. No entanto, se 
forem observados efeitos associados ao tratamento, os grupos de dose mais 
baixa também devem ser avaliados.
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Autópsia macroscópica  
60. Na altura do término do estudo ou em caso de morte prematura, todos os 
animais P e F  1 são sujeitos a autópsia e examinados macroscopicamente no 
que se refere a anomalias estruturais ou alterações patológicas. Deve prestar-se especial atenção aos órgãos do sistema reprodutivo. As crias eutanasiadas por se encontrarem moribundas e as crias mortas devem ser 
registadas e, se não estiverem maceradas, examinadas quanto a potenciais 
defeitos e/ou causa de morte, e preservadas.
 
61. Nas fêmeas P e F  1 adultas, é examinado um esfregaço vaginal no dia da 
autópsia para determinar o estádio do ciclo éstrico e permitir a correlação 
com a histopatologia dos órgãos reprodutivos. Os úteros de todas as fêmeas P (e fêmeas F
 1 , se aplicável) são examinados relativamente à presença e 
número de locais de implantação, sem comprometer a avaliação histopato ­
lógica.  
Pesagem dos órgãos e preservação de tecido — animais adultos P e F  1 
62. Na altura do término do estudo, os pesos corporais e os pesos húmidos dos 
órgãos abaixo listados de todos os animais P e todos os adultos F  1 das 
coortes relevantes (como descrito em baixo), são determinados logo que 
possível após a dissecação, para evitar que sequem. Posteriormente, estes órgãos devem ser preservados em condições adequadas. Salvo indicação em contrário, os órgãos pares podem ser pesados individualmente ou em con ­
junto, de forma consistente com a prática comum do laboratório em ques ­
tão.
 
— Útero (com ovidutos e colo do útero), ovários;  
— Testículos, epidídimos (total e cauda para as amostras utilizadas para 
contagens de espermatozóides);  
— Próstata (partes dorsolateral e ventral em conjunto). Impõe-se grande 
prudência durante o corte do complexo da próstata, de forma a evitar 
a perfuração das vesículas seminais repletas de fluido. Se se verificar 
um efeito associado ao tratamento no peso total da próstata, os segmen ­
tos dorsolateral e ventral devem ser cuidadosamente dissecados após a fixação e pesados separadamente.
 
— Vesículas seminais com glândulas de coagulação e respetivos fluidos 
(como uma unidade);  
— Cérebro, fígado, rins, coração, baço, timo, hipófise, tiróide (pós-fixa ­
ção), glândulas suprarrenais e órgãos e tecidos-alvo conhecidos.  
63. Para além dos órgãos acima listados, deve preservar-se amostras dos nervos 
periféricos, músculo, medula espinal, olho e nervo ótico, trato gastrointes ­
tinal, bexiga, pulmão, traqueia (com a tiróide e paratiróide), medula óssea, 
ducto deferente (machos), glândula mamária (machos e fêmeas) e vagina, em condições adequadas.
 
64. Todos os órgãos dos animais da coorte 1A devem ser pesados e preservados 
para histopatologia.  
65. Para a investigação de efeitos imunotóxicos induzidos antes e depois do 
parto, 10 machos e 10 fêmeas dos animais da coorte 1A de cada grupo de 
tratamento (1 macho ou 1 fêmea por ninhada; todas as ninhadas represen ­
tadas por pelo menos 1 cria; seleção aleatória) serão sujeitos ao seguinte procedimento no término do estudo:
 
— pesagem dos nós linfáticos associados e distantes da via de exposição 
(para além da pesagem das glândulas suprarrenais, do timo e do baço, já 
realizada em todos os animais da coorte 1A);  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 875
 
— análise da subpopulação de linfócitos esplénicos (linfócitos T CD4+ e 
CD8+, linfócitos B e células exterminadoras naturais), utilizando uma 
metade do baço; a outra metade do baço é preservada para avaliação histopatológica.
 
A análise de subpopulações de linfócitos esplénicos em animais não imu ­
nizados (coorte 1A) determinará se a exposição está relacionada com uma 
mudança na distribuição estável imunológica de linfócitos auxiliares 
(CD4+) ou citotóxicos (CD8+) provenientes do timo ou células extermina ­
doras naturais (NK) (respostas rápidas às células neoplásicas e agentes patogénicos).
 
66. Os animais da coorte 1B devem ter os seguintes órgãos pesados e os tecidos 
correspondentes processados para a fase de bloco:  
— Vagina (não pesada)  
— Útero com colo do útero  
— Ovários  
— Testículos (pelo menos um)  
— Epidídimos  
— Vesículas seminais e glândulas de coagulação  
— Próstata  
— Hipófise  
— Órgãos-alvo identificados  
Deve proceder-se à histopatologia na coorte 1B se os resultados da coorte 
1A não forem inequívocos, ou em casos de suspeita de tóxicos para o sistema reprodutivo ou endócrino.
 
67. Coortes 2A e 2B: Ensaio de neurotoxicidade no desenvolvimento (21.  o ou 
22. o dia pós-natal e descendência adulta). O estudo dos animais da coorte 
2A termina após o ensaio comportamental, com pesagem de cérebro regis ­
tada e neuro-histopatologia completa para efeitos de avaliação de neuroto ­
xicidade. O estudo dos animais da coorte 2B termina no 21.  o ou 22.  o dia 
após o nascimento, com a pesagem de cérebro registada e o exame micros ­
cópico do mesmo para efeitos de avaliação de neurotoxicidade. A fixação 
com perfusão é necessária para os animais da coorte 2A e opcional para os animais da coorte 2B, como descrito no método de ensaio B.53 (35).
 
Pesagem de órgãos e preservação de tecido — animais F  1 desmamados  
68. O estudo das crias não selecionadas para coortes, incluindo as de tamanho 
inferior ao normal, termina após o desmame, no 22.  o dia após o nascimento, 
a não ser que os resultados apontem para a necessidade de investigação subsequente em vida. As crias cujo estudo já tenha terminado são sujeitas a autópsia macroscópica, incluindo uma avaliação dos órgãos reprodutores, 
consoante descrito nos parágrafos 62 e 63. O cérebro, o baço e o timo de 
até 10 crias por sexo e por grupo, do maior número possível de ninhadas, devem ser pesados e preservados em condições adequadas. Para além disso, os tecidos mamários destas crias do sexo masculino e feminino podem ser 
preservados para posterior análise microscópica (
 1 ) [ver documento de 
orientações 151 da OCDE (40)]. As anomalias graves e os tecidos-alvo devem ser preservados para possível exame histológico.
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( 1 ) Os estudos mostram que a glândula mamária, especialmente durante o seu desenvolvi ­
mento precoce, constitui um parâmetrosensível para a ação do estrogénio. Recomenda-se 
que os parâmetros que envolvam glândulas mamárias de crias de ambos os sexos sejam 
incluídos neste método de ensaio, quando validados.
 Histopatologia — animais P  
69. É realizada uma histopatologia completa dos órgãos listados nos parágrafos 
62 e 63 para todos os animais P de controlo e sujeitos a uma dose elevada. 
Os órgãos que apresentem alterações associadas ao tratamento devem tam ­
bém ser examinados em todos os animais nos grupos de dosagem inferior para ajudar a determinar um NOAEL. Para além disso, os órgãos reprodu ­
tores de todos os animais com suspeita de fertilidade reduzida, por exemplo 
aqueles que não conseguiram acasalar, conceber, reproduzir-se ou dar à luz descendência saudável, ou cujo ciclo éstrico ou quantidade, mobilidade ou morfologia dos espermatozóides tenham sido afetados, bem como todas as 
lesões graves, devem ser sujeitos a avaliação histopatológica.
 
Histopatologia — animais F  1 
Animais da coorte 1  
70. É realizada uma histopatologia completa dos órgãos listados nos parágrafos 
62 e 63 para todos os animais adultos de controlo e sujeitos a uma dose elevada da coorte 1A. Todas as ninhadas devem estar representadas por pelo menos 1 cria por sexo. Os órgãos e tecidos que apresentem alterações 
associadas ao tratamento e todas as lesões graves devem também ser exa ­
minados em todos os animais dos grupos de dosagem inferior para ajudar a determinar um NOAEL. Para a avaliação de efeitos induzidos antes e 
depois do parto nos órgãos linfóides, deve ser avaliada a histopatologia 
dos nós linfáticos e medula óssea colhidos de 10 machos e 10 fêmeas da coorte 1
 a , juntamente com a avaliação histopatológica do timo, baço e 
glândulas suprarrenais já realizada em todos os animais 1A.  
71. Os tecidos reprodutivos e endócrinos de todos os animais da coorte 1B, 
processados para a fase de bloco, consoante descrito no parágrafo 66, devem ser alvo de exame histopatológico em caso de suspeita de tóxicos para o sistema reprodutor ou endócrino. A coorte 1B deve também ser 
sujeita a exame histológico se os resultados da coorte 1A não forem ine ­
quívocos.
 
72. Os ovários de fêmeas adultas devem conter folículos primordiais e em 
crescimento, assim como corpos lúteos; assim, um exame histopatológico 
deve ter como objetivo uma avaliação quantitativa dos folículos primordiais 
e de baixo crescimento, assim como dos corpos lúteos, em fêmeas F  1 ; o 
número de animais, a seleção da secção do ovário e o tamanho da amostra da secção devem ser estatisticamente adequados para o procedimento de 
avaliação utilizado. A enumeração folicular deve ser realizada em primeiro 
lugar em animais de controlo e sujeitos a dosagem elevada e, se se verificar um efeito adverso nos últimos, devem ser examinadas as dosagens inferio ­
res. O exame deve incluir a enumeração da quantidade de folículos primor ­
diais, que podem ser combinados com folículos de baixo crescimento, para 
comparação entre os ovários dos animais tratados e dos animais de controlo [ver documento de orientações 151 da OCDE (40)]. A avaliação dos corpos lúteos deve ser realizada em paralelo com o ensaio ao ciclo éstrico, de 
modo a que o estádio do ciclo possa ser tido em consideração na avaliação. 
O oviduto, o útero e a vagina são examinados quanto ao desenvolvimento típico do órgão.
 
73. São realizados exames de histopatologia testicular detalhados nos machos 
F 1 de modo a identificar efeitos associados ao tratamento na diferenciação e 
desenvolvimento dos testículos e na espermatogénese (38). Quando possí ­
vel, devem ser examinadas secções da rede testicular. A cabeça, corpo e cauda do epidídimo e o ducto deferente são examinados quanto ao desen ­
volvimento típico do órgão, assim como quanto aos parâmetros requeridos 
para os machos P.
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Animais da coorte 2  
74. É realizada uma neuro-histopatologia de todos os animais de controlo e 
sujeitos a uma dose elevada da coorte 2A, por sexo, a seguir ao término do ensaio neurocomportamental (depois do 75.
 o mas antes do 90.  o dia após 
o nascimento). É realizada a histopatologia do cérebro de todos os animais 
de controlo e sujeitos a uma dose elevada da coorte 2B, por sexo, no 21.
 o ou 22.  o dia após o nascimento. Os órgãos ou tecidos que apresentem 
alterações associadas ao tratamento devem também ser examinados nos 
animais dos grupos de dosagem inferior, para ajudar a determinar um 
NOAEL. Nos animais das coortes 2A e 2B, são examinadas várias secções do cérebro para permitir o exame dos bolbos olfativos, córtex cerebral, 
hipocampo, gânglios basais, tálamo, hipotálamo, centro do cérebro (forame 
cego, calote e pedúnculos cerebrais), tronco cerebral e cerebelo. Apenas na coorte 2A, são examinados os olhos (retina e nervo ótico) e amostras dos nervos periféricos, músculo e medula espinal. Todos os procedimentos 
neuro-histológicos devem estar em conformidade com o método de ensaio 
B.53 (35).
 
75. As avaliações morfométricas (quantitativas) devem ser realizadas em áreas 
representativas do cérebro (secções homólogas selecionadas cuidadosamente 
com base em marcos microscópicos) e podem incluir medições lineares ou espaciais de regiões específicas do cérebro. Pelo menos três secções con ­
secutivas devem ser retiradas em cada marco (nível), de modo a selecionar a 
secção mais homóloga e representativa do cérebro específico a avaliar. O neuropatologista deve verificar com cuidado se as secções preparadas para a medição são equivalentes às outras do conjunto de amostras e, assim, 
indicadas para inclusão, uma vez que as medições lineares, em particular, 
podem variar ao longo de uma distância relativamente curta (28). As sec ­
ções não homólogas não devem ser utilizadas. O objetivo é colher amostras de todos os animais reservados para este propósito (10/sexo/nível de dose); 
porém, pode também ser adequada uma quantidade menor. No entanto, 
amostras de menos de 6 animais/sexo/nível de dose não são geralmente consideradas suficientes para efeitos deste método de ensaio. Pode recorrer-se à estereologia para identificar efeitos associados ao tratamento 
em parâmetros como o volume ou o número de células em regiões neuroa ­
natómicas específicas. Todos os aspetos da preparação de amostras de tecido, desde a fixação do tecido, dissecação das amostras de tecido, pro ­
cessamento do tecido até à coloração de lâminas, devem seguir uma con ­
ceção equilibrada para que cada lote contenha amostras representativas de 
cada grupo de dosagem. Quando se utilizarem análises morfométricas ou estereológicas, o tecido do cérebro deve ser envolvido em meios adequados em todos os níveis de dose em simultâneo, de modo a evitar artefactos de 
contração associados a um armazenamento prolongado no fixador.
 
RELATÓRIOS  
Dados  
76. Os dados são registados individualmente e resumidos sob a forma de tabela. 
Se for caso disso, para cada grupo de ensaio e cada geração, deve 
registar-se o seguinte: número de animais no início do ensaio, número de animais encontrados mortos durante o ensaio ou eutanasiados, hora de todos 
os óbitos, naturais ou por eutanásia, número de animais férteis, número de 
fêmeas grávidas, número de fêmeas a dar à luz uma ninhada e número de animais que apresenta sinais de toxicidade. Também deve ser registada uma descrição da toxicidade, incluindo a hora de início, duração e gravidade.
 
77. Os resultados numéricos devem ser avaliados através de um método esta ­
tístico adequado e aceite. Os métodos estatísticos devem ser selecionados no âmbito da definição do estudo e mencionar, de modo adequado, os dados 
fora do normal (p. ex.: dados de contagem), não considerados (p. ex.: tempo 
de observação limitado), não independentes (p. ex.: efeitos da ninhada e
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 878
 
medições repetidas) e as variâncias desiguais. Os modelos lineares genera ­
lizados mistos e modelos de dose-resposta cobrem uma vasta classe de 
ferramentas analíticas que podem ser adequadas para os dados gerados no âmbito deste método de ensaio. O relatório deve incluir informações sufi ­
cientes sobre os métodos de análise e o programa informático utilizado, para 
que o revisor/estatístico independente possa avaliar/reavaliar a análise.
 
Avaliação de resultados  
78. As conclusões devem ser avaliadas em termos de efeitos observados, in ­
cluindo as autópsias e as constatações microscópicas. A avaliação inclui a relação, ou a falta dela, entre a dose e a presença, incidência e gravidade 
das anomalias, incluindo lesões graves. Os órgãos-alvo, fertilidade, anoma ­
lias clínicas, desempenho reprodutivo e da ninhada, alterações do peso corporal, mortalidade e quaisquer outros efeitos tóxicos e no desenvolvi ­
mento também devem ser avaliados. Deve prestar-se especial atenção às 
alterações específicas do sexo. As propriedades físico-químicas do produto 
químico em estudo e, se disponíveis, os dados de toxicocinética, incluindo transferência placentária e excreção no leite, devem ser tidos em conside ­
ração durante a avaliação dos resultados do ensaio.
 
Relatório de ensaio  
79. O relatório de ensaio deve incluir as seguintes informações obtidas no 
presente estudo a partir dos animais P, F  1 e F 2 (quando relevante):  
Produto químico em estudo:  
— Todas as informações disponíveis e relevantes sobre o produto químico 
em estudo e sobre as suas propriedades toxicocinéticas e toxicodinâmi ­
cas; 
— Dados de identificação do produto;  
— Pureza;  
Veículo (se adequado):  
— Justificação da escolha do veículo, se outro que não água;  
Animais de ensaio:  
— Espécie/estirpe utilizada;  
— Número, idade e sexo dos animais;  
— Origem, condições de alojamento, dieta, materiais de nidificação, etc.;  
— Peso individual dos animais no início do ensaio;  
— Dados do esfregaço vaginal para as fêmeas P antes do início do trata ­
mento (se forem recolhidos dados nessa altura);  
— Registos de emparelhamento da geração P, indicando o macho e a 
fêmea de um acasalamento e o grau de sucesso do mesmo;  
— Registos da ninhada de origem para os adultos da geração F  1 ; 
Condições de ensaio:  
— Justificação para a escolha do nível de dosagem;  
— Detalhes sobre a formulação do produto químico em estudo/preparação 
da dieta, concentrações alcançadas;  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 879
 
— Estabilidade e homogeneidade da preparação no veículo ou agente de 
transporte (p. ex.: dieta, água potável), no sangue e/ou no leite, nas 
condições de utilização e armazenamento entre as utilizações;  
— Detalhes da administração do produto químico em estudo;  
— Conversão da concentração do produto químico em estudo (ppm) na 
dieta/água potável para a dose alcançada (mg/kg de peso corporal/dia), se aplicável;
 
— Detalhes sobre a qualidade dos alimentos e da água (incluindo compo ­
sição da dieta, se disponível);  
— Descrição detalhada sobre os procedimentos de randomização na seleção 
das crias para abate e na atribuição das crias aos grupos de ensaio;  
— Condições ambientais;  
— Lista do pessoal que participa no estudo, incluindo a respetiva formação 
profissional;  
Resultados (resumo e dados individuais por sexo e dose):  
— Consumo de alimentos, consumo de água, se disponível, eficiência ali ­
mentar (aumento do peso corporal por grama de alimentos consumidos, 
exceto para o período de coabitação e durante a amamentação) e con ­
sumo do produto químico em estudo (administração na dieta/água po ­
tável) para os animais P e F  1 ; 
— Dados de absorção (se disponíveis);  
— Dados sobre o peso corporal dos animais P;  
— Dados sobre o peso corporal dos animais F  1 selecionados, após o 
desmame;  
— Hora do óbito durante o estudo ou indicação de que os animais sobre ­
viveram até ao término do estudo;  
— Natureza, gravidade e duração das observações clínicas (reversíveis ou 
não);  
— Hematologia, análises à urina e dados químicos clínicos, incluindo TSH 
e T4;  
— Análise fenotípica das células do baço (células T, B, NK);  
— Celularidade da medula óssea;  
— Dados de resposta tóxica;  
— Número de fêmeas P e F  1 com ciclo éstrico normal ou anormal e 
duração do ciclo;  
— Tempo até ao acasalamento (intervalo pré-coito, número de dias entre o 
emparelhamento e o acasalamento);  
— Efeitos tóxicos ou outros na reprodução, incluindo números e percenta ­
gens de animais que alcançaram o acasalamento, gravidez, parto e ama ­
mentação, de machos que induziram gravidez, de fêmeas com sinais de distócia/parto prolongado ou difícil;
 
— Duração da gravidez e, se disponível, do parto;  
— Número de implantações, tamanho da ninhada e percentagem de crias 
do sexo masculino;  
— Número e percentagem de perda pós-implantação, nados-vivos e 
nados-mortos;  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 880
 
— Dados sobre o peso da ninhada e das crias (machos, fêmeas e combi ­
nados), número de animais de tamanho inferior ao normal, se 
constatado;  
— Número de crias com anomalias manifestamente visíveis;  
— Efeitos tóxicos ou outros na descendência, crescimento pós-natal, via ­
bilidade, etc.;  
— Dados sobre marcos físicos em crias e outros dados sobre o desenvol ­
vimento pós-natal;  
— Dados sobre a maturação sexual dos animais F  1 ; 
— Dados sobre observações funcionais em crias e adultos, quando aplicá ­
vel; 
— Peso corporal no momento do sacrifício e peso relativo e absoluto dos 
órgãos dos animais P e animais adultos F  1 ; 
— Dados obtidos por autópsia;  
— Descrição detalhada de todos os achados histopatológicos;  
— Número total de espermatozóides na cauda do epidídimo, percentagem 
de espermatozóides com mobilidade progressiva; percentagem de esper ­
matozóides com morfologia normal e percentagem de espermatozóides com cada uma das anomalias identificadas nos machos P e F
 1 ; 
— Números e estádios de maturação dos folículos contidos nos ovários das 
fêmeas P e F  1 , quando aplicável;  
— Enumeração de corpos lúteos nos ovários das fêmeas F  1 ; 
— Tratamento estatístico dos resultados, quando adequado;  
Parâmetros da coorte 2:  
— Descrição detalhada dos métodos utilizados para uniformizar observa ­
ções e procedimentos, assim como definições operacionais para as ob ­
servações de classificação;  
— Lista de todos os procedimentos de ensaio utilizados e justificação da 
respetiva utilização;  
— Detalhes de procedimentos comportamentais/funcionais, neuropatológi ­
cos e morfométricos utilizados, incluindo informações e detalhes sobre 
dispositivos automáticos;  
— Procedimentos para calibração e garantia de equivalência de dispositivos 
e equilibragem dos grupos de tratamento em procedimentos de ensaio;  
— Breve justificação que explique quaisquer decisões que envolvam jul ­
gamento profissional;  
— Descrição detalhada de todos os achados comportamentais/funcionais, 
neuropatológicos e morfométricos por sexo e grupo de dosagem, in ­
cluindo aumentos e diminuições em relação aos controlos;  
— Peso do cérebro;  
— Quaisquer diagnósticos decorrentes de sinais e lesões neurológicas, in ­
cluindo doenças ou condições naturais;  
— Imagens de constatações exemplares;  
— Imagens de baixa resolução para comprovar a homologia das secções 
utilizadas para morfometria;  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 881
 
— Tratamento estatístico dos resultados, incluindo modelos estatísticos uti ­
lizados para analisar os dados e os resultados, independentemente de 
terem sido significativos ou não;  
— Relação de quaisquer outros efeitos tóxicos para uma conclusão sobre o 
potencial neurotóxico do produto químico em estudo, por sexo e grupo de dosagem;
 
— Impacto de quaisquer informações toxicocinéticas nas conclusões;  
— Dados que suportam a fiabilidade e sensibilidade do método de ensaio 
(ou seja, dados positivos e históricos de controlo);  
— Relações, se existentes, entre os efeitos neuropatológicos e funcionais;  
— NOAEL ou dose de referência para crias e descendentes, por sexo e 
grupo de dosagem;  
— Discussão da interpretação global dos dados com base nos resultados, 
incluindo uma conclusão sobre se o produto químico provocou, ou não, 
neurotoxicidade no desenvolvimento e o NOAEL;  
Parâmetros da coorte 3:  
— Títulos de anticorpos IgM séricos (sensibilização a SRBC ou KLH), ou 
unidades PFC IgM esplénicas (sensibilização a SRBC);  
— O desempenho do método TDAR deve ser confirmado como parte do 
processo de otimização nos laboratórios que realizam o ensaio pela primeira vez e periodicamente (p. ex.: anualmente) por todos os labo ­
ratórios;
 
— Discussão da interpretação global dos dados com base nos resultados, 
incluindo uma conclusão sobre se o produto químico provocou, ou não, 
imunotoxicidade no desenvolvimento e NOAEL;  
Discussão dos resultados  
Conclusões, incluindo valores de NOAEL nos progenitores e na descendên ­
cia 
Todas as informações que não tenham sido obtidas durante o estudo, mas 
que sejam úteis para a interpretação dos resultados (p. ex.: semelhanças com 
os efeitos de quaisquer neurotóxicos conhecidos) devem também ser 
disponibilizadas.  
Interpretação dos Resultados  
80. Um «Estudo alargado de toxicidade durante a reprodução numa geração» 
proporcionará informações sobre os efeitos da exposição repetida a produtos químicos durante todas as fases do ciclo reprodutivo, conforme necessário. 
Em particular, o estudo providencia informações sobre o sistema reprodu ­
tivo e sobre os parâmetros de desenvolvimento, crescimento, sobrevivência e funcionais da descendência até ao 90.
 o dia após o nascimento.  
81. A interpretação dos resultados do estudo deve ter em consideração todas as 
informações disponíveis sobre o produto químico, incluindo propriedades físico-químicas, toxicocinéticas e toxicodinâmicas, informações relevantes 
disponíveis sobre análogos estruturais e resultados de estudos de toxicidade 
anteriores com o produto químico em estudo (p. ex.: toxicidade aguda, toxicidade após aplicação repetida, estudos mecanísticos e estudos que ava ­
liam se existem diferenças qualitativas e quantitativas substanciais entre 
espécies no que respeita às propriedades metabólicas  in vivo /in vitro ). Os 
resultados da autópsia macroscópica e da pesagem dos órgãos devem ser avaliados no contexto das observações de outros estudos com dose repetida, quando tal for viável. As reduções no crescimento das crias podem ser 
consideradas relativamente a uma influência do produto químico em estudo 
na composição do leite (29).
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 882
 
Coorte 2 (Neurotoxicidade no desenvolvimento)  
82. Os efeitos neurocomportamentais e neuropatológicos podem ser interpreta ­
dos no contexto de todos os achados, recorrendo a uma abordagem de 
suficiência de prova com parecer de peritos. Devem ser discutidos os pa ­
drões das constatações comportamentais ou morfológicas, se presentes, as ­
sim como a evidência de uma relação dose-resposta. A avaliação de neu ­
rotoxicidade no desenvolvimento, incluindo estudos epidemiológicos em 
humanos ou relatórios de caso e estudos experimentais em animais (p. ex.: dados toxicocinéticos, informação sobre estrutura/atividade e dados de outros estudos de toxicidade), deve ser incluída nesta caracterização. 
A avaliação dos dados deve incluir uma discussão da significância biológica 
e estatística. A avaliação deve incluir a relação, se existente, entre alterações neuropatológicas e comportamentais. Para orientações quanto à interpreta ­
ção dos resultados de neurotoxicidade no desenvolvimento, consultar o 
método de ensaio B.53 (35) e Tyl  et al. , 2008 (31).
 
Coorte 3 (Imunotoxicidade no desenvolvimento)  
83. A supressão ou o reforço da função imunitária, conforme estipulado pelas 
TDAR (respostas de anticorpos dependentes de células T) deve avaliar-se no contexto de todas as observações constatadas. A significância dos resul ­
tados de TDAR deve ser sustentada por outros efeitos em indicadores 
relacionados com a imunologia (p. ex.: celularidade da medula óssea, peso e histopatologia dos tecidos linfoides, distribuição do subgrupo de linfócitos). Os efeitos estabelecidos por TDAR podem ser menos significa ­
tivos no caso de outras toxicidades constatadas em concentrações de menor 
exposição.
 
84. O documento de orientações 43 da OCDE deve ser consultado como fonte 
de ajuda na interpretação dos resultados sobre a reprodução e da neuroto ­
xicidade (26).  
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35. Capítulo B.53 do presente anexo, ‘Estudo de neurotoxicidade durante o 
desenvolvimento’.  
36. Capítulo B.54 do presente anexo, ‘Bioensaio uterotrófico em roedores: 
Ensaio de despistagem a curto prazo de propriedades estrogénicas’.  
37. Capítulo B.55 do presente anexo, ‘Bioensaio de Hershberger no rato: 
Ensaio de despistagem a curto prazo de propriedades (anti)androgénicas’.  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 885
 
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Apêndice 1  
Medidas e observações incluídas na bateria de observação funcional (coorte 2a)  
Gaiola e Campo Aberto Manipulativas Fisiológicas  
Postura Facilidade de remoção Temperatura 
Tonicoclónico involuntário Facilidade de manipulação Peso corporal 
Fechamento das pálpebras Tónus muscular Reação pupilar Piloereção Reação à aproximação Tamanho das pupilas Salivação Reação ao toque Lacrimação Resposta auditiva Vocalizações Reação ao beliscão na cauda Levantar nas patas traseiras Reação de endireitamento 
Anormalidades da marcha Abdução das patas ao aterrar 
Excitação Força de preensão dos mem ­
bros dianteiros 
Estereotipia Força de preensão dos mem ­
bros traseiros 
Comportamento estranho 
Manchas Anormalidades respiratórias
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 887
 
Apêndice 2  
DEFINIÇÕES  
Produto químico : uma substância ou uma mistura.  
Produto químico em estudo : qualquer substância ou mistura estudada utilizando 
este método de ensaio.  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 888
 
B.57.  ENSAIO DE ESTEROIDOGÉNESE H295R  
INTRODUÇÃO  
1. Este método é equivalente ao  Test Guideline  TG 456 (2011) da OCDE. A 
OCDE iniciou em 1998 uma atividade altamente prioritária com o objetivo 
de rever as diretrizes em vigor para a pesquisa e o ensaio de produtos químicos com possíveis efeitos de perturbação endócrina e desenvolver novas diretrizes. O  Conceptual Framework for Testing and Assessment of 
Endocrine Disrupting Chemicals  da OCDE, (2002) compreende cinco ní ­
veis, cada um dos quis corresponde a um nível diferente de complexidade biológica (1). O ensaio de esteroidogénese H295R  in vitro  descrito no 
presente método de ensaio utiliza uma linhagem celular do adenocarcinoma 
humano (células NCI-H295R) e constitui um ensaio  in vitro  de nível 2, 
proporcionando dados mecanísticos a utilizar para fins de monitorização e priorização. O desenvolvimento e a normalização do ensaio para a pesquisa dos efeitos dos produtos químicos na esteroidogénese, designadamente na 
produção de 17 β-estradiol (E2) e de testosterona (T), resultaram de um 
processo em várias fases. O ensaio H295R foi otimizado e validado (2) (3) (4) (5).
 
2. O objetivo do ensaio de esteroidogénese H295R consiste em detetar pro ­
dutos químicos que afetem a produção de E2 e T. O ensaio H295R tem por objetivo identificar substâncias xenobióticas que tenham por alvo(s) os 
componentes endógenos que constituem o mecanismo bioquímico intrace ­
lular que, numa sequência de reações, conduz à produção de E2 e/ou T a partir do colesterol. O ensaio H295R não tem por objetivo identificar pro ­
dutos químicos que afetem a esteroidogénese através de efeitos no sistema 
hipotálamo-hipófise-gónadas (HPG). O objetivo consiste apenas em obter 
uma resposta POSITIVA/NEGATIVA quanto ao potencial de um produto químico de induzir ou inibir a produção de T e E2; podem, contudo, obter-se resultados quantitativos em certos casos (ver pontos 53 e 54). Os 
resultados do ensaio são expressos em alterações relativas da produção de 
hormonas relativamente aos ensaios de controlo com solvente (SC). O objetivo não consiste em obter informações específicas sobre os mecanis ­
mos implicados na interação do produto químico em estudo com o sistema 
endócrino. Foram realizadas investigações com a linhagem celular tendo em 
vista identificar efeitos nas enzimas específicos e nas hormonas intermediá ­
rias, como a progesterona (2).
 
3. As definições e abreviaturas utilizadas no presente método de ensaio são 
descritas no apêndice. O apêndice I-III do documento da OCDE intitulado  
Multi-Laboratory Validation of the H295R Steroidogenesis Assay to Identify Modulators of Testosterone and Estradiol Production  (4) inclui um proto ­
colo pormenorizado com instruções para a preparação das soluções, a cul ­
tura das células e a execução das várias fases do ensaio.
 
CONSIDERAÇÕES INICIAIS E LIMITAÇÕES  
4. Na biossíntese das hormonas sexuais esteroides participam cinco enzimas 
diferentes, que catalisam seis reações específicas. A conversão enzimática 
do colesterol em pregnenolona, promovida pela enzima CYP11A de cliva ­
gem da cadeia lateral do colesterol do citocromo P450, constitui o passo inicial numa série de reações bioquímicas que conduzem à síntese de pro ­
dutos finais esteroides. Consoante a ordem das duas reações seguintes, o 
mecanismo da esteroidogénese divide-se em duas vias, a via dos Δ5-hidro­
xiesteroides e a via dos Δ4-cetoesteroides, que convergem na produção de 
androstenodiona (figura 1).
 
5. A androstenodiona é convertida em testosterona (T) por ação da desidro ­
genase dos 17 β-hidroxiesteroides (17 β-HSD). A testosterona é simultanea ­
mente um intermediário e um produto final (hormona). Nos machos, pode 
ser convertida em di-hidrotestosterona (DHT) por ação da 5 α-redutase pre ­
sente na membrana celular, no invólucro nuclear e no retículo endoplásmico dos tecidos-alvo da ação androgénica, como a próstata e as vesículas semi ­
nais. A DHT é um androgénio significativamente mais potente que a tes ­
tosterona, sendo também considerada um produto final hormonal. O ensaio 
H295R não determina a DHT (ver ponto 10).
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6. A aromatase (CYP19) é a enzima que, no processo da esteroidogénese, 
promove a conversão das substâncias androgénicas em estrogénicas, nomea ­
damente a testosterona (T) em 17 β-estradiol (E2) e a androstenodiona em 
estrona. A E2 e a T são consideradas produtos finais hormonais no processo da esteroidogénese.
 
7. A especificidade da atividade de liase da CYP17 relativamente aos subs ­
tratos intermediários difere em função das espécies. No homem, a enzima favorece os substratos da via dos Δ5-hidroxiesteroides (pregnenolona), en ­
quanto, no rato, são favorecidos os substratos da via dos Δ4-cetoesteroides 
(progesterona) (19). Estas diferenças na atividade de liase da CYP17 per ­
mitem explicar algumas diferenças específicas das espécies na resposta aos produtos químicos que alteram a esteroidogénese  in vivo  (6). Observou-se 
que as células H295 refletem mais estreitamente a expressão das enzimas 
adrenais e o mecanismo de produção de esteroides no homem adulto (20), embora, no respeitante à síntese de androgénios, produzam enzimas para as vias dos Δ5-hidroxiesteroides e dos Δ4-cetoesteroides (7) (11) (13) (15).
 
Figura 1  
Mecanismo da esteroidogénese nas células H295R
  
Nota:  
As enzimas são indicadas em itálico, as hormonas em negrito e as setas 
indicam a direção do processo. O fundo cinzento indica as vias e os pro ­
dutos corticosteróides. As hormonas sexuais e respetivas vias estão envoltas 
por uma linha circular. CYP = citocromo P450; HSD = desidrogenase dos 
hidroxiesteroides; DHEA = desidroepiandrosterona  
8. A linhagem celular do adenocarcinoma humano H295R constitui um mo ­
delo útil para a investigação  in vitro  dos efeitos na síntese de hormonas 
esteroides (2) (7) (8) (9) (10). A linhagem celular H295R exprime genes que codificam todas as enzimas-chave da esteroidogénese atrás referidas (11) (15) (figura 1). Trata-se de uma propriedade única, dado que a ex ­
pressão  in vivo  desses genes é específica dos tecidos e das fases de desen ­
volvimento, sendo que, em geral, um só tecido ou uma única fase de desenvolvimento não exprime todos os genes implicados na esteroidogénese (2). As células H295R têm características fisiológicas de células adrenais 
fetais humanas não diferenciadas por zonas (11). As células constituem um 
sistema  in vitro  específico, na medida em que têm a capacidade de produzir
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todas as hormonas esteroides do córtex adrenal e das gónadas dos adultos, 
permitindo observar, em simultâneo, efeitos na síntese de corticosteróides e 
de hormonas sexuais esteroides como os androgénios e os estrogénios, embora o ensaio tenha sido validado apenas para a deteção de T e E2. As alterações registadas pelo sistema de ensaio, expressas em alterações na 
produção de T e E2, podem decorrer duma vasta gama de interações di ­
versas dos produtos químicos em estudo com as funções esteroidogénicas expressas pelas células H295R. Essas alterações abrangem a modulação da expressão, a síntese ou a ação das enzimas implicadas na produção, trans ­
formação ou eliminação das hormonas esteroides (12) (13) (14). A inibição 
da produção hormonal pode ser devida à ligação competitiva direta a uma enzima implicada no processo, ao impacto em cofatores como o NADPH (fosfato de dinucleótido nicotinamida-adenina) e o cAMP (monofosfato de 
adenosina cíclica), e/ou a um aumento do metabolismo dos esteroides ou à 
supressão da expressão dos genes que codificam determinadas enzimas no mecanismo da esteroidogénese. Enquanto a inibição pode resultar de pro ­
cessos diretos ou indiretos implicados na produção das hormonas, a indução 
é, em geral, de natureza indireta — por exemplo, afetando cofatores como o 
NADPH e o cAMP (caso da forskolina), reduzindo o metabolismo dos esteroides (13) e/ou regulando positivamente a expressão dos genes esteroi ­
dogénicos.
 
9. O ensaio H295R apresenta várias vantagens:  
— Permite a deteção de aumentos e reduções na produção de T e E2;  
— Permite a avaliação direta do possível impacto de um produto químico 
na viabilidade das células ou na citotoxicidade. Esta característica é importante, na medida em que permite a distinção entre os efeitos 
devidos à citotoxicidade e os efeitos devidos à interação direta dos 
produtos químicos com o mecanismo da esteroidogénese, o que não é possível por recurso a sistemas de explantes de tecidos constituídos por vários tipos de células com sensibilidades e funcionalidades diversas;
 
— Não exige a utilização de animais;  
— A linhagem celular H295R encontra-se disponível no comércio.  
10. As principais limitações do ensaio são as seguintes:  
— A sua capacidade metabólica é desconhecida, sendo, provavelmente, 
bastante limitada, pelo que o ensaio não permite identificar a ação de produtos químicos que necessitem de ativação metabólica.
 
— Uma vez que é obtida a partir de tecido adrenal, a linhagem H295R 
contém as enzimas que promovem a produção dos glucocorticoides e 
dos mineralocorticoides, bem como das hormonas sexuais; os efeitos na 
produção de glucocorticoides e mineralocorticoides podem condicionar os teores de T e E2 observados no ensaio.
 
— Não determina a DHT, pelo que, em princípio, não permite detetar 
produtos químicos que inibem a 5 α-redutase, caso em que pode 
recorrer-se ao ensaio de Hershberger (16).  
— Não permite detetar produtos químicos que interfiram com a esteroido ­
génese ao nível do eixo hipotálamo-pituitária-gónadas (HPG), caso que 
só pode ser estudado com animais intactos.  
PRINCÍPIO DO ENSAIO  
11. O objetivo do ensaio consiste na deteção de produtos químicos que afetem a 
produção de testosterona e de E2. A testosterona é também um intermediá ­
rio na produção de E2. O ensaio permite detetar, em especial, produtos 
químicos que inibam ou induzam as enzimas que promovem a esteroido ­
génese.  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 891
 
12. Em geral, o ensaio é realizado em condições normalizadas de cultura celu ­
lar, em placas de cultura com 24 alvéolos. Em alternativa, podem utilizar-se 
placas de outras dimensões; contudo, a inoculação e as condições experi ­
mentais devem ser ajustadas em conformidade, de forma a manter o respeito dos critérios de desempenho.
 
13. Após um período de aclimação de 24 horas em placas multialvéolos, as 
células são expostas durante 48 horas a sete concentrações do produto químico em estudo, pelo menos em triplicado. Adicionam-se concentrações 
fixas de um solvente e de um inibidor ou promotor conhecido da produção 
de hormonas, na qualidade de controlos negativos e positivos. No final do período de exposição, é removido o meio de cada alvéolo. A viabilidade das células em cada alvéolo é analisada imediatamente após a remoção do 
meio. As concentrações de hormonas no meio podem ser medidas por 
diversos métodos, nomeadamente por recurso a conjuntos de determinação de hormonas disponíveis no comércio e/ou técnicas instrumentais como a cromatografia em fase líquida acoplada com espetrometria de massa (LC- 
-MS). Os dados são expressos em fatores de alteração relativamente ao 
controlo com solvente e à menor concentração com efeito observável (LOEC —  Lowest Observed Effect Concentration ). Se o ensaio for negati ­
vo, a concentração mais elevada objeto de ensaio é referida como concen ­
tração sem efeitos observáveis (NOEC —  No Observed Effect Concentra ­
tion). As conclusões quanto à capacidade do produto químico de afetar a 
esteroidogénese devem basear-se em, pelo menos, dois ensaios independen ­
tes. O primeiro ensaio pode consistir num rastreio de gamas de concen ­
tração, procedendo-se ao ajustamento das concentrações nos dois ensaios 
posteriores, se pertinente, caso se registem problemas de solubilidade ou citotoxicidade ou se a atividade do produto químico se situar no limite da 
gama de concentrações de ensaio.
 
PROCEDIMENTO DE CULTURA CELULAR  
Linhagem celular  
14. As células NCI-H295R são comercializadas pela  American Type Culture 
Collections  (ATCC), mediante a assinatura de um contrato ( Material Trans ­
fer Agreement  — MTA) (  1 ). 
Introdução  
15. Devido às alterações da capacidade de produção de E2 das células com a 
idade ou o número de passagens (2), as células devem ser cultivadas com base num protocolo específico antes de serem utilizadas, devendo registar-se o número de passagens desde o descongelamento das células, 
bem como o número da passagem na qual as mesmas são congeladas e 
armazenadas em azoto líquido. O primeiro número indica o número real da passagem; o segundo descreve o número da passagem na qual as células foram congeladas e armazenadas. Por exemplo, células que tenham sido 
congeladas após a passagem n.
 o 5, posteriormente descongeladas e divididas 
três vezes (quatro passagens, sendo a primeira constituída pelas células recém-descongeladas), sendo subsequentemente sujeitas a nova cultura, se ­
rão classificadas como células de passagem 4,5. O apêndice 1 do relatório 
de validação (4) apresenta um exemplo do sistema de numeração.
 
16. O meio de partida é utilizado como base para os meios suplementado e de 
congelamento. O meio suplementado é um componente necessário à cultura 
celular. O meio de congelamento destina-se especificamente a permitir o congelamento sem impacto nas células para armazenagem a longo prazo. Antes da utilização, deve analisar-se o Nu-serum  (ou um soro semelhante 
com propriedades análogas, relativamente ao qual se tenha demonstrado que 
produz dados conformes com os requisitos de desempenho e controlo da qualidade do ensaio), componente do meio suplementado, para pesquisar concentrações de fundo de T e E2. A preparação destas soluções é descrita 
no apêndice II do relatório de validação (4).
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( 1 ) ATCC CRL-2128; ATCC, Manassas, VA, USA, [http://www.lgcstandards-atcc.org/].
 17. Após o início da cultura de células H295R a partir de um lote ATCC 
original, as células devem ser sujeitas a cinco passagens (ou seja, quatro 
divisões). As células da passagem n.  o 5 são então congeladas em azoto 
líquido, para armazenagem. Antes do congelamento, procede-se ao ensaio de uma amostra das células da passagem n.
 o 4 numa placa de controlo da 
qualidade (ver pontos 36 e 37), para verificar se a produção basal de 
hormonas e a resposta aos produtos químicos de controlo positivo cumprem os critérios de controlo da qualidade definidos no quadro 5.
 
18. Após a cultura, as células H295R têm de ser congeladas e armazenadas em 
azoto líquido, de forma a garantir que são sempre da passagem ou idade 
adequada à cultura e à utilização. O número máximo de passagens após a inoculação na cultura de um lote de células novo (
 1 ) ou congelado (  2 ) acei­
tável para utilização no ensaio H295R não deve exceder 10. Por exemplo, o 
número aceitável de passagens em culturas de células a partir de um lote 
congelado na passagem n.  o 5 estará compreendido entre 4,5 e 10,5. No caso 
das células colhidas de lotes congelados, deve seguir-se o procedimento descrito no ponto 19. Estas células devem ser cultivadas por, pelo menos, 
quatro passagens adicionais (passagem 4,5) antes de serem utilizadas no 
ensaio.
 
Preparação das células a partir do material congelado  
19. Utiliza-se o procedimento de inoculação das células a partir do material 
congelado sempre que um novo lote de células é removido do azoto líquido para fins de cultura e ensaio. O procedimento pormenorizado encontra-se descrito no apêndice III do relatório de validação (4). As células são remo ­
vidas do azoto líquido, descongeladas rapidamente e colocadas num meio 
suplementado, num tubo de centrifugadora, sendo centrifugadas à tempera ­
tura ambiente, ressuspendidas em meio suplementado e transferidas para um recipiente de cultura. O meio de cultura deve ser substituído no dia seguin ­
te. As células H295R são cultivadas numa incubadora a 37 °C, em ar 
atmosférico com 5 % CO
 2 , sendo o meio renovado duas a três vezes por 
semana. Quando as células exibirem uma confluência de aproximadamente 85-90 %, devem ser divididas. A divisão é necessária para assegurar o bom 
estado e o crescimento das células e conservá-las até à realização dos 
bioensaios. As células são lavadas três vezes com uma solução-tampão salina de fosfatos (PBS, sem Ca
 2+ nem Mg  2+. ) e retiradas do recipiente 
de cultura através da adição de uma enzima de desprendimento adequada, 
por exemplo tripsina, dissolvida em PBS (sem Ca  2+ nem Mg  2+ ). Imediata ­
mente após a remoção das células do recipiente de cultura, deve suspender-se a ação da enzima através da adição de um meio suplementado na proporção de três vezes o volume utilizado no tratamento enzimático. As 
células são colocadas num tubo de centrifugadora e centrifugadas à tempe ­
ratura ambiente; o sobrenadante é removido e o aglomerado de células ressuspendido no meio suplementado. Coloca-se no novo recipiente de cultura a quantidade adequada da solução com as células. A quantidade 
desta solução deve ser ajustada de forma que as células mostrem confluên ­
cia num período de 5-7 dias. O rácio de subcultura recomendado é de 1:3 a 1:4. A placa deve ser rotulada cuidadosamente. As células ficam, assim, prontas para utilização no ensaio, devendo as células em excesso ser con ­
geladas em azoto líquido do modo descrito no ponto 20.
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 893  
( 1 ) A expressão «novo lote» refere-se a um novo lote de células recebidas do ATCC. 
( 2 ) A expressão «lote congelado» referes-se a células anteriormente cultivadas e, de seguida, 
congeladas num laboratório diverso do ATCC.
 Congelamento das células H295R (preparação para armazenamento em 
azoto líquido)  
20. Para preparar as células H295R para congelamento, deve seguir-se o pro ­
cedimento atrás descrito para a divisão das mesmas, até à etapa de ressus ­
pensão do aglomerado de células presentes no fundo do tubo de centrifu ­
gadora, que é efetuada em meio de congelamento. A solução é transferida 
para um balão criogénico devidamente rotulado e congelada a – 80 °C du ­
rante 24 horas, período após o qual o balão criogénico é transferido para o recipiente com azoto líquido, para armazenagem. O apêndice III do relatório de validação (4) contém os pormenores do procedimento a seguir.
 
Preparação das placas e pré-incubação das células para ensaio  
21. O número necessário de placas de 24 alvéolos, preparadas do modo descrito 
no ponto 19, depende do número de produtos químicos a ensaiar, bem 
como da confluência das células nos recipientes de cultura. Em geral, um 
recipiente de cultura (75 cm  2 ) com 80-90 % de células confluentes fornece 
um número de células suficiente para 1 a 1,5 placas de 24 alvéolos, à densidade-alvo de 200 000 a 300 000 células por ml de meio, resultando 
numa confluência de, aproximadamente, 50-60 % nos alvéolos em 24 horas 
(figura 2). Esta é, normalmente, a densidade celular ótima para a produção de hormonas no ensaio. A densidades mais elevadas, são alterados os perfis de produção de T e de E2. Antes de realizar o ensaio pela primeira vez, 
recomenda-se que sejam ensaiadas várias densidades de inoculação com ­
preendidas entre 200 000 e 300 000 células por ml, devendo selecionar-se para os ensaios posteriores a densidade que determine uma confluência de 50-60 % nos alvéolos em 24 horas.
 
Figura 2  
Fotomicrografia de células H295R à densidade de inoculação de 50 %, numa placa de 
cultura de 24 alvéolos, às 24 horas, no bordo (A) e no centro (B) de um alvéolo
  
22. O meio é removido com uma pipeta do recipiente de cultura, sendo as 
células lavadas três vezes com PBS estéril (sem Ca  2+ nem Mg  2+ ). Para 
desprender as células do recipiente de cultura, adiciona-se uma solução de enzima em PBS. Após um período adequado ao desprendimento das 
células, suspende-se a ação enzimática através da adição de meio suplemen ­
tado à razão de três vezes o volume utilizado no tratamento enzimático.
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Colocam-se as células num tubo de centrifugadora e centrifuga-se à tem ­
peratura ambiente; seguidamente, remove-se o sobrenadante e 
ressuspende-se o aglomerado de células em meio suplementado. Calcula-se a densidade celular, utilizando, p.ex. um hemocitómetro ou um contador celular. A solução com as células deve ser diluída para a densi ­
dade pretendida na placa e homogeneizada de forma a garantir uma densi ­
dade celular homogénea. As células são colocadas na placa com 1 ml de solução por alvéolo, devendo rotular-se as placas e os alvéolos. As placas inoculadas são incubadas durante 24 horas a 37 °C, em ar atmosférico com 
5 % de CO
 2 , de forma a permitir a aderência das células aos alvéolos.  
REQUISITOS DE CONTROLO DA QUALIDADE  
23. Durante a dosagem, é indispensável que sejam colocados nos alvéolos 
volumes exatos das soluções e amostras, dado que esses volumes determi ­
nam as concentrações utilizadas no cálculo dos resultados.  
24. Antes do início da cultura celular e de qualquer ensaio posterior, cada 
laboratório deve demonstrar a sensibilidade do seu sistema de determinação das hormonas (pontos 29-31).
 
25. Caso se utilizem métodos de determinação de hormonas baseados em an ­
ticorpos, deve averiguar-se, antes de iniciar o ensaio, o potencial de inter ­
ferência dos produtos químicos a ensaiar com o sistema de medida utilizado 
para quantificar a T e a E2, como referido no ponto 32.  
26. O DMSO é o solvente recomendado para o ensaio. Caso se utilize um 
solvente alternativo, devem determinar-se os seguintes parâmetros:  
— Solubilidade do produto químico em estudo, da forskolina e do proclo ­
raz no solvente; e  
— Citotoxicidade em função da concentração do solvente.  
Recomenda-se que a concentração máxima permissível do solvente não 
exceda uma diluição de 10 vezes a concentração menos citotóxica do solvente.
 
27. Antes de realizar o ensaio pela primeira vez, o laboratório deve realizar um 
ensaio de qualificação que demonstre a sua capacidade de adotar e manter 
as condições de cultura celular e condições experimentais adequadas ao 
ensaio do produto químico em conformidade com os pontos 33-35.  
28. Deve realizar-se um ensaio de controlo, como descrito nos pontos 36 e 37, 
antes da utilização de um novo lote de células, com vista a avaliar o desempenho das mesmas.
 
Desempenho do sistema de determinação das hormonas  
Sensibilidade, exatidão e precisão do método; reatividade cruzada com a 
matriz da amostra  
29. Para a análise da T e da E2 produzidas pelas células H295R, cada labora ­
tório pode utilizar um sistema de determinação de hormonas da sua escolha, 
desde que o mesmo satisfaça os critérios de desempenho, nomeadamente os limites de quantificação (LOQ). Estes são, geralmente, de 100 pg/ml no caso da testosterona e de 10 pg/ml no caso da E2, valores que se baseiam 
nos níveis de hormonas basais observados nos estudos de validação. Podem, 
contudo, justificar-se níveis mais elevados ou mais baixos, em função dos
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níveis basais de hormonas obtidos no laboratório em causa. Antes de iniciar 
a verificação do controlo da qualidade e os ensaios, o laboratório deve 
demonstrar que o método a utilizar na determinação das hormonas permite medir as respetivas concentrações no meio suplementado com exatidão e precisão suficientes para o cumprimento dos critérios de controlo de quali ­
dade especificados nos quadros 1 e 5, analisando o meio suplementado 
enriquecido com hormona (controlo interno). O meio suplementado é enri ­
quecido com, pelo menos, três concentrações de cada hormona ( p.ex.  100, 
500 e 2 500 pg/ml de T; 10, 50 e 250 pg/ml de E2; em alternativa, podem 
utilizar-se as concentrações mais baixas possíveis em função dos limites de 
deteção do sistema de determinação escolhido para as concentrações enri ­
quecidas mais baixas para a T e a E2) e, seguidamente, analisado. As concentrações de hormonas determinadas nas amostras não extraídas não 
devem divergir em mais de 30 % das concentrações nominais e a variação 
entre determinações replicadas da mesma amostra não deve exceder 25 % (o quadro 8 contém critérios adicionais de controlo da qualidade). Caso estes critérios sejam satisfeitos, considera-se que o método de determinação 
das hormonas é suficientemente exato e preciso, não se prevendo a ocor ­
rência de reações cruzadas com os componentes do meio (matriz da amos ­
tra) que possam influir de forma significativa nos resultados. Nesse caso, não é necessário proceder à extração das amostras antes da determinação 
das hormonas.
 
30. Se não forem satisfeitos os critérios de controlo da qualidade constantes dos 
quadros 1 e 8, pode estar a ocorrer um efeito matricial significativo, de ­
vendo realizar-se um ensaio com meio enriquecido extraído. O apêndice II 
do relatório de validação (4) apresenta um exemplo do procedimento de extração. A determinação das concentrações de hormonas nas amostras extraídas deve efetuar-se em triplicado (
 1 ). Se, após a extração, for possível 
demonstrar que os componentes do meio não interferem com o método de 
deteção das hormonas definido pelos critérios de controlo da qualidade, todos os ensaios subsequentes devem ser realizados com amostras extraídas. Se os critérios de controlo da qualidade não forem cumpridos após a ex ­
tração, o sistema de determinação das hormonas utilizado não é adequado 
para os fins do ensaio de esteroidogénese H295R, devendo recorrer-se a um método alternativo.
 
Curva-padrão  
31. As concentrações de hormonas nos controlos com solvente devem situar-se 
no troço linear da curva-padrão, devendo, preferencialmente, ser próximas do valor correspondente ao ponto médio do referido troço, para que se possa determinar a indução ou a inibição da síntese das hormonas. As 
diluições do meio (ou dos extratos) a determinar devem ser selecionadas 
em conformidade. A relação linear deve ser definida por um método esta ­
tístico adequado.
 
Ensaio de determinação da interferência de produtos químicos  
32. Se, para a determinação das hormonas, forem utilizados ensaios baseados 
em anticorpos, como ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA) e en ­
saios radioimunológicos (RIA), deve averiguar-se a possível interferência de cada um dos produtos químicos em estudo com o sistema de determinação 
de hormonas a utilizar, antes do início do ensaio do produto em causa 
[apêndice III do relatório de validação (4)], dado que alguns produtos químicos podem interferir com os processos de ensaio (17). Caso a análise demonstre uma interferência traduzida num aumento da produção de T e/ou 
E2 ≥ 20 % relativamente à produção basal destas hormonas, deve efetuar-se 
um ensaio de interferência dos produtos químicos na determinação das hormonas (do tipo descrito no apêndice III do relatório de validação (4), secção 5.0) com todas as diluições do produto químico em estudo, para 
identificar a dose-limiar à qual ocorre uma interferência significativa 
(≥ 20 %). Se a interferência for inferior a 30 %, os resultados podem ser 
corrigidos em conformidade. Se exceder 30 %, os dados não são válidos,
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 896  
( 1 ) Nota:  Se a extração for necessária, devem efetuar-se três medições em replicado para 
cada extrato. Cada amostra deve ser extraída apenas uma vez.
 devendo as concentrações em causa ser eliminadas do estudo. Se ocorrer 
uma interferência significativa da substância em estudo com o sistema de 
determinação das hormonas a mais de uma concentração não citotóxica, deve utilizar-se outro sistema de determinação. Para evitar interferências de produtos químicos contaminantes, recomenda-se que as hormonas sejam 
extraídas do meio por recurso a solventes adequados; o relatório de valida ­
ção descreve métodos possíveis para esse efeito (4).
 
Quadro 1  
Critérios de desempenho para os sistemas de determinação de 
hormonas  
Parâmetro Critério  
Sensibilidade do método de deter ­
minação Limite de quantificação (LOQ) 
T: 100 pg/ml; E2: 10 pg/ml (  r ) 
Eficiência de extração das hormo ­
nas (apenas se esta for necessária) As taxas médias de recuperação (com 
base em determinações em triplicado) 
para as quantidades de hormonas adi ­
cionadas não devem exibir um des ­
vio superior a 30 % da quantidade adicionada. 
Interferência química (apenas para 
sistemas baseados em anticorpos) Não deve registar-se uma reatividade 
cruzada substancial ( ≥ 30 % da pro ­
dução basal da hormona em causa) com nenhuma das hormonas produzi ­
das pelas células (
 s ) ( t ) 
( r ) Nota:  Os limites de determinação do método derivam dos valores de produção 
basal de hormonas constantes do quadro 5 e baseiam-se no desempenho. Os 
limites podem ser superiores se a produção basal de hormonas for superior. 
( s ) A percentagens superiores, alguns anticorpos da T e da E2 podem reagir de forma 
cruzada com a androstenodiona e a estrona, respetivamente. Nessas condições, não é possível determinar com exatidão os efeitos na 17 β-HSD. Apesar disso, os 
dados podem proporcionar informações úteis sobre os efeitos na produção de 
estrogénios ou androgénios em geral. Nesses casos, os dados devem ser expressos 
em androgénios/estrogénios produzidos, em vez de E2 e T. 
(
 t ) Designadamente: colesterol, pregnenolona, progesterona, 11-desoxicorticosterona, 
corticosterona, aldosterona, 17 α-pregnenolona,17 α-progesterona, desoxicortisol, 
cortisol, DHEA, androstenodiona, estrona.  
Ensaio de proficiência laboratorial  
33. Antes de ensaiar produtos químicos desconhecidos, um laboratório deve 
demonstrar, por recurso ao ensaio de proficiência laboratorial, a sua capa ­
cidade de adotar e manter as condições de cultura celular e condições experimentais adequadas à boa realização do ensaio. Dado que o desempe ­
nho de um ensaio está diretamente ligado ao pessoal do laboratório que o 
realiza, o procedimento deve ser parcialmente repetido caso ocorram mu ­
danças no pessoal.
 
34. O ensaio de proficiência deve ser realizado nas condições descritas nos 
pontos 38 a 40, expondo células a sete concentrações crescentes de indu ­
tores e inibidores fortes, moderados e ligeiros, bem como a um produto 
químico negativo (ver quadro 2). Especificamente, os produtos químicos a ensaiar incluem o indutor forte forskolina (n.
 o CAS 66575-29-9); o inibidor 
forte procloraz (n.  o CAS 67747-09-5); o indutor moderado atrazina 
(n. o CAS 1912-24-9); o inibidor moderado aminoglutetimida (n.  o CAS 
125-84-8); o indutor fraco (produção de E2) e o inibidor fraco (produção  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 897
 
de T) bisfenol A (n.  o CAS 80-05-7), bem como o produto químico negativo 
gonadotrofina coriónica humana (HCG) (n.  o CAS 9002-61-3), como se 
ilustra no quadro 2. Utilizam-se placas distintas para cada produto químico, de acordo com o modelo que se ilustra no quadro 6. Cada ensaio diário dos produtos químicos para o esnaio de proficiência deve incluir uma placa de 
controlo da qualidade (quadro 4, pontos 36-37).
 
Quadro 2  
Produtos químicos para o ensaio de proficiência e concentrações de 
exposição  
Produto químico Concentrações de ensaio [ μM] 
Procloraz 0 (  a ), 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 
Forskolina 0 (  a ), 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 
Atrazina 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100 
Aminoglutetimida 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100 
Bisfenol A 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100 
HCG 0 (  a ), 0,03, 0,1, 1, 3, 10, 30, 100  
( a ) Controlo com solvente (DMSO) (0), 1 μl DMSO/alvéolo.  
No ensaio de proficiência laboratorial, a exposição das células H295R aos 
produtos químicos é efetuada em placas de 24 alvéolos. A dosagem é expressa em μM no respeitante a todas as doses de produtos químicos 
em estudo. As doses devem ser administradas em DMSO a 0,1 % (v/v) 
por alvéolo. Todas as concentrações de ensaio devem ser ensaiadas em 
triplicado (quadro 6). Utilizam-se placas distintas para cada produto quími ­
co. Cada série de ensaios diária deve incluir uma placa de controlo da qualidade.
 
35. As análises da viabilidade celular e das hormonas devem ser efetuadas do 
modo descrito nos pontos 42 a 46. O valor-limiar (menor concentração com 
efeito observável, LOEC) e a decisão de classificação devem ser comuni ­
cados e comparados com os valores constantes do quadro 3. Os dados são considerados aceitáveis se forem conformes com o LOEC e a decisão de 
classificação constantes do quadro 3.
 
Quadro 3  
Valores-limiar (LOEC) e decisões de classificação respeitantes aos produtos químicos 
para o ensaio de proficiência  
N. o CAS LOEC [μM] Decisão de classificação 
T E2 T E2  
Procloraz 67747-09-5 ≤ 0,1 ≤ 1,0 + (  a ) (Inibição) + (Inibição) 
Forskolina 66575-29-9 ≤ 10 ≤ 0,1 + (Indução) + (Indução) 
Atrazina 1912-24-9 ≤ 100 ≤ 10 + (Indução) + (Indução) 
Aminogluteti ­
mida 125-84-8 ≤ 100 ≤ 100 + (Inibição) + (Inibição)  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 898
 
N. o CAS LOEC [μM] Decisão de classificação 
T E2 T E2  
Bisfenol A 80-05-7 ≤ 10 ≤ 10 + (Inibição) + (Indução) 
HCG 9002-61-3 n/a n/a Negativo Negativo  
( a ) +, positivo 
n/a: não aplicável, dado que não deverão ocorrer alterações após a exposição a concentrações não citotóxicas do controlo negativo.
 
Placa de controlo da qualidade  
36. A placa de controlo da qualidade é utilizada para verificar o desempenho 
das células H295R em condições de cultura normalizadas, bem como para criar uma base de dados históricos de concentrações das hormonas nos 
solventes de controlo, nos controlos positivos e negativos e nos outros 
ensaios de controlo da qualidade que forem sendo efetuados.
 
— O desempenho das células H295R deve ser avaliado por recurso a uma 
placa de controlo da qualidade para cada novo lote ATCC, ou após a 
utilização, pela primeira vez, de um lote de células previamente conge ­
ladas, exceto se tiver sido realizado um ensaio de proficiência labora ­
torial (pontos 32-34) com esse lote de células.  
— A placa de controlo da qualidade proporciona uma avaliação completa 
das condições de ensaio de produtos químicos ( p.ex.  viabilidade celular, 
controlos com solvente, controlos negativos e positivos, variabilidade intra e interensaios), devendo constituir parte integrante de cada ensaio.
 
37. O ensaio de controlo da qualidade é realizado numa placa de 24 alvéolos, 
seguindo os mesmos procedimentos em matéria de incubação, dosagem, 
viabilidade celular/citotoxicidade, extração e análise das hormonas descritos nos pontos 38 a 46 para o ensaio dos produtos químicos. A placa de controlo da qualidade contém brancos, controlos com solvente e duas con ­
centrações de um indutor (forskolina, 1, 10 μM) e de um inibidor (proclo ­
raz, 0,1, 1 μM) conhecido da síntese de E2 e T. Utiliza-se também, em 
alguns alvéolos, MeOH (controlo positivo do ensaio de viabilidade celular/ /citotoxicidade). O quadro 4 apresenta uma descrição pormenorizada da 
configuração da placa. Os critérios que esta deve satisfazer são enumerados 
no quadro 5. Tanto no controlo com solvente como nos alvéolos em branco deve observar-se a produção basal mínima de hormonas (T e E2).
 
Quadro 4  
Configuração da placa de controlo da qualidade para o ensaio do desempenho de células 
H295R não expostas e de células expostas a inibidores (PRO = procloraz) e promotores 
(FOR = forskolina) conhecidos da produção de E2 e T. Após o termo da exposição e a remoção do meio, adiciona-se uma solução de metanol a 70 % a todos os alvéolos com MeOH, que servirá de controlo positivo da citotoxicidade [ver o ensaio de citotoxicidade 
no apêndice III do relatório de validação (4)]
 
1 2 3 4 5 6  
A Branco (  a ) Branco (  a ) Branco (  a ) Branco (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) Branco (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) Branco (  a ) 
(+ MeOH) (  b ) 
B DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) DMSO (  c ) 
1 μl 
(+ MeOH) (  b ) ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 899
 
1 2 3 4 5 6  
C FOR 1 
μM FOR 1 
μM FOR 1 
μM PRO 0,1 μM PRO 0,1 μM PRO 0,1 μM 
D FOR 10 
μM FOR 10 
μM FOR 10 
μM PRO 1 μM PRO 1 μM PRO 1 μM 
( a ) As células nos alvéolos correspondentes ao branco recebem apenas meio (sem solvente). 
( b ) O metanol (MeOH) é adicionado  após o termo da exposição, sendo o meio removido dos alvéolos. 
( c ) Controlo com solvente DMSO (1 μl/alvéolo).  
Quadro 5  
Critérios de desempenho para a placa de controlo da qualidade  
T E2  
Produção basal de hor ­
monas no controlo com 
solvente (CS) ≥ 5 × LOQ ≥ 2,5 × LOQ 
Indução (10 μM fors­
kolina) ≥ 1,5 × CS ≥ 7,5 × CS 
Inibição (1 μM proclo ­
raz) ≤ 0,5 × CS ≤ 0,5 × CS  
PROCEDIMENTO DE ExposIÇÃO AOS PRODUTOS QUÍMICOS  
38. As células pré-incubadas são tiradas da incubadora (ponto 21) e observadas 
ao microscópio, para assegurar que se encontram em boas condições (ade ­
rência, morfologia), antes da dosagem.  
39. As células são colocadas num espaço confinado biosseguro, sendo o meio 
suplementado removido e substituído por um novo meio suplementado (1 
ml/alvéolo). O DMSO é o solvente preferido neste método de ensaio. Contudo, se existirem motivos para utilizar outros solventes, deve apresentar-se a respetiva fundamentação científica. As células são expostas 
ao produto químico em estudo através da adição de 1 μl da solução-mãe 
adequada em DMSO [ver apêndice II do relatório de validação (4)] por mililitro de meio suplementado (volume do alvéolo). A concentração final de DMSO nos alvéolos será, assim, de 0,1 %. Para assegurar a homoge ­
neização, é geralmente preferível que a solução-mãe adequada do produto 
químico em estudo em DMSO seja misturada com meio suplementado de forma a produzir a concentração final pretendida para cada dose, sendo a mistura resultante adicionada em cada alvéolo imediatamente após a remo ­
ção do meio anterior. Se se utilizar esta opção, a concentração de DMSO 
(0,1 %) deverá ser a mesma em todos os alvéolos. Os alvéolos que conte ­
nham as duas concentrações mais elevadas são inspecionados visualmente, por recurso a um estereomicroscópio, para averiguar a eventual formação de 
precipitados ou turbidez, que constituem indicações de uma solubilização 
incompleta do produto químico em estudo. Caso se observem essas condi ­
ções (turbidez, formação de precipitados), os alvéolos que contêm as con ­
centrações inferiores (e assim sucessivamente) são também examinados; as 
concentrações que não tenham conduzido a uma dissolução completa são 
excluídas da avaliação e análise complementar. Recoloca-se a placa na incubadora a 37 °C, com ar atmosférico com 5 % de CO
 2 , durante 48 
horas. O quadro 6 ilustra a configuração da placa com a substância em 
estudo. Os lotes 1-7 mostram a distribuição na placa das doses crescentes de 
produto químico em estudo.  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 900
 
Quadro 6  
Esquema de dosagem para a exposição de células H295R a produtos químicos em estudo, 
numa placa de 24 alvéolos  
1 2 3 4 5 6  
A DMSO DMSO DMSO Lote 4 Lote 4 Lote 4 
B Lote 1 Lote 1 Lote 1 Lote 5 Lote 5 Lote 5 C Lote 2 Lote 2 Lote 2 Lote 6 Lote 6 Lote 6 
D Lote 3 Lote 3 Lote 3 Lote 7 Lote 7 Lote 7
 
40. Após 48 horas, as placas são removidas da incubadora, sendo cada alvéolo 
sujeito à inspeção microscópica com vista a determinar o estado das células 
(aderência, morfologia, grau de confluência) e quaisquer sinais de citotoxi ­
cidade. O meio presente em cada alvéolo é dividido em duas porções iguais, de aproximadamente 490 μl, e transferido para dois recipientes devidamente 
rotulados (uma das alíquotas constitui uma amostra de reserva para cada 
alvéolo). Para evitar a secagem das células, o meio é removido por filas ou colunas e substituído com o meio para o ensaio de viabilidade celular/ci ­
totoxicidade. Se a viabilidade celular ou citotoxicidade não for determinada 
de imediato, adiciona-se a cada alvéolo 200 μl de PBS com Ca
 2+ e Mg  2+ . 
Os meios são congelados a – 80 °C até se proceder à análise das concen ­
trações de hormonas (ver pontos 44-46). Embora, num meio mantido a – 80 °C, a T e a E2 se mantenham, em geral, estáveis por, pelo menos, três 
meses, cada laboratório deve documentar a estabilidade das hormonas du ­
rante a armazenagem.
 
41. A viabilidade celular/citotoxicidade em cada placa é determinada imediata ­
mente após a remoção do meio.  
Determinação da viabilidade celular  
42. Para determinar o impacto potencial do produto químico em estudo, pode 
utilizar-se um ensaio de viabilidade celular/citotoxicidade da escolha do laboratório. O ensaio deve ter capacidade para proporcionar uma medição correta da percentagem de células viáveis presentes num alvéolo; em alter ­
nativa, deve demonstrar-se a sua comparabilidade direta (expressa numa 
função linear) com o ensaio Live/Dead® [ver o apêndice III do relatório de validação (4)]. Um ensaio alternativo que se verificou funcionar bem é o ensaio com MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio] 
(18). A avaliação da viabilidade celular por recurso aos referidos métodos 
constitui uma medida relativa que não apresenta necessariamente uma rela ­
ção linear com o número absoluto de células num alvéolo. O analista deve, pois, efetuar, em paralelo, um exame visual subjetivo de cada alvéolo, 
devendo também, se necessário, obter e arquivar imagens digitais dos con ­
trolos com solvente (SC —  Solvent Controls ) e das duas concentrações não 
citotóxicas mais elevadas, para permitir a avaliação posterior da densidade celular real. Se a inspeção visual mostrar, ou o ensaio de viabilidade celular/ 
/citotoxicidade demonstrar, um aumento aparente do número de células, é 
necessário verificá-lo. Se esse aumento for comprovado, o facto deve cons ­
tar do relatório do ensaio. A viabilidade celular é expressa em relação à resposta média nos SC (100 % de células viáveis), e é calculada por um 
método adequado ao ensaio de viabilidade celular/citotoxicidade em causa. 
No caso do ensaio com MTT, pode utilizar-se a seguinte fórmula:
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 901
 
% células viáveis =  (resposta no alvéolo – resposta média nos alvéolos 
tratados com MeOH [= 100 % células mortas]) – (resposta média nos 
alvéolos SC – resposta média nos alvéolos tratados com MeOH [= 100 % células mortas)
 
43. Os alvéolos cuja viabilidade celular seja inferior a 80 % relativamente à 
viabilidade média nos SC (= 100 %) não devem ser incluídos na análise final dos dados. A inibição da esteroidogénese que se observa em cerca de 20 % dos casos de citotoxicidade deve ser cuidadosamente avaliada, de 
forma a garantir que a citotoxicidade não constitui a causa da inibição.
 
Análise das hormonas  
44. Para a análise da T e da E2, cada laboratório pode utilizar um sistema de 
determinação de hormonas da sua escolha. Podem utilizar-se alíquotas de 
reserva do meio de cada grupo de tratamento para preparar diluições des ­
tinadas a obter uma concentração no troço linear da curva-padrão. Como referido no ponto 29, cada laboratório deve demonstrar a conformidade do 
sistema de determinação de hormonas que utilizar ( p.ex.  ELISA, RIA, 
LC-MS, LC-MS/MS) com os critérios de controlo da qualidade, analisando, para o efeito, meio suplementado enriquecido com um controlo interno de hormona, antes de efetuar os ensaios de controlo da qualidade ou de ana ­
lisar os produtos químicos. Para garantir que as componentes do sistema de 
ensaio não interferem com a determinação das hormonas, estas podem ter de ser extraídas do meio antes da análise (as condições nas quais a extração é ou não necessária são descritas no ponto 30). Recomenda-se que a ex ­
tração seja efetuada de acordo com os procedimentos descritos no apêndice 
III do relatório de validação (4).
 
45. Se for utilizado um conjunto de ensaio comercial para medir a produção de 
hormonas, a análise deve ser efetuada do modo especificado nos manuais de instruções fornecidos pelo fabricante. A maioria dos fabricantes tem um procedimento único para a realização das análises hormonais. As diluições 
das amostras têm de ser ajustadas para que as concentrações de hormonas 
previstas nos controlos com solvente se situem na zona média do troço linear da curva-padrão do ensaio individual [apêndice III do relatório de validação (4)]. Os valores que se situem fora do referido troço linear devem 
ser rejeitados.
 
46. As concentrações finais das hormonas são calculadas do seguinte modo:  
Exemplo: 
Quantidade extraída: 450 μl de meio 
Reconstituição em: 250 μl de tampão 
Diluição no ensaio: 1:10 (para situar a amostra no troço li ­
near da curva-padrão) 
Concentração de hormonas ob ­
tida no ensaio: 150 pg/ml (já ajustada à concentração 
por ml de amostra utilizada no ensaio) 
Recuperação: 89 % 
Concentração final de hormonas 
= (Concentração de hormonas (por ml) ÷ 
recuperação) (fator de diluição) 
Concentração final de hormonas 
= (150 pg/ml) ÷ (0,89) × (250 μl/450 μl) × 
10 = 936,3 pg/ml  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 902
 
Seleção das concentrações de ensaio  
47. Devem efetuar-se, no mínimo, duas séries independentes de ensaios. Exceto 
se existirem informações, nomeadamente sobre os limites de solubilidade ou 
a citotoxicidade, que permitam selecionar as concentrações de ensaio, recomenda-se que as concentrações do ensaio inicial sejam espaçadas por fatores de log
 10 , sendo 10  –3 M a concentração máxima. Se o produto 
químico for solúvel e não citotóxico a qualquer das concentrações ensaiadas 
e a primeira série de ensaios produzir resultados negativos para todas as concentrações, há que proceder a uma confirmação com uma nova série de ensaios, utilizando as mesmas condições que na primeira série (quadro 7). 
Se os resultados da primeira série de ensaios forem  equívocos  (ou seja, o 
fator de alteração em relação ao SC for estatisticamente significativa apenas a uma concentração) ou positivos (ou seja, o fator de alteração entre duas ou mais concentrações adjacentes for estatisticamente significativo), o en ­
saio deve ser repetido da forma indicada no quadro 7, refinando as concen ­
trações de ensaio selecionadas. As concentrações de ensaio na segunda e terceira séries (se for caso disso) devem ser ajustadas com base nos resul ­
tados das concentrações da série de ensaios inicial que produziram um 
efeito, utilizando intervalos de concentração semilogarítmicos (p. ex., se, 
na série original de 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100, 1 000 μM se observaram 
induções a 1 e 10 μM, as concentrações ensaiadas na segunda série devem 
ser de 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 e 100 μM), exceto se tiverem de ser utilizadas 
concentrações mais baixas para atingir uma LOEC. Neste caso, devem 
utilizar-se na segunda série de ensaios, pelo menos, cinco concentrações inferiores à concentração mais baixa ensaiada na primeira série, de acordo com uma escala semilogarítmica. Se os resultados da segunda série de 
ensaios não confirmarem os da primeira (isto é, se não ocorrer significância 
estatística à concentração com resultados positivos no ensaio anterior ± 1 incremento de concentração), é necessário efetuar uma terceira série de ensaios utilizando as condições originais. Os resultados equívocos da pri ­
meira série consideram-se negativos se o efeito observado não puder ser 
confirmado em nenhuma das séries de ensaios subsequentes. Os resultados equívocos são considerados respostas positivas (efeito) se for possível con ­
firmar a resposta em, pelo menos, uma série de ensaios complementar com 
um incremento de concentração de ± 1 (ver o ponto 55 do procedimento para a interpretação dos dados).
 
Quadro 7  
Matriz de decisões para possíveis cenários de resultados  
Série 1 Série 2 Série 3 Decisão 
Cenário Decisão Cenário Decisão Cenário Positivo Negativo  
Negativo Confirmar (  a ) Negativo Parar X 
Negativo Confirmar (  a ) Positivo Refinar (  b ) Negativo X 
Equívoco (  c ) Refinar (  b ) Negativo Confirmar (  a ) Negativo X 
Equívoco (  c ) Refinar (  b ) Negativo Confirmar (  a ) Positivo X 
Equívoco (  c ) Refinar (  b ) Positivo X 
Positivo Refinar (  b ) Negativo Confirmar (  a ) Positivo X  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 903
 
Série 1 Série 2 Série 3 Decisão 
Cenário Decisão Cenário Decisão Cenário Positivo Negativo  
Negativo Confirmar (  a ) Positivo Refinar (  b ) Positivo X 
Positivo Refinar (  b ) Positivo Parar X  
( a ) Confirmar o ensaio anterior utilizando as mesmas condições experimentais. 
( b ) Reefetuar o ensaio com intervalos de concentração semilogarítmicos (em torno da concentração que produziu resultados 
significativamente diferentes no ensaio anterior). 
( c ) Estatisticamente, a uma dada concentração, o fator multiplicador é significativamente diferente do SC  
Controlo de qualidade da placa de ensaio  
48. Além dos critérios aplicáveis à placa de controlo da qualidade, 
apresentam-se no quadro 8 outros critérios de qualidade que devem ser cumpridos, respeitantes, designadamente, à variação aceitável entre alvéolos 
replicados, ensaios replicados, linearidade e sensibilidade dos sistemas de 
determinação de hormonas, variabilidade entre as determinações replicadas de hormonas na mesma amostra e percentagem de recuperação das amostras enriquecidas em hormonas após a extração do meio (se pertinente — ver o 
ponto 30 para os requisitos em matéria de extração). Para serem tidos em 
conta na avaliação posterior, os dados devem situar-se nas gamas aceitáveis definidas para cada parâmetro. Se isso não suceder, deve assinalar-se que os critérios de controlo da qualidade não foram cumpridos no caso da amostra 
em questão, devendo a mesma ser reanalisada ou eliminada do conjunto de 
dados.
 
Quadro 8  
Gamas e/ou variação (%) aceitáveis para os parâmetros da placa do ensaio H295R.  
(LOQ: Limite de quantificação do sistema de determinação de hormonas. CV: Coeficiente de 
variação; SC: Controlo com solvente; DPM: Desintegrações por minuto)  
Comparação T E2  
Produção basal de hormo ­
nas nos SC Fator multiplicador em 
relação à LOQ ≥ 5 vezes ≥ 2,5 vezes 
Ensaios de exposição — 
CV para os SC intraplacas 
(alvéolos replicados) Concentrações absolutas ≤ 30 % ≤ 30 % 
Ensaios de exposição — 
CV para os SC interplacas (ensaios replicados) Fator multiplicador ≤ 30 % ≤ 30 % 
Sistema de determinação 
das hormonas –Sensibili ­
dade Fator de redução detetável 
em relação ao SC ≥ 5 vezes ≥ 2,5 vezes 
Sistema de determinação 
das hormonas — determi ­
nações replicadas de CV para os SC (
 a ) Concentrações absolutas ≤ 25 % ≤ 25 % 
Extração do meio — Recu ­
peração do padrão interno 
3H (se pertinente) DPM ≥ 65 % Nominal  
( a ) Refere-se a determinações replicadas da mesma amostra.  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 904
 
ANÁLISE E APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS  
Análise dos dados  
49. Para avaliar o aumento/decréscimo relativos da produção de hormona in ­
duzidos pelos produtos químicos, os resultados devem ser normalizados em 
relação ao valor médio de SC de cada placa de ensaio, sendo os resultados expressos em alterações relativamente ao SC em cada placa. Todos os dados devem ser expressos em média ± 1 desvio-padrão (SD).
 
50. A análise dos dados deve apenas abranger dados relativos às hormonas dos 
alvéolos nos quais se observou uma citotoxicidade inferior a 20 %. As alterações relativas são calculadas do seguinte modo:
 
Alteração relativa =  (Concentração de hormonas em cada alvéolo) ÷ (Con ­
centração média de hormonas em todos os alvéolos de controlo com sol ­
vente).  
51. Se a inspeção visual do alvéolo ou o ensaio de viabilidade/citotoxicidade 
descrito no ponto 42 indiciarem um aumento do número de células, este 
aumento aparente deve ser verificado. Caso se confirme, o facto deve ser referido no relatório de ensaio.
 
52. Antes de proceder às análises estatísticas, importa avaliar os pressupostos de 
normalidade e homogeneidade das variâncias. A normalidade deve ser ava ­
liada por recurso a gráficos de probabilidade-padrão ou por outro método estatístico adequado ( p.ex.  ensaio de Shapiro-Wilk). Se os dados (fatores de 
alteração) não apresentarem uma distribuição normal, deve procurar-se 
transformá-los para que se aproximem da mesma. Se os dados apresentarem 
uma distribuição normal ou próxima desta, devem analisar-se as diferenças entre os grupos sujeitos a concentrações do produto químico e os SC, por recurso a um ensaio paramétrico (p. ex., ensaio de Dunnett), tomando a  
concentração  como variável independente e a  resposta  (fator de alteração) 
como variável dependente. Se os dados não apresentarem uma distribuição normal, deve utilizar-se um ensaio não paramétrico adequado (p. ex., ensaio de Kruskal-Wallis ou ensaio de Steel). Consideram-se as diferenças signi ­
ficativas se  p ≤ 0,05 . As avaliações estatísticas são efetuadas com base nos 
valores médios dos alvéolos que representam dados replicados independen ­
tes. Devido ao grande intervalo entre as doses na primeira série de ensaios (escala de log
 10 ), prevê-se que, em muitos casos, não seja possível definir 
claramente relações concentração-resposta se as duas doses mais elevadas se 
situarem no troço linear da curva sigmóide. Assim, no caso dos dados da primeira série de ensaios ou de qualquer outra série de dados em que tal ocorra (p.ex., se não puder ser estimada a eficácia máxima), aplicam-se 
estatísticas de variável fixa do tipo I, da forma atrás descrita.
 
53. Se, pelo menos, dois pontos se situarem no troço linear da curva e puderem 
ser calculadas as eficácias máximas — como se prevê no caso de alguns ensaios da 2
 a série efetuados utilizando intervalos semilogarítmicos entre as 
concentrações de exposição — a devem utilizar-se métodos  probit , logit  ou 
outros modelos adequados de regressão linear (p. ex., EC50 e EC20) para o cálculo das concentrações efetivas.
 
54. Os resultados devem ser apresentados em forma gráfica (gráfico de barras 
representando a média ± 1 desvio-padrão) e tabular (LOEC/NOEC, tipo de 
efeito e intensidade da resposta máxima na componente dose-resposta dos dados) (a figura 3 apresenta um exemplo). A avaliação dos dados apenas se considera válida se for baseada em, pelo menos, duas séries de ensaios 
independentes. Um ensaio, ou série de ensaios, é considerado independente 
se tiver sido efetuado numa data diferente, utilizando uma nova série de soluções e de controlos. A gama de concentrações utilizada nas séries de ensaios 2 e 3 (se necessário) pode ser adaptada com base nos resultados da 
série 1, de forma a definir melhor a gama de respostas que abrange a LOEC 
(ver ponto 47).
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Figura 3  
Exemplo de apresentação e avaliação de dados obtidos com a execução do ensaio H295R, em 
forma gráfica e tabular  
[Os asteriscos indicam diferenças estatisticamente significativas em relação ao controlo com 
solvente ( p< 0,05 ). LOEC: Menor concentração com efeito observável; Alteração máx: 
Intensidade máxima da resposta observada a qualquer concentração relativamente à resposta 
média do SC (= 1)]
  
Produto químico LOEC Alteração máx.  
Forskolina 0,01 0,15 vezes 
Letrozole 0,001 29 vezes  
Procedimento de interpretação dos dados  
55. Um produto químico é considerado positivo se o fator multiplicativo de 
indução for estatisticamente diferente ( p ≤ 0,05) entre duas concentrações 
adjacentes do controlo com solvente em, pelo menos, duas séries de ensaios 
independentes (quadro 7). Um produto químico é considerado negativo na 
sequência de duas séries de ensaios independentes negativas, ou de três séries em que duas se revelaram negativas e uma equívoca ou positiva. 
Se os dados produzidos por três ensaios independentes não cumprirem os 
critérios de decisão enumerados no quadro 7, os resultados experimentais não são interpretáveis. Os resultados obtidos com concentrações superiores aos limites de solubilidade ou concentrações citotóxicas não devem ser 
incluídos na interpretação dos resultados.
 
Relatório de ensaio  
56. O relatório de ensaio deve incluir as seguintes informações:  
Estabelecimento de ensaio  
— Nome e endereço do estabelecimento;  
— Diretor do estudo e outras pessoas envolvidas, com especificação das 
suas responsabilidades;  
— Datas de início e termo do estudo;  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 906
 
Produto químico em estudo, reagentes e substâncias de controlo  
— Identidade (nome/n.  o CAS se pertinente), fonte, número de lote ou série, 
pureza, fornecedor e caracterização do produto químico em estudo, dos 
reagentes e das substâncias de controlo;  
— Natureza física e propriedades fisicoquímicas relevantes do produto 
químico em estudo;  
— Condições de armazenagem; método e frequência de preparação do 
produto químico em estudo, dos reagentes e das substâncias de controlo;  
— Estabilidade do produto químico em estudo;  
Células  
— Fonte e tipo de células;  
— Número (identificador) de passagens celulares das células utilizadas no 
ensaio;  
— Descrição dos procedimentos de conservação das culturas celulares;  
Requisitos prévios à realização do ensaio (se pertinente)  
— Descrição e resultados do ensaio de interferência produto químico-hor ­
mona;  
— Descrição e resultados das determinações de eficiência de extração das 
hormonas;  
— Curvas-padrão e de calibração correspondentes a todos os ensaios ana ­
líticos a realizar;  
— Limites de deteção dos métodos analíticos escolhidos;  
Condições de ensaio  
— Composição do meio;  
— Concentração do produto químico em estudo;  
— Densidade celular (concentrações celulares estimadas ou determinadas a 
24 e 48 horas)  
— Solubilidade do produto químico em estudo (limite de solubilidade, se 
determinado);  
— Tempo e condições de incubação;  
Resultados do ensaio  
— Dados em bruto para cada alvéolo (substâncias de controlo e produtos 
químicos em estudo) – cada determinação replicada na forma dos dados originais fornecidos pelo instrumento utilizado para determinar a produ ­
ção de hormonas ( p.ex.  OD, unidades de fluorescência, DPM, etc.);
 
— Validação da normalidade ou explicação da transformação dos dados;  
— Respostas médias ± 1 desvio-padrão para cada alvéolo determinado;  
— Dados de citotoxicidade (concentrações de ensaio que causaram citoto ­
xicidade);  
— Confirmação do cumprimento dos requisitos de controlo da qualidade;  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 907
 
— Alteração relativamente ao controlo com solvente, com correção para ter 
em conta a citotoxicidade;  
— Gráfico de barras ilustrativo das alterações relativas (fatores multiplica ­
tivos) para cada concentração, da SD e da significância estatística, como 
referido nos pontos 49-54;  
Interpretação dos dados  
— Aplicação do procedimento de interpretação dos dados aos resultados e 
discussão das constatações;  
Discussão  
— Existem algumas indicações, decorrentes do estudo, quanto à possibili ­
dade de os dados relativos à T/E2 terem sido influenciados por efeitos indiretos nas vias dos glucocorticoides e mineralocorticoides?
 
Conclusões  
REFERÊNCIAS  
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sment of Endocrine Disrupting Chemicals  (apêndice 2 do capítulo B.54 do 
presente anexo)  
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rapid in vitro determination of effects on steroidogenesis: Hormone pro ­
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3. Hecker, M., Hollert, H., Cooper, R., Vinggaard, A.-M., Akahori, Y., 
Murphy, M., Nellemann, C., Higley, E., Newsted, J., Wu, R., Lam, P., 
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6. Battelle (2005), Detailed Review Paper on Steroidogenesis. Disponível em: 
[http://www.epa.gov/endo/pubs/edmvs/steroidogenesis_drp_final_3_29_05. pdf]
 
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11. Gazdar, A. F., Oie, H. K., Shackleton, C. H., Chen, T. R., Triche, T. J., 
Myers, C. E., Chrousos, G. P., Brennan, M. F., Stein, C. A. and La Rocca, R. V. (1990), Establishment and characterization of a human adrenocorti ­
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13. Zhang, X.W., Yu, R.M.K., Jones, P.D., Lam, G.K.W., Newsted, J.L., 
Gracia, T., Hecker, M., Hilscherova, K., Sanderson, J.T., Wu, R.S.S. and Giesy, J.P. (2005), Quantitative RT-PCR methods for evaluating 
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Environ. Sci. Technol.,  39:2777-2785.
 
14. Higley, E.B., Newsted, J.L., Zhang, X., Giesy, J.P. and Hecker, M. (2010), 
Differential assessment of chemical effects on aromatase activity, and E2 and T production using the H295R cell line,  Environ. Sci. Pol. Res.,  
17:1137-1148.
 
15. Rainey, W. E., Bird, I. M., Sawetawan, C., Hanley, N. A., Mccarthy, J. L., 
Mcgee, E. A., Wester, R. and Mason, J. I. (1993), Regulation of human adrenal carcinoma cell (NCI-H295) production of C19 steroids,  J. Clin. 
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16. Chapter B.55 of this Annex: Hershberger Bioassay in Rats: A short-term 
Screening Assay for (Anti)Androgenic Properties.  
17. Shapiro, R., and Page, L.B. (1976), Interference by 2,3-dimercapto-1- 
-propanol (BAL) in angiotensin I radioimmunoassay,  J. Lab. Clin. Med.,  
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18. Mosmann, T. (1983), Rapid colorimetric assay for growth and survival: 
application to proliferation and cytotoxicity assays,  J. Immunol. Methods.,  
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19. Brock, B.J., Waterman, M.R. (1999). Biochemical differences between rat 
and human cytochrome P450c17 support the different steroidogenic needs 
of these two species, Biochemistry. 38:1598-1606.  
20. Oskarsson, A., Ulleras, E., Plant, K., Hinson, J. Goldfarb, P.S., (2006), 
Steroidogenic gene expression in H295R cells and the human adrenal gland: adrenotoxic effects of lindane in vitro, J. Appl. Toxicol., 26:484- 
-492.
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 909
 
Apêndice  
DEFINIÇÕES  
Confluência  refere-se à cobertura ou proliferação das células sobre ou no meio 
de cultura.  
Produto químico  designa uma substância ou mistura.  
CV designa o coeficiente de variação, definido como a razão entre o 
desvio-padrão de uma distribuição e a sua média aritmética.  
CYP  designa as mono-oxigenases do citocromo P450, enzimas produzidas por 
uma família de genes, que catalisam uma vasta gama de reações bioquímicas, 
nomeadamente a síntese e o metabolismo das hormonas esteroides.  
DPM  significa desintegrações por minuto. Consiste no número de átomos numa 
determinada quantidade de matéria radioativa que sofre decaimento num minuto.  
E2 designa o 17 β-estradiol, estrogénio mais importante nos mamíferos.  
As células H295R  são células de adenocarcinoma humano, que têm caracterís ­
ticas fisiológicas de células adrenais do feto humano sem diferenciação por zonas 
que exprimem todas as enzimas implicadas na esteroidogénese. Podem ser obti ­
das junto do ATCC.  
O meio de congelamento  é utilizado para congelar as células e armazenar as 
células congeladas. É constituído por meio de partida ao qual se adiciona  NuSe­
rum BD e dimetilssulfóxido.  
Troço linear  é o troço da curva-padrão do sistema de determinação de hormonas 
em que os resultados são proporcionais à concentração de substância a analisar 
presente na amostra.  
LOQ  designa o « limite de quantificação », que consiste na quantidade mais baixa 
de um produto químico distinguível da ausência desse produto (ensaio em bran ­
co), com um dado intervalo de confiança. Para os fins do presente método, e salvo especificação em contrário, o LOQ é, em geral, definido pelo fabricante do 
sistema de ensaio.
 
LOEC  designa a menor concentração com efeito observável, concentração mais 
baixa à qual a resposta no ensaio é estatisticamente diferente da do controlo com 
solvente.  
NOEC  designa a concentração sem efeitos observáveis, concentração mais ele ­
vada utilizada no ensaio sem que se observe uma resposta positiva.  
Passagem  designa o número de vezes que as células são divididas após o início 
de uma cultura a partir de material congelado. À passagem inicial a partir do material congelado é atribuído o número um (1). As células resultantes da pri ­
meira divisão correspondem à passagem n.
 o 2, etc.  
PBS designa a solução-tampão salina de fosfatos de Dulbecco.  
Controlo de qualidade  (CQ) designa as determinações necessárias para assegu ­
rar a validade dos dados.  
Placa de controlo de qualidade  é uma placa de 24 alvéolos com duas concen ­
trações dos controlos positivo e negativo, destinada a monitorizar o desempenho 
de um novo lote de células ou a fornecer os controlos positivos para o ensaio dos 
produtos químicos.  
Série  é um ensaio independente caracterizado por um novo conjunto de soluções 
e controlos.  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 910
 
Meio de partida  é a base para a preparação dos restantes reagentes. Consiste 
numa mistura na proporção de 1:1 de meio de Eagle modificado de Dulbecco e 
mistura de nutrientes F-12 de Ham (DMEM/F12) em tampão HEPES 15 mM, sem adição de vermelho de fenol nem bicarbonato de sódio. Este último é adicionado como tampão — ver o apêndice II do relatório de validação (4).
 
O meio suplementado  é constituído por meio de partida ao qual é adicionado  
Nu-Serum  BD e  ITS+ premium mix  — ver o apêndice II do relatório de valida ­
ção (4).  
Esteroidogénese  é a via metabólica através da qual o colesterol é transformado 
nas várias hormonas esteroides. Alguns intermediários no processo, como a progesterona e a testosterona, são hormonas importantes por si só, mas cons ­
tituem também precursores de outras hormonas, a jusante no processo metabó ­
lico.
 
T designaa testosterona, um dos dois androgénios mais importantes nos mamí ­
feros.  
Produto químico em estudo  designa qualquer substância ou mistura ensaiada 
por recurso ao presente método de ensaio.  
Placa de ensaio  é a placa na qual as células H295R são expostas aos produtos 
químicos em estudo. As placas de ensaio contêm o solvente de controlo e sete concentrações do produto químico em estudo, em triplicado.
 
Tripsina 1X  é a uma solução diluída da enzima tripsina, protease do suco 
pancreático, utilizada para remover as células de uma placa de cultura — ver 
o apêndice III do relatório de validação (4).  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 911
 
B.58.  ENSAIOS DE MUTAÇÕES GENÉTICAS DAS CÉLULAS 
GERMINATIVAS E SOMÁTICAS DE ROEDORES 
TRANSGÉNICOS  
INTRODUÇÃO  
1. Este método de ensaio é equivalente ao ao  Test Guideline  TG 488 (2013) 
da OCDE. Existem métodos de ensaio da UE para uma ampla variedade de ensaios de mutações  in vitro , capazes de detetar mutações ao nível dos 
cromossomas e/ou dos genes. Existem métodos de ensaio para parâmetros  
in vivo  (ou seja, aberrações cromossomáticas e síntese não programada de 
ADN); no entanto, estes métodos não medem as mutações dos genes. Os ensaios de mutações em Roedores Transgénicos (TGR) preenchem a neces ­
sidade de ensaios  in vivo  práticos e amplamente disponíveis para mutações 
dos genes.
 
2. Os ensaios de mutações em TGR foram analisados de forma aprofundada 
(24) (33). Usam ratos e ratinhos transgénicos que contêm várias cópias de vetores de transporte de plasmídeos ou fagos integrados nos cromossomas. Os transgenes contêm genes repórter para a deteção de vários tipos de 
mutações induzidas  in vivo  por produtos químicos.
 
3. As mutações que surjam num roedor são classificadas através da recupera ­
ção do transgene e da análise do fenótipo do gene repórter num hospedeiro 
bacteriano com o gene repórter ausente. Os ensaios de mutações genéticas em TGR medem as mutações induzidas em genes neutros recuperados de praticamente qualquer tecido do roedor. Portanto, estes ensaios contornam 
muitas das limitações atualmente associadas ao estudo das mutações gené ­
ticas in vivo  em genes endógenos (p. ex.: número limitado de tecidos 
adequados à análise, seleção negativa/positiva contra mutações).
 
4. A experiência adquirida sugere que os transgenes respondem aos agentes 
mutagénicos de modo semelhante aos genes endógenos, especialmente no que respeita à deteção de substituições de pares de bases, de mutações por 
deslocamento e de pequenas supressões e inserções(24).
 
5. Os  International Workshops on Genotoxicity Testing  (IWGT) subscreveram 
a inclusão dos ensaios de mutações genéticas em TGR para a deteção  in 
vivo de mutações genéticas e recomendaram um protocolo para a sua apli ­
cação (15) (29). O presente método de ensaio baseia-se nessas recomenda ­
ções. A referência (16) inclui análises adicionais que fundamentam a utili ­
zação deste protocolo.  
6. Espera-se que, no futuro, venha a ser possível combinar um ensaio de 
mutações genéticas em TGR com um estudo de toxicidade de dose repetida 
(Capítulo B.7 do presente Anexo). No entanto, são necessários dados para garantir que a sensibilidade dos ensaios de mutações genéticas em TGR não seja afetada pelo período de tempo inferior usado nos estudos de toxicolo ­
gia de dose repetida: um dia entre o final do período de administração e o 
momento da amostragem, em comparação com os 3 dias usados nos ensaios de mutações genéticas em TGR. São também necessários mais dados para verificar se o resultado dos ensaios de dose repetida não é negativamente 
afetado pela utilização de uma estirpe de roedores transgénicos em vez das 
estirpes de roedores tradicionais. Quando esses dados estiverem disponíveis, o presente método de ensaio será atualizado.
 
7. Os termos-chave encontram-se definidos no Apêndice.  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 912
 
CONSIDERAÇÕES INICIAIS  
8. Os ensaios de mutações genéticas em TGR relativamente aos quais existem 
dados suficientes para apoiar o seu uso neste método de ensaio são: bacteriófago  
lacZ do ratinho (Muta™Mouse); plasmídeo  lacZ  do ratinho; delta  gpt (gpt e 
Spi – ) do ratinho e do rato;  lacI  do ratinho e do rato (Big Blue®), quando 
conduzidos em condições padrão. Além disso, o ensaio de seleção positiva  
cII poderá ser usado para avaliar mutações nos modelosBig Blue® e Muta™ ­
Mouse. Normalmente, a mutagénese é avaliada nos modelos TGR em termos de frequência das mutações; se necessário, no entanto, a análise molecular das mutações pode fornecer informação adicional (ver parágrafo 24).
 
9. Estes ensaios  in vivo  de mutações genéticas em roedores são especialmente 
relevantes para a avaliação de riscos mutagénicos, uma vez que as respostas do ensaio dependem do metabolismo  in vivo , da farmacocinética, dos pro ­
cessos de reparação do ADN e da síntese de ADN translesão, embora estes 
fatores possam variar conforme as espécies, tecidos e tipos de lesão do ADN. Um ensaio  in vivo  de mutações genéticas poderá ser útil para uma 
investigação mais aprofundada de um efeito mutagénico detetado num sis ­
tema  in vitro  e em complemento dos resultados de ensaios que usem outros 
parâmetros  in vivo  (24). Para além de ter relação causal com a indução do 
cancro, a mutação genética é um parâmetro relevante para a previsão de doenças não-oncológicas com base em mutações nalguns tecidos somáticos 
(12) (13), bem como de doenças transmitidas através da linha germinativa.
 
10. Se houver evidência de que o produto químico em estudo, ou um metabo ­
lito relevante, não atingirá nenhum dos tecidos de interesse, não deverá ser 
realizado um ensaio de mutações genéticas em TGR.  
PRINCÍPIO DO ENSAIO  
11. Nos ensaios descritos no parágrafo 8, o gene-alvo é de origem bacteriana ou 
bacteriofágica e a forma como é recuperado do ADN genómico do roedor é 
através da incorporação do transgene num vetor de transporte λ bacteriófá ­
gico ou plasmídeo. Este procedimento envolve a extração do ADN genó ­
mico do tecido de interesse do roedor, o processamento  in vitro  desse ADN 
genómico (ou seja, empacotamento de vetores λ, ou ligação e eletroporação 
de plasmídeos para recuperar o vetor de transporte) e a deteção subsequente 
de mutações em hospedeiros bacterianos, em condições adequadas. Os en ­
saios empregam transgenes neutros, facilmente obtíveis da maioria dos tecidos.
 
12. As experiências básicas de ensaio de mutações genéticas em TGR envolvem 
o tratamento do animal com um produto químico durante um determinado período. Os produtos químicos podem ser administrados por qualquer via 
adequada, incluindo a implantação (p. ex.: ensaio de dispositivos médicos). 
O período total durante o qual um animal receberá doses do produto é designado por período de administração. A administração é geralmente seguida de um período, antes do sacrifício, durante o qual o produto quí ­
mico não é administrado e as lesões do ADN não reparadas se fixam em 
mutações estáveis. Na literatura, este período tem sido designado por tempo de manifestação, tempo de fixação ou tempo de expressão; o final deste período é o momento de amostragem (15) (29). Depois de o animal ser 
sacrificado, o ADN genómico é isolado do(s) tecido(s) de interesse e 
purificado.
 ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 913
 
13. Os dados respeitantes a um único tecido por animal e a vários empacota ­
mentos/ligações são geralmente agregados, e a frequência de mutação é 
geralmente avaliada usando um total de entre 10  5 e 10  7 unidades formado ­
ras de placas ou formadoras de colónias. Quando se usam métodos de seleção positiva, as unidades formadoras de placas totais são determinadas 
com um conjunto separado de placas não seletivas.
 
14. Os métodos de seleção positiva foram desenvolvidos para facilitar a deteção 
de mutações tanto no gene  gpt [gpt delta em ratinhos e ratos, fenótipo  gpt  – 
(20) (22) (28)] como no gene  lacZ  [Muta™Mouse ou plasmídeo  lacZ  no 
ratinho (3) (10) (11) (30)]; por seu lado, as mutações no gene  lacI  em 
animais Big Blue® são detetadas através de um método não seletivo que 
identifica mutações através da geração de placas coloridas (azuis). A me ­
todologia de seleção positiva é também usada para detetar mutações pon ­
tuais que surjam no gene  cII do vetor de transporte λ bacteriofágico [Big 
Blue® no ratinho ou rato e Muta™Mouse (17)] e mutações de supressão 
nos genes λ red e gam  [seleção Spi  – no delta  gpt no ratinho e no rato (21) 
(22) (28)]. A frequência de mutação é calculada dividindo o número de placas/plasmídeos que apresentam mutações no transgene pelo número total 
de placas/plasmídeos recuperados da mesma amostra de ADN. Nos estudos 
de mutações genéticas em TGR, a frequência de mutação é o parâmetro comunicado. Além disso, pode determinar-se uma frequência de mutação como a proporção de células que apresentam mutações independentes; este 
cálculo exige correção para expansão clonal através da sequenciação dos 
mutantes recuperados(24).
 
15. As mutações classificadas nos ensaios de mutações pontuais  lacI, lacZ, cII  e 
gpt consistem principalmente em mutações por substituição de um par de 
bases, mutações por deslocamento e pequenas inserções/supressões. A pro ­
porção relativa destes tipos de mutações entre as mutações espontâneas é 
semelhante à verificada no gene  Hprt  endógeno. As grandes supressões só 
são detetadas nos ensaios de seleção Spi  – e ensaios com plasmídeos  lacZ  
(24). As mutações de interesse são mutações  in vivo  que surgem no rato ou 
ratinho. As mutações  in vitro  e ex vivo , que podem surgir durante a recu ­
peração, replicação ou reparação dos fagos/plasmídeos, são relativamente raras e, nalguns sistemas, podem ser especificamente identificadas ou ex ­
cluídas pelo sistema de hospedeiro bacteriano/seleção positiva.
 
DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
Preparações  
Seleção da espécie animal  
16. Atualmente, estão disponíveis vários modelos de deteção de mutações gé ­
nicas em ratinhos transgénicos, mais amplamente usados do que os modelos 
com ratos transgénicos. Se o rato for claramente um modelo mais adequado 
do que o ratinho (p. ex.: na investigação do mecanismo de carcinogénese de um tumor apenas observado em ratos, para correlacionar com um estudo de 
toxicidade em ratos ou se o metabolismo do rato for reconhecidamente mais 
representativo do metabolismo humano), deve considerar-se a utilização de modelos com ratos transgénicos.
 
Condições de alojamento e alimentação  
17. A temperatura na sala onde são conservados os animais para experiências 
deve ser, idealmente, de 22 °C (± 3 °C). Embora a humidade relativa deva ser pelo menos de 30 % e, de preferência, não deva exceder os 70 %, exceto durante a limpeza da sala, o objetivo deve ser a manutenção de 
uma humidade relativa entre os 50 % e os 60 %. A iluminação deve ser 
artificial, com um ciclo diário de 12 horas de luz seguidas de 12 horas de
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escuridão. Para a alimentação, podem ser usadas dietas convencionais de 
laboratório, com acesso ilimitado a água potável. A escolha da dieta pode 
ser influenciada pela necessidade de garantir uma mistura adequada de um produto químico em estudo, quando administrado por esta via. Os animais devem ser mantidos em pequenos grupos (não mais do que cinco) do 
mesmo sexo, se não for previsivel um comportamento agressivo. Os ani ­
mais podem ser alojados individualmente se tal se justificar do ponto de vista científico.
 
Preparação dos animais  
18. Os animais jovens e saudáveis, adultos e sexualmente maturos (8 a 12 
semanas de idade no início do tratamento) são aleatoriamente afetados aos grupos de controlo e de tratamento. Os animais são identificados por um código único. Devem ser aclimatizados às condições do laboratório 
durante pelo menos cinco dias. As gaiolas devem estar dispostas de forma 
a minimizar os possíveis efeitos devidos à localização. No início do estudo, a diferença de peso entre os animais deve ser mínima e não deve exceder ± 20 % do peso médio de cada sexo.
 
Preparação das doses  
19. Os produtos químicos em estudo na forma sólida devem ser dissolvidos ou 
suspensos em solventes ou veículos adequados, ou misturados na dieta ou 
na água potável antes da administração aos animais. Os produtos químicos 
em estudo na forma líquida podem ser administrados diretamente ou diluí ­
dos antes da administração. Para exposições por inalação, os produtos quí ­
micos em estudo podem ser administrados sob a forma de gás, vapor ou 
aerossol sólido/líquido, dependendo das respetivas propriedades físico-quí ­
micas. Devem ser utilizadas preparações frescas do produto químico em estudo, a menos que os dados de estabilidade demonstrem que o mesmo pode ser armazenado.
 
Condições de Ensaio  
Solvente/veículo  
20. O solvente/veículo não deve produzir efeitos tóxicos nos volumes utilizados 
e não devem existir indícios de reação química com o produto químico em 
estudo. Se forem usados solventes/veículos pouco conhecidos, a sua utili ­
zação deverá ser fundamentada por dados de referência que indiquem a sua compatibilidade. Recomenda-se que, sempre que possível, se considere em primeiro lugar a utilização de um solvente/veículo aquoso.
 
Controlos Positivos  
21. Normalmente, devem ser usados animais de controlo positivo em simultâ ­
neo. No entanto, para laboratórios que tenham demonstrado competência 
(ver parágrafo 23) e que usem rotineiramente estes ensaios, o ADN de 
animais anteriormente utilizados como controlo positivo pode ser incluído em cada estudo para confirmar o sucesso do método. Esse ADN de expe ­
riências anteriores deve ser obtido a partir da mesma espécie e dos mesmos 
tecidos de interesse e armazenado adequadamente (ver parágrafo 36). 
Quando são usados controlos positivos em simultâneo, não é necessário administrá-los pela mesma via usada para o produto químico em estudo; no entanto, os controlos positivos devem induzir comprovadamente muta ­
ções em um ou mais tecidos de interesse para o produto químico em estudo. 
As doses dos produtos químicos do controlo positivo devem ser seleciona ­
das de modo a produzir efeitos fracos ou moderados que permitam avaliar criticamente o funcionamento e a sensibilidade do ensaio. O Quadro 1 
inclui exemplos de produtos químicos de controlo positivo e de alguns 
dos respetivos tecidos-alvo.
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Quadro 1  
Exemplos de produtos químicos de controlo positivo e de alguns dos respetivos tecidos-alvo  
Produto Químico de Controlo 
Positivo e N.  o CAS Nome e N.  o EINECS Características Tecido-alvo de Mutação 
Rato Ratinho  
N-Etilo-N-nitrosureia 
[N. o CAS 759-73-9] N-Etilo-N-nitrosureia 
[212-072-2] Agente mutagé ­
nico de ação direta Fígado, pul ­
mão Medula óssea, có ­
lon, epitélio do có ­
lon, intestino, fíga ­
do, pulmão, baço, 
rim, células granulo ­
sas do ovário, célu ­
las germinativas 
masculinas 
Carbamato de etilo (ureta ­
no) 
[N. o CAS 51-79-6] Uretano 
[200-123-1] Agente mutagéni ­
co, exige metabo ­
lismo mas produz apenas efeitos fra ­
cos Medula óssea, pré- 
-estômago, intestino 
delgado, fígado, pul ­
mão, baço 
2,4-Diaminotolueno 
[N.
 o CAS 95-80-7] 4-Metil-m-fenilenodia ­
mina 
[202-453-1] Agente mutagéni ­
co, exige metabo ­
lismo, também po ­
sitivo no ensaio Spi
 – Fígado Fígado 
Benzo[a]pireno 
[N. o CAS 50-32-8] Benzo[def]criseno 
[200-028-5] Agente mutagéni ­
co, exige metabo ­
lismo Fígado, 
omento Medula óssea, ma ­
ma, cólon, pré-estô ­
mago, estômago 
glandular, coração, fígado, pulmão, cé ­
lulas germinativas 
masculinas
 
Controlos negativos  
22. Cada amostragem deve incluir controlos negativos, tratados apenas com 
solvente ou veículo e em todos os outros aspetos tratados da mesma forma 
que os grupos de tratamento. Na ausência de dados de controlo históricos ou publicados que demonstrem que o solvente/veículo escolhido não induz nenhum efeito prejudicial ou mutagénico, cada amostragem deverá também 
incluir controlos sem tratamento, de modo a estabelecer a aceitabilidade do 
controlo do veículo.
 
Verificação da proficiência do laboratório  
23. A competência nestes ensaios deve ser estabelecida através da demonstração 
da capacidade de reproduzir os resultados esperados a partir de dados publicados (24) para: 1) frequências de mutação com produtos químicos 
de controlo positivo (incluindo respostas fracas) como os listados no quadro 
1, não-mutagénicos e controlos do veículo; e 2) recuperação de transgenes do ADN genómico (p. ex.: eficiência de empacotamento).
 
Sequenciação de mutações  
24. Para aplicações normativas, não é exigida a sequenciação do ADN dos 
mutantes, especialmente quando for obtido um resultado positivo ou nega ­
tivo claro. No entanto, os dados de sequenciação podem ser úteis quando se observa uma elevada variação interindividual. Nestes casos, a sequenciação 
pode ser usada para excluir a possibilidade de  jackpots  ou eventos de 
clonagem, ao identificar a proporção de mutantes únicos de um tecido
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em particular. A sequenciação de cerca de 10 mutantes por tecido e por 
animal deverá ser suficiente para determinar simplesmente se a clonagem 
contribuiu para a frequência de mutação; poderá ser necessário sequenciar até 25 mutantes para corrigir matematicamente a frequência de mutação para os efeitos da clonagem clonagem. A sequenciação dos mutantes 
pode também ser considerada quando se constatarem pequenos aumentos 
(ou seja, pouco acima dos valores do controlo não tratado) nas frequências de mutação. As diferenças no espectro de mutantes entre as colónias mu ­
tantes de animais tratados e não tratados podem apoiar as suspeitas de um 
efeito mutagénico (29). Além disso, os espectros de mutações poderão ser 
úteis para desenvolver hipóteses mecanísticas. Quando for necessário incluir a sequenciação no protocolo do estudo, deve dedicar-se particular atenção à conceção do mesmo, em particular no que se refere ao número de mutantes 
sequenciados por amostra, de modo a assegurar uma cobertura suficiente de 
acordo com o modelo estatístico usado (ver parágrafo 43).
 
PROCEDIMENTO  
Número e Sexo dos Animais  
25. O número de animais por grupo deve ser predeterminado de modo a ser 
suficiente para proporcionar a validade estatística necessária para detetar 
pelo menos uma duplicação na frequência de mutação. Os grupos terão pelo menos cinco animais; no entanto, se a validade estatística não for suficiente, o número de animais deve ser aumentado conforme necessário. 
Normalmente, devem ser usados machos. Pode haver casos em que se 
justifique testar apenas fêmeas, por exemplo no ensaio de medicamentos específicos para mulheres ou na investigação do metabolismo específico do 
sexo feminino. Se houver diferenças significativas entre os sexos em termos 
de toxicidade ou de metabolismo, será necessário utilizar machos e fêmeas.
 
Período de Administração  
26. Com base em observações que demonstram a acumulação de mutações com 
cada tratamento, é necessário aplicar um regime de dose repetida, com 
tratamentos diários por um período de 28 dias. Este período é geralmente considerado aceitável, tanto para produzir uma acumulação suficiente de mutações por agentes mutagénicos fracos como para oferecer um tempo 
de exposição adequado para deteção de mutações em órgãos de proliferação 
lenta. Para algumas avaliações, podem ser adequados regimes de tratamento alternativos, cujos esquemas de doseamento alternativos devem ser cienti ­
ficamente justificados no protocolo. Os tratamentos não devem ser mais 
curtos do que o tempo necessário para completar a indução de todas as 
enzimas metabólicas relevantes e os tratamentos mais curtos poderão exigir a utilização de vários pontos de amostragem adequados para órgãos com diferentes taxas de proliferação. De qualquer modo, toda a informação 
disponível (p. ex.: sobre toxicidade geral ou sobre o metabolismo e a 
farmacocinética) deve ser usada na justificação de um protocolo, especial ­
mente quando este se desviar das recomendações padrão supracitadas. Em ­
bora possam aumentar a sensibilidade, os tratamentos mais longos do que 8 
semanas devem ser claramente explicados e justificados, uma vez que tem ­
pos de tratamento prolongados podem produzir um aumento aparente na frequência de mutação através da expansão clonal (29).
 
Níveis de Dosagem  
27. Os níveis de dosagem devem ser baseados nos resultados de um estudo de 
determinação de intervalos de dosagem que meça a toxicidade geral e que tenha sido conduzido pela mesma via de exposição, ou nos resultados de estudos de toxicidade subaguda pré-existentes. Podem usar-se animais não 
transgénicos da mesma estirpe de roedores para a determinação dos inter ­
valos de dosagem. No ensaio principal, e a fim de obter informação sobre a
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resposta à dosagem, um estudo completo deve incluir um grupo de controlo 
negativo (ver parágrafo 22) e um mínimo de três níveis de dose, adequa ­
damente espaçados, exceto quando for utilizada uma dose limite (ver pará ­
grafo 28). A dose superior deve ser a Dose Máxima Tolerada (DMT). A DMT é definida como a dose que produz sinais de toxicidade tais que 
níveis de dose superiores, baseados no mesmo regime de doseamento, 
seriam letais. Os produtos químicos com atividades biológicas específicas em doses baixas não tóxicas (como hormonas e agentes mitogénicos) e produtos químicos que apresentem saturação de propriedades toxicocinéti ­
cas podem ser exceções aos critérios de definição da dosagem e devem ser 
avaliados caso a caso. Os níveis de dose usados devem abarcar um intervalo desde a toxicidade máxima até uma toxicidade reduzida ou ausente.
 
Ensaio de Limite  
28. Se as experiências de determinação de intervalos de dosagem, ou dados 
existentes de estirpes relacionadas de roedores, indicarem que um regime de 
tratamento com, pelo menos, a dose limite (ver abaixo) não produz efeitos tóxicos observáveis,e se não for de esperar genotoxicidade com base em dados relativos a produtos químicos estruturalmente relacionados, poderá 
não ser considerado necessário um estudo completo com três níveis de 
dose. Para um período de administração de 28 dias (ou seja, 28 tratamentos diários), a dose limite é de 1 000 mg/kg de peso corporal/dia. Para períodos de administração de 14 dias ou menos, a dose limite é de 2 000 mg/kg/de 
peso corporal/dia (os esquemas de doseamento que se afastem dos 28 
tratamentos diários devem ser cientificamente justificados no protocolo; ver parágrafo 26).
 
Administração das Doses  
29. O produto químico em estudo é geralmente administrado por gavagem, 
usando uma sonda gástrica ou uma cânula de intubação adequada. De modo geral, a via antecipada de exposição humana deve ser considerada na conceção de um ensaio. Portanto, outras vias de exposição (tais como 
água potável, via subcutânea, intravenosa, tópica, por inalação, intratra ­
queal, na dieta ou por implantação) podem ser aceitáveis, quando puderem ser justificadas. A injeção intraperitonial não é recomendada, uma vez que não é uma via fisiologicamente relevante de exposição humana. O volume 
máximo de líquido que pode ser administrado por gavagem ou injeção de 
uma só vez depende do tamanho do animal de ensaio. O volume não deve exceder os 2 ml/100 g de peso corporal. A utilização de volumes superiores deverá ser justificada. Exceto no caso de produtos químicos irritantes ou 
corrosivos, que normalmente revelam efeitos exacerbados em concentrações 
superiores, a variabilidade no volume de ensaio deve ser minimizada ajus ­
tando a concentração de modo a garantir um volume constante em todos os níveis de dose.
 
Momento de Amostragem  
Células Somáticas  
30. O momento da amostragem é uma variável crítica, porque é determinado 
pelo tempo necessário para que as mutações se fixem. Este período é 
específico para cada tecido e parece estar relacionado com o tempo de substituição da população de células, sendo que a medula óssea e o intes ­
tino são tecidos de resposta rápida e o fígado apresenta uma resposta muito 
mais lenta. Um compromisso aceitável para a medição de frequências de 
mutação tanto em tecidos de proliferação rápida como lenta é 28 tratamen ­
tos diários consecutivos (conforme indicado no parágrafo 26), com amos ­
tragem três dias depois do tratamento final, embora a frequência de mutação 
máxima possa não se manifestar em tecidos de proliferação lenta nestas 
condições. Se os tecidos de proliferação lenta assumirem particular impor ­
tância, poderá ser mais adequada uma amostragem mais tardia, 28 dias após o período de administração de 28 dias (16) (29). Nesses casos, a amos ­
tragem mais tardia substituirá a amostragem aos 3 dias e exigirá justificação 
científica.
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Células Germinativas  
31. Os ensaios em TGR são adequados para o estudo da indução de mutações 
genéticas em células germinativas masculinas (7) (8) (27), em que o tempo e a cinética da espermatogénese tenham sido bem definidos (27). O número 
reduzido de óvulos disponíveis para análise, mesmo depois de superovula ­
ção, e o facto de não haver síntese de ADN no ovócito impedem a deter ­
minação de mutações em células germinativas femininas usando ensaios transgénicos (31).
 
32. Os momentos de amostragem para as células germinativas masculinas de ­
vem ser selecionados de modo a recolher amostras de todos os tipos de células expostas durante o desenvolvimento das células germinativas e a que o estádio-alvo da amostragem tenha recebido uma exposição suficiente. 
O tempo necessário para a progressão das células germinativas em desen ­
volvimento desde a fase das células estaminais espermatogoniais até à fase dos espermatozóides maduros que chegam ao ducto deferente/cauda do epidídimo é de~49 dias no ratinho (36) e de ~70 dias no rato (34) (35). 
Após uma exposição de 28 dias com um período subsequente de amos ­
tragem de três dias, o esperma acumulado, colhido no ducto deferente/cauda do epidídimo (7) (8), representa uma população de células expostas durante aproximadamente a última metade da espermatogénese, que inclui o período 
mitótico e pós-mitótico, mas não o período espermatogonial ou as células 
estaminais. Para obter amostras adequadas das células presentes no ducto deferente/cauda do epidídimo que estavam no estádio de células estaminais espermatogoniais durante o período de exposição, é necessário um mo ­
mento de amostragem adicional, no mínimo às 7 semanas (ratinhos) ou 
10 semanas (rato) após o final do tratamento.
 
33. As células extraídas dos túbulos seminíferos após um regime de 28 + 3 dias 
contêm uma população mista enriquecida para todos os estádios das células 
germinativas em desenvolvimento (7) (8). Colher amostras destas células 
para deteção de mutações genéticas não fornece uma avaliação tão precisa dos estádios nos quais as mutações das células germinais foram induzidas, como a que pode ser obtida através da colheita de amostras de espermato ­
zóides do ducto deferente/cauda do epidídimo (uma vez que as células 
germinativas colhidas nos túbulos são de diferentes tipos e haverá algumas células somáticas a contaminar esta população celular). No entanto, a co ­
lheita de amostras de células dos túbulos seminíferos, para além da recolha 
de espermatozóides do ducto deferente/cauda do epidídimo após um regime 
de amostragem de apenas 28 + 3 dias, permitirá alguma cobertura das células expostas ao longo da maior parte das fases de desenvolvimento das células germinativas e poderá ser útil para detetar alguns agentes mu ­
tagénicos de células germinativas.
 
Observações  
34. Devem ser feitas observações clínicas gerais pelo menos uma vez por dia, 
de preferência à(s) mesma(s) hora(s) todos os dias e tendo em consideração o período de pico de efeitos antecipados após a administração da dose. A 
condição de saúde dos animais deve ser registada. Pelo menos duas vezes 
por dia, todos os animais devem ser observados quanto a sinais de morbi ­
lidade e mortalidade. Todos os animais devem ser pesados pelo menos uma vez por semana e no momento do sacrifício. Pelo menos uma vez por 
semana, devem ser realizadas medições do consumo de alimentos. Se o 
produto químico em estudo for administrado através de água potável, o consumo de água deve ser medido em cada mudança de água e pelo menos uma vez por semana. Os animais que exibam indicadores não letais de 
toxicidade excessiva devem ser eutanasiados antes da conclusão do período 
de ensaio (23).
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Colheita de tecidos  
35. A fundamentação lógica para a colheita de tecidos deve ser definida de 
forma clara. Uma vez que é possível estudar a indução de mutações em 
praticamente qualquer tecido, a seleção dos tecidos a colher deve basear-se no motivo para a realização do estudo e quaisquer dados de mutagenicida ­
de, carcinogenicidade ou toxicidade existentes para o produto químico que 
esteja a ser investigado. Nos fatores importantes a considerar devem 
incluir-se a via de administração [com base na(s) via(s) de exposição hu ­
mana provável(is)], a distribuição prevista do tecido e o possível mecanismo de ação. Na ausência de qualquer informação de contexto, deverão ser 
colhidos vários tecidos somáticos que poderão apresentar interesse, respre ­
sentativos dos tecidos de proliferação rápida, de proliferação lenta e dos locais de contacto. Além disso, os espermatozóides do ducto deferente/ /cauda do epidídimo e as células germinativas em desenvolvimento prove ­
nientes dos túbulos seminíferos (como descrito nos parágrafos 32 e 33) 
devem ser colhidos e armazenados para a eventualidade de que seja neces ­
sária uma análise futura da mutagenicidade das células germinativas. Deve ser obtido o peso dos órgãos e, para os órgãos de maiores dimensões, a 
mesma área do órgão deverá ser recolhida em todos os animais.
 
Armazenamento de tecidos e ADN  
36. Os tecidos (ou homogeneizados de tecido) devem ser armazenados a uma 
temperatura de – 70 °C ou inferior e ser utilizados para isolamento do ADN 
no prazo de 5 anos. O ADN isolado, armazenado refrigerado a 4 °C em 
tampão adequado, deverá idealmente ser utilizado para análise das mutações no prazo de 1 ano.
 
Seleção de tecidos para análise das mutações  
37. A escolha de tecidos deve basear-se em considerações como: 1) a via de 
administração ou o local de primeiro contacto (p. ex.: estômago glandular, 
se a administração for oral, pulmão, se a administração for por inalação, ou pele, se for utilizada uma aplicação tópica); e 2) os parâmetros farmacoci ­
néticos observados em estudos de toxicidade geral que indiquem disposição, 
retenção ou acumulação nos tecidos ou órgãos-alvo para a toxicidade. Se 
forem realizados estudos na sequência de estudos de carcinogenicidade, devem ser considerados os tecidos-alvo dessa carcinogenicidade. A escolha dos tecidos para análise deve maximizar a deteção dos produtos químicos 
que sejam mutagénicos de ação direta  in vitro , rapidamente metabolizados, 
altamente reativos ou mal absorvidos, ou aqueles para os quais o tecido-alvo é determinado pela via de administração (6).
 
38. Na ausência de informação contextual e tendo em consideração o local de 
contacto decorrente da via de administração, o fígado e pelo menos um 
tecido de divisão rápida (p. ex.: estômago glandular, medula óssea) devem ser avaliados em termos de mutagenicidade. Na maioria dos casos, os requisitos acima podem ser preenchidos a partir de análises de dois tecidos 
cuidadosamente selecionados, mas nalguns casos será necessário analisar 
três ou mais tecidos diferentes. Se houver motivos de preocupação especí ­
fica com os efeitos sobre as células germinativas, incluindo respostas posi ­
tivas em células somáticas, os tecidos de células germinativas devem ser 
avaliados para mutações.
 
Métodos de Medição  
39. Existem métodos laboratoriais padrão ou que se encontram publicados para 
a deteção de mutações nos modelos transgénicos recomendados: bacterió ­
fago e plasmídeo lambda  lacZ  (30);  lacI  no ratinho (2) (18); delta  gpt no 
ratinho (22); delta  gpt no rato (28);  cII (17). As modificações devem ser 
justificadas e devidamente documentadas. Os dados de vários pacotes po ­
dem ser agregados e utilizados para se obter um número adequado de placas ou colónias. No entanto, a necessidade de um grande número de reações de 
empacotamento para se obter um número adequado de placas pode ser uma 
indicação de qualidade insuficiente do ADN. Nesses casos, os dados devem
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ser considerados com precaução, pois podem não ser fiáveis. O número 
total ideal de placas ou colónias por amostra de ADN é regido pela pro ­
babilidade estatística de deteção de números suficientes de mutações numa determinada frequência de mutação espontânea. Geralmente é necessário um mínimo de 125 000 a 300 000 placas se a frequência de mutação espontânea 
estiver na ordem de 3 × 10
 –5 (15). Para o ensaio Big Blue®  lacI , é 
importante demonstrar que é possível detetar toda a gama de fenótipos mutantes na côr, através da inclusão de controlos de côr adequados em cada conjunto de placas. Os tecidos e as amostras (ou órgãos) resultantes 
devem ser processados e analisados utilizando uma conceção em bloco, na 
qual as amostras provenientes do grupo de controlo veículo/solvente, do grupo de controlo positivo (se for utilizado) ou do ADN de controlo posi ­
tivo (quando apropriado) e de cada grupo de tratamento sejam processados 
em conjunto.
 
DADOS E RELATÓRIOS  
Tratamento dos resultados  
40. Os dados relativos a cada animal devem ser apresentados num quadro. A 
unidade experimental é o animal. O relatório deve incluir o número total de unidades formadoras de placas (pfu) ou unidades formadoras de colónias (cfu), o número de mutações e a frequência de mutação para cada tecido de 
cada animal. Se houver várias reações empacotamento/resgate, deve ser 
comunicado o número de reações por amostra de ADN. Embora devam ser conservados os dados respeitantes a cada reação individual, só é neces ­
sário comunicar os totais de pfu ou cfu. Devem ser comunicados os dados 
relativos à toxicidade e aos sinais clínicos, em conformidade com o pará ­
grafo 34. Todos os resultados de sequenciamento devem ser apresentados para cada mutação analisada e devem ser apresentados os cálculos da fre ­
quência de mutação resultantes para cada animal e tecido.
 
Avaliação e interpretação estatística dos resultados  
41. Existem vários critérios para determinar um resultado positivo, tais como 
um aumento na frequência de mutação relacionado com a dose ou um claro 
aumento na frequência de mutação de um único grupo de dosagem com ­
parativamente ao grupo de controlo de solvente/veículo. Devem ser anali ­
sados pelo menos três grupos tratados, de modo a proporcionar dados 
suficientes para uma análise da resposta à dosagem. Embora a relevância 
biológica dos resultados deva ser a principal consideração, podem ser uti ­
lizados métodos estatísticos adequados auxiliares da avaliação dos resulta ­
dos dos ensaios (4) (14) (15) (25) (26). Os testes estatísticos utilizados 
devem ter em consideração o animal como unidade experimental.  
42. Um produto químico em estudo para o qual os resultados não cumpram os 
critérios acima em qualquer tecido é considerado não mutagénico neste ensaio. Para a relevância biológica de um resultado negativo, a exposição do tecido deve ser confirmada.
 
43. Para as análises de sequenciamento de ADN, está disponível uma série de 
abordagens estatísticas para auxiliar na interpretação dos resultados (1) (5) 
(9) (19).  
44. A consideração sobre se os valores observados estão dentro ou fora da faixa 
de controlo histórico pode fornecer orientações para a avaliação da signifi ­
cância biológica da resposta (32).  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 921
 
Relatório de ensaio  
45. O relatório de ensaio deve incluir a seguinte informação:  
Produto químico em estudo:  
— dados de identificação e n.  o CAS, se for conhecido;  
— fonte, número do lote, se disponível;  
— natureza física e pureza;  
— propriedades físico-químicas relevantes para a realização do estudo;  
— estabilidade do produto químico em estudo, se conhecida;  
Solvente/veículo:  
— justificação da escolha do veículo;  
— solubilidade e estabilidade do produto químico em estudo no solvente/ 
/veículo, se conhecidas;  
— preparação de fórmulas alimentares, na água potável ou inaláveis;  
— determinações analíticas sobre essas fórmulas (p. ex.: estabilidade, ho ­
mogeneidade, concentrações nominais);  
Animais de ensaio:  
— espécie/estirpe utilizada e justificação da escolha;  
— número, idade e sexo dos animais;  
— proveniência, condições de alojamento, dieta administrada, etc.;  
— peso de cada animal no início do ensaio, incluindo o intervalo de pesos 
corporais, a média e o desvio-padrão para cada grupo;  
Condições de ensaio:  
— dados de controlo positivos e negativos (veículo/solvente);  
— dados do estudo de determinação de intervalos de dosagem;  
— motivo da escolha da gama de dosagem;  
— detalhes da preparação do produto químico em estudo;  
— detalhes relativos à administração do produto químico em estudo;  
— justificação da via de administração escolhida;  
— métodos de medição da toxicidade para os animais, incluindo, sempre 
que disponíveis, análises histopatológicas ou hematológicas e a frequên ­
cia com que foram realizadas observações dos animais e dos respetivos pesos corporais;
 
— métodos de verificação de que o produto químico em estudo atingiu o 
tecido-alvo, ou a circulação geral, se os resultados forem negativos;  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 922
 
— dose real (mg/kg de peso corporal/dia), calculada a partir da concen ­
tração do produto químico em estudo nos alimentos/água potável (ppm) 
e do consumo, se aplicável;  
— pormenores relativos à qualidade dos alimentos e da água;  
— descrição detalhada do tratamento e calendários de amostragem e justi ­
ficação das escolhas feitas;  
— método de eutanásia;  
— procedimentos para o isolamento e preservação de tecidos;  
— métodos para o isolamento de ADN genómico de roedor, resgate do 
transgene a partir de ADN genómico e transferência do ADN trans ­
génico para um hospedeiro bacteriano;  
— números de origem e lote de todas as células,  kits e reagentes (quando 
aplicável);  
— métodos para a enumeração das mutações;  
— métodos de análise molecular das mutações e utilização na correção 
para a clonalidade e/ou para o cálculo das frequências de mutação, se aplicável;
 
Resultados:  
— condição do animal antes e durante o período de ensaio, incluindo sinais 
de toxicidade;  
— pesos corporal e dos órgãos no momento do sacrifício;  
— para cada tecido/animal, número de mutações, número de placas ou 
colónias avaliadas e frequência das mutações;  
— para cada grupo de tecidos/animais, número de reações de empacota ­
mento por amostra de ADN, número total de mutações, frequência 
média de mutação, desvio padrão;  
— relação dose-resposta, quando possível;  
— para cada tecido/animal, número de mutações independentes e frequên ­
cia de mutação média, sempre que tenha sido realizada uma análise 
molecular das mutações;  
— dados históricos e simultâneos sobre o controlo negativo, com interva ­
los, médias e desvios-padrão;  
— dados de controlo positivo simultâneos (ou controlo positivo de ADN 
não simultâneo);  
— determinações analíticas, se disponíveis (p. ex.: concentrações de ADN 
utilizadas nos empacotamentos, dados de sequenciação do ADN);  
— análise estatística e métodos aplicados;  
Discussão dos resultados  
Conclusão  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 923
 
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Apêndice  
DEFINIÇÕES  
Período de administração:  o período total durante o qual um animal é exposto a 
uma dose do produto químico.  
Substituição de um par de bases:  um tipo de mutação que provoca a subs ­
tituição de uma única base de nucleotídeos do ADN por outra base de nucleo ­
tídeos do ADN.  
Cápside:  o invólucro proteico que envolve uma partícula viral.  
Produto químico:  uma substância ou uma mistura.  
Expansão clonal:  a produção de muitas células a partir de uma única célula 
(mutante).  
Unidades formadoras de colónias (cfu):  uma medida do número de bactérias 
viáveis.  
Concatâmero:  uma biomolécula contínua e longa constituída por várias cópias 
idênticas ligadas em série.  
Local cos:  um segmento de 12 nucleótidos de ADN de cadeia simples que existe 
em ambas as extremidades do genoma de cadeia dupla do bacteriófago lambda.  
Supressão:  uma mutação na qual um ou mais nucleótidos (sequenciais) desapa ­
recem do genoma.  
Eletroporação:  a aplicação de impulsos elétricos para aumentar a permeabili ­
dade das membranas celulares.  
Gene endógeno:  um gene nativo do genoma.  
Variação extra-binomial:  maior variabilidade das estimativas repetidas de uma 
proporção da população do que seria de esperar se essa população tivesse uma 
distribuição binomial.  
Mutação por deslocamento:  uma mutação genética causada por inserções ou 
supressões de um número de nucleótidos que não é divisível uniformemente por três dentro de uma sequência de ADN que codifica para uma proteína/péptido.
 
Inserção:  o acréscimo de um ou mais pares de bases de nucleótidos numa 
sequência de ADN.  
Jackpot:  um grande número de mutações que surgiram através da expansão 
clonal de uma única mutação.  
Grandes supressões:  supressões no ADN auperiores a vários milhares de bases 
(detetadas de forma eficaz pelos ensaios de seleção Spi  – e do plasmídeo lacZ).  
«Colagem»:  a ligação covalente de duas extremidades de moléculas de ADN 
utilizando ligases.  
Mitogénio:  uma substância química que estimula uma célula a iniciar a divisão 
celular, desencadeando a mitose (ou seja, a divisão celular).  
Gene neutro:  um gene que não é afetado pelas pressões seletivas positivas ou 
negativas.  
Empacotamento:  a síntese de partículas de fagos infeciosos a partir de uma 
preparação de proteínas da cápside e da cauda do fago e um concatâmero de 
moléculas de ADN de fágicas. Geralmente utilizado para empacotar o ADN clonado num vetor lambda (separado por locais cos) em partículas lambda infeciosas.
 
Eficiência de empacotamento:  a eficiência com a qual os bacteriófagos empa ­
cotados são recuperados em bactérias hospedeiras.  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 927
 
Unidade formadora de placas (pfu):  uma medida de números de bacteriófagos 
viáveis.  
Mutação pontual:  um termo geral para uma mutação que afeta apenas uma 
pequena sequência de ADN, incluindo pequenas inserções, supressões e subs ­
tituições de pares de bases.  
Seleção positiva:  um método que permite que sobrevivam apenas os indivíduos 
nos quais se verificaram mutações.  
Gene repórter:  um gene cujo resultado mutante pode ser facilmente detetado.  
Período de amostragem:  o final do período, antes do sacrifício, durante o qual a 
substância química não é administrada e as lesões do ADN não processadas são fixadas em mutações estáveis.
 
Vetor de transporte:  um vetor construído de modo a poder propagar-se em duas 
espécies hospedeiras diferentes; assim, o ADN inserido num vetor de transporte 
pode ser testado ou manipulado em dois tipos de células diferentes ou dois 
organismos diferentes.  
Produto químico em estudo:  qualquer substância ou mistura estudada utilizando 
este método de ensaio.  
Transgénico:  de, relativo a, ou organismo cujo genoma foi modificado através 
da transferência de um gene ou genes de outras espécies.  ▼M5 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 928
 
PARTE C: MÉTODOS PARA A DETERMINAÇÃO DA 
ECOTOXICIDADE  
ÍNDICE 
C.1. TOXICIDADE AGUDA PARA OS PEIXES C.2. ENSAIO DE IMOBILIZAÇÃO AGUDA DA  DAPHNIA  SP. 
C.3. CIANOBACTÉRIAS E ALGAS DE ÁGUA DOCE, ENSAIO DE 
INIBIÇÃO DE CRESCIMENTO 
C.4. DETERMINAÇÃO DA BIODEGRADABILIDADE «FÁCIL» PARTE I. CONSIDERAÇÕES GERAIS PARTE II. ENSAIO DA REDUÇÃO GRADUAL DO COD (método C.4-A) PARTE III. TESTE DE DESPISTE DA OCDE MODIFICADO (método C.4-B) PARTE IV. ENSAIO DA LIBERTAÇÃO DE CO
 2 (método C.4-C) 
PARTE V. ENSAIO DE RESPIROMETRIA MANOMÉTRICA (método C.4-D) PARTE VI. ENSAIO EM FRASCO FECHADO (método C.4-E) PARTE VII. ENSAIO DE M.I.T.I. (método C.4-F) C.5 DEGRADAÇÃO — CARÊNCIA BIOQUÍMICA DE OXIGÉNIO C.6. DEGRADAÇÃO — CARÊNCIA QUÍMICA DE OXIGÉNIO C.7. DEGRADAÇÃO — DEGRADAÇÃO ABIÓTICA: HIDRÓLISE 
EM FUNÇÃO DO PH 
C.8. TOXICIDADE EM RELAÇÃO ÀS MINHOCAS C.9. BIODEGRADAÇÃO — ENSAIO DE ZAHN E WELLENS C.10. ENSAIO DE SIMULAÇÃO DO TRATAMENTO AERÓBIO DE 
EFLUENTES C.10-A: UNIDADES DE LAMAS ATIVADAS — C.10-B BIOFILMES 
C.11. BIODEGRADAÇÃO — LAMAS ACTIVADAS: ENSAIOS DE 
INIBIÇÃO DA RESPIRAÇÃO 
C.12. BIODEGRADAÇÃO — ENSAIO L.A.S.C. MODIFICADO C.13. BIOCONCENTRAÇÃO: ENSAIO DINÂMICO COM PEIXE C.14. ENSAIO DE CRESCIMENTO JUVENIL EM PEIXE C.15. ENSAIO DE TOXICIDADE DE CURTO PRAZO NOS PEIXES 
EM ESTÁDIO EMBRIONÁRIO E RECÉM-NASCIDOS 
C.16. ABELHAS DOMÉSTICAS — ENSAIO DE TOXICIDADE 
ORAL AGUDA 
C.17. ABELHAS DOMÉSTICAS — ENSAIO DE TOXICIDADE 
AGUDA POR CONTACTO 
C.18. ADSORÇÃO/DESSORÇÃO POR RECURSO A UM MÉTODO 
DE EQUILÍBRIO POR LOTES DE SOLO
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 929
 
C.19. ESTIMATIVA DO VALOR DO COEFICIENTE DE ADSOR ­
ÇÃO  (K  OC ) EM SOLOS E EM LAMAS DE DEPURAÇÃO 
POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA 
(HPLC) 
C.20. ENSAIO SOBRE A REPRODUÇÃO DA  DAPHNIA MAGNA  
C.21. MICROORGANISMOS NO SOLO: ENSAIO DE TRANSFOR ­
MAÇÃO DE AZOTO 
C.22. MICROORGANISMOS NO SOLO: ENSAIO DE TRANSFOR ­
MAÇÃO DE CARBONO 
C.23. TRANSFORMAÇÕES AERÓBIAS E ANAERÓBIAS NO SOLO C.24. TRANSFORMAÇÕES AERÓBIAS E ANAERÓBIAS EM SIS ­
TEMAS DE SEDIMENTOS AQUÁTICOS 
C.25. MINERALIZAÇÃO AERÓBICA EM ÁGUAS DE SUPERFÍCIE 
— ENSAIO DE SIMULAÇÃO DE BIODEGRADAÇÃO 
C.26. ENSAIO DE INIBIÇÃO DE CRESCIMENTO COM  LEMNA  
SPP.
 
▼M4 
C.27. ENSAIO DE TOXICIDADE EM QUIRONOMÍDEOS NUM SIS ­
TEMA SEDIMENTOS-ÁGUA COM SEDIMENTOS ENRIQUE ­
CIDOS 
C.28. ENSAIO DE TOXICIDADE EM QUIRONOMÍDEOS NUM SIS ­
TEMA SEDIMENTOS-ÁGUA COM ÁGUA ENRIQUECIDA 
C.29. BIODEGRADABILIDADE "FÁCIL" — CO  2 EM RECIPIENTES 
FECHADOS (Ensaio do espaço livre) 
C.30. BIOACUMULAÇÃO EM OLIGOQUETAS TERRESTRES  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 930
 
C.1. TOXICIDADE AGUDA PARA OS PEIXES  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
O objectivo deste ensaio consiste em determinar a toxicidade letal 
aguda de uma substância para os peixes de água-doce. Tanto quanto 
possível é desejável possuir informações sobre a solubilidade na água, a pressão de vapor, a estabilidade química, as constantes de dissociação e a biodegradabilidade da substância para auxiliar a 
seleccionar o método de ensaio mais apropriado (estático, semiestá ­
tico ou por escoamento) para garantir concentrações constantes sa ­
tisfatórias da substância de ensaio durante o período desse ensaio.
 
Ao fazer-se o planeamento do ensaio e a interpretação dos resultados 
devem tomar-se em consideração as informações adicionais disponí ­
veis (por exemplo, fórmula estrutural, grau de pureza, natureza e 
percentagem das impurezas significativas, presença e quantidades de aditivos, coeficiente de partição n-octanol/água).
 
1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES  
A toxicidade aguda é o efeito adverso perceptível induzido num 
organismo ao fim de um curto período de tempo (alguns dias) de 
exposição a uma substância. Neste ensaio, exprime-se a toxicidade 
aguda pelo valor da concentração letal cinquenta (CL  50 ), isto é, a 
concentração em água que mata 50 % dos peixes que constituem o grupo submetido a ensaio decorrido um período contínuo de expo ­
sição o qual deve ser especificado.
 
Todas as concentrações da substância de ensaio são dadas em peso 
por volume (miligramas por litro). As concentrações também podem ser expressas em peso por peso (mg/kg
 -1 ). 
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Pode fazer-se o ensaio com uma substância de referência para se 
demonstrar que, sob as condições de ensaio laboratoriais, a resposta das espécies testadas não se modificou significativamente.
 
Para este ensaio não estão especificadas quaisquer substâncias de 
referência.  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Pode efectuar-se um teste-limite para a concentração de 100 mg por 
litro no sentido de se demonstrar que o valor CL  50 é superior a esta 
concentração.  
Os peixes são expostos à substância de ensaio misturada com água, 
num determinado intervalo de concentrações, durante um período de 96 horas. Procede-se ao registo do número de mortes em intervalos 
de 24 horas pelo menos e calcula-se, sempre que possível, as con ­
centrações que matam 50 % dos peixes (CL
 50 ) em cada momento de 
observação.  
1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
Os critérios de qualidade deverão ser aplicados ao teste-limite e 
também no método do teste global.  
A mortalidade nos controlos não deve exceder o valor de 10 % (ou 
um peixe no caso de se utilizar menos de dez peixes) no termo do 
ensaio.  
A concentração do oxigénio dissolvido deve ser superior a 60 % do 
valor da saturação com ar.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 931
 
A concentração da substância de ensaio deverá ser mantida a cerca 
de 80 % do valor da concentração inicial, ao longo do período de 
duração do ensaio.  
Para as substâncias que se dissolvem facilmente no meio de ensaio, 
dando origem a soluções estáveis, isto é, para as substâncias que não 
são significativamente volatilizáveis, degradáveis, hidrolisáveis ou adsorvidas, pode considerar-se a concentração inicial como equiva ­
lente ao valor da concentração nominal. Dever-se-á demonstrar que 
as concentrações foram mantidas durante todo o ensaio e que os 
critérios de qualidade foram satisfeitos.
 
Para as substâncias que são:  
i) fracamente solúveis no meio de ensaio, ou  
ii) susceptíveis de formar emulsões ou dispersões estáveis, ou  
iii) instáveis em soluções aquosas,  
pode considerar-se a concentração inicial como sendo a concentração 
medida na solução (ou, no caso de ser tecnicamente impossível, 
medida na coluna de água) no início do ensaio. A concentração deverá ser determinada após um período de equilíbrio, mas antes da introdução dos peixes de ensaio.
 
Em quaisquer desses casos é necessário efectuar outras medições 
durante o ensaio, para se confirmar que as concentrações da expo ­
sição e os critérios de qualidade foram respeitados.  
O valor do pH não deverá variar mais de uma unidade.  
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
É possível utilizar três tipos de procedimentos:  
Ensaio estático:  
Trata-se de um ensaio de toxicidade em que não ocorre qualquer 
fluxo da solução de ensaio. (As soluções permanecem inalteradas 
durante o período do ensaio.)  
Ensaio semiestático:  
Trata-se de um ensaio sem fluxo da solução de ensaio, mas com 
renovação regular das soluções de ensaio após períodos prolongados 
(por exemplo, 24 horas).  
Ensaio por escoamento:  
Trata-se de um ensaio de toxicidade em que a água é renovada 
constantemente nas câmaras de ensaio, sendo a substância química 
de ensaio transportada com a água utilizada para renovar o meio de ensaio.
 
1.6.1.  Reagentes  
1.6.1.1.  Soluções das substâncias de ensaio  
As soluções de reserva com a concentração pretendida são prepara ­
das dissolvendo a substância em água desionizada ou simplesmente em água, de acordo com o ponto 1.6.1.2.
 
As concentrações escolhidas para o ensaio são preparadas por dilui ­
ção da solução de reserva. Se se realiza um ensaio com concentra ­
ções elevadas, a substância pode ser diluída directamente na água de 
diluição.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 932
 
Normalmente as substâncias apenas deverão ser testadas até ao limite 
de solubilidade. Para algumas substâncias (por exemplo, substâncias 
que possuem fraca solubilidade em água, ou com um valor P  ow 
elevado, ou para aquelas que formam dispersões estáveis em vez 
de uma verdadeira solução em água), é aceitável efectuar a expe ­
riência com uma concentração superior ao limite de solubilidade da 
substância para garantir a obtenção da máxima concentração solúvel/estável. Todavia é importante que essa concentração não perturbe, por qualquer forma, o sistema de ensaio (por exemplo, 
formação de uma película da substância sobre a superfície da água 
evitando a sua oxigenação, etc.).
 
É possível recorrer à dispersão ultra-sónica, a solventes orgânicos, a 
emulsionantes ou a dispersantes para auxiliar a preparação das solu ­
ções de reserva de substâncias com fraca solubilidade na água ou para auxiliar a dispersão dessas substâncias no meio de ensaio. 
Quando se utilizam essas substâncias auxiliares todas as concentra ­
ções de ensaio deverão conter a mesma quantidade de substância auxiliar e dever-se-á expor os peixes de ensaio de controlo adicional a uma concentração da substância auxiliar idêntica à utilizada nas 
séries de ensaio. A concentração dessas substâncias auxiliares deverá 
ser mínima e em caso algum deve exceder 100 mg por litro de meio de ensaio.
 
O ensaio deve ser efectuado sem ajustamento do valor de pH. Se 
houver sinais evidentes de uma alteração nítida dos valores de pH, é 
aconselhável repetir o ensaio com ajustamento desses valores e efec ­
tuar-se o registo dos resultados. Nesse caso ajustar-se-á o valor do pH da solução de reserva para o valor de pH da água de diluição, salvo se houver razões específicas para não se proceder desse modo. 
Para satisfazer este objectivo é preferível utilizar HC1 e NaOH. Este 
ajustamento do valor do pH deverá ser efectuado de tal modo que a concentração da substância de ensaio na solução de reserva não varie significativamente. No caso de ocorrer qualquer reacção química ou 
precipitação do composto de ensaio, provocada por esse ajustamento, 
deve descrever-se tal facto.
 
1.6.1.2.  Água de confinação e de diluição  
Utiliza-se uma fonte de água potável (não contaminada por concen ­
trações potencialmente nocivas de cloro, de metais pesados ou de outras substâncias), água natural de boa qualidade ou água recons ­
tituída (ver apêndice 1). É preferível utilizar águas com uma dureza 
total compreendida entre 10 e 250 mg de CaCO
 3 por litro e com um 
valor de pH compreendido entre 6,0 e 8,5.  
1.6.2.  Aparelho  
Todos os aparelhos devem ser feitos com materiais quimicamente 
inertes.  
— sistema de diluição automático (para o ensaio por escoamento),  
— medidor de oxigénio,  
— equipamento para a determinação da dureza da água,  
— aparelho adequado para o controlo de temperatura,  
— medidor de pH.  
1.6.3.  Peixes de experiência  
Os peixes devem estar em boas condições de saúde e não devem ser 
portadores de qualquer defeito físico aparente.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 933
 
As espécies utilizadas deverão ser seleccionadas tomando como base 
critérios práticos tais como a sua fácil disponibilidade ao longo do 
ano, a facilidade da sua manutenção, a conveniência de os submeter a ensaio, a sua sensibilidade relativa às substâncias químicas, e quaisquer factores económicos, biológicos ou ecológicos significati ­
vos. Quando se faz a selecção das espécies de peixes deve ter-se 
presente a necessidade de efectuar um estudo comparando os resul ­
tados obtidos com os resultados existentes relativos à harmonização internacional (referência 1).
 
No apêndice 2 encontra-se uma listagem das espécies de peixes 
recomendadas para a realização deste ensaio; as espécies preferen ­
ciais são o peixe-zebra e a truta-arco-íris.  
1.6.3.1.  Confinação  
Preferencialmente os peixes deverão ser provenientes de uma reserva 
única em que todos possuem a mesma idade e comprimento. Os peixes devem ser confinados durante pelo menos 12 dias nas condi ­
ções seguintes:
 
Carga:  
apropriada ao sistema (recirculação ou escoamento) e às espécies de 
peixes;  
Água:  
ver ponto 1.6.1.2;  
Luz: 
fotoperíodo diário de 12 a 16 horas;  
Concentração do oxigénio dissolvido:  
pelo menos 80 % do valor da saturação com ar;  
Alimentação:  
três vezes por semana ou diariamente, cessando 24 horas antes do 
início do ensaio.  
1.6.3.2.  Mortalidade  
Após um período de ajustamento de 48 horas procede-se ao registo 
das mortalidades aplicando os critérios seguintes:  
— superior a 10 % da população, em sete dias:  
rejeição de todo o lote,  
— entre 5 % e 10 % da população:  
prolonga-se o período de confinação durante mais sete dias.  
Se não houver mais mortalidades, o lote é aceitável; caso con ­
trário deve ser rejeitado,  
— menos do que 5 % da população:  
aceita-se o lote.  
1.6.4.  Adaptação  
Os peixes devem ser mantidos, nas condições do ensaio relativas à 
qualidade da água e à temperatura, durante pelo menos sete dias 
antes do início deste.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 934
 
1.6.5.  Procedimento de ensaio  
Antes do ensaio definitivo pode efectuar-se um ensaio preliminar no 
sentido de se obter informação sobre as concentrações que devem ser utilizadas no ensaio principal.
 
Para além das séries de ensaio efectua-se uma experiência de con ­
trolo sem a substância de ensaio, e, se for relevante, efectua-se 
também uma experiência de controlo contendo a substância auxiliar.  
Consoante as propriedades físicas e químicas do composto de ensaio, 
assim será seleccionado um ensaio estático, semiestático ou por es ­
coamento, para satisfazer os critérios de qualidade.  
Os peixes são expostos à substância de ensaio conforme a seguir 
descrito:  
— duração: 96 horas,  
— número de animais: pelo menos sete para cada concentração,  
— tanques: com capacidade adequada em relação à carga recomen ­
dada,  
— carga: recomenda-se uma carga máxima de 1,0 g por litro para os 
ensaios estático e semiestático; para os sistemas de escoamento é 
aceitável uma carga superior,  
— concentração de ensaio: utilizar-se-ão pelo menos cinco concen ­
trações afastadas entre si por um factor constante inferior a 2,2, e 
abrangendo tanto quanto possível o intervalo de mortalidade 
compreendido entre 0 e 100 %,  
— água: ver ponto 1.6.1.2,  
— luz: fotoperíodo diário de 12 a 16 horas,  
— temperatura: apropriada às espécies (apêndice 2) não variando de 
± 1  o C para cada ensaio particular,  
— concentração do oxigénio dissolvido: não inferior a 60 % do 
valor da saturação com ar, para o valor de temperatura seleccio ­
nado,  
— alimentação: nenhuma.  
Os peixes são inspeccionados decorridas as duas a quatro horas 
iniciais e pelo menos em intervalos de 24 horas. Considera-se que 
os peixes estão mortos se o toque no pedúnculo caudal não produzir 
qualquer reacção e se não houver movimentos respiratórios visíveis. Regista-se o número de peixes mortos e faz-se a sua remoção. Re ­
gista-se também as anomalias visíveis (por exemplo, perda de equi ­
líbrio, alterações do comportamento natatório, função respiratória, 
pigmentação, etc.).
 
Diariamente proceder-se-á à medição dos valores de pH, do oxigénio 
dissolvido e da temperatura.  
Teste-limite  
Utilizando o procedimento descrito neste método de ensaio é possí ­
vel efectuar um teste-limite para a concentração de 100 mg por litro no sentido de se demonstrar que o valor CL
 50 é superior a esta 
concentração.  
Se a natureza da substância for tal que não seja possível obter uma 
concentração de 100 mg por litro, o teste-limite deverá ser efectuado para um valor de concentração igual à solubilidade da substância (ou 
igual à concentração máxima que forma uma dispersão estável) no 
meio utilizado (ver também o ponto 1.6.1.1).
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 935
 
O teste-limite deverá ser efectuado utilizando sete a dez peixes, 
utilizando-se o mesmo número nos controlos. (A teoria do binómio 
estabelece que no caso de se utilizar dez peixes com mortalidade 0, existe um intervalo de confiança de 99,9 % em que o valor CL
 50 é 
superior à concentração utilizada no teste-limite. Com sete, oito ou 
nove peixes, a ausência de mortalidade proporciona um intervalo de 
confiança de pelo menos 99 % em que o valor CL  50 é superior à 
concentração utilizada.)  
Se houver mortalidade deve efectuar-se um estudo completo. 
No caso de serem observados efeitos subletais, estes deverão ser registados.
 
2. RESULTADOS E AVALIAÇÃO  
Para cada período de observações registadas (24, 48, 72 e 96 horas), 
traça-se a curva da percentagem de mortalidade para cada período de 
exposição recomendada em função da concentração utilizando papel logarítmico/probabilidade.
 
Sempre que possível e para cada momento de observação deve 
estimar-se o valor CI.  50 e os limites de confiança (p = 0,05), utili ­
zando procedimentos normalizados; esses valores deverão ser apro ­
ximados para um ou, no máximo, dois algarismos significativos 
(exemplos de arredondamento para dois algarismos: de 173,5 para 174; de 0,127 para 0,13; de 1,21 para 1,2).
 
Nos casos em que o declive da curva de resposta concentração/ ­
percentagem é muito acentuado para permitir o cálculo do valor 
CL 50 , considera-se suficiente uma estimativa gráfica deste valor.  
No caso de duas concentrações consecutivas, sendo a razão entre 
elas 2,2, proporcionarem apenas mortalidades de 0 e 100 %, consi ­
dera-se que esses dois valores são suficientes para indicar o intervalo de localização do valor CL
 5O . 
No caso de se verificar que a estabilidade ou a homogeneidade da 
substância de ensaio não pode ser mantida, dever-se-á descrever esse 
facto e é necessário tomar precauções na interpretação dos resulta ­
dos. 
3. RELATÓRIO  
O relatório do ensaio deverá conter, se possível, a informação se ­
guinte:  
— informação sobre o peixe de ensaio (designação científica, estir ­
pe, fornecedor, qualquer tratamento prévio, dimensões e número utilizado para cada concentração de ensaio),
 
— fonte da água de diluição e características químicas principais 
(pH, dureza, temperatura),  
— no caso de uma substância de fraca solubilidade aquosa, indicar- 
-se-á o método de preparação das soluções de reserva e de ensaio,  
— concentração de quaisquer substâncias auxiliares,  
— enumeração das concentrações utilizadas e qualquer informação 
disponível sobre a estabilidade para essas concentrações da subs ­
tância química de ensaio, na solução de ensaio,  
— no caso de se efectuarem análises químicas, indicar os métodos 
utilizados e os resultados,  
— resultados do teste-limite, se existirem,  
— razões para a escolha e pormenores sobre o procedimento de 
ensaio utilizado (por exemplo, método estático, semiestático, ra ­
zão entre doses, débito do escoamento, arejamento, número de 
peixes, etc.),  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 936
 
— descrição do equipamento de ensaio,  
— regime de exposição à luz,  
— concentrações do oxigénio dissolvido, valor de pH e temperatu ­
ras das soluções de ensaio em cada 24 horas,  
— provas demonstrativas de que os critérios de qualidade foram 
cumpridos,  
— um quadro apresentando a mortalidade cumulativa para cada 
concentração e para o controlo (e, se necessário, para o controlo com a substância auxiliar) em cada um dos momentos de obser ­
vação recomendados,
 
— gráfico da curva de resposta concentração/percentagem no fim do 
ensaio,  
— sempre que possível, os valores CL  50 em cada um dos momentos 
de observação recomendados (com limites de confiança de 
95 %),  
— procedimentos estatísticos para a determinação dos valores CL  50 , 
— no caso de se utilizar uma substância de referência, os resultados 
obtidos,  
— valor da mais elevada concentração de ensaio que não provoca 
mortalidade durante o período do ensaio,  
— valor da mais fraca concentração que provoca 100 % de morta ­
lidade durante o período do ensaio.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) OECD, Paris, 1981, Test Guideline 203, Decision of the Coun ­
cil C(81) 30 final and updates.  
(2) AFNOR — Determination of the acute toxicity of a substance 
to Brachydanio rerio  — Static and Flow Through methods — 
NFT 90-303 June 1985.  
(3) AFNOR — Determination of the acute toxicity of a substance 
to Salmo gairdneri  — Static and Flow Through methods — 
NFT 90-305 June 1985.  
(4) ISO 7346/1,/2 and/3 — Water Quality — Determination of the 
acute lethal toxicity of substances to a fresh water fish  (Bra­
chydanio rerio  Hamilton-Buchanan —  Teleostei, Cyprinidae).  
Part 1: Static method. Part 2: Semi-static method. Part 3: Flow- 
-through method.  
(5) Eidgenössisches Department des Innern, Schweiz: Richtlinien 
fur Probenahme und Normung von Wasseruntersuchungsmet ­
hoden — Part II 1974.  
(6) DIN Testverfahren mit Wasserorganismen, 38 412 (L1) und L 
(15).  
(7) JIS K 0102, Acute toxicity test for fish.  
(8) NEN 6506 — Water — Bepaling van de akute toxiciteit met 
behulp van  Poecilia reticulata,  1980.  
(9) Environmental Protection Agency, Methods for the acute toxi ­
city tests with fish, macroinvertebrates and amphibians. The 
Committee on Methods for Toxicity Tests with Aquatic Orga ­
nisms, Ecological Research Series EPA-660-75-009, 1975.  
(10) Environmental Protection Agency, Environmental monitoring 
and support laboratory, Office of Research and Development, 
EPA-600/4-78-012, January 1978.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 937
 
(11) Environmental Protection Agency, Toxic Substance Control, 
Part IV, 16 March 1979.  
(12) Standard methods for the examination of water and wastewa ­
ter, 14th edition, APHA-AWWA-WPCF, 1975.  
(13) Commission of the European Communities, Inter-laboratory 
test programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to the fish. EEC Study 
D.8368, 22 March 1979.
 
(14) Verfahrensvorschlag des Umweltbundesamtes zum akuten 
Fisch-Test. Rudolph, P. und Boje, R. Ökocoxikologie, Grun ­
dlagen für die Ökotoxikologische Bewertung von Umweltche ­
mikalien nach dem Chemikaliengesetz, ecomed 1986.  
(15) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F., A simplified method for 
evaluating dose effects experiments, J. Pharm, Exp. Therap., 1949, vol. 96, 99.
 
(16) Finney, D.J. Statistical Methods in Biological Assay. Griffin, 
Weycombe, U.K., 1978.  
(17) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. Bio ­
assay methods for acute toxicity. Water Res., 1969, vol. 3, 793-821.
 
(18) Sprague, J.B. Measurement of pollutant toxicity to fish. II 
Utilising and applying bioassay results. Water Res. 1970, 
vol. 4, 3-32.  
(19) Stephan, C.E. Methods for calculating an LC  50 . In Aquatic 
Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. Mayer and J.L. Hamelink). American Society for Testing and Materials, 
ASTM STP 634, 1977, 65-84.
 
(20) Stephan, C.E., Busch, K.A., Smith, R., Burke, J. and Andrews, 
R.W. A computer program for calculating an LC  50 . US EPA.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 938
 
Apêndice 1  
Água reconstituída  
Exemplo de uma água adequada para diluição  
Todas as substâncias químicas devem ser de qualidade analítica.  
A água deve ser destilada e de boa qualidade, ou desionizada com uma condu ­
tividade inferior a 5 μScm  -1 . 
O aparelho para a destilação da água não deve conter quaisquer partes feitas de 
cobre.  
Soluções de reserva  
CaCl  2 . 2H  2 O (cloreto de cálcio dihidratado): 
Dissolve-se em água e ajusta-se o volume até 1 litro utili ­
zando água. 11,76 g 
MgSO  4 . 7H  2 O (sulfato de magnésio heptahidratado): 
Dissolve-se em água e ajusta-se o volume até 1 litro utili ­
zando água. 4,93 g 
NaHCO  3 (hidrogenocarbonato de sódio): 
Dissolve-se em água e ajusta-se o volume até 1 litro utili ­
zando água. 2,59 g 
KCl (cloreto de potássio): 
Dissolve-se em água e ajusta-se o volume até 1 litro utili ­
zando água. 0,23 g  
Água de diluição reconstituída  
Mistura-se 25 ml de cada uma das quatro soluções de reserva e ajusta-se o 
volume até 1 litro utilizando água.  
Faz-se o arejamento até que a concentração do oxigénio dissolvido seja igual ao 
valor da saturação com ar.  
O pH deve ser 7,8 ± 0,2.  
Se necessário ajusta-se o valor do pH com NaOH (hidróxido de sódio) ou com 
HCl (ácido clorídrico).  
A água para diluição assim preparada é colocada à parte durante 12 horas e não 
deve ser mais arejada.  
A soma dos iões Ca e Mg nesta solução é de 2,5 mmol por litro. A razão entre 
os iões Ca:Mg é de 4:1 e entre os iões Na:K é de 10:1. A alcalinidade total desta solução é de 0,8 mmol por litro.
 
Qualquer desvio na preparação da água de diluição não deve modificar a com ­
posição ou as propriedades da água.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 939
 
Apêndice 2  
Espécies de peixes recomendadas para ensaio  
Espécies recomendadas Intervalo 
recomendado para 
as temperaturas de 
ensaio (  o C) Comprimento 
total recomendado 
para os animais 
do ensaio (cm)  
Brachydanio rerio (Teleostei, Cyprinidae)  
(Hamil-ton-Buchanan) Peixinho-zebra 20 a 24 3,0 ± 0,5  
Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae)  
(Rafi-nesque) Peixinho-cabeça-gorda 20 a 24 5,0 ± 2,0  
Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae)  
(Linnaeus 1758) Carpa 20 a 24 6,0 ± 2,0  
Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliiae) Cy ­
prinodonti-dae  (Tomminck et Schlegel 
1850) Peixe-arroz-do-Ja-pão 20 a 24 3,0 ± 1,0  
Poecilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae)  
(Peters 1859) Gupi 20 a 24 3,0 ± 1,0  
Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrar ­
chídae)  (Rafinesque Linnaeus 1758) Perca- 
-azul 20 a 24 5,0 ± 2,0  
Onchorhynchus mykiss (Teleostei, Salmoni ­
dae) (Walbaum 1988) Truta-arco-íris 12 a 17 6,0 ± 2,0  
Leuciscus idus (Teleostei, Cyprinidae)  (Lin­
naeus 1758) Escalo-prateado 20 a 24 6,0 ± 2,0  
Obtenção dos peixes  
Os peixes acima enumerados são fáceis de criar e amplamente disponíveis ao 
longo do ano. É fácil criá-los e mantê-los em instalações piscícolas ou em laboratórios, sob condições de controlo de doenças e de parasitas, de tal modo que os animais sejam saudáveis e de origem conhecida. Estes peixes existem em 
muitas partes do mundo.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 940
 
Apêndice 3  
Exemplo de concentração: mortalidade percentual  
Exemplo da determinação do valor CL  50 utilizando papel log-probit
  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 941
 
C.2. ENSAIO DE IMOBILIZAÇÃO AGUDA DA  DAPHNIA  SP. 
1. MÉTODO  
O presente método de ensaio de imobilização aguda é equivalente ao 
descrito na publicação OECD TG 202 (2004).  
1.1. INTRODUÇÃO  
O presente método descreve um ensaio de toxicidade aguda para 
avaliação dos efeitos das substâncias químicas nos dafnídeos. Na medida do possível, foram utilizados métodos de ensaio já existentes (1) (2) (3).
 
1.2. DEFINIÇÕES  
NO ÂMBITO DO PRESENTE MÉTODO, UTILIZAM-SE AS SE ­
GUINTES DEFINIÇÕES:  
CE 50 : estimativa da concentração necessária para imobilizar 50 % 
dos dafnídeos num dado período de exposição. Caso seja utilizada 
outra definição, a definição utilizada e a respectiva referência devem 
ser especificadas.  
Imobilização:  Os animais incapazes de nadar decorridos 15 segun ­
dos, após agitação suave do recipiente de ensaio, são considerados 
imobilizados.  
1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Dafnídeos jovens, com menos de 24 horas no início do ensaio, são 
expostos por um período de 48 horas a diferentes concentrações da substância a ensaiar. Decorridas 24 horas e 48 horas, respectivamen ­
te, a imobilização é registada e comparada com valores-testemunha. 
Os resultados são depois analisados para cálculo da CE
 50 às 48h 
(para as definições, ver ponto 1.2). A determinação da CE  50 às 
24h é facultativa.  
1.4. INFORMAÇÃO SOBRE A SUBSTÂNCIA A ENSAIAR  
A solubilidade em água e a pressão de vapor da substância a ensaiar 
deverão ser conhecidas, devendo existir um método analítico fiável para a quantificação da substância nas soluções de ensaio, relativa ­
mente ao qual estejam descritos a eficiência de recuperação e o 
limite de determinação. A fórmula estrutural, o grau de pureza, a 
estabilidade em água ou a estabilidade à luz, o P
 ow e os resultados de 
um ensaio de biodegradabilidade «fácil» da substância a ensaiar constituem informações úteis (ver método C.4).
 
Nota:  Na referência (4) são dadas orientações para o ensaio de subs ­
tâncias cujas propriedades físico-químicas dificultam o respectivo ensaio.
 
1.5. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Pode fazer-se a determinação da CE  50 duma substância de referência, 
para garantia da fiabilidade das condições de ensaio. Recomendam- -se, para este efeito, os tóxicos utilizados em ensaios interlaboratoriais (1) (5) (
 1 ). Recomenda-se repetir o ensaio das substâncias de refe ­
rência mensalmente ou, no mínimo, duas vezes por ano.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 942  
( 1 ) De acordo com estes ensaios interlaboratoriais, bem como com a rectificação técnica à 
norma ISO 6341, a CE  50 — 24 h do dicromato de potássio (K  2 Cr 2 O 7 ) está compreendida 
entre 0,6 mg/l e 1,7 mg/l.
 1.6. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
Um ensaio é considerado válido quando satisfaz os seguintes crité ­
rios: 
— nos tratamentos-testemunha, incluindo o que contém o agente 
solubilizante, a proporção de dafnídeos imobilizados não excede 10 %,
 
— a concentração de oxigénio dissolvido no final do ensaio é > 
3 mg/l, tanto nos recipientes das testemunhas como nos dos 
tratamentos.  
Nota:  Em relação ao primeiro critério, a proporção de dafnídeos- 
-testemunha imobilizados ou com outros sinais de doença ou distúr ­
bios — por exemplo, alterações da cor ou comportamentos anóma ­
los, tais como retenção à superfície da água — não deve exceder 10 %.
 
1.7. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.7.1.  Equipamento  
Os recipientes de ensaio, e restante equipamento que entre em con ­
tacto com as soluções de ensaio, devem ser exclusivamente de vidro 
ou outro material quimicamente inerte. Para o ensaio utilizar-se-ão 
normalmente tubos de ensaio ou copos, que devem ser limpos antes de cada utilização seguindo procedimentos normais de laboratório. Os recipientes de ensaio devem ser tapados mas não vedados, de 
forma a reduzir a perda de água por evaporação e evitar que entre 
poeira nas soluções. O ensaio de substâncias voláteis deve ser feito em recipientes completamente cheios e fechados, suficientemente grandes para que o teor de oxigénio não se torne limitante ou de ­
masiado baixo (ver ponto 1.6 e primeiro parágrafo do ponto 1.8.3).
 
Utilizar-se-á ainda o seguinte equipamento, na totalidade ou em 
parte: medidor de oxigénio (com microeléctrodo ou outro equipa ­
mento adequado para a medição do oxigénio dissolvido em amostras de volume reduzido); medidor de pH; aparelho adequado para o controlo da temperatura; equipamento para a determinação da con ­
centração de carbono orgânico total (COT); equipamento para a 
determinação da carência química de oxigénio (CQO); equipamento para a determinação da dureza, etc.
 
1.7.2.  Organismos experimentais  
A espécie preferida é a  Daphnia magna  Straus, embora possam 
também utilizar-se outras espécies adequadas de  Daphnia  (por exem ­
plo, Daphnia pulex ). No início do ensaio, os animais devem ter 
menos de 24 horas de vida; a fim de reduzir a variabilidade, reco ­
menda-se vivamente que não provenham da primeira postura do 
progenitor. Devem provir de uma população saudável [isto é, não evidenciar sinais de distúrbios, tais como elevada mortalidade, pre ­
sença de machos e ovos de resistência ( ephippia ), atraso na primeira 
postura, animais com alterações na cor, etc.]. Todos os organismos 
utilizados num determinado ensaio devem provir de culturas da mesma população de dafnídeos. Os animais dessa população devem ser mantidos em condições de cultura (luz, temperatura, meio) seme ­
lhantes às que irão ser utilizadas no ensaio. Se o meio de cultura a 
utilizar no ensaio for diferente do normalmente utilizado para a cultura de dafnídeos, é aconselhável prever um período de aclimata ­
ção antes do ensaio. Para o efeito, os dafnídeos devem ser mantidos 
em água de diluição à temperatura do ensaio pelo menos durante as 
48 horas anteriores ao início do ensaio.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 943
 
1.7.3.  Águas de cultura e de diluição  
Para a cultura e a diluição pode utilizar-se água natural (superficial 
ou subterrânea), água reconstituída ou água da torneira desclorada, desde que os dafnídeos sobrevivam durante todo o período de cul ­
tura, de aclimatação e de ensaio sem evidenciar sinais de distúrbios. 
Qualquer água conforme às características químicas de uma água de diluição aceitável, enunciadas no apêndice 1, é adequada para o ensaio. A qualidade de água deve ser mantida constante durante o 
decorrer do ensaio. A água reconstituída pode ser preparada juntando 
a água desionizada ou destilada quantidades determinadas de reagen ­
tes de qualidade analítica reconhecida. Nos documentos indicados 
nas referências (1) e (6) e no apêndice 2 são dados exemplos de 
água reconstituída. Saliente-se que os meios contendo quelantes co ­
nhecidos, tais como os meios M4 e M7 do apêndice 2, devem ser evitados no ensaio de substâncias que contenham metais. O pH deve 
estar compreendido no intervalo de 6 a 9. Recomenda-se uma dureza 
compreendida entre 140 e 250 mg/l (expressa em CaCO
 3 ), para a  
Daphnia magna,  ao passo que para outras espécies de  Daphnia  
podem ser também adequadas durezas menores. A água de diluição 
pode ser arejada antes da utilização no ensaio, de forma a que a 
concentração de oxigénio dissolvido atinja a saturação.  
Se for utilizada água natural, os parâmetros de qualidade devem ser 
medidos pelo menos duas vezes por ano, ou sempre que haja sus ­
peita de que as características indicadas (ver parágrafos anteriores e 
apêndice 1) possam ter variado de modo significativo. Deve também 
determinar-se o teor de metais pesados (Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni, etc.). Se for utilizada água da torneira desclorada, é aconselhável determinar diariamente o teor de cloro. Se a água de diluição provier 
de um manancial subterrâneo ou superficial, devem ser determinados 
a condutividade e o carbono orgânico total (COT) ou a carência química de oxigénio (CQO).
 
1.7.4.  Soluções de ensaio  
De um modo geral, as soluções de ensaio com as concentrações 
escolhidas são preparadas por diluição de uma solução-padrão. As 
soluções-padrão devem ser preparadas, de preferência, por dissolução da substância a ensaiar na água de diluição. Deve evitar-se, tanto quanto possível, a utilização de solventes, emulsionantes ou disper ­
santes. No entanto, tais compostos podem ser necessários, em alguns 
casos, para produzir uma solução-padrão com a concentração ade ­
quada. O documento indicado na referência (4) contém orientações quanto aos solventes, emulsionantes e dispersantes mais adequados. 
Em qualquer dos casos, o teor de substância ensaiada presente nas 
soluções de ensaio nunca deve exceder o limite de solubilidade na água de diluição.
 
O ensaio deve ser efectuado sem ajustamento do pH. Se o pH não se 
mantiver no intervalo de 6 a 9 será efectuado outro ensaio, ajustando 
o pH da solução-padrão ao da água de diluição antes da adição da 
substância a ensaiar. O ajustamento do pH deve ser efectuado de modo a não provocar alteração significativa da concentração da so ­
lução-padrão, nem causar qualquer reacção química ou precipitação 
da substância ensaiada. Devem utilizar-se, de preferência, HCl e 
NaOH.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 944
 
1.8. PROCEDIMENTO  
1.8.1.  Condições de exposição  
1.8.1.1.  Grupos tratados e grupos-testemunha  
Encher os recipientes de ensaio com volumes adequados de água de 
diluição e de soluções da substância a ensaiar. A relação ar/água, em 
volume, deve ser a mesma nos recipientes dos grupos tratados e dos grupos-testemunha. Colocar, em seguida, os dafnídeos nos recipien ­
tes de ensaio. Para cada concentração ensaiada e para os grupos- 
-testemunha devem ser utilizados pelo menos 20 animais, de prefe ­
rência divididos em quatro grupos de cinco animais. Deve haver um volume de pelo menos 2 ml de solução de ensaio por animal (ou 
seja, um volume de 10 ml para cinco dafnídeos por recipiente). O 
ensaio pode ser realizado utilizando o sistema de renovação semies ­
tático ou, quando a concentração da substância ensaiada não for estável, o sistema de escoamento.
 
A par da série de tratamentos, deve ser realizada uma série-testemu ­
nha com água de diluição e, se aplicável, uma série-testemunha com o agente de solubilização.
 
1.8.1.2.  Concentrações ensaiadas  
Pode ser realizado um ensaio prévio para determinação da gama de 
concentrações a utilizar no ensaio propriamente dito, excepto nos casos em que existam informações quanto à toxicidade da substância 
a ensaiar. Para o efeito, os dafnídeos devem ser expostos a concen ­
trações da substância a ensaiar bastante espaçadas entre si. Devem ser expostos a cada concentração ensaiada cinco dafnídeos, durante 48 horas ou menos, não sendo necessárias repetições. O período de 
exposição pode ser encurtado (por exemplo, 24 horas ou menos) se 
for possível obter em menos tempo as informações necessárias à determinação da gama de concentrações a utilizar.
 
Devem ser ensaiadas pelo menos cinco concentrações, numa pro ­
gressão geométrica cuja razão não deve, de preferência, ser superior a 2,2. Deve fornecer-se uma justificação quando se utilizem menos de cinco concentrações. De preferência, a concentração máxima de ­
veria resultar em 100 % de imobilização e a concentração mínima 
não ter efeitos observáveis.
 
1.8.1.3.  Condições de incubação  
A temperatura deve estar compreendida no intervalo de 18  o C a 
22 o C, não devendo a variação em cada ensaio exceder ± 1  o C. 
Recomenda-se um ciclo de 16 horas de luz e 8 horas de escuridão. Pode também optar-se pela escuridão completa, sobretudo se a subs ­
tância ensaiada for instável à luz.
 
Os recipientes não devem ser arejados durante o ensaio. O ensaio é 
efectuado sem ajustamento do pH. Os dafnídeos não devem ser alimentados durante o ensaio.
 
1.8.1.4.  Duração  
A duração do ensaio é de 48 horas.  
1.8.2.  Observações  
24 horas e 48 horas após o início do ensaio, os recipientes devem ser 
observados para contagem dos dafnídeos imobilizados (ver defini ­
ções no ponto 1.2). Além da imobilização, deve ser registado tam ­
bém qualquer comportamento ou aspecto anómalo.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 945
 
1.8.3.  Determinações analíticas  
O oxigénio dissolvido e o pH são determinados no início e no fim 
do ensaio, nas testemunhas e no tratamento com maior concentração de substância ensaiada. A concentração de oxigénio dissolvido nos 
recipientes dos grupos-testemunha deve estar em conformidade com 
o critério de validade (ver ponto 1.6). A variação do pH em cada ensaio não deve, normalmente, exceder 1,5 unidades. A temperatura é normalmente medida nos recipientes-testemunha ou no ar ambien ­
te, devendo, de preferência, ser registada continuamente durante o 
ensaio ou, no mínimo, no início e no fim do mesmo.
 
A concentração de substância ensaiada deve ser medida, no mínimo, 
nos tratamentos com maior e menor concentração, no início e no fim do ensaio (4). Recomenda-se que os resultados se baseiem em con ­
centrações medidas. No entanto, caso seja possível demonstrar que a 
concentração da substância a ensaiar na solução se manteve, durante 
o ensaio, no intervalo de ± 20 % do valor nominal ou do valor da concentração inicial medida, os resultados poderão basear-se em valores nominais ou nos valores iniciais medidos.
 
1.9. ENSAIO-LIMITE  
Pode ser efectuado, utilizando os procedimentos descritos no pre ­
sente método, um ensaio-limite com uma concentração de 100 mg/l da substância a ensaiar, ou até ao respectivo limite de solubilidade no meio de ensaio, se este for inferior, a fim de demonstrar que a 
CE
 50 é superior àquela concentração. O ensaio-limite deve ser efec ­
tuado com 20 dafnídeos (de preferência, divididos em quatro grupos de cinco), utilizando-se o mesmo número nos grupos-testemunha. Se 
houver alguma ocorrência de imobilização, deverá realizar-se um 
estudo completo. Qualquer comportamento anómalo deve ser regis ­
tado.
 
2. DADOS  
Os dados devem ser resumidos num quadro, indicando, para cada 
grupo de tratamento e cada grupo-testemunha, o número de dafní ­
deos usados e a imobilização em cada momento de observação. As percentagens de imobilizados registadas às 24 horas e às 48 horas são depois representadas num gráfico, em função das concentrações 
ensaiadas. Os dados são em seguida analisados por métodos estatís ­
ticos adequados (por exemplo, análise probit, etc.) para cálculo dos coeficientes angulares e da CE
 50 , com um intervalo de confiança de 
95 % (p = 0,05) (7) (8).  
Quando não sejam aplicáveis aos dados obtidos os métodos usuais 
de cálculo da CE  50 , a maior concentração que não provoque imobi ­
lização e a menor concentração que provoque 100 % de imobilização 
devem ser usadas como valores aproximados para o cálculo da CE  50 , 
que será considerada como sendo a média geométrica daquelas duas concentrações.
 
3. RELATÓRIOS  
3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deve incluir o seguinte:  
Substância ensaiada:  
— natureza física e propriedades físico-químicas relevantes,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 946
 
— dados relativos à identificação química, incluindo a pureza.  
Espécie experimental:  
— espécie de  Daphnia  utilizada e sua origem, fornecedor original 
(se for conhecido) e condições de cultura utilizadas (incluindo a origem, tipo e quantidade de alimentos e a frequência com que 
são fornecidos).
 
Condições experimentais:  
— descrição dos recipientes de ensaio: tipo de recipiente, volume de 
solução, número de dafnídeos por recipiente, número de recipien ­
tes (repetições) por concentração,  
— métodos de preparação das soluções-padrão e das soluções de 
ensaio, incluindo a utilização de solventes ou dispersantes, con ­
centrações utilizadas,  
— informações respeitantes à água de diluição: origem e parâmetros 
de qualidade (pH, dureza, razão Ca/Mg, razão Na/K, alcalinida ­
de, condutividade, etc.); composição da água reconstituída, caso tenha sido utilizada,
 
— condições de incubação: temperatura, intensidade e periodicidade 
da iluminação, oxigénio dissolvido, pH, etc.  
Resultados:  
— número e percentagem de dafnídeos imobilizados ou nos quais 
foram detectados efeitos nocivos (incluindo anomalias de com ­
portamento) nos grupos-testemunha e em cada um dos grupos 
tratados, em cada uma das observações efectuadas, bem como 
uma descrição da natureza dos efeitos observados,  
— resultados e data do ensaio da substância de referência, caso 
existam,  
— concentrações nominais ensaiadas e resultado de todas as análises 
efectuadas para determinação da concentração da substância en ­
saiada nos recipientes de ensaio; devem também ser indicados a eficiência de recuperação do método e o limite de determinação,
 
— todas as medições físico-químicas da temperatura, do pH e do 
oxigénio dissolvido efectuadas durante o ensaio,  
— o valor da CE  50 de imobilização às 48 h, com intervalos de 
confiança e gráficos do modelo ajustado utilizados no respectivo 
cálculo, os coeficientes angulares das linhas dose/resposta e res ­
pectivo desvio-padrão, os métodos estatísticos utilizados na de ­
terminação da CE  50 (os mesmos dados devem também ser indi ­
cados para a imobilização às 24 h, se tiverem sido medidos),  
— explicação dos eventuais desvios relativamente ao «Método de 
ensaio», e da medida em que afectaram os resultados do ensaio.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) ISO 6341. (1996). Water quality — Determination of the in ­
hibition of the mobility of  Daphnia magna  Straus (Cladocera, 
Crustacea) — Acute toxicity test. Third edition, 1996.  
(2) EPA OPPTS 850.1010. (1996). Ecological Effects Test Guide ­
lines — Aquatic Invertebrate Acute Toxicity Test, Freshwater 
Daphnids.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 947
 
(3) Environment Canada. (1996) Biological test method. Acute 
Lethality Test Using  Daphnia  spp. EPS 1/RM/11. Environment 
Canada, Ottawa, Ontario, Canada.  
(4) Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult 
Substances and Mixtures. OECD Environmental Health and Safety Publication. Series on Testing and Assessment. 
No. 23. Paris, 2000.
 
(5) Commission of the European Communities. Study D8369. 
(1979). Inter-laboratory Test Programme concerning the study of the ecotoxicity of a chemical substance with respect to  
Daphnia.
 
(6) OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Guideline 
211: Daphnia magna  Reproduction Test, adopted September 
1998.  
(7) Stephan C.E. (1977). Methods for calculating an LC  50 . In 
Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (edited by F.I. 
Mayer and J.L. Hamelink). ASTM STP 634 — American 
Society for Testing and Materials. Pp 65-84  
(8) Finney D.J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. 
3 rd ed. London. Griffin, Weycombe, UK.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 948
 
Apêndice 1  
ALGUMAS CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS DE UMA ÁGUA DE 
DILUIÇÃO ACEITÁVEL  
Substância Concentração  
Partículas em suspensão < 20 mg/l 
Carbono orgânico total < 2 mg/l 
Amoníaco (não ionizado) < 1 μg/l 
Cloro residual < 10 μg/l 
Total de pesticidas organofosforados < 50 ng/l Total de pesticidas organoclorados + bifenilos policlorados < 50 ng/l Cloro orgânico total < 25 ng/l
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 949
 
Apêndice 2  
EXEMPLOS DE ÁGUA RECONSTITUÍDA ADEQUADA PARA O 
ENSAIO  
Água de ensaio ISO (1)  
Soluções-padrão (uma só substância) Para preparar a água 
reconstituída, juntar a 1 litro de 
água os seguintes volumes de 
soluções-padrão (*) Substância Quantidade adicionada a 1 
litro de água (*)  
Cloreto de cálcio 
CaCl  2 2H 2 O 11,76 g 25 ml 
Sulfato de magnésio 
MgSO  4 7H 2 O 4,93 g 25 ml 
Bicarbonato de sódio 
NaHCO  3 2,59 g 25 ml 
Cloreto de potássio 
KCl 0,23 g 25 ml  
(*) Água de pureza adequada, por exemplo, desionizada, destilada ou tratada por osmose 
inversa, de preferência com condutividade não superior a 10 μS.cm  -1 . 
Meios Elendt M7 e M4  
Aclimatação aos meios Elendt M4 e M7  
Alguns laboratórios tiveram dificuldades na transferência directa de  Daphnia  para 
os meios M4 e M7. No entanto, obteve-se algum sucesso com uma aclimatação 
gradual, isto é, transferindo do meio próprio para meio Elendt a 30 %, a 60 % e, por fim, a 100 %. Os períodos de aclimatação necessários podem atingir um mês.
 
Preparação  
Oligoelementos  
Preparar separadamente soluções-padrão (I) de cada oligoelemento em água de 
pureza adequada, por exemplo, desionizada, destilada ou tratada por osmose inversa. Com estas soluções-padrão (I), preparar uma segunda solução-padrão 
única (II) contendo todos os oligoelementos (solução combinada), ou seja:
 
Solução(ões)-padrão I (uma só 
substância) Quantidade adicionada à 
água (mg/l) Concentração (em 
relação ao meio M4) Para preparar a solução-padrão combinada II, 
juntar a seguinte quantidade de soluçãopadrão I à 
água (ml/l) 
M4 M7  
H 3 BO 3 57 190 20 000 vezes 1,0 0,25 
MnCl  2 4H 2 O 7 210 20 000 vezes 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000 vezes 1,0 0,25  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 950
 
Solução(ões)-padrão I (uma só 
substância) Quantidade adicionada à 
água (mg/l) Concentração (em 
relação ao meio M4) Para preparar a solução-padrão combinada II, 
juntar a seguinte quantidade de soluçãopadrão I à 
água (ml/l) 
M4 M7  
RbCl 1 420 20 000 vezes 1,0 0,25 
SrCl  2 6H 2 O 3 040 20 000 vezes 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000 vezes 1,0 0,25 
Na 2 MoO  4 2H 2 O 1 230 20 000 vezes 1,0 0,25 
CuCl  2 2H 2 O 335 20 000 vezes 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000 vezes 1,0 1,0 
CoCl  2 6H 2 O 200 20 000 vezes 1,0 1,0 
KI 65 20 000 vezes 1,0 1,0 
Na 2 SeO  3 43,8 20 000 vezes 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000 vezes 1,0 1,0 
Na 2 EDTA 2H  2 O 5 000 2 000 vezes — — 
FeSO  4 7H 2 O 1 991 2 000 vezes — — 
As soluções Na  2 EDTA e FeSO  4 são preparadas separadamente, depois vertidas no mesmo recipiente e imediatamente 
esterilizadas em autoclave, 
obtendo-se assim: 
21 de solução Fe-EDTA 1 000 vezes 20,0 5,0  
Meios M4 e M7  
Os meios M4 e M7 são preparados a partir da solução-padrão II, dos macronu ­
trientes e das vitaminas, do seguinte modo:  
Quantidade adicionada à 
água (mg/l) Concentração (em 
relação ao meio M4) Quantidade de solução II adicionada para 
preparação do meio (ml/l) 
M4 M7  
Solução-padrão II (combi ­
nação de oligoelementos) 20 vezes 50 50 
Soluções-padrão de macro ­
nutrientes (uma só subs ­
tância) 
CaCl  2 · 2H  2 0 293 800 1 000 vezes 1,0 1,0 
MgSO  4 · 7H  2 O 246 600 2 000 vezes 0,5 0,5 
KCl 58 000 10 000 vezes 0,1 0,1 
NaHCO  3 64 800 1 000 vezes 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 · 9H  2 O 50 000 5 000 vezes 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000 vezes 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000 vezes 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000 vezes 0,1 0,1  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 951
 
Quantidade adicionada à 
água (mg/l) Concentração (em 
relação ao meio M4) Quantidade de solução II adicionada para 
preparação do meio (ml/l) 
M4 M7  
Solução-padrão de vitami ­
nas — 10 000 vezes 0,1 0,1 
A solução-padrão de vitaminas prepara-se juntando as três vitaminas a 1 litro de água conforme indicado a seguir: 
Cloridrato de tiamina 750 10 000 vezes 
Cianocobalamina (B  12 ) 10 10 000 vezes 
Biotina 7,5 10 000 vezes  
A solução-padrão de vitaminas é armazenada e congelada em pequenas alíquotas. 
As vitaminas são adicionadas ao meio imediatamente antes da utilização.  
N.B.: Para evitar a precipitação dos sais quando se prepara o meio completo, 
adicionar as alíquotas de soluções de reserva a cerca de 500-800 ml de 
água desionizada e perfazer até 1 l.  
N.B: A primeira publicação relativa ao meio M4 tem a seguinte referência: 
Elendt, B. P. (1990). Selenium deficiency in crustacea; an ultrastructual 
approach to antennal damage in  Daphnia magna  Straus. Protoplasma, 
154, 25-33.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 952
 
C.3. CIANOBACTÉRIAS E ALGAS DE ÁGUA DOCE, ENSAIO DE 
INIBIÇÃO DE CRESCIMENTO  
1. MÉTODO  
Este método é equivalente ao OECD TG 201 (Orientação de ensaio 
201 da OCDE, 2006) (1).  
1.1. INTRODUÇÃO  
Os métodos de ensaio são revistos e actualizados periodicamente à 
luz dos progressos científicos. O método de ensaio C.3 precisava de 
ser revisto a fim de incluir mais espécies e de garantir o cumpri ­
mento das exigências em matéria de avaliação de riscos e de classi ­
ficação dos produtos químicos. A revisão foi concluída com base na extensa experiência prática, nos progressos científicos no domínio 
dos estudos de toxicidade com algas e na extensa utilização no 
domínio regulamentar desde a adopção do método original.
 
1.2. DEFINIÇÔES  
Para efeitos do presente método de ensaio, foram utilizadas as se ­
guintes definições e abreviaturas:  
Biomassa : peso seco de matéria viva presente numa população, 
expresso por unidade de volume; ou seja, mg de algas/litro de so ­
lução de ensaio. Normalmente, a «biomassa» é definida como uma massa, mas no presente ensaio o termo é utilizado em relação à massa por unidade de volume. Ainda no presente ensaio, alguns 
valores alternativos de biomassa, como as contagens de células, a 
fluorescência, etc., são normalmente medidos, sendo o termo «bio ­
massa» utilizado também para essas medições alternativas.
 
Coeficiente de variação : é uma medida adimensional da variabili ­
dade de um parâmetro, definida como a relação entre o desvio-pa ­
drão e a média. Esta medida pode igualmente ser expressa em termos de percentagem. O coeficiente de variação médio da taxa de cresci ­
mento específica média em culturas de controlo replicadas deve ser 
calculado do seguinte modo:
 
1. Calcular o CV, em percentagem, da taxa média de crescimento 
específico de cada replicado a partir das taxas de crescimento diárias/em cada secção do ensaio.
 
2. Calcular o valor médio de todos os valores calculados de acordo 
com o ponto 1, a fim de obter o coeficiente de variação médio das taxas de crescimento específico diárias/em cada secção do ensaio dos replicados das culturas de controlo.
 
EC x : é a concentração da substância em estudo que, dissolvida no 
meio de ensaio, resulta numa redução de x % (p. ex.: 50 %) do crescimento do organismo de ensaio, após um determinado período de exposição (que deverá ser explicitamente mencionado nos casos 
em que se afaste da duração total ou normal do ensaio). A fim de 
indicar de forma inequívoca se o valor de EC se refere à taxa de crescimento ou ao rendimento, serão utilizados, respectivamente, os símbolos «E
 r C» e «E  y C». 
Meio de crescimento : é o meio de cultura sintético completo em 
que as algas de ensaio são cultivadas quando expostas à substância em estudo. A substância em estudo será normalmente dissolvida no meio de ensaio.
 
Taxa de crescimento (taxa média de crescimento específico) : é o 
aumento logarítmico da biomassa durante o período de exposição.  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 953
 
Menor concentração com efeito observável (LOEC) : é a concen ­
tração mais baixa à qual se observa que a substância em estudo tem 
um efeito estatisticamente significativo (para p < 0,05) de redução do crescimento, quando comparada com o controlo, para um determi ­
nado período de exposição. No entanto, todas as concentrações de 
ensaio superiores à LOEC devem ter um efeito prejudicial igual ou 
superior ao verificado com a LOEC. Quando estas duas condições não estiverem satisfeitas, deverá ser fornecida uma explicação por ­
menorizada sobre a forma como se determinou a LOEC (e, conse ­
quentemente, a NOEC).
 
Concentração sem efeitos observáveis (NOEC) : é a concentração 
de ensaio imediatamente inferior à LOEC.  
Variável de resposta : é uma variável de estimação da toxicidade, 
derivada de qualquer dos parâmetros medidos que descrevem a bio ­
massa nos diferentes métodos de cálculo. No caso do presente mé ­
todo, as taxas de crescimento e os rendimentos são variáveis de resposta derivadas da medição directa da biomassa ou de qualquer 
dos métodos alternativos mencionados.
 
Taxa de crescimento específico : é uma variável de resposta definida 
como o quociente da diferença entre os logaritmos naturais de um 
parâmetro de observação (no presente método, a biomassa) e o res ­
pectivo período.  
Rendimento : é o valor de uma variável de medição no final do 
período de exposição menos o valor da variável de medição no início do período de exposição, que exprime o aumento da biomassa du ­
rante o ensaio.
 
1.3. APLICABILIDADE DO ENSAIO  
O presente método de ensaio será de aplicação mais fácil para subs ­
tâncias hidrossolúveis que, nas condições de ensaio, permaneçam em 
solução na água. Para o ensaio de substâncias voláteis, fortemente 
adsorventes, coradas, com baixa hidrossolubilidade ou que possam afectar a disponibilidade de nutrientes ou de minerais no meio de 
ensaio, poderá ser necessário proceder a algumas alterações do pro ­
cedimento descrito (p. ex.: utilização de sistemas fechados, condi ­
cionamento dos recipientes de ensaio). Para mais orientações sobre algumas alterações adequadas, consultar as referências bibliográficas 
(2), (3) e (4).
 
1.4. PRINCÍPIO DO ENSAIO  
O objectivo do presente ensaio é determinar os efeitos de uma subs ­
tância sobre o crescimento de cianobactérias e/ou algas de água 
doce. Os organismos de ensaio em fase de crescimento exponencial 
são expostos à substância em estudo em culturas em meio líquido, normalmente durante 72 horas. Apesar da duração relativamente curta do ensaio, podem avaliar-se os efeitos ao longo de diversas 
gerações.
 
A resposta do sistema consiste na redução do crescimento numa série 
de culturas de algas (unidades de ensaio) expostas a diferentes con ­
centrações da substância em estudo. Essa resposta é avaliada em função da concentração de exposição, por comparação com o cres ­
cimento médio de culturas de controlo replicadas e não expostas à 
substância em estudo. A fim de obter uma caracterização total da 
resposta do sistema aos efeitos tóxicos (optimização da sensibilida ­
de), permite-se o crescimento exponencial não limitado das culturas, com uma quantidade suficiente de nutrientes e em condições de 
iluminação constante, durante um período suficiente para que se 
possa medir a redução da taxa de crescimento específica.
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 954
 
O crescimento, bem como a respectiva inibição, é quantificado atra ­
vés da medição da biomassa das algas ao longo do tempo. A bio ­
massa das algas é definida como o peso seco por unidade de volume, ou seja, ml de algas/litro de solução de ensaio. A determinação do peso seco é, contudo, difícil, pelo que se utilizam parâmetros alter ­
nativos. Entre esses, o mais utilizado é a contagem de células. Outros 
parâmetros alternativos incluem o volume de células, a fluorescência, a densidade óptica, etc. Deve ser conhecido um factor de conversão entre o parâmetro alternativo medido e a biomassa.
 
O ponto final do ensaio ocorre quando se dá inibição do crescimen ­
to, expresso como o aumento logarítmico da biomassa (taxa média de crescimento específico) durante o período de exposição. A partir das taxas médias de crescimento específico registadas numa série de 
soluções de ensaio, a concentração que causa uma inibição da taxa 
de crescimento de x % (p. ex.: 50 %) é determinada e expressa como E
 r C x (nesse caso, E  r C 50 ). 
Para efeitos da aplicação do presente método no âmbito do quadro 
regulamentar da UE, o cálculo dos resultados deverá basear-se numa taxa média de crescimento específico, pelos motivos abaixo expos ­
tos, no ponto 2.2. Uma variável de resposta adicional utilizada no 
presente método de ensaio é o rendimento, que pode ser necessário 
para dar cumprimento a exigências regulamentares específicas de alguns países. Essa variável é definida como a biomassa no final do período de exposição menos a biomassa no início do mesmo 
período. A partir do rendimento registado numa série de soluções 
de ensaio, a concentração que causa uma inibição do rendimento de x % (p. ex.: 50 %) é determinada e expressa como E
 y C x (nesse caso, 
E y C 50 ). 
Por outro lado, a menor concentração com efeito observável (LOEC) 
e a concentração sem efeitos observáveis (NOEC) podem ser deter ­
minadas estatisticamente.  
1.5. INFORMAÇÃO SOBRE A SUBSTÂNCIA EM ESTUDO  
A informação sobre a substância em estudo que poderá ser útil para 
estabelecer as condições do ensaio inclui a sua fórmula estrutural, pureza, estabilidade à luz, estabilidade nas condições de ensaio, pro ­
priedades de absorção da luz, pKa e os resultados dos estudos de 
transformação, incluindo a biodegradabilidade na água.
 
A hidrossolubilidade, o coeficiente de partição octanol/água (P  ow ) e a 
pressão de vapor da substância em estudo deverão ser conhecidos, devendo estar disponível um método validado para a quantificação 
da substância nas soluções de ensaio com uma eficiência de recupe ­
ração e um limite de detecção conhecidos.
 
1.6. SUBSTÂNCIA DE REFERÊNCIA  
Para verificação do procedimento de ensaio, pode(m) ser ensaiada(s) 
(uma) substância(s) de referência, como por exemplo o 3,5-dicloro ­
fenol, utilizado na prova internacional do anel (4). O dicromato de 
potássio pode também ser utilizado como substância de referência para as algas verdes. Será desejável proceder ao ensaio de uma substância de referência pelo menos duas vezes por ano.
 
1.7. VALIDADE DO ENSAIO  
Um ensaio é considerado válido quando satisfaz os seguintes crité ­
rios de desempenho:  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 955
 
— A biomassa das culturas de controlo deve ter aumentado expo ­
nencialmente num factor de pelo menos 16 durante as 72 horas 
do período de ensaio. Esse valor corresponde a uma taxa de crescimento específica de 0,92 dia
 –1 . A taxa de crescimento 
das espécies mais frequentemente utilizadas é geralmente muito 
mais elevada (ver o apêndice 1). Este critério não poderá ser 
cumprido quando se utilizarem espécies de crescimento mais lento do que as espécies que constam do apêndice 1. Nesses casos, o período de ensaio deverá ser alargado para permitir 
um factor de crescimento mínimo de 16 nas culturas de controlo, 
devendo esse crescimento ser exponencial durante todo o período de ensaio. O período de ensaio poderá ser reduzido até ao mí ­
nimo de 48 horas, de modo a manter um crescimento exponen ­
cial não limitado durante todo o período de ensaio, desde que o 
factor mínimo de multiplicação por 16 seja atingido,
 
— O coeficiente médio de variação das taxas de crescimento espe ­
cífico em cada secção do ensaio (dias 0-1, 1-2 e 2-3, no caso dos ensaios de 72 horas) nas culturas de controlo (ver no ponto 1.2 a 
definição de «coeficiente de variação») não deve exceder os 
35 %. No que respeita ao cálculo das taxas de crescimento específico em cada secção do ensaio, ver o segundo parágrafo do ponto 2.2.1. Este critério é aplicável ao valor médio dos 
coeficientes de variação calculados para os replicados das cultu ­
ras de controlo,
 
— O coeficiente de variação das taxas médias de crescimento espe ­
cífico dos replicados das culturas de ensaio, durante todo o pe ­
ríodo de ensaio, não deve exceder 7 % nos ensaios com  Pseu­
dokirchneriella subcapitata  e com  Desmodesmus subspicatus . 
Em relação a outras espécies menos utilizadas, esse valor não deve exceder os 10 %.
 
1.8. DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
1.8.1.  Equipamento  
Os recipientes de ensaio e outros equipamentos que entrem em con ­
tacto com as soluções de ensaio devem ser totalmente construídos 
em vidro ou noutro material quimicamente inerte. Todo o material 
deve ser cuidadosamente lavado, de forma a garantir que nenhum contaminante orgânico ou inorgânico possa interferir com o cresci ­
mento das algas ou com a composição das soluções de ensaio.
 
Os recipientes de ensaio serão normalmente frascos de vidro dimen ­
sionados de forma a permitir a recolha dos volumes de cultura 
necessários para as medições ao longo do ensaio e a garantir uma superfície de contacto suficiente para a permuta de CO
 2 com a 
atmosfera (ver o segundo parágrafo do ponto 1.8.9). De notar que 
o volume de líquido deve ser suficiente para as necessárias determi ­
nações analíticas (ver o quinto parágrafo do ponto 1.8.11).  
Adicionalmente, será necessário o seguinte equipamento:  
— Aparelho de cultura: recomenda-se a utilização de um armário ou 
câmara onde a temperatura de incubação escolhida possa ser mantida com uma precisão de ± 2 °C,
 
— Instrumentos de medição da luz: é importante notar que o mé ­
todo escolhido para a medição da intensidade luminosa e, em 
especial, o tipo de receptor (colector) terá influência sobre o 
valor medido. As medições deverão ser feitas, de preferência, utilizando um receptor esférico (4 π, que responda à luz directa 
e à luz reflectida a partir de todos os ângulos acima e abaixo do 
plano de medição) ou um receptor 2 π (que responda à luz 
proveniente de todos os ângulos acima do plano de medição),
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 956
 
— Aparelho para determinação da biomassa das algas: A contagem 
de células, que é o parâmetro alternativo mais frequentemente 
utilizado para a biomassa das algas, poderá ser feita utilizando um contador electrónico de partículas, um microscópio com câ ­
mara de contagem ou um citómetro de fluxo. Outros métodos 
alternativos possíveis são a medição com um citómetro de massa, 
com um fluorímetro, com um espectrofotómetro ou com um colorímetro. Será conveniente calcular um factor de conversão que relacione a contagem de células com o peso seco. A fim de 
conseguir medições úteis para as baixas concentrações de bio ­
massa, quando se utilize um espectrofotómetro poderá ser neces ­
sário utilizar células com um percurso óptico mínimo de 4 cm.
 
1.8.2.  Organismos de ensaio  
Podem ser utilizadas diversas espécies de cianobactérias e de micro ­
algas de água livre. As estirpes que constam da lista do apêndice 1 mostraram-se apropriadas para utilização no procedimento especi ­
ficado no presente método de ensaio.
 
Se forem utilizadas outras espécies, deverá ser comunicada a respec ­
tiva estirpe e/ou origem. É necessário confirmar que o crescimento 
exponencial das algas seleccionadas para o ensaio pode ser mantido 
ao longo de todo o período de ensaio, nas condições vigentes.  
1.8.3.  Meio de crescimento  
São recomendados dois meios de crescimento alternativo, o meio 
OCDE e o meio AAP. As composições desses meios são apresen ­
tadas no apêndice 2. De notar que o valor inicial de pH e a capa ­
cidade tampão (regulação do aumento do pH) dos dois meios são diferentes. Logo, os resultados dos ensaios poderão ser diferentes em 
função do meio utilizado, em especial quando estiverem em estudo 
substâncias ionizantes.
 
Poderá ser necessário modificar o meio de crescimento para deter ­
minados efeitos, como por exemplo quando se pretender proceder ao ensaio de metais ou de agentes quelantes ou quando se pretender proceder a ensaios a diferentes valores de pH. A utilização de um 
meio modificado deve ser descrita em pormenor e justificada (3)(4).
 
1.8.4.  Concentração inicial de biomassa  
A biomassa inicial das culturas de ensaio deve ser a mesma em todas 
as culturas e suficientemente baixa para permitir um crescimento 
exponencial ao longo de todo o período de incubação, sem risco 
de esgotamento dos nutrientes. A biomassa inicial não deve ser superior a 0,5 mg/l em peso seco. São recomendadas as seguintes concentrações iniciais de células:  
Pseudokirchneriella subcapitata:  5 × 10
 3 -10 4 células/ml  
Desmodesmus subspicatus  2-5 × 10  3 células/ml  
Navicula pelliculosa  10  4 células/ml  
Anabaena flos-aquae  10  4 células/ml  
Synechococcus leopoliensis  5 × 10  4 -10 5 células/ml  
1.8.5.  Concentrações da substância em estudo  
A gama de concentrações na qual é provável a ocorrência de efeitos 
pode ser determinada com base nos resultados de ensaios de deter ­
minação da gama de concentrações a utilizar. Para o ensaio final e definitivo, devem ser seleccionadas pelo menos cinco concentrações, 
organizadas numa série geométrica com um factor que não exceda os 
3,2. Para as substâncias em estudo que mostrem uma curva de res ­
posta à concentração invariável, poderá justificar-se um factor mais elevado. As séries de concentrações deverão, de preferência, abran ­
ger uma gama que cause uma inibição de 5-75 % da taxa de cres ­
cimento das algas.
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 957
 
1.8.6.  Replicados e controlos  
O ensaio deve ser conduzido com três replicados de cada concen ­
tração em estudo. Caso não seja necessário determinar o NOEC, o ensaio poderá ser alterado de modo a aumentar o número de concen ­
trações estudadas, reduzindo o número de replicados por concentra ­
ção. O controlo deve ter, no mínimo, três replicados e o ideal será utilizar para o controlo o dobro do número de replicados utilizados para cada concentração estudada.
 
Poderá ser preparado um conjunto separado de soluções de ensaio 
para as determinações analíticas das concentrações da substância em 
estudo (ver o quarto e o sexto parágrafos do ponto 1.8.11).  
Quando for utilizado um solvente para solubilização da substância 
em estudo, o ensaio deverá incluir controlos adicionais que conte ­
nham esse solvente à mesma concentração usada nas culturas de ensaio.
 
1.8.7.  Preparação da cultura de inóculo  
Para adaptar as algas às condições de ensaio e garantir que se encon ­
tram na fase de crescimento exponencial quando são utilizadas para inocular as soluções em estudo, prepara-se uma cultura de inóculo, 
em meio de ensaio, 2-4 dias antes do início do mesmo. A biomassa 
de algas deve ser ajustada de modo a permitir que o inóculo se mantenha em crescimento exponencial até ao início do ensaio. A 
cultura de inóculo deve ser incubada nas mesmas condições que as 
culturas de ensaio. O aumento da biomassa da cultura de inóculo será medido, para garantir que o seu crescimento se encontra dentro dos padrões normais para a estirpe de ensaio nas condições de cul ­
tura. Um exemplo do procedimento a utilizar para a cultura de algas 
é apresentado no apêndice 3. Para evitar uma situação de divisões celulares sincronizadas durante o ensaio, poderá ser necessário exe ­
cutar um segundo passo de propagação da cultura de inóculo.
 
1.8.8.  Preparação das soluções em estudo  
Todas as soluções em estudo devem conter a mesma concentração de 
meio de crescimento e a mesma biomassa inicial de algas de ensaio. As soluções de ensaio às concentrações escolhidas são normalmente 
preparadas misturando uma solução de reserva da substância em 
estudo com meio de crescimento e com a cultura de inóculo. As soluções de reserva são normalmente preparadas por dissolução da substância no meio de ensaio.
 
Nos casos em que se pretenda adicionar ao meio de ensaio subs ­
tâncias pouco hidrossolúveis, poderão ser utilizados solventes como 
a acetona, o álcool t-butílico ou a dimetilformamida (2)(3). A con ­
centração de solvente, que deve ser acrescentado a todas as culturas (incluindo as culturas de controlo) do ensaio à mesma concentração, 
não deve ultrapassar os 100 μl/l.
 
1.8.9.  Incubação  
Tapar os frascos de ensaio com rolhas permeáveis ao ar. Os frascos 
são agitados e colocados no aparelho de incubação. Durante o en ­
saio, é necessário manter as algas em suspensão e facilitar as trans ­
ferências de CO  2 . Para tal, deve utilizar-se uma agitação ou um 
movimento constante. As culturas devem ser mantidas a uma tem ­
peratura entre os 21 e os 24 °C, controlada com uma precisão de 
± 2 °C. Quando forem utilizadas espécies diferentes das que constam 
da lista do apêndice 1, por exemplo tropicais, poderão ser necessário utilizar temperaturas mais elevadas, desde que sejam cumpridos os critérios de validade. Recomenda-se que os frascos sejam colocados 
na incubadora de forma aleatória e que a respectiva posição seja 
mudada diariamente.
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 958
 
O pH do meio de controlo não deve aumentar mais do que 1,5 
unidades durante o ensaio. Para os metais e compostos que ionizam 
parcialmente a um pH próximo do pH do ensaio, poderá ser neces ­
sário limitar a variação do pH, a fim de obter resultados reprodutí ­
veis e bem definidos. Uma variação inferior a 0,5 unidades de pH é 
tecnicamente realizável e pode ser conseguida se se garantir uma 
taxa de transferência mássica de CO  2 da atmosfera para a solução 
de ensaio, por exemplo aumentando a agitação. Outra hipótese passa pela redução das necessidades de CO
 2 , reduzindo a biomassa inicial 
ou a duração do ensaio.  
A superfície em que as culturas são incubadas deve receber uma 
iluminação fluorescente contínua e uniforme, do tipo «branco frio» ou «luz do dia». As diferentes estirpes de algas e cianobactérias têm 
diferentes necessidades em termos de luz. A intensidade da luz deve, 
portanto, ser adaptada ao organismo de ensaio utilizado. Para as espécies recomendadas de algas verdes, a intensidade da luz ao nível da solução de ensaio será seleccionada na gama dos 60-120 
μE·m
 –2 ·s –1 , medidos na gama de comprimentos de onda necessária 
para a fotossíntese, entre 400-700 nm, utilizando um receptor ade ­
quado. Algumas espécies, em especial a  Anabaena flos-aquae , cres­
cem bem com menor intensidade de luz, podendo mesmo ser preju ­
dicadas por uma luz demasiado intensa. Para essas espécies, deve ser 
utilizada intensidade luminosa média de 40-60 μE·m  –2 ·s –1 (para os 
instrumentos de medição da luz calibrados em lux, uma gama equi ­
valente a 4 440-8 880 lux para a luz branca corresponde aproxima ­
damente à intensidade luminosa recomendada de 60-120 
μE·m  –2 ·s –1 ). A intensidade luminosa não deve variar mais de 
± 15 % em relação à intensidade média sobre a zona de incubação.  
1.8.10.  Duração do ensaio  
A duração normal dos ensaios é de 72 horas. No entanto, poderão 
ser efectuados ensaios de maior ou menor duração, desde que este ­
jam cumpridos todos os critérios de validade referidos no ponto 1.7.  
1.8.11.  Medições e determinações analíticas  
A biomassa de algas em cada frasco será determinada pelo menos 
uma vez por dia, ao longo do período de ensaio. Se as medições forem efectuadas em pequenos volumes retirados da solução de en ­
saio por meio de uma pipeta, esses volumes não devem ser repostos.
 
A medição da biomassa é efectuada por contagem manual de células 
num microscópio ou num contador electrónico de partículas (conta ­
gem de células e/ou biovolume). Podem ser utilizadas outras técnicas 
alternativas, como a citometria de fluxo, a fluorescência clorofílica  in 
vitro  ou in vivo  (6)(7) ou a densidade óptica, desde que se possa 
demonstrar uma boa correlação com a biomassa ao longo de toda a gama de concentrações de biomassa prevista durante o ensaio.
 
O pH das soluções será medido no início e no final do ensaio.  
Desde que exista um procedimento analítico para a determinação da 
substância em estudo na gama de concentrações utilizada, as solu ­
ções de ensaio deverão ser analisadas para verificação da concen ­
tração inicial e da manutenção da concentração de exposição ao 
longo do ensaio.  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 959
 
A análise da concentração da substância em estudo no início e no 
final do ensaio, para as concentrações de ensaio mais elevadas e 
mais baixas e para uma concentração próxima do EC  50 previsto, 
poderá ser suficiente quando não for esperada uma variação das concentrações de exposição superior a 20 % em relação ao respec ­
tivo valor nominal ao longo do ensaio. Nos casos em que seja 
improvável que as concentrações se mantenham no intervalo de 80-120 % da concentração nominal, recomenda-se a análise de todas as concentrações de ensaio no início e no final do mesmo. Para as 
substâncias em estudo voláteis, instáveis ou fortemente adsorventes, 
recomenda-se a realização de amostragens suplementares para análise a intervalos de 24 horas durante o período de exposição, de modo a caracterizar melhor a diminuição da concentração da substância em 
estudo. Para essas substâncias, será necessário utilizar um número 
maior de replicados. Em qualquer dos casos, a determinação das concentrações da substância em estudo só é necessária num dos frascos replicados para cada concentração de ensaio (ou no conteúdo 
misturado de todos os frascos replicados).
 
O meio de ensaio preparado especificamente para a análise das 
concentrações de exposição durante o ensaio deverá ser tratado da 
mesma forma que o utilizado no ensaio, ou seja, deve ser inoculado 
com algas e incubado em condições idênticas. Se for necessário analisar a concentração da substância em estudo dissolvida, as algas poderão ter de ser separadas do meio de crescimento. Essa separação 
deverá, de preferência, ser feita por centrifugação a baixa velocidade, 
suficiente para garantir a deposição das algas.
 
Se existirem provas de que a concentração da substância de ensaio 
não variou mais de 20 %, durante o ensaio, em relação ao valor da 
concentração nominal ou da concentração inicial medida, a análise dos resultados poderá basear-se nos valores nominais ou iniciais medidos. Se a variação em relação à concentração nominal ou à 
concentração inicial medida for superior a ± 20 %, a análise dos 
resultados deverá basear-se na média geométrica da concentração durante a exposição ou em modelos que descrevam a diminuição da concentração da substância em estudo (3)(8).
 
O ensaio de inibição de crescimento de algas representa um sistema 
de ensaio mais dinâmico do que a maior parte dos outros tipos de ensaio de toxicidade a curto prazo em meio aquático. Logo, as 
concentrações reais de exposição poderão ser difíceis de determinar, 
especialmente para as substâncias mais adsorventes e ensaiadas a concentrações mais baixas. Nesses casos, o desaparecimento da subs ­
tância da solução, por adsorção à cada vez maior biomassa de algas, 
não significa que a substância tenha desaparecido do sistema de 
ensaio. Quando os resultados do ensaio forem analisados, deve ve ­
rificar-se se a diminuição da concentração da substância em estudo ao longo do mesmo é ou não acompanhada de uma diminuição da 
inibição do crescimento. Se for esse o caso, poderá ser considerada a 
possibilidade de utilização de um modelo que descreva a diminuição da concentração da substância em estudo (8). Senão, o melhor po ­
derá ser basear a análise dos resultados nas concentrações iniciais 
(nominais ou medidas).
 
1.8.12.  Outras observações  
O inóculo deverá ser observado ao microscópio para verificar se a 
cultura apresenta um aspecto normal e saudável, tal como as culturas de ensaio, no final do mesmo, para verificar se se observa algum 
aspecto anormal das algas que possa ser causado pela exposição à 
substância em estudo.
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 960
 
1.8.13.  Ensaio limite  
Em determinadas circunstâncias, ou seja, quando um ensaio preliminar 
indicar que a substância em estudo não apresenta efeitos tóxicos em concentrações até aos 100 mg·l
 –1 ou até ao limite de solubilidade da 
substância no meio de ensaio (conforme a que seja menor), poderá 
proceder-se a um ensaio limite com comparação das respostas de um grupo de controlo e de um grupo exposto à substância em estudo (a uma concentração de 100 mg·l
 –1 ou que corresponda ao limite de 
solubilidade da substância no meio de ensaio). É fortemente recomen ­
dado que se confirme a ausência de toxicidade através da análise da concentração de exposição. Todas as condições de ensaio e critérios de 
validade anteriormente descritos são aplicáveis aos ensaios limite, com 
excepção da necessidade de utilizar, no mínimo, seis replicados dos frascos expostos à substância. As variáveis de resposta dos grupos de controlo e de exposição podem ser analisadas através de um ensaio 
estatístico de comparação das médias, como por exemplo o teste t- 
-Student. Caso as variâncias dos dois grupos sejam diferentes, deverá ser realizado um teste t-Student ajustado para diferenças das variâncias.
 
1.8.14.  Modificação para substâncias fortemente coradas  
Deve ser utilizada uma irradiação (intensidade luminosa) na parte 
superior da gama prevista pelo presente método de ensaio: 
120 μE·m  –2 ·s –1 ou mais.  
O percurso óptico deve ser encurtado, reduzindo o volume das 
soluções de ensaio (cerca de 5-25 ml).  
Deve proceder-se a uma agitação suficiente, por exemplo sacudindo 
ligeiramente, de modo a obter uma frequência elevada de exposição 
das algas a altos níveis de irradiação na superfície da cultura.  
2. DADOS  
2.1. APRESENTAÇÃO DAS CURVAS DE CRESCIMENTO  
A biomassa dos frascos de ensaio pode ser expressa nas unidades do 
parâmetro alternativo que tenha sido utilizado para as medições (p. ex.: número de células, fluorescência).
 
Criar tabelas com a concentração estimada da biomassa das culturas 
de ensaio e dos controlos, em função das concentrações do material 
em estudo e do momento da amostragem, arredondado às horas, de modo a produzir gráficos das curvas de crescimento. Numa primeira fase poderá ser útil utilizar tanto a escala geométrica como a loga ­
rítmica, mas a segunda é obrigatória e resulta geralmente numa 
melhor representação das variações do padrão de crescimento du ­
rante o período de ensaio. De notar que o crescimento exponencial, 
quando apresentado em escala logarítmica, resulta numa recta cuja 
inclinação (declive) indica a taxa de crescimento específico.
 
Utilizando os gráficos, verificar se as culturas de controlo cresceram 
exponencialmente à taxa prevista ao longo de todo o ensaio. São factores críticos a análise de todos os pontos, do aspecto global dos 
gráficos e a verificação dos dados brutos e dos procedimentos apli ­
cados, a fim de detectar eventuais erros. Verificar, em particular, qualquer dos pontos que pareça ser afectado por erros sistemáticos. Se se identificarem e/ou forem altamente prováveis erros de proce ­
dimento, o ponto em causa será identificado como um ponto aber ­
rante e não deverá ser incluído na análise estatística subsequente (uma concentração de algas igual a zero num dos dois ou três re ­
plicados pode indicar que o frasco não foi correctamente inoculado, 
ou que não estava suficientemente limpo). Os motivos para a rejei ­
ção de um ponto considerado como aberrante devem ser claramente indicados no respectivo relatório de ensaio. Os motivos aceites são exclusivamente os (raros) erros de procedimento e não a simples 
falta de precisão. Os procedimentos estatísticos para a identificação 
dos pontos aberrantes apresentam uma utilidade limitada para este tipo de problemas, não substituindo nunca a opinião abalizada de um perito. Os pontos aberrantes (assinalados como tal) deverão, de pre ­
ferência, ser conservados entre os dados apresentados posteriormente 
em qualquer gráfico ou tabela.
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 961
 
2.2. VARIÁVEIS DE RESPOSTA  
O objectivo do ensaio é determinar os efeitos da substância em 
estudo sobre o crescimento das algas. O método de ensaio descreve duas variáveis de resposta, já que os Estados-Membros têm diferen ­
tes preferências e necessidades regulamentares. Para que os resulta ­
dos dos ensaios possam ser aceitáveis em todos os Estados-Mem ­
bros, os efeitos terão de ser avaliados utilizando ambas as variáveis de resposta, a) e b), a seguir descritas.
 
a) Taxa média de crescimento específico: esta variável é calculada 
com base no aumento logarítmico diário da biomassa durante o período de ensaio.
 
b) Rendimento: a variável de resposta é a biomassa no final do 
ensaio menos a biomassa no início do mesmo.  
Para efeitos da aplicação do presente método no âmbito do quadro 
regulamentar da UE, o cálculo dos resultados deverá basear-se numa 
taxa média de crescimento específico, pelos motivos abaixo expos ­
tos. Cabe aqui notar que os valores de toxicidade calculados através destas duas variáveis de resposta não são comparáveis e que essa 
diferença tem de ser reconhecida para efeitos da utilização dos re ­
sultados do ensaio. Os valores de EC
 x baseados na taxa média de 
crescimento específico (E  r C x ) serão geralmente mais elevados do que 
os resultados baseados no rendimento (E  y C x ), se forem seguidas as 
condições de ensaio apresentadas no presente método de ensaio, 
devido à base matemática das respectivas abordagens. Esse facto não deve ser interpretado como uma diferença de sensibilidade entre as duas variáveis de resposta, mas simplesmente como uma diferença 
matemática entre os valores. O conceito de taxa média de cresci ­
mento específico baseia-se no padrão geral de crescimento exponen ­
cial das algas em culturas não sujeitas a limitações, sendo a toxici ­
dade estimada com base nos efeitos sobre a taxa de crescimento, e 
não depende do valor absoluto da taxa de crescimento específico dos 
controlos, do declive da curva de concentração-resposta ou da dura ­
ção do ensaio. Em contraste, os resultados baseados no rendimento enquanto variável de resposta são dependentes de todas essas variá ­
veis. O valor de E
 y C x é dependente da taxa de crescimento especí ­
fico da espécie de algas utilizada em cada ensaio e da taxa máxima de crescimento específico, que pode ser diferente para as diferentes espécies ou mesmo para as diferentes estirpes de algas. Esta variável 
de resposta não deve ser utilizada para comparar a sensibilidade das 
diferentes espécies ou mesmo das diferentes estirpes de algas aos produtos tóxicos. Embora seja preferível, do ponto de vista científi ­
co, utilizar a taxa média de crescimento específico para a estimação 
da toxicidade, as estimativas da toxicidade com base no rendimento 
foram também incluídas no presente método de ensaio para satisfazer as actuais exigências regulamentares de alguns países.
 
2.2.1.  Taxa média de crescimento  
A taxa média de crescimento específico para um determinado pe ­
ríodo é calculada como o aumento logarítmico da biomassa em cada um dos frascos de controlo e de ensaio, a partir da seguinte equação:
 
μ iÄj ¼ ln X j – ln X i 
t j – t i ðdia – 1 Þ 
onde:  
μ i-j : é a taxa média de crescimento específico entre o momento  i e 
o momento  j 
X i : é a biomassa no momento  i 
X j : é a biomassa no momento  j ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 962
 
Para cada um dos grupos de exposição e de controlo, calcular um 
valor médio da taxa de crescimento, associado às respectivas esti ­
mativas da variância.  
Calcular a taxa média de crescimento específico ao longo de todo o 
ensaio (normalmente nos dias 0-3), utilizando o valor nominal da biomassa inoculada como valor inicial, de preferência à utilização de 
um valor medido nesse momento, já que dessa forma se consegue 
geralmente uma precisão mais elevada. Se o equipamento utilizado para a medição da biomassa permitir uma determinação suficiente ­
mente precisa dos níveis reduzidos de biomassa presentes após a 
inoculação (p. ex.: citómetro de fluxo), poderá utilizar-se o valor 
medido de concentração inicial da biomassa. Verificar igualmente as taxas de crescimento em cada secção do ensaio, calculadas como as taxas de crescimento específico em cada dia do ensaio (dias 
0-1, 1-2 e 2-3), verificando se a taxa de crescimento dos controlos se 
mantém constante (ver os critérios de validade, ponto 1.7). Uma taxa de crescimento específico significativamente mais baixa no primeiro 
dia do que a taxa média de crescimento específico da totalidade do 
ensaio pode indicar uma fase de latência. Embora a fase de latência possa ser minimizada ou mesmo praticamente eliminada nas culturas de controlo através de uma propagação adequada da cultura de ar ­
ranque, essa fase de latência nas culturas expostas à substância em 
estudo pode indicar uma recuperação após a fase inicial de  stress  por 
toxicidade ou uma menor exposição à substância em estudo devido ao seu desaparecimento (incluindo a eventual adsorção à biomassa 
das algas) após a exposição inicial. Logo, a taxa de crescimento em 
cada secção do ensaio pode ser avaliada para verificar os efeitos da substância em estudo durante o período de exposição. A existência de diferenças substanciais entre as taxas de crescimento de cada 
secção do ensaio e a taxa média de crescimento indica um desvio 
em relação à situação de crescimento exponencial constante, exi ­
gindo portanto uma análise mais pormenorizada das curvas de cres ­
cimento.
 
Calcular a percentagem de inibição da taxa de crescimento para cada 
um dos replicados expostos, utilizando a seguinte equação:  
%I r ¼ μ C – μ T 
μ C Ü 100 
onde:  
%I r : percentagem de inibição da taxa média de crescimento espe ­
cífico  
μ C : valor médio das taxas médias de crescimento específico ( μ) no 
grupo de controlo  
μ T : taxa média de crescimento específico dos replicados do grupo 
exposto  
Quando forem utilizados solventes na preparação das soluções de 
ensaio, devem utilizar-se para o cálculo da percentagem de inibição 
os controlos com adição de solvente, em vez dos controlos apenas do 
meio de cultura.  
2.2.2.  Rendimento  
O rendimento é calculado como a biomassa no final do ensaio 
menos a biomassa inicial, em cada um dos frascos de controlo e de exposição. Para cada uma das concentrações de ensaio e de con ­
trolo, calcular um valor médio de rendimento, associado às respec ­
tivas estimativas da variância. A percentagem de inibição do rendi ­
mento (% I
 y ) pode ser calculada, para cada replicado exposto, do 
seguinte modo:  
%I y ¼ ðY C – Y  T Þ 
Y C Ü 100 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 963
 
onde:  
% I  y : percentagem de inibição do rendimento  
Y C : valor médio de rendimento no grupo de controlo  
Y T : valor de rendimento para os replicados expostos  
2.3. GRÁFICO DA CURVA DE RESPOSTA À CONCENTRAÇÃO  
Desenhar o gráfico da percentagem de inibição em função do loga ­
ritmo da concentração da substância em estudo e analisar o gráfico 
cuidadosamente, não entrando em consideração com os pontos que 
tenham sido identificados como aberrantes na primeira fase. Ajustar uma curva aproximada aos pontos experimentais, à vista ou por interpolação informática, de modo a obter uma primeira impressão 
da relação de resposta à concentração, após o que se deverá proceder 
à definição de uma curva mais exacta, de preferência utilizando métodos estatísticos computorizados. Dependendo da utilização que se pretenda dar aos dados, a qualidade (precisão) e a quantidade de 
dados, bem como a disponibilidade de ferramentas de análise dos 
mesmos, poderá decidir-se (por vezes, justificadamente) nesta fase não continuar a análise dos dados e limitar as leituras à determinação dos valores-chave EC
 50 e EC  10 (e/ou EC  20 ) a partir da curva ajustada 
à vista (ver também o ponto seguinte, em relação aos efeitos de 
estimulação). Entre as razões válidas para a não utilização de um método estatístico podem referir-se:
 
— Os dados não permitem obter, a partir de um método computo ­
rizado, resultados mais fiáveis do que os que se conseguem obter 
por opinião abalizada — nessas situações, alguns programas in ­
formáticos poderão mesmo ser incapazes de apresentar qualquer solução fiável (iterações divergentes, etc.),
 
— Os casos em que a respostas é a estimulação do crescimento não 
são bem descritos pelos programas informáticos disponíveis (ver 
abaixo).  
2.4. PROCEDIMENTOS ESTATÍSTICOS  
O objectivo é descrever de forma quantitativa, por análise de regres ­
são, a relação concentração-resposta. Pode utilizar-se uma regressão linear ponderada, antecedida de uma transformação de linearização dos dados de resposta — por exemplo para unidades  probit , logit  ou 
de Weibull (9), mas a técnica preferida é a aplicação de procedimen ­
tos de regressão não linear, que permitem lidar melhor com as ine ­
vitáveis irregularidades dos dados e com os desvios em relação a uma boa distribuição. Nas zonas próximas da inibição nula ou total, 
essas irregularidades podem mesmo ser magnificadas pela transfor ­
mação, o que irá interferir com a análise (9). Cabe aqui notar que os métodos padrão de análise que utilizam os transformados  probit , 
logit ou Weibull se destinam à análise de dados quantais (p. ex.: 
mortalidade e sobrevivência), pelo que terão de ser alterados para 
lidar com dados de crescimento ou de biomassa. Alguns métodos para a determinação dos valores de EC
 x a partir de dados contínuos 
podem ser consultados em (10), (11) e (12). A utilização da análise 
de regressão não linear é apresentada com mais pormenor no 
apêndice 4.  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 964
 
Para cada uma das variáveis de resposta em estudo, utilizar a relação 
concentração-resposta para estimar os valores de EC  x . Sempre que 
possível, devem ser determinados os limites do intervalo de con ­
fiança a 95 %. Para cada estimativa, a adequação do ajustamento da curva estimada pelo modelo de regressão aos dados de resposta 
deve ser avaliada, graficamente ou por métodos estatísticos. A aná ­
lise de regressão deve ser efectuada utilizando os valores de cada replicado e não o valor médio para cada grupo exposto. No entanto, se o ajustamento de um gráfico não linear se revelar difícil ou não 
for possível devido à grande dispersão dos dados, o problema poderá 
ser contornado pela aplicação da regressão aos valores médios de cada grupo, como forma prática de reduzir a influência dos pontos que sejam provavelmente aberrantes. A utilização desse método deve 
ser referida no relatório de ensaio como um desvio em relação ao 
procedimento normal, por não ter sido possível ajustar uma curva aos valores individuais de todos os replicados com bons resultados.
 
As estimativas do EC  50 e os respectivos intervalos de confiança 
podem também ser obtidos utilizando uma interpolação linear com  
bootstrapping  (13), quando os modelos/métodos de regressão dispo ­
níveis não forem aplicáveis aos dados existentes.  
Para a estimação do LOEC e, portanto, do NOEC, bem como dos 
efeitos da substância em estudo sobre a taxa de crescimento, será necessário analisar as médias dos frascos expostos utilizando técnicas de análise da variância (ANOVA). A média para cada concentração 
deve então ser comparada com a média observada no controlo, uti ­
lizando um método apropriado de comparação múltipla ou de análise das tendências. Os testes de Dunnett ou de Williams (14)(15)(16) ­
(17)(18) poderão ser úteis para esse efeito. É necessário verificar se 
está garantida a presunção de homogeneidade da variância das aná ­
lises ANOVA. Essa verificação poderá ser realizada graficamente ou através de um teste formal (18). Podem ser utilizados os testes de Levene ou de Bartlett. O problema do não cumprimento da presun ­
ção de homogeneidade das variâncias pode por vezes ser corrigido 
através da transformação logarítmica dos dados. Caso a heterogenei ­
dade das variâncias seja extrema e não possa ser corrigida por trans ­
formação, deverá ser considerada a possibilidade de utilização de 
métodos de análise das tendências como por exemplo o 
método degressivo de Jonkheere. Para mais orientações sobre a de ­
terminação do NOEC, consultar a referência (12).
 
Os mais recentes desenvolvimentos científicos conduziram à reco ­
mendação de que fosse abandonado o conceito de NOEC, que de ­
verá ser substituído pela estimação de valores de EC  x por regressão. 
No caso do presente ensaio com algas, não foi definido nenhum valor ideal para o x. A gama entre 10-20 % parece ser apropriada 
(dependendo da variável de resposta escolhida), devendo ser comu ­
nicados, de preferência, tanto os valores de EC
 10 como de EC  20 . 
2.5. ESTIMULAÇÃO DO CRESCIMENTO  
Por vezes, pode observa-se uma estimulação do crescimento (inibi ­
ção negativa) a baixas concentrações. Esse fenómeno pode resultar 
tanto de hormese («estimulação por tóxicos») como da adição de 
factores estimulantes do crescimento associados ao material em es ­
tudo que é adicionado ao meio de reserva. Cabe aqui notar que a adição de nutrientes inorgânicos não deverá, em princípio, ter qual ­
quer efeito directo sobre o ensaio, na medida em que o meio de 
ensaio deve, de qualquer modo, garantir uma situação de excedente de nutrientes ao longo de todo o ensaio. A estimulação a baixas concentrações pode geralmente ser ignorada para efeitos do cálculo 
de EC
 50 , a não nos casos em que é extrema. Nesses casos de esti ­
mulação extrema, ou quando o valor de x em EC  x é muito baixo, 
poderá ser necessário utilizar procedimentos especiais. A eliminação pura e simples das respostas de estimulação para efeitos da análise 
dos dados deve ser evitada sempre que possível e, nos casos em que 
os programas de ajustamento de curvas aos dados não consigam lidar com as consequências da estimulação a baixas concentrações, pode recorrer-se à interpolação linear com  bootstrapping . Se a estimulação 
seja extrema, pode considerar-se a possibilidade de utilizar um mo ­
delo de hormese (19).
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 965
 
2.6. INIBIÇÃO NÃO TÓXICA DO CRESCIMENTO  
Os materiais em estudo que absorvam a luz podem ocasionar uma 
diminuição da taxa de crescimento por efeito da redução da quanti ­
dade de luz disponível. Esse efeitos de tipo físico devem ser calcu ­
lados de forma independente dos efeitos tóxicos, se necessário alte ­
rando as condições do ensaio, e apresentados separadamente. Para mais orientação sobre esta questão, ver as referências (2) e (3).
 
3. RELATÓRIOS  
3.1. RELATÓRIO DE ENSAIO  
O relatório do ensaio deve incluir a seguinte informação:  
Substância em estudo:  
— natureza física e propriedades fisico-químicas relevantes, in ­
cluindo o limite de hidrossolubilidade,  
— dados relativos à identificação química, incluindo a pureza.  
Espécie de ensaio:  
— estirpe, fornecedor ou fonte do organismo e condições de cultura 
utilizadas.  
Condições de ensaio:  
— data de início do ensaio e respectiva duração,  
— descrição do planeamento do ensaio: recipientes de ensaio, vo ­
lume das culturas, densidade da biomassa no início do ensaio,  
— composição do meio,  
— concentrações de ensaio e replicados (p. ex.: número de replica ­
dos, número de concentrações ensaiadas e progressão geométrica utilizada),
 
— descrição da preparação das soluções de ensaio, incluindo a 
eventual utilização de solventes, etc.,  
— equipamento de incubação,  
— intensidade e qualidade da luz (fonte, homogeneidade),  
— temperatura,  
— concentrações ensaiadas: concentrações nominais do ensaio e 
resultados das análises para determinação da concentração da 
substância em estudo nos frascos de ensaio. Devem ser comuni ­
cados a eficácia de recuperação e o limite de quantificação do método na matriz de ensaio,
 
— todos os desvios em relação ao presente método de ensaio,  
— método de determinação da biomassa e provas da correlação 
entre o parâmetro medido e o peso seco.  
Resultados:  
— valores do pH no início e no final do ensaio, para todos os 
frascos expostos,  
— biomassa em cada frasco e em cada ponto de medição, bem 
como o método utilizado para a sua medição,  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 966
 
— curvas de crescimento (gráficos da biomassa em função do tem ­
po), 
— variáveis de resposta calculadas para cada replicado exposto, com 
os respectivos valores médios, e coeficiente de variação dos 
replicados,  
— representação gráfica da relação concentração/efeito,  
— estimativas da toxicidade para as variáveis de resposta, p. ex.: 
EC 50 , EC  10 , EC  20 , e os intervalos de confiança associados. 
Quando forem calculados, valores do LOEC e do NOEC e mé ­
todos estatísticos utilizados para a respectiva determinação,  
— caso tenha sido utilizada uma análise ANOVA, dimensão do 
efeito detectado (p. ex.:, diferenças menos significativas),  
— ocorrência de estimulação do crescimento que tenha sido verifi ­
cada em qualquer dos grupos expostos,  
— qualquer outro efeito observado, como por exemplo a alteração 
da morfologia das algas,  
— discussão dos resultados, incluindo qualquer influência sobre os 
resultado do ensaio que seja decorrente das alterações efectuadas 
em relação ao presente método de ensaio.  
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) OECD TG 201 (2006) Freshwater Alga and Cyanobacteria, 
Growth Inhibition Test  
(2) ISO 1998: Water quality — Guidance for algal growth inhi ­
bition tests with poorly soluble materials, volatile compounds, metals and waster water. ISO/DIS 14442
 
(3) OCDE 2000: Guidance Document on Aquatic Toxicity Tes ­
ting of Difficult Substances and mixtures. Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Asses ­
sment, n.
 o 23 
(4) ISO 1998: Water quality — Sampling — Part 16: General 
Guidance for Biotesting. ISO 5667-16  
(5) ISO 1993: Water quality — Algal growth inhibition test. 
ISO 8692  
(6) Mayer, P., Cuhel, R. and Nyholm, N. (1997). A simple in 
vitro fluorescence method for biomass measurements in algal 
growth inhibition tests. Water Research 31: 2525-2531  
(7) Slovacey, R.E. and Hanna, P.J. In vivo fluorescence determi ­
nations of phytoplancton chlorophyll, Limnology & Oceano ­
graphy 22,5 (1977), pp.919-925  
(8) Simpson, S.L., Roland, M.G.E., Stauber, J.L. and Batley, G.E. 
(2003) Effect of declining toxicant concentrations on algal 
bioassay endpoints. Environ. Toxicol. Chem 22, 2073-2079  
(9) Christensen, E.R., Nyholm, N. (1984): Ecotoxicological As ­
says with Algae: Weibull Dose-Response Curves. Env. Sci. 
Technol. 19, 713-718  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 967
 
(10) Nyholm, N. Sørensen, P.S., Kusk, K.O. and Christensen, E.R. 
(1992): Statistical treatment of data from microbial toxicity 
tests. Environ. Toxicol. Chem. 11, 157-167  
(11) Bruce, R.D., and Versteeg, D.J. (1992). A statistical procedure 
for modelling continuous toxicity data. Env. Toxicol. Chem. 11:1485-1494
 
(12) OCDE. (2004). Guidance Document on Statistical Analysis of 
Ecotoxicity Data  
(13) Norberg-King T.J. (1988) An interpolation estimate for chro ­
nic toxicity: The ICp approach. National Effluent Toxicity Assessment Center Technical Report 05-88. USEPA, Duluth, 
MN
 
(14) Dunnett, C.W. (1955) A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. Assoc. 50: 1096-1121
 
(15) Dunnett, C.W. (1964) New tables for multiple comparisons 
with a control. Biometrics 20: 482-491  
(16) Williams, D.A. (1971) A test for differences between treat ­
ment means when several dose levels are compared with a zero dose control. Biometrics 27: 103-117
 
(17) Williams, D.A. (1972) The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics 28: 510-531  
(18) Draper, N.R. and Smith, H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition. Wiley, New York  
(19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe 
dose-responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed Research, 29, 93-96
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 968
 
Apêndice 1  
Estirpes que se revelaram adequadas para o ensaio  
Algas verdes  
— Pseudokirchneriella subcapitata  (anteriormente designada por  Selenastrum 
capricornutum ), ATCC 22662, CCAP 278/4, 61.81 SAG  
— Desmodesmus subspicatus  (anteriormente designada por  Scenedesmus subs ­
picatus ) 86.81 SAG  
Diatomáceas  
— Navicula pelliculosa , UTEX 664  
Cianobactérias  
— Anabaena flos-aquae , UTEX 1444, ATCC 29413, CCAP 1403/13A  
— Synechococcus leopoliensis , UTEX 625, CCAP 1405/1  
Origem das estirpes  
As estirpes recomendadas estão disponíveis sob a forma de culturas puras nas 
seguintes colecções (por ordem alfabética):  
ATCC: American Type Culture Collection  
10801 University Boulevard  
Manassas, Virginia 20110-2209  
EUA  
CCAP, Culture Collection of Algae and Protozoa  
Institute of Freshwater Ecology,  
Windermere Laboratory  
Far Sawrey, Amblerside  
Cumbria  
LA22 0LP  
REINO UNIDO  
SAG — Sammlung von Algenkulturen  
Albrecht-von-Haller-Institut  
Universität Göttingen  
Nikloausberger Weg 18  
D-37073 Göttingen  
ALEMANHA  
UTEX Culture Collection of Algae  
Section of Molecular, Cellular and Developmental Biology  
School of Biological Sciences  
the University of Texas at Austin  
Austin, Texas 78712  
EUA ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 969
 
Aspecto e características das espécies recomendadas  
P. subcapitata D. subspicatus N. pelliculosa A. flos-aquae S. leopoliensis  
Aspecto Células 
isoladas, 
curvadas e torcidas Células ovais, 
na sua 
maioria isoladas Bastonetes Cadeias de 
células ovais Bastonetes 
Dimensões (C × L), em μm 8-14 × 2-3 7-15 × 3-12 7,1 × 3,7 4,5 × 3 6 × 1 
Volume celular ( μm
 3 /célula) 40-60 (  1 ) 60-80 (  1 ) 40-50 (  1 ) 30-40 (  1 ) 2,5 (  2 ) 
Peso seco das células (mg/célula) 2-3 × 10  –8 3-4 × 10  –8 3-4 × 10  –8 1-2 × 10  –8 2-3 × 10  –9 
Taxa de crescimento (  3 ) (dia  –1 ) 1,5-1,7 1,2-1,5 1,4 1,1-1,4 2,0-2,4  
( 1 ) Medido com um contador electrónico de partículas. 
( 2 ) Calculado a partir das dimensões medidas. 
( 3 ) Taxa de crescimento mais frequentemente observada em meio OCDE, com incubação a 21 °C com uma intensidade luminosa de 
aproximadamente 70 μE·m  –2 ·s –1 . 
Recomendações específicas quanto à cultura e ao manuseamento das 
espécies de ensaio recomendadas  
Pseudokirchneriella subcapitata  e Desmodesmus subspicatus  
Estas algas verdes são geralmente fáceis de conservar em diferentes meios de 
cultura. Toda a informação sobre os meios mais adequados está disponível junto 
das colecções de culturas. As células apresentam-se normalmente isoladas e a sua densidade pode ser facilmente medida utilizando um contador electrónico de partículas ou um microscópio.
 
Anabaena flos-aquae  
Diferentes meios de cultura podem ser utilizados para manter uma cultura de 
arranque. É particularmente importante evitar que a cultura em meio líquido vá 
para além da fase de crescimento exponencial, já que a recuperação se torna difícil para lá desse ponto.
 
A Anabaena flos-aquae  desenvolve agregados de cadeias de células. A dimensão 
desses agregados pode variar em função das condições de cultura. Para se poder proceder à contagem de células com um contador electrónico de partículas ou 
com um microscópio, com vista à determinação da biomassa, poderá ser neces ­
sário quebrar esses agregados.
 
As amostras podem ter de ser divididas em subamostras e tratadas com ultra-sons 
para quebrar as cadeias e reduzir a variabilidade das contagens. O tratamento 
com ultra-sons para quebrar as cadeias pode destruir as células se for demasiado prolongado. A intensidade e a duração do tratamento com ultra-sons devem ser idênticos para todas as amostras tratadas.
 
Contar as células num número suficiente de campos do hemocitómetro (pelo 
menos 400 células) para compensar a variabilidade. A fiabilidade das determi ­
nações através da densidade microscópica será assim maior.  
O volume total de  Anabaena  pode ser determinado com um contador electrónico 
de partículas, depois de quebrar as cadeias de células através de um tratamento 
cuidadoso com ultra-sons. A energia dos ultra-sons deve ser ajustada de forma a 
evitar provocar danos nas células.  
Utilizar um agitador magnético de rotação ou outro método semelhante que 
permita garantir que a suspensão de algas utilizada para inocular os frascos de 
ensaio esteja bem misturada e seja homogénea.  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 970
 
Os frascos de ensaio devem ser colocados num agitador orbital ou lateral, a cerca 
de 150 rotações por minuto. Em alternativa, pode utilizar-se uma agitação in ­
termitente para reduzir a tendência para a criação de agregados da  Anabaena . Se 
houver agregação, deve ter-se o cuidado de retirar amostras representativas para as medições de biomassa. Poderá ser necessário agitar vigorosamente os frascos 
imediatamente antes da mostra, de modo a desfazer os agregados de algas.
 
Synechococcus leopoliensis  
Diferentes meios de cultura podem ser utilizados para manter uma cultura de 
arranque. Toda a informação sobre os meios mais adequados está disponível 
junto das colecções de culturas.  
A Synechococcus leopoliensis  apresenta células isoladas, em forma de bastonete. 
As células são muito pequenas, o que complica a utilização das contagens ao microscópio para a medição da biomassa. Poderá utilizar-se um contador elec ­
trónico de partículas equipado para a contagem de partículas com uma dimensão 
mínima aproximada de 1 μm. Outra possibilidade é medições fluorimétricas  in 
vitro .
 
Navicula pelliculosa  
Podem ser utilizados diferentes meios de cultura para manter uma cultura de 
arranque. Toda a informação sobre os meios mais adequados está disponível 
junto das colecções de culturas. De notar que o meio terá de conter silicatos.  
A Navicula pelliculosa  pode, em certas condições de cultura, formar agregados. 
Uma vez que produzem lípidos, as células têm por vezes tendência a acumula ­
rem-se na película superficial. Nessas circunstâncias, terão de se adoptar medidas 
especiais, aquando da recolha das subamostras para determinação da biomassa, de modo a obter amostras representativas. Poderá ser necessária uma agitação vigorosa, por exemplo com um agitador magnético de rotação.
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 971
 
Apêndice 2  
Meio de cultura  
Pode utilizar-se um dos dois meios de cultura seguintes:  
Meio OCDE: meio original do método OECD TG 201, norma ISO 8692;  
Meio US EPA AAP, norma ASTM.  
Para a preparação destes meios, deve utilizar-se reagentes e produtos químicos de 
qualidade analítica e água desionizada.  
Composição do meio AAP (US. EPA) e do meio OECD TG 201  
Composto EPA OCDE 
mg/l mM mg/l mM  
NaHCO  3 15,0 0,179 50,0 0,595 
NaNO  3 25,5 0,300 
NH  4 Cl 15,0 0,280 
MgCl  2 ·6(H  2 O) 12,16 0,0598 12,0 0,0590 
CaCl  2 ·2(H  2 O) 4,41 0,0300 18,0 0,122 
MgSO  4 ·7(H  2 O) 14,6 0,0592 15,0 0,0609 
K 2 HPO  4 1,044 0,00599 
KH  2 PO 4 1,60 0,00919 
FeCl  3 ·6(H  2 O) 0,160 0,000591 0,0640 0,000237 
Na 2 EDTA·2(H  2 O) 0,300 0,000806 0,100 0,000269 (*) 
H 3 BO 3 0,186 0,00300 0,185 0,00299 
MnCl  2 ·4(H  2 O) 0,415 0,00201 0,415 0,00210 
ZnCl  2 0,00327 0,000024 0,00300 0,0000220 
CoCl  2 ·6(H  2 O) 0,00143 0,000006 0,00150 0,00000630 
Na 2 MoO  4 ·2(H  2 O) 0,00726 0,000030 0,00700 0,0000289 
CuCl  2 .2(H  2 O) 0,000012 0,00000007 0,00001 0,00000006 
pH 7,5 8,1  
(*) A relação molar do EDTA para o ferro é ligeiramente superior a 1, o que permite evitar a precipitação do 
ferro e, simultaneamente, minimizar a quelação dos iões de metais pesados.  
Nos ensaios com a diatomácea  Navicula pelliculosa , ambos os meios devem ser 
complementados com Na  2 SiO  3 ·9H  2 0, na quantidade necessária para obter uma 
concentração final de 1,4 mg Si/l.  
O pH do meio é função do equilíbrio entre o sistema carbonato do meio e a 
pressão parcial de CO  2 no ar atmosférico. A relação aproximada entre o pH a 
25 °C e a concentração molar de bicarbonato é dada por:  
pH eq = 11,30 + log [HCO  3 ] ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 972
 
Com 15 mg/l de NaHCO  3 , pH  eq = 7,5 (meio U.S. EPA) e com 50 mg/l NaHCO  3 , 
pH eq = 8,1 (meio OCDE).  
Composição elementar dos meios de ensaio  
Elemento EPA OCDE 
mg/l mg/l  
C 2,144 7,148 
N 4,202 3,927 
P 0,186 0,285 
K 0,469 0,459 
Na 11,044 13,704 
Ca 1,202 4,905 
Mg 2,909 2,913 
Fe 0,033 0,017 
Mn 0,115 0,115  
Preparação do meio OCDE  
Nutriente Concentração na solução de reserva 
Solução de reserva 1: macronutrientes  
NH  4 Cl 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 ·2H  2 O 
MgSO  4 ·7H  2 O 
KH  2 PO 4 1,5 g·l  –1 
1,2 g·l  –1 
1,8 g·l  –1 
1,5 g·l  –1 
0,16 g·l  –1 
Solução de reserva 2: ferro  
FeCl  3 ·6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 64 mg·l-  –1 
100 mg·l-  –1 
Solução de reserva 3: oligoelementos  
H 3 BO 3 
MnCl  2 ·4H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 
Na 2 MoO  4 ·2H  2 O 185 mg·l  –1 
415 mg·l  –1 
3 mg·l  –1 
1,5 mg·l  –1 
0,01 mg·l  –1 
7 mg·l  –1 
Solução de reserva 4: bicarbonato  
NaHCO  3 50 g·l  –1 
Na 2 SiO  3 ·9H  2 0 
Esterilizar as soluções de reserva por filtração através de membrana (diâmetro de 
poro de 0,2 μm) ou em autoclave (120 °C, 15 min). Armazenar as soluções ao 
abrigo da luz, a 4 °C.  
Não esterilizar as soluções 2 e 4 em autoclave, mas sim por filtração através de 
membrana.  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 973
 
Preparar o meio de cultura adicionando um volume apropriado das soluções de 
reserva 1-4 à água.  
Adicionar a 500 ml de água esterilizada:  
— 10 ml da solução de reserva 1  
— 1 ml da solução de reserva 2  
— 1 ml da solução de reserva 3  
— 1 ml da solução de reserva 4  
Completar o volume até 1 000 ml, com água esterilizada.  
Permitir que decorra um tempo suficiente para que o meio atinja o equilíbrio com 
o CO  2 atmosférico, se necessário borbulhando com ar estéril filtrado durante 
algumas horas.  
Preparação do meio AAP  
A1.1. Adicionar 1 ml de cada uma das soluções de reserva descritas em 
A1.2.1-A1.2.7 a cerca de 900 ml de água desionizada ou destilada, 
corrigindo depois o volume até 1 l.  
A1.2. As soluções de reserva de macronutrientes são preparadas dissolvendo 
os seguintes elementos em 500 ml de água desionizada ou destilada. Os reagentes A1.2.1, A1.2.2, A1.2.3 e A1.2.4 podem ser combinados 
numa única solução de reserva.
 
A1.2.1.  NaNO  3 – 12,750 g.  
A1.2.2.  MgCl  2 · 6H 2 O – 6,082 g.  
A1.2.3.  CaCl  2 · 2H 2 O – 2,205 g.  
A1.2.4.  Solução de reserva Micronutrientes  (ver o ponto A1.3).  
A1.2.5.  MgSO  4 ·7H  2 O – 7,350 g.  
A1.2.6.  K  2 HPO  4 – 0,522 g.  
A1.2.7.  NaHCO  3 – 7,500 g.  
A1.2.8.  Na  2 SiO  3 ·9H  2 O — Ver o ponto A1.1.  
Nota A1.1 — Utilizar exclusivamente quando a espécie de ensaio for 
uma diatomácea. O composto pode ser acrescentado directamente 
(202,4 mg) ou utilizando uma solução de reserva que permita obter uma concentração final de Si de 20 mg/l no meio
 
A1.3. As soluções de reserva de micronutrientes são preparadas dissolvendo 
os seguintes elementos em 500 ml de água desionizada ou destilada.  
A1.3.1.  H  3 BO 3 – 92,760 mg.  
A1.3.2.  MnCl  2 ·4H  2 O – 207,690 mg.  
A1.3.3.  ZnCl  2 – 1,635 mg.  
A1.3.4.  FeCl  3 ·6H  2 O – 79,880 mg.  
A1.3.5.  CoCl  2 ·6H  2 O – 0,714 mg.  
A1.3.6.  Na  2 MoO  4 ·2H  2 O – 3,630 mg.  
A1.3.7.  CuCl  2 ·2H  2 O – 0,006 mg.  
A1.3.8.  Na  2 EDTA·2H  2 O – 150,000 mg.  
[(Etilenodinitrilo)tetraacetato de dissódio].  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 974
 
A1.3.9.  Na  2 SeO  4 ·5H  2 O – 0,005 mg — Ver o ponto A1.2.  
Nota A1.2 — Utilizar exclusivamente no meio para as culturas de 
arranque de espécies de diatomáceas.  
A1.4. Ajustar o pH a 7,5 ± 0,1 com HCl ou NaOH 0,1  N ou 1,0  N. 
A1.5. Filtrar os meios para um recipiente esterilizado através de um filtro de 
membrana com um diâmetro de poro de 0,22 μm, se se pretender 
utilizar um contador electrónico de partículas, ou de 0,45 μm, se não 
for esse o caso.  
A1.6. Armazenar o meio ao abrigo da luz, a 4 °C, até ao momento da 
utilização.  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 975
 
Apêndice 3  
Exemplo de um procedimento para a cultura de algas  
Observações gerais  
O objectivo da cultura de acordo com o procedimento a seguir descrito é a 
preparação de culturas de algas para a realização de ensaios de toxicidade.  
Devem ser utilizados métodos que permitam garantir que as culturas de algas não 
sejam infectadas por bactérias. Mesmo que se pretendam utilizar culturas puras, 
devem preparar-se e ser conservadas culturas de cada uma das diferentes espécies de algas.
 
Todas as operações devem ser realizadas em condições de esterilidade, de modo 
a evitar a contaminação por bactérias ou por outras algas.  
Equipamento e material  
Ver o ponto «Método de Ensaio»: Equipamento.  
Procedimentos para a obtenção de culturas de algas  
Preparação das soluções nutrientes (meios):  
Todos os sais nutrientes do meio são preparados como soluções de reserva 
concentradas e armazenados ao abrigo da luz e ao frio. As soluções são esteri ­
lizadas por filtração ou em autoclave.  
Os meios são preparados misturando a quantidade correcta de solução de reserva 
com água destilada esterilizada, tomando o cuidado de evitar infecções. Para os 
meios sólidos, é acrescentado àgar-àgar à concentração de 0,8 %.  
Culturas de arranque:  
As culturas de arranque são culturas de algas com pequeno volume que são 
regularmente transferidas para meio fresco, de modo a que possam ser utilizadas 
como inóculo para os ensaios. Se as culturas não forem regularmente utilizadas, devem ser conservadas por inoculação em tubos com meio de ágar-ágar inclina ­
do. As culturas serão transferidas para meio fresco pelo menos uma vez de dois 
em dois meses.
 
As culturas de arranque são feitas em frascos cónicos (com um volume de cerca 
de 100 ml), com o meio apropriado. Quando as algas forem incubadas a 20 °C com iluminação contínua, será necessário transferi-las a cada semana.
 
Durante a transferência, uma determinada quantidade da cultura «antiga» é trans ­
ferida com uma pipeta esterilizada para um frasco com meio fresco, de modo a 
obter, para as espécies de crescimento rápido, uma concentração inicial cerca de 100 vezes inferior à que existia na cultura original.
 
A taxa de crescimento de uma espécie pode ser determinada a partir da sua curva 
de crescimento. A partir do momento em que seja conhecida, é possível estimar a 
densidade a que a cultura deve ser transferida para o meio fresco. A transferência 
deve ser feita antes de a cultura atingir a fase de morte celular.  
Pré-cultura:  
O objectivo da pré-cultura é obter uma quantidade de algas adequada para a 
inoculação das culturas de ensaio. A pré-cultura será incubada em condições de 
ensaio e utilizada enquanto se encontra na fase exponencial, normalmente após um período de incubação de 2 a 4 dias. Quando as culturas de algas apresentarem células deformadas ou anormais, devem ser descartadas.
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 976
 
Apêndice 4  
Análise dos dados por regressão não linear  
Considerações de carácter geral  
A resposta dos ensaios com algas e de outros ensaios de crescimento microbiano 
— o aumento da biomassa é, por natureza, uma variável contínua ou métrica — 
terá a forma de uma taxa quando se utilizar a taxa de crescimento ou de um 
integral em função do tempo se se escolher utilizar a quantidade de biomassa. Ambas as variáveis serão referenciadas em função da resposta média dos repli ­
cados de controlo, não expostos, que apresentem uma resposta mais elevada às 
condições vigentes — sendo que a temperatura e a luz são os principais factores 
determinantes nos ensaios com algas. O sistema é distribuído ou homogéneo, e a biomassa pode ser vista como um valor contínuo, sem tomar em consideração as células individuais. A distribuição das variâncias do tipo de resposta está, nesses 
sistemas, exclusivamente relacionada com os factores experimentais (tipicamente 
descritos pela curva log-normal ou pela distribuição normal dos erros). Esta situação contrasta com as respostas típicas dos bioensaios com dados quantais, nos quais a tolerância (tipicamente distribuída de forma binomial) de cada orga ­
nismo é frequentemente assumida como a componente dominante da variância. 
As respostas dos controlos são, nesse caso, nulas ou correspondentes à linha de base.
 
Numa situação sem complicações, a resposta normalizada ou relativa, r, diminui 
de forma monotónica entre 1 (inibição nula) e 0 (inibição a 100 %). De notar que todas as respostas têm um erro associado, pelo que se poderão constatar inibições 
negativas apenas por efeito dos erros aleatórios.
 
Análise de regressão  
Modelos  
O objectivo da análise de regressão é a descrição quantitativa da curva de 
concentração-resposta, sob a forma de uma função matemática de regressão Y = f (C) ou, mais frequentemente, F (Z), onde Z = log C. A utilização da 
função inversa C = f
 –1 (Y) permite o cálculo dos valores de EC  x , incluindo EC  50 , 
EC 10 e EC  20 , bem como dos respectivos limites de confiança a 95 %. Diversas 
funções matemáticas simples podem ser utilizadas para uma boa descrição da relação concentração-resposta obtida em ensaios de inibição de crescimento com 
algas. Essas funções incluem, por exemplo, a equação logística, a equação assi ­
métrica de Weibull e a função de distribuição log normal, todas curvas sigmóides que se aproximam da assímptota 1 quando C → 0 e da assímptota 0 quando 
C → infinito.
 
A utilização de modelos com uma função de limite contínuo (p. ex.: o modelo 
Kooijman «para a inibição do crescimento da população», Kooijman et al. 1996) 
foi recentemente proposta como alternativa aos modelos assimptóticos. Esse 
modelo assume que não há qualquer efeito às concentrações que se encontram abaixo de um determinado limite, EC0+, estimado por extrapolação, a partir da relação concentração-resposta, do ponto de intercepção do eixo das concentra ­
ções, aplicando uma função contínua simples que não é diferenciada no ponto 
inicial.
 
De notar que a análise em causa poderá ser uma simples minimização da soma 
dos mínimos quadrados (assumindo uma variância constante) ou dos quadrados 
ponderados, quando for necessário compensar para uma variância heterogénea.  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 977
 
Procedimento  
O procedimento pode ser esquematizado do seguinte modo: seleccionar uma 
equação Y = f (C) apropriada e ajustá-la aos dados por regressão não linear. Usar, de preferência, as medições de cada frasco, em vez do valor médio dos replicados, de modo a extrair tanta informação quanto possível dos dados dis ­
poníveis. Por outro lado, se a variância for elevada, a experiência prática sugere 
que os valores médios dos replicados podem resultar numa estimativa matema ­
ticamente mais robusta e menos influenciada por erros sistemáticos que possam afectar dados do que acontece quando se utilizam os valores medidos em cada 
frasco.
 
Desenhar a curva ajustada e marcar os pontos medidos, verificando se há um 
bom ajustamento. A análise dos mínimos quadrados pode ser um instrumento particularmente útil para esse fim. Se a função escolhida para o ajustamento da 
curva de concentração-resposta não descrever a totalidade da curva ou de alguma 
das suas partes essenciais, como por exemplo a resposta a baixas concentrações, seleccionar outra opção de ajustamento da curva — p. ex.: uma curva não simétrica, como a equação de Weibull, em vez de uma curva simétrica. A 
inibição negativa pode, por exemplo no caso da função de distribuição log- 
-normal, constituir um problema que também poderá tornar necessária a utilização de uma função de regressão alternativa. Não se recomenda a atribuição de um valor zero ou de um valor positivo baixo a esses valores negativos, já que esse 
procedimento iria distorcer a distribuição dos erros. Poderá ser indicado proceder 
a diferentes ajustamentos para cada parte da curva, por exemplo na parte da baixa inibição, para estimativa dos valores de EC
 x baixo  . Calcular, a partir da equação 
ajustada (por «estimativa inversa», C = f  –1 (Y)) as estimativas de alguns pontos 
EC x característicos, comunicando, no mínimo, o valor de EC  50 e o valor esti ­
mado de um ou de dois EC  x baixo  . A experiência com ensaios práticos demonstra 
que a precisão dos ensaios com algas permite normalmente uma estimativa razoavelmente correcta do nível de 10 % de inibição, se se dispuser de um 
número suficiente de pontos medidos — a não ser nos casos em que haja 
estimulação a baixas concentrações, que poderá ser factor de confusão. A preci ­
são das estimativas de EC
 20 é muitas vezes consideravelmente maior do que para 
o EC  10 , porque o ponto EC  20 se encontra normalmente na parte central, quase 
linear, da curva de concentração-resposta. Por vezes, o valor de EC  10 pode ser 
difícil de estimar, devido à estimulação do crescimento a baixas concentrações. Assim, embora o EC
 10 possa normalmente ser obtido com uma precisão sufi ­
ciente, recomenda-se que seja sempre comunicado também o EC  20 . 
Factores de ponderação  
Normalmente, a variância experimental não é constante e, na maior parte dos 
casos, inclui uma componente proporcional, pelo que há vantagem em realizar, 
por rotina, uma regressão ponderada. Geralmente, assume-se que os factores de ponderação utilizados nesse tipo de análise são inversamente proporcionais da variância:
 
W i = 1/Var(r  i ) 
Diversos programas de regressão permitem a opção de uma análise de regressão 
ponderada com factores de conversão que são apresentados sob a forma de listas. O mais conveniente será normalizar os factores de ponderação, isto é, multiplicá- 
-los por n/ Σ w
 i (em que n é o número de pontos experimentais) de modo a que a 
respectiva soma seja igual a 1.  
Respostas de normalização  
A normalização em função da resposta média dos controlos suscita problemas de 
princípio e tem como resultado uma estrutura de variâncias que é bastante com ­
plicada. Ao dividir as respostas pelo valor médio da resposta dos controlos, para obtenção da percentagem de inibição, é introduzido um erro adicional, causado 
pelo erro que afecta a média dos controlos. A não ser nos casos em que esse erro 
é negligenciável, os factores de ponderação da regressão e dos limites de con ­
fiança terão de ser corrigidos em relação à co-variância com o controlo (17). Cabe aqui notar que é importante obter estimativas de alta precisão do valor 
médio da resposta dos controlos, de modo a minimizar a variância global para a 
resposta relativa. Essa variância pode ser descrita do seguinte modo:
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 978
 
(o i em índice faz referência ao nível de concentração i, enquanto que o 0 em 
índice se refere aos controlos)  
Y i = Resposta relativa = r  i /r 0 = 1 — I = f (C  i ) 
com uma variância de:  
Var (Y  i ) = Var (r  i /r 0 ) e¼ (∂Y i / ∂ r i ) 2 · Var(r  i ) + (∂ Y i / ∂ r 0 ) 2 ·Var (r  0 ) 
e, tendo em conta que:  
(∂ Y i / ∂ r i ) = 1/r  0 e (∂ Y i / ∂ r 0 ) = r  i /r 0 2 
com uma distribuição normal e replicados m  i e m  0 : 
Var(r  i ) = σ 2 /m i 
a variância total da resposta relativa, Y  i , passa portanto a ser:  
Var(Y  i ) = σ 2 /(r 0 2 m i ) + r  i 2 · σ 2 /r 0 4 m 0 
O erro da média dos controlos é inversamente proporcional à raiz quadrada do 
número de replicados do controlo utilizados para o cálculo dessa média, podendo por vezes justificar-se a inclusão de dados históricos para reduzir fortemente o erro. Outro procedimento alternativo será não normalizar os dados e fazer o 
ajustamento das respostas absolutas, incluindo os dados de resposta dos contro ­
los, mas introduzindo como parâmetro adicional a ajustar por regressão não linear o valor de resposta dos controlos. No caso das equações de regressão habitual ­
mente utilizadas, com 2 parâmetros, este método exige o ajustamento de 3 
parâmetros, pelo que necessita de mais pontos do que a regressão não linear 
de dados que tenham sido normalizados utilizando uma resposta do controlo pré- -definida.
 
Intervalos de confiança inversos  
O cálculo de intervalos de confiança da regressão não linear por estimativa 
inversa é bastante complexo e não é normalmente uma opção disponível nos pacotes estatísticos informáticos mais comuns. É possível obter uma aproximação dos limites de confiança utilizando programas normais de regressão não linear 
com reparametrização (Bruce and Versteeg, 1992), o que implica voltar a escre ­
ver a equação matemática com os pontos que se pretende estimar, ou seja, EC
 10 e 
EC 50 , como os parâmetros a determinar. (Partindo da função I = f ( α, β, concen­
tração), utilizar as relações de definição f ( α, β, EC  10 ) = 0,1 e f ( α, β, EC  50 ) = 0,5 
para substituir f ( α, β, concentração) por uma função equivalente g (EC  10 , EC  50 , 
concentração).  
Um cálculo mais directo (Andersen et al, 1998) poderá ser efectuado mantendo a 
equação original e utilizando uma expansão de Taylor em redor dos valores 
médios de r  i e de r  0 . 
Recentemente, os métodos de « boot strapping » têm vindo a ganhar popularidade. 
Esses métodos utilizam os dados medidos e uma reamostragem frequente, deter ­
minada por um gerador de números aleatórios, para estimar uma distribuição empírica da variância.
 
Bibliografia  
Kooijman, S.A.L.M.; Hanstveit, A.O.; Nyholm, N. (1996): No-effect concentra ­
tions in algal growth inhibition tests. Water Research, 30, 1625-1632  
Bruce, R.D. and Versteeg, D.J.(1992) A Statistical Procedure for Modelling 
Continuous Ecotoxicity Data. Env. Toxicol. Chem.11, 1485-1494  
Andersen, J.S., Holst, H., Spliid, H., Andersen, H., Baun, A. & Nyholm, N. 
(1998): Continuous ecotoxicological data evaluated relative to a control response. Journal of Agricultural, Biological and Environmental Statistics, 3, 405-420
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 979
 
C.4. DETERMINAÇÃO DA BIODEGRADABIL1DADE «FÁCIL»  
PARTE I.  CONSIDERAÇÕES GERAIS  
I.1. INTRODUÇÃO  
Descrevem-se seis métodos de ensaio que permitem fazer o despiste 
da biodegradabilidade fácil de substâncias químicas, num meio 
aquoso aeróbio:  
a) Redução gradual do Carbono Orgânico Dissolvido (COD) (mé ­
todo C.4-A);  
b) Método de despiste da OCDE modificado — redução gradual do 
COD (método C.4-B);  
c) Libertação de dióxido de carbono (CO  2 ) (teste de Sturm modifi ­
cado) (método C.4-C);  
d) Respirometria manométrica (método C.4-D);  
e) Frasco fechado (método C.4-E);  
f) MITI (Ministério do Comércio Internacional e da Indústria — 
Japão) (método C.4-F).  
As considerações gerais e também as considerações comuns aos seis 
testes figuram na parte I do método. Os aspectos específicos de cada método são descritos nas partes II a VII. Os apêndices contêm de ­
finições, fórmulas e anotações informativas.
 
Um exercício comparativo interlaboratorial organizado pela OCDE, 
efectuado em 1988, demonstrou que os métodos permitem obter 
resultados consistentes. Todavia, consoante as características físicas 
da substância que se pretende testar, assim se dará preferência a um ou outro método.
 
I.2. SELECÇÃO DO MÉTODO APROPRIADO  
No sentido de se seleccionar o método mais adequado, é essencial 
dispor de informações sobre a solubilidade, a pressão de vapor e as características de adsorção das substâncias químicas. A estrutura 
química ou a fórmula química devem ser conhecidas para o cálculo 
dos valores teóricos e/ou confirmação dos valores medidos dos pa ­
râmetros característicos, por exemplo, CTeO, CO
 2 Te, COD, COT, 
CQO (ver apêndices 1 e 2).  
As substâncias químicas de ensaio que forem solúveis em água na 
proporção de pelo menos 100 mg/l podem ser avaliadas por todos os 
métodos, desde que não sejam voláteis e não sejam adsorventes. Para 
as substâncias químicas que forem pouco solúveis em água, voláteis ou adsorventes, os métodos adequados são indicados no quadro 1. No apêndice 3 é descrito o modo de proceder com as substâncias 
químicas pouco solúveis em água e com as substâncias químicas 
voláteis. As substâncias químicas moderadamente voláteis podem ser testadas pelo método de redução gradual do COD, se existir espaço livre suficiente para o gás nos recipientes de ensaio (os quais 
devem estar adequadamente tapados). Neste caso deve ser efectuado 
um controlo abiótico que permita detectar eventuais perdas físicas.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 980
 
Quadro I  
aplicabilidade dos métodos de ensaio  
Teste Método analítico Adequado para substâncias que são: 
pouco solúveis voláteis adsorvíveis  
Redução gradual do COD Carbono orgânico dissol ­
vido — — +/- 
Redução gradual do COD/ 
/método OCDE Carbono orgânico dissol ­
vido — — +/- 
Libertação de CO  2 Respirometria: libertação de 
CO 2 + — + 
Respirometria manométrica Respirometria manométrica: 
consumo de oxigénio + +/- + 
Frasco fechado Respirometria: oxigénio 
dissolvido +/- + + 
MITI Respirometria: consumo de 
oxigénio + +/- +  
É necessário dispor de informações sobre a pureza ou sobre as 
proporções relativas dos componentes principais do material de en ­
saio para interpretar os resultados obtidos, especialmente quando os 
resultados são baixos ou marginais.  
O facto de se dispor de informações sobre a toxicidade da substância 
química de teste em relação às bactérias (apêndice 4) pode ser muito útil 
para seleccionar concentrações de ensaio adequadas e pode ser essencial para a interpretação correcta de valores baixos de biodegradação.
 
I.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Para se controlar o processo testam-se substâncias químicas de refe ­
rência que satisfaçam os critérios de biodegradabilidade fácil, reali ­
zando uma experiência num frasco adequado, em paralelo com os 
procedimentos normais.  
As substâncias químicas adequadas são a anilina (recentemente destila ­
da), o acetato de sódio e o benzoato de sódio. Todas estas substâncias químicas de referência degradam-se ao serem submetidas a estes méto ­
dos, mesmo quando nenhum in όculo é deliberadamente adicionado.
 
Foi sugerida a utilização de uma substância química de referência 
que fosse facilmente biodegradável, mas que necessitasse da adição 
de um in όculo. Foi sugerida a utilização de hidrogenoftalato de 
potássio mas é necessário obter mais provas de eficácia com esta substância, antes que possa ser aceite como substância de referência.
 
Nos ensaios respirométricos, os compostos que contêm azoto podem 
afectar o consumo de oxigénio devido à nitrificação (ver apêndices 2 
e 5).  
I.4. PRINCÍPIO DOS MÉTODOS DE ENSAIO  
Faz-se a inoculação de uma solução ou suspensão da substância de 
ensaio num meio mineral e, depois, procede-se à incubação sob 
condições aeróbias, ao abrigo da luz ou sob luz difusa. A quantidade de COD na solução de ensaio originada pelo in όculo deverá ser 
mantida o mais baixo possível relativamente à quantidade de COD 
originada pela substância de ensaio. Tem-se em conta a actividade 
endógena do in όculo efectuando ensaios paralelos em branco, com 
inόculo, mas sem a substância de ensaio, embora a actividade endó ­
gena das células na presença da substância não seja exactamente a 
mesma que no controlo endógeno. Efectua-se um ensaio em paralelo 
com a substância de referência, para verificação do processo.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 981
 
Em geral, acompanha-se a degradação determinando parâmetros ca ­
racterísticos, tais como o COD, a produção de CO  2 e o consumo de 
oxigénio, efectuando-se medições com suficiente frequência, de modo a identificar o início e o fim da biodegradação. Com os respirómetros automáticos as medições são contínuas. O COD é 
por vezes medido em conjunto com outro parâmetro mas normal ­
mente isso só sucede no início e no fim do ensaio. Também se pode recorrer a análises químicas específicas para avaliar a degradação primária da substância de ensaio e para se determinar a concentração 
de quaisquer substâncias intermédias formadas (obrigatório no teste 
de MITI).
 
Normalmente, o ensaio prolonga-se por 28 dias. Todavia, os ensaios 
podem ser terminados antes de decorridos 28 dias, isto é, logo que a curva de biodegradação tenha atingido um patamar que envolva pelo menos 3 determinações. Os ensaios também podem ser prolongados para 
além do período de 28 dias, no caso de a curva mostrar que se iniciou a 
biodegradação mas que o patamar não foi atingido até ao 28.
 o dia. 
I.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
I.5.1.  Reprodutibilidade  
Devido à natureza da biodegradação e das populações bacterianas 
mistas utilizadas como inóculos, as determinações devem ser efec ­
tuadas pelo menos em duplicado.  
Sabe-se pela experiência que, quanto maior for a concentração de 
microorganismos adicionados inicialmente ao meio de ensaio, meno ­
res serão as diferenças entre repetições. Ensaios interlaboratoriais 
demonstram também que pode haver grandes diferenças entre os resultados obtidos em laboratórios diferentes, embora se obtenha, normalmente, uma boa concordância quando se utilizam compostos 
facilmente biodegradáveis.
 
I.5.2.  Validade do ensaio  
Considera-se que um ensaio é válido se a diferença entre valores 
extremos de repetições de desaparecimento da substância química de 
ensaio, no patamar, no fim do teste ou no final dos 10 dias, for inferior a 20 % e se a percentagem de degradação da substância de referência atingir o nível de biodegradabilidade fácil ao fim de 14 
dias. Se qualquer uma destas condições não for satisfeita, o ensaio 
deve ser repetido. Devido à especificidade dos métodos, os valores baixos não significam necessariamente que a substância de ensaio não seja biodegradável nas condições ambientais, mas significa que 
serão necessários novos estudos para se provar a biodegradabilidade.
 
Se num ensaio de toxicidade, contendo tanto a substância de ensaio 
como a substância química de referência, ocorrer uma degradação 
inferior a 35 % (tomando como base o COD) ou inferior a 25 % (tomando como base CTeO ou CO
 2 Te) decorridos 14 dias, pode 
admitir-se que as substâncias químicas de ensaio são inibidoras 
(ver também o apêndice 4). As sequências de ensaio deverão ser repetidas, utilizando, se possível, uma concentração inferior da subs ­
tância química de ensaio e/ou uma concentração superior de in όculo, 
mas não superior a 30 mg de sólidos/litro.
 
I.6. PREPARAÇÕES E PROCEDIMENTOS GERAIS  
As condições gerais aplicáveis aos ensaios são resumidas no quadro 
2. O equipamento e outras condições experimentais correspondentes 
especificamente a um determinado ensaio são descritas depois, sob o 
título desse ensaio.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 982
 
Quadro 2  
condições de ensaio  
Ensaio Redução 
gradual de 
COD Libertação de 
CO 2 Respirometria 
manométrica Despiste da 
OCDE 
modificado Frasco fechado M1T1 (I)  
Concentração 
da substância 
de ensaio 
mg/l 100 2–10 100 mg COD/l 10–40 10–20 10–40 mg CTeO/l 50–100 5–10 
Concentração 
do inόculo 
(em células/l, aproximada ­
mente) ≤ 30 mg/l SS 
ou ≤100 ml de efluente/l 
(10
 7 - 10  8 ) 0,5 ml de 
efluente se ­
cundário/l 
(10 5 ) < 5 ml de 
efluente/l 
(10 4 - 10  6 ) 30 mg/l SS 
(10 7 - 10  8 ) 
Concentração 
de elementos no meio mi ­
neral (em 
mg/l): 
P 116 11,6 29 N 1,3 0,13 1,3 Na 86 8,6 17,2 K 122 12,2 36,5 Mg 2,2 2,2 6,6 Ca 9,9 9,9 29,7 Fe 0,05-0,1 0,05-0,1 0,15 
pH 7,4 ± 0,2 preferencial ­
mente 7,0 
Temperatura 22 ± 2
 o C 25 ± 1  o C 
COD = Carbono Orgânico Dissolvido CTeO = Carência Teó ­
rica de Oxigénio SS =  
I.6.1.  Água de diluição  
É usada água desionizada ou destilada, livre de substâncias tóxicas 
(por exemplo iões Cu  ++ ) em concentrações inibidoras. Não deve 
conter mais do que 10 % do teor de carbono orgânico introduzido pela substância de ensaio. É necessária uma elevada pureza para a 
água de ensaio para evitar um elevado número de valores em branco. 
A contaminação pode resultar de impurezas inerentes e também de resinas de permuta iónica e do material lisado de bactérias e algas. Para cada série de ensaios utiliza-se apenas um lote de água, con ­
trolada previamente por análise do COD. Tal controlo não é neces ­
sário no teste do frasco fechado, mas o consumo de oxigénio da água deve ser baixo.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 983
 
I.6.2.  Soluções de reserva de componentes minerais  
Para se preparar as soluções de ensaio recorre-se a utilização de 
soluções de reserva com concentrações apropriadas de componentes minerais. É possível utilizar as seguintes soluções de reserva (com 
diversos factores de diluição) para os métodos de redução gradual do 
COD, despiste da OCDE modificado, libertação de CO
 2 , respirome ­
tria manométrica, ensaio em frasco fechado.  
Os factores de diluição e, no caso do ensaio de MITI, a preparação 
específica do meio mineral, são indicados sob os títulos dos ensaios específicos.
 
Soluções de reserva:  
Preparam-se as seguintes soluções de reserva utilizando reagentes da 
qualidade analítica. 
a) Dihidrogeno-ortofosfato monopotássico, KH  2 PO 4 8,50 g 
Monohidrogeno-ortofosfato dipotássico, K  2 HPO  4 21,75 g 
Monohidrogeno-ortofosfato dissódico dihidratado, 
Na 2 HP0  4 . 2H  2 O 33,40 g 
Cloreto de amónio, NH  4 Cl 
Dissolver em água e ajustar até ao volume de 1 
litro. O pH da solução deverá ser 7,4; 
b) Cloreto de cálcio anidro, CaCl  2 27,50 g 
ou cloreto de cálcio dihidratado, CaCl  2 . 2H  2 O 36,40 g 
Dissolver em água e ajustar o volume até 1 litro; 
c) Sulfato de magnésio heptahidratado, MgSO  4 . 
7H 2 O 22,50 g 
Dissolver em água e ajustar o volume até 1 litro; 
d) Cloreto de ferro (III) hexahidratado, FeCl  3 . 6H  2 O 0,25 g 
Dissolver em água e ajustar o volume até 1 litro.  
Nota : Para não se ter de preparar esta solução imediatamente antes 
da sua utilização adiciona-se-lhe uma gota de HC1 concentrado ou 0,4 g do sal dissódico do ácido etilenodiarninatetracético (EDTA) 
por litro.
 
I.6.3.  Soluções de reserva das substâncias químicas  
Quando a solubilidade for superior a 1 g/l, dissolver 1-10 g, por 
exemplo, conforme for apropriado, da substância química de ensaio 
ou de referência em água desionizada e ajustar o volume a 1 litro. 
Caso contrário, preparar soluções de reserva em meio mineral e adicionar a substância química directamente ao meio mineral. Para o caso de substâncias químicas de menor solubilidade veja-se o 
apêndice 3; no teste do MITI (método C.4-F) não serão utilizados 
nem solventes nem agentes emulsionantes.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 984
 
I.6.4.  Inóculos  
O inόculo pode ser obtido a partir de uma diversidade de origens: 
lamas activadas, efluentes de esgotos (não clorados), solos e águas superficiais ou a partir de uma mistura dessas origens. Para os en ­
saios de redução gradual do COD, de libertação de CO
 2 e de respi ­
rometria manométrica, no caso de se utilizarem lamas activadas estas devem ser obtidas a partir de uma estação de tratamento ou de uma unidade laboratorial que receba essencialmente águas residuais do ­
mésticas. Verificou-se que os inóculos provenientes de outras origens 
provocam uma maior dispersão de resultados. Nos ensaios de des ­
piste da OCDE modificado e de frasco fechado é necessário um 
inόculo mais diluído, sem partículas de lama, sendo a fonte prefe ­
rencial um efluente secundário proveniente de uma estação de trata ­
mento de resíduos domésticos ou de uma unidade laboratorial. No caso do ensaio de MITI, o in όculo provém de uma mistura de 
origens, sendo descrito sob o título do ensaio específico.
 
I.6.4.1.  Inόculo de lamas activadas  
Recolher uma amostra de lamas activadas recentes, provenientes de 
um tanque de arejamento de uma estação de tratamento de esgotos 
ou de uma unidade laboratorial que trate essencialmente esgotos 
domésticos. Remover as partículas grosseiras, se necessário por fil ­
tração através de um crivo fino, e manter posteriormente as lamas em estado aeróbio.
 
Em alternativa, deixar sedimentar ou centrifugar (por exemplo, a 
1 100 g durante 10 minutos) depois da remoção de todas as partí ­
culas grosseiras. Rejeitar o sobrenadante. As lamas podem ser lava ­
das em meio mineral. Preparar uma suspensão das lamas concentra ­
das em meio mineral, para se obter uma concentração de 3-5 g de sólidos em suspensão/l e efectuar o arejamento enquanto for neces ­
sário.
 
As lamas devem ser obtidas a partir de uma adequada estação de 
tratamento. Se as lamas forem obtidas de uma estação de tratamento 
de grandes caudais ou nas quais se admite a presença de inibidores, devem ser lavadas. Deixar sedimentar ou centrifugar as lamas da nova suspensão após mistura profunda, rejeitar o sobrenadante e 
preparar outra suspensão das lamas lavadas num novo volume de 
meio mineral. Repetir este procedimento até se concluir que as lamas não possuem inibidor ou substrato em excesso.
 
Depois de se ter obtido uma nova suspensão, ou quando se utilizam 
lamas não tratadas, retirar uma amostra imediatamente antes da sua utilização para determinação do resíduo seco correspondente às subs ­
tâncias sólidas em suspensão.
 
Outra alternativa consiste em homogeneizar as lamas activadas 
(3-5 g de sólidos em suspensão/l). Tratar as lamas num misturador 
mecânico durante 2 minutos, a uma velocidade média. Deixar sedi ­
mentar a mistura de lamas durante 30 minutos ou durante um pe ­
ríodo mais longo, se necessário, e decantar o líquido para utilização 
como inόculo na proporção de 10 ml/l de meio mineral.  
I.6.4.2.  Outras fontes de in όculo 
Este pode ser obtido a partir de um efluente secundário de uma 
estação de tratamento ou de uma unidade laboratorial que receba 
essencialmente resíduos domésticos. Recolher uma amostra fresca e 
conservá-la aerobicamente durante o transporte. Deixar sedimentar durante uma hora ou filtrar através de papel de filtro para partículas grosseiras e conservar aerobicamente o efluente decantado ou o fil ­
trado, enquanto for necessário. Pode utilizar-se até 100 ml deste tipo 
de inόculo para cada litro de meio.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 985
 
As águas superficiais constituem uma fonte adicional de in όculo. 
Nesse caso, recolher uma amostra de uma água superficial adequada, 
por exemplo, dos rios ou dos lagos e conservá-la em estado aeróbio enquanto for necessário. Se tal se justificar, concentrar o in όculo por 
filtração ou por centrifugação.
 
I.6.5.  Pré-condicionamento dos inóculos  
Os inóculos podem ser pré-condicionados para as condições experi ­
mentais mas não podem ser pré-adaptados à substância química de 
ensaio. O pré-condicionamento consiste em arejar as lamas activadas em meio mineral ou efluente secundário durante cinco a sete dias, à temperatura de ensaio. Por vezes, o pré-condicionamento melhora a 
precisão dos métodos de ensaio pelo facto de reduzir os valores dos 
brancos. É desnecessário pré-condicionar o in όculo para o método de 
MITI.
 
I.6.6.  Controlos abióticos  
Sempre que necessário, verificar a possível degradação abiótica da 
substância de ensaio, determinando a remoção do COD, o consumo 
de oxigénio ou a libertação de dióxido de carbono em controlos 
estéreis que não contenham in όculo. Esterilizar por filtração através 
de uma membrana (0,2 - 0,45 mícron) ou adicionando uma subs ­
tância tóxica adequada numa concentração conveniente. Se é usada 
membrana de filtração, colhem-se as amostras assepticamente para 
que se mantenha a esterilidade. A menos que se tenha excluído previamente a adsorção da substância de ensaio, os testes para a 
medição da biodegradação por remoção do COD, especialmente 
com inόculo de lamas activas, deverão incluir um controlo abiótico, 
o qual é inoculado e contaminado.
 
I.6.7.  Número de frascos  
O número de frascos numa experiência-tipo é descrito nos títulos de 
cada ensaio.  
Podem usar-se os seguintes tipos de frascos:  
— suspensão de ensaio: substância de ensaio e in όculo,  
— branco de in όculo: somente o inoculo,  
— controlo do processo: substância de referência e inóculo,  
— controlo abiótico estéril: substância de ensaio, estéril (ver ponto 
I.6.6),  
— controlo de adsorção: substância de ensaio, in όculo e agente 
esterilizante,  
— controlo de toxicidade: substância de ensaio, substância de refe ­
rência e in όculo.  
As determinações na suspensão de ensaio e no branco do in όculo 
deverão obrigatoriamente ser feitas em paralelo. É também aconse ­
lhável fazer as determinações noutro frasco, em paralelo.  
Todavia, isto nem sempre é possível. Garantir que são preparadas 
amostras suficientes ou efectuadas leituras suficientes de modo que 
possa avaliar-se a remoção percentual no período dos 10 dias.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 986
 
I.7. RESULTADOS E AVALIAÇÃO  
No cálculo do valor D  t , degradação percentual, utilizam-se os valores 
médios das medições em duplicado dos parâmetros tanto nos reci ­
pientes de ensaio como no branco do in όculo. As fórmulas são 
apresentadas a seguir, nas secções correspondentes sobre os ensaios 
específicos. A evolução da degradação é representada graficamente, sendo indicado o período dos 10 dias. Calcular e registar a remoção percentual alcançada no final do período dos 10 dias e o valor no 
patamar ou no final do ensaio, conforme o caso.
 
Nos ensaios respirométricos os compostos que contêm azoto podem 
afectar o consumo de oxigénio, devido a fenómenos de nitrificação 
(ver os apêndices 2 e 5).  
I.7.1.  Degradação medida através da determinação do COD  
Para o cálculo da percentagem de degradação (D  t ), é colhida uma 
amostra num dado momento, o qual deverá ser calculado separada ­
mente para cada um dos frascos que contêm a substância a testar, usando os valores médios das medições em duplicado do COD, com 
o fim de se poder avaliar a validade do teste (ver ponto I.5.2). Para o 
cálculo usa-se a seguinte equação:
 
D t ¼ 1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C b0 Í Î 
Ü 100 
em que:  
D t = % de degradação no momento t,  
C o = concentração média inicial de COD no meio de cultura 
inoculado que contém a substância de ensaio (mg de 
COD/l),  
C t = concentração média de COD no meio de cultura inoculado 
que contém a substância de ensaio, no momento t (mg de COD/l),
 
C bo = concentração média inicial de COD no branco de meio 
mineral inoculado (mg de COD/l),  
C bt = concentração média de COD no branco de meio mineral 
inoculado no momento t (mg de COD/l).  
Todas as concentrações são medidas experimentalmente.  
I.7.2.  Degradação medida através de análise específica  
No caso de existirem dados analíticos específicos, calcular a biode ­
gradação primária pela fórmula:  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
em que:  
D t = % de degradação no momento t, normalmente após 28 dias,  
S a = quantidade residual de substância de ensaio no meio inocu ­
lado no final do ensaio (mg),  
S b = quantidade residual de substância de ensaio no teste em 
branco que utiliza água/meio a que apenas se adicionou a 
substância de ensaio (mg).  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 987
 
I.7.3.  Degradação abiótica  
Quando é usado um controlo estéril abiótico, usa-se para o cálculo 
da percentagem de degradação abiótica, a fórmula seguinte:  
% de degradação abiótica  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
em que:  
C s(o) = concentração COD no controlo estéril no dia zero,  
C s(t) = concentração COD no controlo estéril no dia t.  
I.8. RELATÓRIO  
O relatório de ensaio deverá conter, se possível, as informações 
seguintes:  
— substâncias químicas de ensaio e de referência e o seu grau de 
pureza,  
— condições de ensaio,  
— inόculo: natureza e locais de amostragem, concentração e qual ­
quer tratamento de pré-condicionamento,  
— proporção e natureza dos resíduos industriais existentes nas águas 
residuais, se forem conhecidas,  
— duração e temperatura do ensaio,  
— nos casos das substâncias químicas de ensaio pouco solúveis, 
qual o tratamento efectuado,  
— método de ensaio aplicado; deverão ser apresentadas e explicadas 
as razões científicas de qualquer modificação de procedimento,  
— folha de dados,  
— qualquer fenómeno de inibição observado,  
— qualquer degradação abiótica observada,  
— dados analíticos químicos específicos, se os houver,  
— dados analíticos químicos sob intermediários, se os houver,  
— o gráfico da degradação percentual em função do tempo para as 
substâncias de ensaio e de referência, a fase de latência, a fase de degradação, o período dos 10 dias e o declive, deverão ser 
claramente indicados (apêndice 1). Se o teste foi sujeito a um 
critério de validade, as percentagens médias de degradação nos frascos com a substância de ensaio podem ser usadas para o gráfico,
 
— a remoção percentual depois do período dos 10 dias, e no pata ­
mar ou no final do ensaio.  
PARTE II.  ENSAIO DA REDUÇÃO GRADUAL DO COD  
(método C.4-A)  
II.1. PRINCÍPIO DO MÉTODO  
Ao abrigo da luz ou sob luz difusa e à temperatura de 22 ± 2 °C faz- 
-se o arejamento de um determinado volume de meio mineral inocu ­
lado, contendo uma concentração conhecida da substância de ensaio 
(10-40 mg COD/l) como única fonte nominal de carbono orgânico.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 988
 
Acompanha-se a degradação por análise frequente do COD ao longo 
de um período de 28 dias. Calcula-se o grau de biodegradação, 
exprimindo a concentração de COD removido (corrigida em função do branco de inóculo de controlo) em percentagem da concentração inicialmente presente. O grau de biodegradação primária também 
pode ser calculado através de uma análise química complementar 
efectuada no início e no fim da incubação.
 
II.2. DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
II.2.1.  Equipamento  
a) Frascos cónicos, por exemplo, com capacidade entre 250 ml e 2 
1, consoante o volume necessário para a análise do COD;  
b) Máquina agitadora — para os frascos cónicos, com controlo 
automático de temperatura ou, em alternativa, utilizada a uma 
temperatura ambiente constante, e com potência suficiente para manter condições aeróbias em todos os frascos;
 
c) Equipamento de filtração, com membranas adequadas;  
d) Analisador de COD;  
e) Equipamento para determinar o oxigénio dissolvido;  
f) Centrifugadora.  
II.2.2.  Preparação do meio mineral  
Para a preparação da solução de reserva, ver ponto I.6.2.  
Misturar 10 ml de solução (a) com 800 ml de água de diluição, 
adicionar 1 ml das soluções (b) a (d) e ajustar o volume a 1 litro com água de diluição.
 
II.2.3.  Preparação e pré-condicionamento do in όculo 
O inόculo pode ser obtido de várias origens: lamas activadas; efluen ­
tes de esgotos; águas de superfície; solos ou misturas destes.  
Ver pontos I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 e 1.6.5.  
II.2.4.  Preparação dos frascos  
A título de exemplo, introduzir quantidades de 800 ml de meio 
mineral em frascos cónicos com a capacidade de 2 litros e adicionar volumes suficientes das soluções de reserva que contêm as subs ­
tâncias de ensaio e de referência a frascos separados, para se obter 
uma concentração de substância química equivalente a 10-40 mg de 
COD/l. Controlar os valores do pH e ajustá-los, se necessário, para 7,4. Inocular os frascos com lamas activadas ou com outra fonte de inóculos (ver ponto I.6.4), para se obter uma concentração final não 
superior a 30 mg de sólidos em suspensão/l. Preparar também os 
controlos de in όculo em meio mineral mas sem a substância química 
de ensaio ou de referência.
 
Se necessário, utilizar um recipiente para verificação do possível 
efeito inibidor da substância química de ensaio, inoculando uma 
solução que contenha, num meio mineral, concentrações comparáveis das substâncias químicas de ensaio e de referência.
 
Ainda no caso de ser necessário, preparar outro frasco estéril para 
verificar se a substância química de ensaio se degrada abioticamente, 
utilizando uma solução não inoculada contendo a substância química 
(ver ponto I.6.6).  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 989
 
Para além disso, no caso de se suspeitar que a substância química de 
ensaio é significativamente adsorvida pelo vidro, lamas, etc., efectuar 
uma avaliação preliminar para se determinar o grau provável da adsorção e, consequentemente, se determinar se o ensaio é adequado à substância química (ver quadro 1). Preparar um frasco com a subs ­
tância de ensaio, o in όculo e o agente esterilizante.
 
Ajustar os volumes em todos os frascos a 1 litro, utilizando meio 
mineral e, depois de se misturar, retirar uma amostra de cada frasco para determinar a concentração inicial de COD (ver apêndice 2.4). 
Tapar as aberturas dos frascos, por exemplo com folha de alumínio, 
de modo a permitir a permuta livre de ar entre o frasco e a atmosfera envolvente. Colocar depois os recipientes na máquina agitadora e iniciar o ensaio.
 
II.2.5.  Número de frascos numa experiência-tipo  
De preferência:  
Frascos 1 e 2: suspensão de ensaio;  
Frascos 3 e 4: branco do in όculo;  
Frasco 5: controlo.  
Se necessário, ainda:  
Frasco 6: controlo abiótico estéril;  
Frasco 7: controlo da adsorção;  
Frasco 8: controlo da toxicidade.  
Ver ponto I.6.7.  
II.2.6.  Realização do ensaio  
Ao longo do ensaio, determinar as concentrações de COD em cada 
frasco em duplicado, a intervalos de tempo conhecidos suficiente ­
mente frequentes que permitam determinar o início do período dos 10 dias e a remoção percentual no final do período dos 10 dias. Utilizar apenas o volume mínimo de suspensão de ensaio necessário 
para cada determinação.
 
Antes da colheita de amostras, repor as perdas dos frascos por eva ­
poração, adicionando água de diluição (ponto I.6.1) na quantidade 
requerida, se for necessário. Homogeneizar o meio de cultura antes 
de se retirar a amostra e garantir que o material aderente às paredes dos recipientes é dissolvido ou se mantém em suspensão antes da colheita de amostras. Filtrar através de membranas ou centrifugar 
(ver apêndice 2.4), imediatamente após a colheita de amostras. Ana ­
lisar no mesmo dia as amostras filtradas ou centrifugadas ou, caso contrário, armazená-las à temperatura de 2-4
 o C durante um período 
máximo de 48 horas, ou a uma temperatura inferior a - 18  o C no 
caso de um período mais longo.  
II.3. RESULTADOS E RELATÓRIO  
II.3.1.  Tratamento dos resultados  
Calcular a percentagem de degradação no momento t conforme re ­
ferido no ponto I.7.1 (determinação do COD) e, facultativamente, 
conforme referido no ponto I.7.2 (análise específica).  
Registar todos os resultados nas folhas de dados fornecidas.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 990
 
II.3.2.  Validade dos resultados  
Ver ponto I.5.2.  
II.3.3.  Relatório  
Ver ponto I.8.  
II.4. FOLHA DE DADOS  
Como exemplo de folha de dados apresenta-se a seguinte:  
ENSAIO DE REDUÇÃO GRADUAL DO COD  
1. LABORATÓRIO  
2. DATA DO INÍCIO DO ENSAIO  
3. SUBSTÂNCIA DE ENSAIO  
Nome:  
Concentração da solução de reserva: ... mg/l da substância  
Concentração inicial no meio, t  o : ... mg/l da substância  
4. INÓCULO  
Origem:  
Tratamento efectuado:  
Pré-condicionamento, se o houver:  
Concentração das substâncias sólidas em suspensão na mistura 
reaccional: mg/l  
5. DETERMINAÇÕES DE CARBONO  
Analisador de carbono:  
N o do frasco COD decorridos n dias (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Substância quí ­
mica de ensaio e inóculo 
1 a
 1 
a 2 
a, média 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, média 
C b(t) ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 991
 
N o do frasco COD decorridos n dias (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Branco de inóculo 
sem substância de ensaio 3 c
 1 
c 2 
c, média C  c(t) 
4 d 1 
d 2 
d, média 
C d(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. AVALIAÇÃO DOS DADOS BÁSICOS  
N o do frasco % de degradação decoridos n dias 
0 n  1 n 2 n 3 n 4 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
Média (*) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
(*) D  1 e D  2 não devem ser ponderados, se há uma diferença considerável.  
Nota:  É possível utilizar fórmulas idênticas para a substância quí ­
mica de referência e para os controlos de toxicidade.  
7. CONTROLO ABIÓTICO  (facultativo)  
Tiempo (días) 
0 t  
conc. de COD (mg/l) en el control estéril C s(o) C s(t) 
% de degradação abiótica  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
8. ANÁLISE QUÍMICA ESPECÍFICA  (facultativa)  
Quantidade residual da subastân ­
cia de ensaio no final do teste 
(mg/l) % degradação  
Controlo estéri S  b ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 992
 
Quantidade residual da subastân ­
cia de ensaio no final do teste 
(mg/l) % degradação  
Meio de ensaio inoculado S  a S b Ä S a 
S b Ü 100 
PARTE III.  TESTE DE DESPISTE DA OCDE MODIFICADO  
(método C.4-B)  
III.1. PRINCÍPIO DO MÉTODO  
Utilizando 0,5 ml de efluente por litro de meio faz-se a inoculação 
de um determinado volume de meio mineral, contendo uma concen ­
tração conhecida da substância de ensaio (10-40 mg de COD/l) como única fonte nominal de carbono orgânico. Faz-se o arejamento da 
mistura ao abrigo da luz ou sob luz difusa, à temperatura de 22 ± 
2
 o C. 
Acompanha-se a degradação por análise frequente do COD ao longo 
de um período de 28 dias. Calcula-se o grau de biodegradação, 
exprimindo a concentração de COD removido (corrigida em função 
do branco de in όculo de controlo) em percentagem da concentração 
inicialmente presente. O grau de biodegradação primária também pode ser calculado através de uma análise química complementar 
efectuada no início e no fim da incubação.
 
III.2. DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
III.2.1. Equipamento  
a) Frascos cónicos, por exemplo, com capacidade entre 250 ml e 2 
1, consoante o volume necessário para a análise do COD;  
b) Máquina agitadora — para os frascos cónicos, com controlo au ­
tomático de temperatura ou, em alternativa, utilizada a uma tem ­
peratura ambiente constante, e com potência suficiente para man ­
ter condições aeróbias em todos os frascos;  
c) Equipamento de filtração, com membranas adequadas;  
d) Analisador de COD;  
e) Equipamento para determinar o oxigénio dissolvido;  
f) Centrifugadora.  
III.2.2.  Preparação do meio mineral  
Para a preparação da solução de reserva, ver ponto I.6.2.  
Misturar 10 ml de solução (a) com 800 ml de água de diluição, 
adicionar 1 ml das soluções (b) a (d) e ajustar o volume a 1 litro 
com a água de diluição.  
Neste método utiliza-se como in όculo apenas 0,5 ml de efluente/litro 
pelo que pode ser necessário reforçar o meio com oligoelementos e 
factores de crescimento. Esta operação efectua-se adicionando 1 ml 
de cada uma das soluções a seguir indicadas por litro de meio final.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 993
 
Solução de oligoelementos: 
Sulfato de manganés tetrahidratado, MnSO  4 . 4H  20 39,9 mg 
Ácido bórico, H  3 BO 3 57,2 mg 
Sulfato de zinco heptahidratado, ZnSO  4 . 7H  20 42,8 mg 
Heptamolibdato de amónio, (NH  4 ) 6 Mo 7 O 24 34,7 mg 
Quelato de Fe (FeCl  3 — ácido etilenodiaminatetracé ­
tico) 100,0 mg 
Dissolver e ajustar o volume a 1 000 ml com água de 
diluição 
Solução vitamínica: Extracto de levedura 15,0 mg
 
Dissolver o extracto de levedura em 100 ml de água. Esterilizar, 
fazendo passar através de uma membrana de 0,2 mícron ou preparar 
de fresco.  
III.2.3.  Preparação e pré-condicionamento do in όculo 
O inόculo é derivado de um efluente secundário de uma estação de 
tratamento ou laboratório, que recebe predominantemente esgotos domésticos. Ver pontos I.6.4.2 e I.6.5.
 
Utiliza-se 0,5 ml por litro de meio mineral.  
III.2.4.  Preparação dos frascos  
A título de exemplo, introduzir quantidades de 800 ml de meio 
mineral em frascos cónicos com a capacidade de 2 litros e adicionar 
volumes suficientes das soluções de reserva que contêm as subs ­
tâncias de ensaio e de referência a frascos separados, para se obter uma concentração de substância química equivalente a 10-40 mg de 
COD/l. Controlar o valor do pH e ajustá-lo, se necessário, para 7,4. 
Inocular os frascos com efluente de águas residuais para se obter uma concentração de 0,5 ml/litro (ver ponto I.6.4.2). Preparar tam ­
bém os controlos de in όculo em meio mineral mas sem a substância 
química de ensaio ou de referência.
 
Se necessário, utilizar um recipiente para verificação do possível 
efeito inibidor da substância química do ensaio, inoculando uma 
solução que contenha, num meio mineral, concentrações comparáveis 
das substâncias químicas de ensaio e de referência.  
Ainda se necessário, preparar outro frasco estéril para verificar se a 
substância química de ensaio se degrada abioticamente, utilizando 
uma solução não inoculada contendo a substância química (ver ponto 1.6.6).
 
Para além disso, no caso de se suspeitar que a substância química de 
ensaio é significativamente adsorvida pelo vidro, lamas, etc., efectuar uma avaliação preliminar para se determinar o grau provável de adsorção e, consequentemente, se determinar se o ensaio é adequado 
à substância química (ver quadro 1). Preparar um frasco com a subs ­
tância de ensaio, o in όculo e o agente esterilizante.
 
Ajustar os volumes em todos os frascos a 1 litro, utilizando meio 
mineral e, depois de se misturar, retirar uma amostra de cada frasco 
para determinar a concentração inicial de COD (ver apêndice 2.4). Tapar as aberturas dos frascos, por exemplo com folha de alumínio, de modo a permitir a permuta livre de ar entre o frasco e a atmosfera 
envolvente. Colocar depois os recipientes na máquina agitadora e 
iniciar o ensaio.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 994
 
III.2.5.  Número de frascos numa experiência-tipo  
De preferência:  
Frascos 1 e 2: suspensão de ensaio,  
Frascos 3 e 4: branco do in όculo,  
Frasco 5: controlo;  
Se necessário, ainda:  
Frasco 6: controlo abiótico estéril, Frasco 7: controlo da adsorção,  
Frasco 8: controlo da toxicidade.  
Ver ainda o ponto I.6.7.  
III.2.6.  Realização do ensaio  
Ao longo do ensaio, determinar as concentrações de COD em cada 
frasco em duplicado, a intervalos de tempo conhecidos suficiente ­
mente frequentes que permitam determinar o início do período dos 
10 dias e a remoção percentual no final do período dos 10 dias. Utilizar apenas o volume mínimo de suspensão de ensaio necessário para cada determinação.
 
Antes da colheita de amostras, repor as perdas dos frascos por eva ­
poração, adicionando água de diluição (ponto I.6.1) na quantidade 
requerida, se for necessário. Homogeneizar o meio de cultura antes 
de se retirar a amostra e garantir que o material aderente às paredes dos recipientes é dissolvido ou se mantém em suspensão antes da colheita de amostras. Filtrar através de membranas ou centrifugar 
(ver apêndice 2.4), imediatamente após a colheita de amostras. Ana ­
lisar no mesmo dia as amostras filtradas ou centrifugadas ou, caso contrário, armazená-las à temperatura de 2-4
 o C durante um período 
máximo de 48 horas, ou a uma temperatura inferior a — 18  o C no 
caso de um período mais longo.  
III.3. RESULTADOS E RELATÓRIO  
III.3.1.  Tratamento dos resultados  
Calcular a percentagem de degradação no momento t conforme re ­
ferido no ponto I.7.1 (determinação do COD) e, facultativamente, conforme referido no ponto I.7.2 (análise específica).
 
Registar todos os resultados nas folhas de dados fornecidas.  
III.3.2. Validade dos resultados  
Ver ponto I.5.2.  
III.3.3. Relatório  
Ver ponto I.8.  
III.4. FOLHA DE DADOS  
Como exemplo de folha de dados apresenta-se a seguinte:  
ENSAIO DE DESPISTE DA OCDE MODIFICADO  
1. LABORATÓRIO  
2. DATA DO INÍCIO DO ENSAIO  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 995
 
3. SUBSTÂNCIA DE ENSAIO  
Nome:  
Concentração da solução de reserva: mg/l da substância  
Concentração inicial no meio, t  o :mg/l da substância  
4. INÓCULO  
Origem:  
Tratamento efectuado:  
Pré-condicionamento, se o houver:  
Concentração das substâncias sólidas em suspensão na mistura 
reaccional: mg/l  
5. DETERMINAÇÕES DE CARBONO  
Analisador de carbono:  
N o do frasco COD decorridos n dias (mg/l) 
0 n  1 n 2 n 3 n x 
Substância quí ­
mica de ensaio e 
inóculo 1 a 1 
a 2 
a, média 
C a(t) 
2 b 1 
b 2 
b, media 
C b(t) 
Branco de inóculo 
sem substância de ensaío 3 c
 1 
c 2 
c, media C  b(t) 
4 d 1 
d 2 
d, media 
C b(t) 
C blðtÞ ¼ C cðtÞ þ C dðtÞ 
2 
6. AVALIAÇÃO DOS DADOS BÁSICOS  
N o do frasco % de degradação decorridos n dias 
0 n  1 n 2 n 3 n 4 
1 D 1 ¼ Í 
1 Ä C aðtÞ Ä C blðtÞ 
C aðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 996
 
N o do frasco % de degradação decorridos n dias 
0 n  1 n 2 n 3 n 4 
2 D 2 ¼ Í 
1 Ä C bðtÞ Ä C blðtÞ 
C bðoÞ Ä C blðoÞ Î 
Ü 100 0 
Média (*) D ¼ D 1 Ä D 2 
2 0 
(*) D  1 e D  2 não devem ser ponderados, se há uma diferença considerável.  
Nota:  É possível utilizar fórmulas idênticas para a substância quí ­
mica de referência e para os controlos de toxicidade.  
7. CONTROLO ABIÓTICO  (facultativo)  
Tempo (dias) 
0 t  
Concentração do COD (mg/l) no controlo 
estéril C s(o) C s(t) 
% de degradação abiótica  ¼ C sðoÞ Ä C sðtÞ 
C sðoÞ Ü 100 
8. ANÁLISE QUÍMICA ESPECÍFICA  (facultativa)  
Quantidade residual da 
substância de ensaio no final do 
teste % degradação primária  
Controlo estéril S  b 
Meio de ensaio inoculado S  a S b Ä S a 
S b Ü 100  
PARTE IV. ENSAIO DA LIBERTAÇÃO DE CO  2 (método 
C.4-C)  
IV.1. PRINCÍPIO DO MÉTODO  
às escuras ou sob luz difusa faz-se passar um caudal controlado de ar 
isento de dióxido de carbono, para o arejamento de um volume determinado de meio mineral inoculado, contendo uma concentração conhecida da substância química de ensaio (10-20 mg de COD ou de 
COT/l) como única fonte nominal de carbono orgânico. Acompanha- 
-se a degradação ao longo de 28 dias, determinando o dióxido de carbono produzido, o qual é retido em hidróxido de bário ou em hidróxido de sódio e é medido por titulação do hidróxido residual ou 
na forma de carbono inorgânico. A quantidade de dióxido de car ­
bono produzido pela substância química de ensaio (corrigida em função dos valores obtidos a partir do branco de in όculo) exprime- 
-se em percentagem do valor CO
 2 Te. O grau de biodegradação tam ­
bém pode ser calculado por uma análise complementar do COD 
efectuada no início e no fim da incubação.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 997
 
IV.2. DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
IV.2.1.  Equipamento  
a) Frascos de 2-5 litros, cada um deles munido de um tubo de 
arejamento que atinge as proximidades do fundo do recipiente 
e com uma abertura de saída;  
b) Agitadores magnéticos, quando se fizer a avaliação de substân ­
cias químicas pouco solúveis;  
c) Frascos de absorção de gás;  
d) Dispositivo para controlar e medir o fluxo de ar;  
e) Equipamento para remoção do dióxido de carbono, para obtenção 
de ar isento de dióxido de carbono; em alternativa, utilizar uma mistura de oxigénio isento de CO
 2 e de azoto isento de CO  2 , 
provenientes de garrafas, nas proporções correctas (20 % de O  2 : 
80 % de N  2 ); 
f) Dispositivo para a determinação do dióxido de carbono, recor ­
rendo a titulação (volumetria) ou utilizando algum tipo de anali ­
sador do carbono inorgânico;  
g) Dispositivo de filtração por membranas (facultativo);  
h) Analisador de COD (facultativo).  
IV.2.2.  Preparação do meio mineral  
Para a preparação das soluções de reserva ver ponto I.6.2.  
Misturar 10 ml de solução (a) com 800 ml de água de diluição, 
adicionar 1 ml das soluções (b) a (d) e ajustar o volume a 1 litro 
com água de diluição.  
IV.2.3.  Preparação e pré-condicionamento do in όculo 
O inόculo pode ser obtido de várias origens: lamas activadas; efluen ­
tes de esgotos; águas de superfície; solos ou misturas destes.  
Ver pontos I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 e I.6.5.  
IV.2.4.  Preparação dos frascos  
A título de exemplo, os volumes e massas a seguir indicados repre ­
sentam valores para frascos de 5 litros que contenham 3 litros de suspensão. No caso de se utilizarem volumes menores, modificar os 
correspondentes valores em conformidade mas garantir que o dió ­
xido de carbono formado possa ser medido com exactidão.
 
A cada frasco de 5 litros adicionar 2 400 ml de meio mineral. Adi ­
cionar um volume adequado das lamas activadas preparadas (ver ponto I.6.4.1 e I.6.5) para se obter uma concentração de substâncias sólidas em suspensão não superior a 30 mg/l, no volume final de 3 l 
de mistura inoculada. Em alternativa, diluir primeiro as lamas pre ­
paradas, de modo a obter-se uma suspensão de 500-1 000 mg/l em meio mineral, antes de se adicionar uma alíquota ao conteúdo do balão de 5 litros, de modo a obter-se uma concentração de 30 mg/l; 
esta operação garante uma grande precisão. É possível utilizar outras 
fontes de in όculo (ver ponto I.6.4.2).
 
Arejar estas misturas inoculadas, utilizando ar isento de CO  2 , durante 
a noite, para purgar o dióxido de carbono do sistema.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 998
 
Adicionar a substância de ensaio e a substância de referência, sepa ­
radamente, a partir de volumes conhecidos das soluções de reserva, a 
frascos idênticos repetidos, para se obterem concentrações, modifi ­
cadas pelas substâncias químicas adicionadas, de 10 a 20 mg de COD ou de COT/l; não adicionar substâncias químicas a alguns 
dos frascos para serem utilizados como controlos do in όculo. Adi ­
cionar as substâncias químicas de ensaio pouco solúveis directamente aos frascos, tomando como base a sua massa ou volume, ou proceder conforme descrito no apêndice 3.
 
Se necessário, utilizar um frasco para verificar o possível efeito 
inibidor da substância química de ensaio, adicionando as substâncias químicas de ensaio e de referência nas mesmas concentrações dos outros frascos.
 
Se necessário, utilizar também um frasco estéril para verificar se a 
substância química de ensaio se degrada abioticamente, utilizando uma solução não inoculada da substância química (ver ponto I.6.6.). Esterilizar adicionando urna substância tóxica numa concentração 
adequada.
 
Ajustar os volumes das suspensões em todos os frascos a 3 litros, 
adicionando meio mineral previamente arejado com ar isento de 
CO 2 . Facultativamente, podem retirar-se amostras para análise do 
COD (ver apêndice 2.4) e/ou para análises específicas. Ligar os recipientes de absorção às saídas de ar dos frascos.
 
No caso de se utilizar hidróxido de bário, ligar em série três frascos 
de absorção, contendo cada um 100 ml de uma solução de hidróxido 
de bário 0,0125 M, a cada frasco de 5 litros. A solução deve estar isenta de sulfatos e carbonatos precipitados e a sua concentração deve ser determinada imediatamente antes da utilização. No caso 
de se utilizar hidróxido de sódio, ligar dois frascos colectores, ac ­
tuando o segundo como elemento de controlo para demonstrar que todo o dióxido de carbono foi absorvido no primeiro. Nos frascos de absorção as rolhas de frascos de soro são adequadas. Adicionar 
200 ml de uma solução de hidróxido de sódio 0,05 M a cada frasco, 
quantidade que é suficiente para absorver a quantidade total de dió ­
xido de carbono libertado até à degradação completa da substância 
química de ensaio. A solução de hidróxido de sódio, ainda que 
recentemente preparada, conterá vestígios de carbonatos; efectua-se a correcção correspondente, deduzindo os carbonatos do branco.
 
IV.2.5.  Número de frascos numa experiência-tipo  
Balão 1 e 2: suspensão de ensaio;  
Balão 3 e 4: branco do in όculo;  
Frasco 5: controlo.  
De preferência e se necessário, ainda:  
Frasco 6: controlo abiótico estéril;  
Frasco 7: controlo da toxicidade.  
Ver também ponto I.6.7.  
IV.2.6.  Realização do ensaio  
Iniciar o ensaio fazendo borbulhar ar isento de CO  2 nas suspensões, 
com um caudal de 30-100 ml/minuto. Retirar periodicamente amos ­
tras do absorvente do dióxido de carbono, para análise do teor de CO
 2 . Durante os primeiros 10 dias recomenda-se que as análises 
sejam feitas de dois em dois ou de três em três dias e, depois, de 
cinco em cinco dias até ao 28.  o dia, de modo que seja possível 
identificar o período dos 10 dias.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 999
 
Ao 28.  o dia, retirar amostras (facultativo) para análise do COD e/ou 
análises específicas, medir o pH das suspensões e adicionar a cada 
frasco 1 ml de ácido clorídrico concentrado; arejar os frascos durante a noite para remoção do dióxido de carbono existente nas suspensões de ensaio. No 29.
 o dia efectuar a última análise do dióxido de 
carbono libertado.  
Nos dias das medições de CO  2 , desligar o dispositivo de absorção de 
hidróxido de bário mais próximo do frasco e fazer a titulação da solução de hidróxido, utilizando HCl 0,05 M e fenolftalina como 
indicador. Deslocar os outros dispositivos de absorção para uma 
posição mais próxima do frasco e colocar um novo dispositivo de absorção, contendo 100 ml de hidróxido de bário 0,0125 M recente, na extremidade mais afastada da série. Efectuar as titulações con ­
forme necessário, por exemplo, quando se observar uma precipitação 
substancial no primeiro frasco de absorção e antes que seja evidente qualquer precipitação no segundo ou logo que aí se note uma pre ­
cipitação fraca. Em alternativa, utilizando NaOH como absorvente, 
retirar com uma seringa uma pequena amostra (depende das carac ­
terísticas do analisador de carbono utilizado) da solução de hidróxido de sódio do dispositivo de absorção mais próximo do frasco. Injectar a amostra na zona correspondente ao CI do analisador de carbono 
para analisar directamente o dióxido de carbono libertado.
 
Analisar o teor no segundo frasco de absorção apenas no final do 
ensaio para corrigir qualquer passagem de dióxido de carbono.  
IV.3. RESULTADOS E RELATÓRIO  
IV.3.1.  Tratamento dos resultados  
A quantidade de CO  2 reti 
da num dispositivo de absorção, quando titulada, é dada por:  
mgCO  2 = (100 × C  B - 0,5 × V × C  A ) × 44  
em que:  
V = volume de HCl utilizado na titulação dos 100 ml existentes 
no dispositivo de absorção (ml),  
C B = concentração da solução de hidróxido de bário (M),  
C A = concentração da solução de ácido clorídrico (M),  
se C  B for 0,0125 M e C  A for 0,05 M, a titulação, para 100 ml de 
hidróxido de bário, será de 50 ml, e a massa de CO  2 será dada por:  
0; 05 
2 Ü 44 Ü ml de HCl titulado  ¼ 1; 1 Ü ml HCI  
Sendo assim, no caso presente, para se converter o volume de HCl 
titulado em mg de CO  2 produzido, utiliza-se o factor 1,1.  
Calcular a massa do CO  2 produzido a partir do in όculo isolado e a 
partir do in όculo e da substância química de ensaio, utilizando os 
respectivos valores de titulação, correspondendo a diferença à massa 
de CO  2 produzido apenas a partir da substância química de ensaio.  
Por exemplo, se o in όculo isoladamente conduzir a uma titulação de 
48 ml e o inóculo e a substância química de ensaio conduzirem a 
uma titulação de 45 ml, então:  
CO 2 proveniente do in όculo = 1,1 × (50-48) = 2,2 mg  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1000
 
CO 2 proveniente do in όculo e da substância química de ensaio 
= 1,1 × (50-45) = 5,5 mg  
pelo que a massa do CO  2 produzido a partir da substância química 
de ensaio será de 3,3 mg.  
A percentagem de biodegradação calcula-se pela expressão:  
% de degradação ¼ mg de CO  2 produzido Ü 100 
CO  2 Te Ü mg substância química de ensaio adicionada  
ou 
% de degradação ¼ mg de CO  2 produzido Ü 100 
mg de COT adicionado no ensaio  Ü 3; 67 
sendo o valor 3,67 o factor de conversão (44/12) de carbono em 
dióxido de carbono.  
Obtém-se a percentagem de degradação decorrido qualquer intervalo 
de tempo, somando as percentagens de CO  2 Te, cujo cálculo foi 
efectuado em cada um dos dias até ao momento em que se faz a 
medição.  
Para os dispositivos de absorção de hidróxido de sódio, calcular a 
quantidade de dióxido de carbono produzida, expressa em Cl (mg), 
multiplicando a concentração de CI no absorvente pelo volume desse absorvente.
 
Calcular a percentagem de degradação pela expressão:  
% de CO  2 Te ¼ mg CI do frasco de ensaio − mg CI do branco 
MG COT adicionado como substância química de ensaio  Ü 100 
Calcular as variações de COD (facultativo) conforme descrito no 
ponto I.7. Registar este e todos os outros resultados na folha de dados fornecida.
 
IV.3.2.  Validade dos resultados  
O teor de Cl da suspensão da substância química de ensaio em meio 
mineral, no início do ensaio, deve ser inferior a 5 % do valor do CT, 
e a libertação total de CO  2 no branco de in όculo, no final do ensaio, 
não deve normalmente exceder 40 mg/l de meio. No caso de serem obtidos valores superiores a 70 mg de CO
 2 /l, deverá fazer-se uma 
análise crítica dos resultados e da técnica experimental.  
Ver também o ponto I.5.2.  
IV.3.3.  Relatório  
Ver ponto I.8.  
IV.4. FOLHA DE DADOS  
Como exemplo de uma folha de dados apresenta-se a seguinte.  
ENSAIO DA LIBERTAÇÃO DE DIÓXIDO DE CARBONO  
1. LABORATÓRIO  
2. DATA DO INÍCIO DO ENSAIO  
3. SUBSTÂNCIA DE ENSAIO  
Nome:  
Concentração da solução de reserva: mg/l da substância  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1001
 
Concentração inicial no meio: mg/l da substância  
C total adicionado ao frasco: mg de C  
CO 2 Te: mg de CO  2 
4. INÓCULO  
Origem:  
Tratamento efectuado:  
Pré-condicionamento, se o houver:  
Concentração das substâncias sólidas em suspensão na mistura 
reaccional: mg/l  
5. PRODUÇÃO DE DIÓXIDO DE CARBONO E DEGRA ­
DABILIDADE  
Método: Ba(OH)  2 /NaOH/outro ...  
Tempo 
(dia) CO 2 formado ensío  
(mg) CO 2 formado bianco  
(mg) C0 2 formado 
acumulado (mg) 
(ensaio menos branco) % de CO  2 Te 
CO  2 
ThCO  2 Ü 100 
1 
2 média 3 
4 média 1 2 1 2 média  
0 
n 1 
n 2 
n 3 
28 
Nota : Podem ser utilizados esquemas idênticos para a substância 
química de referência e para os controlos de toxicidade.  
6. ANÁLISE DO CARBONO  (facultativa)  
Analisador de carbono:  
Tempo (dia) Branco mg/l Substância química de ensaio mg/l  
0 C  b(o) C o 
28 (*)  C b(t) C t 
(*) ou no final da incubação.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1002
 
% de COD removido  ¼ Í 
1 Ä C t Ä C bðtÞ 
C o Ä C bðoÞ Î 
Ü 100 
7. DEGRADAÇÃO ABIÓTICA  (facultativo) 
% de degradação abiótica  ¼ formação de CO  2 em frasco estéril decorridos ki dias  ðmgÞ 
CO  2 Te ðmgÞ Ü 100 
PARTE V.  ENSAIO DE RESPIROMETRIA MANOMÉ ­
TRICA  (método C.4-D)  
V.1. PRINCÍPIO DO MÉTODO  
Agita-se um volume determinado de meio mineral inoculado, con ­
tendo uma concentração conhecida da substância química de ensaio (substância de ensaio na concentração de 100 mg/l, para dar pelo menos 50-100 mg de CTeO/l) como única fonte nominal de carbono 
orgânico, num frasco fechado, a uma temperatura constante (± 1
 o C 
ou mais precisa), durante um período de 28 dias. Determina-se o consumo de oxigénio, medindo a quantidade de oxigénio (produzido electroliticamente) necessária para manter constante o volume de gás 
no frasco do respirómetro, ou, em alternativa, recorrendo à variação 
de volume ou de pressão (ou a uma combinação de ambas) no aparelho. O dióxido de carbono libertado é absorvido por uma so ­
lução de hidróxido de potássio ou por outro absorvente adequado. A 
quantidade de oxigénio consumida pela substância química de ensaio 
(corrigida em função do consumo paralelo do branco de inóculo) exprime-se em percentagem de CTeO ou CQO. Facultativamente, a biodegradação primária também pode ser calculada através de 
uma análise específica suplementar, efectuada no início e no fim 
da incubação, e a biodegradação total por análise do COD.
 
V.2. DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
V.2.1.  Equipamento  
a) Respirómetro adequado;  
b) Controlo de temperatura, a ± 1  o C ou mais precisa;  
c) Dispositivo de filtração por membranas (facultativo);  
d) Analisador de carbono (facultativo).  
V.2.2.  Preparação do meio mineral  
Para a preparação das soluções de reserva ver ponto I.6.2.  
Misturar 10 ml da solução (a) com 800 ml de água de diluição, 
adicionar 1 ml das soluções (b) a (d) e ajustar o volume a 1 litro 
com água de diluição.  
V.2.3.  Preparação e pré-condicionamento do in όculo 
O inóculo pode ser obtido de várias origens: lamas activadas; efluen ­
tes de esgotos; águas de superfície; solos ou misturas destes.  
Ver pontos I.6.4, I.6.4.1, I.6.4.2 e I.6.5.  
V.2.4.  Preparação dos frascos  
Preparar soluções das substâncias químicas de ensaio e de referência, 
em lotes separados, em meio mineral, com uma concentração, em 
geral, de 100 mg de substância química/l, para dar pelo menos 50- 
-100 mg de CTeO/l, utilizando as soluções de reserva.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1003
 
Calcular o valor de CTeO com base na formação de sais de amónio, 
a não ser que se preveja a existência de nitrificação, caso em que o 
cálculo deverá basear-se na formação de nitrato (ver apêndice 2.2).  
Determinar os valores do pH e, se necessário, ajustá-los a 7,4 ± 0,2.  
As substâncias pouco solúveis devem ser adicionadas numa fase 
posterior (ver adiante).  
No caso de se pretender determinar a toxicidade da substância quí ­
mica de ensaio, preparar outra solução em meio mineral, contendo as substâncias químicas de ensaio e de referência em concentrações 
idênticas às das soluções individuais.
 
Se for necessário efectuar a medição do consumo físico-químico de 
oxigénio, preparar uma solução da substância química de ensaio, 
normalmente na concentração de 100 mg de CTeO/l, previamente esterilizada por adição de uma substância tóxica adequada (ver I.6.6).
 
Introduzir o volume necessário das soluções das substâncias de en ­
saio e de referência nos frascos correspondentes, pelo menos em duplicado. Adicionar a outros frascos apenas meio mineral (para os controlos de in όculo) e, se necessário, a solução mista das substân ­
cias químicas de ensaio/referência e a solução estéril.
 
Se a substância química de ensaio for pouco solúvel, adicioná-la 
directamente nesta fase, tomando como base a massa ou o volume, 
ou proceder conforme descrito no apêndice 3. Adicionar hidróxido de potássio, grânulos de soda ou outro absorvente aos compartimen ­
tos do dispositivo de absorção de CO
 2 . 
V.2.5.  Número de frascos numa experiência-tipo  
De preferência:  
Frascos 1 e 2: suspensão de ensaio;  
Frascos 3 e 4: branco do in όculo;  
Frasco 5: controlo;  
Se necessário, ainda:  
Frasco 6: controlo abiótico estéril;  
Frasco 7: controlo da toxicidade.  
Ver também o ponto I.6.7.  
V.2.6.  Realização do ensaio  
Deixar que os recipientes atinjam a temperatura desejada e inocular 
os recipientes adequados com as lamas activadas preparadas ou com outra fonte de in όculo, para se obter uma concentração de substân ­
cias sólidas em suspensão não superior a 30 mg/l. Montar o equi ­
pamento, iniciar a agitação, verificar a estanquidade e começar a medir o consumo de oxigénio. Normalmente, não é necessária maior atenção do que efectuar as leituras necessárias e efectuar verificações 
diárias para se poder actuar no sentido de se manter a temperatura 
correcta e uma agitação adequada.
 
Calcular o consumo de oxigénio a partir das leituras efectuadas a 
intervalos de tempo regulares e frequentes, utilizando os métodos 
fornecidos pelo fabricante do equipamento. No final da incubação, normalmente decorridos 28 dias, medir o valor do pH do conteúdo dos frascos, especialmente no caso de os consumos de oxigénio 
serem baixos ou superiores ao valor da CTeO
 NH4 (para os compostos 
que contêm azoto).  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1004
 
Se necessário, retirar amostras dos frascos do respirómetro, na fase ini ­
cial e na fase final, para análise do COD ou da substância química 
específica (ver apêndice 2.4). No momento da recolha da amostra inicial, garantir que se conhece o volume da suspensão de ensaio que permanece no frasco. Quando o oxigénio é consumido por uma substância de ensaio 
que contenha azoto, determinar o acréscimo da concentração de nitrito e 
de nitrato ao longo de 28 dias e calcular a correcção decorrente do oxigénio consumido por nitrificação (apêndice 5).
 
V.3. RESULTADOS E RELATÓRIO  
V.3.1.  Tratamento dos resultados  
Dividir o consumo de oxigénio (mg) da substância química de ensaio 
decorrido um determinado período (corrigido em função do branco 
de inόculo de controlo correspondente ao mesmo período) pela 
massa da substância química de ensaio utilizada. Deste modo, ob ­
tém-se o valor CBO, expresso em mg de oxigénio/mg de substância química de ensaio, ou seja:
 
CBO ¼ ðmg O  2 consumido pela subst : de ensaio − mg O  2 consumido pelo branco Þ 
ðmg de substância de ensaio no frasco Þ 
= mg de O  2 por mg de substância de ensaio no frasco  
Calcula-se a percentagem de biodegradação pela expressão:  
% de biodegradação  ¼ % CTeO ¼ CBO ðmg O  2=mg de substância química Þ 
CTeO ðmg O  2 de substância química Þ Ü 100 
ou pela expressão:  
% CQO ¼ CBOðmg O  2=mg de substância química Þ 
CQOðmg O  2 de substância química Þ Ü 100 
Note-se que estes dois métodos não conduzirão necessariamente ao 
mesmo valor, sendo preferível utilizar o primeiro.  
Utilizar o valor apropriado da CTeO (NH  4 ou NO  3 ), consoante se 
conheça ou se preveja a ocorrência da nitrificação (apêndice 2.2). Se ocorrer nitrificação mas esta não for completa, calcular a correcção decorrente do oxigénio consumido por nitrificação, a partir das va ­
riações na concentração de nitrito e nitrato (apêndice 5).
 
Quando se fazem determinações facultativas de carbono orgânico 
e/ou de substâncias químicas específicas, calcular a percentagem 
de degradação conforme descrito no ponto I.7.  
Registar todos os resultados nas folhas de dados anexas.  
V.3.2.  Validade dos resultados  
O consumo de oxigénio pelo branco de inóculo é, normalmente, de 
20-30 mg de O  2 /l e não deverá ser superior a 60 mg/l em 28 dias. Os 
valores superiores a 60 mg/l exigem uma análise crítica dos resulta ­
dos e das técnicas experimentais. Se o valor do pH estiver fora do 
intervalo 6-8,5 e se o consumo de oxigénio pela substância química 
de ensaio for inferior a 60 %, o ensaio deve ser repetido com uma concentração inferior de substância química de ensaio.
 
Ver também o ponto I.5.2.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1005
 
V.3.3.  Relatório  
Ver ponto I.8.  
V.4. FOLHA DE DADOS  
Como exemplo de folha de dados apresenta-se a seguinte:  
ENSAIO DE RESPIROMETRIA MANOMÉTRICA  
1. LABORATÓRIO  
2. DATA DO INÍCIO DO ENSAIO  
3. SUBSTÂNCIA DE ENSAIO  
Nome:  
Concentração da solução de reserva: ... mg/l  
Concentração inicial no meio, C  o : ...mg/l  
Volume no frasco de ensaio (V): ...ml  
CTeO ou CQO: ...mg O  2 /mg de substância de ensaio (NH  4 , 
NO  3 ) 
4. INÓCULO  
Origem: ...  
Tratamento efectuado: ...  
Pré-condicionamento, se o houver: ...  
Concentração das substâncias sólidas em suspensão na mistura 
reaccional: ...mg/l  
5. CONSUMO DE OXIGÉNIO: BIODEGRADABILIDADE  
Tempo (días) 
0 7 14 21 28  
O 2 consumido 
(mg), substân ­
cia de ensaio 1 
2 
a, média 
O 2 consumido 
(mg) branco 3 
4 
b, média 
CBO corrigida 
(mg) (a 1 – b  m ) 
(a 2 – b  m ) 
CBO por mg 
de substância de ensaio
 ða 1 Ä bÞ 
C o V 
ða 2 Ä bÞ 
C o V ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1006
 
Tempo (días) 
0 7 14 21 28  
% degradação  
CBO 
CTeO Ü 100 D 1 (a 1 ) 
D 2 (a 2 ) 
Média (*)  
V = volume de meío no frasco de ensaio. 
(*) D  1 e D  2 não devem ser ponderados, se há uma diferença considerável.  
N.B: Podem ser utilizados esquemas idênticos para a substância 
química de referência e para os controlos de toxicidade.  
6. CORRECÇÃO PARA A NITRIF1CAÇÃO  (ver apêndice 5)  
Dia 0 28 Diferença  
i) Concentração de nitrato (mg N/l) (N) 
ii) Equivalente de oxigénio (4,57 X N × V) (mg) — — 
iii) Concentração de nitrito (mg N/l) (N) iv) Equivalente de oxigénio (3,43 × N X V) (mg) — — ii) + iv) Total de equivalente de oxigénio — —
 
7. ANÁLISE DO CARBONO  (facultativa)  
Analisador de carbono:  
Tempo (dia) Branco mg/l Substância química de ensaio mg/l  
0 C  b(o) C o 
28 (*) C  b(t) C t 
(*) ou no final da incubação.  
% de COD removido  ¼ 1 Ä C t Ä C blt 
C o Ä C blo Í Î 
Ü 100 
8. SUBSTÂNCIA QUÍMICA ESPECÍFICA  (facultativo)  
S b = concentração no controlo físico-químico (estéril) decor ­
ridos 28 dias,  
S a = concentração no frasco inoculado decorridos 28 dias,  
% de biodegradação  ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
9. DEGRADAÇÃO ABIÓT1CA  (facultativo)  
a = consumo de oxigénio em frascos estéreis decorridos 28 
dias (mg) 
consumo de oxigénio por mg de substância química de ensaio  ¼ a Ü 100 
C o V ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1007
 
(ver secções 1 e 3),  
% de degradação abiótica  ¼ a Ü 100 
C o V Ü CTeO  
PARTE VI.  ENSAIO EM FRASCO FECHADO  (métodoC.4-E)  
VI.1. PRINCÍPIO DO MÉTODO  
Faz-se a inoculação da solução da substância química de ensaio em 
meio mineral, normalmente na concentração de 2-5 mg/l, utilizando 
um número relativamente pequeno de microorganismos provenientes 
de uma população mista e mantém-se em frascos fechados, comple ­
tamente cheios, ao abrigo da luz e a uma temperatura constante. 
Acompanha-se a degradação pela análise do oxigénio dissolvido ao 
longo de um período de 28 dias. A quantidade de oxigénio consu ­
mido pela substância química de ensaio, corrigida em função do consumo paralelo do branco de inóculo, exprime-se em percentagem 
dos valores CTeO ou CQO.
 
VI.2. DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
VI.2.1.  Equipamento  
a) Frascos para CBO com rolhas de vidro, por exemplo, com a 
capacidade de 250-300 ml;  
b) Banho ou incubador, para manter os frascos a uma temperatura 
constante (± 1  o C ou mais precisa), ao abrigo da luz;  
c) Frascos de vidro grandes (2-5 1) para a preparação dos meios e 
para enchimento dos frascos para CBO;  
d) Eléctrodo de oxigénio e medidor, ou equipamento e reagentes 
para a titulação de Winkler.  
VI.2.2.  Preparação do meio mineral  
Para a preparação da solução de reserva ver ponto I.6.2.  
Misturar 1 ml das soluções (a) a (d) e ajustar o volume a 1 litro com 
água de diluição.  
VI.2.3.  Preparação do inóculo  
O inóculo é normalmente obtido dum efluente secundário duma 
estação de tratamento ou duma unidade laboratorial, que recebe pre ­
dominantemente esgotos domésticos. Uma origem alternativa para o inóculo é a água de superfície. Usa-se normalmente de uma gota 
(0,05 ml) a 5 ml de filtrado por litro de meio. Podem ser necessárias 
várias tentativas para se descobrir o volume óptimo de dado efluente (ver pontos I.6.4.2 e I.6.5).
 
VI.2.4.  Preparação dos frascos  
Arejar fortemente o meio mineral durante pelo menos 20 minutos. 
Efectuar cada série de ensaios com meio mineral proveniente do mesmo lote. De um modo geral, o meio estará pronto para utilização 
depois de ter estado em repouso durante 20 horas, à temperatura de 
ensaio. Determinar a concentração do oxigénio dissolvido para efei ­
tos de controlo; esse valor deve ser de aproximadamente 9 mg/l à temperatura de 20
 o C. Efectuar todas as operações de transferência e 
de enchimento de meio saturado com ar sem formação de bolhas, 
por exemplo, utilizando sifões.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1008
 
Paralelamente, preparar outros grupos de frascos para CBO, para a 
determinação das substâncias químicas de ensaio e de referência em 
séries experimentais simultâneas. Preparar um número suficiente de frascos para CBO, incluindo os brancos de inóculo, de modo que possam efectuar-se as medições de consumo de oxigénio, pelo me ­
nos em duplicado, com os intervalos de ensaio desejados, por exem ­
plo, decorridos 0, 7, 14, 21 e 28 dias. Para se assegurar a identifi ­
cação do período dos 10 dias, podem ser necessários mais frascos.
 
Adicionar meio mineral completamente arejado aos frascos grandes 
de modo que estes fiquem cheios até um terço. Adicionar depois 
quantidade suficiente das soluções de reserva da substância química de ensaio e da substância química de referência a frascos grandes distintos, de modo que a concentração final das substâncias químicas 
não seja normalmente superior a 10 mg/l. Não adicionar nenhuma 
substância química ao branco de controlo do meio, contido noutro frasco grande.
 
Para não se limitar a actividade do inóculo, garantir que a concen ­
tração do oxigénio dissolvido não desça abaixo de 0,5 mg/l nos 
frascos para CBO. Isto limita a concentração da substância química de ensaio a cerca de 2 mg/l. Contudo, nos casos de compostos dificilmente degradáveis e dos que têm um valor de CTeO baixo, 
pode prever-se 5-10 mg/l. Em alguns casos, é aconselhável efectuar 
uma série de experiências paralelas, com a substância química de ensaio em duas concentrações diferentes, por exemplo, 2 e 5 mg/l. Normalmente, calcula-se o valor da CTeO com base na formação de 
sais de amónio mas, se se souber que há nitrificação ou se esta for 
previsível, efectua-se o cálculo com base na formação de nitrato (CTeO
 NO3 : ver apêndice 2.2). Todavia, havendo nitrificação mas 
não sendo esta completa, efectua-se a correcção em função das va ­
riações da concentração de nitrito e de nitrato, determinadas por 
análise (ver apêndice 5).  
No caso de se pretender investigar a toxicidade da substância quí ­
mica de ensaio (por exemplo, no caso de se ter verificado previa ­
mente um fraco valor de biodegradabilidade), é necessária outra série 
de frascos.  
Preparar outro frasco grande para meio mineral arejado (cheio até um 
terço do seu volume), mais a substância química de ensaio e a 
substância química de referência com os valores finais de concen ­
tração, normalmente idênticos aos dos outros frascos grandes.  
Inocular as soluções dos frascos grandes com efluente secundário 
(uma gota, ou cerca de 0,05 ml, até 5 ml/l) ou de outra origem, 
tal como a água dos rios (ver ponto I.6.4.2). Finalmente, ajustar o volume das soluções com meio mineral arejado, utilizando um tubo que atinja o fundo do frasco de modo a obter-se uma mistura ade ­
quada.
 
VI.2.5.  Número de frascos numa experiência-tipo  
Numa experiência-tipo utilizam-se os frascos seguintes:  
— pelo menos 10 contendo a substância química de ensaio e o 
inóculo (suspensão de ensaio),  
— pelo menos 10 contendo apenas inóculo (branco de inóculo),  
— pelo menos 10 contendo a substância química de referência e o 
inóculo (controlo),  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1009
 
— e, se necessário, seis frascos contendo a substância química de 
ensaio, a substância química de referência e o inóculo (controlo 
de toxicidade). Contudo, para se assegurar a identificação do período dos 10 dias, será necessário utilizar o dobro dos frascos.
 
VI.2.6. Realização do ensaio  
Distribuir imediatamente cada solução preparada pelo respectivo grupo 
de frascos para CQO, utilizando um tubo que mergulhe até um quarto do fundo (e não no fundo) do frasco grande, de modo que todos os frascos 
para CQO fiquem completamente cheios. Bater suavemente para remo ­
ver quaisquer bolhas de ar. Verificar, logo no momento inicial, a exis ­
tência de oxigénio dissolvido nos frascos, recorrendo a análises, pelos métodos de Winkler ou do eléctrodo. O conteúdo dos frascos pode ser 
conservado para análise posterior pelo método de Winkler, adicionando 
sulfato de manganés (II) e hidróxido de sódio (o primeiro é o reagente de Winkler). Armazenar os frascos cuidadosamente tapados, contendo o oxigénio retido na forma de óxido de manganés (III) hidratado, que é 
castanho, ao abrigo da luz e à temperatura de 10
 o C-20  o C, durante um 
período inferior a 24 horas, antes de continuar com os outros passos do método de Winkler. Rolhar os restantes frascos em duplicado, garantindo que não contêm bolhas de ar, e incubar à temperatura de 20
 o C, ao abrigo 
da luz. Cada série deve ser acompanhada por uma outra série paralela 
completa, para as determinações no branco de meio inoculado. De cada série, retirar pelo menos dois frascos idênticos para análise do oxigénio 
dissolvido, a intervalos de tempo regulares (pelo menos semanalmente) 
durante os 28 dias de incubação.
 
A amostragem semanal deve permitir avaliar a remoção percentual 
num período de 14 dias, ao passo que as amostras recolhidas cada três, quatro dias devem permitir identificar o período dos 10 dias, o 
que exigirá o dobro dos frascos.
 
Para as substâncias de ensaio que contêm azoto, devem ser feitas 
correcções que dêem conta do consumo de oxigénio provocado por qualquer fenómeno de nitrificação que possa ocorrer. Para efectuar esta operação, recorrer ao método do eléctrodo de O
 2 para a deter ­
minação da concentração do oxigénio dissolvido e, depois, retirar 
uma amostra do frasco para a CBO, para a análise de nitrito e de nitrato. A partir do acréscimo na concentração de nitrito e de nitrato, calcular o oxigénio utilizado (ver apêndice 5).
 
VI.3. RESULTADOS E RELATÓRIO  
VI.3.1.  Tratamento dos resultados  
Calcular primeiro a CBO que se manifesta após cada período, subtraindo 
a redução de oxigénio (mg de O  2 /l) no branco de inóculo do valor 
determinado para a substância química de ensaio. Dividir esta redução corrigida pela concentração (mg/l) da substância química de ensaio, para 
se obter o valor CBO específico, em miligrama de oxigénio por mili ­
grama de substância química de ensaio. Calcular a percentagem de bio ­
degradabilidade, dividindo o valor CBO específico pelo valor CTeO específico (calculado em conformidade com o apêndice 2.2) ou pelo 
valor CQO (determinado por análise, ver apêndice 2.3) ou seja:
 
CBO ¼ ðmg O  2 consumido pela subst : de ensaio − mg O  2 consumido pelo branco Þ 
ðmg de substância de ensaio no frasco Þ ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1010
 
= mg de O  2 por mg de substância de ensaio  
% de degradação ¼ CBO ðmg O  2=mg de substância de ensaio Þ 
CTeO ðmg O  2= mg de substância de ensaio Þ Ü 100 
ou 
% de degradação ¼ CBO ðmg O  2=mg de substância de ensaio Þ 
CQO ðmg O  2= mg de substância de ensaio Þ Ü 100 
Note-se que estes dois métodos não conduzirão necessariamente ao 
mesmo valor, sendo preferível utilizar o primeiro.  
Para as substâncias de ensaio que contêm azoto, utilizar os valores 
CTeO adequados (NH  4 ou NO  3 ) conforme exista ou se admita que 
possa ocorrer nitrificação (apêndice 2.2). Se houver nitrificação, não 
sendo esta completa, calcular a correcção decorrente do oxigénio 
consumido por nitrificação, a partir da variação na concentração de nitrito e de nitrato (apêndice 5).
 
VI.3.2.  Validade dos resultados  
A redução do oxigénio no branco de inóculo não deve exceder 1,5 
mg de oxigénio dissolvido/l decorridos 28 dias. Valores superiores a 
esse exigem uma análise cuidadosa das técnicas experimentais. A concentração de oxigénio residual nos frascos de ensaio não deverá descer abaixo de 0,5 mg/litro em nenhuma ocasião. Esses níveis 
baixos de oxigénio apenas são válidos se o método utilizado para 
a determinação do oxigénio dissolvido permitir medir tais níveis com exactidão.
 
Ver também o ponto I.5.2.  
VI.3.3.  Relatório  
Ver I.8.  
VI.4. FOLHA DE DADOS  
Como exemplo de folha de dados apresenta-se a que se segue.  
ENSAIO DO FRASCO FECHADO  
1. LABORATÓRIO  
2. DATA DO INÍCIO DO ENSAIO  
3. SUBSTÂNCIA DE ENSAIO  
Nome: ...  
Concentração da solução de reserva: ... mg/l  
Concentração inicial no frasco: ... mg/l  
CTeO ou CQO: mg 0  2 /mg de substância de ensaio  
4. INÓCULO  
Origem: ...  
Tratamento efectuado: ...  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1011
 
Pré-condicionamento, se o houver: ...  
Concentrações das substâncias sólidas em suspensão na mistura 
reaccional: ... ml/l  
5. DETERMINAÇÕES DO OD  
Método: Winkler/eléctrodo.  
Análises em frasco  
Tempo de incubação (d) DO (mg/l) 
0 n  1 n 2 
Branco (sem substân ­
cia química) 1 C  1 
2 C  2 
Média 
m b ¼ C 1 þ C 2 
2 
Substância de ensaio 1 a  1 
2 a  2 
Média 
m t ¼ a 1 þ a 2 
2 
NB: Podem ser utilizados esquemas idênticos para a substância quí ­
mica de referência e para os controlos de toxicidade  
6. CORRECÇÃO DEVIDA A NITRIFICAÇÃO  (ver apêndice 5)  
Tempo de incubação (d) 0 n  1 n 2 n 3 
i) Concentração de nitrato (mg N/l) 
ii) Variação na concentração de nitrato (mg N/l) — iii) Equivalente de oxigénio (mg/l) — iv) Concentração de nitrito (mg N/l) v) Variação na concentração de nitrito (mg N/l) — vi) Equivalente de oxigénio (mg/l N/l) — iii) + vi) Equivalente de oxigénio total (mg/l) —
 
7. REDUÇÃO DO OD: % DE DEGRADAÇÃO  
Redução decorridos n dias (mg/l)) 
n 1 n 2 n 3 
Frasco 1: (m  to - m  tx ) - (m  bo - m  bx ) 
Frasco 2: (m  to - m  tx ) - (m  bo - m  bx ) ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1012
 
Redução decorridos n dias (mg/l)) 
n 1 n 2 n 3 
Frasco 1: 
% D  1 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ 
conc : de ensaio Ü CTeO da subs : quím : Ü 100 
Frasco 2: 
% D  2 ¼ ½ðm to Ä m tx Þ Ä ðm bo Ä m bx Þâ 
conc : de ensaio Ü CTeO da subs : quím : Ü 100 
% D média (*) =  D 1 Ä D 2 
2 
(*) Não retomar o valor médio, se existirem diferenças consideráveis entre os duplicados.  
m to = valor no frasco de ensaio no tempo 0,  
m tx = valor no frasco de ensaio no tempo x,  
m bo = valor médio do branco no tempo 0,  
m bx = valor médio do branco no tempo x.  
Aplicar também a correcção decorrente da nitrificação, com base em 
iii) + vi) da secção 6.  
8. REDUÇÕES DE OD NO BRANCO  
Consumo de oxigénio no branco: (m  bo - m  b28 ) mg/l. Este con ­
sumo é importante para a validade do ensaio. Deve ser inferior 
a 1,5 mg/l.  
PARTE VII.  ENSAIO DE MITI  (método C.4-F)  
VII.1. PRINCÍPIO DO MÉTODO  
Mede-se automaticamente a absorção de oxigénio por uma solução 
ou suspensão agitada, contendo a substância química de ensaio num 
meio mineral, inoculada com microorganismos inadaptados e espe ­
cialmente desenvolvidos, durante um período de 28 dias, num res ­
pirómetro encerrado, ao abrigo da luz e à temperatura de 25 ± 1  o C. 
A absorção do dióxido de carbono libertado faz-se com cal sódica. 
Exprime-se a biodegradabilidade pela percentagem do consumo de oxigénio (corrigida em função do consumo do branco) em relação ao consumo teórico (CTeO). Calcula-se também a percentagem de bio ­
degradabilidade primária, a partir de uma análise química específica 
complementar, efectuada no início e no fim da incubação, por exem ­
plo, por análise do COD.
 
VII.2. DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
VII.2.1.  Equipamento  
a) Medidor de CBO electrolítico automático ou respirómetro, nor ­
malmente equipado com seis frascos de 300 ml cada um e tam ­
bém equipado com recipientes para o absorvente de CO  2 ; ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1013
 
b) Sal. de temperatura constante e/ou banho à temperatura de 
25 ± 1  o C ou mais precisa;  
c) Dispositivo de filtração por membranas (facultativo);  
d) Analisador de carbono (facultativo).  
VII.2.2.  Preparação do meio mineral  
Preparar as seguintes soluções de reserva, utilizando reagentes de 
qualidade analítica e água (ponto I.6.1): 
a) Dihidrogeno-ortofosfato monopotássico, KH  2 PO 4 8,50 g 
Monohidrogeno-ortofosfato dipotássico, K  2 HPO  4 21,75 g 
Monohidrogeno-ortofosfato dissódico dodecahi ­
dratado, Na  2 HPO  4 12 H  2 O 44,60 g 
Cloreto de amónio, NH  4 Cl 1,70 g 
Dissolver em água e ajustar o volume a 1 litro. O valor do pH da solução deve ser de 7,2; 
b) Sulfato de magnésio heptahidratado, MgSO
 4 7 
H 2 O 22,50 g 
Dissolver em água e ajustar o volume a 1 litro; 
c) Cloreto de cálcio anidro, CaCl  2 27,50 g 
Dissolver em água e ajustar o volume a 1 litro; 
d) Cloreto de ferro (III) hexahidratado, FeCl  3 . 6 H  2 O 0,25 g 
Dissolver em água e ajustar o volume a 1 litro.  
Retirar 3 ml de cada uma das soluções a), b), c) e d) e ajustar o 
volume a 1 litro.  
VII.2.3.  Preparação do inóculo  
Recolher amostras recentes em pelo menos dez locais, sobretudo em 
áreas onde sejam utilizados e descarregados diversos produtos quí ­
micos. Em locais tais como as estações de tratamento de águas 
residuais, estações de tratamento de esgotos industriais, rios, lagos, 
mar, recolher 1 litro de amostras de lamas, solo superficial, água, etc., e misturar tudo muito bem. Após a remoção dos materiais flutuantes, deixar repousar e ajustar o pH do sobrenadante a 7 ± 
1, utilizando hidróxido de sódio ou ácido fosfórico.
 
Utilizar um volume adequado de sobrenadante filtrado para encher 
um recipiente próprio para lamas activadas com dispositivo de en ­
chimento e esvaziamento. Arejar o líquido durante cerca de 23,5 
horas. Trinta minutos após a interrupção do arejamento, rejeitar cerca de um terço do volume total do sobrenadante e adicionar igual volume de uma solução (pH 7) contendo glucose, peptona e orto ­
fosfato monopotássico de concentração 0,1 % em qualquer destes 
componentes, ao material sedimentado, e recomeçar o processo de arejamento. Repetir este procedimento uma vez por dia. A unidade de lamas deve operar de acordo com as seguintes boas práticas: os 
efluentes deverão ser límpidos, a temperatura deverá ser mantida a 
25 ± 2
 o C e o pH deverá ser 7 ± 1, a sedimentação das lamas deverá 
ser boa, arejamento suficiente para manter a mistura permanente ­
mente em condições aeróbias, presença de protozoários, devendo 
testar-se a actividade das lamas por comparação com uma substância 
de referência, pelo menos cada três meses. Não utilizar lamas como inóculo sem que tenha decorrido pelo menos um mês de operação, mas não mais do que quatro meses. Seguidamente, colher amostras 
em pelo menos 10 locais a intervalos regulares, uma vez em cada 
três meses.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1014
 
Para se manter a mesma actividade nas lamas frescas e nas antigas, 
misturar o sobrenadante filtrado de lamas activadas em utilização 
com igual volume de sobrenadante filtrado de uma mistura recente ­
mente obtida a partir de dez origens e fazer a cultura do caldo combinado conforme anteriormente descrito. Recolher as lamas 
para utilização como inóculo decorridas 18-24 horas sobre a alimen ­
tação da unidade de lamas.
 
VII.2.4.  Preparação dos frascos  
Preparar os seis frascos seguintes:  
N. o 1: substância química de ensaio em água de diluição, a 100 mg/l  
N. os 2, 3 e 4: substância química de ensaio em meio mineral, a 
100 mg/l  
N. o 5: substância química de referência (por exemplo, anilina) em 
meio mineral, a 100 mg/l  
N. o 6: apenas meio mineral  
Adicionar directamente as substâncias químicas de ensaio pouco 
solúveis, com base na sua massa ou volume ou proceder conforme 
descrito no apêndice 3, com a excepção de não ser conveniente utilizar nem solventes nem agentes emulsionantes. Adicionar o ab ­
sorvente de CO
 2 a todos os frascos, colocando-o nos recipientes 
especiais existentes. Ajustar o valor do pH a 7,0, nos frascos n.  os 
2, 3 e 4.  
VII.2.5.  Realização do ensaio  
Inocular os frascos n.  os 2, 3 e 4 (suspensões de ensaio), n.  o 5 (con­
trolo de actividade) e n.  o 6 (branco de inóculo) com um pequeno 
volume de inóculo, para se obter uma concentração de sólidos em suspensão de 30 mg/l. Não se adiciona nenhum inóculo ao frasco n.
 o 1, que serve como controlo abiótico. Montar o equipamento, 
verificar a sua estanquidade, pôr os agitadores em movimento e 
começar a medição do consumo de oxigénio ao abrigo da luz. Ve ­
rificar diariamente a temperatura, os agitadores e o registador cou ­
lombimétrico do consumo de oxigénio, e registar quaisquer modifi ­
cações de cor no conteúdo dos frascos. Fazer a leitura dos consumos 
de oxigénio referentes aos seis frascos directamente, por um método apropriado, por exemplo a partir dos seis gráficos do registador das curvas de CBO. No final da incubação, normalmente decorridos 28 
dias, medir o valor do pH do conteúdo dos frascos e determinar a 
concentração residual da substância química de ensaio e de qualquer produto intermediário e, no caso de substâncias solúveis na água, a concentração do COD (apêndice 2.4). Tomar precauções especiais no 
caso das substâncias químicas voláteis. No caso de se prever nitrifi ­
cação, determinar a concentração de nitrato e de nitrito, se possível.
 
VII.3. RESULTADOS E RELATÓRIO  
VII.3.1.  Tratamento dos resultados  
Dividir o consumo de oxigénio (mg) da substância química de en ­
saio, correspondente a um determinado período, pela massa da subs ­
tância química de ensaio utilizada, corrigindo aquele com o valor referente ao branco de inóculo de controlo correspondente ao mesmo 
período. Obtém-se assim a CBO, expressa em mg de oxigénio/mg de 
substância química de ensaio, ou seja:
 
CBO ¼ ðmg O  2 consumido pela subst : de ensaio − mg O  2 consumido pelo branco Þ 
ðmg de substância de ensaio no frasco Þ 
= mg de O  2 /mg de substância de ensaio  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1015
 
Deste modo, obtém-se a percentagem de biodegradação pela expres ­
são: 
% biodegradação ¼ % CTeO ¼ CBO ðmg O  2=mg de substância química Þ 
CTeO ðmg O  2= mg de substância química Þ Ü 100 
Para misturas, calcular a CTeO por análise elementar, tal como para 
um composto único. Utilizar o valor de CTeO adequado (CTeO  NH4 
ou CTeO  NO3 ) consoante não haja nitrificação ou esta seja completa 
(apêndice 2.2). Todavia, se houver nitrificação mas se esta for in ­
completa, efectuar uma correcção decorrente do oxigénio consumido por nitrificação, calculado a partir das variações nas concentrações de nitrito e de nitrato (apêndice 5).
 
Calcular a percentagem de biodegradação primária a partir das per ­
das da substância química específica (original) (ver ponto I.7.2).  
D t ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 %  
Se tiver havido uma perda de substância química de ensaio no frasco 
n. o 1, medir a variação físico-química, registar esse facto e utilizar a 
concentração da substância química de ensaio (Sb) decorridos 28 
dias, nesse frasco, para calcular a percentagem de biodegradação.  
No caso de se efectuarem determinações de COD (facultativas), 
calcular a percentagem de biodegradação final pela expressão:  
D t ¼ 1 Ä C t Ä C bt 
C o Ä C bo Í Î 
Ü 100 %  
conforme descrito no ponto I.7.1. Se tiver havido uma perda de COD 
no frasco n.  o 1, ao medir-se a remoção por via físico-química, deve 
utilizar-se a concentração de GOD nesse frasco para calcular a per ­
centagem de biodegradação.  
Registar todos os resultados na folha de dados anexa.  
VII.3.2.  Validade dos resultados  
O oxigénio consumido pelo branco de inóculo é, normalmente, de 
20-30 mg de O  2 /l e não deverá ser superior a 60 mg/l em 28 dias. Os 
valores superiores a 60 mg/l exigem uma análise crítica dos resulta ­
dos e das técnicas experimentais. No caso de o valor do pH estar fora do intervalo 6-8,5 e se o oxigénio consumido pela substância de ensaio for inferior a 60 %, o ensaio deverá ser repetido com uma 
concentração inferior de substância química de ensaio.
 
Ver também o ponto I.5.2.  
Se a percentagem de degradação da anilina, calculada a partir do 
consumo de oxigénio, não exceder 40 %, decorridos sete dias, e 65 %, decorridos catorze dias, o ensaio não deve ser considerado 
válido.
 
VII.3.3.  Relatório  
Ver ponto I.8.  
VII.4. FOLHA DE DADOS  
Como exemplo de folha de dados apresenta-se a seguinte:  
ENSAIO DO MITI (I)  
1. LABORATÓRIO  
2. DATA DO INÍCIO DO ENSAIO  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1016
 
3. SUBSTÂNCIA DE ENSAIO  
Nome:  
Concentração da solução de reserva: mg/l da substância  
Concentração inicial no meio, C  o : mg/l da substância  
Volume da mistura reaccional: ml  
CTeO: mg O  2 /l 
4. INÓCULO  
Locais de colheita das amostras de lama: 
1. ... 6. ... 
2. ... 7. ... 
3. ... 8. ... 
4. ... 9. ... 5. ... 10. ...
 
Concentração de sólidos em suspensão nas lamas activadas 
depois de aclimatização com águas residuais sintéticas = mg/l,  
Volume de lamas activadas por litro de meio final = ml,  
Concentração de lamas no meio final = mg/l.  
5. CONSUMO DE OXIGÉNIO: BIODEGRADABILIDADE  
Tipo de respirómetro utilizado:  
Tempo (dias) 
0 7 14 21 28  
O 2 consumido 
(mg) pela subs ­
tância de ensaio a 1 
a 2 
a 3 
O 2 consumido 
(mg) pelo branco b 
O 2 consumido 
(mg) corrigido (a 1 - b) 
(a 2 - b) 
(a 3 - b) 
CBO por mg de 
substância química 
de ensaio ða Ä bÞ 
C o V Frasco 1 
Frasco 2 Frasco 3 
% de degradação
 
CBO 
CTeO Ü 100 1 
2 3 
média (*)
 
(*) Não retomar o valor médio, se existirem diferenças consideráveis entre os duplicados.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1017
 
NB: Podem ser utilizados esquemas idênticos para a substância quí ­
mica de referência.  
6. ANÁLISE DE CARBONO  (opcional)  
Analisador de carbono:  
Frasco COD % de COD 
removido Média 
Medido Corrigido  
Água + substância de ensaio a — — 
Lamas + substância de ensaio b  1 b 1 - c 
Lamas + substância de ensaio b  2 b 2 - c 
Lamas + substância de ensaio b  3 b 3 - c 
Branco de controlo c — — —  
% de COD removido  a 1 Ä ðb Ä cÞ 
a Ü 100 
7. DADOS ANALÍTICOS ESPECÍFICOS DA SUBSTÂNCIA 
QUÍMICA  
Quantidade residual de substância de 
ensaio no final do teste % de degradação  
ensaio em branco com água S  b 
meio inoculado S a1 
S a2 
S a3 
% de degradação ¼ S b Ä S a 
S b Ü 100 
Calcular a percentagem de degradação para os frascos a  1 , a 2 e 
a 3 , respectivamente.  
8. OBSERVAÇÕES  
Deve anexar-se a curva de CBO em função do tempo, se 
existir.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1018
 
Apêndice 1  
ABREVIATURAS E DEFINIÇÕES  
OD: O oxigénio dissolvido (mg/l) é a concentração do oxigénio dissolvido 
numa amostra aquosa.  
CBO: A carência bioquímica de oxigénio (g) é a quantidade de oxigénio 
consumida pelos microorganismos ao metabolizarem um composto de ensaio; também se exprime em g de oxigénio consumido por g de composto de ensaio (ver método C.5).
 
CQO: A carência química de oxigénio (g) é a quantidade de oxigénio consu ­
mida durante a oxidação de um composto de ensaio com dicromato ácido a quente; permite medir a quantidade de matérias oxidáveis pre ­
sentes; também se exprime em g de oxigénio consumido por g de 
composto de ensaio (ver método C.6).
 
COD: O carbono orgânico dissolvido é o carbono orgânico presente na solu ­
ção ou que passa através de um filtro de 0,45 microns ou que per ­
manece no sobrenadante após centrifugação a 40 000 m.s  -2 (± 4 000 
g) durante 15 minutos.  
CTeO: A carência teórica de oxigénio (mg) é a quantidade de oxigénio neces ­
sária para oxidar completamente uma substância química; calcula-se a 
partir da fórmula molecular (ver apêndice 2.2) e também se exprime em mg de oxigénio necessário por mg de composto de ensaio.
 
CO 2 Te: O dióxido de carbono teórico (mg) é a quantidade calculada do dióxido 
de carbono que seria produzido a partir do teor de carbono medido ou 
conhecido do composto de ensaio, quando totalmente mineralizado; também se exprime em mg de dióxido de carbono libertado por mg de composto de ensaio.
 
COT: O carbono orgânico total de uma substância é a soma do carbono 
orgânico em solução e em suspensão.  
CI: Carbono inorgânico.  
CT: Carbono total, é a soma do carbono orgânico e inorgânico presente na 
amostra.  
Biodegradação primária:  
é a alteração da estrutura química de uma substância efectuada por acção bioló ­
gica, tendo como resultado a perda de propriedades específicas dessa substância.  
Biodegradação total (aeróbia):  
é o nível de degradação alcançado quando o composto de ensaio é totalmente 
utilizado pelos microorganismos, produzindo dióxido de carbono, água, sais minerais e novos constituintes celulares microbianos (biomassa).
 
Facilmente biodegradável:  
é uma classificação arbitrária para as substâncias químicas que passaram nos 
diversos ensaios específicos de despiste da biodegradabilidade total; dado que 
esses ensaios são tão exigentes, assumiu-se que essas substâncias serão biode ­
gradadas fácil e completamente em ambiente aquático, sob condições aeróbias.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1019
 
Intrinsecamente biodegradável:  
é uma classificação de substâncias químicas relativamente às quais existem pro ­
vas inequívocas de biodegradação (primária e total) num qualquer ensaio reco ­
nhecido de biodegradabilidade.  
Tratáveis:  
é a possibilidade de certos compostos serem removidos durante o tratamento 
biológico de águas residuais sem afectarem desfavoravelmente o funcionamento normal do processo de tratamento. De um modo geral, os compostos facilmente biodegradáveis são tratáveis mas o mesmo não sucede com todos os compostos 
intrinsecamente biodegradáveis. Também podem ser utilizados processos abióti ­
cos.
 
Tempo de latência:  
é o tempo decorrido desde a inoculação, num ensaio de redução gradual, até que 
a percentagem de degradação tenha aumentado pelo menos até 10 %. O tempo de 
latência é normalmente bastante variável e pouco reprodutível.  
Tempo de degradação:  
é o tempo decorrido desde o final do tempo de latência até ao momento em que 
se atinge 90 % do nível máximo de degradação.  
Período dos dez dias:  
é o período de dez dias que se segue imediatamente a um nível de degradação de 
10 %.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1020
 
Apêndice 2  
CÁLCULO E DETERMINAÇÃO DE PARÂMETROS 
CARACTERÍSTICOS ADEQUADOS  
Consoante o método escolhido, assim serão necessários determinados parâmetros 
característicos. Na secção seguinte descreve-se o modo de obter esses valores. A 
utilização desses parâmetros foi descrita em cada um dos métodos.  
1. Teor de carbono  
Calcula-se o teor de carbono a partir da composição elementar conhecida 
ou determina-se por análise elementar da substância de ensaio.  
2. Carência teórica de oxigénio (CTeO)  
A carência teórica de oxigénio (CTeO) pode ser calculada se for conhecida 
a composição elementar ou pode ser determinada por análise elementar. Para o seguinte composto genérico
 
C c H h Cl cl N n Na na O o P p S s sera:  
sem nitrificação,  
ThOD  NH4 ¼ 16 ½2 c þ 1=2 ðh Ä cl Ä 3 nÞ þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
Massa molecular mg=mg 
ou, com nitrificação,  
ThOD  NO3 ¼ 16 ½2 c þ 1=2 ðh Ä clÞ þ 5=2 n þ 3 s þ 5=2 p þ 1=2 na Ä oâ 
Massa molecular mg=mg 
3. Carência química de oxigénio (CQO)  
A carência química de oxigénio (CQO) determina-se em conformidade com 
o método C.6.  
4. Carbono orgânico dissolvido (COD)  
Por definição, o carbono orgânico dissolvido (COD) é o carbono orgânico 
de qualquer substância química ou de qualquer mistura em água que não é 
relido por um filtro de 0,45 microns.  
Retiram-se amostras dos recipientes de ensaio e filtram-se imediatamente 
no equipamento de filtração, utilizando um filtro de membrana adequado. Os primeiros 20 ml (esta quantidade pode ser reduzida quando se utilizam 
filtros pequenos) de filtrado são rejeitados. Retêm-se volumes de 10-20 ml 
ou inferiores, se forem injectados (volume dependente da quantidade ne ­
cessária para o analisador de carbono), para análise de carbono. Determina- -se a concentração de COD por meio de um analisador de carbono orgânico 
capaz de medir com exactidão uma concentração de carbono equivalente ou 
inferior a 10 % da concentração do COD inicial utilizada no ensaio.
 
As amostras filtradas que não possam ser analisadas no próprio dia do trabalho 
podem ser conservadas num frigorífico à temperatura de 2-4  o C, durante 48 
horas, ou a temperaturas inferiores a - 18  o C durante períodos mais longos.  
Observações:  
Os filtros de membrana são frequentemente impregnados com agentes ten ­
sioactivos para hidrofilização. Deste modo, o filtro pode conter até alguns mg de carbono orgânico solúvel que pode interferir com as determinações 
de biodegradabilidade. Os agentes tensioactivos e outros compostos orgâ ­
nicos solúveis são removidos dos filtros por fervura em água desionisada durante três períodos de uma hora. Depois, os filtros podem ser mantidos em água durante uma semana. No caso de se utilizarem embalagens de 
filtros descartáveis, cada lote deve ser verificado para se confirmar que não 
liberta carbono orgânico solúvel.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1021
 
A substância química de ensaio pode ser retida por adsorção, dependendo 
do tipo de filtro de membrana. Por esse motivo, é aconselhável garantir que 
a substância química de ensaio não é retida pelo filtro.  
Em vez da filtração, pode recorrer-se a centrifugação a 40 000 m.s  -2 
(4 000 g), durante 15 minutos, para diferenciar o COD do COT. Este 
método não é fiável para uma concentração inicial < 10 mg de COD/l 
uma vez que nem todas as bactérias são removidas, nem o carbono que 
faz parte do plasma bacteriano é redissolvido.  
BIBLIOGRAFIA  
— Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 12th 
ed, Am. Pub. Hlth. Ass., Am. Wat. Oll. control Fed., Oxygen Demand, 
1965, p. 65.  
— Wagner, R. Von Wasser, 1976, Vol. 46, 139.  
— DIN-Entwurf 38409 Teil 41 — Deutsche Einhcitsverfahren zur Wasser- 
-, Abwasser- und Schlammuntersuchung, Summarische Wirkungs- und 
Stoffkenngrößen (Gruppe H). Bestimmung des Chemischen Sauerstoff ­
bedarfs (CSB) (H 41), Normenausschuß Wasserwesen (NAW) in DIN Deutsches Institut für Normung e.v.
 
— Gerike, P. The biodegradability testing of poorly water soluble com ­
pounds. Chemosphere, 1984, Vol. 13 (1), 169.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1022
 
Apêndice 3  
AVALIAÇÃO DA BIODEGRADABILIDADE DE SUBSTÂNCIAS POUCO 
SOLÚVEIS  
Nos ensaios de biodegradabilidade com substâncias pouco solúveis é necessário 
prestar especial atenção aos aspectos que se seguem.  
Embora os líquidos homogéneos raramente apresentem problemas de amostra ­
gem, recomenda-se que se faça a homogeneização das substâncias sólidas por 
meios adequados, para evitar erros devidos a heterogeneidade. É necessário tomar cuidados especiais quando se pretendem amostras representativas de alguns mili ­
gramas, obtidas a partir de misturas de substâncias químicas ou de outras subs ­
tâncias com grandes quantidades de impurezas.
 
Podem utilizar-se diversas formas de agitação durante os ensaios. É necessário ter 
a precaução de utilizar apenas a agitação suficiente para manter as substâncias químicas dispersas e para evitar sobreaquecimento, excessiva formação de es ­
puma e forças de corte excessivas.
 
Pode ser utilizado um emulsionante que produza uma dispersão estável da subs ­
tância química. Não deve ser tóxico para as bactérias e não deve ser biodegra ­
dado ou provocar espuma nas condições de ensaio.  
Aos solventes, aplica-se o mesmo critério dos emulsionantes.  
Não se recomenda a utilização de veículos sólidos para as substâncias de ensaio 
no estado sólido embora possam ser adequados para as substâncias oleosas.  
No caso de se utilizarem substâncias auxiliares, tais como os emulsionantes, 
solventes e veículos, deve efectuar-se também uma experiência com um branco que contenha a substância auxiliar.
 
Pode ser utilizado qualquer um dos três ensaios respirométricos de CO  2 , CBO e 
MITI, para estudar a biodegradabilidade de compostos pouco solúveis.  
BIBLIOGRAFIA  
— de Morsier, A. et al. Biodegradation tests for poorly soluble compounds. 
Chemosphere, 1987, Vol. 16, 833.  
— Gerike, P. The Biodegradability testing of poorly water soluble compounds. 
Chemosphere, 1984, Vol. 13, 169.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1023
 
Apêndice 4  
AVALIAÇÃO DA BIODEGRADABILIDADE DE SUBSTÂNCIAS 
QUÍMICAS QUE POSSAM SER TÓXICAS PARA O INÓCULO  
Quando se submete uma substância química a um ensaio de biodegradabilidade 
fácil e esta não é, aparentemente, biodegradável, recomenda-se o procedimento 
seguinte, no caso de se pretender estabelecer uma distinção entre inibição e 
inércia (Reynolds et al., 1987).  
Para os ensaios de toxicidade e de biodegradação devem ser utilizados inóculos 
semelhantes ou idênticos.  
Para se avaliar a toxicidade de substâncias químicas de ensaio através de ensaios 
de biodegradabilidade fácil, sugere-se a aplicação de um ou de uma combinação 
do método de inibição da taxa respiratória das lamas (ensaio de inibição da 
respiração em lamas activadas — Dir 88/302/CEE), do CBO e/ou da inibição do crescimento.
 
No caso de se pretender evitar a inibição decorrente da toxicidade, sugere-se que 
as concentrações da substância de ensaio utilizadas no ensaio de biodegradabili ­
dade fácil sejam inferiores a 1/10 dos valores CE  50 (ou inferiores aos valores de 
CE 20 ), obtidos em ensaios de toxicidade. Não é provável que os compostos com 
um valor de CE  50 superior a 300 mg/l possuam efeitos tóxicos em ensaios de 
biodegradabilidade imediata.  
É provável que valores de CE  50 inferiores a 20 mg/l causem grandes problemas 
na continuação dos testes. Devem ser utilizadas baixas concentrações de ensaio, sendo necessário recorrer ao ensaio rigoroso e sensível do frasco fechado ou utilizar material marcado com
 14 C. Em alternativa, um inóculo aclimatizado 
pode permitir a utilização de concentrações mais elevadas da substância de 
ensaio. Contudo, neste último caso, perde-se o critério específico do ensaio de biodegradabilidade imediata.
 
BIBLIOGRAFIA  
Reynolds, L. et al. Evaluation of the toxicity of substances to be assessed for 
biodegradability. Chemosphere, 1987, Vol. 16, 2259.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1024
 
Apêndice 5  
CORRECÇÃO DO CONSUMO DE OXIGÉNIO DECORRENTE DA 
INTERFERÊNCIA POR NITRIFICAÇÃO  
Os erros provocados por não se considerar a nitrificação na avaliação da biode ­
gradabilidade das substâncias de ensaio que não contêm azoto através do con ­
sumo de oxigénio são marginais (não superiores a 5 %), mesmo no caso de a 
oxidação do azoto do amónio do meio ocorrer irregularmente, tal como sucede em relação aos recipientes de ensaio e ao branco. Contudo, para as substâncias de ensaio que contêm azoto, podem surgir erros graves.
 
Se houver nitrificação mas esta não for completa, o consumo de oxigénio pela 
mistura reaccional pode ser corrigido em função da quantidade de oxigénio 
utilizada para oxidar amónio em nitrito e nitrato, se as variações de concentração do nitrito e do nitrato durante a incubação forem determinadas tendo em conta as equações seguintes: 
2 NH
 4 Cl + 3 O  2 = 2 HNO  2 + 2 HC1 + 2 H  2 O (1) 
2 HNO  2 + O  2 = 2 HNO  3 (2) 
Globalmente é: 2 NH
 4 C1 + 4 O  2 = 2 HNO  3 + 2 HC1 + 2 H  2 O (3)  
A partir da equação (1) verifica-se que o consumo de oxigénio por cada 28 g de 
azoto contido no cloreto de amónio (NH  4 C1) oxidado a nitrito é 96 g, isto é, um 
factor de 3,43 (96/28). De modo idêntico, a partir da equação (3), verifica-se que 
o consumo de oxigénio por cada 28 g de azoto oxidado a nitrato é 128 g, isto é, 
traduz-se por um factor de 4,57 (128/28).  
Uma vez que as reacções são sequenciais, sendo provocadas por espécies carac ­
terísticas e diferentes de bactérias, é possível que a concentração de nitrito 
aumente ou diminua; neste último caso, formar-se-ia uma concentração equiva ­
lente de nitrato. Deste modo, o oxigénio consumido na formação de nitrato é o acréscimo da concentração de nitrato multiplicado por 4,57, ao passo que o oxigénio associado à formação de nitrito é o acréscimo da concentração de nitrito 
multiplicado por 3,43 ou, se houver diminuição da sua concentração, a perda de 
oxigénio é o decréscimo de concentração multiplicado por - 3,43.
 
Dito de outro modo: 
O 2 consumido na formação de nitrato = 4,57 × acréscimo na 
concentração de nitrato-N (4) 
e 
O 2 consumido na formação de nitrito = 3,43 × acréscimo na 
concentração de nitrito-N (5) 
e 
perda de O  2 por reacção com nitrito = ± 3,43 × acréscimo na 
concentração de nitrito-N (6) 
pelo que consumo de 
O 2 devido à nitrificação = - 3,43 × variação da concentração de 
nitrito-N + 4,57 × acréscimo na concentração de nitrato-N (7) 
e, portanto, consumo de 
O 2 devido a oxidação de C = consumo total observado — 
consumo devido à nitrificação (8) 
Em alternativa, se apenas se determinar o azoto oxidado total, o consumo de 
oxigénio devido à nitrificação pode considerar-se igual, em primeira aproxima ­
ção, a 4,57 × acréscimo do azoto oxidado.  
O valor corrigido em função do consumo de oxigénio provocado pela oxidação 
do carbono é então comparado com o valor CTeO  NH4 , conforme foi calculado no 
apêndice 2.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1025
 
C.5. DEGRADAÇÃO — CARÊNCIA BIOQUÍMICA DE OXIGÉNIO  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
O objectivo deste método consiste em medir a carência bioquímica 
de oxigénio (CBO) de substâncias orgânicas sólidas ou líquidas.  
Os dados elaborados com este ensaio relacionam-se com os compos ­
tos solúveis em água; todavia, em princípio pelo menos, é possível ensaiar também compostos voláteis e compostos de fraca solubili ­
dade em água.
 
O método aplica-se apenas aos materiais de ensaio orgânicos que 
não sejam inibidores das bactérias nas concentrações utilizadas no 
ensaio. No caso de o material de ensaio não ser solúvel para valores da concentração de ensaio, será necessário recorrer a acções especiais tais como a dispersão ultra-sónica para se conseguir uma boa dis ­
persão do material de ensaio.
 
A informação sobre a toxicidade do composto químico pode ser útil 
para a interpretação de resultados insuficientes e para a selecção das concentrações de ensaio apropriadas.
 
1.2. DEFINIÇÃO E UNIDADES  
Define-se a CBO como sendo a massa de oxigénio dissolvido ne ­
cessária para o processo de oxidação bioquímica de um volume específico de solução da substância sob as condições prescritas.
 
Os resultados exprimem-se em gramas de CBO por grama de subs ­
tância ensaiada.  
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
É desejável a utilização de uma substância de referência adequada 
para verificação da actividade do inóculo.  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Inocula-se com microorganismos uma quantidade predeterminada da 
substância dissolvida ou dispersa num meio adequado e bem arejado e depois faz-se a incubação ao abrigo de luz e a uma temperatura ambiente previamente definida e constante.
 
Determina-se a CBO pela diferença entre o teor em oxigénio dissol ­
vido no início e no termo do ensaio. A duração do ensaio deve ser 
de pelo menos 5 dias e não deve exceder 28 dias.  
Numa experiência paralela deve efectuar-se um ensaio em branco 
sem conter qualquer substância de ensaio.  
1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
A determinação da CBO não pode ser considerada uma determinação 
válida da biodegradabilidade de uma substância. Este ensaio apenas pode ser considerado como um ensaio de pesquisa preliminar.
 
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Prepara-se uma solução ou dispersão preliminar da substância para 
se obter uma concentração da CBO compatível com o método utili ­
zado. Determina-se depois a CBO utilizando qualquer método ade ­
quado nacional ou internacionalmente normalizado.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1026
 
2. RESULTADOS E AVALIAÇÃO  
Calcula-se a CBO existente na solução preliminar de acordo com o 
método normalizado seleccionado e converte-se em gramas de CBO por grama de substância ensaiada.
 
3. RELATÓRIO  
O método utilizado deverá ser especificado.  
O valor da carência bioquímica de oxigénio deverá ser uma média de 
pelo menos três medições válidas.  
Todas as informações e observações relevantes para a interpretação 
dos resultados devem ser descritas, especialmente no que diz respeito a impurezas, estado físico, efeitos tóxicos e composição inerente da 
substância, que possa afectar os resultados.
 
Deve anotar-se a utilização de um aditivo para inibir a nitrificação 
biológica.  
4. REFERÊNCIAS  
Enumeração de métodos normalizados, por exemplo:  
NF T 90-103: Determination of the biochemical oxygen demand.  
NBN 407: Biochemical oxygen demand.  
NEN 3235 5.4: Bepaling van het biochemish zuurstofverbruik 
(BZV).  
The determination of biochemical oxygen demand, Methods for 
the examination of water and associated materials, HMSO, Lon ­
don. 
ISO 5815: Determination of biochemical oxygen demand after n 
days. ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1027
 
C.6. DEGRADAÇÃO — CARÊNCIA QUÍMICA DE OXIGÉNIO  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
O objectivo deste método consiste em medir a carência química de 
oxigénio (CQO) de substâncias orgânicas sólidas ou líquidas por um 
processo arbitrário normalizado, sob condições laboratoriais previa ­
mente estabelecidas.  
A informação sobre a fórmula da substância será útil para efectuar 
este ensaio e para interpretar os resultados obtidos (por exemplo, sais de halogéneos, sais ferrosos de compostos orgânicos, compostos 
organoclorados).
 
1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES  
A carência química de oxigénio é uma medida da oxidabilidade de 
uma substância, e exprime-se pela quantidade equivalente de oxigé ­
nio de um reagente oxidante, consumido pela substância, sob con ­
dições laboratoriais previamente determinadas.  
Exprime-se o resultado em gramas de CQO por grama da substância 
ensaiada.  
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Não é necessário utilizar substâncias de referência em todos os casos 
quando se investiga uma substância nova. Elas deverão servir essen ­
cialmente para calibrar o método de vez em quando e para permitir a comparação dos resultados quando se aplicar outro método.
 
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Utilizando dicromato de potássio em ácido sulfúrico concentrado e 
utilizando sulfato de prata como catalisador, oxida-se uma quanti ­
dade predeterminada da substância, dissolvida ou dispersa em água, e levada a refluxo, durante duas horas. Determina-se o dicromato 
residual por um processo de titulação com um padrão de sulfato de 
amónio ferroso.
 
No caso das substâncias que contêm cloro, adiciona-se sulfato 
mercúrico (  1 ) para reduzir a interferência.  
1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
Devido ao processo arbitrário de determinação, o valor da CQO 
constitui um «indicador de oxidabilidade» e como tal utiliza-se 
como um método prático para a medição de matéria orgânica.  
Os cloretos podem interferir com este ensaio; a redução inorgânica 
ou os agentes oxidantes podem interferir também com a determina ­
ção da CQO.  
Alguns compostos cíclicos e muitas substâncias voláteis (por exem ­
plo, os ácidos gordos de baixo peso molecular) não são oxidados totalmente neste ensaio.
 
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Prepara-se uma solução ou dispersão preliminar da substância de 
ensaio para se obter uma CQO entre 250 e 600 mg por litro.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1028  
( 1 ) Após a utilização, as soluções que contêm sais de mercúrio deverão ser tratadas para 
evitar a contaminação do ambiente com mercúrio.
 Anotações:  
No caso das substâncias fracamente solúveis ou não dispersíveis, 
pode pesar-se uma quantidade da substância finamente pulverizada 
ou da substância líquida, correspondente a cerca de 5 mg da CQO, e depois coloca-se no aparelho experimental com água.
 
A carência química de oxigénio (CQO) é determinada frequente e 
especialmente no caso das substâncias fracamente solúveis, recor ­
rendo às vantagens de uma variante do método, isto é, num sistema 
fechado com um igualizador de pressão (H. Kelkenberg, 1975). De acordo com esta modificação, é possível quantificar frequentemente com sucesso os compostos para os quais as determinações são muito 
difíceis pelo método convencional (por exemplo, o ácido acético). 
Contudo, o método fracassa também no caso da piridina. Se a con ­
centração do dicromato de potássio, conforme prescrito na referência (1), aumentar para 0,25 N (0,0416 M), fica facilitada a pesagem 
directa de 5-10 mg de substância o que é essencial para a determi ­
nação da CQO de substâncias fracamente solúveis em água (referên ­
cia 2).
 
Caso contrário, determina-se depois a CQO utilizando qualquer mé ­
todo adequado nacional ou internacionalmente normalizado.  
2. RESULTADOS E AVALIAÇÃO  
Calcula-se a CQO existente no balão de ensaio experimental utili ­
zando o método normalizado seleccionado e depois converte-se em gramas de CQO por grama de substância ensaiada.
 
3. RELATÓRIO  
Deverá especificar-se o método de referência utilizado.  
A carência química de oxigénio deverá ser a média de pelo menos 
três medições. Toda a informação e anotações relevantes para a 
interpretação dos resultados deverão ser descritas, especialmente no 
que diz respeito a impurezas, estado físico e propriedades inerentes à substância (se forem conhecidas) que possam afectar os resultados.
 
Deve ser mencionada a utilização de sulfato mercúrico para minimi ­
zar a interferência dos cloretos.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) Kelkenberg, H. (1975). Z. von Wasser und Abwasserfors ­
cnung, 8, 146.  
(2) Gerike, P. (1984). The biodegradability testing of poorly water 
soluble compounds. Chemosphere, 13, 169.  
Enumeração de métodos normalizados, por exemplo:  
NBN T 91-201 Determination of the chemical oxygen de ­
mand.  
ISBN 0 11 7512494 Chemical oxygen demand (dichromate 
value) of polluted and waste waters.  
NF T 90-101 Determination of the chemical oxygen de ­
mand.  
DS 217 = water analysis Determination of the chemical 
oxygen demand.  
DIN 38409-H-41 Determination of the chemical oxygen de ­
mand (COD) within the range above 15 mg per litre.  
NEN 3235 5.3 Bepaling van het chemisch zuurstofverbruik.  
ISO 6060 Water quality: chemical oxygen demand dichro ­
mate methods.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1029
 
C.7. DEGRADAÇÃO — DEGRADAÇÃO ABIÓTICA: HIDRÓLISE 
EM FUNÇÃO DO PH  
1. MÉTODO  
O presente método de ensaio é equivalente ao método OECD TG 
111 (2004).  
1.1. INTRODUÇÃO  
As substâncias químicas podem afluir às águas de superfície por vias 
tais como a aplicação directa, a dispersão de pulverizados, a escor ­
rência, a drenagem, a eliminação de resíduos, os efluentes industriais, 
domésticos e agrícolas e a deposição atmosférica, podendo ser trans ­
formados nas referidas águas por processos químicos (por exemplo hidrólise ou oxidação), fotoquímicos e/ou microbianos. A presente directriz descreve um método de ensaio laboratorial com o objectivo 
de avaliar as transformações por hidrólise abiótica de substâncias 
químicas em sistemas aquáticos com valores de pH correntes (pH 4 - 9) e baseia-se nas directrizes em vigor (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).
 
O objectivo dos ensaios consiste em determinar (i) a velocidade de 
hidrólise da substância em estudo em função do pH e (ii) a identi ­
dade ou natureza, bem como as velocidades de formação e trans ­
formação, dos produtos de hidrólise a que os organismos possam ser expostos. Os estudos em causa podem ser necessários no caso de 
substâncias químicas directamente aplicadas na água ou que possam 
afectar o ambiente pelas outras vias atrás referidas.
 
1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES  
Ver o apêndice 2.  
1.3. APLICABILIDADE DO MÉTODO  
O método é aplicável, de forma geral, a substâncias químicas (mar ­
cadas ou não) para as quais exista um método analítico de precisão e 
sensibilidade suficientes. É aplicável a compostos ligeiramente volá ­
teis e não voláteis de solubilidade suficiente em água, não devendo ser aplicado a substâncias altamente voláteis em meio aquoso (no ­
meadamente fumigantes e solventes orgânicos), dado que as mesmas 
não podem ser mantidas em solução nas condições experimentais do ensaio. A realização do ensaio com substâncias de solubilidade mí ­
nima em água poderá revelar-se difícil (8).
 
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO  
Procede-se à adição da substância em estudo a soluções-tampão 
aquosas estéreis de diversos valores de pH (pH 4, 7 e 9), seguida 
de incubação ao abrigo da luz em condições laboratoriais controladas (a temperaturas constantes). Após intervalos de tempo adequados, analisam-se as soluções-tampão para a pesquisa da substância em 
estudo, bem como de produtos de hidrólise. O recurso a substâncias 
de ensaio marcadas (por exemplo com
 14 C) permite obter um ba ­
lanço de massas com maior facilidade.  
O método de ensaio é concebido numa forma progressiva que se 
ilustra e elucida no apêndice 1. Cada nível é condicionado pelos 
resultados do nível anterior.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1030
 
1.5. INFORMAÇÕES SOBRE A SUBSTÂNCIA EM ESTUDO  
As substâncias em estudo a utilizar para a determinação da veloci ­
dade de hidrólise podem ser marcadas ou não. As substâncias mar ­
cadas são especialmente úteis para o estudo do mecanismo da hi ­
drólise e para o estabelecimento do balanço de massas; todavia, em 
alguns casos especiais, a marcação poderá não ser totalmente indis ­
pensável. Recomenda-se a marcação com  14 C, embora o recurso a 
outros isótopos, nomeadamente  13 C, 15 N e  3 H, possa revelar-se tam ­
bém útil. Na medida do possível, a marcação deve ser posicionada 
na parte ou nas partes mais estáveis da molécula. Por exemplo, se a substância em causa contiver um anel, é necessária a marcação do 
mesmo; se a substância contiver dois ou mais anéis, poderá ser 
necessário efectuar ensaios separados para avaliar o comportamento de cada anel marcado e obter informações adequadas sobre a forma ­
ção dos produtos de hidrólise. A substância em estudo deve ter uma 
pureza mínima de 95 %.
 
Antes da realização de um ensaio de hidrólise, devem conhecer-se os 
seguintes dados sobre a substância em estudo:  
a) Solubilidade em água [método de ensaio A.6];  
b) Solubilidade em solventes orgânicos;  
c) Pressão de vapor [método de ensaio A.4] e/ou constante de Henry;  
d) Coeficiente de partição n-octanol/água [método de ensaio A.8];  
e) Constante de dissociação (pK  a ) [Directriz OECD 112] (9);  
f) Velocidade de fototransformação directa e indirecta em água, se 
adequado.  
Devem existir métodos analíticos para a quantificação da substância 
em estudo e, caso seja relevante, para a identificação e quantificação dos produtos de hidrólise em solução aquosa (ver também a secção 1.7.2).
 
1.6. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Sempre que possível, deverão utilizar-se substâncias de referência 
para a identificação e quantificação dos produtos de hidrólise por 
métodos espectroscópicos e cromatográficos ou outros métodos de sensibilidade adequada.
 
1.7. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
1.7.1.  Recuperação  
A análise, pelo menos em duplicado, das soluções-tampão ou ex ­
tractos das mesmas imediatamente após a adição da substância em 
estudo fornece uma primeira indicação da repetibilidade do método analítico e da uniformidade do procedimento de adição da substân ­
cia. Nas fases posteriores dos ensaios, as recuperações decorrem dos 
balanços de massas (em caso de utilização de substâncias marcadas). 
As recuperações deverão situar-se entre 90 % e 110 %, para subs ­
tâncias marcadas ou não (7). Caso seja tecnicamente difícil atingir este intervalo, é aceitável uma recuperação de 70 % no caso de 
substâncias não marcadas, devendo, contudo, apresentar-se uma jus ­
tificação.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1031
 
1.7.2.  Repetibilidade e sensibilidade do método analítico  
A repetibilidade do(s) método(s) analítico(s) utilizado(s) para a quan ­
tificação da substância em estudo e, posteriormente, dos produtos de hidrólise pode ser comprovada pela análise em duplicado das mes ­
mas soluções-tampão (ou de extractos das mesmas) após a formação 
de uma quantidade suficiente de produtos de hidrólise para quanti ­
ficação.
 
O método analítico deve ser suficientemente sensível para quantificar 
a substância em estudo em concentrações da ordem de 10 % ou 
menos da concentração inicial. Se pertinente, os métodos analíticos 
deverão também ser suficientemente sensíveis para quantificar quais ­
quer produtos de hidrólise que constituam 10 % ou mais da quan ­
tidade adicionada (em qualquer fase do ensaio) até 25 % ou menos 
da concentração máxima.  
1.7.3.  Intervalos de confiança para os dados de cinética da hidrólise  
Os intervalos de confiança devem ser objecto de tratamento infor ­
mático de forma a obter os coeficientes de regressão, as constantes 
de velocidade, os tempos de semitransformação e quaisquer outros parâmetros cinéticos (por exemplo, DT50).
 
1.8. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.8.1.  Equipamento e aparelhagem  
O ensaio deve ser realizado em recipientes de vidro (tubos de ensaio 
ou recipientes pequenos) ao abrigo da luz e em condições estéreis, se 
necessário, excepto se existirem dados (por exemplo, coeficiente de 
partição n-octanol-água) que indiquem a possibilidade de a substân ­
cia em estudo aderir ao vidro. Nesse caso, deverá estudar-se a pos ­
sibilidade de utilizar materiais alternativos (nomeadamente Teflon). 
A adesão da substância ao vidro poderá também ser minimizada por recurso a um ou mais dos seguintes métodos:
 
— determinação da massa de substância em estudo e dos produtos 
de hidrólise aderentes ao recipiente de ensaio,  
— uso de um banho de ultra-sons,  
— lavagem com solvente do material de vidro com após a análise 
de cada amostra,  
— uso de produtos na forma de formulações,  
— aumento da quantidade de co-solvente utilizada para a adição da 
substância em estudo ao sistema; em caso de utilização de um 
co-solvente, este não deverá hidrolisar a substância em estudo.  
Em geral, é necessário utilizar agitadores mecânicos de banhos-maria 
com controlo de temperatura ou incubadores com controlo termos ­
tático para a incubação das soluções em estudo.  
O equipamento de laboratório de uso corrente deverá incluir, nomea ­
damente, o seguinte:  
— medidor de pH,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1032
 
— instrumentos de análise tais como aparelhos de GC, HPLC, TLC, 
incluindo sistemas adequados de detecção para a análise de subs ­
tâncias marcadas ou não com radioisótopos ou pelo método de diluição isotópica inversa,
 
— instrumentos de identificação (MS, GC-MS, HPLC-MS, RMN, etc.),  
— contador de cintilação líquida,  
— ampolas de decantação para extracção líquido-líquido,  
— instrumentos para a concentração das soluções e extractos (por 
exemplo, evaporador rotativo),  
— dispositivo de controlo da temperatura (por exemplo, banho-maria).  
Os reagentes incluem, nomeadamente:  
— solventes orgânicos de qualidade analítica (hexano, diclorometa ­
no, etc.),  
— líquido de cintilação,  
— soluções-tampão (ver secção 1.8.3).  
O material de vidro, a água de qualidade analítica e as soluções- 
-tampão a utilizar nos ensaios de hidrólise devem ser esterilizados.  
1.8.2.  Adição da substância em estudo  
A substância em estudo, na forma de solução aquosa, é adicionada 
às diversas soluções-tampão (ver apêndice 3). Caso tal seja necessá ­
rio a uma dissolução adequada, é permitida a utilização de pequenas 
quantidades de solventes miscíveis com água (tais como acetonitrilo, acetona e etanol) para a adição e difusão da substância em estudo, que não devem contudo exceder, em geral, 1 % (v/v). O recurso a 
uma concentração mais elevada de solvente (por exemplo, no caso 
de a substância em estudo ter uma solubilidade reduzida) apenas é permitida se for provado que o solvente não tem efeitos na hidrólise da substância em estudo.
 
Não se recomenda o uso rotineiro de produtos na forma de formu ­
lações, dado que não é de excluir a possibilidade de os ingredientes 
da formulação interferirem no processo de hidrólise. A utilização dos 
produtos em causa poderá contudo ser uma alternativa adequada no caso de substâncias em estudo de solubilidade reduzida em água ou 
que adiram ao vidro (ver a secção 1.8.1).
 
Deve usar-se uma concentração única da substância em estudo, que 
não deverá exceder 0,01 M ou metade da concentração de saturação 
(ver o apêndice 1).  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1033
 
1.8.3.  Soluções-tampão  
O ensaio de hidrólise deverá ser realizado a pH 4, 7 e 9. Para tal, 
devem preparar-se soluções-tampão por recurso a produtos com pu ­
reza de reagente e água. O apêndice 3 apresenta alguns sistemas- 
-tampão úteis. De referir que o sistema-tampão utilizado poderá in ­
fluenciar a velocidade de hidrólise, caso em que deverá utilizar-se um sistema-tampão alternativo (
 1 ). 
O pH de cada solução-tampão deverá ser comprovado com o auxílio 
de um medidor de pH com uma precisão mínima de 0,1, à tempe ­
ratura requerida.  
1.8.4.  Condições de ensaio  
1.8.4.1.  Temperatura  
Os ensaios de hidrólise devem ser realizados a temperaturas cons ­
tantes. Para fins de extrapolação, é importante manter a temperatura com uma aproximação mínima de ± 0,5
 o C. 
Caso o comportamento hidrolítico da substância em estudo seja desco ­
nhecido, deverá proceder-se a um ensaio preliminar (nível 1) à tempe ­
ratura de 50  o C. Devem realizar-se ensaios cinéticos de nível superior a, 
pelo menos, três temperaturas (incluindo o ensaio a 50  o C), excepto se o 
ensaio de nível 1 tiver demonstrado a estabilidade hidrolítica da subs ­
tância em estudo. Sugere-se uma gama de temperaturas compreendida 
entre 10 e 70  o C (em princípio, deverá realizar-se pelo menos um ensaio 
a uma temperatura inferior a 25  o C), que abrange a temperatura de 
referência de 25  o C e a maioria das temperaturas registadas em campo.  
1.8.4.2.  Luz e oxigénio  
Nos ensaios de hidrólise deverão utilizar-se quaisquer métodos ade ­
quados para evitar os efeitos fotolíticos. Deve recorrer-se a todas as 
medidas adequadas para evitar a oxigenação (por exemplo, fazendo 
borbulhar hélio, azoto ou árgon durante 5 minutos antes de preparar a solução).
 
1.8.4.3.  Duração do ensaio  
O ensaio preliminar deverá ser realizado em 5 dias; os ensaios de 
nível superior deverão ser realizados até se verificar a hidrólise de 
90 % da substância em estudo ou em 30 dias, consoante o que 
ocorrer primeiro.  
1.8.5.  Realização do ensaio  
1.8.5.1.  Ensaio preliminar (Nível 1)  
O ensaio preliminar é realizado a 50 ± 0,5  o C e pH 4,0, 7,0 e 9,0. 
Se, após 5 dias, a extensão da hidrólise não exceder 10 % (t  0,525  o C > 
1 ano), a substância em estudo é considerada hidroliticamente está ­
vel, não sendo necessário proceder a ensaios complementares. Se for 
conhecida a instabilidade da substância a temperaturas relevantes no plano ambiental (
 2 ), não é necessário realizar o ensaio preliminar. O 
método analítico deverá ser suficientemente preciso e sensível para 
detectar uma redução de 10 % da concentração inicial.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1034  
( 1 ) Mabey e Mill recomendam o uso de tampões de borato ou acetato em vez de fosfato (11). 
( 2 ) A informação em causa pode provir de outras fontes, nomeadamente dados sobre a 
hidrólise de compostos estruturalmente afins obtidos na literatura ou dados de outros 
ensaios preliminares de hidrólise à escala semiquantitativa com a substância em estudo 
num estádio de desenvolvimento mais elementar.
 1.8.5.2.  Hidrólise de substâncias instáveis (Nível 2)  
O ensaio de nível superior (ensaio avançado) deverá realizar-se a 
valores de pH aos quais a substância em estudo se revelou instável no ensaio preliminar. As soluções tamponadas da substância em 
estudo devem ser termostatadas às temperaturas escolhidas. 
No caso da pesquisa de reacções de primeira ordem, cada solução deverá ser analisada a intervalos de tempo que permitam obter, no mínimo, seis valores (pontos) compreendidos, em princípio, entre 
10 % e 90 % da hidrólise da substância em estudo. Remover as 
amostras individuais múltiplas (deve proceder-se, no mínimo, à aná ­
lise de duplicados em recipientes de reacção separados) e analisar o 
conteúdo correspondente a cada um dos seis tempos de reacção 
(desta forma, obtêm-se, no mínimo, doze pontos). Considera-se ina ­
dequada a utilização de uma solução-mãe da qual se retiram alíquo ­
tas da solução em estudo em cada intervalo de amostragem, dado 
que não permite a análise da variabilidade dos dados e pode levar à 
contaminação da solução em estudo. Devem realizar-se ensaios de confirmação da esterilidade no final do ensaio de nível superior (90 % de hidrólise ou 30 dias). Todavia, estes ensaios não são 
necessários se não tiver sido observada qualquer transformação.
 
1.8.5.3.  Identificação dos produtos de hidrólise (Nível 3)  
Todos os principais produtos de hidrólise, designadamente os que 
representam um teor igual ou superior a 10 % da dose adicionada, 
devem ser identificados por métodos analíticos adequados.  
1.8.5.4.  Ensaios facultativos  
As substâncias hidroliticamente instáveis poderão necessitar de en ­
saios complementares a valores de pH diversos de 4, 7 e 9. Para fins 
fisiológicos, por exemplo, poderá ser necessário efectuar um ensaio em condições mais ácidas (por exemplo, pH 1,2) a uma única tem ­
peratura fisiologicamente relevante (37
 o C). 
2. DADOS  
Se pertinente, as quantidades de substâncias em estudo e produtos de 
hidrólise devem ser expressas em percentagem da concentração ini ­
cial adicionada e, se adequado, em mg/l, para cada intervalo de 
amostragem, cada pH e cada temperatura de ensaio. Além disso, no caso da utilização de uma substância marcada, deve apresentar- -se um balanço de massa expresso em percentagem da concentração 
inicial adicionada.
 
Deve apresentar-se uma representação gráfica dos logaritmos das 
concentrações da substância em estudo em função do tempo. Os 
principais produtos de hidrólise (os que representem, pelo menos, 10 % da dose adicionada) devem ser identificados, procedendo-se à representação gráfica dos logaritmos das suas concentrações em fun ­
ção do tempo tal como no caso da substância de origem, de forma a 
evidenciar as suas velocidades de formação e transformação.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1035
 
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS  
É possível efectuar determinações mais precisas dos tempos de se ­
mitransformação ou dos parâmetros DT  50 por recurso a cálculos com 
modelos cinéticos adequados. Devem comunicar-se, para cada pH e 
temperatura, os tempos de semitransformação e/ou os parâmetros 
DT 50 (incluindo os limites de confiança), juntamente com uma des ­
crição domodelo utilizado, a ordem cinética e o coeficiente de de ­
terminação (r  2 ). Se adequado, os cálculos deverão também abranger 
os produtos de hidrólise.  
No caso do estudo de velocidades de reacção efectuados a tempera ­
turas diferentes, as constantes de hidrólise de pseudoprimeira ordem (k
 obs ) devem ser descritas em função da temperatura. Os cálculos 
deverão basear-se, por um lado, na decomposição de k  obs em cons­
tantes de velocidade de hidrólise catalisada em meio ácido, neutro ou básico (k
 H , k neutro  e k OH respectivamente) e, por outro, na equação 
de Arrhenius:  
k obs ¼ k H ½H þ â þ k neutro þ k OH ½OH Ä â ¼ Σ 
i¼H;neutro ;OH A i e ÄB i=T 
em que A  i e B  i são as constantes de regressão decorrentes, respec ­
tivamente, do declive e da ordenada na origem da linha mais ade ­
quada obtida por regressão linear ln k  i em função do inverso da 
temperatura absoluta, expressa em Kelvin (T). A aplicação da equa ­
ção de Arrhenius à hidrólise catalisada em meio ácido, neutro e 
básico permite calcular as constantes de velocidade de pseudopri ­
meira ordem e, consequentemente, as meias vidas, para temperaturas às quais a determinação directa da constante de velocidade não é 
viável na prática (10).
 
2.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS  
A maioria das reacções de hidrólise apresenta uma cinética aparente 
de primeira ordem, pelo que os tempos de semitransformação são 
independentes da concentração (ver a equação 4 do apêndice 2). Tal facto permite, em geral, a extrapolação dos resultados laboratoriais determinados com concentrações de 10
 -2 -10 -3 M às condições am ­
bientais (< 10  -6 M) (10). Mabey e Mill (11) comunicaram vários 
exemplos de bom acordo entre as velocidades de hidrólise de diver ­
sas substâncias químicas determinadas em águas puras e naturais, a 
pH e temperaturas bem determinados.  
3. RELATÓRIOS  
3.1. RELATÓRIO DE ENSAIO  
O relatório de ensaio deverá incluir, no mínimo, as seguintes infor ­
mações:  
Substância em estudo:  
— denominação comum, denominação química, número CAS, fór ­
mula estrutural (com indicação da posição marcada, caso se uti ­
lizem radioisótopos) e propriedades físico-químicas relevantes 
(ver a secção 1.5),  
— pureza da substância (presença de impurezas),  
— pureza declarada da substância marcada e respectiva actividade 
molar (se pertinente).  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1036
 
— Soluções-tampão:  
— datas e pormenores de preparação,  
— tampões e água utilizados,  
— molaridade e pH das soluções-tampão.  
Condições de ensaio:  
— data da realização dos estudos,  
— quantidade de substância em estudo adicionada,  
— método e solventes (tipo e quantidade) utilizados para a adição 
da substância em estudo,  
— volume de soluções tamponadas da substância em estudo incu ­
badas,  
— descrição do sistema de incubação utilizado,  
— pH e temperatura durante o estudo,  
— cronologia da colheita de amostras,  
— método(s) de extracção,  
— métodos de quantificação e identificação da substância em estudo 
e dos seus produtos de hidrólise nas soluções-tampão,  
— número de amostras múltiplas.  
Resultados:  
— repetibilidade e sensibilidade dos métodos de análise utilizados,  
— recuperações (apresentam-se na secção 1.7.1 os valores percen ­
tuais relativos a um ensaio válido),  
— dados e médias respeitantes às amostras múltiplas, apresentados 
na forma de quadros,  
— balanço de massas durante e no final do estudo (caso se utilize 
uma substância marcada),  
— resultados do ensaio preliminar,  
— discussão e interpretação dos resultados,  
— dados e valores originais.  
As informações que se seguem apenas são necessárias caso se de ­
termine a velocidade de hidrólise:  
— representação gráfica das concentrações da substância em estudo 
e, se pertinente, dos produtos de hidrólise, em função do tempo, a cada pH e temperatura,
 
— tabelas de resultados da equação de Arrhenius à temperatura de 
20 o C/25  o C, 
— especificando o pH, a constante de velocidade [h  -1 ou dia  -1 ], o 
tempo de semitransformação ou o DT50, as temperaturas [  o C], 
incluindo os limites de confiança e os coeficientes de correlação 
(r 2 ), ou dados similares,  
— mecanismo de hidrólise proposto.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1037
 
4. REFERÊNCIAS  
(1) OECD (1981). Hydrolysis as a Function of pH. OECD Gui ­
deline for Testing of Chemicals Nr. 111, adoptado em 12 de Maio de 1981.
 
(2) US-Environmental Protection Agency (1982). 40 CFR 
796.3500, Hydrolysis as a Function of pH at 25  o C. Pesticide 
Assessment Guidelines, Subdivision N. Chemistry: Environ ­
mental Fate.  
(3) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate 
Guidelines for registration of pesticides in Canada.  
(4) União Europeia (UE) (1995). Directiva 95/36/CE da Comissão 
que altera a Directiva 91/414/CEE relativa à colocação dos produtos fitofarmacêuticos no mercado. Anexo V: destino e 
comportamento no ambiente.
 
(5) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1991). Ap ­
plication for registration of a pesticide. Section G: Behaviour of the product and its metabolites in soil, water and air.
 
(6) BBA (1980). Merkblatt Nr. 55, Teil I und II: Prüfung des 
Verhaltens von Pflanzenbehandlungsmitteln im Wasser (Outu ­
bro de 1980).  
(7) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
Fate and Ecotoxicity of Pesticides. Mark R. Lynch, Ed.  
(8) OECD (2000). Guidance document on aquatic toxicity testing 
of difficult substances and mixtures, OECD Environmental 
Health and Safety Publications Series on Testing and Asses ­
sment No 23.  
(9) OECD (1993). Guidelines for the Testing of Chemicals. Paris. 
OECD (1994-2000): Addenda 6-11 to Guidelines for the Tes ­
ting of Chemicals.  
(10) Nelson, H, Laskowski D, Thermes S, and Hendley P. (1997) 
Recommended changes in pesticide fate study guidelines for improving input to computer models (texto de uma exposição oral no 14.
 o Encontro Anual da  Society of Environmental To ­
xicology and Chemistry,  Dallas TX, November 1993).  
(11) Mabey, W. and Mill, T. (1978). Critical review of hydrolysis 
of organic compounds in water under environmental condi ­
tions. J. Phys. Chem. Ref. Data 7, 383-415.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1038
 
Apêndice 1  
Representação esquemática do ensaio de hidrólise progressivo
  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1039
 
Apêndice 2  
Definições e unidades  
Devem usar-se sistematicamente  unidades do Sistema Internacional (SI).  
Substância em estudo:  substância de origem ou produtos de transformação 
relevantes.  
Produtos de transformação:  quaisquer substâncias resultantes da transformação 
biótica ou abiótica da substância em estudo.  
Produtos de hidrólise:  quaisquer substâncias resultantes de reacções de trans ­
formação hidrolítica da substância em estudo.  
Hidrólise:  reacção de uma substância em estudo RX com água, com troca do 
grupo X com um grupo OH: 
RX + HOH → ROH + HX [1]  
De forma simplificada, a velocidade de redução da concentração de RX é dada 
por 
velocidade = k [H  2 O] [RX] reacção de segunda ordem 
ou 
velocidade = k [RX] reacção de primeira ordem  
em função do passo determinante da velocidade. Uma vez que a água se encontra 
presente em grande excesso relativamente à substância em estudo, o tipo de 
reacção em causa é geralmente descrito como de pseudoprimeira ordem. A cons ­
tante de velocidade observada é expressa do seguinte modo 
k obs = k [H  2 O] [2]  
e pode ser determinada por recurso à expressão (*)  
k obs ¼ 1 
t ln C o 
C t [3] 
em que  
t = tempo  
C o , C t = concentrações de RX nos instantes 0 e t.  
A constante tem dimensões de (tempo)  -1 ; o tempo de semitransformação (tempo 
necessário para a reacção de 50 % da substância RX) é dada por  
t 0;5 ¼ ln2 
k obs [4] 
Tempo de semitransformação:  (t 0,5 ) tempo necessário à hidrólise de 50 % da 
substância em estudo, no caso de uma reacção com cinética de primeira ordem. É independente da concentração.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1040  
(*) Se a representação dos logaritmos das concentrações em função do tempo não for uma 
função linear (facto que traduz uma cinética de primeira ordem), o recurso à equação [3] 
não é adequado à determinação da constante de velocidade da hidrólise da substância em 
estudo.
 DT 50 (Tempo de semi-reacção):  tempo necessário a uma redução de 50 % da 
concentração da substância em estudo. É diferente do tempo de semitransforma ­
ção, t  0,5 , se a reacção não apresentar uma cinética de primeira ordem.  
Estimativa de k a uma temperatura diferente  
Sempre que sejam conhecidas as constantes de velocidade a duas temperaturas, 
as constantes a outras temperaturas podem ser calculadas por recurso à equação de Arrhenius:
 
k ¼ A Ü e Ä E R Ü T ou ln k ¼ ÄE 
R Ü T þ ln A 
Por representação de ln k em função de 1/T obtém-se uma recta com declive -E/R  
em que:  
k = constante de velocidade, determinada a temperaturas diferentes  
E = energia de activação [kJ/mol]  
T = temperatura absoluta [K]  
R = constante dos gases [8,314 J/mol.K]  
A energia de activação foi calculada por análise da seguinte equação por regres ­
são linear:  
E ¼ R Ü ln k  2 Ä ln k  1 
1 
T 1 Ä 1 
T 2 Í Î  
em que: T  2 > T  1 . ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1041
 
Apsêndice 3  
Sistemas-tampão  
A. CLARK E LUBS:  
Misturas-tampão de CLARK e LUBS  (*) 
Composição pH  
0,2 N HCl E 0,2 N KCl A 20  o C 
47,5 ml HC1 + 25 ml KC1 dil. para 100 ml 1,0 
32,25 ml HC1 + 25 ml KC1 dil. para 100 ml 1,2 
20,75 ml HC1 + 25 ml KC1 dil. para 100 ml 1,4 13,15 ml HC1 + 25 ml KC1 dil. para 100 ml 1,6 
8,3 ml HC1 + 25 ml KC1 dil. para 100 ml 1,8 5,3 ml HC1 + 25 ml KC1 dil. para 100 ml 2,0 
3,35 ml HC1 + 25 ml KC1 dil. para 100 ml 2,2  
0,1 M biftalato de potássio + 0,1 N HC1 a 20
 o C 
46,70 ml 0,1 N HC1 + 50 ml biftalato dil. para 100 ml 2,2 39,60 ml 0,1 N HC1 + 50 ml biftalato dil. para 100 ml 2,4 
32,95 ml 0,1 N HC1 + 50 ml biftalato dil. para 100 ml 2,6 
26,42 ml 0,1 N HC1 + 50 ml biftalato dil. para 100 ml 2,8 20,32 ml 0,1 N HC1 + 50 ml biftalato dil. para 100 ml 3,0 14,70 ml 0,1 N HC1 + 50 ml biftalato dil. para 100 ml 3,2 
9,90 ml 0,1 N HC1 + 50 ml biftalato dil. para 100 ml 3,4 5,97 ml 0,1 N HC1 + 50 ml biftalato dil. para 100 ml 3,6 2,63 ml 0,1 N HC1 + 50 ml biftalato dil. para 100 ml 3,8  
0,1 M biftalato de potássio + 0,1 N NaOH a 20
 o C 
0,40 ml 0,1 N NaOH +50 ml biftalato dil. para 100 ml 4,0 3,70 ml 0,1 N NaOH +50 ml biftalato dil. para 100 ml 4,2 
7,50 ml 0,1 N NaOH +50 ml biftalato dil. para 100 ml 4,4 
12,15 ml 0,1 N NaOH +50 ml biftalato dil. para 100 ml 4,6 17,70 ml 0,1 N NaOH +50 ml biftalato dil. para 100 ml 4,8
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1042  
(*) Os valores de pH constantes dos quadros foram calculados com base em determinações potenciométricas, por 
recurso às equações-padrão de Sörensen (1909). Os valores de pH correspondentes são superiores em 0,04 
aos valores constantes dos quadros.
 Composição pH  
23,85 ml 0,1 N NaOH +50 ml biftalato dil. para 100 ml 5,0 
29,95 ml 0,1 N NaOH +50 ml biftalato dil. para 100 ml 5,2 
35,45 ml 0,1 N NaOH +50 ml biftalato dil. para 100 ml 5,4 39,85 ml 0,1 N NaOH +50 ml biftalato dil. para 100 ml 5,6 43,00 ml 0,1 N NaOH +50 ml biftalato dil. para 100 ml 5,8 45,45 ml 0,1 N NaOH +50 ml biftalato dil. para 100 ml 6,0  
0,1 M fosfato monopotássico + 0,1 N NaOH a 20
 o C 
5,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato dil. para 100 ml 6,0 
8,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato dil. para 100 ml 6,2 
12,60 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato dil. para 100 ml 6,4 17,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato dil. para 100 ml 6,6 23,45 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato dil. para 100 ml 6,8 29,63 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato dil. para 100 ml 7,0 35,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato dil. para 100 ml 7,2 39,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato dil. para 100 ml 7,4 
42,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato dil. para 100 ml 7,6 
45,20 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato dil. para 100 ml 7,8 46,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml fosfato dil. para 100 ml 8,0  
0,1 M H
 3 B0 3 em 0,1 M KCl + 0,1 N NaOH a 20  o C 
2,61 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ácido bórico dil. para 100 ml 7,8 3,97 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ácido bórico dil. para 100 ml 8,0 5,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ácido bórico dil. para 100 ml 8,2 8,50 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ácido bórico dil. para 100 ml 8,4 
12,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ácido bórico dil. para 100 ml 8,6 
16,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ácido bórico dil. para 100 ml 8,8 21,30 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ácido bórico dil. para 100 ml 9,0 26,70 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ácido bórico dil. para 100 ml 9,2
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1043
 
32,00 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ácido bórico dil. para 100 ml 9,4 
36,85 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ácido bórico dil. para 100 ml 9,6 
40,80 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ácido bórico dil. para 100 ml 9,8 
43,90 ml 0,1 N NaOH + 50 ml ácido bórico dil. para 100 ml 10,0  
B. KOLTHOFF AND VLEESCHHOUWER:  (*) 
Tampões de citrato de KOLTHOFF e VLEESCHHOUWER  
Composição pH  
0,1 M citrato monopotássico e 0,1 N HCl a 18  o C (*) 
49,7 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citrato dil. para 100 ml 2,2 
43,4 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citrato dil. para 100 ml 2,4 
36,8 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citrato dil. para 100 ml 2,6 
30,2 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citrato dil. para 100 ml 2,8 
23,6 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citrato dil. para 100 ml 3,0 
17,2 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citrato dil. para 100 ml 3,2 
10,7 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citrato dil. para 100 ml 3,4 
4,2 ml 0,1 N HC1 + 50 ml citrato dil. para 100 ml 3,6  
0,1 M citrato monopotássico e 0,1 N NaOH a 18  o C (*) 
2,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato dil. para 100 ml 3,8 
9,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato dil. para 100 ml 4,0 
16,3 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato dil. para 100 ml 4,2 
23,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato dil. para 100 ml 4,4 
31,5 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato dil. para 100 ml 4,6 
39,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato dil. para 100 ml 4,8 
46,7 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato dil. para 100 ml 5,0 
54,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato dil. para 100 ml 5,2 
61,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato dil. para 100 ml 5,4 
68,0 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato dil. para 100 ml 5,6 
74,4 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato dil. para 100 ml 5,8 
81,2 ml 0,1 N NaOH + 50 ml citrato dil. para 100 ml 6,0  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1044  
(*) Deve adicionar-se um pequeno cristal de timol ou de uma substância afim para evitar a 
formação de depósitos molds.
 C. SÖRENSEN:  
Misturas de boratos de SÖRENSEN  
Composição Sörensen 
18 o C Walbum, pH a 
ml Borax ml HC1/NaOH 10  o C 40  o C 70  o C 
0,05 M borax + 0,1 N HCl  
5,25 4,75 7,62 7,64 7,55 7,47 
5,50 4,50 7,94 7,98 7,86 7,76 
5,75 4,25 8,14 8,17 8,06 7,95 6,00 4,00 8,29 8,32 8,19 8,08 6,50 3,50 8,51 8,54 8,40 8,28 7,00 3,00 8,08 8,72 8,56 8,40 7,50 2,50 8,80 8,84 8,67 8,50 8,00 2,00 8,91 8,96 8,77 8,59 8,50 1,50 9,01 9,06 8,86 8,67 9,00 1,00 9,09 9,14 8,94 8,74 
9,50 0,50 9,17 9,22 9,01 8,80 
10,00 0,00 9,24 9,30 9,08 8,86  
0,05 M borax + 0,1 N NaOH  
10,0 0,0 9,24 9,30 9,08 8,86 
9,0 1,0 9,36 9,42 9,18 8,94 8,0 2,0 9,50 9,57 9,30 9,02 7,0 3,0 9,68 9,76 9,44 9,12 6,0 4,0 9,97 10,06 9,67 9,28
 
Misturas de fosfatos de SÖRENSEN  
Composição pH  
0,0667 M fosfato monopotássico + 0,0667 M fosfato dissódico a 20  o C 
99,2 ml KH  2 PO 4 + 0,8 ml Na  2 HPO  4 5,0 
98,4 ml KH  2 PO 4 + 1,6 ml Na  2 HPO  4 5,2 
97,3 ml KH  2 PO 4 + 2,7 ml Na  2 HPO  4 5,4 
95,5 ml KH  2 PO 4 + 4,5 ml Na  2 HPO  4 5,6 
92,8 ml KH  2 PO 4 + 7,2 ml Na  2 HPO  4 5,8 
88,9 ml KH  2 PO 4 + 11,1 ml Na  2 HPO  4 6,0 
83,0 ml KH  2 PO 4 + 17,0 ml Na  2 HPO  4 6,2 
75,4 ml KH  2 PO 4 + 24,6 ml Na  2 HPO  4 6,4 
65,3 ml KH  2 PO 4 + 34,7 ml Na  2 HPO  4 6,6 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1045
 
53,4 ml KH  2 PO 4 + 46,6 ml Na  2 HPO  4 6,8 
41,3 ml KH  2 PO 4 + 58,7 ml Na  2 HPO  4 7,0 
29,6 ml KH  2 PO 4 + 70,4 ml Na  2 HPO  4 7,2 
19,7 ml KH  2 PO 4 + 80,3 ml Na  2 HPO  4 7,4 
12,8 ml KH  2 PO 4 + 87,2 ml Na  2 HPO  4 7,6 
7,4 ml KH  2 PO 4 + 92,6 ml Na  2 HPO  4 7,8 
3,7 ml KH  2 PO 4 + 96,3 ml Na  2 HPO  4 8,0 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1046
 
C.8. TOXICIDADE EM RELAÇÃO ÀS MINHOCAS  
ENSAIO UTILIZANDO SOLO ARTIFICIAL  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
Neste ensaio laboratorial, a substância de ensaio é adicionada a um 
solo artificial no qual são colocadas minhocas durante 14 dias. Após este período (e, facultativamente, após 7 dias) examina-se o efeito letal da substância nas minhocas. O ensaio fornece um método para a 
avaliação, num prazo relativamente curto, do efeito dos produtos 
químicos nas minhocas, por absorção via cutânea e alimentar.
 
1.2. DEFINIÇÃO E UNIDADE  
Cl 50 : a concentração de uma substância que se considera responsável 
pela morte de 50 % dos animais de ensaio durante o período de ensaio.
 
1.3. SUBSTÂNCIA DE REFERÊNCIA  
É utilizada periodicamente uma substância de referência com o ob ­
jectivo de demonstrar que a sensibilidade do sistema de ensaio não 
variou significativamente.  
Recomenda-se como substância de referência a cloroacetamida de 
pureza analítica.  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO  
O solo constitui um meio variável e, por essa razão, é utilizado neste 
ensaio um solo franco artificial cuidadosamente definido. As minho ­
cas adultas da espécie  Eisenia foetida  (ver nota em apêndice) são 
mantidas num solo artificial, tratado com diferentes concentrações da 
substância de ensaio. O conteúdo dos recipientes é espalhado sobre 
um tabuleiro 14 dias (e facultativamente sete dias) após o início do ensaio e contam-se as minhocas sobreviventes, para cada uma das concentrações.
 
1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
Pretende-se que o ensaio seja o mais reprodutível possível no que diz 
respeito ao substrato e ao organismo a ensaiar. A mortalidade nos 
controlos não deve exceder 10 % no termo do ensaio, caso contrário 
este não é válido.  
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.6.1.  Materiais  
1.6.1.1. S u b s t r a t o p a r a o e n s a i o  
É utilizado como substrato de base para o ensaio um solo artificial 
de constituição bem definida.  
a) Substrato de base (as percentagens são expressas em termos de 
peso seco):  
— 10 % de turfa de esfagno (tão próximo quanto possível do pH 
5,5 - 6,0, sem resíduos vegetais visíveis e finamente moído),  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1047
 
— 20 % de argila caulinítica, de preferência com mais de 50 % 
de caulinite,  
— cerca de 69 % de areia industrial com quartzo (predominância 
de areia fina com mais de 50 % de partículas de granulome ­
tria 0,05 - 0,2 mm). Se a substância não for suficientemente 
dispersível em água, é necessário dispor de 10 g por reci ­
piente de ensaio para misturar posteriormente com a substân ­
cia de ensaio,  
— cerca de 1 % de carbonato de cálcio (CaCO  3 ) pulverizado e 
quimicamente puro para ajustar o pH a 6,0 ± 0,5;  
b) Substrato para o ensaio  
O substrato para o ensaio contém substrato de base, a substância 
de ensaio e água desionizada.  
O teor em água deve corresponder a cerca de 25-42 % do peso 
seco do substrato de base. O teor em água do substrato determi ­
na-se por secagem da amostra a 105  o C até se obter um peso 
constante. O critério-chave é que o solo artificial seja humedecido 
até à sua saturação. Deve-se proceder à sua mistura cuidadosa ­
mente de modo a obter uma distribuição uniforme da substância de ensaio e do substrato. Deve ser referido o modo como é 
introduzida a substância de ensaio no substrato;
 
c) Substrato de controlo  
O substrato de controlo contém o substrato de base e água. Se se 
utilizar um aditivo, um substrato de controlo suplementar deverá 
conter idêntica quantidade do aditivo.  
1.6.1.2. R e c i p i e n t e s d e e n s a i o  
Recipientes em vidro, com uma capacidade aproximada de um litro 
(adequadamente cobertos com tampas de plástico, discos ou filme de plástico perfurados para efeitos de ventilação) cheios com uma dada 
quantidade de substrato húmido para ensaio ou substrato de controlo, 
equivalente a 500 g de substrato seco.
 
1.6.2.  Condições do ensaio  
Os recipientes devem ser mantidos em câmaras climatizadas a uma 
temperatura de 20 ± 2  o C com luz contínua. A intensidade da luz 
deve situar-se entre 400 e 800 luz.  
A duração do ensaio é de 14 dias, mas pode-se optar por avaliar a 
mortalidade após terem decorrido 7 dias desde o início do ensaio.  
1.6.3.  Método de ensaio  
C o n c e n t r a ç õ e s d e e n s a i o  
As concentrações da substância de ensaio são expressas em peso de 
substância por unidade de peso seco do substrato de base (mg/kg).  
E n s a i o d e d e t e r m i n a ç ã o d e c o n c e n t r a ç õ e s  
O intervalo de concentrações susceptível de provocar mortalidades 
de zero a 100 % pode ser determinado num ensaio de determinação 
de concentrações, com o objectivo de fornecer informações relativas 
ao intervalo de concentrações a utilizar no ensaio definitivo.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1048
 
A substância deve ser ensaiada nas seguintes concentrações: 1 000; 
100; 10; 1; 0,1 mg substância/kg de substratode ensaio (peso seco).  
Se se efectuar um ensaio definitivo completo, um meio de ensaio por 
cada concentração e um meio para o controlo não tratado, cada um 
dos quais com dez minhocas, pode ser suficiente para o ensaio de 
determinação de concentrações.  
E n s a i o d e f i n i t i v o  
Os resultados do ensaio de determinação de concentrações são utili ­
zados para escolher pelo menos cinco concentrações segundo uma série geométrica que provoquem uma mortalidade de 0 a 100 %, 
diferindo entre si de um factor constante não superior a 1,8.
 
Um ensaio que utilize estas séries de concentração deve permitir 
avaliar com a maior precisão possível o valor de CL  50 e os respec ­
tivos limites de confiança.  
No ensaio definitivo utilizam-se pelo menos quatro meios de ensaio 
por concentração e quatro meios de controlo sem tratamento, cada 
um deles com dez minhocas. Os resultados das repetições destes 
meios são expressos em termos de média e desvio padrão.  
Quando duas concentrações consecutivas, com uma razão de 1,8 
entre si, dão apenas mortalidades de 0 % e 100 %, esses dois valores 
são suficientes para determinar o intervalo em que se situa a CL  5() . 
M i s t u r a d o s u b s t r a t o d e b a s e p a r a o e n s a i o e d a 
s u b s t â n c i a d e e n s a i o  
5empre que possível, o substrato para o ensaio deve ser preparado 
sem quaisquer aditivos além de água. Prepara-se uma emulsão ou 
dispersão da substância de ensaio em água desionizada ou outro 
solvente e, imediatamente antes do início do ensaio, mistura-se com o substrato de base para o ensaio, ou pulveriza-se uniforme ­
mente sobre ele, com um dispositivo de pulverização para cromato ­
grafia fina ou outro semelhante.
 
Se a substância de ensaio for insolúvel em água, pode ser dissolvida 
num determinado volume, o mais pequeno possível, de um solvente 
orgânico adequado (por exemplo, hexano, acetona ou clorofórmio).  
Para solubilizar, dispersar ou emulsionar a substância de ensaio ape ­
nas se podem utilizar agentes que se volatilizem facilmente. O subs ­
trato para o ensaio deve ser arejado antes de ser utilizado. A quan ­
tidade de água evaporada deve ser substituída. O controlo deve conter a mesma quantidade de qualquer aditivo.
 
Se a substância de ensaio não for solúvel, dispersível ou emulsioná ­
vel, em solventes orgânicos, misturam-se 490 g de substrato de ensaio seco com 10 g de uma mistura de areia fina com quartzo e 
uma quantidade de substância de ensaio correspondente à dose ne ­
cessária para tratar 500 g de solo artificial seco.
 
Para cada meio de ensaio, são colocados, em cada recipiente de 
vidro, uma dada quantidade de substrato húmido para o ensaio, 
equivalente a 500 g de peso seco e, sobre a superfície do substrato para o ensaio, 10 minhocas. Estas minhocas foram acondicionadas durante 24 horas num substrato de base húmido semelhante ao de 
ensaio, após o que foram rapidamente lavadas e a água em excesso 
absorvida com um papel de filtro antes da utilização.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1049
 
Os recipientes são cobertos com tampas de plástico, discos ou filmes 
de plástico perfurados para evitar que o substrato seque e são man ­
tidos nas condições de ensaio durante 14 dias.  
A avaliação deve ser efectuada 14 dias (e facultativamente sete dias) 
após o início do ensaio. O substrato é espalhado sobre uma placa de vidro ou aço inoxidável. Examinam-se então as minhocas e determi ­
na-se o número de sobreviventes. Considera-se que as minhocas 
estão mortas se não reagirem a um ligeiro estímulo mecânico apli ­
cado na extremidade frontal.
 
Quando o exame é efectuado no 7.  o dia, o recipiente enche-se no ­
vamente com substrato e as minhocas sobreviventes são de novo 
colocadas na mesma superfície do substrato de ensaio.  
1.6.4.  Organismos a utilizar no ensaio  
Os organismos a utilizar no ensaio devem ser adultos da espécie  
Eisenia foetida  (ver nota em apêndice) (pelo menos com 2 meses 
de vida e com clitelo), com peso húmido de 300 a 600 mg (ver método de reprodução em apêndice).
 
2. DADOS  
2.1. PROCESSAMENTO E AVALIAÇÃO DE RESULTADOS  
As concentrações da substância de ensaio apresentam-se em função 
das percentagens correspondentes de minhocas mortas.  
Quando os dados são adequados, o valor CL  50 e os limites de 
confiança (p = 0,05) devem ser determinados utilizando métodos padrão  (Litchfield e Wilcoxon,  1949, ou método equivalente). O 
valor CL
 50 deve ser expresso em mg de substância de ensaio 
por kg de substrato de ensaio (peso seco).  
Nos casos em que o declive da curva de concentrações é demasiado 
abrupto para permitir o cálculo da CL  50 , é suficiente uma estimativa 
gráfica deste valor.  
Quando duas concentrações consecutivas com uma razão de 1,8 
entre si provocam 0 % e 100 % de mortalidade, estes dois valores 
são suficientes para indicar o intervalo entre o qual se situa a CL  50. 
3. RELATÓRIO  
3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deve incluir, se possível, as seguintes informa ­
ções:  
— referir se o ensaio foi efectuado de acordo com os critérios de 
qualidade acima mencionados,  
— tipo de ensaio (ensaio de determinação de concentrações e/ou 
ensaio definitivo),  
— descrição exacta das condições de ensaio ou referir se o ensaio 
foi efectuado de acordo com o método; devem ser referidos todos os desvios em relação ao método indicado,
 
— descrição exacta do modo como a substância de ensaio foi mis ­
turada com o substrato de base para o ensaio,  
— informações relativas aos organismos utilizados no ensaio (espé ­
cie, idade, peso médio e intervalo de variação do peso, condições 
de reprodução e manutenção, fornecedor),  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1050
 
— método utilizado na determinação da CL  50 , 
— resultados dos ensaios, incluindo todos os dados utilizados,  
— descrição dos sintomas ou alterações do comportamento obser ­
vados nos organismos utilizados no ensaio,  
— mortalidade nos controlos,  
— CL  50 ou a mais elevada concentração ensaiada que não provocou 
mortalidade e a concentração ensaiada mais baixa que provocou urna mortalidade de 100 %, catorze dias (e facultativamente sete 
dias) após o início do ensaio,
 
— representação gráfica da curva concentração-resposta,  
— resultados obtidos com a substância de referência quer em rela ­
ção ao presente ensaio quer provenientes de anteriores ensaios de controlo de qualidade.
 
4. REFERÊNCIAS  
(1) OCDE, Paris, 1981,  Test Guideline 207,  Decisão C(81) 30 
final do Conselho.  
(2) Edwards, C. A. and Lofty, J. R.  Biology of Earthworms,  Chap­
man and Hall, London, 331 pp.  
(3) Bouche, M. B., 1972,  Lombriciens de France, Ecologie et 
Systematique,  Institut National de la Recherche Agronomique, 
671 pp.  
(4) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F., A simplified method of 
evaluating dose effect experiments,  J. Pharm. Exp. Therap.,  
vol. 96, 1949, p. 99.  
(5) Comissão das Comunidades Europeias,  Development of a stan ­
dardized laboratory method for assessing the toxicology of 
chemical substances to earthworms,  Report EUR 8714 EN, 
1983.  
(6) Umweltbundesamt/Biologische Bundesanstalt fur Land- und 
Forstwirtschaft, Berlin, 1984, Verfahrens-vorschlag «Toxizi ­
tätstest am Regenwurm  Eisenia foetida  in künstlichem Boden», 
in: Rudolph/Boje,  Ökotoxikologie,  ecomed. Landsberg, 1986.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1051
 
Apêndice  
Reprodução e manutenção das minhocas antes do ensaio  
Para reproduzir os animais, colocar 30 a 50 minhocas adultas numa caixa de 
reprodução com substrato fresco e removê-las ao fim de 14 dias,.Estes animais podem ser utilizados para futuros lotes de reprodução. As posturas são utilizadas 
no ensaio quando atingirem a maturidade (nos termos das condições determina ­
das, ao fim de 2 a 3 meses).
 
Condições de reprodução e manutenção  
Câmara climatizada: temperatura 20 ± 2  o C, de preferência dispondo de luz 
contínua (de intensidade 400 a 800 lux).  
Caixas de reprodução: recipientes adequados de pequena profundidade, com 
um volume de 10 a 20 1.  
Substrato:  Eisenia foetida  pode ser criada em vários excrementos 
animais. Recomenda-se como meio de reprodução a 
utilização de uma mistura de 50 % de turfa e 50 % 
de estrume de cavalo ou vaca. O meio deve ter um pH de aproximadamente 6 a 7 (ajustado com carbonato de 
cálcio) e baixa condutividade iónica (inferior a 
6 mmhos ou 0,5 % de concentração de sais). 
O substrato deve ser húmido, mas não demasiado mo ­
lhado.
 
Além do método acima referido, podem ser utilizados 
com êxito outros processos.  
Nota : Eisenia foetida  existe sob a forma de duas subespécies que alguns taxio ­
nomistas separaram em espécies (Bouche, 1972). São morfologicamente seme ­
lhantes mas uma delas, a  Eisenia foetida foetida,  apresenta como característica 
listas ou bandas transversais sobre os segmentos e a outra, a  Eisenia foetida 
andrei,  não possui tal característica, apresentando uma coloração avermelhada 
matizada. Sempre que possível, deve-se utilizar a  Eisenia foetida andrei.  Podem 
ser utilizadas outras espécies desde que se disponha da necessária metodologia.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1052
 
C.9. BIODEGRADAÇ ĀO 
ENSAIO DE ZAHN E WELLENS  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
O objectivo do presente método é a avaliação da biodegradação final 
potencial de substâncias orgânicas, não voláteis, solúveis em água quando são expostas a concentrações relativamente elevadas de mi ­
croorganismos num ensaio estático.
 
Pode-se verificar adsorção físico-química sobre os sólidos em sus ­
pensão, o que deve ser tomado em consideração na interpretação dos resultados (ver 3.2),
 
As substâncias a estudar são utilizadas em concentrações que cor ­
respondem a valores de COD que vão de 50 a 400 mg/litro ou a valores de CQO situados entre 100 e 1 000 mg/l (COD = carbono orgânico dissolvido; CQO = carência química de oxigénio). Estas 
concentrações relativamente elevadas asseguram uma boa confiança 
analítica. Os compostos dotados de propriedades tóxicas podem atra ­
sar ou inibir o processo de degradação.
 
No presente método, utiliza-se a medição da concentração do car ­
bono orgânico dissolvido ou a carência química de oxigénio para avaliar a biodegradação final da substância de ensaio.
 
A utilização simultânea de um método analítico específico pode 
permitir a avaliação da biodegradação primária da substância (desa ­
parecimento da estrutura química inicial).  
O método apenas se aplica às substâncias orgânicas que, na concen ­
tração utilizada no ensaio:  
— são solúveis em água nas condições do ensaio,  
— têm uma pressão de vapor negligenciável nas condições do en ­
saio, 
— não exercem efeitos inibidores sobre as bactérias,  
— não sofrem uma adsorção importante pelo equipamento de en ­
saio, 
— não desaparecem da solução de ensaio devido a formação de 
espuma.  
Na interpretação dos resultados obtidos, especialmente nos casos em 
que estes resultados são baixos ou marginais, é útil conhecer as 
proporções relativas dos principais elementos constituintes da subs ­
tância de ensaio.  
Na interpretação de resultados pouco elevados e na selecção das 
concentrações de ensaio adequadas, é desejável dispor de informa ­
ções relativas à toxicidade da substância em relação aos microorga ­
nismos.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1053
 
1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES  
A taxa de degradação alcançada no final do ensaio constitui a «Bio ­
degradação no ensaio de Zahn e Wellens»:  
D T ð%Þ ¼ " 
1 Ä ðC T Ä C B Þ 
ðC A Ä C BA Þ # 
Ü 100 
em que:  
D T = biodegradação (%) no instante T.  
C A = Valores do COD (ou da CQO) da mistura de ensaio 
medidos três horas após o início do ensaio (mg/l) 
(COD = carbono orgânico dissolvido, CQO = carência 
química do oxigénio),  
C T = valores do COD ou da CQO na mistura do ensaio no 
momento da colheita da amostra (mg/l),  
C B = valor do COD ou da CQO do ensaio em branco no 
momento da colheita da amostra,  
C BA = valor do COD ou da CQO do ensaio em branco, medido 
três horas após o início do ensaio (mg/l).  
A taxa de degradação obtida é arredondada até ao valor inteiro da 
percentagem mais próxima.  
A percentagem de degradação é definida como sendo a percentagem 
de remoção de COD (ou da CQO) da substância de ensaio.  
A diferença entre o valor medido após 3 horas e o valor inicial 
calculado ou de preferência, medido, pode fornecer informações úteis 
relativas à eliminação da substância (ver 3.2, Interpretação dos re ­
sultados).  
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
No estudo de novas substâncias, podem por vezes ser úteis subs ­
tâncias de referencia; contudo, ainda não podem ser recomendadas substâncias de referência específicas.
 
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Colocam-se num recipiente de vidro de 1 a 4 litros de capacidade, 
munida de um agitador e de um arejador, uma solução aquosa de 
lamas activadas, substâncias nutritivas minerais e a substância de 
ensaio que constituem a única fonte de carbono. A mistura é agitada e arejada a uma temperatura de 20 a 25
 o C, sob uma iluminação 
difusa ou numa câmara escura durante um período que pode ir até 
vinte e oito dias. Acompanha-se o processo de degradação determi ­
nando o valor do COD (ou da CQO) na solução filtrada, diariamente ou segundo uma outra periodicidade adequada. Após cada período, o COD (ou a CQO) eliminado é referido ao valor verificado três horas 
após o início do ensaio e expresso em percentagem de biodegrada ­
ção; isto constitui a medida da taxa de degradação nesse momento. O resultado é representado graficamente em função do tempo, o que permite obter a curva de biodegradação.
 
Se se utiliza um método analítico específico, podem-se medir as 
variações da concentração da molécula original atribuíveis à biode ­
gradação (biodegradação primária).  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1054
 
1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
A reprodutibilidade do presente método foi provada num ensaio de 
intercalibração.  
A sensibilidade do método é largamente determinada pela variabili ­
dade do ensaio em branco e, em menor extensão, pela precisão da 
determinação do carbono orgânico dissolvido e da concentração da 
substância de ensaio no meio.  
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.6.1.  Preparações  
1.6.1.1. R e a g e n t e s  
Água utilizada no ensaio: água de beber contendo menos de 5 mg/l 
de carbono orgânico. A concentração total de iões, cálcio e magnésio 
não deve ultrapassar 2,7 mmoles/l; se não for o caso, corrigir a 
diluição com a necessária quantidade de água desionizada ou desti ­
lada. 
Acido sulfúrico de pureza analítica (P.A.): 50 g/l. 
Solução de hidróxido de sódio P.A.: 40 g/l. Solução nutritiva mineral: dissolver num litro de água 
desionizada: 
cloreto de amónio, NH
 4 Cl, P.A.: 38,50 g, 
dihidrogenofosfato de sódio, NaH  2 PO 4 .2H  2 0, P.A.: 33,40 g, 
dihidrogenofosfato de potássio KH  2 PO 4 , P.a.: 8,50 g, 
monohidrogenofosfato de dipotássio K  2 HPO  4 , P.A.: 21,75 g.  
A mistura serve simultaneamente de meio nutritivo e solução tam ­
pão. 
1.6.1.2. E q u i p a m e n t o  
Recipientes de vidro com uma capacidade de 1 a 4 litros (por exem ­
plo, recipientes cilíndricos).  
Dispositivos de agitação com um agitador em vidro ou em metal 
fixado a uma haste adequada (o agitador deve descrever um movi ­
mento rotativo a cerca de 5 a 10 cm do fundo do recipiente). Pode-se 
utilizar igualmente um agitador magnético com 7 a 10 cm de com ­
primento.  
Tubo de arejamento em vidro com 2 a 4 mm do diâmetro interno. A 
abertura do tubo deve situar-se cerca de 1 cm acima do fundo do recipiente.
 
Centrífuga (cerca de 3 550 g).  
Potenciómetro.  
Aparelho para a medição do oxigénio dissolvido.  
Papéis de filtro.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1055
 
Aparelho de filtração por membrana.  
Membranas filtrantes de porosidade 0,45 μm. As membranas filtran ­
tes são adequadas se não libertarem carbono e não absorverem a 
substância na fase da filtração.  
Material de análise para a dosagem do carbono orgânico e a deter ­
minação da carência química de oxigénio.  
1.6.1.3. P r e p a r a ç ã o d o i n ó c u l o  
Lavar as lamas activadas provenientes de uma estação de tratamento 
biológica por sucessivas centrifugações ou decantações com água do 
ensaio (ver acima).  
As lamas activadas devem possuir as características adequadas. Esta 
lama pode ser obtida numa estação de tratamento de águas residuais 
em boas condições de funcionamento. Para dispor do maior número 
possível de diferentes espécies ou de estirpes de bactérias, pode ser preferível misturar os inóculos provenientes de diferentes fontes (por exemplo, de diferentes estações de tratamento, extractos de solo, 
água de rios, etc.). A mistura deve ser tratada tal como é acima 
indicado.
 
Para o controlo da actividade das lamas activadas, ver abaixo «Con ­
trolo funcional».  
1.6.1.4. P r e p a r a ç ã o d a s s o l u ç õ e s d e e n s a i o  
Num recipiente de ensaio, adicionar 500 ml de água de ensaio, 2,5 
ml/l de solução mineral nutritiva e uma quantidade de lamas activa ­
das correspondente a 0,2 a 1,0 g/l de matéria seca na mistura final. Adicionar uma quantidade suficiente de solução de reserva da subs ­
tância de ensaio de modo a obter, na mistura final, uma concentração 
de COD de 50 a 400 mg/l. Os valores correspondentes de CQO são 
100 a 1 000 mg/l. Adicionar água até um volume total de 1 a 4 litros. O volume total escolhido depende do número de amostras a colher para a determinação do COD ou da CQO e do volume ne ­
cessário para a análise.
 
Normalmente consideram-se dois litros como o volume satisfatório. 
Para cada série de ensaios, preparar pelo menos um recipiente con ­
trolo (branco) contendo apenas as lamas activadas e a solução mi ­
neral nutritiva, diluídas com água de ensaio, até se dispor de um 
volume total idêntico ao dos recipientes de ensaio.  
1.6.2.  Execução do ensaio  
Agitam-se os recipientes de ensaio com agitadores magnéticos ou 
agitadores a hélice, sob iluminação difusa ou numa câmara escura, a 
uma temperatura de 20 a 25  o C. O arejamento processa-se por in ­
jecção de ar comprimido purificado por um filtro de algodão em rama e, se necessário, por um frasco de lavagem. Deve-se garantir que a lama não se deposite e que a concentração de oxigénio não 
desça abaixo de 2 mg/l,
 
O valor de pH deve ser verificado a intervalos regulares (por exem ­
plo, diariamente) e ajustado a pH 7 a 8, se necessário.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1056
 
As perdas devidas a evaporação são compensadas, imediatamente 
antes de cada colheita de amostras, com água desionizada ou desti ­
lada nas quantidades adequadas. Um bom método consiste em mar ­
car o nível do líquido no recipiente antes de dar início ao ensaio. Após cada colheita, marcam-se de novo os recipientes (sem areja ­
mento nem agitação). As primeiras amostras são sempre colhidas três 
horas após o início do ensaio, de modo a permitir detectar uma adsorção da substância de ensaio pelas lamas activadas.
 
À degradação da substância de ensaio segue-se a dosagem do COD 
ou da CQO, diariamente, ou a outro intervalo regular. Filtrar as amostras provenientes do recipiente de ensaio e do recipiente de 
controlo (branco) através de um papel de filtro cuidadosamente la ­
vado. Rejeitar os primeiros 5 ml do filtrado da solução de ensaio. As lamas dificilmente filtráveis podem ser previamente eliminadas por uma centrifugação de 10 minutos. As determinações do COD e da 
CQO efectuam-se pelo menos em duplicado. A duração dos ensaios 
prolonga-se até 28 dias.
 
Observação:  As amostras que permanecem turvas são filtradas atra ­
vés de filtros de membrana. Estes não devem libertar nem adsorver matérias orgânicas.
 
C o n t r o l o f u n c i o n a l d e l a m a s a c t i v a d a s  
Por cada série de ensaios é necessário prever um recipiente que 
contenha uma substância conhecida de forma a poder verificar a capacidade funcional de lamas activadas. O dietilcnoglicol revelou- 
-se útil para este efeito.
 
A d a p t a ç ã o  
Se as análises são efectuadas a intervalos relativamente curtos (por 
exemplo, diariamente), a curva de degradação pode fazer salientar claramente um fenómeno de adaptação (ver figura 2). O ensaio não 
deverá, portanto, ser iniciado imediatamente antes de um fim-de- 
-semana.
 
Se a adaptação tem lugar nos últimos dias do ensaio, este deve ser 
prolongado até à degradação completa.  
Observação:  Se for necessário um melhor conhecimento do compor ­
tamento da lama, as mesmas lamas activadas são expostas de novo à mesma substância de ensaio de acordo com o seguinte processo:
 
Parar o agitador e o arejador e deixar precipitar as lamas activadas. 
Retirar o sobrenadante, encher com água de ensaio até perfazer dois 
litros, agitar durante 15 minutos e deixar de novo precipitar. Retirar de novo o sobrenadante e utilizar as restantes lamas para repetir o ensaio com a mesma substância, em conformidade com os pontos 
1.6.1.4 e 1.6.2 anteriores. As lamas activadas podem igualmente ser 
separadas por centrifugação em vez de precipitação.
 
As lamas adaptadas podem ser misturadas com as lamas frescas para 
atingir 0,2 a 1 g de matéria seca/litro.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1057
 
A n á l i s e s  
De um modo geral as amostras são filtradas através de um papel de 
filtro cuidadosamente lavado com água desionizada.  
As amostras que permanecem turvas são filtradas através de filtros 
de membrana (0,45 μm). 
Determinar a concentração de COD em duplicado nos filtrados das 
amostras (rejeitar os primeiros 5 ml) com o auxílio de um aparelho 
de medição do TOC. Se a análise do filtrado não puder ser efectuada 
no próprio dia, conservá-la no frigorífico até ao dia seguinte. Não é aconselhável conservá-la mais tempo.
 
Determinar a concentração da CQO nos filtrados das amostras com o 
auxílio do dispositivo de análise da CQO, em conformidade com o 
procedimento descrito no ponto 2 seguinte.  
2. RESULTADOS E AVALIAÇÃO  
Proceder a, pelo menos, duas determinações da concentração do 
COD e da CQO nas amostras, em conformidade com as indicações acima fornecidas em 1.6.2. Calcular a percentagem de degradação no instante T de acordo com a fórmula (com as suas definições) dada no 
ponto 1.2 anteriormente indicado.
 
Arredondar a taxa de degradação até à unidade de percentagem mais 
próxima. A taxa de degradação atingida no final do ensaio constitui a «Biodegradação no ensaio de Zahn-Wellens».
 
Observação:  Se se realiza a degradação completa antes do final da 
duração do ensaio e se este resultado for confirmado por uma se ­
gunda análise efectuada no dia seguinte, pode-se dar o ensaio por concluído.
 
3. RELATÓRIO  
3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio, deve incluir, se possível, as seguintes infor ­
mações:  
— a concentração inicial da substância,  
— quaisquer outras indicações e os resultados experimentais relati ­
vos à substância ensaiada, à substância de referência eventual ­
mente usada e ao ensaio de controlo (branco),  
— a concentração após três horas,  
— a curva de biodegradação com a respectiva descrição,  
— a data e o local de colheita dos organismos de ensaio, fase de 
adaptação, concentração utilizada, etc.,  
— as razões científicas de eventuais alterações ao método de ensaio.  
3.2. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS  
A eliminação do COD (ou da CQO) que se produz gradualmente 
durante um determinado número de dias ou de semanas indica que a 
substância ensaiada se degrada biologicamente.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1058
 
Contudo, uma adsorção físico-química pode desempenhar um papel 
em determinados casos, o que é indicado quando se verifica uma 
remoção total ou parcial da substância desde o início, durante as primeiras três horas, e a diferença entre os licores sobrenadantes de ensaio e de controlo permanecem a um nível inesperadamente 
baixo.
 
São necessários ensaios suplementares se se pretender estabelecer a 
distinção entre biodegradação (ou biodegradação parcial) e adsorção.  
Existem diversos métodos para estabelecer tal distinção, sendo o 
melhor a utilização do sobrenadante como inóculo num ensaio pre ­
liminar (de preferência um ensaio respirométrico).  
As substâncias de ensaio que conduzem a uma elevada remoção 
neste ensaio, não associada à adsorção do COD (ou do CQO), de ­
vem ser consideradas como potencialmente biodegradáveis. Uma eliminação parcial, não associada à adsorção, indica que o produto 
químico é, pelo menos, biodegradável em determinada extensão. 
Uma eliminação baixa ou nula de COD (ou de CQO) pode ser atribuída à inibição dos microorganismos pela substância ensaiada, o que pode ser também revelado pela lise e perda de lamas, dando 
origem a sobrenadantes turvos. O ensaio deve ser repetido utilizando 
uma menor concentração da substância de ensaio.
 
A utilização de um método analítico específico em relação a um 
composto ou de uma substância de ensaio marcada com  14 C pode 
permitir uma maior sensibilidade. No caso dos compostos marcados 
com  14 C, a recuperação do  14 CO 2 confirmará que se verificou bio ­
degradação.  
Quando os resultados se exprimem em termos de biodegradação 
primária, deve ser dada, se possível, uma explicação relativa à mo ­
dificação de estrutura química que conduz a uma diminuição da 
resposta da substância original.  
A validade do método analítico deve ser acompanhada da indicação 
da resposta encontrada no ensaio de controlo (branco).  
4. REFERÊNCIAS  
(1) OCDE, Paris, 1981, T est Guideline 302  B, Decisão C(81) 30 
final do Conselho.  
(2) Annex V C.9 Degradation: Chemical Oxygen Demand, Direc ­
tiva 84/449/CEE da Comissão (JO L 251 de 19.9.1984, p. 1).  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1059
 
Apêndice  
EXEMPLO DE UMA AVALIAÇÃO 
Composto orgânico: ácido 4-etoxibenzóico 
Concentração teórica no ensaio: 600 mg/l COD teórico: 390 mg/l 
Inóculo: estação de tratamento de águas residuais de 
Concentração: 1 grama matéria seca/litro Estado de adaptação: não adaptado Análise: determinação do COD 
Volume da amostra: 3 ml 
Substância de controlo: dietilenoglicol Toxicidade do composto: sem efeitos tóxicos para valores inferiores a 
1 000 mg/l 
Ensaio realizado: ensaio em tubos de fermenta ­
ção
 
Instante do 
ensaio Substância de controlo Substância de ensaio 
Branco 
COD (  1 ) 
mg/l COD (  1 ) 
mg/l COD 
líquido mg/l Degradação 
% COD (  1 ) 
mg/l COD lí­
quido 
mg/l Degradação 
% 
0 — — 300,0 — — 390,0 — 
3 horas 4,0 298,0 294,0 2 371,6 367,6 6 1 dia 6,1 288,3 282,2 6 373,3 367,2 6 2 dias 5,0 281,2 276,2 8 360,0 355,0 9 5 dias 6,3 270,5 264,2 12 193,8 187,5 52 6 dias 7,4 253,3 245,9 18 143,9 136,5 65 7 dias 11,3 212,5 201,2 33 104,5 93,2 76 
8 dias 7,8 142,5 134,7 55 58,9 51,1 87 
9 dias 7,0 35,0 28,0 91 18,1 11,1 97 10 dias 18,0 37,0 19,0 94 20,0 2,0 99
 
( 1 ) Valores médios de três determinações.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1060
 
Figura 1  
Exemplos de curvas de biodegradação
  
Figura 2  
Exemplos de adaptação das lamas
  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1061
 
C.10.  ENSAIO DE SIMULAÇÃO DO TRATAMENTO AERÓBIO DE 
EFLUENTES C.10-A: UNIDADES DE LAMAS ATIVADAS — C.10-B 
BIOFILMES  
C.10-A: Unidades de lamas ativadas  
INTRODUÇÃO  
1. O presente método de ensaio é equivalente ao  Test Guideline  TG 303 da 
OCDE (2001). Na década de 1950, concluiu-se que os novos tensioativos causavam a formação excessiva de espuma nas estações de tratamento de 
águas residuais e nos cursos de água. Observou-se que não eram totalmente 
eliminados no tratamento aeróbio e que, em alguns casos, limitavam a remoção de outras matérias orgânicas. Este facto levou à realização de várias investigações sobre o modo como os tensioativos poderiam ser re ­
movidos das águas residuais e a compatibilidade dos novos produtos quí ­
micos produzidos pela indústria com o tratamento de águas residuais. Para este efeito, foram utilizados modelos de unidades que representavam os dois 
principais tipos de tratamento biológico aeróbio das águas residuais (lamas 
ativadas e filtração por percolação ou em leito percolador). Seria inviável e muito oneroso disseminar cada novo produto químico e monitorizar estações de tratamento em grande escala, mesmo a nível local.
 
CONSIDERAÇÕES INICIAIS  
Unidades de lamas ativadas  
2. Estão descritos modelos de unidades de lamas ativadas de volume com ­
preendido entre 300 ml e 2 000 ml. Alguns modelos, que constituem répli ­
cas bastante fiéis de estações à escala real, possuem tanques de decantação a 
partir dos quais as lamas decantadas são bombeadas para um tanque de 
arejamento, enquanto outros, como o modelo Swisher (1), não possuem decantadores. As dimensões a adotar resultam de um compromisso; por 
um lado, devem ser suficientemente grandes para que as operações mecâ ­
nicas sejam executadas de forma correta e para que o volume das amostras seja suficiente, sem afetar o funcionamento; por outro, o equipamento não deve ocupar demasiado espaço nem exigir uma quantidade excessiva de 
materiais.
 
3. As unidades de Husmann (2) e as unidades de vasos porosos (3)(4) cons ­
tituem dois tipos de dispositivos utilizados em larga escala e de forma satisfatória, tendo sido os primeiros utilizados no estudo dos tensioativos; 
estas unidades são descritas no presente método de ensaio. Foram também 
utilizadas com resultados satisfatórios outras unidades, como, por exemplo, a de Eckenfelder (5). Atendendo ao custo relativamente elevado e ao esforço apreciável que o recurso ao presente ensaio de simulação implica, foram 
estudados em paralelo ensaios de rastreio mais simples e menos onerosos, 
que constam do capítulo C.4 A-F do presente anexo (6). A experiência adquirida com muitos tensioativos e outros produtos químicos demonstrou que aqueles que são aprovados nos ensaios de rastreio (facilmente biode ­
gradáveis) se degradaram também no ensaio de simulação. Alguns produtos 
químicos que não foram aprovados nos ensaios de rastreio foram-no nos ensaios de biodegradabilidade inerente — capítulos C.12 (7) e C.19 (8), do presente anexo —, mas apenas alguns destes últimos se degradaram no 
ensaio de simulação; os produtos químicos não aprovados nos ensaios de 
biodegradabilidade inerente não se degradaram nos ensaios de simulação (9)(10)(11).
 
4. Para alguns fins, são suficientes os ensaios de simulação efetuados com uma 
única combinação condições experimentais; os resultados são expressos em 
percentagem de remoção do produto químico em estudo ou do carbono orgânico dissolvido (COD). O presente método apresenta uma descrição de um desses ensaios. No entanto, contrariamente à versão anterior deste 
capítulo, que descrevia apenas um tipo de dispositivo para o tratamento de 
águas residuais sintéticas em unidades interligadas, utilizando um método
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relativamente rudimentar de rejeição das lamas, o presente texto contempla 
diversas variantes. Descreve-se alternativas para o tipo de dispositivo, o 
modo de funcionamento, as águas residuais e a rejeição das lamas. O texto segue de perto a norma ISO 11733 (12), que foi objeto de análise cuidadosa durante a preparação deste método; porém, este não foi ainda sujeito a um 
ensaio interlaboratorial.
 
5. Para outros fins, é necessário conhecer de forma mais precisa a concentração 
do produto químico em estudo no efluente, o que implica o recurso a um 
método mais elaborado. O caudal da rejeição de lamas, por exemplo, deve ser controlado de forma mais precisa ao logo de cada dia e do período do ensaio, sendo necessário que as unidades funcionem com vários caudais de 
rejeição. No caso de um método mais elaborado, devem também ser reali ­
zados ensaios a duas ou três temperaturas diferentes: Birch (13)(14) des ­
creve um método desse tipo, que se resume no apêndice 6. Contudo, os conhecimentos atuais são insuficientes para decidir quais os modelos ciné ­
ticos aplicáveis à biodegradação de produtos químicos no tratamento de 
águas residuais e no meio aquático em geral. A aplicação da cinética de Monod, que se refere no apêndice 6 a título de exemplo, limita-se a pro ­
dutos químicos presentes em quantidades não inferiores 1 mg/l, embora, de 
acordo com algumas fontes, isto tenha ainda de ser demonstrado. O apên ­
dice 7 diz respeito a ensaios a concentrações mais próximas das observadas nas águas residuais; contudo, esses ensaios, assim como os que constam do apêndice 6, não constituem, por si só, métodos diferenciados.
 
Filtros  
6. Tem sido dada uma menor atenção aos modelos com filtros de percolação, 
provavelmente por ocuparem mais espaço e serem menos compactos do que os modelos de estações de lamas ativadas. Gerike  et al.  desenvolveram 
unidades de filtração em leito percolador e utilizaram-nas interligadas (15). 
Os filtros utilizados são relativamente grandes (altura 2 m; volume 60 l) e cada um deles necessita de um caudal de águas residuais da ordem de 2 l/h. Baumann  et al.  (16) simularam filtros de leito percolador inserindo fitas de 
poliéster "aveludado" em tubos de 1 m (14 mm de diâmetro interno) pre ­
viamente imersas durante 30 minutos em lamas ativadas concentradas. O produto químico em estudo, única fonte de carbono numa solução de sais minerais, foi descarregado no tubo vertical e avaliou-se a biodegradação 
através de medições de COD no efluente e de CO
 2 no gás libertado.  
7. Foram simulados ainda biofiltros de outra forma (15): as superfícies internas 
de tubos rotativos, com uma inclinação ligeira em relação à horizontal, 
foram alimentadas com águas residuais (cerca de 250 ml/h) com e sem o produto químico em estudo, tendo os efluentes recolhidos sido analisados para a determinação do COD e/ou daquele produto.
 
PRINCÍPIO DO MÉTODO  
8. Este método destina-se a determinar a eliminação e a biodegradação primá ­
ria e/ou final, por microrganismos aeróbios, de produtos químicos orgânicos hidrossolúveis, num sistema de ensaio em funcionamento contínuo que simula o processo das lamas ativadas. As fontes de carbono e de energia 
dos microrganismos são um meio orgânico facilmente biodegradável e o 
produto químico em estudo.
 
9. Duas unidades de ensaio em funcionamento contínuo (sistema de lamas 
ativadas ou de vasos porosos) funcionam em paralelo e em condições idên ­
ticas, selecionadas de acordo com o objetivo do ensaio. Normalmente, o tempo médio de retenção hidráulica é de 6 h e o tempo de permanência 
médio (tempo de retenção) das lamas é de 6 a 10 dias. A rejeição das lamas 
processa-se por um de dois métodos: o produto químico em estudo é ge ­
ralmente adicionado ao afluente (meio orgânico) de apenas uma das unida ­
des numa concentração compreendida entre 10 mg/l e 20 mg/l de carbono 
orgânico dissolvido (COD). A segunda unidade é utilizada como unidade de 
controlo para determinar a biodegradação do meio orgânico.
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10. Determina-se o COD (de preferência), ou a carência química de 
oxigénio (CQO), juntamente com a concentração do produto químico em 
estudo (se necessário), por meio de análises específicas efetuadas a amos ­
tras, colhidas com frequência, do efluente da unidade que recebe o produto químico em estudo. Presume-se que a diferença entre as concentrações de 
COD ou de CQO no efluente das unidades de ensaio e de controlo, é devida 
ao produto químico em estudo ou aos seus metabolitos orgânicos. Essa diferença é comparada com a concentração de COD ou CQO no afluente ao produto químico em estudo, a fim de determinar a eliminação deste.
 
11. A biodegradação pode geralmente distinguir-se da bioadsorção através de 
um exame cuidadoso da curva de eliminação em função do tempo, podendo confirmar-se através de um ensaio de biodegradabilidade "fácil", por recurso a um inóculo aclimatado da unidade recetora do produto químico em estudo.
 
INFORMAÇÃO SOBRE O PRODUTO QUÍMICO EM ESTUDO  
12. A pureza, a hidrossolubilidade, a volatilidade e as características de adsorção 
do produto químico em estudo devem ser conhecidas, a fim de permitir uma 
interpretação correta dos resultados. Em geral, os produtos químicos voláteis e os produtos químicos insolúveis não podem ser alvo de ensaio, salvo se forem tomadas precauções especiais (ver o apêndice 5). A estrutura química 
ou, pelo menos, a fórmula empírica, devem também ser conhecidas para o 
cálculo dos valores teóricos e/ou a confirmação dos valores medidos de parâmetros como, por exemplo, a carência teórica de oxigénio (CTeO), o carbono orgânico dissolvido (COD) e a carência química de 
oxigénio (CQO).
 
13. O facto de se dispor de informações sobre a toxicidade do produto químico 
em estudo para os microrganismos (apêndice 4) pode ser útil para selecionar concentrações de ensaio adequadas e essencial para uma interpretação cor ­
reta dos valores baixos de biodegradação que possam surgir.
 
NÍVEIS DE APROVAÇÃO  
14. Na aplicação inicial do presente ensaio de simulação (confirmação) da bio ­
degradação primária de tensioativos, era necessário que mais de 80 % do produto químico em causa fosse removido antes de o tensioativo poder ser comercializado. Se a referida percentagem não for atingida, pode recorrer-se 
ao presente ensaio de simulação (confirmação) e o tensioativo só pode ser 
comercializado se mais de 90 % do produto químico causa for removido. Com a maioria dos produtos químicos, não se coloca a questão da aprova ­
ção ou não aprovação e a percentagem de remoção obtida pode ser utilizada 
no cálculo aproximado da concentração ambiental provável a utilizar na 
avaliação dos perigos associados aos produtos químicos. Os resultados ten ­
dem a seguir um padrão "tudo ou nada". Numa série de estudos de produtos químicos puros, observou-se uma percentagem de remoção de COD superior 
a 90 % em mais de três quartos dos produtos químicos que revelaram um 
grau significativo de biodegradabilidade e superior a 80 % em mais de 90 % deles.
 
15. Às concentrações utilizadas no presente ensaio (cerca de 10 mg C/l), rela ­
tivamente poucos produtos químicos (por exemplo, tensioativos) estão pre ­
sentes nas águas residuais. Alguns produtos químicos podem ter efeitos inibidores a estas concentrações, ao passo que a cinética da remoção de outros pode apresentar diferenças a baixas concentrações. É possível efetuar 
uma avaliação mais precisa da degradação por recurso a métodos modifica ­
dos, utilizando concentrações baixas realistas do produto químico em estu ­
do; os dados obtidos podem ser utilizados para o cálculo das constantes cinéticas. No entanto, as técnicas experimentais necessárias ainda não foram 
totalmente validadas, nem foram estabelecidos os modelos cinéticos que 
descrevem as reações de biodegradação (ver o apêndice 7).
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SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
16. A fim de garantir uma execução correta do processo experimental, pode ser 
útil submeter a ensaio substâncias de comportamento conhecido, juntamente com os produtos químicos em estudo. Entre as primeiras contam-se o ácido 
adípico, o 2-fenilfenol, o 1-naftol, o ácido difénico, o ácido 1-naftóico, etc. 
(9)(10)(11).
 
REPRODUTIBILIDADE DOS RESULTADOS DOS ENSAIOS  
17. Há muito menos referências de ensaios de simulação que de ensaios de 
determinação da biodegradabilidade "fácil". No caso dos produtos químicos com degradabilidade igual ou superior a 80 %, a reprodutibilidade entre 
ensaios simultâneos é boa (desvios de 10 a 15 %), embora a variabilidade 
aumente se o produto químico for menos degradável. Além disso, nas nove semanas em que decorreram os ensaios, alguns produtos químicos próximos do limite produziram resultados muito díspares (por exemplo, 10 % e 90 %) 
em diversas ocasiões.
 
18. Observou-se poucas diferenças nos resultados obtidos com os dois tipos de 
dispositivos, mas alguns produtos químicos exibiram uma degradação mais completa e constante na presença de águas residuais domésticas do que com 
o efluente sintético previsto no método da OCDE.
 
DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
Dispositivos  
Sistema de ensaio  
19. O sistema de ensaio de um produto químico é constituído por uma unidade 
de ensaio e uma unidade de controlo; contudo, quando apenas se efetuam análises específicas (biodegradação primária), só é necessária uma unidade 
de ensaio. Pode ser utilizada uma unidade de controlo para várias unidades 
de ensaio que utilizem o mesmo produto químico em estudo ou produtos químicos diferentes. Em caso de interligação de unidades de ensaio (apên ­
dice 3), cada unidade deve ter a sua própria unidade de controlo. O sistema 
de ensaio pode consistir num modelo de estação de lamas ativadas — 
unidade de Husmann (apêndice 1, figura 1) ou vaso poroso (apêndice 1, figura 2). Em ambos os casos, são necessários recipientes de armazenagem de dimensões adequadas aos afluentes e efluentes, bem como bombas para a 
adição do afluente, com ou sem uma solução do produto químico em 
estudo.
 
20. Cada unidade da instalação de lamas ativadas é constituída por um tanque 
de arejamento com uma determinada capacidade (cerca de três litros de 
lamas ativadas) e um separador (clarificador secundário) com capacidade 
de cerca de 1,5 litros; até certo ponto, os volumes podem ser alterados, mediante o ajustamento da altura do separador. São admissíveis recipientes de dimensões diferentes, desde que processam cargas hidráulicas compará ­
veis. Se não for possível manter a temperatura do local de ensaio no in ­
tervalo desejado, recomenda-se a utilização de recipientes com circulação de água a temperatura regulada. Utiliza-se uma bomba de ar ou uma bomba de dosagem para transferir as lamas ativadas do separador para o recipiente de 
arejamento, de forma contínua ou intermitente, a intervalos regulares.
 
21. O sistema de vasos porosos é composto por um cilindro poroso interno com 
fundo cónico, montado num recipiente ligeiramente maior de plástico im ­
permeável, com a mesma forma. Um material adequado para o recipiente é polietileno poroso com poros de 90 μm de diâmetro máximo e 2 mm de 
espessura. A separação das lamas do meio orgânico tratado é efetuada por 
passagem diferencial através da parede porosa. Os efluentes são recolhidos no espaço anular, do qual transitam para o recipiente de recolha. Dado não ocorrer precipitação, não se regista retorno de lamas. O sistema, no seu 
conjunto, pode ser montado num banho-maria com controlo termostático. 
Os vasos porosos obstruem-se e podem transbordar nas fases iniciais. Nesse
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caso, substituir o revestimento poroso por um revestimento novo, extraindo, 
por bombagem, as lamas do recipiente para um balde limpo e removendo o 
revestimento. Após a limpeza do cilindro impermeável exterior, inserir um novo revestimento e retransferir as lamas no recipiente. As lamas aderentes às faces obstruídas do revestimento são também removidas cuidadosamente 
e transferidas. Começar por limpar os recipientes obstruídos, por meio de 
um jato fino de água, de forma a remover a lama remascente; enxaguar com uma solução diluída de hipoclorito de sódio e, seguidamente, com água, antes de proceder a uma lavagem completa com água.
 
22. Para o arejamento das lamas nos tanques de arejamento de ambos os siste ­
mas podem utilizar-se métodos adequados, como, por exemplo, cubos sin ­
terizados (rochas difusoras) e ar comprimido. Se necessário, o ar deve ser 
depurado, por passagem por um filtro adequado ou por lavagem. Deve circular pelo sistema uma quantidade de ar suficiente para manter as con ­
dições aeróbias e manter os flocos das lamas em suspensão permanente, 
durante o ensaio.
 
Dispositivo de filtração ou centrifugação  
23. Dispositivo de filtração das amostras com filtros de membrana de porosi ­
dade adequada (diâmetro nominal da abertura: 0,45 μm), que adsorva 
substâncias orgânicas solúveis e liberte uma quantidade mínima de carbono orgânico. Caso se utilizem filtros que libertem carbono orgânico, lavá-los cuidadosamente com água quente, para eliminar o carbono orgânico 
lixiviável. Em alternativa, pode utilizar-se uma centrifugadora que produza 
40 000 m/s
 2 . 
Equipamento de análise  
24. Aparelhos que permitam determinar os seguintes parâmetros:  
— COD (carbono orgânico dissolvido) e COT (carbono orgânico total), ou 
CQO (carência química de oxigénio),  
— substância específica, se necessário,  
— sólidos em suspensão, pH, concentração de oxigénio na água,  
— temperatura, acidez e alcalinidade,  
— amónio, nitritos e nitratos, se o ensaio for executado em condições de 
nitrificação.  
Água  
25. Água da rede de abastecimento, com menos de 3 mg/l de COD. Determinar 
a alcalinidade, se não for conhecida.  
26. Água desionizada, com menos de 2 mg/l de COD.  
Meio orgânico  
27. Podem utilizar-se como meio orgânico águas residuais sintéticas, águas 
residuais domésticas ou uma combinação de ambas. Foi demonstrado (11) 
(14) que a utilização de águas residuais domésticas simples origina com frequência uma maior percentagem de remoção de COD, permitindo mesmo a remoção e biodegradação de alguns produtos químicos que não sofrem 
biodegradação quando se utiliza o efluente sintético OCDE. Além disso, a 
adição permanente ou intermitente de águas residuais domésticas estabiliza frequentemente as lamas ativadas, melhorando a capacidade de precipitação, que constitui um parâmetro essencial. Recomenda-se, pois, a utilização de 
águas residuais domésticas. Determinar a concentração de COD (ou a CQO) 
de cada novo lote de meio orgânico. Deve conhecer-se a acidez ou a alcalinidade do meio orgânico. Se esta acidez ou alcalinidade for baixa, pode ser necessário adicionar ao meio um tampão adequado (hidrogenocar ­
bonato de sódio ou di-hidrogenofosfato de potássio), para manter o pH no 
tanque de arejamento a cerca de 7,5 ± 0,5, durante o ensaio. A quantidade de solução-tampão e o momento em que é adicionada devem ser decididos caso a caso. Quando as misturas são utilizadas de forma contínua ou in ­
termitente, o seu teor de COD, ou a CQO, devem ser mantidos a um valor 
aproximadamente constante, por exemplo, diluindo com água.
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Águas residuais sintéticas  
28. Dissolver, por cada litro de água da rede de abastecimento, 160 mg de 
peptona; 110 mg de extrato de carne; 30 mg de ureia; 28 mg de hidroge ­
nofosfato dipotássico anidro (K  2 HPO  4 ); 7 mg de cloreto de sódio (NaCl); 4 
mg de cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl  2 .2H  2 O); 2 mg de sulfato de 
magnésio hepta-hidratado (Mg  2 SO 4 .7H  2 O). O efluente sintético OCDE 
constitui um exemplo e proporciona uma concentração média de COD no afluente de cerca de 100 mg/l. Em alternativa, podem utilizar-se composi ­
ções mais próximas das das águas residuais em estudo, com uma concen ­
tração idêntica de COD. Se for necessário um afluente menos concentrado, diluir o efluente sintético, por exemplo, na proporção 1:1, com água da rede 
de abastecimento, de forma a obter uma concentração da ordem de 50 mg/l. 
O recurso a uma concentração mais baixa permitirá uma melhor proliferação dos organismos nitrificantes, pelo que esta modificação é aconselhável caso o estudo diga respeito à simulação de estações de tratamento de águas 
residuais com nitrificação. O efluente sintético, numa forma concentrada, 
pode ter por base água destilada e ser armazenado a cerca de 1 °C durante uma semana, no máximo. Se necessário, diluir com água da rede de abas ­
tecimento (este meio não é inteiramente satisfatório, uma vez que, por 
exemplo, a concentração de azoto é muito elevada e o teor de carbono 
relativamente baixo, mas não foram sugeridas alternativas melhores, exceto a adição de mais fosfato no tampão e de uma quantidade suplementar de peptona).
 
Águas residuais domésticas  
29. Utilizar águas residuais recentemente decantadas, recolhidas diariamente 
numa instalação de tratamento que processe predominantemente esgotos 
domésticos. A amostra deve ser recolhida, antes de decantação primária, 
da conduta de alimentação do decantador, ou da conduta de alimentação da instalação de lamas ativadas, e ter a menor quantidade possível de partículas grosseiras. As águas residuais podem ser utilizadas após terem 
sido armazenadas durante vários dias (em geral, não mais de sete), a cerca 
de 4 °C, caso se apresentem provas de que o COD (ou a CQO) não baixou significativamente (ou seja, mais de 20 %) durante a armazenagem. A fim de evitar perturbações do sistema, o COD (ou a CQO) de cada novo lote 
deve ser ajustado, antes da utilização, para um valor constante, por exemplo, 
através de diluição com água da rede de abastecimento.
 
Lamas ativadas  
30. As lamas ativadas para inoculação devem ser recolhidas num tanque de 
arejamento de uma estação de tratamento de águas residuais explorada corretamente ou numa unidade de lamas ativadas à escala laboratorial, que trate predominantemente águas residuais domésticas.
 
Soluções-mãe da substância em estudo  
31. No caso de produtos químicos com solubilidade adequada, preparar solu ­
ções-mãe de reserva de concentrações apropriadas (por exemplo, 1 a 5 g/l) 
em água desionizada, ou na fração mineral do efluente sintético (no caso de 
produtos químicos insolúveis e voláteis, ver o apêndice 5). Determinar o COD e o carbono orgânico total (COT) da solução-mãe e repetir as medi ­
ções para cada novo lote. Se a diferença entre o COD e o COT for superior 
a 20 %, verificar a solubilidade em água do produto químico em estudo. 
Comparar o COD ou a concentração do produto químico em estudo deter ­
minados por análise específica da solução-mãe com o valor nominal, de forma a averiguar se a recuperação é suficiente (em geral, deve ser superior 
a 90 %). Verificar, em especial no caso das dispersões, se o COD pode ou 
não ser utilizado como parâmetro analítico, ou se é necessário utilizar uma técnica analítica específica para o produto químico em causa. Com as dis ­
persões, é necessário proceder à centrifugação das amostras. Para cada novo 
lote, determinar o COD, a CQO ou o produto químico em estudo por meio 
de uma análise específica.
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32. Determinar o pH da solução-mãe. A ocorrência de valores extremos indica 
que a adição do produto químico pode influenciar o pH das lamas ativadas 
no sistema de ensaio. Neste caso, neutralizar a solução de reserva com pequenas quantidades de ácido ou de base, de forma a obter um pH de 7,0 ± 0,5, evitando, contudo, a precipitação do produto químico em estudo.
 
PROCEDIMENTO  
33. O procedimento descrito é aplicável a unidades de instalações de lamas 
ativadas; no caso de um sistema de vasos porosos, tem de sofrer adaptações ligeiras.
 
Preparação do inóculo  
34. No início do ensaio, inocular o sistema com lamas ativadas ou com um 
inóculo com baixa concentração de microrganismos. Manter o inóculo are ­
jado à temperatura ambiente, até ser utilizado (em menos de 24 horas). 
No primeiro caso, colher uma amostra de lama ativada do tanque de areja ­
mento de uma estação de tratamento de águas residuais biológica que fun ­
cione de forma eficiente, ou de uma estação de tratamento à escala labora ­
torial, que processe essencialmente efluentes domésticos. Se for necessário 
simular condições de nitrificação, utilizar lamas provenientes de uma estação de tratamento de águas residuais com nitrificação. Determinar a concentra ­
ção de sólidos em suspensão e, se necessário, concentrar as lamas por 
sedimentação, de forma a que o volume adicionado ao sistema de ensaio 
seja mínimo. Assegurar uma concentração inicial de matéria seca da ordem de 2,5 g/l.
 
35. No segundo caso, utilizar como inóculo 2 a 10 ml/l de efluente proveniente 
de uma estação de tratamento de águas residuais domésticas biológica. Para 
dispor do maior número possível de diferentes espécies de bactérias, pode 
ser útil adicionar inóculos provenientes de várias fontes, como, por exemplo, águas de superfície. Neste caso, as lamas ativadas desenvolver-se-ão e pro ­
liferarão no sistema de ensaio.
 
Introdução de meio orgânico  
36. Assegurar que os recipientes do afluente e do efluente, bem como a conduta 
entre o primeiro e o segundo, são bem limpos, de forma a eliminar qualquer proliferação de flora microbiana antes do ensaio e durante o mesmo. Montar 
os sistemas de ensaio num compartimento com controlo de temperatura (em 
geral, na gama 20-25 °C) ou utilizar unidades com circulação de água. Preparar um volume suficiente de meio orgânico (pontos 27 e 29). Começar por encher o tanque de arejamento e o separador com o meio orgânico, 
adicionando em seguida o inóculo (pontos 34, 35). Iniciar o arejamento de 
modo a manter as lamas em suspensão, em condições aeróbias, e começar a introdução do afluente e a reciclagem das lamas decantadas. Transferir o meio orgânico dos tanques de armazenagem para os recipientes de areja ­
mento (pontos 20 e 21) das unidades de ensaio e de controlo, e recolher os 
respetivos efluentes em tanques de armazenagem idênticos. Para obter o tempo de retenção hidráulica normal (6 h), o meio orgânico é bombeado 
a 0,5 l/h. Para confirmar este caudal, medir a quantidade diária de meio 
orgânico adicionado, registando o decréscimo dos volumes do meio nos recipientes de armazenagem. Para determinar os efeitos das descargas inter ­
mitentes e descargas intensivas de produtos químicos, seriam necessárias 
outras formas de dosagem.
 
37. Se o meio orgânico for preparado para utilização por um período superior a 
um dia, é necessário arrefecê-lo a cerca de 4 °C, ou recorrer a outros 
métodos adequados de conservação, para evitar a proliferação de microrga ­
nismos e a ocorrência de biodegradação fora das unidades de ensaio (ponto 29). Se for utilizado efluente sintético, pode preparar-se, e armazenar-se a 
cerca de 4 °C, uma solução-mãe concentrada (por exemplo, com uma con ­
centração 10 vezes superior à normal - ponto 28). Esta solução pode ser diluída com um volume adequado de água da rede de abastecimento, antes da utilização. Em alternativa, pode ser bombeada diretamente, sendo o 
referido volume adequado de água da rede de abastecimento bombeado 
separadamente.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1068
 
Introdução do produto químico em estudo  
38. Adicionar um volume adequado da solução-mãe do produto químico em 
estudo (ponto 31) ao recipiente de armazenagem de efluente ou introduzi-la diretamente, com uma bomba, no tanque de arejamento. A 
concentração média normal do produto químico em estudo no afluente 
deve estar compreendida entre 10 mg/l e 20 mg/l de COD, não devendo exceder 50 mg/l. Se a solubilidade em água do produto químico for baixa, ou se for provável a ocorrência de efeitos tóxicos, reduzir a concentração 
para 5 mg/l de COD ou menos, mas apenas se estiver disponível e puder ser 
aplicado um método analítico específico (os produtos químicos dispersos que forem pouco solúveis em água podem ser adicionadas por recurso a 
técnicas especiais de dosagem — ver o apêndice 5).
 
39. Começar a adcionar o produto químico em estudo após um período neces ­
sário à estabilização do sistema e à eliminação eficiente (cerca de 80 %) do COD do meio orgânico. Antes da adição do produto químico, é importante verificar se todas as unidades estão a funcionar de forma igualmente eficaz; 
se tal não for o caso, justifica-se, geralmente, misturar as lamas e redistribuir 
volumes iguais pelas unidades. Quando se utiliza um inóculo de cerca de 2,5 g/l (massa a seco) de lama ativada, o produto químico em estudo pode ser adicionado no início do ensaio, uma vez que a adição direta de quan ­
tidades crescentes desde o início apresenta a vantagem de as lamas ativadas 
poderem adaptar-se melhor à substância. Independentemente do método de adição, recomenda-se que o caudal e/ou os volumes no(s) recipiente(s) de armazenagem sejam medidos com intervalos regulares.
 
Processamento das lamas ativadas  
40. Durante o ensaio, independentemente do inóculo utilizado, a concentração 
das lamas ativadas sólidas estabiliza-se, em geral, entre determinados limi ­
tes, no intervalo de 1 a 3 g/l (massa a seco), em função da natureza e da 
concentração do meio orgânico, das condições de funcionamento, da natu ­
reza dos microrganismos presentes e da influência do produto químico em estudo.
 
41. Determinar os sólidos em suspensão nos tanques de arejamento, pelo menos, 
uma vez por semana e eliminar o excesso de lamas, de forma a manter a concentração na gama 1 g/l a 3 g/l (massa a seco), ou manter constante o tempo de permanência médio das lamas (em geral, na gama de 6 a 10 dias). 
Se, por exemplo, for escolhido um tempo de retenção das lamas de oito 
dias, remover diariamente e eliminar 1/8 do volume das lamas ativadas contidas no tanque de arejamento. Efetuar esta operação diariamente ou, de preferência, recorrer a um dispositivo automático de bombagem intermi ­
tente. O facto de manter a concentração de sólidos em suspensão a níveis 
constantes, ou dentro de limites restritos, não permite obter um valor cons ­
tante do tempo de retenção das lamas, parâmetro que condiciona a concen ­
tração do produto químico em estudo no efluente.
 
42. Durante todo o ensaio, remover, pelo menos uma vez por dia, as lamas 
aderentes às paredes do tanque de arejamento e do separador, de forma a 
repô-las em suspensão. Verificar e limpar regularmente todas as tubagens, para impedir a formação de biofilmes. Transferir a lama decantada do se ­
parador para o tanque de arejamento, de preferência por bombagem inter ­
mitente. Embora não ocorra reciclagem no sistema de vasos porosos, im ­
porta assegurar que são inseridos vasos interiores limpos antes de o volume no tanque aumentar significativamente (ponto 21).
 
43. Nas unidades de Husmann, pode observar-se precipitação deficiente e perda 
de lamas. Estas ocorrências podem ser retificadas através de um dos proce ­
dimentos que se referem de seguida, aplicados em paralelo nas unidades de ensaio e de controlo:
 
— podem adicionar-se a intervalos regulares (por exemplo, semanalmente) 
lamas frescas ou floculante (por exemplo, 2 ml de solução de 50 g/l 
FeCl  3 por tanque), verificando, porém, que não ocorre qualquer reação 
nem precipitação do produto químico em estudo com FeCl  3 , ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1069
 
— a bomba de ar pode ser substituída por uma bomba peristáltica que 
proprocione um caudal de recirculação das lamas aproximadamente igual 
ao caudal do afluente e o desenvolvimento de uma zona anaeróbia nas lamas decantadas (a geometria da bomba de ar limita o caudal mínimo das lamas de retorno a cerca de doze vezes o caudal do afluente),
 
— as lamas podem ser bombeadas por intermitência do separador do 
tanque de arejamento (por exemplo, 5 minutos em cada 2,5 h, para 
reciclar de 1 a 1,5 l/h),  
— pode utilizar-se um agente antiespumante não tóxico (por exemplo, 
óleo de silicone), numa concentração mínima, para evitar as perdas através das espumas,
 
— pode-se fazer borbulhar ar nas lamas do separador, em rajadas curtas 
(por exemplo, 10 segundos por hora),  
— o meio orgânico pode ser introduzido no tanque de arejamento a 
intervalos regulares (por exemplo, 3 a 10 minutos por hora).  
Amostragem e análise  
44. Medir, a intervalos regulares, a concentração de oxigénio dissolvido, a 
temperatura e o pH das lamas ativadas, nos tanques de arejamento. Garantir que esteja sempre presente oxigénio em quantidade suficiente (> 2 mg/l) e a 
temperatura seja mantida na gama pretendida (em geral, de 20
 o C a 25  o C). 
Manter o pH a 7,5 ± 0,5, por adição de pequenas quantidades de base ou ácido inorgânicos no tanque de arejamento ou no afluente, ou aumentando a capacidade-tampão do meio orgânico (ver ponto 27). A nitrificação produz 
ácido; a oxidação de 1 mg de azoto produz o equivalente de cerca de 7 mg 
de CO
 3 2- . A frequência das medições depende do parâmetro a medir e da 
estabilidade do sistema, podendo variar consoante as medições sejam diárias ou semanais.
 
45. Medir o COD ou a CQO nos afluentes dos tanques de ensaio e de controlo. 
Medir a concentração do produto químico em estudo no afluente respetivo, 
através de uma análise específica ou por estimativa, com base na sua con ­
centração na solução-mãe (ponto 31), no volume utilizado e na quantidade de águas residuais tratadas na unidade de ensaio. Recomenda-se o cálculo da 
concentração do produto químico em estudo, a fim de reduzir a variabili ­
dade dos valores obtidos para a concentração.
 
46. Recolher amostras adequadas nos efluentes (por exemplo, amostras compó ­
sitas em 24 h), e filtrar com uma membrana de porosidade 0,45 μm, ou 
centrifugar a cerca de 40 000 m/s  2 durante 15 minutos. Deve recorrer-se à 
centrifugação se a filtragem for difícil. Determinar o COD ou a CQO pelo 
menos em duplicado, para avaliar a biodegradação final e, se necessário, a 
biodegradação primária, através de uma análise específica do produto quí ­
mico em estudo.  
47. A baixas concentrações, a utilização da CQO pode originar problemas ana ­
líticos, pelo que se recomenda apenas para concentrações suficientemente 
elevadas do produto químico em estudo (cerca de 30 mg/l). Além disso, no 
caso de produtos químicos fortemente adsorventes, recomenda-se a determi ­
nação da quantidade de produto químico em estudo adsorvida nas lamas, por recurso a uma técnica analítica específica.
 
48. A frequência de amostragem depende da duração prevista do ensaio. 
Recomenda-se uma frequência de três vezes por semana. Se as unidades 
estiverem a funcionar eficazmente, prever um período de adaptação de uma 
semana a, no máximo, seis semanas após a adição do produto químico em estudo, para que seja atingido um estado estacionário. Para a avaliação do resultado do ensaio, obter, de preferência, um mínimo de 15 valores válidos 
na fase de patamar (ponto 59), que dura, em geral, três semanas. O ensaio 
pode ser concluído se for observado um grau de eliminação suficiente (por exemplo, superior a 90 %) e se estiverem disponíveis os 15 valores referi ­
dos, representativos de análises efetuadas todos os dias durante três sema ­
nas. A duração do ensaio não deve, em geral, exceder 12 semanas após a 
adição do produto químico em estudo.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1070
 
49. Se as lamas nitrificarem e se pretender estudar os efeitos do produto quí ­
mico em estudo na nitrificação, determinar o amónio e/ou os nitritos, bem 
como os nitratos, em amostras dos efluentes das unidades de ensaio e de controlo, pelo menos uma vez por semana.
 
50. Todas as análises (em especial as determinações de azoto) devem ser efe ­
tuadas tão rapidamente quanto possível. Se for necessário adiar a realização das análises, armazenar as amostras a cerca de 4 °C, na obscuridade, em 
garrafas hermeticamente fechadas. Se for necessário armazenar as amostras 
por um período superior a 48 horas, conservá-las por ultracongelação, aci ­
dificação (por exemplo, com 10 ml/l de solução de ácido sulfúrico a 400 g/l) ou por adição de uma substância tóxica adequada (por exemplo, 20 ml/l de 
uma solução de cloreto de mercúrio (II) a 10 g/l). Assegurar que a técnica 
de conservação não influencia os resultados da análise.
 
Interligação das unidades de ensaio  
51. Caso se recorra a uma interligação (apêndice 3), efetuar diariamente trocas 
da mesma quantidade de lamas ativadas (150 ml a 1 500 ml, no caso de 
tanques de arejamento que contenham 3 litros de fase líquida) entre os 
tanques de arejamento da unidade de ensaio e da unidade de controlo. Se o produto químico em estudo for fortemente adsorvido pelas lamas, alterar apenas o sobrenadante dos separadores. Em ambos os casos, utilizar um 
fator de correção para calcular os resultados dos ensaios (ponto 55).
 
DADOS E RELATÓRIOS  
Tratamento dos resultados  
52. Calcular a percentagem de eliminação do produto químico em estudo, em 
termos de COD ou de CQO, para cada avaliação programada, por recurso à equação:
 
D t ¼ C s Ä ðE Ä E o Þ 
C s Ü 100 
em que  
D t = % de eliminação do COD ou da CQO no instante  t 
C s = COD ou CQO no afluente devidos ao produto químico em estudo, 
estimado, de preferência, a partir da solução-mãe (mg/l)  
E = valor medido de COD ou CQO no efluente em estudo, no instante  t 
(mg/l)  
E o = valor medido de COD ou CQO no efluente de controlo, no instante  t 
(mg/l)  
53. O grau de eliminação de COD ou de CQO do meio orgânico da unidade de 
controlo é uma informação útil para avaliar a atividade de biodegradação das lamas ativadas, durante o ensaio. Calcular a percentagem de eliminação por recurso à equação:
 
D B ¼ C M Ä E o 
C M Ü 100 
em que  
D B = % de eliminação do COD ou da CQO do meio orgânico na unidade 
de controlo, no instante  t 
C M = COD ou de CQO do meio orgânico no afluente de controlo (mg/l)  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1071
 
Como opção, calcular a percentagem de eliminação do COD ou da CQO 
devida ao meio orgânico e ao produto químico em estudo na unidade de 
ensaio, com base na seguinte equação:  
D T ¼ C T Ä E 
C T Ü 100 
em que  
D T = % de eliminação do COD ou da CQO total do afluente em estudo  
C T = COD ou CQO total do afluente em estudo, ou calculados a partir 
das soluções-mãe (mg/l)  
54. Calcular a remoção do produto químico em estudo, se determinada por um 
método analítico específico, em cada instante, com base na equação:  
D ST ¼ S i Ä S e 
S i Ü 100 
em que  
D ST = % de eliminação primária do produto químico em estudo, no ins ­
tante  t 
S i = concentração medida ou estimada do produto químico em estudo no 
afluente (mg/l)  
S e = concentração medida ou estimada do produto químico em estudo no 
efluente, no instante  t (mg/l)  
55. Caso tenha sido utilizado o modo de interligação, compensar, através de um 
fator de correção, a diluição do produto químico em estudo no tanque de arejamento devida à substituição das lamas (ver o apêndice 3). Se tiver sido 
utilizado um tempo de retenção hidráulica médio de 6 h e se tiver procedido 
à substituição de metade do volume de lamas ativadas contido no tanque de arejamento, é necessário corrigir os valores de eliminação diária determina ­
dos (D
 t , ponto 52), de forma a obter o verdadeiro grau de eliminação, D  tc , 
do produto químico em estudo, através da seguinte equação:  
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
Apresentação dos resultados do ensaio  
56. Traçar o gráfico da percentagem de remoção, D  t (ou D  tc ) e D  st , consoante o 
caso, em função do tempo (ver o apêndice 2). A forma da curva de remoção do produto químico em estudo (em relação ao próprio produto ou na forma de COD) permite tirar algumas conclusões sobre o processo de remoção.
 
Adsorção  
57. Caso se observe uma elevada remoção de COD do produto químico em 
estudo desde o início do ensaio, o produto em causa é, provavelmente, 
removido por adsorção nos sólidos das lamas ativadas. É possível compro ­
var este fenómeno através da determinação da quantidade de produto quí ­
mico em estudo adsorvido, por recurso a um método de análise específico. Não é habitual que a eliminação do COD de produtos químicos adsorvíveis 
se mantenha a um nível elevado durante todo o ensaio; em geral, observa-se 
um elevado grau de eliminação no início, que baixa progressivamente para um valor de equilíbrio. Contudo, se o produto químico adsorvível em estudo tiver causado, de qualquer forma, a aclimatação da flora microbiana, a 
remoção do seu COD poderá aumentar posteriormente, estabilizando-se 
em valores elevados.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1072
 
Fase de latência  
58. Muitos produtos químicos em estudo passam por uma fase de latência, antes 
de ocorrer a biodegradação completa, nomeadamente nos ensaios estáticos de rastreio. Na fase de latência, ocorre a aclimatação ou adaptação das 
bactérias responsáveis pela degradação, não se observando praticamente 
qualquer eliminação do produto químico em estudo; a proliferação das bactérias inicia-se em seguida. Esta fase termina, iniciando-se a fase de de ­
gradação, quando for eliminada cerca de 10 % da quantidade inicial de 
produto químico em estudo (após a adsorção, caso ocorra). Em geral, a 
fase de latência é muito variável e pouco reprodutível.
 
Fase de patamar  
59. A fase de patamar da curva de eliminação de um ensaio contínuo é definida 
como a fase em que ocorre a degradação máxima. Deve durar, pelo menos, 
três semanas, durante as quais importa determinar cerca de 15 valores vá ­
lidos.  
Grau de eliminação médio do produto químico em estudo  
60. Calcular o valor médio a partir dos valores de eliminação (D  t ) obtidos para o 
produto químico em estudo na fase de patamar. O grau de eliminação do produto químico em estudo é arredondado ao número inteiro mais próximo (1 %). Recomenda-se também o cálculo do intervalo de confiança de 95 % 
do valor médio.
 
Eliminação do meio orgânico  
61. Desenhar o gráfico da percentagem de eliminação do COD ou da CQO do 
meio orgânico na unidade de controlo (D  B ) em função do tempo. Indicar o 
grau de eliminação médio da mesma forma que para o produto químico em 
estudo (ponto 60).  
Indicação da biodegradação  
62. Se o produto químico em estudo não for adsorvido de forma significativa 
pelas lamas ativadas e a curva de eliminação tiver a forma característica de 
uma curva de biodegradação com fases de latência, degradação e patamar (pontos 58 e 59), a remoção determinada pode ser atribuída com confiança à biodegradação. Se ocorrer uma elevada remoção inicial, o ensaio de simu ­
lação não permite distinguir os processos de eliminação biológicos dos 
abióticos. Nesses casos, e noutros em que existam dúvidas quanto a biode ­
gradação (por exemplo, se ocorrer separação), analisar o produto químico em estudo adsorvido ou efetuar mais ensaios estáticos de biodegradação 
com base em parâmetros que comprovem claramente os processos biológi ­
cos. Trata-se, designadamente, dos métodos baseados no consumo de oxi ­
génio [capítulo C.4, D, E e F do presente anexo (6)], de um ensaio com medição do dióxido de carbono produzido [capítulo C.4 C do presente 
anexo (6)] ou do método de  headspace  da ISO (18), utilizando um inóculo 
pré-exposto do ensaio de simulação. Se tiverem sido determinadas a remo ­
ção do COD e a eliminação das substâncias específicas, a ocorrência de diferenças significativas entre as percentagens (primeiro valor superior ao 
segundo) indicam a presença nos efluentes de substâncias orgânicas inter ­
mediárias cuja degradação pode ser mais difícil que a da substância de origem.
 
Validade dos resultados  
63. Obtêm-se informações sobre o comportamento do inóculo em matéria de 
biodegradação se for determinado o grau de eliminação do meio orgânico (ponto 53) da unidade de controlo. Considerar o ensaio válido se, decorridas duas semanas, o grau de eliminação do COD ou da CQO da(s) unidade(s) 
de controlo exceder 80 % e não se registarem quaisquer ocorrências rele ­
vantes.
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64. Se tiver sido utilizada uma substância de referência facilmente biodegradá ­
vel, o grau de biodegradação (D  T , ponto 52) deve ser superior a 90 %.  
65. Se o ensaio for efetuado em condições de nitrificação, a concentração média 
nos efluentes devem ser inferior a 1 mg/l de azoto amoniacal e a 2 mg/l de azoto na forma de nitritos.
 
66. Se esses critérios (pontos 63-65) não forem cumpridos, repetir o ensaio 
utilizando um inóculo de origem diferente, submeter a ensaio uma subs ­
tância de referência e rever todos os procedimentos experimentais.  
Relatório do ensaio  
67. O relatório do ensaio deve incluir as seguintes informações:  
Produto químico em estudo:  
— dados de identificação,  
— natureza física e, quando pertinente, propriedades físico-químicas.  
Condições de ensaio:  
— tipo de sistema de ensaio; quaisquer alterações introduzidas para o en ­
saio de produtos químicos insolúveis e voláteis,  
— tipo de meio orgânico,  
— proporção e natureza das águas residuais provenientes de indústrias, se 
conhecidas,  
— inόculo: natureza e local(is) de amostragem, concentração e eventual 
pré-tratamento,  
— solução-mãe do produto químico em estudo: teor de COD e COT; forma 
de preparação, caso se trate de uma suspensão; concentração de ensaio 
utilizada; fundamentação de um eventual afastamento da gama de 10 a 20 mg/l de COD; método de adição; data da primeira adição; quaisquer alterações,
 
— tempo de permanência médio das lamas e tempo médio de retenção 
hidráulica; método de remoção das lamas; métodos para evitar a mistura e a perda de lamas, etc.,
 
— técnicas de análise utilizadas,  
— temperatura de ensaio,  
— qualidades das lamas misturadas, índice de volume das lamas, mistura de 
sólidos em suspensão no meio fluido,  
— eventuais desvios aos procedimentos normalizados e quaisquer ocorrên ­
cias que possam ter afetado os resultados.  
Resultados do ensaio:  
— todos os valores medidos (COD, CQO, análises específicas, pH, tempe ­
ratura, concentração de oxigénio, sólidos em suspensão, substâncias azotadas, se for caso disso,
 
— todos os valores calculados dos parâmetros D  t (ou D  tc ), D  B , D  St , na 
forma de quadro e a partir das curvas de eliminação,  
— informações sobre as fases de latência e de patamar, a duração do 
ensaio, o grau de eliminação do produto químico em estudo e do meio orgânico na unidade de controlo, juntamente com dados estatísticos 
e conclusões sobre a biodegradabilidade e a validade do ensaio,
 
— discussão dos resultados.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1074
 
REFERÊNCIAS:  
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(5) Eckenfelder, W.W (19) US EPA.  
(6) Capítulo C.4 deste anexo: "Determinação da biodegradabilidade "fácil'".  
(7) Capítulo C.12 deste anexo: "Biodegradação - Ensaio L.A.S.C. modificado".  
(8) Capítulo C.19 deste anexo: "Estimativa do valor do coeficiente de adsorção 
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(17) Her Majesty’s Stationery Office (1982). Assessment of biodegradability. 
Methods for the examination of waters and associated materials. p. 91-98 
ISBN 011 751661 9.  
(18) ISO 14593 (1998). Water Quality — Evaluation in an aqueous medium of 
the ultimate biodegradability of organic compounds. Method by the analysis of inorganic carbon in sealed vessels.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1075
 
Apêndice 1  
Figura 1  
Equipamentos utilizados para avaliar a biodegradação  
Unidade de Husmann
  
A. Tanque de armazenagem  
B. Bomba doseadora  
C. Câmara de arejamento (capacidade 3 l)  
D. Tanque de decantação  E. Bomba de ar comprimido  
F. Tanque de recolha  
G. Arejador  
H. Medidor do caudal de ar  
Figura 2  
Equipamentos utilizados para avaliar a biodegradação  
Vaso poroso
  
A. Tanque de armazenagem  
B. Bomba de dosagem  
C. Tanque poroso de arejamento  
D. Recipiente exterior impermeável  E. Tanque de recolha  
F. Difusor  
G. Caudalímetro de ar  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1076
 
Figura 3  
Pormenor do vaso poroso de arejamento de três litros
  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1077
 
Apêndice 2  
Exemplo de curva de eliminação
  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1078
 
Apêndice 3  
[INFORMATIVO]  
INTERLIGAÇÃO DAS UNIDADES DE ENSAIO  
Para tentar igualizar as populações microbianas nas lamas de uma unidade de 
ensaio que processa águas residuais com um produto químico em estudo e de 
uma unidade de controlo que apenas processa efluentes, procede-se a uma trans ­
ferência de lamas diária (1). Este processo designa-se por interligação e o método é conhecido por método das unidades interligadas. A interligação começou por 
ser efetuada por recurso a unidades de Husmann de lamas ativadas, mas, poste ­
riormente, foram também utilizadas unidades de vasos porosos (2) (3). Não foram registadas diferenças significativas, em termos de resultados, entre unida ­
des interligadas ou não, quer se trate de unidades Husmann ou de vasos porosos, 
pelo que não se justifica o dispêndio de tempo e energia com a interligação de 
unidades.
 
O intercâmbio de lamas pode dar a impressão de ocorrência de uma remoção 
considerável, uma vez que uma parte do produto químico em estudo nas lamas 
transferidas e as concentrações do mesmo nos efluentes de ensaio e de controlo 
são praticamente iguais. É, pois, necessário utilizar fatores de correção, consoante a fração em causa e o tempo médio de retenção hidráulica. A referência (1) contém mais pormenores para o cálculo.
 
Calcular o valor corrigido do grau de eliminação do COD ou da CQO utilizando 
a seguinte fórmula geral: 
D tc ¼ ðD t Ä 100 · a · r=12Þ=ð1 Ä a · r=12Þ % 
em que:  
D tc = % corrigida de eliminação do COD ou da CQO  
D t = % determinada de eliminação do COD ou da CQO  
a = fração trocada do volume das unidades de lamas ativadas  
r = tempo médio de retenção hidráulica (h)  
Se, por exemplo, metade do volume do recipiente de arejamento for trocada 
(a = 0,5) e o tempo médio de retenção hidráulica for de 6 h, a fórmula de 
correção é a seguinte: 
D tc ¼ 4D t Ä 100 
3 
REFERÊNCIAS  
(1) Fischer W, Gerike P, Holtmann W (1975): Biodegradability Determinations 
via Unspecific Analyses (Chemical Oxygen Demand, DOC) in Coupled 
Units of the OECD Confirmatory Test. I The test.  Wat. Res . 9: 1131-1135.  
(2) Painter HA, Bealing DJ (1989): Experience and Data from the OECD Ac ­
tivated Sludge Simulation Test. p. 113-138. In: Laboratory Tests for Simu ­
lation of Water Treatment Processes CEC Water Pollution Report 18. Eds. 
Jacobsen BN, Muntau H, Angeletti G.  
(3) Painter HA, King EF (1978): Water Research Centre Porous Pot Method for 
Assessing Biodegradability. Technical Report TR70, Water Research Centre, Stevenage, Reino Unido.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1079
 
Apêndice 4  
AVALIAÇÃO DA INIBIÇÃO DAS LAMAS ATIVADAS  
Processamento dos produtos químicos em estudo  
1. Um produto químico (ou uma água residual) pode não ser degradado ou 
removido no ensaio de simulação, podendo mesmo apresentar um efeito 
inibidor nos microrganismos presentes nas lamas. Alguns produtos químicos são biodegradados a baixas concentrações, mas são inibidores a concentra ­
ções mais elevadas (hormese). Os efeitos inibidores podem ser detetados 
numa fase precoce ou podem ser determinados por recurso a um ensaio de 
toxicidade, utilizando um inóculo semelhante ou idêntico ao utilizado no ensaio de simulação (1). Estes métodos consistem na inibição do consumo de oxigénio (capítulo C.11 do presente anexo (2) e norma ISO 8192, n.
 o 3) 
ou na inibição do crescimento dos organismos das lamas (ISO 15522, n.  o 4). 
2. No ensaio de simulação, observa-se inibição se a diferença de teores de COD 
ou CQO entre os efluentes do recipiente de ensaio e do recipiente de controlo 
for superior ao COD correspondente ao produto químico em estudo. Por outras palavras, a percentagem de remoção de COD (ou de CBO, CQO, e/ou NH
 + 4 ) do meio orgânico tratado baixará devido à presença do produto 
químico em estudo. Caso tal suceda, o ensaio deve ser repetido, reduzindo-se 
a concentração do produto químico em estudo até ser atingido um nível em que não ocorra inibição e, eventualmente, até o produto ser biodegradado. Se o produto químico, ou as águas residuais, em estudo revelarem efeitos ne ­
gativos no processo a todas as concentrações testadas, isso indica que o 
processamento biológico do produto é difícil, ou mesmo impossível; poderá, contudo, ser interessante repetir o ensaio com lamas ativadas de origem 
diferente e/ou submetendo as lamas a uma aclimatação mais gradual.
 
3. Reciprocamente, se o produto químico em estudo for bioeliminado no pri ­
meiro ensaio de simulação, a sua concentração deve ser aumentada, caso se 
pretenda conhecer os seus possíveis efeitos de inibição.  
4. Nas tentativas para determinar os graus de inibição, importa recordar que as 
populações colonizadoras das lamas ativadas podem variar, pelo que, com o tempo, os microrganismos podem exibir tolerância a uma substância inibi ­
dora.
 
5. Cálculo do grau de inibição:  
A percentagem global de remoção (R  o ), de CBO, COD, CQO, etc., das 
unidades de ensaio e de controlo, pode ser calculada com base na equação:  
R o ¼ 100 ðI Ä EÞ= I% 
em que:  
I = concentração de CBO, DOC, COD, etc. no afluente, nos recipientes 
de ensaio ou de controlo (mg/l)  
E = mesmas concentrações no efluente (mg/l).  
Os valores de I e E devem ser corrigidos para ter em conta o COD atribuível 
ao produto químico em estudo nas unidades de ensaio, sem o que os cálculos 
da percentagem de inibição serão incorretos.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1080
 
O grau de inibição decorrente da presença do produto químico em estudo é 
calculado a partir da equação:  
% inibição ¼ 100 ðR c Ä R t Þ=R c 
em que:  
R c = percentagem de remoção nos recipientes de controlo  
R t = percentagem de remoção nos recipientes de ensaio  
REFERÊNCIAS  
(1) Reynolds L  et al.  (1987): Evaluation of the toxicity of substances to be 
assessed for biodegradability.  Chemosphere  16: 2259.  
(2) Captítulo C.11 deste anexo: "Biodegradação — Lamas Ativadas: Ensaios de 
Inibição da Respiração".  
(3) ISO 8192 (2007) Water quality — Test for inhibition of oxygen consumption 
by activated sludge for carbonaceous and ammonium oxidation.  
(4) ISO 15522 (1999) Water Quality — Determination of the inhibitory effect of 
water constituents on activated sludge microorganisms.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1081
 
Apêndice 5  
Produtos químicos em estudo pouco solúveis em água — substâncias voláteis  
Produtos químicos pouco solúveis em água  
Foram publicados poucos relatórios sobre ensaios de simulação de tratamento de 
águas residuais com produtos químicos pouco solúveis ou insolúveis em água (1) 
(2) (3).  
Não existe um método único de dispersão da substância em estudo aplicável a 
todos os produtos químicos insolúveis. Dois dos quatro tipos de métodos des ­
critos na norma ISO 10634 (4) afiguram-se adequados à dispersão dos produtos 
químicos destinados a ensaios de simulação: trata-se do recurso a agentes emul ­
sionantes e/ou à energia ultrassónica.  
Deve determinar-se a estabilidade da dispersão em períodos de, pelo menos, 
24 horas.  
As dispersões, devidamente estabilizadas, contidas num recipiente com agitação 
constante (ponto 38), são transferidas para um tanque de arejamento separada ­
mente das águas residuais domésticas ou sintéticas.  
Se as dispersões forem estáveis, investigar de que forma o produto químico 
poderá ser determinado na forma dispersa. É improvável que a determinação 
do COD seja adequada, devendo, por isso, definir-se para a análise do produto químico um método específico passível de ser aplicado a efluentes, sólidos 
provenientes de efluentes e lamas ativadas. Pode, então, determinar-se o com ­
portamento do produto no processo de simulação das lamas ativadas, nas fases líquida e sólida. Deve, pois, estabelecer-se um "balanço de massas" para decidir se o produto químico em estudo foi biodegradado. No entanto, esse parâmetro 
indica apenas a biodegradação primária. Para comprovar a biodegradação final, 
deve utilizar-se um ensaio respirométrico da biodegradabilidade imediata (capí ­
tulo C.4 do presente anexo (5) C, F ou D), utilizando como inóculo lamas expostas ao produto químico em estudo no ensaio de simulação.
 
Produtos químicos voláteis  
A simulação do tratamento das águas residuais com produtos químicos voláteis é 
discutível e problemática. Tal como no caso dos produtos químicos de baixa solubilidade em água, têm sido publicados muito poucos relatórios sobre ensaios 
de simulação com produtos químicos voláteis. Um dispositivo de mistura de tipo 
clássico pode ser adaptado, tapando os tanques de arejamento e de sedimentação, medindo e controlando o fluxo de ar por recurso a fluxómetros e fazendo passar os gases libertados por coletores, para recolha das matérias orgânicas voláteis. 
Em alguns casos, utiliza-se uma bomba de vácuo para drenar os gases através de 
um coletor a frio ou de um coletor com purga que contenha Tenax e silica-gel, para análise por cromatografia em fase gasosa. O produto químico em estudo 
presente no coletor pode ser determinado por via analítica.
 
O ensaio é efetuado em duas fases. Na primeira fase, as unidades são utilizadas 
sem lamas, mas com águas residuais sintéticas, sendo o produto químico em 
estudo bombeado para o tanque de arejamento. São colhidas amostras de afluen ­
te, efluente e de gases libertados e analisadas para deteção do produto químico em estudo, durante alguns dias. A percentagem (R
 vs ) deste removida do sistema 
pode calcular-se a partir dos dados recolhidos.  
Em seguida, realiza-se o ensaio biológico normal (com lamas), em condições 
operacionais idênticas às utilizadas no ensaio de remoção. Efetuam-se também medições do COD ou da CQO, para verificar se as unidades estão a funcionar de forma eficaz. Ocasionalmente, efetua-se análises para determinar a concentração 
de produto químico em estudo no afluente, no efluente e nos gases libertados, na 
primeira parte do ensaio; após a aclimatação, efetua-se análises com uma maior frequência. É igualmente possível calcular, a partir dos dados no estado estacio ­
nário, a percentagem de eliminação do produto químico em estudo da fase 
líquida (R
 T ) por todos os processos (físicos e biológicos), bem como a proporção 
removida do sistema (R  V ). ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1082
 
Cálculos:  
a) No ensaio não biológico, a percentagem (R  VP ) de produto químico em estudo 
removido do sistema pode calcular-se com base na fórmula:  
R VP ¼ S VP 
S IP · 100 
em que  
R VP = remoção do produito químico em estudo por volatilização (%),  
S VP = produto químico em estudo recolhido no coletor, expresso em concen ­
tração equivalente na fase líquida (mg/l),  
S IP = concentração do produto químico em estudo no afluente (mg/l).  
b) No ensaio biológico, a percentagem (R  V ) de produto químico em estudo 
removida do sistema pode calcular-se com base na fórmula:  
R V ¼ S V 
S I · 100 
em que  
R V = remoção do produto químico em estudo por volatilização, no ensaio 
biológico (%)  
S V = produto químico em estudo recolhido no coletor, no ensaio biológico, 
expresso em concentração equivalente no afluente líquido (mg/l),  
S I = concentração do produto químico em estudo no afluente (mg/l).  
c) No ensaio biológico, a percentagem (R  T ) de produito químico em estudo 
removida por todos os processos é dada por:  
R T ¼ 1 Ä S E 
S I · 100 
em que  
S E = concentração de produto químico em estudo no efluente líquido 
(mg/l).  
d) Assim, a percentagem (R  BA ) removida por biodegradação e adsorção é cal ­
culada da seguinte forma:  
R BA ¼ ðR T Ä R V Þ 
Deve realizar-se ensaios separados para determinar se o produto químico em 
estudo é adsorvido; se for o caso, pode efetuar-se uma nova correção.  
e) Uma comparação entre a proporção de produto químico em estudo removida 
nos sistemas de ensaio biológico (R  v ) e não biológico (R  vp ) indica os efeitos 
globais do tratamento biológico na emissão da produto para a atmosfera.  
Exemplo:  Benzeno  
Tempo de retenção nas lamas = 4 dias  
Tempo de retenção nas águas residuais sintéticas = 8 horas  
S IP = S  I = 150 mg/l  
S VP = 150 mg/l (S  EP = 0) 
S V = 22,5 mg/l  
S E = 50 μg/l ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1083
 
Assim,  
R VP = 100 %, R  V = 15 %  
R T = 100 % e R  BA = 85 %.  
Conclui-se que o benzeno não é adsorvido pelas lamas.  
REFERÊNCIAS  
(1) Horn J.A., Moyer J.E., Hale J.H. (1970). Biological degradation of tertiary 
butyl alcohol. Proc. 25th Ind. Wastes Conference Purdue Univ.: 939-854.  
(2) Pitter P., Chudoba J. (1990). Biodegradability of organic substances in the 
aquatic environment. CRC Press. Boston, USA.  
(3) Stover E.L., Kincannon D.F. (1983): Biological treatability of specific orga ­
nic compounds found in chemical industry waste waters. J. Wat. Pollut. 
Control Fed. 55: 97.  
(4) ISO 10634 (1995) Water Quality — Guidance for the preparation and treat ­
ment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evalua ­
tion of their biodegradability in an aqueous medium.  
(5) Capítulo C.4 deste anexo:"Determinação da biodegradabilidade 'fácil' ".  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1084
 
Apêndice 6  
Efeitos do tempo de retenção das lamas (SRT) na capacidade de 
tratamento dos produtos químicos  
INTRODUÇÃO  
1. O método descrito no texto principal foi concebido para verificar se os 
produtos químicos sujeitos a ensaio (geralmente aqueles cuja biodegradabi ­
lidade inerente é conhecida, mas não a "fácil") podem ser biodegradados nos limites impostos nas estações de tratamento de águas residuais. Os resulta ­
dos são expressos em termos de percentagem de remoção e percentagem de 
biodegradação. As condições de funcionamento das unidades de lamas ati ­
vadas e a escolha do afluente permitem grandes variações de concentração do produto químico em estudo no efluente. Os ensaios são efetuados apenas 
com uma concentração nominal de lamas sólidas ou um tempo de retenção 
nominal (SRT); os caudais de remoção das lamas descritos podem causar variações consideráveis do SRT durante o ensaio, tanto de dia para dia como num determinado dia.
 
2. Nesta variante (1) (2), o SRT é mantido entre limites muito mais estreitos 
em cada período de 24 horas (tal como acontece em grande escala), o que 
resulta numa concentração mais constante nos efluentes. Recomenda-se a 
utilização de águas residuais domésticas, que proporciona uma percentagem de remoção mais constante e elevada. Além disso, investigam-se os efeitos de uma série de valores de STF; num estudo mais pormenorizado, podem 
estudar-se os efeitos da variação da temperatura na concentração do efluente.
 
3. Ainda não há consenso quanto aos modelos cinéticos implicados na biode ­
gradação nas condições de tratamento de águas residuais. O modelo de 
Monod de crescimento bacteriano e a utilização do substrato foram selecio ­
nados (1)(2) para aplicação aos dados recolhidos, uma vez que o método se destinava a ser aplicado apenas a produtos químicos produzidos em grandes 
quantidades, que produziam concentrações superiores a 1 mg/l nas águas 
residuais. A validade do modelo simplificado e os pressupostos assumidos foram estabelecidos por recurso a uma série de etoxilatos de etilo com diversos graus de biodegradabilidade primária (2)(3).
 
Nota:  Este método alternativo segue de perto o método descrito (C.10-A), 
apenas diferindo nos aspetos que se indicam de seguida.  
PRINCÍPIO DO MÉTODO  
4. Utiliza-se unidades de vasos porosos com lamas ativadas, concebidas para 
facilitar a remoção quase contínua do meio fluido misto, de forma a permitir um controlo muito preciso do tempo de retenção das lamas (SRT, ou θ
 s ), de 
modo não interligado, numa determinada gama de SRT e, eventualmente, 
numa determinada gama de temperaturas. Em geral, o tempo de retenção é 
de 2 a 10 dias, a uma temperatura compreendida entre 5 e 20 °C. As águas residuais, de preferência domésticas, e uma solução do produto químico em estudo são colocadas separadamente nas unidades a caudais que proporcio ­
nem o tempo de retenção requerido (três a seis horas) e a concentração 
requerida do produto no afluente. Paralelamente, para fins comparativos, utilizam-se unidades de controlo sem adição do produto químico em estudo.
 
5. Pode utilizar-se outros tipos de equipamentos, devendo porém fazer-se o 
possível para assegurar o controlo dos SRT. Por exemplo, no caso de ins ­
talações munidas de um decantador, pode ser necessário ter em conta a perda de sólidos através dos efluentes. Além disso, deve tomar-se precau ­
ções especiais para evitar erros atribuíveis à variação da quantidade de lamas 
no decantador.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1085
 
6. Faz-se funcionar as unidades com cada conjunto selecionado de condições; 
ao atingir o equilíbrio, medem-se as concentrações estacionárias médias do 
produto químico em estudo e, eventualmente, o COD nos efluentes, num período de cerca de três semanas. Além de avaliar a percentagem de remo ­
ção do produto químico em estudo e, opcionalmente, o COD, determina-se, 
na forma de gráfico, a relação entre as condições de funcionamento da 
instalação e a concentração do produto no efluente. A partir do gráfico, pode calcular-se as constantes cinéticas e prever-se as condições de proces ­
samento do produto químico em estudo.
 
INFORMAÇÕES SOBRE O PRODUTO QUÍMICO EM ESTUDO  
7. Aplica-se o descrito no capítulo C.10-A, pontos 12 e 13.  
NÍVEIS DE APROVAÇÃO  
8. Aplica-se o descrito no capítulo C.10-A, pontos 14 e 15.  
SUBSTÂNCIA DE REFERÊNCIA  
9. Aplica-se o descrito no capítulo C.10-A, ponto 16.  
REPRODUTIBILIDADE DOS RESULTADOS DOS ENSAIOS  
10. Aplica-se o descrito no capítulo C.10-A, pontos 17 e 18.  
DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
Dispositivos  
11. O sistema de vasos porosos modificado (apêndice 6.1) constitui uma uni ­
dade adequada. Consiste num recipiente interno (ou revestimento) de poli ­
propileno poroso com 3,2 mm de espessura e porosidade aproximada 90 
μm, com juntas soldadas topo a topo, o que torna esta unidade mais robusta 
do que a descrita no ponto 21 do presente capítulo, C.10-A. O revestimento é colocado num recipiente exterior de polietileno impermeável, composto 
por duas partes, designadamente uma base circular em que se abrem orifí ­
cios destinados a receber duas linhas de ar e um tubo para remoção das lamas, e um cilindro superior aparafusado à base, com uma saída posicio ­
nada de forma a proporcionar um volume conhecido (3 l) ao recipiente de 
vasos porosos. Uma das condutas de ar é munida de uma pedra difusora; a 
outra tem uma extremidade aberta, estando posicionada perpendicularmente à pedra no recipiente. Este sistema produz a agitação necessária para asse ­
gurar a mistura completa do conteúdo do vaso, bem como concentrações de 
oxigénio dissolvido superiores a 2 mg/l.
 
12. As unidades, em número adequado, são mantidas a temperaturas controladas 
na gama 5-20 °C (± 1 °C), quer por meio de banhos-maria quer mantendo a temperatura da zona a um nível constante. São necessárias bombas para 
transferir a solução Do produto químico em estudo, bem como as águas 
residuais decantadas, para os recipientes de arejamento, com o caudal re ­
querido (0-1,0 ml/min e 0-25 ml/min, respetivamente), e uma terceira bomba para remover os resíduos de lamas dos recipientes de arejamento. O neces ­
sário caudal muito baixo de resíduos de lamas é obtido por recurso a uma 
bomba fixada a um caudal mais elevado, funcionando de forma intermitente sob o comando de um temporizador (por exemplo, 10 segundos por minuto, com um caudal de 3 ml/min, produzindo, assim, uma taxa de remoção de 
0,5 ml/min).
 
Dispositivo de filtração ou centrifugação  
13. Aplica-se o descrito no capítulo C10 A, ponto 23.  
Equipamento de análise  
14. Aplica-se o descrito no capítulo C.10-A, ponto 24.  
Água  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1086
 
15. Aplica-se o descrito no capítulo C.10-A, pontos 25 e 26.  
Meio orgânico  
16. Aplica-se o descrito no capítulo C.10-A, ponto 27.  
Águas residuais sintéticas  
17. Aplica-se o descrito no capítulo C.10-A, ponto 28.  
Águas residuais domésticas  
18. Aplica-se o descrito no capítulo C.10-A, ponto 29.  
Lamas ativadas  
19. Aplica-se o descrito no capítulo C10 A, ponto 30.  
Soluções-mãe do produto químico em estudo  
20. Aplica-se o descrito no capítulo C.10-A, pontos 31 e 32.  
PROCEDIMENTO  
Preparação do inóculo  
21. Aplica-se o descrito no capítulo C.10, ponto 34 — utilizar lamas ativadas 
(cerca de 2,5 g/l).  
Número de unidades de ensaio  
22. Para um ensaio simples, ou seja, para medir a percentagem de eliminação, 
apenas é necessário um STF; contudo, para obter os dados necessários ao 
cálculo das constantes cinéticas, deve dispor-se de 4 ou 5 valores de STF. Selecionam-se, em geral, valores compreendidos entre 2 e 10 dias. Na 
prática, é conveniente realizar em simultâneo um ensaio com 4 ou 5 
SRT, a uma dada temperatura, em estudos mais aprofundados, utilizam-se os mesmos SRT, ou, eventualmente, uma gama diferente de valores, a outras temperaturas na gama 5-20 °C. Para a biodegradação primária (prin ­
cipal utilização), apenas se necessita, em geral, de uma unidade por conjunto 
de condições. No entanto, para a determinação da biodegradabilidade final, é necessária, para cada conjunto de condições, uma unidade de controlo que processe as águas residuais sem o produto químico em estudo. Caso se 
suponha que este está presente nas águas residuais utilizadas, é necessário 
recorrer a unidades de controlo para avaliar a biodegradação primária e efetuar as necessárias correções nos cálculos.
 
Introdução do meio orgânico e do produto químico em estudo  
23. Aplica-se o descrito no capítulo C.10-A, pontos 36 a 39; de salientar, 
contudo, que o produto químico em estudo é adicionado separadamente e 
que são utilizados vários caudais de remoção de lamas. Controlar e ajustar 
também frequentemente, se necessário, com uma precisão de 10 %, os caudais dos afluentes, dos efluentes e da remoção de lamas, por exemplo, duas vezes por dia. Se surgirem dificuldades com os métodos analíticos ao 
utilizar águas residuais domésticas, realizar o ensaio com o efluente sinté ­
tico, garantindo, porém, que os meios diferentes originam dados cinéticos comparáveis.
 
Processamento das lamas ativadas  
24. Aplica-se o descrito no capítulo C.10-A, pontos 40 a 43, controlando, 
porém, o SRT através da eliminação constante de lamas.  
Amostragem e análise  
25. Aplica-se o descrito no capítulo C.10-A, pontos 44 a 50, determinando 
obrigatoriamente a concentração do profuto químico em estudo e, facultati ­
vamente, o COD; não deve utilizar-se a CQO.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1087
 
DADOS E RELATÓRIOS  
Tratamento dos resultados  
26. Aplica-se o descrito no capítulo C.10-A, pontos 52 a 54.  
Apresentação dos resultados do ensaio  
27. Aplica-se o descrito no capítulo C.10-A, pontos 56 a 62.  
Cálculo das constantes cinéticas  
28. É mais realista exprimir a concentração média do produto químico em 
estudo no efluente, no estado estacionário, e descrever o modo como varia, nas condições de funcionamento da instalação, do que exprimir a percenta ­
gem de biodegradação primária. Para tal, pode recorrer-se à equação (6) do 
apêndice 6.2, que pode fornecer valores para os parâmetros K
 S , μ m e θ SC , 
tempo crítico de retenção das lamas.  
(em alternativa, podem obter-se valores de K  S e μ m utilizando um programa 
informático simples que adapte aos valores experimentais obtidos a curva 
teórica determinada a partir da equação 2 (apêndice 6.2). Embora a solução 
obtida não seja única, pode obter-se um valor aproximado razoável dos parâmetros K
 S e μ m ). 
Variabilidade dos resultados  
29. Sabe-se pela experiência que cada produto químico produz valores diferen ­
tes de parâmetros cinéticos. Pensa-se que as condições de cultivo das lamas, bem como as condições de ensaio utilizadas (cf. ponto 5 e outros ensaios), 
influenciam de modo considerável os valores obtidos. Um aspeto desta 
variabilidade foi debatido por Grady  et al.  (4), que sugeriram a utilização 
dos termos "permanentes" e "intrínsecas" para qualificar duas condições extremas que representam os limites do estado fisiológico de uma cultura 
durante um ensaio cinético. Se não forem possíveis mudanças de estado 
durante o ensaio, os valores dos parâmetros cinéticos refletem as condições do ambiente do qual foram extraídos os microrganismos; estes valores são chamados "permanentes". No extremo oposto, se as condições de ensaio 
forem de molde a permitir o pleno desenvolvimento do sistema de síntese 
proteica que proporcione a taxa de crescimento máxima, os parâmetros cinéticos obtidos são "intrínsecos" e apenas dependentes da natureza do substrato e dos tipos de bactérias na cultura. A título de orientação, os 
valores existentes são obtidos mantendo um rácio baixo (por exemplo, 
0,025) de concentração do substrato para microrganismos adequados (S
 o / 
/X o ), surgindo os valores intrínsecos quando o rácio é elevado (por exemplo, 
não inferior a 20). Em ambos os casos, o valor S  o deve ser igual ou superior 
ao valor de Ks (constante de auto-saturação).  
30. A variabilidade, juntamente com outros aspetos da cinética da biodegrada ­
ção, foi debatida num seminário recente da SETAC (5). Esses estudos, 
realizados ou projetados, permitirão uma visão mais clara da cinética dos processos nas estações de tratamento de águas residuais, tendo em vista uma 
melhor interpretação dos dados existentes e propor modelos mais adequados 
para os futuros métodos de ensaio.
 
REFERÊNCIAS:  
(1) Birch R.R. (1982). The biodegradability of alcohol ethoxylates. XIII  Jornado 
Com. Español Deterg .: 33-48.  
(2) Birch R.R. (1984). Biodegradation of nonionic surfactants. J.A.O.C.S., 61(2): 
340-343.  
(3) Birch R.R. (1991). Prediction of the fate of detergent chemicals during 
sewage treatment.  J. Chem. Tech. Biotechnol ., 50: 411-422.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1088
 
(4) Grady C.P.L., Smets B.F., Barbeau D.S. (1996). Variability in kinetic para ­
meter estimates: A review of possible causes and a proposed terminology.  
Wat. Res ., 30 (3): 742-748.  
(5) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997). Workshop realizado em Port Sunlight, Reino Unido. Eds. Hales S.G., Feitjel T., King H., Fox K., Verstraete W. 4-6 Set. 1996. 
SETAC- Europe, Bruxelas.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1089
 
Apêndice 6.1  
Vaso poroso com controlo do SRT
  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1090
 
Apêndice 6.2  
Cálculo das constantes cinéticas  
1. Assumindo a aplicabilidade da cinética de Monod e um equilíbrio de massas 
dos sólidos ativos e do substrato no sistema de lamas ativadas (1), podem obter-se as seguintes expressões para os estados estacionários:
 
1 
θ s ¼ μ m · S 1 
K s þ S 1 Ä K d [1] 
ou 
S 1 ¼ K s · ð1 þ K d · θ s Þ 
θ s · ðμ m Ä K d Þ Ä 1 [2] 
em que  
S 1 = concentração de substrato no efluente (mg/l)  
K S = constante de meia saturação (concentração à qual μ = μ m /2 (mg/l)  
μ = taxa de crescimento específica (d  –1 ) 
μ m = valor máximo de μ m (d –1 ) 
K d = taxa de eliminação específica dos sólidos ativos (d  –1 ) 
θ S = tempo médio de retenção das lamas, SRT (d)  
O exame desta equação conduz às seguintes conclusões:  
i) a concentração do efluente é independente da do afluente (S  0 ); por con ­
seguinte, a percentagem de biodegradação varia com a concentração do efluente, S
 0 ; 
ii) o único parâmetro de controlo da instalação que afeta a concentração S  1 
é o tempo de retenção das lamas, θ S ; 
iii) a cada concentração no afluente, S  0 , corresponde um tempo crítico de 
retenção das lamas, da seguinte forma:  
1 
θ SC ¼ μ s · S 0 
K s þ S 0 Ä K d [3] 
em que  
θ SC = tempo crítico de retenção das lamas, abaixo do qual os micro ­
rganismos competentes são eliminados da instalação.  
iv) uma vez que os outros parâmetros da equação (2) estão associados à 
cinética do crescimento, a temperatura é suscetível de afetar o nível de 
substrato no efluente e o tempo de permanência crítico das lamas, ou seja, o tempo de retenção das lamas necessário para obter um certo nível de tratamento aumenta à medida que diminui a temperatura.
 
2. A partir de um equilíbrio de massas de sólidos no sistema de vasos porosos, 
e partindo do princípio de que a concentração de sólidos no efluente da instalação, X
 2 , é reduzido em comparação com a do tanque de arejamento, 
X 1 , o tempo de retenção das lamas é dado por:  
θ s ¼ V · X 1 
ðQ 0 Ä Q 1 Þ · X 2 þ Q 1 · X 1 [4] ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1091
 
e 
θ s ¼ V · X 1 
Q 1 · X 1 ¼ V 
Q 1 
em que  
V = volume do tanque de arejamento (l)  
X 1 = concentração de sólidos no tanque de arejamento (mg/l)  
X 2 = concentração de sólidos no efluente (mg/l)  
Q 0 = caudal do afluente (l/d)  
Q 1 = caudal dos resíduos de lamas (l/d)  
É, pois, possível manter o tempo de retenção das lamas a um determinado 
valor pré-selecionado através do controlo do caudal dos resíduos de lamas, Q
 1 . 
Conclusões  
3. O principal objetivo do ensaio consiste em permitir prever a concentração do 
efluente e, por conseguinte, os níveis do produto químico em estudo nas 
águas recetoras.  
4. Representando graficamente S  1 versus  θ S , pode, por vezes, avaliar-se rapida ­
mente o tempo crítico de retenção das lamas, θ SC (exemplo: curva 3 da figura 
1). Se tal não for possível, pode calcular-se θ SC , obtendo também valores 
aproximados de μ m e K  S , representando S  1 , versus  S 1 · θ S . 
Rearranjando a equação (1), obtém-se  
S 1 · θ s 
1 þ θ s · K d ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [5] 
Se o valor K  d for baixo, 1 + θ s · K  d ~ 1 e a equação [5] assume a forma:  
S 1 · θ s ¼ K s 
μ m þ S 1 
μ m [6] 
O gráfico deve, pois, ser uma linha reta (figura 2) de declive 1/ μ m e ordenada 
na origem K  S /μ m ; além disso, θ S ~1/μ m . ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1092
 
Figura 1  
Três temperaturas; cinco SRT
  
Figura 2  
Regressão linear SRT · S 1 versus  S 1 (T = 5 °C)
  
Glossário:  
Concentração do efluente  
Curva  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1093
Apêndice 7  
ENSAIO NUMA GAMA BAIXA DE CONCENTRAÇÕES ( μg/l) 
1. Muitos produtos químicos encontram-se presentes no meio aquático, inclu ­
sive nas águas residuais, a muito baixas concentrações ( μg/l). Nessas con ­
centrações, não podem, provavelmente, constituir substratos primários para o crescimento bacteriano, mas é maior a probabilidade de se decomporem 
como substratos secundários, em competição com uma vasta gama de com ­
postos de carbono de ocorrência natural. A decomposição desses produtos não se adapta, pois, ao modelo descrito no apêndice 6. Existem vários modelos suscetíveis de serem aplicados e, nas condições inerentes aos sis ­
temas de tratamento de águas residuais, pode utilizar-se mais de um sistema 
em simultâneo. É necessário prosseguir a investigação com vista a elucidar esta questão.
 
2. Entretanto, pode seguir-se o procedimento descrito no texto principal (capí ­
tulo C.10-A), mas apenas no respeitante à biodegradabilidade primária, utilizando uma gama adequada de baixas concentrações (< 100 μg/l) e 
um procedimento analítico validado. A percentagem de biodegradação 
pode ser calculada (ponto 54 do método de ensaio) tendo em conta os 
processos abióticos (adsorção, volatilidade etc.). Nyholm e seus colaborado ­
res (1)(2) realizaram um estudo utilizando um ciclo de 4 h num sistema "enchimento-esvaziamento", tendo comunicado a obtenção de constante de 
pseudo-primeira ordem para cinco produtos químicos adicionados a um 
efluente sintético (5 a 100 μg/l). No caso da biodegradabilidade final, podem 
utilizar-se substâncias marcadas com
 14 C. A descrição deste procedimento 
excede o âmbito do presente método de ensaio, dado não existirem ainda 
procedimentos aprovados, embora tenha sido proposto um método 
(ISO 14592 (3)) que contém orientações para a utilização de produtos químicos marcadas com
 14 C. 
Ensaio SCAS  
3. Posteriormente, foi proposto um ensaio mais simples, em duas fases 
(4)(5)(6); o método semi-contínuo das lamas ativadas ( semi-continuous ac ­
tivated sludge  - SCAS) é seguido de ensaios cinéticos curtos com amostras 
colhidas nas unidades SCAS. Contrariamente ao método de ensaio original C.12, o sistema SCAS funciona com caudais conhecidos de remoção de lamas e utiliza águas residuais sintéticas OCDE ou águas residuais domés ­
ticas. Em virtude da variabilidade do pH e da reduzida decantabilidade das 
lamas, as águas residuais sintéticas são modificadas por adição de tampão de fosfatos, extrato de levedura, cloreto de ferro (III) e quantidades vestigiais de sais, sendo a sua CQO aumentada para cerca de 750 mg/l através do 
reforço da concentração de peptona e extrato de carne. As unidades funcio ­
nam num ciclo de 24 h: arejamento durante 23 h, remoção das lamas, decantação, remoção do sobrenadante (efluente) seguida de adição das águas residuais sintéticas com o produto químico em estudo, até perfazer 100 μg/l, 
(aproximadamente a mesma concentração utilizada no ensaio curto). Uma 
vez por semana, 10 % das lamas totais substituem-se por lamas recentes, para manter o equilíbrio da população microbiana.
 
4. Determinan-se as concentrações inciais e finais do produto químico em 
estudo no início e no final da fase de arejamento, prosseguindo-se o ensaio 
até se alcançar uma remoção constante do profuto químico, o que pode levar de uma semana a vários meses.
 
Ensaio curto  
5. Efetua-se um ensaio curto (p.ex., oito horas) para determinar a constante 
cinética de pseudo-primeira ordem para a eliminação do produto químico 
em estudo em lamas ativadas com origens e historiais conhecidos mas dife ­
rentes. São colhidas, nomeadamente, amostras de lamas dos reatores SCAS, no termo de um período de arejamento (em que a concentração de substrato orgânico é baixa), num ensaio de aclimatação (pontos 3 e 4). Podem também 
recolher-se lamas de uma unidade SCAS paralela não exposta ao produto 
químico em estudo, para fins comparativos. Procede-se ao arejamento de
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1094
 
misturas de lamas e do produto químico em estudo, adicionado em duas ou 
mais concentrações na gama 1-50 μg/l, sem águas residuais sintéticas ou 
outro substrato orgânico. O produto químico em estudo remanescente na solução é determinado a intervalos regulares (p.ex. de hora a hora), con ­
soante a sua degradabilidade, por um período não superior a 24 h. As 
amostras são centrifugadas antes de sujeitas a análise adequada.
 
Cálculos  
6. Os dados das unidades SCAS são utilizados para calcular a percentagem de 
remoção do produto químico em estudo (ponto 54). Por outro lado, a cons ­
tante média de velocidade, K  1 , (corrigida para ter em conta a concentração 
de sólidos em suspensão) pode ser calculada do seguinte modo:  
K 1 ¼ 1=t · ln C e 
C i · 1=SSð1=g hÞ 
em que  
t = tempo de arejamento (23 h)  
C e = concentração no final do período de arejamento ( μg/l) 
C i = concentração no início do arejamento ( μg/l) 
SS = concentração de sólidos nas lamas ativadas (g/l)  
7. No ensaio curto, o logaritmo da concentração percentual remanescente é 
representado em função do tempo; o declive da parte inicial (10-50 % de degradação) da curva é equivalente a K
 1 , constante de pseudo-primeira 
ordem. Esta é corrigida para ter em conta a concentração de sólidos nas 
lamas dividindo o declive por esta última concentração. Os resultados co ­
municados devem incluir pormenores relativos às concentrações iniciais de produto químico em estudo e de sólidos em suspensão, ao tempo de reten ­
ção das lamas, à origem e à carga destas e, se pertinente, à exposição prévia 
ao produto químico em estudo.
 
Variabilidade dos resultados  
8. A variabilidade, juntamente com outros aspetos da cinética da biodegrada ­
ção, foi debatida num seminário recente da SETAC (7). Esses estudos, realizados ou projetados, permitirão uma visão mais clara da cinética dos 
processos nas estações de tratamento de águas residuais, tendo em vista uma 
melhor interpretação dos dados existentes e propor modelos mais adequados para os futuros métodos de ensaio.
 
REFERÊNCIAS  
(1) Nyholm N., Jacobsen B.N., Pedersen B.M., Poulsen O., Dambourg A., 
Schultz B. (1992). Removal of micropollutants in laboratory activated sludge 
reactors. Biodegradability.  Wat. Res . 26: 339-353.  
(2) Jacobsen B.N., Nyholm N., Pedersen B.M., Poulsen O., Ostfeldt P. (1993): 
Removal of organic micropollutants in laboratory activated sludge reactors 
under various operating conditions: Sorption.  Wat. Res . 27: 1505-1510.  
(3) ISO 14592 (ISO/TC 147/SC5/WG4, N264) (1998). Water Quality - Evalua ­
tion of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concen ­
trations in water.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1095
 
(4) Nyholm N., Ingerslev F., Berg U.T., Pedersen J.P., Frimer-Larsen H. (1996): 
Estimation of kinetic rate constants for biodegradation of chemicals in acti ­
vated sludge waste water treatment plants using short-term batch experiments and μg/l range spiked concentrations  Chemosphere  33 (5): 851-864.
 
(5) Berg U.T., Nyholm N. (1996): Biodegradability simulation Studies in 
semi-continuous activated sludge reactors with low ( μg/l range) and standard 
(ppm range) chemical concentrations.  Chemosphere  33 (4): 711-735.  
(6) Danish Environmental Protection Agency: (1996). Activated sludge biode ­
gradability simulation test. Environmental Project, No. 337. Nyholm, N. Berg, U.T. Ingerslev, F. Min. of Env. and Energy, Copenhagen.
 
(7) Biodegradation kinetics: Generation and use of data for regulatory decision 
making (1997):  Workshop  realizado em Port Sunlight, Reino Unido. Eds. 
Hales, SG. Feitjel, T. King, H. Fox, K., Verstraete, W. 4-6 Set. 1996. SETAC- Europe, Bruxelas.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1096
 
C.10-B: Biofilmes  
INTRODUÇÃO  
1. Em geral, os ensaios de simulação aplicam-se a produtos químicos não 
aprovados num ensaio de rastreio da biodegradabilidade imediata [capítulo C.4, A a F, do presente anexo (9)], mas aprovados num ensaio de biode ­
gradabilidade inerente. Excecionalmente, os ensaios de simulação podem 
também aplicar-se a qualquer produto químico em relação ao qual sejam 
necessárias mais informações, em especial produtos químicos produzidas em grandes quantidades, para o que se recorre, em geral, a um ensaio de lamas ativadas (C.10-A). Em alguns casos, contudo, são necessárias informações 
específicas sobre o comportamento de um produto químico com a aplicação 
de métodos de tratamento de águas residuais com recurso a biofilmes, nomeadamente filtros percoladores ou biológicos, contratores rotativos bio ­
lógicos e leitos fluidizados. Para tal, foram desenvolvidos vários dispositi ­
vos.
 
2. Gerike  et al.  (1) utilizaram filtros biológicos de grandes dimensões, à 
escala-piloto, em modo interligado. Estes filtros ocupam muito espaço e necessitam de volumes relativamente elevados de águas residuais, sintéticas ou não. Truesdale  et al.  (2) descreveram um sistema que utiliza filtros mais 
pequenos (6 pés x 6 polegadas de diâmetro), alimentados com águas resi ­
duais naturais isentas de tensioativos, mas que requerem, mesmo assim, volumes elevados. Podem ser necessárias 14 semanas para a "maturação" de um bifilme e 4 a 8 semanas adicionais, após a primeira introdução do 
tensioativo em estudo, para que se registe aclimatação.
 
3. Baumann  et al.  (3) desenvolveram um filtro muito mais pequeno de poliés ­
ter "aveludado" previamente embebido em lama ativada (suporte inerte). O produto químico em estudo constitui a única fonte de carbono; a biodegra ­
dabilidade é avaliada através de determinações do carbono orgânico 
dissolvido (COD) no afluente e no efluente, bem como da quantidade de 
CO
 2 nos gases libertados.  
4. Gloyna  et al.  (4) utilizaram uma abordagem radicalmente diferente, tendo 
inventado o reator tubular rotativo. Procedeu-se à cultura de um biofilme na superfície interna do tubo rotativo, mediante passagem de afluente introdu ­
zido no topo do tubo, inclinado num ângulo ligeiro relativamente à hori ­
zontal. O reator foi utilizado para estudar a biodegradabilidade dos tensioa ­
tivos (5), bem como para investigar a espessura ótima do biofilme e a difusão através do mesmo (6). Posteriormente, estes autores introduziram aperfeiçoamentos no reator, alterando-o, nomeadamente para poderem de ­
terminar o CO
 2 nos gases libertados.  
5. O reator tubular rotativo foi desenvolvido pelo  Standing Committee of Ana ­
lysts (Reino Unido) como método-padrão para avaliar a biodegradabilidade 
de produtos químicos (7) e a tratabilidade e toxicidade das águas residuais (8). O método que se descreve tem como vantagens a simplicidade, a 
compacidade, a reprodutibilidade e a necessidade de quantidades relativa ­
mente baixas de meio orgânico.
 
PRINCÍPIO DO MÉTODO  
6. As águas residuais, sintéticas ou domésticas, e o produto quíimico em 
estudo, simples ou em mistura, entram em contacto com a superfície interna 
de um tubo rotativo ligeiramente inclinado. Assiste-se à formação, na su ­
perfície interna, de uma camada de microrganismos semelhante à que se observa nos biofiltros. As condições de funcionamento do reator são esco ­
lhidas de forma a proporcionarem uma eliminação adequada da matéria 
orgânica e, se necessário, a oxidação do ião amónio.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1097
 
7. Recolhe-se o efluente do tubo, que é decantado e/ou filtrado antes da de ­
terminação do COD e/ou do produto químico em estudo por um método 
específico. As unidades de controlo que não utilizam o produto químico em estudo funcionam em paralelo, nas mesmas condições, para fins comparati ­
vos. Considera-se que a diferença entre as concentrações de COD nos 
efluentes das unidades de ensaio e de controlo é devida ao produto químico 
em estudo e aos seus metabolitos orgânicos. Esta diferença é comparada com a concentração do produto químico em estudo adicionado (expressa em COD), para o cálculo da eliminação deste.
 
8. Em princípio, é possível distinguir-se a biodegradação da bioadsorção atra ­
vés de um exame cuidadoso da curva eliminação  versus  tempo. Em geral, 
pode obter-se a confirmação por recurso a um ensaio de biodegradação 
rápida (consumo de oxigénio ou produção de dióxido de carbono), utili ­
zando um inóculo aclimatado colhido, no final do ensaio, nos reatores nos quais foi adicionado o produto químico em estudo.
 
INFORMAÇÕES SOBRE O PRODUTO QUÍMICO EM ESTUDO  
9. A pureza, a solubilidade em água, a volatilidade e as características de 
adsorção Do produto químico devem ser conhecidas, a fim de permitir a interpretação correta dos resultados.
 
10. Em geral, os produtos químicos voláteis e pouco solúveis não podem ser 
testados, salvo se forem tomadas precauções especiais (ver o capítulo C.10- 
-A, apêndice 5). A estrutura química ou, pelo menos, a fórmula empírica, devem também ser conhecidas para o cálculo dos valores teóricos e/ou a confirmação dos valores medidos dos parâmetros, como, por exemplo, a 
carência teórica de oxigénio (CTeO) e o COD.
 
11. O facto de se dispor de informações sobre a toxicidade do produto químico 
em estudo para os microrganismos (ver o capítulo C.10-A, apêndice 4) pode 
ser útil para selecionar concentrações de ensaio adequadas e pode ser es ­
sencial para a interpretação correta de valores baixos de biodegradação.  
NÍVEIS-LIMITE  
12. No passado, os tensioativos tinham de apresentar uma biodegradação pri ­
mária de, pelo menos, 80 %, para que os produtos pudessem ser comercia ­
lizados. Para percentagens inferiores, pode recorrer-se ao presente ensaio de 
simulação (confirmação) e o tensioativo só pode ser comercializado se 
remover mais de 90 % do produto químico em causa. Com a generalidade dos produtos químicos, não se coloca a questão de exceder ou de não atingir a percentagem de remoção obtida, que pode ser utilizada no cálculo apro ­
ximado da concentração ambiental provável a utilizar na avaliação dos 
riscos dos produtos químicos. Numa série de estudos de produtos químicos puros, observou-se uma percentagem de remoção de COD superior a 90 % em mais de três quartos das amostras e superior a 80 % em mais de 90 % 
das produtos que revelaram um grau significativo de biodegradabilidade.
 
SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
13. A fim de garantir a execução correta do processo experimental, é importante 
submeter a ensaios ocasionais substâncias de referência de comportamento 
conhecido. Essas substâncias incluem o ácido adípico, o 2-fenilfenol, o 1- 
-naftol, o ácido difénico e o ácido 1-naftóico.  
REPRODUTIBILIDADE DOS RESULTADOS DOS ENSAIOS  
14. Um laboratório no Reino Unido obteve os valores de 3,5 % para o 
desvio-padrão relativo intra-ensaios e de 5 % para o mesmo parâmetro 
inter-ensaios (7).  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1098
 
DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
Equipamento  
Reatores tubulares rotativos  
15. O dispositivo (ver figuras 1 e 2 no apêndice 8) é constituído por um 
conjunto de tubos acrílicos, cada um dos quais com 30,5 cm de compri ­
mento e 5 cm de diâmetro interno, suportados por rodas revestidas com borracha num suporte metálico. Cada tubo tem um entalhe exterior, com cerca de 0,5 cm de profundidade, para encaixe nas rodas; a superfície in ­
terna é endurecida com um fio de lã grosseira e existe um rebordo com 
0,5 cm de profundidade na extremidade superior (alimentação) para reter o líquido. Os tubos estão inclinados num ângulo de aproximadamente um grau em relação à horizontal, de forma a proporcionar o tempo de contacto 
necessário quando o meio de ensaio é introduzido num tubo limpo. As 
rodas revestidas com borracha rodam por ação de um motor de velocidade lenta ajustável. A temperatura dos tubos é controlada por instalação num compartimento com temperatura constante.
 
16. Introduzindo cada reator tubular num tubo ligeiramente maior, tapado, e 
assegurando a impermeabilidade gasosa das vedações, é possível recolher 
numa solução alcalina o CO  2 libertado, para posterior determinação (6).  
17. Durante 24 horas, introduz-se em cada tubo meio orgânico, se for caso disso 
com o produto químico em estudo, armazenado num recipiente de 20 l (a) 
(ver a figura 2). Se necessário, a solução do produto químico em estudo pode ser introduzida separadamente. Cada recipiente de armazenagem apre ­
senta, junto do fundo, um orifício do qual sai um tubo de um material 
adequado (por exemplo, de borracha de silicone), que, passando por uma 
bomba peristáltica (b), se liga a um tubo adutor de vidro ou de um material acrílico, o qual se liga 2-4 cm acima da extremidade mais elevada (de alimentação) do tubo inclinado (C). O efluente sai pela extremidade inferior 
do tubo inclinado, sendo recolhido noutro recipiente de armazenagem (D). É 
decantado ou filtrado antes da análise.
 
Dispositivo de filtração-centrifugação  
18. Dispositivo de filtração das amostras com filtros de membrana de porosi ­
dade adequada (diâmetro nominal da abertura: 0,45 m), que adsorva produ ­
tos químicos orgânicos solúveis ou liberte uma quantidade mínima de car ­
bono orgânico. Caso se utilizem filtros que libertem carbono orgânico, lavá- -los cuidadosamente com água quente, para eliminar o carbono orgânico 
lixiviável. Em alternativa, pode utilizar-se uma centrifugadora que produza 
40 000 m/s
 2 . 
19. Equipamento analítico para a determinação dos seguintes parâmetros:  
— COD/carbono orgânico total (COT) ou carência química de 
oxigénio (CQO),  
— produto químico específico (por HPLC, cromatografia em fase gasosa, 
etc.), se necessário,  
— pH, temperatura, acidez, alcalinidade,  
— amónio, nitritos e nitratos, se os ensaios forem executados em condições 
de nitrificação.  
Água  
20. Água da rede de abastecimento, com menos de 3 mg/l de COD.  
21. Água destilada ou desionizada, com menos de 2 mg/l de COD.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1099
Meio orgânico  
22. Podem ser utilizadas como meio orgânico águas residuais sintéticas, águas 
residuais domésticas ou uma combinação de ambas. Foi demonstrado que a utilização de águas residuais domésticas simples origina com frequência 
uma maior percentagem de remoção de COD em unidades de lamas ativa ­
das, permitindo mesmo a biodegradação de alguns produtos químicos que não sofrem biodegradação quando se utiliza o efluente sintético OCDE. Recomenda-se, pois, a utilização de águas residuais domésticas. Determinar 
a concentração de COD (ou a CQO) de cada novo lote de meio orgânico. 
Deve conhecer-se a acidez ou a alcalinidade deste. Se a acidez ou a alca ­
linidade do meio orgânico for baixa, pode ser necessário adicionar-lhe um 
tampão adequado (hidrogenocarbonato de sódio ou hidrogenofosfato de 
potássio), para manter o pH no reator a cerca de 7,5 ± 0,5, durante o ensaio. A quantidade de solução-tampão e o momento em que é adicionada devem ser decididos caso a caso.
 
Águas residuais sintéticas  
23. Dissolver. por litro de água da torneira: 160 mg de peptona; 110 mg de 
extrato de carne; 30 mg de ureia; 28 mg de hidrogenofosfato dipotássico anidro (K
 2 HPO  4 ); 7 mg de cloreto de sódio (NaCl); 4 mg de cloreto de 
cálcio di-hidratado (CaCl  2 .2H  2 O); 2 mg de sulfato de magnésio 
hepta-hidratado (MgSO  4 .7H  2 O). O efluente sintético OCDE constitui um 
exemplo e proporciona uma concentração média de COD no afluente de cerca de 100 mg/l. Em alternativa, podem utilizar-se composições mais próximas das das águas residuais em estudo, com uma concentração idêntica 
de COD. O efluente sintético, numa forma concentrada, pode ter por base 
água destilada, e ser armazenado a cerca de 1 °C durante uma semana, no máximo. Se necessário, diluir com água da rede de abastecimento (embora este meio não seja satisfatório — por exemplo, a concentração de azoto é 
muito elevada e o teor de carbono relativamente baixo —, não foram su ­
geridas alternativas melhores, exceto a adição de mais fosfato, no tampão, e de uma quantidade suplementar de peptona).
 
Águas residuais domésticas  
24. Utilizar águas residuais recentemente decantadas, recolhidas diariamente 
numa instalação de tratamento que processe predominantemente esgotos domésticos. A amostra deve ser recolhida da conduta de alimentação do tanque de decantação primária, ou da conduta de alimentação da instalação 
de lamas ativadas, e ter a menor quantidade possível de partículas grossei ­
ras. As águas residuais podem ser utilizadas após terem sido armazenadas durante vários dias a cerca de 4 °C, caso apresentem provas de que o COD (ou a CQO) não baixou significativamente (ou seja, mais de 20 %) durante a 
armazenagem. A fim de limitar perturbações do sistema, o COD (ou a 
CQO) de cada novo lote deve ser ajustado, antes da utilização, para um valor constante, por exemplo, através de diluição com água da rede de abastecimento.
 
Lubrificante  
25. Para a lubrificação dos rolos da bomba peristáltica, podem utilizar-se glice ­
rol ou azeite; ambos são adequados para utilização com tubos de borracha de silicone.
 
Soluções-mãe do produto químico em estudo  
26. Se a solubilidade dos produtos químicos for adequada, preparar soluções-mãe 
de reserva de concentrações adequadas (por exemplo, 1 a 5 g/l) em água desionizada, ou na fração mineral do efluente sintético. No caso de produtos químicos insolúveis, ver o apêndice 5 do capítulo C.10-A. Este método não é 
aplicável a produtos químicos voláteis sem alterações dos reatores tubulares 
(ponto 16). Determinar o COD e o COT da solução-mãe, repetindo as me ­
dições para cada novo lote. Se a diferença entre o COD e o COT for superior a 20 %, verificar a solubilidade em água do produto químico em estudo. 
Comparar com o valor nominal o COD ou a concentração do mesmo 
produto determinados por análise específica da solução-mãe, de forma a
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averiguar se a recuperação é suficiente (em geral, deve ser superior a 90 %). 
Verificar, em especial no caso das dispersões, se o COD pode ou não ser 
utilizado como parâmetro analítico, ou se é necessário utilizar uma técnica analítica específica para o produto químico em causa. No caso das disper ­
sões, é necessário proceder à centrifugação das amostras. Para cada novo 
lote, determinar o COD, a CQO ou o produto químico em estudo por meio 
de uma análise específica.
 
27. Determinar o pH da solução-mãe. A ocorrência de valores extremos indica 
que a adição do produto químico pode influenciar o pH das lamas ativadas no sistema de ensaio. Neste caso, neutralizar a solução de reserva com 
pequenas quantidades de ácido ou de base, de forma a obter um pH de 
7,0 ± 0,5, evitando, contudo, a precipitação do produto químico em estudo.
 
PROCEDIMENTO  
Preparação do meio orgânico para determinação  
28. Assegurar que os recipientes do afluente e do efluente, bem como a conduta 
entre o primeiro e o segundo, são bem limpos, de forma a eliminar qualquer proliferação de flora microbiana antes do ensaio e durante o mesmo.
 
29. Preparar o efluente sintético (ponto 23) diariamente, a partir dos sólidos ou 
da solução-mãe concentrada, por diluição adequada com água da rede de 
abastecimento. Medir, numa proveta, a quantidade necessária e adicionar a um recipiente limpo destinado a receber o afluente. Se necessário, juntar também a quantidade necessária de solução-mãe do produto químico em 
estudo e da substância de referência ao efluente sintético, antes de efetuar a 
diluição. Se for mais prático, ou necessário para evitar perdas do produto químico em estudo, preparar separadamente uma solução diluída desta em estudo num recipiente específico e aduzi-la aos tubos inclinados através de 
uma bomba doseadora.
 
30. Em alternativa (e de preferência), utilizar águas residuais domésticas decan ­
tadas (ponto 24) recolhidas diariamente, se possível.  
Funcionamento dos reatores tubulares rotativos  
31. Para a determinação de um produto químico em estudo, são necessários dois 
reatores tubulares idênticos, montados num compartimento a temperatura constante (em geral, 22 ± 2 °C).
 
32. Ajustar as bombas peristálticas para um caudal de 250 ± 25 ml/h do meio 
orgânico (sem o produto químico em estudo) para os tubos inclinados, que se fazem rodar a 18 ± 2 rpm. Lubrificar (ponto 25) os tubos de bombagem no início, bem como, periodicamente, ao longo do ensaio, de modo a 
assegurar o seu bom funcionamento e prolongar a sua vida útil.
 
33. Ajustar o ângulo de inclinação dos tubos relativamente à horizontal, de 
forma a obter um tempo de permanência adequado das matérias nos tubos limpos de 125 ± 12,5. Estimar o tempo de retenção, adicionando à matéria- 
-prima um marcador não biológico (p.ex. NaCl ou um corante inerte): o 
tempo necessário para atingir a concentração máxima no efluente é consi ­
derado o tempo médio de retenção (se estiver presente uma quantidade máxima de filme, o tempo de retenção pode aumentar até cerca de 30 min).
 
34. Os referidos caudais, velocidades e tempos são aqueles que se verificou 
conduzirem a taxas de eliminação adequadas (> 80 %) de COD ou CQO 
e à produção de efluentes nitrificados. Se a taxa de eliminação for insufi ­
ciente, ou se pretender simular o desempenho de uma determinada estação de tratamento, o caudal deve ser alterado. Neste caso, ajustar o caudal de 
adição do meio orgânico até o desempenho do reator ser equivalente ao da 
estação de tratamento.
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Inoculação  
35. Se forem utilizadas águas residuais sintéticas, a inoculação proprocionada 
pelo ar ambiente pode ser bastante para iniciar a proliferação dos microrga ­
nismos; se tal não for o caso, adicionar 1 ml/l de águas residuais decantadas 
à fonte de alimentação, durante 3 dias.  
Medições  
36. Verificar regularmente se os caudais e as velocidades de rotação se encon ­
tram dentro dos limites requeridos. Determinar também o pH do efluente, 
em especial se for previsível a ocorrência de nitrificação.  
Amostragem e análise  
37. O método, os padrões e a frequência da amostragem são escolhidos de 
acordo com o objetivo do ensaio. Colher, por exemplo, amostras pontuais do afluente e do efluente, ou colher amostras durante um período mais 
longo, por exemplo, 3-6 h. No primeiro período (sem o produto químico 
em estudo), colher amostras duas vezes por semana. Filtrar as amostras com membranas ou centrifugar a cerca de 40 000 m/s
 2 durante cerca de 15 
minutos (ponto 18). Pode ser necessário decantar as amostras e/ou filtrá- 
-las com um filtro grosseiro antes da filtração com membrana. Determinar o 
COD, ou a CQO, pelo menos em duplicado, bem como, se necessário, a CBO, o amónio e os nitritos/nitratos.
 
38. As análises devem ser efetuadas o mais rapidamente possível após a colheita 
e a preparação das amostras. Se for necessário adiar a realização das aná ­
lises, armazenar as amostras a cerca de 4 °C, na obscuridade, em garrafas 
hermeticamente fechadas. Se as amostras tiverem de ser armazenadas por um período superior a 48 horas, conservá-las por congelação, acidificação ou por adição de uma substância tóxica, por exemplo, 20 ml/l de solução a 
10 g/l de cloreto de mercúrio (II). Assegurar que a técnica de conservação 
não influencia os resultados da análise.
 
Período de desenvolvimento  
39. Neste período, a superfície do biofilme aumenta até atingir uma espessura 
ótima, o que leva, geralmente, cerca de 2 semanas, não devendo exceder seis semanas. A eliminação de COD ou de CQO (ponto 44) aumenta até atingir um valor estacionário. Quando tiver sido atingida a fase de patamar, 
registando-se em valor equivalente em ambos os tubos, seleciona-se um 
destes como testemunha para o resto do ensaio, durante o qual o seu desempenho deverá permanecer constante.
 
Introdução do produto químico em estudo  
40. Adicionar ao outro reator, nesta fase, o produto químico em estudo na 
concentração requerida, geralmente da ordem de 10-20 mg C/l. O reator de controlo continua a processar apenas o meio orgânico.
 
Período de aclimatação  
41. Continuar a realizar duas vezes por semana a análise do COD ou da CQO; 
caso se pretenda avaliar a biodegradabilidade primária, medir também a 
concentração do produto químico em estudo através de um método de 
análise específico. Prever de uma a seis semanas (ou, em condições espe ­
ciais, um período mais longo) para a aclimatação, na sequência da introdu ­
ção do produto químico em estudo. Quando a percentagem de remoção 
(pontos 43-45) atingir um valor máximo, obter 12-15 valores válidos na 
fase de patamar durante cerca de três semanas, para avaliação da percenta ­
gem de remoção média. Considera-se o ensaio concluído quando for obtido um nível de eliminação suficientemente elevado. A duração do ensaio não 
deve, em geral, exceder 12 semanas após a adição do produto químico em 
estudo.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1102
 
Eliminação de crostas do filme  
42. A eliminação súbita de grandes quantidades de filme em excesso dos tubos 
(crostas) ocorre a intervalos relativamente regulares. Para garantir que a comparabilidade dos resultados não é afetada, os ensaios devem abranger, 
pelo menos, dois ciclos completos de cultura e eliminação de crostas.
 
DADOS E RELATÓRIOS  
Tratamento dos resultados  
43. Calcular a percentagem de remoção do prpoduto químico em estudo, em 
termos de COD ou de CQO, para cada avaliação programada, por recurso à equação:
 
D t ¼ 100 ½C s Ä ðE Ä E o Þâ=C s % 
em que  
D t = % de eliminação do COD ou da CQO no instante  t 
Cs = concentração de DOC (ou COD) no afluente devida ao produto 
químico em estudo, estimada, de preferência, a partir da concentra ­
ção, em mg/l, da solução-mãe e do volume desta adicionado;  
E = valor medido de COD ou CQO no efluente em estudo, no instante  t 
(mg/l)  
Eo = valor medido de COD ou CQO no efluente em estudo, no instante  t 
(mg/l)  
Repetir o cálculo para a substância de referência, se tiver sido utilizada.  
Desempenho do reator-testemunha  
44. O grau de eliminação (D  B ) de COD ou de CQO do meio orgânico da 
unidade de controlo é uma informação útil para avaliar a atividade de 
biodegradação do biofilme durante o ensaio. Calcular a percentagem de 
eliminação por recurso à equação:  
D B ¼ 100 ð1 Ä E o=C m Þ % 
em que  
Cm = COD ou CQO do meio orgânico no afluente de controlo (mg/l)  
45. Calcular a remoção (D  ST ) do produto químico em estudo, se determinada 
por um método analítico específico, em cada instante, com base na equação:  
DST ¼ 100 ð1 Ä S e=S i Þ % 
em que  
S i = concentração medida ou (de preferência) estimada do produto quí ­
mico em estudo no afluente (mg/l)  
S e = concentração medida ou estimada do produto químico em estudo no 
efluente, no instante  t (mg/l)  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1103
 
Se o método de análise conduzir a um valor positivo nas lamas inalteradas, 
equivalente a S  c mg/l, calcular a percentagem de eliminação (D  SC ) com base 
na seguinte equação:  
DSC ¼ 100 ðS i Ä S e þ S c Þ=ðS i þ S c Þ % 
Apresentação dos resultados do ensaio  
46. Traçar o gráfico da percentagem de eliminação, D  t (ou D  SC ) e D  ST , se for o 
caso, em função do tempo (ver o capítulo C.10-A, apêndice 2). Considerar a média (arredondada ao número inteiro mais próximo) e o desvio-padrão dos 
valores dos 12-15 valores de D
 T (e de D  ST , se disponíveis) obtidos na fase 
de patamar como a percentagem de remoção do produto químico em estudo. A forma da curva de eliminação permite tirar algumas conclusões quanto aos processos de remoção.
 
Adsorção  
47. Caso se observe uma elevada remoção de COD do produto químico em 
estudo no início do ensaio, o produto em causa é, provavelmente, removido 
por adsorção no biofilme. Esta suposição pode ser comprovada determi ­
nando a quantidade de produto adsorvido nos sólidos removidos do filme. Não é comum que a eliminação do COD das substâncias adsorvíveis per ­
maneça elevada ao longo do ensaio; em geral, observa-se um elevado grau 
de eliminação no início, que baixa progressivamente para um valor de 
equilíbrio. Contudo, se a substância em estudo adsorvida tiver causado a aclimatação da flora microbiana, a eliminação do seu COD poderá aumentar posteriormente, estabilizando-se em valores elevados.
 
Fase de latência  
48. Muitos produtos químicos em estudo passam por uma fase de latência, antes 
de ocorrer a biodegradação completa, nomeadamente nos ensaios estáticos 
de rastreio. Na fase de latência, ocorre a aclimatação ou adaptação das bactérias responsáveis pela degradação, não se observando praticamente qualquer remoção do produto; a proliferação das bactérias inicia-se em 
seguida. Esta fase termina, considerando-se que se inicia a fase de degrada ­
ção, quando for removida cerca de 10 % da quantidade inicial de produto químico em estudo (após a adsorção, caso ocorra). Em geral, a fase de latência é muito variável e pouco reprodutível.
 
Fase de patamar  
49. A fase de patamar da curva de eliminação de um ensaio contínuo é definida 
como a fase em que ocorre a degradação máxima. Deve durar, pelo menos, 
3 semanas, durante as quais se devem determinar cerca de 12-15 valores 
válidos.  
Grau de remoção médio do produto químico em estudo  
50. Calcular o valor médio a partir dos valores de eliminação (D  t e D  st , se 
disponível) obtidos para o produto químico em estudo na fase de patamar. O grau de remoção do produto químico em estudo é arredondado ao número inteiro mais próximo (1 %). Recomenda-se também o cálculo do intervalo 
de confiança de 95 % do valor médio. Calcular do mesmo modo o grau 
médio (D
 B ) de eliminação do meio orgânico no recipiente de controlo.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1104
 
Indicação da biodegradação  
51. Se o produto químico em estudo não for adsorvido de forma significativa 
pelo biofilme e a curva de eliminação tiver a forma característica de uma curva de biodegradação com fases de latência, degradação e patamar (pontos 
48 e 49), a eliminação determinada pode ser atribuída com segurança à 
biodegradação. Se ocorrer uma elevada remoção inicial, o ensaio de simu ­
lação não permite distinguir os processos de eliminação biológicos dos abióticos. Nesses casos, e noutros casos em que existam dúvidas quanto a 
biodegradação (por exemplo, se ocorrer separação), analisar o produto quí ­
mico em estudo adsorvido em amostras do filme ou efetuar mais ensaios estáticos de rastreio da biodegradabilidade com base em parâmetros que 
comprovem claramente os processos biológicos. Esses ensaios devem con ­
sistir em métodos baseados no consumo de oxigénio (capítulo C.4 do pre ­
sente anexo D, E e F) (9) ou num teste que meça a produção de CO
 2 
(capítulo C.4-C do presente anexo, ou o método  headspace ) (10); utilizar 
como inόculo biofilme pré-exposto proveniente do reator adequado.  
52. Se tiverem sido determinadas a remoção do COD e a eliminação de subs ­
tâncias específicas, a ocorrência de diferenças significativas entre as per ­
centagens (primeiro valor superior ao segundo) indicam a presença nos 
efluentes de substâncias orgânicas intermediárias cuja degradação pode ser mais difícil. Estas substâncias devem ser objeto de investigação.
 
Validade dos resultados  
53. Considerar o ensaio válido se o grau de eliminação do COD (ou de CQO) 
(D B ) nas unidades de controlo for superior a 80 % após 2 semanas de 
funcionamento sem se observarem ocorrências relevantes.  
54. Se a substância de referência utilizada apresentar uma biodegradabilidade 
"fácil", o grau de biodegradação deve ser > 90 % e a diferença entre os duplicados não deve exceder 5 %. Caso estes dois critérios não sejam sa ­
tisfeitos, rever os procedimentos experimentais e/ou utilizar águas residuais 
domésticas de outra origem.
 
55. Do mesmo modo, as diferenças entre os valores de biodegradação das 
unidades em duplicado (se utilizadas) que processem um produto químico 
em estudo não devem divergir em mais de 5 %. Se este critério não for respeitado, mas a eliminação permanecer elevada, prosseguir a análise por um período de mais três semanas. Se a eliminação for baixa, investigar os 
efeitos inibidores do produto químico em estudo, caso não sejam conheci ­
dos, e repetir o ensaio com uma concentração inferior do produto, se pos ­
sível.
 
Relatório do ensaio  
56. O relatório do ensaio deve incluir as seguintes informações:  
Produto químico em estudo:  
— dados de identificação,  
— natureza física e, quando pertinente, propriedades físico-químicas.  
Condições de ensaio:  
— quaisquer alterações ao sistema de ensaio, especialmente se forem utili ­
zadas frações insolúveis ou voláteis,  
— tipo de meio orgânico,  
— proporção e natureza das eventuais águas residuais provenientes de in ­
dústrias, se conhecidas,  
— método de inoculação,  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1105
 
— solução-mãe do produto químico em estudo — COD (carbono orgânico 
dissolvido) e COT (carbono orgânico total); forma de preparação, caso 
se trate de uma suspensão; concentração(ões) de ensaio utilizada(s), justificando eventuais desvios em relação à gama 10-20 mg/l de COD; método de adição; data da primeira adição; quaisquer alterações da 
concentração,
 
— tempo médio de retenção hidráulica (sem proliferação); velocidade de 
rotação do tubo; ângulo de inclinação aproximado, se possível,  
— pormenores sobre formação de crostas; tempo e intensidade,  
— temperatura, ou gama de temperaturas, de ensaio,  
— técnicas de análise utilizadas.  
Resultados do ensaio:  
— todos os valores medidos (COD, CQO, análises específicas, pH, tempe ­
ratura, substâncias azotadas, se for caso disso),  
— todos os valores calculados dos parâmetros D  t (ou D  tc ), D  B , D  St , na 
forma de quadro e a partir das curvas de eliminação,  
— informações sobre as fases de latência e de patamar, a duração do 
ensaio, o grau de eliminação do produto químico em estudo, da subs ­
tância de referência (se utilizada) e do meio orgânico na unidade de 
controlo, juntamente com dados estatísticos e conclusões sobre a biode ­
gradabilidade e a validade do ensaio,  
— discussão dos resultados.  
REFERÊNCIAS:  
(1) Gerike P., Fischer W., Holtmann W. (1980): Biodegradability determina ­
tions in trickling filter units compared with the OECD Confirmatory Test.  
Wat. Res . 14: 753-758.  
(2) Truesdale G.A., Jones K., Vandyke K.G. (1959): Removal of synthetic 
detergents in sewage treatment proccesses: Trials of a new biologically attackable material. Wat. Waste Tr. J . 7: 441-444.
 
(3) Baumann U., Kuhn G., Benz M. (1998): Einfache Versuchsanordnung zur 
Gewinnung gewässerökologisch relevanter Daten, UWSF -  Z. Umweltchem. 
Ökotox.  10: 214-220.  
(4) Gloyna E.F., Comstock R.F., Renn C.E. (1952): Rotary tubes as experi ­
mental trickling filters. Sewage ind. Waste 24: 1355-1357.  
(5) Kumke G.W., Renn C.E. (1966). LAS removal across an institutional trick ­
ling filter. JAOCS 43: 92-94.  
(6) Tomlinson T.G., Snaddon D.H.M. (1966): Biological oxidation of sewage 
by films of micro-organisms.  Int.J. Air Wat. Pollut . 10: 865-881.  
(7) Her Majesty’s Stationery Office (1982): Methods for the examination of 
waters and associated materials. Assessment of biodegradability, 1981, Lon ­
dres.  
(8) Her Majesty’s Stationery Office (1984): Methods for the examination of 
waters and associated materials. Methods for assessing the treatability of chemicals and industrial waste waters and their toxicity to sewage treatment 
processes, 1982, Londres.
 
(9) Capítulo C.4 deste anexo: "Determinação da Biodegradabilidade 'Fácil', 
A-F".  
(10) ISO 14593 (1998). Water Quality-Evaluation in an aqueous medium of the 
ultimate biodegradability of organic substances. Method by analysis of 
released inorganic carbon in sealed vessels.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1106
 
Apêndice 8  
Figura 1  
Tubos rotativos
  
Glossário:  
planta  
alçado A/B  
rodas motrizes  
rodas não motrizes  
motor  
desmultiplicador  
flange interna  
mecanismo basculante  
engrenagem cónica  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1107
 
Figura 2  
Diagrama das operações
  
A: Tanque de alimentação  
B: Bomba peristáltica  
C: Tubo rotativo  
D: Recipiente de recolha do efluente  
DEFINIÇÕES  
Substância em estudo: qualquer substância ou mistura à qual seja aplicado o 
presente método de ensaio.  
Produtos químicos: De notar que o termo " chemical ", amplamente utilizado nos 
acordos UNCED e documentos posteriores, abrange substâncias, produtos, mis ­
turas, preparações ou quaisquer outros termos utilizados em sistemas existentes para denotar abrangência.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1108
 
C.11.  BIODEGRADAÇÃO  
LAMAS ACTIVADAS: ENSAIO DE INIBIÇÃO DA RESPIRAÇÃO  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
O método descrito avalia o efeito da substância de ensaio sobre os 
microorganismos medindo a taxa respiratória em condições determi ­
nadas, na presença de diferentes concentrações da substância de ensaio.
 
O objectivo do presente método é fornecer um processo de selecção 
rápido que permita identificar as substâncias de ensaio que podem 
afectar negativamente o funcionamento das estações de tratamento 
microbiano aeróbio e indicar as concentrações adequadas não inibi ­
doras das substâncias de ensaio a utilizar nas experiências de biode ­
gradação.  
Um ensaio (preliminar) pode preceder o ensaio final, o qual forne ­
cerá informações relativas à gama de concentrações a utilizar no ensaio principal,
 
Além dos ensaios com a substância a estudar, incluem-se no proto ­
colo experimental dois controlos, um no início e outro no final da série de experiências. Cada lote de lamas activadas deve igualmente 
ser testado utilizando uma substância de referência.
 
O presente método aplica-se sobretudo a substâncias que, em virtude 
da sua solubilidade na água e fraca volatilidade, são susceptíveis de 
permanecer na água. Para as substâncias cuja solubilidade no meio 
do ensaio é limitada, pode não ser possível determinar a CE  50 . 
Os resultados baseados no consumo de oxigénio podem conduzir a 
conclusões erróneas quando a substância de ensaio tem tendência a romper a fosforilação oxidativa.
 
Para efectuar o ensaio, é útil dispor das seguintes informações:  
— solubilidade na água,  
— pressão de vapor,  
— fórmula de estrutura,  
— pureza da substância de ensaio.  
Recomendação:  
As lamas activadas podem conter organismos potencialmente pato ­
génicos e devem ser manipuladas com prudência.  
1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES  
A laxa respiratória é o consumo de oxigénio dos microorganismos 
aeróbios contidos nas lamas das águas residuais, expresso geralmente 
em mg O  2 por mg de lamas por hora.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1109
 
Para calcular o efeito inibidor de uma substância de ensaio numa 
dada concentração; exprime-se a taxa respiratória sob a forma de 
percentagem da média:  
1 Ä 2R s 
Rc 1 þ Rc  2 Í Î  
Ü 100 ¼ percentagem de inibição  
em que:  
R s = taxa de consumo de oxigénio da substância de ensaio a 
uma dada concentração,  
Rc 1 = taxa de consumo de oxigénio do controlo 1,  
Rc 2 = taxa de consumo de oxigénio do controlo 2.  
Neste método, a CE  50 é a concentração da substância de ensaio para 
a qual a taxa respiratória é 50 % da verificada no controlo, nas 
condições descritas neste método.  
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Recomenda-se a utilização como substância de referência do 3,5- 
-diclorofenol, um conhecido inibidor da respiração e para cada lote 
de lamas activadas, determina-se a CE  50 dessa substância a fim de 
avaliar se a sensibilidade das lamas não é anormal.  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Mede-se a taxa respiratória das lamas activadas alimentadas com 
uma quantidade-padrão de águas residuais sintéticas após um tempo de contacto de 30 minutos ou de três horas, ou de ambos. Por outro lado, mede-se igualmente a taxa respiratória das mesmas lamas ac ­
tivadas em presença de diversas concentrações da substância de 
ensaio em condições idênticas. O efeito inibidor da substância de ensaio a uma determinada concentração é expresso como uma per ­
centagem do valor médio das taxas respiratórias dos dois controlos. 
Calcula-se um valor de CE
 50 a partir das determinações feitas a 
diferentes concentrações.  
1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
Os resultados do ensaio são válidos se:  
— as taxas respiratórias dos dois controlos não diferirem entre si 
mais de 15 %,  
— a CE  50 (30 minutos e/ou três horas) do 3,5-diclorofenol se situa 
num intervalo aceitável de 5 a 30 mg/l.  
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.6.1.  Reagentes  
1.6.1.1. S o l u ç õ e s d a s u b s t â n c i a d e e n s a i o  
Preparam-se soluções frescas da substância de ensaio no início deste 
a partir de uma solução-mãe. É adequada uma solução-mãe com a 
concentração de 0,5 g/l quando se utiliza a metodologia a seguir 
indicada.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1110
 
1.6.1.2. S o l u ç ã o d a s u b s t â n c i a d e c o n t r o l o  
Pode-se preparar, por exemplo, uma solução de 3,5-diclorofenol dis ­
solvendo 0,5 g de 3,5 — diclorofenol em 10 ml de 1M NaOH, diluindo depois em água destilada até perfazer aproximadamente 
30 ml e adicionando, ao mesmo tempo que se agita, 0,5 M H
 2 SO 4 
até ao início da precipitação — são necessários aproximadamente 
8 ml de 0,5 M H  2 SO 4 — e por fim, dilui-se a mistura com água 
destilada até perfazer 1 litro. O pH deverá então estar compreendido 
entre 7 e 8.  
1.6.1.3. Á g u a s r e s i d u a i s s i n t é t i c a s  
Prepara-se uma alimentação de águas residuais sintéticas dissolvendo 
as seguintes quantidades de substâncias num litro de água:  
— 16 g de peptona,  
— 11 g de extracto de carne,  
— 3 g de ureia,  
— 0,7 g de NaCl,  
— 0,4 g de CaCl  2 .2H  2 O, 
— 0,2 g de MgSO  4 .7H  2 O, 
— 2,8 g de K  2 HPO  4 . 
Nota 1:  Esta água residual sintética é 100 vezes mais concentrada do 
que a descrita no relatório técnico da OCDE «Método proposto para a determinação da biodegradação dos agentes tensioactivos utilizados nos detergentes sintéticos», de 11 de Junho de 1976, com a adição 
de hidrogenofosfato de dipotássio.
 
Nota 2:  Se o meio que se preparou não for utilizado imediatamente, 
deve ser guardado em condições de obscuridade, à temperatura de 0 
a 4 o C, por um período máximo de uma semana, em condições em 
que não se verifique qualquer alteração da sua composição. Antes de se proceder ao seu armazenamento, o meio pode igualmente ser esterilizado ou proceder-se à adição da peptona e do extracto de 
carne um pouco antes de efectuar o ensaio. Antes de utilizar este 
meio, deve-se misturar completamente e ajustar-se o pH.
 
1.6.2.  Equipamento  
Aparelho de medição: não é essencial uma concepção específica do 
aparelho. Contudo, não deve existir qualquer espaço vazio por cima do líquido e o eléctrodo deve adaptar-se perfeitamente ao gargalo do 
frasco de medição.
 
E necessário um equipamento normal de laboratório e especialmente 
os seguintes instrumentos:  
— aparelho de medição,  
— dispositivo de arejamento,  
— eléctrodo e aparelho de medição do pH,  
— eléctrodo de oxigénio.  
1.6.3.  Preparação do inóculo  
Como inóculo microbiano para o ensaio, utilizam-se lamas activadas 
provenientes de uma estação de tratamento de águas residuais que 
trate predominantemente águas residuais domésticas.  
Se necessário, no laboratório, as partículas grosseiras podem ser 
removidas por sedimentação durante um curto período de tempo, por exemplo de 15 minutos, e decantando posteriormente o sobre ­
nadante, contendo os sólidos mais finos, para ser utilizado no ensaio. 
Alternativamente, podem-se misturar as lamas durante alguns segun ­
dos recorrendo a um misturador.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1111
 
Além disso, se se suspeitar que se encontram presentes substâncias 
inibidoras, as lamas devem ser lavadas com água da torneira ou com 
uma solução isotónica. Após centrifugação, o sobrenadante é decan ­
tado (repete-se este processo três vezes).  
Pesa-se e seca-se uma pequena quantidade de lamas. A partir deste 
resultado, pode-se calcular a quantidade de lamas húmidas que de ­
vem ser dispersas em água de modo a obter lamas activadas com uma concentração de sólidos suspensos no licor misto entre 2 e 4 g/l. Este valor conduz a uma concentração no meio de 0,8 a 1,6g/l se se 
seguir a metodologia abaixo recomendada.
 
Se as lamas não puderem ser utilizadas no próprio dia da sua co ­
lheita, adicionam-se 50 ml de águas residuais sintéticas a cada litro 
de lamas activadas preparadas da forma acima descrita e arejam-se 
durante a noite à temperatura de 20 ± 2  o C. Conservam-se arejadas 
para serem utilizadas durante o dia. Antes da sua utilização, verifica- -se o pH e, se necessário, ajusta-se a pH 6,0 a 8,0. Os sólidos 
suspensos no licor misto devem ser determinados tal como foi des ­
crito no parágrafo anterior.
 
Se for necessário utilizar o mesmo lote de lamas durante vários dias 
consecutivos (quatro dias no máximo) adiciona-se uma outra dose de 
50 ml de água residual sintética por litro de lamas no final de cada dia de trabalho.
 
1.6.4.  Execução do ensaio  
Duração/tempo de contac ­
to: 30 minutos e/ou três horas, durante as 
quais o meio de ensaio é arejado 
Água: água de beber (desclorada, se necessá ­
rio) 
Fornecimento de ar: ar limpo, sem óleo. Caudal de ar de 0,5 
a 1 l/minuto 
Aparelho de medição: frasco de fundo plano tal como o des ­
tinado à medição da DBO 
Medidor de oxigénio: eléctrodo de oxigénio adequado com 
um registador 
Solução nutritiva: águas residuais sintéticas (ver acima) 
Substância de ensaio: a solução de ensaio fresca é preparada 
no início do ensaio 
Substância de referência: por exemplo, 3,5 diclorofenol (em pelo 
menos três concentrações) 
Controlos: amostra inoculada, sem substância de 
ensaio 
Temperatura: 20 ± 2  o C. 
Sugere-se seguidamente um método experimental que pode ser apli ­
cado tanto à substância de ensaio como à substância de referência para um tempo de contacto de três horas.
 
Utilizam-se vários recipientes (por exemplo, provetas de um litro).  
Devem-se utilizar pelo menos cinco concentrações, espaçadas entre 
si por um factor constante que, de preferência, não deve ultrapassar 
3,2. 
No instante «0», a 16 ml de água residual sintética adiciona-se água 
até perfazer 300 ml. Juntam-se 200 ml de inóculo microbiano e 
deita-se a mistura (500 ml) para um primeiro recipiente (primeiro 
controlo C  1 ). ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1112
 
Os recipientes de ensaio devem ser continuamente arejados de modo 
a garantir que o O  2 dissolvido não desça abaixo de 2,5 mg/l e que, 
imediatamente antes da medição da taxa respiratória, a concentração de O
 2 seja de cerca de 6,5 mg/l.  
Ao fim de 15 minutos (15 minutos é um intervalo arbitrário, mas 
conveniente), repete-se o procedimento anterior com a excepção de 
que se adicionam 100 ml da solução de reserva da substância de 
ensaio a 16 ml de água residual sintética, antes de proceder à adição de água até perfazer 300 ml e do inóculo microbiano até aos 500 ml. Esta mistura é em seguida deitada para um segundo recipiente e 
arejada tal como anteriormente. Repete-se este procedimento de 
quinze em quinze minutos com diferentes volumes da solução-mãe da substância de ensaio a fim de obter uma série de recipientes com diferentes concentrações da substância de ensaio. Por fim, prepara-se 
um segundo controlo (C
 2 ). 
Ao fim de três horas regista-se o pH, deita-se uma amostra bem 
misturada do conteúdo do primeiro recipiente no aparelho de medi ­
ção e mede-se a taxa respiratória durante um período máximo de 10 minutos.
 
Repete-se esta determinação com o conteúdo de cada recipiente a 
intervalos de quinze minutos de modo a que o tempo de contacto em cada recipiente seja de três horas.
 
A substância de referência é ensaiada de modo idêntico com cada 
lote de inóculo microbiano.  
Será necessário um processo diferente (por exemplo, mais do que um 
aparelho de medição de oxigénio) quando se efectuarem as medições 
após 30 minutos de contacto.  
Se for necessário determinar o consumo de oxigénio, preparam-se 
recipientes suplementares contendo a substância de ensaio, água re ­
sidual sintética e água, mas sem lamas activadas. O consumo de 
oxigénio é medido e registado após um tempo de arejamento de 30 minutos e/ou três horas (tempo de contacto).
 
2. RESULTADOS E AVALIAÇÃO  
A taxa respiratória calcula-se a partir do traçado do registador para 
as medições compreendidas aproximadamente entre 6,5 mg de O  2 /l e 
2,5 mg de O  2 /l ou durante um período de dez minutos quando a taxa 
respiratória é baixa. A parte da curva respiratória sobre a qual se 
mede a taxa respiratória deve ser linear.  
Se as taxas respiratórias dos dois controlos diferirem entre si de mais 
de 15 % ou se a CE  50 (30 minutos e/ou três h) da substância de 
referência não se encontrar no intervalo aceitável (5 a 30 mg/l para o 
3,5 — diclorofenol), o ensaio não é válido e deve ser repetido.  
Calcula-se a percentagem de inibição para cada concentração de 
ensaio (ver 1.2). Representa-se graficamente em papel log-normal (ou log-probabilidade) a percentagem de inibição em função da con ­
centração e deduz-se o valor de CE
 50 . 
Podem ser determinados os intervalos de confiança a 95 % para os 
valores de CE  50 segundo os métodos normalmente utilizados.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1113
 
3. RELATÓRIO  
3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deve incluir, se possível, as seguintes informa ­
ções:  
— substância de ensaio: dados de identificação química,  
— sistema de ensaio: origem, concentração e eventual tratamento 
prévio das lamas activadas,  
— condições de ensaio:  
— pH da mistura de reacção antes da medição da respiração,  
— temperatura de ensaio,  
— duração do ensaio,  
— substância de referência e respectiva CE  50 , 
— consumo abiótico de oxigénio (se se verificar),  
— resultados:  
— todos os dados determinados,  
— curva de inibição e método de cálculo da CE  50 , 
— CE  50 e, se possível, intervalos de confiança a 95 %, CE  20 e 
CE 80 , 
— todas as observações e quaisquer desvios em relação ao pre ­
sente método de ensaio que poderiam ter influenciado os 
resultados.  
3.2. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS  
O valor da CE  50 deve ser apenas considerado como uma indicação 
da toxicidade provável da substância de ensaio quer para o trata ­
mento das águas residuais por lamas activadas quer para os micro ­
organismos das águas residuais, uma vez que as complexas interac ­
ções que se verificam no ambiente não podem ser simuladas com 
precisão num ensaio de laboratório. Além disso, as substâncias de ensaio que podem ter um efeito inibidor na oxidação do amoníaco podem também produzir curvas de inibição atípicas. Por conseguinte, 
tais curvas devem ser cuidadosamente interpretadas.
 
4. REFERÊNCIAS  
(1) Internacional Standard ISO 8192-1986.  
(2) Broecker, B., Zahn, R.,  Water Research  11, 1977, p. 165.  
(3) Brown, D., Hitz, H. R., Schaefer, L.,  Chemosphere  10, 1981, 
p. 245.  
(4) ETAD (Ecological and Toxicological Association of Dyestuffs 
Manufacturing Industries)  Recommended Method n  o 103, also 
described by:  
(5) Robra, B.,  Wasser/Abwasser  117, 1976, p. 80.  
(6) Schefer, W.,  Textilveredlung  6, 1977, p. 247.  
(7) OCDE, Paris, 1981,  Test Guideline 209,  Decisão C(81) 30 
final do Conselho.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1114
 
C.12.  BIODEGRADAÇÃO  
ENSAIO LASC MODIFICADO  
1. MÉTODO  
1.1. INTRODUÇÃO  
O objectivo do método é avaliar a biodegradação final potencial de 
substâncias orgânicas solúveis em água e não voláteis quando ex ­
postas a concentrações relativamente elevadas de microorganismos durante um longo período de tempo. Durante este período, a viabi ­
lidade dos microorganismos é mantida através da adição diária de 
uma alimentação de águas residuais decantadas. (Para conservação das águas residuais durante o fim-de-semana as mesmas poderão ser 
guardadas a 4
 o C. Podem-se utilizar alternativamente as águas resi ­
duais sintéticas do ensaio de confirmação da OCDE.)  
Pode verificar-se uma adsorção físico-química aos sólidos suspensos, 
o que deve ser tomado em consideração na interpretação dos resul ­
tados (ver 3.2).  
Devido ao extenso período de retenção da fase líquida (36 horas) e à 
adição intermitente de nutrientes, o ensaio não simula as condições que ocorrem numa estação de tratamento de águas residuais. Os resultados obtidos com várias substâncias de ensaio indicam que o 
ensaio apresenta um elevado potencial de biodegradação.
 
As condições do ensaio são altamente favoráveis à selecção e/ou 
adaptação de microorganismos capazes de degradar o composto en ­
saiado. (O procedimento pode igualmente ser utilizado na produção 
de inóculos adaptados para utilização em outros ensaios.)  
No presente método, utiliza-se a medida da concentração de carbono 
orgânico dissolvido na avaliação da biodegradação final das subs ­
tâncias de ensaio. É preferível determinar o COD após acidificação e 
purificação do que através da diferença de C  total — C  inorgânico  . 
A utilização simultânea de um método analítico específico pode 
permitir a avaliação da degradação primária da substância (desapa ­
recimento da estrutura química original).  
O método apenas se aplica às substâncias orgânicas de ensaio que, 
nas concentrações utilizadas no ensaio:  
— são solúveis em água (pelo menos 20 mg de carbono orgânico 
dissolvido/l),  
— possuem uma pressão de vapor negligenciável,  
— não adsorvem significativamente no sistema de ensaio,  
— não se perdem na solução de ensaio devido a formação de es ­
puma,  
— não exercem efeitos inibidores sobre as bactérias.  
Deve ser determinado o teor em carbono orgânico da substância de 
ensaio,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1115
 
As informações respeitantes às proporções relativas dos componentes 
principais das substâncias de ensaio serão úteis na interpretação dos 
resultados obtidos, especialmente nos casos em que os resultados são baixos ou marginais.
 
As informações relativas à toxicidade da substância para os micro ­
organismos podem ser úteis na interpretação dos resultados baixos e na selecção das concentrações de ensaio adequadas.
 
1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES  
C E = concentração do composto ensaiado em carbono orgânico 
presente ou adicionado às águas residuais decantadas no iní ­
cio do período de arejamento (mg/l),  
C e = concentração do carbono orgânico dissolvido presente no 
licor sobrenadante do ensaio no final do período de areja ­
mento (mg/l),  
C c = concentração do carbono orgânico dissolvido presente no 
licor sobranadante do controlo no final do período de areja ­
mento (mg/l).  
No presente método a biodegradação é definida como o desapareci ­
mento de carbono orgânico. A biodegradação pode ser expressa em:  
1. Remoção em percentagem D  ad da quantidade de substância adi ­
cionada diariamente:  
D da ¼ C T Ä ðC T Ä C c Þ 
C T Ü 100 [1]  
em que:  
D ad = degradação/adição diária.  
2. A remoção em percentagem D  ad da quantidade de substância 
presente no início de cada dia:  
D ssd ¼ 2C T þ C ti Ä C ci Ä 3C  tðiþ1Þ þ 3C  cðiþ1Þ 
2C T þ C ti Ä C ci Ü 100  [2(a)]  
≈ 2C T Ä 2ðC t Ä C c Þ 
2C T þ ðC t Ä C c Þ Ü 100 [2(b)]  
em que:  
D ad = degradação/substância no início do dia;  
em que os índices i e (i + l)se referem ao dia da medição.  
A equação 2(a) é recomendada se o COD do efluente variar de 
um dia para outro, enquanto a equação 2(b) pode ser utilizada 
quando o COD do efluente permanece relativamente constante de 
um dia para o outro.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1116
 
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Em alguns casos, quando se investiga uma nova substância, podem 
ser úteis substâncias de referência; contudo, não se recomenda aqui qualquer substância de referência específica.
 
Fornecem-se dados relativos a diversos compostos avaliados em en ­
saios de intercalibração (ver apêndice 1) de modo a que se possa 
fazer a calibração do método de tempos a tempos e a permitir a comparação dos resultados quando se utiliza outro método.
 
1.4. PRINCIPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Numa unidade de lamas activadas semicontínua (LASC), colocam-se 
lamas activadas provenientes de uma estação de tratamento de águas residuais. Adicionam-se o composto a ensaiar e as águas residuais 
domésticas decantadas e a mistura é arejada durante 23 horas. Pára- 
-se depois o arejamento, permitindo a sedimentação das lamas e retira-se o licor sobrenadante.
 
As lamas que permanecem no tanque de arejamento são então mis ­
turadas com outra alíquota do composto de ensaio e águas residuais 
e repete-se o processo.  
Avalia-se a biodegradação através da determinação do teor em car ­
bono orgânico dissolvido no licor sobrenadante. Compara-se este 
valor com o que se obtém para o licor proveniente de um tubo de controlo contendo apenas águas residuais decantadas.
 
Quando se utiliza um método analítico específico, podem medir-se 
alterações na concentração da molécula original devido a biodegra ­
dação (Biodegradação primária).  
1.5. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
A reprodutibilidade do presente método baseado na remoção do 
carbono orgânico dissolvido ainda não foi, estabelecida. (Quando 
se considera a biodegradação primária, obtém-se dados muito preci ­
sos para substâncias que são consideravelmente degradadas.)  
A sensibilidade do método é determinada em larga medida pela 
variabilidade do ensaio em branco e, em menor extensão, pela pre ­
cisão da determinação do carbono orgânico dissolvido e teor do 
composto de ensaio no licor, no início de cada ciclo.  
1.6. DETENÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.6.1.  Preparações  
Ligam-se um número suficiente de unidades de arejamento limpas 
(pode-se utilizar alternativamente a unidade de ensaio de 1,51 de LASC inicial) e tubos para entrada do ar (figura 1) para cada subs ­
tância de ensaio e controlo. O ar comprimido fornecido às unidades 
de ensaio, limpo através de um filtro de algodão, deve ser isento de carbono orgânico e pré-saturado com água de modo a reduzir as perdas por evaporação.
 
De uma estação de lamas activadas que trate predominantemente 
éguas residuais domésticas, retira-se uma amostra de licor misto 
contendo 1 a 4 g de sólidos suspensos/l. São necessários por cada 
unidade de arejamento cerca de 150 ml de licor misto.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1117
 
Preparam-se soluções de reserva da substância de ensaio em água 
destilada; a concentração normalmente exigida é de 400 mg/l como 
carbono orgânico o que dá uma concentração no composto de ensaio de 20 mg/l de carbono no início de cada ciclo de arejamento se não se verificar biodegradação.
 
É possível utilizar concentrações mais elevadas se a toxicidade em 
relação aos microorganismos o permitir.  
Mede-se o teor em carbono orgânico nas soluções de reserva.  
1.6.2.  Condições de ensaio  
O ensaio deve efectuar-se a 20 a 25  o C. 
Utiliza-se uma concentração elevada de microorganismos aeróbios 
(de 1 a 4 g/l de sólidos suspensos) e o período de retenção efectiva é de 36 horas. As substâncias carbonadas presentes nas águas resi ­
duais de alimentação são largamente oxidadas, em geral no espaço 
de oito horas após o início de cada cicio de arejamento. Em seguida, verifica-se uma respiração endógena das lamas durante o restante período de arejamento, no decurso do qual o único substrato dispo ­
nível é o composto de ensaio a não ser que este seja também rapi ­
damente metabolizado. Estas características associadas a uma reino ­
culação diária do ensaio quando são utilizadas como meio águas residuais domésticas fornecem condições altamente favoráveis tanto 
para a adaptação como para elevados graus de biodegradação.
 
1.6.3.  Execução do ensaio  
Retira-se uma amostra de licor misto de uma unidade laboratorial ou 
estação de lamas activadas predominantemente doméstica e conser ­
va-se em condições aeróbias até ser utilizada no laboratório. Cada 
uma das unidades de arejamento e de controlo são cheios com 
150 ml de licor misto (se se utilizar a unidade de ensaio LASC, multiplicar por 10 os volumes dados) e dá-se início ao arejamento. 
Após 23 horas, interrompe-se o arejamento e deixam-se sedimentar 
as lamas durante 45 minutos. Abrem-se sucessivamente as torneiras de cada um dos recipientes e rejeitam-se fracções de 100 ml do licor sobrenadante. Recolhe-se uma amostra de águas residuais domésticas 
decantadas imediatamente antes da utilização e adicionam-se 100 ml 
às lamas remanescentes em cada unidade de arejamento. Recomeça- -se de novo o arejamento. Nesta fase, não se adicionam quaisquer substâncias de ensaio e as unidades são diariamente alimentadas com 
águas residuais domésticas apenas até ao momento em que se obtém 
na decantação um licor sobrenadante límpido. Este processo demora geralmente duas semanas, no fim das quais o carbono orgânico dissolvido no licor sobrenadante no final de cada ciclo de arejamento 
se aproxima de um valor constante.
 
No final deste período, misturam-se as lamas decantadas separada ­
mente e adicionam-se a cada unidade 50 ml das lamas compostas resultantes.
 
Adicionam-se às unidades de controlo 95 ml de águas residuais 
decantadas mais 5 ml de água e às unidades de ensaio 95 ml mais 5 ml da solução adequada de reserva do composto de ensaio 
(400 mg/l). Recomeça-se de novo o are|2mento que prossegue du ­
rante 23 horas. Deixam-se então sedimentar as lamas durante 45 minutos e o sobrenadante é retirado e analisado o seu teor em carbono orgânico dissolvido.
 
Este processo de enchimento e esvaziamento é repetido diariamente 
ao longo do ensaio.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1118
 
Antes da sedimentação pode ser necessário limpar as paredes das 
unidades de modo a evitar a acumulação de sólidos acima do nível 
do líquido. Para evitar uma contaminação cruzada, utilizam-se ras ­
padores ou escovas individuais para cada unidade.  
O ideal seria determinar diariamente o carbono orgânico dissolvidos 
nos licores sobrenadantes, embora sejam admissíveis análises menos 
frequentes. Antes da análise, os licores são filtrados através de filtros limpos de membrana de 0,45 mm ou centrifugados. Os filtros de membrana são adequados se se garantir que nem libertam carbono 
nem absorvem a substância durante o processo de filtração. A tem ­
peratura da amostra não deve exceder 40
 o C quando se encontra na 
centrífuga.  
A duração do ensaio para compostos que apresentam uma biodegra ­
dação fraca ou nula é indeterminada, mas a experiência sugere que deve ser, em geral, de pelo menos 12 semanas, mas nunca mais de 26 semanas.
 
2. RESULTADOS E AVALIAÇÃO  
Representam-se graficamente, em função do tempo, os valores de 
carbono orgânico dissolvido nos licores sobrenadantes das unidades 
de ensaio e das unidades de controlo.  
À medida que ocorre a biodegradação, o nível obtido no ensaio 
aproximar-se-á do obtido no controlo. Quando se verificar que a 
diferença entre os dois níveis é constante ao longo de três medições consecutivas, efectua-se o número de medições posteriores que seja necessário para permitir o tratamento estatístico dos dados e calcula- 
-se a percentagem de biodegradação do composto de ensaio (D
 ad , 
D sid , ver 1.2).  
3. RELATÓRIO  
3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio, deve incluir, se possível, as seguintes infor ­
mações:  
— todas as informações relativas à natureza das águas residuais, tipo 
de unidade utilizada e resultados experimentais respeitantes à substância ensaiada, substância de referência se utilizada e ensaio 
em branco,
 
— a temperatura,  
— a curva de remoção com a descrição e processo de cálculo 
(ver 1.2),  
— data e local onde foram recolhidas as lamas activadas e as águas 
residuais, estado de adaptação, concentração, etc.,  
— razões científicas de quaisquer alterações da metodologia,  
— assinatura e data.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1119
 
3.2. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS  
Uma vez que a substância a ser ensaiada através do presente método 
não será imediatamente biodegradável, qualquer remoção do COD devido apenas à biodegradação será normalmente gradual ao longo 
de vários dias ou semanas, excepto nos casos em que a adaptação é 
repentina, tal como é indicado por uma remoção abrupta que ocorra após algumas semanas.
 
Todavia, a adsorção físico-química pode, por vezes, desempenhar um 
papel importante; isto verifica-se quando há uma remoção total ou 
parcial do COD adicionado no início. O que acontece posteriormente depende de factores tais como os graus de adsorção e a concentração dos sólidos em suspensão no efluente rejeitado. Em geral, a diferença 
entre a concentração de COD nos licores sobrenadantes do controlo 
e do ensaio aumenta gradualmente a partir de um valor inicial baixo e esta diferença mantém-se então ao nível do novo valor durante o resto da experiência, a menos que tenha lugar a adaptação.
 
Se for necessário estabelecer uma distinção entre biodegradação (ou 
biodegradação parcial) e adsorção, são necessários outros ensaios. 
Esta distinção pode ser obtida de diferentes modos mas o mais convincente é utilizar como inóculo o licor sobrenadante, ou as lamas, num método de base (de preferência um ensaio respirométri ­
co).
 
As substâncias de ensaio que no presente ensaio apresentam remo ­
ções elevadas de COD não devidas a adsorção devem ser conside ­
radas como potencialmente biodegradáveis.  
Uma remoção parcial não devida a adsorção indica que a substância 
é sujeita pelo menos a alguma biodegradação. Uma remoção baixa 
ou nula de COD pode ser devida a inibição dos microorganismos pela substância de ensaio e isto pode também ser demonstrado pela lise e perda de lamas, dando origem a sobrenadantes turvos. O 
ensaio deve ser repetido, utilizando uma concentração mais baixa 
de substância de ensaio.
 
A utilização de um método analítico específico ou da substância de 
ensaio marcada com  14 C pode permitir uma maior sensibilidade. 
No caso do composto de ensaio marcado com  14 C, a recuperação 
de l4 CO 2 confirmará que se verificou biodegradação.  
Quando os resultados se expressam também em termos de biodegra ­
dação primária, deve ser fornecida, se possível, uma explicação re ­
lativa à alteração de estrutura química que conduz à perda de res ­
posta da substância de ensaio original.  
A validação do método analítico deve ser fornecida conjuntamente 
com a resposta obtida no ensaio em branco.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) OCDE, Paris, 1981,  Test Guideline 302 A,  Decisão C(81) 30 
final do Conselho.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1120
 
Apêndice 1  
Ensaio LASC: EXEMPLOS DE RESULTADOS  
Substâncias C E 
(mg/l) c e - c c 
(mg/l) Percentagem de 
biodegradação Duração de 
ensaio 
(dias)  
Sulfonato de 4-acetilaminobenzeno 17,2 2,0 85 40 
Sulfonato de tetrapropilenobenzeno 17,3 8,4 51,4 40 4-nitrofenol 16,9 0,8 95,3 40 
Dietilenoglicol 16,5 0,2 98,8 40 
Anilina 16,9 1,7 95,9 40 Tetracarboxilato de ciclopentano 17,9 3,2 81,1 120
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1121
 
Apêndice 2  
Exemplo de equipamento  
Figure 1
  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1122
 
C.13.  BIOCONCENTRAÇÃO: ENSAIO DINÂMICO COM PEIXES  
1. MÉTODO  
O presente método é idêntico ao método OCDE TG 305 (1996).  
1.1. INTRODUÇÃO  
O presente método descreve um processo para a caracterização da 
bioconcentração potencial de determinadas substâncias em peixes, em condições dinâmicas. Embora seja largamente preferível o re ­
curso a regimes dinâmicos, podem também utilizar-se regimes se ­
miestáticos, na condição de serem satisfeitos os critérios de validade.
 
O método fornece informações suficientes para a realização do en ­
saio, permitindo todavia, em larga medida, a adaptação das condi ­
ções experimentais ao perfil dos laboratórios e às características das 
substâncias em estudo. O método destina-se particularmente a subs ­
tâncias orgânicas estáveis com log P  ow compreendido entre 1,5 e 6,0 
(1), podendo, no entanto, aplicar-se também a substâncias superlipó ­
filas (log P  ow > 6,0). A estimativa preliminar do factor de biocon ­
centração (BCF) das referidas substâncias superlipófilas, por vezes designado K
 B , é, em geral, superior ao factor de bioconcentração do 
estado estacionário (BCF  SS ) obtido por via experimental. A equação 
de Bintein  et al.  (2) permite obter uma estimativa preliminar do 
factor de bioconcentração de substâncias orgânicas com P  ou da or­
dem de 9,0. Os parâmetros que caracterizam o potencial de biocon ­
centração incluem a constante de velocidade de fixação (k  1 ), a cons­
tante de velocidade de depuração (k  2 ) e o factor BCF  SS . 
A utilização de marcadores radioactivos poderá facilitar a análise de 
amostras de água e de peixes, bem como a determinação da neces ­
sidade de identificar e quantificar os produtos de degradação. Caso 
se determinem os resíduos radioactivos totais (nomeadamente por combustão ou solubilização de tecidos), o factor BCF é calculado com base na substância de origem, nos metabolitos fixados e no 
carbono assimilado, não sendo, por tal facto, directamente compará ­
vel ao factor decorrente de análise química específica da substância de origem.
 
Nos ensaios com radiomarcadores podem utilizar-se métodos de de ­
puração, determinando o factor BCF com base da substância de origem e procedendo, se necessário, à caracterização dos metabolitos. 
É também possível combinar um estudo de metabolismo dos peixes 
com um estudo de bioconcentração, mediante a análise e identifica ­
ção dos resíduos em tecidos.
 
1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES  
A bioconcentração/bioacumulação consiste no aumento da concen ­
tração da substância em estudo num determinado organismo ou em 
determinados tecidos do mesmo, relativamente à respectiva concen ­
tração no meio circundante.  
O factor de bioconcentração (BCF ou K  B ) em qualquer momento da 
fase de fixação do ensaio de acumulação consiste no quociente entre a concentração da substância em estudo nos peixes ou em determi ­
nados tecidos dos mesmos [C
 t expressa em μg/g (ppm)] e a respec ­
tiva concentração no meio circundante [C  w , expressa em μg/ml 
(ppm)].  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1123
 
O factor de bioconcentração num estado estacionário (BCF  SS ou K  B) 
não sofre uma alteração significativa num período longo, uma vez 
que a concentração da substância em estudo no meio circundante é constante no período em causa.
 
Um estado estacionário é atingido sempre que a representação grá ­
fica da concentração da substância em estudo nos peixes (C  t ) em 
função do tempo consista numa linha paralela ao eixo dos tempos e três determinações sucessivas de C
 t em amostras recolhidas com 
intervalos de, pelo menos, dois dias, apresentem valores que não 
difiram em mais de 20 %, na ausência de diferenças significativas entre os três períodos de amostragem. No caso das amostras combi ­
nadas, são necessárias, pelo menos, quatro determinações. No caso 
de substâncias recolhidas de forma lenta, o intervalo mais adequado é de sete dias.
 
O factor de bioconcentração calculado directamente a partir das 
constantes cinéticas (k  1 /k 2 ) constitui o factor de concentração ciné ­
tica, BCF  k . 
O coeficiente de partição octanol-água (P  ow ), também designado 
K ow , consiste no quociente entre a solubilidade de uma substância 
em n-octanol e em água, em condições de equilíbrio (método A.8). 
O logaritmo de  P ov é utilizado como indicador de potencial químico 
de bioconcentração em organismos aquáticos.  
A fase de exposição ou de fixação consiste no tempo de exposição 
dos peixes à substância em estudo.  
A constante de velocidade de fixação (k  1 ) consiste no valor numérico 
que define a taxa de aumento da concentração da substância em estudo nos peixes ou em determinados tecidos dos mesmos, sempre que se encontrem expostos à substância em causa (a constante k
 1 é 
expressa em dias  -1 ). 
A fase de pós-exposição ou de depuração consiste no período du ­
rante o qual se estuda a depuração da substância pelos peixes ou por 
tecidos específicos dos mesmos, na sequência da transferência dos animais de um meio que contenha a substância em estudo para um meio que a não contenha.
 
A constante de velocidade de depuração (k  2 ) é o valor numérico que 
define a velocidade de redução da concentração da substância em 
estudo nos peixes ou em determinados tecidos dos mesmos, na se ­
quência da transferência dos animais de um meio que contenha a substância em estudo por um meio que a não contenha (a constante k
 2 é expressa em dias  -1 ). 
1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
O ensaio é constituído por duas fases, designadamente a fase de 
exposição (fixação) e a fase de pós-exposição (depuração). Durante a fase de fixação, diversos grupos de peixes de uma determinada 
espécie são expostos a, pelo menos, duas concentrações da subs ­
tância em estudo. Seguidamente, os animais são transferidos para um meio isento da referida substância, onde decorre a fase de de ­
puração. Esta última é sempre necessária, excepto no caso de a 
quantidade de substância absorvida na fase de fixação ser desprezá ­
vel (BCF < 10). A concentração da substância em estudo no peixe ou em determinados tecidos do mesmo é acompanhada em ambas as fases do ensaio. Além dos grupos expostos às duas concentrações de 
ensaio, submete-se um grupo de peixes a condições idênticas, ex ­
cepto no que respeita à substância em estudo, que é omitida, de modo a estabelecer uma correlação entre os eventuais efeitos nega ­
tivos observados no ensaio de bioconcentração com um grupo de 
controlo de referência e a obter as concentrações de fundo da subs ­
tância em estudo.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1124
 
A fase de fixação deverá durar 28 dias, excepto se o equilíbrio for 
atingido antes. A equação que se apresenta no apêndice 3 permite 
prever a duração da fase de fixação, bem como o surgimento da fase estacionária. O período de depuração inicia-se com a transferência dos peixes para um meio idêntico que não contenha a substância em 
estudo, num recipiente limpo. Sempre que possível, deve calcular-se 
o factor de bioconcentração na forma de quociente (BCF
 SS ) das 
concentrações nos peixes (C  t ) e na água (C  u , num estado estacionário 
aparente, e também o factor de bioconcentração cinético (BCF  k , que 
consiste no quociente entre as constantes de velocidade de fixação 
(k 1 ) e de depuração (k  2 ), assumindo um processo cinético de pri ­
meira ordem. Caso o processo não apresenta uma cinética de pri ­
meira ordem, devem aplicar-se modelos mais complexos (ver apên ­
dice 5).  
Caso não se atinja o estado estacionário em 28 dias, a fase de 
fixação deve ser prolongada, até um máximo de 60 dias, inician ­
do-se então a fase de depuração.  
A constante de velocidade de fixação, a constante de velocidade de 
depuração, as constantes decorrentes da aplicação de modelos mais 
complexos, o factor de bioconcentração e, sempre que possível, os intervalos de confiança de cada parâmetro, devem ser calculados com base no modelo mais adequado à descrição das concentrações 
da substância em estudo nos peixes e na água.
 
O factor BCF é expresso em função da massa húmida total dos 
peixes. Todavia, podem utilizar-se, para fins específicos, determina ­
dos tecidos ou órgãos (por exemplo, tecido muscular ou fígado), caso as dimensões dos animais o permitam, podem também divi ­
dir-se os peixes em porções comestíveis e não comestíveis (vísceras). 
Uma vez que, no que respeita a muitas substâncias orgânicas, existe 
uma nítida relação entre o potencial de bioconcentração e a lipofilia, existe também uma relação entre o teor de lípidos dos peixes em estudo e a bioconcentração das substâncias em causa. De modo a 
reduzir a variabilidade dos resultados, no que respeita ás substâncias 
com elevada lipofilia (log P
 ow > 3), a bioconcentração deve ser 
expressa em função de teor de lípidos, bem como da massa corpórea total.
 
Sempre que tal seja viável, deve determinar-se o teor de lípidos do 
material biológico utilizado para determinar a concentração da subs ­
tância em estudo.  
1.4. INFORMAÇÕES RELATIVAS À SUBSTÂNCIA EM ESTUDO  
Antes de realizar o ensaio de bioconcentração, devem possuir-se as 
seguintes informações relativas a substância em estudo:  
a) Solubilidade em água;  
b) Coeficiente de partição octanol-água, P  ow (também designado 
K ow ), determinado por HPLC de acordo com o método A.8;  
c) Hidrólise;  
d) Fotossensibilidade em água, determinada por irradiação solar na ­
tural ou simulada, bem como nas condições de irradiação do 
ensaio de bioconcentração (3);  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1125
 
e) Tensão superficial (no caso de substâncias cujo log P  ow não 
possa ser determinado);  
f) Pressão de vapor;  
g) Biodegradabilidade natural (se adequado).  
A toxicidade para a espécie utilizada no ensaio constitui outra das 
informações necessárias, devendo conferir-se especial atenção à to ­
xicidade assintótica (isto é, independente do tempo) LC  50 . Para a 
quantificação da substância em estudo nas soluções, bem como no 
material biológico, deve utilizar-se um método analítico adequado, de exactidão, precisão e sensibilidade conhecidas, devendo possuir-se informações pormenorizadas sobre a preparação e armazenagem da 
amostra. Deve também conhecer-se o limite de detecção da subs ­
tância em estudo na água e nos tecidos dos peixes. Caso se utilize uma substância marcada com
 14 C, é necessário conhecer a percenta ­
gem de radioactividade associada às impurezas.  
1.5. VALIDADE DO ENSAIO  
Para que o ensaio seja válido, devem satisfazer-se as seguintes con ­
dições:  
— as variações de temperatura devem ser inferiores a ± 2  o C, 
— a concentração de oxigénio dissolvido não deve ser inferior a 
60 % da concentração de saturação,  
— a variação da concentração da substância em estudo nas células 
não deve exceder ± 20 % da média dos valores determinados na fase de fixação,
 
— a mortalidade ou quaisquer outros efeitos nocivos registados no 
final do ensaio, tanto no que respeita ao lote de controlo como ao lote de ensaio, deve ser inferior a 10 %; caso o ensaio se pro ­
longue por várias semanas ou meses, os referidos factores não 
devem exceder 5 % por mês e 30 % na totalidade.
 
1.6. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
A utilização de substâncias de referência de potencial de bioconcen ­
tração conhecido apresenta utilidade na comprovação do procedi ­
mento experimental, sempre que necessário. Todavia, não se afigura 
ainda possível recomendar substâncias específicas.  
1.7. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.7.1.  Equipamento  
No que respeita ao equipamento, deve evitar-se a utilização de ma ­
teriais que apresentem riscos de dissolução, absorção ou lixiviação, 
ou possam apresentar efeitos nocivos nos animais. Podem utilizar-se tanques em forma de paralelepípedo ou cilindro, de um material quimicamente inerte, com capacidade adequada à população. Deve 
evitar-se tanto quanto possível o uso de tubos de plástico flexível, 
recorrendo-se, de preferência, a tubos de teflon (R), aço inoxidável e/ou vidro. A experiência tem demonstrado que, no caso de subs ­
tâncias com coeficientes de adsorção elevados, nomeadamente os 
piretróides sintéticos, pode ser necessário utilizar vidro silanizado. 
Em tais casos, o equipamento deve ser descartado após o uso.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1126
 
1.7.2.  Água  
Em princípio, o ensaio deve utilizar água natural proveniente de uma 
fonte não contaminada e de qualidade uniforme. A qualidade da água de diluição deve permitir a sobrevivência da espécie durante as fases 
de aclimatação e de ensaio sem que os animais adquiram uma apa ­
rência ou um comportamento anormais. Em condições ideais, a es ­
pécie em causa deve poder sobreviver, desenvolver-se e reproduzir- -se na água de diluição (nomeadamente em cultura laboratorial ou 
num ensaio de toxicidade em toda a vida). Devem conhecer-se, pelo 
menos, os seguintes parâmetros: pH, dureza, sólidos totais, carbono orgânico total, bem como, se possível, amónio, nitritos, alcalinidade 
e, no caso de ensaios com espécies marinhas, salinidade. Os parâme ­
tros que possuem importância para o bem-estar dos animais são bem conhecidos; contudo, o apêndice 1 apresenta as concentrações máxi ­
mas recomendadas de diversos factores em águas doces e salgadas.
 
A qualidade da água deve manter-se constante no decurso do ensaio. 
O pH deve oscilar entre 6,0 e 8,5, embora, no decurso de um determinado ensaio, a respectiva variação não deva exceder ± 0,5. De modo a assegurar que a água de diluição não afecta os resultados 
(nomeadamente devido à complexação da substância em estudo) ou 
o comportamento dos animais, devem recolher-se periodicamente amostras da mesma para análise, procedendo-se à determinação dos metais pesados (Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), principais aniões e 
catiões (Ca
 2 + , Mg  2+ , Na -, K -, Cl-, SO  4 2- ), pesticidas (nomeada ­
mente pesticidas organofosforados totais e organoclorados totais), carbono orgânico total e sólidos em suspensão, com uma frequência aproximadamente trimestral, caso a qualidade da água de diluição 
seja relativamente constante. Se a referida qualidade se revelar cons ­
tante num período não inferior a um ano, as determinações podem ser menos frequentes, efectuando-se com intervalos alargados (por exemplo, semestrais).
 
O teor de partículas naturais, bem como de carbono orgânico total, 
da água de diluição deve ser tão reduzido quanto possível, de modo a evitar a adsorção de substância em estudo pela matéria orgânica, 
reduzindo a sua biodisponibilidade (4). O valor máximo aceitável é 
de 5 mg/l, no caso das partículas (matérias secas que não passem através de um filtro de 0,45 μm) e 2 mg/l no caso do carbono 
orgânico total (ver apêndice 1). Se necessário, a água deverá ser 
filtrada antes do uso. A contribuição das excreções dos peixes e 
dos resíduos alimentares para o teor de carbono orgânico total deve ser tão reduzida tanto quanto possível. No decurso do ensaio, a concentração de carbono orgânico no recipiente não deve exceder a 
concentração de carbono orgânico proveniente da substância em es ­
tudo e do agente de solubilização (se utilizado) em mais de 10 mg/l (± 20 %).
 
1.7.3.  Soluções de ensaio  
Prepara-se uma solução-mãe da substância em estudo, de concen ­
tração adequada, de preferência misturando ou agitando a substância 
com a água de diluição. Não é aconselhável utilizar solventes ou dispersantes (agentes de solubilização) embora, em determinados casos, possa recorrer-se aos mesmos para obter uma concentração 
adequada. Os solventes que podem ser utilizados são o etanol, o 
metanol os éteres mono e dimetílico do etilenoglicol a dimetilforma ­
mida e o trietilenoglicol. No que respeita aos dispersantes, podem utilizar-se o Cremophor RH40, o Tween 80, a metilcelulose a 
0,01 % e o HCO-40. Os agentes que apresentem biodegradabilidade 
natural devem utilizar-se com precaução, uma vez que podem origi ­
nar problemas de crescimento bacteriano nos ensaios dinâmicos. A substância em estudo pode ser marcada com um radioisótopo, de ­
vendo ser de um grau de pureza elevado (de preferência superior a 
98 %).
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1127
 
Em ensaios dinâmicos, é necessário utilizar um sistema de forneci ­
mento e diluição contínuos da solução-mãe da substância em estudo 
(por exemplo, bomba com regulação de caudal, diluidor proporcio ­
nal, sistema de saturação), de modo a alimentar os recipientes de ensaio. De preferência, devem efectuar-se diariamente pelo menos 
cinco renovações do volume de cada recipiente de ensaio. Em prin ­
cípio, devem utilizar-se condições dinâmicas; todavia, se tal não se afigurar possível (por exemplo, caso os animais sejam afectados) pode recorrer-se a uma técnica semiestática, na condição de serem 
satisfeitos os critérios de validade. Os caudais da solução-mãe e da 
água de diluição devem ser verificados 48 horas antes do início do ensaio e com uma frequência pelo menos diária no decurso do mesmo, A referida verificação inclui a determinação do caudal em 
cada recipiente de ensaio, devendo assegurar-se que o mesmo não 
regista uma variação superior a 20 % num determinado recipiente ou entre dois recipientes.
 
1.7.4.  Selecção das espécies  
Os principais critérios de selecção das espécies consistem na sua 
fácil disponibilidade, nas dimensões adequadas e na facilidade de manutenção no laboratório. Outros critérios incluem o interesse re ­
creativo e comercial e a importância ecológica, bem como a sensi ­
bilidade relativa, os antecedentes de utilização, etc.
 
O apêndice 2 refere as espécies recomendadas. Podem utilizar-se 
outras espécies, devendo, contudo, adaptar-se os procedimentos de 
modo a obter condições de ensaio adequadas. Em tais casos, deve 
apresentar-se o fundamento da selecção da espécie e do método experimental.
 
1.7.5.  Tratamento dos peixes  
Deve aclimatar-se a população de ensaio durante, pelo menos, duas 
semanas, à temperatura de ensaio, alimentando-a com uma dieta idêntica à utilizada no decurso do ensaio.
 
Após um período de adaptação de 48 horas, regista-se a mortalidade, 
aplicando os seguintes critérios:  
— caso a mortalidade exceda 10 % da população em sete dias, 
desprezar a totalidade do lote,  
— caso a mortalidade se situe entre 5 e 10 % da população em sete 
dias, aclimatar os peixes por um período de sete dias suplemen ­
tares,  
— caso a mortalidade seja inferior a 5 % da população em sete dias, 
aproveitar o lote; se a mortalidade registada no segundo período de sete dias for superior a 5 %, desprezar a totalidade do lote.
 
Os animais a utilizar nos ensaios não devem apresentar doenças ou 
perturbações observáveis. Devem rejeitar-se quaisquer animais doen ­
tes. Além disso, os peixes não devem ser objecto de tratamento 
contra eventuais afecções nas duas semanas que procedem o ensaio 
e durante o mesmo.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1128
 
1.8. REALIZAÇÃO DO ENSAIO  
1.8.1.  Ensaio preliminar  
Poderá ser útil efectuar um ensaio preliminar com o objectivo de 
optimizar as condições do ensaio definitivo no que respeita, nomea ­
damente, à selecção da concentração da substância em estudo e á 
duração das fases de fixação e de depuração.  
1.8.2.  Condições de exposição  
1.8.2.1. D u r a ç ã o d a f a s e d e f i x a ç ã o  
Pode obter-se uma estimativa da duração da fase de fixação com 
base na experiência prática (por exemplo, dados decorrentes de um 
estudo prévio ou dados relativos à acumulação de uma substância 
afim), bem como em determinadas relações empíricas que utilizam conhecimentos decorrentes da solubilidade da substância em água ou do respectivo coeficiente de partição octanol/água (ver apêndice 3).
 
A fase de fixação deve durar, pelo menos, 28 dias, excepto se o 
equilíbrio for atingido antes. Se o estado estacionário não for atin ­
gido em 28 dias, deve prolongar-se a fase de fixação, procedendo a determinações complementares, até um máximo de 60 dias.
 
1.8.2.2. D u r a ç ã o d a f a s e d e d e p u r a ç ã o  
Em geral, um período com uma duração de ordem de metade da fase 
de fixação é suficiente para uma redução adequada (isto é, cerca de 
95 %) da carga corporal da substância em estudo (ver o apêndice 3 
para uma especificação da estimativa). Se o período necessário para a referida redução de 95 % exibir urna extensão que o torne impra ­
ticável (mais de 56 dias), pode utilizar-se um período mais curto (ou 
seja, até que a concentração da substância em estudo seja inferior a 
10 % da concentração do estado estacionário). Todavia, no caso de substâncias com perfis de fixação e de depuração mais complexos que no caso de modelos com uma cinética de primeira ordem, devem 
adaptar-se períodos de depuração alargados, e modo a determinar a 
velocidade do processo. O período em causa pode ser definido pelo período em que a concentração da substância em estudo nos peixes permanece superior ao limite de detecção.
 
1.8.2.3. N ú m e r o d e a n i m a i s  
O número de peixes a utilizar por concentração de ensaio deve ser 
seleccionado de forma a que se disponha de quatro animais por 
amostragem. Se for exigido um rigor estatístico superior, deve dis ­
por-se de mais peixes por amostragem.  
Caso se utilizem peixes adultos, deve especificar-se o respectivo 
sexo. Caso se utilizem animais de ambos os sexos, as diferenças entre os respectivos teores de lípidos antes do início da exposição 
não devem ser significativas, podendo ser necessário reunir os ma ­
chos e as fêmeas.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1129
 
Em qualquer ensaio, seleccionam-se peixes de massa semelhante, de 
modo que a massa do mais leve não seja inferior a 2/3 da massa do 
mais pesado. Os peixes devem ser de mesma coorte (classe etária) e da mesma proveniência. Uma vez que a massa e a idade dos peixes parecem, por vezes, apresentar um efeito significativo nos valores do 
factor BCF (1), devem registar-se de forma precisa os pormenores 
em causa. Recomenda-se a pesagem de uma amostra do lote de peixes, de modo a calcular a massa média.
 
1.8.2.4. I n t r o d u ç ã o d o s a n i m a i s  
Devem utilizar-se rácios elevados água/peixes, de modo a minimizar 
a redução de C  w determinada pela introdução dos peixes no início do 
ensaio, bem como do decréscimo da concentração do oxigénio dis ­
solvido. A taxa de carga deve ser adequada às espécies utilizadas. Recomenda-se, em geral, uma taxa diária de 0,1 a 1,0 g de peixes 
(massa húmida) por litro de água. Caso a concentração requerida da 
substância em estudo não registe uma variação superior a ± 20 % e a quantidade de oxigénio dissolvido não atinja valores inferiores a 60 % da concentração de saturação, podem utilizar-se taxas de carga 
mais elevadas.
 
Na selecção dos regimes de carga adequados deve ter-se em conta o 
habitat normal das espécies em causa. Por exemplo, as espécies 
bentónicas necessitam de aquários com maior área de base que as 
espécies pelágicas, para o mesmo volume de água.  
1.8.2.5. A l i m e n t a ç ã o  
Durante os períodos de aclimatação e de ensaio, os peixes são ali ­
mentados com uma dieta adequada, de teor total de lípidos e de 
proteínas conhecido, numa quantidade suficiente para mantê-los em condições saudáveis e manter constante a respectiva massa corporal. Os animais são alimentados diariamente, sendo a quantidade de 
alimentos fornecida de ordem de 1 a 2 % da massa corporal/dia, o 
que permite manter a concentração de lípidos da maioria das espé ­
cies a níveis relativamente constantes, durante o ensaio. A quanti ­
dade de alimentos deve ser reavaliada com uma frequência, por 
exemplo, semanal, de modo a manter constantes a massa corporal 
e o teor de lípidos. Para tal, pode estimar-se a massa dos peixes de cada célula de ensaio com base na massa do peixe retirado mais recentemente da mesma. Não devem pesar-se os peixes que per ­
manecem nas células.
 
Os alimentos remanescentes e as fezes são removidos diariamente 
das células de ensaio, 30 minutos a 1 hora após o fornecimento dos 
alimentos. As células devem manter-se tão limpas quanto possível ao 
longo do ensaio, de modo a que a concentração de matérias orgâni ­
cas seja mantida aos níveis mais reduzidos, uma vez que a presença de carbono orgânico pode limitar a biodisponibilidade da substância 
em estudo (1).
 
Uma vez que muitos alimentos contêm ingredientes à base de peixe, 
deve averiguar-se a ocorrência da substância em estudo nos mesmos. 
Deve também pesquisar-se a ocorrência de pesticidas e metais pesa ­
dos nos alimentos.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1130
 
1.8.2.6. I l u m i n a ç ã o e t e m p e r a t u r a  
O período de irradiação é, em geral, de 12 a 16 horas, devendo a 
temperatura, cuja variação não deve exceder ± 2  o C, ser adequada às 
espécies em estudo (ver apêndice 2). Deve especificar-se o tipo e as 
características da iluminação e atender-se à eventual fotólise da subs ­
tância em estudo nas condições de irradiação do ensaio. Devem utilizar-se fontes de iluminação adequadas, de modo a evitar a ex ­
posição dos animais a produtos de fotólise não naturais. Em alguns 
casos, pode afigurar-se adequado utilizar um filtro que elimine as 
radiações ultravioletas de comprimento de onda inferior a 290 nm.
 
1.8.2.7. C o n c e n t r a ç õ e s d e e n s a i o  
Os peixes são expostos, em condições dinâmicas, a, pelo menos, 
duas concentrações da substância em estudo em água. Em geral, a concentração mais elevada deve ser da ordem de 1 % da concen ­
tração LC
 50 aguda assintótica e, pelo menos, dez vezes superior ao 
limite de detecção em água do método analítico utilizado.  
A concentração mais elevada pode também ser calculada através do 
quociente de LC  50 em 96 horas por um rácio concentração aguda/ ­
crónica (os rácios adequados a determinadas substâncias podem va ­
riar de 3 a 100). Sempre que possível, as restantes concentrações devem diferir da concentração mais elevada num factor de 10. Caso a aplicação dos critérios baseados no parâmetro LC
 50 e no limite de 
detecção não se afigure viável, pode utilizar-se um factor inferior a 
10 ou, em alternativa, recorrer a uma substância marcada com  14 C. 
Não devem utilizar-se concentrações superiores à solubilidade da substância em estudo.
 
Caso se utilize um agente de solubilização, a respectiva concentração 
não deve exceder 0,1 ml/l, devendo ser idêntica em todos os reci ­
pientes. Deve conhecer-se a contribuição do referido agente, junta ­
mente com a substância em estudo, por o teor de carbono orgânico total da água. Deve, contudo, evitar-se ao máximo a utilização de tais substâncias.
 
1.8.2.8. C o n t r o l o s  
Além das séries de ensaio, deve efectuar-se um controlo com água 
de diluição ou, se adequado, com o agente de solubilização, na condição de este último não apresentar efeitos negativos nos peixes. 
Caso contrário, devem efectuar-se ambos os controlos.
 
1.8.3.  Frequência das determinações da qualidade da água  
Durante o ensaio, devem determinar-se em todos os recipientes o 
oxigénio dissolvido, o carbono orgânico total, o pH e a temperatura. 
Além disso, devem determinar-se a dureza e, se for caso disso, a 
salinidade, das amostras de controlo e da água de um dos recipientes em que a concentração da substância em estudo seja mais elevada. O oxigénio dissolvido e, se for caso disso, a salinidade, devem ser 
determinados, no mínimo, três vezes durante o período de fixação 
(no início, na fase intermédia e no final) e com uma frequência semanal no decurso da fase de depuração. O carbono orgânico total deve ser determinado no início do ensaio (48 h e 24 h antes do 
início), antes da colocação dos peixes nos recipientes e, pelo menos, 
uma vez por semana no decurso das fases de fixação e depuração. Deve determinar-se a temperatura diariamente, o pH no início e no final da cada período e a dureza uma vez em cada ensaio. Deve 
determinar-se a temperatura em contínuo pelo menos num dos reci ­
pientes.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1131
 
1.8.4.  Amostragem e análise dos peixes e da água  
1.8.4.1. C a l e n d á r i o d a r e c o l h a d e a m o s t r a s d e p e i x e s e d e 
á g u a  
Devem recolher-se amostras de água para a determinação da concen ­
tração da substância em estudo antes da colocação dos peixes nos 
recipientes, bem como no decurso das fases de fixação e depuração. As amostras de água devem, no mínimo, ser recolhidas em simultâ ­
neo com os peixes e antes da alimentação. Durante a fase de fixação, 
as concentrações da substância em estudo são determinadas de modo 
a verificar o respeito dos critérios de validade.
 
Os peixes são recolhidos em, pelo menos, cinco ocasiões no decurso 
da fase de fixação e em, pelo menos, quatro ocasiões, durante a fase de depuração. Uma vez que, por vezes, se torna difícil efectuar uma estimativa razoavelmente precisa do factor BCF com base no número 
de amostras, em especial no caso de a depuração envolver processos 
que não apresentem uma cinética de primeira ordem, é aconselhável recolher amostras com uma frequência superior, em ambos os perío ­
dos (ver apêndice 4). As amostras suplementares são armazenadas, 
sendo apenas analisadas se os resultados da primeira série de deter ­
minações forem insuficientes para o cálculo do referido factor com a precisão desejada.
 
O apêndice 4 apresenta um exemplo de calendário de amostragem. 
Podem elaborar-se outros calendários mediante a utilização de outros valores do P
 ow para o cálculo do tempo de exposição necessário a 
uma fixação de 95 %.  
A amostragem deve prosseguir durante a fase de fixação até ser 
atingido o estado estacionário, num máximo de 28 dias. Caso o estado estacionário não seja atingido em 28 dias, a amostragem 
deverá prosseguir até um máximo de 60 dias. Antes do início da 
fase de depuração, os peixes são transferidos para células limpas.
 
1.8.4.2. R e c o l h a e p r e p a r a ç ã o d a s a m o s t r a s  
As amostras de água para análise são recolhidas, por exemplo, por 
bombagem através de tubos inertes, a partir de um ponto central na 
célula de ensaio. Uma vez que nem sempre se afigura possível separar as fracções não biodisponível e biodisponível da substância em estudo por filtração ou centrifugação (em especial no caso de substâncias 
superlipófilas, isto é, substâncias com log P
 ow > 5) (1) (5).  
As amostras não devem ser sujeitas a tais processos, devendo adop ­
tar-se medidas para manter as células tão limpas quanto possível e 
determinar-se o teor de carbono orgânico em ambas as fases (fixação 
e depuração).  
Em cada amostragem, recolhe-se um número adequado de peixes (de 
modo geral, igual ou superior a 4) das células de ensaio. Os animais 
em causa são lavados rapidamente com água, secos, mortos instan ­
taneamente, por recurso a métodos humanos, e pesados.  
É aconselhável analisar os peixes e a água imediatamente após a 
recolha das amostras, de modo a evitar eventuais efeitos, nomeada ­
mente devidos à degradação, calculando as taxas de fixação e depu ­
ração aproximadas em função do avanço do ensaio. A análise ime ­
diata permite também identificar prontamente o início de uma fase 
estacionária.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1132
 
Caso não se proceda à análise imediata, as amostras são armazenadas 
de acordo com um método adequado. Antes do início do ensaio, 
devem obter-se dados relativos à armazenagem adequada da subs ­
tância em estudo, nomeadamente por ultracongelação, manutenção a 4
 o C, extracção, etc., bem como à duração da mesma.  
1.8.4.3. Q u a l i d a d e d o m é t o d o a n a l í t i c o  
Uma vez que o processo global é determinado essencialmente pela 
exactidão, precisão e sensibilidade do método analítico utilizado, 
deve comprovar-se experimentalmente a adequação ao mesmo da 
precisão e reprodutibilidade deste último, bem como do método de recolha da substância em estudo a partir da água e dos peixes, ao referido método. Deve também comprovar-se a não detectabilidade 
da substância em estudo na água de diluição.
 
Se necessário, os valores de C  w e C  f obtidos no ensaio são corrigidos 
de modo a ter em conta as recuperações e as concentrações de fundo dos controlos. As amostras de peixes e de água devem ser manipu ­
ladas de modo a minimizar contaminações e perdas, resultantes, 
nomeadamente, da adsorção pelos equipamentos de amostragem.
 
1.8.4.4. A n á l i s e d a s a m o s t r a s d e p e i x e s  
Caso se utilizem radiomarcadores, pode determinar-se a radioactivi ­
dade total (isto é, da substância de origem e dos seus metabolitos) ou, como alternativa, tratar as amostras de modo a que a substância de origem seja analisada separadamente. Além disso, os principais 
metabolitos podem ser caracterizados no estado estacionário ou no 
final da fase de fixação, consoante o que ocorrer primeiro. Se o factor BCF calculado com base nos resíduos radioactivos totais for igual ou superior a 1 000 %, pode ser aconselhável e mesmo, no 
caso de determinadas categorias de substâncias, tais como os pesti ­
cidas, fortemente recomendável, identificar e quantificar os produtos de degradação que representem 10 % ou mais da totalidade dos resíduos nos tecidos dos peixes, no estado estacionário. Caso se 
identifiquem e quantifiquem os produtos de degradação que repre ­
sentam 10 % ou mais dos resíduos totais marcados com radioisóto ­
pos nos tecidos dos peixes, recomenda-se também a identificação e quantificação dos produtos de degradação na água do ensaio.
 
Em geral, deve determinar-se a concentração da substância em es ­
tudo para cada peixe pesado. Se tal não for possível, podem com ­
binar-se as amostras em cada amostragem, sem prejuízo do trata ­
mento estatístico dos dados. Caso a especificidade e o rigor do método estatístico sejam importantes, deve utilizar-se no ensaio um 
número adequado de peixes, de modo a adaptar o procedimento de 
combinação ao rigor do método (6) (7).
 
O factor BCF deve ser expresso em função da massa húmida total e, 
no caso de substâncias altamente lipófilas, em função também do teor de lípidos. O teor de lípidos dos peixes deve ser determinado, se 
possível, em cada amostragem, devendo, para tal, utilizar-se métodos 
adequados (ver os pontos 8 e 2 do apêndice 3). Como método- -padrão, pode recomendar-se a extracção com clorofórmio/metanol (9). A aplicação de métodos diversos não conduz a resultados idên ­
ticos (10), pelo que devem fornecer-se pormenores sobre o método 
utilizado. Sempre que possível, deve efectuar-se a determinação dos lípidos no extracto utilizado para a análise da substância em estudo, uma vez que, com frequência, é necessário remover os mesmos do 
extracto antes da análise cromatográfica deste último. O teor de 
lípidos dos peixes no final da experiência, expresso em mg/kg, não deve diferir do teor inicial em mais de 25 %. Deve também referir-se a percentagem de matéria seca nos tecidos, de modo a 
permitir converter o teor de lípidos em relação à massa húmida no 
teor relativo à massa seca.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1133
 
2. RESULTADOS  
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS  
A curva de fixação da substância em estudo é obtida através da 
representação gráfica da respectiva concentração nos peixes ou em 
determinados tecidos dos mesmos na fase de fixação, em função do 
tempo, numa escala aritmética. Quando se observar o início do es ­
tado estacionário, isto é, quando a curva se tornar aproximadamente assintótica relativamente ao eixo dos tempos, calcula-se o factor 
BCF
 ss do seguinte modo:  
C f no estado estacionário  ðmédiaÞ 
C w no estado estacionário  ðmédiaÞ 
Se não for atingido o estado estacionário, pode calcular-se um factor 
BCF  ss suficientemente preciso para a avaliação dos riscos assumindo 
um estado estacionário «virtual», a 80 % (1,6/k  2 ) ou 95 % (3,0/k  2 ) 
do equilíbrio.  
O factor de concentração (BCF  k ) consiste no quociente das cons ­
tantes cinéticas de primeira ordem, k  1 /k 2 . De modo geral, a constante 
de velocidade de depuração (k  2 ) é determinada com base na curva de 
depuração (representação gráfica do decréscimo da concentração da 
substância em estudo nos peixes em função do tempo), calculando-se a constante de velocidade de fixação (k
 1 ) com base em k  2 e num 
valor de C  t obtido da curva de fixação (ver também o apêndice 5). O 
método mais aconselhável para obter o factor BCF  k e as constantes 
k 1 e k 2 consiste no recurso a métodos computacionais de estimativa 
não linear de parâmetros (11). Caso contrário, podem utilizar-se métodos gráficos para o cálculo das constantes cinéticas. Se a curva 
de depuração revelar de modo inequívoco que o processo não segue 
uma cinética de primeira ordem, há que recorrer a modelos mais complexos (ver referências no apêndice 3), procurando a orientação de um perito em bioestatística.
 
2.2. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS  
Sempre que as concentrações das soluções de ensaio sejam próximas 
do limite de detecção do método analítico utilizado, os resultados devem ser interpretados com precaução.
 
A obtenção de curvas de fixação e de depuração bem definidas 
constitui um indicador da qualidade dos dados relativos à bioconcen ­
tração. A variação das velocidades de fixação e depuração obtidas 
com ambas as concentrações de ensaio deve ser inferior a 20 %, devendo registar-se e tentar explicar-se a ocorrência de variações significativas das referidas velocidades. O intervalo de confiança 
dos valores de BCF obtidos em estudos adequados é, em geral, da 
ordem de ± 20 %.
 
3. RELATÓRIO  
O relatório do ensaio deverá incluir as seguintes informações:  
3.1. SUBSTÂNCIA EM ESTUDO  
— natureza física e, se adequado, propriedades físico-químicas,  
— dados decorrentes de análise química (incluindo o teor de car ­
bono orgânico, se adequado),  
— no caso da utilização de radiomarcadores, posição do(s) átomo(s) 
substituído(s) e percentagem de radioactividade associada às im ­
purezas.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1134
 
3.2. ESPÉCIES ANIMAIS UTILIZADAS  
— denominação científica, variedade, origem, pré-tratamento even ­
tual, aclimatação, idade, gama de dimensões, etc.  
3.3. CONDIÇÕES DE ENSAIO  
— tipo de procedimento utilizado (ensaio dinâmico ou semiestático),  
— tipo e características da iluminação utilizada e respectivo período,  
— concepção do ensaio (número e dimensões das células de ensaio, 
taxa de renovação do volume de água, número de replicados, 
números de peixes por replicado, número de concentrações de ensaio, duração das fases de fixação e depuração, frequência de amostragem de peixes e de água),
 
— método de preparação das soluções-mãe e frequência de renova ­
ção (caso se utilize um agente de solubilização, deve fornecer-se 
a respectiva concentração, bem como a contribuição do mesmo para o teor de carbono orgânico da água),
 
— concentrações de ensaio nominais, média e desvio-padrão dos 
valores determinados e método de obtenção dos mesmos,  
— fonte de água de diluição, descrição do eventual pré-tratamento 
desta última, resultados de quaisquer ensaios destinados a com ­
provar a adequação da água aos peixes e características da água: pH, dureza, temperatura, concentração de oxigénio dissolvido, 
cloro residual (se determinado), carbono orgânico total, sólidos 
em suspensão, salinidade (se adequado) e quaisquer outras deter ­
minações efectuadas,
 
— qualidade da água nos recipientes de ensaio (pH, dureza, carbono 
orgânico total, temperatura e concentração de oxigénio dissolvi ­
do), 
— informações pormenorizadas sobre a alimentação dos animais 
(por exemplo, tipo de alimentos, origem e composição dos mes ­
mos — se possível, apresentar, pelo menos, o respectivo teor de 
lípidos e proteínas —, quantidade fornecida e frequência),  
— informações sobre o tratamento das amostras de peixes e de 
água, incluindo pormenores relativos à preparação, armazenagem e extracção, bem como métodos analíticos aplicados à substância em estudo e à eventual determinação do teor de lípidos, in ­
cluindo a respectiva precisão.
 
3.4. RESULTADOS  
— resultados de quaisquer estudos preliminares efectuados,  
— mortalidade dos peixes do lote de controlo e dos peixes expostos 
à substância, bem como qualquer comportamento anormal obser ­
vável,  
— teor de lípidos dos peixes (se determinado no decurso do ensaio),  
— curvas de fixação e de depuração da substância em estudo pelos 
peixes, exibindo os valores determinados e incluindo o intervalo 
de surgimento do estado estacionário,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1135
 
— concentrações C  f e C  w (incluindo os respectivos desvios-padrão e 
gama, se adequado) para todos os períodos de amostragem. Deve 
exprimir-se a concentração C  f em μg/g (ppm) de massa húmida 
do animal na sua totalidade ou de determinados tecidos do mes ­
mo, nomeadamente tecidos ricos em lípidos; o valor C  w é ex­
presso em μg/ml (ppm). Devem também apresentar-se os valores 
de C  w relativos às séries de controlo, bem como as concentrações 
de fundo,  
— factor de bioconcentração no estado estacionário (BCF  SS ), e/ou 
factor de concentração cinético (BCF  k ), bem como, se for caso 
disso, os intervalos de confiança (95 %) das constantes de velo ­
cidade de fixação e depuração (expressos em relação à massa 
húmida dos peixes e ao teor total de lípidos, se determinado, dos animais ou de determinados tecidos dos mesmos), intervalos de confiança e desvio-padrão (se disponíveis). Devem também refe ­
rir-se os métodos computacionais e/ou de análise de dados apli ­
cados a cada concentração da substância em estudo,
 
— caso se utilizem radiomarcadores, pode, se necessário, apresentar- 
-se a acumulação de quaisquer metabolitos detectados,  
— devem referir-se quaisquer ocorrências especiais registadas no 
decurso do ensaio, bem como quaisquer desvios relativamente 
ao procedimento ou outras informações de relevo.  
O número de resultados classificados de «não detectados no limite 
de detecção» deve ser minimizado mediante o desenvolvimento de 
um método e de um protocolo experimental preliminares; os referi ­
dos resultados não podem ser utilizados para o cálculo das cons ­
tantes de velocidade.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) Connell D.W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent 
chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. To ­
xicol. 102, p. 117-156.  
(2) Bintein S., Devillers, J. and Karcher W. (1993). Nonlinear 
dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water parti ­
tion coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, p. 29-390.
 
(3) OECD, Paris (1996). Direct Phototransformation of Chemicals 
in Water. Environmental Health and Safety Guidance Docu ­
ment Series on Testing and Assessment of Chemicals. No 3.  
(4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: Comparison of 
bioconcentration factors derived from OECD and ASTM tes ­
ting methods; influence of particulate organic matter to the bioavaila- bility of chemicals. Water Quality Institute, Den ­
mark.
 
(5) US EPA 822-R-94-002 (1994). Great Lake Water Quality Ini ­
tiative Technical Support Doc. for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994.
 
(6) US FDA, (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide 
analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 20852, July 1975.
 
(7) US EPA (1974). Section 5, A(l). Analysis of Human Adipose 
Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Evi ­
ronmental Samples, Thompson J.F. (ed.) Research Triangle Park, N.C. 27711.
 
(8) Compaan H. (1980). in «The determination of the possible 
effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation». Ch. 
2.3, Part II. Government Publisshing Office, the Hague, The 
Netherlands.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1136
 
(9) Gardner  et al.,  (1995). Limn. & Oceanogr. 30, p. 1099-1105.  
(10) Randall R.C., Lee H., Ozretich R.J., Lake J.L. and Pruell R.J. 
(1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising 
pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, p. 1431-1436.
 
(11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: 
the flow-through method-Ring Test Programme, 
1984-1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen 
and N. Nyholm.  
(12) ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for 
conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater 
Bivalve Molluscs.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1137
 
Apêndice 1  
Características químicas de uma água de diluição adequada  
Substância Concentração limite  
1 Teor de partículas 5 mg/l 
2 Carbono orgânico total 2 mg/l 3 Amoníaco não ionizado 1 μg/l 
4 Cloro residual 10 μg/l 
5 Pesticidas organofosforados totais 50 ng/l 6 Pesticidas organoclorados totais e bifenilos policlorados 50 ng/l 
7 Cloro orgânico total 25 ng/l 
8 Alumínio 1 μg/l 
9 Arsénio 1 μg/l 
10 Crómio 1 μg/l 
11 Cobalto l μg/l 
12 Cobre 1 μg/l 
13 Ferro 1 μg/l 
14 Chumbo 1 μg/l 
15 Níquel 1 μg/l 
16 Zinco 1 μg/l 
17 Cádmio 100 ng/l 18 Mercúrio 100 ng/l 
19 Prata 100 ng/l
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1138
 
Apêndsice 2  
Espécies recomendadas para o ensaio  
Espécies recomendadas Gama de 
temperaturas de 
ensaio 
recomendadas 
( o C) Comprimento 
recomendado dos 
animais de ensaio 
(cm) 
1 Danio rerio  ( 1 ) (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton- 
-Buchanan) 20-25 3,0 ± 0,5 
2 Pimephales promelas  (Teleostei, Cyprinidae) (Rafi ­
nesque) 20-25 5,0 ± 2,0 
3 Cyprinus carpio  (Teleostei, Cyprinidae) (Linnaeus) 20-25 5,0 ± 3,0 
4 Oryzias latipes  (Teleostei, Poeciliidae) (Temminck 
and Schlegel) 20-25 4,0 ± 1,0 
5 Poecilia reticulata  (Teleostei, Poeciliidae) (Peters) 20-25 3,0 ± 1,0 
6 Lepomis macroehirus  (Teleostei, Centrarchidae) 
(Rafinesque) Bluegill 20-25 5,0 ± 2,0 
7 Oncorbynchus mykiss  (Teleostei, Salmonidae) (Wal ­
baum) 13-17 8,0 ± 4,0 
8 Gasterosteus aculeatus  (Teleostei, Gasterosteidae) 
(Linnaeus) 18-20 3,0 ± 1,0  
( 1 ) Meyer A., Orti G. (1993). Proc. Royal Society of London, Series B., Vol. 252, p. 231.  
Diversas espécies estuarinas e marinhas foram utilizadas em países diferentes, nomeadamente:  
Leiostomus xanthurus 
Cyprinodon variegatus Menidia beryllina 
Cymatogaster aggregata 
Parophrys vetulus Leptocottus armatus Gasteroteus aculeatus 
Dicentracus labrax 
Alburnus alburnus.
 
Obtenção dos peixes  
Os peixes de água doce referidos no quadro supra são de fácil reprodução, encontrando-se dispo ­
níveis todo o ano, enquanto que a disponibilidade de algumas das espécies marinhas e estuarinas se encontra limitada a determinados países. Os peixes de água doce podem ser criados em explorações piscícolas ou no laboratório, em condições controladas no que respeita a doenças e parasitas, de 
modo a produzir animais saudáveis com uma linha parental conhecida. Estas espécies encontram-se 
disponíveis em várias partes do mundo.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1139
 
Apêndice 3  
Previsão da duração das fases de fixação e depuração  
1. Estimativa da duração da fase de fixação  
Antes de realizar o ensaio, pode obter-se uma estimativa de k  2 e, conse­
quentemente, do tempo necessário para atingir o estado estacionário, com 
base em relações empíricas entre k  2 e o coeficiente de partição n-octanol/ ­
água (P  ow ) ou entre k  2 e a solubilidade em água(s).  
A relação empírica que se segue permite obter, nomeadamente, uma esti ­
mativa de k  2 (expressa em dias  -1 ) (1): 
log 10 k 2 = 0,414 log  10 (P ow ) + 1,47 (r  2 = 0,95) (equação 1)  
A referência (2) inclui outras equações.  
Caso o coeficiente de partição (P  ow ) não seja conhecido, pode obter-se uma 
estimativa (3) com base na solubilidade em água da substância em estudo: 
log 10 (P ow ) = 0,862 log  10 (s) + 0,710 (r  2 = 0,994) (equação 2)  
em que  
s = solubilidade (moles/l): (n = 36).  
As equações apenas são aplicáveis a substâncias com valores de log P  ow 
compreendidos entre 2 e 6,5 (4).  
Pode obter-se o tempo necessário para atingir uma determinada percenta ­
gem do estado estacionário a partir do valor de k  2 estimado, com base na 
equação cinética que descreve a fixação e a depuração (assumindo uma 
cinética de primeira ordem):  
dC f 
dt ¼ k 1 · C w Ä k 2 · C f 
ou, para C  w constante:  
C f ¼ k 1 
k 2 · C w ð1 Ä e Äk 2 t Þ (equação 3)  
Na vizinhança do estado estacionário (t → ∞), a equação 3 pode reduzir-se 
a (5) (6):  
C f ¼ k 1 
k 2 · C w ou C f /C w = k  1 /k 2 = BCF  
O valor k  1 /k 2 . C w constitui uma estimativa da concentração nos peixes no 
estado estacionário «virtual» (C  fs ). 
A equação 3 pode transformar-se em:  
C f ¼ C f;s ð1 Ä e Äk 2 t Þ or C f 
C fs ¼ 1 Ä e Äk 2 t (equação 4)  
Aplicando a equação 4, pode prever-se o tempo necessário para atingir uma 
determinada percentagem do estado estacionário, utilizando o valor de k  2 
determinado por intermédio da equação 1 ou 2.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1140
 
Do ponto de vista estatístico, a duração óptima da fase de fixação para a 
obtenção de dados estatísticos fiáveis (BCF  k ) consiste no período necessá ­
rio para que a curva decorrente da representação gráfica do logaritmo da concentração da substância em estudo nos peixes em função do tempo, numa escala aritmética, atinja o ponto médio, ou 1,6/k
 2 , ou 80 % do estado 
estacionário, mas não mais de 3,0/k  2 , ou 95 % do estado estacionário (7).  
O tempo necessário para atingir 80 % do estado estacionário é dado por 
(equação 4):  
0; 80 ¼ 1 Ä e Äk 2 t 80 or t 80 ¼ 1; 6 
k 2 (equação 5)  
Do mesmo modo, o tempo necessário para atingir 95 % do estado estacio ­
nário é dado por:  
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 (equação 6)  
Por exemplo, a duração da fase de fixação (up) de uma substância com log 
P ow = 4, é calculada do seguinte modo, por recurso às equações 1, 5 e 6: 
log 10 k 2 = - 0,414.(4) + 1,47 k  2 = 0,652 dias  
up (80 %) = 1,6/0,652, ou seja, 2,45 dias (59 horas)  
ou up (95 %) = 3,0/0,652, ou seja, 4,60 dias (110 horas)  
Do mesmo modo, a duração da fase de fixação de uma substância com s = 
10 -5 mal/l [log(s) = - 5,0], é calculada por recurso as equações 1, 2, 5 e 6:  
log 10 (P ow ) = - 0,862 . (- 5,0) + 0,710 = 5,02  
log 10 k 2 = - 0,414 . (5,02)+ 1,47  
k 2 = 0,246 dias  -1 
up (80 %) = 1,6/0,246, ou seja, 6,5 dias (156 horas)  
ou up (95 %)  = 3,0/0,246, ou seja, 12,2 dias (293 horas)  
Como alternativa,  
t eq = 6,54 × 10  3 P ow + 55,31 (horas)  
pode utilizar-se a expressão seguinte para o cálculo do tempo necessário 
para atingir o estado estacionário real (4):  
2. Estimativa da duração da fase de depuração  
Com base na equação geral que descreve a fixação e a depuração de acordo 
com uma cinética de primeira ordem, pode obter-se uma estimativa do tempo necessário para reduzir a carga corporal de uma determinada per ­
centagem da concentração inicial (1) (8).
 
Na fase de depuração, a concentração C  w deve ser nula, pelo que a equação 
pode reduzir-se a:  
dC f 
dt ¼ Ä k 2 C f or C f ¼ C f;o · e Äk 2 t ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1141
 
em que C  f.o representa a concentração no início do período de depuração. 
O tempo necessário para atingir 50 % da depuração (t  50 ) é dado por:  
C f 
C f;o ¼ 1 
2 ¼ e Äk 2 t 50 or t 50 ¼ 0; 693 
k 2 
Do mesmo modo, o tempo necessário para atingir 95 % de depuração será:  
t 95 ¼ 3; 0 
k 2 
Caso se utilize um valor correspondente a 80 % da fixação no primeiro 
período (1,6/k  2 ) e a 95 % da depuração na fase respectiva (3,0/k  2 ), a 
duração da fase de depuração é aproximadamente dupla da duração da 
fase de fixação.  
Deve sublinhar-se, todavia, que as estimativas em causa apenas são válidas 
para perfis de fixação e depuração que sigam uma cinética de primeira 
ordem. Caso se demonstre que tal não sucede, deve recorrer-se a modelos 
mais complexos [por exemplo, referência (1)].  
Referências  
(1) Spacie A. and Hamelink J.L. (1982). Alternative models for descri ­
bing the bioconcentration of organics in fish. Environ. Toxicol. and 
Chem. 1, p. 309-320.  
(2) Kristensen P. (1991). Bioconcentration is fish: comparison of BCF's 
derived from OECD and ASTM testing methods; influence of parti ­
culate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Qua ­
lity Institute.  
(3) Chiou C.T. and Schmedding D.W. (1982). Partitioning of organic 
compounds in octanol-water systems. Environ: Sci. Technol. 16 (1), p. 4-10.
 
(4) Hawker D.W. and Connell D.W. (1988). Influence of partition coef ­
ficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with 
fish. Wat. Res. 22 (6), p. 701-707.  
(5) Branson D.R., Blau G.E., Alexander H.C. and Neely W.B. (1975). 
Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), p. 785-792.  
(6) Ernst W. (1985). Accumulation in Aquatic Organisms. In: Appraisal 
of tests to predict the environne- mental behaviour of chemicals. Ed. 
by Sheehman P., Korte F., Klein W. and Bourdeau P.H., Part 4.4, p. 243-255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd, New York.
 
(7) Reilly P.M., Bajramovic R., Blau G.E., Branson D.R. and Sauerhoff 
M.W. (1977), Guidelines for the optimal design of experiments to 
estimate parameters in first order kinetic models, Can. J. Chem. Eng. 
55, p. 614-622.  
(8) Könemann H. and Van Leeuwen K. (1980). Toxicokinetics in fish: 
Accumulation and Elimination of Six Chlorobenzenes by Guppies. 
Chemosphere, 9, p. 3-19.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1142
 
Apêndsice 4  
Exemplo de calendário de amostragem aplicável aos ensaios de bioconcentração de substâncias com log P  ow = 4 
Recolha de amostras de 
peixes Calendário de amostragem 
Número de amostras 
adicionais Número de peixes por 
amostra Frequência mínima 
necessária (dias) Recolha de amostras 
adicionais  
Fase de fixação - 1 
0 2 (*) 
2 45-80 peixes 
1. a 0,3 0,4 2 
(2) 4 
(4) 
2. a 0,6 0,9 2 
(2) 4 
(4) 
3. a 1,2 1,7 2 
(2) 4 
(4) 
4. a 2,4 3,3 2 
(2) 4 
(4) 
5. a 4,7 2 6 
Fase de depuração Transferência dos pei ­
xes para uma célula 
com água isenta da 
substância em estudo 
6. a 5,0 5,3 4 
(4) 
7. a 5,9 7,0 4 
(4) 
8. a 9,3 11,2 4 
(4) 
9. a 14,0 17,5 6 
(4) 
(*) Recolher as amostras de água após, pelo menos, três renovações do volume da célula. 
Os valores entre parêntesis correspondem ao número de amostras de água e de peixes a recolher caso se proceda a uma amostragem 
suplementar.  
Nota: : O valor estimado de k  2 para log P  ow = 4,0 é de0,652dias  -1 . A duração total do ensaio é dada por: 3 × up = 3 × 4,6 dias = 14 dias. 
Para o cálculo do factor «up», consultar o apêndice 3.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1143
 
Apêndice 5  
Descrição do modelo  
Considera-se que a maioria dos dados referentes à bioconcentração são razoavel ­
mente descritos por recurso a um modelo simples do tipo «dois compartimentos/ ­
dois parâmetros», baseado na linearidade da curva obtida na representação grá ­
fica em papel semilogarítmico das concentrações nos peixes durante a fase de 
depuração em função do tempo. Caso não se obtenha uma curva linear, devem utilizar-se processos mais complexos, nomeadamente o processo descrito por Spacie e Hamelink (referência 1 do apêndice 3).
 
Método gráfico para a determinação da constante de velocidade de 
depuração, k  2 
Representar graficamente, em papel semilogarítmico, a concentração da substân ­
cia em estudo nas diversas amostras de peixe em função dos tempos de amos ­
tragem. O declive da curva obtida fornece o valor de k  2 . 
k 2 ¼ ln ðC f1=C f2 Þ 
t 2 Ä t 1
 
Deve sublinhar-se que quaisquer eventuais desvios à linearidade podem constituir 
indicação de um perfil de depuração mais complexo que o descrito por uma 
cinética de primeira ordem, podendo também aplicar-se métodos gráficos no 
caso de processos de depuração que não exibam uma cinética de primeira ordem.  
Método gráfico para a determinação da constante de velocidade de fixação, k  1 
Conhecida a constante k  2 calcular k  1 do seguinte modo:  
k 1 ¼ C f k 2 
C w Ü ð1 Ä e Äk 2 t Þ equação 1  
O valor de C  f é obtido a partir do ponto médio da curva de fixação obtida na 
representação gráfica do logaritmo da concentração em função do tempo.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1144
 
Método computacional para o cálculo das constantes de velocidade de 
fixação e de depuração  
O processo mais adequado para obter o factor de bioconcentração, bem como as 
constantes k  1 e k 2 , consiste no recurso a métodos computacionais de estimativa 
não linear. Os programas utilizados permitem obter valores para k  1 e k 2 a partir 
de uma série sequencial de dados tempo/concentração, aplicando o seguinte 
modelo teórico:  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü 1 Ä e Äk 2 t Ä Ö  
0 < t < t  c equação 2  
C f ¼ C w · k 1 
k 2 Ü e Äk 2 ðtÄt c Þ Ä e Äk 2 t Ê Ì  
t > t  c equação 3  
em que t  c = tempo decorrido até ao final da fase de fixação.  
A abordagem em causa permite obter uma estimativa de k  1 e k 2 com base no 
desvio-padrão.  
Uma vez que, na maioria dos casos, a constante k  2 pode ser estimada a partir da 
curva de depuração com uma precisão relativamente elevada, determinando-se em simultâneo a forte correlação existente entre os parâmetros k
 1 e k 2 , pode ser 
aconselhável começar por calcular k  2 apenas com base nos dados de depuração, 
calculando posteriormente k  1 a partir dos dados de fixação, por recurso a um 
método de regressão não linear.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1145
 
C.14.  ENSAIO DE CRESCIMENTO JUVENIL EM PEIXES  
1. MÉTODO  
O presente método de ensaio de toxicidade no crescimento baseia-se 
na publicação OECD TG 215 (2000) (normas de ensaio da OCDE).  
1.1. INTRODUÇÃO  
O presente ensaio, concebido para avaliar os efeitos da exposição 
prolongada a substâncias químicas no crescimento de peixes juvenis, 
baseia-se num método desenvolvido e testado na União Europeia 
através de um ensaio interlaboratorial (1) (3) e destinado a determi ­
nar os efeitos de substâncias químicas no crescimento de juvenis de truta arco-íris  (Oncorynchus mykiss)  em condições de escoamento. 
Podem usar-se para ensaio outras espécies relativamente às quais 
existam obras de referência. As publicações sobre ensaios de cresci ­
mento em peixe-zebra  (Danio rerio ) (2) (4) (5) e em peixinho dos 
arrozais  (Oryzias latipes ) (6) (7) (8), por exemplo, contêm informa ­
ções úteis para este tipo de estudos.
 
Ver também a introdução geral, parte C.  
1.2. DEFINIÇÕES  
Menor concentração com efeito observável (MCCEO):  é a menor 
concentração de ensaio da substância a ensaiar para a qual se ob ­
serva um efeito significativo (a p < 0,05) quando comparado com o 
controlo. No entanto, todas as concentrações de ensaio superiores à 
MCCEO devem ter um efeito prejudicial igual ou superior ao veri ­
ficado com a MCCEO.  
Concentração sem efeito observável (CSEO):  é a concentração de 
ensaio cujo valor se situa imediatamente abaixo do valor da 
MCCEO.  
EC x no presente método de ensaio, é a concentração da substância 
de ensaio que causa uma variação de x % na taxa de crescimento dos 
peixes relativamente aos controlos.  
Taxa de carga:  é o peso fresco de peixe por volume de água.  
Densidade de ocupação:  é o número de peixes por volume de água.  
Taxa específica de crescimento individual de um peixe:  expressa a 
taxa de crescimento de um indivíduo relativamente ao seu peso inicial.
 
Taxa específica média de crescimento de um tanque:  expressa a 
taxa média de crescimento da população de um tanque para uma 
dada concentração da substância de ensaio.  
Taxa de crescimento pseudo-específica:  expressa a taxa de cresci ­
mento individual relativamente ao valor médio do peso inicial da 
população do tanque.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1146
 
1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Os peixes juvenis em fase exponencial de crescimento são pesados, 
colocados em câmaras de ensaio e expostos a uma gama de concen ­
trações subletais da substância de ensaio dissolvida em água. O 
ensaio deverá realizar-se preferencialmente em condições de escoa ­
mento; se tal não for possível, poderão usar-se condições semiestá ­
ticas (estático — renovação) apropriadas. A duração do ensaio é de 28 dias. Os peixes são alimentados diariamente. A quantidade de 
alimento fornecido aos peixes é calculada com base no seu peso 
inicial e pode ser reavaliada decorridos 14 dias de ensaio. No final do ensaio, os peixes são pesados novamente. Os efeitos nas taxas de 
crescimento são analisados por meio de um modelo de regressão, de 
forma a estimar a concentração que provocaria uma variação de x % na taxa de crescimento, ou seja, CEx (por exemplo, CE10, CE20 ou CE30). Em alternativa, os dados podem ser comparados com valores 
de controlo, de modo a determinar a menor concentração com efeito 
observável (MCCEO) e, a partir desse valor, a concentração sem efeito observável (CSEO).
 
1.4. INFORMAÇÃO SOBRE A SUBSTÂNCIA DE ENSAIO  
Deverão estar disponíveis resultados de um ensaio de toxicidade 
aguda (ver método de ensaio C.1.) realizado de preferência com a espécie escolhida para este ensaio, o que implica que a solubilidade 
em água e a pressão de vapor da substância de ensaio são conheci ­
das, e que existe um método analítico fiável para a quantificação da substância nas soluções a ensaiar, relativamente ao qual a exactidão e o limite de detecção são conhecidos e se encontram descritos.
 
A fórmula estrutural, o grau de pureza, a estabilidade em água, a 
estabilidade à luz, os valores de pK  a e P  ow e os resultados de um 
ensaio de biodegradabilidade «fácil» da substância de ensaio cons ­
tituem informações úteis (ver método de ensaio C.4).  
1.5. VALIDADE DO ENSAIO  
Um ensaio é considerado válido quando são cumpridas as seguintes 
condições:  
— no(s) controlo(s), a mortalidade no final do ensaio não deverá ser 
superior a 10 %,  
— o aumento do peso médio dos peixes no(s) controlo(s) deverá ser 
suficiente para permitir a detecção da mínima variação da taxa de crescimento considerada significativa. Os resultados de um ensaio interlaboratorial (3) demonstraram que, para a truta ar ­
co-íris, o peso médio dos peixes nos controlos deve sofrer, ao 
longo de 28 dias, um aumento que seja, no mínimo, equivalente a metade (isto é, a 50 %) do seu peso médio inicial; por exem ­
plo, peso inicial: 1 g/peixe (= 100 %), peso final após 28 dias: 
≥ 1,5 g/peixe ( ≥ 150 %),
 
— a concentração do oxigénio dissolvido deve ser igual ou superior 
a 60 % do valor da saturação com ar (VSA) ao longo de todo o ensaio,
 
— a variação da temperatura da água não deve ser superior a ± 1  o C 
entre as diferentes câmaras de ensaio em qualquer momento do ensaio nem deverá ultrapassar um intervalo de 2
 o C dentro das 
gamas de temperatura especificadas para as espécies a ensaiar 
(apêndice 1).  
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.6.1.  Equipamento  
Equipamento normal de laboratório e, mais especificamente, o se ­
guinte:  
a) Medidores de oxigénio e de pH;  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1147
 
b) Equipamento para determinação da dureza e alcalinidade da água;  
c) Aparelhos apropriados para o controlo da temperatura e que per ­
mitam, de preferência, a sua monitorização contínua;  
d) Tanques construídos com um material quimicamente inerte e de 
capacidade adequada à carga e à densidade de ocupação reco ­
mendadas (ver ponto 1.8.5 e apêndice 1);  
e) Balança de precisão apropriada (isto é, com uma exactidão de 
± 0,5 %).  
1.6.2.  Água  
Qualquer água que sustente a sobrevivência e o crescimento adequa ­
dos a longo prazo, da espécie em ensaio, poderá ser utilizada como 
água de ensaio. A qualidade da água deve ser mantida constante durante o ensaio. Os valores de pH devem situar-se entre 6,5 e 8,5, não devendo, num dado ensaio, sofrer variações superiores a 
± 0,5 pH unidades. Recomenda-se uma dureza superior a 140 mg/l 
(expressos em CaCO
 3 ). Para assegurar que a água de diluição não 
influencie indevidamente o resultado do ensaio (por complexação da substância de ensaio, por exemplo), deverão ser regularmente retira ­
das amostras para análise. Devem efectuar-se medições de metais 
pesados (por exemplo, Cu, Pb, Zn, Hg, Cd e Ni), principais aniões e catiões (por exemplo, Ca, Mg, Na, K, Cl e SO
 4 ), pesticidas (por 
exemplo, pesticidas organofosforados totais e organoclorados totais), 
carbono orgânico total e sólidos em suspensão. Nos casos em que se 
sabe que a água de diluição mantém uma qualidade relativamente constante, estas medições deverão ser efectuadas, por exemplo, de três em três meses. Caso se demonstre que a qualidade da água se 
mantém inalterada durante, pelo menos, um ano, as determinações 
podem ser menos frequentes (de seis em seis meses, por exemplo). No apêndice 2 apresentam-se algumas características químicas de uma água de diluição aceitável.
 
1.6.3.  Soluções de ensaio  
As soluções de ensaio com as concentrações escolhidas são prepa ­
radas por diluição de uma solução de reserva.  
A solução de reserva deve ser preparada, preferencialmente, apenas 
por mistura ou agitação da substância de ensaio na água de diluição, 
utilizando meios mecânicos (agitação ou dispersão ultra-sónica, por 
exemplo). Podem ser utilizadas colunas de saturação (colunas de solubilidade) para obter uma solução de reserva concentrada adequa ­
da.
 
Em alguns casos, pode ser necessário utilizar solventes ou disper ­
santes (agentes solubilizantes) para produzir uma solução de reserva com a concentração adequada. A acetona, o etanol, o metanol, o dimetilsulfóxido, a dimetilformamida e o trietilenoglicol são exem ­
plos de solventes adequados. Dispersantes adequados são, por exem ­
plo, o Cremofor RH40, o Tween 80, a metilcelulose a 0,01 % e o HCO-40. Deve ter-se cuidado ao utilizar agentes facilmente biode ­
gradáveis (como a acetona, por exemplo) e/ou compostos altamente 
voláteis, uma vez que estes podem causar problemas relacionados 
com o desenvolvimento de bactérias nos ensaios em que for utilizado o método de escoamento. Quando se utiliza um agente solubilizante, este não deve afectar de forma significativa o crescimento dos pei ­
xes, nem produzir efeitos adversos observáveis nos juvenis, de 
acordo com um controlo na presença apenas do solvente.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1148
 
Para os ensaios por escoamento, é necessário utilizar um sistema que 
distribua e dilua continuamente a solução de reserva da substância de 
ensaio (por exemplo, uma bomba de medição, um diluidor propor ­
cional ou um sistema saturador), por forma a fornecer uma série de concentrações às câmaras de ensaio. As taxas de fluxo das soluções 
de reserva e da água de diluição devem ser verificadas a intervalos 
regulares durante o ensaio, de preferência diariamente, e não devem variar mais do que 10 % ao longo do ensaio. Os resultados de um ensaio interlaboratorial demonstraram que, para a truta arco-íris, é 
adequado utilizar uma frequência de remoção de água de 6 l/g de 
peixe/dia (ver ponto 1.8.2.2).
 
Para os ensaios semiestáticos (de renovação), a frequência de reno ­
vação do meio dependerá da estabilidade da substância de ensaio. 
No entanto, recomenda-se uma renovação diária da água. Se, a partir 
de ensaios de estabilidade preliminares (ver ponto 1.4), se demons ­
trar que a concentração da substância de ensaio não é estável (isto é, se estiver fora da gama de 80-120 % do valor nominal ou se for 
inferior a 80 % da concentração medida inicialmente) durante o 
período de renovação, deve considerar-se a utilização de um ensaio por escoamento.
 
1.6.4.  Selecção de espécies  
A espécie recomendada para o presente ensaio é a truta arco-íris  
(Oncorhynchus mykiss),  uma vez que a maior parte da informação 
disponível foi obtida a partir de ensaios interlaboratoriais realizados 
com esta espécie (1) (3). Podem ser usadas outras espécies relativa ­
mente às quais exista documentação de referência embora o método de ensaio possa ter de ser adaptado de modo a proporcionar as 
condições de ensaio adequadas. Por exemplo, existem obras de re ­
ferência relativas ao peixe-zebra  (Danio rerio)  (4) (5) e ao peixinho 
dos arrozais ( Oryzias latipes ) (6) (7) (8). Neste caso, o relatório 
deverá indicar o critério para a selecção das espécies e o método 
experimental.
 
1.6.5.  Confinação dos peixes  
Os peixes de ensaio devem ser seleccionados a partir da população 
de uma única reserva (de preferência proveniente da mesma desova), que tenha sido mantida em condições de qualidade da água e de 
iluminação idênticas às usadas no ensaio durante, pelo menos, as 
duas semanas anteriores à sua realização. Durante o período de confinação e no decorrer do ensaio, os peixes devem ser alimentados preferencialmente com uma ração equivalente a 4 % do peso corpo ­
ral por dia; no mínimo, a ração diária deverá corresponder a 2 % do 
peso corporal.
 
Decorrido um período inicial de 48 h deverá registar-se a mortali ­
dade e aplicar os seguintes critérios:  
— mortalidade superior a 10 % da população num período de sete 
dias: o lote é rejeitado na sua totalidade,  
— mortalidade de 5 % a 10 % da população: aclimatação durante 
um período adicional de sete dias: caso se verifique mortalidade 
superior a 5 % durante este segundo período, deverá rejeitar-se a 
totalidade do lote,  
— mortalidade inferior a 5 % da população num período de sete 
dias: o lote é aceite.  
Os peixes não devem receber qualquer tratamento de doenças nas 
duas semanas anteriores ao ensaio nem durante a realização do mes ­
mo. ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1149
 
1.7. PLANEAMENTO DO ENSAIO  
O «planeamento do ensaio» consiste na escolha do número e inter ­
valos das concentrações de ensaio, do número de tanques para cada concentração e do número de peixes por tanque. Um planeamento de 
ensaio correctamente elaborado deverá considerar os seguintes aspec ­
tos:
 
a) O objectivo do estudo;  
b) O método de análise estatística a utilizar;  
c) A disponibilidade e o custo dos meios experimentais.  
A definição do objectivo deverá, se possível, especificar o rigor 
estatístico para o qual é necessário ocorrer uma determinada diferen ­
ça, de modo a ser detectada (na taxa de crescimento, por exemplo). 
Em alternativa, poderá especificar a precisão com que será necessário 
determinar a CE  X de modo a permitir a sua estimativa (por exemplo, 
com x = 10, 20 ou 30; de preferência, o valor de x não deve ser inferior a 10). Se nenhuma destas informações for disponibilizada, 
não será possível dar uma indicação correcta da dimensão do estudo.
 
Importa ter presente que um planeamento considerado óptimo (ou 
seja, o que utiliza da melhor forma os recursos disponíveis) para 
análise através de um dado método estatístico poderá não o ser 
para outro método. Assim, um planeamento concebido para determi ­
nação da MCCEO/CSEO não será idêntico a um outro concebido para análise por regressão.
 
Na maioria dos casos, pelas razões analisadas por Stephan e Rogers 
(9), considera-se que a análise de regressão é preferível à análise de variância. No entanto, no caso de não se encontrar um modelo de regressão adequado (r
 2 < 0,9), deverá usar-se a estimativa de CSEO/ ­
MCCEO.  
1.7.1.  Planeamento para análise por regressão  
O planeamento de um ensaio a analisar por regressão deverá consi ­
derar os seguintes aspectos:  
a) As concentrações testadas no ensaio deverão, obrigatoriamente, 
incluir as concentrações às quais se observam determinadas per ­
centagens de efeito (por exemplo, CE  10,20,30  ) e abranger a gama 
de concentrações para as quais o efeito da substância de ensaio é significativo. As estimativas das concentrações responsáveis por determinadas percentagens de efeito poderão ser feitas com maior 
precisão se os respectivos valores se localizarem a meio da gama 
de concentrações ensaiadas. A realização de um ensaio preliminar para determinação da gama de concentrações poderá ser útil na escolha das concentrações de ensaio apropriadas;
 
b) De modo a permitir a aplicação de um modelo estatístico, o 
ensaio deve incluir, no mínimo, um tanque de controlo e cinco tanques adicionais com diferentes concentrações da substância de ensaio. Caso se utilize um agente solubilizante, o ensaio deverá 
incluir, além da série de ensaio, um controlo contendo o agente 
solubilizante na maior das concentrações testadas no ensaio (ver pontos 1.8.3 e 1.8.4);
 
c) Embora se possam utilizar séries geométricas ou séries logarítmi ­
cas adequadas (10) (ver apêndice 3), recomenda-se o espaça ­
mento logarítmico das concentrações de ensaio;  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1150
 
d) Se existirem mais do que seis tanques, os tanques excedentes 
devem ser usados para repetição ou distribuídos ao longo da 
gama de concentrações de forma a reduzir o intervalo entre ní ­
veis. Não há preferência por qualquer destes procedimentos.  
1.7.2.  Planeamento para a estimativa de CSEO/MCCEO através de 
análise de variância (ANOVA)  
Sempre que possível, devem usar-se repetições dos tanques corres ­
pondentes a cada concentração; a análise estatística deve efectuar-se ao nível de cada tanque (11). Sem repetições, não é possível analisar a variabilidade entre tanques, mas apenas a atribuível à variabilidade 
entre cada um dos elementos da população. No entanto, os resultados 
de um estudo publicado (12) demonstraram que, no caso examinado, a variabilidade entre tanques era muito pequena quando comparada com a variabilidade dentro de cada tanque (isto é, entre os peixes de 
um tanque). Assim, considera-se a realização de análise estatística a 
nível individual uma alternativa relativamente aceitável.
 
Convencionalmente, utilizam-se pelo menos cinco concentrações de 
ensaio de uma série geométrica com um factor que, de preferência, 
não deverá ser superior a 3,2.  
Em geral, em ensaios com tanques repetidos, o número de repetições 
de tanques de controlo (e portanto, o número de peixes) deverá ser o 
dobro do usado em cada uma das concentrações de ensaio, as quais 
deverão ser de dimensão idêntica (13) (14) (15). Em contrapartida, na ausência de tanques repetidos, o número de peixes no grupo de controlo deve ser idêntico ao usado em cada concentração de ensaio.
 
Caso se utilize uma ANOVA baseada em tanques e não em indiví ­
duos (o que implicaria a marcação individual dos peixes ou o uso de taxas de crescimento pseudo-específicas (ver ponto 2.1.2), o ensaio deverá incluir as repetições necessárias para a determinação do des ­
vio-padrão relativo aos «tanques nas mesmas concentrações». Assim 
sendo, a estimativa do erro na análise de variância deverá considerar, no mínimo, cinco graus de liberdade (11). Se o ensaio incluir apenas repetições dos controlos, a variabilidade do erro poderá ser desviada, 
uma vez que pode aumentar com o valor médio da taxa de cresci ­
mento em questão. Dado ser provável que a taxa de crescimento diminua com o aumento da concentração, esta situação poderá con ­
duzir a uma sobrestimação da variabilidade.
 
1.8. PROCEDIMENTO  
1.8.1.  Selecção e pesagem dos peixes de ensaio  
É importante minimizar a variação entre o peso de cada peixe no 
início do ensaio. O apêndice 1 contém as gamas de pesos aceitáveis para as diferentes espécies recomendadas para uso neste ensaio. A 
gama de pesos individuais em todo o lote de peixes no início do 
ensaio deve situar-se, de preferência, dentro dos limites de ± 10 % da média aritmética dos pesos, não devendo, em circunstância algu ­
ma, exceder os 25 %. Por forma a estimar o peso médio, recomenda- 
-se a pesagem de uma amostra do lote de peixe antes de dar início ao 
ensaio.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1151
 
A população de reserva deve ser privada de alimento durante as 24 
horas que antecedem o início do ensaio. Os peixes deverão então ser 
escolhidos de forma aleatória. Utilizando um anestésico geral (por exemplo, uma solução aquosa de 100 mg/l de metanosulfonato de tricaína [MS 222], neutralizada por adição de duas partes de bicar ­
bonato de sódio por cada parte de MS 222), os peixes devem ser 
pesados individualmente por forma a determinar o peso fresco (secos com papel absorvente) com a precisão indicada no apêndice 1. Os peixes cujo peso se encontre dentro da gama pretendida são selec ­
cionados e distribuídos aleatoriamente pelos recipientes de ensaio. 
Deve registar-se o peso fresco total dos peixes em cada recipiente. O uso de anestésicos e a manipulação (incluindo a secagem com papel e a pesagem) podem causar tensão ou danos físicos nos peixes 
juvenis, especialmente em espécies de pequeno tamanho. Por essa 
razão, a manipulação dos juvenis deverá ser feita com o máximo cuidado para se evitarem esses efeitos nos animais do ensaio.
 
Os peixes voltam a ser pesados no 28.  o dia de ensaio (ver ponto 
1.8.6). No entanto, caso se considere necessário recalcular a ração alimentar, pode efectuar-se uma pesagem adicional no 14.
 o dia de 
ensaio (ver ponto 1.8.2.3). A detecção de alterações no tamanho dos 
peixes, a partir dos quais se possam ajustar as rações alimentares, poderá ser efectuada através de outros métodos, tais como a foto ­
grafia.
 
1.8.2.  Condições de exposição  
1.8.2.1.  Duração  
A duração mínima do ensaio é de 28 dias.  
1.8.2.2.  Taxas de carga e densidades de ocupação  
É importante que a taxa de carga e a densidade de ocupação sejam 
adequadas à espécie usada no ensaio (ver apêndice 1). Uma densi ­
dade de ocupação demasiado elevada poderá dar origem a perturba ­
ções por superlotação, causadoras de reduções nas taxas de cresci ­
mento e, possivelmente, de doenças. Por outro lado, o uso de baixas densidades de ocupação poderá induzir comportamentos territoriais, que poderão também afectar o crescimento. Em todo o caso, a taxa 
de carga deverá ser suficientemente baixa para permitir manter uma 
concentração de oxigénio dissolvido de pelo menos 60 % VSA sem arejamento. Um ensaio interlaboratorial (3) demonstrou que, para a 
truta arco-íris, é adequado utilizar uma taxa de carga de 16 trutas de 
3-5 g num volume de 40 1. A frequência de remoção de água recomendada durante o período de ensaio é de 6 l/g de peixe/dia.
 
1.8.2.3.  Alimentação  
Os peixes devem ser nutridos com um alimento apropriado (apêndice 
1), administrado a um ritmo suficiente para induzir uma taxa de crescimento aceitável. Deverão ser tomadas as precauções necessá ­
rias para evitar o crescimento de microorganismos e a turbidez da 
água. No caso da truta arco-íris, considera-se adequada uma quanti ­
dade diária correspondente a 4 % do seu peso corporal (3) (16) (17) (18). A ração diária pode ser dividida em duas porções iguais, que serão fornecidas aos peixes em duas tomas separadas por um inter ­
valo mínimo de cinco horas. O cálculo da ração baseia-se no peso 
total inicial dos peixes em cada recipiente. No caso de se efectuar uma segunda pesagem dos peixes no 14.
 o dia de ensaio, poderá 
efectuar-se um novo cálculo da ração alimentar. Os peixes devem 
ser privados de alimento durante o período de 24 horas que antecede 
a pesagem.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1152
 
Os alimentos não consumidos e a matéria fecal devem ser removidos 
diariamente dos recipientes de ensaio, limpando-se cuidadosamente o 
fundo de cada tanque com um sistema de sucção.  
1.8.2.4.  Luz e temperatura  
O fotoperíodo e a temperatura da água do ensaio devem ser apro ­
priados para a espécie de ensaio (apêndice 1).  
1.8.3.  Concentrações de ensaio  
Normalmente, deverão ser utilizadas cinco concentrações da subs ­
tância de ensaio, independentemente do planeamento do ensaio (ver 
ponto 1.7.2). O conhecimento prévio da toxicidade da substância de 
ensaio (obtido a partir de um ensaio de toxicidade aguda e/ou de um ensaio para determinação de gama de concentrações, por exemplo) deverá ajudar na selecção das concentrações de ensaio apropriadas. 
Deve fornecer-se uma justificação quando se utilizam menos de 
cinco concentrações. A concentração de ensaio mais elevada não deverá exceder o limite de solubilidade da substância em água.
 
Quando se utiliza um agente solubilizante para facilitar a preparação 
de soluções de reserva, a sua concentração final não deve ser supe ­
rior a 0,1 ml/l e, de preferência, deverá ser a mesma em todos os 
recipientes de ensaio (ver ponto 1.6.3). No entanto, devem fazer-se todos os esforços para evitar a utilização destes produtos.
 
1.8.4.  Controlos  
O número de controlos em água de diluição depende do planeamento 
do ensaio (ver pontos 1.7-1.7.2). Se se utilizar um agente solubili ­
zante, o ensaio deverá incluir controlos com essa substância em 
número idêntico aos controlos em água de diluição.  
1.8.5.  Frequência das determinações analíticas e medições  
Durante o ensaio, as concentrações da substância de ensaio deverão 
ser determinadas a intervalos regulares (ver abaixo).  
Nos ensaios por escoamento, as taxas de fluxo das soluções de 
reserva do agente de diluição e da substância tóxica devem ser 
verificadas a intervalos regulares, de preferência diariamente, não devendo variar mais do que 10 % ao longo do ensaio. Nos ensaios em que se espera que as concentrações da substância de ensaio se 
mantenham dentro de um intervalo de ± 20 % dos valores nominais 
(isto é, dentro da gama 80-120 %; ver pontos 1.6.2 e 1.6.3), reco ­
menda-se que, no mínimo, a maior e a menor das concentrações de ensaio sejam analisadas no início do estudo e, a partir daí, semanal ­
mente. Para os ensaios em que não se espera que a concentração da 
substância de ensaio se mantenha dentro do intervalo de ± 20 % do valor nominal (com base nos dados de estabilidade da substância), será necessário analisar todas as concentrações de ensaio, seguindo o 
mesmo regime.
 
Nos ensaios semiestáticos (de renovação), em que se espera que a 
concentração da substância de ensaio se mantenha dentro de um intervalo de ± 20 % do valor nominal, recomenda-se que, no míni ­
mo, a maior e a menor das concentrações de ensaio sejam analisadas 
logo após a sua preparação e imediatamente antes da renovação, no 
início do estudo e, a partir daí, semanalmente. Para os ensaios em que não se espera que a concentração da substância de ensaio se mantenha dentro do intervalo de ± 20 % do valor nominal, será 
necessário analisar todas as concentrações de ensaio, seguindo um 
regime idêntico ao recomendado para substâncias mais estáveis.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1153
 
Recomenda-se que os resultados se baseiem em concentrações me ­
didas. No entanto, caso existam provas de que a concentração da 
substância a ensaiar na solução se manteve, durante o ensaio, no intervalo de ± 20 % do valor nominal ou do valor da concentração inicial medida, os resultados poderão basear-se em valores nominais 
ou em valores medidos.
 
As amostras podem precisar de ser centrifugadas ou filtradas (utili ­
zando um poro com 0,45 μm, por exemplo). Embora a centrifugação 
seja o procedimento recomendado, as amostras podem ser filtradas desde que o material de ensaio não adsorva aos filtros.
 
Durante o ensaio, o oxigénio dissolvido, o pH e a temperatura de ­
vem ser medidos em todos os recipientes de ensaio. A dureza total, a alcalinidade e a salinidade (se relevante) devem ser medidas nos controlos e num recipiente com a concentração mais elevada. O 
oxigénio dissolvido e a salinidade (se relevante) devem ser medidos 
três vezes (no início, a meio e no fim do ensaio). Nos ensaios semiestáticos, recomenda-se que o oxigénio dissolvido seja medido com maior frequência, de preferência antes e após cada renovação da 
água ou, pelo menos, uma vez por semana. O pH deve ser medido 
no início e no fim de cada renovação da água nos ensaios de reno ­
vação estática e, pelo menos, semanalmente nos ensaios por escoa ­
mento. A dureza e a alcalinidade devem ser medidas uma vez em 
cada ensaio. A temperatura deverá ser, de preferência, monitorizada 
continuamente, pelo menos, num recipiente de ensaio.
 
1.8.6.  Observações  
Peso: No fim do ensaio, todos os peixes sobreviventes devem ser 
pesados, avaliando-se o peso fresco (seco com papel absorvente). A pesagem pode ser feita individualmente ou em grupos por recipiente 
de ensaio; este último procedimento é preferível, uma vez que a 
pesagem em separado exige a marcação individual dos peixes. Se for necessário efectuar pesagens individuais para determinar taxas específicas de crescimento de cada um dos peixes, a técnica de 
marcação adoptada deverá evitar perturbar os animais (poderão uti ­
lizar-se alternativas a marcação por congelação, tais como a utiliza ­
ção de linha de pesca fina colorida).
 
Durante o período do ensaio, os peixes devem ser observados dia ­
riamente, devendo ser assinaladas quaisquer anomalias externas (tais 
como hemorragia, descoloração) ou comportamentos anómalos. A 
mortalidade deverá ser registada, e os peixes mortos retirados o mais rapidamente possível. Os peixes mortos não são substituídos, uma vez que a taxa de carga e a densidade de ocupação são sufi ­
cientes para impedir que alterações no número de peixes por tanque 
afectem o crescimento. No entanto, a taxa de alimentação deverá ser reajustada.
 
2. DADOS E RELATÓRIO  
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS  
Recomenda-se que um técnico estatístico participe tanto no planea ­
mento como na análise do ensaio, uma vez que o método permite 
variações consideráveis no plano experimental no que se refere, por exemplo, ao número de recipientes de ensaio, ao número de concen ­
trações de ensaio, ao número de peixes, etc. Devido às opções dis ­
poníveis quanto ao planeamento do ensaio, não se fornece qualquer 
orientação específica relativamente aos procedimentos estatísticos.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1154
 
As taxas de crescimento não devem ser calculadas em recipientes de 
ensaio em que a mortalidade seja superior a 10 %. No entanto, deve 
indicar-se a taxa de mortalidade para todas as concentrações de ensaio.
 
Seja qual for o método utilizado na análise dos dados, o conceito 
fundamental é a taxa específica de crescimento r entre os tempos t  1 e 
t 2 . Esta pode ser definida de várias formas, dependendo de os peixes 
serem ou não marcados individualmente, bem como da necessidade de determinar uma média por tanque.
 
r 1 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
r 2 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
r 3 ¼ log e W 2 Ä log  e W 1 
t 2 Ä t 1 Ü 100 
em que  
r 1 = taxa específica de crescimento individual  
r 2 = taxa específica de crescimento média por tanque  
r 3 = taxa pseudo-específica de crescimento  
w 1 , w 2 = pesos de determinado peixe nos tempos t  1 e t 2 , res­
pectivamente  
log e w 1 = logaritmo do peso de um indivíduo no início do pe ­
ríodo de estudo  
log e w 2 = logaritmo do peso de um indivíduo no final do pe ­
ríodo de estudo  
log e W 1 = média dos logaritmos dos valores de w  1 para os pei ­
xes do tanque no início do período de estudo  
log e W 2 = média dos logaritmos dos valores de w  2 para os pei ­
xes do tanque no final do período de estudo  
t 1 , t 2 = tempo (em dias) no início e no final do período de 
estudo  
As taxas r  1 , r 2 , r 3 podem ser calculadas para o período «dia 0-dia 
28», e, quando apropriado (isto é, quando se efectuaram medições no 
14. o dia de ensaio), para os períodos «dia 0-dia 14» e «dia 14-dia 
28». 
2.1.1.  Análise de resultados por regressão (modelo concentração-res ­
posta)  
Este método de análise estabelece uma relação matemática adequada 
entre a taxa específica de crescimento e a concentração, permitindo a determinação da «CE
 x », ou seja, de qualquer valor de CE. Utilizando 
este método não é necessário calcular o valor individual de r (r  1 ) e, 
em vez disso, a análise pode basear-se no valor médio de r por 
tanque (r  2 ). Este último procedimento é considerado preferível, e 
também mais adequado a espécies de menores dimensões.  
As taxas específicas de crescimento médias por tanque (r  2 ) devem 
ser representadas graficamente em função da concentração, de forma 
a observar a relação concentração-resposta.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1155
 
A relação entre r  2 e a concentração deve ser expressa através de um 
modelo apropriado, cuja escolha deve ser bem fundamentada.  
Se os números de peixes sobreviventes em cada tanque forem dife ­
rentes, o procedimento de ajuste do modelo (seja este simples ou não linear) deverá ser ponderado por forma a permitir grupos de diferen ­
tes dimensões.
 
O método de ajuste do modelo deve permitir estimar, por exemplo, o 
valor de CE  20 e da respectiva dispersão (erro-padrão ou intervalo de 
confiança). O gráfico do modelo ajustado deve ser apresentado em conjunto com os dados, de modo a permitir observar a adequação do 
ajuste realizado (9) (19) (20) (21).
 
2.1.2.  Análise de resultados para a determinação da MCCEO  
Caso o ensaio tenha incluído repetições dos tanques para todas as 
concentrações, a estimativa da MCCEO pode basear-se numa análise de variância (ANOVA) da taxa específica de crescimento média dos 
tanques (ver ponto 2.1), seguida da aplicação de um método apro ­
priado de comparação entre o r médio para cada concentração e o r médio dos controlos [por exemplo, o teste de Dunnett ou o teste de Williams (13) (14) (15) (22)], a fim de identificar a menor concen ­
tração para a qual a diferença entre os dois valores é significativa a 
uma probabilidade de 0,05. Se não se verificarem os requisitos exi ­
gidos pelos métodos paramétricos — distribuição não normal (teste de Shapiro-Wilk, por exemplo) ou variância heterogénea (teste de 
Bartlett) –, poderá ser equacionada a transformação dos dados de 
forma a homogeneizar as variâncias antes de efectuar a ANOVA. Em alternativa, poderá realizar-se uma ANOVA ponderada.
 
Na ausência de repetições dos tanques para cada concentração, uma 
ANOVA com base em dados de tanques será insensível ou impos ­
sível. Nestes casos, um compromisso aceitável será a realização da ANOVA com base nos valores individuais da taxa pseudo-específica de crescimento r
 3 . 
O valor médio de r  3 para cada concentração de ensaio poderá depois 
ser comparado com o valor médio de r  3 para os controlos, podendo a 
MCCEO ser determinada de acordo com o procedimento acima des ­
crito. Importa salientar que este método não tem em conta a varia ­
bilidade entre tanques, para além da que é devida à variabilidade 
entre indivíduos. No entanto, os resultados de um estudo publicado (9) demonstraram que a variabilidade entre tanques era muito pe ­
quena quando comparada com a variabilidade em cada tanque (ou 
seja, entre os peixes de um tanque). Se a análise não considerar os 
peixes de forma individual, deverá ser indicado o método de iden ­
tificação de aberrações, bem como uma justificação para a sua uti ­
lização.
 
2.2. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS  
Os resultados devem ser interpretados com precaução quando as 
concentrações tóxicas medidas nas soluções de ensaio ocorrem em 
níveis perto do limite de detecção do método analítico. A interpre ­
tação dos resultados de ensaios semiestáticos, em que a concentração da substância de ensaio diminui entre o momento em que a solução é 
preparada e a renovação, deve igualmente ser efectuada com precau ­
ção.
 
2.3. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deverá incluir as seguintes informações:  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1156
 
2.3.1.  Substância de ensaio:  
— natureza física e propriedades físico-químicas relevantes,  
— dados de identificação química, incluindo o grau de pureza e o 
método analítico de quantificação da substância de ensaio, 
quando apropriado.  
2.3.2.  Espécie de ensaio:  
— nome científico, se possível,  
— estirpe, dimensões, fornecedor, tratamentos prévios, etc.  
2.3.3.  Condições de ensaio:  
— procedimento de ensaio utilizado (por exemplo, semiestático/re ­
novação, por escoamento, carga, densidade de ocupação, etc.),  
— planeamento do ensaio (por exemplo, o número de recipientes de 
ensaio, concentrações de ensaio e repetições, número de peixes por recipiente),
 
— método de preparação das soluções de reserva e frequência de 
renovação (quando utilizados, o agente solubilizante e a sua 
concentração devem ser indicados),  
— valores nominais das concentrações de ensaio, médias dos valo ­
res medidos nos recipientes de ensaio e respectivos desvios-pa ­
drão, bem como o método através do qual estes foram obtidos; 
devem ainda ser fornecidas provas de que as medições se referem às concentrações da substância de ensaio em verdadeira solução,
 
— características da água de diluição: pH, dureza, alcalinidade, tem ­
peratura, concentração do oxigénio dissolvido, níveis de cloro residual (caso tenham sido medidos), carbono orgânico total, sólidos em suspensão, salinidade do meio de ensaio (caso tenha 
sido medida) e quaisquer outras medições efectuadas,
 
— qualidade da água dentro dos recipientes de ensaio: pH. dureza, 
temperatura e concentração do oxigénio dissolvido,  
— informações pormenorizadas sobre a alimentação [por exemplo, 
tipo de alimento(s), proveniência, quantidade fornecida e fre ­
quência de administração].  
2.3.4.  Resultados:  
— prova de que os controlos satisfazem os critérios de validade 
relativos à sobrevivência, bem como dados sobre a mortalidade observada em qualquer uma das concentrações ensaiadas,
 
— métodos de análise estatística utilizados, dados usados na análise 
estatística (repetições ou peixes), tratamento dos dados e justifi ­
cação das técnicas usadas,  
— tabelas contendo os dados relativos aos pesos individuais e mé ­
dios dos peixes nos dias 0, 14 (caso tenham sido medidos) e 28, 
bem como os valores das taxas de crescimento médias por tanque ou pseudo-específicas (conforme seja apropriado) referentes aos períodos «dia 0-dia 28», ou, se possível, «dia 0-dia 14» e «dia 
14-dia 28»,
 
— resultados da análise estatística (isto é, análise de regressão ou 
ANOVA), apresentados, de preferência, em tabelas de forma gráfica, bem como a MCCEO (p = 0,05) e a CSEO ou a CE
 X ; 
sempre que possível e apropriado, deverão indicar-se os erros- 
-padrão,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1157
 
— incidência de quaisquer reacções invulgares manifestadas pelos 
peixes e de quaisquer efeitos visíveis produzidos pela substância 
de ensaio.  
3. REFERÊNCIAS  
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 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1160
 ▼B 
Apêndice I  
ESPÉCIES DE PEIXES RECOMENDADAS PARA ENSAIO E CONDIÇÕES DE ENSAIO APROPRIADAS  
Espécie Gama de 
temperaturas 
recomendada 
( o C) Fotoperíodo 
(horas) Gama de pesos 
iniciais dos peixes 
recomendada 
(g) Precisão de medição 
exigida Taxa de carga 
(g/l) Densidade de 
ocupação 
(por litro) Alimentação Duração do ensaio 
(dias)  
Espécie recomendada:  
Oncorhynchus mykiss  
Truta arco-íris 12,5-16,0 12-16 1-5 100 mg 1,2-2,0 4 Alimento seco (comercial), 
preparado a partir de salmoní ­
deos jovens ≥ 28 
Outras espécies sobre as quais 
existe documentação:  
Danio rerio  
Peixe-zebra 21-25 12-16 0,050-0,100 1 mg 0,2-1,0 5-10 Alimento vivo ( Brachionus, 
Artemia ) ≥ 28 
Oryzias latipes  
Peixinho dos arrozais 21-25 12-16 0,050-0,100 1 mg 0,2-1,0 5-20 Alimento vivo ( Brachionus, 
Artemia ) ≥ 28
Apêndice 2  
ALGUMAS CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS DE UMA ÁGUA DE 
DILUIÇÃO ACEITÁVEL  
Substância Concentrações  
Partículas < 20 mg/l 
Carbono orgânico total < 2 mg/l 
Amónia não ionizada < 1 μg/l 
Cloro residual < 10 μg/l 
Total de pesticidas organofosforados < 50 ng/1 Total de pesticidas organoclorados + bifenilos policlora ­
dos < 50 ng/1 
Cloro orgânico total < 25 ng/1
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Apêndice 3  
Séries logarítmicas de concentrações apropriadas para ensaio de toxicidade (9)  
Coluna (número de concentrações entre 100 e 10 ou entre 10 e 1) (*) 
1 2 3 4 5 6 7  
100 100 100 100 100 100 100 
32 46 56 63 68 72 75 10 22 32 40 46 52 56 
3,2 10 18 25 32 37 42 1,0 4,6 10 16 22 27 32 
2,2 5,6 10 15 19 24 
1,0 3,2 6,3 10 14 18 
1,8 4,0 6,8 10 13 1,0 2,5 4,6 7,2 10 
1,6 3,2 5,2 7,5 1,0 2,2 3,7 5,6 
1,5 2,7 4,2 
1,0 1,9 3,2 
1,4 2,4 1,0 1,8 
1,3 1,0
 
(*) Pode escolher-se uma série de cinco (ou mais) concentrações sucessivas de uma coluna. Os pontos intermédios entre as concen ­
trações de uma coluna (x) encontram-se na coluna (2x + 1). Os valores listados podem representar concentrações expressas em 
percentagem por volume ou peso (mg/l ou μg/l). Os valores podem ser multiplicados ou divididos por qualquer potência de 10, 
conforme seja apropriado. Caso exista uma incerteza considerável relativamente ao nível de toxicidade, pode usar-se a coluna 1.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1162
 
C.15.  ENSAIO DE TOXICIDADE DE CURTO PRAZO NOS PEIXES 
EM ESTÁDIO EMBRIONÁRIO E RECÉM-NASCIDOS  
1. MÉTODO  
O presente método de ensaio de toxicidade de curto prazo baseia-se 
na publicação OECD TG 212 (1998) (normas de ensaio da OCDE).  
1.1. INTRODUÇÃO  
O presente ensaio de toxicidade a curto prazo nos peixes em estádio 
embrionário e recém-nascidos é um ensaio de curto prazo, em que se testa a exposição em todas as fases do ciclo de vida desde o ovo recém-fertilizado até ao fim da fase de recém-nascido. Uma vez que, 
neste ensaio, não é fornecido qualquer alimento aos embriões e 
peixes recém-nascidos, o ensaio deve ser finalizado enquanto os peixes recém-nascidos ainda se alimentam a partir do saco vitelino.
 
Este ensaio destina-se a definir os efeitos letais e, até certo ponto, 
subletais de determinados produtos químicos nos estádios e espécies 
ensaiados. A informação obtida será útil na medida em que permite a) estabelecer uma ligação entre os ensaios letais e subletais; b) ser utilizado como um ensaio de despiste tanto para um ensaio relativo 
às primeiras fases de vida como para ensaios de toxicidade crónica; e 
c) ser utilizado para ensaios em espécies para as quais as técnicas de criação não estejam suficientemente avançadas de modo a abrange ­
rem o período de mudança da alimentação endógena para a exógena.
 
Importa ter presente que, de um modo geral, só os ensaios que 
abrangem todos os estádios do ciclo de vida dos peixes são suscep ­
tíveis de proporcionar uma estimativa exacta da toxicidade crónica dos produtos químicos para estes animais e que a redução da expo ­
sição em qualquer estádio pode reduzir a sensibilidade e, por con ­
seguinte, subestimar a toxicidade crónica. É então de esperar que os 
ensaios em embriões e peixes recém-nascidos sejam menos sensíveis que um ensaio que englobe todas as fases iniciais de vida, particu ­
larmente no respeitante a produtos químicos com elevada lipofilici ­
dade (log P
 ow > 4) e produtos químicos com um mecanismo espe ­
cífico de acção tóxica. No entanto, para produtos químicos com um mecanismo de acção narcótico não específico, esperam-se menores 
diferenças entre os dois ensaios em termos de sensibilidade (1).
 
Antes da publicação deste ensaio, a maior parte das experiências 
com embriões e peixes recém-nascidos foram realizadas com o peixe de água doce  Danio rerio  Hamilton-Buchanan  (Teleostei, Cyprini ­
dae; nome comum peixe-zebra). Por esta razão, é fornecida no apên ­
dice 1 uma orientação mais pormenorizada sobre o ensaio com esta 
espécie, o que não exclui a utilização de outras espécies ensaiadas e relativamente às quais existem obras de referência (quadros 1A e 1B).
 
1.2. DEFINIÇÕES  
Menor concentração com efeito observável (LOEC):  é a menor 
concentração de ensaio da substância a ensaiar para a qual se ob ­
serva um efeito significativo (a p < 0,05) quando comparado com o controlo. No entanto, todas as concentrações de ensaio superiores à LOEC devem ter um efeito prejudicial igual ou superior ao verifi ­
cado com a NOEC.
 
Concentração sem efeito observável (NOEC):  é a concentração de 
ensaio cujo valor se situa imediatamente abaixo do valor da LOEC.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1163
 
1.3. PRINCÍPIO DO ENSAIO  
Os peixes em estádio embrionário e recém-nascidos são expostos a 
uma gama de concentrações da substância de ensaio dissolvida em água. No âmbito do protocolo, é possível escolher entre um método 
semi-estático e um método por escoamento. A escolha depende da 
natureza da substância de ensaio. O ensaio inicia-se colocando ovos fertilizados nas câmaras de ensaio e termina imediatamente antes de o saco vitelino de qualquer larva em qualquer das câmaras de ensaio 
ter sido completamente absorvido ou antes de ocorrer mortalidade 
nos controlos por falta de alimento. Os efeitos letais e subletais são avaliados e comparados com os valores de controlo de modo a 
determinar a menor concentração com efeito observável e, a partir 
daí, a concentração sem efeito observável. Em alternativa, podem ser analisados utilizando um modelo de regressão para estimar a concen ­
tração que provocaria uma dada percentagem de efeito (isto é a 
CL/CE
 X , em que x é uma % de efeito definido).  
1.4. INFORMAÇÃO SOBRE A SUBSTÂNCIA DE ENSAIO  
Deverão estar disponíveis resultados de um ensaio de toxicidade 
aguda (ver método C.1) realizado de preferência com a espécie escolhida para este ensaio. Os resultados podem ser úteis para a selecção de uma gama apropriada das concentrações a testar no 
ensaio sobre as fases iniciais de vida. A solubilidade em água (in ­
cluindo a solubilidade na água do ensaio) e a pressão de vapor da substância de ensaio devem ser conhecidas. Deve ser possível utilizar um método analítico fiável para a quantificação da substância nas 
soluções a ensaiar, relativamente ao qual a exactidão e o limite de 
detecção sejam conhecidos e se encontrem descritos.
 
A fórmula estrutural da substância de ensaio, o seu grau de pureza, 
estabilidade à luz, estabilidade nas condições do ensaio, pKa, P  ow e 
os resultados de um ensaio para a biodegradabilidade «fácil» são 
informações úteis para o planeamento do ensaio (ver método C.4).  
1.5. VALIDADE DO ENSAIO  
Um ensaio é considerado válido quando são cumpridas as seguintes 
condições:  
— o número total de ovos fertilizados vivos no grupo de controlo e, 
quando aplicável, nos recipientes-controlo para o solvente, deve 
ser igual ou superior aos limites definidos nos apêndices 2 e 3,  
— a concentração do oxigénio dissolvido deve situar-se entre 60 e 
100 % do valor da saturação com o ar (VSA) ao longo de todo o 
ensaio,  
— a temperatura da água não deve variar mais do que ± 1,5  o C 
entre as diferentes câmaras de ensaio ou entre dias sucessivos, em qualquer momento do ensaio, devendo ainda situar-se na 
gama de temperaturas especificada para as espécies a ensaiar 
(apêndices 2 e 3).
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1164
 
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.6.1.  Câmaras de ensaio  
Podem ser utilizados quaisquer recipientes de vidro ou outros reci ­
pientes em material quimicamente inerte. A dimensão dos recipientes 
deve ser suficiente para permitir cumprir os requisitos relativos à 
carga (ver ponto 1.7.1.2). Recomenda-se que as câmaras de ensaio sejam posicionadas de forma aleatória na área de ensaio. Quando em presença de efeitos sistemáticos no laboratório que possam ser con ­
trolados mediante a disposição por agrupamento, é preferível aplicar 
um esquema aleatório de disposição por agrupamento, com cada tratamento está presente em cada grupo, do que um esquema total ­
mente aleatório. A disposição das câmaras de ensaio por agrupamen ­
to, se utilizada, deve ser tomada em consideração na posterior análise de dados. As câmaras de ensaio devem estar protegidas contra per ­
turbações indesejáveis.
 
1.6.2.  Selecção das espécies de peixes  
As espécies de peixes recomendadas encontram-se indicadas no qua ­
dro 1A. Poderão ser utilizadas outras espécies (exemplos no quadro 1B), mas o método de ensaio poderá ter de ser adaptado de modo a 
proporcionar condições de ensaio adequadas. Neste caso, o critério 
para a selecção das espécies e o método experimental deverão ser indicados no relatório.
 
1.6.3.  Confinação da descendência dos peixes  
Poderão ser encontradas indicações úteis sobre a confinação dos 
alevins em condições adequadas no OECD TG 210 (  1 ) e nas refe ­
rências bibliográficas (2), (3), (4), (5) e (6).  
1.6.4.  Manuseamento de embriões e larvas  
Dentro do recipiente principal, os embriões e as larvas podem ser 
colocados em recipientes menores com as partes laterais ou extremi ­
dades em rede, de modo a permitir um fluxo da solução de ensaio 
através do recipiente. Uma forma de provocar o fluxo, sem turbu ­
lência, consiste em pendurar estes pequenos recipientes num «braço» que se movimente para cima e para baixo, desde que os organismos sejam mantidos sempre submersos. Poderá também utilizar-se um 
sistema de fluxo por efeito de sifão. Os ovos fertilizados de peixes 
salmonídeos podem ser colocados em suportes ou redes com orifí ­
cios suficientemente largos para permitir que as larvas saiam após a eclosão. Nos ensaios semi-estáticos com renovação diária total, a 
remoção dos embriões e das larvas poderá ser feita de forma apro ­
priada utilizando pipetas Pasteur (ver ponto 1.6.6).
 
Quando se utilizam recipientes de ovos, grades ou redes para confi ­
nar os ovos no recipiente principal de ensaio, estas vedações devem ser removidas após a eclosão (
 1 ) das larvas, com excepção das redes, 
que devem ser mantidas para evitar que os peixes escapem. Se 
houver necessidade de transferir as larvas, estas não devem ser ex ­
postas ao ar e não se devem utilizar redes para soltar os peixes dos recipientes de ovos (tal precaução pode não ser necessária para al ­
gumas espécies menos frágeis, como a carpa, por exemplo). O mo ­
mento adequado para efectuar esta transferência varia em função das 
espécies utilizadas, havendo casos em que a transferência poderá não ser necessária. Para o método semi-estático, podem ser utilizados 
copos ou recipientes pouco fundos e, se necessário, equipados com 
uma peneira de rede ligeiramente elevada acima do fundo do copo. Se o volume destes recipientes for suficiente para obedecer aos requisitos de carga, poderá não ser necessário efectuar a transferência 
de embriões ou larvas (ver ponto 1.7.1.2).
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1165  
( 1 ) OECD, Paris, 1992. Test Guideline 210, «Fish, Early-life Stage Toxicity Test».
 1.6.5.  Água  
Qualquer água é adequada como água de ensaio, desde que esteja em 
conformidade com as características químicas de uma água de dilui ­
ção aceitável, como indicado no apêndice 4, e desde que a taxa de 
sobrevivência das espécies a ensaiar seja, nos controlos, pelo menos 
tão satisfatória como a descrita nos apêndices 2 e 3. A qualidade de água deve ser mantida constante durante o decorrer do ensaio. A variação do valor de pH não deverá ser superior a ± 0,5 unidades. 
De modo a assegurar que a água de diluição não influencie indevi ­
damente o resultado do ensaio (por complexação da substância de ensaio, por exemplo) ou afecte de forma desfavorável o desempenho 
do lote de descendentes, deverão ser retiradas amostras regularmente 
para análise. Devem efectuar-se medições de metais pesados (por exemplo Cu, Pb, Zn, Hg, Cd e Ni), aniões e catiões principais (por exemplo Ca, Mg, Na, K, Cl e SO
 4 ), pesticidas (por exemplo 
pesticidas organofosforados totais e organoclorados totais), carbono 
orgânico total e sólidos em suspensão, por exemplo, de três em três meses nos casos em que se sabe que a água de diluição mantém uma qualidade relativamente constante. Se se demonstrar que a qualidade 
da água se mantém inalterada durante, pelo menos, um ano, as 
determinações podem ser menos frequentes (de seis em seis meses, por exemplo).
 
1.6.6.  Soluções de ensaio  
As soluções de ensaio com as concentrações escolhidas são prepa ­
radas por diluição da solução de reserva.  
A solução de reserva deve ser preparada, preferencialmente, apenas 
por mistura ou agitação da substância de ensaio na água de diluição, 
utilizando meios mecânicos (agitação e dispersão ultra-sónica, por 
exemplo). Podem ser utilizadas colunas de saturação (colunas de solubilidade) para obter uma solução de reserva concentrada adequa ­
da. Deve evitar-se, tanto quanto possível, a utilização de solventes ou 
dispersantes (agentes solubilizantes). No entanto, tais compostos po ­
dem ser necessários, em alguns casos, para produzir uma solução de reserva com a concentração adequada. A acetona, o etanol, o meta ­
nol, a dimetilformamida e o trietilenoglicol são exemplos de solven ­
tes adequados. Dispersantes adequados são, por exemplo, o Cremo ­
for RH40, o Tween 80, a metilcelulose 0,01 % e o HCO-40. Deve ter-se cuidado ao utilizar agentes facilmente biodegradáveis (como a acetona, por exemplo) e/ou altamente voláteis, uma vez que estes 
podem causar problemas com o desenvolvimento de bactérias nos 
ensaios em que for utilizado o método de escoamento. Quando se utiliza um agente solubilizante, este não deve ter um efeito signifi ­
cativo na sobrevivência, nem um efeito adverso observável nas fases 
iniciais de vida, de acordo com o controlo em presença apenas do 
solvente. No entanto, como se referiu acima, devem fazer-se todos os esforços para evitar utilizar tais produtos.
 
Para o método semi-estático, podem seguir-se dois procedimentos de 
renovação diferentes: i) podem preparar-se novas soluções de ensaio 
em recipientes limpos e transferir suavemente os ovos e larvas so ­
breviventes para estes recipientes, num pequeno volume da solução velha e evitando a exposição ao ar, ou ii) podem manter-se os organismos a ensaiar nos recipientes enquanto uma proporção da 
água de ensaio (pelo menos três quartos) é mudada. A frequência 
de renovação do meio dependerá da estabilidade da substância de ensaio, mas recomenda-se uma renovação diária da água. Se, a partir de ensaios de estabilidade preliminares (ver ponto 1.4), se demons ­
trar que a concentração da substância de ensaio não é estável (isto é, 
se estiver fora da gama de 80-120 % do valor nominal ou for inferior a 80 % da concentração medida inicialmente) durante o período de renovação, deve considerar-se a utilização de um ensaio por escoa ­
mento. Em qualquer dos casos, deve ter-se cuidado para evitar a 
perturbação das larvas durante a operação de renovação da água.
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Para os ensaios por escoamento, é necessário utilizar um sistema que 
distribua e dilua continuamente a solução de reserva da substância de 
ensaio (uma bomba de medição, um diluidor proporcional, um sis ­
tema saturador, por exemplo), por forma a fornecer uma série de concentrações às câmaras de ensaio. As taxas de fluxo das soluções 
de reserva e da água de diluição devem ser verificadas a intervalos 
regulares, de preferência diariamente, e não devem variar mais do que 10 % ao longo do ensaio. Considera-se adequada uma taxa de fluxo equivalente a, pelo menos, o volume de cinco câmaras de 
ensaio em 24 horas (2).
 
1.7. PROCEDIMENTO  
Existem trabalhos publicados que contêm informações úteis sobre a 
realização de ensaios de toxicidade em embriões de peixe e peixes 
recém-nascidos, dos quais alguns são indicados na bibliografia apre ­
sentada no final (7), (8) e (9).  
1.7.1.  Condições de exposição  
1.7.1.1.  Duração  
O ensaio deve iniciar-se de preferência 30 minutos após a fertiliza ­
ção dos ovos. Os embriões são imersos na solução de ensaio antes ou o mais cedo possível depois do início da fase de segmentação 
discoidal mas, de qualquer forma, sempre antes do início da fase de 
gástrula. Nos casos em que os ovos utilizados forem obtidos através de um fornecedor comercial, poderá não ser possível iniciar o ensaio imediatamente após a fertilização. O ensaio deve iniciar-se nas oito 
horas subsequentes à fertilização, porque qualquer atraso pode in ­
fluenciar significativamente a sensibilidade. Uma vez que as larvas não são alimentadas durante o período de exposição, o ensaio deve 
terminar imediatamente antes que o saco vitelino de qualquer larva 
em qualquer das câmaras de ensaio tenha sido completamente ab ­
sorvido ou antes que se registe mortalidade por falta de alimento. O tempo de exposição dependerá da espécie utilizada. Nos apêndices 2 
e 3, apresentam-se algumas recomendações relativas ao período de 
exposição.
 
1.7.1.2.  Carga  
O número de ovos fertilizados no início do ensaio deverá ser sufi ­
ciente para permitir o cumprimento dos requisitos estatísticos. Os 
ovos devem ser distribuídos aleatoriamente pelos grupos de trata ­
mento e, pelo menos. 30 ovos fertilizados deverão ser repartidos 
de forma equitativa (ou da forma mais equitativa possível, uma 
vez que é difícil obter lotes iguais quando se utilizam algumas espécies) pelo menos por três câmaras de ensaio (repetições) para cada concentração. A taxa de carga (biomassa por volume de solução 
de ensaio) deve ser suficientemente pequena para permitir manter 
uma concentração de oxigénio dissolvido de pelo menos 60 % VSA sem arejamento. Para os ensaios por escoamento, foi recomendada uma taxa de carga que nunca deverá exceder 0,5 g/l 
em 24 horas, nem 5 g/l de solução (2).
 
1.7.1.3.  Luz e temperatura  
O fotoperíodo e a temperatura da água do ensaio devem ser apro ­
priados para a espécie a ensaiar (apêndices 2 e 3). Poderá ser apro ­
priado utilizar um recipiente de ensaio adicional para a monitoriza ­
ção da temperatura.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1167
 
1.7.2.  Concentrações de ensaio  
Normalmente, deverão ser utilizadas cinco concentrações da subs ­
tância de ensaio espaçadas por um factor constante não superior a 3,2. Na escolha da gama de concentrações do ensaio, deve conside ­
rar-se a curva que relaciona a CL
 50 com o período de exposição no 
estudo de toxicidade aguda. Nalgumas circunstâncias, poderá ser apropriado utilizar menos de cinco concentrações (em testes-limite, por exemplo) e um intervalo de concentração mais estreito. Deve 
fornecer-se uma justificação quando se utilizam menos de cinco 
concentrações. As concentrações da substância superiores ao valor CL
 50 após 96 horas ou a 100 mg/l (a mais reduzida das duas), não 
necessitam de ser ensaiadas. As substâncias não devem ser ensaiadas 
acima do seu limite de solubilidade na água de ensaio.  
Quando se utiliza um agente solubilizante para facilitar a preparação 
de soluções de ensaio (ver ponto 1.6.6), a sua concentração final nos 
recipientes de ensaio não deve ser superior a 0,1 ml/l e deve ser a mesma em todos os recipientes de ensaio.
 
1.7.3.  Controlos  
Além dos ensaios principais, devem ser utilizados um controlo da 
água destilada (com as repetições apropriadas) e, se relevante, um controlo contendo o agente solubilizante (com as repetições apro ­
priadas).
 
1.7.4.  Frequência das determinações analíticas e medições  
Durante o ensaio, as concentrações da substância de ensaio deverão 
ser determinadas a intervalos regulares.  
No ensaio semi-estático, em que se espera que a concentração da 
substância de ensaio se mantenha dentro de um intervalo de ± 20 % 
do valor nominal (isto é, dentro da gama 80-120 %; ver ponto 1.4 e 
1.6.6), recomenda-se que, no mínimo, a maior e a menor concen ­
trações de ensaio sejam analisadas quando acabam de ser preparadas e imediatamente antes da renovação em, pelo menos, três ocasiões a 
intervalos regulares durante o ensaio (isto é as análises devem ser 
realizadas numa amostra da mesma solução — quando esta acaba de ser preparada e no momento da renovação).
 
Para os ensaios em que não se espera que a concentração da subs ­
tância de ensaio se mantenha dentro do intervalo de ± 20 % do valor nominal (com base nos dados de estabilidade da substância), é ne ­
cessário analisar todas as concentrações de ensaio, logo após a sua 
preparação e antes da renovação, mas seguindo o mesmo regime (isto é, em pelo menos três ocasiões a intervalos regulares durante o ensaio). A determinação das concentrações da substância de ensaio 
antes da renovação só necessita de ser realizada numa das repetições 
para cada concentração de ensaio. O intervalo entre as determinações não deve exceder sete dias. Recomenda-se que os resultados se baseiem em concentrações medidas. No entanto, os resultados podem 
basear-se em valores nominais ou valores iniciais medidos, se exis ­
tirem provas de que a concentração da substância a ensaiar na solu ­
ção se manteve no intervalo de ± 20 % do valor nominal ou do valor da concentração inicial medida durante o ensaio.
 
Para os ensaios por escoamento, é apropriado um regime de amos ­
tragem semelhante ao descrito para os ensaios semi-estáticos (embora 
a medição das soluções «usadas» não seja aplicável neste caso). 
No entanto, se o ensaio se prolongar por mais de sete dias, poderá ser aconselhável aumentar o número de amostras analisadas durante a primeira semana (efectuando três conjuntos de medições, por 
exemplo) de forma a assegurar que as concentrações de ensaio se 
mantêm estáveis.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1168
 
As amostras podem precisar de ser centrifugadas ou filtradas (utili ­
zando um poro com 0,45 μm de tamanho, por exemplo). No entanto, 
como nem sempre a centrifugação ou a filtração separam a fracção não biodisponível da fracção biodisponível da substância de ensaio, as amostras poderão não ser sujeitas a estes tratamentos.
 
Durante o ensaio, o oxigénio dissolvido, o pH e a temperatura de ­
vem ser medidos em todos os recipientes de ensaio. A dureza total e 
a salinidade (se relevante) devem ser medidas nos controlos e num recipiente com a concentração mais elevada. O oxigénio dissolvido e a salinidade (se relevante) devem ser medidos, no mínimo, três vezes 
(no início, a meio e no fim do ensaio). Nos ensaios semi-estáticos, 
recomenda-se que o oxigénio dissolvido seja medido com maior frequência, de preferência antes e após cada renovação da água ou, pelo menos, uma vez por semana. O pH deve ser medido no início e 
no fim de cada renovação da água nos ensaios semi-estáticos e, pelo 
menos, semanalmente nos ensaios por escoamento. A dureza deve ser medida uma vez em cada ensaio. A temperatura deve ser medida 
diariamente e, de preferência, monitorizada continuamente pelo me ­
nos num recipiente de ensaio.
 
1.7.5.  Observações  
1.7.5.1.  Estádio de desenvolvimento embrionário  
O estádio embrionário (isto é, o estádio de gástrula) no início da 
exposição à substância de ensaio deve ser verificado de forma tão 
precisa quanto possível. Poder-se-á utilizar para o efeito uma amostra 
representativa dos ovos adequadamente conservados e limpos. A bibliografia apresentada no final poderá também ser consultada para a descrição e ilustração dos estádios embrionários (2), (5), 
(10) e (11).
 
1.7.5.2.  Eclosão e sobrevivência  
A eclosão e a sobrevivência deverão ser observadas e registadas, 
pelo menos diariamente. No início do ensaio, poderá ser útil efectuar observações mais frequentes (de 30 em 30 minutos durante as pri ­
meiras três horas, por exemplo), uma vez que, em alguns casos, o 
período de sobrevivência pode ser mais relevante do que apenas o 
número de mortes (quando existem efeitos tóxicos agudos, por exemplo). Os embriões e as larvas mortos devem ser retirados logo após a sua observação, uma vez que podem decompor-se rapi ­
damente. A remoção dos indivíduos mortos deverá ser extremamente 
cuidadosa, de forma a não provocar danos físicos nos ovos/larvas vizinhos, já que estes são extremamente frágeis e sensíveis. Os cri ­
térios de morte variam de acordo com o estádio de vida:
 
— para os ovos:  particularmente nos estádios iniciais, uma acen ­
tuada perda de translucidez e alteração na coloração, causada por coagulação e/ou precipitação de proteína e conduzindo a um aspecto branco opaco,
 
— para os embriões:  ausência de movimento e/ou ausência de 
batimentos cardíacos e/ou descoloração opaca nas espécies com embriões normalmente translúcidos,
 
— para as larvas:  imobilidade e/ou ausência de movimentos res ­
piratórios e/ou ausência de batimentos cardíacos e/ou coloração 
branca opaca do sistema nervoso central e/ou falta de reacção a 
estímulos mecânicos.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1169
 
1.7.5.3.  Aspecto anómalo  
O número de larvas que apresentam uma forma corporal e/ou uma 
pigmentação anómalos, assim como o estado de absorção do saco vitelino deverão ser registados a intervalos de tempo adequados em 
função da duração do ensaio e da natureza da anomalia descrita. É 
importante notar que o aparecimento de embriões e larvas com ano ­
malias é um fenómeno que ocorre naturalmente, podendo nalgumas espécies afectar uma percentagem significativa do(s) controlo(s). Os 
animais que apresentem um aspecto anómalo só devem ser retirados 
dos recipientes de ensaio quando estiverem mortos.
 
1.7.5.4.  Comportamento anómalo  
Anomalias tais como a hiperventilação, as alterações no comporta ­
mento natatório e o estado de passividade anormal, deverão ser registadas a intervalos de tempo adequados, em função da duração 
do ensaio. Embora estes efeitos sejam difíceis de quantificar, a sua 
observação pode ajudar na interpretação dos dados relativos à mor ­
talidade, isto é, podem fornecer informação sobre o mecanismo de acção tóxica da substância.
 
1.7.5.5.  Comprimento  
Recomenda-se que, no fim do ensaio, se proceda à medição do 
comprimento de cada indivíduo. Os comprimentos a medir poderão 
ser o normalizado, o comprimento até à extremidade da barbatana caudal ou o comprimento total. Se, no entanto, as barbatanas caudais dos peixes apresentarem sinais de apodrecimento ou erosão, o com ­
primento a medir será o normalizado. Normalmente, num ensaio bem 
realizado o coeficiente da variação de comprimento entre as repeti ­
ções dos controlos deve ser ≤ 20 %.
 
1.7.5.6.  Peso  
No fim do ensaio, os indivíduos poderão ser pesados separadamente, 
sendo preferível o peso seco (24 horas a 60  o C) ao peso fresco (seco 
com papel absorvente). Normalmente, num ensaio bem realizado, o 
coeficiente de variação de peso entre as repetições dos controlos deve ser ≤ 20 %.
 
A partir destas observações, deverão ser elaborados todos ou parte 
dos seguintes dados, que serão objecto de análise estatística:  
— mortalidade acumulada,  
— números de larvas saudáveis no fim do ensaio,  
— início e fim do período de eclosão (isto é 90 % de eclosão em 
cada repetição),  
— números de larvas eclodidas por dia,  
— comprimento (e peso) dos animais sobreviventes no fim do en ­
saio, 
— números de larvas que apresentam deformações ou um aspecto 
anómalo,  
— números de larvas que apresentam um comportamento anómalo.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1170
 
2. DADOS E RELATÓRIO  
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS  
Recomenda-se que um técnico estatístico participe tanto no planea ­
mento como na análise do ensaio, uma vez que o método permite 
variações consideráveis no planeamento experimental no que se re ­
fere, por exemplo, ao número de câmaras de ensaio, ao número de concentrações de ensaio, ao número inicial de ovos fertilizados e aos parâmetros medidos. Devido às inúmeras opções disponíveis quanto 
ao planeamento do ensaio, não se fornece qualquer orientação espe ­
cífica relativamente aos procedimentos estatísticos.
 
Se se pretender determinar a LOEC/NOEC, será necessário analisar 
as variações dentro de cada conjunto de repetições, utilizando uma 
análise de variância (ANOVA) ou procedimentos de tabelas de con ­
tingência. O método de Dunnett (12) (13) pode ser útil para efectuar uma comparação múltipla entre os resultados das concentrações in ­
dividuais e os dos controlos. Existem igualmente outros exemplos 
úteis (14) (15). A dimensão do efeito detectável utilizando o método ANOVA ou outros procedimentos (isto é a capacidade do ensaio) deverá ser calculada e descrita. Importa salientar que nem todas as 
observações descritas no ponto 1.7.5.6 são adequadas para a análise 
estatística utilizando a ANOVA. A mortalidade acumulada e os nú ­
meros de larvas saudáveis no fim do ensaio podem ser analisados utilizando métodos probit, por exemplo.
 
Se se pretender determinar os valores CL/CE  X , a(s) curva(s) 
adequada(s), como a curva logística, deve(m) ser ajustada(s) aos dados relevantes utilizando um método estatístico (como o método 
dos mínimos quadrados ou dos mínimos quadrados não linear). A(s) 
curva(s) deve(m) ser parametrizada(s) de modo a que os valores CL/CE
 X de interesse e o seu desvio-padrão possam ser estimados 
directamente. Isto facilitará enormemente o cálculo dos limites de 
confiança em volta dos valores CL/CE  X . A não ser que haja boas 
razões para preferir limites de confiança diferentes, devem ser utili ­
zados limites de confiança de mais ou menos 95 %. O procedimento de ajuste deve, preferencialmente, permitir avaliar a significância da 
falta de ajuste. Podem utilizar-se métodos gráficos de ajuste de cur ­
vas. A análise de regressão é adequada para todas as observações descritas no ponto 1.7.5.6.
 
2.2. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS  
Os resultados devem ser interpretados com precaução quando as 
concentrações tóxicas medidas nas soluções de ensaio ocorrem em 
níveis situados perto do limite de detecção do método analítico. A interpretação dos resultados para concentrações superiores ao limite de solubilidade da substância na água deve igualmente ser efectuada 
com precaução.
 
2.3. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deverá incluir as seguintes informações:  
2.3.1.  Substância de ensaio:  
— natureza física e propriedades físico-químicas relevantes,  
— dados de identificação química, incluindo o grau de pureza e o 
método analítico para a quantificação das substâncias de ensaio, 
quando apropriado.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1171
 
2.3.2.  Espécie de ensaio:  
— nome científico, estirpe, número de peixes progenitores (isto é 
número de fêmeas utilizadas para fornecer o número de ovos necessários ao ensaio), fonte e método de recolha dos ovos fer ­
tilizados e posterior manuseamento.
 
2.3.3.  Condições de ensaio:  
— o procedimento de ensaio utilizado (semi-estático ou por escoa ­
mento, período de tempo desde a fertilização até ao início do ensaio, carga, etc.),
 
— o(s) fotoperíodo(s),  
— o planeamento do ensaio (por exemplo, o número de câmaras de 
ensaio e repetições, o número de embriões por repetição),  
— o método de preparação das soluções de reserva e a frequência 
de renovação (quando utilizados, o agente solubilizante e a sua 
concentração devem ser indicados),  
— os valores nominais das concentrações de ensaio, os valores 
medidos, as suas médias e os respectivos desvios-padrão nos 
recipientes de ensaio, o método através do qual estes foram 
obtidos e, se a substância de ensaio for solúvel na água em concentrações inferiores às ensaiadas, as provas de que as medi ­
ções se referem às concentrações da substância de ensaio na 
solução,
 
— características da água de diluição: o pH, a dureza, a temperatura, 
a concentração do oxigénio dissolvido, os níveis de cloro residual (caso tenham sido medidos), o carbono orgânico total, os sólidos 
em suspensão, a salinidade do meio de ensaio (caso tenha sido 
medida) e quaisquer outras medições efectuadas,
 
— a qualidade da água dentro dos recipientes de ensaio: o pH, a 
dureza, a temperatura e a concentração do oxigénio dissolvido.  
2.3.4.  Resultados:  
— resultados de qualquer estudo preliminar sobre a estabilidade da 
substância de ensaio,  
— prova de que os controlos estão de acordo com o padrão de 
aceitação de sobrevivência total da espécie de ensaio (apêndices 2 e 3),
 
— dados sobre a mortalidade/sobrevivência nos estádios embrioná ­
rio e larvar e sobre a mortalidade/sobrevivência total,  
— dias até à eclosão e número de eclosões,  
— dados sobre o comprimento (e peso),  
— incidência e descrição de anomalias morfológicas, caso tenham 
sido observadas,  
— incidência e descrição de efeitos comportamentais, caso tenham 
sido observados,  
— análise estatística e tratamento de dados,  
— para ensaios analisados utilizando o método ANOVA, a menor 
concentração com efeito observável (LOEC) a p = 0,05 e a concentração sem efeito observável (NOEC) para cada resposta avaliada, incluindo uma descrição dos procedimentos estatísticos 
utilizados e uma indicação da dimensão do efeito que pode ser 
detectado,
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1172
 
— para os ensaios analisados utilizando técnicas de regressão, a 
CL/CE  X e os intervalos de confiança, bem como o gráfico do 
modelo ajustado utilizado para o seu cálculo,  
— explicação dos motivos para qualquer desvio a este método de 
ensaio.  
3. REFERÊNCIAS  
(1) Kristensen P. (1990). Evaluation of the Sensitivity of Short 
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B. and Viktor T. (1987). Ring Test of an Embryo-larval To ­
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(10) Kirchen R. V. and W. R. West (1969). Teleostean Develop ­
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(11) Kirchen R. V. and W. R. West (1976). The Japanese Medaka. 
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(13) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons 
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delphia.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1173
 
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(16) Environment Canada. (1992). Toxicity Tests Using Early Life 
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(19) Ghillebaert F., Chaillou C., Deschamps F. and Roubaud P. 
(1995). Toxic Effects, at Three pH Levels, of Two Reference Molecules on Common Carp Embryo. Ecotoxicology and En ­
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(21) US EPA, (1991). Guidelines for Conducting Early Life Stage 
Toxicity Tests with Japanese Medaka,  (Oryzias latipes).  EPA 
report EPA/600/3-91/063, Dec. 1991, EPA, Duluth.  
(22) De Graeve G. M., Cooney J. D., McIntyre D. O., Poccocic T. L., 
Reichenbach N. G., Dean J. H. and Marcus M. D. (1991). Validity in the performance of the seven-day Fathead minnow  (Pimepha ­
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laboratory study. Environ. Tox. Chem. 10, p. 1189-1203.
 
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Oxford. Vol. 1, Chapter 10: Methods for spawning, culturing and conducting toxicity tests with Early Life stages of Estua ­
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(24) Balon E. K. (1985). Early life history of fishes: New develop ­
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(25) Blaxter J. H. S. (1988). Pattern and variety in development, in: 
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Academic press, p. 1-58.  
Quadro 1A  
Espécies de peixes recomendadas para os ensaios  
Água doce  
Oncorhynchus mykiss  
Truta arco-íris (9) (16)  
Danio rerio  
Peixe-zebra (7) (17) (18)  
Cyprinus caprio  
Carpa (8) (19)  
Oryzias latipes  
Peixinho dos arrozais (20) (21)  
Pimephales promelas  (8) (22)  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1174
 
Quadro 1B  
Exemplos de outras espécies que também já foram utilizadas e sobre as quais existe documentação  
Água doce Água salgada  
Carassius auratus  
Pimpão (8)  Menidia peninsulae  
(23) (24) (25)  
Lepomis macrochirus  
(8) Clupea harengus  
Arenque (24) (2 5)  
Gadus morhua  
Bacalhau (24) (25)  
Cyprinodon variegatus  
(23) (24) (25)  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1175
 
Apênsdice 1  
ORIENTAÇÃO SOBRE A REALIZAÇÃO DE UM ENSAIO DE 
TOXICIDADE EM EMBRIÕES E RECÉM-NASCIDOS DE PEIXE- 
-ZEBRA ( BRACHYDANIO RERIO ) 
INTRODUÇÃO  
O peixe-zebra é originário da costa Coromandel, na Índia, onde habita em 
riachos de correntes rápidas. É um peixe vulgar de aquário da família das carpas, sendo possível encontrar informação acerca dos procedimentos relativos ao seu tratamento e cultura em livros de referência sobre peixes tropicais. A sua biologia 
e utilização na investigação piscícola foram revistas por Laale (1).
 
O peixe raramente excede os 45 mm em comprimento. O corpo é cilíndrico com 
sete a nove riscas horizontais azul-escuro prateadas. Estas riscas prolongam-se 
pelas barbatanas ventrais e caudais. A região posterior é verde azeitona. Os 
machos são mais magros do que as fêmeas. As fêmeas são mais prateadas e o seu abdómen apresenta uma forma dilatada, particularmente antes da desova.
 
Os peixes adultos toleram grandes variações de temperatura, pH e dureza. 
No entanto, devem ser criadas condições óptimas para obter peixes saudáveis que produzam ovos de boa qualidade.
 
Durante a desova o macho persegue e atinge a fêmea, sendo os ovos fertilizados 
à medida que vão sendo expelidos. Os ovos, que são transparentes e não ade ­
rentes, caem para o fundo onde podem ser comidos pelos progenitores. A desova 
é influenciada pela luz. Se a luz da manhã for adequada, o peixe geralmente desova nas primeiras horas a seguir ao amanhecer.
 
Uma fêmea pode produzir semanalmente lotes de várias centenas de ovos.  
CONDIÇÕES PARA OS PEIXES PROGENITORES, A REPRODUÇÃO E AS 
FASES INICIAIS DE VIDA  
Seleccionar um número adequado de peixes saudáveis e mantê-los numa água 
adequada (nas condições descritas no apêndice 4, por exemplo) durante, pelo 
menos, duas semanas antes da desova pretendida. Deve permitir-se que o grupo 
de peixes se reproduza pelo menos uma vez antes de produzir o lote de ovos utilizados no ensaio. A densidade dos peixes durante este período não deve 
exceder 1 grama por litro. A mudança regular da água ou a utilização de sistemas 
de purificação permitirão que a densidade seja mais elevada. A temperatura nos tanques de conservação deve ser mantida a 25 ± 2
 o C. Deve fornecer-se aos 
peixes uma dieta variada, que poderá consistir, por exemplo, em alimentos co ­
merciais secos apropriados, larvas vivas recém-eclodidas,  Artemia, chironomus, 
Daphnia,  ou Enchytraeus.  
São indicados em seguida dois procedimentos que, na prática, permitiram obter 
um lote de ovos fertilizados saudáveis adequado à realização de um ensaio:  
i) Colocam-se oito fêmeas e 16 machos num tanque contendo 50 litros de água 
de diluição, protegidos da luz directa e mantidos, tanto quanto possível, sem 
perturbações durante pelo menos 48 horas. Na tarde do dia anterior ao início do ensaio, coloca-se um tabuleiro de desova no fundo do aquário. O tabuleiro de desova consiste numa moldura de  plexi-glass  ou outro material adequado 
com 5 a 7 cm de altura, com uma rede grosseira de malha de 2 a 5 mm presa 
no topo, e uma rede fina (malha de 10 a 30 μm) no fundo. Prende-se à rede 
grosseira da estrutura uma série de «árvores de desova», que consistem em pedaços de corda de  nylon  desenrolada. Após o peixe ter permanecido num 
ambiente sem luz durante 12 horas, acende-se uma luz ténue que provocará o 
início da desova. Duas a quatro horas após a desova, remove-se o tabuleiro e recolhem-se os ovos. O tabuleiro de desova evitará que o peixe coma os ovos e, ao mesmo tempo, permitirá a sua fácil recolha. O grupo de peixes deverá 
ter desovado pelo menos uma vez antes da desova que originará os ovos a 
utilizar no ensaio;
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1176
 
ii) Cinco a dez peixes machos e fêmeas são mantidos individualmente pelo 
menos duas semanas antes da desova pretendida. Após cinco a dez dias, o 
abdómen das fêmeas estará distendido e as suas papilas genitais visíveis. Os machos não têm papila. A desova é realizada em tanques de desova equipa ­
dos com um fundo falso em rede (como descrito anteriormente). Enche-se o 
tanque com água de diluição, de modo a que a altura da água acima da rede 
seja de 5 a 10 cm. Colocam-se uma fêmea e dois machos no tanque um dia antes da desova pretendida. Aumenta-se gradualmente a temperatura da água um grau acima da temperatura de aclimatização. Apaga-se a luz e o tanque é 
mantido com a mínima perturbação possível. De manhã, acende-se uma luz 
ténue que irá provocar o início da desova. Após duas a quatro horas, remo ­
vem-se os peixes e recolhem-se os ovos. Se uma só fêmea não produzir lotes com número suficiente de ovos, podem preparar-se, em paralelo, tantos tan ­
ques de desova quantos os necessários. Os registos sobre o nível de repro ­
dução individual das fêmeas antes do ensaio (tamanho do lote e qualidade) poderão servir para seleccionar as fêmeas com maior sucesso reprodutivo.
 
Os ovos devem ser transferidos para os recipientes de ensaio utilizando tubos de 
vidro (com um diâmetro interno não inferior a 4 mm) adaptados a uma ampola 
de sucção flexível. A quantidade de água que acompanha os ovos aquando da sua transferência deverá ser reduzida ao mínimo possível. Os ovos são mais pesados do que a água e afundam-se caindo do tubo. Deve ter-se cuidado para 
evitar que os ovos (e as larvas) entrem em contacto com o ar. O exame micros ­
cópico de amostra(s) do(s) lote(s) deve ser realizado para assegurar que não há irregularidades nos primeiros estádios de desenvolvimento. Não é permitida a desinfecção dos ovos.
 
A taxa de mortalidade dos ovos é mais elevada durante as primeiras 24 horas 
após a fertilização, período durante o qual se observa, geralmente, uma taxa de 
mortalidade de 5 a 40 %. por cento. Os ovos degeneram em consequência do insucesso da fertilização ou de alteração no desenvolvimento. A qualidade do lote de ovos parece depender do peixe fêmea, uma vez que algumas fêmeas 
produzem consistentemente ovos de boa qualidade, enquanto que outras nunca 
o fazem. As taxas de desenvolvimento e de eclosão variam igualmente de lote para lote. Os ovos fertilizados com sucesso e as larvas com saco vitelino sobre ­
vivem bem, normalmente com taxas acima dos 90 %. A 25
 o C, os ovos eclodirão 
três a cinco dias após a fertilização e o saco vitelino será absorvido cerca de 13 
dias após a fertilização.  
O desenvolvimento embrionário foi descrito de forma muito completa por Hi ­
saoka e Battle (2). Devido à transparência dos ovos e das larvas pós-eclosão, o 
desenvolvimento dos peixes pode ser seguido e a presença de malformações 
observada. Aproximadamente quatro horas após a desova, é possível distinguir os ovos fertilizados dos não fertilizados (3). Para efectuar este exame, os ovos e as larvas são colocados em recipientes de ensaio de pequeno volume e estudados 
ao microscópio.
 
As condições de ensaio aplicáveis às fases iniciais de vida encontram-se descritas 
no apêndice 2. Os valores óptimos para o pH e a dureza da água de diluição são, respectivamente, 7,8 e 250 mg CaCO
 3 /l. 
CÁLCULOS E ESTATÍSTICA  
Propõe-se uma abordagem em duas fases. Primeiro, são analisados estatistica ­
mente os dados sobre a mortalidade, o desenvolvimento anómalo e o tempo de eclosão. Depois, para as concentrações em que não se detectaram efeitos adver ­
sos em quaisquer destes parâmetros, avalia-se estatisticamente o comprimento do 
corpo. Aconselha-se esta abordagem, uma vez que o produto tóxico pode matar selectivamente peixes menores, atrasar o tempo de eclosão e induzir malforma ­
ções graves, conduzindo assim a desvios às medições de comprimento. Além 
disso, existirão aproximadamente o mesmo número de peixes a medir por trata ­
mento, o que garante a validade da estatística do ensaio.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1177
 
DETERMINAÇÃO DA CL  50 E DA CE  50 
A percentagem de ovos e de larvas sobreviventes é calculada e corrigida para a 
mortalidade nos controlos, de acordo com a fórmula de Abbott (4):  
P ¼ 100 Ä C Ä P 0 
C Ü 100 Í Î  
em que  
P = % sobrevivência corrigida  
P' = % sobrevivência observada com a concentração de ensaio  
C = % sobrevivência no controlo  
Se possível, a CL  50 deve ser determinada através de um método adequado no fim 
do ensaio.  
Se for desejável incluir as anomalias morfológicas na estatística de CE  50 , o 
trabalho de Stephan (5) poderá fornecer orientações úteis.  
ESTIMATIVAS DA LOEC E NOEC  
Um dos objectivos do ensaio em ovos e peixes recém-nascidos é comparar as 
concentrações diferentes de zero com o controlo, isto é, determinar a LOEC, pelo que deverão ser utilizados os métodos de comparação múltipla indicados nas obras de referência (6) (7) (8) (9) (10).
 
REFERÊNCIAS  
(1) Laale H. W. (1977). The Biology and Use of the Zebrafish  (Brachydanio 
rerio)  in Fisheries Research. A Literature Review. J. Fish Biol. 10, p. 121- 
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(2) Hisaoka K. K. and Battle H. I. (1958). The Normal Development Stages of 
the Zebrafish  Brachydanio rerio  (Hamilton-Buchanan) J. Morph., 102, 311 
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(3) Nagel R. (1986). Untersuchungen zur Eiproduktion beim Zebrabärbling  
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(4) Finney D. J. (1971). Probit Analysis, 3rd ed., Cambridge University Press, 
Great Britain, p. 1-333.  
(5) Stephan C. E. (1982). Increasing the Usefulness of Acute Toxicity Tests. 
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766, J. G. Pearson, R. B. Foster and W. E. Bishop, Eds., American Society 
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(6) Dunnett C. W. (1955). A Multiple Comparisons Procedure for Comparing 
Several Treatments with a Control. J. Amer. Statist. Assoc., 50, p. 1096- -1121.
 
(7) Dunnett C. W. (1964). New Tables for Multiple Comparisons with a Con ­
trol. Biometrics, 20, p. 482-491.  
(8) Williams D. A. (1971). A Test for Differences Between Treatment Means 
when Several Dose Levels are Compared with a Zero Dose Control. Bio ­
metrics, 27, p. 103-117.  
(9) Williams D. A. (1972). The Comparison of Several Dose Levels with a 
Zero Dose Control. Biometrics 28, p. 519-531.  
(10) Sokal R. R. and Rohlf F. J. (1981). Biometry, the Principles and Practice of 
Statistics in Biological Research, W. H. Freeman and Co., San Francisco.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1178
 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1179
 ▼B 
Apêndice 2  
CONDIÇÕES DE ENSAIO, DURAÇÃO E CRITÉRIO DE SOBREVIVÊNCIA PARA AS ESPÉCIES RECOMENDADAS  
Espécie Temperatura 
( o C) Salinidade 
(0/00) Fotoperíodo 
(horas) Duração dos estádios 
(dias) 
Duração típica do ensaio Taxa de sobrevivência nos 
controlos 
(mínima %) 
Embriões Recém-nascidos Sucesso da 
eclosão Pós-eclosão  
ÁGUA DOCE  
Brachydanio rerio Pei  
xe-zebra 25 ± 1 — 12-16 3-5 8-10 Tão cedo quanto possível após a fertiliza ­
ção (estádio de gástrula inicial) até cinco 
dias após a eclosão (8-10 dias) 80 90  
Oncorhynchus mykiss  
Truta arco-íris 10 ± 1 (  1 ) 
12 ± 1 (  2 ) — 0 (  a ) 30-35 25-30 Tão cedo quanto possível após a fertiliza ­
ção (estádio de gástrula inicial) até 20 dias após a eclosão (50-55 dias) 66 70  
Cyprinus carpio  
Carpa 21-25 — 12-16 5 > 4 Tão cedo quanto possível após a fertiliza ­
ção (estádio de gástrula inicial) até quatro 
dias após a eclosão (8-9 dias) 80 75  
Oryzias latipes  
Peixinho dos arrozais 24 ± 1 (
 1 ) 
23 ± 1 (  2 ) — 12-16 8-11 4-8 Tão cedo quanto possível após a fertiliza ­
ção (estádio de gástrula inicial) até cinco dias após a eclosão (13-16 dias) 80 80  
Pimephales promelas  25 + 2 — 16 4-5 5 Tão cedo quanto possível após a fertiliza ­
ção (estádio de gástrula inicial) até quatro 
dias após a eclosão (8-9 dias) 60 70
 
( 1 ) Para embriões. 
( 2 ) Para larvas. 
( a ) Escuridão para o embrião e as larvas até uma semana após a eclosão, excepto quando estes estão a ser inspeccionados. A partir  daí, deve utilizar-se luz fraca ao longo do ensaio.
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 ▼B 
Apêndice 3  
Condições de ensaio, duração e critérios de sobrevivência para outras espécies relativamente às quais existem trabalhos de refe rência  
Espécie Temperatura 
(DC) Salinidade (0/00) Fotoperíodo 
(horas) Duração dos estádios (dias) 
Duração típica do ensaio de embriões e 
recém-nascidos Taxa de sobrevivência nos 
controlos ( % mínima) 
Embriões Ensaio 
recém-nascidos Sucesso da 
eclosão Pós-eclosão  
ÁGUA DOCE  
Carassius auratus  
Pimpão 24 ± 1 — — 3-4 > 4 Tão cedo quanto possível após a fertiliza ­
ção (estádio de gástrula inicial) até quatro 
dias após a eclosão (sete dias) — 80  
Leopomis macrochirus  21 ± 1 — 16 3 > 4 Tão cedo quanto possível após a fertiliza ­
ção (estádio de gástrula inicial) até quatro dias após a eclosão (sete dias) — 75 
ÁGUA SALGADA  
Menidia peninsulae  22-25 15-22 12 1,5 10 Tão cedo quanto possível após a fertiliza ­
ção (estádio de gástrula inicial) até cinco 
dias após a eclosão (6-7 dias) 80 60  
Clupea harengus  
Arenque 10 ± 1 8-15 12 20-25 3-5 Tão cedo quanto possível após a fertiliza ­
ção (estádio de gástrula inicial) até três dias 
após a eclosão (23-27 dias) 60 80  
Gadus morhua  
Bacalhau 5 ± 1 5-30 12 14-16 3-5 Tão cedo quanto possível após a fertiliza ­
ção (estádio de gástrula inicial) até três dias após a eclosão (18 dias) 60 80  
Cyprinodon variegatus  25 ± 1 15-30 12 — — Tão cedo quanto possível após a fertiliza ­
ção (estádio de gástrula inicial) até 4-7 dias 
após a eclosão (28 dias) > 75 80
Apêndisce 4  
ALGUMAS CARACTERÍSTICAS QUÍMICAS DE UMA ÁGUA DE 
DILUIÇÃO ACEITÁVEL  
Substância Concentrações  
Partículas < 20 mg/l 
Carbono orgânico total < 2 mg/l 
Amónia não ionizada < 1 μg/l 
Cloro residual < 10 μg/l 
Total de pesticidas organofosforados < 50 ng/l Total de pesticidas organoclorados + bifenis policlorados < 50 ng/l Cloro orgânico total < 25 ng/l
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1181
 
C.16.  ABELHAS DOMÉSTICAS — ENSAIO DE TOXICIDADE ORAL 
AGUDA  
1. MÉTODO  
O presente método de ensaio de toxicidade aguda baseia-se na pu ­
blicação OECD TG 213 (1998) (normas de ensaio da OCDE).  
1.1. INTRODUÇÃO  
O presente ensaio de toxicidade constitui um método laboratorial 
destinado a avaliar a toxicidade oral aguda de produtos fitofarma ­
cêuticos e outras substâncias químicas para as abelhas domésticas 
obreiras adultas.  
Os processos de avaliação e verificação das características tóxicas de 
substâncias podem exigir a determinação da toxicidade oral aguda para as abelhas domésticas. Esta situação verifica-se, por exemplo, quando há uma probabilidade de exposição de abelhas a um produto 
químico específico. O ensaio de toxicidade oral aguda permite de ­
terminar a toxicidade de pesticidas e outras substâncias químicas para as abelhas. Os seus resultados condicionarão a necessidade de efectuar ulteriores avaliações. O método é especialmente adequado 
para uso em programas passo-a-passo, destinados a avaliar os efeitos 
perigosos de pesticidas para as abelhas. Estes programas baseiam-se numa progressão sequencial de ensaios de toxicidade, que evolui de ensaios laboratoriais para experiências parcial ou totalmente realiza ­
das no campo (1). Os pesticidas podem ser submetidos a ensaio sob 
a forma de substâncias activas (s.a.) ou de produtos formulados.
 
A sensibilidade das abelhas e o rigor do procedimento experimental 
devem ser verificados pela inclusão de um padrão tóxico nos en ­
saios.  
1.2. DEFINIÇÕES  
Toxicidade oral aguda:  conjunto dos efeitos adversos que se ma ­
nifestam num período máximo de 96 horas após a administração oral 
de uma dose única da substância de ensaio.  
Dose:  quantidade consumida da substância de ensaio. A dose é 
expressa em massa ( μg) de substância de ensaio por animal ( μg/­
abelha). O facto de as abelhas serem alimentadas de forma colectiva não permite calcular a dose efectiva por cada animal. No entanto, é 
possível determinar a dose média (massa total de substância em 
ensaio consumida/número de abelhas em ensaio em cada gaiola).
 
DL 50 (dose letal média) oral:  dose única, calculada estatisticamente, 
de uma substância susceptível de causar a morte de 50 % dos ani ­
mais quando administrada por via oral. O valor da DL  50 é expresso 
em μg de substância de ensaio por abelha. Em ensaios de pesticidas, 
a substância de ensaio pode ser uma substância activa (s.a.) ou um 
produto formulado, que contém uma ou várias substâncias activas.  
Mortalidade:  um animal é considerado morto quando permanece 
completamente imóvel.  
1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
O método baseia-se na exposição de abelhas domésticas (Apis  mel­
lifera)  obreiras adultas a uma gama de doses da substância de ensaio 
dispersa numa solução de sacarose. Após a administração das doses, 
as abelhas são alimentadas com a mesma solução, sem a substância 
de ensaio. A mortalidade das abelhas é registada diariamente, num período nunca inferior a 48 horas, sendo depois comparada com valores de controlo. Caso a taxa de mortalidade aumente entre 24 
e 48 horas após a administração das doses, mantendo-se a mortali ­
dade dos controlos num nível aceitável (ou seja, ≤ 10 %), o ensaio 
deverá ser prolongado até um máximo de 96 horas. Os resultados deverão ser analisados de forma a calcular a DL
 50 às 24 horas e às 
48 horas e, em caso de prolongamento do ensaio, às 72 horas e às 96 
horas.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1182
 
1.4. VALIDADE DO ENSAIO  
O ensaio será considerado válido, desde que se verifiquem as se ­
guintes condições:  
— a mortalidade média na totalidade dos controlos no final do 
ensaio não deverá ser superior a 10 %,  
— a DL  50 do padrão tóxico deverá enquadrar-se na gama de con ­
centrações especificada.  
1.5. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.5.1.  Recolha de abelhas  
O ensaio deve ser realizado com obreiras adultas jovens da mesma 
raça, isto é, abelhas da mesma idade, em idênticas condições de alimentação, etc. As abelhas devem provir de colónias governadas 
por rainhas, bem alimentadas, saudáveis, tanto quanto possível isen ­
tas de doenças e com historial e estado fisiológico conhecidos. As abelhas podem ser recolhidas na manhã do dia do ensaio ou na noite anterior, desde que permaneçam nas condições de ensaio até à rea ­
lização deste. Consideram-se adequadas para o ensaio as abelhas 
recolhidas de favos sem postura. Devido ao facto de as abelhas sofrerem alterações fisiológicas no início da Primavera e no final 
do Outono, deverão evitar-se recolhas durante estes períodos. Caso 
seja necessário realizar ensaios nestas épocas do ano, podem usar-se abelhas eclodidas numa incubadora e alimentadas com pólen colhido da colmeia e solução de sacarose durante uma semana. As abelhas 
tratadas com substâncias químicas (tais como antibióticos, produtos 
varroacidas, etc.) não devem ser usadas em ensaios de toxicidade até quatro semanas após o final do último tratamento.
 
1.5.2.  Condições de alojamento e alimentação  
Devem usar-se gaiolas bem ventiladas e fáceis de limpar. As gaiolas 
podem ser construídas com quaisquer materiais apropriados, tais 
como aço inoxidável, tela de arame ou plástico. Podem ainda ser usadas gaiolas de madeira descartáveis. Por norma, cada gaiola de ­
verá conter, de preferência, um grupo de dez abelhas. As gaiolas 
usadas nos ensaios devem possuir dimensões adequadas ao número 
de abelhas a alojar, de modo a proporcionarem espaço suficiente.
 
As abelhas devem ser mantidas no escuro, numa sala de ensaios, à 
temperatura de 25 ± 2  o C. A humidade relativa, normalmente de 
cerca de 50-70 %, deverá ser registada ao longo do ensaio. Os 
procedimentos de manipulação, incluindo o tratamento e as observa ­
ções, poderão ser efectuados com iluminação (natural). As abelhas são alimentadas com uma solução aquosa de sacarose a uma concen ­
tração de 500 g/l (50 % p/v). Após a administração das doses de 
ensaio, as abelhas devem dispor de alimento  ad libitum.  Deve usar- 
-se um sistema de alimentação que permita registar a quantidade de alimento consumido em cada gaiola (ver ponto 1.6.3.1). Para tal, 
pode utilizar-se um tubo de vidro, com cerca de 50 mm de com ­
primento e 10 mm de largura e a extremidade aberta estreitada para cerca de 2 mm de diâmetro.
 
1.5.3.  Preparação das abelhas  
As abelhas recolhidas são distribuídas aleatoriamente por gaiolas de 
ensaio, as quais, por sua vez, são dispostas ao acaso na sala de 
ensaios.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1183
 
Antes do ensaio, as abelhas podem ser privadas de alimento por um 
período não superior a duas horas. Este tratamento é recomendável, 
uma vez que assegura que, no início do ensaio, todas as abelhas se encontram em idênticas condições no que respeita ao conteúdo in ­
testinal. Antes de dar início ao ensaio, as abelhas moribundas devem 
ser retiradas e substituídas por abelhas saudáveis.
 
1.5.4.  Preparação das doses  
Caso a substância a testar seja miscível com água, poderá ser direc ­
tamente dispersa numa solução de sacarose a 50 %. No caso de produtos industriais e substâncias de baixa solubilidade em água, 
podem usar-se outros veículos, tais como solventes orgânicos, emul ­
sionantes ou dispersantes de baixa toxicidade para as abelhas (por exemplo, acetona, dimetilformamida, dimetilsulfóxido), A concentra ­
ção do veículo depende da solubilidade da substância de ensaio, 
devendo ser idêntica para todas as concentrações testadas. Na gene ­
ralidade dos casos, é adequado utilizar (e não ultrapassar) uma con ­
centração de 1 %.
 
Devem preparar-se as soluções de controlo apropriadas, ou seja, 
utilizando um solvente ou dispersante para tornar a substância de ensaio solúvel. Assim, deverão ser administradas, a dois grupos de controlo distintos, duas soluções: uma em água e outra em água com 
sacarose, ambas contendo o solvente/veículo na mesma concentração 
que as soluções de dosagem.
 
1.6. PROCEDIMENTO  
1.6.1.  Grupos de ensaio e de controlo  
O número de doses e de repetições usado no ensaio deverá satisfazer 
os requisitos estatísticos para a determinação das DL  50 , com limites 
de confiança de 95 %. De uma forma geral, é necessário usar cinco doses em série geométrica, com um factor não superior a 2,2 e cobrindo uma gama de concentrações que abranja a DL
 50 . 
No entanto, o factor de diluição e o número de concentrações por 
dosagem deverão ser determinados em função do declive da curva de toxicidade (dose  versus  mortalidade) e tomando em consideração o 
método estatístico adoptado para a análise dos resultados. Um ensaio 
de determinação de gama de concentrações permitirá escolher as 
concentrações apropriadas para a dosagem.
 
Cada concentração a testar deve ser aplicada em, pelo menos, três 
grupos idênticos, cada um constituído por 10 abelhas. Além da série 
em ensaio, devem ser testados pelo menos três grupos de controlo, formados por 10 abelhas cada um. Devem ainda ser incluídos os grupos de controlo apropriados para os solventes/veículos usados 
(ver ponto 1.5.4).
 
1.6.2.  Padrão tóxico  
A série em ensaio deve incluir um padrão tóxico. Devem seleccio ­
nar-se pelo menos três doses deste padrão, de modo a abranger o valor previsto para a DL
 50 . Para cada dose de ensaio, devem usar-se, 
pelo menos, três gaiolas idênticas, cada uma contendo dez abelhas. O 
padrão tóxico mais vulgarmente utilizado é o dimetoato. A DL  50 oral 
às 24 horas descrita para este composto situa-se na gama de 0,10 a 0,35 μg s.a./abelha (2). No entanto, podem ser usados outros padrões 
tóxicos, desde que existam dados suficientes para verificar a resposta 
prevista à dose administrada (por exemplo, paratião).
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1184
 
1.6.3.  Exposição  
1.6.3.1.  Administração de doses  
A cada grupo de abelhas em ensaio, devem ser administrados 100- 
-200 μl de solução aquosa de sacarose a 50 %, contendo a substância 
de ensaio na concentração apropriada. No ensaio de produtos de 
baixa solubilidade, toxicidade ou concentração no preparado, será necessário aumentar a proporção dos mesmos na solução de sacarose e utilizar volumes superiores. Deverá controlar-se a quantidade de 
solução tratada, consumida por cada grupo. Uma vez consumido o 
alimento tratado (normalmente num período de três a quatro horas), o sistema de alimentação deve ser retirado da gaiola e substituído por 
outro contendo apenas solução de sacarose, a qual deverá ser forne ­
cida então  ad líbitum.  Em alguns casos, poderá ocorrer a rejeição das 
doses correspondentes às concentrações mais elevadas da de ensaio, o que terá como resultado um consumo de alimento reduzido ou 
nulo. Após um lapso máximo de seis horas, a solução tratada que 
não tenha sido consumida deverá ser substituída pela solução de sacarose sem aditivos. Deve avaliar-se a quantidade da solução tra ­
tada consumida, medindo, por exemplo, o volume ou o peso da 
solução não consumida.
 
1.6.3.2.  Duração  
O ensaio deverá prolongar-se, de preferência, até 48 horas após a 
substituição da solução em ensaio pela solução de sacarose sem aditivos. Se, após as primeiras 24 horas, a mortalidade continuar a 
aumentar em mais de 10 %, o ensaio deverá ser prolongado até um 
máximo de 96 horas, desde que a mortalidade nos controlos não exceda 10 %.
 
1.6.4.  Observações  
Devem efectuar-se registos de mortalidade decorridas quatro horas, 
24 horas e 48 horas após o início do ensaio (ou seja, após a adminis ­
tração da dose). Em caso de prolongamento do período de observa ­
ção, deverão realizar-se avaliações suplementares a intervalos de 24 horas, até um máximo de 96 horas, desde que a mortalidade dos 
grupos de controlo não exceda 10 %.
 
Deverá ser determinada a quantidade de solução consumida por cada 
grupo. A comparação entre as taxas de consumo de solução tratada e não tratada durante o período de seis horas em que esta é fornecida 
aos animais poderá dar informações sobre a palatabilidade do ali ­
mento tratado.
 
Deverão ser objecto de registo todas as eventuais anomalias de 
comportamento verificadas durante o período do ensaio.  
1.6.5.  Teste-limite  
Em determinadas circunstâncias (por exemplo, quando se prevê que 
a substância de ensaio apresente um baixo nível de toxicidade), pode efectuar-se um teste-limite, usando 100 μg s.a./abelha, de forma a 
certificar-se de que a DL
 50 é superior a este valor. Deve seguir-se um 
procedimento idêntico ao descrito acima, incluindo o uso de três 
grupos duplicados para a dose de ensaio, a realização dos controlos relevantes e a avaliação da quantidade de alimento tratado consumi ­
da, assim como o uso de um padrão tóxico. Se ocorrer mortalidade, 
deverá realizar-se um estudo completo. Todos os efeitos subletais, 
caso existam, deverão ser registados (ver ponto 1.6.4).
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1185
 
2. DADOS E RELATÓRIO  
2.1. DADOS  
Os dados devem ser resumidos num quadro, indicando, para cada 
grupo em tratamento (e para os grupos de controlo e os associados 
ao padrão tóxico), o número de abelhas usado e a mortalidade em 
cada momento de observação, bem como o número de abelhas que apresentam um comportamento anómalo. Os dados relativos à mor ­
talidade devem ser analisados mediante métodos estatísticos adequa ­
dos (por exemplo, análise probit, média móvel, teoria do binómio 
relativamente à probabilidade) (3) (4). Devem ser traçadas curvas dose-resposta para cada tempo de observação recomendado, proce ­
dendo-se depois ao cálculo dos respectivos declives e à determinação 
das doses letais médias (DL
 50 ) com limites de confiança de 95 %. 
Podem efectuar-se correcções na mortalidade dos grupos de controlo, usando os valores de correcção de Abbott (4) (5). Nos casos em que 
o alimento tratado não tenha sido totalmente consumido, deverá 
determinar-se a dose de substância de ensaio consumida por cada grupo. A DL
 50 deverá ser expressa em μg de substância de ensaio 
por abelha.  
2.2. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deverá incluir as seguintes informações:  
2.2.1.  Substância de ensaio:  
— natureza física e propriedades físico-químicas relevantes (por 
exemplo, estabilidade na água, pressão de vapor),  
— dados de identificação química, incluindo a fórmula estrutural, o 
grau de pureza [ou seja, no caso de pesticidas, a identidade e a 
concentração da(s) substância(s) activa(s)].  
2.2.2.  Espécies submetidas a ensaio:  
— nome científico, estirpe, idade aproximada (em semanas), método 
de recolha, data da recolha,  
— dados informativos sobre as colónias usadas para recolha das 
abelhas submetidas a ensaio, incluindo o estado de saúde, a 
ocorrência de doenças de adultos, eventuais tratamentos previa ­
mente aplicados, etc.  
2.2.3.  Condições do ensaio:  
— temperatura e humidade relativa da sala de ensaios,  
— condições de alojamento, incluindo o tipo, as dimensões e o 
material de construção das gaiolas,  
— métodos de preparação das soluções-mãe e soluções de ensaio 
(em caso de utilização de um solvente não aquoso, deve indicar- 
-se a sua natureza e a respectiva concentração),  
— planeamento do ensaio, ou seja, o número de concentrações de 
ensaio e os respectivos valores, bem como o número de contro ­
los; para cada concentração de ensaio e para cada controlo, de ­
verá indicar-se o número de gaiolas em duplicado e o número de abelhas em cada uma delas,
 
— data do ensaio.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1186
 
2.2.4.  Resultados:  
— em caso de realização de um estudo preliminar para determina ­
ção da gama de concentrações de ensaio, os respectivos resulta ­
dos, 
— dados não processados: mortalidade correspondente a cada dose 
de ensaio em cada momento de observação,  
— representação gráfica das curvas dose-resposta no final do ensaio,  
— valores DL  50 . com limites de confiança de 95 %, para cada 
período de observação recomendado, tanto para a substância de 
ensaio, como para o padrão tóxico,  
— tratamentos estatísticos usados para a determinação da DL  50 , 
— mortalidade nos controlos,  
— outros efeitos biológicos observados ou medidos, como, por 
exemplo, anomalias no comportamento das abelhas (incluindo rejeição da dose de ensaio), taxa de consumo de alimento em 
grupos tratados e em grupos não tratados,
 
— qualquer desvio em relação aos procedimentos aqui descritos, 
assim como quaisquer outras informações relevantes.  
3. REFERÊNCIAS  
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for 
the Environmenta! Risk Assessment of Plant Protection Pro ­
ducts — Honeybees. EPPO Bulletin, Vol. 23, N.1, p. 151- 
-165. March 1993.  
(2) Gough, H. J., McIndoe, E.C., Lewis, G.B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxi ­
city tests on honeybees  (Apis mellifera  L.) 1981-1992. Journal 
of Apicultural Research, 22, p. 119-125.  
(3) Litchfield, J.T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Exper. Ther., 96, p. 99-113.
 
(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New York.  
(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effective ­
ness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol., 18, p. 265-267.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1187
 
C.17.  ABELHAS DOMÉSTICAS — ENSAIO DE TOXICIDADE 
AGUDA POR CONTACTO  
1. MÉTODO  
O presente método de ensaio de toxicidade aguda baseia-se na pu ­
blicação OECD TG 214 (1998) (normas de ensaio da OCDE).  
1.1. INTRODUÇÃO  
O presente ensaio de toxicidade constitui um método laboratorial, 
destinado a avaliar a toxicidade aguda por contacto de produtos fitofarmacêuticos e outras substâncias químicas para as abelhas do ­
mésticas obreiras adultas.
 
Os processos de avaliação e verificação das características tóxicas de 
substâncias podem exigir a determinação da toxicidade aguda por 
contacto para as abelhas domésticas. Esta situação verifica-se, por exemplo, quando há a probabilidade de exposição de abelhas a um produto químico específico. O ensaio de toxicidade aguda por con ­
tacto permite determinar a toxicidade de pesticidas e outras subs ­
tâncias químicas para as abelhas. Os seus resultados condicionarão a necessidade de efectuar ulteriores avaliações. O método é especial ­
mente adequado para uso em programas passo-a-passo, destinados a 
avaliar os efeitos perigosos de pesticidas para as abelhas. Estes pro ­
gramas baseiam-se numa progressão sequencial de ensaios de toxi ­
cidade, que evolui de ensaios laboratoriais para experiências parcial 
ou totalmente realizadas no campo (1). Os pesticidas podem ser 
submetidos a ensaio sob a forma de substâncias activas (s.a.) ou de produtos formulados.
 
A sensibilidade das abelhas e o rigor do procedimento experimental 
devem ser verificados pela inclusão de um padrão tóxico nos en ­
saios.  
1.2. DEFINIÇÕES  
Toxicidade aguda por contacto:  conjunto dos efeitos adversos que 
se manifestam num período máximo de 96 horas após a aplicação tópica de uma dose única de uma substância.
 
Dose:  quantidade aplicada da substância de ensaio. O valor da dose 
é expresso em massa ( μg) de substância de ensaio por animal ( μg/­
abelha).  
DL 50 (dose letal média) por contacto:  dose única, calculada esta ­
tisticamente, de uma substância susceptível de causar a morte de 50 % dos animais quando administrada por contacto. O valor da DL
 50 é expresso em μg de substância de ensaio por abelha. Em 
ensaios de pesticidas, a substância de ensaio pode ser uma substância 
activa (s.a) ou um produto formulado, contendo uma ou várias subs ­
tâncias activas.  
Mortalidade:  um animal é considerado morto quando permanece 
completamente imóvel.  
1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
O método baseia-se na exposição de abelhas domésticas  (Apis mel ­
lifera)  obreiras adultas a uma gama de doses da substância de ensaio 
dissolvida num veículo adequado e aplicada directamente no tórax (em gotículas). O ensaio tem a duração de 48 horas. Caso a taxa de mortalidade aumente entre 24 e 48 horas após a aplicação das doses, 
mantendo-se a mortalidade dos controlos num nível aceitável (ou 
seja, < 10 %), o ensaio deverá ser prolongado até um máximo de 96 horas. A mortalidade das abelhas é registada diariamente e com ­
parada com valores de controlo. Os resultados deverão ser analisados 
de forma a calcular a DL
 50 às 24 horas e às 48 horas e, em caso de 
prolongamento do ensaio, às 72 horas e às 96 horas.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1188
 
1.4. VALIDADE DO ENSAIO  
O ensaio será considerado válido, desde que se verifiquem as se ­
guintes condições:  
— a mortalidade média na totalidade dos controlos no final do 
ensaio não deverá ser superior a 10 %,  
— a DL  50 do padrão tóxico deverá enquadrar-se na gama de con ­
centrações especificada.  
1.5. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.5.1.  Recolha de abelhas  
O ensaio deve ser realizado com obreiras adultas jovens, ou seja, abelhas 
da mesma idade, em idênticas condições de alimentação, raça idêntica, etc. As abelhas devem provir de colónias governadas por rainhas, bem 
alimentadas, saudáveis, tanto quanto possível isentas de doenças e com 
historial e estado fisiológico conhecidos. As abelhas podem ser recolhi ­
das na manhã do dia do ensaio ou na noite anterior, desde que se mantenham nas condições de ensaio até à sua realização. Consideram- 
-se adequadas para o ensaio as abelhas recolhidas de favos sem postura. 
Devido ao facto de as abelhas sofrerem alterações fisiológicas no início da Primavera e no final do Outono, deverão evitar-se recolhas durante estes períodos. Caso seja necessário realizar ensaios nestas épocas do 
ano, podem usar-se abelhas eclodidas numa incubadora e alimentadas 
durante uma semana com pólen colhido da colmeia e solução de saca ­
rose. As abelhas tratadas com substâncias químicas (tais como antibió ­
ticos, produtos varroacidas, etc.) não devem ser usadas para ensaios de 
toxicidade até quatro semanas após o final do último tratamento.
 
1.5.2.  Condições de alojamento e alimentação  
Devem usar-se gaiolas bem ventiladas e fáceis de limpar. As gaiolas 
podem ser construídas com quaisquer materiais apropriados, tais 
como aço inoxidável, tela de arame ou plástico. Podem ainda ser 
usadas gaiolas de madeira descartáveis. As gaiolas usadas nos en ­
saios devem possuir dimensões adequadas ao número de abelhas a alojar, de modo a proporcionarem espaço suficiente. Por norma, cada 
gaiola deverá conter um grupo de dez abelhas.
 
As abelhas devem ser mantidas no escuro, numa sala de ensaios, à 
temperatura de 25 ± 2  o C. A humidade relativa, normalmente de cerca 
de 50-70 %, deverá ser registada ao longo do ensaio. Os procedimentos de manipulação, incluindo o tratamento e as observações, poderão ser efectuados com iluminação (natural). As abelhas são alimentadas com 
uma solução aquosa de sacarose a uma concentração de 500 g/l (50 % 
p/v), que deve ser fornecida  ad libitum  durante todo o ensaio por meio 
de um sistema de alimentação de abelhas. Para tal, pode utilizar-se um tubo de vidro com cerca de 50 mm de comprimento e 10 mm de largura 
e a extremidade aberta estreitada para cerca de 2 mm de diâmetro.
 
1.5.3.  Preparação das abelhas  
Para a aplicação da substância de ensaio, as abelhas recolhidas são 
anestesiadas, podendo usar-se dióxido de carbono ou azoto para o 
efeito. Deverá minimizar-se a quantidade usada e o tempo de expo ­
sição ao anestésico. Antes de dar início ao ensaio, as abelhas mori ­
bundas devem ser retiradas e substituídas por abelhas saudáveis.  
1.5.4.  Preparação das doses  
A substância de ensaio deverá ser aplicada na forma de solução num 
veículo, ou seja, num solvente orgânico ou numa solução aquosa con ­
tendo um agente molhante. O solvente orgânico mais vulgarmente uti ­
lizado é a acetona. No entanto, podem utilizar-se outros compostos de 
baixa toxicidade para as abelhas, como, por exemplo, dimetilformamida 
ou dimetilsulfóxido. A aplicação de produtos formulados dispersos em água ou de substâncias orgânicas de elevada polaridade insolúveis em solventes orgânicos pode tornar-se mais fácil se as respectivas soluções 
forem preparadas numa solução diluída de um agente molhante comer ­
cial (por exemplo, Agrai, Cittowett, Lubrol, Triton ou Tween).
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1189
 
As soluções de controlo devem ser preparadas de forma adequada, 
isto é, utilizando um solvente ou dispersante para tornar a substância 
de ensaio solúvel. Deverão ser utilizados dois grupos de controlo distintos, um tratado com água e o outro com o solvente ou disper ­
sante.
 
1.6. PROCEDIMENTO  
1.6.1.  Grupos de ensaio e de controlo  
O número de doses e repetições usados no ensaio deverá satisfazer 
os requisitos estatísticos para a determinação da DL  50 , com limites 
de confiança de 95 %. De uma forma geral, é necessário usar cinco doses em série geométrica, com um factor não superior a 2,2 e 
cobrindo uma gama de concentrações que abranja a DL
 50 . 
No entanto, o número de doses deverá ser determinado em função do declive da curva de toxicidade (dose  versus  mortalidade) e tendo 
em consideração o método estatístico adoptado para a análise dos 
resultados. Um ensaio de determinação de gama de concentrações 
permitirá escolher as doses apropriadas.
 
Cada concentração de ensaio deve ser aplicada em, pelo menos, três 
grupos idênticos, cada um constituído por dez abelhas.  
Além da série em ensaio, devem ser testados pelo menos três grupos 
de controlo, cada um formado por dez abelhas. Sempre que se utilize um solvente orgânico ou um agente molhante, deverão ser incluídos três grupos de controlo adicionais para estas substâncias, constituídos 
por dez abelhas cada.
 
1.6.2.  Padrão tóxico  
A série em ensaio deve incluir um padrão tóxico. Devem seleccio ­
nar-se pelo menos três doses deste padrão, de modo a abranger o valor previsto para a DL
 50 . Para cada dose de ensaio, devem usar-se 
pelo menos três gaiolas, cada uma contendo dez abelhas. O padrão 
tóxico mais vulgarmente utilizado é o dimetoato. A DL  50 por con­
tacto às 24 horas descrita para este composto situa-se na gama de 0,10 a 0,30 μg s.a./abelha (2). No entanto, podem ser usados outros 
padrões tóxicos, desde que existam dados suficientes para verificar a 
resposta prevista à dose aplicada (por exemplo, paratião).
 
1.6.3.  Exposição  
1.6.3.1.  Administração de doses  
As abelhas anestesiadas são tratadas individualmente por aplicação 
tópica. As diferentes doses de ensaio e os controlos são distribuídos 
de forma aleatória pelas abelhas. As doses são aplicadas com o auxílio de um microaplicador no lado dorsal do tórax de cada abelha, em alíquotas de 1 μl de uma solução contendo a substância de ensaio 
na concentração apropriada. Caso se justifique, poderão ser usados 
outros volumes. Após a aplicação, as abelhas são colocadas em gaiolas de ensaio e alimentadas com soluções de sacarose.
 
1.6.3.2.  Duração  
O ensaio deverá durar, de preferência, 48 horas. Caso a mortalidade 
aumente em mais de 10 % entre 24 e 48 horas após a aplicação, o 
ensaio deverá ser prolongado até um máximo de 96 horas, desde que 
a mortalidade nos controlos não exceda 10 %.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1190
 
1.6.4.  Observações  
Devem efectuar-se registos de mortalidade decorridas quatro, 24 e 48 
horas após o início do ensaio. Em caso de prolongamento do período de observação, deverão realizar-se avaliações suplementares com 
intervalos de 24 horas, até um máximo de 96 horas, desde que a 
mortalidade dos grupos de controlo não exceda 10 %.
 
Deverão ser objecto de registo todas as eventuais anomalias de 
comportamento verificadas durante o período do ensaio.  
1.6.5.  Teste-limite  
Em determinadas circunstâncias (por exemplo, quando se prevê que 
a substância de ensaio apresente um baixo nível de toxicidade), pode 
efectuar-se um teste-limite, usando 100 μg s.a./abelha, de forma a 
certificar-se de que a DL  50 é superior a este valor. Deve seguir-se um 
procedimento semelhante ao descrito acima, incluindo o uso de três 
grupos duplicados para a dose de ensaio e a realização dos controlos 
relevantes, assim como o uso de um padrão tóxico. Se ocorrer mor ­
talidade, deverá realizar-se um estudo completo. Todos os efeitos subletais, caso existam, deverão ser registados (ver ponto 1.6.4).
 
2. DADOS E RELATÓRIO  
2.1. DADOS  
Os dados devem ser resumidos num quadro, indicando, para cada 
grupo de tratamento (e para os grupos de controlo e os associados ao padrão tóxico), o número de abelhas usadas e a mortalidade em cada momento de observação, bem corno o número de abelhas que apre ­
sentam um comportamento anómalo. Os dados de mortalidade de ­
vem ser analisados mediante métodos estatísticos adequados (por exemplo, análise probit, média móvel, teoria do binómio relativa à probabilidade) (3) (4). Devem ser traçadas curvas dose-resposta para 
cada tempo de observação recomendado (ou seja, 24 horas, 48 horas 
e, se for relevante, 72 horas e 96 horas), procedendo-se depois ao cálculo dos respectivos declives e à determinação das doses letais médias (DL
 50 ) com limites de confiança de 95 %. Podem efectuar-se 
correcções na mortalidade dos controlos, usando os valores de cor ­
recção de Abbott (4) (5). A DL  50 deverá ser expressa em μg de 
substância de ensaio por abelha.  
2.2. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deverá incluir as seguintes informações:  
2.2.1.  Substância de ensaio:  
— natureza física e propriedades físico-químicas (por exemplo, es ­
tabilidade na água, pressão de vapor),  
— dados de identificação química, incluindo a fórmula estrutural, o 
grau de pureza [ou seja, no caso de pesticidas, a identidade e a 
concentração da(s) substância(s) activa(s)].  
2.2.2.  Espécies submetidas a ensaio:  
— nome científico, raça, idade aproximada (em semanas), método 
de recolha, data da recolha,  
— dados informativos sobre as colónias usadas para recolha das 
abelhas submetidas a ensaio, incluindo o estado de saúde, a 
ocorrência de doenças de adultos, eventuais tratamentos previa ­
mente aplicados, etc.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1191
 
2.2.3.  Condições do ensaio:  
— temperatura e humidade relativa da sala de ensaios,  
— condições de alojamento, incluindo o tipo, as dimensões e o 
material de construção das gaiolas,  
— métodos de administração da substância de ensaio (indicando, 
por exemplo, o solvente usado como veículo, o volume aplicado 
da solução de ensaio e os anestésicos usados),  
— planeamento do ensaio, ou seja, o número de doses de ensaio e 
as respectivas concentrações, bem como o número de controlos; 
para cada dose de ensaio e para cada controlo, deverá indicar-se 
o número de gaiolas em duplicado e o número de abelhas em cada uma delas,
 
— data do ensaio.  
2.2.4.  Resultados:  
— em caso de realização de um estudo preliminar para determina ­
ção da gama de concentrações de ensaio, os respectivos resulta ­
dos, 
— dados não processados: mortalidade correspondente a cada con ­
centração de ensaio em cada momento de observação,  
— representação gráfica das curvas dose-resposta no final do ensaio,  
— valores de DL  50 , com limites de confiança de 95 %, para cada 
período de observação recomendado, tanto para a substância de 
ensaio, como para o padrão tóxico,  
— tratamentos estatísticos usados para a determinação da DL  50 , 
— mortalidade nos controlos,  
— outros efeitos biológicos observados ou medidos e qualquer reac ­
ção anormal das abelhas,  
— qualquer desvio em relação aos procedimentos aqui descritos, 
assim como quaisquer outras informações relevantes.  
3. REFERÊNCIAS  
(1) EPPO/Council of Europe (1993). Decision-Making Scheme for 
the Environmental Risk Assessment of Plant Protection Pro ­
ducts — Honeybees. EPPO bulletin, Vol. 23, N.1, p. 1 51- -165. March 1993.
 
(2) Gough, H. J., McIndoe, E. C, Lewis, G. B. (1994). The use of 
dimethoate as a reference compound in laboratory acute toxi ­
city tests on honeybees ( Apis mellifera  L.), 1981-1992. Journal 
of Apicultural Research 22, p. 119-125.  
(3) Litchfield, J. T. and Wilcoxon, F. (1949). A simplified method 
of evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and 
Exper. Ther., 96, p. 99-11 3.  
(4) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3rd ed., Cambridge, 
London and New York.  
(5) Abbott, W. S. (1925). A method for computing the effective ­
ness of an insecticide. Jour. Econ. Entomol. 18, p. 265-267.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1192
 
C.18.  ADSORÇÃO/DESSORÇÃO POR RECURSO A UM MÉTODO 
DE EQUILÍBRIO POR LOTES DE SOLOS  
1. MÉTODO  
O presente método é uma reprodução do método OCDE TG 106, 
para a determinação da adsorção/dessorção em solos por recurso a 
um método de equilíbrio por lotes (2000).  
1.1. INTRODUÇÃO  
O presente método baseia-se em ensaios específicos, bem como nos 
resultados de um seminário ( workshop ) para a selecção de solos, 
com vista ao desenvolvimento de um ensaio de adsorção (1) (2) 
(3) (4). O método tem também em conta as directrizes em vigor a nível nacional (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11).
 
Os estudos de adsorção/dessorção permitem obter informações es ­
senciais sobre a mobilidade dos produtos químicos e sua distribuição 
nos diversos componentes da biosfera (edáfico, aquático e atmosfé ­
rico) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21). As informa ­
ções recolhidas podem ser utilizadas na previsão ou estimativa, no ­
meadamente, da disponibilidade de uma substância química 
para degradação (22) (23), transformação e absorção pelos organis ­
mos vivos (24), do perfil de lixiviação pelos solos (16) (18) (19) (21) (25) (26) (27) (28), da volatilidade nos solos (21) (29) (30) e da 
transferência da superfície de solos para águas naturais (18) (31) 
(32). Os dados de adsorção podem ser utilizados para fins compara ­
tivos, bem como de modelização (19) (33) (34) (35).
 
A distribuição de uma substância química entre o solo e uma fase 
aquosa constitui um processo complexo que depende de diversos 
factores, designadamente a natureza química da substância (12) (36) (37) (38) (39) (40), as características do solo (4) (12) (13) (14) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) (49) e factores climáticos 
tais como a pluviosidade, a temperatura, a exposição ao sol e os 
ventos. Deste modo, os numerosos fenómenos e mecanismos envol ­
vidos no processo de adsorção de uma substância pelo solo não podem ser totalmente definidos por um modelo laboratorial simpli ­
ficado do tipo descrito no presente método. Todavia, embora a pre ­
sente contribuição não abranja todos os casos possíveis no domínio ambiental, fornece informações valiosas sobre o impacto ambiental 
da adsorção de uma substância.
 
Ver também a introdução geral.  
1.2. ÂMBITO  
O presente método visa determinar o comportamento de uma subs ­
tância no solo em termos de adsorção/dessorção. O objectivo con ­
siste em obter um parâmetro que possa ser utilizado para prever a 
partição em diversas condições ambientais; para tal, determinam-se 
os coeficientes de adsorção em equilíbrio de um produto químico em vários solos, em função das características destes últimos (por exem ­
plo, teor de carbono orgânico, teor de argila, textura e pH). Devem 
utilizar-se diferentes tipos de solos, de modo a abranger tanto quanto 
possível as interacções de uma determinada substância com solos de ocorrência natural.
 
No presente método, a adsorção é entendida como o processo de 
ligação de uma substância à superfície dos solos, não se efectuando 
qualquer distinção entre os diversos processos de adsorção (adsorção física e química), bem como entre os processos de degradação su ­
perficial catalisada, adsorção na massa e reacção química. Não é tida 
em conta a adsorção em partículas coloidais (diâmetro < 0,2 μm) 
produzidas nos solos.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1193
 
Os parâmetros referentes ao solo considerados mais importantes no 
contexto da adsorção são os seguintes: teor de carbono orgânico (3) 
(4) (12) (13) (14) (41) (43) (44) (45) (46) (47) (48), teor de argila e textura dos solos (3) (4) (41) (42) (43) (44) (45) (46) (47) (48) e pH, no caso de compostos ionizáveis (3) (4) (42). Outros parâmetros que 
podem apresentar um impacto na adsorção-dessorção do solo são a 
capacidade de permuta catiónica efectiva (ECHC), o teor de ferro amorfo e de óxidos de alumínio, em especial em solos vulcânicos e tropicais (4), bem como a superfície específica (49).
 
O ensaio foi concebido para avaliar a adsorção de uma substância 
em vários tipos de solos, com diversos teores de carbono orgânico, argila, textura e pH, sendo constituído por três fases:
 
Fase 1 : Estudo preliminar para a determinação:  
— da razão solo/solução,  
— do tempo necessário para atingir o equilíbrio de adsor ­
ção, bem como da quantidade de substância teste adsor ­
vida no estado de equilíbrio,  
— da adsorção da substância em estudo na superfície dos 
recipientes de ensaio, bem como da estabilidade da substância durante o período de ensaio.
 
Fase 2 : Ensaio de selecção: estuda-se a cinética de adsorção a con ­
centração constante em cinco tipos diferentes de solos, de ­
terminando-se os coeficientes de distribuição K  d e K  oc . 
Fase 3 : Determinação das isotérmicas de adsorção de Freundlich, de 
modo a avaliar a influência da concentração na extensão da 
adsorção nos solos.  
Estudo da dessorção através da respectiva cinética, bem como 
das isotérmicas de dessorção de Freundlich (apêndice 1).  
1.3. DEFINIÇÕES E UNIDADES  
Símbolo Definição Unidades  
A t i percentagem de adsorção no instante t  i % 
A eq percentagem de adsorção no estado de equilíbrio de ad ­
sorção % 
m ads 
s ðt i Þ massa de substância em estudo adsorvida no solo no ins ­
tante t  i μg 
m ads 
s ðΔt i Þ massa de substância em estudo adsorvida no solo no in ­
tervalo de tempo At  i μg 
m ads 
s ðeqÞ massa de substância em estudo adsorvida no solo no es ­
tado de equilíbrio de adsorção μg 
m 0 massa de substância em estudo no recipiente de ensaio, no 
início do mesmo μg 
m ads 
m ðt i Þ massa de substância em estudo determinada numa alíquota 
(v a A ) no instante t  j μg 
m ads 
aq ðeqÞ massa de substância em estudo na solução, no estado de 
equilíbrio de adsorção μg 
m solo quantidade de fase edáfica, expressa em massa seca g  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1194
 
Símbolo Definição Unidades  
C st concentração mássica da solução-mãe da substância μg cm  -3 
C 0 concentração mássica inicial da solução de ensaio em 
contacto com o solo μg cm  -3 
C aq ads ðt i Þ concentração mássica da substância na fase aquosa no 
instante t  i em que a análise é efectuada μg cm  -3 
C s ads ðeqÞ teor de substância adsorvida no solo no estado de equilí ­
brio de adsorção μg g -1 
C aq ads ðeqÞ concentração mássica da substância na fase aquosa no 
estado de equilíbrio de adsorção μg cm  -3 
V 0 volume inicial da fase aquosa em contacto com o solo 
durante o ensaio de adsorção cm 3 
v a A volume da alíquota em que se determina a substância de 
ensaio cm 3 
coeficiente de distribuição da adsorção cm  3 g -1 
coeficiente de adsorção normalizado relativo ao carbono 
orgânico cm 3 g -1 
coeficiente de adsorção normalizado da matéria orgânica cm  3 g -1 
K F ads coeficiente de adsorção de Freundlich μg -1 
l/n expoente de Freundlich  
D t i percentagem de dessorção no instante t  i % 
D Δt i percentagem de dessorção no intervalo Δt i % 
K des coeficiente de dessorção aparente cm  3 g -1 
K F ads coeficiente de dessorção de Freundlich μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g -1 
m aq ads ðt i Þ massa de substância de ensaio dessorvida do solo no ins ­
tante t  i μg 
m m ads ðΔt i Þ massa de substância de ensaio dessorvida do solo no in ­
tervalo Δt j μg 
m m ads ðeqÞ massa de substância determinada analiticamente na fase 
aquosa no estado de equilíbrio de dessorção μg 
m aq ads ðeqÞ massa total de substância em estudo no estado de equilí ­
brio de dessorção μg 
m s ads ðΔt i Þ massa de substância que permanece adsorvida no solo após 
o intervalo At  i μg 
m aq A massa de substância remanescente do equilíbrio de adsor ­
ção devido a uma substituição incompleta de volumes μg 
C s ads ðeqÞ teor de substância em estudo que permanece adsorvida no 
solo no estado de equilíbrio de dessorção μg g -1 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1195
 
Símbolo Definição Unidades  
() concentração mássica de substância de ensaio na fase 
aquosa no estado de equilíbrio de dessorção μg cm  3 
V T volume total da fase aquosa em contacto com o solo 
durante o ensaio de cinética de dessorção efectuado pelo método sequencial cm
 3 
volume de sobrenadante removido do tubo após atingir o 
estado de equilíbrio de adsorção e substituído por igual volume de solução de CaCl
 2 0,01 M cm 3 
v a D volume da alíquota recolhida para fins analíticos a partir 
do instante (i), durante o ensaio de cinética de dessorção 
efectuado pelo método sequencial cm 3 
V r r volume de solução recolhida do tubo (i) para a determi ­
nação da substância em estudo, no ensaio de cinética de 
dessorção (método paralelo) cm 3 
V r F volume de solução recolhida do tubo para a determinação 
da substância em estudo, no estado de equilíbrio de des ­
sorção cm 3 
MB balanço de massas % 
m E massa total de substância em estudo extraída do solo e das 
paredes do recipiente de ensaio em duas etapas μg 
V rec volume de sobrenadante recolhido após atingir o estado de 
equilíbrio de adsorção cm 3 
P ow coeficiente de partição octanol/água 
pKa constante de dissociação 
S w solubilidade em água g l  -1 
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Adicionam-se a amostras de solos de massa seca conhecida, previa ­
mente equilibradas com CaCl  2 , 0,01 M, volumes conhecidos de 
soluções da substância em estudo em CaCl  2 , 0,01 M, de concentra ­
ção conhecida, marcadas ou não com radioisótopos. A mistura é 
agitada durante um período adequado. As suspensões de solo são separadas por centrifugação e eventualmente filtradas, procedendo-se à análise da fase aquosa. A quantidade de substância em estudo 
adsorvida pela amostra de solo é calculada na forma de diferença 
entre a quantidade de substância inicialmente presente na solução e a quantidade remanescente no final do ensaio (método indirecto).
 
Como alternativa, pode determinar-se directamente a quantidade de 
substância em estudo adsorvida, mediante a análise do solo (método directo). Este processo, que implica a extracção do solo, por etapas, com solventes adequados, é recomendado nos casos em que não 
possa determinar-se com rigor a diferença das concentrações da subs ­
tância na solução. A adsorção da substância na superfície dos reci ­
pientes de ensaio, a instabilidade da substância no período de ensaio, bem como uma adsorção fraca que determine apenas alterações li ­
geiras da concentração da solução ou uma forte adsorção que origine 
concentrações demasiado reduzidas para serem determinadas com rigor, constituem exemplos de tais casos. Se se utilizarem substâncias marcadas com radioisótopos, pode evitar-se a extracção do solo me ­
diante a análise da fase edáfica por combustão seguida de contagem 
com um contador de cintilação líquida. Trata-se, todavia, de uma técnica não específica, que não permite distinguir as substâncias iniciais dos produtos de transformação, pelo que deve ser utilizada 
apenas se a substância em estudo for estável no período de duração 
do ensaio.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1196
 
1.5. INFORMAÇÕES RELATIVAS À SUBSTÂNCIA EM ESTUDO  
Os reagentes devem ser de qualidade analítica. No caso de subs ­
tâncias em estudo de composição conhecida não marcadas, recomen ­
da-se um grau de pureza mínimo de 95 %; no caso de substâncias 
marcadas com radioisótopos, a pureza deve ser de grau radioquími ­
co. Se os isótopos radioactivos possuírem uma meia vida reduzida, devem utilizar-se parâmetros de correcção.
 
Antes de efectuar um ensaio de adsorção-dessorção, devem conhe ­
cer-se as seguintes informações relativas à substância em estudo:  
a) Solubilidade em água (A.6);  
b) Pressão de vapor (A.4) e/ou constante da lei de Henry;  
c) Degradação abiótica: hidrólise em função do pH (C.7);  
d) Coeficiente de partição (A.8);  
e) Biodegradabilidade fácil (C.4) ou transformação aeróbia/ ­
anaeróbia no solo;  
f) pKa das substâncias ionizáveis presentes;  
g) Fotólise directa em água (por exemplo, espectro de absorção UV-Vis 
em água, rendimento quântico) e fotodegradação no solo.  
1.6. APLICABILIDADE DO ENSAIO  
O ensaio é aplicável a substâncias químicas para as quais existe um 
método analítico suficientemente rigoroso. A estabilidade da subs ­
tância no período de ensaio é um parâmetro susceptível de influen ­
ciar a fiabilidade dos resultados, em especial quando se utiliza o método indirecto. Deve, pois, efectuar-se um ensaio preliminar 
com o objectivo de verificar a estabilidade; caso ocorra uma trans ­
formação no período de ensaio, recomenda-se a análise do solo e das fases aquosas no ensaio principal.
 
Podem surgir dificuldades na condução do ensaio em substâncias de 
solubilidade reduzida em água (S  w < 10  -4 g l -1 ), bem como em 
substâncias com carga eléctrica elevada, pode determinar dificulda ­
des, uma vez que a determinação analítica da concentração da fase 
aquosa não pode ser efectuada com rigor suficiente. Nestes casos, é 
necessário adoptar medidas adicionais. Nas secções relevantes do presente método fornecem-se orientações para a resolução dos pro ­
blemas em causa.
 
Caso se utilizem substâncias voláteis, devem evitar-se perdas durante 
o processo.  
1.7. DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
1.7.1.  Equipamento e reagentes  
Equipamento corrente de laboratório, nomeadamente:  
a) Tubos ou recipientes de ensaio, que devem possuir as seguintes 
características:  
— ser directamente adaptáveis à centrifugadora. de modo a mi ­
nimizar os erros de manipulação e transferência,  
— ser feitos de um material inerte, de modo a minimizar a 
adsorção da substância em estudo na sua superfície;  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1197
 
b) Dispositivo de agitação: agitador vertical ou equipamento equi ­
valente; o dispositivo de agitação deve manter a amostra de solo 
em suspensão durante o processo;  
c) Centrifugadora: preferentemente de alta velocidade (por exemplo, 
força centrífuga > 3 000 g), com controlo de temperatura e capa ­
cidade de remover da solução aquosa partículas de diâmetro su ­
perior a 0,2 μm. Os tubos ou recipientes devem ser tapados 
durante a agitação e centrifugação, de modo a evitar perdas por volatilização ou perdas de água; com vista a minimizar a adsor ­
ção nos tubos ou recipientes, devem utilizar-se tampas activadas, 
nomeadamente de teflon;
 
d) Dispositivo de filtração (opcional): filtros com poros de 0,2 μm, 
esterilizados e descartáveis. Devem adoptar-se precauções espe ­
ciais na selecção dos materiais de filtração, de modo a evitar 
perdas da substância em estudo; no caso de substâncias pouco 
solúveis, não é recomendável o uso de filtros de matérias orgâ ­
nicas;  
e) Equipamento analítico adequado à determinação da concentração 
da substância em estudo;  
f) Estufa com possibilidade de manter a temperatura entre 103  o C e 
110  o C. 
1.7.2.  Caracterização e selecção dos solos  
Os solos devem ser caracterizados pelos três principais parâmetros 
considerados responsáveis pela capacidade de adsorção: teor de car ­
bono orgânico, teor de argila, textura do solo e pH. Como referido  
supra  (Âmbito), devem ter-se em conta quaisquer outras proprieda ­
des físico-químicas do solo que possam apresentar impacto na adsorção/dessorção de uma determinada substância.
 
Os métodos utilizados para a caracterização dos solos são bastante 
importantes, podendo influenciar os resultados de modo significativo. Deste modo, recomenda-se a determinação do pH do solo numa solução de CaCl
 2 , 0,01 M (solução utilizada no ensaio de adsorção/ ­
dessorção) de acordo com o método ISO correspondente (ISO- 
-10390-1). Recomenda-se também a determinação de outras proprie ­
dades importantes do solo por recurso a métodos normalizados (por exemplo manual ISO de análise dos solos «Handbook of Soil Ana ­
lysis»); a análise dos dados de adsorção/dessorção poderá assim 
basear-se em parâmetros globalmente normalizados. As referências (50-52) fornecem algumas directrizes referentes aos métodos norma ­
lizados existentes para a análise e caracterização dos solos. No que 
respeita à calibração dos métodos de ensaio aplicáveis aos solos, 
recomenda-se o uso de amostras de solos de referência.
 
O quadro 1 fornece directrizes para a selecção dos solos a utilizar 
nos ensaios de adsorção/dessorção. Os sete tipos de solos seleccio ­
nados são característicos das regiões temperadas. No caso da utili ­
zação de substâncias ionizáveis, os solos seleccionados devem pos ­
suir uma gama alargada de pH, de modo a que possa avaliar-se a adsorção da substância nas suas formas ionizada e não ionizada. Na 
secção 1.9 (Realização do ensaio) apresentam-se orientações relativas 
ao número de solos diferentes que devem ser utilizados nas várias fases do ensaio.
 
Caso se utilizem outros tipos de solos, estes últimos devem ser 
caracterizados pelos mesmos parâmetros, devendo as suas proprieda ­
des apresentar uma variação semelhante à dos solos descritos no 
quadro 1, mesmo que não satisfaçam os critérios de forma rigorosa.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1198
 
Quadro 1  
Directrizes para a selecção das amostras de solos a utilizar nos ensaios de adsorção-dessorção  
Tipo de solo Gama de pH (em 
CaCl  2 0,01 M) Teor de carbono 
orgânico (%) Teor de argila (%) Textura (  1 ) 
1 4,5 - 5,5 1,0 - 2,0 65-80 argilosa 
2 > 7,5 3,5 - 5,0 20-40 argilo-limosa 
3 5,5 - 7,0 1,5 - 3,0 15-25 franco-limosa 4 4,0 - 5,5 3,0 - 4,0 15-30 limosa 5 < 4,0 - 6,0 (
 2 ) < 0,5 - 1,5 (  2 ) ( 3 ) < 10-15 (  2 ) limo-arenosa 
6 > 7,0 < 0,5 - 1,0 (  2 ) ( 3 ) 40-65 argilo-limosa/argi ­
losa 
7 < 4,5 > 10 < 10 arenosa/limo-are ­
nosa  
( 1 ) Em conformidade com o sistema da FAO e dos Estados Unidos (85). 
( 2 ) As variáveis respectivas devem, preferencialmente, exibir valores incluídos nas gamas indicadas. Todavia, caso se 
observem dificuldades em encontrar solos adequados, podem utilizar-se valores inferiores aos mínimos indicados. 
( 3 ) A utilização de solos com teor de carbono orgânico inferior a 0,3 % poderá perturbar a correlação entre o referido teor 
e a adsorção. Recomenda-se, pois, a utilização de solos com um teor mínimo de carbono orgânico de 0,3 %.  
1.7.3.  Recolha e armazenagem das amostras de solos  
1.7.3.1.  Recolha  
Não se recomendam técnicas ou instrumentos específicos de amos ­
tragem; a técnica a utilizar depende do objectivo do ensaio (53) (54) (55) (56) (57) (58).
 
Deve ter-se em conta o seguinte:  
a) São necessárias informações pormenorizadas sobre a história do 
local de recolha, nomeadamente a localização, o tipo de vegeta ­
ção presente, o eventual tratamento com pesticidas e/ou adubos, a 
adição de matéria biológica e a contaminação acidental. No que 
respeita à descrição do referido local, devem seguir-se as reco ­
mendações da norma ISO relativa à recolha de amostras de solos (ISO 10381-6);
 
b) O local de recolha das amostras deve ser definido por UTM 
(Universal  Transversal Mercator-Projection/European Horizontal 
Datum)  ou por coordenadas geográficas; o que permitirá a reco ­
lha futura de tipos específicos de solos ou contribuir para a 
definição dos solos em diversos sistemas de classificação utiliza ­
dos em países diferentes. As amostras devem ser recolhidas ape ­
nas em horizontes A, até uma profundidade máxima de 20 cm. 
Se, no caso particular do solo n.  o 7, se encontrar presente uma 
componente de horizonte O  h , a mesma deve ser incluída na amos ­
tragem.  
As amostras de solo devem ser transportadas em recipientes e a 
temperaturas tais que as suas propriedades não sofram alterações 
significativas.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1199
 
1.7.3.2.  Armazenagem  
É preferível a utilização de solos recentemente recolhidos. Nos casos 
em que tal não for possível, os solos podem ser armazenados à temperatura ambiente, numa atmosfera seca. Não se recomenda qual ­
quer período-limite de armazenagem; contudo, no caso dos solos 
armazenados há mais de três anos, deve determinar-se o teor de carbono orgânico, o pH e CEC antes da utilização.
 
1.7.3.3.  Manuseamento das amostras de solos e sua preparação para o 
ensaio  
Os solos são mantidos numa atmosfera seca, à temperatura ambiente 
(de preferência, entre 20 e 25  o C). Devem aplicar-se forças de desa ­
gregação mínimas, de modo a manter tanto quanto possível a textura 
original dos solos. Os solos são crivados a uma granulometria in ­
ferior ou igual a 2 mm; o processo de crivagem deve ser conforme às recomendações da norma ISO relativa à recolha de amostras de solos 
(ISO 10381-6). Recomenda-se uma homogeneização cuidadosa, de 
modo a aumentar a reprodutibilidade dos resultados. O teor de hu ­
midade dos solos é determinado com três alíquotas, por aquecimento a 105
 o C até não se observarem alterações de massa significativas 
(cerca de 12 h). Para efeitos de cálculo, utiliza-se a massa de solo 
seco na estufa, isto é a massa corrigida do teor de humidade.  
1.7.4.  Preparação da substância em estudo para aplicação no solo  
A substância é dissolvida numa solução de CaCl  2 , 0,01 M em água 
destilada ou desionizada; a solução de CaCl  2 é utilizada como fase 
aquosa com o objectivo de melhorar a centrifugação e minimizar a permuta catiónica. De preferência, a concentração da solução-mãe deve ser três ordens de grandeza acima do limite de detecção do 
método analítico utilizado. Este limiar garante o rigor das determi ­
nações no âmbito da metodologia do presente método; além disso, a concentração da solução-mãe deve ser inferior à solubilidade da substância em estudo em água.
 
A solução-mãe deve ser preparada, preferencialmente, imediatamente 
antes da aplicação nas amostras de solos, devendo ser mantida fe ­
chada e na ausência de luz, a 4  o C. O tempo de armazenagem 
depende da estabilidade da substância e da sua concentração na 
solução.  
No caso de substâncias pouco solúveis (S  w < 10-  4 g l -1 ), pode ser 
necessário utilizar um agente de solubilização adequado. Este último: a) deve ser miscível com a água (por exemplo, metanol ou acetoni ­
trilo); b) a sua concentração não deve exceder 1 % do volume total 
da solução-mãe e deve ser inferior à concentração da substância de 
ensaio em contacto com o solo (de preferência menos de 0,1 %); c) não deve ser tensioactivo nem susceptível de participar em processos de solvólise com a substância em estudo. A utilização de um agente 
de solubilização deve ser justificada de modo pormenorizado no 
relatório de ensaio.
 
A dopagem por adição da substância em estudo constitui outra al ­
ternativa aplicável a substâncias pouco solúveis. Neste caso, a subs ­
tância em estudo é dissolvida num solvente orgânico, sendo adicio ­
nada uma alíquota ao sistema constituído pelo solo e a solução de CaCl
 2 0,01 M em água destilada ou desionizada. O teor de solvente 
orgânico na fase aquosa deverá ser mantido a níveis tão reduzidos 
quanto possível, não devendo, em geral, exceder 0,1 %. A técnica em causa tem como desvantagem a não reprodutibilidade dos volu ­
mes: o facto de a concentração da substância em estudo e do co- 
-solvente não ser idêntica em todos os ensaios poderá representar um 
factor de erro adicional.
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1.8. REQUISITOS PRÉVIOS PARA A REALIZAÇÃO DOS ENSAIOS 
DE ADSORÇÃO/DESSORÇÃO  
1.8.1.  Método analítico  
Os principais parâmetros que podem influenciar o rigor das determi ­
nações de adsorção/dessorção incluem a precisão do método de aná ­
lise da solução e da fase adsorvida, a estabilidade e pureza da subs ­
tância em estudo, o tempo necessário para atingir o equilíbrio de adsorção/dessorção, a amplitude da variação de concentração da so ­
lução, a razão solo/solução e as alterações na estrutura do solo 
durante o processo de equilíbrio (35) (59-62). O apêndice 2 fornece alguns exemplos ligados à precisão das determinações.
 
Deve verificar-se a fiabilidade do método analítico para a gama de 
concentrações susceptíveis de ocorrer durante o ensaio. O experi ­
mentador deve ser livre de desenvolver um método com exactidão, 
precisão, reprodutibilidade, limites de detecção e recuperação ade ­
quados. A descrição infra fornece directrizes sobre o modo de exe ­
cução do ensaio em causa.  
Agita-se um volume adequado (por exemplo, 100 cm  3 ) de CaCl  2 
0,01 M, durante quatro horas, com uma massa de solo (por exemplo, 
20 g) de elevada capacidade de adsorção, isto é, com um teor ele ­
vado de carbono orgânico e de argila. As massas e volumes referidos podem variar em função das necessidades analíticas; uma razão 
solo/solução de 1:5 constitui, em geral, um valor inicial adequado. 
A mistura é centrifugada, podendo filtrar-se a fase aquosa. Adiciona- -se à mistura um determinado volume de solução-mãe da substância em estudo, de modo a obter uma concentração nominal incluída na 
gama de concentrações susceptíveis de ocorrer durante o ensaio. O 
referido volume não deverá exceder 10 % do volume final da fase aquosa, de modo a alterar tão pouco quanto possível a natureza da solução de pré-equilíbrio. Procede-se à análise da solução.
 
Deve efectuar-se um ensaio em branco com o sistema constituído 
pelo solo e a solução de CaCl  2 (suprimindo a substância em estudo), 
de modo a averiguar a existência de anomalias no método analítico, bem como possíveis efeitos matriciais causados pelo solo.
 
Os métodos analíticos que podem ser utilizados para as determina ­
ções de adsorção/dessorção incluem a cromatografia gás-líquido 
(GLC), a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), a espec ­
trometria (espectrometria de massa acoplada à GLC e HPLC) e a contagem por cintilação líquida (no caso de substâncias marcadas com radioisótopos). Independentemente do método analítico utiliza ­
do, considera-se que o mesmo é adequado se as recuperações forem 
da ordem de 90 % a 110 % do valor nominal. De modo a permitir efectuar a detecção e avaliação após a partição, os limites de detec ­
ção do método analítico devem ser inferiores à concentração nominal 
em, pelo menos, duas ordens de grandeza.
 
As características e limites de detecção do método analítico utilizado 
nos estudos de adsorção desempenham um papel importante na de ­
finição das condições de ensaio e no desempenho global do mesmo. O presente método constitui uma abordagem experimental, forne ­
cendo recomendações e directrizes para o desenvolvimento de solu ­
ções alternativas caso o método analítico e as condições laboratoriais 
imponham limitações.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1201
 
1.8.2.  Selecção das razões solo/solução adequadas  
A selecção das razões solo/solução adequadas aos estudos de 
adsorção/dessorção depende do coeficiente de distribuição K  d e do 
grau de adsorção relativa pretendido. A alteração da concentração da 
substância na solução determina o rigor estatístico da determinação, 
baseado na forma da equação de adsorção e do limite da metodolo ­
gia analítica. Na prática, é conveniente adoptar uma série de razões fixas, relativamente às quais a percentagem adsorvida seja superior a 
20 % e, preferentemente, a 50 % (62), devendo procurar manter-se a 
concentração da substância em estudo na fase aquosa a níveis que possam ser determinados com rigor. Tal facto é particularmente 
importante no caso de se observarem percentagens de adsorção ele ­
vadas.
 
A estimativa do valor de K  d , quer através de estudos preliminares 
quer por técnicas de estimativa consagradas (apêndice 3). fornece uma abordagem conveniente da selecção das razões solo/água ade ­
quadas. A selecção de uma razão pode ser efectuada com base numa 
representação das razões solo/solução em função dos valores de K
 d , 
para percentagens fixas de adsorção (figura 1), presumindo a linea ­
ridade da equação de adsorção (  1 ). A relação aplicável é obtida atra ­
vés do rearranjo da equação (4), de modo a obter a equação (1):  
V 0 
m solo ¼ Í m 0 
m ads 
s ðeqÞ Ä 1 Î 
K d [1] 
ou, na forma logarítmica, assumíndo que R = m  solo /V 0 c A  eq %/100 
¼ m ads 
s ðeqÞ 
m 0 : 
logR ¼ Ä log K  d þ log " 
ðA eq %=100Þ 
ð1 Ä A eq %=100Þ # [2]
 
Figura 1.  Relação entre as razões solo/solução e K  d , para diferentes 
percentagens de substância em estudo adsorvida  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1202  
( 1 ) C ads 
s ðeqÞ ¼ K d ·C ads 
aq ðeqÞ:
 A figura 1 apresenta as razões solo/solução necessárias em função de 
K d , para diversos níveis de adsorção. Por exemplo, com uma razão 
solo/solução de 1:5 e um K  d de 20, a percentagem de adsorção será 
da ordem de 80 %. Para obter uma percentagem de adsorção de 50 %, com um idêntico valor de K
 d , deve utilizar-se uma razão de 
1:25. Esta abordagem de selecção das razões solo/solução adequadas 
fornece ao investigador a flexibilidade necessária à satisfação das exigências experimentais.
 
As zonas de abordagem analítica mais difícil são aquelas em que a 
substância apresenta uma adsorção ligeira ou bastante elevada. Em caso de adsorção reduzida, recomenda-se a utilização de uma razão 
solo/solução de 1:1, embora, para solos com elevado teor de matéria 
orgânica, possa revelar-se necessário utilizar razões inferiores, de modo a obter uma massa pastosa. Devem adoptar-se precauções com a metodologia analítica para a determinação de pequenas alte ­
rações de concentração, sem o que o cálculo da adsorção será ine ­
xacto. Por outro lado, no caso de coeficientes de partição K
 d bastante 
elevados, pode utilizar-se uma razão solo/solução de 1:100, de modo a que permaneça na solução uma quantidade apreciável da substân ­
cia. Contudo, devem adoptar-se precauções no sentido de assegurar 
uma homogeneização adequada, devendo prever-se o tempo neces ­
sário ao equilíbrio do sistema. A previsão do valor de K
 d por recurso 
a técnicas de estimativa baseadas, por exemplo, nos valores de P  ow 
(apêndice 3) constitui uma abordagem alternativa, que pode ser uti ­
lizada, nomeadamente, no caso de substâncias polares ou com ad ­
sorção reduzida, bem como com valores de P  ow inferiores a 20, e no 
caso de substâncias lipófilas/ou de elevada adsorção com P  ow > 10  4 . 
1.9. REALIZAÇÃO DO ENSAIO  
1.9.1.  Condições de ensaio  
Todos os ensaios devem ser realizados à temperatura ambiente e, se 
possível, a uma temperatura constante compreendida entre 20  o C e 
25 o C. 
As condições de centrifugação devem permitir remover da solução 
partículas de granulometria superior a 0,2 μm. Este valor representa a 
granulometria mínima para que uma partícula seja considerada sóli ­
da, constituindo o limite entre as partículas sólidas e coloidais. O 
apêndice 4 fornece directrizes para a determinação das condições de 
centrifugação.  
Se o equipamento de centrifugação não garantir a remoção de par ­
tículas de granulometria superior a 0,2 μm, pode combinar-se a 
centrifugação com uma filtração com filtros de 0,2 um de porosida ­
de. Os filtros devem ser feitos de um material inerte adequado, de 
modo a evitar quaisquer perdas da substância em estudo. Em qual ­
quer caso, deve provar-se a não ocorrência de perdas da substância durante a filtração.
 
1.9.2.  Etapa 1 — Ensaio preliminar  
O objectivo da realização de um ensaio preliminar foi já referido na 
secção «Âmbito». Fornecem-se de seguida directrizes para o estabe ­
lecimento das condições do referido ensaio.  
1.9.2.1.  Selecção das razões solo/solução adequadas  
Utilizam-se dois tipos de solos e três razões solo/solução (seis en ­
saios). Um dos tipos de solos deverá possuir um teor elevado de carbono orgânico e um teor reduzido de argila; o outro solo deverá 
possuir um teor reduzido de carbono orgânico e um elevado teor de 
argila. Recomendam-se as seguintes razões:
 
— 50 g de solo e 50 cm  3 de solução aquosa da substância em 
estudo (razão 1/1),  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1203
 
— 10 g de solo e 50 cm  3 de solução aquosa da substância em 
estudo (razão 1/5),  
— 2 g de solo e 50 cm  3 de solução aquosa da substância em estudo 
(razão 1/25).  
A quantidade mínima de solo necessária para efectuar o ensaio de ­
pende das condições laboratoriais e do desempenho dos métodos 
analíticos utilizados. Recomenda-se, contudo, a utilização de, pelo menos, 1 g, e, de preferência, 2 g, de modo a obter resultados fiáveis.
 
Uma amostra de controlo, contendo a substância em estudo dissol ­
vida na solução de CaCl  2 0,01 M, na ausência de solo, é sujeita ao 
mesmo tratamento que os sistemas de ensaio, com o objectivo de 
verificar a estabilidade da substância em estudo na solução de CaCl  2 , 
bem como a sua eventual adsorção na superfície dos recipientes de ensaio.
 
Deve efectuar-se um ensaio em branco para cada tipo de solo, apli ­
cando um procedimento idêntico a uma amostra constituída pela 
mesma quantidade de solo e um volume total de 50 cm  3 de solução 
de CaCl  2 0,01 M, na ausência da substância em estudo. O ensaio em 
branco possui uma função de controlo do processo analítico, per ­
mitindo detectar a presença de substâncias interferentes ou de con ­
taminantes dos solos.  
Todos os ensaios, incluindo os de controlo e brancos, devem ser 
realizados pelo menos em duplicado. O número total de amostras 
a preparar para o ensaio pode ser calculado em função da metodo ­
logia utilizada.  
Os métodos utilizados no ensaio preliminar e no ensaio principal são, 
de modo geral, idênticos, referindo-se as excepções sempre que for 
caso disso.  
Antes da realização do ensaio, as amostras de solos secas ao ar são 
equilibradas por agitação, durante 12 h, com um volume mínimo de 
45 cm  3 de CaCl  2 0,01 M. Seguidamente, adiciona-se um volume 
determinado de solução-mãe da substância em estudo, de modo a ajustar o volume final para 50 cm
 3 . O volume de solução-mãe a 
adicionar: a) não deve exceder 10 % do volume final (50 cm  3 ) da 
fase aquosa, de modo a alterar tão pouco quanto possível a natureza da solução de pré-equilíbrio: b) deve, de preferência, resultar numa concentração inicial da substância em estudo em contacto com o solo 
(C
 0 ) superior ao limite de detecção do método analítico em, pelo 
menos, duas ordens de grandeza; este limiar garante a possibilidade de efectuar determinações rigorosas mesmo em caso de ocorrência de uma forte adsorção (> 90 %), bem corno o cálculo posterior das 
isotérmicas de adsorção. Recomenda-se também, na medida do pos ­
sível, que a concentração inicial da substância em estudo (C
 0 ) não 
exceda metade do seu limite de solubilidade.  
Apresenta-se de seguida um exemplo do cálculo da concentração da 
solução-mãe (C  st ). Assume-se que o limite de detecção é de 0,01 
μg cm  -3 e a taxa de adsorção de 90 %; nestas condições, a concen ­
tração inicial da substância em estudo em contacto com o solo deve, 
preferentemente, ser de 1 μg cm  -3 (superior ao limite de detecção em 
duas ordens de grandeza). Supondo que se adiciona o volume má ­
ximo recomendável de solução-mãe, isto é, 5 a 45 cm  3 de solução de 
CaCl  2 0,01 M (= 10 % de solução-mãe a um volume total da fase 
aquosa de 50 cm  3 ), a concentração da solução-mãe deve ser de 10 
μg cm  -3 , ou seja, superior ao limite de detecção do método analítico 
em três ordens de grandeza.  
Deve determinar-se o pH da fase aquosa antes e após o contacto com 
o solo. uma vez que desempenha um papel importante em todo o 
processo de adsorção, especialmente no caso das substâncias ionizá ­
veis. ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1204
 
A mistura é agitada até ser atingido o equilíbrio de adsorção. O 
tempo necessário para atingir o equilíbrio no solo é bastante variável, 
dependendo da natureza da substância e do tipo de solo; um período de 24 h é, em geral, suficiente (77). No estudo preliminar, recomen ­
da-se a adopção de uma amostragem sequencial nas 48 h subsequen ­
tes à mistura (por exemplo, após quatro, oito, 24 e 48 h). Deve, 
contudo, adoptar-se uma relativa flexibilidade no que respeita à du ­
ração do ensaio, tendo em conta a programação do trabalho de laboratório.
 
Existem duas opções para a análise da substância em estudo na 
solução aquosa: a) método paralelo b) método sequencial. Deve 
sublinhar-se que, embora no plano experimental o método paralelo 
seja mais fastidioso, o tratamento matemático dos resultados é mais simples (ver apêndice 5). Todavia, a escolha da metodologia a adop ­
tar é deixada ao critério do experimentador, que deverá ter em conta 
as condições e os recursos laboratoriais disponíveis.
 
a) Método paralelo: preparam-se amostras com a mesma razão solo/ ­
solução, em número igual aos intervalos de tempo em que pre ­
tende estudar-se a cinética de adsorção. Após centrifugação e, se necessário, filtração, a fase aquosa do primeiro tubo é recolhida tão completamente quanto possível e sujeita a análise após, por 
exemplo, quatro h, sendo a fase aquosa do segundo tubo reco ­
lhida após oito h, a do terceiro tubo após 24, etc.;
 
b) Método sequencial: prepara-se uma única amostra em duplicado 
por cada razão solo/solução. A mistura é centrifugada a intervalos regulares, de modo a separar as fases. Determina-se de imediato a 
substância em estudo numa pequena alíquota da fase aquosa, 
prosseguindo-se o ensaio com a mistura original. Caso se recorra à filtração após a centrifugação, as condições do laboratório de ­
vem permitir filtrar alíquotas aquosas de volume reduzido. Reco ­
menda-se que o volume total de alíquotas recolhidas não exceda 
1 % do volume total da solução, de modo a não alterar signifi ­
cativamente a razão solo/solução e reduzir a massa de soluto disponível para adsorção durante o ensaio.
 
Calcula-se a percentagem de adsorção  A t i em cada instante (t  i ) com 
base na concentração inicial nominal e na concentração determinada 
no instante de amostragem (t  j ), corrigida do valor referente à amostra 
em branco. A representação gráfica A, em função! do tempo (figura 1 do apêndice 5) permite obter uma estimativa do tempo necessário para atingir o patamar de equilíbrio (
 1 ), bem como calcular o valor 
de K  d no estado de equilíbrio. Com base no valor de K  d , seleccio ­
nam-se da figura l razões solo/solução adequadas, que determinem uma percentagem de adsorção superior a 20 % e, preferentemente, superior a 50 % (61). As equações a aplicar e princípios de repre ­
sentação gráfica são fornecidos na secção «Apresentação dos resul ­
tados» e no apêndice 5.
 
1.9.2.2.  Determinação do tempo necessário para atingir o equilíbrio de 
adsorção e da quantidade de substância em estudo adsorvida no estado de equilíbrio
 
Como referido  supra , a representação gráfica de  A t i ou C  ads 
aq Ê Ì  
em 
função do tempo permite obter uma estimativa do instante em que é 
atingido o equilíbrio de adsorção, bem como da quantidade de subs ­
tância em estudo adsorvida no estado de equilíbrio. As figuras 1 e 2 do apêndice 5 fornecem exemplos das referidas representações. O tempo necessário para atingir o equilíbrio traduz-se no tempo de que 
o sistema necessita para atingir o patamar de equilíbrio.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1205  
( 1 ) A representação gráfica da concentração da substância de ensaio na fase aquosa (  C ads 
aq Ê Ì  
) 
em função do tempo pode também ser utilizada na estimativa do instante em que é 
atingido o patamar de equilíbrio (ver figura 2 do apêndice 5).
 Se, no caso de um determinado solo, não se observar a ocorrência de 
qualquer patamar, mas antes um aumento constante, tal facto pode 
ser devido a factores de perturbação tais como a biodegradação ou difusão lenta. Pode averiguar-se a ocorrência de biodegradação re ­
petindo o ensaio com uma amostra de solo esterilizada. Caso não se 
observe também qualquer patamar, o experimentador deve averiguar 
a ocorrência de outro fenómeno possível no caso específico em questão, procedendo a alterações adequadas das condições experi ­
mentais (temperatura, tempos de agitação, razões solo/solução). 
Compete ao experimentador decidir o prosseguimento do ensaio 
apesar da eventual impossibilidade de atingir o equilíbrio.
 
1.9.2.3.  Adsorção na superfície do recipiente de ensaio e estabilidade da 
substância em estudo  
A análise das amostras de controlo permite obter informações sobre 
a adsorção da substância em estudo na superfície dos recipientes de ensaio, bem como sobre a respectiva estabilidade. Caso se observe uma perda superior ao erro-padrão do método analítico utilizado, esta 
pode dever-se a uma degradação abiótica e/ou adsorção na superfície 
do recipiente de ensaio. Estes fenómenos são distinguíveis mediante a lavagem das paredes do recipiente com um volume conhecido de um solvente adequado, seguida de determinação da substância em 
estudo na solução resultante da lavagem. Se não ocorrer adsorção na 
superfície do recipiente de ensaio, a perda reflecte a instabilidade abiótica da substância em estudo. Caso se observe a ocorrência de adsorção, é necessário utilizar recipientes de outro material. De re ­
ferir que os dados relativos à adsorção na superfície dos recipientes 
de ensaio assim obtidos não são directamente extrapoláveis para o ensaio solo/solução, uma vez que a presença de solo afecta o pro ­
cesso de adsorção.
 
Podem obter-se informações adicionais sobre a estabilidade da subs ­
tância em estudo através do cálculo do balanço de massas em função 
do tempo. Tal implica a determinação da substância em estudo na 
fase aquosa, em extractos do solo e nas paredes do recipiente de ensaio. A diferença entre a massa de substância em estudo adicio ­
nada e a soma das massas da mesma substância na fase aquosa, nos 
extractos de solo e no recipiente de ensaio corresponde à 
massa degradada e/ou volatilizada e/ou não extraída. A determinação do balanço de massas apenas deve ser efectuada se o equilíbrio de adsorção tiver sido atingido no período de ensaio.
 
O balanço de massas é determinado para ambos os solos, bem como 
para uma razão solo/solução por solo com uma perda superior a 20 % e, preferentemente, superior a 50 %, no estado de equilíbrio. 
Após a análise da última amostra de fase aquosa, decorridas 48 h do 
início do ensaio, as fases são separadas por centrifugação e even ­
tualmente filtradas. A fase aquosa é recuperada na maior extensão possível, adicionando-se de seguida ao solo um solvente de extrac ­
ção adequado, com um coeficiente de extracção mínimo de 95 %, de 
modo a extrair a substância em estudo. Recomenda-se a realização de duas extracções sucessivas. Determina-se então a quantidade de substância em estudo presente no solo e nos extractos dos recipien ­
tes, procedendo-se ao cálculo do balanço de massas (equação 10 da 
secção «Apresentação dos resultados»). Caso o referido balanço seja inferior a 90 %, a substância deve considerar-se instável no intervalo de duração do ensaio. Podem, contudo, prosseguir-se os estudos, 
tendo em devida conta a referida instabilidade; neste caso, recomen ­
da-se a análise de ambas as fases no ensaio principal.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1206
 
1.9.3.  Etapa 2 — Cinética de adsorção para uma determinada concentra ­
ção da substância em estudo  
Utilizam-se cinco solos, seleccionados com base no quadro 1. É 
conveniente utilizar alguns dos solos (ou mesmo todos) utilizados 
no ensaio preliminar. Neste caso, não deverá repetir-se a etapa 2 para 
os solos utilizados no referido ensaio.  
O tempo necessário para atingir o equilíbrio, a razão solo/solução, a 
massa da amostra de solo, o volume de fase aquosa em contacto com o solo e a concentração da substância em estudo na solução são seleccionados com base nos resultados do ensaio preliminar. De 
preferência, deve efectuar-se a análise após um tempo de contacto 
aproximado de duas, quatro, seis, oito (eventualmente também 10) e 24 h; caso os resultados dos ensaios de das razões mostrem que um determinado produto necessita de tempos de exposição superiores, o 
tempo de agitação pode ser aumentado para, no máximo, 48 h. O 
estabelecimento dos referidos tempos deve, contudo, ser encarado de modo flexível.
 
Cada ensaio com um tipo específico de solo e uma solução deve ser 
efectuado pelo menos em duplicado, de modo a permitir estimar a variância dos resultados. Deve também realizar-se em cada caso um ensaio em branco, utilizando uma massa de amostra de solo e um 
volume de solução de CaCl
 2 0,01 M idênticos aos utilizados no 
ensaio principal, na ausência da substância em estudo. Deve apli ­
car-se o mesmo procedimento de ensaio a uma amostra de controlo contendo apenas a substância em estudo dissolvida na solução de 
CaCl
 2 0,01 M, na ausência de solo, como medida de precaução 
contra factores imprevistos.  
A percentagem de adsorção é calculada em cada instante  A t i e/ou em 
cada intervalo  A Δt i (de acordo com as necessidades), sendo repre ­
sentada graficamente em função do tempo. Calcula-se também o coeficiente de distribuição no equilíbrio, K
 d , bem como o coeficiente 
de adsorção normalizado em relação ao carbono orgânico, K  oc (apli­
cável a substâncias orgânicas não polares).  
Resultados do ensaio de cinética de adsorção  
De modo geral, o valor linear de K  d é suficientemente preciso para 
descrever o comportamento do solo em termos de adsorção/ ­
dessorção (35) (78), constituindo uma expressão da mobilidade ca ­
racterística da substância no solo. Considera-se, por exemplo, que as 
substâncias com K  d ≤ 1 cm  3 g -1 apresentam uma mobilidade quali ­
tativa apreciável. Além disso, MacCall  et al.  (16) desenvolveram um 
método de classificação da mobilidade com base nos valores de K  oc . 
Existem também sistemas de classificação da lixiviação baseados na 
relação entre K  oc e DT-50 (  1 ) (32) (79).  
Por outro lado, de acordo com os estudos de análise de erros (61), os 
valores de K  d inferiores a 0,3 cm  3 g -1 não podem ser estimados de 
forma rigorosa com base no decréscimo da concentração da fase aquosa, mesmo quando se utiliza a razão solo/solução mais favorável do ponto de vista da precisão, ou seja, 1:1. Neste caso, recomenda-se 
proceder à análise de ambas as fases (solo e solução).
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1207  
( 1 ) DT-50: tempo necessário para a degradação de 50 % da substância em estudo.
 Relativamente às observações  supra , recomenda-se que o estudo do 
comportamento da substância no solo em termos de adsorção, bem 
como da sua mobilidade potencial, seja seguido da determinação das isotérmicas de adsorção de Freundlich para os sistemas que permitam uma determinação rigorosa de K
 d através do protocolo experimental 
descrito no presente método. Essta determinação é possível caso o 
valor resultante da multiplicação de K  d pela razão solo/solução seja 
superior a 0,3, sempre que as determinações sejam baseadas no decréscimo de concentração da fase aquosa (método indirecto), ou 
superior a 0,1, quando se procede à análise de ambas as fases (mé ­
todo directo) (61).
 
1.9.4.  Etapa 3 — Isotérmicas de adsorção e cinética de dessorção/ ­
isotérmicas de dessorção  
1.9.4.1. I s o t é r m i c a s d e a d s o r ç ã o  
Utilizam-se cinco concentrações da substância em estudo, que deve ­
rão abranger, de preferência, duas ordens de grandeza; na selecção 
das referidas concentrações, devem ter-se em conta a solubilidade em 
água e as concentrações de equilíbrio resultantes. Para cada solo, deve utilizar-se ao longo de todo o ensaio a mesma razão solo/ ­
solução. O ensaio de adsorção é efectuado do modo descrito supra, 
embora a fase aquosa seja analisada uma única vez, após o tempo 
necessário para atingir o equilíbrio, estabelecido na etapa 2. Determinam-se as concentrações da solução no equilíbrio, calcu ­
lando-se a quantidade adsorvida com base na perda da substância em 
estudo na solução ou pelo método directo. Representa-se grafica ­
mente a massa adsorvida por unidade de massa do solo em função da concentração de equilíbrio da substância em estudo (ver secção «Apresentação dos resultados»).
 
Resultados do ensaio para a determinação das isotérmicas de adsor ­
ção 
De entre os diversos modelos matemáticos de adsorção propostos, a 
isotérmica de Freundlich constitui um dos mais frequentemente uti ­
lizados para descrever os processos de adsorção. As referências (41) 
(45) (80) (81) (82) fornecem informações mais pormenorizadas sobre 
a interpretação e importância dos modelos de adsorção.  
Nota:  Deve referir-se que a comparação dos valores de K  F (coefi­
ciente de adsorção de Freundlich) de diversas substâncias apenas é possível se os referidos valores forem expressos nas mesmas unida ­
des (83).
 
1.9.4.2. C i n é t i c a d e d e s s o r ç ã o  
O objectivo do ensaio consiste em averiguar a reversibilidade ou 
irreversibilidade da adsorção de uma substância no solo, informação 
importante na medida em que o processo de dessorção desempenha 
um papel considerável no comportamento da substância no solo. Além disso, os dados de dessorção são utilizados na modelização por computador de processos de lixiviação e escoamento de subs ­
tâncias dissolvidas. Caso se pretenda efectuar um estudo de dessor ­
ção, recomenda-se a aplicação do protocolo descrito  infra  a cada 
sistema relativamente ao qual foi possível efectuar uma determinação rigorosa de K
 d no ensaio de cinética de adsorção precedente.  
Tal como no estudo de cinética de adsorção, existem duas opções 
para efectuar o ensaio de cinética de dessorção: a) método paralelo; b) método sequencial. A selecção da metodologia a adoptar é dei ­
xada ao critério do experimentador, que deverá ter em conta as 
condições e os recursos laboratoriais disponíveis.
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a) Método paralelo: para cada tipo de solo seleccionado para o 
ensaio de dessorção, preparam-se amostras com a mesma razão 
solo/solução em número igual ao número de intervalos de tempo em que pretende estudar-se a cinética de dessorção. Devem usar- -se, de preferência, os intervalos de tempo do ensaio de cinética de 
adsorção; pode, contudo, prolongar-se de forma adequada o 
tempo total, de modo a permitir que o sistema atinja o equilíbrio de dessorção. Deve efectuar-se um ensaio em branco para cada tipo de solo e concentração da solução, utilizando uma massa de 
solo e um volume de solução de CaCl
 2 0,01 M idênticos aos do 
ensaio principal, na ausência da substância em estudo. Deve ainda aplicar-se o mesmo procedimento de ensaio a uma amostra de controlo contendo apenas a substância em estudo dissolvida na 
solução de CaCl
 2 0,01 M, na ausência de solo. Agitam-se as 
misturas solo-solução até atingir o equilíbrio de adsorção, como determinado na etapa 2. Procede-se de seguida à separação das fases por centrifugação, recolhendo as fases aquosas na maior 
extensão possível. Os volumes de solução recolhidos são subs ­
tituídos por iguais volumes de CaCl
 2 0,01 M, na ausência de 
substância em estudo, agitando de novo. Removem-se as fases aquosas de modo tão completo quanto possível, efectuando-se 
determinações após, por exemplo, duas h, no caso do primeiro 
tubo, quatro h no caso do segundo, seis h no caso do terceiro, etc. até atingir o equilíbrio de dessorção;
 
b) Método sequencial: após o ensaio de cinética de adsorção, a 
mistura é centrifugada e a fase aquosa remo vida na maior ex ­
tensão possível. O volume de solução removida é substituído por igual volume de CaCl
 2 0,01 M, na ausência da substância em 
estudo. A nova mistura é agitada até atingir o equilíbrio de des ­
sorção. Durante este período, procede-se à centrifugação da mis ­
tura a intervalos regulares, de modo a separar as fases. Determi ­
na-se de imediato a substância em estudo numa pequena alíquota 
da fase aquosa, prosseguindo o ensaio com a mistura original. O 
volume de cada alíquota recolhida deve ser inferior a 1 % do volume total. Adiciona-se à mistura uma quantidade igual de solução de CaCl
 2 0,01 M, com o objectivo de manter a razão 
solo/solução, mantendo a agitação até ao próximo intervalo.  
Calcula-se a percentagem de dessorção em cada instante ( ðD t i Þ) e/ou 
intervalo (ðD Δt i Þ) (de acordo com o objectivo do estudo), represen ­
tando-a graficamente em função do tempo. Calcula-se também o 
coeficiente de dessorção no equilíbrio, K  des . As equações a aplicar 
são fornecidas na secção «Apresentação dos resultados» e no apêndice 5.
 
Resultados do ensaio de cinética de dessorção  
A representação gráfica da percentagem de dessorção  D t i e adsorção  
A t i em função do tempo permite estimar a reversibilidade do pro ­
cesso de adsorção. Caso o equilíbrio de dessorção seja atingido, 
mesmo num tempo duplo do tempo de equilíbrio de adsorção, e a 
dessorção total seja superior a 75 % da quantidade adsorvida, o processo de adsorção é considerado reversível.
 
1.9.4.3. I s o t é r m i c a s d e d e s s o r ç ã o  
As isotérmicas de dessorção de Freundlich são determinadas nos 
solos utilizados no ensaio das isotérmicas de adsorção. O ensaio de dessorção é efectuado em conformidade com o protocolo descrito na secção «Cinética de dessorção», com a única diferença de que a 
fase aquosa é analisada uma única vez, no estado de equilíbrio de 
dessorção. Calcula-se a quantidade de substância em estudo dessor ­
vida, representando graficamente o teor de substância em estudo que permanece adsorvida no solo no estado de equilíbrio de dessorção 
em função da concentração de equilíbrio da substância em estudo na 
solução (ver a secção «Apresentação dos resultados» e o apêndice 5).
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1209
 
2. APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS  
Os dados analíticos são apresentados na forma de quadro (ver apên ­
dice 6). Deve fornecer-se os resultados das várias determinações e as médias calculadas, bem como as representações gráficas das isotér ­
micas de adsorção. Os cálculos são efectuados do modo descrito  
infra.
 
Para os fins do ensaio, considera-se que 1 cm  3 de solução aquosa 
possui a massa de 1 g. Deste modo, a razão solo/solução pode ser expressa em massa/massa ou massa/volume com o mesmo valor numérico.
 
2.1. ADSORÇÃO  
A adsorção ( A t i ) é definida como a percentagem de substância ad ­
sorvida no solo, relativamente à quantidade presente no início do ensaio e nas condições em causa. Caso a substância em estudo 
seja estável e não ocorra uma adsorção significativa nas paredes 
do recipiente, o valor de
 A t i em cada instante t  i é calculado através 
da equação:  
A t i ¼ m ads 
s ðt i Þ·100 
m 0 ð%Þ (3) 
em que:  
A t i = percentagem de adsorção no instante t  i (%); 
m ads 
s ðt i Þ = massa de substância em estudo adsorvida no solo no 
instante t  i (μg); 
m 0 = massa de substância em estudo presente no recipiente 
de ensaio, no início do mesmo ( μg). 
O apêndice 5 fornece informações pormenorizadas sobre o modo de 
cálculo da percentagem de adsorção  A t i tanto no caso do método 
paralelo corno do método sequencial.  
O coeficiente de distribuição K  d é a razão entre o teor de substância 
na fase edáfica e a concentração mássica da mesma na solução 
aquosa ao atingir o equilíbrio de adsorção, nas condições de ensaio.  
K d ¼ C ads 
s ðeqÞ 
C ads 
aq ðeqÞ ¼ m ads 
s ðeqÞ 
m ads 
aq ðeqÞ · V 0 
m soil (cm  3 g -1 ) (4) 
em que:  
C ads 
s ðeqÞ = teor de substância adsorvida no solo no estado de 
equilíbrio de adsorção ( μg g -1 ); 
C ads 
aq ðeqÞ = concentração mássica da substância na fase aquosa 
no estado de equilíbrio de adsorção ( μg cm-  3 ), cuja 
determinação analítica tem em conta os valores ob ­
tidos nos ensaios em branco;  
m ads 
s ðeqÞ = massa de substância adsorvida no solo no estado de 
equilíbrio de adsorção ( μg); 
m ads 
aq ðeqÞ = massa de substância presente na solução, no estado 
de equilíbrio de adsorção ( μg); 
m solo = quantidade de fase edáfica, expressa em massa seca 
de solo (g);  
V 0 = volume inicial de fase aquosa em contacto com o 
solo (cm  3 ). 
A relação entre A  eq e K  d é dada por:  
K d ¼ A eq 
100 Ä A eq · V 0 
m soil (cm  3 g -1 ) (5) ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1210
 
em que:  
A eq = percentagem de adsorção no estado de equilíbrio de 
adsorção, %.  
O coeficiente de adsorção normalizado relativo ao carbono orgânico 
K oc exprime o coeficiente de distribuição K  d em função do teor de 
carbono orgânico da amostra de solo:  
K oc ¼ K d · 100 
%OC  (cm  3 g -1 ) (6) 
em que:  
%OC = percentagem de carbono orgânico na amostra de solo (g 
g- 1 ). 
O coeficiente K  oc constitui um parâmetro característico da partição 
do carbono orgânico entre o solo ou sedimento e a água, nomeada ­
mente no caso de compostos orgânicos não polares. Existe uma correlação entre a adsorção das referidas substâncias e o teor de 
carbono orgânico do sólido adsorvente (7); os valores de K
 nc depen­
dem das características específicas das fracções húmicas cuja capa ­
cidade de adsorção diferem de modo considerável, devido, nomea ­
damente, à sua origem ou génese diversa.  
2.1.1.  Isotérmicas de adsorção  
A equação que exprime as isotérmicas de adsorção de Freundlich 
relaciona a quantidade de substância em estudo adsorvida com a 
concentração da substância em estudo na solução, no estado de equilíbrio (equação 8).
 
Os dados são processados de modo idêntico ao descrito na secção 
«Adsorção», calculando-se, para cada recipiente de ensaio, o teor de 
substância em estudo adsorvida no solo após o ensaio de adsorção [
C ads 
s ðeqÞ, por vezes designado por x/m]. Presume-se que o equilí ­
brio foi atingido e que  C s ads ðeqÞ representa o valor no estado de 
equilíbrio:  
C ads 
s ðeqÞ ¼ m ads 
s ðeqÞ 
m soil ¼ h 
C 0 Ä C ads 
aq ðeqÞ i
: V 0 
m soil (μg g  -1 ) (7) 
A equação de adsorção de Freundlich é dada por (8):  
C ads 
s ðeqÞ ¼ K ads 
F Ö C ads 
aq ðeqÞ 1=n (μg g  -1 ) (8) 
ou, na forma linear:  
logC  ads 
s ðeqÞ ¼ logK  ads 
F þ 1=n·logC  ads 
aq ðeqÞ (9) 
em que:  
K ads 
F = Coeficiente de adsorção de Freundlich, cujas dimensões 
são de cm  3 g -1 apenas nos casos em que l/n = 1: em 
todos os restantes casos, o declive l/n é introduzido na dimensão de
 K ads 
F (μg 1-1/n (cm  3 ) 1/n g -1 ); 
n = constante de regressão; l/n situa-se, de modo geral, entre 
0,7 e 1,0, mostrando que os dados de adsorção/ ­
dessorção são, com frequência, ligeiramente não linea ­
res. 
Aplicam-se as equações (8) e (9), sendo os valores de  K F ads e l/n 
calculados por regressão linear, com o auxílio da equação 9. Calcula- 
-se também o coeficiente de correlação r  2 da equação logarítmica. A 
figura 2 fornece um exemplo das representações em causa.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1211
 
Figura 2.  Gráficos de adsorção de Freundlich (normal e linearizado)  
2.1.2.  Balanço de massas  
O balanço de massas (MB) é definido como a percentagem de subs ­
tância inicialmente presente que pode ser analiticamente recuperada na sequência de um ensaio de adsorção.
 
O tratamento dos dados é diferente no caso de solventes totalmente 
miscíveis em água, podendo aplicar-se o método descrito na secção 
«Dessorção» para determinar a quantidade de substância recuperada por extracção com solvente. Se o solvente for menos miscível em água, deve determinar-se a quantidade recuperada.
 
O balanço de massas MB do processo de adsorção é calculado do 
modo que se segue; assume-se que o termo (m  E ) corresponde à soma 
das massas da substância em estudo extraídas do solo e das paredes do recipiente de ensaio com um solvente orgânico:
 
MB ¼ V rec ·C ads 
aq ðeqÞ þ m  E Ê Ì  
·100 
V 0 ·C 0 ð%Þ (10) 
em que:  
MB = balanço de massas (%);  
m L = massa total de substância em estudo extraída do solo e 
das paredes do recipiente de ensaio em duas etapas ( μg); 
C 0 = concentração inicial da solução de ensaio em contacto 
com o solo ( μg cm  -3 ): 
V rec = volume de sobrenadante recuperado após atingir o equilí ­
brio de adsorção (cm  -3 ). 
2.2. DESSORÇÃO  
A dessorção (D) é definida como a percentagem dessorvida de subs ­
tância em estudo, relativamente à quantidade previamente adsorvida, nas condições de ensaio:
 
D t i ¼ m des 
aq ðt i Þ 
m ads 
s ðeqÞ ·100ð%Þ (11) 
em que:  
D t i = percentagem de dessorção no instante t  i (%); ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1212
 
m des 
aq ðt i Þ = massa de substância em estudo dessorvida do solo no 
instante t  i (μg); 
m ads 
s ðeqÞ = massa de substância em estudo adsorvida no solo no 
estado de equilíbrio de adsorção ( μg). 
O apêndice 5 fornece directrizes para o cálculo da percentagem de 
dessorção  D t i no caso dos métodos paralelo e sequencial.  
O coeficiente de dessorção aparente (K  des ) é a razão entre a quanti ­
dade de substância que permanece na fase edáfica e a concentração mássica da substância dessorvida na solução aquosa, ao atingir o estado de equilíbrio de dessorção, nas condições de ensaio:
 
K des ¼ m ads 
s ðeqÞ Ä m des 
aq ðeqÞ V T 
m des 
aq ðeqÞ m  soil (cm  3 g -1 ) (12) 
em que:  
K des = coeficiente de dessorção (cm  3 g- 1 ); 
m des 
aq ðeqÞ = massa total de substância em estudo dessorvida do 
solo no estado de equilíbrio de dessorção ( μg); 
V t = volume total da fase aquosa em contacto com o solo 
durante o ensaio de cinética de dessorção (cm  3 ). 
A secção «Dessorção» do apêndice 5 fornece directrizes para o 
cálculo de  m des 
aq ðeqÞ. 
Nota:  
Caso o ensaio de adsorção precedente tenha sido efectuado pelo 
método paralelo, considera-se que o volume V  T da equação (12) é 
igual a V  0 . 
2.2.1.  Isotérmicas de dessorção  
A equação que exprime as isotérmicas de dessorção de Freundlich 
relaciona o teor de substância em estudo que permanece adsorvida no solo com a concentração de substância em estudo presente na 
solução no estado de equilíbrio de dessorção (equação 16).
 
Para cada recipiente de ensaio, o teor de substância que permanece 
adsorvida no solo no estado de equilíbrio de dessorção é calculado através da equação:
 
C des 
s ðeqÞ ¼ m ads 
s ðeqÞ Ä m des 
aq ðeqÞ 
m soil (μg g  -1 ) (13) 
m des 
aq ðeqÞ é definida como:  
m des 
aq ðeqÞ ¼ m des 
m ðeqÞ· V 0 
V r F Ä m A 
aq (μg) (14) 
em que:  
C des 
s ðeqÞ = teor de substância em estudo que permanece adsor ­
vida no solo no estado de equilíbrio de dessorção (μg g
 -1 ): 
m des 
m ðeqÞ = massa de substância determinada analiticamente na 
fase aquosa, no estado de equilíbrio de dessorção 
(μg); ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1213
 
m A 
aq = massa de substância em estudo remanescente do 
equilíbrio de adsorção devido a uma substituição 
incompleta de volumes ( μg); 
m des 
aq ðeqÞ = massa de substância na solução no estado de equilí ­
brio de adsorção ( μg); 
m A 
aq ¼ m ads 
aq ðeqÞ· V 0 Ä V R 
V 0 Í Î  (15) 
V r F = volume de solução recolhido do recipiente para determina ­
ção da substância em estudo, no estado de equilíbrio de 
dessorção (cm  3 ); 
V R = volume de sobrenadante removido do tubo ao atingir o 
estado de equilíbrio de adsorção e substituído pelo mesmo volume de solução de CaCl
 2 0,01 M (cm  3 ); 
A equação de dessorção de Freundlich é dada por (16):  
C des 
s ðeqÞ ¼ K des 
F ·C des 
aq ðeqÞ 1=n (μg g  -1 ) (16) 
ou, na forma linear:  
logC  des 
s ðeqÞ ¼ logK  des 
F þ 1=n·logC  des 
aq ðeqÞ (17) 
em que:  
K des 
F = coeficiente de dessorção de Freundlich;  
n = constante de regressão;  
C des 
aq ðeqÞ = concentração mássica da substância na fase aquosa, 
no estado de equilíbrio de dessorção ( μg cm  -3 ). 
As equações (16) e (17) podem ser representadas graficamente, cal ­
culando-se os valores de  K des 
F e l/n por regressão linear, através da 
equação 17.  
Nota:  
Caso o expoente l/n da equação de adsorção ou dessorção de Freun ­
dlich seja unitário, a constante de adsorção ou dessorção de Freun ­
dlich ( K ads 
F e K des 
F ) é igual à constante de equilíbrio de adsorção ou 
dessorção (K  d e K  des) , respectivamente, sendo lineares as represen ­
tações de C  s em função de C  aq . Caso os referidos expoentes sejam 
diferentes de 1, a representação de C  s versus  C aq será não linear, 
variando as constantes de adsorção e dessorção ao longo das isotér ­
micas.  
2.2.2.  Relatório do ensaio  
O relatório do ensaio deverá incluir as seguintes informações:  
— Identificação completa das amostras de solo utilizadas, incluindo:  
— identificação geográfica do local (latitude, longitude),  
— data de recolha das amostras,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1214
 
— perfil de utilização do solo (por exemplo, solo agrícola, florestal, 
etc.),  
— profundidade da recolha de amostras,  
— teor de areia/sedimentos/argila,  
— valores de pH (em solução de CaCl  2 0,01 M),  
— teor de carbono orgânico,  
— teor de matéria orgânica,  
— teor de azoto,  
— razão C/N,  
— capacidade de permuta catiónica (mmol/kg),  
— todas as informações relativas à recolha e armazenagem das 
amostras de solo,  
— se adequado, quaisquer informações relevantes para a interpreta ­
ção dos processos de adsorção-dessorção da substância em estu ­
do, 
— referência aos métodos utilizados para a determinação de cada 
parâmetro,  
— informações adequadas sobre a substância em estudo,  
— temperatura de ensaio,  
— condições de centrifugação,  
— processo analítico utilizado para a análise da substância em es ­
tudo,  
— justificação do eventual recurso a um agente de solubilização na 
preparação da solução-mãe da substância em estudo,  
— explicação das correcções efectuadas nos cálculos, se for caso 
disso,  
— dados apresentados em conformidade com o formulário do apên ­
dice 6 e representações gráficas,  
— quaisquer informações e observações úteis para a interpretação 
dos resultados do ensaio.  
3. REFERÊNCIAS  
(1) Kukowski H. and Brümmer G., (1987). Investigations on the 
Adsorption and Desorption of Selected Chemicals in Soils. 
UBA Report 106 02045, Part II.  
(2) Fränzle O., Kuhnt G. and Vetter L., (1987). Selection of 
Representative Soils in the EC-Territory. UBA Report 106 02045, Part I.
 
(3) Kuhnt G. and Muntau H. (Eds.) EURO-Soils: Identification, 
Collection, Treatment, Characterisation. Special Publication No 1.94.60, Joint Research Centre. European Commission, ISPRA, December 1994.
 
(4) OECD Test Guidelines Programme, Final Report of the OECD 
Workshop on Selection of Soils/Sediments, Belgirate, Italy, 
18-20 January 1995 (June 1995).  
(5) US Environment Protection Agency: Pesticide Assessment 
Guidelines, Subdivision N, Chemistry: Environmental Fate. 
Series 163-1, Leaching and Adsorption/Desorption Studies, 
Addendum 6 on Data Reporting, 540/09-88-096, Date: 1/1988.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1215
 
(6) US Environment Protection Agency: Prevention, Pesticides and 
Toxic Substances, OPPTS Harmonized Test Guidelines, Series 
835-Fate. Transport and Transformation Test Guidelines, OPPTS No: 835.1220 Sediment and Soil Adsorption/ ­
Desorption Isotherm. EPA No: 712-C-96-048, April 1996.
 
(7) ASTM Standards, E 1195-85, Standard Test Method for De ­
termining a Sorption Constant (K  oc ) for an Organic Chemical 
in Soil and Sediments.  
(8) Agriculture Canada: Environmental Chemistry and Fate. Gui ­
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 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1220
 
Apêndice 1  
Protocolo de ensaio
  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1221
 
Apêndice 2  
INFLUÊNCIA DO RIGOR DO MÉTODO ANALÍTICO E DAS 
ALTERAÇÕES DE CONCENTRAÇÃO NOS RESULTADOS DE 
ADSORÇÃO  
A análise do quadro infra (84) torna evidente que, caso a diferença entre a massa 
inicial (m  0 = 110 μg) e a massa de equilíbrio ( m ads 
aq ðeqÞ = 100 μg] da substância 
em estudo na solução seja bastante reduzida, um erro de 5 % na determinação da concentração de equilíbrio resulta num erro de 50 % no cálculo do teor de substância adsorvida no solo (
m ads 
s ðeqÞ e de 52,4 % no cálculo de K  d . 
Quantidade de solo m  solo = 10 g 
Volume de solução V  0 = 100 cm  3 
m ads 
aq ðeqÞ 
(μg) C aq ads ðeqÞ 
(μg cm-  3 ) R m s ads ðeqÞä 
(μg) C s ads ðeqÞä 
(μg g  -1 ) R‡ K  d * R‡  
A = 9 %
 m 0 ¼ 110 μg ou 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
100 1,000 valor real 10 1,00 valor real 1 
101 1,010 1 % 9 0,90 10 % 0,891 10,9 % 105 1,050 5 % 5 0,50 50 % 0,476 52,4 % 
109 1,090 9 % 1 0,10 90 % 0,092 90,8 %  
A = 55 %
 m 0 ¼ 110 μg ou 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
50,0 0,500 valor real 60,0 6,00 valor real 12,00 
50,5 0,505 1 % 59,5 5,95 0,8 % 11,78 1,8 % 
52,5 0,525 5 % 57,5 5,75 4,0 % 10,95 8,8 % 55,0 0,550 10 % 55,0 5,50 8,3 % 10,00 16,7 %  
A = 99 %
 m 0 ¼ 110 μg ou 
C 0 ¼ 1; 100 μg=cm3 
1,100 0,011 valor real 108,9 10,89 valor real 990 
1,111 0,01111 1 % 108,889 10,8889 0,01 % 980 1,0 % 
1,155 0,01155 5 % 108,845 10,8845 0,05 % 942 4,8 % 
1,21 0,0121 10 % 108,790 10,8790 0,10 % 899 9,2 %  
onde: 
äm ads 
s ðeqÞ = m  0 Ä m ads 
aq ðeqÞ; C ads 
s ðeqÞ ¼ ½C 0 Ä C ads 
aq ðeqÞâ V 0 
m soil: Kd ¼ m ads 
s ðeqÞ 
m ads 
aq ðeqÞ V 0 
m soil 
m ads 
s ðeqÞ = massa da substância em estudo no solo, no estado de equilíbrio, μg 
m ads 
aq ðeqÞ = massa da substância em estudo na fase aquosa, no estado de equilíbrio, μg 
C ads 
s ðeqÞ = teor da substância em estudo no solo, no estado de equilíbrio, μg g -1 
C ads 
aq ðeqÞ = concentração mássica da substância em estudo na fase aquosa, no estado de equilíbrio, μg cm-  3 
R = erro analítico na determinação de  m ads 
aq ðeqÞ; 
R‡ = erro calculado devido ao erro analítico R.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1222
 
Apêndice 3  
TÉCNICAS DE ESTIMATIVA DE K  D 
1. O recurso a técnicas de estimativa permite prever o valor de K  d com base 
na correlação, nomeadamente com os valores de P  ow (12) (39) (63-68), 
solubilidade em água (12) (19) (21) (39) (68-73) ou polaridade decorrentes 
da análise por HPLC de fase reversa (74-76) Como se mostra nos quadros 
1 e 2, os valores de K  oc e K  om são calculados com base nas equações que 
se seguem, sendo o valor de K  d determinado de forma indirecta:  
K oc ¼ K d · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ K  om ¼ K d 
1; 724 · 100 
%oc ðcm 3 g Ä1 Þ 
2. As referidas correlações baseiam-se em dois pressupostos: (1) o teor de 
matéria orgânica de um solo é o principal factor determinante da adsorção 
de uma substância nesse solo: (2) as interacções envolvidas são principal ­
mente não polares. Em consequência, as referidas correlações: (1) não são aplicáveis, ou apenas são parcialmente aplicáveis, a substâncias polares: (2) não são aplicáveis aos casos em que o teor de matéria orgânica dos solos 
seja bastante reduzido (12). Além disso, embora seja possível obter corre ­
lações satisfatórias entre os valores de P
 ow e da adsorção (19), o mesmo 
não sucede no que respeita à relação entre a solubilidade em água e a extensão da adsorção (19) (21): os estudos realizados até ao presente 
têm-se revelado bastante contraditórios.
 
3. Os quadros 1 e 2, respectivamente, fornecem alguns exemplos de correla ­
ções entre os coeficientes de adsorção e os coeficientes de partição octanol- -água, bem como a solubilidade em água.
 
Quadro 1.  
Exemplos de correlações entre o coeficiente de distribuição de adsorção e o coeficiente de partição octanol- 
-água: para mais exemplos, ver as referências (12) (68)  
Substâncias Correlações Autores  
Diversos pesticidas log K  om = 0,69 + 0,52 log P  ow Briggs (1981) (39) 
Compostos aromáticos clora ­
dos log K  oc = - 0,779 + 0,904 log P  ow Chiou  et al . (1983) (65) 
Diversos pesticidas log K  om = 4,4 + 0,72 log P  ow Gerstl e Mingelgrin (1984) (66) 
Hidrocarbonetos aromáticos log K  oc = - 2,53 + 1,15 log P  ow Vowles e Mantoura (1987) (67)  
Quadro 2.  
Exemplos de correlações entre o coeficiente de distribuição de adsorção e a solubilidade em água; para mais 
exemplos, ver as referências (68) (69)  
Substâncias Correlações Autores  
Diversos pesticidas log K  om = 3,8 - 0,561 log S  w Gerstl e Mingelgrin (1984) (66) 
Compostos alifáticos e aro ­
máticos clorados log K  om = (4,040 +/- 0,038) - (0,557 
+/- 0,012) log S  w Chiou  et al . (1979) (70) 
α-naphtol log K  oc = 4,273 - 0,686 log S  w Hasset et al. (1981) (71) 
Compostos cíclicos (alifáti ­
cos e aromáticos log K  oc = - 1,405 - 0,921 log S  w - 
0,00953 (mp-25) Karickhoff (1981) (72) 
Diversas substâncias log K  om = 2,75 - 0,45 log S  w Moreale van Blade (1982) (73)  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1223
 
Apêndice 4  
CÁLCULOS PARA A DEFINIÇÃO DAS CONDIÇÕES DE 
CENTRIFUGAÇÃO  
1. O tempo de centrifugação é dado pela seguinte fórmula, presumindo que as 
partículas possuem forma esférica:  
t ¼ 9 
2 η 
ω 2 rp 2 ρ s Ä ρ aq Ä Ö " #  
ln ðR b=R t Þ (1) 
Por motivos de simplificação, todos os parâmetros são apresentados em 
unidades não pertencentes ao SI (g, cm).  
ω = velocidade angular (=2 π rpm/60), rad s  -1 ; 
rpm = rotações por minuto;  
η = viscosidade da solução, g s  -1 cm -1 ; 
r p = raio das partículas, cm;  
p s = densidade do solo, g cm  -3 ; 
p aq = densidade da solução, g cm  -3 ; 
R t = distância do centro do rotor da centrifugadora ao topo da so ­
lução no tubo de ensaio, cm;  
R b = distância do centro do rotor da centrifugadora à base do tubo 
de ensaio, cm;  
R b -R t = altura da mistura solo/solução no tubo de ensaio, cm.  
Na prática, devem utilizar-se tempos duplos dos calculados, de modo a 
garantir a separação completa.  
2. A equação (1) pode ser simplificada, considerando que a viscosidade ( η) e 
a densidade (p  aq ) da solução são iguais à viscosidade e densidade da água a 
25 o C; obtém-se, assim, n = 8,95 × 10  -3 g s -1 cm -1 and p  aq = 1,0 g, cm  -3 . 
O tempo de centrifugação é dado pela fórmula (2):  
t ¼ 3:7 
rpmð Þ  2 · r p 2 ρ s Ä 1ð Þ  ln R b 
R t (2) 
3. A equação 2 mostra a importância de dois parâmetros, designadamente o 
tempo (t) e a velocidade (rpm), na definição das condições de centrifugação 
tendo cm vista a separação de partículas de dimensões específicas (no caso em estudo 0,1 um radianos): (1) a densidade do solo e (2) a altura da mistura no tubo de ensaio (R
 b -R t ), ou seja, a distância entre o topo da 
solução e a base do tubo; como é óbvio, para um determinado volume, a 
altura da mistura no tubo depende do quadrado do respectivo raio.  
4. A figura 1 apresenta o gráfico da variação do tempo de centrifugação (t) 
em função da velocidade de centrifugação (rpm), para solos de densidades diversas (p
 s ) (fig. 1a) e diversas alturas da mistura nos tubos de ensaio (fig. 
lb). A figura 1a evidencia a influência da densidade do solo; por exemplo, 
para um perfil de centrifugação clássico de 3 000 rpm o tempo de cen ­
trifugação é da ordem de 240 minutos para um solo de 1,2 g cm  3 de 
densidade, sendo de apenas 50 minutos para uma densidade de 2,0 g cm
 3 . Do mesmo modo, a figura lb mostra que, para um perfil de cen ­
trifugação clássico de 3 000 rpm o tempo de centrifugação é de cerca de 
50 minutos para uma altura da mistura de 10 cm e apenas 7 minutos para uma altura de 1 cm. Todavia, é conveniente adoptar um equilíbrio ade ­
quado entre o requisito de menor altura possível na centrifugação e a 
facilidade de manipulação pelo experimentador na separação das fases 
após a centrifugação.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1224
 
5. Além disso, na definição das condições experimentais para a separação de 
fases solo/solução é conveniente ter em conta a possível existência de uma 
«pseudofase» coloidal. As partículas coloidais, de diâmetro inferior a 0,2 μm, podem apresentar um impacto considerável no mecanismo de 
adsorção de uma substância numa suspensão de solo. Sempre que se exe ­
cuta uma centrifugação do modo descrito  supra,  os colóides permanecem 
na fase aquosa, sendo objecto de análise juntamente com esta última. Perdem-se, pois, as informações referentes ao seu impacto.
 
Caso o laboratório possua condições para efectuar ultracentrifugação ou 
ultrafiltração, a adsorção/dessorção de uma substância no solo pode ser 
estudada de modo mais aprofundado, permitindo obter informações sobre 
a adsorção da substância nos colóides. Neste caso, deve efectuar-se uma ultracentrifugação a 60 000 rpm/minuto ou uma ultrafiltração com um filtro de 100 000 Daltons de porosidade, de modo a separar as três fases (solo, 
colóides, solução). O protocolo de ensaio deve também ser alterado de 
modo a assegurar a determinação da substância em estudo nas três fases.
 
Fig. 1a.
  
Variação do tempo de centrifugação (t) em função da velocidade de cen ­
trifugação (rpm), para solos de diversas densidades ( ρ s ). R  t = 10 cm, R  b -R t 
= 10 cm, η = 8,95 × 10  -3 g s -1 cm -1 e ρ aq = 1,0 g.cm  -3 a 25  o C. 
Fig. lb.
  
Variação do tempo de centrifugação (t) em função da velocidade de cen ­
trifugação (rpm) para diversas alturas da mistura nos tubos de ensaio (R|,-R,) - L; R
 t = 10 cm, η = 8,95 × 10  -3 g s -1 cm -1 , ρ aq = 1,0 g.cm  -3 a 
25 o C e ρ s = 2,0 g cm  -3 . ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1225
 
Apêndice 5  
CÁLCULO DA ADSORÇÃO A ( %) E DA DESSORÇÃO D ( %)  
O esquema cronológico do ensaio é o seguinte:
  
Em todos os cálculos, presume-se que a substância de ensaio é estável e não 
exibe uma adsorção significativa nas paredes do recipiente.  
ADSORÇÃO A (A %)  
a) Método paralelo  
Para cada tubo de ensaio (i), a percentagem de adsorção em cada instante 
(t j ) é calculada de acordo com a equação:  
A t i ¼ m ads 
s ðt i Þ · 100 
m 0 (%) (1) 
Os termos da equação podem ser calculados do seguinte modo: 
m 0 = C  0 · V 0 (μg) (2)  
m ads 
s ðt i Þ ¼ m 0 Ä C ads 
aq ðt i Þ · V 0 (μg) (3) 
em que:  
A t i = percentagem de adsorção ( %) no instante t  j ; 
m ads 
s ðt i Þ = massa da substância em estudo presente no solo no instante 
t j em que a análise é efectuada ( μg) 
m 0 = massa da substância em estudo presente no tubo de ensaio 
no início do mesmo ( μg) 
C 0 = concentração ponderal inicial da solução em contacto com o 
solo (μg cm  -3 ) ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1226
 
C ads 
aq ðt i Þ = concentração ponderal da substância na fase aquosa no ins ­
tante t  i em que a análise é efectuada ( μg cm  -3 ): a determi ­
nação analítica desta concentração tem em conta os valores obtidos nos ensaios em branco.
 
V 0 = volume inicial de solução em contacto com o solo (cm  3 ). 
Os valores relativos à percentagem de adsorção  A t i ou C ads 
aq ðt i Þ são repre ­
sentados graficamente em função do tempo, determinando-se o tempo ne ­
cessário para atingir o estado de equilíbrio. As figuras 1 e 2, respectiva ­
mente, fornecem exemplos das representações em causa.
  
Figura 1 . 
Representação gráfica do equilíbrio de adsorção
  
Fig. 2 . 
Concentraçào mássica da substáncia em estudo na fase aquosa (C  aq ) em 
funçào do tempo  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1227
 
b) Método sequencial  
As equaçóes que se seguem tém em consideraçào o facto de o ensaio de 
adsorçào se basear em determinaçóes da substáncia em estudo em pequenas alíquotas da fase aquosa, a intervalos específicos.
 
— A quantidades de substáncia adsorvida no solo em cada intervalo é 
calculada do seguinte modo:  
— princiro intervalo Δt 1 = t 1 - t 0 
m ads 
s ðΔt 1 Þ ¼ m 0 Ä m ads 
m ðt 1 Þ · Í 
V 0 
v a A Î (4) 
— segundo intervalo Δt2 = t  2 - t 1 
m ads 
s ðΔt 2 Þ ¼ m ads 
m ðt 1 Þ · Í 
V 0 
v a A Î 
Ä m ads 
m ðt 2 Þ · Í 
V 0 Ä v a A 
v a A Î (5) 
— terceiro intervalo Δt3 = t  3 - t 2 
m ads 
s ðΔt 3 Þ ¼ m ads 
m ðt 2 Þ · Í 
V 0 Ä v a A 
v a A Î 
Ä m ads 
m ðt 3 Þ · Í 
V 0 Ä 2 · v a A 
v a A Î (6) 
— enésimo intervalo Δtn = t  n - t n-1 
m ads 
s ðΔt n Þ ¼ m ads 
m ðt nÄ1 Þ · Í 
V 0 Ä ðn Ä 2Þ · v a A 
v a A Î 
Ä m ads 
m ðt n Þ · V 0 Ä ðn Ä 1Þ · v a A Ä Ö  
v a A Í Î  (7) 
— A percentagem de adsorção em cada intervalo,  A Δt i , é calculada por 
recurso à seguinte equação:  
A Δt i ¼ m ads 
s ðΔt i Þ 
m 0 · 100ð%Þ (8) 
enquanto que a percentagem de adsorção  ðA t i Þ no instante t  i é dada por:  
A t i ¼ Σ Δt i 
j ¼ Δt 1 m ads 
s ðjÞ 
m 0 · 100 ð%Þ (9) 
Os valores correspondentes à adsorção,  A t i ou A Δt i (de acordo com o 
objectivo do estudo) são representados graficamente em função do 
tempo, determinando-se o tempo necessário para atingir o estado de equilíbrio.
 
— No instante de equilíbrio t  eq : 
— a massa de substância em estudo adsorvida no solo é dada por:  
m ads 
s ðeqÞ ¼ Σ n 
Δt i ¼ 1 m ads 
s ðΔt i Þ (10) ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1228
 
— a massa de substância em estudo na solução é dada por:  
m ads 
aq ðeqÞ ¼ m 0 Ä Σ n 
Δt i ¼ 1 m ads 
s ðΔt i Þ (11) 
— a percentagem de adsorção no estado de equilíbrio é calculada com 
base na equação:  
A eq ¼ m ads 
s ðeqÞ 
m 0 · 100 ð%Þ (12) 
Os parâmetros utilizados são definidos do seguinte modo:  
m ads 
s ðΔt 1 Þ; m ads 
s ðΔt 2 Þ; :::; m ads 
s ðΔt n Þ = massa de substância adsorvida no 
solo nos intervalos Δ t1 , Δ t2 ,..., Δ tn 
respectivamente ( μg); 
m ads 
m ðt 1 Þ; m ads 
m ðt 2 Þ; :::; m ads 
n ðt n Þ = massa de substância em estudo 
determinada numa alíquota  
m ads 
s ðeqÞ nos intervalos t  1 , t 2 ,t n 
respectivamente ( μg); 
m ads 
s ðeqÞ = massa de substância adsorvida no 
solo no estado de equilíbrio de adsorção ( μg);
 
m ads 
aq ðeqÞ = massa de substância presente na 
solução no estado de equilíbrio 
de adsorção ( μg); 
v a A = volume da alíquota em que se 
determina a substância em estudo 
(cm  3 ); 
A Δt i = percentagem de adsorção corres ­
pondente ao intervalo Δt i ( %);  
A eq = percentagem de adsorção no es ­
tado de equilíbrio de adsorção 
( %).  
DESSORÇÃO D ( %)  
Considera-se que o ensaio de cinética de dessorção tem início no instante t  0 em 
que o volume máximo recuperado da solução da substância em estudo (após 
atingir o equilíbrio de adsorção) é substituído pelo mesmo volume de solução de 
CaCl  2 , 0,01 M.  
a) Método paralelo  
Num determinado instante t  i , determina-se a massa da substância em estudo 
presente na fase aquosa recolhida do tubo i  V  i 
r Ä Ö  
, calculando-se a massa 
dessorvida de acordo com a equação:  
m des 
aq ðt i Þ ¼ m des 
m ðt i Þ · Í 
V 0 
v r i Î 
Ä m A 
aq (13) 
No estado de equilíbrio de dessorção, t  i = t  eq e, portanto,  m  des 
aq ðt i Þ = 
m des 
aq ðeqÞ 
A massa de substância em estudo dessorvida no intervalo At  i é dada pela 
equação:  
m des 
aq ðΔt i Þ ¼ m des 
aq ðt i Þ Ä Σ i ¼ 1 
j ¼ 1 m des 
aq ðjÞ (14) 
A percentagem de dessorção é calculada do seguinte modo:  
num instante t  i , com base na equação:  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1229
 
D t i ¼ m des 
aq ðt i Þ 
m ads 
s ðeqÞ · 100 ð%Þ (15) 
num intervalo At  i , com base na equação:  
D Δt i ¼ m des 
aq ðΔt i Þ 
m ads 
s ðeqÞ · 100 ð%Þ (16) 
em que:  
D t i = percentagem de dessorção no instante t  i (%); 
D Δt i = percentagem de dessorção correspondente ao intervalo Δt i 
(%); 
m des 
aq ðt 1 Þ = massa de substância em estudo dessorvida no instante t  i , 
(μg); 
m des 
aq ðΔt 1 Þ = massa de substância em estudo dessorvida no intervalo Δt i 
(μg); 
m des 
m ðt i Þ = massa de substância em estudo determinada analitica ­
mente no instante t  i num volume  V i 
r ,de solução recolhida 
para análise ( μg); 
m A 
aq = massa de substância em estudo excluída do equilíbrio de 
adsorção devido a substituição incompleta de volumes (μg).
 
m A 
aq ¼ m ads 
aq ðeqÞ · V 0 Ä V R 
V 0 Í Î  (17) 
m ads 
aq ðeqÞ = massa de substância em estudo presente na soluçào no estado 
equilíbrio de adsorçào ( μg). 
V R = volume de sobrenadante removido do tubo depois de atingido 
o estado de equilíbrio de adsorçào e substituído pelo mesmo 
de soluçào de CaCl  2 0,01 M (cm  3 ): 
V r i = volume de soluçào recolhido do tubo (i) para a determinaçào da 
substância em estudo, no ensaio de cinética de dessorçào (cm  3 ) 
Os valores correspondentes à dessorção  D t i or D Δt i (de acordo com o 
objectivo do estudo) são representados graficamente em função do tempo, 
determinando-se o tempo necessário para atingir o estado de equilíbrio.  
b) Método sequencial  
As equações que se seguem têm em consideração o facto de o ensaio de 
adsorção precedente se basear em determinações da substância em estudo em 
pequenas alíquotas (  v A 
a Ä Ö  
) da fase aquosa (método sequencial descrito na sec ­
ção 1.9. «Realização do ensaio»). Presume-se que: a) o volume de sobrenadante removido do tubo na sequência do ensaio de cinética de adsorção foi substituído pelo mesmo volume de solução de CaCl
 2 0,01 M (V  R ); e b) o volume total da 
fase aquosa em contacto com o solo (V  T ) durante o ensaio de cinética de 
dessorção permanece constante, sendo dado pela equação:  
V T ¼ V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v a A ðiÞ (18) ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1230
 
Num determinado instante t  i : 
— Determina-se a massa da substância em estudo presente numa pequena 
alíquota (ðv a D Þ), calculando-se a massa dessorvida de acordo com a 
equação:  
m des 
aq ðt i Þ ¼ m des 
m ðt i Þ · Í V T 
v D 
a Î 
Ä m A 
aq · V T Ä ði Ä 1Þ · v D 
a Ä Ö  
V T Í Î  (19) 
— No estado de equilíbrio de dessorção t  i = t eq e, portanto,  m des 
aq ðt i Þ = 
m des 
aq ðeqÞ. 
— A percentagem de dessorção  D t i é calculada por recurso à equação:  
D t i ¼ m des 
aq ðt i Þ 
m ads 
s ðeqÞ · 100 ð%Þ (20) 
Num intervalo ( Δt i ): 
A quantidade de substância dessorvida em cada intervalo é calculada do 
seguinte modo:  
— primeiro intervalo Δt i = t 1 -t 0 
m des 
aq ðΔt 1 Þ ¼ m des 
m ðt 1 Þ · Í 
V T 
v D 
a Î 
Ä m A 
aq and m  des 
s ðt 1 Þ ¼ m aq 
s ðeqÞ Ä m des 
aq ðΔt 1 Þ (21) 
— segundo intervalo Δt i = t 2 -t 1 
m des 
aq ðΔt 2 Þ ¼ m des 
m ðt 2 Þ · Í 
V T 
v D 
a Î 
Ä m des 
aq ðΔt 1 Þ · V T Ä v D 
a Ä Ö  
V T Í Î 
Ä m A 
aq · V T Ä v D 
a Ä Ö  
V T Í Î  
and 
m des 
s ðt 2 Þ ¼ m ads 
s ðeqÞ Ä m  des 
aq ðΔt 1 Þ þ m des 
aq ðΔt 2 Þ h i  (22) 
— enésimo intervalo Δt n = t n -t n-1 
m des 
aq ðΔt n Þ ¼ Ï 
m des 
m ðt n Þ · V T 
v a D Í Î 
Ä m A 
aq · V T Ä n Ä 1ð Þ  · v D 
a Ä Ö  
V T Í Î  
Ä Σ nÄ1 
i ¼ 1; n ≠ 1 V T Ä n Ä ið Þ  · v D 
a Ä Ö  
V T · m des 
aq ðΔt i Þ Í Î  # 
and 
m des 
s ðt n Þ ¼ m  ads 
s ðeqÞ Ä Σ n 
i ¼ 1; n ≠ 1 m des 
aq ðΔt i Þ (23) 
Por fim, a percentagem de dessorção em cada intervalo,  D Δt i , é calculada 
por recurso à seguinte equação:  
D Δt i ¼ m des 
aq ðΔt i Þ 
m ads 
s ðeqÞ · 100 ð%Þ (24) 
enquanto que a percentagem de dessorção  D t i no instante t  i é dada por:  
D t i ¼ Σ Δt i 
j ¼ Δt 1 m des 
aq ðjÞ 
m ads 
s ðeqÞ · 100 ¼ m des 
aq ðt i Þ 
m ads 
s ðeqÞ · 100 ð%Þ (25) ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1231
 
os parâmetros supra são definidos do seguinte modo:  
m des 
s ðΔt 1 Þ, m des 
s ðΔt 2 Þ,... , m des 
s ðΔt n Þ = massa de substância que per ­
manece adsorvida no solo nos intervalos Δt
 1 , Δt 2 ,..., Δt n res­
pectivamente ( μg); 
m des 
aq ðΔt 1 Þ, m des 
aq ðΔt 2 Þ,... , m des 
aq ðΔt n Þ = massa de substância em estudo 
dessorvida nos intervalos Δt 1 , 
Δt 2 ,..., Δt n respectivamente ( μg); 
m des 
m ðt 1 Þ, m des 
m ðt 2 Þ,... , m des 
m ðt n Þ = massa de substância determi ­
nada numa alíquota  ðv D a Þ nos 
instantes t  1 ,t 2 ,..., t  n , respectiva ­
mente (μg); 
V T = volume total da fase aquosa em 
contacto com o solo durante o ensaio de cinética de dessorção 
efectuado pelo método sequen ­
cial (cm
 3 ); 
m A 
aq = massa de substância em estudo 
excluído do equilíbrio de adsor ­
ção devido a substituição in ­
completa de volumes ( μg) 
m A 
aq ¼ V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 
Ä V R 
V 0 Ä Σ n 
i ¼ 1 v A 
a ið Þ Í Î 0 
B B B @ 1 
C C C A · m
 ads 
aq ðeqÞ (26) 
V R = volume de sobrenadante remo ­
vido do tubo após atingir o estado de equilíbrio de adsorção e subs ­
tituído pelo mesmo volume de so ­
lução de CaCl
 2 0,01 M (cm  3 ) 
v D 
a = volume da alíquota recolhida do 
tubo para fins analíticos (i), du ­
rante o ensaio de cinética de 
dessorção efectuado pelo mé ­
todo sequencial (cm  3 ); 
v D 
a ≤ 0; 02 · V T (27) ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1232
 
Apêndice 6  
ADSORÇÃO-DESSORÇÃO EM SOLOS: FICHA DE APRESENTAÇÃO DOS RESULTADOS  
Substância ensaiada:  
Solo ensaiado:  
Massa seca do solo (105  o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatura:  o C 
Adequabilidade do método analítico  
Massa da amostra de solo g 
Massa seca de solo g Volume de solução de CaCl
 2 cm 3 
Concentração nominal final da solução μg cm  -3 
Concentração analítica final da solução μg cm  -3 
Princípio do método analítico utilizado:  
Calibração do método analítico:  
Substância ensaiada:  
Solo ensaiado:  
Massa seca do solo (105  o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Metodologia analítica adoptada: Método in ­
directo  □ Método pa ­
ralelo □ Método se ­
quencial  □ 
Método di ­
recto □ 
Ensaio de adsorção: amostras  
Símbolo Unidades Tempo 
necessário para 
atingir o 
equilíbrio Tempo 
necessário para 
atingir o 
equilíbrio Tempo 
necessário para 
atingir o 
equilíbrio Tempo 
necessário para 
atingir o 
equilíbrio  
Tubo n.  o 
Solo: massa determinada — g 
Solo: massa seca m  solo g 
Volume calculado de humidade 
no solo V ws cm 3 
Volume de solução de CaCl  2 
0,01 M necessário para equili ­
brar o solo cm 3 
Volume de solução-mãe cm  3 
Volume total da fase aquosa em 
contacto com o solo v 0 cm 3 
Concentração inicial da solução 
de ensaio c 0 μg cm  3 
Massa de substância em estudo 
no início do ensaio m 0 μg ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1233
 
Símbolo Unidades Tempo 
necessário para 
atingir o 
equilíbrio Tempo 
necessário para 
atingir o 
equilíbrio Tempo 
necessário para 
atingir o 
equilíbrio Tempo 
necessário para 
atingir o 
equilíbrio  
Após agitação e centrifugação  
MÉTODO INDIRECTO 
Método paralelo 
Concentração da substância em 
estudo na fase aquosa, incluindo d correcção decorrente do ensaio 
em branco
 C ads 
aq ðt i Þ μg cm  -3 
Método sequencial 
Massa de substância em estudo 
determinada na alíquota V  A a m ads 
m ðt i Þ μg 
MÉTODO DIRECTO 
Massa da substância em estudo 
adsorvida no solo  m ads 
s ðt i Þ μg 
Cálculo da adsorção 
Adsorção  A  t i % 
A Δt i % 
Método 
Coeficiente de adsorção K  d cm 3 g -1 
Método 
Coeficiente de adsorção K  oc cm 3 g -1 
Método  
Substância ensaiada:  
Solo ensaiado:  
Massa seca de solo (105  o C, 1 2 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Adsorção: ensaios em branco e de controlo  
Símbolo Unidades Branco Branco Controlo  
Tubo n.  o 
Massa da amostra de solo g 0 0 
Teor de humidade calculado no 
solo cm 3 — — 
Volume de solução de CaCl  2 
0,01 M adicionado cm 3 
Volume de solução-mãe da 
substância em estudo adicionado cm 3 0 0 
Volume total da fase aquosa 
(calculado) cm 3 — —  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1234
 
Símbolo Unidades Branco Branco Controlo  
Concentração inicial da subs ­
tância em estudo na fase aquosa μg cm  -3 
Após agitação e centrifugação  
Concentração da fase aquosa μg cm  -3 
Nota:  Aditar colunas suplementares, se necessário.  
Substância ensaiada:  
Solo ensaiado:  
Massa seca do solo (105  o C, 1 2 h): %  
Temperatura:  o C 
Balanço de massas  
Símbolo Unidades  
Tubo n.  o 
Massa da amostra de solo — g 
Massa seca de solo m  solo g 
Volume de água calculado no solo V  WS ml 
Volume de solução de CaCl  2 0,01 M 
necessário para equilibrar o solo ml 
Volume de solução-mãe cm  3 
Volume total de fase aquosa em contacto 
com o solo v 0 cm 3 
Concentração inicial da solução de en ­
saio C 0 μg cm  -3 
Tempo necessário para atingir o equilí ­
brio — h  
Após agitação e centrifugação  
Concentração da substância em estudo na 
fase aquosa no estado de equilíbrio de adsorção, incluindo a correcção decor ­
rente do ensaio em branco
 C aq ads ðeqÞ μg cm  3 
Tempo necessário para atingir o equilí ­
brio t eq h 
Primeira diluição com solvente 
Volume de fase aquosa removido V  rec cm 3 
Volume de solvente adicionado ΔV cm  3 
Primeira extracção com solvente 
Intensidade do sinal do detector (sol ­
vente) s EI var. 
Concentração da substância em estudo 
no solvente C EI μg cm  -3 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1235
 
Símbolo Unidades  
Massa de substância extraída do solo e 
das paredes do recipiente m E1 μg 
Segunda diluição com solvente com solvente 
Volume de solvente removido ΔV s cm 3 
Volume de solvente adicionado ΔV' cm  3 
Segunda extracção com solvente 
intensidade do sinal do detector (solven ­
te) S E2 var. 
Concentração da substância em estudo 
no solvente C E2 μg cm  -3 
Massa de substância extraída do solo e 
das paredes do recipiente m E2 μg 
Massa total de substância em estudo ex ­
traída nas duas etapas m E μg 
Balanço de massas MB %  
Substância ensaiada:  
Solo ensaiado:  
Massa seca de solo (105  o C, 12 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Isotérmicas de adsorção  
Símbolo Unidades  
Tubo n.  o 
Massa da amostra de solo — g 
Massa seca de solo E g 
Volume de água calculado no 
solo V ws cm 3 
Volume de solução de CaCl  2 
0,01 M necessário para equili ­
brar o solo cm 3 
Volume de solução-mãe adicio ­
nado cm 3 
Volume total de fase aquosa em 
contacto com o solo (calculado) v 0 cm 3 
Concentração da solução C  0 μg cm  3 
Tempo necessário para atingir o 
equilíbrio — h  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1236
 
Símbolo Unidades  
Após agitação e centrifugação  
Concentração da substância na 
fase aquosa, incluindo a correcção decorrente do ensaio em branco
 C ads 
aq ðeqÞ μg cm  -3 
Temperatura  o C 
Massa adsorvida por unidade de 
solo C s ads ðeqÞ μg g  -1 
Análise por regressão linear:  
valor de KK  F ads : 
valor de l/n:  
coeficiente de regressão r  2 : 
Substância ensaiada:  
Solo ensaiado:  
Massa seca do solo (105  o C, 1 2 h): . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . %  
Temperatura: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .  o C 
Metodologia analítica adoptada: Método in ­
directo  □ Método pa ­
ralelo □ Método se ­
quencial  □ 
Ensaio de dessorção  
Símbolo Unidades Intervalo Intervalo Intervalo Intervalo  
Número do tubo no ensaio de adsorção 
Massa de substância adsorvida no solo no 
estado de equilíbrio de adsorção  m s ads ðeqÞ μg 
Volume de fase aquosa removido e 
substituído por solução de CaCl  2 0,01 M V R cm 3 
Volume total de fase 
aquosa em contacto com o 
solo PM V  0 cm 3 
SM V  T cm 3 
Massa de substância em estudo excluída 
do equilíbrio de adsorção devido a subs ­
tituição incompleta de volumes  m aq A μg 
Cinética de dessorção  
Massa determinada de substância dessor ­
vida do solo no instante t  i m m ads ðt i Þ μg 
Volume de solução reco ­
lhida do tubo (i) para de ­
terminação da substância em estudo PM V
 f i cm 3 
SM v  a A cm 3 
Massa de substância dessorvida do solo 
no instante t  i (calculada)  m aq ads ðt i Þ μg 
Massa de substância dessorvida do solo 
no intervalo Δt i (calculada)  m aq ads ðΔt i Þ μg ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1237
 
Símbolo Unidades Intervalo Intervalo Intervalo Intervalo  
Percentagem de dessorção  
Dessorção no instante t  i D ti % 
Dessorção no intervalo Δt i D Δt i % 
Coeficiente de dessorção aparente K  des 
PM: Método paralelo  
SM: Método sequencial  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1238
 
C.19.  ESTIMATIVA DO VALOR DO COEFICIENTE DE ADSORÇÃO 
(K OC ) EM SOLOS E EM LAMAS DE DEPURAÇÃO POR 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (HPLC)  
1. MÉTODO  
O presente método baseia-se na publicação OECD TG 121 (2000) 
(normas de ensaio da OCDE).  
1.1. INTRODUÇÃO  
O comportamento absortivo e/ou adsortivo das substâncias presentes 
em solos ou lamas de depuração pode ser descrito por meio de 
parâmetros determinados experimentalmente, através do método de ensaio C 18. O coeficiente de adsorção é um parâmetro importante, definido como a razão entre a concentração da substância no solo/ ­
lamas e a concentração da substância na fase aquosa, em condições 
de equilíbrio de adsorção. O coeficiente de adsorção normalizado para o teor de carbono orgânico no solo (K
 oc ), é um indicador útil 
da capacidade de ligação de um composto químico à matéria orgâ ­
nica presente no solo e nas lamas de depuração, permitindo que se 
estabeleçam comparações entre os diferentes compostos químicos. Este parâmetro pode ser estimado através de correlações com a solubilidade em água e com o coeficiente de partição n-octanol/água 
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).
 
O método experimental descrito no presente ensaio utiliza a técnica 
HPLC para estimar o coeficiente de adsorção K  oc em solos e em 
lamas de depuração (8). Os valores estimados são mais fiáveis que 
os obtidos através do método de cálculos QSAR («quantitative struc ­
ture-activity relationships», relações quantitativas estrutura/ ­
actividade) (9). Por se tratar de um método estimativo, o presente 
método experimental não pode substituir completamente as experiên ­
cias em reactor descontínuo que são utilizadas no método de ensaios C l8. No entanto, o valor estimado para K
 oc pode ser útil na escolha 
dos parâmetros de ensaio adequados para estudos de adsorção/ ­
dessorção de acordo com o método de ensaios C l8, através do 
cálculo de K  d (coeficiente de distribuição) ou de K  l (coeficiente de 
adsorção de Freundlich), segundo a equação 3 (ver ponto 1.2).  
1.2. DEFINIÇÕES  
K d : coeficiente de distribuição. Este coeficiente é definido como a 
razão entre as concentrações de equilíbrio (C), de uma substância de 
ensaio dissolvida num sistema bifásico constituído por um compo ­
nente com comportamento absortivo e/ou adsortivo (solo ou lamas de depuração) e uma fase aquosa. Esta grandeza é adimensional 
quando as concentrações em ambas as fases são expressas em peso/ ­
peso. No caso da concentração da fase aquosa ser expressa em peso/volume, as unidades utilizadas são ml.g
 -1 . O valor de K  d 
pode variar com as propriedades do componente com comporta ­
mento absortivo e/ou adsortivo, assim como depender da sua concen ­
tração.  
K d ¼ C soil 
C aq or C sludge 
C aq (1) 
em que:  
C solo = concentração da substância de ensaio no solo, no equi ­
líbrio (μg · g  -1 ) 
C lamas = concentração da substância de ensaio nas lamas, no 
equilíbrio, ( μg · g  -1 ) 
C aq = concentração da substância de ensaio na fase aquosa, 
no equilíbrio ( μg · g  -1 , μg · ml  -1 ). ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1239
 
K f : coeficiente de adsorção de Freundlich. Este coeficiente é definido 
como a concentração da substância de ensaio no solo ou nas lamas 
de depuração (x/m) quando a concentração de equilíbrio na fase aquosa (C
 aq ) é igual a um. Esta grandeza é expressa em μg · g  -1 
de componente com comportamento absortivo e/ou adsortivo. O va ­
lor de K  f pode ser afectado pelas propriedades desse componente.  
log x 
m ¼ logK  f þ 1 
n ·logC  aq (2) 
em que:  
x/m = quantidade da substância de ensaio x ( μg) adsorvida numa 
quantidade m (g) de componente com comportamento ab ­
sortivo e/ou adsortivo, no equilíbrio  
l/n = declive da isotérmica de adsorção de Freundlich  
C aq = concentração da substância de ensaio na fase aquosa, no 
equilíbrio ( μg · ml  -1 ) 
At C aq ¼ 1; logK  f ¼ log x 
m 
K oc : coeficiente de distribuição (K  d ) ou coeficiente de adsorção de 
Freundlich (K  f ) normalizados para o teor de carbono orgânico (f  oc ), 
de um componente com comportamento absortivo e/ou adsortivo. 
Esta grandeza é um indicador adequado do grau de adsorção entre a substância e o componente com comportamento absortivo e/ou adsortivo, principalmente no caso de compostos químicos não ioni ­
zados, permitindo que sejam feitas comparações entre diferentes 
compostos químicos. Dependendo das unidades de K
 d ou de K  f , o 
K oc pode ser adimensional ou expresso em ml · g  -1 or μg · g  -1 de 
matéria orgânica:  
Koc ¼ Kd 
foc ðadimensional ou ml ·g Ä1 Þor Kf 
foc ðμg·g Ä1 Þ (3) 
Embora a relação entre K  oc e K  d não seja sempre linear, pelo que os 
valores de K  oc podem variar de solo para solo, esta variabilidade é 
significativamente reduzida comparativamente à registada para os 
valores de K  d ou K  f , 
O coeficiente de adsorção (K  oc ) é deduzido a partir do factor de 
capacidade (k  1 ), utilizando uma curva de calibração de log k  1 em 
função de log K  oc dos compostos de referência seleccionados.  
k 0 ¼ t R Ä t 0 
t 0 (4) 
em que:  
t R = tempo de retenção em HPLC da substância de ensaio e da 
substância de referência (em minutos)  
t 0 = tempo-limite em HPLC (minutos) (ver ponto 1.8.2).  
P OW : coeficiente de partição octanol-água. Este coeficiente define-se 
como a razão entre as concentrações da substância dissolvida em n- -octanol e em água. Trata-se de uma grandeza adimensional
 
Pow ¼ Coctanol 
Caq ð¼ KowÞ (5) 
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Antes da utilização do método, é necessário conhecer a fórmula 
estrutural, o grau de pureza e a constante de dissociação (caso seja adequado). Será útil dispor de informações relativas à solubilidade 
em água e em solventes orgânicos, ao coeficiente de partição octa ­
nol-água e às características de hidrólise.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1240
 
De forma a correlacionar os valores de retenção, medidos em HPLC, de 
uma substância de ensaio com o seu coeficiente de adsorção, K  oc , deverá 
ser traçada uma curva de calibração de log K  oc em função de log k  1 . 
Deverão ser utilizados, no mínimo, seis valores de referência, dos quais pelo menos um deverá estar acima e outro abaixo do valor esperado para 
a substância de ensaio. O grau de exactidão do método será melhorado 
significativamente se forem utilizadas substâncias de referência estrutu ­
ralmente relacionadas com a substância de ensaio. Caso estes dados não estejam disponíveis, cabe ao analista seleccionar as substâncias de cali ­
bração adequadas. Nesse caso, deverá ser escolhido um conjunto mais 
abrangente de substâncias, estruturalmente heterogéneas. Nas tabelas 1 e 3 do apêndice apresentam-se listas das substâncias e valores de K
 oc que 
podem ser utilizados para as lamas de depuração e para os solos, res ­
pectivamente. A selecção de outras substâncias de calibração deverá ser 
devidamente justificada.  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
O HPLC é realizado em colunas analíticas com enchimento de cia ­
nopropilo comercial em fase sólida contendo grupos lipofílicos e grupos polares. E utilizada uma fase estacionária com polaridade 
moderada baseada numa matriz de sílica. 
– O – Sí –CH
 2 –CH  2 –CH  2 –CN 
sílica espaçador apolar grupo polar  
O princípio do método de ensaio é semelhante ao utilizado no mé ­
todo de ensaio A.8 (coeficiente de partição, método de HPLC). A 
substância de ensaio interage com a fase estacionária ao passar pela 
coluna juntamente com a fase móvel, sendo retardada em resultado da partição entre as fases móvel e estacionária. A composição mista 
da fase estacionária, que contém grupos polares e grupos apoiares, 
permite que a interacção dos grupos polares e apoiares de determi ­
nada molécula ocorra de forma semelhante à que se verifica com a matéria orgânica em matrizes de solo ou de lamas de depuração, 
possibilitando o estabelecimento de uma relação entre o tempo de 
retenção na coluna e o coeficiente de adsorção à matéria orgânica.
 
O pH tem uma influência significativa no comportamento absortivo 
e/ou adsortivo, sobretudo no caso de substâncias polares. Em solos agrícolas ou em tanques de estações de tratamento de águas resi ­
duais, o pH varia normalmente entre 5,5 e 7,5. Relativamente a 
substâncias ionizáveis, deverão ser efectuados dois ensaios, um com a forma ionizada e outro com a forma não ionizada em soluções tampão adequadas, apenas nos casos em que pelo menos 10 % do 
composto de ensaio se encontre dissociado a pH entre 5,5 e 7,5.
 
Uma vez que, para avaliar os resultados, utiliza-se apenas a relação 
entre a retenção na coluna de HPLC e o coeficiente de adsorção, não é necessário utilizar qualquer método quantitativo, determinar o tempo de retenção. Caso se disponha de um conjunto adequado de 
substâncias de referência e estejam estabelecidas condições experi ­
mentais-padrão, o presente método constitui um modo rápido e efi ­
caz para estimar o valor do coeficiente de adsorção K
 oc . 
1.5. APLICABILIDADE DO ENSAIO  
O método de HPLC é aplicável a substâncias químicas (marcadas ou 
não) para as quais exista um sistema de detecção adequado (por exem ­
plo, espectrofotómetro, detector de radioactividade) e que sejam sufi ­
cientemente estáveis durante o período de ensaio. O método pode ser particularmente útil no caso de produtos químicos que sejam difíceis de estudar com outros sistemas experimentais (ou seja, substâncias voláteis, 
substâncias que não são solúveis em água em concentrações que possam 
ser determinadas analiticamente, substâncias que apresentem uma ele ­
vada afinidade para a superfície dos sistemas de incubação). O método pode ser utilizado para misturas que apresentam bandas de eluição não 
resolvidas. Nesse caso, devem ser referidos os limites superior e inferior 
dos valores de log K
 oc dos compostos presentes na mistura de ensaio.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1241
 
As impurezas podem por vezes representar um problema para a 
interpretação dos resultados de HPLC. No entanto, a sua influência 
pode ser minimizada se a substância de ensaio puder ser inequivo ­
camente identificada pelo método analítico e separada das impurezas.  
O presente método encontra-se validado para as substâncias descritas 
na tabela 1 do apêndice, tendo sido igualmente aplicado a uma série 
de outros compostos químicos pertencentes às seguintes famílias de 
compostos:  
— aminas aromáticas (por exemplo, trifluralina, 4-cloroanilina, 3,5- 
-dinitroanilina, 4-metilanilina, N-metilanilina, l-naftilamina),  
— ésteres de ácidos carboxílicos aromáticos (por exemplo, éster 
metílico do ácido benzóico, éster etílico do ácido 3,5-dinitroben ­
zóico),  
— hidrocarbonetos aromáticos (por exemplo, tolueno, xileno, etil ­
benzeno, nitrobenzeno),  
— ésteres do ácido ariloxifenoxipropiónico (por exemplo, diclofop- 
-metilo, fenoxaprop-etilo, fenoxaprop-P-etilo),  
— fungicidas benzimidazólicos e imidazólicos (por exemplo, car ­
bendazim, fuberidazol, triazóxido),  
— amidas de ácidos carboxílicos (por exemplo, 2-clorobenzamida, 
N,N-dimetilbenzamida, 3,5-dinitrobenzamida, N-metilbenzamida, 
2-nitrobenzamida, 3-nitrobenzamida),  
— hidrocarbonetos clorados (por exemplo, endosulfan, DDT, hexa ­
clorobenzeno, quintozeno, 1.2.3-triclorobenzeno),  
— insecticidas organo-fosforados (por exemplo, azinfos-metilo, dis ­
sulfotão, fenamifos, isofenfos, pirazofos, sulprofos, triazofos),  
— fenóis (por exemplo, fenol, 2-nitrofenol, 4-nitrofenol, pentacloro ­
fenol, 2,4,6-triclorofenol, 1-naftol),  
— derivados da fenilureia (por exemplo, isoproturão, monolinurão, 
pencicurão),  
— corantes (por exemplo, Amarelo Acido 219, Azul Básico 41, 
Vermelho Directo 81),  
— hidrocarbonetos poliaromáticos (por exemplo, acenafteno, nafta ­
leno),  
— herbicidas do tipo 1,3,5-triazina (por exemplo, prometrino, pro ­
pazina, simazina, terbutrina),  
— derivados de triazole (por exemplo, tebuconazole, triadimefona, 
tradimenol, triapentenol).  
O presente método não é aplicável a substâncias que reajam com o 
eluente ou com a fase estacionária nem a substâncias que interajam 
de forma específica com componentes inorgânicos (por exemplo, formação de agregados de complexos com minerais argilosos). O presente método pode não ser adequado para a análise de surfactan ­
tes, compostos inorgânicos ou ácidos e bases moderadamente fortes 
ou fortes. O presente método permite determinar valores de log K
 oc 
entre 1,5 e 5,0. Na medição de substâncias ionizáveis deve utilizar-se 
uma fase móvel tamponada, sendo necessário tomar precauções de 
modo a evitar a precipitação dos componentes do tampão ou da 
substância de ensaio.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1242
 
1.6. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
1.6.1.  Exactidão  
De um modo geral, o coeficiente de adsorção de uma substância de 
ensaio pode ser estimado com uma margem de erro de ± 0,5 unida ­
des de logaritmo, relativamente ao valor determinado em reactor 
descontínuo (ver tabela 1 do apêndice). Poderá obter-se um grau de exactidão superior se se utilizarem substâncias de referência es ­
truturalmente relacionadas com a substância de ensaio.
 
1.6.2.  Repetitividade  
Cada determinação deve ser feita pelo menos em duplicado. Os 
valores de log K  oc obtidos em cada medição devem encontrar-se 
numa gama de 0,25 unidades de logaritmo.  
1.6.3.  Reprodutibilidade  
A experiência obtida até ao momento com a aplicação do presente 
método suporta a sua validade. Numa análise do método de HPLC, 
realizada com 48 substâncias (pesticidas, na sua maior parte) relati ­
vamente às quais existiam valores fiáveis de K  oc em solos, o coefi ­
ciente de correlação obtido foi de R = 0,95 (10) (11).  
De modo a melhorar e validar o presente método, foi efectuado um 
ensaio comparativo interlaboratorial no qual participaram 11 labora ­
tórios (12). Os resultados desse ensaio são apresentados na tabela 2 
do apêndice.  
1.7. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.7.1.  Estimativa preliminar do coeficiente de adsorção  
O coeficiente de partição octanol-água P  ow (= K  ow ), assim como, em 
certa medida, a solubilidade em água, podem ser utilizados como 
indicadores da extensão da adsorção, em particular para substâncias não ionizáveis, podendo assim ser utilizados numa primeira aproxi ­
mação com vista a determinar a gama de variação do valor do 
coeficiente de adsorção. Relativamente a vários grupos de compostos 
químicos. Têm sido publicadas uma série de correlações úteis rela ­
tivamente a vários grupos de compostos químicos (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7).
 
1.7.2.  Equipamento  
É necessário um cromatógrafo de fase líquida equipado com uma 
bomba de pulsação livre e um equipamento de detecção adequado. Recomenda-se a utilização de uma válvula de injecção com ciclos de 
injecção. Deverão ser utilizadas resinas comerciais de cianopropilo 
quimicamente ligado a uma base de sílica (por exemplo, Hypersil e Zorbax CN). Poderá interpor-se uma coluna de protecção do mesmo 
material entre o sistema de injecção e a coluna analítica. A eficiência 
de separação das colunas poderá variar substancialmente em função do fabricante. Como referência, relativamente aos factores de capa ­
cidade k' deverão ser atingidas os seguintes valores: log k' > 0,0 para 
log K
 oc = 3,0 e log k' > 0,4 para log K  oc = 2,0, quando se utiliza 
uma fase móvel de metanol/água nas proporções de 55/45 %.  
1.7.3.  Fases móveis  
Foram ensaiadas diversas fases móveis, sendo recomendadas as duas 
seguintes:  
— metanol/água (55/45 % v/v),  
— metanol/0,01 M tampão citrato pH 6,0 (55/45 % v/v).  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1243
 
Na preparação do solvente de eluição, deve utilizar-se metanol 
com grau de pureza para HPLC e água destilada ou tampão 
citrato. Os gases da mistura devem ser eliminados antes da sua utilização. Deve utilizar-se uma eluição isocrática. Se o uso de misturas metanol/água não for apropriado, pode tentar 
utilizar-se outras misturas água/solventes orgânicos como, por 
exemplo, etanol/água ou acetonitrilo/água. Para compostos ioni ­
záveis, é recomendada a utilização da solução tampão, de modo a estabilizar o pH. Deverão tomar-se precauções para evitar a 
precipitação de sais e a deterioração da coluna, que podem 
ocorrer com algumas misturas de fase orgânica/tampão.
 
Não devem ser utilizados aditivos, como reagentes de pares iónicos, 
uma vez que estes podem afectar as propriedades absortivas e/ou adsortivas da fase estacionária, de uma forma que poderá ser irre ­
versível. É por esta razão obrigatório que os ensaios com aditivos 
sejam realizados em colunas separadas do mesmo tipo.
 
1.7.4.  Solutos  
Tanto as substâncias de ensaio como as de referência devem ser 
dissolvidas na fase móvel.  
1.8. PROCEDIMENTO DO ENSAIO  
1.8.1.  Condições de ensaio  
Deve ser registada a temperatura à qual se efectuam as medidas. É 
fortemente recomendada a utilização de um compartimento de colu ­
nas com controlo de temperatura, de modo a garantir condições de 
temperatura constante durante a calibração, de avaliação prévia e das medições da substância de ensaio.
 
1.8.2.  Determinação do tempo limite t  o 
Podem ser utilizados dois métodos diferentes na determinação do 
tempo limite t  o (ver também ponto 1.2).  
1.8.2.1.  Determinação do tempo limite t  o através de uma série homóloga  
Este procedimento provou dar origem a valores de t  o fiáveis e pa ­
dronizados. Pormenores sobre este método podem ser encontrados 
no método de ensaio A.8: coeficiente de partição (n-octanol/água), método de HPLC.
 
1.8.2.2.  Determinação do tempo limite t  0 através de substâncias inerte que 
não são retidas pela coluna  
Esta técnica baseia-se na injecção de soluções de formamida, ureia 
ou nitrato de sódio. As medições devem ser feitas, peio menos, em 
duplicado.  
1.8.3.  Determinação dos tempos de retenção t  R 
As substâncias de referência devem ser seleccionadas de acordo com 
o procedimento descrito no ponto 1.3. Para determinar os respectivos tempos de retenção, podem ser injectadas misturadas desde que se tenha confirmado que o tempo de retenção de cada um dos padrões 
não é afectado pela presença dos outros padrões. A calibração deve 
ser efectuada a intervalos regulares, pelo menos duas vezes por dia, de modo a poder detectar quaisquer alterações inesperadas no com ­
portamento da coluna. Para uma boa prática laboratorial, as injecções 
de calibração devem ser efectuadas antes e depois da injecção da 
substância de ensaio, de modo a confirmar se não houve alterações nos tempos de retenção. As substâncias de ensaio são injectadas separadamente, em quantidades o mais reduzidas possível (de 
modo a evitar a sobrecarga da coluna), e determinados os seus 
tempos de retenção.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1244
 
Para aumentar o grau de confiança das medições, as determinações 
devem ser feitas pelo menos em duplicado. Os valores de log K  oc 
obtidos em cada medição devem manter-se numa gama de 0,25 
unidades de logaritmo.  
1.8.4.  Avaliação  
Os factores de capacidade k' são calculados a partir do tempo limite t  o e 
dos tempos de retenção t  R das substâncias de referência seleccionadas, de 
acordo com a equação 4 (ver ponto 1.2) Os valores de log k' das subs ­
tâncias de referência são em seguida representados graficamente em 
função dos respectivos valores de log K  oc , obtidos nos ensaios em reactor 
descontínuo fornecidos nas tabelas 1 e 3 do apêndice. Através deste gráfico, o valor de log k' de uma substância de ensaio é então utilizado 
para determinar o seu valor de log K
 oc . Se os resultados obtidos revela ­
rem que o valor de log K  oc da substância de ensaio se encontra fora da 
curva de calibração, o ensaio deve ser repetido com outras substâncias de referência, mais adequadas.
 
2. DADOS E RELATÓRIO  
O relatório deve incluir a seguinte informação:  
— a identidade das substâncias de ensaio e de referência, e o seu 
grau de pureza e, se relevante, os respectivos valores de pK  a , 
— a descrição do equipamento e das condições de funcionamento, 
por exmplo, o tipo e a dimensão da coluna analítica (e da coluna de protecção), os meios de detecção, a fase móvel (composição relativa e pH), a gama de temperaturas observadas durante o 
decorrer das medições,
 
— o tempo limite e o método utilizado para a sua determinação,  
— as quantidades das substâncias de ensaio e de referência introdu ­
zidas na coluna,  
— os tempos de retenção dos compostos de referência utilizados 
para a calibração,  
— as características da regressão linear dos pontos experimentais 
(log k' em função de log K  oc ) e um gráfico da recta obtida por 
regressão linear,  
— os dados sobre o tempo médio de retenção e o valor estimado 
para log K  oc do composto de ensaio,  
— cromatogramas.  
3. REFERÊNCIAS  
(1) W. J. Lyman, W. F. Reehl, D. H. Rosenblatt (ed). (1990). 
Handbook of chemical property estimation methods, Chap. 4, 
McGraw-Hill, New York.  
(2) J. Hodson, N. A. Williams (1988). The estimation of the ad ­
sorption coefficient (K  oc ) for soils by HPLC. Chemosphere, 
17, 1-67.  
(3) G. G. Briggs (1981). Theoretical and experimental relations ­
hips between soil adsorption, octanol-water partition coeffi ­
cients, water solubilities, bioconcentration factors, and the pa ­
rachor. J. Agric. Food Chem., 29, p. 1050-1059.  
(4) C. T. Chiou, P. E. Porter, D.W. Schmedding (1983). Partition 
equilibria of nonionic organic compounds between soil organic matter and water. Environ. Sci. Technol., 17, p. 227-231.
 
(5) Z. Gerstl, U. Mingelgrin (1984). Sorption of organic substan ­
ces by soils and sediment. J. Environm. Sci. Health, B19, p. 
297-312.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1245
 
(6) C. T. Chiou, L. J. Peters, V. H. Freed (1979). A physical 
concept of soil water equilibria for nonionic organic com ­
pounds, Science, 106, p. 831-832.  
(7) S. W. Karickhoff (1981). Semi-empirical estimation of sorption 
of hydrophobic pollutants on natural sediments and soils. Che ­
mosphere, 10, p. 833-846.  
(8) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of 
the HPLC-screening method for the determination of the ad ­
sorption coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), p. 121-128.
 
(9) M. Mueller, W. Kördel (1996). Comparison of screening met ­
hods for the estimation of adsorption coefficients on soil. Che ­
mosphere, 32(12), p. 2493-2504.  
(10) W. Kördel, J. Stutte, G. Kotthoff (1993). HPLC-screening met ­
hod for the determination of the adsorption coefficient in soil- -comparison of different stationary phases, Chemosphere, 27 ­
(12), p. 2341-2352.
 
(11) B. von Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Sorption of non ­
polar and polar compounds to soils: Processes, measurements and experience with the applicability of the modified OECD 
Guideline 106, Chemosphere, 22, p. 28 5-304.
 
(12) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (199 5). HPLC-screening 
method for the determination of the adsorption coefficient on soil-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), p. 1373-1384.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1246
 
Apêndice  
Tabela 1  
Comparação entre os valores de K  oc para solos e lamas de depuração e os valores calculados pelo método de 
HPLC  ( 1 ), ( 2 ) 
Substância Número CAS Log K  OC 
lamas de 
depuração Log K  OC 
HPLC A Log K  OC 
solos Log K  OC 
HPLC A 
Atrazina 1912-24-9 1,66 2,14 0,48 1,81 2,20 0,39 
Linurão 330-55-2 2,43 2,96 0,53 2,59 2,89 0,30 Fentião 55-38-9 3,75 3,58 0,17 3,31 3,40 0,09 Monurão 150-68-5 1,46 2,21 0,75 1,99 2,26 0,27 Fenantreno 85-01-8 4,35 3,72 0,63 4,09 3,52 0,57 Éster fenílico do ácido ben ­
zóico 93-99-2 3,26 3,03 0,23 2,87 2,94 0,07 
Benzamida 55-21-0 1,60 1,00 0,60 1,26 1,25 0,01 
4-Nitrobenzamida 619-80-7 1,52 1,49 0,03 1,93 1,66 0,27 
Acetanilida 103-84-4 1,52 1,53 0,01 1,26 1,69 0,08 
Anilina 62-53-3 1,74 1,47 0,27 2,07 1,64 0,43 2,5-Dicloroanilina 95-82-9 2,45 2,59 0,14 2,55 2,58 0,03
 
( 1 ) W. Kördel, D. Hennecke, M. Herrmann (1997). Application of the HPLC-screening method for the determination of the adsorption 
coefficient on sewage sludges. Chemosphere, 35(1/2), p. 121-128. 
( 2 ) W. Kördel, D. Hennecke, C. Franke (1997). Determination of the adsorption-coefficients of organic substances on sewage 
sludges.Chemosphere. 35(1/2), p. 107-119.  
Tabela 2  
Resultados de um ensaio comparativo interlaboratorial (11 laboratórios participantes), efectuado com o objectivo 
de melhorar e validar o método de HPLC  ( 1 ) 
Substância Número CAS Log K  OC K OC Log K  OC 
(OECD 106) (método de HPLC)  
Atrazina 1912-24-9 1,81 78 ± 16 1,89 
Monurão 150-68-5 1,99 100 + 8 2,00 Triapentenol 77608-88-3 2,37 292 ± 58 2,47 
Linurão 330-55-2 2,59 465 ± 62 2,67 
Fentião 55-38-9 3,31 2062 ± 648 3,31
 
( 1 ) W. Kördel, G. Kotthoff, J. Müller (1995). HPLC-screening method for the determination of the adsorption coefficient on soil- 
-results of a ring test. Chemosphere, 30(7), p. 1373-1384.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1247
 
Tabela 3  
Substâncias de referência recomendadas para o método de HPLC baseado em dados de adsorção em solos  
Substância de referência Número CAS Valores médios 
de log K  OC em 
reactor 
descontínuo Número de 
valores de K  OC Log 
desvio-padrão Fonte  
Acetanilida 103-84-4 1,25 4 0,48 (  a ) 
Fenol 108-95-2 1,32 4 0,70 (  a ) 
2-Nitrobenzamida 610-15-1 1,45 3 0,90 (  b ) 
N,N-dimetilbenzamida 611-74-5 1,52 2 0,45 (  a ) 
4-Metilbenzamida 619-55-6 1,78 3 1,76 (  a ) 
Benzoato de metilo 93-58-3 1,80 4 1,08 (  a ) 
Atrazina 1912-24-9 1,81 3 1,08 (  c ) 
Isoproturão 34123-59-6 1,86 5 1,53 (  c ) 
3-Nitrobenzamida 645-09-0 1,95 3 1,31 (  b ) 
Anilina 62-53-3 2,07 4 1,73 (  a ) 
3,5-Dinitrobenzamida 121-81-3 2,31 3 1,27 (  b ) 
Carbendazim 10605-21-7 2,35 3 1,37 (  c ) 
Triadimenol 55219-65-3 2,40 3 1,85 (  c ) 
Triazóxido 72459-58-6 2,44 3 1,66 (  c ) 
Triazofos 24017-47-8 2,55 3 1,78 (  c ) 
Linurão 330-5 5-2 2,59 3 1,97 (  c ) 
Naftaleno 91-20-3 2,75 4 2,20 (  a ) 
Endosulfan-diol 2157-19-9 3,02 5 2,29 (  c ) 
Metiocarbe 2032-65-7 3,10 4 2,39 (  c ) 
Amarelo Ácido 21 9 63405-85-6 3,16 4 2,83 (  a ) 
1,2,3-Triclorobenzeno 87-61-6 3,16 4 1,40 (  a ) 
Y-HCH 58-89-9 3,23 5 2,94 (  a ) 
Fentião 55-38-9 3,31 3 2,49 (  c ) 
Vermelho Directo 81 2610-11-9 3,43 4 2,68 (  a ) 
Pirazofos 1 3457-18-6 3,65 3 2,70 (  c ) 
a-Endosulfan 959-98-8 4,09 5 3,74 (  c ) 
Diclofop-metilo 51338-27-3 4,20 3 3,77 (  c ) 
Fenantreno 85-01-8 4,09 4 3,83 (  a ) 
Azul Básico 41 (mistura) 268 50-47-5 
12270-13-2 4,89 4 4,46 (  a ) 
DDT 50-29-3 5,63 1 — (  b ) 
( a ) W. Kördel, J. Müller (1994). Bestimmung des Adsorptionskoeffizienten organischer Chemikalien mit der HPLC. UBA R & D 
Report No 106 01044 (1994). 
( b ) B.V. Oepen, W. Kördel, W. Klein (1991). Chemosphere, 22, p. 285-304. 
( c ) Dados fornecidos por entidades industriais.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1248
 
C.20.  ENSAIO SOBRE A REPRODUÇÃO DE  DAPHNIA MAGNA  
1. MÉTODO  
Este método de ensaio de toxicidade na reprodução baseia-se na 
publicação OECD TG 211 (1998) (normas de ensaio da OCDE).  
1.1. INTRODUÇÃO  
O principal objectivo do ensaio consiste em determinar o efeito de 
produtos químicos sobre a produção de descendência de  Daphnia 
magna.  
1.2. DEFINIÇÕES E UNIDADES  
Animais progenitores:  as fêmeas  Daphnia  presentes no início do 
ensaio e cuja reprodução é o objecto do estudo.  
Descendência:  os juvenis  Daphnia  produzidos pelos animais proge ­
nitores no decorrer do ensaio.  
Menor concentração com efeito observável (LOEC):  a menor 
concentração testada em que a substância ensaiada produz um efeito observável estatisticamente significativo sobre a reprodução e mor ­
talidade dos progenitores (a p < 0,05), comparativamente ao con ­
trolo, durante um período de exposição definido. No entanto, todas as concentrações de ensaio superiores à LOEC devem ter um efeito 
nocivo igual ou superior ao verificado para a LOEC. Quando estas 
duas condições não puderem ser satisfeitas, deverá ser fornecida uma explicação pormenorizada sobre a forma como se determinou a LOEC (e, consequentemente, a NOEC).
 
Concentração sem efeito observável (NOEC):  a mais elevada con ­
centração ensaiada que, quando comparada com o controlo, não tem 
qualquer efeito estatisticamente significativo (p < 0,05), durante um período de exposição definido (corresponde à concentração ensaiada imediatamente abaixo da LOEC).
 
CE x : a concentração da substância de ensaio dissolvida em água que 
provoca uma redução de x % na reprodução da  Daphnia magna,  
durante um período de exposição definido.  
Taxa intrínseca de crescimento:  uma medida do crescimento da 
população que integra a produção de descendência e a mortalidade 
específica da idade (20) (21) (22). O seu valor será igual a zero nas populações estáveis, positivo para as populações em crescimento e negativo para populações em declínio. Manifestamente, a última 
situação não é sustentável c, em última análise, conduzirá à extinção.
 
Limite de detecção:  a menor concentração que pode ser detectada, 
mas não quantificada.  
Limite de determinação:  a menor concentração que pode ser me ­
dida de forma quantitativa.  
Mortalidade:  um animal é considerado morto quando permanece 
imóvel, isto é, quando não é capaz de nadar ou quando não se observa movimento dos apêndices ou do pós-abdómen no intervalo de 15 segundos após agitação suave do recipiente de ensaio (se for 
utilizada outra definição, esta deve ser mencionada juntamente com a 
sua referência).
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1249
 
1.3. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
As fêmeas jovens  Daphnia  (os animais progenitores), com menos de 
24 horas de vida no início do ensaio, são expostas à substância de ensaio misturada na água em diversas concentrações. A duração do 
ensaio é de 21 dias. No fim do ensaio, é determinado o número total 
de descendentes vivos produzidos por cada animal progenitor que esteja vivo. Isto significa que são excluídos dos cálculos os juvenis produzidos por adultos que morreram durante o ensaio. A produção 
de descendência pelos animais progenitores pode expressar-se de 
outras formas (por exemplo, pelo número de descendentes vivos produzidos por animal e por dia, desde o primeiro dia em que se 
observou descendência), mas estas devem ser descritas juntamente 
com o número total de juvenis produzidos por progenitor vivo no fim do ensaio. A produção de descendência pelos animais expostos â substância de ensaio é comparada com a obtida no(s) controlo(s), a 
fim de determinar a menor concentração com efeito observável 
(LOEC) e, consequentemente, a concentração sem efeito observável (NOEC). Adicionalmente, e na medida do possível, os dados são analisados utilizando um modelo de regressão de modo a estimar a 
concentração que causaria uma redução de x % na produção de 
descendência (isto é CE
 50 , CE  20 ou CE  10 ). 
É necessário registar também a sobrevivência dos animais progeni ­
tores e o tempo que decorreu até ao aparecimento dos primeiros 
juvenis. Podem ainda ser examinados outros efeitos relacionados 
com a substância, em parâmetros como o crescimento (o compri ­
mento, por exemplo) e, possivelmente, a taxa intrínseca de cresci ­
mento.  
1.4. INFORMAÇÃO SOBRE A SUBSTÂNCIA DE ENSAIO  
Deverão estar disponíveis os resultados de um ensaio de toxicidade 
aguda (ver método C.2, parte I) realizado com a  Daphnia magna.  
Estes resultados podem ser úteis para seleccionar um intervalo apro ­
priado de concentrações a usar nos ensaios de reprodução. A solu ­
bilidade em água e a pressão de vapor da substância de ensaio deverão ser conhecidas, e deverá estar disponível um método analí ­
tico fiável para a quantificação da substância nas soluções de ensaio, 
relativamente ao qual esteja descrita a eficiência de recuperação e o 
limite de determinação.
 
A fórmula estrutural, o grau de pureza da substância, a estabilidade à 
luz, a estabilidade nas condições do ensaio, o pKa, o P  ow e os 
resultados do ensaio para a biodegradabilidade «fácil» constituem 
informações relativas à substância que podem ser úteis para o esta ­
belecimento das condições do ensaio (ver método C.4).  
1.5. VALIDADE DO ENSAIO  
Para que um ensaio seja válido, deverão ser satisfeitos os seguintes 
critérios relativamente ao(s) controlo(s):  
— a mortalidade dos animais progenitores (fêmea  Daphnia ) no fim 
do ensaio não deve exceder 20 %;  
— o número médio da descendência viva, produzida por animal 
progenitor sobrevivente no fim do ensaio deve ser ≥ 60. 
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.6.1.  Equipamento  
Os recipientes de ensaio e outros aparelhos que entrem em contacto 
com as soluções de ensaio devem ser, exclusivamente, de vidro ou outro material quimicamente inerte. Os recipientes de ensaio utiliza ­
dos serão, normalmente, copos de vidro.
 
Adicionalmente, será necessário utilizar parte ou a totalidade do 
seguinte equipamento:  
— medidor de oxigénio (com microeléctrodo ou outro equipamento 
adequado para a medição de oxigénio dissolvido em amostras 
com volume reduzido),  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1250
 
— aparelhos adequados para o controlo da temperatura,  
— medidor de pH,  
— equipamento para a determinação da dureza da água,  
— equipamento para a determinação da concentração de carbono 
orgânico total (COT) da água ou equipamento para a determina ­
ção da carência química de oxigénio (CQO),  
— aparelho adequado para o controlo do regime de luz e a medição 
da intensidade da luz.  
1.6.2.  Organismos de ensaio  
A espécie a ser utilizada no ensaio é a  Daphnia magna  Straus. 
Podem ser utilizadas outras espécies de  Daphnia,  desde que obede ­
çam aos critérios de validade (o critério de validade relativo à pro ­
dução de descendência nos controlos deve ser aplicável à espécie de  
Daphnia).  Se forem utilizadas outras espécies de  Daphnia,  estas 
devem ser claramente identificadas e o seu uso justificado.  
É desejável que os clones tenham sido identificados, por genotipa ­
gem. A investigação já efectuada nesse domínio (1) demonstrou que a reprodução do clone A (proveniente do 1RCHA, em França) (3) obedece de forma satisfatória ao critério de validade de uma média ≥ 
60 descendentes por animal progenitor sobrevivente, quando culti ­
vado nas condições descritas no presente método. No entanto, são aceitáveis outros clones, desde que se demonstre que a cultura de  
Daphnia  satisfaz os critérios de validade para o ensaio.
 
No início do ensaio, os animais devem ter menos de 24 horas de 
vida e não devem fazer parte da primeira ninhada do progenitor. 
Devem provir de um lote saudável [isto é, não evidenciar sinais de 
distúrbio, tais como elevada mortalidade, presença de machos e ovos de repouso  (ephippia),  atraso na produção da primeira ninhada, ani ­
mais descorados, etc.]. O lote de animais deve ser mantido em 
condições de cultura (luz, temperatura, meio, alimentação e número 
de animais por unidade de volume) semelhantes às que irão ser utilizadas no ensaio. Se o meio de cultura da  Daphnia  a ser utilizado 
no ensaio for diferente do utilizado para a cultura de rotina da  
Daphnia , é boa prática incluir um período de aclimatação de cerca 
de três semanas antes do ensaio (isto é, uma geração) para evitar perturbações nos animais progenitores.
 
1.6.3.  Meio de ensaio  
E recomendada a utilização, neste ensaio, de um meio totalmente 
definido. Isto permite evitar o uso de aditivos (por exemplo, algas 
marinhas, extracto de solo, etc.), que são difíceis de caracterizar, e 
assim melhorar o processo de padronização entre laboratórios. Foram considerados adequados para este fim os meios Elendt M4 (4) e M7 (ver apêndice 1). São aceitáveis, no entanto, outros meios [ver, por 
exemplo, (5) e (6)] desde que as características da cultura de  Daph­
nia satisfaçam os critérios de validade para o ensaio.
 
Se for utilizado um meio que inclui aditivos não definidos, estes 
deverão ser claramente especificados e o relatório do ensaio deverá incluir informações sobre a composição, nomeadamente no que diz respeito ao teor de carbono, já que este poderá contribuir para o 
alimento fornecido. Recomenda-se que o carbono orgânico total 
(COT) e/ou a carência química de oxigénio (CQO) da solução de reserva do aditivo orgânico sejam determinados, e feita uma estima ­
tiva da contribuição resultante para os valores COT/CQO no meio de 
ensaio. Recomenda-se que os níveis de COT no meio (isto é, antes 
da adição das algas) sejam inferiores a 2 mg/l (7).
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1251
 
Quando as substâncias de ensaio contêm metais, é importante reco ­
nhecer que as propriedades do meio de ensaio (por exemplo, a 
dureza, capacidade quelante) podem ter influência na toxicidade da substância de ensaio. Por esta razão, é desejável utilizar um meio cuja composição seja totalmente conhecida. No entanto, actualmente, 
os únicos meios totalmente definidos que se sabe serem adequados 
para a cultura a longo prazo da  Daphnia magna  são os meios Elendt 
M4 e M7. Ambos os meios contêm o agente quelante EDTA. Alguns estudos (2) demonstram que a toxicidade aparente do cádmio é 
geralmente menor quando o ensaio da reprodução é realizado em 
meios M4 e M7 do que quando é realizado num meio que não contém EDTA. Em consequência, os meios M4 e M7 não são reco ­
mendados para o ensaio de substâncias contendo metais, devendo 
igualmente ser evitados outros meios contendo agentes quelantes. 
Para substâncias que contenham metais, poderá ser aconselhável utilizar um meio alternativo, como, por exemplo, água dura ASTM reconstituída (7), que não contém EDTA, com adição de extracto de 
algas marinhas (8). Esta combinação de água dura ASTM recons ­
tituída e extracto de algas marinhas é também adequada para culturas de longo prazo e ensaios de  Daphnia magna  (2), embora ainda 
exerça uma fraca acção quelante devido ao componente orgânico 
existente no extracto de algas marinhas adicionado.
 
A concentração de oxigénio dissolvido no início e ao longo do 
ensaio deve ser superior a 3 mg/l. O valor de pH deve estar situado 
entre 6 e 9 e não deve variar em nenhum ensaio mais do que 1,5 
unidades. Recomenda-se uma dureza superior a 140 mg/l (como CaCO
 3 ). Ensaios a este nível e superiores demonstraram que, nessas 
condições, a produção de descendência cumpre os critérios de vali ­
dade (9) (10).  
1.6.4.  Soluções de ensaio  
De um modo geral, as soluções de ensaio com as concentrações 
escolhidas são preparadas por diluição de uma solução de reserva. 
As soluções de reserva devem ser preparadas, de preferência, por dissolução da substância no meio de ensaio.
 
Em alguns casos, pode ser necessário recorrer a solventes orgânicos 
ou dispersantes de modo a produzir uma solução de reserva com uma concentração adequada, mas deverão ser feitos todos os esforços de modo a evitar a utilização de tais substâncias. A acetona, o etanol, 
o metanol, a dimetilformamida e o trietilenoglicol constituem exem ­
plos de solventes adequados. Como exemplos de dispersantes ade ­
quados, podem citar-se o Cremophor RH40, a metilcelulose 0,01 % e o HCO-40. Em qualquer um dos casos, a substância de ensaio 
presente nas soluções nunca deve exceder o limite de solubilidade no 
meio de ensaio.
 
Utilizam-se solventes com o fim de preparar uma solução de reserva 
que permita o doseamento exacto da substância no meio de cultura. Na concentração recomendada para meio de ensaio final (isto é ≤ 0,1 
ml/l), os solventes acima indicados não são tóxicos, nem aumentam 
a solubilidade da substância em água.
 
Os dispersantes podem ser úteis para o doseamento e dispersão 
correctos da substância. Na concentração recomendada para o meio 
de ensaio final (< 0,1 ml/l), os dispersantes acima indicados não são 
tóxicos, nem aumentam a solubilidade da substância em água.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1252
 
1.7. PLANEAMENTO DO ENSAIO  
Os tratamentos devem ser distribuídos pelos recipientes de ensaio e 
todos os processos de manuseamento subsequentes devem ser efec ­
tuados de modo aleatório. O não cumprimento destas recomendações 
pode provocar desvios nos resultados que poderão ser erradamente 
interpretados como um efeito da concentração. Em particular, se as unidades experimentais forem manuseadas por ordem de tratamento ou concentração, alguns efeitos relacionados com o tempo, como a 
fadiga do operador ou outro tipo de erro, poderão ter efeitos e 
repercussões de maior dimensão nas concentrações mais elevadas. Além disso, se houver indicações de que os resultados do ensaio 
podem ser afectados por uma condição inicial ou ambiental do en ­
saio, como a localização no laboratório, deve considerar-se a possi ­
bilidade de efectuar o ensaio por agrupamento de recipientes.
 
1.8. PROCEDIMENTO  
1.8.1.  Condições de exposição  
1.8.1.1.  Duração  
A duração do ensaio é de 21 dias.  
1.8.1.2.  Carga  
Os animais progenitores são mantidos individualmente, um em cada 
recipiente de ensaio, contendo cada recipiente 50-100 ml de meio.  
Por vezes, podem ser necessários volumes maiores de modo a pos ­
sibilitar o cumprimento dos requisitos do procedimento analítico utilizado para a determinação da concentração da substância de en ­
saio, embora seja também permitida a junção de repetições para 
análise química. Se forem utilizados volumes superiores a 100 ml, 
poderá ser necessário aumentar a ração fornecida às  Daphnia  de 
modo a assegurar uma disponibilidade adequada de alimento e o cumprimento dos critérios de validade. Em ensaios por escoamento, 
podem ser considerados, por razões técnicas, planos alternativos (por 
exemplo, quatro grupos de 10 animais num volume de ensaio maior), devendo, no entanto, qualquer alteração do plano do ensaio ser indicada no relatório.
 
1.8.1.3.  Número de animais  
Para ensaios semi-estáticos, deverão ser mantidos individualmente, 
pelo menos, 10 animais em cada concentração de ensaio e 10 ani ­
mais nas séries de controlo.  
Para ensaios por escoamento, concluiu-se ser adequado dividir 40 
animais por quatro grupos de 10 animais para cada concentração de 
ensaio (1). Pode ser utilizado um número menor de organismos de ensaio, sendo recomendado um mínimo de 20 animais para cada concentração, repartidos por duas ou mais repetições com igual nú ­
mero de animais (por exemplo, quatro repetições com cinco animais 
cada). Convém salientar que nos ensaios em que os animais são mantidos em grupos, não será possível expressar a produção de descendência em termos de número total de descendentes vivos pro ­
duzidos por animal progenitor vivo no fim do ensaio se os animais 
progenitores morrerem. Nestes casos, a produção de descendência deve ser expressa em termos de «número total de descendentes vivos produzidos por progenitor presente no início do ensaio».
 
1.8.1.4.  Alimentação  
Para ensaios semi-estáticos, a alimentação deve ser fornecida de 
preferência diariamente, no mínimo, três vezes por semana (isto é, correspondendo às mudanças de meio). Qualquer desvio em relação 
a essa norma (por exemplo, para ensaios por escoamento) deverá ser 
indicado no relatório.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1253
 
Durante o ensaio, a dieta dos animais progenitores deverá consistir, 
de preferência, em células de algas vivas de uma ou mais das se ­
guintes espécies:  Chlorella  sp, Selenastrum capricornutum  [agora  
Pseudokirchneriella subcapitata  (11)] e  Scenedesmus subspicatus.  
A dieta fornecida deve basear-se na quantidade do carbono orgânico 
(C) fornecida a cada animal progenitor. Os dados da investigação já 
realizada nesta área (12) demonstraram que, para a  Daphnia magna,  
níveis de ração entre 0,1 e 0,2 mg C/ Daphnia /dia são suficientes 
para atingir o número de descendentes necessário para satisfazer o 
critério de validade do ensaio. A ração pode ser fornecida a uma taxa 
constante ao longo de todo o período do ensaio ou, se for desejável, pode ser utilizada uma taxa inferior no início, que será depois au ­
mentada durante o ensaio de modo a compensar o crescimento dos 
animais progenitores. Neste caso, a ração deverá continuar a manter- 
-se dentro da gama recomendada de 0,1-0,2 mg C/ Daphma /dia.
 
Se forem utilizados medições alternativas, tais como o número de 
células de algas ou a absorvância, para determinar o nível de ração necessário (por razões de conveniência, uma vez que as medições do 
teor de carbono são muito mais demoradas), cada laboratório deve 
produzir o seu próprio nomograma em que relacione a medida alter ­
nativa com o conteúdo em carbono da cultura de algas (ver apêndice 2 para conselhos sobre a elaboração do nomograma). Os nomogra ­
mas devem ser verificados pelo menos anualmente, e com maior 
frequência se tiverem sido alteradas as condições de cultura das algas. Verificou-se que a absorvância é uma medida alternativa mais adequada para a determinação do teor de carbono do que o 
número de células (13).
 
De modo a reduzir o volume do meio de cultura de algas transferido 
para os recipientes de ensaio, a suspensão de algas fornecida às  
Daphnia  deve ser concentrada. A concentração das algas pode ser 
efectuada por centrifugação seguida de re-suspensão em água desti ­
lada, água desionizada ou meio de cultura de  Daphnia.  
1.8.1.5.  Luz  
Período de exposição à luz de 16 horas com uma intensidade que 
não exceda 15-20 μE · m  -2 · s -1 . 
1.8.1.6.  Temperatura  
A temperatura do meio de ensaio deve situar-se entre 18 e 22  o C. 
No entanto, para qualquer ensaio, a temperatura não deve, se possí ­
vel, variar mais do que 2  o C dentro destes limites (por exemplo, 18- 
-20, 19-21 ou 20-22  o C). Poderá ser vantajoso utilizar um recipiente 
de ensaio adicional para a monitorização da temperatura.  
1.8.1.7.  Arejamento  
Os recipientes de ensaio não devem ser arejados durante o ensaio.  
1.8.2.  Concentrações de ensaio  
Normalmente deverão ser testadas pelo menos cinco concentrações 
de ensaio, dispostas numa série geométrica com um factor de sepa ­
ração que não exceda de preferência 3.2 e deverá ser utilizado um 
número de repetições apropriado para cada concentração de ensaio (ver ponto 1.8.1.3). Se forem utilizadas menos de cinco concentra ­
ções, deverá ser apresentada uma justificação. As substâncias não 
devem ser ensaiadas acima do seu limite de solubilidade no meio 
de ensaio.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1254
 
Na escolha da gama de concentrações, importa ter presente o seguin ­
te: 
i) Se o objectivo consistir em determinar a LOEC/NOEC, o valor 
da menor concentração de ensaio deve ser suficientemente baixo de modo a que a fecundidade àquela concentração não seja 
significativamente inferior à do controlo. Se não for este o caso, 
o ensaio terá de ser repetido reduzindo a da menor concentração ensaiada;
 
ii) Se o objectivo for a determinação da LOEC/NOEC, o valor da 
maior concentração de ensaio deve ser suficientemente elevado para que a fecundidade àquela concentração seja significativa ­
mente inferior à do controlo. Se não for este o caso, o ensaio terá 
de ser repetido com um aumento da maior concentração;
 
iii) Se for estimada a CE  X para os efeitos sobre a reprodução, é 
aconselhável utilizar concentrações suficientes de modo a definir 
a CE  X com um nível de confiança apropriado. Se for estimada a 
CE 50 para os efeitos sobre a reprodução, é aconselhável que a 
maior concentração de ensaio seja superior a este valor CE  50 . De 
outro modo, embora seja ainda possível estimar o valor CE  50 , o 
intervalo de confiança para o valor CE  50 será muito alargado e 
poderá não ser possível estabelecer satisfatoriamente o nível de adequação do modelo ajustado;
 
iv) A gama de concentrações de ensaio não deverá incluir, de pre ­
ferência, quaisquer concentrações que tenham um efeito estatis ­
ticamente significativo na sobrevivência de adultos, pois tal al ­
teraria a natureza do ensaio, transformando um ensaio de repro ­
dução simples num ensaio combinado de reprodução e mortali ­
dade, o que exigiria urna análise estatística muito mais complexa.  
O conhecimento prévio da toxicidade da substância de ensaio (obtido 
a partir de um ensaio de toxicidade aguda e/ou de estudos prelimi ­
nares para determinação das concentrações, por exemplo) deverá ajudar na selecção das concentrações de ensaio apropriadas.
 
Quando for utilizado um solvente ou dispersante na preparação de 
soluções de ensaio (ver ponto 1.6.4), a sua concentração final nos recipientes de ensaio não deverá ser superior a 0,1 ml/l e deverá ser a 
mesma em todos os recipientes de ensaio.
 
1.8.3.  Controlos  
A par das séries de ensaio, deve ser realizada uma série de ensaios 
de controlo do meio c, se aplicável, uma série de controlo contendo o solvente ou o dispersante. Quando forem utilizados solventes ou 
dispersantes, a sua concentração deve ser igual à utilizada nos reci ­
pientes contendo a substância de ensaio. Deve utilizar-se um número apropriado de repetições (ver ponto 1.8.1.3).
 
Em geral, num ensaio bem realizado, o coeficiente de variação re ­
lativamente ao número médio de descendentes vivos produzidos por animal progenitor no(s) controlo(s) deve ser < 25 %, o que deverá ser descrito nos planos de ensaio que utilizem animais mantidos 
individualmente.
 
1.8.4.  Renovação do meio de ensaio  
A frequência da renovação do meio dependerá da estabilidade da 
substância de ensaio, mas deve ser no mínimo de três vezes por semana. Se, a partir de ensaios de estabilidade preliminares (ver 
ponto 1.4) a concentração da substância de ensaio não for estável 
(isto é, se ela se situar fora da gama de 80-120 % do valor nominal ou abaixo de 80 % da concentração inicial medida) durante o pe ­
ríodo máximo de renovação (isto é, três dias), deve considerar-se 
uma renovação mais frequente do meio ou efectuar um ensaio por 
escoamento.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1255
 
Nos ensaios semi-estáticos, quando o meio é renovado, deverá pre ­
parar-se uma segunda série de recipientes de ensaio e para onde se 
transferem os animais progenitores utilizando, por exemplo, uma pipeta de vidro de diâmetro adequado. O volume do meio transferido com a  Daphnia  deve ser reduzido ao mínimo.
 
1.8.5.  Observações  
Os resultados das observações realizadas durante o ensaio devem ser 
registados em folhas de dados (ver exemplos nos apêndices 3 e 4). 
Se tiverem de ser efectuadas outras medições, poderá ser necessário 
efectuar observações adicionais (ver pontos 1.3 e 1.8.8).  
1.8.6.  Descendência  
Os descendentes produzidos por cada animal progenitor devem ser 
retirados e contados, de preferência diariamente desde o apareci ­
mento dos primeiros juvenis, para evitar que estes consumam a 
comida destinada aos adultos. Embora para atingir o objectivo deste 
método apenas seja necessário contar o número de descendentes vivos, a presença de ovos abortados ou descendentes mortos também deverá ser indicada no relatório.
 
1.8.7.  Mortalidade  
A mortalidade entre os animais progenitores deve ser registada, de 
preferência diariamente ou, no mínimo, quando se efectua a conta ­
gem dos descendentes.  
1.8.8.  Outros parâmetros  
Embora este método seja planeado sobretudo para avaliar os efeitos 
sobre a reprodução, é possível que outros efeitos possam também ser suficientemente quantificados de modo a permitir urna análise esta ­
tística. As medições relativas ao crescimento são desejáveis, pois 
fornecem informação sobre possíveis efeitos subletais, que podem 
ser mais úteis que a simples medição relativa à reprodução. Reco ­
menda-se a medição do comprimento dos animais progenitores (isto é, o comprimento do corpo excluindo o espinho anal) no fim do 
ensaio. O tempo necessário para a produção da primeira ninhada (e 
seguintes), o número e tamanho das ninhadas por animal progenitor, o número de ovos abortados, a presença de machos ou ovos de repouso ( ephippia ) e a taxa intrínseca de crescimento da população 
são outros parâmetros que podem ser medidos ou calculados.
 
1.8.9.  Frequência das determinações analíticas e medições  
Pelo menos uma vez por semana, deve ser medida a concentração de 
oxigénio, a temperatura, o grau de dureza e os valores de pH nos meios frescos e velhos, nos controlo(s) e na maior concentração da substância de ensaio.
 
As concentrações da substância de ensaio são determinadas a inter ­
valos regulares durante o ensaio.  
Nos ensaios semi-estáticos, em que a concentração da substância de 
ensaio deverá manter-se entre ± 20 % do valor nominal (isto é, dentro da gama dos 80-120 % — ver 1.4 e 1.8.4), recomenda-se que, no mínimo, sejam analisadas a maior e menor concentrações de 
ensaio quando acabadas de preparar e uma vez durante a primeira 
semana do ensaio, na altura da renovação do meio (isto é, devem efectuar-se análises numa amostra da solução no momento em que esta acaba de ser preparada e no momento da renovação do meio). A 
partir de então, estas determinações devem ser repetidas, pelo menos, 
a intervalos semanais.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1256
 
Para os ensaios em que não é esperado que a concentração da subs ­
tância de ensaio se mantenha dentro de ± 20 % do valor nominal, é 
necessário analisar todas as concentrações de ensaio no momento em que as soluções acabam de ser preparadas e na altura da renovação do meio. No entanto, para os ensaios em que a concentração inicial 
medida da substância de ensaio não se encontra no intervalo de ± 
20 % do valor nominal, mas em que é possível fornecer provas suficientes de que as concentrações iniciais são reprodutíveis e está ­
veis (isto é, mantêm-se dentro da gama dos 80 — 120 % das con ­
centrações iniciais), as determinações químicas para concentrações de 
ensaio poderão ser reduzidas na segunda e terceira semana do ensaio, limitando-se à maior e menor concentração. Em todos os casos, a determinação das concentrações da substância de ensaio antes da 
renovação do meio só precisa de ser efectuada no recipiente de 
uma das repetições, para cada concentração de ensaio.
 
Se for efectuado um ensaio por escoamento, é adequado aplicar um 
método de amostragem semelhante ao descrito para os ensaios semi- -estáticos (não sendo, neste caso, aplicável a medição de soluções 
«usadas»). No entanto pode ser aconselhável aumentar o número de 
amostragens durante a primeira semana (efectuando três conjuntos de medições, por exemplo) de modo a assegurar que as concentrações de ensaio se mantêm estáveis. Nestes tipos de ensaio, a taxa de fluxo 
do diluente e da substância de ensaio deverá ser verificada diaria ­
mente.
 
Se existirem provas de que, durante o ensaio, a concentração da 
substância de ensaio não excedeu ± 20 % do valor da concentração nominal ou da concentração inicial medida, os resultados podem 
basear-se nos valores nominais ou iniciais medidos. Se o desvio 
em relação ao valor nominal ou da concentração inicial medida for superior a ± 20 %, os resultados devem ser expressos através da média ponderada em função do tempo (ver o apêndice 5).
 
2. DADOS E RELATÓRIO  
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS  
O objectivo deste ensaio consiste em determinar o efeito da subs ­
tância de ensaio no número total de descendentes vivos produzidos por animal progenitor vivo no fim do ensaio. Deverá calcular-se o número total de descendentes por animal progenitor em cada reci ­
piente de ensaio (isto é, em cada repetição). Se, em qualquer repe ­
tição, se observar a presença de animais progenitores mortos durante o ensaio ou se o progenitor for um macho, a repetição é excluída do ensaio. A análise basear-se-á então num número reduzido de repeti ­
ções.
 
Para determinar a LOEC e, consequentemente, a NOEC em relação 
aos efeitos da substância química na produção de descendência, é necessário calcular a produção da descendência média nas repetições de cada concentração e o desvio-padrão residual conjunto, o que 
poderá ser feito através de uma análise de variância (ANOVA). A 
média para cada concentração deve ser então comparada com a média observada no controlo, utilizando um método de comparações múltiplas apropriado. Os testes de Dunnett ou Williams (14) (15) 
(16) (17) poderão ser úteis para o efeito. É necessário verificar se se 
verifica a presunção de homogeneidade da variância calculada atra ­
vés da ANOVA. Recomenda-se que isso seja realizado graficamente e não por meio de um teste de significância formal (18); uma alter ­
nativa adequada consiste em realizar um teste de Bartlett. Se esta 
presunção não se verificar, deve considerar-se a transformação dos dados de modo a homogeneizar as variâncias antes de realizar a ANOVA, ou a realização de uma ANOVA ponderada. Deve ser 
calculada e registada a dimensão do efeito detectável através da 
ANOVA (isto é, a diferença menos significativa).
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1257
 
Para efectuar uma estimativa da concentração que causaria uma re ­
dução de 50 % no resultado reprodutivo (isto é, a CE  50 ), deverá 
ajustar-se aos dados uma curva adequada (curva logística, por exem ­
plo), utilizando um método estatístico como, por exemplo, o método dos mínimos quadrados. A curva pode ser parametrizada de modo a 
que a CE
 50 e o seu desvio-padrão possam ser estimados directamen ­
te, o que facilitaria enormemente o cálculo dos limites de confiança da CE
 50 . Deverão ser utilizados limites de confiança de mais ou 
menos 95 %, a não ser que existam boas razões para preferir níveis 
de confiança diferentes. É aconselhável que o procedimento de ajuste 
da curva permita avaliar a significância dos desvios. Isto poderá ser realizado graficamente ou dividindo a soma residual dos quadrados em «desvios de ajuste» e «componentes de erro puro» e realizando 
um teste de significância para os desvios. Uma vez que os tratamen ­
tos que resultam em elevada fecundidade são susceptíveis de registar, relativamente ao número de juvenis produzidos, uma variação supe ­
rior à que se verifica nos tratamentos que resultam em baixa fecun ­
didade, deverá considerar-se a ponderação dos valores observados de 
modo a reflectir as diferentes variâncias nos diferentes grupos de tratamento [para informação sobre este assunto, ver referência (18)].
 
Na análise dos dados do ensaio interlaboratorial final (2), a curva 
logística foi ajustada utilizando o modelo seguinte, embora possam 
ser adoptados outros modelos adequados:  
Y ¼ c 
1 þ x 
x 0 Í Î  b 
em que:  
Y = é o número total de juvenis por animal progenitor vivo no 
fim do ensaio (calculado para cada recipiente)  
x = é o valor da concentração da substância  
c = é o número esperado de juvenis quando x = 0  
x 0 = é o valor CE  5o na população  
b = é o parâmetro de declive  
Este modelo deverá ser adequado num elevado número de situações, 
embora possivelmente não o seja para todos os ensaios. Como se propõe acima, deve realizar-se um teste para verificar a validade do 
modelo. Em alguns casos, poderá ser apropriado utilizar um modelo 
hormesis, no qual os efeitos observados a baixas concentrações são ampliados (19).
 
Poderão também ser estimadas outras concentrações, tais como a 
CE 10 ou CE  20 , embora neste caso possa ser preferível utilizar uma 
parametrização do modelo diferente da utilizada para estimar a CE  50 . 
2.2. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deve incluir o seguinte:  
2.2.1.  Substância de ensaio:  
— natureza física e propriedades físico-químicas relevantes,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1258
 
— dados relativos à identificação química, incluindo a pureza.  
2.2.2.  Espécie de ensaio:  
— o clone (quer tenha sido ou não geneticamente identificado), o 
fornecedor ou fonte (se conhecidos) e as condições de cultura 
utilizadas. Se for utilizada uma espécie diferente de  Daphnia 
magna,  tal deverá ser registado e justificado.  
2.2.3.  Condições do ensaio:  
— o método de ensaio utilizado (por exemplo, semi-estático ou por 
escoamento, o volume, a carga expressa em número de  Daphnia  
por litro),  
— fotoperíodo e intensidade da luz,  
— plano do ensaio (número de repetições, número de progenitores 
por repetição, por exemplo),  
— informações pormenorizadas sobre o meio de cultura utilizado,  
— eventuais adições de material orgânico, incluindo a composição, 
a fonte, o método de preparação, o COT/CQO de preparações de reserva, a estimativa do COT/CQO resultante no meio de ensaio,
 
— informação pormenorizada sobre a alimentação, incluindo as 
quantidades (em mg C/ Daphnia/ dia) e a descrição [o tipo de 
alimento(s), incluindo — para as algas — o nome específico (espécie) e, se conhecida, a estirpe e as condições de cultura, por exemplo],
 
— método de preparação das soluções de reserva e frequência de 
renovação do meio (quando utilizados, devem ser fornecidas as concentrações do solvente ou dispersante).
 
2.2.4.  Resultados:  
— resultados de quaisquer estudos preliminares sobre a estabilidade 
da substância de ensaio,  
— o valor nominal das concentrações de ensaio e os resultados de 
todas as análises para determinar a concentração da substância de 
ensaio nos recipientes de ensaio (ver exemplo de folha de dados 
no apêndice 4); a eficiência de recuperação do método e o limite de determinação também deverão ser regista dos,
 
— a qualidade da água nos recipientes de ensaio (isto é, o pH, a 
temperatura e a concentração de oxigénio dissolvido, assim como 
o COT e/ou a CQO e a dureza, quando aplicável) (ver exemplo de folha de dados no apêndice 3),
 
— o registo completo da descendência viva de cada animal proge ­
nitor (ver exemplo nas folhas de dados do apêndice 3),  
— o número de animais progenitores mortos e o dia em que ocorreu 
a morte (ver exemplo de folha de dados no apêndice 3).  
— o coeficiente de variação da fecundidade no controlo (baseado no 
número total de descendentes vivos por animal progenitor vivo no fim do ensaio),
 
— representação gráfica do número total de descendentes vivos por 
animal progenitor vivo (para cada repetição) no fim do ensaio, em função da concentração da substância de ensaio,
 
— a menor concentração com efeito observável (LOEC) na repro ­
dução, incluindo uma descrição dos métodos estatísticos utiliza ­
dos, uma indicação da dimensão do efeito que poderia ser de ­
tectada e a concentração sem efeito observável (NOEC) na re ­
produção; quando for apropriado, também deverão ser regista dos 
os valores LOEC/NOEC para a mortalidade dos animais proge ­
nitores,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1259
 
— quando for apropriado, o valor CE  X para a reprodução, os inter ­
valos de confiança, um gráfico do modelo ajustado utilizado para 
o seu cálculo, o declive da curva de dose/resposta e o seu desvio- -padrão,
 
— outras medições ou efeitos biológicos observados: descrição de 
qualquer outro efeito biológico que tenha sido observado ou 
medido (crescimento de animais progenitores, por exemplo), in ­
cluindo qualquer justificação apropriada,  
— uma explicação para qualquer desvio do método de ensaio.  
3. REFERÊNCIAS  
(1) OECD Test Guideline Programme, Report of the Workshop on 
the Daphnia magna  Pilot Ring Test, Sheffield University, UK, 
20-21 March 1993.  
(2) OECD Environmental Health and Safety Publications. Series 
on Testing and Assessment No. 6. Report of the Final Ring 
Test of the Daphnia  magna  Reproduction Test Paris. 1997.  
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Calow P. (1991). A comparative study of genotype sensitivity to acute toxic stress using clones of  Daphnia magna  Strauss. 
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Straus. Protoplasma, 154, p. 25-33.  
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Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Or ­
ganisms. (Fourth ed.). EPA/600/4-90/027F. C. I. Weber (ed), 
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Environ. Contam. Toxicol., 47, p. 775-782.  
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Tests with Fishes, Macroinvertebrates and Amphibians. E729- 
-88a. American Society for Testing and Materials, Philadelphia 
P.A. 20 p.  
(8) Baird D. J., Soares A. M. V. M., Girling A., Barber J., Bradley 
M. C. and Calow P. (1989). The long term maintenance of  
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(9) Parkhurst B. R., Forte J. L. and Wright G. P. (1981). Repro ­
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Bull. Environ. Contam. and Toxicol., 26, p. 1-8.  
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cladocerans to water quality variables: salinity and hardness. Arch. Hydrobiol., 120(2), p. 185-196.
 
(11) Korshikov (1990).  Pseudokirchneriella subcapitata  Hindak, F- 
-1990. Biologice Prace, 36, 209.  
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(14) Dunnett C. W., (1955). A multiple comparisons procedure for 
comparing several treatments with a control. J. Amer. Statist. 
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(15) Dunnett C. W., (1964). New tables for multiple comparisons 
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(16) Williams D. A. (1971). A test for differences between treat ­
ment means when several dose levels are compared with a zero 
dose control. Biometrics 27, p. 103-117.  
(17) Williams D. A. (1972). The comparison of several dose levels 
with a zero dose control. Biometrics, 28, p. 510-531.  
(18) Draper N. R. and Smith H. (1981). Applied Regression 
Analysis, second edition, Wiley, N.Y.  
(19) Brain P. and Cousens R. (1989). An equation to describe dose 
responses where there is stimulation of growth at low doses. 
Weed Research, 29, p. 93-96.  
(20) Wilson E. O. and Bossert, W. H. (1971). A Primer of Popu ­
lation Biology. Sinauer Associates Inc. Publishers.  
(21) Poole R. W. (1974). An Introduction to quantitative Ecology. 
McGraw-Hill Series in Population Biology, New York, p. 532.  
(22) Meyer J. S., Ingersoll C. G., McDonald L. L. and Boyce M. S. 
(1986). Estimating uncertainty in population growth rates: Jackknife vs bootstrap techniques. Ecology, 67, p. 1156-1166.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1261
 
Apêndice I  
PREPARAÇÃO DOS MEIOS TOTALMENTE DEFINIDOS ELENDT M7 
E M4  
Aclimatação aos meios Elendt M7 e M4  
Alguns laboratórios tiveram dificuldades na transferência directa de  Daphnia  para 
os meios M4 (1) e M7. No entanto, obteve-se algum sucesso com uma aclima ­
tação gradual, isto é, transferindo do próprio meio para Elendt a 30 %, a 60 % e, por fim, a 100 %. Os períodos de aclimatação necessários podem atingir a duração de um mês.
 
PREPARAÇÃO  
Elementos vestigiais  
Em primeiro lugar, preparam-se soluções de reserva separadas (I) de elementos 
vestigiais individuais em água com um grau de pureza adequado — por exemplo, 
desionizada, destilada ou submetida a osmose inversa. A partir destas soluções de 
reserva individuais (I), é preparada uma segunda solução de reserva simples (II), que contém todos os elementos vestigiais (solução combinada), isto é:
 
Soluções de reserva I 
(substância simples) Quantidade 
adicionada à água 
(mg/l) Concentração (em 
relação ao meio 
M4) 
x (vezes) Para preparar a solução de reserva 
combinada II, adicionar a seguinte 
quantidade de solução de reserva I à 
água 
(ml/l) 
M 4 M 7 
H 3 BO 3 57 190 20 000 1,0 0,25 
MnCl  2 * 4 H  2 O 7 210 20 000 1,0 0,25 
LiCl 6 120 20 000 1,0 0,25 
RbCl 1 420 20 000 1,0 0,25 SrCl
 2 * 6 H  2 O 3 040 20 000 1,0 0,25 
NaBr 320 20 000 1,0 0,25 Na
 2 MoO  4 * 2 H  2 O 1 260 20 000 1,0 0,25 
CuCl  2 * 2 H  2 O 335 20 000 1,0 0,25 
ZnCl  2 260 20 000 1,0 1,0 
CoCl  2 * 6 H  2 O 200 20 000 1,0 1,0 
Kl 65 20 000 1,0 1,0 Na
 2 SeO  3 43,8 20 000 1,0 1,0 
NH  4 VO  3 11,5 20 000 1,0 1,0 
Na 2 EDTA · 2 H  2 O 5 000 2 000 — — 
FeSO  4 * 7 H  2 O 1 991 2 000 — — 
Ambas as soluções Na  2 EDTA e FeSO  4 são preparadas individualmente, juntas e imediatamente autoclavadas. Isto dá: 
21 solução Fe-EDTA 1 000 20,0 5,0  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1262
 
Meios M4 e M7  
Os meios M4 e M7 são preparados utilizando a solução de reserva II, os ma ­
cronutrientes e as vitaminas tal como indicado:  
Quantidade 
adicionada à água 
(mg/l) Concentração 
(relacio-nada com 
o meio M4) 
X (vezes) Quantidade de solução de reserva 
adicionada para preparar o meio 
ml/l 
M 4 M 7 
Solução de reserva 11 elementos vestigiais 
combinados 20 50 50 
Soluções de reserva de macronutrientes (substância única) 
CaCl  2 * 2 H  2 O 293 800 1 000 1,0 1,0 
MgSO  4 * 7 H  2 O 246 600 2 000 0,5 0,5 
KCl 58 000 10 000 0,1 0,1 NaHCO
 3 64 800 1 000 1,0 1,0 
Na 2 SiO  3 * 9 H  2 O 50 000 5 000 0,2 0,2 
NaNO  3 2 740 10 000 0,1 0,1 
KH  2 PO 4 1 430 10 000 0,1 0,1 
K 2 HPO  4 1 840 10 000 0,1 0,1 
Solução de reserva de vitaminas — 10 000 0,1 0,1 A solução de reserva de vitaminas é preparada adicionando as três vitaminas a 1 l de água como se mostra em baixo: Hidrocloreto de tiamina 750 10 000 — — Cianocobalamina (B
 12 ) 10 10 000 — — 
Biotina 7,5 10 000 — —  
A solução de reserva de vitaminas é armazenada e congelada em pequenas alíquotas. As vitaminas são adicionadas ao meio imedia ­
tamente antes da utilização.  
Notas:  Para evitar a precipitação dos sais quando se prepara o meio completo, adicionar as alíquotas de soluções de reserva a cerca d e 
500-800 ml de água desionizada e perfazer até 1 l. 
A primeira publicação relativa ao meio M4 tem a seguinte referência: Elendt, B.P. (1990).  Selenium deficiency in crustacea: an 
ultras-tructural approach  to antennal damage  in Daphnia magna  Straus . Protoplasma, 154, 25-33.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1263
 
Apêndice 2  
ANÁLISE DO CARBONO ORGÂNICO TOTAL (COT) E PRODUÇÃO 
DE UM NOMOGRAMA PARA O TEOR COT DAS ALGAS QUE 
SERVEM DE ALIMENTO  
Reconhece-se que o teor de carbono das algas que servem de alimento não será 
normalmente medido directamente, mas sim através de correlações (isto é, nomo ­
gramas) com medições alternativas, tais como o número de células de algas ou a absorvância).
 
O COT deve ser medido por oxidação a alta temperatura em vez de utilizar 
métodos de UV ou persulfato. (ver:  The Instrumental Determination of Total  
Organic  Carbon. Total Oxygen Demand and Related Determinands  1979, 
HMSO 1980; 49 High Holborn, London WC1V 6HB).  
Para a elaboração do nomograma, as algas devem ser separadas do meio de cresci ­
mento por centrifugação, seguida de re-suspensão em água destilada. Medir o parâ ­
metro de substituição e a concentração de COT em cada amostra em triplicado. 
Devem ser analisados «brancos» de água destilada e a concentração de COT deverá 
ser deduzida a partir da concentração de COT presente na amostra de algas.  
O nomograma deve ser linear em toda a gama de concentrações de carbono 
necessária. São indicados a seguir alguns exemplos.  
Nota:  Estes exemplos não deverão ser aproveitados para efectuar conversões; é 
essencial que os laboratórios preparem os seus próprios nomogramas.
  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1264
 
▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1265
 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1266
 ▼B 
Apêndice 3  
EXEMPLO DE FOLHAS DE DADOS COM REGISTO DA RENOVAÇÃO DOS MEIOS, DADOS DE MONITORIZAÇÃO FÍSICA/QUÍMICA, ALIMENTAÇÃO, REPRODUÇÃO D E 
DAPHNIA  E MORTALIDADE DE ADULTOS  
Experiência número: Dados iniciais: Clone: Meio: Tipo de alimento Substância de ensaio: Conc. nominal: 
Dia 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
Renovação do meio 
(assinalar os dias) 
PH (  1 ) novo 
velho 
O 2 mg/l (  1 ) novo 
velho 
Temperatura (  o C) (  1 ) novo 
velho 
Alimentos fornecidos 
(assinalar os dias) 
Número de descen ­
dentes vivos Total 
Recipiente 1 
2 
3 
4 5
 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1267
 ▼B 
Experiência número: Dados iniciais: Clone: Meio: Tipo de alimento Substância de ensaio: Conc. nominal: 
Dia 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21  
6 
7 8 9 10 
Total 
Mortalidade cumulativa de 
adultos
 
( 1 ) Indicar o recipiente utilizado na experiência.
 Apêndice 4  
EXEMPLO DE FOLHA DE DADOS PARA REGISTO DE RESULTADOS DA ANÁLISE QUÍMICA  
a) Concentrações medidas  
Conc. nominal Amostra da semana 1 Amostra da semana 2 Amostra da semana 3 
Nova Velha Nova Velha Nova Velha  
b) Concentrações medidas em percentagem do valor nominal  
Conc. nominal Amostra da semana 1 Amostra da semana 2 Amostra da semana 3 
Nova Velha Nova Velha Nova Velha  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1268
 
Apêndice 5  
CÁLCULO DA MÉDIA PONDERADA EM FUNÇÃO DO TEMPO  
Média ponderada em função do tempo  
Considerando que a concentração da substância de ensaio pode diminuir durante 
o período entre renovações do meio, é necessário determinar um valor de con ­
centração representativo da gama de concentrações a que os progenitores  Daph­
nia foram expostos. A determinação desse valor deve basear-se tanto em consi ­
derações biológicas como estatísticas. Por exemplo, se se considerar que a re ­
produção é afectada principalmente pela concentração máxima experimentada, 
deverá utilizar-se a concentração máxima, No entanto, se se considerar que o 
efeito acumulado ou a longo prazo da substância tóxica tem um peso mais importante, será mais adequado utilizar um valor médio de concentração. Neste caso, a concentração média ponderada em função do tempo será um valor apro ­
priado, uma vez que considera a variação da concentração instantânea ao longo 
do tempo.
 
Figura 1:  
Exemplo de média ponderada em função do tempo
  
A figura 1 mostra um exemplo de um ensaio (simplificado) com a duração de 
sete dias, em que o meio é renovado nos dias 0, 2 e 4.  
— A linha em ziguezague representa a concentração ao longo do tempo. Assu ­
me-se que a queda do valor de concentração segue uma curva exponencial.  
— Os seis pontos representados no gráfico representam as concentrações medi ­
das no início e fim de cada período de renovação.  
— A linha mais espessa indica a posição da média ponderada em função do 
tempo.  
A média ponderada em função do tempo é calculada de modo a que a área 
abaixo desse valor seja igual à área abaixo da curva de concentração. O quadro 
1 apresenta em pormenor o cálculo correspondente ao exemplo da figura 1.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1269
 
Quadro 1:  
Cálculo da média ponderada em função do tempo  
Número da renovação Dias Conc0 Conc 1 Ln(Conc0) Ln(Concl) Área  
1 2 10,000 4,493 2,303 1,503 13,767 
2 2 11,000 6,037 2,398 1,798 16,544 3 3 10,000 4,066 2,303 1,403 19,781 
Total de dias: 7 Área total 50,091 
Média pon ­
derada em 
função do 
tempo 7,156
 
A coluna «Dias» corresponde ao número de dias no período de renovação.  
A coluna «Conc0» corresponde à concentração medida no início de cada período de reno ­
vação.  
A coluna «Conc1» corresponde ã concentração medida no fim de cada período de renova ­
ção. 
A coluna «Ln(Conc0)» corresponde ao logaritmo natural de Conc0.  
A coluna «Ln(Conc1)» corresponde ao logaritmo natural de Concl.  
A coluna «Área» corresponde à área abaixo da curva exponencial para cada período de 
renovação. É calculada através da seguinte fórmula:  
Área ¼ Conc 0 Ä Conc 1 
LnðConc 0Þ Ä LnðConc 1Þ Ü Dias  
A média ponderada em função do tempo (MPFT) é a «Área total» dividida pelo 
«Total de dias».  
Para o ensaio de reprodução de  Daphnia,  o quadro deverá, obviamente, ser 
aumentado de modo a abranger 21 dias.  
É óbvio que, quando as observações se limitam ao princípio e ao fim de cada 
período de renovação, não é possível confirmar se o decaimento segue, de facto, uma curva exponencial. Uma curva diferente resultará num cálculo diferente para 
os valores da «Área». No entanto, o decaimento seguindo uma curva exponencial 
constitui um modelo plausível, que não é de excluir e que, na ausência de outras informações, constituirá, provavelmente, a curva mais adequada.
 
No entanto, é necessário tomar algum cuidado no caso de a análise química não 
permitir detectar a substância no fim do período de renovação. A não ser que seja 
possível estimar a velocidade a que a substância desapareceu da solução, é 
impossível obter uma área realista abaixo da curva e, consequentemente, é im ­
possível obter uma média ponderada em função do tempo que seja razoável.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1270
 
C.21.  MICROoRGANISMOS DO SOLO: ENSAIO DE 
TRANSFORMAÇÃO DE AZOTO  
1. MÉTODO  
O presente método de ensaio baseia-se na publicação OCDE TG 216 
(1999).  
1.1. INTRODUÇÃO  
O presente método de ensaio descreve um método laboratorial concebido 
para a investigação dos efeitos, a longo prazo, resultantes de uma única exposição a produtos químicos, na capacidade de transformação do azoto pelos microorganismos do solo. O ensaio baseia-se, fundamentalmente, 
nas recomendações da Organização Europeia e Mediterrânica para a 
Protecção das Plantas (1), embora tenham sido igualmente consideradas outras linhas de orientação, nomeadamente as fornecidas pelas seguintes organizações: Biologische Bundesanstalt da Alemanha (2); Agência de 
Protecção do Ambiente dos EUA (3); SETAC (4) e Organização Inter ­
nacional de Normalização (ISO) (5). As orientações respeitantes ao nú ­
mero e tipo de solos a utilizar neste ensaio são as acordadas na reunião de trabalho da OCDE sobre Selecção de Solos/Sedimentos que decorreu em 
Belgirate, Itália, em 1995 (6). As recomendações respeitantes à recolha, 
manuseamento e armazenamento de amostras de solos baseiam-se nas normas ISO 10381-6 (7) e nas recomendações da reunião de Belgirate. A determinação e avaliação das características de toxicidade de determina ­
das substâncias de ensaio poderão requerer a determinação dos seus 
efeitos sobre a actividade microbiana dos solos, por exemplo, quando se pretendem conhecer os potenciais efeitos secundários de produtos utilizados na protecção de culturas agrícolas sobre a microflora do 
solo ou quando se prevê a exposição dos microorganismos do solo a 
outro tipo de substâncias químicas. O ensaio de transformação de azoto aplica-se na determinação dos efeitos destes produtos sobre a microflora do solo. No ensaio de produtos químicos agrícolas (por exemplo, pro ­
dutos de protecção de culturas, fertilizantes, químicos florestais) deverão 
realizar-se os ensaios de transformação de azoto e de transformação de carbono. Nos ensaios de produtos químicos não agrícolas, considera-se suficiente a realização do ensaio de transformação de azoto, ressalvando- 
-se os casos em que os valores de CE
 50 obtidos no ensaio de transforma ­
ção de azoto se encontrem dentro dos valores correspondentes aos ini ­
bidores de nitrificação comerciais (por exemplo, nitrapirina), casos em que deve ser efectuado um ensaio de transformação de carbono no 
sentido de se obter informação adicional.
 
Os solos são misturas complexas e heterogéneas de elementos vivos e 
não vivos. Os microorganismos desempenham um papel importante na decomposição e transformação da matéria orgânica em solos férteis através de processos complexos em que diversas espécies contribuem 
de forma distinta para cada um dos factores que determinam a fertili ­
dade do solo. Por este motivo, qualquer interferência a longo prazo nos processos bioquímicos envolvidos constitui uma potencial interferên ­
cia nos ciclos nutricionais, podendo vir a afectar a fertilidade do solo. A 
transformação de carbono e de azoto ocorre em todos os solos férteis e, 
ainda que as comunidades de microorganismos responsáveis por estes processos divirjam de solo para solo, as vias e processos de transfor ­
mação são essencialmente os mesmos.
 
O Método de Ensaio aqui descrito foi desenvolvido com o objectivo de 
determinar os efeitos adversos a longo prazo de uma substância no 
processo de transformação de azoto em solos aeróbios de superfície. Este método de ensaio permite ainda estimar os efeitos dos produtos testados sobre a transformação de carbono pela microflora dos solos. 
Uma vez que a formação de nitratos ocorre subsequentemente à quebra 
das ligações azoto-carbono, a observação de taxas idênticas de produção de nitratos em solos tratados e de referência indica que é muito elevada a probabilidade de as principais etapas de degradação do carbono se en ­
contrarem intactas e funcionais. O substrato escolhido para o ensaio 
(farinha de luzerna) possui uma relação carbono/azoto adequada (geral ­
mente entre 12/1 e 16/1). Por este motivo, a privação de carbono é reduzida durante o ensaio e, no caso de as comunidades de microorga ­
nismos serem afectadas por um produto químico, será possível a sua 
recuperação num período de 100 dias.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1271
 
Os ensaios que serviram de base ao presente Método de Ensaio 
foram inicialmente desenvolvidos para substâncias relativamente às 
quais é possível estimar a quantidade de substância que atinge o solo. É o caso, por exemplo, dos produtos utilizados para a protecção de culturas agrícolas, uma vez que é conhecida a sua taxa de apli ­
cação nos campos. No caso de produtos químicos agrícolas, consi ­
dera-se suficiente o ensaio de duas doses relevantes, relativamente à taxa de aplicação estimada ou prevista. Os produtos químicos agrí ­
colas podem ser testados como ingredientes activos (i.a.) ou como 
formulações. A aplicação deste ensaio não se limita, no entanto, a 
produtos químicos agrícolas. Fazendo variar simultaneamente a quantidade de substância de ensaio aplicada no solo e o método de avaliação dos dados, o ensaio poderá ser igualmente utilizado 
em situações em que não é conhecida a quantidade de produto 
químico que atinge o solo Deste modo, para produtos químicos não agrícolas, deverão determinar-se os efeitos de uma série de concentrações sobre a transformação de azoto e utilizar-se os dados 
obtidos nesses ensaios para construir uma curva de dose-resposta, a 
partir da qual se calculam os valores de CE
 x , em que x corresponde 
à percentagem de efeito.  
1.2. DEFINIÇÕES  
Transformação de azoto:  é a degradação total por microorganismos 
de matéria orgânica contendo azoto, através do processo de amoni ­
ficação e nitrificação, até ao respectivo nitrato inorgânico final.  
EC x (Concentração Efectiva):  é a concentração da substância de 
ensaio no solo que resulta numa percentagem x de inibição da trans ­
formação de azoto em nitrato.  
EC 50 (Concentração Média Efectiva):  é a concentração da subs ­
tância de ensaio no solo que resulta em 50 % de inibição da trans ­
formação de azoto em nitrato.  
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Nenhuma.  
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
Depois de peneirado, adiciona-se ao solo uma farinha de cereal, após o 
que se reserva uma parte que irá ser utilizada como controlo e se trata o restante com a substância de ensaio. No ensaio de produtos químicos agrícolas recomenda-se o teste de um mínimo de duas concentrações, 
que deverão ser escolhidas tendo em conta a maior concentração de 
substância que se prevê que venha a ser aplicada no campo. Após 0, 7, 14 e 28 dias de incubação, procede-se à extracção de amostras dos solos tratados e de controlo com um solvente adequado e determinam-se as 
quantidades de nitratos nos extractos. A taxa de formação de nitratos 
nas amostras tratadas é comparada com a taxa de formação de nitratos nas amostras de controlo e calcula-se a percentagem de desvio das amostras tratadas. Todos os ensaios têm uma duração mínima de 28 
dias. Se ao 28.
 o dia as diferenças entre as amostras tratadas e as amos ­
tras não tratadas forem iguais ou superiores a 25 %, deverão continuar a efectuar-se medições até ao limite de 100 dias. Nos ensaios de produtos químicos não agrícolas, adiciona-se uma série de concentrações da 
substância de ensaio a amostras de solo, medindo-se as quantidades 
de nitratos formadas nas amostras tratadas e nas amostras de controlo após 28 dias de incubação. Os resultados dos ensaios com múltiplas concentrações são analisados através de um modelo de regressão, com 
base no qual se calculam os valores de CE
 X (isto é: CE  50 , CE  25 ou 
CE 10 ). Ver definições.  
1.5 VALIDADE DO ENSAIO  
As análises dos resultados dos ensaios com produtos químicos agrí ­
colas baseiam-se em diferenças relativamente pequenas (isto é, com 
um valor médio de ± 25 %) entre as concentrações de nitrato nas amostras de solo tratadas e nas amostras de controlo. Por este mo ­
tivo, e uma vez que grandes variações entre as amostras de controlo 
podem conduzir a resultados falsos, a variação entre repetições das 
amostras de controlo deve ser inferior a ± 15 %.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1272
 
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.6.1.  Equipamento  
Os recipientes utilizados durante o ensaio devem ser de materiais 
quimicamente inertes e ter uma capacidade adequada ao método 
usado na incubação dos solos, isto é, a granel ou numa série de 
amostras de solo individualizadas (ver secção 1.7.1.2). Devem to ­
mar-se precauções no sentido de minimizar as perdas de água e permitir trocas gasosas durante o ensaio (por exemplo, os recipientes 
de ensaio podem ser cobertos com folhas de polietileno perfuradas). 
Para o ensaio de substâncias voláteis, devem ser usados recipientes seláveis e estanques com dimensões que permitam que aproximada ­
mente um quarto do seu volume seja ocupado pela amostra de solo.
 
Utiliza-se, para além do equipamento corrente de laboratório, o se ­
guinte equipamento:  
— mecanismo de agitação: agitador mecânico ou equipamento equi ­
valente,  
— mecanismo de centrifugação (3 000 g) ou de filtração (uso de 
filtro que não contenha nitratos),  
— instrumento de sensibilidade e reprodutibilidade adequadas para 
análise de nitratos.  
1.6.2.  Selecção e número de solos  
No presente ensaio utiliza-se um único solo, cujas características 
recomendadas são as seguintes:  
— teor de areia: não inferior a 50 % e não superior a 75 %,  
— pH: 5,5 a 7,5,  
— teor de carbono orgânico: 0,5 a 1,5 %,  
— a biomassa microbiana deve ser medida (8)(9) e o seu teor de 
carbono deve corresponder, no mínimo, a 1 % do total de car ­
bono orgânico do solo.  
Na maioria dos casos, um solo com estas características representa a 
situação menos favorável, uma vez que nestas condições a adsorção da substância química de ensaio é mínima e a sua disponibilidade 
para a microflora é máxima. Por este motivo, a realização de ensaios 
com outros solos é geralmente desnecessária. Contudo, em determi ­
nadas circunstâncias, por exemplo, quando se prevê que a substância de ensaio venha a ser principalmente utilizada em solos específicos, 
tais como solos florestais acídicos, ou para produtos químicos com 
carga electrostática, poderá ser necessário utilizar um solo adicional.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1273
 
1.6.3.  Recolha e armazenamento das amostras de solo  
1.6.3.1.  Recolha  
Deve existir, e estar disponível, informação pormenorizada sobre a 
história do local donde foram recolhidas, as amostras de solo para o 
ensaio. A informação necessária inclui a localização exacta, o co ­
berto vegetal, as datas dos tratamentos com produtos utilizados para a protecção de culturas agrícolas, os tratamentos com fertilizantes orgânicos e inorgânicos, as aplicações de materiais biológicos e as 
de contaminações acidentais. Deverá ser escolhido, para a recolha de 
solo, um local que permita o seu uso a longo prazo. Consideram-se locais adequados: as pastagens permanentes, os campos com culturas 
anuais de cereais (à excepção de milho) ou os campos densamente 
semeados para produção de adubo natural. No local escolhido para a amostragem não devem ter sido aplicados produtos de protecção de culturas agrícolas, pelo menos, durante o último ano, nem nenhum 
fertilizante orgânico, pelo menos, nos últimos seis meses. O uso de 
fertilizantes minerais apenas poderá ser aceite quando em concordân ­
cia com as necessidades das culturas agrícolas e, nesse caso, a reco ­
lha de amostras de solo não deverá ser efectuada antes de passados 
três meses após a aplicação do fertilizante. Deve ser evitado o uso de 
solos tratados com fertilizantes que tenham efeitos biocidas conhe ­
cidos (por exemplo, cianamida de cálcio).
 
Deve ser evitada a recolha de amostras durante, ou imediatamente 
após, períodos longos (superiores a 30 dias) de seca ou de excessos de água. Em solos lavrados, as amostras devem ser recolhidas a uma profundidade de 0 a 20 cm. Nas pastagens ou outros solos que não 
são lavrados durante períodos longos (pelo menos, uma época de 
cultivo), a profundidade máxima de amostragem pode ser ligeira ­
mente superior a 20 cm (por exemplo, até 25 cm).
 
As amostras de solo devem ser transportadas em recipientes adequa ­
dos, em condições de temperatura que garantam que as propriedades iniciais do solo não são alteradas de forma significativa.
 
1.6.3.2.  Armazenamento  
Sempre que possível, é de preferir a utilização de amostras de solos 
recolhidas na altura. Nos casos em que o armazenamento em labo ­
ratório não possa ser evitado, os solos devem ser armazenados no escuro, a uma temperatura de 4 ± 2
 o C e por um período máximo de 
três meses. Durante o armazenamento dos solos, devem ser assegu ­
radas condições aeróbias. Se os solos forem recolhidos em zonas onde permanecem gelados por períodos iguais ou superiores a três meses por ano, poderá ser considerada a hipótese do seu armazena ­
mento durante seis meses a uma temperatura entre 18
 o C negativos e 
22 o C negativos. A biomassa microbiana de solos armazenados é 
medida antes de cada experiência e o teor de carbono na biomassa não deverá ser inferior a 1 % do teor total de carbono orgânico no 
solo (ver secção 1.6.2).
 
1.6.4.  Manuseamento e preparação do solo para o ensaio  
1.6.4.1.  Pré-incubação  
Se o solo esteve armazenado (ver secção 1.6.3.2), recomenda-se um 
período de pré-incubação de 2 a 28 dias. A temperatura e a humi ­
dade do solo durante a pré-incubação e o ensaio devem ser idênticas 
às utilizadas durante o ensaio (ver secções 1.6.4.2 e 1.7.1.3).  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1274
 
1.6.4.2.  Características físico-químicas  
Os objectos de grandes dimensões (por exemplo, pedras, pedaços de 
plantas, etc.) são removidos manualmente do solo e a amostra é peneirada húmida, evitando dessecação excessiva, de forma a reduzir 
as partículas a uma dimensão máxima de 2 mm. O teor de humidade 
da amostra de solo deve ser ajustado com água destilada ou desio ­
nizada para um valor entre 40 % e 60 % da sua capacidade máxima de retenção de água.
 
1.6.4.3.  Adição de substrato orgânico  
Deverá ser adicionado ao solo um substrato orgânico adequado — 
por exemplo, farinha de luzerna-erva-relva (componente principal:  
Medicago sativa)  com uma relação C/N entre 12/1 e 16/1. A relação 
luzerna-solo recomendada é de 5 g de luzerna por quilograma de solo (peso seco).
 
1.6.5.  Preparação da substância de ensaio para aplicação no solo  
A aplicação da substância de ensaio no solo envolve, geralmente, a 
utilização de um excipiente (matriz de transporte), que pode ser água (para substâncias hidrossolúveis) ou um sólido inerte, como, por exemplo, areia fina de quartzo (tamanho de partículas: 0,1 a 
0,5 mm). A utilização de outros excipientes líquidos (por exemplo, 
solventes orgânicos, como acetona, clorofórmio) deve ser evitada devido à possibilidade de virem a afectar a microflora. Nos casos em que se use areia como excipiente, esta pode ser coberta com a 
substância de ensaio em solução ou suspensão num solvente adequa ­
do. Nesses casos, o solvente deve ser removido por evaporação antes da mistura com o solo. De modo a optimizar a distribuição da subs ­
tância de ensaio no solo, recomenda-se uma relação de 10 g de areia 
por quilograma de solo (peso seco). As amostras de controlo são tratadas com uma quantidade equivalente de água ou de areia de quartzo (sem adição de substância de ensaio).
 
Nos ensaios de produtos químicos voláteis importa, tanto quanto 
possível, evitar perdas durante o tratamento e procurar assegurar a 
homogeneidade da distribuição dos produtos no solo (por exemplo, 
as substâncias de ensaio devem ser injectadas em diferentes locais do solo).
 
1.6.6.  Concentrações de ensaio  
Nos ensaios de produtos químicos agrícolas devem ser usadas pelo 
menos duas concentrações. A concentração inferior deve reflectir, no mínimo, a quantidade máxima que se espera que, na prática, venha a atingir o solo, enquanto a concentração mais elevada deve ser um 
múltiplo da concentração inferior. As concentrações da substância de 
ensaio adicionada ao solo são calculadas assumindo uma incorpora ­
ção uniforme até uma profundidade de 5 cm e uma densidade apa ­
rente do solo de 1,5. Para produtos químicos agrícolas que são 
aplicados directamente no solo ou para compostos químicos cuja 
quantidade que atinge o solo pode ser prevista, as concentrações recomendadas são a máxima concentração prevista no ambiente («predicted environmental concentration», PEC) e cinco vezes o 
valor dessa concentração. Nos casos em que se prevê que as subs ­
tâncias sejam aplicadas diversas vezes no solo durante uma mesma estação, devem ser efectuados ensaios a concentrações corresponden ­
tes à multiplicação da PEC pelo número máximo de aplicações 
previsto. Contudo, a concentração máxima de ensaio não deve ex ­
ceder dez vezes a taxa máxima para uma única aplicação. Nos en ­
saios de produtos químicos não agrícolas. deve ser usada uma série geométrica de, pelo menos, cinco concentrações. As concentrações 
usadas devem cobrir a gama necessária para os cálculos dos valores 
de CE
 x . ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1275
 
1.7. PROCEDIMENTO DO ENSAIO  
1.7.1.  Condições de Exposição  
1.7.1.1.  Tratamento e Controlo  
Nos ensaios de produtos químicos agrícolas, o solo é dividido em 
três porções de igual peso. Duas porções são misturadas com o 
excipiente contendo o produto e a terceira é misturada apenas com o excipiente (amostra de controlo). Recomenda-se um mínimo de três repetições para ambos os solos, tratado e de controlo. Nos 
ensaios de produtos químicos não agrícolas, o solo é dividido em 
seis porções de igual peso. Cinco das amostras são misturadas com o excipiente contendo o produto e a sexta é misturada com o exci ­
piente não activado. Recomendam-se três repetições para ambos os 
solos, tratado e de controlo. Devem ser tomadas precauções de modo a assegurar uma distribuição homogénea da substância de ensaio nas amostras de solo tratadas. Durante a mistura deve evitar-se a aglo ­
meração ou compactação do solo.
 
1.7.1.2.  Incubação das amostras de solo  
A incubação das amostras de solo pode ser realizada de duas formas: 
usando cada um dos solos, tratado e de controlo, como amostras 
únicas ou dividindo-os numa série de subamostras individualizadas e de igual peso. Contudo, no caso de substâncias voláteis, os ensaios 
devem ser realizados obrigatoriamente na forma de séries de suba ­
mostras individuais. Quando os solos são incubados como amostras únicas, preparam-se grandes quantidades de cada solo, tratado e de controlo, e vão-se retirando subamostras para análise, conforme ne ­
cessário, ao longo do ensaio. A quantidade de solo inicialmente 
preparada para cada tratamento e para cada controlo depende do tamanho das subamostras a retirar durante o ensaio, do número de repetições a realizar e do número máximo de tempos de amostragem 
previsto. Os solos incubados como amostras únicas devem ser mis ­
turados vigorosamente antes de cada subamostragem. Quando os solos são incubados como uma série de amostras individualizadas, cada solo tratado e de controlo é inicialmente dividido no número de 
subamostras pretendido e estas utilizadas conforme necessário. Nas 
experiências em que se prevêem mais de dois tempos de amostra ­
gem, devem preparar-se subamostras em número suficiente para to ­
das as repetições de todas as amostragens. Pelo menos, três repeti ­
ções do solo de ensaio devem ser incubadas em condições aeróbias 
(ver secção 1.7.1.1). Os recipientes utilizados durante todos os testes devem possuir um volume livre suficiente para impedir o desenvol ­
vimento de condições anaeróbias. Nos casos em que as substâncias 
de ensaio são voláteis, o ensaio só deve ser realizado com séries de 
subamostras individualizadas.
 
1.7.1.3.  Condições e duração dos ensaios  
O ensaio é realizado em câmara escura à temperatura de 20±2  o C. 
Durante o ensaio, o teor de humidade das amostras de solo deve. ser mantido entre 40 % e 60 % da capacidade máxima de retenção de 
água do solo (ver secção 1.6.4.2), com uma variação máxima de 
±5 %. Sempre que necessário, pode adicionar-se água destilada ou desionizada.
 
A duração mínima do ensaio é de 28 dias. Nos ensaios de produtos 
químicos agrícolas, comparam-se as taxas de formação de nitratos nas 
amostras tratadas e de controlo. Se estes valores diferirem em mais de 
25 % após o 28.  o dia, o ensaio continua até que essa diferença atinja um 
valor igual ou inferior a 25 % ou até ao 100.  ° dia. Para compostos 
químicos não agrícolas, o ensaio tem a duração de 28 dias. 
No 28.  o dia, determinam-se as quantidades de nitratos nas amostras 
de solo tratadas e de controlo e calculam-se os valores de CE  x . ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1276
 
1.7.2.  Amostragem e análise dos solos  
1.7.2.1.  Calendário de amostragem dos solos  
Nos ensaios de produtos químicos agrícolas, analisa-se a quantidade 
de nitratos nas amostras de solo nos dias 0, 7, 14 e 28. Caso seja 
necessário prolongar o ensaio, após o 28.  o dia devem efectuar-se 
medições com intervalos de 14 dias.  
Nos ensaios de produtos químicos não agrícolas, testa-se um mínimo 
de cinco concentrações de ensaio e a análise de nitratos nas amostras 
de solo efectua-se no início (dia 0) e no fim do período de exposição (28.
 o dia). Nos casos em que tal se revele necessário, podem realizar- 
-se medições intermédias — por exemplo, ao 7.° dia. Os dados ob ­
tidos ao 28.° dia são utilizados para determinar o valor de CE  X para 
o produto químico. Se desejado, os dados obtidos para a amostra de controlo no dia 0 podem ser utilizados para indicar a quantidade 
inicial de nitratos no solo.
 
1.7.2.2.  Análise das amostras de solo  
Para cada repetição de cada amostra de solo, tratada e de controlo, 
determina-se a quantidade de nitratos formada em cada tempo de amostragem. Os nitratos são removidos do solo por agitação das 
amostras num solvente de extracção adequado — por exemplo, 
uma solução 0,1 M de cloreto de potássio. Recomenda-se uma razão de 5 ml de solução de KCl por equivalente de grama de solo (peso seco). Para optimizar a extracção, a mistura da amostra de solo com 
a solução de extracção não deve ocupar mais de metade do volume 
do recipiente de extracção. As misturas são agitadas a 150 rpm durante 60 minutos e em seguida centrifugadas ou filtradas, sendo a fase líquida resultante analisada para detecção de nitratos. Os 
extractos líquidos livres de partículas sólidas podem ser armazenados 
antes de analisados, devendo ser mantidos a 20±5
 o C negativos até 
um máximo de seis meses.  
2. DADOS  
2.1. TRATAMENTO DE RESULTADOS  
Nos ensaios efectuados com produtos químicos agrícolas, regista-se a 
quantidade de nitratos formada em cada repetição de cada amostra de solo e os valores médios do conjunto de repetições devem ser apresen ­
tados numa tabela. As taxas de transformação de azoto devem ser 
analisadas usando métodos estatísticos usuais e adequados (por exem ­
plo, Teste-F, nível de significância de 5 %). As quantidades de nitratos formados expressam-se em mg nitrato/kg solo (peso seco)/dia. A taxa 
de formação de nitratos em cada tratamento é comparada com a da 
respectiva amostra de controlo, calculando-se o desvio, em percenta ­
gem, da amostra de teste relativamente ao controlo.
 
Nos ensaios efectuados com produtos químicos não agrícolas, deter ­
mina-se a quantidade de nitratos formados em cada repetição e traça- -se uma curva de dose-resposta para estimar os valores de CE
 x . As 
quantidades de nitratos — isto é, mg nitrato/kg solo (peso seco) — 
obtidas para as amostras tratadas, após 28 dias são comparadas com 
as quantidades obtidas para as amostras de controlo. A partir destes resultados, calcula-se a percentagem de inibição para cada concen ­
tração de ensaio. As percentagens obtidas são representadas num 
gráfico em função da concentração e, usando procedimentos estatís ­
ticos, determinam-se os valores de CE
 X . Os limites de confiança 
(p = 0,95) para os valores de CE  x calculados são igualmente deter ­
minados usando métodos-padrão (10) (11) (12).  
No caso de conterem quantidades elevadas de azoto, as substâncias 
de ensaio podem contribuir para as quantidades de nitratos formadas durante o ensaio. Por este motivo, em ensaios com elevadas concen ­
trações dessas substâncias (por exemplo, compostos químicos que se 
prevê que venham a ser usados em aplicações repetidas), devem ser incluídas amostras de controlo adequadas (isto é, uma mistura de solo com a substância de ensaio, sem a farinha vegetal). Os dados 
dessas amostras de controlo devem ser tidos era conta nos cálculos 
de CE
 x . ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1277
 
2.2. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS  
Quando, na avaliação dos resultados dos ensaios com produtos quí ­
micos agrícolas, a diferença entre as taxas de formação de nitratos entre o tratamento com a menor concentração (isto é, correspondente 
à máxima concentração prevista para a situação real) e a respectiva 
amostra de controlo for igual ou inferior a 25 % em qualquer amos ­
tragem efectuada após o 28.
° dia, o produto pode ser considerado 
como não tendo influência a longo prazo na transformação de azoto 
dos solos. Para ensaios envolvendo produtos químicos não agrícolas, 
os valores CE50, CE  25 ou CE  10 são utilizados como indicadores.  
3. RELATÓRIO  
O relatório do ensaio deve incluir a seguinte informação:  
Identificação completa do solo utilizado, incluindo:  
— referência geográfica do local (latitude, longitude),  
— informação sobre a caracterização histórica do local (isto é, co ­
berto vegetal, tratamentos com produtos de protecção das cultu ­
ras agrícolas, tratamentos com fertilizantes, contaminações aci ­
dentais, etc.),  
— uso do solo (por exemplo, solo agrícola, floresta, etc.),  
— profundidade de amostragem (cm),  
— teor de areia/lama/argila ( % peso seco),  
— pH (em água),  
— teor de carbono orgânico ( % peso seco),  
— teor de azoto ( % peso seco),  
— concentração inicial de nitratos (mg nitratos/kg peso seco),  
— capacidade de permuta catiónica (mmol/kg),  
— biomassa microbiana, em termos de percentagem de carbono 
orgânico total,  
— referência dos métodos usados na determinação de cada parâme ­
tro, 
— toda a informação relacionada com a recolha e armazenamento 
das amostras de solo,  
— pormenores sobre a pré-incubação do solo, quando existir.  
Substância de ensaio:  
— natureza física e, quando relevante, propriedades físico-químicas,  
— dados de identificação química, sempre que relevantes, incluindo 
fórmula estrutural, pureza (teor do componente activo, em per ­
centagem, no caso dos produtos de protecção das culturas agrí ­
colas), teor de azoto.  
Substrato:  
— origem do substrato,  
— composição (isto é, farinha de luzerna, farinha de luzerna-erva- 
-relva),  
— teor de carbono e azoto ( % peso seco),  
— diâmetro dos peneiras (mm).  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1278
 
Condições de ensaio:  
— pormenores sobre a adição de substrato orgânico ao solo,  
— número de concentrações do produto químico de ensaio que 
foram testadas e, quando adequado, justificação das concentra ­
ções de ensaio escolhidas,  
— pormenores sobre a aplicação da substância de ensaio no solo,  
— temperatura de incubação,  
— teor de humidade do solo no início e durante o ensaio,  
— método usado na incubação do solo (isto é, como amostra única 
ou como séries de subamostras individualizadas),  
— número de repetições,  
— tempos de amostragem,  
— método usado para extracção de nitratos do solo;  
Resultados:  
— procedimento analítico e equipamento usado na análise de nitra ­
tos, 
— tabelas de resultados, incluindo valores individuais e valores mé ­
dios para as medições de nitratos,  
— variação entre repetições nas amostras tratadas e nas amostras de 
controlo,  
— explicação das correcções efectuadas nos cálculos, quando rele ­
vantes,  
— a variação percentual da taxa de formação de nitratos em cada 
ponto de amostragem ou, quando adequado, o valor de CE  50 com 
um limite de confiança de 95 %, outros valores de CE  x (isto é, 
CE 25 ou CE  10 ), com os respectivos intervalos de confiança, e a 
representação gráfica da curva de dose-resposta,  
— tratamento estatístico dos resultados,  
— toda a informação e observações úteis para a interpretação dos 
resultados.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Capítulo 7: 
Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.  
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection 
Products, VI, 1-1 (2.  a edição, 1990).  
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicity Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Gui ­
delines; Proposed rule. 28 de Setembro de 1987.  
(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M. R. Lynch, Pub. SETAC-Europa, Bruxelas.
 
(5) ISO/DIS 14238 (1995). Soil Quality — Determination of Ni ­
trogen Mineralisation and Nitrification in Soils and the In ­
fluence of Chemicals on these Processes. Comité Técnico 
ISO/TC 190/SC 4:  Soil Quality — Biological Methods.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1279
 
(6) OCDE (1995). Final Report of the OECD Workshop on Se ­
lection of Soils/Sediments, Belgirate, Itália, 18-20 de Janeiro 
de 1995.  
(7) ISO 10381-6 (1993). Soil quality — Sampling. Guidance on 
the collection, handling and storage of soil for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory.
 
(8) ISO 14240-1 (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 1: Substrate-induced respiration 
method.  
(9) ISO 14240-2 (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 2: Fumigation-extraction method.  
(10) Litchfield, J. T. e Wilcoxon F. (1949). A simplified method of 
evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Ex ­
per. Ther., 96, 99-113.  
(11) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3.  a edição, Cambridge, 
Londres e Nova Iorque.  
(12) Finney, D. J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. 
Griffin, Weycombe, Reino Unido.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1280
 
C.22.  MICROORGANISMOS DO SOLO: ENSAIO DE 
TRANSFORMAÇÃO DE CARBONO  
1. MÉTODO  
O presente método de ensaio baseia-se na publicação OCDE TG 217 
(1999).  
1.1. INTRODUÇÃO  
O presente método de ensaio descreve um método laboratorial con ­
cebido para a investigação dos potenciais efeitos, a longo prazo, 
resultantes de uma única exposição a produtos de protecção de cul ­
turas agrícolas, e possivelmente outras substâncias químicas, na ca ­
pacidade de transformação do carbono pelos microorganismos do solo. O ensaio baseia-se, fundamentalmente, nas recomendações da 
Organização Europeia e Mediterrânica para a Protecção das Plantas 
(1), embora tenham sido igualmente consideradas outras linhas de orientação, nomeadamente as fornecidas pelas seguintes organiza ­
ções: Biologische Bundesanstalt da Alemanha (2); Agência de Pro ­
tecção do Ambiente dos EUA (3) e SETAC (4). As orientações 
respeitantes ao número e tipo de solos a utilizar neste ensaio são as acordadas na reunião de trabalho da OCDE sobre Selecção de Solos/Sedimentos que decorreu em Belgirate, Itália, em 1995 (5). As 
recomendações respeitantes à recolha, manuseamento e armazena ­
mento de amostras de solos baseiam-se nas normas ISO 10381-6 (6) e nas recomendações da reunião de Belgirate.
 
A determinação e avaliação das características de toxicidade de de ­
terminadas substâncias de ensaio poderão requerer a determinação dos seus efeitos sobre a actividade microbiana dos solos, por exem ­
plo, quando se pretende conhecer os potenciais efeitos secundários 
de produtos utilizados na protecção de culturas agrícolas sobre a microflora do solo ou quando se prevê a exposição dos microorga ­
nismos do solo a outro tipo de substâncias químicas. O ensaio de 
transformação de carbono aplica-se na determinação dos efeitos des ­
tes produtos sobre a microflora do solo. No ensaio de produtos químicos agrícolas (por exemplo, produtos de protecção de culturas, fertilizantes, químicos florestais) devem realizar-se os ensaios de 
transformação de carbono e de transformação de azoto. Nos ensaios 
de produtos químicos não agrícolas, considera-se suficiente a reali ­
zação do ensaio de transformação de azoto, ressalvando-se os casos em que os valores de CE
 50 obtidos no ensaio de transformação de 
azoto se encontrem dentro dos valores correspondentes aos inibido ­
res de nitrificação comerciais (por exemplo, nitrapirina), casos em que deve ser efectuado um ensaio de transformação de carbono no sentido de se obter informação adicional.
 
Os solos são misturas complexas e heterogéneas de elementos vivos 
e não vivos. Os microorganismos desempenham um papel impor ­
tante na decomposição e transformação da matéria orgânica em solos 
férteis através de processos complexos em que diversas espécies 
contribuem de forma distinta para cada um dos factores que deter ­
minam a fertilidade do solo. Por este motivo, qualquer interferência a longo prazo nos processos bioquímicos envolvidos constitui uma 
potencial interferência nos ciclos nutricionais, podendo vir a afectar 
a fertilidade do solo. A transformação de carbono e de azoto ocorre em todos os solos férteis e, ainda que as comunidades de micro ­
organismos responsáveis por estes processos divirjam de solo para 
solo, as vias e processos de transformação são essencialmente os 
mesmos.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1281
 
O Método de Ensaio aqui descrito foi desenvolvido com o objectivo 
de determinar os efeitos adversos a longo prazo de uma substância, 
no processo de transformação de carbono em solos aeróbios de superfície. O ensaio é sensível a alterações na dimensão e actividade das comunidades microbianas responsáveis pela transformação do 
carbono, na medida em que sujeita essas comunidades simultanea ­
mente a condições de stress químico e de privação de carbono. Utiliza-se um solo arenoso pobre em matéria orgânica. O solo é tratado com a substância de ensaio e incubado em condições tais 
que permitem um rápido metabolismo microbiano, e sob as quais as 
fontes de carbono acessíveis no solo se esgotam rapidamente. O processo provoca o empobrecimento de carbono, causando simulta ­
neamente a morte das células microbianas e a indução do estado de 
letargia ou esporulação. Se o teste decorrer durante um período 
superior a 28 dias, o somatório destas reacções pode ser medido em amostras de controlo (solo não tratado) como uma perda pro ­
gressiva da biomassa microbiana metabolicamente activa (7). Se a 
biomassa de um solo em stress por privação de carbono, nas condi ­
ções de ensaio, é afectada pela presença de um produto químico, a recuperação do solo poderá não se verificar até ao mesmo nível que o solo de controlo. Por este motivo, as perturbações causadas pela 
substância de ensaio, em qualquer momento do ensaio, mantêm-se 
geralmente até ao final do mesmo.
 
Os ensaios que serviram de base ao presente Método de Ensaio 
foram inicialmente desenvolvidos para substâncias relativamente às 
quais é possível estimar a quantidade de substância que atinge o solo. É o caso, por exemplo, dos produtos utilizados para a protecção de culturas agrícolas, uma vez que é conhecida a sua taxa de apli ­
cação nos campos. No caso de produtos químicos agrícolas, consi ­
dera-se suficiente o ensaio de duas doses relevantes, relativamente à taxa de aplicação estimada ou prevista. Os produtos químicos agrí ­
colas podem ser testados como ingredientes activos (i.a.) ou como 
formulações. A aplicação deste ensaio não se limita, no entanto, a 
produtos químicos agrícolas. Fazendo variar simultaneamente a quantidade de substância de ensaio aplicada no solo e o método de avaliação dos dados, o ensaio poderá ser igualmente utilizado 
em situações em que não é conhecida a quantidade de produto 
químico que atinge o solo. Deste modo, para produtos químicos não agrícolas, deverão determinar-se os efeitos de uma série de concentrações sobre a transformação de carbono e utilizar-se os da ­
dos obtidos nesses ensaios para construir uma curva de dose-respos ­
ta, a partir da qual se calculam os valores de CE
 x , em que x cor ­
responde à percentagem de efeito.  
1.2. DEFINIÇÕES  
Transformação de carbono:  é a degradação da matéria orgânica 
por microorganismos até formar um produto final inorgânico, o dió ­
xido de carbono.  
EC x (Concentração Efectiva):  é a concentração da substância de 
ensaio no solo que resulta numa percentagem x de inibição da trans ­
formação de carbono em dióxido de carbono.  
EC 50 (Concentração Média Efectiva):  é a concentração da subs ­
tância de ensaio no solo que resulta em 50 % de inibição da trans ­
formação de carbono em dióxido de carbono.  
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
Nenhuma.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1282
 
1.4. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
O solo peneirado é tratado com a substância de ensaio ou deixado 
por tratar (controlo). No ensaio de produtos químicos agrícolas re ­
comenda-se o teste de um mínimo de duas concentrações, que de ­
verão ser escolhidas tendo em conta a maior concentração de subs ­
tância que se prevê que venha a ser aplicada no campo. Após 0, 7, 14 e 28 dias de incubação, amostras do solo tratadas e de controlo são misturadas com glucose e a taxa de respiração induzida pela 
glucose é medida durante 12 horas consecutivas. As taxas de respi ­
ração são expressas em termos de dióxido de carbono libertado (mg dióxido de carbono/kg solo seco/h) ou de oxigénio consumido (mg 
oxigénio/kg solo/h). A taxa média de respiração nas amostras trata ­
das é comparada com a das respectivas amostras de controlo e calcula-se a percentagem de desvio das amostras tratadas relativa ­
mente às de controlo. Todos os ensaios têm uma duração mínima de 
28 dias. Se ao 28.
 o dia as diferenças entre as amostras tratadas e as 
amostras não tratadas forem iguais ou superiores a 25 %, devem continuar a efectuar-se medições, em intervalos de 14 dias, até ao limite de 100 dias. Nos ensaios de produtos químicos não agrícolas, 
adiciona-se uma série de concentrações da substância de ensaio a 
amostras de solo e medem-se as taxas de respiração induzida por glucose (isto é, a média das quantidades de dióxido de carbono formado ou de oxigénio consumido) após 28 dias. Os resultados 
dos ensaios com múltiplas concentrações são analisados através de 
um modelo de regressão, com base no qual se calculam os valores de CE
 x (isto é: CE  50 , CE  25 ou CE  10 ). Ver definições.  
1.5. VALIDADE DO ENSAIO  
As análises dos resultados dos ensaios com produtos químicos agrí ­
colas baseiam-se em diferenças relativamente pequenas (isto é, com um valor médio de ± 25 %) entre as quantidades de dióxido de 
carbono libertado ou de oxigénio consumido nas (ou pelas) amostras 
de solo tratadas e nas (ou pelas) amostras de controlo. Por este motivo, e uma vez que grandes variações entre as amostras de con ­
trolo podem conduzir a resultados falsos, a variação entre repetições 
das amostras de controlo deve ser inferior a ± 15 %.
 
1.6. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.6.1.  Equipamento  
Os recipientes utilizados durante o ensaio devem ser de materiais 
quimicamente inertes e ter uma capacidade adequada ao método usado na incubação dos solos, isto é, a granel ou numa série de 
amostras de solo individualizadas (ver secção 1.7.1.2). Devem to ­
mar-se precauções no sentido de minimizar as perdas de água e permitir trocas gasosas durante o ensaio (por exemplo, os recipientes de ensaio podem ser cobertos com folhas de polietileno perfuradas). 
Para o ensaio de substâncias voláteis, devem ser usados recipientes 
seláveis e estanques com dimensões que permitam que aproximada ­
mente um quarto do seu volume seja ocupado pela amostra de solo.
 
Para a determinação da taxa de respiração induzida pela glucose, são 
necessários sistemas de incubação e instrumentos para medir a pro ­
dução de dióxido de carbono ou o consumo de oxigénio. Na litera ­
tura encontram-se exemplos destes sistemas e instrumentos (8) (9) 
(10) (11).  
1.6.2.  Selecção e número de solos  
No presente ensaio utiliza-se um único solo, cujas características 
recomendadas são as seguintes:  
— teor de areia: não inferior a 50 % e não superior a 75 %;  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1283
 
— pH: 5,5 a 7,5;  
— teor de carbono orgânico: 0,5 a 1,5 %;  
— a biomassa microbiana deve ser medida (12)(13) e o seu teor de 
carbono deve corresponder, no mínimo, a 1 % do carbono orgâ ­
nico total do solo.  
Na maioria dos casos, um solo com estas características representa a 
situação menos favorável, uma vez que nestas condições a adsorção 
da substância química de ensaio é mínima e a sua disponibilidade para a microflora é máxima. Por este motivo, a realização de ensaios com outros solos é geralmente desnecessária. Contudo, em determi ­
nadas circunstâncias, por exemplo, quando se prevê que a substância 
de ensaio venha a ser principalmente utilizada em solos específicos, tais como solos florestais acídicos, ou para produtos químicos com carga electrostática, poderá ser necessário utilizar um outro tipo de 
solo.
 
1.6.3.  Recolha e armazenamento das amostras de solo  
1.6.3.1.  Recolha  
Deve existir, e estar disponível, informação pormenorizada sobre a 
história do local donde foram recolhidas as amostras de solo para o 
ensaio. A informação necessária inclui a localização exacta, o co ­
berto vegetal, as datas dos tratamentos com produtos utilizados para a protecção de culturas agrícolas, dos tratamentos com fertilizantes orgânicos e inorgânicos, das aplicações de materiais biológicos ou de 
contaminações acidentais. Deverá ser escolhido, para a recolha de 
solo, um local que permita o seu uso a longo prazo. Consideram-se locais adequados: as pastagens permanentes, os campos com culturas anuais de cereais (à excepção de milho) ou os campos densamente 
semeados para produção de adubo verde. No local escolhido para a 
amostragem não devem ter sido aplicados produtos de protecção de culturas agrícolas, pelo menos, durante o último ano, nem nenhum 
fertilizante orgânico, pelo menos, nos últimos seis meses. O uso de 
fertilizantes minerais apenas poderá ser aceite quando em concordân ­
cia com as necessidades das culturas agrícolas e, nesse caso, a reco ­
lha de amostras de solo não deverá ser efectuada antes de passados 
três meses após a aplicação do fertilizante. Deve ser evitado o uso de 
solos tratados com fertilizantes que tenham efeitos biocidas conhe ­
cidos (por exemplo, cianamida de cálcio).
 
Deve ser evitada a recolha de amostras durante, ou imediatamente 
após, períodos longos (superiores a 30 dias) de seca ou de explora ­
ção de águas. Em solos lavrados, as amostras devem ser recolhidas a uma profundidade de 0 a 20 cm. Nas pastagens ou outros solos que 
não são lavrados durante períodos longos (pelo menos, uma época de 
cultivo), a profundidade máxima de amostragem pode ser ligeira ­
mente superior a 20 cm (por exemplo, até 25 cm). As amostras de solo devem ser transportadas em recipientes adequados e em condi ­
ções de temperatura que garantam que as propriedades iniciais do 
solo não são alteradas de forma significativa.
 
1.6.3.2.  Armazenamento  
Sempre que possível, é preferível a utilização de amostras de solos 
recolhidas na altura. Nos casos em que o armazenamento em labo ­
ratório não possa ser evitado, os solos devem ser armazenados no 
escuro, a uma temperatura de 4±2  o C e por um período máximo de 
três meses. Durante o armazenamento dos solos, devem ser assegu ­
radas condições aeróbias. Se os solos forem recolhidos em zonas 
onde permanecem gelados por períodos iguais ou superiores a três 
meses por ano, poderá ser considerada a hipótese do seu armazena ­
mento durante seis meses a uma temperatura de 18 °C negativos. A biomassa microbiana de solos armazenados é medida antes de cada 
experiência e o teor de carbono na biomassa não deverá ser inferior a 
1 % do teor total de carbono orgânico no solo (ver secção 1.6.2).
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1284
 
1.6.4.  Manuseamento e preparação do solo para o ensaio  
1.6.4.1.  Pré-incubação  
Se o solo esteve armazenado (ver secção 1.6.3.2), recomenda-se um 
período de pré-incubação de 2 a 28 dias. A temperatura e a humi ­
dade do solo durante a pré-incubação e o ensaio devem ser idênticas 
às utilizadas durante o ensaio (ver secções 1.6.4.2 e 1.7.1.3).  
1.6.4.2.  Características físico-químicas  
Os objectos de grandes dimensões (por exemplo, pedras, pedaços de 
plantas, etc.) são removidos manualmente do solo e a amostra é 
peneirada húmida, evitando a dessecação excessiva, de forma a re ­
duzir as partículas a uma dimensão máxima de 2 mm. O teor de humidade da amostra de solo deve ser ajustado com água destilada 
ou desionizada para um valor entre 40 % e 60 % da sua capacidade 
máxima de retenção de água.
 
1.6.5.  Preparação da substância de ensaio para aplicação no solo  
A aplicação da substância de ensaio no solo envolve, geralmente, a 
utilização de um excipiente (matriz de transporte), que pode ser água 
(para substâncias hidrossolúveis) ou um sólido inerte, como, por exemplo, areia fina de quartzo (tamanho de partículas: 0,1 a 0,5 mm). A utilização de outros excipientes líquidos (por exemplo, 
solventes orgânicos, como acetona, clorofórmio) deve ser evitada 
devido à possibilidade de virem a afectar a microflora. Nos casos em que se use areia como excipiente, esta pode ser coberta com a substância de ensaio em solução ou suspensão num solvente adequa ­
do. Nesses casos, o solvente deve ser removido por evaporação antes 
da mistura com o solo. De modo a optimizar a distribuição da subs ­
tância de ensaio no solo, recomenda-se uma relação de 10 g de areia por quilograma de solo (peso seco). As amostras de controlo são 
tratadas com uma quantidade equivalente de água ou de areia de 
quartzo (sem adição de substância de ensaio).
 
Nos ensaios de produtos químicos voláteis importa, tanto quanto 
possível, evitar perdas durante o tratamento e procurar assegurar a 
homogeneidade da distribuição dos produtos no solo (por exemplo, as substâncias de ensaio devem ser injectadas em diferentes locais do solo).
 
1.6.6.  Concentrações de ensaio  
Nos ensaios de produtos utilizados para protecção de culturas agrí ­
colas, ou outros produtos químicos cujas concentrações ambientais possam ser previstas, devem ser usadas, pelo menos, duas concen ­
trações. A concentração inferior deve reflectir, no mínimo, a quan ­
tidade máxima que se espera que, na prática, venha a atingir o solo, enquanto a concentração mais elevada deve ser um múltiplo da concentração inferior. As concentrações da substância de ensaio adi ­
cionada ao solo são calculadas assumindo uma incorporação uni ­
forme até uma profundidade de 5 cm e uma densidade aparente do solo de 1,5. Para produtos químicos agrícolas que são aplicados directamente no solo ou para compostos químicos cuja quantidade 
que atinge o solo pode ser prevista, as concentrações recomendadas 
são a máxima concentração prevista no ambiente («predicted envi ­
ronmental concentration», PEC) e cinco vezes o valor dessa concen ­
tração. Nos casos em que se prevê que as substâncias sejam aplica ­
das diversas vezes no solo durante uma mesma estação, devem ser 
efectuados ensaios a concentrações correspondentes à multiplicação da PEC pelo número máximo de aplicações previsto. Contudo, a concentração máxima de ensaio não deve exceder dez vezes a taxa 
máxima para uma única aplicação.
 
Nos ensaios de produtos químicos não agrícolas deve ser usada uma 
série geométrica de, pelo menos, cinco concentrações. As concen ­
trações usadas devem cobrir a gama necessária para os cálculos dos 
valores de CE  x . ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1285
 
1.7. PROCEDIMENTO DO ENSAIO  
1.7.1.  Condições de Exposição  
1.7.1.1.  Tratamento e Controlo  
Nos ensaios de produtos químicos agrícolas, o solo é dividido em 
três porções de igual peso. Duas porções são misturadas com o 
excipiente contendo o produto e a terceira é misturada apenas com o excipiente (amostra de controlo). Recomenda-se um mínimo de três repetições para ambos os solos, tratado e de controlo. Nos 
ensaios de produtos químicos não agrícolas, o solo é dividido em 
seis porções de igual peso. Cinco das amostras são misturadas com o excipiente contendo o produto e a sexta é misturada com o exci ­
piente não activado. Recomendam-se três repetições para ambos os 
solos, tratado e de controlo. Devem ser tomadas precauções de modo a assegurar uma distribuição homogénea da substância de ensaio nas amostras de solo tratadas. Durante a mistura deve evitar-se a aglo ­
meração ou compactação do solo.
 
1.7.1.2.  Incubação das amostras de solo  
A incubação das amostras de solo pode ser realizada de duas formas: 
usando cada um dos solos, tratado e de controlo, como amostras únicas, ou dividindo-os numa série de subamostras individualizadas e de igual peso. Contudo, no caso de substâncias voláteis, os ensaios 
devem ser realizados obrigatoriamente na forma de séries de suba ­
mostras individuais. Quando os solos são incubados como amostras únicas, preparam-se grandes quantidades de cada solo, tratado e de controlo, e vão-se retirando subamostras para análise, conforme ne ­
cessário, ao longo do ensaio. A quantidade de solo inicialmente 
preparada para cada tratamento e para cada controlo depende do tamanho das subamostras a retirar durante o ensaio, do número de repetições a realizar e do número máximo de tempos de amostragem 
previsto. Os solos incubados como amostras únicas devem ser mis ­
turados vigorosamente antes de cada subamostragem. Quando os solos são incubados como uma série de amostras individualizadas, cada solo tratado e de controlo é inicialmente dividido no número de 
subamostras pretendido e estas utilizadas conforme necessário. Nas 
experiências em que se prevêem mais de dois tempos de amostra ­
gem, devem preparar-se subamostras em número suficiente para to ­
das as repetições de todas as amostragens. Pelo menos, três repeti ­
ções do solo de ensaio devem ser incubadas em condições aeróbias (ver secção 1.7.1.1). Os recipientes utilizados durante todos os testes devem possuir um volume livre suficiente para impedir o desenvol ­
vimento de condições anaeróbias. Nos casos em que as substâncias 
de ensaio são voláteis, o ensaio só deve ser realizado com séries de subamostras individualizadas.
 
1.7.1.3.  Condições e duração dos ensaios  
O ensaio é realizado em câmara escura à temperatura de 20 ± 2  o C. 
Durante o ensaio, o teor de humidade das amostras de solo deve ser 
mantido entre 40 % e 60 % da capacidade máxima de retenção de 
água do solo (ver secção 1.6.4.2), com uma variação máxima de ± 5 %. Sempre que necessário, pode adicionar-se água destilada ou desionizada.
 
A duração mínima do ensaio é de 28 dias. Nos ensaios de produtos 
químicos agrícolas, comparam-se as quantidades de dióxido de car ­
bono libertado ou de oxigénio consumido entre as amostras tratadas e de controlo. Se estes valores diferirem em mais de 25 % após o 
28.
 o dia, o ensaio continua até que essa diferença atinja um valor 
igual ou inferior a 25 % ou até ao 100.  o dia. Para compostos quí ­
micos não agrícolas, o ensaio tem a duração de 28 dias. No 28.  o dia, 
determinam-se as quantidades de dióxido de carbono libertado ou de 
oxigénio consumido nas amostras de solo tratadas e de controlo e 
calculam-se os valores de CE  X . ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1286
 
1.7.2.  Amostragem e análise dos solos  
1.7.2.1.  Calendário de amostragem dos solos  
Nos ensaios de produtos químicos agrícolas, analisam-se as taxas de 
respiração induzida pela glucose através das quantidades de dióxido 
de carbono libertado ou de oxigénio consumido nas amostras de solo 
nos dias 0, 7, 14 e 28. Caso seja necessário prolongar o ensaio, após o 28.
 o dia devem efectuar-se medições com intervalos de 14 dias.  
Nos ensaios de produtos químicos não agrícolas, testa-se um mínimo 
de cinco concentrações de ensaio e a análise da taxa de respiração induzida pelo glucose efectua-se no início do ensaio (dia 0) e no fim 
do período de exposição (28.
 o dia). Nos casos em que tal se revele 
necessário, podem realizar-se medições intermédias — por exemplo ao 7.
 o dia. Os dados obtidos ao 28.° dia são utilizados para deter ­
minar o valor de CE  x para o produto químico. Se desejado, os dados 
obtidos para a amostra de controlo no dia 0 podem ser utilizados 
para indicar as quantidades iniciais de biomassa microbiana metabo ­
licamente activa no solo (12).  
1.7.2.2.  Medida das taxas de respiração induzida por glucose  
Para cada repetição de cada amostra de solo, tratada e de controlo, 
determina-se a taxa de respiração induzida por glucose em cada tempo de amostragem. As amostras de solo são misturadas com uma quantidade de glucose suficiente para provocar uma resposta 
máxima de respiração imediata. A quantidade de glucose necessária 
para provocar a resposta máxima de respiração de um dado solo pode ser determinada através de um teste preliminar usando uma série de concentrações de glucose (14). Contudo, para solos arenosos 
com 0,5 a 1,5 % de carbono orgânico, 2 000 a 4 000 mg de glucose 
por kg de solo (peso seco) são, em geral, suficientes. A glucose pode ser pulverizada com areia limpa de quartzo [10 g areia/kg de solo (peso seco)] e misturada com o solo de forma homogénea.
 
As amostras de solo adicionadas de glucose são incubadas num 
aparelho adequado para a determinação de taxas de respiração, em regime contínuo, de hora a hora ou de duas em duas horas (ver 
secção 1.6.1) a 20±2
 o C. O dióxido de carbono libertado, ou o 
oxigénio consumido, é medido durante 12 horas consecutivas e as medições devem iniciar-se logo que possível, isto é, 1 ou 2 horas após o suplemento de glucose. A partir dos dados obtidos, determi ­
nam-se as quantidades totais de dióxido de carbono libertado, ou de 
oxigénio consumido, durante as 12 horas, assim como as taxas mé ­
dias de respiração.
 
2. DADOS  
2.1. TRATAMENTO DE RESULTADOS  
Nos ensaios efectuados com produtos químicos agrícolas, regista-se a 
quantidade de dióxido de carbono libertado, ou de oxigénio consu ­
mido, em cada repetição de cada amostra de solo e os valores mé ­
dios do conjunto de repetições devem ser apresentados numa tabela. 
Os resultados devem ser avaliados usando métodos estatísticos usuais e adequados (por exemplo, Teste-F, nível de significância de 5 %). As taxas de respiração induzida pela glucose expressam- 
-se em mg dióxido de carbono/kg solo (peso seco)/h ou mg 
oxigénio/kg solo (peso seco)/h. A taxa média de formação de dió ­
xido de carbono, ou a taxa média de consumo de oxigénio, em cada tratamento é comparada com a da amostra de controlo, calculando-se 
o desvio, em percentagem, da amostra de teste relativamente ao 
controlo.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1287
 
Nos ensaios efectuados com produtos químicos não agrícolas, deter ­
minam-se as quantidades de dióxido de carbono libertado, ou de 
oxigénio consumido, em cada repetição e traça-se uma curva de dose-resposta para estimar os valores de CE
 X . As taxas de respiração 
induzida pela glucose [isto é, mg dióxido de carbono/kg solo (peso 
seco)/h ou mg oxigénio/kg solo (peso seco)/h] obtidas para as amos ­
tras tratadas após 28 dias são comparadas com as obtidas para as amostras de controlo. A partir destes resultados, calculam-se os va ­
lores percentuais de inibição para cada concentração de ensaio. As 
percentagens obtidas são representadas num gráfico em função da 
concentração e, usando procedimentos estatísticos, determinam-se os valores de CE
 x . Os limites de confiança (p = 0,95) para os valores de 
CE x calculados são igualmente determinados usando métodos-padrão 
(15) (16) (17).  
2.2. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS  
Quando, na avaliação dos resultados dos ensaios com produtos quí ­
micos agrícolas, a diferença entre as taxas de respiração entre o tratamento com a menor concentração (isto é, correspondente à má ­
xima concentração prevista para a situação real) e a respectiva amos ­
tra de controlo for igual ou inferior a 25 % em qualquer amostragem 
efectuada após o 28.
 o dia, o produto pode ser considerado como não 
tendo influência a longo prazo na transformação de carbono dos solos. Para ensaios envolvendo produtos químicos não agrícolas, 
os valores CE
 50 , CE  25 ou CE  10 são utilizados como indicadores.  
3. RELATÓRIO  
RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deve incluir a seguinte informação:  
Identificação completa do solo utilizado, incluindo:  
— referência geográfica do local (latitude, longitude),  
— informação sobre a caracterização histórica do local (isto é, co ­
berto vegetal, tratamentos com produtos de protecção das cultu ­
ras agrícolas, tratamentos com fertilizantes, contaminações aci ­
dentais, etc.),  
— uso do solo (por exemplo, solo agrícola, floresta, etc.),  
— profundidade de amostragem (cm),  
— teor de areia/lama/argila ( % peso seco),  
— pH (em água),  
— teor de carbono orgânico ( % peso seco),  
— teor de azoto ( % peso seco),  
— capacidade de permuta catiónica (mmol/kg),  
— biomassa microbiana inicial, em termos de percentagem de car ­
bono orgânico total,  
— referência dos métodos usados na determinação de cada parâme ­
tro, 
— toda a informação relacionada com a recolha e armazenamento 
das amostras de solo,  
— pormenores sobre a pré-incubação do solo, quando exista.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1288
 
Substância de ensaio:  
— natureza física e, quando relevante, propriedades físico-químicas,  
— dados de identificação química, sempre que relevantes, incluindo 
fórmula estrutural, pureza (teor do componente activo, em per ­
centagem, no caso dos produtos de protecção de culturas agríco ­
las), teor de azoto.  
Condições de ensaio:  
— pormenores sobre a correcção do solo com substrato orgânico,  
— número de concentrações do produto químico de ensaio que 
foram testadas e, quando adequado, justificação das concentra ­
ções de ensaio escolhidas,  
— pormenores sobre a aplicação da substância de ensaio no solo,  
— temperatura de incubação,  
— teor de humidade do solo no início e durante o ensaio,  
— método usado na incubação do solo (isto é, como amostra única 
ou como séries de subamostras individualizadas),  
— número de repetições,  
— tempos de amostragem;  
Resultados:  
— método e equipamento usado para a medição das taxas de respi ­
ração,  
— tabelas de resultados, incluindo valores individuais e valores mé ­
dios para as quantidades de dióxido de carbono ou oxigénio,  
— variação entre repetições nas amostras tratadas e nas amostras de 
controlo,  
— explicação das correcções efectuadas nos cálculos, quando rele ­
vantes,  
— a variação percentual da taxa de respiração induzida pela glucose 
em cada ponto de amostragem ou, quando adequado, o valor de CE
 50 com um limite de confiança de 95 %, ou outros valores de 
CE x (isto é, CE  25 ou CE  10 ), com os respectivos intervalos de 
confiança, e a representação gráfica da curva de dose-resposta,  
— tratamento estatístico dos resultados, quando apropriado,  
— toda a informação e observações úteis para a interpretação dos 
resultados.  
4. REFERÊNCIAS  
(1) EPPO (1994). Decision-Making Scheme for the Environmental 
Risk Assessment of Plant Protection Chemicals. Chapter 7: 
Soil Microflora. EPPO Bulletin 24: 1-16, 1994.  
(2) BBA (1990). Effects on the Activity of the Soil Microflora. 
BBA Guidelines for the Official Testing of Plant Protection Products, VI, 1-1 (2.
 a edição, 1990).  
(3) EPA (1987). Soil Microbial Community Toxicíty Test. EPA 40 
CFR Part 797.3700. Toxic Substances Control Act Test Gui ­
delines; Proposed rule. 28 de Setembro de 1987.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1289
 
(4) SETAC-Europe (1995). Procedures for assessing the environ ­
mental fate and ecotoxicity of pesticides, Ed. M. R. Lynch, 
Pub. SETAC-Europa, Bruxelas.  
(5) OECD (1995). Final Report of the OECD Workshop on Se ­
lection of Soils/Sediments, Belgirate, Itália, 18-20 de Janeiro de 1995.
 
(6) ISO 10381-6 (1993). Soil quality — Sampling. Guidance on 
the collection, handling and storage of soil for the assessment 
of aerobic microbial processes in the laboratory.  
(7) Anderson, J. P. E. (1987). Handling and Storage of Soils for 
Pesticide Experiments, in «Pesticide Effects on Soil Microflo ­
ra». Eds. L. Somerville and M. P. Greaves, Capítulo 3: 45-60.  
(8) Anderson, J. P. E. (1982). Soil Respiration, in «Methods of 
Soil Analysis — Part 2: Chemical and Microbiological Proper ­
ties». Agronomy Monograph N  o 9. Eds. A. L. Page, R. H. 
Miller and D. R. Keeney. 41:831- 871.  
(9) ISO 11266-1. (1993). Soil Quality — Guidance on Laboratory 
Tests for Biodegradation in Soil: Part 1. Aerobic Conditions.  
(10) ISO 14239 (1997E). Soil Quality — Laboratory incubation 
systems for measuring the mineralization of organic chemicals in soil under aerobic conditions.
 
(11) Heinemeye, O., Insam, H., Kaiser, E. A, e Walenzik, G. 
(1989). Soil microbial biomass and respiration measurements; 
an automated technique based on infrared gas analyses. Plant and Soil, 116: 77-81.
 
(12) ISO 14240-1 (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 1: Substrate-induced respiration 
method.  
(13) ISO 14240-2 (1997). Soil quality — Determination of soil 
microbial biomass — Part 2: Fumigation-extraction method.  
(14) Malkomes, H.-P. (1986). Einflu β von Glukosemenge auf die 
Reaktion der Kurzzeit-Atmung im Boden Gegenüber Pflan ­
zenschutzmitteln, Dargestellt am Beispiel eines Herbizide. (In ­
fluence of the Amount of Glucose Added to the Soil on the Effect of Pesticides in Short-Term Respiration, using a Herbi ­
cide as an Example). Nachrichtenbl. Deut. Pflanzenschutzd., 
Braunschweig, 38: 113-120.
 
(15) Litchfield, J. T. e Wilcoxon, F. (1949). A simplified method of 
evaluating dose-effect experiments. Jour. Pharmacol. and Ex ­
per. Ther., 96, 99-113.  
(16) Finney, D. J. (1971). Probit Analysis. 3.  a edição, Cambridge, 
Londres e Nova Iorque.  
(17) Finney D. J. (1978). Statistical Methods in Biological Assay. 
Griffin, Weycombe, Reino Unido.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1290
 
C.23.  TRANSFORMAÇÕES AERÓBIAS E ANAERÓBIAS NO SOLO  
1. MÉTODO  
O presente método baseia-se na publicação OECD TG 307 (2002).  
1.1. INTRODUÇÃO  
O presente Método de Ensaio baseia-se nas orientações existentes (1) 
(2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). O método descrito no presente Método de Ensaio foi concebido para avaliar as transformações aeróbias e 
anaeróbias de produtos químicos no solo. As experiências a realizar 
têm como objectivo a determinação (i) da taxa de transformação da substância de ensaio e (ii) da natureza e taxas de formação e degradação de produtos de transformação a que as plantas e orga ­
nismos do solo possam ser expostos. Os estudos descritos neste 
Método de Ensaio são requeridos quer para produtos químicos di ­
rectamente aplicados no solo quer para substâncias que o possam vir a atingir. Os resultados dos presentes estudos laboratoriais poderão 
igualmente vir a ser utilizados para o desenvolvimento de protocolos 
de amostragem e análise em áreas de estudo relacionadas.
 
Para a avaliação das vias de transformação, é geralmente suficiente a 
realização de estudos aeróbios e anaeróbios com um único tipo de solo (8) (10) (11). Pelo contrário, a determinação das taxas de trans ­
formação deverá basear-se em análises efectuadas em, pelo menos, 
mais três solos diferentes (8) (10).
 
O número e tipos de solos que devem ser utilizados no presente 
ensaio foram acordados numa reunião de trabalho da OCDE sobre 
selecção de solos e sedimentos, que decorreu em Belgirate, Itália, em 1995 (10). Os tipos de solos a ensaiar devem ser representativos das condições ambientais onde a substância de ensaio virá a ser utilizada 
ou libertada no ambiente. Por exemplo, os produtos químicos que 
podem vir a ser libertados em climas subtropicais a tropicais devem ser ensaiados com Ferrasoles ou Nitosoles (sistema FAO). Da refe ­
rida reunião saíram igualmente recomendações relativas à recolha, 
manipulação e armazenamento das amostras de solos, tendo como 
base a Orientação ISO (15). No presente método considera-se igual ­
mente a utilização de solos de arrozais  paddy .
 
1.2. DEFINIÇÕES  
Substância de ensaio:  Qualquer substância, quer se trate do com ­
posto inicial ou de produtos de transformação relevantes.  
Produtos de transformação:  Todas as substâncias resultantes de 
reacções de transformação bióticas ou abióticas da substância de ensaio, incluindo CO
 2 e produtos presentes nos resíduos ligados.  
Resíduos ligados:  Os «resíduos ligados» representam compostos 
presentes no solo, planta ou animal, que, após extracção, persistam na matriz, quer na forma da substância inicial quer como um dos 
seus metabolitos/produtos de transformação. O método de extracção 
não poderá alterar substancialmente nem os próprios compostos nem a estrutura da matriz. A natureza da ligação poderá ser parcialmente determinada utilizando métodos extractivos que alterem a matriz e 
através de técnicas analíticas sofisticadas. Têm sido identificadas 
deste modo, por exemplo, ligações do tipo covalente, iónico e de absorção/adsorção, assim como encapsulação. De um modo geral, a 
formação de resíduos ligados reduz significativamente a bioacessibi ­
lidade e a biodisponibilidade das substâncias (12) [adaptado de IU ­
PAC 1984 (13)].
 
Transformação aeróbia:  Reacções que ocorrem na presença de 
oxigénio molecular (14).  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1291
 
Transformação anaeróbia:  Reacções que ocorrem na ausência de 
oxigénio molecular (14).  
Solo:  Mistura de componentes abióticos (constituintes químicos mi ­
nerais e orgânicos, em que os últimos incluem compostos com ele ­
vado conteúdo de carbono e azoto e de peso molecular elevado) e bióticos (pequenos organismos vivos, maioritariamente microorganis ­
mos). O solo pode ser manuseado em dois estados distintos:
 
(a) não perturbado, tal como se desenvolveu ao longo do tempo, em 
camadas características de vários tipos de solos;  
(b) perturbado, tal como é normalmente encontrado em campos ará ­
veis ou como se apresenta quando a recolha de amostras para utilização no presente método de ensaio é feita por escavação (14).
 
Mineralização:  Degradação completa de um composto orgânico em 
CO 2 e H  2 O, em condições aeróbias, ou em CH  4 , CO  2 e H  2 O em 
condições anaeróbias. No contexto do presente método de ensaio, quando se utiliza um composto marcado com
 14 C, o termo minera ­
lização refere-se à sua degradação extensa, envolvendo a oxidação de 
um átomo de carbono marcado e a libertação da quantidade corres ­
pondente de  14 CO 2 (14).  
Semivida:  t 0,5 , é o tempo necessário para a transformação de 50 % 
da substância de ensaio, nos casos em que a transformação pode ser descrita por uma cinética de primeira ordem. A semivida da subs ­
tância é independente da sua concentração.
 
DT 50 (Tempo de Desaparecimento 50):  Tempo necessário para 
reduzir a concentração da substância de ensaio em 50 %; nos casos em que a transformação não segue uma cinética de primeira ordem, o valor de DT
 50 è diferente de t  0,5 (semivida).  
DT 75 (Tempo de Desaparecimento 75):  Tempo necessário para 
reduzir a concentração da substância de ensaio em 75 %.  
DT 90 (Tempo de Desaparecimento 90):  Tempo necessário para 
reduzir a concentração da substância de ensaio em 90 %.  
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
A caracterização e/ou identificação dos produtos de transformação 
através de métodos espectroscópicos e cromatográficos deverá envol ­
ver a utilização de substâncias de referência.  
1.4. APLICABILIDADE DO ENSAIO  
O método é aplicável a todas as substâncias químicas (não marcadas 
ou marcadas radioactivamente) para as quais se encontre disponível 
um método analítico suficientemente sensível e preciso. É aplicável a 
compostos ligeiramente voláteis, não voláteis, solúveis ou insolúveis em água. O ensaio não deve ser aplicado a compostos químicos muito voláteis a partir do solo (por exemplo, fumigantes, solventes 
orgânicos) já que estes, nas condições experimentais descritas, não 
podem ser mantidos no solo.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1292
 
1.5. INFORMAÇÃO SOBRE A SUBSTÂNCIA DE ENSAIO  
Enquanto para a medição da taxa de transformação poderão ser 
utilizadas substâncias de ensaio marcadas ou não marcadas, para o estudo da via de transformação e para o estabelecimento do balanço 
de massa é necessária a utilização de compostos marcados. A mar ­
cação recomendada é com
 14 C, embora a utilização de outros isóto ­
pos, tais como  13 C, 15 N, 3 H e  32 P, possa igualmente revelar-se útil. 
A marcação deve ser feita, tanto quanto possível, na(s) zona(s) mais 
estável(eis) da molécula (  1 ). A pureza da substância de ensaio deve 
ser de, pelo menos, 95 %.  
Antes de efectuar um ensaio sobre transformação aeróbia ou anae ­
róbia no solo, deve estar disponível a seguinte informação sobre a 
substância de ensaio:  
(a) solubilidade em água (Método A.6)  
(b) solubilidade em solventes orgânicos;  
(c) pressão de vapor (Método A.4) e constante da lei de Henry;  
(d) coeficiente de partição n-octanol/água (Método A.8);  
(e) estabilidade química no escuro (hidrólise) (Método C.7);  
(f) pK  a se a molécula puder sofrer protonação ou desprotonação 
[Norma de Ensaio 112 da OCDE] (16).  
Poderão ser úteis outras informações como, por exemplo, a existên ­
cia de dados relativos à toxicidade da substância de ensaio para os 
microorganismos do solo [Métodos de Ensaio C.21 e C.22] (16).  
Deverão estar disponíveis métodos analíticos (incluindo métodos de 
extracção e erradicação) que permitam a quantificação e identificação tanto da substância de ensaio como dos seus produtos de transfor ­
mação.
 
1.6. PRINCIPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
As amostras de solo são tratadas com a substância de ensaio e 
incubadas no escuro em balões biométricos ou em sistemas de fluxo em condições laboratoriais controladas (com temperatura e humidade do solo constantes). A intervalos de tempo adequados, extraem-se 
amostras de solo que são analisadas relativamente à substância inicial 
e aos seus produtos de transformação. Os produtos voláteis são igualmente recolhidos para análise utilizando dispositivos de absor ­
ção adequados. A utilização de material marcado com
 I4 C permite a 
determinação das várias taxas de mineralização da substância de 
ensaio através da recolha do  I4 CO 2 libertado e o estabelecimento 
de um balanço de massa que inclui a formação de resíduos ligados ao solo.
 
1.7. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
1.7.1.  Recuperação  
A extracção e análise de amostras de solo, pelo menos em duplicado 
imediatamente após a adição da substância de ensaio, fornece uma primeira indicação relativa à repetitividade do método analítico e à uniformidade do procedimento de aplicação da substância de ensaio. 
Os valores de recuperação em fases mais adiantadas das experiências 
são obtidos através dos respectivos balanços de massa. Os valores de recuperação devem variar entre 90 % e 110 % no caso de produtos químicos marcados (8) e entre 70 % e 110 % no caso de produtos 
químicos não marcados (3).
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1293  
( 1 ) Por exemplo, se a estrutura da substância de ensaio inclui um anel, este deverá ser 
marcado; no caso de a substância de ensaio possuir dois ou mais anéis, poderá ser 
necessário efectuar estudos independentes de modo a avaliar o destino de cada um 
dos anéis marcados e obter informação adequada sobre a formação dos produtos de 
transformação.
 1.7.2.  Repetitividade e sensibilidade do método analítico  
A repetitividade do método analítico (com excepção da eficiência de 
extracção inicial) na quantificação da substância de ensaio e dos produtos de transformação pode ser verificada pela análise em du ­
plicado do mesmo extracto de solo, após incubação durante o tempo 
suficiente para que ocorra a formação de produtos de transformação.
 
O limite de detecção (LD) do método analítico, tanto para a subs ­
tância de ensaio como para os produtos de transformação, deve corresponder, no mínimo, ao menor dos seguintes valores: 0,01 
mg kg
 -1 de solo (como substância de ensaio) ou 1 % da dose apli ­
cada. Deve ser igualmente especificado o limite de quantificação (LQ).
 
1.7.3.  Precisão dos dados de transformação  
A análise de regressão das concentrações da substância de ensaio em 
função do tempo fornece informação apropriada sobre a fiabilidade da curva de transformação e permite o cálculo dos limites de con ­
fiança para as semividas (no caso de cinética de pseudoprimeira 
ordem) ou os valores de DT
 50 e, se adequado, os valores de DT  75 
e de DT  90 . 
1.8. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.8.1.  Equipamento e reagentes químicos  
Os sistemas de incubação consistem em sistemas estáticos fechados 
ou em sistemas de fluxo adequados (7)(17), dos quais se representam 
exemplos nas figuras 1 (aparelho adequado para a incubação de 
solos em sistema de fluxo) e 2 (balão biométrico). Ambos os tipos de sistemas de incubação apresentam vantagens e limitações (7)(17).
 
Para além do material corrente de laboratório, é necessário o seguin ­
te: 
— Instrumentos analíticos, tais como equipamento de GLC, HPLC, 
TLC, incluindo os sistemas de detecção apropriados para a aná ­
lise de substâncias marcadas radioactivamente ou não marcadas 
ou o método de diluição inversa de isótopos;  
— Instrumentos para fins de identificação (por exemplo, MS, GC- 
-MS, HPLC-MS, NMR, etc.);  
— Contador de cintilações;  
— Câmara de combustão oxidante para combustão do material ra ­
dioactivo;  
— Centrífuga;  
— Aparelhos de extracção (por exemplo, tubos de centrífuga para 
extracção a frio e aparelho de Soxhlet para extracção contínua 
em refluxo);  
— Instrumentação para concentração de soluções e extractos (por 
exemplo, evaporador rotativo);  
— Banho de água;  
— Dispositivo para mistura mecânica (por exemplo, máquina de 
amassar, misturador rotativo).  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1294
 
Os reagentes químicos a utilizar incluem, por exemplo:  
— NaOH, qualidade analítica, 2 mol . dm  -3 , ou outra base adequada 
(por exemplo, KOH, etanolamina);  
— H  2 SO 4 , qualidade analítica, 0,05 mol . dm  -3 ; 
— Etilenoglicol, qualidade analítica;  
— Materiais sólidos de adsorção, tais como cal de soda e pastilhas 
de poliuretano;  
— Solventes orgânicos, qualidade analítica, tais como acetona, me ­
tanol, etc.;  
— Líquido de cintilação.  
1.8.2.  Aplicação da substância de ensaio  
Com vista à sua adição e distribuição no solo, a substância de ensaio 
pode ser dissolvida em água (desionizada ou destilada) ou, quando necessário, em quantidades mínimas de acetona ou de outros solven ­
tes orgânicos (6) em que a substância de ensaio seja suficientemente 
solúvel e estável. Neste caso, a quantidade do solvente seleccionado não deverá ter uma influência significativa na actividade microbiana do solo (ver secções 1.5 e 1.9.2-1.9.3). Deverá igualmente evitar-se a 
utilização de solventes que inibam a actividade microbiana, tais 
como clorofórmio, diclorometano e outros solventes halogenados.
 
A substância de ensaio pode também ser adicionada na forma sólida, 
por exemplo, misturada com areia de quartzo (6) ou com uma pe ­
quena subamostra do solo a ensaiar que tenha sido previamente seca 
ao ar e esterilizada. Neste caso, se a substância de ensaio foi adicio ­
nada utilizando um solvente, dever-se-á permitir a evaporação deste antes da adição da subamostra contendo a substância de ensaio à 
amostra original, não estéril, de solo.
 
No caso de produtos químicos de ocorrência comum, cuja via prin ­
cipal de entrada no solo é através de lamas de esgotos ou actividades agrícolas, a substância de ensaio deverá ser adicionada às lamas que são em seguida introduzidas na amostra de solo (ver secções 1.9.2 e 
1.9.3).
 
Embora a utilização sistemática de produtos formulados não seja 
recomendada, em algumas situações, como por exemplo, no caso de substâncias de ensaio pouco solúveis, a utilização deste tipo de 
produtos pode constituir uma alternativa apropriada.
 
1.8.3.  Solos  
1.8.3.1.  Selecção de solos  
Para a determinação da via de transformação, poderá utilizar-se um 
solo representativo. Nestes casos, recomenda-se a escolha de um solo areno-limoso, franco-limoso, limoso ou limo-arenoso [de acordo com 
a classificação da FAO e da USDA (18)] com um pH entre 5,5 - 8,0, 
um conteúdo de carbono orgânico entre 0,5 - 2,5 % e uma biomassa microbiana de, pelo menos, 1 % do carbono orgânico total (10).
 
Para estudos de taxas de transformação, devem utilizar-se pelo me ­
nos mais três solos, que deverão ser representativos de uma gama de 
solos relevante e cujo teor em carbono orgânico, pH, argila e bio ­
massa microbiana deverá variar (10).  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1295
 
Todos os solos deverão ser caracterizados, pelo menos, em relação à 
sua textura ( % de areia, % de silte, % de argila) [de acordo com a 
classificação da FAO e da USDA (18)], pH, capacidade de troca catiónica, carbono orgânico, densidade aparente, características de retenção de água (
 1 ) e biomassa microbiana (apenas no caso de 
estudos aeróbios); no entanto, a disponibilidade de outras informa ­
ções relativas às propriedades do solo poderá ser útil para a inter ­
pretação dos resultados. Com vista à determinação das características 4o solo, podem ser utilizados os métodos recomendados nas referên ­
cias (19)(20)(21)(22)(23). A biomassa microbiana deverá ser deter ­
minada pelo método da respiração induzida pelo substrato (SIR) (25)(26) ou por métodos alternativos (20).
 
1.8.3.2.  Recolha, manuseamento e armazenamento de solos  
Deve estar disponível informação pormenorizada sobre a história do 
local de recolha do solo a ensaiar, que inclua: a localização exacta, o coberto vegetal, o eventual tratamento com produtos químicos, fer ­
tilizantes orgânicos e inorgânicos, a adição de matéria biológica ou 
outras contaminações. No caso de terem sido tratados com a subs ­
tância de ensaio ou seus análogos estruturais nos quatro anos ime ­
diatamente anteriores, os solos não devem ser utilizados para estudos de transformação (10) (15),
 
A amostra de solo deverá ter sido recolhida recentemente (do hori ­
zonte A ou até 20 cm da camada superior) e o seu conteúdo de água deverá ser tal que facilite a crivagem. Para outros solos que não os 
provenientes de arrozais  paddy , deve evitar-se a amostragem durante 
ou imediatamente após longos períodos (> 30 dias) de seca, gelo ou inundação (14). Na medida do possível, as amostras devem ser trans ­
portadas de modo a minimizar alterações no conteúdo de água do 
solo e devem ser mantidas no escuro, em condições de boa ventila ­
ção. Para este fim, é geralmente adequada a utilização de sacos de polietileno fechados frouxamente.
 
Após a recolha, o solo deverá ser processado tão depressa quanto 
possível. Após a remoção da vegetação, fauna macroscópica e pe ­
dras, o solo é passado através de um peneiro de 2 mm, que remove 
as pequenas pedras e restos da fauna e plantas. Antes da crivagem, 
devem evitar-se a secagem e o esmagamento extensivos do solo (15).  
Nos casos em que a recolha das amostras é difícil durante o Inverno 
(solo congelado ou coberto de camadas de neve), a amostragem 
poderá ser feita a partir de um lote de solo armazenado numa estufa e coberto por vegetação (por exemplo, erva ou misturas de erva e trevo). Embora haja uma acentuada preferência por estudos efectua ­
dos com solos recolhidos na altura, nos casos em que o solo reco ­
lhido e processado tenha de ser armazenado antes do início do estudo, as condições de armazenamento devem ser adequadas e de curta duração (4 ± 2
 o C durante três meses, no máximo) de modo a 
manter a actividade microbiana (  2 ). Nas referências (8) (10) (15) (26) 
(27) podem encontrar-se instruções pormenorizadas sobre a recolha, o manuseamento e o armazenamento de solos para utilização em experiências de biotransformação.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1296  
( 1 ) As características de retenção de água de um solo podem ser medidas como capacidade 
de campo, capacidade de retenção de água ou tensão de sucção de água (pF). Consultar o 
apêndice 1 para mais pormenores. No relatório deverá referir-se se as características de 
retenção de água e densidade aparente dos solos foram determinadas em amostras de 
campo não perturbadas ou em amostras perturbadas (processadas). 
( 2 ) Resultados de investigações recentes indicam que solos provenientes de zonas tempera ­
das podem igualmente ser armazenados a - 20  o C durante períodos superiores a três 
meses (28) (29) sem se registarem perdas significativas de actividade microbiana.
 Antes da utilização do solo processado para o presente ensaio, este 
deve ser pré-incubado de modo a permitir a germinação e remoção 
das sementes e o restabelecimento do equilíbrio do metabolismo microbiano após a passagem de condições de amostragem ou arma ­
zenamento para condições de incubação. De modo a aproximar as 
condições de temperatura e humidade daquelas que serão utilizadas 
no ensaio, a pré-incubação durante um período de 2 a 28 dias) é geralmente adequada (15). No total, os períodos de armazenamento e pré-incubação não devem exceder três meses.
 
1.9. PROCEDIMENTO DO ENSAIO  
1.9.1.  Condições do ensaio:  
1.9.1.1.  Temperatura de ensaio  
Ao longo de todo o período do ensaio, os solos devem ser incubados 
no escuro e a uma temperatura constante e representativa das con ­
dições climáticas onde ocorrerá o uso ou libertação da substância. Relativamente a todas as substâncias de ensaio que possam vir a atingir o solo em climas temperados, a temperatura recomendada é 
de 20 ± 2
 o C. A temperatura deve ser monitorizada.  
No caso de produtos químicos aplicados ou libertados em climas 
mais frios (por exemplo, em países do Norte, durante o Outono ou 
o Inverno), devem ser incubadas amostras de solo adicionais a uma temperatura inferior (por exemplo, 10 ±2
 o C). 
1.9.1.2.  Teor de humidade  
No caso de ensaios de transformação em condições aeróbias, o teor 
de humidade do solo (  1 ) deve ser ajustado e mantido a um valor de 
pF entre 2,0 e 2,5 (3). O teor de humidade do solo é expresso em 
massa de água por massa de solo seco e deve ser controlado regu ­
larmente (por exemplo, de 2 em 2 semanas) por pesagem dos balões de incubação, devendo as perdas de água ser compensadas por adi ­
ção de água (de preferência, água da torneira esterilizada por filtra ­
ção). Durante a adição de água devem tomar-se precauções com 
vista a evitar ou minimizar perdas da substância de ensaio e/ou dos produtos de transformação por volatilização e/ou fotodegradação (caso ocorra).
 
No caso de ensaios de transformação em condições anaeróbias ou de 
solos  paddy , o solo é saturado com água por inundação.  
1.9.1.3.  Condições de incubação aeróbia  
No caso de sistemas de fluxo, as condições aeróbias serão mantidas 
através de ciclos de lavagem ou por ventilação contínua com ar humidificado. No caso de balões biométricos, a permuta de a ré 
mantida por difusão.
 
1.9.1.4.  Condições aeróbias estéreis  
Com vista à obtenção de informações relativas à relevância da trans ­
formação abiótica de uma substância de ensaio, as amostras de solo 
podem ser esterilizadas (para informações sobre métodos de esterili ­
zação, consultar as referências 16 e 29), tratadas com a substância de ensaio estéril (por exemplo, por adição da solução através de um 
filtro estéril) e arejadas com ar humidificado estéril, tal como des ­
crito na secção 1.9.1.3. No caso de solos  paddy , tanto o solo como a 
água devem ser esterilizados e a incubação deve ser efectuada tal como descrito na secção 1.9.1.6.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1297  
( 1 ) O solo não deve estar nem demasiado molhado nem demasiado seco de modo a manter 
uma ventilação e alimentação adequadas da microflora. Os teores de humidade recomen ­
dados para um crescimento microbiano óptimo variam entre 40 % e 60 % da capacidade 
de retenção de água (WHC) e entre 0,1 e 0,33 bar (6). Este último intervalo é equivalente 
a uma gama de pF entre 2,0 e 2,5. No apêndice 2 apresentam-se os teores de humidade 
típicos para vários tipos de solos.
 1.9.1.5.  Condições de incubação anaeróbia  
De modo a estabelecer e manter condições anaeróbias, o solo tratado 
com a substância de ensaio é inicialmente incubado em condições aeróbias durante 30 dias, uma semivida ou DT
 50 (escolher a opção 
mais curta), após o que é coberto de água (camada de água de 1- 
-3 cm) e o sistema de incubação lavado com um gás inerte (por exemplo, azoto ou árgon) (
 1 ). O sistema de ensaio deve permitir a 
realização de medições de pH, concentração de oxigénio e potencial 
redox, e incluir dispositivos de retenção de produtos voláteis. O 
sistema de balões biométricos deve ser fechado de modo a evitar a entrada de ar por difusão.
 
1.9.1.6.  Condições de incubação paddy  
De modo a estudar a transformação em solos de arrozais  paddy , o 
solo é coberto com uma camada de água de 1-5 cm e a substância de 
ensaio é aplicada na fase aquosa (9). A profundidade mínima do solo recomendada é de 5 cm. O sistema é ventilado com ar, tal como descrito para as condições aeróbias. Os valores de pH, concentração 
de oxigénio e potencial redox da camada aquosa devem ser monito ­
rizados e incluídos no relatório. O início dos estudos de transforma ­
ção deve ser precedido de um período de pré-incubação de, pelo menos, duas semanas (ver secção 1.8.3.2).
 
1.9.1.7.  Duração do ensaio  
Os estudos de taxa e via de transformação não devem normalmente 
exceder 120 dias (  2 ) (3) (6) (8), pois após este período é de esperar 
uma diminuição da actividade microbiana do solo num sistema la ­
boratorial artificial e isolado dos sistemas naturais de reposição de nutrientes. Sempre que seja necessário caracterizar o desapareci ­
mento da substância de ensaio e a formação e desaparecimento 
dos principais produtos de transformação, os estudos poderão ser prolongados (por exemplo, 6 ou 12 meses) (8). O prolongamento do ensaio deverá ser justificado no relatório de ensaio e acompa ­
nhado de medições de biomassa realizadas durante e no final desses 
períodos.
 
1.9.2.  Princípio do ensaio  
Em cada balão de incubação (ver figuras 1 e 2 do apêndice 3) 
coloca-se cerca de 50g a 200 g de solo (peso seco), que é tratado 
com a substância de ensaio utilizando um dos métodos descritos na 
secção 1.8.2. Caso se utilizem solventes orgânicos para a aplicação da substância de ensaio, estes devem ser removidos do solo por evaporação. 0 solo deverá ser muito bem mexido, utilizando uma 
espátula e/ou por agitação do balão. Se o ensaio for conduzido em 
condições de arrozal  paddy , o solo e a água devem ser muito bem 
misturados após a aplicação da substância de ensaio. De modo a verificar a uniformidade da distribuição da substância de ensaio, 
esta deverá ser analisada em pequenas alíquotas (por exemplo, 1 
g) dos solos tratados. Em alternativa, poderá ser utilizado um outro método, que se descreverá mais à frente.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1298  
( 1 ) As condições aeróbias são as que predominam em solos superficiais e mesmo em solos 
subsuperficiais, tal como foi demonstrado num projecto de investigação financiado pela 
UE [K. Takagi  et al.  (1992). Microbial diversity and activity in subsoils: Methods, field 
site, seasonal variation in subsoil temperatures and oxygen contents. Proc. Intemat. Symp. Environm. Aspects Pesticides Microbiol., 270-277, 17-21 August 1992, Sigtuna, 
Sweden]. A ocorrência de condições anaeróbias é ocasional, verificando-se apenas du ­
rante a inundação dos solos após precipitação intensa ou quando são estabelecidas 
condições  paddy  (em arrozais). 
(
 2 ) Os estudos aeróbios poderão ser terminados muito antes de decorridos 120 dias, desde 
que se tenha manifestamente atingido o final da mineralização e da via de transformação. 
A conclusão do teste poderá ocorrer após 120 dias ou quando pelo menos 90 % da 
substância de ensaio tiver sido transformada, mas apenas se se tiver formado, no mínimo, 
5 % de CO  2 .
 A taxa de tratamento deverá corresponder à maior taxa de aplicação 
de um produto de protecção de culturas que é recomendada nas 
instruções de utilização e a uma incorporação uniforme até uma profundidade adequada no campo (por exemplo, camada superficial de 10 cm de solo (
 1 ). Por exemplo, para produtos químicos aplicados 
na folhagem ou no solo sem incorporação, a profundidade apropriada 
para o cálculo de quantidade de produto químico a adicionar a cada balão é de 2,5 cm. No caso de produtos químicos incorporados no solo, a profundidade apropriada é a profundidade de incorporação 
especificada nas instruções de utilização. No caso de produtos quí ­
micos de ocorrência comum, a taxa de aplicação deve ser estimada com base na via de entrada mais relevante. Por exemplo, quando as lamas de esgotos constituem a principal via de entrada no solo, o 
produto químico deve ser adicionado às lamas a uma concentração 
que reflecte a sua concentração esperada e a quantidade de lamas adicionadas ao solo deve reflectir a sua carga habitual em solos agrícolas. Se esta concentração não for suficientemente elevada 
para que se possam identificar os principais produtos de transforma ­
ção, poderá ser útil a incubação de amostras de solo independentes contendo taxas mais elevadas, embora devam ser evitadas taxas ex ­
cessivas que possam influenciar as funções microbianas do solo (ver 
secções 1.5 e 1.8.2).
 
Alternativamente, poderá tratar-se uma maior quantidade de solo (ou 
seja, 1 kg a 2 kg) com a substância de ensaio; depois de ser cuida ­
dosamente misturado numa máquina misturadora apropriada, o solo tratado será então dividido em pequenas porções de 50 g a 200 g e 
transferido para os balões de incubação (por exemplo, utilizando 
divisores de amostras). Também neste caso deverão ser analisados pequenas alíquotas do lote de solo tratado (por exemplo, 1 g), de modo a determinar a uniformidade da distribuição da substância de 
ensaio. Este procedimento apresenta a vantagem de permitir uma 
distribuição mais uniforme da substância de ensaio no solo, pelo que será preferível a sua utilização.
 
Deverão ser igualmente incubadas, nas mesmas condições (aeróbias), 
que as amostras tratadas com a substância de ensaio, amostras de 
solo não tratadas; estas amostras serão utilizadas para medições de 
biomassa durante e no final dos estudos.  
Nos casos em que a substância de ensaio é aplicada no solo dissol ­
vida em solvente(s) orgânico(s), deverão ser incubadas, nas mesmas condições (aeróbias) que as amostras tratadas com a substância de ensaio, amostras de solo tratadas com a mesma quantidade de sol ­
vente(s) (sem adição da substância em ensaio). Estas amostras são 
utilizadas para medições de biomassa no início, durante e no final dos estudos de modo a verificar os efeitos do(s) solvente(s) na biomassa microbiana.
 
Os balões contendo o solo tratado podem ser ligados ao sistema de 
fluxo descrito na Figura 1 ou tapados com a coluna de absorção 
ilustrada na figura 2 (ver apêndice 3).  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1299  
( 1 ) O cálculo da concentração inicial com base na área utiliza a seguinte equação:  
C solo ½mg =kg solo â ¼ A½kg=haâ·10 6 ½mg =kgâ 
l½mâ·10 4 ½m 2=haâ·d½kg solo=m 3 â 
C solo = Concentração inicial no solo [mg ·kg -1 ] 
A = Taxa de aplicação [kg · ha -1 ]; 1 = espessura da camada de solo no campo [m]; 
d = densidade aparente do solo seco [kg · m -3 ]. 
Em geral, uma taxa de aplicação de 1 kg ha  -1 resulta numa concentração no solo de 
aproximadamente 1 mg · kg -1 , numa camada de 10 cm (assumindo uma densidade apa ­
rente de 1 g · cm  -3 ).
 1.9.3  Amostragem e medição  
A intervalos de tempo apropriados, removem-se dois balões de in ­
cubação, extraem-se as respectivas amostras de solo com solventes apropriados de polaridade diferente e analisa-se a substância de en ­
saio e/ou os produtos de transformação. Um estudo bem planeado 
deverá incluir um número de balões suficiente para que possam ser utilizados dois balões em cada ponto de amostragem. A intervalos de tempo variados durante a incubação de cada amostra de solo (inter ­
valos de 7 dias durante o primeiro mês e de 17 dias nos meses 
subsequentes), e no final do período de incubação, as soluções de absorção ou os materiais sólidos de absorção deverão ser removidos 
e analisados relativamente à presença de produtos, voláteis. Para 
além de uma amostra de solo recolhida imediatamente após a apli ­
cação da substância de ensaio (amostra do dia 0), deverão ser in ­
cluídos, pelo menos, 5 pontos de amostragem. Os intervalos de 
tempo deverão ser escolhidos de modo a possibilitar o estabeleci ­
mento do padrão de desaparecimento da substância de ensaio e dos padrões de formação e desaparecimento dos produtos de transforma ­
ção (por exemplo, 0, 1, 3, 7 dias; 2, 3 semanas; 1, 2, 3 meses, etc.).
 
No caso de se utilizar uma substância de ensaio marcada com  14 C, a 
radioactividade não extractável será quantificada por combustão e 
será calculado um balanço de massa para cada intervalo de amos ­
tragem.  
No caso de incubação anaeróbia ou  paddy , as fases de solo e água 
podem ser analisadas conjuntamente para a substância de ensaio e 
produtos de transformação ou ser separadas por filtração ou centri ­
fugação antes da extracção e análise.  
1.9.4.  Ensaios opcionais  
A fim de estimar a influência da temperatura e humidade do solo nas 
taxas de transformação de uma substância de ensaio e/ou dos seus produtos de transformação no solo, poderá ser útil realizar estudos 
em condições aeróbias, não estéreis, noutras condições de tempera ­
tura e humidade.
 
Pode tentar-se uma caracterização mais aprofundada da radioactivi ­
dade não extractável utilizando, por exemplo, extracção com fluidos supercríticos.
 
2. DADOS  
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS  
As quantidades de substância de ensaio, produtos de transformação, 
substâncias voláteis (apenas em percentagem) e produtos não extrac ­
táveis, devem ser indicadas na forma de percentagem da concentra ­
ção aplicada inicialmente e, quando apropriado, em mg-kg  -1 de solo 
(com base em peso de solo seco), para cada intervalo de amostra ­
gem. Para cada um destes intervalos deverá ainda apresentar-se um balanço de massa, em percentagem da concentração aplicada inicial ­
mente. A representação gráfica das concentrações da substância de 
ensaio em função do tempo permitirá estimar a sua semivida de 
transformação, ou DT
 50 . Os produtos dê transformação principais 
devem ser identificados e os valores das suas concentrações devem também ser representados graficamente em função do tempo a fim 
de evidenciar as suas taxas de formação e desaparecimento. Consi ­
dera-se um produto de transformação principal qualquer produto cuja concentração seja ≥ 10 % da dose aplicada em qualquer altura ao 
longo do estudo.
 
Os produtos voláteis retidos fornecem alguma indicação sobre a 
capacidade de volatilização, a partir do solo, de uma substância de 
ensaio e dos seus produtos de transformação.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1300
 
Devem ser determinados valores mais precisos para as semividas ou 
DT 50 e se apropriado, para DT  75 e DT  90 , através da aplicação de 
modelos cinéticos apropriados. Os valores de semivida e de DT50 devem ser apresentados conjuntamente com a descrição do modelo utilizado, da ordem da cinética da reacção e do coeficiente de de ­
terminação (r
 2 ). É preferível assumir uma cinética de primeira ordem, 
excepto se r  2 < 0,7. Quando apropriado, os cálculos devem ser 
igualmente aplicados aos produtos de transformação principais. As referências 31 a 35 descrevem exemplos de modelos apropriados.
 
No caso de estudos de taxas conduzidos a várias temperaturas, as 
taxas de transformação devem ser descritas em função da tempera ­
tura, dentro da gama de temperaturas utilizada experimentalmente, através duma relação de Arrhenius do tipo:
 
k ¼ A·e ÄB=T or lnk ¼ 1nA Ä B 
T , 
em que ln A e B correspondem, respectivamente, aos parâmetros de 
regressão ordenada na origem e declive da melhor correlação linear obtida entre ln k e 1/T, k representa a constante de velocidade à 
temperatura T e T representa a temperatura em kelvin. Deve ter-se 
em atenção que a relação de Arrhenius é válida para um intervalo limitado de temperatura, no caso de a transformação ser influenciada pela acção microbiana.
 
2.2. AVALIAÇÃO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS  
Apesar de os estudos serem efectuados num sistema laboratorial 
artificial, os resultados permitirão obter uma estimativa da taxa de transformação da substância de ensaio, assim como da taxa de for ­
mação e desaparecimento dos produtos de transformação em condi ­
ções de campo (36) (37).
 
O estudo da via de transformação de uma substância de ensaio 
fornece informação sobre o modo como a substância aplicada é estruturalmente modificada no solo por reacções químicas e micro ­
bianas.
 
3. RELATÓRIO  
RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deve incluir o seguinte:  
Substância de ensaio:  
— nome vulgar, nome químico, número CAS, fórmula estrutural 
(com indicação da(s) posição(s) de marcação no caso da utiliza ­
ção de material marcado radioactivamente) e propriedades físico- 
-químicas relevantes (ver secção 1.5),  
— pureza (impurezas) da substância de ensaio,  
— pureza radioquímica do produto químico marcado e actividade 
específica (quando apropriado).  
Substâncias de referência:  
— nome químico e estrutura das substâncias de referência utilizadas 
para a caracterização e/ou identificação dos produtos de trans ­
formação.  
Solos utilizados no ensaio:  
— características do local de recolha,  
— data e procedimento utilizado para a recolha de amostras do solo,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1301
 
— propriedades dos solos, tais como, pH, teor de carbono orgânico, 
textura ( % de areia, % de silte, % de argila), capacidade de troca 
catiónica, densidade aparente, características de retenção de água e biomassa microbiana,
 
— duração e condições de armazenamento do solo (caso tenha sido 
armazenado).  
Condições do ensaio:  
— datas em que os estudos foram efectuados,  
— quantidade de substância de ensaio aplicada,  
— solventes utilizados e método de aplicação da substância de en ­
saio, 
— peso do solo inicialmente tratado e retirado para análise em cada 
intervalo de tempo,  
— descrição do sistema de incubação utilizado,  
— taxas de fluxo de ar (apenas para sistemas de fluxo),  
— temperatura do sistema experimental,  
— teor de humidade do solo durante a incubação,  
— biomassa microbiana no início, durante e no final dos estudos 
aeróbios,  
— pH, concentração de oxigénio e potencial redox no início, du ­
rante e no final dos estudos anaeróbios e  paddy , 
— método(s) de extracção,  
— métodos de quantificação e identificação da substância de ensaio 
e principais produtos de transformação no solo e materiais de 
absorção,  
— número de repetições (duplicados) e número de controlos.  
Resultados:  
— resultado da determinação da actividade microbiana,  
— repetitividade e sensibilidade dos métodos analíticos utilizados,  
— taxas de recuperação (na secção 1.7.1 indicam-se os valores per ­
centuais que deverão verificar-se para um estudo válido),  
— tabelas de resultados expressos como percentagens da dose ini ­
cial aplicada e, quando apropriado, como mg-kg  -1 de solo (com 
base no peso seco),  
— balanço de massa durante e no final dos estudos,  
— caracterização da radioactividade não extractável (ligada) ou de 
resíduos presentes no solo,  
— quantificação do CO  2 e outros compostos voláteis libertados,  
— gráficos representativos da concentração de substância de ensaio 
no solo e, quando apropriado, dos produtos de transformação principais, em função do tempo,
 
— valores de semivida ou DT  50 , DT  75 e DT  90 para a substância de 
ensaio e, quando apropriado, para os produtos de transformação 
principais, incluindo os limites de confiança,  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1302
 
— estimativa da taxa de degradação abiótica em condições estéreis,  
— uma avaliação da cinética de transformação da substância de 
ensaio e, quando apropriado, dos produtos de transformação prin ­
cipais,  
— vias de transformação propostas, quando apropriado,  
— discussão e interpretação dos resultados,  
— dados experimentais (ou seja, exemplos de cromatogramas, 
exemplos de cálculos de taxas de transformação e métodos uti ­
lizados para identificar os produtos de transformação).  
4. REFERÊNCIAS  
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(2) Agriculture Canada (1987). Environmental Chemistry and Fate. 
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(3) Directiva 95/36/CE de 14 de Julho de 1995 que altera a Di ­
rectiva 91/414/CEE relativa à colocação dos produtos fitofar ­
macêuticos no mercado. Parte A do Anexo II e Parte A do Anexo III: Destino e comportamento no ambiente.
 
(4) Dutch Commission for Registration of Pesticides (1995). Ap ­
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(5) BBA (1986). Richtlinie für die amtliche Prüfung von Pflan ­
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(6) ISO/DIS 11266-1 (1994). Soil Quality-Guidance on laboratory 
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(7) ISO 14239 (1997). Soil Quality — Laboratory incubation sys ­
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(8) SETAC (1995). Procedures for Assessing the Environmental 
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(9) MAFF — Japan 2000 — Draft Guidelines for transformation 
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(adoptado a 12 de Maio de 1981).  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1303
 
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(19) Methods of Soil Analysis (1986). Part 1, Physical and Mine ­
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edição.  
(20) Methods of Soil Analysis (1982). Part 2, Chemical and Micro ­
biological Properties. A.L. Page, R.H. Miller and D.R. Kelney, Eds. Agronomy Series No 9, 2.
 a edição.  
(21) ISO Standard Compendium Environment (1994). Soil Quality 
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(22) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologis ­
chen, geomorphologischen, mineralogischen und petrologis ­
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(23) Scheffer, F., Schachtschabel, P. (1975). Lehrbuch der Boden ­
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Academic Press, 83-122.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1305
 
Apêndice 1  
TENSÃO DE ÁGUA, CAPACIDADE DE CAMPO (FC) E CAPACIDADE DE RETENÇÃO 
DE ÁGUA (WHC)  ( 1 ) 
Altura da Coluna de Água 
[cm] pF (  a ) bar (  b ) Observações  
10 7 7 10  4 Solo seco 
1,6 . 10  4 4,2 16 Ponto de emurchecimento 
10 4 4 10 
10 3 . 3 1 
6 . 10  2 2,8 0,6 
3,3 . 10  2 2,5 0,33 (  c ) 
Gama de 
Capacidade de campo (  d ) 10 2 2 0,1 
60 1,8 0,06 33 1,5  9 
> > > > > > = 
> > > > > > ; 0,033 
10 1 0,01 WHC (aproximação) 
1 0 0,001 Solo saturado de água
 
( a ) pF = log da altura da coluna de água, em centímetros. 
( b ) l bar = 10  5 Pa. 
( c ) Corresponde a um teor de água aproximado de 10 % na areia, 35 % no limo e 45 % na argila. 
( d ) A capacidade de campo não é constante, variando com o tipo de solo, com valores de pF entre 1,5 e 2,5.  
A tensão de água é  medida em centímetros da coluna de água ou em bar. Devido à extensa gama 
de valores para a tensão de sucção, esta é simplesmente expressa como o valor de pF que é 
equivalente ao logaritmo da altura da coluna de água, em centímetros.  
A capacidade de campo  é definida como a quantidade de água que pode ser armazenada, contra a 
gravidade, por um solo natural, 2 dias após um extenso período de precipitação ou após irrigação suficiente. É determinado no solo não perturbado,  in situ,  no campo. Esta medição não é, portanto, 
aplicável a amostras de solo processadas laboratorialmente. Os valores de FC determinados em 
solos processados podem apresentar amplas variâncias sistemáticas.
 
A capacidade de retenção de água  (WHC) é determinada laboratorialmente em solos não pertur ­
bados ou em solos processados, através da saturação de uma coluna de solo com água por trans ­
porte capilar. É particularmente útil para solos processados e pode atingir valores até 30 % supe ­
riores à capacidade de campo (1). Para além disso, é mais fácil a sua determinação experimental do que a determinação de valores fiáveis de FC.
 
Notas  
( 1 ) Mückenhausen, E. (1975). Die Bodenkunde und ihre geologischen, geomorphologischen, mineralogischen und 
petrologischen Grundlagen. DLG-Verlag, Frankfurt am Main.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1306
 
Apêndice 2  
TEORES DE HUMIDADE DO SOLO (g de água por 100 g de solo seco) DE VÁRIOS TIPOS 
DE SOLOS PROVENIENTES DE DIFERENTES PAÍSES  
Teor de humidade do solo a 
Tipo de solo País 
WHC (  1 ) pF = 1,8 pF = 2,5  
Arenoso Alemanha 28,7 8,8 3,9 
Limo-arenoso Alemanha 50,4 17,9 12,1 
Limo-arenoso Suíça 44,0 35,3 9,2 
Franco-limoso Suíça 72,8 56,6 28,4 Argilo-limoso Brasil 69,7 38,4 27,3 Argilo-limoso Japão 74,4 57,8 31,4 Areno-limoso Japão 82,4 59,2 36,0 Franco-limoso EUA 47,2 33,2 18,8 Areno-limoso EUA 40,4 25,2 13,3
 
( 1 ) Capacidade de Retenção de Agua  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1307
 
Apêndice 3  
Figura 1:  
Exemplo de um sistema de fluxo para o estudo da transformação de produtos químicos no 
solo ( 1 ) ( 2 )
 
Figura 2  
Exemplo de um balão biométrico para o estudo da transformação de produtos químicos no 
solo ( 3 )
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1308  
( 1 ) Guth, J.A. (1980). The study of transformations. In Interactions between Herbicides and the Soil (R.J. Hance, 
Ed.), Academic Press, 123-157. 
( 2 ) Guth, J.A. (1981). Experimental approaches to studying the fate of pesticides in soil. In Progress in Pesticide 
Biochemistry. D.H. Hutson, T.R. Roberts, Eds. J. Wiley & Sons. Vol 1, 85-114. 
( 3 ) Anderson, J.P.E. (1975). Einfluss von Temperatur und Feuchte auf Verdampfung, Abbau und Festlegung von 
Diallat im Boden. Z. PflKrankh Pflschutz, Sonderheft VII, 141-146.
 C.24.  TRANSFORMAÇÕES AERÓBIAS E ANAERÓBIAS EM 
SISTEMAS DE SEDIMENTOS AQUÁTICOS  
1. MÉTODO  
O presente método baseia-se na publicação OECD TG 308 (2002).  
1.1. INTRODUÇÃO  
Os produtos químicos podem penetrar em águas superficiais ou pro ­
fundas por diversas vias, tais como aplicação directa, arrastamento, escoamento superficial, drenagem, eliminação de resíduos, efluentes 
industriais, domésticos ou agrícolas e deposição atmosférica. O pre ­
sente Método de Ensaio descreve um método laboratorial para ava ­
liar as transformações aeróbias e anaeróbias de produtos químicos orgânicos em sistemas de sedimentos aquáticos e baseia-se em nor ­
mas de ensaio anteriormente definidas (1) (2) (3) (4) (5) (6). O 
número e tipo de sedimentos que devem ser utilizados no presente ensaio foi acordado numa reunião de trabalho da OCDE sobre se ­
lecção de solos e sedimentos, que decorreu em Belgirate, Itália, em 
1995 (7). Foram ainda feitas recomendações relativas à recolha, 
manipulação e armazenamento das amostra de sedimentos, tendo como base a Orientação ISO (8). Os estudos aqui descritos são necessários para os compostos químicos utilizados na água ou que 
são susceptíveis de vir a atingir o ambiente aquático pelas vias 
supracitadas.
 
As condições nos sistemas de sedimentos aquáticos naturais são 
frequentemente aeróbias na fase aquática superior. Enquanto a ca ­
mada superficial de sedimentos pode ser aeróbia ou anaeróbia, a camada mais profunda é usualmente anaeróbia. De modo a abranger as diferentes condições, o presente documento descreve tanto ensaios 
aeróbios como anaeróbios. O ensaio aeróbio simula uma coluna de 
água aeróbia no topo de uma camada aeróbia de sedimentos que é sustentada por um gradiente anaeróbio. O ensaio anaeróbio simula um sistema água-sedimento completamente anaeróbio. Em algumas 
circunstâncias poderá ser necessário utilizar condições significativa ­
mente diferentes das descritas nas presentes recomendações, por exemplo, utilizando núcleos intactos de sedimento ou sedimentos que possam ter sido expostos à substância de ensaio; nestes casos, 
deverão ser utilizados outros métodos disponíveis (9).
 
1.2. DEFINIÇÕES  
Devem ser sempre utilizadas unidades do Sistema Internacional (SI).  
Substância de ensaio:  Qualquer substância, quer seja o composto 
inicial ou um produto de transformação relevante.  
Produtos de transformação:  Todas as substâncias resultantes de 
reacções de transformação bióticas ou abióticas da substância de 
ensaio, incluindo CO  2 e resíduos ligados.  
Resíduos ligados: «resíduos ligados» representam compostos presen ­
tes no solo, planta ou animal, que, após extracção, persistem na 
matriz quer na forma da substância inicial quer como um dos seus 
metabolito(s). O método de extracção não poderá alterar substancial ­
mente nem os próprios compostos nem a estrutura da matriz. A natureza da ligação poderá ser parcialmente determinada utilizando 
métodos extractivos que alterem a matriz e através de técnicas ana ­
líticas sofisticadas. Têm sido identificadas deste modo, por exemplo, ligações do tipo covalente, iónico e de absorção/adsorção, assim como encapsulação. De um modo geral, a formação de resíduos 
ligados reduz significativamente a bioacessibilidade e a biodisponi ­
bilidade das substâncias (10) [adaptado de IUPAC 1984 (11)].
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1309
 
Transformação aeróbia  (oxidante): Reacções que ocorrem na pre ­
sença de oxigénio molecular (12).  
Transformação anaeróbia  (redutora): Reacções que ocorrem na 
ausência de oxigénio molecular (12).  
Águas naturais:  São águas superficiais provenientes de charcos, 
rios, cursos de água, etc.  
Sedimento:  É uma mistura de constituintes químicos minerais e 
orgânicos, em que os últimos incluem compostos com elevado con ­
teúdo de carbono e azoto e de peso molecular elevado. É depositado por águas naturais, com as quais forma uma interface.
 
Mineralização:  Degradação completa de um composto orgânico em 
CO 2 e H  2 O, em condições aeróbias, ou em CH  4 , CO  2 e H  2 O, em 
condições anaeróbias. No contexto do presente método de ensaio, quando se utiliza um composto marcado radioactivamente, o termo 
mineralização refere-se à sua degradação extensa, envolvendo a oxi ­
dação ou redução de um átomo de carbono marcado e a libertação da quantidade correspondente de
 14 CO 2 ou 14 CH 4 , respectivamente.  
Semivida:  t 0,5 , é o tempo necessário para a transformação de 50 % 
da substância de ensaio, nos casos em que a transformação pode ser 
descrita por uma cinética de primeira ordem. A semivida da subs ­
tância é independente da sua concentração inicial.  
DT 50 (Tempo de Desaparecimento 50):  Tempo necessário para 
reduzir a concentração inicial da substância de ensaio em 50 %.  
DT 75 (Tempo de Desaparecimento 75):  Tempo necessário para 
reduzir a concentração inicial da substância de ensaio em 75 %.  
DT 90 (Tempo de Desaparecimento 90):  Tempo necessário para 
reduzir a concentração inicial da substância de ensaio em 90 %.  
1.3. SUBSTÂNCIAS DE REFERÊNCIA  
A identificação e quantificação dos produtos de transformação atra ­
vés de métodos espectroscópicos e cromatográficos deverão envolver a utilização de substâncias de referência.
 
1.4. INFORMAÇÃO SOBRE A SUBSTÂNCIA DE ENSAIO  
Embora possam ser utilizadas para a medição da taxa de transfor ­
mação substâncias de ensaio marcadas isotopicamente ou não mar ­
cadas, é de preferir a utilização de material marcado. Para o estudo da via de transformação e para o estabelecimento do balanço de massa, é obrigatória a utilização de compostos marcados. A marca ­
ção recomendada é com
 14 C, embora a utilização de outros isótopos, 
tais como  13 C, 15 N, 3 H e  32 P, possa igualmente revelar-se útil. A 
marcação deve ser feita, tanto quanto possível, na(s) zona(s) mais estável(eis) da molécula (
 1 ). A pureza química e/ou radioquímica da 
substância de ensaio deve ser de, pelo menos, 95 %.  
Antes de se efectuar um ensaio, deve estar disponível a seguinte 
informação sobre a substância de ensaio:  
(a) solubilidade em água (Método A.6);  
(b) solubilidade em solventes orgânicos;  
(c) pressão de vapor (Método A.4) e constante da Lei de Henry;  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1310  
( 1 ) Por exemplo, se a estrutura da substância de ensaio inclui um anel, este deverá ser 
marcado; no caso de a substância de ensaio possuir dois ou mais anéis, poderá ser 
necessário efectuar estudos independentes de modo a avaliar o destino de cada um 
dos anéis marcados e obter informação adequada sobre a formação dos produtos de 
transformação.
 (d) coeficiente de partição n-octanol/água (Método A.8);  
(e) coeficiente de adsorção (K  d , K  f ou K  oc , quando apropriado) 
(Método C.18);  
(f) hidrólise (Método C.7);  
(g) constante de dissociação (pK  a ) [Norma de Ensaio OCDE 112] 
(13);  
(h) estrutura química da substância de ensaio e, quando aplicável, 
posição da(s) marcação(ões) isotópica(s).  
Nota:  A temperatura a que se efectuaram estas medições deverá ser 
indicada no relatório.  
Outras informações poderão ser úteis, como, por exemplo, a existên ­
cia de dados relativos à toxicidade da substância de ensaio para os microorganismos, dados sobre a biodegradabilidade «fácil» e/ou ine ­
rente e dados sobre as transformações aeróbias e anaeróbias no solo.
 
Deverão estar disponíveis métodos analíticos (incluindo métodos de 
extracção e erradicação) que permitam a identificação e quantificação 
da substância de ensaio e dos seus produtos de transformação em 
água e em sedimentos (ver secção 1.7.2).  
1.5. PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO  
O método descrito no presente ensaio utiliza um sistema aeróbio e 
um sistema anaeróbio de sedimento aquático (ver apêndice 1) que 
permite:  
(i) a medição da taxa de transformação da substância de ensaio 
num sistema água-sedimento;  
(ii) a medição da taxa de transformação da substância de ensaio no 
sedimento;  
(iii) a medição da taxa de mineralização da substância de ensaio e/ou 
dos seus produtos de transformação (caso se utilize a substância de ensaio marcada com C);
 
(iv) a identificação e quantificação dos produtos de transformação 
nas fases aquosa e de sedimento, incluindo balanço de massa 
(caso se utilize a substância de ensaio marcada);  
(v) a medição da distribuição da substância de ensaio e dos seus 
produtos de transformação entre as duas fases durante um pe ­
ríodo de incubação no escuro (a fim de evitar, por exemplo, o desenvolvimento explosivo de algas), a temperatura constante. Nos casos em que os dados o permitam, determinam-se valores 
para as semividas, DT
 50 , DT  75 e DT  90 , não devendo estes va ­
lores ser extrapolados para muito além do período experimental (ver secção 1.2).
 
Tanto para os estudos aeróbios como para os estudos anaeróbios, são 
necessários pelo menos dois sedimentos e as respectivas águas asso ­
ciadas (7). No entanto, poderão existir situações em que deverão ser utilizados mais do que dois sedimentos aquáticos, como, por exem ­
plo, no caso de um produto químico que possa estar presente em 
ambientes de água doce e/ou marítimos.
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1.6. APLICABILIDADE DO ENSAIO  
O método é geralmente aplicável a todas as substâncias químicas 
(não marcadas ou marcadas radioactivamente) para as quais se en ­
contre disponível um método analítico suficientemente sensível e 
preciso. É aplicável a compostos ligeiramente voláteis, não voláteis, 
solúveis ou pouco solúveis em água. O ensaio não deve ser aplicado a compostos químicos muito voláteis a partir da água (por exemplo, fumigantes, solventes orgânicos) já que estes, nas condições experi ­
mentais descritas, não podem ser mantidos na água e/ou sedimento.
 
O método tem sido aplicado ao estudo das transformações sofridas 
por produtos químicos em águas doces e sedimentos embora, em princípio, possa ser igualmente aplicado a sistemas de estuários e marítimos. Não é, no entanto, adequado para simular as condições de 
águas correntes (por exemplo, rios) ou de alto mar.
 
1.7. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
1.7.1.  Recuperação  
A extracção e análise de amostras de água e de sedimento, pelo 
menos em duplicado, imediatamente após a adição da substância de ensaio, fornece uma primeira indicação relativa à repetitividade 
do método analítico e à uniformidade do procedimento de aplicação 
da substância de ensaio. Os valores de recuperação em fases mais adiantadas das experiências são obtidos através dos respectivos ba ­
lanços de massa (caso se utilize material marcado). Os valores de 
recuperação devem variar entre 90 % e 110 % no caso de produtos 
químicos marcados (6) e entre 70 % e 110 % no caso de produtos químicos não marcados.
 
1.7.2.  Repetitividade e sensibilidade do método analítico  
A repetitividade do método analítico (com excepção da eficiência de 
extracção inicial) na quantificação da substância de ensaio e dos produtos de transformação pode ser verificada pela análise, em du ­
plicado, do mesmo extracto das amostras de água ou de sedimento, 
após incubação durante um período de tempo suficiente para que ocorra a formação de produtos de transformação.
 
O limite de detecção (LD) do método analítico, tanto para a subs ­
tância de ensaio como para os produtos de transformação, deve 
corresponder, no mínimo, ao menor dos seguintes valores: 0,01 
mg-kg  -1 de água ou sedimento (como substância de ensaio) ou 
1 % da dose inicialmente aplicada ao sistema de ensaio. Deve ser igualmente especificado o limite de quantificação (LQ).
 
1.7.3.  Precisão dos dados de transformação  
A análise de regressão das concentrações da substância de ensaio em 
função do tempo fornece informação apropriada sobre a precisão da 
curva de transformação e permite o cálculo dos limites de confiança 
para as semividas (no caso de cinética de pseudo primeira ordem) ou os valores de DT
 50 e, se adequado, os valores de DT  75 e de DT  90 . 
1.8. DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
1.8.1.  Sistema de ensaio e aparelhagem  
O estudo deve ser efectuado em recipientes de vidro (por exemplo, 
frascos, tubos de centrífuga), excepto se existir informação prelimi ­
nar (tal como coeficientes de partição n-octanol/água, dados de 
absorção/adsorção, etc.) indicativa de que a substância de ensaio pode aderir ao vidro, caso em que se deve considerar a utilização de um material alternativo (como Teflon). Quando se sabe que a 
substância de ensaio adere ao vidro, o problema pode ser contornado 
através da utilização de um ou mais dos seguintes métodos:
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— determinar a massa da substância de ensaio e dos produtos de 
transformação que se encontram absorvidos/adsorvidos ao vidro,  
— efectuar uma lavagem de todo o material de vidro com solvente 
no final do ensaio,  
— utilizar produtos formulados (ver igualmente secção 1.9.2),  
— utilizar uma maior quantidade de co-solvente para a adição da 
substância de ensaio ao sistema. Caso se utilize um co-solvente, este não deverá provocar solvólise da substância de ensaio.
 
Nos apêndices 2 e 3 apresentam-se exemplos de montagens experi ­
mentais típicas de ensaio, ou seja, sistemas de fluxo e biométricos, respectivamente (14). Na referência 15 são descritos sistemas de incubação alternativos. A concepção das montagens experimentais 
deve permitir a troca de ar ou azoto e a retenção de produtos volá ­
teis. As dimensões da montagem experimental devem estar de acordo com os requisitos do ensaio (ver secção 1.9.1). A ventilação pode ser obtida quer por ligeiro borbulhar, quer por passagem de ar ou azoto 
sobre a superfície da água. No último caso, é aconselhável agitar 
ligeiramente a água, a partir do topo, por forma a garantir uma melhor distribuição do oxigénio e azoto. Não deve ser utilizado ar sem CO
 2 , pois tal pode provocar um aumento do pH da água. Em 
qualquer dos casos, a perturbação do sedimento é indesejável e deve 
ser, tanto quanto possível, evitada. Os produtos químicos ligeira ­
mente voláteis devem ser ensaiados num sistema biométrico com ligeira agitação da superfície da água. Podem igualmente ser utiliza ­
dos recipientes fechados com um espaço livre contendo ar atmosfé ­
rico ou azoto e pequenos recipientes internos para a retenção de produtos voláteis (16). Durante o ensaio aeróbio, o gás presente na zona superior livre deve ser mudado regularmente de modo a com ­
pensar o consumo de oxigénio pela biomassa.
 
Para a recolha de produtos de transformação voláteis, podem ser 
utilizados dispositivos de retenção adequados, embora não se restrin ­
gindo a uma solução de hidróxido de potássio ou de hidróxido de sódio a 1 mol.dm
 -3 para a retenção de dióxido de carbono (  1 ) e 
etilenoglicol, ou etanolamina ou uma solução de parafina a 2 % 
em xileno para compostos orgânicos. Os produtos voláteis formados em condições anaeróbias, tais como o metano, podem ser removidos, por exemplo, através de peneiros moleculares. Estes compostos vo ­
láteis podem ser sujeitos a combustão, a CO
 2 , por exemplo, por 
passagem do gás através de um tubo de quartzo cheio com CuO a uma temperatura de 900
 o C e recuperando o CO  2 formado num 
absorvente alcalino (17).  
É necessária aparelhagem laboratorial adequada à análise química da 
substância de ensaio e dos produtos de transformação (por exemplo, cromatografia gás-líquido (GLC), cromatografia líquida de alta reso ­
lução (HPLC), cromatografia de camada fina (TLC), espectroscopia 
de massa (MS), cromatografia gasosa acoplada a espectroscopia de 
massa (GC-MS), cromatografia líquida acoplada a espectroscopia de massa (LC-MS), ressonância magnética nuclear (NMR), etc.), in ­
cluindo sistemas de detecção para produtos marcados radioactiva ­
mente, ou não marcados. No caso de se utilizar material marcado 
radioactivamente, serão ainda necessários um contador de cintilações e uma mufla de combustão oxidante (para a combustão de amostras de sedimento antes da análise de radioactividade).
 
Outro equipamento corrente de laboratório necessário inclui o mate ­
rial apropriado para determinações físico-químicas e biológicas (ver 
tabela 1, secção 1.8.2.2), material de vidro, produtos químicos e reagentes.
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( 1 ) Uma vez que estas soluções alcalinas de absorção absorvem também o dióxido de 
carbono proveniente do ar de ventilação e da respiração em experiências aeróbias, devem 
ser trocadas a intervalos regulares, de modo a evitar a sua saturação e consequente perda 
de capacidade de absorção.
 1.8.2.  Selecção e número de sedimentos aquáticos  
Os locais de amostragem devem ser seleccionados de acordo com os 
objectivos do ensaio para cada situação. Na sua selecção, deve ter-se em conta o historial de possíveis descargas de origem agrícola, in ­
dustrial ou doméstica que tenham atingido a água no local de cap ­
tação ou a montante. Não devem ser utilizados sedimentos que te ­
nham sido contaminados com a substância de ensaio ou seus análo ­
gos estruturais nos últimos 4 anos.
 
1.8.2.1.  Selecção de sedimento  
Para os estudos aeróbios (7), utilizam-se normalmente dois sedimen ­
tos que devem diferir em relação ao teor de carbono orgânico e à textura. Um dos sedimentos deve apresentar um elevado teor de 
carbono orgânico (2,5 - 7,5 %) e uma textura fina, enquanto o outro 
deve apresentar um baixo teor de carbono orgânico (0,5 - 2,5 %) e uma textura grossa. A diferença mínima entre os teores de carbono 
orgânico deverá ser de 2 %. Define-se «textura fina» como um 
conteúdo em [argila + silte] (
 1 ) > 50 % e «textura grossa» como 
um conteúdo em [argila + silte] < 50 %. A diferença entre os conteúdos em [argila + silte] nos dois sedimentos deve ser de, 
pelo menos, 20 %. Nos casos em que o produto químico possa 
atingir águas marinhas, pelo menos um dos sistemas água-sedimento deve ser de origem marinha.
 
Para o estudo em condições estritamente anaeróbias, devem ser re ­
colhidas amostras de dois sedimentos (incluindo as respectivas águas) a partir de zonas anaeróbias de massas de água superficiais (7). Tanto a fase sedimentar como a aquosa devem ser cuidadosa ­
mente manuseadas e transportadas na ausência de oxigénio.
 
Para a selecção dos sedimentos a incluir no ensaio podem ser im ­
portantes outros parâmetros, que devem ser considerados caso a 
caso. Por exemplo, a gama de pH dos sedimentos será importante para a análise de produtos químicos cuja transformação e/ou absorção/adsorção possa depender do pH. A dependência da 
absorção/adsorção relativamente aos valores de pH pode ser indicada 
pelo pK
 a da substância de ensaio.  
1.8.2.2.  Caracterização das amostras água-sedimento  
Os parâmetros mais relevantes que deverão ser medidos tanto para a 
água como para o sedimento e incluídos no relatório (fazendo refe ­
rência ao método utilizado), assim como a fase do ensaio em que devem ser determinados, encontram-se resumidos na tabela abaixo. As referências (18) (19) (20) (21) descrevem os métodos para deter ­
minação desses parâmetros.
 
Em casos específicos, poderá ser necessário medir, e incluir no 
relatório, outros parâmetros [por exemplo, para água doce: partículas, 
alcalinidade, dureza, condutividade, NO  3 /PO  4 (razão e valores indi ­
viduais); para sedimentos: capacidade de troca catiónica, capacidade de retenção de água, carbonato, azoto e fósforo totais; para sistemas 
marítimos: salinidade]. Para a avaliação das condições redox, espe ­
cialmente no que diz respeito à transformação anaeróbia, poderá ainda ser útil a análise dos sedimentos e da água relativamente à presença de nitrato, sulfato, ferro biodisponível e outros aceitadores 
electrónicos possíveis.
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( 1 ) [Argila + silte] é a fracção mineral do sedimento com dimensão de partícula < 50 μm.
 Medição de parâmetros para a caracterização das amostras água-sedimento (7) (22) (23)  
Parâmetro Fase do procedimento de ensaio 
Amostra­
gem de 
campo Manusea­
mento 
posterior Início da 
aclimatação Início do 
ensaio Durante o 
ensaio Final do 
ensaio  
Água  
Origem X Temperatura X PH X X X X X 
TOC X X X 
Concentração de O
 2 (*) X X X X X 
Potencial redox (*) X X X X  
Sedimento  
Origem X Profundidade da camada X 
PH X X X X X 
Distribuição do tamanho das 
partículas X 
TOC X X X X 
Biomassa microbiana (**) X X X Potencial redox (*) Observa ­
ção (cor/ 
/cheiro) X X X X
 
(*) Investigações recentes revelaram que as medições das concentrações de oxigénio e de potenciais redox na água não 
possuem valor mecanístico nem preditivo relativamente ao crescimento e desenvolvimento de populações microbia ­
nas em águas superficiais (24)(25). A determinação da carência bioquímica de oxigénio (BOD, durante a amostragem 
de campo, no início e no final do ensaio) e das concentrações dos micro/macronutrientes Ca, Mg e Mn (no início e 
no final do ensaio), para o caso da água, e a medição do N e P totais no caso de sedimentos (durante a amostragem 
de campo e no final do ensaio) podem constituir instrumentos mais úteis para a interpretação e avaliação das taxas e 
vias de biotransformação aeróbia. 
(**) Métodos utilizados: Para estudos aeróbios, o método da taxa de respiração microbiana (26); método de fumigação 
(27) ou contagem de colónias (por exemplo, bactérias, actinomicetes, fungos e colónias totais). Para estudos 
anaeróbios, taxa de metanogénese.  
1.8.3.  Recolha, manuseamento e armazenamento  
1.8.3.1.  Recolha  
Para a amostragem de sedimento, deve ser utilizada a versão preli ­
minar da Orientação ISO para a amostragem de sedimentos (8). As amostras de sedimento recolhidas devem incluir toda a camada su ­
perior (5 cm a 10 cm) do sedimento. A água associada deve ser 
recolhida da mesma zona ou local e ao mesmo tempo que o sedi ­
mento. Para o estudo anaeróbio, o sedimento e a água associada devem ser recolhidos e transportados na ausência de oxigénio (28) (ver secção 1.8.2.1). Encontram-se descritos na literatura alguns dis ­
positivos de amostragem (8) (23).
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1.8.3.2.  Manuseamento  
A separação do sedimento da água é feita por filtração e o sedimento 
húmido é crivado com um peneiro de 2 mm, utilizando um excesso de água recolhida no mesmo local que é posteriormente rejeitada. 
Em seguida, misturam-se quantidades conhecidas de sedimento e 
água, na razão desejada (ver secção 1.9.1), em balões de incubação e preparam-se para o período de aclimatação (ver secção 1.8.4). Para o estudo anaeróbio, todos os passos devem ser realizados na ausência 
de oxigénio (29) (30) (31) (32) (33).
 
1.8.3.3.  Armazenamento  
A utilização de amostras de sedimento e água recentemente recolhi ­
das é vivamente recomendada. No entanto, caso o seu armazena ­
mento seja necessário, o sedimento e a água devem ser crivados, tal como descrito anteriormente, e armazenados conjuntamente, com o sedimento coberto de água (camada de água de 6 cm a 10 cm), no 
escuro, a 4 ± 2
 o C (  1 ) por um período máximo de 4 semanas (7) (8) 
(23). As amostras que se destinam a estudos aeróbios devem ser armazenadas em condições de boa ventilação (por exemplo, em recipientes abertos), enquanto as amostras destinadas a estudos anae ­
róbios devem ser armazenadas na ausência de oxigénio. Durante o 
transporte e o armazenamento não poderá verificar-se o congela ­
mento do sedimento e da água ou a secagem do sedimento.
 
1.8.4.  Preparação das amostras de sedimento/água para o ensaio  
Cada amostra de sedimento/água deverá ser sujeita a um período de 
aclimatação, antes da adição da substância de ensaio. Para tal, cada amostra é colocada no recipiente de incubação que será utilizado no ensaio principal, exactamente nas mesmas condições de incubação 
do ensaio (ver secção 1.9.1). O período de aclimatação decorrerá 
durante o tempo necessário para atingir uma estabilidade razoável do sistema, reflectido pelos valores de pH, concentração de oxigénio 
na água, potencial redox do sedimento e da água e separação ma ­
croscópica das fases. O período de aclimatação deverá ser, geralmen ­
te, de uma a duas semanas, não devendo exceder quatro semanas. Os resultados das determinações efectuadas durante este período devem 
ser incluídos no relatório.
 
1.9. PROCEDIMENTO DO ENSAIO  
1.9.1.  Condições do ensaio:  
O ensaio deve ser efectuado num aparelho de incubação (ver secção 
1.8.1), com uma razão volume de água/sedimento entre 3:1 e 4:1 e 
uma espessura da camada de sedimento de 2,5 cm (± 0,5 cm).  2 
Recomenda-se ter um mínimo de 50 g de sedimento (peso seco) 
por recipiente de incubação.  
O ensaio deve ser efectuado no escuro, a uma temperatura constante 
compreendida entre 10 e 30  o C. Considera-se adequada uma tempe ­
ratura de (20 ± 2)  o C. Nos casos em que tal for apropriado, depen ­
dendo da informação pretendida com o ensaio, poderá considerar-se a utilização de uma temperatura mais baixa (por exemplo, 10
 o C). A 
temperatura de incubação deverá ser sempre monitorizada e indicada 
no relatório.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1316  
( 1 ) Estudos recentes demonstraram que o armazenamento a 4  o C pode conduzir a uma 
diminuição do teor de carbono orgânico do sedimento que, por sua vez, poderá resultar 
numa diminuição da actividade microbiana (34).
 1.9.2.  Tratamento e aplicação da substância de ensaio  
O ensaio é realizado com uma única concentração do produto 
químico (  1 ). No caso de produtos químicos de protecção de colheitas 
aplicados directamente em massas de água, a dosagem máxima in ­
dicada no rótulo deve ser considerada como a taxa máxima de apli ­
cação calculada com base na área superficial de água do recipiente de ensaio. Em todos os restantes casos, a concentração a utilizar deverá basear-se em previsões de emissões ambientais. Devem adop ­
tar-se precauções que garantam a aplicação de uma concentração 
adequada da substância de ensaio, de modo a permitir a caracteriza ­
ção da via de transformação e da formação e desaparecimento dos 
produtos de transformação. Nos casos em que, no início do estudo, 
as concentrações da substância de ensaio se encontram próximas dos limites de detecção e/ou nos casos em que os principais produtos de transformação não podem ser facilmente detectados quando a sua 
concentração é de 10 % da taxa de aplicação da substância de 
ensaio, poderá ser necessária a aplicação de doses mais elevadas (por exemplo, 10 vezes superiores). No entanto, caso se utilizem no ensaio concentrações superiores, estas não deverão ter efeitos 
adversos significativos na actividade microbiana do sistema água- 
-sedimento. A fim de obter uma concentração constante da substância de ensaio em recipientes de diferentes dimensões, poderá considerar- -se apropriado ajustar a quantidade da substância de ensaio ao volume 
em ensaio; neste caso, os cálculos deverão basear-se na relação entre 
a profundidade da coluna de água no recipiente e a profundidade da água no campo (que se assume como sendo de 100 cm, apesar de poderem ser utilizados outros valores). Ver um exemplo de cálculo 
no apêndice 4.
 
Idealmente, a substância de ensaio deve ser adicionada à fase aquosa 
do sistema de ensaio na forma de solução aquosa. No entanto, 
quando tal for inevitável, poderão utilizar-se pequenas quantidades 
de solventes miscíveis em água (tais como acetona, etanol) para a aplicação e distribuição da substância de ensaio, desde que a sua 
concentração não exceda 1 % v/v nem provoque efeitos adversos na 
actividade microbiana do sistema de ensaio. Durante a preparação da solução aquosa da substância de ensaio devem tomar-se as precau ­
ções necessárias e de modo a assegurar a sua completa homogenei ­
dade poderá ser necessário utilizar colunas e pré-mistura. Após a 
adição da solução aquosa ao sistema de ensaio, a fase aquosa deverá ser suavemente misturada, evitando, tanto quanto possível, perturbar o sedimento.
 
Embora a utilização rotineira de produtos formulados não seja reco ­
mendada, já que os ingredientes da formulação podem afectar a distribuição da substância de ensaio e/ou dos produtos de transfor ­
mação entre as fases aquosa e sedimentar, no caso de substâncias de 
ensaio pouco solúveis em água, a sua utilização poderá constituir uma alternativa apropriada.
 
O número de recipientes de incubação depende do número de 
pontos de amostragem (ver secção 1.9.3), devendo ser incluídos sistemas de ensaio suficientes para permitir a utilização de dois 
sistemas em cada ponto de amostragem. Nos casos em que se 
utilizem unidades de controlo para cada sistema de sedimento aquático, estas não deverão ser tratadas com a substância de ensaio. As unidades de controlo poderão ser utilizadas para a 
determinação da biomassa microbiana do sedimento e do car ­
bono orgânico total da água e do sedimento no final do estudo. Duas das unidades de controlo (ou seja, uma unidade de con ­
trolo de cada sedimento aquático) poderão ser utilizadas para 
monitorizar os parâmetros requeridos, relativamente ao sedimento 
e à água, durante o período de aclimatação (ver tabela na secção 1.8.2.2). No caso de a aplicação da substância de ensaio envolver a utilização de um solvente, deverão ser incluídas duas 
unidades de controlo adicionais para a medição dos potenciais 
efeitos adversos do solvente na actividade microbiana do sistema de ensaio.
 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1317  
( 1 ) O ensaio com uma segunda concentração poderá ser útil no caso de produtos químicos 
que atingem águas superficiais por diferentes vias de entrada, resultando em concen ­
trações significativamente diferentes; nestes casos, é necessário garantir que a concen ­
tração mais baixa pode ser analisada com precisão suficiente.
 1.9.3. Normalmente, a duração da experiência não deve exceder 100 dias 
(6), e deve prosseguir até que se encontrem estabelecidas as vias 
de degradação e os perfis de distribuição água/sedimento ou até que 90 % da substância de ensaio se tenha dissipado por transformação e/ou volatilização. Deverão ser incluídos, pelo menos, seis pontos de 
amostragem (incluindo a amostragem no tempo zero). A duração e o 
regime de amostragem apropriados para o ensaio poderão ser esta ­
belecidos através da realização de um estudo preliminar opcional (ver secção 1.9.4) ou, no caso de existirem, a partir de dados dis ­
poníveis sobre a substância de ensaio provenientes de estudos ante ­
riores. No caso de substâncias de ensaio hidrófobas, poderá ser necessária a inclusão de pontos de amostragem adicionais durante o período inicial do estudo, de modo a permitir a determinação da 
taxa de distribuição entre as fases aquosa e sedimentar.
 
No tempo correspondente a cada ponto de amostragem, obtêm-se, 
para análise, recipientes de incubação em duplicado. O sedimento e a 
fase aquosa sobrenadante são analisados separadamente (  1 ). A água 
superficial deve ser removida cuidadosamente, tendo o cuidado de causar a mínima perturbação possível na fase sedimentar. A extrac ­
ção e caracterização da substância de ensaio e dos seus produtos de 
transformação devem ser feitas recorrendo a procedimentos analíticos apropriados. O material que possa ter ficado adsorvido, quer no recipiente de incubação quer nos tubos de ligação aos dispositivos 
de retenção de substâncias voláteis, deve ser removido.
 
1.9.4.  Ensaio preliminar opcional  
Nos casos em que a duração e o regime de amostragem não possam 
ser estimados a partir de outros estudos relevantes sobre a substância 
de ensaio, pode ser considerado apropriado recorrer a um ensaio preliminar, opcional, que deverá ser efectuado utilizando as mesmas condições experimentais propostas para o estudo definitivo. Caso 
seja efectuado o ensaio preliminar, as condições experimentais 
mais relevantes e os resultados devem ser incluídos, de uma forma resumida, no relatório.
 
1.9.5.  Medições e análise  
A concentração da substância de ensaio e dos seus produtos de 
transformação na água e no sedimento, em cada ponto de amostra ­
gem, deve ser medida e incluída no relatório (expressa em concen ­
tração e em percentagem de substância aplicada). De uma forma 
geral, e a menos que seja apresentada uma justificação razoável 
para o contrário, devem ser identificados todos os produtos de trans ­
formação que sejam detectados em quantidade ≥ 10 % da radioacti ­
vidade aplicada no sistema água-sedimento total, em qualquer ponto 
de amostragem. Os produtos de transformação cujas concentrações aumentarem continuamente durante o ensaio também devem ser identificados, mesmo nos casos em que a sua concentração não 
exceda os limites apresentados acima, já que este comportamento 
poderá ser indicativo de persistência. Esta área deve ser considerada caso a caso e o procedimento adoptado deve ser justificado no relatório.
 
Os resultados obtidos a partir dos sistemas de retenção de gases/ ­
compostos voláteis (CO  2 e outros compostos químicos, ou seja, 
compostos orgânicos voláteis) devem ser incluídos no relatório 
para cada um dos tempos de amostragem. As taxas de mineralização deverão igualmente ser incluídas no relatório, assim como os dados sobre os resíduos não extractáveis (ligados) para cada ponto de 
amostragem.
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( 1 ) Nos casos em que os produtos de transformação anaeróbia possam ser fácil e rapida ­
mente reoxidados, as condições anaeróbias devem ser mantidas durante a amostragem e a 
análise.
 2. DADOS  
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS  
Para cada ponto de amostragem, deverá ser calculado o balanço de 
massa total ou a recuperação da radioactividade adicionada (ver 
secção 1.7.1). Os resultados devem ser expressos, no relatório, 
como percentagem da radioactividade adicionada. A distribuição da radioactividade entre a água e o sedimento deve ser apresentada no relatório, para cada tempo de amostragem, na forma de concentra ­
ções e de percentagens.
 
Devem calcular-se os valores de semivida, DT  50 e, se apropriado, 
DT 75 e DT  90 da substância de ensaio, e respectivos limites de con ­
fiança (ver secção 1.7.3). A informação relativa à taxa de dissipação da substância de ensaio em água e no sedimento poderá ser obtida através da utilização de métodos de avaliação adequados, que podem 
ir desde a aplicação de um modelo de cinética de pseudoprimeira 
ordem a técnicas empíricas de ajuste de curvas, que aplicam soluções gráficas ou numéricas, e avaliações mais complexas que utilizem, por exemplo, modelos de compartimento único ou compartimentos múl ­
tiplos. Para informação mais pormenorizada poderá consultar-se a 
literatura relevante (35) (36) (37).
 
Todos os métodos disponíveis apresentam vantagens e desvantagens 
e grande variabilidade em termos de complexidade. Se, por um lado, o pressuposto de uma cinética de primeira ordem pode ser uma simplificação excessiva dos processos de degradação e de distribui ­
ção, a sua aplicação, quando possível, fornece um termo (constante 
de velocidade ou semivida) que é facilmente compreendido e bas ­
tante útil em modelação por simulação e no cálculo de concentrações ambientais previstas. A aplicação de métodos empíricos ou de mo ­
delos de transformação linear pode resultar num melhor ajuste da 
curva aos dados experimentais e, portanto, permitir uma melhor estimativa dos valores de semivida, DT
 50 e, quando apropriado, 
DT 75 e DT  90 . No entanto, a utilização das constantes assim derivadas 
é limitada. Por seu lado, a aplicação de modelos de compartimentos 
permite o cálculo de várias constantes úteis na avaliação de risco, que caracterizam a taxa de degradação nos diferentes compartimen ­
tos, bem como a distribuição do produto químico. Estes modelos 
devem igualmente ser utilizados para estimar as constantes de velo ­
cidade para a formação e degradação dos produtos de transformação principais. Em qualquer dos casos, a selecção do método adoptado deve ser justificada no relatório e o experimentador deve demonstrar 
graficamente e/ou estatisticamente a adequação do ajuste.
 
3. RELATÓRIO  
3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório deve incluir a seguinte informação:  
Substância de ensaio:  
— nome vulgar, nome químico, número CAS, fórmula estrutural 
(com indicação da posição de marcação no caso da utilização de material marcado radioactivamente) e propriedades físico-quí ­
micas relevantes,
 
— pureza (impurezas) da substância de ensaio,  
— pureza radioquímica do produto químico marcado e actividade 
molar (quando apropriado).  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1319
 
Substância de referência:  
— nome químico e estrutura das substâncias de referência utilizadas 
para a caracterização e/ou identificação dos produtos de trans ­
formação.  
Sedimentos e águas utilizados no ensaio:  
— localização e descrição do local de recolha das amostras de se ­
dimento aquático, incluindo, se possível, o historial de contami ­
nação,  
— toda a informação relacionada com a recolha, armazenamento 
(caso tenha sido efectuado) e aclimatação dos sistemas água- -sedimento,
 
— características das amostras de água -sedimento, tal como apre ­
sentadas na tabela da secção 1.8.2.2.  
Condições do ensaio:  
— sistema de ensaio utilizado (por exemplo, sistema de fluxo, sistema 
biométrico, modo de ventilação, método de agitação, volume de 
água, massa de sedimento, espessura da camada de água e da 
camada de sedimento, dimensão dos recipientes de ensaio, etc.),  
— aplicação da substância de ensaio ao sistema de ensaio: concen ­
tração de ensaio utilizada, número de repetições (duplicados) e controlos e modo de aplicação da substância de ensaio (por exemplo, utilização de solvente, caso necessário), etc.,
 
— temperatura de incubação,  
— tempos de amostragem,  
— métodos de extracção e respectivas eficiências, assim como mé ­
todos analíticos e limites de detecção,  
— métodos para caracterização/identificação dos produtos de trans ­
formação,  
— deviations from the test protocol or test conditions during the 
study.  
Results:  
— raw data figures of representative analyses (all raw data have to 
be stored in the GLP-archive);  
— repeatability and sensitivity of the analytical methods used;  
— rates of recovery ( % values for a valid study are given in section 
1.7.1);  
— tables of results expressed as % of the applied dose and in 
mg· kg  -1 in water, sediment and total system ( % only) for the 
test substance and, if appropriate, for transformation products and non-extractable radioactivity;
 
— mass balance during and at the end of the studies;  
— a graphical representation of the transformation in the water and 
sediment fractions and in total system (including mineralisation);  
— mineralisation rates;  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1320
 
— half-life, DT  50 and, if appropriate, DT  75 and DT  90 values for the 
test substance and, where appropriate, for major transformation 
products including confidence limits in water, sediment and in total system;
 
— an assessment of the transformation kinetics of the test substance 
and, where appropriate, the major transformation products;  
— a proposed pathway of transformation, where appropriate;  
— discussion of results.  
4. REFERENCES  
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 ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1323
 
Annex 1  
GUIDANCE ON THE AEROBIC AND THE ANAEROBIC TEST 
SYSTEMS  
Aerobic test system  
The aerobic test system described in this test method consists of an aerobic water 
layer (typical oxygen concentrations range from 7 to 10 mg · l -1 ) and a sediment 
layer, aerobic at the surface and anaerobic below the surface (typical average redox potentials (E
 h ) in the anaerobic zone of the sediment range from –80 to 
–190 mV). Moistened air is passed over the surface of the water in each incu ­
bation unit to maintain sufficient oxigen in the head space.  
Anaerobic test system  
For the anaerobic test system, the test procedure is essentially the same as that 
outlined for the aerobic system with the exception that moistened nitrogen is 
passed above the surface of the water in each incubation unit to maintain a head 
space of nitrogen. The sediment and water are regarded as anaerobic once the redox potential (E
 h ) is lower than –100 mV.  
In the anaerobic test, assessment of mineralisation includes measurement of 
evolved carbon dioxide and methane.  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1324
 
Annex 2  
EXAMPLE OF A GAS FLOW-THROUGH APPARATUS
  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1325
 
Annex 3  
EXAMPLE OF A BIOMETER APPARATUS
  ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1326
 
ANNEX 4  
EXAMPLE CALCULATION FOR APPLICATION DOSE TO TEST 
VESSELS  
Cylinder internal diameter: = 8 cm 
Water column depth not including sediment: = 12 cm Surface area: 3,142 × 4
 2 = 50,3 cm  2 
Application rate: 500 g test substance/ha cor ­
responds to 5 μg/cm  2 
Total μg: 5 × 50,3 = 251,5 μg 
Adjust quantity in relation to a depth of 
100 cm: 
12 × 251,5 ÷ 100 = 30,18 μg 
Volume of water column: 50,3 × 12 = 603 ml 
Concentration in water: 30,18 ÷ 603 = 0,050 μg/ml or 50 μg/l ▼B 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1327
 
C.25.  MINERALIZAÇÃO AERÓBICA EM ÁGUAS DE SUPERFÍCIE 
— ENSAIO DE SIMULAÇÃO DE BIODEGRADAÇÃO  
1. MÉTODO  
Este método é equivalente ao OCDE TG 309 (2004) (1).  
1.1. INTRODUÇÃO  
O objectivo do presente ensaio é medir a evolução da biodegradação 
de uma substância em estudo, a baixa concentração, em águas natu ­
rais aeróbicas, bem como quantificar as observações efectuadas sob a forma de expressões com taxas cinéticas. O presente ensaio de si ­
mulação é realizado em regime descontínuo ( batch ), em grupos de 
frascos colocados num agitador de laboratório, para determinação das taxas de degradação aeróbica de substâncias orgânicas em amos ­
tras de águas de superfície naturais (água doce, água salobra ou água 
do mar). O ensaio baseia-se na norma ISO/DIS 14592-1 (2), in ­
cluindo ainda elementos dos métodos de ensaio C.23 e C.24 (3)(4). A título facultativo, nos ensaios de longa duração, poderá ser utili ­
zado o regime semicontínuo, em vez do regime descontínuo, para 
evitar a deterioração do organismo de ensaio. O principal objectivo 
do ensaio de simulação é determinar a mineralização da substância de ensaio nas águas superficiais, sendo essa mineralização utilizada como base para a expressão da cinética de degradação. O ensaio 
poderá ainda, a título facultativo e como objectivo secundário, ser 
utilizado para obter informação sobre a degradação primária e sobre a formação dos principais metabolitos. A identificação dos metabo ­
litos e, quando possível, a quantificação das respectivas concentra ­
ções, são particularmente importantes para as substâncias que mine ­
ralizam de forma muito lenta (p.ex.: com uma meia-vida para o
 14 C 
residual total superior a 60 dias). Devido às limitações analíticas, a 
identificação e quantificação dos principais metabolitos exigirá nor ­
malmente a utilização de concentrações elevadas da substância em estudo (p.ex.: > 100 μg/l).
 
No contexto do presente ensaio, uma baixa concentração significa 
uma concentração (p.ex.: de menos de 1 μg/l a 100 μg/l) suficien ­
temente baixa para garantir que a cinética de biodegradação obtida 
pelo ensaio reflecte o que seria de esperar no meio natural. Por comparação com a massa total de substratos de carbono biodegradá ­
veis disponíveis na água natural utilizada para o ensaio, a substância 
em estudo, presente a baixa concentração, servirá como substrato 
secundário, pelo que será de esperar uma cinética de biodegradação de primeira ordem (cinética de «não crescimento») com a substância em estudo a ser degradada por «co-metabolismo». Um cinética de 
primeira ordem implica que a taxa de degradação (mg/l/dia) é pro ­
porcional à concentração de substrato, que diminui ao longo do tempo. Numa verdadeira cinética de primeira ordem, a taxa especí ­
fica constante de degradação, k, é independente do tempo e da 
concentração, ou seja, k não varia de forma apreciável durante o 
decurso de uma experiência e não se altera com as concentrações adicionadas entre as diferentes fases da mesma. Por definição, a taxa específica constante de degradação é igual à alteração relativa da 
concentração por unidade de tempo: k = (1/C) · (dC/dt). Embora 
seja de esperar, nas condições descritas, uma cinética de primeira ordem, poderão existir circunstâncias em que outro tipo de cinética seja mais apropriado. Podem observar-se desvios em relação a uma 
cinética de primeira ordem, por exemplo, no caso em que certos 
fenómenos de transferência de massa como a taxa de difusão, e não a taxa da reacção biológica, são o factor limitante da biotrans ­
formação No entanto, os dados quase sempre podem ser descritos 
por uma cinética de pseudo primeira ordem, com uma taxa constante 
dependente da concentração.
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1328
 
A informação sobre a biodegradabilidade da substância em estudo a 
concentrações mais elevadas (p.ex.: a partir de ensaios-padrão de 
identificação), bem como sobre a degradabilidade abiótica, os meta ­
bolitos e as propriedades físico-químicas relevantes, deve estar dis ­
ponível antes da realização do ensaio, de modo a permitir a planifi ­
cação da experiência e a interpretação dos resultados. O estudo de 
substâncias marcadas com  14 C e a determinação da distribuição do  
14 C pelas fases no final do ensaio permitem a determinação da 
biodegradabilidade global. Quando se utilizam substâncias não mar ­
cadas, a biodegradabilidade global só pode ser estimada se se pro ­
ceder ao ensaio de concentrações mais elevadas e se todos os me ­
tabolitos forem conhecidos.  
1.2. DEFINIÇÕES  
Biodegradação primária : alteração estrutural (transformação) de 
uma substância química por microorganismos, resultando na perda 
da identidade química.  
Biodegradação funcional : alteração estrutural (transformação) de 
uma substância química por microorganismos, resultando na perda de uma determinada propriedade.
 
Biodegradação aeróbica completa : desnaturação de uma substância 
química por microorganismos, na presença de oxigénio, de que re ­
sulta a formação de dióxido de carbono, água e sais minerais dos 
restantes elementos presente (mineralização) e a produção de bio ­
massa e de produtos orgânicos de biossíntese microbiana.  
Mineralização : desnaturação de uma substância química ou de ma ­
téria orgânica por microorganismos, na presença de oxigénio, de que 
resulta a formação de dióxido de carbono, água e sais minerais dos 
restantes elementos presentes.  
Fase de latência : período que decorre desde o início do ensaio até à 
adaptação do microorganismo responsável pela degradação e ao apa ­
recimento de um grau detectável de biodegradação (p.ex.: 10 % da 
biodegradação teórica máxima, ou menos, dependendo da precisão da técnica de medição) de uma substância química ou de matéria orgânica.
 
Nível máximo de biodegradação : nível de biodegradação de uma 
substância química ou matéria orgânica num ensaio, registado em percentagem, acima do qual não ocorre mais biodegradação durante o ensaio.
 
Substrato primário : conjunto de fontes naturais de carbono e de 
energia que permitem o crescimento e a sobrevivência da biomassa microbiana.
 
Substrato secundário : componente do substrato presente numa con ­
centração tão baixa que a sua degradação apenas fornece aos micro ­
organismos presentes quantidades insignificantes de carbono e de energia, quando comparadas com o carbono e energia fornecidos pela degradação dos componentes principais do substrato (substratos 
primários).
 
Taxa constante de degradação : taxa cinética constante de primeira 
ordem ou de pseudo- primeira ordem, k (d  –1 ), que indica a taxa dos 
processos de degradação. Numa experiência em modo descontínuo, k 
é estimado a partir da parte inicial da curva de degradação, após o 
final da fase de latência.  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1329
 
Meia-vida, t  1/2 (d): termo utilizado para caracterizar a taxa de uma 
reacção de primeira ordem. É o intervalo de tempo que corresponde 
a uma divisão da concentração por 2. A meia-vida e a taxa constante de degradação são relacionados pela equação t
 1/2 = ln 2/k.  
Tempo de meia degradação, DT  50 (d): termo utilizado para quan ­
tificar o resultado dos ensaios de biodegradação. É o período, in ­
cluindo a fase de latência, necessário para se atingir um valor de 50 % de degradação.
 
Limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ) : o 
limite de detecção (LOD) é a concentração de uma substância abaixo da qual a identidade da mesma não pode ser distinguida da linha de 
base do aparelho analítico utilizado. O limite de quantificação (LOQ) 
é a concentração de uma substância abaixo da qual a concentração não pode ser determinada com uma precisão aceitável.
 
Carbono Orgânico Dissolvido (COD) : é a parte do carbono orgâ ­
nico presente numa amostra de água que não pode ser removida por separação de fases, por exemplo por centrifugação a 40 000 ms
 –2 
durante 15 minutos ou por filtração através de membrana com um 
diâmetro de poro de 0,2 μm-0,45 μm. 
Actividade total  14 C orgânico (TOA) : a actividade total do  14 C 
associado ao carbono orgânico.  
Actividade  14 C orgânico dissolvido (DOA) : a actividade total do  
14 C associado ao carbono orgânico dissolvido.  
Actividade  14 C orgânico particulado (POA) : a actividade total do  
14 C associado ao carbono orgânico particulado.  
1.3. APLICABILIDADE DO ENSAIO  
O ensaio de simulação é aplicável a substâncias orgânicas não vo ­
láteis ou pouco voláteis, ensaiadas a baixas concentrações. Utilizando 
frascos abertos para a atmosfera (p.ex.: tapados com rolha de lã de 
vidro), as substâncias com uma constante de Henry inferior a cerca de 1 Pa·m
 3 /mol (aprox. 10  –5 atm·m  3 /mol) podem ser consideradas, 
em termos práticos, como não voláteis. Utilizando frascos fechados, 
com algum espaço livre na parte superior, é possível ensaiar subs ­
tâncias ligeiramente voláteis (com uma constante de Henry < 100 Pa·m
 3 /mol ou < 10  –3 atm·m  3 /mol) sem perdas a partir do sistema de 
ensaio. A perda de substâncias marcadas com  14 C pode ocorrer, se 
não se tomarem as devidas precauções, durante a purga do CO  2 . 
Nessas situações, poderá ser necessário capturar o CO  2 num absor ­
vente alcalino interno ou utilizar um sistema externo de absorção do CO
 2 (determinação directa do  14 CO 2 ; ver o anexo 3). Para a deter ­
minação da cinética de biodegradação, a concentração da substância 
em estudo deve ser inferior à sua hidrossolubilidade máxima. Cabe aqui notar, contudo, que os valores de hidrossolubilidade existentes na literatura podem ser consideravelmente mais elevados do que a 
solubilidade da substância em estudo em águas naturais. A título 
facultativo, a solubilidade de substâncias em estudo particularmente difíceis de dissolver em água poderá ser determinada utilizando as águas naturais em estudo.
 
O método pode ser utilizado para simular a biodegradação em águas 
de superfície livres de partículas grosseiras (ensaio pelágico) ou em águas de superfície turvas, como as que se podem encontrar, por 
exemplo, junto ao interface água/sedimento (ensaio com sedimento 
em suspensão).
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1330
 
1.4. PRINCÍPIO DO ENSAIO  
O ensaio é realizado em modo descontínuo, incubando a substância 
em estudo apenas com água de superfície (ensaio pelágico) ou com água de superfície com sólidos/sedimentos em suspensão numa con ­
centração entre 0,01 e 1 g/l de peso seco (ensaio com sedimento em 
suspensão), para simular uma massa de água com sólidos em sus ­
pensão ou com sedimentos re-suspendidos. Uma concentração de sólidos/sedimentos na parte inferior do intervalo referido é típica 
na maior parte das águas superficiais. Os frascos de ensaio são 
incubados em ambiente escuro, à temperatura ambiente, em condi ­
ções aeróbicas e com agitação. Para a determinação da cinética 
de degradação, devem ser utilizadas pelo menos duas concentrações 
da substância em estudo, diferentes entre si num factor de 5 a 10 e que devem corresponder à gama de concentrações presentes no am ­
biente natural. A concentração máxima da substância em estudo não 
deve ultrapassar os 100 μg/l, mas será preferível utilizar concentra ­
ções máximas abaixo dos 10 μg/l, de modo a garantir a biodegra ­
dação de acordo com uma cinética de primeira ordem. A concen ­
tração mais baixa não deverá exceder os 10 μg/l, mas será preferível 
utilizar concentrações na gama dos 1-2 μg/l ou mesmo inferiores a 1 
μg/l. Normalmente, é possível proceder a uma análise adequada de 
concentrações dessa ordem de grandeza utilizando substâncias mar ­
cadas com
 14 C disponíveis no comércio. Devido a limitações analí ­
ticas, a medição da concentração da substância em estudo com a 
precisão exigida é muitas vezes impossível, quando a concentração utilizada é ≤ 100 μg/l (ver o segundo parágrafo do ponto 1.7.2). 
Uma concentração mais elevada da substância em estudo (> 100 
μg/l e, por vezes, > 1 mg/l) pode ser utilizada para a identificação 
e quantificação dos principais metabolitos ou para os casos em que não existe um método analítico específico com um limite de detec ­
ção suficientemente baixo. Quando se ensaiarem concentrações ele ­
vadas da substância em estudo, poderá não ser possível utilizar os 
resultados para estimar a constante de degradação de primeira ordem ou a meia-vida, já que a degradação não se fará provavelmente de acordo com uma cinética de primeira ordem.
 
A degradação será acompanhada a intervalos apropriados, por medi ­
ção do  14 C residual ou da concentração residual da substância em 
estudo, quando se utilizar um método específico de análise química. 
A marcação com  14 C das partes mais estáveis da molécula em estudo 
garante a determinação da mineralização total, enquanto que a mar ­
cação com  14 C das partes menos estáveis da mesma molécula, tal 
como a utilização de um método de análise específico, só permite 
avaliar a biodegradação primária. No entanto, a parte mais estável 
não inclui necessariamente a fracção funcionalmente relevante da molécula (que pode ser relacionada com uma determinada proprie ­
dade, como a toxicidade, a bioacumulação, etc). Se for esse o caso, 
poderá ser melhor utilizar no estudo uma substância marcada com
 
14 C na sua parte funcional, de modo a poder acompanhar a elimi ­
nação da propriedade que lhe esteja associada.  
1.5. INFORMAÇÃO SOBRE A SUBSTÂNCIA EM ESTUDO  
No presente ensaio, a substância em estudo utilizada tanto pode ser 
marcada como não marcada. A marcação, para a qual se recomenda 
a técnica do  14 C, deve ser normalmente aplicada na(s) parte(s) mais 
estável(is) da molécula (ver também o ponto 1.4). No caso das subs ­
tâncias com mais do que um anel aromático, deverão ser marcados, 
de preferência, um ou mais átomos de carbono em cada anel. Por 
outro lado, deverão igualmente ser marcados, de preferência com  
14 C, um ou mais átomos de carbono em ambos os lados das ligações 
mais facilmente degradáveis. A pureza química e/ou radioquímica da 
substância em estudo deve ser > 95 %. No caso das substâncias 
marcadas com radioisótopos, será preferível uma actividade especí ­
fica da ordem dos μCi/mg (1,85 MBq) ou mais, de modo a facilitar 
as medições do  14 C nos ensaios com baixas concentrações iniciais. 
Deve ser fornecida a seguinte informação em relação à substância 
em estudo:  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1331
 
— hidrossolubilidade [método de ensaio A.6],  
— solubilidade em solvente(s) orgânico(s) (substâncias aplicadas 
com um solvente ou de baixa hidrossolubilidade),  
— constante de dissociação (pKa), nos casos em que a substância 
seja propensa a protonização ou desprotonização [OCED TG 112] (5),
 
— pressão de vapor [método de ensaio A.4] e/ou constante de 
Henry,  
— estabilidade química na água e em ambiente escuro (hidrólise) 
[método C.7].  
Quando se proceder ao ensaio de substâncias com baixa hidrossolu ­
bilidade em água do mar, poderá também ser útil conhecer a cons ­
tante de salinização (ou «constante de Setschenow»), K  s , que é de ­
finida pela seguinte equação: log (S/S’) = K  s C m , onde S e S’ 
representam a solubilidade da substância em água doce e salgada, 
respectivamente, e C  m é a concentração molar de sal.  
Se o ensaio for conduzido como um «ensaio com sedimento em 
suspensão», deverá igualmente ser fornecida a seguinte informação:  
— coeficiente de partição n-octanol/água [método de ensaio A.8],  
— coeficiente de adsorção [método C.18].  
Outra informação que poderá ser útil inclui:  
— a concentração no ambiente natural, quando for conhecida ou 
puder ser estimada,  
— a toxicidade da substância em estudo para o microorganismo 
[método C.11],  
— a biodegradabilidade imediata e/ou inerente [métodos C.4 A-F, 
C.12, C.9, OCDE TG 302] (5),  
— a biodegradabilidade aeróbica ou anaeróbica em estudos de trans ­
formação no solo ou em sedimentos/água [métodos C.23 e C.24].  
1.6. SUBSTÂNCIA DE REFERÊNCIA  
Uma substância, que normalmente deverá ser facilmente degradada 
em condições aeróbicas (p.ex.: anilina ou benzoato de sódio), deverá 
ser utilizada como substância de referência. O tempo previsto para 
a degradação da anilina ou do benzoato de sódio é normalmente inferior a 2 semanas. A substância de referência é utilizada para garantir que a actividade microbiana da água em estudo se encontra 
dentro de certos limites; ou seja, que a água contém uma população 
microbiana activa.
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1.7. CRITÉRIOS DE QUALIDADE  
1.7.1.  Recuperação  
Imediatamente após a adição da substância em estudo, as concen ­
trações iniciais de ensaio devem ser verificadas por medição da 
actividade do  14 C ou por análise química, no caso das substâncias 
não marcadas, em amostras pelo menos duplicadas. Essa verificação permitirá obter informação sobre a aplicabilidade e reproductividade do método analítico e ainda sobre a homogeneidade da distribuição 
da substância em estudo. Normalmente, o valor a utilizar posterior ­
mente na análise dos dados será o valor inicial medido da actividade do
 14 C ou da concentração da substância em estudo, e não a concen ­
tração nominal, o que permite eliminar os eventuais erros devido às 
perdas por adsorção e a erros de doseamento. No caso de uma substância marcada com
 14 C, o nível de recuperação no final da 
experiência é dado pelo balanço de massas (ver o último parágrafo 
do ponto 1.8.9.4). Em termos ideais, o balanço de massas das subs ­
tâncias marcadas com  14 C deve situar-se entre 90 % e 110 %, en ­
quanto que a precisão analítica deverá resultar numa recuperação inicial de entre 70 % e 110 % para as substâncias em estudo não 
marcadas. Estes intervalos devem ser interpretados como um objec ­
tivo, não devendo ser utilizados como critério de aceitação do ensaio. A título facultativo, poderá ser determinada a precisão analítica para concentrações inferiores da substância em estudo e para os principais 
metabolitos.
 
1.7.2.  Reproductividade e sensibilidade do método analítico  
A reproductividade do método analítico (incluindo a eficiência da 
extracção inicial) em termos da quantificação da substância em es ­
tudo e, se aplicável, dos respectivos metabolitos, deverá ser verifi ­
cada através de cinco análises replicadas de extractos da água de 
superfície.  
O limite de detecção (LOD) do método analítico para a substância 
em estudo e para os seus metabolitos deverá ser, quando possível, 
pelo menos 1 % da quantidade inicial aplicada no sistema de ensaio. 
O limite de quantificação (LOQ) deverá ser igual ou menor do que 10 % da concentração aplicada. A análise química de muitas subs ­
tância orgânicas e dos respectivos metabolitos exige frequentemente 
que a substância em estudo seja aplicada numa concentração relati ­
vamente elevada, ou seja, > 100 μg/l.
 
1.8. DESCRIÇÃO DO MÉTODO DE ENSAIO  
1.8.1.  Equipamento  
O ensaio pode ser conduzido em frascos cónicos ou cilíndricos de 
capacidade apropriada (p.ex.: 0,5 l ou 1 l) tapados com rolhas de 
silicone ou de borracha, ou ainda em frascos de soro com tampas impermeáveis ao CO
 2 (p.ex.: rolha de borracha butílica). Outra pos ­
sibilidade será efectuar o ensaio utilizando diversos frascos para cada 
concentração e recolhendo, para cada amostra, um frasco inteiro, 
pelo menos em duplicado (ver o último parágrafo do ponto 1.8.9.1). No caso das substâncias não voláteis e não marcadas com um radio ­
isótopo, não será necessário utilizar rolhas ou tampas impermeáveis 
aos gases, bastando utilizar rolhas de algodão que evitem a conta ­
minação aérea (ver o segundo parágrafo do ponto 1.8.9.1). As subs ­
tâncias ligeiramente voláteis devem ser ensaiadas num sistema de tipo biométrico, com ligeira agitação das águas de superfície em 
estudo. A fim de garantir a ausência de contaminação bacteriana, 
os frascos poderão, a título facultativo, ser esterilizados por aqueci ­
mento ou em autoclave, antes do início do ensaio. Será utilizado o seguinte equipamento de laboratório:
 
— mesa com agitação ou agitadores magnéticos, para agitação con ­
tínua dos frascos de ensaio,  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1333
 
— centrifugadora,  
— medidor de pH,  
— turbidímetro para medições nefelométricas da turbidez,  
— forno ou micro-ondas, para as determinações do peso seco,  
— aparelho de filtração por membrana,  
— autoclave ou forno para a esterilização por calor do material de 
vidro,  
— instalações para o manuseamento de substâncias marcadas com  14 C, 
— equipamento para quantificar a actividade do  14 C em amostras 
das soluções com o CO  2 precipitado e, se necessário, de amostras 
de sedimento,  
— equipamento analítico para o doseamento da substância em es ­
tudo (e da substância de referência) através de análise química 
específica (p.ex.: cromatografia de gás, HPLC).  
1.8.2.  Soluções de reserva da substância em estudo  
Utilizando água desionizada, preparam-se soluções de reserva da 
substância em estudo e da substância de referência (ver o primeiro parágrafo do ponto 1.8.7). A água desionizada deve estar isenta de 
qualquer substância que possa ser tóxica para os microorganismos e 
não deverá ter um teor de carbono orgânico dissolvido (COD) su ­
perior a 1 mg/l (6).
 
1.8.3.  Recolha e transporte da água de superfície  
O local de amostragem para a recolha da água de superfície deve ser 
seleccionado, independentemente da situação, de acordo com o ob ­
jectivo do ensaio. Para a escolha dos locais de amostragem, deverão 
ser tomados em conta os eventuais efeitos da agricultura, da indústria ou das actividades domésticas. Se um determinado ambiente aquático tiver comprovadamente sido contaminado com a substância em es ­
tudo ou com outras substâncias estruturalmente análogas durante os 
quatro anos anteriores, não deverá ser utilizado para a recolha de amostras de água, a não ser que o investigador esteja expressamente interessado na investigação das taxas de degradação em locais pre ­
viamente expostos à substância. O pH e a temperatura da água 
devem ser medidos no local de colheita. Devem igualmente ser registadas a profundidade a que foi feita a amostra e a aparência (p.ex.: cor e turbidez) da mesma (ver o ponto 3). A concentração de 
oxigénio e/ou o potencial redox da água e da camada superficial do 
sedimento devem ser medidos de modo a demonstrar a existência de condições aeróbicas, a não ser que essas condições sejam óbvias a julgar pela aparência e pela experiência já adquirida no local. A água 
de superfície deve ser transportada num recipiente cuidadosamente 
lavado. Durante o transporte, a temperatura da amostra não deve ultrapassar significativamente a temperatura que irá ser utilizada no ensaio. Quando a duração do transporte ultrapassar as 2 a 3 horas, 
recomenda-se o arrefecimento a 4
 o C. A amostra de água não deve 
ser congelada.  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1334
 
1.8.4.  Armazenamento e preparação da água de superfície  
O ensaio deve, de preferência, ser iniciado no prazo de um dia a 
partir da colheita da amostra. O armazenamento da água, quando necessário, deve ser reduzido ao mínimo possível e não deve, em 
qualquer caso, ultrapassar um máximo de 4 semanas. A amostra de 
água deve ser conservada a 4 °C, com arejamento, até ser utilizada. Antes disso, devem remover-se as partículas mais grosseiras, por exemplo por filtração através de um filtro de  nylon  com um poro 
de cerca de 100 μm, de papel de filtro grosso ou ainda por sedi ­
mentação.
 
1.8.5.  Preparação da água corrigida com o sedimento (facultativo)  
Para os ensaios com sedimento em suspensão, o sedimento superfi ­
cial é acrescentado a frascos contendo água natural (filtrada para 
remoção das partículas mais grosseiras, como se descreve no ponto 1.8.4), de modo a obter uma suspensão; a concentração de sólidos em suspensão deve ser de 0,01 a 1 g/l. O sedimento superficial deve 
ser proveniente do mesmo local de onde foi recolhida a amostra de 
água. Dependendo do tipo de ambiente aquático em causa, o sedi ­
mento superficial poderá ser caracterizado por um teor elevado de carbono orgânico (2,5-7,6 %) e por uma textura fina ou por um 
baixo teor de carbono orgânico (0,5-2,5 %) e por uma textura 
mais grosseira (3). O sedimento superficial pode ser preparado do seguinte modo: extrair diversas amostras em profundidade do sedi ­
mento, utilizando um tubo de plástico transparente, separando as 
camadas superiores aeróbicas (desde a superfície até uma profundi ­
dade máxima de 5 cm) imediatamente após a amostragem e juntan ­
do-as numa só amostra. Essa amostra do sedimento deve ser trans ­
portada num recipiente com muito espaço livre, de modo a que o 
sedimento se mantenha em condições aeróbicas (arrefecer a 4 °C se 
o transporte durar mais do que 2-3 horas). A amostra de sedimento deverá ser suspensa na água de ensaio numa razão de 1:10 e mantida a 4 °C, com arejamento, até ao momento da utilização. O armaze ­
namento do sedimento, quando necessário, deve ser reduzido ao 
mínimo possível e não deve, em qualquer caso, ultrapassar um má ­
ximo de 4 semanas.
 
1.8.6.  Procedimento semicontínuo (facultativo)  
Nos casos em que a fase de latência, até que seja possível medir 
uma degradação significativa da substância em estudo, seja longa poderá ser necessária uma incubação prolongada (diversos meses). Se essa característica já for conhecida de anteriores ensaios da subs ­
tância, o ensaio poderá ser iniciado utilizando um procedimento 
semicontínuo, que permite a renovação periódica de parte da água ou da suspensão em estudo (ver o anexo 2). Se não for esse o caso, o ensaio normal, em modo descontínuo, poderá ser transformado 
num ensaio semicontínuo se não se observar nenhuma degradação 
da substância em estudo durante aproximadamente 60 dias de ensaio em descontínuo (ver o segundo parágrafo do ponto 1.8.8.3).
 
1.8.7.  Adição da substância em estudo (ou de referência)  
Para as substâncias altamente hidrossolúveis (> 1 mg/l) e pouco 
voláteis (constante de Henry < 1 Pa·m  3 /mol ou < 10  –5 atm·m  3 /mol), 
poderá preparar-se uma solução de reserva em água ionizada (ver o ponto 1.8.2); essa solução deverá ser adicionada aos frascos de en ­
saio no volume necessário para obter a concentração pretendida. O 
volume de qualquer solução de reserva adicionada deverá ser limi ­
tado ao mínimo que seja prático (sempre que possível, < 10 % do volume final de líquido). Outro procedimento passa pela dissolução da substância em estudo num volume maior de água de ensaio, que 
poderá ser utilizada em alternativa à utilização de solventes orgâni ­
cos.
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Quando não for possível evitá-lo, as soluções de reserva de subs ­
tâncias não voláteis e de fraca hidrossolubilidade podem ser prepa ­
radas com um solvente orgânico volátil, mas a quantidade adicionada desse solvente não deve exceder 1 % v/v e não deve ter qualquer efeito adverso sobre a actividade microbiana. O solvente não deverá 
afectar a estabilidade da substância em estudo em meio aquático. O 
solvente deverá ser escorrido até que só reste uma quantidade ex ­
tremamente pequena, de maneira a não aumentar significativamente o COD da água ou da suspensão em estudo, factor que deverá ser 
verificado por análise específica da substância em causa ou, se pos ­
sível, por análise do COD (6). Deve tomar-se o cuidado de limitar a quantidade de solvente transferido ao mínimo estritamente necessá ­
rio, bem como de garantir que a quantidade pretendida da substância 
em estudo possa ser dissolvida no volume final de água previsto para 
o ensaio. Poderão ser utilizadas outras técnicas para a introdução da substância em estudo nos frascos de ensaio, como se descreve em (7) e (8). Quando se utilizar um solvente orgânico para a aplicação da 
substância em estudo, frascos de controlo do solvente com a água de 
ensaio (sem mais nenhuma substância adicionada) e com a água de ensaio e a substância de referência deverão ser tratados da mesma forma que os frascos de ensaio propriamente ditos, aos quais foi 
acrescentada a substância em estudo, dissolvida num solvente. O 
objectivo dos controlos do solvente é analisar a possibilidade de ocorrência de efeitos adversos causados pelo solvente sobre a popu ­
lação microbiana e que tenham efeitos sobre a degradação da subs ­
tância de referência.
 
1.8.8.  Condições de ensaio  
1.8.8.1.  Temperatura de ensaio  
A incubação deve ser feita em local escuro (de preferência) ou com 
luz difusa e a temperatura controlada (± 2 °C), que poderá ser a 
temperatura de campo ou uma temperatura normalizada de 
20-25 °C. A temperatura de campo pode ser entendida como a temperatura real da amostra no momento da colheita ou como a temperatura média no local da recolha.
 
1.8.8.2.  Agitação  
Os frascos devem ser agitados ou mexidos em contínuo, para que as 
partículas e microorganismos se mantenham em suspensão. A agita ­
ção servirá igualmente para facilitar a transferência de oxigénio a partir do espaço livre acima do líquido, de modo a que as condições 
aeróbicas sejam mantidas de forma adequada. Colocar os frascos 
numa mesa de agitação (aproximadamente 100 rpm) ou utilizar agi ­
tação magnética. A agitação deve ser contínua, mas tão suave quanto possível, desde que permita manter uma suspensão homogénea.
 
1.8.8.3.  Duração do ensaio  
A duração do ensaio não deverá normalmente ultrapassar os 60 dias, 
a não ser que se utilize um regime de ensaio semicontínuo, com 
renovação periódica da suspensão de ensaio (ver o ponto 1.8.6 e o anexo 2). O período dos ensaios em descontínuo poderá, no entanto, ser alargado até um máximo de 90 dias, se a degradação da subs ­
tância em estudo se tiver iniciado durante os primeiros 60 dias. 
A degradação será acompanhada, a intervalos apropriados, pela de ­
terminação da actividade residual do
 14 C ou da evolução do  14 CO 2 
(ver o ponto 1.8.9.4) e/ou por análise química (ver o ponto 1.8.9.5). 
O período de incubação deve ser suficientemente longo para permitir 
a avaliação do processo de degradação. A degradação deverá, de preferência, ultrapassar os 50 %; no caso das substâncias de degradação lenta, a percentagem de degradação deve ser sufi ­
ciente (normalmente superior a 20 %) para permitir a estimação de 
uma taxa constante de degradação cinética.
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1336
 
O pH e a concentração de oxigénio do sistema de ensaio devem ser 
medidos periodicamente, a não ser quando a experiência anterior de 
ensaios semelhantes com amostras de água e de sedimentos recolhi ­
dos no mesmo local faça com que isso não seja necessário. Em certas condições, o metabolismo dos substratos primários presentes 
a concentrações muito elevadas na água ou nos sedimentos poderá 
eventualmente resultar numa produção de CO
 2 e numa depleção do 
oxigénio suficientes para alterar de forma significativa as condições experimentais durante o ensaio.
 
1.8.9.  Procedimento  
1.8.9.1.  Preparação dos frascos para o ensaio pelágico  
Transferir um volume adequado de água de ensaio para os frascos, 
enchendo até cerca de um terço do volume total, pelo menos com 100 ml. Se se utilizarem diversos frascos (de forma a permitir a 
recolha de um frasco inteiro em cada amostra), o volume de água 
de ensaio mais indicado será também de cerca de 100 ml, já que a utilização de volumes menores poderá ter influência sobre a duração da fase de latência. A substância em estudo é adicionada a partir de 
uma solução de reserva, como se descreve nos pontos 1.8.2 e 
1.8.7. Para a determinação da cinética de degradação e para o cálculo da taxa constante de degradação cinética, devem ser utilizadas pelo menos duas concentrações diferentes da substância em estudo, com 
um factor de concentração entre 5 e 10. Ambas as concentrações 
devem ser inferiores a 100 μg/l e, de preferência, estar compreendi ­
das no intervalo entre <1 e 10 μg/l.
 
Fechar os frascos com rolhas ou tampas impermeáveis ao ar e ao 
CO 2 . No caso dos ensaios de substâncias químicas não marcadas 
com  14 C e não voláteis, podem ser utilizadas simples tampas de 
algodão que evitem a contaminação (ver o ponto 1.8.1), desde que 
se saiba que os principais metabolitos também não são voláteis e que se utilize um método indirecto para a determinação do CO
 2 (ver o 
anexo 3).  
Incubar os frascos à temperatura escolhida (ver o ponto 1.8.8.1). 
Retirar amostras para a análise química ou para a medição do  14 C 
no início do ensaio (ou seja, antes de começar a biodegradação, ver o 
ponto 1.7.1) e depois a intervalos adequados durante o ensaio. A 
amostragem pode ser efectuada retirando subamostras (p.ex.: aliquo ­
tas de 5 ml) de cada replicado ou recolhendo um frasco inteiro em cada momento de amostra. A mineralização da substância em estudo 
pode ser determinada de forma directa ou indirecta (ver o anexo 3). 
Normalmente, uma estimativa fiável da constante de degradação exi ­
ge, no mínimo, 5 pontos de amostragem durante a fase de degradação (ou seja, após o final da fase de latência), a não ser 
quando se possa provar que três pontos são suficientes para as subs ­
tâncias de degradação rápida. Quanto às substâncias que não são rapidamente degradadas, a obtenção de mais pontos durante a fase de degradação não deve constituir nenhuma dificuldade, pelo que se 
deverão utilizar mais pontos de amostragem para a estimativa de k. 
Não é possível indicar nenhum calendário fixo de amostragem, dada a variação das taxas de biodegradação; no entanto a recomendação, nos casos em que a degradação seja lenta, é que se efectuem amos ­
tras uma vez por semana. Se a substância em estudo se degradar 
rapidamente, deve ser feita uma amostra por dia durante os primeiros três dias e, depois disso, uma amostra a cada dois ou três dias. Em determinadas circunstâncias, como por exemplo substâncias de hi ­
drólise rápida, poderá ser necessário proceder a uma amostragem de 
hora a hora. Recomenda-se a realização de um estudo prévio ao ensaio, de modo a determinar o intervalo de amostragem mais ade ­
quado. Se as amostras tiverem de ser conservadas para posterior 
realização de análises específicas, será aconselhável retirar um nú ­
mero maior de amostras e depois, no final do estudo, seleccionar as que serão analisadas de trás para a frente, ou seja, analisando pri ­
meiro as últimas amostras (ver o segundo parágrafo do ponto 1.8.9.5 
para mais orientações sobre a estabilidade das amostras durante o 
armazenamento).
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1337
 
1.8.9.2.  Número de frascos e de amostras  
Preparar um número suficiente de frascos de ensaio para incluir:  
— frascos de ensaio; frascos pelo menos em duplicado (e, de pre ­
ferência, um mínimo de três) para cada concentração da subs ­
tância em estudo ou diversos frascos por concentração, quando se recolherem frascos inteiros em cada momento de amostragem 
(representados pelo símbolo F
 T ), 
— frascos de ensaio para o cálculo do balanço de massas; frascos 
pelo menos em duplicado para cada concentração em estudo 
(representados pelo símbolo F  M ), 
— controlos «brancos», sem adição da substância em estudo; pelo 
menos um frasco de ensaio «branco», contendo apenas água de ensaio (representado pelo símbolo F
 B ), 
— controlo de referência; frascos em duplicado, com a substância de 
referência (p.ex.: anilina ou benzoato de sódio, a 10 μg/l) (re­
presentados pelo símbolo F  C ). O objectivo do controlo de refe ­
rência é confirmar a existência de uma actividade microbiana 
mínima. Quando for conveniente, poderá ser utilizada uma subs ­
tância de referência marcada com um isótopo, mesmo nos casos em que a degradação da substância em estudo seja acompanhada 
por análise química,
 
— controlo estéril; um ou dois frascos com água de ensaio esterili ­
zada, para analisar a possível degradação abiótica ou outro tipo 
de eliminação não-biológica da substância em estudo (represen ­
tados pelo símbolo F  S ); A actividade biológica pode ser inter ­
rompida por tratamento em autoclave (121  o C; 20 min) da água 
de ensaio, pela adição de um produto tóxico (p.ex.: azoteto de 
sódio (NaN  3 ) a 10-20 g/l, cloreto de mercúrio (HgCl  2 ) a 100 mg/l 
ou formalina a 100 mg/l) ou por irradiação com raios gama. Se se utilizar HgCl
 2 , deve ser eliminado como resíduo tóxico. 
No caso de águas com grande quantidade de sedimento, nem 
sempre é fácil conseguir obter condições de esterilidade; nesses casos, recomenda-se a repetição do tratamento em autoclave (p.ex.: três vezes). Deve ter-se em atenção que as características 
de adsorção do sedimento poderão ser alteradas pelo tratamento 
em autoclave,
 
— controlos do solvente, contendo água de ensaio e água de ensaio 
com a substância de referência; frascos em duplicado, tratados 
com a mesma quantidade de solvente e sujeitos ao mesmo pro ­
cedimento que os frascos a que foi adicionada a substância em 
estudo. O objectivo é verificar os eventuais efeitos adversos do 
solvente, através da determinação da degradação da substância de referência.
 
Para a definição do método de ensaio, o investigador deverá tomar 
em consideração a importância relativa do aumento do número de replicados contra o aumento do número de pontos de amostragem. O número exacto de frascos que serão necessários dependerá do mé ­
todo utilizado para a medição da degradação (ver o terceiro pará ­
grafo do ponto 1.8.9.1, o ponto 1.8.9.4 e o apêndice 3).
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Em cada momento de amostragem, devem ser retiradas de cada 
frasco de ensaio duas subamostras (p.ex.: aliquotas de 5 ml). Se se 
utilizar um regime com amostragem de frascos inteiros em cada momento de amostragem, devem ser sacrificados dois frascos para cada amostra (ver o primeiro parágrafo do ponto 1.8.9.1).
 
1.8.9.3.  Preparação dos frascos para o ensaio com sedimento em suspensão 
(facultativo)  
Acrescentar os volumes necessários de água de ensaio e de sedimen ­
to, se for o caso, aos frascos de ensaio (ver o ponto 1.8.5). A preparação dos frascos para o ensaio com sedimento em suspensão 
é idêntica à dos frascos para o ensaio pelágico (ver os pontos 1.8.9.1 
e 1.8.9.2). Utilizar, de preferência, frascos de soro ou de forma semelhante. Colocar os frascos num agitador, em posição horizontal. Como é óbvio, os frascos abertos, utilizados para as substâncias não 
voláteis e não marcadas com
 14 C devem ser colocados em posição 
vertical; nesse caso, recomenda-se a utilização de agitação magnéti ­
ca, com barras de agitação revestidas a vidro. Se necessário, arejar os frascos para manter condições aeróbicas adequadas.
 
1.8.9.4.  Determinações radioquímicas  
O 14 CO 2 resultante da degradação é medido de forma directa e 
indirecta (ver o apêndice 3). O  14 CO 2 é determinado indirectamente 
pela diferença entre a actividade  14 C inicial na água ou suspensão de 
ensaio e a actividade total residual no momento da amostra, medida 
após acidificação da amostra a pH 2-3 e purga do CO  2 . Dessa forma, 
o carbono inorgânico é removido, pelo que a actividade residual medida provém do material orgânico. A determinação indirecta do
 
14 CO 2 não deve ser utilizada quando os principais metabolitos 
da degradação da substância de ensaio sejam voláteis (ver o apêndice 3). Se possível, a evolução do
 14 CO 2 deverá ser medida de forma 
directa (ver o apêndice 3), em cada momento de amostragem, em 
pelo menos um frasco de ensaio; esse procedimento permite, por um 
lado, obter os balanços mássicos e, por outro, verificar a evolução do processo de degradação, mas está limitado aos ensaios conduzidos com frascos fechados.
 
Se o  14 CO 2 resultante da degradação for medido directamente du ­
rante o ensaio, devem ser previstos, no início do mesmo, um número suficiente de frascos para o efeito. A determinação directa do
 14 CO 2 
é recomendada nos casos em que os principais metabolitos resultan ­
tes da transformação da substância em estudo sejam voláteis. Em cada ponto de medição, os frascos adicionais serão acidificados até pH de 2-3 e o
 14 CO 2 será recolhido num adsorvente interno ou 
externo (ver o apêndice 3).  
A título facultativo, as concentrações da substância em estudo mar ­
cada com  14 C e dos principais metabolitos poderão ser determinadas 
por radiocromatografia (p.ex.: cromatografia em camada fina, RAD- 
-TLC) ou por HPLC com detector de radionuclídeos.  
Ainda a título facultativo, poderá determinar-se a distribuição da radio ­
actividade remanescente pelas diferentes fases (ver o apêndice 1) e a 
concentração residual da substância em estudo e dos metabolitos.  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1339
 
No final do ensaio, o balanço mássico deverá ser determinado atra ­
vés de medição directa do  14 CO 2 , utilizando frascos de ensaio dife ­
rentes, dos quais não tenham sido retiradas amostras durante o ensaio (ver o apêndice 3).
 
1.8.9.5.  Análise química específica  
Se existir um método analítico específico com uma sensibilidade 
suficiente, a biodegradação primária poderá ser avaliada medindo a 
concentração residual total da substância de ensaio, em vez de uti ­
lizar técnicas de radiomarcação. Se for utilizada uma substância marcada com um radioisótopo (para medição da mineralização total), poderão ser efectuadas em paralelo análises químicas específicas, a 
fim de obter informação adicional que possa ser útil e de verificar o 
procedimento utilizado. As análises químicas específicas poderão igualmente ser utilizadas para a medição dos metabolitos formados durante a degradação da substância em estudo, sendo recomendadas 
para as substâncias que mineralizam com uma meia-vida superior a 
60 dias. A concentração da substância em estudo e dos respectivos metabolitos deve ser determinada e comunicada para cada momento de amostragem (sob a forma de uma concentração e, quando apli ­
cável, de uma percentagem). Em geral, os metabolitos detectados 
com uma concentração ≥ 10 % da concentração aplicada em qual ­
quer momento do ensaio devem ser identificados, a não ser que a sua presença possa ser razoavelmente justificada por qualquer outro me ­
canismo que não a degradação da substância em estudo. Deverá 
considerar-se a hipótese de identificação de todos os metabolitos cuja concentração aumente continuamente ao longo do ensaio, mesmo que a sua concentração nunca ultrapasse o limite acima 
indicado, já que essa característica poderá indicar que se trata de 
produtos persistentes. A análise dos metabolitos nos controlos esté ­
reis deve ser ponderada nos casos em que se considera possível a ocorrência de transformação biótica rápida (hidrólise) da substância 
em estudo. A necessidade de quantificação e de identificação dos 
metabolitos deve ser ponderada numa base casuística, devendo, quando for realizada, ser justificada no relatório de ensaio. As téc ­
nicas de extracção com solventes orgânicos devem ser aplicadas de 
acordo com as instruções apresentadas nos respectivos procedimen ­
tos analíticos.
 
As amostras devem ser conservadas hermeticamente fechadas entre 2 
e 4 °C, se a análise for realizada num prazo de 24 horas (preferível). 
Para um armazenamento mais prolongado, as amostras devem ser 
congeladas abaixo dos – 18 °C ou conservadas com adição de quí ­
micos. A acidificação não é um método recomendado para a con ­
servação das amostras, na medida em que as amostras acidificadas 
poderão ser instáveis. Se as amostras não forem analisadas num 
prazo de 24 horas e forem armazenadas por um período prolongado, deverá proceder-se a um estudo de estabilidade durante o armazena ­
mento, a fim de demonstrar a estabilidade das substâncias de inte ­
resse em condições de armazenamento a – 18 °C ou com conser ­
vantes químicos. Se o método analítico implicar a extracção com solventes ou em fase sólida (SPE), essa extracção deverá ser efec ­
tuada imediatamente após a amostragem ou depois de conservar a 
amostra refrigerada por um prazo máximo de 24 horas.
 
Dependendo da sensibilidade do método analítico, poderá ser neces ­
sário recolher volumes superiores aos que são indicados no ponto 1.8.1. O ensaio pode ser realizado de forma simples com volumes de 
ensaio de 1 l, em frascos com uma capacidade de 2-3 l, o que torna 
possível a recolha de amostras de aproximadamente 100 ml.
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1340
 
2. RESULTADOS E APRESENTAÇÃO DE RELATÓRIOS  
2.1. TRATAMENTO DOS RESULTADOS  
2.1.1.  Apresentação dos resultados  
Arredondar os momentos de amostragem às horas (a não ser nos 
casos em que a substância em estudo se degrade substancialmente 
numa questão de minutos ou de horas), mas não aos dias. Marcar num gráfico as estimativas da actividade residual da substância em estudo (para as substâncias marcadas com
 14 C) ou da concentração 
residual (para as substâncias não marcadas) em função do tempo, 
tanto em papel milimétrico como em papel semilogarítmico (ver as figuras 1a, 1b). Se tiver ocorrido degradação, comparar os resultados 
dos frascos F
 T com os dos frascos F  S . Se as médias dos resultados 
dos frascos com a substância de ensaio (F  T ) e dos frascos estéreis 
(F S ) apresentarem um desvio inferior a 10 %, pode assumir-se que 
a degradação observada se deve principalmente a factores abióticos. 
Se a degradação for menor nos frascos F  S , os respectivos valores 
poderão ser utilizados para corrigir (por subtracção) os valores rela ­
tivos aos frascos F  T , de modo a poder estimar a dimensão da biode ­
gradação. Quando se efectuarem análises facultativas dos principais 
metabolitos, os gráficos da sua formação e destruição devem ser 
apresentados, juntamente com um gráfico da evolução da concen ­
tração da substância em estudo.  
Estimar a duração da fase de latência, t  L , a partir da curva 
de degradação (gráfico semilogarítmico), extrapolando a sua parte 
linear até ao ponto de degradação zero ou, em alternativa, determi ­
nando o tempo necessário para que ocorra uma degradação de cerca de 10 % (ver as figuras 1a e 1b). A partir do gráfico semilogarítmi ­
co, estimar a constante de primeira ordem k e o respectivo erro- 
-padrão, por regressão do ln (valor residual da actividade
 14 C ou da 
concentração da substância) em função do tempo. Em relação às medições do
 14 C, em particular, utilizar apenas os dados da parte 
inicial linear da curva, após o final da fase de latência, sendo pre ­
ferível que se seleccionem poucos pontos que sejam significativos do 
que um número maior de pontos afectados de maior incerteza. Os factores de incerteza incluem, nesse caso, os erros inerentes à medi ­
ção directa da actividade residual do
 14 C, que é recomendada (ver 
abaixo). Por vezes, poderá ser relevante calcular duas constantes 
diferentes, quando a degradação apresentar duas fases bem distintas. Para tal, devem ser definidas as duas fases da curva de degradação. Os cálculos da taxa constante k e da meia-vida t
 ½ = ln2/k devem ser 
efectuados para cada um dos frascos replicados, quando forem reti ­
radas subamostras de um mesmo frasco, ou utilizando valores mé ­
dios, quando se recolherem frascos inteiros em cada momento de amostragem (ver o último parágrafo do ponto 1.8.9.2). Quando for 
utilizado o primeiro desses procedimentos, deverão apresentar-se a 
taxa constante e a meia-vida para cada um dos frascos replicados e ainda o seu valor médio, com o respectivo desvio padrão. Se se tiverem usado concentrações elevadas da substância em estudo, a 
curva de degradação poderá desviar-se consideravelmente de uma 
linha recta (gráfico semilogarítmico), caso em que não será válida uma cinética de primeira ordem. Logo, a definição a meia-vida dei ­
xará de fazer sentido. É possível, no entanto, que se possa aplicar 
uma cinética de pseudo primeira ordem numa gama limitada de 
concentrações, o que poderá permitir a definição do meio-tempo de degradação DT
 50 (tempo necessário para uma degradação de 
50 %). Contudo, deve tomar-se em consideração que o decurso 
da degradação para lá da gama de concentrações seleccionada não 
pode ser previsto utilizando esse DT  50 , que apenas descreve um 
conjunto específico de resultados. Existem diversos instrumentos analíticos que podem facilitar os cálculos estatísticos e o ajustamento 
das curvas, sendo recomendada a utilização de programas informá ­
ticos desse tipo.
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1341
 
Se forem realizadas análises químicas específicas, calcular as taxas 
constantes e as meia-vida da degradação primária, como se descreve 
acima, para o caso da mineralização total. Se a degradação primária constituir o processo limitante, poderá ser possível, em certos casos, utilizar pontos de toda a curva de degradação. Isto acontece porque a 
medição, ao contrário do que acontece com as medições da activi ­
dade do
 14 C, é directa.  
Se forem utilizadas substâncias marcadas com  14 C, deve ser apre ­
sentado, pelo menos em relação ao momento final do ensaio, um 
balanço de massas expresso em percentagem da concentração inicial aplicada.
 
2.1.2.  Actividade residual  
Quando a parte de uma substância orgânica que está marcada com  
14 C é biodegradada, a maior parte do  14 C é convertido em  14 CO 2 , 
enquanto que outra parte é utilizada para a produção de biomassa 
e/ou para a síntese de metabolitos extracelulares. Logo, a degradação 
completa «final» de uma substância não resulta numa conversão de 100 % do respectivo carbono em
 14 CO 2 . O 14 C integrado em meta ­
bolitos da biosíntese é posteriormente libertado, de forma lenta, 
como  14 CO 2 , num processo de «mineralização secundária». Por 
esse motivo, a actividade residual do  14 C orgânico (medida após 
purga do CO  2 ) ou do  14 CO 2 produzido em função do tempo apre ­
senta uma parte final com um declive muito baixo, após a conclusão 
da degradação. Esse factor vem complicar a interpretação cinética 
dos dados e, portanto, só a parte inicial da curva (a partir do final da fase de latência e até à degradação de aproximadamente 50 % da substância presente) deverá normalmente ser utilizada para a estima ­
ção de uma taxa constante de degradação. Se a substância em estudo 
for degradada, a actividade total do
 14 C orgânico residual será sem ­
pre superior à actividade do  14 C associada à substância em estudo 
que permanece intacta. Se a substância em estudo for degradada 
segundo uma cinética de primeira ordem e se uma fracção constante, 
α, for mineralizada em CO  2 , o declive inicial da curva de desapare ­
cimento do  14 C (  14 C orgânico total em função do tempo) será α 
vezes superior ao declive da correspondente curva de concentração 
da substância em estudo (ou, em termos mais precisos, da parte da 
substância em estudo marcada com  14 C). Se se utilizarem as medi ­
ções não corrigidas da actividade total de  14 C orgânico, a taxa cons ­
tante de degradação calculada será, portanto, subavaliada. A litera ­
tura especializada descreve alguns procedimentos para a estimação 
das concentrações da substância em estudo a partir da actividade radioquímica medida, com base em diversos pressupostos de sim ­
plificação (2)(9)(10)(11). Esses procedimentos serão mais facilmente 
aplicáveis às substâncias de degradação rápida.
 
2.2. INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS  
Se se constatar que k é independente da concentração adicionada (ou 
seja, se o k calculado for aproximadamente o mesmo para todas as 
concentrações da substância em estudo), poderá assumir-se que a 
taxa constante de primeira ordem é representativa das condições de ensaio utilizadas, ou seja, da substância em estudo, da amostra de água e da temperatura de ensaio. Só a experiência permitirá decidir 
até que ponto os resultados podem ser generalizados ou extrapolados 
para outros sistemas. Se se utilizar uma concentração elevada da substância em estudo e se a degradação não ocorrer, portanto, se ­
gundo uma cinética de primeira ordem, os dados não poderão ser 
utilizados para a estimação directa de uma taxa constante de primeira 
ordem ou da correspondente meia-vida. No entanto, os dados reco ­
lhidos a partir de um ensaio com elevada concentração da substância em estudo poderão ainda ser utilizáveis para a estimação do grau de 
mineralização total e/ou dos limites de detecção e de quantificação 
dos metabolitos.
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1342
 
Se as taxas de outros processos, diferentes da biodegradação, que 
causam a perda da substância (p.ex.: hidrólise ou volatilização) fo ­
rem conhecidas, poderão ser subtraídas da taxa líquida de desapare ­
cimento da substância observada ao longo do ensaio, de modo a obter uma estimativa aproximada da taxa de biodegradação. Os da ­
dos relativos à hidrólise podem se obtidos, por exemplo, a partir dos 
frascos de controlo estéreis ou de ensaios paralelos com uma concen ­
tração mais elevada da substância em estudo.
 
A determinação, directa e indirecta, do  14 CO 2 (ponto 1.8.9.4 e anexo 
3) só pode ser utilizada para medir o grau de mineralização da 
substância em estudo em CO  2 . A radiocromatografia (RAD-TLC) 
ou o HPLC podem ser utilizados para analisar as concentrações da substância de ensaio marcada com
 14 C e a formação dos principais 
metabolitos (ver o terceiro parágrafo do ponto 1.8.9.4). A fim de 
permitir a estimação directa da meia-vida, é necessário que não esteja presente nenhum dos principais metabolitos (definidos como os metabolitos cuja concentração é ≥ 10 % da quantidade da subs ­
tância em estudo utilizada. Se estiverem presentes metabolitos prin ­
cipais, de acordo com essa definição, será necessário proceder a uma análise pormenorizada dos dados. Essa análise poderá incluir a re ­
petição de ensaios e/ou a identificação dos metabolitos (ver o pri ­
meiro parágrafo do ponto 1.8.9.5), a não ser quando o destino dos 
produtos de transformação possa ser razoavelmente avaliado com base na experiência adquirida (p.ex.: informação sobre a sequência de reacções da degradação). Na medida em que a proporção do 
carbono da substância em estudo que é transformada em CO
 2 varia 
(dependendo, em grande medida, da concentração da substância e de outros substratos disponíveis, das condições de ensaio e da popula ­
ção microbiana), este ensaio não permite uma estimação simples da 
biodegradação final, como acontece com o ensaio de redução gradual 
do COD, mas o seu resultado é semelhante ao obtido no caso dos ensaios respirométricos. O grau de mineralização será, portanto, me ­
nor ou igual do que o nível mínimo da degradação final. Para con ­
seguir obter uma imagem mais completa da biodegradação final 
(mineralização e incorporação sob a forma de biomassa), deverá ser efectuada, no final do ensaio, uma análise da distribuição do
 
14 C pelas diferentes fases (ver o apêndice 1). O  14 C presente na 
fase particulada será composto pelo  14 C incorporado na biomassa 
bacteriana e pelo  14 C adsorvido sobre outras partículas orgânicas.  
2.3. VALIDADE DO ENSAIO  
Se a substância de referência não for degradada durante o período 
em que isso seria de esperar (no caso da anilina e do benzoato de 
sódio, normalmente menos de duas semanas), a validade do ensaio 
será duvidosa e deverá ser verificada de forma mais aprofundada; em alternativa, o ensaio deverá ser repetido com uma nova amostra de água. Durante um ensaio de anel ISO do presente método, com a 
participação de sete laboratórios de toda a Europa, as constantes da 
taxa de degradação para a anilina variaram entre 0,3 e 1,7 dia
 –1 , com 
uma média de 0,8 d  –1 a 20  o C e um desvio-padrão de ± 0,4 d  –1 
(t ½ = 0,9 dias). A fase de latência tipicamente observada é de 1 a 
7 dias. As águas analisadas tinham, de acordo com os relatórios 
apresentados, uma biomassa bacteriana correspondente a 10  3 -10 4 
unidades formadoras de colónias (CFU) por ml. As taxas 
de degradação medidas nas águas ricas em nutrientes da Europa 
Central foram superiores às das águas nórdicas, oligotróficas, o 
que poderá dever-se a uma situação trófica diferente ou a uma ex ­
posição anterior a substâncias químicas.  
A recuperação total (balanço de massas) no final da experiência 
deverá situar-se entre os 90-110 % para as substâncias marcadas 
com um radioisótopo, enquanto que a recuperação inicial no início da experiência se deverá situar entre os 70-110 % para as substâncias não marcadas. No entanto, estes intervalos devem ser interpretados 
como um objectivo, não devendo ser utilizados como critério de 
aceitação do ensaio.
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1343
 
3. RELATÓRIO DE ENSAIO  
O relatório deve indicar claramente o tipo de ensaio, ou seja, se se 
trata de um ensaio pelágico ou com sedimento em suspensão, para além da seguinte informação:
 
Substância em estudo e substância(s) de referência:  
— nomes comuns, nomes químicos (nomes IUPAC e/ou CAS reco ­
mendados), números CAS, fórmulas estruturais (indicando a po ­
sição do  14 C, quando se utilizarem substâncias marcadas) e pro ­
priedades físico-químicas relevantes da substância em estudo e da 
substância de referência (ver os pontos 1.5 e 1.6),  
— nomes químicos, números CAS, fórmulas estruturais (indicando a 
posição do  14 C, quando se utilizarem substâncias marcadas) e 
propriedades físico-químicas relevantes das substâncias utilizadas como padrão para a identificação e quantificação dos metaboli ­
tos,
 
— pureza (impurezas) da substância em estudo e das substâncias de 
referência,  
— pureza radioquímica da substância marcada e respectiva activi ­
dade específica (se aplicável).  
Águas de superfície:  
Deve ser fornecida, no mínimo, a seguinte informação em relação à 
amostra de água:  
— localização e descrição do local de amostragem, incluindo, se 
possível, os antecedentes conhecidos em termos de poluição,  
— data e hora da recolha da amostra,  
— nutrientes (N total, amónio, nitritos, nitratos, P total, ortofosfatos 
dissolvidos),  
— profundidade da colheita,  
— aspecto da amostra (p.ex.: cor e turbidez),  
— COD e COT,  
— CBO,  
— temperatura e pH no local e momento da amostragem,  
— oxigénio ou potencial redox (obrigatório apenas quando as con ­
dições aeróbicas não sejam óbvias),  
— salinidade e condutividade (no caso da água do mar e da água 
salobra),  
— sólidos em suspensão (caso a amostra se apresente turva),  
— eventualmente, outra informação relevante acerca do local de 
amostragem no momento da mesma (p.ex.: dados actuais ou 
passados sobre o caudal dos rios ou correntes marinhas, descar ­
gas importantes que se encontram próximas e o respectivo tipo, condições meteorológicas que precederam a recolha da amostra),
 
e, facultativamente:  
— biomassa microbiana (p.ex.: contagem directa com laranja de 
acridina ou número de unidades formadoras de colónias),  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1344
 
— carbono inorgânico,  
— concentração de clorofila-a, como estimativa específica da bio ­
massa de algas.  
Quando se proceder a um ensaio com sedimentos em suspensão, 
deverá também ser fornecida a seguinte informação sobre os sedi ­
mentos:  
— profundidade da colheita de sedimento,  
— aparência do sedimento (p.ex.: colorido, lamacento, lodoso ou 
arenoso),  
— textura (p.ex.: % de areão, de areia fina, de lodo e de argilas),  
— peso seco dos sólidos em suspensão, em g/l, concentração do 
COT ou perda de peso após combustão, como medição do con ­
teúdo em matéria orgânica,  
— pH,  
— oxigénio ou potencial redox (obrigatório apenas quando as con ­
dições aeróbicas não sejam óbvias).  
Condições de ensaio:  
— período decorrido entre a recolha das amostras e a respectiva 
utilização no ensaio, condições de armazenamento e de pré-tra ­
tamento das amostras, data de realização dos estudos,  
— quantidade da substância em estudo aplicada, concentrações de 
ensaio e substância de referência,  
— método de aplicação da substância em estudo, incluindo a even ­
tual utilização de solventes,  
— volume de água de superfície e de sedimentos (se aplicável) 
utilizados, e volume recolhido em cada amostra para fins de 
análise,  
— descrição do sistema de ensaio utilizado.  
Se as culturas não forem mantidas em ambiente escuro, informação 
sobre as condições de «luz difusa»:  
— informação sobre o(s) método(s) utilizado(s) para a preparação 
dos controlos estéreis (p.ex.: temperatura, duração e número de tratamentos em autoclave),
 
— temperatura de incubação,  
— informação sobre as técnicas analíticas e sobre o(s) método(s) 
utilizado(s) para as medições da actividade radioquímica, para a verificação dos balanços de massa e para a medição da dis ­
tribuição pelas fases (se for efectuada),
 
— número de replicados.  
Resultados:  
— percentagens de recuperação (ver o ponto 1.7.1),  
— reproductividade e sensibilidade dos métodos analíticos utiliza ­
dos, incluindo os respectivos limites de detecção (LOD) e de 
quantificação (LOQ) (ver o ponto 1.7.2),  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1345
 
— todos os dados medidos (incluindo o momento das amostragens), 
tabela com os valores calculados e curvas de degradação; para 
cada concentração estudada e para cada frasco replicado, apre ­
sentar o coeficiente de correlação linear correspondente ao de ­
clive do gráfico logarítmico, a duração estimada da fase de la ­
tência e (se possível) uma taxa constante de primeira ordem ou 
de pseudo primeira ordem, bem como a correspondente meia- -vida (ou período de meia-vida, t
 50 ), 
— comunicar os valores relevantes, p.ex.: duração da fase de latên ­
cia, taxa constante e meia-vida de degradação (ou t  50 ), sob a 
forma de uma média dos resultados observados nos diferentes 
replicados,  
— classificar o sistema como adaptado ou não-adaptado, a julgar 
pelo aspecto da curva de degradação e pela possível influência da 
concentração de ensaio,  
— resultados da verificação final dos balanços de massa e das me ­
dições da distribuição pelas diferentes fases (se efectuadas),  
— fracção do  14 C mineralizada e, caso sejam utilizadas análises 
específicas, nível final da degradação primária,  
— identificação, concentração molar e percentagem da substância 
aplicada e dos principais metabolitos (ver o primeiro parágrafo do ponto 1.8.9.5), quando aplicável,
 
— proposta de esquema da sequência de reacções, quando aplicável,  
— discussão dos resultados.  
4. BIBLIOGRAFIA  
1. OECD TG 309 (2004) Aerobic Mineralisation in surface water 
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4. Testing Method C.24. Aerobic and anaerobic transformation in 
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6. ISO 8245 (1999). Water quality — Guidelines on the determi ­
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carbon (DOC).  
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10. Ingerslev, F. and N. Nyholm. (2000). Shake-flask test for deter ­
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11. ISO/CD 14592-1 (1999). Ring test report: Water Quality — 
Evaluation of the aerobic biodegradability of organic compounds at low concentrations part 1 — report of 1998/1999 ring-test. Shake flask batch test with surface water or surface water/ ­
sediment suspensions.
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1347
 
Apêndice 1  
Distribuição do  14 C pelas diferentes fases  
Para efeitos da verificação do procedimento, as medições rotineiras da actividade 
residual do  14 C orgânico total (TOA) devem ser complementadas por medições 
dos balanços de massa, que indicam a determinação directa do  14 CO 2 produzido 
após captura num adsorvente (ver o anexo 3). A formação de  14 CO 2 representa, 
por si só, uma prova directa de biodegradação, por oposição à degradação abió ­
tica ou a outros mecanismos de redução da concentração da substância, como a volatilização ou a adsorção. Alguma informação útil para a caracterização do 
comportamento em termos de biodegradabilidade pode ser obtida medindo a 
distribuição do TOA entre a fase de solução (actividade do
 14 C orgânico dissol ­
vido, DOA) e a fase particulada (actividade do  14 C orgânico particulado, POA), 
após separação das partículas por filtração através de membrana ou por centri ­
fugação. A POA consiste na substância adsorvida sobre a biomassa microbiana e 
sobre outras partículas, para além do carbono marcado proveniente da substância em estudo e que tenha sido utilizado para a síntese de novo material celular, sendo assim incorporado na fracção da biomassa particulada. A formação de 
material orgânico dissolvido com
 14 C pode ser estimada pela DOA no final da 
biodegradação (parte em que a curva da degradação em função do tempo passa a ser paralela ao eixo dos ×).
 
Estimar a distribuição do  14 C pelas fases em amostras seleccionadas, por filtração 
das amostras através de um filtro de membrana com diâmetro de poro de 
0,22 μm ou de 0,45 μm, num material que não seja significativamente adsorvente 
em relação à substância em estudo (os filtros de policarbonato poderão servir). Caso a adsorção da substância em estudo no filtro seja demasiado importante para que possa ser ignorada (a verificar antes de iniciar a experiência) poderá 
utilizar-se, em vez da filtração, um procedimento de centrifugação a alta veloci ­
dade (2 000 g, 10 min).
 
Proceder à filtração ou à centrifugação de amostras não filtradas, como se des ­
creve no anexo 3. Dissolver os filtros de membrana num fluído de cintilação 
adequado e proceder à contagem do modo habitual, utilizando apenas o método 
do rácio externo padrão para corrigir a atenuação, ou utilizar um oxidante das amostras. Se se tiver procedido a centrifugação, ressuspender o  pellet  formado 
pela fracção particulada em 1-2 ml de água destilada e transferir para uma célula 
de cintilómetro. Lavar duas vezes com 1 ml de água destilada e transferir a água 
da lavagem para a célula. Se necessário, a suspensão poderá ser colocada num gel para a contagem por cintilação em meio líquido.
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1348
 
Apêndice 2  
Procedimento semicontínuo  
Para conseguir chegar a uma degradação suficiente das substâncias mais recalci ­
trantes, poderá ser necessário incubar as culturas durante períodos que poderão chegar a vários meses. A duração do ensaio não deverá normalmente ultrapassar 
60 dias, a não ser quando as características da amostra original da água possam 
ser mantidas através da renovação da suspensão de ensaio. O período de ensaio poderá, no entanto, ser alargado até um máximo de 90 dias, sem renovação da suspensão de ensaio, se a degradação da substância em estudo se tiver iniciado 
durante os primeiros 60 dias.
 
Durante a incubação por longos períodos, a diversidade da comunidade micro ­
biana poderá reduzir-se devido a diferentes mecanismos de perda e também ao esgotamento de nutrientes essenciais e substratos primários de carbono na água de ensaio. Assim, recomenda-se a utilização de um ensaio em semicontínuo, a 
fim de determinar de forma apropriada a taxa de degradação das substâncias em 
que esse processo é mais lento. O ensaio deve ser iniciado utilizando um pro ­
cedimento semicontínuo quando a experiência anterior mostrar que será neces ­
sário um período de incubação de três meses para conseguir a degradação de 
20 % da substância presente. Se não for esse o caso, o ensaio normal, em modo 
descontínuo, poderá ser transformado num ensaio semicontínuo se não se obser ­
var nenhuma degradação da substância em estudo durante aproximadamente 60 dias de ensaio em descontínuo. Pode interromper-se o procedimento semicontí ­
nuo e continuar o ensaio em descontínuo a partir do momento em que se tenha 
registado uma degradação substancial (p.ex.: > 20 %).
 
No ensaio semicontínuo, cerca de um terço do volume da suspensão de ensaio 
será substituída, a cada quinze dias, por água acabada de recolher à qual foi 
adicionada a substância em estudo à concentração inicial pretendida. Se o ensaio 
for realizado com sedimento em suspensão, o sedimento será igualmente adicio ­
nado à água de substituição, com a mesma concentração inicial do ensaio (entre 0,01 e 1 g/l). Para efeitos da realização de um ensaio com sólidos sedimentares 
em suspensão, é importante manter o sistema em suspensão permanente, mesmo 
durante a mudança de água, e um tempo de residência seja idêntico para os sólidos e para a água, já que de outra forma a pretendida similaridade com um sistema aquoso homogéneo sem fases definidas não estará garantida. Por 
essas razões, quando se utilizar o regime semicontínuo será preferível utilizar 
uma concentração inicial de sólidos em suspensão na parte inferior do intervalo de concentrações sugerido.
 
A substância em estudo deve ser adicionada com uma concentração que faça com 
que a concentração inicial não seja ultrapassada aquando da renovação parcial da 
suspensão de ensaio, o que permitirá evitar os fenómenos de adaptação que ocorrem 
frequentemente a altas concentrações da substância em estudo. Na medida em que o procedimento implica tanto uma reinoculação como a compensação dos nutrientes e substratos primários entretanto esgotados, a diversidade microbiana original é re ­
posta, pelo que o ensaio poderá, teoricamente, prolongar-se até ao infinito. Quando 
se utiliza o procedimento semicontínuo, é importante notar que a concentração residual da substância em estudo deve ser corrigida em função das quantidades removidas e adicionadas em cada renovação. A concentração total e a concentração 
em solução da substância de ensaio podem ser tratadas como equivalentes no caso 
dos compostos com baixa adsorção. A adsorção é insignificante (< 5 %), nas condições de ensaio (0,1-1 g sólidos/l) para as substâncias em que log Kow < 3 
(válido para compostos lipofílicos neutros). Essa característica é ilustrada pelo 
seguinte exemplo: 0,1 g/l de sólidos correspondem, mais ou menos, a 10 mg de carbono por litro (fracção carbono, f
 C = 0,01). Assumindo que:  
Log K  ow (da substância de ensaio) = 3  
K oc = 0,42 × K  ow 
Coeficiente de partição, K  d = f C × K  oc 
logo, a fracção dissolvida da concentração total (C-água (C  w )/C-total (C  t ) será:  
C w /C t = 1/(1 + K  d × SS) = 1(1 + K  oc × f C × SS) = 1/(1 + 0,42 × 10  3 × 0,01 × 
0,1 × 10  –3 ) = 0,999  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1349
 
Apêndice 3  
Determinação do  14 CO  2 
Determinação indirecta do  14 CO  2 
Para as medições de rotina, o método indirecto é geralmente o mais rápido e 
preciso, quando a substância de ensaio e os respectivos metabolitos não forem 
voláteis. Transferir simplesmente amostras não filtradas, por exemplo com um 
volume de 5 ml, para células de cintiloscópio. A actividade das amostras deverá localizar-se inicialmente entre os 5 000 dpm-10 000 dpm (80-170 Bq), sendo a actividade mínima inicial, normalmente, da ordem dos 1 000 dpm. O CO
 2 deve 
ser purgado após acidificação das amostras a pH 2-3 com uma ou duas gotas de 
HCl ou H  3 PO 4 concentrado. A purga do CO  2 pode ser feita por borbulhamento 
com ar durante cerca de ½-1 hora. Em alternativa, agitar vigorosamente as células (p.ex.: em agitador orbital) durante 1-2 horas ou, com agitação menos 
vigorosa, de um dia para o outro. A eficiência da purga de CO
 2 deve ser 
verificada (prolongando o período de arejamento ou de agitação). Adicionar depois um líquido de cintilação adequado para a contagem de amostras aquosas, homogeneizar a amostra num agitador orbital e determinar a radioactividade por 
contagem de cintilação do líquido, subtraindo a actividade de base encontrada 
nos brancos utilizados no ensaio (F
 B ). A não ser nos casos em que a água de 
ensaio seja muito corada ou contenha uma elevada concentração de partículas, as amostras devem normalmente apresentar uma atenuação uniforme, pelo que será 
suficiente proceder a correcções da atenuação utilizando um padrão externo. Se a 
água de ensaio se apresentar muito corada, poderá ser necessário proceder a uma correcção adicional da atenuação utilizando um padrão interno. Se a concentração de partículas for elevada poderá ser difícil obter uma solução ou gel homogéneo, 
ou poderão ocorrer variações de atenuação demasiado grandes de amostra para 
amostra. Nesse caso, poderá ser utilizado o método de contagem descrito abaixo para as lamas. Se o ensaio for realizado com sedimento em suspensão, a medição do
 14 CO 2 poderá ser efectuada indirectamente retirando uma amostra homogénea 
de 10 ml da água/suspensão de ensaio e separando as respectivas fases por 
centrifugação a uma velocidade apropriada (p.ex.: 40 000 m/s  2 durante 
15 min). A fase aquosa deverá então ser tratada como se descreve acima. Para a determinação da actividade de
 14 C da fase particulada (POA), ressuspender o 
sedimento num pequeno volume de água destilada, transferir para as células de 
cintiloscópio e adicionar líquido de cintilação de modo a formar um gel (existem líquidos de cintilação especiais para esse efeito). Dependendo da natureza das partículas (nomeadamente do respectivo teor de matéria orgânica), poderá ser 
viável proceder à digestão da amostra, de um dia para o outro, numa solução 
que dissolva os tecidos e depois à respectiva homogeneização em agitador orbi ­
tal, antes de adicionar o líquido de cintilação. Em alternativa, a POA pode ser determinada por combustão em presença de oxigénio excedentário, utilizando um 
oxidador de amostras. Para a contagem, devem ser sempre incluídos padrões 
internos, podendo ser necessário proceder a correcções da atenuação por adição de um padrão interno a cada uma das amostras.
 
Determinação directa do  14 CO  2 
Se o  14 CO 2 produzido for medido directamente, será necessário prever, no início 
do ensaio, um número suficiente de frascos, que serão recolhidos em cada mo ­
mento de amostragem e acidificados a pH 2-3, sendo o  14 CO 2 recolhido num 
adsorvente interno (colocado em cada frasco de ensaio no início do mesmo) ou 
externo. Como agente adsorvente, podem utilizar-se produtos alcalinos (p.ex.: 
solução 1 N ou  pellets  de NaOH), etanolamina ou um adsorvente baseado na 
etanolamina que se encontre disponível no mercado. Quando as medições do  
14 CO 2 sejam feitas de forma directa, os frascos de ensaio devem ser hermetica ­
mente fechados, por exemplo com rolhas de borracha butírica.  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1350
 
Figura 1a  
Exemplo de um gráfico aritmético dos dados (actividade residual em função do tempo)
  
Figura 1b  
Exemplo de um gráfico semilogarítmico dos dados (ln da actividade residual em função do tempo)
  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1351
 
C.26.  ENSAIO DE INIBIÇÃO DE CRESCIMENTO COM  LEMNA  
SPP.  
1. MÉTODO  
Este método é equivalente ao OECD TG 221 (2006). As autoridades 
da UE estão de acordo em afirmar que o ensaio com  Lemna  constitui 
uma alternativa adequada para o ensaio com algas de substâncias fortemente coradas (2)(3).
 
1.1. INTRODUÇÃO  
O presente método de ensaio foi concebido para avaliar a toxicidade 
de determinadas substâncias para as plantas aquáticas do Género  
Lemna  (lentilha-de-água). O método é baseado em orientações exis ­
tentes (4)(5)(6)(7)(8)(9), mas inclui modificações desses métodos para tomar em conta a investigação mais recente e as consultas 
realizadas em relação a uma série de questões. O método proposto 
foi validado por um ensaio de anel internacional (10).
 
O presente método de ensaio descreve ensaios de toxicidade que 
utilizam as espécies  Lemna gibba  e Lemna minor , que foram exten ­
samente estudadas e são objecto das normas acima referidas. A taxonomia das  Lemna  spp. é difícil, sendo complicada pela existên ­
cia de diversos fenótipos. Embora a resposta das  Lemna  aos agentes 
tóxicos possa ser afectada por variabilidade genética, a informação actualmente existente sobre essa fonte de variabilidade não é sufi ­
ciente para permitir que se recomende um clone específico para a 
utilização no presente método de ensaio. Cabe aqui notar que embora o ensaio não seja realizado com culturas puras, são tomadas medidas, em diversas fases, para que a contaminação por outros organismos 
seja reduzida ao mínimo.
 
São descritos os pormenores do ensaio com renovação (semiestático 
e em contínuo) e sem renovação (estático) da solução de ensaio. 
Dependendo dos objectivos do ensaio e das exigências regulamen ­
tares, é recomendado que se analise a possibilidade de aplicação dos métodos semiestático e em contínuo, nomeadamente para as subs ­
tâncias que desaparecem rapidamente da solução por efeito de vola ­
tilização, de fotodegradação, de precipitação ou de biodegradação. Para mais orientações, consultar a referência bibliográfica (11).
 
1.2. DEFINIÇÕES  
Para efeitos do presente método de ensaio, foram utilizadas as se ­
guintes definições e abreviaturas:  
Biomassa : é o peso seco da matéria viva presente numa população. 
No presente ensaio são utilizadas algumas formas alternativas de 
medição da biomassa, como o número ou a superfície das frondes, 
sendo o termo «biomassa» utilizado também para essas medições alternativas.
 
Clorose : é o amarelecimento do tecido das frondes.  
Clone : é um organismo ou célula obtido a partir de um único in ­
divíduo por reprodução assexuada. Os indivíduos de um mesmo 
clone são, portanto, geneticamente idênticos.  
Colónia : é um agregado de frondes (geralmente 2 a 4) progenitoras e 
descendentes, ligadas entre si. As colónias são por vezes designadas 
por «planta».  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1352
 
EC x : é a concentração da substância em estudo que, dissolvida no 
meio de ensaio, resulta numa redução de x % (p. ex.: 50 %) do 
crescimento da  Lemna , após um determinado período de exposição 
(que deverá ser explicitamente mencionado nos casos em que se afaste da duração total ou normal do ensaio). A fim de indicar de 
forma inequívoca se o valor de EC se refere à taxa de crescimento 
ou ao rendimento, o símbolo «E
 r C» é utilizado no primeiro caso e o 
símbolo «E  y C» no segundo, sendo seguidos da designação da variá ­
vel de medição utilizada, p. ex.: E  r C (número de frondes).  
Ensaio em contínuo : é um ensaio em que a solução em estudo é 
continuamente substituída.  
Fronde : é uma estrutura individual/única, em «forma de folha», de 
uma planta de lentilha-de-água. Trata-se da mais pequena unidade, 
ou seja, indivíduo, capaz de reprodução.  
Giba : é uma fronde que apresenta um aspecto irregular ou inchado.  
Crescimento : é o aumento da variável de medição, que pode ser o 
número de frondes, o peso seco, o peso húmido ou a superfície das 
frondes, ao longo do período de ensaio.  
Taxa de crescimento (taxa média de crescimento específico) : é o 
aumento logarítmico da biomassa durante o período de exposição.  
Menor concentração com efeito observável (LOEC) : é a concen ­
tração mais baixa à qual se observa que a substância em estudo tem 
um efeito estatisticamente significativo (p < 0,05) de redução do crescimento, quando comparada com o controlo, para um determi ­
nado período de exposição. No entanto, todas as concentrações de 
ensaio superiores à LOEC devem ter um efeito prejudicial igual ou 
superior ao verificado com a LOEC. Quando estas duas condições não puderem ser satisfeitas, deverá ser fornecida uma explicação pormenorizada sobre a forma como se determinou a LOEC (e, con ­
sequentemente, a NOEC).
 
Variáveis de medição : é qualquer tipo de variável que seja medida 
para permitir a determinação do ponto final do ensaio, utilizando 
uma ou mais do que uma variáveis de resposta. No presente método, 
o número de frondes, a superfície das frondes, o peso fresco e o peso seco são variáveis de resposta.
 
Monocultura : é uma cultura com uma única espécie de planta.  
Necrose : é o tecido da fronde morto (ou seja, branco ou empapado 
em água).  
Concentração sem efeitos observáveis (NOEC) : é a concentração 
de ensaio imediatamente inferior à LOEC.  
Fenótipo : são as características observáveis de um organismo, de ­
terminadas pela interacção dos seus genes com o ambiente em que vive.
 
Variáveis de resposta : são variáveis de estimação da toxicidade, 
derivadas de qualquer dos parâmetros medidos que descrevem a 
biomassa nos diferentes métodos de cálculo. No presente método, as taxas de crescimento e o rendimento são variáveis de resposta derivadas de variáveis de medição como o número de frondes, a 
superfície das frondes, o peso fresco ou o peso seco.
 
Ensaio semiestático (com renovação do meio) : é um ensaio em que 
a solução de ensaio é periodicamente substituída, em determinados momentos do ensaio.
 
Ensaio estático : é um método de ensaio durante o qual não há 
renovação da solução de ensaio.  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1353
 
Ponto final do ensaio : descreve, em termos gerais, o factor que será 
alterado pela substância química em estudo, por comparação com o 
controlo, cuja identificação é o objectivo do ensaio. No presente método, o ponto final é a inibição do crescimento, que pode ser expressa por diferentes variáveis de resposta, baseadas em uma ou 
mais variáveis de medição.
 
Meio de ensaio : é o meio sintético completo de crescimento em que 
as plantas de ensaio são cultivadas quando expostas à substância em 
estudo. A substância em estudo será normalmente dissolvida no meio 
de ensaio.  
Rendimento : é o valor de uma variável de medição que exprime a 
biomassa no final do período de exposição menos o valor dessa variável de medição no início do período de exposição.
 
1.3. PRINCÍPIO DO ENSAIO  
Utilizando monoculturas de plantas do género  Lemna  em cresci ­
mento exponencial, são feitas culturas com diferentes concentrações da substância em estudo, durante sete dias. O objectivo do ensaio é quantificar os efeitos da substância em estudo sobre o crescimento 
vegetativo durante esse período, com base na avaliação de determi ­
nadas variáveis de medição. O número de frondes é a variável de medição primária. Pelo menos mais uma variável de medição (su ­
perfície total das frondes, peso seco ou peso fresco) será também 
medida, já que certas substâncias podem afectar outras variáveis de 
medição de forma muito mais severa do que o número de frondes. Para quantificar os efeitos relacionados com a substância em estudo, o crescimento das culturas de ensaio é comparado com o dos con ­
trolos, sendo determinada a concentração que causa uma inibição do 
crescimento de x % (p. ex.: 50 %), expressa como EC
 x (p. ex.: 
EC 50 ). 
O ponto final do ensaio é a inibição do crescimento, expresso como 
o aumento logarítmico da variável de medição (taxa média de cres ­
cimento específico) durante o período de exposição. A partir das 
taxas médias de crescimento específico registadas numa série de 
soluções de ensaio, a concentração que causa uma inibição da taxa de crescimento de x % (p. ex.: 50 %) é determinada e expressa como E
 r C x (nesse caso, E  r C 50 ) 
Outra variável de resposta utilizada no presente método de ensaio é o 
rendimento, que pode ser necessário para dar cumprimento a exigên ­
cias regulamentares específicas de alguns países. O rendimento é 
definido como o valor da variável de medição no final do período de exposição menos o valor da variável de medição no início do período de exposição A partir dos rendimentos registados numa série 
de soluções de ensaio, a concentração que causa uma inibição do 
rendimento de x % (p. ex.: 50 %) é determinada e expressa como E
 y C x (nesse caso, E  y C 50 ). 
Por outro lado, a menor concentração com efeito observável (LOEC) 
e a concentração sem efeitos observáveis (NOEC) podem ser deter ­
minadas estatisticamente.  
1.4. INFORMAÇÃO SOBRE A SUBSTÂNCIA EM ESTUDO  
Deve existir um método analítico que apresente uma sensibilidade 
adequada para a quantificação da substância no meio de ensaio.  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1354
 
A informação sobre a substância em estudo que poderá ser útil para 
estabelecer as condições do ensaio inclui a sua fórmula estrutural, 
pureza, hidrossolubilidade, estabilidade à luz e em água, pK  a , K ow , 
pressão de vapor e biodegradabilidade. A hidrossolubilidade e a pressão de vapor podem ser utilizadas para calcular a constante da 
Lei de Henry, o que permitirá verificar a probabilidade de perdas 
significativas da substância em estudo durante o período de ensaio. Dessa forma, poderá avaliar-se se é necessário adoptar medidas es ­
pecíficas para o controlo dessas perdas. Nos casos em que a infor ­
mação sobre a solubilidade e a estabilidade da substância de ensaio 
for incerta, recomenda-se que as mesmas sejam avaliadas nas con ­
dições de ensaio, ou seja, com o mesmo meio de crescimento, tem ­
peratura e regime de iluminação que irá ser utilizado no ensaio.
 
O controlo do pH do meio de ensaio é particularmente importante, 
nomeadamente no caso dos ensaios de metais ou de substâncias 
hidroliticamente instáveis, pelo que se recomenda, nesses casos, a 
adição de um tampão ao meio de crescimento (ver o primeiro pará ­
grafo do ponto 1.7.4. Para mais orientações sobre o ensaio de subs ­
tâncias cujas propriedades físico-químicas dificultam o ensaio, con ­
sultar a referência bibliográfica (11).  
1.5. SUBSTÂNCIA DE REFERÊNCIA  
Para verificação do procedimento de ensaio, pode(m) ser ensaiada(s) 
(uma) substância(s) de referência, como por exemplo o 3,5-dicloro ­
fenol, utilizado no ensaio de anel internacional (10). Será desejável proceder ao ensaio de uma substância de referência pelo menos duas vezes por ano ou, quando os ensaios forem realizados com menos 
frequência, em paralelo com a determinação da toxicidade das subs ­
tâncias em estudo.
 
1.6. VALIDADE DO ENSAIO  
Para que o ensaio seja válido, o tempo de duplicação do número de 
frondes no controlo deve ser inferior a 2,5 dias (60 horas), o que corresponde aproximadamente a uma multiplicação por sete em sete dias e a uma taxa média de crescimento específico de 0,275 d
 –1 . 
Utilizando os meios e as condições de ensaio descritas no presente 
método, esse critério pode ser cumprido num regime de ensaio es ­
tático (8). Parte-se igualmente do princípio de que esse critério po ­
derá ser cumprido nos ensaios semiestáticos ou contínuos. O cálculo 
do tempo de duplicação é apresentado no ponto 2.1.  
1.7. DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
1.7.1.  Equipamento  
Todos os equipamentos que entrem em contacto com as soluções de 
ensaio devem ser totalmente construídos em vidro ou noutro material quimicamente inerte O material de vidro utilizado para as culturas e ensaios deve ser limpo de todos os contaminantes químicos que 
possam lixiviar para o meio de ensaio e esterilizado. Os frascos de 
ensaio devem ser suficientemente largos para que as frondes das diferentes colónias dos frascos de controlo possam crescer sem se sobreporem até ao final do ensaio. Não importa se as raízes tocarem 
o fundo dos frascos de ensaio, mas será aconselhável utilizar frascos 
com uma profundidade mínima de 20 mm e com um volume mínimo de 100 ml. A escolha do melhor tipo de frascos não é crítica, desde que esses requisitos sejam cumpridos. O ensaio já foi realizado com 
sucesso em frascos de vidro, caixas de cristalização ou caixas de 
Petri de dimensões apropriadas. Os frascos de ensaio devem ser cobertos de modo a minimizar a evaporação e a contaminação aci ­
dental, sem pôr em causa as necessárias trocas gasosas. Os frascos e, 
em especial, as tampas mais indicadas não provocarão zonas de 
sombra ou alterações das características do espectro luminoso.
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1355
 
As culturas e os frascos de ensaio não devem ser conservados juntos. 
Para tal, o melhor será utilizar câmaras de crescimento, incubadoras 
ou mesmo salas separadas. A iluminação e a temperatura devem ser controláveis e mantidas a um nível constante (ver o ponto 1.7.8).
 
1.7.2.  Organismo de ensaio  
O presente ensaio pode ser realizado com  Lemna gibba  ou com  
Lemna minor . O apêndice 1 apresenta uma breve descrição das 
espécies de lentilha-de-água que já foram utilizadas para ensaios de toxicidade. O material vegetal pode ser obtido junto de uma 
colecção de culturas, de outro laboratório ou no campo. Quando 
forem recolhidas no campo, as plantas devem ser mantidas em cul ­
tura no mesmo meio que irá ser utilizado para o ensaio durante pelo menos oito semanas antes do mesmo. Os locais de colheita no 
campo onde se faz a recolha de culturas de arranque devem estar 
isentos de fontes evidentes de poluição. Caso sejam obtidas de outro laboratório ou de uma colecção de culturas, as plantas devem ser mantidas da mesma forma durante pelo menos três semanas. A fonte 
do material vegetal e da espécie ou clone (se conhecido) utilizado 
para o ensaio deve ser sempre indicada.
 
Devem ser utilizadas monoculturas visivelmente isentas de contami ­
nação por outros organismos, como algas ou protozoários. As plantas 
saudáveis de  L. minor  são formadas por colónias com duas a cinco 
frondes, enquanto que as colónias saudáveis de  L. gibba  podem 
apresentar até sete frondes.  
A qualidade e a uniformidade das plantas utilizadas para o ensaio 
terão uma influência significativa sobre o resultado do mesmo, pelo 
que as plantas devem ser cuidadosamente seleccionadas. Devem ser 
utilizadas plantas jovens, de crescimento rápido e sem lesões ou descoloração (clorose) visíveis. Uma cultura de boa qualidade é caracterizada por uma elevada incidência de colónias com pelo me ­
nos duas frondes. Um número elevado de frondes isoladas é indica ­
tivo de  stress  ambiental, nomeadamente por limitação de nutrientes, 
pelo que o material vegetal das culturas com essas características não deverá ser utilizado para os ensaios.
 
1.7.3.  Cultura  
Para reduzir a frequência das transferências para conservação da 
cultura (p. ex.: durante os períodos em que não estejam previstos ensaios com  Lemna ) as culturas poderão ser conservadas em am ­
biente escuro e a baixa temperatura (4-10 °C). O apêndice 2 apre ­
senta mais informação sobre as técnicas de cultura. O surgimento de sinais evidentes de contaminação por algas ou por outros organismos 
exigirá a esterilização superficial de uma subamostra de frondes de  
Lemna , seguida de transferência para meio fresco (ver o apêndice 2). 
Nesse caso, a parte restante da cultura contaminada deverá ser des ­
cartada.
 
Pelo menos sete dias antes do ensaio, um número suficiente de 
colónias será transferido em condições assépticas para meio fresco esterilizado e cultivado durante 7-10 dias nas condições de ensaio.
 
1.7.4.  Meio de ensaio  
Existem diversos meios recomendados para as culturas de  Lemna 
minor  e Lemna gibba , como se descreve a seguir. A inclusão de 
um tampão de pH no meio de ensaio [MOPS (ácido 4-morfoline ­
propanosulfónico, N.  o CAS: 1132-61-2; N.  o EINECS: 214-478-5) no 
meio para  L. minor  ou NaHCO  3 no meio para  L. gibba ] deve ser 
cuidadosamente ponderada nos casos em que possa haver interacção com a substância em estudo que influencie a expressão da sua toxi ­
cidade. O meio de Steinberg (12) também poderá ser utilizado, desde 
que estejam cumpridos os critérios de validade do ensaio.
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1356
 
Para as culturas e ensaios com  L. minor , recomenda-se a utilização 
do meio Swedish Standard (SIS) para  Lemna , modificado. A com ­
posição desse meio é dada no apêndice 3.  
O meio de crescimento 20X — AAP, descrito no apêndice 3, é 
recomendado para as culturas e ensaios com  L. gibba . 
O meio de Steinberg, tal como descrito no apêndice 3, também é 
indicado para a  L. minor , mas pode ser utilizado para a  L. gibba , 
desde que estejam cumpridos os critérios de validade do ensaio.  
1.7.5.  Soluções de ensaio  
As soluções de ensaio são geralmente preparadas através da diluição 
de soluções de reserva. As soluções de reserva da substância em 
estudo são normalmente preparadas por dissolução da substância em meio de crescimento.
 
A concentração mais elevada da substância em estudo no ensaio não 
deverá normalmente ser superior ao limite de solubilidade da subs ­
tância em água, nas condições de ensaio. No entanto, cabe aqui notar que as  Lemna  spp. flutuam à superfície, podendo ser expostas a 
substâncias recolhidas na interface água-ar (p. ex.: substâncias de 
baixa hidrossolubilidade, hidrófobas ou tensioactivas). Nessas cir ­
cunstâncias, terá lugar uma exposição a materiais diferentes dos que se encontram em solução e as concentrações de ensaio podem, 
dependendo das características da substância em estudo, ultrapassar o 
limite de hidrossolubilidade. Para as substância com baixa hidrosso ­
lubilidade, poderá ser necessário preparar uma solução de reserva concentrada ou dispersar a substância por meio de um dispersante 
ou solvente orgânico, de modo a facilitar a adição de quantidades 
exactas da substância em estudo ao meio de ensaio e a respectiva dispersão e dissolução. Devem ser desenvolvidos todos os esforços 
para evitar utilizar materiais desse tipo. A utilização de dispersantes 
ou de solventes auxiliares não deverá acarretar qualquer fitotoxici ­
dade. Assim, por exemplo, os solventes mais comuns que não cau ­
sam fitotoxicidade em concentrações até aos 100 ml·l
 –1 incluem a 
acetona e a dimetilformamida. Se for utilizado um dispersante ou um 
solvente, a sua concentração final, tão baixa quanto possível (≤ 100 ml·l
 –1 ), deve ser comunicada e todos os frascos de exposição 
e de controlo devem ser expostos à mesma concentração. Para mais 
orientações sobre a utilização de dispersantes, consultar a referência 
bibliográfica (11).  
1.7.6.  Grupos de ensaio e de controlo  
O conhecimento prévio da toxicidade da substância em estudo para a  
Lemna , por exemplo determinada com base nos resultados de ensaios de 
determinação da gama de concentrações, permitirá uma mais fácil esco ­
lha das concentrações a utilizar no ensaio. No ensaio de toxicidade definitivo, deverão normalmente ser estudadas cinco concentrações de 
ensaio, em progressão geométrica. De preferência, o factor de separação 
entre as concentrações de ensaio não deve ultrapassar os 3,2, mas poderá ser utilizado um valor mais elevado quando a curva de concentração- -resposta for pouco pronunciada. Quando se utilizarem menos de cinco 
concentrações, deve ser apresentada uma justificação. Devem ser utili ­
zados pelo menos três replicados de cada concentração de ensaio.
 
Para efeitos da definição da gama de concentrações (tanto nos en ­
saios de determinação da gama quanto nos ensaios definitivos de 
toxicidade) deve tomar-se em consideração os seguintes elementos:  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1357
 
— Para a determinação do EC  x , as concentrações de ensaio devem 
abranger o valor de EC  x , de modo a garantir um nível de con ­
fiança apropriado. Assim, para a determinação do EC  50 , por 
exemplo, a concentração de ensaio mais elevada deve ser supe ­
rior ao valor de EC  50 . Se o valor de EC  50 se encontrar fora da 
gama de concentrações ensaiadas, os intervalos de confiança 
associados serão maiores, o que poderá impossibilitar o ajusta ­
mento de um modelo estatístico,  
— Se o objectivo for a determinação do LOEC/NOEC, a concen ­
tração mais baixa ensaiada deve ser suficientemente baixa para 
que o seu crescimento não seja significativamente inferior ao dos 
controlos. Por outro lado, a concentração mais elevada a ensaiar deve ser suficientemente alta para que o seu crescimento seja significativamente inferior ao do controlo. Se não for esse o caso, 
o ensaio terá de ser repetido com uma gama de concentrações 
diferente (a não ser quando a concentração máxima já se encon ­
tre perto do limite de solubilidade ou da concentração máxima pretendida, 100 mg·l
 –1 ). 
Todos os ensaios devem incluir controlos compostos pelo mesmo 
meio nutriente, número de frondes e de colónias e sujeitos às mes ­
mas condições ambientais e procedimentos que os frascos de ensaio, mas sem adição da substância em estudo. Se for utilizado um dis ­
persante ou solvente auxiliar, o ensaio deverá incluir um controlo 
suplementar, com a mesma concentração de solvente/dispersante que 
os frascos com a substância em estudo. O número de frascos com os replicados dos controlos (e de frascos com solvente, se aplicável) deve ser pelo menos igual e idealmente o dobro do número de 
frascos utilizados para cada concentração de ensaio.
 
Caso não seja necessário determinar o NOEC, o ensaio poderá ser 
alterado de modo a aumentar o número de concentrações estudadas, reduzindo o número de replicados por concentração. O número de replicados dos controlos deve, no entanto, ser de pelo menos três.
 
1.7.7.  Exposição  
As colónias, com 2 a 4 frondes visíveis, são transferidas da cultura de 
inóculo e distribuídas de forma aleatória pelos frascos de ensaio, em 
condições assépticas. Cada frasco de ensaio deve ser inoculado com um total de 9 a 12 frondes. O número de frondes e de colónias deve ser o mesmo em todos os frascos de ensaio. A experiência já obtida com 
o presente método e os dados dos ensaios de anel indicam que a utili ­
zação de três replicados de cada concentração em estudo, com 9 a 12 frondes em cada replicado, são suficientes para detectar diferenças de crescimento da ordem dos 4 a 7 %, para a inibição calculada a partir da 
taxa de crescimento (e dos 10 a 15 % a partir do rendimento), entre as 
diferentes concentrações (10).
 
A colocação aleatória dos frascos de ensaio na incubadora é neces ­
sária para reduzir ao mínimo a influência das diferenças espaciais em termos de intensidade da luz ou de temperatura. É igualmente ne ­
cessário mudar a posição dos frascos, por blocos ou de forma alea ­
tória, após as amostragens (ou mais frequentemente).
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1358
 
Se um ensaio preliminar de estabilidade mostrar que a concentração 
da substância em estudo não pode ser mantida (ou seja, se a concen ­
tração medida diminuir mais de 80 % em relação à concentração inicial medida) durante o período de ensaio (7 dias), recomenda-se a utilização de um regime de ensaio semiestático. Nesse caso, as co ­
lónias devem ser expostas a soluções frescas de ensaio e de controlo 
em pelo menos duas ocasiões durante o ensaio (p. ex.: nos dias 3 e 5). A frequência da exposição ao meio fresco dependerá da estabi ­
lidade da substância em estudo; para manter concentrações quase 
constantes de substâncias altamente instáveis ou voláteis, poderá 
ser necessária uma frequência maior. Em certos casos, poderá ser necessário utilizar um procedimento em contínuo (11)(13).
 
A possibilidade de exposição através de aplicação foliar (aspersão) 
não está prevista no presente método de ensaio, para esse método ver 
a referência bibliográfica (14).  
1.7.8.  Condições de incubação  
Deve ser utilizada uma iluminação fluorescente constante com luz 
branca, quente ou fria, de modo a proporcionar às culturas uma 
intensidade luminosa seleccionada na gama dos 85-135 μE·m  –2 ·s –1 , 
medida no comprimento de onda da fotossíntese (400-700 nm) em pontos que se encontrem à mesma distância da fonte luminosa que as 
frondes de  Lemna  (intensidade equivalente a 6 500-10 000 lux). As 
diferenças em relação à intensidade luminosa escolhida não devem ultrapassar, em toda a zona de ensaio, ± 15 %. O método de detec ­
ção e medição da luz e, em particular, o tipo de sensor utilizado, 
afectarão o valor medido. Os sensores esféricos (que respondem à 
luz proveniente de todos os ângulos acima e abaixo do plano de medição) e os sensores «de co-seno» (que respondem à luz prove ­
niente de todos os ângulos acima do plano de medição) são prefe ­
ríveis aos sensores unidireccionais e darão leituras mais elevadas 
para as fontes múltiplas de luz do tipo aqui descrito.
 
A temperatura dos frascos de ensaio deve ser mantida a 24 ± 2 °C. O 
pH do meio de controlo não deve aumentar mais de 1,5 unidades 
durante o ensaio. No entanto, um desvio superior a 1,5 unidades de pH não invalidará o ensaio quando se possa demonstrar que os critérios de validade são cumpridos. Em certos caos, contudo, 
como por exemplo nos ensaios de substâncias instáveis ou de metais, 
poderá ser necessário adoptar cuidados adicionais em relação à va ­
riação de pH. Para mais informações, consultar a referência biblio ­
gráfica (11).
 
1.7.9.  Duração  
O ensaio terminará 7 dias depois de as plantas terem sido trans ­
feridas para os frascos de ensaio.  
1.7.10.  Medições e determinações analíticas  
No início do ensaio, o número de frondes em cada frasco de ensaio 
será registado, com o cuidado de contar todas as frondes evidentes e distintamente visíveis. O número de frondes que apresentam uma aparência normal e anormal deve ser determinado no início do ensaio 
e pelo menos mais uma vez a cada 3 dias durante o período de 
exposição (ou seja, pelo menos duas vezes ao longo dos 7 dias do ensaio) e no final do mesmo. Qualquer alteração observada no de ­
senvolvimento das plantas, por exemplo no que respeita à dimensão 
e aparência das frondes, a indicações de necrose, clorose ou da 
formação de gibas, à desagregação ou perda de flutuabilidade das colónias ou à dimensão e aspecto das raízes, deverá ser registada. As características mais significativas do meio de ensaio (p. ex.: presença 
de materiais em suspensão, crescimento de algas nos frascos de 
ensaio) devem também ser registadas.
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1359
 
Para além da determinação do número de frondes durante o ensaio, 
devem também ser avaliados os efeitos da substância em estudo 
sobre uma (ou mais) das seguintes variáveis de medição:  
i) superfície total das frondes,  
ii) peso seco,  
iii) peso fresco.  
A superfície total das frondes, enquanto variável, tem a vantagem de 
poder ser determinada para cada frasco de ensaio e de controlo no início, durante e no final do ensaio. O peso seco ou fresco deverá ser determinado no início do ensaio a partir de uma amostra da cultura 
de inóculo, representativa do inóculo utilizado para lançar o ensaio, e 
no final do mesmo, com o material retirado das plantas de cada frasco de ensaio e de controlo. Se a superfície das frondes não for medida, o seguimento do peso seco será preferível ao do peso fresco.
 
A superfície total das frondes, o peso seco e o peso fresco podem ser 
determinados do seguinte modo:  
i) Superfície total das frondes: a superfície total das frondes de 
todas as colónias pode ser determinada por análise visual. Uma silhueta do frasco e das plantas de ensaio pode ser filmada com 
uma câmara de vídeo (p. ex.: colocando o frasco numa mesa de 
luz) e digitalizada. A partir de uma calibração utilizando formas planas com uma superfície conhecida, a superfície total das fron ­
des em cada frasco de ensaio pode ser determinada. Deve ter-se 
o cuidado de excluir a interferência causada pela borda do frasco 
de ensaio. Uma abordagem alternativa, mais trabalhosa, será tirar uma fotografia dos frascos e plantas de ensaio, recortando depois a silhueta resultante das colónias e determinando a respectiva 
superfície utilizando um integrador ou papel milimétrico. Outras 
técnicas (p. ex.: a relação entre o peso da superfície de papel equivalente à silhueta das colónias e o peso de uma superfície de papel unitária) poderão igualmente revelar-se apropriadas;
 
ii) Peso seco: todas as colónias de cada frasco de ensaio são reco ­
lhidas e lavadas com água destilada ou desionizada. Retira-se a 
água em excesso e seca-se a 60 °C até obter um peso constante. 
Os fragmentos de raízes que se encontrem presentes também devem ser incluídos. O peso seco deverá ser expresso com uma precisão mínima de 0,1 mg;
 
iii) Peso fresco: as colónias são transferidas para tubos de plástico 
(ou de outro material inerte) de peso conhecido e com pequenos 
orifícios (1 mm) no fundo. Os tubos são depois centrifugados a 
3 000 rpm durante 10 minutos, à temperatura ambiente. Os tubos com as colónias, agora secas, voltam a ser pesados e o peso fresco é calculado por subtracção do peso dos tubos vazios.
 
1.7.10.1.  Frequência das medições e determinações analíticas  
Se se utilizar um método de ensaio estático, o pH de cada frasco de 
ensaio deve ser medido no início e no final do ensaio. No caso dos ensaios semiestáticos, deve ser medido o pH da solução de ensaio 
«fresca», antes da sua utilização, bem como o pH das corresponden ­
tes soluções «usadas».
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1360
 
A intensidade luminosa deve ser medida, na câmara de crescimento, 
incubadora ou sala, em pontos que estejam à mesma distância da 
fonte de luz que as frondes de  Lemna . A medição deverá ser efec ­
tuada pelo menos uma vez durante o ensaio. Deve ser registada diariamente a temperatura do meio contido num frasco especialmente 
destinado para esse efeito e mantido nas mesmas condições na câ ­
mara de crescimento, incubadora ou sala utilizada para o ensaio.
 
Durante o ensaio, as concentrações da substância em estudo deverão 
ser determinadas a intervalos regulares. Nos ensaios estáticos, a exi ­
gência mínima é que as concentrações sejam determinadas no início e no final do ensaio.
 
No caso dos ensaios semiestáticos em que não seja de esperar que a 
concentração da substância em estudo se mantenha no intervalo de ± 20 % da concentração nominal, será necessário analisar todas as 
soluções de ensaio no momento em que sejam preparadas e também 
imediatamente antes da respectiva utilização (ver o terceiro parágrafo do ponto 1.7.7). No entanto, para os ensaios em que a concentração inicial medida da substância em estudo não se encontra no intervalo 
de ± 20 % do valor nominal, mas em que se possam fornecer provas 
suficientes de que as concentrações iniciais são reprodutíveis e está ­
veis (isto é, se mantêm dentro da gama dos 80-120 % das concen ­
trações iniciais), as determinações químicas poderão ser limitadas à 
maior e à menor concentração usadas no ensaio. Em qualquer dos 
casos, a determinação das concentrações da substância em estudo antes da sua utilização só é necessária num dos frascos replicados para cada concentração de ensaio (ou no conteúdo misturado de 
todos os frascos replicados).
 
Nos ensaios em contínuo, poderá ser utilizado um regime de amos ­
tragem semelhante ao descrito para os ensaios semiestáticos, com 
análises no início, no meio e no final do ensaio, sem que seja necessário, nesse caso, medir as concentrações nas soluções «usa ­
das». Nesse tipo de ensaios, a taxa de diluição da mistura do diluente 
ou da solução de reserva com a substância em estudo deverá ser 
verificada diariamente.
 
Se existirem provas de que a concentração da substância de ensaio 
não variou mais de ± 20 %, durante o ensaio, em relação ao valor da concentração nominal ou da concentração inicial medida, a análise dos resultados poderá basear-se nos valores nominais ou iniciais 
medidos. Se a variação em relação à concentração nominal ou à 
concentração inicial medida for superior a ± 20 %, a análise dos resultados deverá basear-se na média geométrica da concentração durante a exposição ou em modelos que descrevam a diminuição 
da concentração da substância em estudo (11).
 
1.7.11.  Ensaio limite  
Em determinadas circunstâncias, ou seja, quando um ensaio prelimi ­
nar indicar que a substância em estudo não apresenta efeitos tóxicos 
em concentrações até aos 100 mgl  –1 ou até ao limite de solubilidade 
da substância no meio de ensaio (conforme a que seja menor), poderá proceder-se a um ensaio limite com comparação das respostas de um grupo de controlo e de um grupo exposto à substância em 
estudo (a uma concentração de 100 mgl
 –1 ou que corresponda ao 
limite de solubilidade da substância no meio de ensaio). É forte ­
mente recomendado que a ausência de toxicidade seja confirmada por análise da concentração de exposição. Todas as condições de 
ensaio e critérios de validade anteriormente descritos são aplicáveis 
aos ensaios limite, com excepção da necessidade de utilizar o dobro do número de replicados dos frascos expostos à substância. O cres ­
cimento dos grupos de controlo e de exposição pode ser analisado 
através de um ensaio estatístico de comparação das médias, como 
por exemplo o teste t-Student.
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1361
 
2. RESULTADOS E RELATÓRIO  
2.1. TEMPO DE DUPLICAÇÃO  
Para determinar o tempo de duplicação (T  d ) do número de frondes e 
verificar se o ensaio cumpre o critério de validade correspondente 
(ponto 1.6), a seguinte fórmula deverá ser aplicada aos dados obtidos 
a partir dos frascos de controlo:  
T d = ln 2/μ 
onde μ é a taxa média de crescimento específico, determinada de 
acordo com o primeiro e segundo parágrafos do ponto 2.2.1.  
2.2. VARIÁVEIS DE RESPOSTA  
O objectivo do ensaio é determinar os efeitos da substância em 
estudo sobre o crescimento vegetativo da  Lemna . O método de en ­
saio descreve duas variáveis de resposta, já que os Estados-Membros 
têm diferentes preferências e necessidades regulamentares. Para que 
os resultados dos ensaios possam ser aceitáveis em todos os Estados- -Membros, os efeitos terão de ser avaliados utilizando ambas as va ­
riáveis de resposta, a) e b), a seguir descritas:
 
a) Taxa média de crescimento específico: esta variável é calculada 
com base no aumento logarítmico do número de frondes e, adi ­
cionalmente, na evolução logarítmica de outro parâmetro de me ­
dição (superfície total das frondes, peso seco ou peso fresco) em função do tempo (por dia), tanto nos frascos de controlo como 
nos grupos tratados com a substância em estudo. É por vezes 
designada por taxa de crescimento relativa (15);
 
b) Rendimento: esta variável de resposta é calculada com base no 
aumento do número de frondes e, adicionalmente, na evolução de outro parâmetro de medição (superfície total das frondes, peso seco ou peso fresco), tanto nos frascos de controlo como nos 
grupos tratados com a substância em estudo, até ao final do 
ensaio.
 
Cabe aqui notar que os valores de toxicidade calculados através 
destas duas variáveis de resposta não são comparáveis e que essa diferença tem de ser reconhecida para efeitos da utilização dos re ­
sultados do ensaio. Os valores de EC
 x baseados na taxa média de 
crescimento específico (E  r C x ) serão geralmente mais elevados do que 
os resultados baseados no rendimento (E  y C x ), se forem seguidas as 
condições de ensaio apresentadas no presente método de ensaio, devido à base matemática das respectivas abordagens. Esse facto 
não deve ser interpretado como uma diferença de sensibilidade entre 
as duas variáveis de resposta, mas simplesmente como uma diferença matemática entre os valores. O conceito de taxa média de cresci ­
mento específico baseia-se no padrão geral de crescimento exponen ­
cial da lentilha-de-água em culturas não sujeitas a limitações, sendo a 
toxicidade estimada com base nos efeitos sobre a taxa de crescimen ­
to, e não depende do valor absoluto da taxa de crescimento especí ­
fico dos controlos, do declive da curva de concentração-resposta ou 
da duração do ensaio. Em contraste, os resultados baseados no ren ­
dimento enquanto variável de resposta são dependentes de todas essas variáveis. O valor de E
 y C x é dependente da taxa de cresci ­
mento específico da espécie de lentilha-de-água utilizada em cada 
ensaio e da taxa máxima de crescimento específico, que pode ser 
diferente para as diferentes espécies ou mesmo para os diferentes clones. Esta variável de resposta não deve ser utilizada para compa ­
rar a sensibilidade das diferentes espécies ou mesmo dos diferentes 
clones de lentilha-de-água aos produtos tóxicos. Embora seja prefe ­
rível, do ponto de vista científico, utilizar a taxa média de cresci ­
mento específico para a estimação da toxicidade, as estimativas da toxicidade com base no rendimento foram também incluídas no pre ­
sente método de ensaio para satisfazer as actuais exigências regula ­
mentares de alguns países.
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1362
 
As estimativas da toxicidade deverão ser baseadas no número de 
frondes e numa variável de medição adicional (superfície total das 
frondes, peso seco ou peso fresco), já que certas substâncias poderão afectar outras variáveis de medição de forma muito mais severa do que o número de frondes. Esse efeito passará despercebido se o 
cálculo se basear exclusivamente no número de frondes.
 
O número de frondes, bem como o valor de qualquer outra variável 
de resposta medida, como a superfície total das frondes, o peso seco ou o peso fresco, será registado numa tabela, juntamente com as 
concentrações da substância em estudo em cada momento de medi ­
ção. A subsequente análise dos dados, por exemplo para determina ­
ção do LOEC, do NOEC ou dos EC
 x , deverá basear-se nos valores 
obtidos para cada replicado e não em médias calculadas para cada 
grupo exposto à substância em estudo.  
2.2.1.  Taxa média de crescimento específico  
A taxa média de crescimento específico durante um determinado 
período é calculada como o aumento logarítmico das variáveis de 
crescimento — número de frondes e outra variável de medição (su ­
perfície total das frondes, peso seco ou peso fresco) — aplicando a fórmula a seguir apresentada aos valores obtidos para cada replicado dos controlos e dos frascos expostos à substância em estudo.
 
μ iÄj ¼ lnðN j Þ – lnðN i Þ 
t 
onde: 
— μ i-j : taxa média de crescimento específico entre o momento i e 
o momento j  
— N  i : variável de medição no frasco de ensaio ou de controlo no 
momento i  
— N  j : variável de medição no frasco de ensaio ou de controlo no 
momento j  
— t: período decorrido entre i e j  
Para cada um dos grupos de exposição e de controlo, calcular um 
valor médio da taxa de crescimento, associado às respectivas esti ­
mativas da variância.  
A taxa média de crescimento específico deve ser calculada para a 
totalidade do período de ensaio (na fórmula acima, «i» é o momento inicial e «j» o momento final do ensaio). Para cada uma das concen ­
trações de ensaio e de controlo, calcular o valor médio da taxa média 
de crescimento específico, associado às respectivas estimativas da variância. Por outro lado, a taxa de crescimento em cada secção do ensaio deve ser avaliada para verificar os efeitos da substância 
em estudo durante o período de exposição (p. ex.: através da análise 
das curvas de crescimento após transformação logarítmica). A exis ­
tência de diferenças substanciais entre as taxas de crescimento de cada secção do ensaio e a taxa média de crescimento indica um 
desvio em relação à situação de crescimento exponencial constante, 
exigindo portanto uma análise mais pormenorizada das curvas de crescimento. Nesses casos, a abordagem mais cautelosa passa pela comparação entre as taxas de crescimento específico das culturas 
expostas durante o período de máxima inibição e as taxas observadas 
nos controlos durante o mesmo período.
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1363
 
A percentagem de inibição da taxa de crescimento (I  r ) poderá então 
ser calculada para cada concentração de ensaio (grupos expostos), de 
acordo com a seguinte fórmula:  
% I r ¼ ðμ C – μ T Þ 
μ C Ü 100  
onde:  
— % I  r : percentagem de inibição da taxa média de crescimento 
específico  
— μ C : valor médio de μ nos controlos  
— μ T : valor médio de μ no grupo exposto  
2.2.2.  Rendimento  
Os efeitos sobre o rendimento são determinados com base em duas 
variáveis de medição, o número de frondes e outra variável (super ­
fície total das frondes, peso seco ou peso fresco), para cada frasco de 
ensaio, no início e no final do mesmo. No que respeita ao peso seco e ao peso fresco, a biomassa de partida é determinada com base numa amostra das frondes retirada da cultura utilizada para inocular 
os frascos de ensaio (ver o segundo parágrafo do ponto 1.7.3). Para 
cada uma das concentrações de ensaio e para os controlos, calcular um valor médio de rendimento, associado às respectivas estimativas da variância. A percentagem média de inibição do rendimento (% I
 y ) 
pode ser calculada, para cada grupo exposto, do seguinte modo:  
% I y ¼ ðb C – b T Þ 
b C Ü 100  
onde:  
— % I  y : percentagem de redução do rendimento  
— b  C : biomassa final menos biomassa inicial do grupo de con ­
trolo  
— b  T : biomassa final menos biomassa inicial do grupo exposto  
2.2.3.  Representação gráfica da curva de concentração-resposta  
Devem ser representadas as curvas de concentração-resposta, que 
relacionam a percentagem média de inibição da variável de resposta 
(I r , ou I  y , calculadas como se indica no último parágrafo do ponto 
2.2.1 ou no ponto 2.2.2) com o logaritmo da concentração da subs ­
tância em estudo.  
2.2.4.  Estimação do EC  x 
As estimativas do EC  x (p. ex.: EC  50 ) devem ser baseadas tanto na 
taxa média de crescimento específico (E  r C x ) como no rendimento 
(E y C x ), devendo cada uma dessas medidas ser, por seu lado, baseada 
no número de frondes e numa variável de medição adicional (super ­
fície total das frondes, peso seco ou peso fresco), já que certas 
substâncias afectam de forma diferente o número de frondes e outras 
variáveis de medição. Os parâmetros de toxicidade pretendidos são, portanto, quatro valores de EC
 x para cada um dos níveis de inibição 
x calculados: E  r C x (número de frondes); E  r C x (superfície total das 
frondes, peso seco ou peso fresco); E  y C x (número de frondes); e 
E y C x (superfície total das frondes, peso seco ou peso fresco).  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1364
 
2.3. PROCEDIMENTOS ESTATÍSTICOS  
O objectivo é descrever de forma quantitativa, por análise de regres ­
são, a relação concentração-resposta. Pode utilizar-se uma regressão linear ponderada, antecedida de uma transformação de linearização 
dos dados de resposta — por exemplo para unidades  probit , logit  ou 
de Weibull (16) –, mas a técnica preferida é a aplicação de proce ­
dimentos de regressão não linear, que permitem lidar melhor com as inevitáveis irregularidades dos dados e com os desvios em relação a 
uma boa distribuição. Nas zonas próximas da inibição nula ou total, 
essas irregularidades podem mesmo ser aumentadas pela transforma ­
ção, o que irá interferir com a análise (16). Cabe aqui notar que os 
métodos padrão de análise que utilizam os transformados  probit , 
logit ou de Weibull se destinam à análise de dados quantais (p. 
ex.: mortalidade ou sobrevivência), pelo que terão de ser alterados para lidar com os dados relativos à taxa de crescimento ou ao ren ­
dimento. Alguns métodos para a determinação dos valores de EC
 x a 
partir de dados contínuos podem ser consultados em (17), (18) e (19).
 
Para cada uma das variáveis de resposta em análise, utilizar a relação 
concentração-resposta para estimar os valores pontuais de EC  x . Sem­
pre que possível, deverão ser determinados os limites de confiança a 
95 % para cada estimativa. A adequação do ajustamento da curva 
estimada pelo modelo de regressão aos dados de resposta deve ser avaliada, graficamente ou por métodos estatísticos. A análise de regressão deve ser efectuada utilizando os valores de cada replicado 
e não o valor médio para cada grupo exposto.
 
As estimativas do EC  50 e os respectivos intervalos de confiança 
podem também ser obtidos utilizando uma interpolação linear com  
bootstrapping  (20), quando os métodos/modelos de regressão dispo ­
níveis não forem aplicáveis aos dados existentes.  
Para a estimação do LOEC e, portanto, do NOEC, será necessário 
comparar as médias dos frascos expostos utilizando técnicas de aná ­
lise da variância (ANOVA). A média para cada concentração deve 
então ser comparada com a média observada nos controlos, utili ­
zando um método apropriado de comparação múltipla ou de análise das tendências. Os testes de Dunnett ou de Williams (21)(22)(23)(24) poderão ser úteis para esse efeito. É necessário verificar se o pres ­
suposto de homogeneidade da variância das análises ANOVA é 
cumprido. Essa verificação poderá ser realizada graficamente ou através de um teste formal (25). Para tal, podem utilizar-se os testes de Levene ou de Bartlett. O problema do não cumprimento do 
pressuposto de homogeneidade das variâncias pode por vezes ser 
corrigido através da transformação logarítmica dos dados. Caso a heterogeneidade das variâncias seja extrema e não possa ser corrigida por transformação, deverá ser considerada a possibilidade de utiliza ­
ção de métodos de análise das tendências como, por exemplo, o 
método degressivo de Jonkheere. Para mais orientações sobre a de ­
terminação do NOEC, consultar a referência (19).
 
Os mais recentes desenvolvimentos científicos conduziram à recomen ­
dação de que fosse abandonado o conceito de NOEC, que deverá ser substituído pela estimação dos valores de EC
 x por regressão. No caso 
do presente ensaio com  Lemna , não foi definido nenhum valor ideal 
para o x. No entanto, a gama entre 10-20 % parece ser apropriada (dependendo da variável de resposta escolhida), devendo ser comuni ­
cados, de preferência, tanto os valores de EC
 10 como de EC  20 . 
3. RELATÓRIOS  
3.1. RELATÓRIO DO ENSAIO  
O relatório do ensaio deve incluir a seguinte informação:  
Substância de ensaio:  
— natureza física e propriedades físico-químicas, incluindo o limite 
de hidrossolubilidade,  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1365
 
— dados de identificação química (p. ex.: Número CAS), incluindo 
a respectiva pureza.  
Espécie de ensaio:  
— nome científico, clone (se for conhecido) e fonte.  
Condições de ensaio:  
— procedimento de ensaio utilizado (estático, semiestático ou con ­
tínuo),  
— data de início do ensaio e respectiva duração,  
— meio de ensaio,  
— descrição do método experimental: frascos e tampas utilizados no 
ensaio, volumes das soluções, número de colónias e de frondes 
em cada frasco de ensaio, no início do mesmo,  
— concentrações de ensaio (nominais ou medidas, conforme apro ­
priado) e número de replicados por concentração,  
— métodos de preparação das soluções de reserva e de ensaio, 
incluindo a eventual utilização de solventes ou dispersantes,  
— temperatura durante o ensaio,  
— fonte luminosa, intensidade e homogeneidade da luz,  
— valores de pH dos meios de controlo e de ensaio,  
— concentrações da substância em estudo e respectivo método de 
análise, juntamente com os dados apropriados para a avaliação da qualidade do método (estudos de validação, desvios-padrão ou limites de confiança das análises),
 
— métodos utilizados para a determinação do número de frondes ou 
de outras variáveis de medição, como o peso seco, o peso fresco ou a superfície das frondes,
 
— todos os desvios em relação ao presente método de ensaio.  
Resultados:  
— dados brutos: número de frondes e outras variáveis de medição 
em cada frasco de ensaio e de controlo, para cada momento de amostragem, e momento de realização da análise,
 
— médias e desvios-padrão para cada variável de medição,  
— curvas de crescimento para cada concentração (recomenda-se a 
transformação logarítmica da variável de medição, ver o segundo parágrafo do ponto 2.2.1,
 
— tempo de duplicação/taxa de crescimento dos controlos, com 
base no número de frondes,  
— variáveis de resposta calculadas para cada replicado exposto, com 
os respectivos valores médios, e coeficiente de variação dos replicados,
 
— representação gráfica da relação concentração/efeito,  
— estimativas dos pontos finais de toxicidade para as variáveis de 
resposta, p. ex.: EC  50 , EC  10 , EC  20 , e os intervalos de confiança 
associados. Quando forem calculados, valores do LOEC e/ou do 
NOEC e métodos estatísticos utilizados para a respectiva deter ­
minação,  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1366
 
— caso tenha sido utilizada uma análise ANOVA, limite de detec ­
ção do efeito (p. ex.: diferenças menos significativas),  
— ocorrência de estimulação do crescimento que tenha sido verifi ­
cada em qualquer dos grupos expostos,  
— sinais visuais de fitotoxicidade, bem como quaisquer observações 
em relação às soluções de ensaio,  
— discussão dos resultados, incluindo qualquer influência sobre os 
resultado do ensaio que seja decorrente das alterações efectuadas em relação ao presente método de ensaio.
 
4. BIBLIOGRAFIA  
(1) OECD TG 221 (2006) Lemna spp. Growth Inhibition Test  
(2) Recurso a estudos com  Lemna  para substâncias coradas é des ­
crito na secção 13.5.3 do  EU Manual of Decisions , de Julho de 
2006, disponível no endereço: http://ecb.jrc.ec.europa.eu/ 
new-chemicals  
(3) Guidance on information requirements and chemical safety as ­
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with a zero dose control. Biometrics, 28: 510-531  
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Apêndice 1  
Descrição de  Lemna  spp.  
A planta aquática que tem o nome comum de lentilha-de-água,  Lemna  spp., pertence à 
Família  Lemnaceae , composta por quatro Géneros com espécies distribuídas por todo 
o mundo. As suas diferentes formas e taxonomia já se encontram descritas de forma 
exaustiva (1)(2). A  Lemna gibba  e a Lemna minor  são espécies representativas das 
zonas temperadas, muito utilizadas em ensaios de toxicidade. Ambas as espécies apresentam um caule discóide (fronde), flutuante ou submerso, e uma raiz muito fina que parte do centro da face inferior de cada fronde. As  Lemna  spp. raramente 
produzem flores, sendo a reprodução garantida pela produção vegetativa de novas 
frondes (3). Em comparação com as plantas mais velhas, as plantas jovens tendem a ser mais claras, com raízes mais curtas e são constituídas por duas ou três frondes de tamanhos diferentes. O pequeno tamanho, a estrutura simples, a reprodução asse ­
xuada e o tempo de duplicação curto das  Lemna  fazem com que estas plantas sejam 
muito utilizadas em ensaios de laboratório (4)(5).
 
Devido a variações de sensibilidade, provavelmente interespecíficas, só são vá ­
lidas as comparações de sensibilidade para uma mesma espécie.  
Exemplos de espécies de  Lemna  que já foram utilizadas em ensaios labora ­
toriais: referências das espécies  
Lemna aequinoctialis : Eklund, B. (1996). The use of the red alga  Ceramium 
strictum  and the duckweed  Lemna aequinoctialis  in aquatic ecotoxicological 
bioassays. Licentiate in Philosophy Thesis 1996:2. Dep. of Systems Ecology, 
Stockholm University.  
Lemna major : Clark, N. A. (1925). The rate of reproduction of  Lemna major  as a 
function of intensity and duration of light. J. phys. Chem., 29: 935-941.  
Lemna minor : United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). 
OPPTS 850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., «Public draft». 
EPA 712-C-96-156. 8 pp.  
Association Française de Normalisation (AFNOR). (1996). XP T 90-337: Déter ­
mination de l’inhibition de la croissance de  Lemna minor . 10 pp.  
Swedish Standards Institute (SIS). (1995). Water quality — Determination of 
growth inhibition (7-d)  Lemna minor , duckweed. SS 02 82 13. 15 pp. (em 
sueco).  
Lemna gibba : ASTM International. (2003). Standard Guide for Conducting Static 
Toxicity Test With  Lemna gibba  G3. E 1415-91 (Reapproved 1998). 
pp. 733-742.  
United States Environmental Protection Agency (USEPA). (1996). OPPTS 
850.4400 Aquatic Plant Toxicity Test Using  Lemna  spp., «Public draft». EPA 
712-C-96-156. 8 pp.  
Lemna paucicostata : Nasu, Y., Kugimoto, M. (1981).  Lemna  (duckweed) as an 
indicator of water pollution. I. The sensitivity of  Lemna paucicostata  to heavy 
metals. Arch. Environ. Contam. Toxicol., 10:1959-1969.  
Lemna perpusilla : Clark, J. R. et al. (1981). Accumulation and depuration of 
metals by duckweed ( Lemna perpusilla ). Ecotoxicol. Environ. Saf., 5:87-96.  
Lemna trisulca : Huebert, D. B., Shay, J. M. (1993). Considerations in the asses ­
sment of toxicity using duckweeds. Environ. Toxicol. and Chem., 12:481-483.  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1369
 
Lemna valdiviana : Hutchinson, T.C., Czyrska, H. (1975). Heavy metal toxicity 
and synergism to floating aquatic weeds. Verh.-Int. Ver. Limnol., 19:2102-2111.  
Fontes para obtenção de plantas de  Lemna  
University of Toronto Culture Collection of Algae and Cyanobacteria  
Department of Botany, University of Toronto  
Toronto, Ontario, CANADÁ, M5S 3 B2  
Tel: +1-416-978-3641  
Fax:+1-416-978-5878  
e-mail: jacreman@botany.utoronto.ca  
http://www.botany.utoronto.ca/utcc  
North Carolina State University  
Forestry Dept  
Duckweed Culture Collection  
Campus Box 8002  
Raleigh, NC 27695-8002  
EUA  
phone 001 (919) 515-7572  
astomp@unity.ncsu.edu  
Institute of Applied Environmental Research (ITM) Stockholm University  
SE-106 91 STOCKHOLM  
SUÉCIA  
Tel: +46 8 674 7240  
Fax +46 8 674 7636  
Federal Environmental Agency (UBA)  
FG III 3.4  
Schichauweg 58  
12307 Berlin  
ALEMANHA  
e-mail: lemna@uba.de  
http://www.umweltbundesamt.de/contact.htm  
Bibliografia  
(1) Hillman, W.S. (1961). The  Lemnaceae  or duckweeds: A review of the des ­
criptive and experimental literature. The Botanical Review, 27:221-287  
(2) Landolt, E. (1986). Biosystematic investigations in the family of duckweed 
(Lemnaceae ). Vol. 2. Geobotanischen Inst. ETH, Stiftung Rubel, Zürich, 
Switzerland  
(3) Björndahl, G. (1982). Growth performance, nutrient uptake and human uti ­
lization of duckweeds ( Lemnaceae  family). ISBN 82-991150-0-0. The Agri ­
cultural Research Council of Norway, University of Oslo  
(4) Wang, W. (1986). Toxicity tests of aquatic pollutants by using common 
duckweed. Environmental Pollution, Ser B, 11:1-14  
(5) Wang, W. (1990). Literature review on duckweed toxicity testing. Environ ­
mental Research, 52:7-22  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1370
 
Apêndice 2  
Conservação das culturas de reserva  
As culturas de reserva podem ser conservadas a baixa temperatura (4-10 °C) por 
longos períodos, sem que seja necessário proceder à sua transferência periódica. O meio de crescimento da  Lemna  pode ser o mesmo que é utilizado para os 
ensaios, mas as culturas de reserva também podem ser conservadas noutros 
meios nutrientes enriquecidos.
 
Periodicamente, um certo número de plantas jovens, verdes claras, são removidas 
e novamente cultivadas, através de uma técnica asséptica, em frascos com meio 
fresco. Nas condições de baixa temperatura aqui sugeridas, a transferência das 
culturas pode ser realizada a intervalos que poderão ir até aos três meses.  
Devem utilizar-se frascos de cultura quimicamente limpos (lavados com ácido) e 
estéreis e técnicas de manuseamento em condições de assepsia. Caso se verifique 
uma contaminação da cultura de reserve, por exemplo por outras algas ou por um 
fungo, será necessário adoptar medidas para eliminar os organismos contaminan ­
tes. No caso das algas e da maior parte dos restantes organismos contaminantes, isso será possível por esterilização superficial. Retira-se uma amostra da planta 
contaminada e cortam-se as raízes. O material é depois vigorosamente agitado em 
água limpa, sendo depois mergulhado numa solução a 0,5 % (v/v) de hipoclorito de sódio durante um período de 30 segundos a 5 minutos. O material vegetal é depois lavado com água esterilizada e transferido para uma série de frascos de 
cultura com meio de crescimento fresco. Muitas frondes acabarão por morrer 
como resultado deste tratamento, principalmente quando os períodos de exposi ­
ção utilizados forem mais longos, mas algumas delas sobreviverão e ficarão normalmente isentas de qualquer contaminação. As frondes sobreviventes podem 
ser utilizadas para reinocular novas culturas.
 ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1371
 
Apêndice 3  
Meios  
Existem diversos meios de crescimento recomendados para  L. minor  e L. gibba . 
Para a  L. minor , o meio recomendado é o meio Swedish Standard (SIS) modi ­
ficado, enquanto que para  L. gibba  o meio recomendado é o meio 20X AAP. A 
composição de ambos os meios é apresentada a seguir. Para a preparação destes 
meios, devem utilizar-se reagentes e produtos químicos de qualidade analítica e água desionizada.
 
Meio de crescimento Swedish Standard (SIS) para  Lemna  
— As soluções de reserva I-V são esterilizadas em autoclave (120 °C, 
15 minutos) ou por filtração através de membrana (aproximadamente 
0,2 μm de diâmetro de poro),  
— As soluções VI e (opcionalmente) VII são esterilizadas exclusivamente por 
filtração através de membrana; estas soluções não devem ser esterilizadas em autoclave,
 
— As soluções de reserva esterilizadas devem ser armazenadas em local fresco e 
ao abrigo da luz. As soluções I-V devem ser descartadas ao fim de seis meses, enquanto que a solução VI (e, opcionalmente, também a VII) têm 
um período de conservação de um mês,
 
N. o da solução 
de reserva Substância Concentração na 
solução de reserva 
(g· l  –1 ) Concentração no 
meio preparado 
(g· l  –1 ) Meio preparado 
Elemento Concentração 
(mg·l  –1 ) 
I NaNO  3 
KH  2 PO4 8,50 
1,34 85 
13,4 Na; N 
K; P 32; 14 
6,0; 2,4 
II MgSO  4 · 7H  2 O 15 75 Mg; S 7,4; 9,8 
III CaCl  2 · 2H  2 O 7,2 36 Ca; Cl 9,8; 17,5 
IV Na 2 CO 3 4,0 20 C 2,3 
V H 3 BO 3 
MnCl  2 .4H  2 O 
Na 2 MoO  4 .2H  2 O 
ZnSO  4 .7H  2 O 
CuSO  4 .5H  2 O 
Co(NO  3 ) 2 .6H  2 O 1,0 
0,20 0,010 
0,050 
0,0050 0,010 1,00 
0,20 0,010 
0,050 
0,0050 0,010 B 
Mn Mo 
Zn 
Cu Co 0,17 
0,056 0,0040 
0,011 
0,0013 0,0020 
VI FeCl
 3 .6H  2 O 
Na 2 -EDTA·2H  2 O 0,17 
0,28 0,84 
1,4 Fe 
— 0,17 
— 
VII MOPS (tampão) 490 490 — —  
— Para preparar um litro de meio SIS, adicionar os seguintes elementos a 
900 ml de água desionizada:  
— 10 ml da solução de reserva I,  
— 5 ml da solução de reserva II,  
— 5 ml da solução de reserva III,  
— 5 ml da solução de reserva IV,  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1372
 
— 1 ml da solução de reserva V,  
— 5 ml da solução de reserva VI,  
— 1 ml da solução de reserva VII (opcional),  
Nota:  A solução de reserva VII (tampão MOPS) poderá ser necessária para o estudo de 
determinadas substâncias (ver o último parágrafo do ponto 1.4).  
— Ajustar o pH a 6,5 ± 0,2 com HCl ou NaOH 0,1 N ou 1,0 N, completando o 
volume até 1 l com água desionizada.  
Meio de crescimento 20X–AAP  
As soluções de reserva são preparadas com água esterilizada ou desionizada.  
As soluções de reserva esterilizadas devem ser armazenadas em local fresco e ao 
abrigo da luz. Nessas condições, terão um tempo de conservação mínimo de 6-8 semanas.
 
Para o meio 20X–AAP, prepara-se cinco soluções de reserva de nutrientes (A1, 
A2, A3, B e C), utilizando produtos químicos de qualidade analítica. Para pro ­
duzir o meio de crescimento, adicionar 20 ml de cada solução de reserva de 
nutrientes a cerca de 850 ml de água desionizada. Ajustar o pH a 7,5 ± 0,1 com HCl ou NaOH 0,1 N ou 1,0 N, completando o volume até 1 l com água desionizada. Filtrar o meio assim obtido por uma membrana com diâmetro de 
poro de (aproximadamente) 0,2 μm para um recipiente esterilizado.
 
O meio de crescimento para os ensaios deve ser preparado com 1-2 dias de 
antecedência, de modo a permitir a estabilização do pH. O pH do meio de crescimento deve ser verificado antes da sua utilização e, se necessário, reajus ­
tado com HCl ou NaOH 0,1 N ou 1,0 N, como se descreve acima.
 
N. o da solução 
de reserva Substância Concentração na 
solução de reserva 
(g·l –1 ) (*) Concentração no 
meio preparado 
(g·l –1 ) (*) Meio preparado 
Elemento Concentração 
(mg·l  –1 ) (*) 
A1 NaNO  3 
MgCl  2 ·6H  2 O 
CaCl  2 .2H  2 O 26 
12 4,4 510 
240 90 Na; N 
Mg Ca 190; 84 
58,08 24,04 
A2 MgSO
 4 .7H  2 O 15 290 S 38,22 
A3 K 2 HPO  4 ·3H  2 O 1,4 30 K; P 9,4;3,7 
B H 3 BO 3 
MnCl  2 .4H  2 O 
FeCl  3 .6H  2 O 
Na 2 EDTA·2H  2 O 
ZnCl  2 
CoCl  2 ·6H  2 O 
Na 2 MoO  4 .2H  2 O 
CuCl  2 ·2H  2 O 0,19 
0,42 0,16 
0,30 
3,3 mg·l
 –1 
1,4 mg·l  –1 
7,3 mg·l  –1 
0,012 mg·l  –1 3,7 
8,3 3,2 
6,0 
66 μg·l
 –1 
29 μg·l –1 
145 μg·l –1 
0,24 μg·l –1 B 
Mn Fe 
— 
Zn Co 
Mo 
Cu 0,65 
2,3 0,66 
— 
31 μg·l
 –1 
7,1 μg·l –1 
58 μg·l –1 
0,080 μg·l –1 
C NaHCO  3 15 300 Na; C 220; 43  
(*) Excepto nos casos assinalados  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1373
 
Nota: A concentração final teoricamente ideal de bicarbonato (que evita qualquer variação 
significativa do pH) é de 15 mg/l e não de 300 mg/l. No entanto, a utilização habitual 
do meio 20X–AAP, nomeadamente no ensaio de anel para o presente método, baseia- -se numa concentração de 300 mg/l [I. Sims, P. Whitehouse e R. Lacey. (1999)]. The OECD  Lemna  Growth Inhibition Test. Development and Ring-testing of draft OECD 
Test Guideline. R&D Technical Report EMA 003. WRc plc — Environment Agency.
 
Meio de STEINBERG (derivado do método ISO 20079)  
Concentrações e soluções de reserva  
— O meio de Steinberg modificado é utilizado no método ISSO 20079 apenas 
para a  Lemna minor  (já que o método só utiliza essa espécie) mas o ensaio 
mostrou bons resultados também com  Lemna gibba . 
— Para a preparação do meio, deve utilizar-se reagentes e produtos químicos de 
qualidade analítica e água desionizada.  
— Preparar o meio nutriente a partir das soluções de reserva ou do meio 10 
vezes mais concentrado, que é a máxima concentração que se pode obter sem que ocorra precipitação.
 
Quadro 1  
Meio de Steinberg com pH estabilizado (modificado segundo Altenburger)  
Substância Meio nutriente  
Macroelementos  peso molecular mg/l mmol/l  
KNO  3 101,12 350,00 3,46 
Ca(NO  3 ) 2 .4H  2 O 236,15 295,00 1,25 
KH  2 PO 4 136,09 90,00 0,66 
K 2 HPO  4 174,18 12,60 0,072 
MgSO  4 .7H  2 O 246,37 100,00 0,41  
Microelementos  peso molecular μg/l μmol/l 
H 3 BO 3 61,83 120,00 1,94 
ZnSO  4 .7H  2 O 287,43 180,00 0,63 
Na 2 MoO  4 .2H  2 O 241,92 44,00 0,18 
MnCl  2 .4H  2 O 197,84 180,00 0,91 
FeCl  3 .6H  2 O 270,21 760,00 2,81 
EDTA disódico bi-hidratado 372,24 1 500,00 4,03  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1374
 
Quadro 2  
Soluções de reserva (Macroelementos)  
1. Macroelementos (50 vezes mais concentrados)  g/l  
Solução de reserva 1:  
KNO  3 17,50 
KH  2 PO 4 4,5 
K 2 HPO  4 0,63 
Solução de reserva 2:  
MgSO  4 .7H  2 O 5,00  
Solução de reserva 3:  
Ca(NO  3 ) 2 .4H  2 O 14,75  
Quadro 3  
Soluções de reserva (Microelementos)  
2. Microelementos (1 000 vezes mais concentrados)  mg/l  
Solução de reserva 4:  
H 3 BO 3 120,0  
Solução de reserva 5:  
ZnSO  4 .7H  2 O 180,0  
Solução de reserva 6:  
Na 2 MoO  4 .2H  2 O 44,0  
Solução de reserva 7:  
MnCl  2 .4H  2 O 180,0  
Solução de reserva 8:  
FeCl  3 .6H  2 O 760,00 
EDTA dissódico bi-hidratado 1 500,00  
— As soluções de reserva 2 e 3 e, em separado, 4 a 7, podem ser misturadas 
(tomando em conta as concentrações pretendidas).  
— Para aumentar o período de conservação, tratar as soluções em autoclave a 
121 °C durante 20 min ou, em alternativa, esterilizar por filtração através de 
membrana (0,2 μm). Para a solução de reserva 8, é fortemente recomendada a 
esterilização por filtração (0,2 μm). 
Preparação da concentração final do meio de STEINBERG (modificado)  
— Juntar 20 ml das soluções de reserva 1, 2 e 3 (ver o quadro 2) a cerca de 
900 ml de água desionizada, para evitar a precipitação.  
— Juntar 1,0 ml das soluções de reserva 4, 5, 6, 7 e 8 (ver o quadro 3).  
— O pH deverá ser de 5,5 ± 0,2 (ajustar por adição de um volume tão pequeno 
quanto possível de solução de NaOH ou de HCl).  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1375
 
— Completar com água até 1 000 ml.  
— Se as soluções de reserva tiverem sido esterilizadas e se se utilizar uma água 
apropriada, não é necessário proceder a mais nenhuma esterilização. Se o meio final for esterilizado, a solução de reserva 8 deve ser acrescentada depois do tratamento em autoclave (a 121 °C durante 20 min).
 
Preparação do meio de STEINBERG (modificado) 10 vezes concentrado, 
para armazenamento temporário  
— Juntar 20 ml das soluções de reserva 1, 2 e 3 (ver o quadro 2) a cerca de 
30 ml de água para evitar a precipitação.  
— Juntar 1,0 ml das soluções de reserva 4, 5, 6, 7 e 8 (ver o quadro 3). 
Completar com água até 100 ml.  
— Se as soluções de reserva tiverem sido esterilizadas e se utilizar uma água 
apropriada, não é necessário proceder a mais nenhuma esterilização. Se o 
meio final for esterilizado, a solução de reserva 8 deve ser acrescentada 
depois do tratamento em autoclave (a 121 °C durante 20 min).  
— O pH do meio (concentração final) deverá ser de 5,5 ± 0,2.  ▼M1 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1376
 
C.27.  ENSAIO DE TOXICIDADE EM QUIRONOMÍDEOS NUM 
SISTEMA SEDIMENTOS-ÁGUA COM SEDIMENTOS ENRIQUECIDOS  
INTRODUÇÃO  
1. O presente método de ensaio é equivalente ao  Test Guideline  TG 218 da 
OCDE (2004). Foi concebido para avaliar os efeitos nas larvas dos dípteros 
de água doce  Chironomus  sp., que vivem nos sedimentos, de uma exposição 
prolongada a determinados produtos químicos. Baseia-se nos atuais proto ­
colos de ensaios de toxicidade para as espécies  Chironomus riparius  e 
Chironomus tentans  que foram desenvolvidos na Europa (1)(2)(3) e na 
América do Norte (4)(5)(6)(7)(8) e foram sujeitos a um ensaio interlabora ­
torial (1)(6)(9). Pode também utilizar-se outras espécies de quironomídeos bem documentadas, como a  Chironomus yoshimatsui  (10)(11).
 
2. O cenário de exposição utilizado neste método de ensaio passa pelo enri ­
quecimento dos sedimentos na substância em estudo. A seleção do cenário de exposição adequado depende da finalidade do ensaio. A adição da subs ­
tância em estudo aos sedimentos tem por objetivo simular a acumulação de 
produtos químicos persistentes nos sedimentos. Este sistema de exposição 
utiliza um sistema de ensaio sedimentos-água no qual os sedimentos foram enriquecidos no produto químico em estudo.
 
3. As substâncias a ensaiar com organismos que vivem nos sedimentos persis ­
tem, em geral, neste compartimento durante longos períodos. A exposição dos referidos organismos pode ter lugar por várias vias. A importância relativa de cada via de exposição, bem como o tempo de contribuição de 
cada uma delas para os efeitos tóxicos globais, depende das propriedades 
físico-químicas do produto químico em causa. No caso de substâncias for ­
temente adsorventes (por exemplo, com log K
 ow > 5) ou de substâncias 
ligadas aos sedimentos por ligações covalentes, a ingestão de alimentos 
contaminados pode constituir uma via de exposição significativa. Para não 
subestimar a toxicidade das substâncias altamente lipófilas, pode ponderar-se a utilização de alimentos adicionados aos sedimentos antes da aplicação da substância em estudo. De forma a ter em conta todas as vias de exposição 
potenciais, o presente método de ensaio focaliza-se na exposição a longo 
prazo. A duração do ensaio é de 20 a 28 dias para  C. riparius  e C. 
yoshimatsui  e de 28 a 65 dias para  C. tentans . Se forem necessários dados 
a curto prazo para uma finalidade específica (por exemplo, para investigar 
os efeitos de um produto químico), é possível utilizar replicados adicionais, 
a remover após dez dias.
 
4. Os parâmetros medidos são o número total de indivíduos adultos emergidos 
e o tempo necessário para tal. Se forem necessários dados adicionais a curto 
prazo, recomenda-se que as determinações da sobrevivência e do cresci ­
mento das larvas apenas sejam efetuadas após um período de dez dias, recorrendo aos replicados adicionais que se justifiquem.
 
5. Recomenda-se a utilização de sedimentos formulados. Estes apresentam 
várias vantagens relativamente aos sedimentos naturais:  
— a variabilidade experimental é reduzida porque os sedimentos constituem 
uma matriz "normalizada" reprodutível, eliminando-se a necessidade de encontrar fontes de sedimentos limpos e não contaminados,
 
— os ensaios podem ser iniciados em qualquer momento, eliminando-se 
assim a variabilidade sazonal dos sedimentos ensaiados, não havendo necessidade de pré-tratar os sedimentos para remover a fauna indígena; a utilização de sedimentos formulados reduz também o custo associado à 
colheita no terreno de quantidades suficientes de sedimentos para os 
ensaios de rotina,
 
— a utilização de sedimentos formulados permite ainda efetuar compara ­
ções de toxicidade e classificar as substâncias em conformidade.  
6. Definem-se no apêndice 1 alguns conceitos utilizados.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1377
 
PRINCÍPIO DO MÉTODO  
7. São expostas larvas de quironomídeos do primeiro estádio larvar a uma 
gama de concentrações do produto químico em estudo em sistemas sedimentos-água. Os sedimentos são enriquecidos na substância em estudo, 
sendo as larvas do primeiro estádio larvar subsequentemente introduzidas 
em copos de ensaio nos quais as concentrações de sedimentos e da água foram estabilizadas. A emergência de quironomídeos e as respetivas taxas de desenvolvimento são medidas no final do ensaio. Se necessário, a sobrevi ­
vência e o peso das larvas podem também ser determinados decorridos 10 
dias, utilizando os replicados adicionais que se justifiquem. Os dados são analisados por recurso a um modelo de regressão, de forma a estimar a 
concentração que causaria uma redução de x% na emergência, na sobrevi ­
vência ou no crescimento das larvas (por exemplo, CE
 15 , CE  50 , etc.), ou 
utilizando hipóteses estatísticas, para determinar o NOEC/LOEC. Este úl ­
timo método exige a comparação de valores que produzem efeitos com 
valores de controlo, por recurso a testes estatísticos.  
INFORMAÇÕES SOBRE A SUBSTÂNCIA EM ESTUDO  
8. Devem ser conhecidas a solubilidade em água e a pressão de vapor da 
substância em estudo, bem como a partição nos sedimentos medida ou 
calculada e a estabilidade na água e nos sedimentos. Para a quantificação 
da substância em estudo na água sobrenadante, na água dos poros e nos sedimentos, deve dispor-se de um método analítico fiável, com exatidão e limite de deteção conhecidos e documentados. A fórmula estrutural e o grau 
de pureza da substância constituem igualmente informações úteis. O com ­
portamento químico da substância em estudo (p. ex.: dissipação, degradação abiótica ou biótica, etc.) é também uma informação importante. Para mais orientações sobre o ensaio de substâncias cujas propriedades físico-químicas 
dificultam a realização dos ensaios, consultar a referência bibliográfica (12).
 
PRODUTOS QUÍMICOS DE REFERÊNCIA  
9. Pode testar-se periodicamente produtos químicos de referência com o obje ­
tivo de garantir a fiabilidade do protocolo e das condições de ensaio. As 
seguintes substâncias constituem exemplos de substâncias tóxicas de refe ­
rência utilizadas com êxito em ensaios interlaboratoriais e em estudos de validação: lindano, trifluralina, pentaclorofenol, cloreto de cádmio e cloreto de potássio (1)(2)(5)(6)(13).
 
VALIDADE DO ENSAIO  
10. Um ensaio é considerado válido se forem cumpridas as seguintes condições:  
— a emergência nos controlos deve ser de, pelo menos, 70 % no final do 
ensaio (1)(6),  
— a emergência de indivíduos adultos das espécies  C. riparius  e C. yos­
himatsui  nos recipientes de controlo deve ocorrer 12 a 23 dias após a 
inserção destas espécies nos recipientes; no caso da  C. tentans , é neces­
sário um período de 20 a 65 dias,  
— no final do ensaio, devem determinar-se o pH e a concentração de 
oxigénio dissolvido em cada recipiente. A concentração de oxigénio deve ser de, pelo menos, 60 % do valor da saturação com ar (VSA) à temperatura utilizada e o pH da água sobrenadante deve estar compreen ­
dido entre 6 e 9, em todos os recipientes de ensaio,
 
— a temperatura da água não deve variar mais de ± 1,0 °C. Esta tempera ­
tura pode ser controlada numa sala isotérmica, caso em que a tempera ­
tura ambiente deve ser confirmada a intervalos adequados.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1378
 
DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
Recipientes de ensaio  
11. O estudo é realizado em copos de vidro de 600 ml, com 8 cm de diâmetro. 
Pode utilizar-se outros recipientes, devendo contudo assegurar-se uma es ­
pessura adequada da água sobrenadante e dos sedimentos. A superfície dos sedimentos deve proporcionar 2 a 3 cm
 2 por cada larva. O rácio entre a 
espessura da camada de sedimentos e a espessura da água sobrenadante 
deve ser de 1:4. Os recipientes de ensaio e o restante equipamento que entre em contacto com o sistema de ensaio devem ser exclusivamente de vidro ou de outro material quimicamente inerte (p. ex. Teflon).
 
Seleção das espécies  
12. A espécie a utilizar de preferência no ensaio é a  Chironomus riparius . A 
espécie  Chironomus tentans  também é adequada, mas é mais difícil de 
manipular e exige um período de ensaio mais longo. Pode igualmente 
utilizar-se a  Chironomus yohimatsui . O apêndice 2 apresenta informações 
sobre os métodos de cultura de  Chironomus riparius . Estão também dispo ­
níveis informações sobre as condições de cultura das espécies  Chironomus 
tentans  (4) e  Chironomus yoshimatsui  (11). A identidade das espécies deve 
ser confirmada antes do ensaio, exceto no caso de organismos provenientes 
de uma cultura interna do laboratório.  
Sedimentos  
13. Devem ser utilizados, de preferência, sedimentos formulados (também cha ­
mados sedimentos reconstituídos, artificiais ou sintéticos). Contudo, se fo ­
rem utilizados sedimentos naturais, estes devem ser caracterizados (pelo 
menos pH e teor de carbono orgânico, recomendando-se a determinação de outros parâmetros, tais como a razão C/N e a granulometria) e devem estar isentos de qualquer contaminação e de outros organismos que possam 
competir com os quironomídeos ou consumi-los. Recomenda-se igualmente 
que, antes de ser utilizados num ensaio de toxicidade em quironomídeos, os sedimentos naturais sejam acondicionados durante sete dias em condições semelhantes às do ensaio subsequente. Recomenda-se que sejam utilizados 
no presente ensaio (1)(15)(16) sedimentos formulados com a seguinte com ­
posição, baseada na do solo artificial utilizado no método C.8 (14):
 
a) 4-5 % (massa seca) de turfa: pH tão próximo quanto possível do inter ­
valo 5,5-6,0; é importante utilizar turfa em pó, finamente moída (granu ­
lometria das partículas ≤ 1 mm), unicamente seca ao ar;  
b) 20 % (massa seca) de argila caulinítica, de preferência com teor de 
caulinite superior a 30 %;  
c) 75-76 % (massa seca) de areia quartzítica, com predominância de areia 
fina com mais de 50 % de partículas de granulometria compreendida 
entre 50 e 200 μm; 
d) A quantidade de água desionizada necessária para que o teor de humi ­
dade da mistura final se situe na gama 30-50 %;  
e) A quantidade de carbonato de cálcio (CaCO  3 ) quimicamente puro neces ­
sária para ajustar o pH da mistura final dos sedimentos a 7,0 ± 0,5. O 
teor de carbono orgânico da mistura final deve ser de 2 % ± 0,5 %, devendo ser ajustado por recurso a quantidades adequadas de turfa e areia, em conformidade com as alíneas a) e c).
 
14. As origens da turfa, da argila caulinítica e da areia devem ser conhecidas. 
Deve verificar-se a ausência de contaminação química (p. ex., metais pesa ­
dos, compostos organoclorados, compostos organofosforados, etc.) nos com ­
ponentes dos sedimentos. No apêndice 3, apresenta-se um exemplo de pre ­
paração de sedimentos formulados. Uma mistura de componentes secos também é aceitável caso se demonstre que, após a adição da água sobrena ­
dante, não ocorre separação de componentes dos sedimentos (por exemplo, 
partículas de turfa flutuantes) e que a turfa ou os sedimentos estão suficien ­
temente acondicionados.
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Água  
15. Qualquer água com as características químicas de uma água de diluição 
aceitável enunciadas nos apêndices 2 e 4 é adequada para o ensaio. Para a cultura e o ensaio, pode utilizar-se qualquer água adequada, água natural 
(superficial ou subterrânea), água reconstituída (ver o apêndice 2) ou água 
da rede de abastecimento desclorada, desde que os quironomídeos nela sobrevivam durante todo o período de cultura e de ensaio sem evidenciarem sinais de  stress . No início do ensaio, o pH da água de ensaio deve estar 
compreendido entre 6 e 9 e a dureza total da água, expressa em CaCO
 3 , não 
deve exceder 400 mg/l. No entanto, caso se suspeite de uma interação entre os iões responsáveis pela dureza e a substância em estudo, deve utilizar-se 
uma água de dureza inferior (nessa eventualidade, o meio Elendt M4 não 
pode ser utilizado). Deve utilizar-se o mesmo tipo de água em todo o estudo. As características de qualidade da água enumeradas no apêndice 4 devem ser determinadas pelo menos duas vezes por ano, ou sempre que se 
suspeite que tenham mudado significativamente.
 
Soluções-mãe — sedimentos enriquecidos  
16. O enriquecimento dos sedimentos na concentração escolhida é geralmente 
efetuado por adição direta de uma solução da substância em estudo. Com o auxílio de um moinho de rolos ou de um misturador de alimentos, ou 
manualmente, adiciona-se aos sedimentos formulados uma solução-mãe da 
substância em estudo, dissolvida em água desionizada. Se a substância for pouco solúvel em água, pode ser dissolvida num volume tão baixo quanto possível de um solvente orgânico adequado (por exemplo, hexano, acetona 
ou clorofórmio). Seguidamente, esta solução é misturada com 10 g de areia 
quartzítica fina por recipiente de ensaio. Deixa-se evaporar o solvente até à sua eliminação total da areia; adiciona-se, então, esta à quantidade adequada de sedimentos por cada copo de ensaio. Para solubilizar, dispersar ou emul ­
sionar a substância em estudo apenas podem utilizar-se agentes de fácil 
volatilização. Ao preparar os sedimentos, importa ter em conta a areia associada à substância em estudo e a mistura de areia (ou seja, utiliza-se menos areia na preparação dos sedimentos). Deve ter-se o cuidado de as ­
segurar que a substância em estudo adicionada aos sedimentos se encontra 
total e uniformemente distribuída nestes. Se necessário, podem analisar-se subamostras, a fim de determinar o grau de homogeneidade.
 
PLANEAMENTO DO ENSAIO  
17. O planeamento do ensaio consiste na escolha do número e dos intervalos 
das concentrações de ensaio, do número de recipientes para cada concen ­
tração e do número de larvas por recipiente. Descreve-se de seguida o método de estimativa dos pontos CE e do NOEC, bem como de realização de ensaios do limite.
 
Análise por regressão  
18. As concentrações testadas no ensaio deverão incluir as concentrações às 
quais se observam efeitos (por exemplo, CE  15 e CE  50 ) e abranger a gama 
de concentrações para as quais o efeito da substância em estudo é signifi ­
cativo. De modo geral, é possível melhorar a exatidão e, em especial, a 
validade das estimativas das concentrações que produzem efeitos (CE  x ) se 
essas concentrações se situarem na gama de concentrações ensaiadas. De ­
vem evitar-se extrapolações muito abaixo da concentração positiva mais baixa ou acima da concentração mais elevada. É útil efetuar um ensaio 
exploratório preliminar para a escolha da gama de concentrações a utilizar 
no ensaio (ver o ponto 27).
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19. Caso se pretenda estimar uma CE  x , devem ser utilizados, pelo menos, cinco 
concentrações e três replicados de cada concentração. Em qualquer caso, 
para obter uma boa estimativa, é aconselhável ensaiar um número suficiente de concentrações. O fator entre as concentrações não deve ser superior a dois (se a curva de resposta à dose tiver um declive reduzido). Pode 
reduzir-se o número de replicados de cada concentração se for aumentado 
o número de concentrações de ensaio com respostas diferentes. O aumento do número de replicados ou a redução dos intervalos entre concentrações produz, em geral, intervalos de confiança mais estreitos. Caso se pretenda 
estimar a sobrevivência e o crescimento das larvas a 10 dias, é necessário 
utilizar mais replicados.
 
Estimativa de NOEC/LOEC  
20. Caso se pretenda estimar o NOEC ou o LOEC, devem ensaiar-se cinco 
concentrações com, pelo menos, quatro replicados, não devendo o fator entre as concentrações ser superior a dois. O número de replicados deverá 
ser suficiente para garantir a possibilidade estatística de detetar de forma 
adequada uma diferença de 20 % relativamente ao controlo, com um grau de significância de 5 % (p = 0,05). No respeitante às taxas de desenvolvi ­
mento, é geralmente adequada uma análise de variância (ANOVA), como o 
teste de Dunnett ou o teste de Williams (17)(18)(19)(20). Quanto à taxa de 
emergência, podem utilizar-se os testes de Cochran-Armitage, o teste exato de Fisher (com a correção de Bonferroni) ou o teste de Mantel-Haentzal.
 
Ensaio do limite  
21. Caso não sejam detetados efeitos no ensaio exploratório preliminar de se ­
leção das concentrações, pode proceder-se a um ensaio do limite (uma 
concentração de ensaio e uma de controlo). O objetivo consiste em realizar 
um ensaio numa concentração suficientemente elevada para permitir aos decisores excluir a possibilidade de efeitos tóxicos da substância em estudo, sendo o limite fixado a uma concentração cuja ocorrência não se prevê em 
caso algum. Recomenda-se a utilização de 1 000 mg/kg (massa seca). Em 
geral, são necessários, pelo menos, seis replicados dos organismos expostos e de controlo. Deve comprovar-se existir a possibilidade estatística de de ­
tetar de forma adequada uma diferença de 20 % relativamente ao controlo, 
com um grau de significância de 5 % (p = 0,05). No que respeita ao efeito 
nas taxas de desenvolvimento e na massa, o teste  t é um método estatístico 
adequado se os dados cumprirem os requisitos do teste (normalidade e variâncias homogéneas). Se estes requisitos não forem preenchidos, pode 
utilizar-se um teste  t de variância desigual ou um teste não paramétrico, 
como o de Wilcoxon-Mann-Whithey. No que respeita à taxa de emergência, o teste exato de Fisher é adequado.
 
PROCEDIMENTO  
Condições de exposição  
Preparação do sistema sedimentos enriquecidos-água  
22. Na aplicação da substância em estudo, recomenda-se o procedimento de 
enriquecimento descrito no método de ensaio C.8: "Toxicidade em relação às minhocas" (14). Coloca-se nos recipientes os sedimentos enriquecidos, adicionando-se água sobrenadante de forma a obter uma razão volúmica 
sedimentos-água de 1:4 (ver os pontos 11 e 15). A espessura da camada 
de sedimentos deve situar-se na gama 1,5-3 cm. Para evitar a separação de componentes dos sedimentos e a ressuspensão de materiais finos durante a criação da coluna de água, os sedimentos podem ser cobertos, enquanto a 
água é vertida, com um disco de plástico que se remove imediatamente 
depois. Podem também utilizar-se outros dispositivos.
 
23. Os recipientes de ensaio devem ser cobertos (por exemplo, com placas de 
vidro). Se necessário, o nível inicial de água pode ser reposto durante o 
ensaio, para compensar a evaporação. Para tal, deve utilizar-se água desti ­
lada ou desionizada, de modo a evitar a acumulação de sais.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1381
 
Estabilização  
24. Quando estiverem preparados os sedimentos enriquecidos e a fase aquosa 
sobrenadante, é conveniente permitir a partição da substância em estudo entre a fase aquosa e os sedimentos (3)(4)(6)(13). A partição deve ocorrer, 
de preferência, às condições de temperatura e arejamento utilizadas no en ­
saio. O tempo necessário para atingir o equilíbrio depende dos sedimentos e do produto químico, podendo variar de algumas horas a vários dias e mesmo, em casos raros, a 4 ou 5 semanas. Dado que, nesse período, muitos 
produtos químicos são passíveis de sofrer degradação, não se espera até o 
equilíbrio total ser alcançado, recomendando-se a adoção de um período de equilíbrio de 48 horas. No final deste período, deve medir-se a concentração 
da substância em estudo na água sobrenadante, na água dos poros e nos 
sedimentos, pelo menos no caso da concentração máxima e de uma concen ­
tração menor (ver o ponto 38). Estas determinações analíticas da substância em estudo permitem o cálculo do balanço de massas e a expressão dos 
resultados com base nas concentrações medidas.
 
Introdução dos organismos em estudo  
25. Quatro a cinco dias antes da introdução dos organismos em estudo nos 
recipientes de ensaio, devem colher-se aglomerados de ovos das culturas 
e colocá-los em pequenos recipientes com o meio de cultura. Pode utilizar-se meio proveniente da cultura-mãe ou um meio recentemente pre ­
parado. Neste último caso, importa adicionar ao meio de cultura uma pe ­
quena quantidade de alimentos, como, por exemplo, algas verdes e/ou al ­
gumas gotas de filtrado de uma suspensão de alimento para peixes fina ­
mente moído (ver o apêndice 2). Apenas devem ser utilizados aglomerados de ovos de postura recente. Normalmente, as larvas começam a eclodir 
alguns dias após a postura dos ovos (2 a 3 dias, a 20 °C, no caso das  
Chironomus riparius , e 1 a 4 dias no caso das  Chironomus tentans , a 23 °C, 
e das  Chironomus yoshimatsui , a 25 °C); o crescimento das larvas ocorre 
em quatro estádios larvares, cada um com a duração de 4 a 8 dias. Utilizar 
no ensaio larvas do primeiro estádio larvar (2-3 ou 1-4 dias após a eclosão). 
O estádio larvar dos insetos pode, eventualmente, ser verificado por exame da largura da cápsula cefálica (6).
 
26. Com o auxílio de uma pipeta embotada, coloca-se aleatoriamente vinte 
larvas do primeiro estádio larvar em cada recipiente de ensaio contendo 
os sedimentos enriquecidos e a água. O arejamento da água tem de ser suspenso durante a colocação das larvas nos recipientes de ensaio, assim permanecendo nas 24 horas subsequentes a esta operação (ver os pontos 25 
e 32). Consoante o tipo de ensaio realizado (ver os pontos 19 e 20), o 
número de larvas por concentração deve ser, no mínimo, de 60, no caso de estimativas de pontos CE, e de 80, no caso das determinações de NOEC.
 
Concentrações de ensaio  
27. Pode ser útil efetuar um ensaio exploratório para a determinação da gama de 
concentrações a utilizar no ensaio definitivo. Para o efeito, recorre-se a uma série de concentrações espaçadas da substância em estudo. Garantindo que a 
densidade de quironomídeos por unidade de superfície seja idêntica à utili ­
zada no ensaio definitivo, os quironomídeos são expostos a cada concen ­
tração da substância em estudo por um período que permita uma estimativa das concentrações de ensaio adequadas, não sendo necessários replicados.
 
28. As concentrações a utilizar no ensaio definitivo são decididas com base nos 
resultados do ensaio exploratório. Devem ser utilizadas pelo menos cinco 
concentrações, selecionadas do modo descrito nos pontos 18 a 20.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1382
 
Controlos  
29. Deve utilizar-se no ensaio um número adequado de recipientes de controlo 
sem a substância em estudo, mas com os sedimentos (ver os pontos 19-20). Caso se recorra a um solvente para a incorporação da substância em estudo 
(ver o ponto 16), deve efetuar-se um controlo utilizando sedimentos com 
solvente.
 
Sistema de ensaio  
30. São utilizados sistemas estáticos. Em casos excecionais, pode utilizar-se 
sistemas semiestáticos ou sistemas de escoamento com renovação intermi ­
tente ou contínua da água sobrenadante, por exemplo, se as características de qualidade da água se tornarem inadequadas ao organismo em estudo ou 
afetarem o equilíbrio químico (isto é, se os teores de oxigénio dissolvido 
baixarem demasiado, se a concentração de produtos de excreção aumentar demasiado, se ocorrer lixiviação de minerais dos sedimentos que afete o pH e/ou dureza da água, etc.). Deve preferir-se, contudo, o recurso a outros 
métodos para melhorar a qualidade da água sobrenadante, como o areja ­
mento, que é, em geral, suficiente.
 
Alimentação  
31. É necessário alimentar as larvas, de preferência diariamente ou, no mínimo, 
três vezes por semana. Utilizar alimento para peixes (suspensão em água ou 
finamente moído, por exemplo, Tetra-Min or Tetra-Phyllou; ver pormenores no apêndice 2); a quantidade de 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg no caso de  C. 
yoshimatsui ) por larva e dia afigura-se adequada para as larvas jovens, nos 
primeiros 10 dias. Após este período, pode ser necessária uma quantidade 
ligeiramente superior: 0,5-1 mg por larva e dia deve bastar para o resto do ensaio. A ração alimentar deve ser reduzida a todos os organismos expostos e aos controlos caso se observe crescimento fúngico ou se verifique morta ­
lidade nos controlos. Se não for possível impedir o crescimento fúngico, 
deve repetir-se o ensaio. Quando se estuda substâncias fortemente adsorven ­
tes (por exemplo, com log K
 ow > 5) ou substâncias ligadas aos sedimentos 
por ligações covalentes, a quantidade de alimentos necessária para assegurar 
a sobrevivência e o crescimento natural dos organismos pode ser adicionada 
aos sedimentos formulados, antes do período de estabilização. Para esse fim, devem ser utilizados matérias vegetais em vez de alimentos para peixes; a título de exemplo, 0,5 % (massa seca) de folhas finamente moídas de espé ­
cies como a urtiga comum ( Urtica dioeca ), a amoreira ( Morus alba ), o trevo 
branco ( Trifolium repens ), o espinafre ( Spinacia oleracea ) ou outras maté ­
rias de origem vegetal ( Cerophyl  ou α-celulose).
 
Condições de incubação  
32. O arejamento ligeiro da água sobrenadante nos recipientes de ensaio deve 
iniciar-se, de preferência, 24 horas após a introdução das larvas, prosse ­
guindo ao longo de todo o ensaio (deve evitar-se que a concentração de oxigénio dissolvido baixe para valores inferiores a 60 % do VSA). O are ­
jamento é efetuado por intermédio de uma pipeta de Pasteur de vidro, fixada 
2-3 cm acima da camada de sedimentos (caudal: uma ou poucas bolhas por segundo). No ensaio de produtos químicos voláteis, pode optar-se por não arejar o sistema sedimentos-água.
 
33. O ensaio é realizado a temperatura constante (20 °C ± 2 °C). No caso das 
espécies  C. tentans  e C. yoshimatsui , as temperaturas recomendadas são 
23 °C e 25 °C (± 2 °C), respetivamente. Utiliza-se um período de irradiação 
de 16 horas, com uma intensidade luminosa de 500 a 1 000 lux.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1383
 
Duração da exposição  
34. A exposição começa com a introdução das larvas nos recipientes enrique ­
cidos e nos recipientes de controlo. A duração máxima da exposição é de 28 dias para a  C. riparius  e a C. yoshimatsui  e de 65 dias para a  C. tentans . Se 
os insetos emergirem precocemente, pode pôr-se termo ao ensaio, no míni ­
mo, cinco dias após a emergência do último indivíduo adulto nos recipientes de controlo.
 
Observações  
Emergência  
35. Determina-se o tempo de desenvolvimento e o número total de insetos 
machos e fêmeas totalmente emergidos. Os machos são facilmente identifi ­
cados pelas suas antenas plumosas.  
36. Os recipientes de ensaio devem ser observados pelo menos três vezes por 
semana, a fim de apreciar visualmente qualquer comportamento anormal 
(por exemplo, saída dos sedimentos, natação anormal) em relação aos reci ­
pientes de controlo. Durante o período de emergência previsto, é necessário proceder à contagem diária dos insetos emergidos. O sexo e o número de 
insetos totalmente emergidos são registados diariamente. Após a identifica ­
ção, remove-se os insetos dos recipientes. Quaisquer aglomerados de ovos postos antes do termo do ensaio devem ser registados e, de seguida, remo ­
vidos, para evitar a reintrodução de larvas nos sedimentos. Regista-se tam ­
bém o número de ninfas visíveis que não emergiram. O apêndice 5 contém 
orientações sobre a mensuração da emergência.
 
Crescimento e sobrevivência  
37. Se for necessário obter dados sobre a sobrevivência e o crescimento das 
larvas em dez dias, devem prever-se recipientes de ensaio suplementares 
desde o início, para que possam ser utilizados posteriormente. Os sedimen ­
tos destes recipientes são passados por um crivo com abertura de malha de 250 μm, para reter as larvas. Os critérios de morte são a imobilidade e a 
ausência de reação a estímulos mecânicos. As larvas não recuperadas devem 
também ser contadas como mortas (as larvas que morreram no início do ensaio podem ter sido degradadas por micróbios). Determina-se a massa seca, isenta de cinzas, de larvas sobreviventes em cada recipiente de ensaio, 
calculando-se a massa seca média por recipiente. É útil determinar o estádio 
larvar das larvas sobreviventes; para tal, pode recorrer-se à medição da largura da cápsula cefálica de cada indivíduo.
 
Determinações analíticas  
Concentração da substância em estudo  
38. Antes do início do ensaio (isto é, da introdução das larvas), procede-se à 
colheita de amostras da massa de sedimentos de, pelo menos, um recipiente 
por exposição, para a determinação analítica da concentração da substância 
em estudo. Recomenda-se que sejam analisadas, no início (ver o ponto 24) e no final do ensaio, no mínimo, amostras da água sobrenadante, da água dos poros e dos sedimentos correspondentes à concentração mais elevada e a 
uma concentração inferior. Estas determinações da concentração da subs ­
tância em estudo proporcionam informações sobre o comportamento e/ou a partição da mesma no sistema água-sedimentos.
 
39. Quando se efetuam medições intermédias (por exemplo, no 7.  o dia) e a 
análise necessita de amostras grandes que não podem ser colhidas dos recipientes de ensaio sem influenciar o sistema em estudo, as determinações analíticas devem ser realizadas com amostras colhidas de recipientes de 
ensaio suplementares tratados da mesma forma (incluindo a presença dos 
organismos em estudo), mas que não são alvo de observações biológicas.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1384
 
40. A centrifugação a cerca de 10 000 g e 4  o C, durante 30 minutos, é o 
procedimento recomendado para isolar a água intersticial. No entanto, 
caso se demonstre que a substância em estudo não é adsorvida aos filtros, a filtragem também é aceitável. Em alguns casos, se a amostra for dema ­
siado pequena, poderá não ser possível analisar concentrações na água dos 
poros.
 
Parâmetros físico-químicos  
41. O pH e a temperatura dos recipientes de ensaio devem ser medidos de forma 
adequada (ver o ponto 10). A dureza e o ião amónio devem ser medidos nos recipientes de controlo e num recipiente de ensaio com a concentração mais elevada, no início e no final do ensaio.
 
DADOS E RELATÓRIOS  
Tratamento dos resultados  
42. O objetivo deste ensaio consiste em determinar o efeito da substância em 
estudo nas taxas de desenvolvimento e no número total de insetos machos e 
fêmeas totalmente emergidos ou, no caso dos ensaios de 10 dias, os efeitos 
na sobrevivência e no peso das larvas. Se não houver indicação de sensi ­
bilidades estatisticamente diferentes entre os sexos, os resultados relativos 
aos machos e às fêmeas podem ser agrupados para efeitos de análise esta ­
tística. As diferenças de sensibilidade entre os sexos podem ser avaliadas estatisticamente, por exemplo, recorrendo a um ensaio de tabela de contin ­
gência χ
 2 -r x 2. Se necessário, determina-se a sobrevivência das larvas e a 
massa seca por recipiente após 10 dias.  
43. As concentrações com efeitos, expressas em relação à massa seca, são 
calculadas de preferência a partir das concentrações medidas nos sedimentos no início do ensaio (ver o ponto 38).
 
44. Para efetuar uma estimativa pontual do valor CE  50 ou de qualquer valor 
CE x , podem equiparar-se os dados estatísticos por recipiente aos de ensaios 
idênticos reais. No cálculo de um intervalo de confiança para qualquer valor 
CE x , importa ter em conta a variabilidade entre recipientes, ou deve 
demonstrar-se que essa variabilidade é tão reduzida que pode ser ignorada. Se o modelo for ajustado pelo método dos mínimos quadrados, deve aplicar-se uma transformação aos dados estatísticos por recipiente, para 
melhorar a homogeneidade da variância. Contudo, os valores de CE
 x só 
devem ser calculados após retransformação da resposta no valor inicial.  
45. Se a análise estatística tiver por objetivo determinar o NOEC/LOEC utili ­
zando hipóteses estatísticas, importa ter em conta a variabilidade entre re ­
cipientes, por exemplo, aplicando um método ANOVA hierarquizado. Se não se verificarem os pressupostos comuns do método ANOVA, testes mais robustos podem constituir uma alternativa adequada (21).
 
Taxa de emergência  
46. As taxas de emergência são dados de "tudo ou nada", que podem ser 
analisados através de um teste de Cochran-Armitage aplicado de forma 
regressiva, nos casos em que se prevê uma relação monótona entre a dose fornecida e a resposta e os dados são compatíveis com a previsão. Caso contrário, pode recorrer-se a um teste exato de Fisher ou a um teste de 
Mantel-Haentzal com valores  p ajustados segundo o método de 
Bonferroni-Holm. Se, para a mesma concentração, houver indícios de uma maior variabilidade entre replicados do que a sugerida por uma distribuição binomial (frequentemente referida como variação "extrabinomial"), deve 
utilizar-se um teste exato de Fisher ou um teste de Cochran-Armitage ro ­
busto, como proposto na referência 21.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1385
 
Determina-se a soma dos insetos emergidos por recipiente, ne, que é segui ­
damente dividida pelo número de larvas nele introduzidas, n  a : 
ER ¼ n e 
n a 
em que:  
ER = Taxa de emergência  
n e = Número de insetos emergidos no recipiente  
n a = Número de larvas introduzidas no recipiente  
47. Uma alternativa mais adequada a amostras grandes, quando se regista va ­
riância extrabinomial, consiste em considerar a taxa de emergência uma 
resposta contínua e aplicar procedimentos como o teste de William, caso 
se preveja uma relação monótona entre a dose fornecida e a resposta, compatível com os dados de taxa de emergência em causa. Por seu turno, o teste de Dunnett é adequado aos casos em que não se regista uma relação 
monótona. Neste contexto, uma amostra "grande" é definida como aquela 
em que o número total de insetos emergidos e não emergidos é, em ambos os casos, superior a cinco por replicado (recipiente).
 
48. A aplicação de métodos ANOVA implica que os valores de taxa de emer ­
gência sejam sujeitos a uma transformação de arco-seno da raiz quadrada ou a uma transformação de Tukey-Freeman, de forma a obter uma distribuição aproximadamente normal e uniformizar as variâncias. Os testes de 
Cochran-Armitage, exato de Fisher (Bonferroni) e Mantel-Haentzal podem 
ser aplicados quando se utilizam frequências absolutas. A transformação de arco-seno da raiz quadrada consiste em calcular o inverso do seno (sin
 -1 ) da 
raiz quadrada do valor da taxa de emergência.  
49. No respeitante às taxas de emergência, os valores de CE  x são calculados por 
análise de regressão – por exemplo, por recurso aos modelos  probit  (22),  
logit ou Weibull ou a programas informáticos comerciais adequados. Em 
caso de fracasso da análise de regressão (por exemplo, se o número de 
respostas parciais for inferior a dois), utilizam-se outros métodos não para ­
métricos, como a média móvel ou a simples interpolação.  
Taxa de desenvolvimento  
50. O tempo médio de desenvolvimento representa o tempo médio decorrido 
entre a introdução das larvas (dia 0 do ensaio) e a emergência da coorte 
experimental de insetos (para o cálculo do tempo de desenvolvimento real, é necessário ter em conta a idade das larvas no momento da introdução). A taxa de desenvolvimento é o inverso do tempo de desenvolvimento (unida ­
de: 1/dia) e representa a quantidade de desenvolvimento larvar que ocorre 
por dia. A taxa de desenvolvimento é o parâmetro preferido para a avaliação destes estudos de toxicidade dos sedimentos, dado que a sua variância é 
mais baixa que a do tempo de desenvolvimento, sendo também mais ho ­
mogénea e mais próxima da distribuição normal. Os testes paramétricos mais potentes estão mais adaptados à taxa de desenvolvimento do que ao tempo de desenvolvimento. Considerando a taxa de desenvolvimento uma 
resposta contínua, os valores de CE
 x podem ser estimados por recurso a uma 
análise de regressão – por exemplo, como descrito em (23)(24).  
51. No contexto dos testes estatísticos que se seguem, considera-se que o nú ­
mero de insetos observado no dia de inspeção  x emergiu no ponto médio do 
intervalo de tempo compreendido entre o dia  x e o dia  x-d (d = duração do 
intervalo de inspeção, em geral 1 dia). A taxa de desenvolvimento média por recipiente (é calculada com base nas seguintes equações:
 
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1386
 
em que:  
x: Taxa de desenvolvimento média por recipiente  
i: Índice do intervalo de inspeção  
m: Número máximo de intervalos de inspeção  
ƒ i : Número de insetos emergidos no intervalo de inspeção  i 
n e : Número total de insetos emergidos no final do ensaio (=  P ƒ i ) 
x i : Taxa de desenvolvimento dos insetos emergidos no intervalo  i 
x i ¼ 1 
Ê 
dia i Ä 1 i 
2 Ì 
em que:  
dia i : Dia da inspeção (n.  o de dias decorridos desde a introdução dos orga ­
nismos)  
d i : Duração do intervalo de inspeção  i (dias, em geral 1 dia)  
Relatório dos ensaios  
52. O relatório dos ensaios deve incluir, no mínimo, as seguintes informações:  
Substância em estudo:  
— natureza física e, quando pertinente, propriedades físico-químicas (solu ­
bilidade na água, pressão de vapor, coeficiente de partição no solo — ou 
nos sedimentos, se disponível —, estabilidade em água, etc.),  
— dados de identificação química (denominação comum, denominação quí ­
mica, fórmula estrutural, número CAS, etc.), incluindo o grau de pureza 
e o método analítico de quantificação da substância.  
Espécies utilizadas nos ensaios:  
— animais: espécie, nome científico, origem dos organismos e condições de 
reprodução,  
— informações sobre o manuseamento dos aglomerados de ovos e das 
larvas,  
— idade dos animais quando introduzidos nos recipientes de ensaio.  
Condições experimentais:  
— sedimentos utilizados, isto é, de origem natural ou formulados,  
— no caso dos sedimentos naturais, localização e descrição do local de 
colheita, incluindo, se possível, o historial de contaminação; caracterís ­
ticas: pH, teor de carbono orgânico, razão C/N e granulometria (se 
pertinente),  
— preparação dos sedimentos formulados: ingredientes e características 
(teor de carbono orgânico, pH, humidade, etc., no início dos ensaios),  
— preparação da água para os ensaios, caso seja utilizada água recons ­
tituída, e respetivas características (concentração de oxigénio, pH, con ­
dutividade, dureza, etc., no início dos ensaios),  
— espessura dos sedimentos e da água sobrenadante,  
— volume de água sobrenadante e de água dos poros; massa do sedimento 
húmido com e sem a água dos poros,  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1387
 
— recipientes de ensaio (material e dimensões),  
— método de enriquecimento dos sedimentos: concentrações de ensaio uti ­
lizadas, número de replicados e solvente utilizado, se for o caso,  
— fase de estabilização do sistema sedimentos enriquecidos-água: duração 
e condições,  
— condições de incubação: temperatura, ciclo de luz e intensidade lumino ­
sa, arejamento (frequência e intensidade),  
— informações pormenorizadas sobre a alimentação dos organismos, in ­
cluindo o tipo de alimentos, a preparação, a quantidade e o regime 
alimentar.  
Resultados:  
— concentrações de ensaio nominais, concentrações de ensaio medidas e 
resultados de todas as análises efetuadas para determinar a concentração 
da substância em estudo nos recipientes de ensaio,  
— qualidade da água nos recipientes de ensaio (pH, temperatura, oxigénio 
dissolvido, dureza e teor de ião amónio),  
— renovação da água evaporada nos ensaios, se for o caso,  
— número de insetos machos e fêmeas emergidos por recipiente e dia,  
— número de larvas que não originaram insetos, por recipiente,  
— massa seca média de larvas por recipiente e, se for caso disso, por 
estádio larvar,  
— percentagem de emergência por replicado e por concentração de ensaio 
(machos e fêmeas no seu conjunto),  
— taxa média de desenvolvimento de insetos totalmente emergidos por 
replicado e por concentração de ensaio (machos e fêmeas no seu con ­
junto),  
— estimativas de parâmetros de toxicidade, como, por exemplo, CEx (e os 
intervalos de confiança associados), NOEC e/ou LOEC e métodos esta ­
tísticos utilizados para a determinação dos mesmos,  
— discussão dos resultados, incluindo qualquer influência nos resultados do 
ensaio decorrente de alterações efetuadas ao presente método de ensaio.  
REFERÊNCIAS:  
(1) BBA (1995). Long-term  toxicity  test with Chironomus riparius: Develop ­
ment and validation of a new test system. Editado por M. Streloke e H. 
Köpp. Berlim, 1995.  
(2) Fleming R.  et al.  (1994). Sediment Toxicity Tests for Poorly Water-Soluble 
Substances. Final Report to the European Commission. Report No: EC 
3738. Agosto de 1994. WRc, Reino Unido.  
(3) SETAC (1993). Guidance Document on Sediment toxicity Tests and Bio ­
assays for Freshwater and Marine Environments. WOSTA Workshop reali ­
zado nos Países Baixos.  
(4) ASTM International/E1706-00 (2002). Test Method for Measuring the To ­
xicity of Sediment-Associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. p. 1125-1241.  In ASTM International 2002 Annual Book of Standards. 
Volume 11.05. Biological Effects and Environmental Fate; Biotechnology; 
Pesticides. ASTM International. West Conshohocken, PA.
 
(5) Environment Canada (1997). Test for Growth and Survival in Sediment 
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1997.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1388
 
(6) US-EPA (2000). Methods for Measuring the Toxicity and Bioaccumulation 
of Sediment-associated Contaminants with Freshwater Invertebrates. Se ­
gunda edição. EPA 600/R-99/064. Março de 2000. Revisão da primeira edição de junho de 1994.
 
(7) US-EPA/OPPTS 850.1735. (1996): Whole Sediment Acute Toxicity Inver ­
tebrates.  
(8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.  
(9) Milani D., Day K.E., McLeay D.J., Kirby R.S. (1996). Recent intra- and 
inter-laboratory studies related to the development and standardisation of 
Environment Canada’s biological test methods for measuring sediment to ­
xicity using freshwater amphipods  (Hyalella azteca)  and midge larvae  (Chi­
ronomus riparius).  Technical Report. Environment Canada. National Water 
Research Institute. Burlington, Ontário, Canadá.  
(10) Sugaya Y. (1997). Intra-specific variations of the susceptibility of insecti ­
cides  in Chironomus yoshimatsui . Jp. J. Sanit. Zool.  48 (4): 345-350.  
(11) Kawai K. (1986). Fundamental studies on Chironomid allergy. I. Culture 
methods of some Japanese Chironomids (Chironomidae, Diptera).  Jp. J. 
Sanit. Zool.  37(1): 47-57.  
(12) OCDE (2000). Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Diffi ­
cult Substances and Mixtures. OECD Environment, Health and Safety Pu ­
blications, Series on Testing and Assessment No. 23.  
(13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of To ­
xicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. Setembro de 1995.
 
(14) Capítulo C.8 deste anexo: Toxicidade em relação às minhocas.  
(15) Suedel B.C., Rodgers J.H. (1994). Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing.  Environ. Toxicol. 
Chem.  13: 1163-1175.  
(16) Naylor C., Rodrigues C. (1995). Development of a test method for Chiro ­
nomus riparius using a formulated sediment.  Chemosphere  31: 3291-3303.  
(17) Dunnett C.W. (1964). A multiple comparisons procedure for comparing 
several treatments with a control.  J. Amer. Statis. Assoc.  50: 1096-1121.  
(18) Dunnett C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control.  
Biometrics  20: 482-491.  
(19) Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment means when 
several dose levels are compared with a zero dose control.  Biometrics  27: 
103-117.  
(20) Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero 
dose control.  Biometrics  28: 510-531.  
(21) Rao J.N.K., Scott A.J. (1992). A simple method for the analysis of clustered 
binary data.  Biometrics  48: 577-585.  
(22) Christensen E.R. (1984). Dose-response functions in aquatic toxicity testing 
and the Weibull model.  Water Research  18: 213-221.  
(23) Bruce, Versteeg (1992). A statistical procedure for modelling continuous 
toxicity data.  Environmental Toxicology and Chemistry  11: 1485-1494.  
(24) Slob W. (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints.  Toxicol. 
Sci. 66: 298-312.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1389
 
Apêndice 1  
DEFINIÇÕES  
No âmbito do presente método de ensaio, aplicam-se as seguintes definições:  
Sedimentos formulados  ou reconstituídos, artificiais ou sintéticos: mistura de 
matérias utilizadas para simular os componentes físicos de sedimentos naturais.  
Água sobrenadante : água situada acima da superfície dos sedimentos, no reci ­
piente de ensaio.  
Água intersticial  ou água dos poros: água que ocupa o espaço entre as partículas 
de sedimentos e de solo.  
Sedimentos enriquecidos : sedimentos aos quais foi adicionada a substância em 
estudo.  
Produto químico em estudo : qualquer substância ou mistura à qual seja apli ­
cado o presente método de ensaio.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1390
 
Apêndice 2  
Recomendações para a cultura de  chironomus riparius  
1. As larvas de  Chironomus  podem ser criadas em caixas de cristalização ou 
recipientes de maiores dimensões. Espalha-se no fundo do recipiente areia quartzítica fina de modo a constituir uma camada fina com 5 a 10 mm de espessura. Verificou-se que o  kieselguhr  (p. ex. Merck 8117) é também um 
substrato adequado; neste caso, pode utilizar-se uma camada mais fina, da 
ordem de poucos milímetros. Adiciona-se de seguida uma coluna de vários centímetros de uma água adequada. Se necessário, os níveis de água podem ser repostos para compensar a evaporação e evitar a dessecação. A água 
pode ser substituída, se necessário. Deve efetuar-se um arejamento ligeiro. 
Os recipientes de criação das larvas devem ser mantidos em gaiolas ade ­
quadas, de forma a evitar fugas de adultos emergentes. A gaiola deve ser suficientemente grande (no mínimo, cerca de 30 x 30 x 30 cm), para per ­
mitir a enxameação dos adultos emergidos, sem o que poderá não ocorrer 
copulação.
 
2. As gaiolas devem ser mantidas à temperatura ambiente ou a uma tempera ­
tura constante de 20 ± 2 °C, com um período de luminosidade (cerca de 
1 000 lux) de 16 horas e oito horas de escuridão. Existem referências documentais de que um teor de humidade relativa do ar inferior a 60 % pode impedir a reprodução.
 
Água de diluição  
3. Pode utilizar-se qualquer água natural ou reconstituída adequada. Utiliza-se 
em geral água de poços, água da rede de abastecimento desclorada e meios 
artificiais (por exemplo, meio Elendt M4 ou M7; ver abaixo). A água tem de ser arejada antes da utilização. Se necessário, a água das culturas pode ser renovada por vazamento ou sifonagem cuidadoso da água dos recipien ­
tes de cultura, para não destruir os tubos das larvas.
 
Alimentação das larvas  
4. As larvas de  Chironomus  são alimentadas com cerca de 250 mg por reci ­
piente e por dia de um alimento floculado para peixes (Tetra Min®, Tetra Phyll® ou outra marca semelhante). Os alimentos podem ser administrados na forma de um pó seco finamente moído ou de uma suspensão em água: 
adicionar 1,0 g de alimento floculado a 20 ml de água de diluição e mis ­
turar de modo a obter uma mistura homogénea. Esta preparação pode ser administrada ao caudal aproximado de 5 ml por recipiente e por dia (agitar antes da utilização). Pode administrar-se às larvas de idade superior uma 
maior quantidade de alimento.
 
5. A alimentação é ajustada em função da qualidade da água. Se o meio de 
cultura se tornar turvo, deve reduzir-se a alimentação. A administração de 
alimentos deve ser objeto de um registo minucioso. A escassez de alimentos 
causaria migração das larvas para a coluna de água, enquanto uma alimen ­
tação demasiado rica aumentaria a atividade microbiana e reduziria a con ­
centração de oxigénio. Ambas estas condições podem resultar numa redução 
das taxas de crescimento.  
6. Ao preparar novos recipientes de cultura, podem também adicionar-se al ­
gumas células de algas verdes (por exemplo,  Scenedesmus subspicatus  e 
Chlorella vulgaris ). 
Alimentação dos adultos emergidos  
7. Alguns experimentadores sugeriram que um tampão de algodão embebido 
numa solução saturada de sacarose pode servir de alimento para os adultos 
emergidos.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1391
 
Emergência  
8. À temperatura de 20 ± 2 °C, os adultos começam a emergir dos recipientes 
de criação das larvas decorridos 13 a 15 dias. Os machos são facilmente distinguidos pelas suas antenas plumosas.
 
Aglomerados de ovos  
9. Quando se encontrarem presentes adultos nas gaiolas de criação, deve 
verificar-se três vezes por semana se ocorre a deposição de aglomerados 
gelatinosos de ovos nos recipientes de criação das larvas. Se tal suceder, devem ser removidos com cuidado e transferidos para uma pequena cápsula com uma amostra da água de incubação. Os aglomerados de ovos são 
utilizados para iniciar novas culturas noutros recipientes (p. ex., 2-4 aglo ­
merados de ovos por recipiente) ou em ensaios de toxicidade.
 
10. As larvas do primeiro estádio larvar devem eclodir decorridos 2-3 dias.  
Preparação de novos recipientes de cultura  
11. Quando as culturas estiverem estabelecidas, deverá ser possível preparar um 
novo recipiente de cultura de larvas por semana, ou com uma frequência menor (consoante os requisitos dos ensaios), removendo os recipientes mais 
antigos após a emergência dos insetos adultos. O recurso a este sistema 
permite obter um aprovisionamento regular de insetos adultos com uma gestão mínima.
 
Preparação das soluções de ensaio M4 e M7  
12. O meio M4 foi descrito por Elendt (1990). O meio M7 é preparado do 
mesmo modo que o M4, exceto no que respeita às substâncias indicadas no quadro 1, cujas concentrações são quatro vezes inferiores às do meio M4. 
Encontra-se em preparação um artigo sobre o meio M7 (Elendt, comunica ­
ção pessoal). A solução de ensaio não deve ser preparada em conformidade com as indicações de Elendt e Bias (1990), dado as concentrações de NaSiO3.5H2O, NaNO3, KH2PO4 e K2HPO4 apresentadas para a prepara ­
ção das soluções-mãe não serem adequadas.
 
Preparação do meio M7  
13. Cada solução-mãe (I) é preparada individualmente, sendo preparada uma 
solução-mãe combinada (II) a partir dessas soluções (I) (ver o quadro 1). O meio M7 é preparado diluindo para 1 l, com água desionizada, 50 ml da solução-mãe combinada (II) e as quantidades de cada solução-mãe de ma ­
cronutrientes indicadas no quadro 2. Prepara-se uma solução-mãe de vita ­
minas juntando três vitaminas a água desionizada, como indicado no quadro 3; adiciona-se 0,1 ml da solução-mãe combinada de vitaminas ao meio M7 final pouco antes da utilização (a solução-mãe de vitaminas é armazenada 
por congelação, em pequenas alíquotas). O meio é arejado e estabilizado.
 
REFERÊNCIAS  
BBA (1995). Long-term toxicity test with  Chironomus riparius : Development 
and validation of a new test system. Editado por M. Streloke e H.Köpp. Berlim, 
1995.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1392
 
Quadro 1  
Soluções-mãe de elementos vestigiais para os meios M4 e M7  
Soluções-mãe (I) Quantidade (mg) 
diluída para 1 
litro com água 
desionizada Para preparar a solução-mãe 
combinada (II), misturar as seguintes 
quantidades (ml) de soluções-mãe (I) 
e diluir para 1 litro com água 
desionizada Concentrações finais nas soluções de 
ensaio (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077 
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 
Na 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na 2 EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO  4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Estas substâncias são diferentes nos meios M4 e M7, como se indica no quadro. 
( 2 ) Estas soluções são preparadas individualmente, misturadas e colocadas de imediato numa autoclave.  
Quadro 2  
Soluções-mãe de macronutrientes para os meios M4 e M7  
Quantidade (mg) 
diluída para 1 litro 
com água desionizada Quantidade de 
soluções-mãe de 
macronutrientes adicionada 
para preparar os meios M4 
e M7 
(ml/l) Concentrações finais 
nas soluções de ensaio 
M4 e M7 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 NaHCO
 3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1393
 
Quadro 3  
Soluções-mãe de vitaminas para os meios M4 e M7. As três soluções de vitaminas são 
combinadas para originar uma única solução-mãe.  
Quantidade (mg) diluída 
para 1 litro com água 
desionizada Quantidade de solução-mãe 
de vitaminas adicionada para 
preparar os meios M4 e M7 
(ml/l) Concentrações finais nas 
soluções de ensaio M4 e 
M7 
(mg/l)  
Cloridrato de tiamina 750 0,1 0,075 
Cianocobalamina (B12) 10 0,1 0,0010 Biotina 7,5 0,1 0,00075
 
REFERÊNCIAS  
Elendt B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 25-33.  
Elendt B.P., Bias W.-R. (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization 
of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna . Water Research  
24 (9): 1157-1167.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1394
 
Apêndice 3  
PREPARAÇÃO DOS SEDIMENTOS FORMULADOS  
Composição dos sedimentos  
A composição dos sedimentos formulados deve ser a seguinte:  
Componente Características % da massa 
seca dos sedimentos  
Turfa Turfa de  Sphagnum , com pH 
tão próximo quanto possível do intervalo 5,5-6,0, sem res ­
tos visíveis de plantas, fina ­
mente moída (granulometria 
≤ 1 mm) e seca ao ar 4-5 
Areia quartzítica Granulometria: > 50 % das 
partículas de granulometria na gama 50-200 μm 75-76 
Argila caulinítica Teor de caulinite ≥ 30 % 20 
Carbono orgânico Ajustado por adição de turfa 
e areia 2 (±0,5) 
Carbonato de cácio CaCO
 3 pulverizado quimica ­
mente puro 0,05-0,1 
Água Condutividade ≤ 10 μS/cm 30-50  
Preparação  
A turfa é seca ao ar e moída até se obter um pó fino. Prepara-se uma suspensão 
da quantidade necessária de turfa pulverizada em água desionizada, por recurso a um dispositivo de homogeneização de alta eficiência. O pH desta suspensão é ajustado para 5,5 ± 0,5 com CaCO
 3 . A suspensão é acondicionada durante, pelo 
menos, dois dias, com agitação ligeira a 20 ± 2 °C, para estabilizar o pH e 
estabelecer um perfil microbiano estável. Findo este período, determina-se nova ­
mente o pH, que deve ser de 6,0 ± 0,5. A suspensão de turfa é então misturada com os outros componentes (areia e argila caulinítica) e água desionizada, de 
forma a obter sedimentos homogéneos com um teor de água da ordem de 30 %- 
-50 % da massa seca dos sedimentos. O pH da mistura final é determinado uma vez mais e, se necessário, ajustado para 6,5-7,5 com CaCO
 3 . São colhidas amos ­
tras dos sedimentos para determinar o resíduo seco e o teor de carbono orgânico. 
Recomenda-se que, antes de ser utilizados num ensaio de toxicidade em quiro ­
nomídeos, os sedimentos formulados sejam acondicionados durante sete dias em condições idênticas às do ensaio subsequente.
 
Armazenagem  
Os componentes secos para a preparação dos sedimentos artificiais podem ser 
armazenados num local seco e fresco, à temperatura ambiente. Os sedimentos 
formulados (húmidos) não devem ser armazenados antes da sua utilização nos ensaios. Devem ser utilizados imediatamente após o período de acondiciona ­
mento de sete dias que conclui a sua preparação.
 
REFERÊNCIAS  
Capítulo C.8 deste anexo: Toxicidade em relação às minhocas.  
Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tu ­
bificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media.  Ecotox. and Environ. 
Safety  39: 10-20.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1395
 
Apêndice 4  
Características químicas de uma água de diluição adequada  
Substância Concentrações  
Partículas < 20 mg/l 
Carbono orgânico total < 2 mg/l Amoníaco não ionizado < 1 μg/l 
Dureza expressa em CaCO
 3 < 400 mg/l (*) 
Cloro residual < 10 μg/l 
Pesticidas organofosforados totais < 50 ng/l Soma dos pesticidas organoclorados e dos bifenilos 
policlorados, totais < 50 ng/l 
Cloro orgânico total < 25 ng/l
 
(*) Contudo, caso se suspeite da existência de uma interação entre os iões responsáveis pela 
dureza e a substância em estudo, deve utilizar-se uma água mais macia (nesse caso, o 
meio Elendt M4 não pode ser utilizado).  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1396
 
Apêndice 5  
Orientações para a monitorização da emergência das larvas de 
quironomídeos  
Os copos de ensaio são munidos de armadilhas de emergência. Estas armadilhas 
são necessárias a partir do vigésimo dia, até ao final do ensaio. A título de exemplo, pode utilizar-se o dispositivo abaixo ilustrado:
 
A: tela de nylon  
B: copo de plástico invertido  
C: copo de exposição sem bico  D: aberturas recobertas, para renovação da água  
E: água  
F: sedimentos  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1397
 
C.28.  ENSAIO DE TOXICIDADE EM QUIRONOMÍDEOS NUM 
SISTEMA SEDIMENTOS-ÁGUA COM ÁGUA ENRIQUECIDA  
INTRODUÇÃO  
1. O presente método de ensaio é equivalente ao  Test Guideline  TG 219 da 
OCDE (2004). Foi concebido para avaliar os efeitos nas larvas dos dípteros 
de água doce  Chironomus  sp., que vivem nos sedimentos, de uma exposição 
prolongada a determinados produtos químicos. Baseia-se principalmente nas orientações da BBA, utilizando um sistema de ensaio sedimentos-água num 
cenário de exposição com solo artificial e coluna de água (1). Tem também 
em conta os atuais protocolos de ensaios de toxicidade para as espécies  
Chironomus riparius  e Chironomus tentans  que foram desenvolvidos na 
Europa (1)(2)(3) e na América do Norte (2)(3)(4)(5)(6)(7)(8) e foram sujei ­
tos a um ensaio interlaboratorial (1)(6)(9). Podem também utilizar-se outras 
espécies de quironomídeos bem documentadas, como a  Chironomus yoshi ­
matsui  (10)(11).
 
2. O cenário de exposição utilizado neste método de ensaio passa pelo enri ­
quecimento da água na substância em estudo. A seleção do cenário de exposição adequado depende da finalidade do ensaio. O cenário de exposi ­
ção na água, que envolve o enriquecimento da coluna de água na substância 
em estudo, tem por objetivo simular as perdas por dispersão na aplicação de 
pesticidas e abrange o pico de concentrações inicial na água dos poros. É também útil para outros tipos de exposições (incluindo o derrame de pro ­
dutos químicos), com exceção dos processos de acumulação mais demora ­
dos do que o período do ensaio.
 
3. As substâncias a ensaiar com organismos que vivem nos sedimentos persis ­
tem, em geral, neste compartimento durante longos períodos. A exposição 
dos referidos organismos pode ter lugar por várias vias. A importância relativa de cada via de exposição, bem como o tempo de contribuição de cada uma delas para os efeitos tóxicos globais, depende das propriedades 
físico-químicas do produto químico em causa. No caso de substâncias for ­
temente adsorventes (por exemplo, com log K
 ow > 5) ou de substâncias 
ligadas aos sedimentos por ligações covalentes, a ingestão de alimentos contaminados pode constituir uma via de exposição significativa. Para não 
subestimar a toxicidade das substâncias altamente lipófilas, pode ponderar-se 
a utilização de alimentos adicionados aos sedimentos antes da aplicação da substância em estudo. De forma a ter em conta todas as vias de exposição potenciais, o presente método de ensaio focaliza-se na exposição a longo 
prazo. A duração do ensaio é de 20 a 28 dias para  C. riparius  e C. 
yoshimatsui  e de 28 a 65 dias para  C. tentans . Se forem necessários dados 
a curto prazo para uma finalidade específica (por exemplo, para investigar os efeitos de um produto químico instável), é possível utilizar replicados 
adicionais a remover após de dez dias.
 
4. Os parâmetros medidos são o número total de indivíduos adultos emergidos 
e o tempo necessário para tal. Se forem necessários dados adicionais a curto 
prazo, recomenda-se que as determinações da sobrevivência e do cresci ­
mento das larvas apenas sejam efetuadas após um período de dez dias, recorrendo aos replicados adicionais que se justifiquem.
 
5. Recomenda-se a utilização de sedimentos formulados. Estes apresentam 
várias vantagens relativamente aos sedimentos naturais:  
— a variabilidade experimental é reduzida porque os sedimentos constituem 
uma matriz "normalizada" reprodutível, eliminando-se a necessidade de encontrar fontes de sedimentos limpos e não contaminados,
 
— os ensaios podem ser iniciados em qualquer momento, eliminando-se 
assim a variabilidade sazonal dos sedimentos ensaiados, não havendo necessidade de pré-tratar os sedimentos para remover a fauna indígena; a utilização de sedimentos formulados reduz também os custos associados 
à colheita no terreno de quantidades suficientes de sedimentos para os 
ensaios de rotina,
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1398
 
— a utilização de sedimentos formulados permite ainda efetuar compara ­
ções de toxicidade e classificar as substâncias em conformidade. Os 
dados de toxicidade obtidos a partir de ensaios com sedimentos naturais e artificiais mostraram-se comparáveis para vários produtos químicos (2).
 
6. São definidos no apêndice 1 alguns conceitos utilizados.  
PRINCÍPIO DO MÉTODO  
7. Expõe-se larvas de quironomídeos do primeiro estádio larvar a uma gama de 
concentrações da substância em estudo em sistemas sedimentos-água. O 
ensaio inicia-se com a colocação de larvas do primeiro estádio larvar nos copos de ensaio com o sistema sedimentos-água, adicionando-se posterior ­
mente a substância em estudo à água. A emergência de quironomídeos e as 
respetivas taxas de desenvolvimento são medidas no final do ensaio. Se 
necessário, a sobrevivência e o peso das larvas podem também ser deter ­
minados decorridos 10 dias, utilizando os replicados adicionais que se jus ­
tifiquem. Os dados são analisados por recurso a um modelo de regressão, de 
forma a estimar a concentração que causaria uma redução de x% na emer ­
gência, na sobrevivência ou no crescimento das larvas (por exemplo, CE
 15 , 
CE 50 , etc.), ou utilizando hipóteses estatísticas, para determinar a NOEC/ 
/LOEC. Este último método exige a comparação de valores que produzem 
efeitos com valores de controlo, por recurso a testes estatísticos.  
INFORMAÇÕES SOBRE A SUBSTÂNCIA EM ESTUDO  
8. Devem ser conhecidas a solubilidade em água e a pressão de vapor da 
substância em estudo, bem como a partição nos sedimentos medida ou calculada e a estabilidade na água e nos sedimentos. Para a quantificação da substância em estudo na água sobrenadante, na água dos poros e nos 
sedimentos, deve dispor-se de um método analítico fiável, com exatidão e 
limite de deteção conhecidos e documentados. A fórmula estrutural e o grau de pureza da substância constituem igualmente informações úteis. O com ­
portamento químico da substância em estudo (p. ex.: dissipação, degradação 
abiótica ou biótica, etc.) é também uma informação importante. Para mais 
orientações sobre o ensaio de substâncias cujas propriedades físico-químicas dificultam a realização dos ensaios, consultar a referência bibliográfica (12).
 
PRODUTOS QUÍMICOS DE REFERÊNCIA  
9. Pode testar-se periodicamente produtos químicos de referência com o obje ­
tivo de garantir a fiabilidade do protocolo e das condições de ensaio. As 
seguintes substâncias constituem exemplos de substâncias tóxicas de refe ­
rência utilizadas com êxito em ensaios interlaboratoriais e em estudos de validação: lindano, trifluralina, pentaclorofenol, cloreto de cádmio e cloreto de potássio (1)(2)(5)(6)(13).
 
VALIDADE DO ENSAIO  
10. Um ensaio é considerado válido se forem cumpridas as seguintes condições:  
— a emergência nos controlos deve ser de, pelo menos, 70 % no final do 
ensaio (1)(6),  
— a emergência de indivíduos adultos das espécies  C. riparius  e C. yos­
himatsui  nos recipientes de controlo deve ocorrer 12 a 23 dias após a 
inserção destas espécies nos recipientes; no caso da  C. tentans , é neces­
sário um período de 20 a 65 dias,  
— no final do ensaio, devem determinar-se o pH e a concentração de 
oxigénio dissolvido em cada recipiente. A concentração de oxigénio deve ser de, pelo menos, 60 % do valor da saturação com ar (VSA) à 
temperatura utilizada e o pH da água sobrenadante deve estar compreen ­
dido entre 6 e 9, em todos os recipientes de ensaio,
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1399
 
— a temperatura da água não deve variar mais de ± 1,0 °C. Esta tempera ­
tura pode ser controlada numa sala isotérmica, caso em que a tempera ­
tura ambiente deve ser confirmada a intervalos adequados.  
DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
Recipientes de ensaio  
11. O estudo é realizado em copos de vidro de 600 ml, com 8 cm de diâmetro. 
Podem utilizar-se outros recipientes, devendo contudo assegurar-se uma 
espessura adequada da água sobrenadante e dos sedimentos. A superfície dos sedimentos deve proporcionar 2 a 3 cm
 2 por cada larva. O rácio entre a 
espessura da camada de sedimentos e a espessura da água sobrenadante 
deve ser de 1:4. Os recipientes de ensaio e o restante equipamento que 
entre em contacto com o sistema de ensaio devem ser exclusivamente de vidro ou de outro material quimicamente inerte (p. ex., Teflon).
 
Seleção das espécies  
12. A espécie a utilizar de preferência no ensaio é a  Chironomus riparius . A 
espécie  Chironomus tentans  também é adequada, mas é mais difícil de 
manipular e exige um período de ensaio mais longo. Pode igualmente 
utilizar-se a  Chironomus yoshimatsui . O apêndice 2 apresenta informações 
sobre os métodos de cultura de  Chironomus riparius . Estão também dispo ­
níveis informações sobre as condições de cultura das espécies  Chironomus 
tentans  (4) e  Chironomus yoshimatsui  (11). A identidade das espécies deve 
ser confirmada antes do ensaio, exceto no caso de organismos provenientes de uma cultura interna do laboratório.
 
Sedimentos  
13. Devem ser utilizados, de preferência, sedimentos formulados (reconstituídos, 
artificiais ou sintéticos). Contudo, se forem utilizados sedimentos naturais, estes devem ser caracterizados (pelo menos pH e teor de carbono orgânico, 
recomendando-se a determinação de outros parâmetros, tais como a razão 
C/N e a granulometria) e devem estar isentos de qualquer contaminação e de outros organismos que possam competir com os quironomídeos ou consumi-los. Recomenda-se igualmente que, antes de serem utilizados 
num ensaio de toxicidade em quironomídeos, os sedimentos naturais sejam 
acondicionados durante sete dias em condições semelhantes às do ensaio subsequente. Recomenda-se que sejam utilizados no presente ensaio (1)(15)(16) sedimentos formulados com a seguinte composição, baseada 
na do solo artificial utilizado no método C.8 (14):
 
a) 4-5 % (massa seca) de turfa: pH tão próximo quanto possível do inter ­
valo 5,5-6,0; é importante utilizar turfa em pó, finamente moída (granu ­
lometria das partículas ≤ 1 mm), unicamente seca ao ar;  
b) 20 % (massa seca) de argila caulinítica, de preferência com teor de 
caulinite superior a 30 %;  
c) 75-76 % (massa seca) de areia quartzítica, com predominância de areia 
fina com mais de 50 % de partículas de granulometria compreendida entre 50 e 200 μm;
 
d) a quantidade de água desionizada necessária para que o teor de humidade 
da mistura final se situe na gama 30-50 %;  
e) a quantidade de carbonato de cálcio (CaCO  3 ) quimicamente puro neces ­
sária para ajustar o pH da mistura final dos sedimentos a 7,0 ± 0,5;  
f) teor de carbono orgânico da mistura final: 2 % ± 0,5 %, devendo ser 
ajustado por recurso a quantidades adequadas de turfa e areia, em con ­
formidade com as alíneas a) e c).  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1400
 
14. As origens da turfa, da argila caulinítica e da areia devem ser conhecidas. 
Deve verificar-se a ausência de contaminação química (p. ex., metais pesa ­
dos, compostos organoclorados, compostos organofosforados, etc.) nos com ­
ponentes dos sedimentos. No apêndice 3, apresenta-se um exemplo de pre ­
paração de sedimentos. Uma mistura de componentes secos também é acei ­
tável caso se demonstre que, após a adição da água sobrenadante, não ocorre 
separação de componentes dos sedimentos (por exemplo, partículas de turfa flutuantes) e que a turfa ou os sedimentos estão suficientemente acondicio ­
nados.
 
Água  
15. Qualquer água com as características químicas de uma água de diluição 
aceitável enunciadas nos apêndices 2 e 4 é adequada para o ensaio. Para a cultura e o ensaio, pode utilizar-se qualquer água adequada, água natural 
(superficial ou subterrânea), água reconstituída (ver o apêndice 2) ou água 
da rede de abastecimento desclorada, desde que os quironomídeos nela sobrevivam durante todo o período de cultura e de ensaio sem evidenciarem sinais de  stress . No início do ensaio, o pH da água de ensaio deve estar 
compreendido entre 6 e 9 e a dureza total da água, expressa em CaCO
 3 , não 
deve exceder 400 mg/l. No entanto, caso se suspeite de uma interação entre os iões responsáveis pela dureza e a substância em estudo, deve utilizar-se uma água de dureza inferior (nessa eventualidade, o meio Elendt M4 não 
pode ser utilizado). Deve utilizar-se o mesmo tipo de água em todo o 
estudo. As características de qualidade da água enumeradas no apêndice 4 devem ser determinadas pelo menos duas vezes por ano, ou sempre que se suspeite que tenham mudado significativamente.
 
Soluções-mãe — água enriquecida  
16. As concentrações de ensaio são calculadas com base nas concentrações da 
água da coluna de água, ou seja, da água sobrenadante dos sedimentos. De 
um modo geral, as soluções de ensaio com as concentrações escolhidas são 
preparadas por diluição de uma solução-mãe. As soluções-mãe devem ser preparadas, de preferência, por dissolução da substância em estudo no meio de ensaio. Em alguns casos, pode ser necessária a utilização de solventes ou 
dispersantes para produzir uma solução-mãe com a concentração adequada. 
A acetona, o etanol, o metanol, os éteres mono e dimetílico do etilenoglicol, a dimetilformamida e o trietilenoglicol constituem exemplos de solventes que podem ser utilizados. No que respeita aos dispersantes, podem 
utilizar-se o Cremophor RH40, o Tween 80, a metilcelulose a 0,01 % e o 
HCO-40. A concentração do agente solubilizante no meio de ensaio final deve ser mínima (ou seja, ≤ 0,1 ml/l) e deve ser a mesma para todas as 
concentrações de exposição. Sempre que se utilize um agente solubilizante, 
este não deve apresentar efeitos significativos na sobrevivência das larvas de 
quironomídeos, nem efeitos adversos observáveis nas mesmas, a confirmar por meio de um controlo do solvente. No entanto, como se referiu acima, devem fazer-se todos os esforços para evitar utilizar tais produtos.
 
PLANEAMENTO DO ENSAIO  
17. O planeamento do ensaio consiste na escolha do número e dos intervalos 
das concentrações de ensaio, do número de recipientes para cada concen ­
tração e do número de larvas por recipiente. Descreve-se de seguida o 
método de estimativa de pontos CE e do NOEC, bem como de realização de ensaios do limite. A análise por regressão linear é preferível à abordagem por testes de hipóteses.
 
Análise por regressão linear  
18. As concentrações testadas no ensaio deverão incluir as concentrações às 
quais se observam efeitos (por exemplo, CE  15 e CE  50 ) e abranger a gama 
de concentrações para as quais o efeito da substância em estudo é signifi ­
cativo. De modo geral, é possível melhorar a exatidão e, em especial, a 
validade das estimativas das concentrações que produzem efeitos (CE  x ) se ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1401
 
essas concentrações se situarem na gama de concentrações ensaiadas. De ­
vem evitar-se extrapolações muito abaixo da concentração positiva mais 
baixa ou acima da concentração mais elevada. É útil efetuar um ensaio exploratório preliminar para a escolha da gama de concentrações a utilizar no ensaio (ver o ponto 27).
 
19. Caso se pretenda estimar uma CE  x , devem ser utilizados, pelo menos, cinco 
concentrações e três replicados de cada concentração. Em qualquer caso, 
para obter uma boa estimativa, é aconselhável ensaiar um número suficiente 
de concentrações. O fator entre as concentrações não deve ser superior a dois (salvo se a curva de resposta à dose tiver um declive reduzido). Pode reduzir-se o número de replicados de cada concentração se for aumentado o 
número de concentrações de ensaio com respostas diferentes. O aumento do 
número de replicados ou a redução dos intervalos entre concentrações in ­
tervalos produz, em geral, intervalos de confiança mais estreitos. Caso se pretenda estimar a sobrevivência e o crescimento das larvas a 10 dias, é 
necessário utilizar mais replicados.
 
Estimativa do NOEC/LOEC  
20. Caso se pretenda estimar o NOEC ou o LOEC, devem ensaiar-se cinco 
concentrações com, pelo menos, quatro replicados, não devendo o fator 
entre as concentrações ser superior a dois. O número de replicados deverá 
ser suficiente para garantir a possibilidade estatística de detetar de forma adequada uma diferença de 20 % relativamente à concentração de controlo, com um grau de significância de 5 % (p = 0,05). No respeitante às taxas de 
desenvolvimento, é geralmente adequada uma análise de 
variância (ANOVA), como o teste de Dunnett ou o teste de Williams (17)(18)(19)(20). Quanto à taxa de emergência, podem utilizar-se o teste de Cochran-Armitage, o teste exato de Fisher (com a correção de Bonfer ­
roni) ou o teste de Mantel-Haentzal.
 
Ensaio do limite  
21. Caso não sejam detetados efeitos no ensaio exploratório preliminar de se ­
leção das concentrações, pode proceder-se a um ensaio do limite (uma 
concentração de ensaio e uma de controlo). O objetivo do ensaio do limite 
consiste em provar que as concentrações tóxicas da substância em estudo são superiores à concentração máxima ensaiada. No âmbito do presente método de ensaio, não é possível sugerir nenhuma concentração a recomen ­
dar; esse critério é deixado à apreciação das entidades regulamentadoras. Em 
geral, são necessários, pelo menos, seis replicados dos organismos expostos e de controlo. Deve comprovar-se existir a possibilidade estatística de de ­
tetar de forma adequada uma diferença de 20 % relativamente ao controlo, 
com um grau de significância de 5 % (p = 0,05). No que respeita ao efeito 
nas taxas de desenvolvimento e na massa, o teste  t é um método estatístico 
adequado se os dados cumprirem os requisitos do teste (normalidade e variâncias homogéneas). Se estes requisitos não forem preenchidos, pode 
utilizar-se um teste  t de variância desigual ou um teste não paramétrico, 
como o de Wilcoxon-Mann-Whithey. No que respeita à taxa de emergência, o teste exato de Fisher é adequado.
 
PROCEDIMENTO  
Condições de exposição  
Preparação do sistema água enriquecida-sedimentos  
22. Coloca-se nos recipientes de ensaio quantidades adequadas de sedimentos 
formulados (ver os pontos 13-14 e o apêndice 3), de modo a formar uma camada com, pelo menos, 1,5 cm de espessura. Junta-se água numa espes ­
sura de 6 cm (ver o ponto 15). A razão entre a espessura da camada de 
sedimentos e a espessura da camada de água não deve exceder 1:4; a espessura da camada de sedimentos não deve exceder 3 cm. O sistema sedimentos-água deve ser sujeito a um arejamento ligeiro durante sete dias, 
antes da introdução dos organismos em estudo (ver o ponto 14 e o apêndice 
3). Para evitar a separação de componentes dos sedimentos e a ressuspensão de materiais finos durante a criação da coluna de água, os sedimentos podem ser cobertos, enquanto a água é vertida, com um disco de plástico 
que se remove imediatamente depois. Podem também utilizar-se outros 
dispositivos.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1402
 
23. Os recipientes de ensaio devem ser cobertos (por exemplo, com placas de 
vidro). Se necessário, o nível inicial de água pode ser reposto durante o 
ensaio, para compensar a evaporação. Para tal, deve utilizar-se água desti ­
lada ou desionizada, de modo a evitar a acumulação de sais.  
Introdução dos organismos em estudo  
24. Quatro a cinco dias antes da introdução dos organismos em estudo nos 
recipientes de ensaio, deve colher-se aglomerados de ovos das culturas e 
colocá-los em pequenos recipientes com o meio de cultura. Pode utilizar-se 
meio proveniente da cultura-mãe ou um meio recentemente preparado. Neste último caso, importa adicionar ao meio de cultura uma pequena quantidade de alimentos, como, por exemplo, algas verdes e/ou algumas gotas de fil ­
trado de uma suspensão de alimento para peixes finamente moído (ver o 
apêndice 2). Apenas devem ser utilizados aglomerados de ovos de postura recente. Normalmente, as larvas começam a eclodir alguns dias após a 
postura dos ovos (2 a 3 dias, a 20 °C, no caso das  Chironomus riparius , 
e 1 a 4 dias no caso das  Chironomus tentans , a 23 °C, e das  Chironomus 
yoshimatsui , a 25 °C); o crescimento das larvas ocorre em quatro estádios 
larvares, cada um com a duração de 4 a 8 dias. Utilizar no ensaio larvas do 
primeiro estádio larvar (2-3 ou 1-4 dias após a eclosão). O estádio larvar dos 
insetos pode, eventualmente, ser verificado por exame da largura da cápsula cefálica (6).
 
25. Com o auxílio de uma pipeta embotada, coloca-se aleatoriamente vinte 
larvas do primeiro estádio larvar em cada recipiente de ensaio contendo os sedimentos e a água. O arejamento da água tem de ser suspenso durante a colocação das larvas nos recipientes de ensaio, assim permanecendo nas 
24 horas subsequentes a esta operação (ver os pontos 24 e 32). Consoante o 
tipo de ensaio realizado (ver os pontos 19 e 20), o número de larvas por concentração deve ser, no mínimo, de 60, no caso de estimativas de pontos CE, e de 80, no caso das determinações de NOEC.
 
26. Vinte e quatro horas após a introdução das larvas, a coluna de água sobre ­
nadante é enriquecida com a substância em estudo, retomando-se um are ­
jamento ligeiro. Com o auxílio de uma pipeta, introduzem-se pequenos 
volumes da solução da substância em estudo abaixo da superfície da água. 
A água sobrenadante deve, em seguida, ser homogeneizada com cuidado, para não perturbar os sedimentos.
 
Concentrações de ensaio  
27. Pode ser útil efetuar um ensaio exploratório para a determinação da gama de 
concentrações a utilizar no ensaio definitivo. Para o efeito, recorre-se a uma 
série de concentrações espaçadas da substância em estudo. Garantido que a densidade de quironomídeos por unidade de superfície seja idêntica à utili ­
zada no ensaio definitivo, os quironomídeos são expostos a cada concen ­
tração da substância em estudo por um período que permita uma estimativa 
das concentrações de ensaio adequadas, não sendo necessários replicados.
 
28. As concentrações a utilizar no ensaio definitivo são decididas com base nos 
resultados do ensaio exploratório. Devem ser utilizadas pelo menos cinco 
concentrações, selecionadas do modo descrito nos pontos 18 a 20.  
Controlos  
29. Deve utilizar-se no ensaio um número adequado de recipientes de controlo 
sem a substância em estudo, mas com os sedimentos (ver os pontos 19-20). Caso se recorra a um solvente para a incorporação da substância em estudo 
(ver o ponto 16), deve efetuar-se um controlo utilizando sedimentos com 
solvente.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1403
 
Sistema de ensaio  
30. São utilizados sistemas estáticos. Em casos excecionais, pode utilizar-se 
sistemas semiestáticos ou sistemas de escoamento com renovação intermi ­
tente ou contínua da água sobrenadante, por exemplo, se as características 
de qualidade da água se tornarem inadequadas ao organismo em estudo ou 
afetarem o equilíbrio químico (isto é, se os teores de oxigénio dissolvido baixarem demasiado, se a concentração de produtos de excreção aumentar demasiado, se ocorrer lixiviação de minerais dos sedimentos que afete o pH 
e/ou dureza da água, etc.). Deve preferir-se, contudo, o recurso a outros 
métodos para melhorar a qualidade da água sobrenadante, como o areja ­
mento, que é, em geral, suficiente.
 
Alimentação  
31. É necessário alimentar as larvas, de preferência diariamente ou, no mínimo, 
três vezes por semana. Utilizar alimento para peixes (suspensão em água ou 
finamente moído, por exemplo, Tetra Min or Tetra-Phyll; ver pormenores no apêndice 2); a quantidade de 0,25-0,5 mg (0,35-0,5 mg no caso de  C. 
yoshimatsui ) por larva e dia afigura-se adequada para as larvas jovens, 
nos primeiros 10 dias. Após este período, pode ser necessária uma quanti ­
dade ligeiramente superior: 0,5-1 mg por larva e dia deve bastar para o resto do ensaio. A ração alimentar deve ser reduzida a todos os organismos expostos e aos controlos caso se observe crescimento fúngico ou se verifi ­
que mortalidade nos controlos. Se não for possível impedir o crescimento 
fúngico, deve repetir-se o ensaio. Quando se estuda substâncias fortemente adsorventes (por exemplo, com log K
 ow > 5) ou substâncias ligadas aos 
sedimentos por ligações covalentes, a quantidade de alimentos necessária 
para assegurar a sobrevivência e o crescimento natural dos organismos pode 
ser adicionada aos sedimentos formulados, antes do período de estabiliza ­
ção. Para esse fim, devem ser utilizados matérias vegetais em vez de ali ­
mentos para peixes; a título de exemplo, 0,5 % (massa seca) de folhas 
finamente moídas de espécies como a urtiga comum ( Urtica dioeca ), a 
amoreira ( Morus alba ), o trevo branco ( Trifolium repens ), o espinafre ( Spi­
nacia oleracea ) ou outras matérias de origem vegetal ( Cerophyl  ou α-celu­
lose).  
Condições de incubação  
32. O arejamento ligeiro da água sobrenadante nos recipientes de ensaio deve 
iniciar-se, de preferência, 24 horas após a introdução das larvas, prosse ­
guindo ao longo de todo o ensaio (deve evitar-se que a concentração de oxigénio dissolvido baixe para valores inferiores a 60 % do VSA). O are ­
jamento é efetuado por intermédio de uma pipeta de Pasteur de vidro, fixada 
2-3 cm acima da camada de sedimentos (caudal: uma ou poucas bolhas por 
segundo). No ensaio de produtos químicos voláteis, pode optar-se por não arejar o sistema sedimentos-água.
 
33. O ensaio é realizado a temperatura constante (20 °C ± 2 °C). No caso das 
espécies  C. tentans  e C. yoshimatsui , as temperaturas recomendadas são 
23 °C e 25 °C (± 2 °C), respetivamente. Utiliza-se um período de irradiação de 16 horas, com uma intensidade luminosa de 500 a 1 000 lux.
 
Duração da exposição  
34. A exposição começa com a introdução das larvas nos recipientes enrique ­
cidos e nos recipientes de controlo. A duração máxima da exposição é de 28 
dias para a  C. riparius  e a C. yoshimatsui  e de 65 dias para a  C. tentans . Se 
os insetos emergirem precocemente, pode pôr-se termo ao ensaio, no míni ­
mo, cinco dias após a emergência do último indivíduo adulto nos recipientes 
de controlo.  
OBSERVAÇÕES  
Emergência  
35. Determina-se o tempo de desenvolvimento e o número total de insetos 
machos e fêmeas totalmente emergidos. Os machos são facilmente identifi ­
cados pelas suas antenas plumosas.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1404
 
36. Os recipientes de ensaio devem ser observados pelo menos três vezes por 
semana, a fim de apreciar visualmente qualquer comportamento anormal 
(por exemplo, saída dos sedimentos, natação anormal) em relação aos reci ­
pientes de controlo. Durante o período de emergência previsto, é necessário proceder à contagem diária dos insetos emergidos. O sexo e o número de 
insetos totalmente emergidos são registados diariamente. Após a identifica ­
ção, removem-se os insetos dos recipientes. Quaisquer aglomerados de ovos postos antes do termo do ensaio devem ser registados e, de seguida, remo ­
vidos, para evitar a reintrodução de larvas nos sedimentos. Regista-se tam ­
bém o número de ninfas visíveis que não emergiram. O apêndice 5 contém 
orientações sobre a mensuração da emergência.
 
Crescimento e sobrevivência  
37. Se for necessário obter dados sobre a sobrevivência e o crescimento das 
larvas em dez dias, deve prever-se recipientes de ensaio suplementares desde 
o início, para que possam ser utilizados posteriormente. Os sedimentos destes recipientes são passados por um crivo com abertura de malha de 250 μm, para reter as larvas. Os critérios de morte são a imobilidade e a 
ausência de reação a estímulos mecânicos. As larvas não recuperadas devem 
também ser contadas como mortas (as larvas que morreram no início do ensaio podem ter sido degradadas por micróbios). Determina-se a massa seca, isenta de cinzas, de larvas sobreviventes em cada recipiente de ensaio, 
calculando-se a massa seca média por recipiente. É útil determinar o estádio 
larvar das larvas sobreviventes; para tal, pode recorrer-se à medição da largura da cápsula cefálica de cada indivíduo.
 
Determinações analíticas  
Concentração da substância em estudo  
38. No início (de preferência uma hora após a aplicação da substância) e no 
final do ensaio, é necessário analisar, no mínimo, amostras da água sobre ­
nadante, da água dos poros e dos sedimentos correspondentes à concentra ­
ção mais elevada e a uma concentração inferior. Estas determinações da concentração da substância em estudo proporcionam informações sobre o 
comportamento e/ou a partição da mesma no sistema água-sedimentos. A 
colheita de amostras dos sedimentos no início do ensaio pode influenciar o sistema (por exemplo, remoção de larvas), pelo que devem ser utilizados recipientes de ensaio adicionais para a realização das determinações analí ­
ticas no início e durante o ensaio, se pertinente (ver o ponto 39). Pode não 
ser necessário efetuar medições nos sedimentos, caso a partição da subs ­
tância em estudo entre a água e os sedimentos tenha sido claramente deter ­
minada num estudo em condições comparáveis (por exemplo, coeficiente de 
partição sedimentos/água, tipo de aplicação, teor de carbono orgânico dos 
sedimentos).
 
39. Quando se efetua medições intermédias (por exemplo, no 7.  o dia) e a análise 
necessita de amostras grandes que não podem ser colhidas dos recipientes de ensaio sem influenciar o sistema em estudo, as determinações analíticas devem ser realizadas com amostras colhidas de recipientes de ensaio suple ­
mentares tratados da mesma forma (incluindo a presença dos organismos em 
estudo), mas que não são alvo de observações biológicas.
 
40. A centrifugação a cerca de 10 000 g e 4  o C, durante 30 minutos, é o 
procedimento recomendado para isolar a água intersticial. No entanto, caso se demonstre que a substância em estudo não é adsorvida aos filtros, a filtragem também é aceitável. Em alguns casos, se a amostra for dema ­
siado pequena, poderá não ser possível analisar concentrações na água dos 
poros.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1405
 
Parâmetros físico-químicos  
41. O pH, o teor de oxigénio dissolvido na água e a temperatura dos recipientes 
de ensaio devem ser medidos de forma adequada (ver o ponto 10). A dureza e o ião amónio devem ser medidos nos recipientes de controlo e num 
recipiente de ensaio com a concentração mais elevada, no início e no final 
do ensaio.
 
DADOS E RELATÓRIOS  
Tratamento dos resultados  
42. O objetivo deste ensaio consiste em determinar o efeito da substância em 
estudo nas taxas de desenvolvimento e no número total de insetos machos e fêmeas totalmente emergidos ou, no caso dos ensaios de 10 dias, os efeitos 
na sobrevivência e no peso das larvas. Se não houver indicação de sensi ­
bilidades estatisticamente diferentes entre os sexos, os resultados relativos aos machos e às fêmeas podem ser agrupados para efeitos de análise esta ­
tística. As diferenças de sensibilidade entre os sexos podem ser avaliadas 
estatisticamente, por exemplo, recorrendo a um ensaio de tabela de contin ­
gência χ
 2 -r x 2. Se necessário, determina-se a sobrevivência das larvas e a 
massa seca por recipiente após 10 dias.  
43. As concentrações com efeitos, expressas em relação à água sobrenadante, 
são calculadas de preferência a partir das concentrações medidas nos sedi ­
mentos no início do ensaio (ver o ponto 38).  
44. Para efetuar uma estimativa pontual do valor CE  50 ou de qualquer valor 
CE x , podem equiparar-se os dados estatísticos por recipiente aos de ensaios 
idênticos reais. No cálculo de um intervalo de confiança para qualquer valor CE
 x , importa ter em conta a variabilidade entre recipientes, ou deve 
demonstrar-se que essa variabilidade é tão reduzida que pode ser ignorada. 
Se o modelo for ajustado pelo método dos mínimos quadrados, deve aplicar-se uma transformação aos dados estatísticos por recipiente, para melhorar a homogeneidade da variância. Contudo, os valores de CE
 x só 
devem ser calculados após retransformação da resposta no valor original.  
45. Se a análise estatística tiver por objetivo determinar o NOEC/LOEC utili ­
zando hipóteses estatísticas, importa ter em conta a variabilidade entre re ­
cipientes, por exemplo, aplicando um método ANOVA hierarquizado. Se 
não se verificarem os pressupostos comuns do método ANOVA, testes mais robustos podem constituir uma alternativa adequada (21).
 
Taxa de emergência  
46. As taxas de emergência são dados de "tudo ou nada", que podem ser 
analisados através de um teste de Cochran-Armitage aplicado de forma 
regressiva, nos casos em que se prevê uma relação monótona entre a dose fornecida e a resposta e os dados são compatíveis com a previsão. Caso contrário, pode recorrer-se a um teste exato de Fisher ou a um teste de 
Mantel-Haentzal com valores  p ajustados segundo o método de 
Bonferroni-Holm. Se, para a mesma concentração, houver indícios de uma maior variabilidade entre replicados do que a sugerida por uma distribuição binomial (frequentemente referida como variação "extrabinomial"), deve 
utilizar-se um teste exato de Fisher ou um teste de Cochran-Armitage ro ­
busto, como proposto na referência 21.
 
47. Determina-se a soma dos insetos emergidos por recipiente, ne, que é segui ­
damente dividida pelo número de larvas nele introduzidas, na:  
ER ¼ n e 
n a ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1406
 
em que:  
ER = Taxa de emergência  
n e = Número de insetos emergidos no recipiente  
n a = Número de larvas introduzidas no recipiente  
48. Uma alternativa mais adequada a amostras grandes, quando se regista va ­
riância extrabinomial, consiste em considerar a taxa de emergência uma resposta contínua e aplicar procedimentos como o teste de William, caso 
se preveja uma relação monótona entre a dose fornecida e a resposta, 
compatível com os dados de taxa de emergência em causa. Por seu turno, o teste de Dunnett é adequado aos casos em que não se regista uma relação monótona. Neste contexto, uma amostra "grande" é definida como aquela 
em que o número total de insetos emergidos e não emergidos é superior a 
cinco por replicado (recipiente).
 
49. A aplicação de métodos ANOVA implica que os valores de taxa de emer ­
gência sejam sujeitos a uma transformação de arco-seno da raiz quadrada ou a uma transformação de Tukey-Freeman, de forma a obter uma distribuição 
aproximadamente normal e uniformizar as variâncias. Os testes de 
Cochran-Armitage, exato de Fisher (Bonferroni) e Mantel-Haentzal podem ser aplicados quando se utilizam frequências absolutas. A transformação de arco-seno da raiz quadrada consiste em calcular o inverso do seno (sin
 –1 ) da 
raiz quadrada do valor da taxa de emergência.  
50. No respeitante às taxas de emergência, os valores de CE  x são calculados por 
análise de regressão — por exemplo, por recurso aos modelos  probit  (22),  
logit ou Weibull ou a programas informáticos comerciais adequados). Em 
caso de fracasso da análise de regressão (por exemplo, se o número de 
respostas parciais for inferior a dois), utilizam-se outros métodos não para ­
métricos, como a média móvel ou a simples interpolação.  
Taxa de desenvolvimento  
51. O tempo médio de desenvolvimento representa o tempo médio decorrido 
entre a introdução das larvas (dia 0 do ensaio) e a emergência da coorte experimental de insetos (para o cálculo do tempo de desenvolvimento real, é 
necessário ter em conta a idade das larvas no momento da introdução). A 
taxa de desenvolvimento é o inverso do tempo de desenvolvimento (unida ­
de: 1/dia) e representa a quantidade de desenvolvimento larvar que ocorre 
por dia. A taxa de desenvolvimento é o parâmetro preferido para a avaliação 
destes estudos de toxicidade dos sedimentos, dado que a sua variância é mais baixa que a do tempo de desenvolvimento, sendo também mais ho ­
mogénea e mais próxima da distribuição normal. Os testes paramétricos 
mais potentes estão mais adaptados à taxa de desenvolvimento do que ao 
tempo de desenvolvimento. Considerando a taxa de desenvolvimento uma resposta contínua, os valores de CE
 x podem ser estimados por recurso a 
uma análise de regressão – por exemplo, como descrito em 23 e 24.  
52. No contexto dos testes estatísticos que se seguem, considera-se que o nú ­
mero de insetos observado no dia de inspeção  x emergiu no ponto médio do 
intervalo de tempo compreendido entre o dia  x e o dia  x-d (d = duração do 
intervalo de inspeção, em geral 1 dia). A taxa de desenvolvimento média por recipiente (é calculada com base nas seguintes equações:
 
x ¼ X  m 
i¼1 ƒ i x i 
n e 
em que:  
x: Taxa de desenvolvimento média por recipiente  
i: Índice do intervalo de inspeção  
m: Número máximo de intervalos de inspeção  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1407
 
ƒ i : Número de insetos emergidos no intervalo de inspeção  i 
n e : Número de insetos emergidos no final do ensaio (=  P ƒ i ) 
x i : Taxa de desenvolvimento dos insetos emergidos no intervalo  i 
x i ¼ 1= Í 
day  i Ä l i 
2 Î 
em que:  
dia i : Dia de inspeção (n.  o de dias decorridos desde a introdução dos or ­
ganismos)  
d i : Duração do intervalo de inspeção  i (dias, normalmente 1 dia)  
Relatório dos ensaios  
53. O relatório dos ensaios deve incluir, no mínimo, as seguintes informações:  
Substância em estudo:  
— natureza física e, quando pertinente, propriedades físico-químicas (solu ­
bilidade na água, pressão de vapor, coeficiente de partição no solo — ou nos sedimentos, se disponível —, estabilidade em água, etc.),
 
— dados de identificação química (denominação comum, denominação quí ­
mica, fórmula estrutural, número CAS, etc.), incluindo o grau de pureza e o método analítico de quantificação da substância.
 
Espécies utilizadas nos ensaios:  
— animais: espécie, nome científico, origem dos organismos e condições de 
reprodução,  
— informações sobre o manuseamento dos aglomerados de ovos e das 
larvas,  
— idade dos animais quando introduzidos nos recipientes de ensaio.  
Condições experimentais:  
— sedimentos utilizados, isto é, de origem natural ou formulados,  
— no caso dos sedimentos naturais, localização e descrição do local de 
colheita, incluindo, se possível, o historial de contaminação; caracterís ­
ticas: pH, teor de carbono orgânico, razão C/N e granulometria (se 
pertinente),  
— preparação dos sedimentos formulados: ingredientes e características 
(teor de carbono orgânico, pH, humidade, etc., no início dos ensaios),  
— preparação da água para os ensaios, caso seja utilizada água recons ­
tituída, e respetivas características (concentração de oxigénio, pH, con ­
dutividade, dureza, etc., no início dos ensaios);  
— espessura dos sedimentos e da água sobrenadante,  
— volume de água sobrenadante e de água dos poros; massa do sedimento 
húmido com e sem a água dos poros,  
— recipientes de ensaio (material e dimensões),  
— método de preparação das soluções-mãe e concentrações de ensaio,  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1408
 
— aplicação da substância em estudo: concentrações de ensaio utilizadas, 
número de replicados e solvente utilizado, se for o caso,  
— condições de incubação: temperatura, ciclo de luz e intensidade lumino ­
sa, arejamento (frequência e intensidade),  
— informações pormenorizadas sobre a alimentação dos organismos, in ­
cluindo o tipo de alimentos, a preparação, a quantidade e o regime alimentar.
 
Resultados:  
— concentrações de ensaio nominais, concentrações de ensaio medidas e 
resultados de todas as análises efetuadas para determinar a concentração da substância em estudo nos recipientes de ensaio,
 
— qualidade da água nos recipientes de ensaio (pH, temperatura, oxigénio 
dissolvido, dureza e teor de ião amónio),  
— renovação da água evaporada nos ensaios, se for o caso,  
— número de insetos machos e fêmeas emergidos por recipiente e dia,  
— número de larvas que não originaram insetos, por recipiente,  
— massa seca média de larvas por recipiente e, se for caso disso, por 
estádio larvar,  
— percentagem de emergência por replicado e por concentração de ensaio 
(machos e fêmeas no seu conjunto),  
— taxa média de desenvolvimento de insetos totalmente emergidos por 
replicado e por concentração de ensaio (machos e fêmeas no seu con ­
junto),  
— estimativas de parâmetros de toxicidade, como, por exemplo, CE  x (e os 
intervalos de confiança associados), NOEC e/ou LOEC, e métodos es ­
tatísticos utilizados para a determinação dos mesmos,  
— discussão dos resultados, incluindo qualquer influência nos resultados do 
ensaio decorrente de alterações efetuadas ao presente método de ensaio.  
REFERÊNCIAS:  
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edição, de junho de 1994.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1409
 
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tebrates.  
(8) US-EPA/OPPTS 850.1790. (1996): Chironomid Sediment toxicity Test.  
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(13) Environment Canada (1995). Guidance Document on Measurement of To ­
xicity Test Precision Using Control Sediments Spiked with a Reference Toxicant. Report EPS 1/RM/30. Setembro de 1995.
 
(14) Capítulo C.8 deste anexo: Toxicidade em relação às minhocas.  
(15) Suedel B.C., Rodgers J.H. (1994). Development of formulated reference 
sediments for freshwater and estuarine sediment testing.  Environ. Toxicol. 
Chem.  13: 1163-1175.  
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(18) Dunnett C.W. (1964). New tables for multiple comparisons with a control.  
Biometrics  20: 482-491.  
(19) Williams D.A. (1971). A test for differences between treatment means when 
several dose levels are compared with a zero dose control.  Biometrics  27: 
103-117.  
(20) Williams D.A. (1972). The comparison of several dose levels with a zero 
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(24) Slob W. (2002). Dose-response modelling of continuous endpoints.  Toxicol. 
Sci. 66: 298-312.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1410
 
Apêndice 1  
DEFINIÇÕES  
No âmbito do presente método, aplica-se as seguintes definições:  
Sedimentos formulados  ou reconstituídos, artificiais ou sintéticos: mistura de 
matérias utilizadas para simular os componentes físicos de sedimentos naturais.  
Água sobrenadante : água situada acima da superfície dos sedimentos, no reci ­
piente de ensaio.  
Água intersticial  ou água dos poros: água que ocupa o espaço entre as partículas 
de sedimentos e de solo.  
Água enriquecida : água utilizada no ensaio, à qual foi adicionada a substância 
em estudo.  
Produto químico em estudo:  qualquer substância ou mistura à qual seja apli ­
cado o presente método de ensaio.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1411
 
Apêndice 2  
Recomendações para a cultura de  Chironomus riparius  
1. As larvas de  Chironomus  podem ser criadas em caixas de cristalização ou 
recipientes de maiores dimensões. Espalha-se no fundo do recipiente areia quartzítica fina de modo a constituir uma camada fina com 5 a 10 mm de espessura. Verificou-se que o  kieselguhr  (p. ex. Merck 8117) é também um 
substrato adequado; neste caso, pode utilizar-se uma camada mais fina, da 
ordem de poucos milímetros. Adiciona-se de seguida uma coluna de vários centímetros de uma água adequada. Se necessário, os níveis de água podem ser repostos para compensar a evaporação e evitar a dessecação. A água 
pode ser substituída, se necessário. Deve efetuar-se um arejamento ligeiro. 
Os recipientes de criação das larvas devem ser mantidos em gaiolas ade ­
quadas, de forma a evitar fugas de adultos emergentes. A gaiola deve ser suficientemente grande (no mínimo, cerca de 30 x 30 x 30 cm), para per ­
mitir a enxameação dos adultos emergidos, sem o que poderá não ocorrer 
copulação.
 
2. As gaiolas devem ser mantidas à temperatura ambiente ou a uma tempera ­
tura constante de 20 ± 2 °C, com um período de luminosidade (cerca de 
1 000 lux) de 16 horas e oito horas de escuridão. Existem referências documentais de que um teor de humidade relativa do ar inferior a 60 % pode impedir a reprodução.
 
Água de diluição  
3. Pode utilizar-se qualquer água natural ou reconstituída adequada. Utiliza-se 
em geral água de poços, água da rede de abastecimento desclorada e meios 
artificiais (por exemplo, meio Elendt M4 ou M7; ver abaixo). A água tem de ser arejada antes da utilização. Se necessário, a água das culturas pode ser renovada por vazamento ou sifonagem cuidadoso da água dos recipien ­
tes de cultura, para não destruir os tubos das larvas.
 
Alimentação das larvas  
4. As larvas de  Chironomus  são alimentadas com cerca de 250 mg por reci ­
piente e por dia de um alimento floculado para peixes (Tetra Min®, Tetra Phyll® ou outra marca semelhante). Os alimentos podem ser administrados na forma de um pó seco finamente moído ou de uma suspensão em água: 
adicionar 1,0 g de alimento floculado a 20 ml de água de diluição e mis ­
turar de modo a obter uma mistura homogénea. Esta preparação pode ser administrada ao caudal aproximado de 5 ml por recipiente e por dia (agitar antes da utilização). Pode administrar-se às larvas de idade superior uma 
maior quantidade de alimento.
 
5. A alimentação é ajustada em função da qualidade da água. Se o meio de 
cultura se tornar turvo, deve reduzir-se a alimentação. A administração de 
alimentos deve ser objeto de um registo minucioso. A escassez de alimentos 
causaria a migração das larvas para a coluna de água, enquanto uma ali ­
mentação demasiado rica aumentaria a atividade microbiana e reduziria a concentração de oxigénio. Ambas estas condições podem resultar numa 
redução das taxas de crescimento.
 
6. Ao preparar novos recipientes de cultura, podem também adicionar-se al ­
gumas células de algas verdes (por exemplo,  Scenedesmus subspicatus  e 
Chlorella vulgaris ). 
Alimentação dos adultos emergidos  
7. Alguns experimentadores sugeriram que um tampão de algodão embebido 
numa solução saturada de sacarose pode servir de alimento para os adultos 
emergidos.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1412
 
Emergência  
8. À temperatura de 20 ± 2 °C, os adultos começam a emergir dos recipientes 
de criação das larvas decorridos 13 a 15 dias. Os machos são facilmente distinguidos pelas suas antenas plumosas.
 
Aglomerados de ovos  
9. Quando se encontrarem presentes adultos nas gaiolas de criação, deve 
verificar-se três vezes por semana se ocorre a deposição de aglomerados 
gelatinosos de ovos nos recipientes de criação das larvas. Se tal suceder, devem ser removidos com cuidado e ser transferidos para uma pequena cápsula com uma amostra da água de incubação. Os aglomerados de 
ovos são utilizados para iniciar novas culturas noutros recipientes (p. ex., 
2-4 aglomerados de ovos por recipiente) ou em ensaios de toxicidade.
 
10. As larvas do primeiro estádio larvar devem eclodir decorridos 2-3 dias.  
Preparação de novos recipientes de cultura  
11. Quando as culturas estiverem estabelecidas, deverá ser possível preparar um 
novo recipiente de cultura de larvas por semana, ou com uma frequência 
menor (consoante os requisitos dos ensaios), removendo os recipientes mais 
antigos após a emergência dos insetos adultos. O recurso a este sistema permitirá obter um aprovisionamento regular de insetos adultos com uma gestão mínima.
 
Preparação das soluções de ensaio M4 e M7  
12. O meio M4 foi descrito por Elendt (1990). O meio M7 é preparado do 
mesmo modo que o M4, exceto no que respeita às substâncias indicadas no 
quadro 1, cujas concentrações são quatro vezes inferiores às do meio M4. Encontra-se em preparação um artigo sobre o meio M7 (Elendt, comunica ­
ção pessoal). A solução de ensaio não deve ser preparada em conformidade 
com as indicações de Elendt e Bias (1990), dado as concentrações de 
NaSiO3.5H2O, NaNO3, KH2PO4 e K2HPO4 apresentadas para a prepara ­
ção das soluções-mãe não serem adequadas.
 
Preparação do meio M7  
13. Cada solução-mãe (I) é preparada individualmente, sendo preparada uma 
solução-mãe combinada (II) a partir dessas soluções (I) (ver o quadro 1). O 
meio M7 é preparado diluindo para 1 l, com água desionizada, 50 ml da 
solução-mãe combinada (II) e as quantidades de cada solução-mãe de ma ­
cronutrientes indicadas no quadro 2. Prepara-se uma solução-mãe de vita ­
minas juntando três vitaminas a água desionizada, como indicado no quadro 
3; adiciona-se 0,1 ml da solução-mãe combinada de vitaminas ao meio M7 
final pouco antes da utilização (a solução-mãe de vitaminas é armazenada por congelação, em pequenas alíquotas). O meio é arejado e estabilizado.
 
Quadro 1  
Soluções-mãe de elementos vestigiais para os meios M4 e M7  
Soluções-mãe (I) Quantidade (mg) 
diluída para 1 
litro com água 
desionizada Para preparar a solução-mãe 
combinada (II), misturar as seguintes 
quantidades (ml) de soluções-mãe (I) 
e diluir para 1 litro com água 
desionizada Concentrações finais nas soluções de 
ensaio (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
H 3 BO 3 ( 1 ) 57 190 1,0 0,25 2,86 0,715 
MnCl  2 · 4 H  2 O (  1 ) 7 210 1,0 0,25 0,361 0,090 
LiCl (  1 ) 6 120 1,0 0,25 0,306 0,077  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1413
 
Soluções-mãe (I) Quantidade (mg) 
diluída para 1 
litro com água 
desionizada Para preparar a solução-mãe 
combinada (II), misturar as seguintes 
quantidades (ml) de soluções-mãe (I) 
e diluir para 1 litro com água 
desionizada Concentrações finais nas soluções de 
ensaio (mg/l) 
M4 M7 M4 M7  
RbCl (  1 ) 1 420 1,0 0,25 0,071 0,018 
SrCl  2 · 6 H  2 O (  1 ) 3 040 1,0 0,25 0,152 0,038 
NaBr (  1 ) 320 1,0 0,25 0,016 0,004 
Na 2 MoO  4 · 2 H  2 O (  1 ) 1 260 1,0 0,25 0,063 0,016 
CuCl  2 · 2 H  2 O (  1 ) 335 1,0 0,25 0,017 0,004 
ZnCl  2 260 1,0 1,0 0,013 0,013 
CaCl  2 · 6 H  2 O 200 1,0 1,0 0,010 0,010 
KI 65 1,0 1,0 0,0033 0,0033 
Na 2 SeO  3 43,8 1,0 1,0 0,0022 0,0022 
NH  4 VO  3 11,5 1,0 1,0 0,00058 0,00058 
Na 2 EDTA · 2 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 5 000 20,0 5,0 2,5 0,625 
FeSO  4 · 7 H  2 O (  1 ) ( 2 ) 1 991 20,0 5,0 1,0 0,249  
( 1 ) Estas substâncias são diferentes nos meios M4 e M7, como se indica no quadro. 
( 2 ) Estas soluções são preparadas individualmente, misturadas e colocadas de imediato numa autoclave.  
Quadro 2  
Soluções-mãe de macronutrientes para os meios M4 e M7  
Quantidade (mg) 
diluída para 1 litro 
com água desionizada Quantidade de 
soluções-mãe de 
macronutrientes adicionada 
para preparar os meios M4 
e M7 
(ml/l) Concentrações finais 
nas soluções de ensaio 
M4 e M7 
(mg/l)  
CaCl  2 · 2 H  2 O 293 800 1,0 293,8 
MgSO  4 · 7 H  2 O 246 600 0,5 123,3 
KCl 58 000 0,1 5,8 
NaHCO  3 64 800 1,0 64,8 
NaSiO  3 · 9 H  2 O 50 000 0,2 10,0 
NaNO  3 2 740 0,1 0,274 
KH  2 PO 4 1 430 0,1 0,143 
K 2 HPO  4 1 840 0,1 0,184  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1414
 
Quadro 3  
Soluções-mãe de vitaminas para os meios M4 e M7  
As três soluções de vitaminas são combinadas para originar uma única solução-mãe.  
Quantidade (mg) diluída 
para 1 litro com água 
desionizada Quantidade de solução-mãe 
de vitaminas adicionada para 
preparar os meios M4 e M7 
(ml/l) Concentrações finais nas 
soluções de ensaio M4 e 
M7 
(mg/l)  
Cloridrato de tiamina 750 0,1 0,075 
Cianocobalamina (B12) 10 0,1 0,0010 Biotina 7,5 0,1 0,00075
 
REFERÊNCIAS  
BBA (1995). Long-term toxicity test with Chironomus riparius: Development and 
validation of a new test system. Editado por M. Streloke e H. Köpp. Berlim, 1995.
 
Elendt B.P. (1990). Selenium Deficiency in Crustacean.  Protoplasma  154: 25-33.  
Elendt B.P., Bias W.-R. (1990). Trace Nutrient Deficiency in  Daphnia magna  
Cultured in Standard Medium for Toxicity Testing. Effects on the Optimization 
of Culture Conditions on Life History Parameters of  D. magna . Water Research  
24 (9): 1157-1167.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1415
 
Apêndice 3  
PREPARAÇÃO DOS SEDIMENTOS FORMULADOS  
Composição dos sedimentos  
A composição dos sedimentos formulados deve ser a seguinte:  
Componente Características % da massa 
seca dos sedimentos  
Turfa Turfa de  Sphagnum , com pH 
tão próximo quanto possível do intervalo 5,5-6,0, sem res ­
tos visíveis de plantas, fina ­
mente moída (granulometria ≤ 1 mm) e seca ao ar 4-5 
Areia quartzítica Granulometria: > 50 % das 
partículas de granulometria na gama 50-200 μm 75-76 
Argila caulinítica Teor de caulinite ≥ 30 % 20 
Carbono orgânico Ajustado por adição de turfa 
e areia 2 (±0,5) 
Carbonato de cácio CaCO
 3 pulverizado quimica ­
mente puro 0,05-0,1 
Água Condutividade ≤ 10 μS/cm 30-50  
Preparação  
A turfa é seca ao ar e moída até se obter um pó fino. Prepara-se uma suspensão 
da quantidade necessária de turfa pulverizada em água desionizada, por recurso a um dispositivo de homogeneização de alta eficiência. O pH desta suspensão é 
ajustado para 5,5 ± 0,5 com CaCO
 3 . A suspensão é acondicionada durante, pelo 
menos, dois dias, com agitação ligeira a 20 ± 2 °C, para estabilizar o pH e estabelecer um perfil microbiano estável. Findo este período, determina-se nova ­
mente o pH, que deve ser de 6,0 ± 0,5. A suspensão de turfa é então misturada 
com os outros componentes (areia e argila caulinítica) e água desionizada, de 
forma a obter sedimentos homogéneos com um teor de água da ordem de 30 %- -50 % da massa seca dos sedimentos. O pH da mistura final é determinado uma vez mais e, se necessário, ajustado para 6,5-7,5 com CaCO
 3 . São colhidas amos ­
tras dos sedimentos para determinar o resíduo seco e o teor de carbono orgânico. 
Recomenda-se que, antes de ser utilizados num ensaio de toxicidade em quiro ­
nomídeos, os sedimentos formulados sejam acondicionados durante sete dias em condições idênticas às do ensaio subsequente.
 
Armazenagem  
Os componentes secos para a preparação dos sedimentos artificiais podem ser 
armazenados num local seco e fresco, à temperatura ambiente. Os sedimentos 
formulados (húmidos) não devem ser armazenados antes da sua utilização nos ensaios. Devem ser utilizados imediatamente após o período de acondiciona ­
mento de sete dias que conclui a sua preparação.
 
REFERÊNCIAS:  
Capítulo C.8 deste anexo: Toxicidade em relação às minhocas.  
Meller M., Egeler P., Rombke J., Schallnass H., Nagel R., Streit B. (1998). 
Short-term Toxicity of Lindane, Hexachlorobenzene and Copper Sulfate on Tu ­
bificid Sludgeworms (Oligochaeta) in Artificial Media.  Ecotox. and Environ. 
Safety  39: 10-20.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1416
 
Apêndice 4  
Características químicas de uma água de diluição adequada  
Substância Concentrações  
Partículas < 20 mg/l 
Carbono orgânico total < 2 mg/l Amoníaco não ionizado < 1 μg/l 
Dureza expressa em CaCO
 3 < 400 mg/l (*) 
Cloro residual < 10 μg/l 
Pesticidas organofosforados totais < 50 ng/l Soma dos pesticidas organoclorados e dos bifenilos 
policlorados, totais < 50 ng/l 
Cloro orgânico total < 25 ng/l
 
(*) Contudo, caso se suspeite da existência de uma interação entre os iões responsáveis pela 
dureza e a substância em estudo, deve utilizar-se uma água mais macia (nesse caso, o 
meio Elendt M4 não pode ser utilizado).  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1417
 
Apêndice 5  
Orientações para a monitorização da emergência das larvas de 
quironomídeos  
Os copos de ensaio são munidos de armadilhas de emergência. Estas armadilhas 
são necessárias a partir do vigésimo dia, até ao final do ensaio. A título de 
exemplo, pode utilizar-se o dispositivo abaixo ilustrado:
  
A: tela de nylon  
B: copo de plástico invertido  
C: copo de exposição sem bico  D: aberturas recobertas, para renovação da água  
E: água  
F: sedimentos  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1418
 
C.29.  BIODEGRADABILIDADE "FÁCIL" — CO  2 EM RECIPIENTES 
FECHADOS (Ensaio do espaço livre)  
INTRODUÇÃO  
1. O presente método de ensaio é equivalente ao  Test Guideline  TG 310 da 
OCDE (2006). Consiste num método exploratório para a avaliação da bio ­
degradabilidade "fácil" dos produtos químicos e proporciona informações semelhantes às dos seis métodos de ensaio descritos no capítulo C.4 do presente anexo (A a F). Assim, um produto químico com resultados posi ­
tivos neste método de ensaio pode ser considerado facilmente biodegradável 
e, por conseguinte, rapidamente degradável no ambiente.
 
2. O método do dióxido de carbono (CO  2 ) (1), que se encontra bem implan ­
tado, baseia-se no ensaio original de Sturm (2) para a avaliação da biode ­
gradabilidade de produtos químicos orgânicos através da medição do dió ­
xido de carbono produzido pela ação microbiana e tem constituído, em 
geral, a primeira opção para o ensaio de produtos químicos pouco solúveis e de produtos químicos muito adsorventes. É também aplicado a produtos 
químicos solúveis (mas não voláteis), uma vez que a libertação de dióxido 
de carbono é frequentemente considerada a única prova inequívoca de ati ­
vidade microbiana. A remoção do carbono orgânico dissolvido pode ter lugar por processos físico-químicos, como a adsorção, a volatilização, a 
precipitação e a hidrólise, bem como pela ação microbiana e por muitas 
reações não biológicas que consomem oxigénio; o CO
 2 raramente é produ ­
zido a partir de produtos químicos orgânicos por via abiótica. Nos ensaios original e modificado de Sturm (1)(2), o CO
 2 é removido da fase líquida 
para os recipientes de absorção por borbulhamento, no meio líquido, de ar 
tratado com o objetivo de remover o CO  2 ; na versão de Larson (3)(4), é 
transferido do recipiente de reação para os absorventes introduzindo um fluxo de ar isento de CO
 2 no espaço livre acima da superfície (" heads­
pace "), com agitação contínua do recipiente de ensaio. O recipiente só é 
agitado no caso da modificação de Larson; a agitação é prescrita, apenas para produtos químicos insolúveis, na norma ISO 9439 (5) e na versão original dos EUA (6), que preconizam ambas o borbulhamento em vez da 
substituição do ar no espaço livre acima da superfície. Em outro método 
oficial da EPA — Estados Unidos da América (7) —, que se baseia no método de Gledhill (8), o recipiente de reação, sob agitação, encontra-se estanque e o CO
 2 produzido é recolhido, diretamente a partir da fase gasosa, 
num coletor interno com uma substância alcalina, como nos respirómetros 
clássicos de Warburg/Barcroft.  
3. Contudo, no caso da aplicação do ensaio de Sturm modificado a vários 
produtos químicos (9), demonstrou-se que, durante o ensaio, se acumula 
no meio carbono inorgânico (CI). Na degradação de 20 mg C/l de anilina, 
por exemplo, observou-se uma concentração de carbono inorgânico da or ­
dem de 8 mg/l. Assim, a recolha de CO  2 em coletores com substâncias 
alcalinas traduz a quantidade real daquele gás produzida microbiologica ­
mente nas fases intermédias da degradação. Por conseguinte, a exigência 
de mais de 60 % da produção máxima teórica de CO  2 (CO  2 Te) ser recolhida 
nos dez dias imediatamente após ser alcançado um nível de 10 % de biode ­
gradação ("período de dez dias"), para que um produto químico seja clas ­
sificado de facilmente biodegradável, não é cumprida no caso de alguns 
produtos químicos, que teriam essa classificação utilizando como critério a remoção do carbono orgânico dissolvido (COD).
 
4. Se a percentagem de degradação for inferior ao previsto, ter-se-á possivel ­
mente acumulado carbono inorgânico na solução de ensaio. A biodegrada ­
bilidade pode, então, ser avaliada por recurso aos outros ensaios de biode ­
gradabilidade "fácil".  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1419
 
5. Outros inconvenientes do método de Sturm (complexidade, morosidade, 
propensão para a ocorrência de erros experimentais e impossibilidade de 
aplicação a produtos químicos voláteis) tinham já levado à procura de uma técnica com recipientes selados diversa da de Gledhill, sem fluxo de gás (10)(11). Boatman  et al.  (12) analisaram os métodos mais antigos e 
adotaram um sistema fechado com libertação de CO
 2 no espaço livre no 
final da incubação, por acidificação do meio. O CO  2 foi determinado através 
da análise do carbono inorgânico por cromatografia em fase gasosa a partir de amostras colhidas automaticamente no espaço livre, sem ter em conta o 
carbono inorgânico dissolvido (CID) na fase líquida. Além disso, foram 
utilizados recipientes muito pequenos (20 ml), com apenas 10 ml de meio, o que causou problemas, por exemplo, ao adicionar as quantidades neces ­
sariamente muito reduzidas de produtos químicos insolúveis e/ou no caso da 
inexistência ou insuficiência, no meio inoculado, de microrganismos para 
a degradação dos produtos químicos em estudo.
 
6. Essas dificuldades foram superadas pelos estudos independentes de Struijs e 
Stoltenkamp (13) e de Birch e Fletcher (14), sendo os destes últimos ins ­
pirados pela experiência dos autores com dispositivos utilizados em ensaios de biodegradação anaeróbia (15). No método dos primeiros (13), o CO
 2 é 
determinado no espaço livre após acidificação e equilíbrio, enquanto no 
segundo método (14) é determinado o carbono inorgânico dissolvido das 
fases gasosa e líquida, sem tratamento; mais de 90 % do carbono inorgânico formado encontra-se na fase líquida. Ambos os métodos têm vantagens relativamente ao ensaio de Sturm, na medida em que o sistema de ensaio 
é mais compacto e mais gerível, podem estudar-se produtos químicos volá ­
teis e evita-se a possibilidade de demoras na determinação do CO
 2 produ­
zido.  
7. Ambas as abordagens foram combinadas na norma ISO com a referência 16, 
que foi sujeita a um ensaio interlaboratorial (17) e constitui a base do presente método de ensaio. O método da EPA dos Estados Unidos da América (18) utiliza também as duas abordagens. Foram recomendados 
dois métodos de determinação do CO
 2 , designadamente a determinação 
no espaço livre após acidificação (13) e a determinação do carbono inorgâ ­
nico na fase líquida após adição de um agente alcalino em excesso. Este último método foi introduzido por Peterson, no decurso do ensaio interla ­
boratorial da CONCAWE (19) do presente método de espaço livre modifi ­
cado para determinar biodegradabilidades intrínsecas. As alterações introdu ­
zidas na revisão de 1992 dos métodos do capítulo C.4 deste anexo, relativos à determinação da biodegradabilidade "fácil" (20), foram incorporadas no 
presente método de ensaio, pelo que, além disso, as condições (meio, du ­
ração, etc.) são as mesmas que as do ensaio de Sturm revisto (20). Birch e Fletcher (14) referiram ter obtido com este ensaio de espaço livre resultados muito semelhantes aos obtidos, para os mesmos produtos químicos, no 
ensaio interlaboratorial dos métodos de ensaio revistos promovido pela 
OCDE (21).
 
PRINCÍPIO DO MÉTODO  
8. O produto químico em estudo, em geral na concentração de 20 mg C/l, que 
constitui a única fonte de carbono e energia, é incubado num tampão de sais 
minerais previamente inoculado com uma população mista de microrganis ­
mos. O ensaio é realizado em recipientes selados, com ar no espaço livre acima do líquido, que proporciona uma reserva de oxigénio para a biode ­
gradação aeróbia. A libertação de CO
 2 resultante da biodegradação aeróbia 
total do produto químico em estudo é determinada pela medição do excesso 
de carbono inorgânico produzido nos recipientes de ensaio relativamente ao produzido em recipientes de ensaio em branco que contêm apenas o meio inoculado. A extensão da biodegradação é expressa em percentagem da 
produção máxima teórica de carbono inorgânico (CITe), com base na quan ­
tidade de produto químico em estudo, expressa em carbono orgânico, ini ­
cialmente adicionada.
 
9. Pode também determinar-se (20) a remoção de COD e/ou o grau de biode ­
gradação primária do produto químico em estudo.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1420
 
INFORMAÇÕES SOBRE O PRODUTO QUÍMICO EM ESTUDO  
10. Para o cálculo da percentagem de degradação, é necessário conhecer o teor 
de carbono orgânico (% ponderal) do produto químico em estudo, quer a partir da sua estrutura química quer por análise. No caso dos produtos 
químicos voláteis, o conhecimento da constante da lei de Henry, por medi ­
ção ou cálculo, é útil para determinar uma razão adequada entre o espaço livre e o volume de líquido. É útil dispor de informações sobre a toxicidade do produto químico em estudo para os microrganismos, a fim de selecionar 
as concentrações de ensaio adequadas e para interpretar resultados de baixa 
biodegradabilidade: recomenda-se a realização de controlos de inibição, exceto se se souber que o produto químico não inibe a atividade microbiana 
(ver o ponto 24).
 
APLICABILIDADE DO MÉTODO  
11. O ensaio é aplicável a produtos químicos solúveis e insolúveis em água, 
embora deva assegurar-se uma boa dispersão do produto químico. Utili ­
zando a proporção recomendada de 1:2 entre o espaço livre e o volume de líquido, podem utilizar-se produtos químicos voláteis com uma constante da lei de Henry não superior a 50 Pa.m
 3 .mol  –1 , dado que a percentagem do 
produto químico no espaço livre não excederá 1 % (13). Pode utilizar-se um 
volume menor de espaço livre no ensaio de produtos químicos mais volá ­
teis, cuja biodisponibilidade possa ser um fator limitante, em especial se forem pouco solúveis em água. No entanto, os utilizadores devem assegurar 
que a razão entre o espaço livre e o volume de líquido, bem como a 
concentração do produto químico, proporcionam uma quantidade suficiente de oxigénio para permitir a biodegradação aeróbia completa, evitando, por exemplo, o recurso a uma concentração elevada de substrato e a um espaço 
livre reduzido. As referências (13) e (23) contêm orientações nesta matéria.
 
PRODUTOS QUÍMICOS DE REFERÊNCIA  
12. A fim de verificar o procedimento, deve submeter-se a ensaio, em paralelo, 
uma substância de referência de biodegradabilidade conhecida. Para o efeito, a anilina, o benzoato de sódio e o etilenoglicol podem ser utilizados com produtos químicos solúveis em água, podendo utilizar-se o 1-octanol no 
caso de produtos químicos pouco solúveis (13). A biodegradação destes 
produtos químicos deve ser superior a 60 % do carbono inorgânico teórico, em 14 dias.
 
REPRODUTIBILIDADE  
13. No ensaio interlaboratorial do método, promovido pela ISO (17), foram 
obtidos os seguintes resultados utilizando as condições recomendadas, no ­
meadamente uma concentração do produto químico em estudo de 20 mg 
C/l. 
Produto químico Percentagem média 
de biodegradação 
(28 dias) Coeficiente de 
variação 
(%) Número de 
laboratórios  
Anilina 90 16 17 
1-Octanol 85 12 14  
Com anilina, a variabilidade interna dos ensaios (indicador de replicabilida ­
de) foi reduzida, não excedendo os coeficientes de variabilidade 5 % em quase todas as séries de ensaios. Nos dois casos em que a replicabilidade foi 
pior, a variabilidade mais elevada deveu-se provavelmente à elevada produ ­
ção de carbono inorgânico nos ensaios em branco. Com 1-octanol, registou-se uma replicabilidade mais baixa, embora com variabilidade infe ­
rior a 10 % em 79 % das séries de ensaios. Esta maior variabilidade interna 
dos ensaios pode ter sido devida a erros de dosagem, dado que foi neces ­
sário injetar um pequeno volume (3 a 4 μl) de 1-octanol nos recipientes de 
ensaio selados. Obtém-se coeficientes de variação superiores quando se utilizam concentrações mais baixas do produto químico em estudo, nomea ­
damente inferiores a 10 mg C/l. Este problema pode ser parcialmente supe ­
rado reduzindo a concentração de carbono inorgânico total (CIT) no inóculo.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1421
 
14. Num ensaio interlaboratorial promovido pela UE (24) de cinco produtos 
químicos tensioativos adicionadas na concentração de 10 mg C/l, foram 
obtidos os seguintes resultados:  
Produto químico Percentagem 
média de 
biodegradação 
(28 dias) Coeficiente 
de variação 
(%) Número de 
laboratórios  
Benzenossulfonato de tetra ­
propileno 17 45 10 
Di-iso-octilssulfosuccinato 
(aniónico) 72 22 9 
Cloreto de 
hexadeciltrimetil-amónio (*) 
(catiónico) 75 13 10 
(Etoxilato)  9 de isononilfenol 
(não iónico) 41 32 10 
Amidopropil de 
coco-dimetil-hidroxissulfo ­
betaína 
(anfotérico) 60 23 11  
(*) Adicionou-se SiO  2 para neutralizar a toxicidade.  
Os resultados mostram que, de um modo geral, a variabilidade foi superior 
no caso dos tensioativos menos degradados. A variabilidade interna dos 
ensaios foi inferior a 15 % em mais de 90 % dos casos; o maior valor 
registado foi da ordem de 30 % a 40 %.  
NOTA:  Na sua maioria, os tensioativos não são espécies moleculares sim ­
ples, mas misturas de isómeros, homólogos, etc., com tempos de degradação característicos diferentes e constantes cinéticas diferen ­
tes, que produzem curvas mal definidas e atenuadas. Poderá, por ­
tanto, não ser possível atingir o limiar de 60 % no período de 10 
dias, embora cada espécie molecular ultrapasse esse valor em 10 dias se for ensaiada isoladamente. Este facto também pode ser observado com outras misturas complexas.
 
DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
Equipamento  
15. Material corrente de laboratório, nomeadamente:  
a) frascos de soro de vidro, selados com rolhas de borracha butílica e 
cápsulas de alumínio. A capacidade recomendada é "125 ml", a que corresponde um volume total de cerca de 160 ml (neste caso, o volume de cada frasco deve ser comprovadamente de 160 ± 1 ml). Se os resul ­
tados satisfizerem as condições descritas nos pontos 66 e 67, pode 
utilizar-se recipientes de capacidade inferior;
 
b) analisador de carbono ou outro instrumento (p. ex. cromatógrafo de gás) 
para a determinação do carbono inorgânico;  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1422
 
c) seringas de elevada precisão para amostras gasosas e líquidas;  
d) agitador orbital num ambiente com controlo de temperatura;  
e) fonte de ar isento de CO  2 — este ar pode ser preparado fazendo passar 
uma corrente de ar por grânulos de cal sodada ou utilizando uma mistura gasosa com 80 % N
 2 /20 % 0  2 (opcional) (ver o ponto 28);  
f) dispositivo de filtração com membrana de porosidade 0,20-0,45 μm (op­
cional);  
g) analisador de carbono orgânico (opcional).  
Reagentes  
16. Utilizar reagentes de qualidade analítica em todo o processo.  
Água  
17. Deve utilizar-se água destilada ou desionizada com teor de carbono orgânico 
total não superior a 1 mg/l. Este valor não excede 5 % do teor de carbono orgânico inicial introduzido pela dose recomendada do produto químico em 
estudo.
 
Soluções-mãe para o meio de sais minerais  
18. As soluções-mãe e o meio de sais minerais são semelhantes aos utilizados 
nos ensaios ISO 14593 (16) e C.4 ("Biodegradabilidade 'fácil'") (20). A 
utilização de uma concentração mais elevada de cloreto de amónio (2,0 
g/l em vez de 0,5 g/l) só é necessária em casos muito excecionais, por exemplo, se a concentração do produto químico em estudo exceder 40 mg de C/l. As soluções-mãe devem ser armazenadas com refrigeração e 
eliminadas após seis meses (ou antes, se existirem indícios de precipitação 
ou de crescimento microbiano). Preparar as seguintes soluções-mãe:
 
a) di-hidrogenofosfato de potássio (KH  2 PO 4 ) 8,50g  
hidrogenofosfato de dipotássio (K  2 HPO  4 ) 21,75g  
hidrogenofosfato de dissódio di-hidratado (Na  2 HPO  4 .2H  2 O) 33,40g  
cloreto de amónio (NH  4 Cl) 0,50g  
Dissolver em água e ajustar para 1 litro. O pH desta solução deve ser de 
7,4 (± 0,2). Se tal não for o caso, preparar uma solução nova;  
b) cloreto de cálcio di-hidratado (CaCl  2 .2H  2 O) 36,40g  
Dissolver em água e ajustar para 1 litro;  
c) sulfato de magnésio hepta-hidratado (MgSO  4 .7H  2 O) 22,50g  
Dissolver em água e ajustar para 1 litro;  
d) cloreto de ferro (III) hexa-hidratado (FeCl  3 .6H  2 0) 0,25g  
Dissolver em água e ajustar para 1 litro, adicionando de seguida uma 
gota de ácido concentrado.  
Preparação do meio de sais minerais  
19. Dissolver 10 ml de solução (a) em cerca de 800 ml de água (ponto 17), 
adicionando de seguida 1 ml das soluções (b), (c) e (d), e ajustar o volume para 1 litro com água (ponto 17).
 
Outros reagentes  
20. Ácido ortofosfórico (H  3 PO 4 ) concentrado (> 85 %, em massa por volume).  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1423
 
Solução de hidróxido de sódio 7 M  
21. Dissolver 280 g de hidróxido de sódio (NaOH) em 1 litro de água (ponto 
17). Determinar a concentração de carbono inorgânico dissolvido da solução e ter em conta este valor no cálculo do resultado do ensaio (ver os pontos 
55 e 61), nomeadamente à luz do critério de validade que consta do 
ponto 66, alínea b). Se a concentração de carbono inorgânico dissolvido for demasiado elevada, preparar uma solução nova.
 
Produto químico em estudo  
22. Preparar uma solução-mãe de um produto químico suficientemente hidros ­
solúvel, em água (ponto 17) ou no meio de ensaio (ponto 19), a uma concentração de preferência 100 vezes superior à concentração final a uti ­
lizar no ensaio; pode ser necessário ajustar o pH da solução-mãe. Esta 
solução deve ser adicionada ao meio mineral, de modo a obter uma concen ­
tração final de carbono orgânico compreendida entre 2 e 40 mg C/l (de preferência 20 mg C/l). A utilização de concentrações inferiores a estas pode comprometer a precisão dos resultados. Os produtos químicos líquidos so ­
lúveis e insolúveis podem ser diretamente introduzidos nos recipientes por 
meio de seringas de alta precisão. Os produtos químicos pouco solúveis e insolúveis podem exigir um tratamento especial (25). As opções nesta ma ­
téria são as seguintes:
 
a) adição direta de quantidades pesadas conhecidas;  
b) dispersão por meio de ultrassons antes da adição;  
c) dispersão com o auxílio de agentes emulsionantes, sendo necessário 
determinar antes da adição se os mesmos têm efeitos inibidores ou estimulantes da atividade microbiana;
 
d) adsorção do produto químico líquido, ou de uma solução num solvente 
volátil adequado, num meio ou suporte inerte (por exemplo, filtro de fibra de vidro), seguida de evaporação do solvente, se utilizado, e adição 
direta de quantidades conhecidas;
 
e) colocação no recipiente de ensaio vazio de um volume conhecido de uma 
solução do produto químico em estudo num solvente muito volátil, se ­
guida de evaporação do solvente.  
É necessário verificar se os agentes ou solventes utilizados nas alíneas c), d) 
e e) têm efeitos estimulantes ou inibidores da atividade microbiana — ver o ponto 42, alínea b).
 
Produto químico de referência  
23. Preparar uma solução-mãe do produto químico (solúvel) de referência em 
água (ponto 17), com uma concentração, de preferência, 100 vezes superior à concentração final a utilizar no ensaio (20 mg C/l).
 
Verificação da inibição  
24. Frequentemente, os produtos químicos estudados não sofrem degradação 
significativa nas condições utilizadas nas avaliações de biodegradabilidade "fácil". Uma das causas possíveis deste facto reside no efeito inibidor, para o inóculo, do produto químico em estudo, às concentrações em que é 
utilizado no ensaio. A verificação da inibição pode ser incluída no proce ­
dimento de ensaio, para facilitar a identificação ( a posteriori ) da inibição 
como causa possível ou fator contribuinte. A verificação da inibição também permite excluir essas interferências e demonstrar que a ausência de degra ­
dação ou a ocorrência de uma degradação ligeira é apenas atribuível a 
condições de ensaio pouco propícias à ação microbiana. A fim de obter informações sobre a toxicidade do produto químico em estudo para micro ­
rganismos (aeróbios), preparar uma solução, no meio de ensaio, do produto 
químico em estudo e do produto químico de referência (ponto 19), cada um 
nas concentrações utilizadas no ensaio (ver os pontos 22 e 23).
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Inóculo  
25. O inóculo pode ter várias origens: lamas ativadas, efluentes de águas resi ­
duais (não clorados), águas de superfície e solos ou uma mistura destes (20). A atividade de biodegradação da fonte do inóculo deve ser verificada por 
recurso a um produto químico de referência. Independentemente da fonte, 
não devem ser utilizados microrganismos anteriormente expostos ao produto químico em estudo para ensaios de determinação da biodegradabilidade "fácil".
 
Atenção: As lamas ativadas, e as águas residuais ou os efluentes de águas 
residuais, contêm organismos patogénicos, pelo quem devem ser 
manipulados com cuidado.  
26. De acordo com a experiência adquirida, o volume ótimo de inóculo satisfaz 
as seguintes condições:  
— é suficiente para proporcionar uma atividade de biodegradação adequa ­
da, 
— degrada o produto químico de referência na percentagem estabelecida 
(ver o ponto 66),  
— origina 10  2 a 10  5 unidades formadoras de colónias por mililitro, na 
mistura final,  
— origina, em geral, uma concentração de 4 mg/l de sólidos em suspensão 
na mistura final quando se utilizam lamas ativadas; é possível utilizar concentrações até 30 mg/l, que podem, contudo, aumentar significativa ­
mente a produção de CO
 2 nos ensaios em branco (26),  
— representa menos de 10 % da concentração inicial de carbono orgânico 
introduzida pelo produto químico em estudo,  
— é, geralmente, da ordem de 1-10 ml por litro de solução de ensaio.  
Lamas ativadas  
27. As lamas ativadas são recolhidas do frasco no tanque de arejamento de uma 
estação de tratamento de águas residuais, ou unidade à escala laboratorial, que trate essencialmente esgotos domésticos. Se necessário, as partículas 
grosseiras devem ser removidas por crivagem (p. ex., através de um crivo 
de malha de 1 mm
 2 ); as lamas devem ser mantidas em condições aeróbias 
até à sua utilização.  
28. Em alternativa, após a remoção das partículas grosseiras eventualmente 
presentes, deixar sedimentar ou centrifugar (por exemplo, a 1 100 g durante 10 minutos). Remover o líquido sobrenadante. As lamas podem ser lavadas na solução de sais minerais. Preparar uma suspensão das lamas concentradas 
no meio de sais minerais, de forma a obter uma concentração de 3-5 g de 
sólidos em suspensão/l. Proceder de seguida ao arejamento enquanto for necessário.
 
29. As lamas devem ser obtidas numa estação de tratamento convencional em 
bom estado de funcionamento. Se forem obtidas numa estação de tratamento de débito elevado ou se nelas se admitir a presença de inibidores, devem ser lavadas. Após obter uma mistura homogénea, deixar sedimentar ou centri ­
fugar as lamas repostas em suspensão, rejeitar o sobrenadante e preparar 
nova suspensão das lamas lavadas num novo volume de meio de sais minerais. Repetir este procedimento até que as lamas possam considerar-se isentas de substrato em excesso ou de inibidor.
 
30. Quando a nova suspensão estiver preparada, ou no caso de se utilizarem 
lamas não tratadas, colher uma amostra imediatamente antes da utilização, para determinar a massa seca dos sólidos em suspensão.
 
31. A homogeneização das lamas ativadas (3-5 g de sólidos em suspensão/l) 
constitui uma alternativa. Tratar as lamas num misturador de Waring durante dois minutos, a velocidade média. Deixar sedimentar a mistura de lamas durante 30 minutos ou, se necessário, por um período mais longo, e decantar 
o líquido, para utilização das lamas como inóculo na proporção de 10 mg/l 
de meio de sais minerais.
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32. É possível obter uma redução ainda maior do CO  2 libertado no ensaio em 
branco através do arejamento das lamas durante a noite com ar isento de 
CO 2 . Utilizar como inóculo no presente ensaio 4 mg de sólidos das lamas 
ativadas por litro (13).  
Efluente secundário de águas residuais  
33. Em alternativa, o inóculo pode ser colhido num efluente secundário de uma 
estação de tratamento, ou unidade à escala laboratorial, que trate essencial ­
mente esgotos domésticos. Manter a amostra em condições aeróbias e uti ­
lizar no dia da colheita, ou efetuar um pré-acondicionamento, se necessário. 
Deve utilizar-se um filtro para remover as partículas grosseiras do efluente, 
determinando-se também o pH.  
34. Para reduzir o teor de carbono inorgânico do filtrado, borbulha-se neste ar 
isento de CO  2 — ponto 15, alínea e) — durante 1 h, mantendo o pH a 6,5 
com o auxílio de ácido ortofosfórico (ponto 20). O pH inicial é reposto com 
o auxílio de uma solução de hidróxido de sódio (ponto 21); após sedimen ­
tação durante cerca de 1 h, toma-se uma alíquota do sobrenadante para inoculação. Este procedimento permite reduzir o teor de carbono inorgânico do inóculo. Por exemplo, quando se utiliza como inóculo o volume máximo 
recomendado de efluente filtrado borbulhado (100 ml) por litro, a quanti ­
dade de carbono inorgânico presente nos recipientes de ensaio em branco é da ordem de 0,4 a 1,3 mg/l (14), o que representa 2 % a 6,5 % do carbono do produto químico em estudo, relativamente a uma concentração de 20 mg 
C/l, e 4 % a 13 %, relativamente a uma concentração de 10 mg C/l.
 
Águas de superfície  
35. Colher uma amostra de uma água de superfície adequada. A amostra deve 
ser mantida em condições aeróbias e ser utilizada no dia da colheita. Se 
necessário, deve ser concentrada por filtração ou centrifugação. O volume de inóculo a utilizar em cada recipiente de ensaio deve satisfazer as condi ­
ções enunciadas no ponto 26.
 
Solos  
36. Colhe-se uma amostra de um solo adequado, a uma profundidade não 
superior a 20 cm. Deve remover-se da amostra pedras, restos vegetais e 
invertebrados, após o que a amostra é peneirada através de uma malha de 
2 mm (se a amostra estiver demasiado húmida para ser peneirada de ime ­
diato, secá-la parcialmente ao ar para facilitar a operação). A amostra deve ser mantida em condições aeróbias e ser utilizada no dia da colheita (se for 
transportada num saco de polietileno negro não hermético, pode ser arma ­
zenada nesse saco, a uma temperatura de 2 a 4 °C, pelo período máximo de um mês).
 
Pré-acondicionamento do inóculo  
37. Os inóculos podem ser pré-acondicionados para as condições experimentais, 
mas não podem ser pré-adaptados ao produto químico em estudo. O pré- -acondicionamento pode reduzir a libertação de CO
 2 nos recipientes de en ­
saio em branco. A operação consiste em arejar as lamas ativadas, durante 
cinco a sete dias, com ar húmido isento de CO  2 , à temperatura de ensaio, 
após diluição para 30 mg/l no meio de ensaio.  
PROCEDIMENTO  
Número de frascos  
38. O número de frascos — ponto 15, alínea a) — necessários depende da 
frequência das análises e da duração do ensaio.  
39. Recomenda-se a análise de frascos em triplicado após um número suficiente 
de períodos, de modo a permitir a identificação do período de 10 dias. Devem também analisar-se, pelo menos, cinco frascos — ponto 15, alínea a) — das séries a), b) e c) (ver o ponto 42), no final do ensaio, 
para permitir o cálculo de intervalos de confiança de 95 % para a percen ­
tagem média de biodegradação.
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Meio inoculado  
40. O inóculo é utilizado numa concentração de 4 mg de sólidos secos de lamas 
ativadas por litro. Preparar, imediatamente antes da utilização, uma quanti ­
dade suficiente de meio inoculado, por exemplo, adicionando 2 ml de lamas 
ativadas sujeitas a um tratamento adequado (pontos 27 a 32), à concentração 
de 2 000 mg/l, a 1 litro de meio de sais minerais (ponto 19). Se forem utilizados efluentes secundários de águas residuais, adicionar 100 ml de efluente (ponto 33) a 900 ml de meio de sais minerais (ponto 19) e diluir 
para 1 litro com o meio.
 
Preparação dos frascos  
41. Coloca-se alíquotas de meio inoculado em séries de frascos replicados, de 
forma a obter uma proporção espaço livre/líquido de 1:2 (colocar, por exemplo, 107 ml em frascos de 160 ml de capacidade). Pode utilizar-se 
outras proporções, atendendo, contudo, às recomendações que constam do 
ponto 11. Qualquer que seja o tipo de inóculo utilizado, deve assegurar-se que o meio inoculado está devidamente homogeneizado, tendo em vista a sua distribuição uniforme nos frascos de ensaio.
 
42. Prepara-se as seguintes séries de frascos – ponto 15, alínea a):  
a) recipientes de ensaio (assinalados por F  T ), que contêm o produto químico 
em estudo;  
b) recipientes de ensaio em branco (assinalados por F  B ) que contêm apenas 
o meio de ensaio e o inóculo; devem adicionar-se também quaisquer produtos químicos, solventes, agentes ou filtros de fibra de vidro utili ­
zados para a introdução do produto químico em estudo nos recipientes de 
ensaio;
 
c) recipientes para controlo do processo (assinalados por F  C ), que contêm o 
produto químico de referência;  
d) se necessário, recipientes destinados à verificação do possível efeito 
inibidor do produto químico em estudo (assinalados por F  I ), que contêm 
este e o produto químico de referência nas mesmas concentrações que, 
respetivamente, os frascos F  T e F C (ponto 24);  
e) recipientes (assinalados por F  S ) destinados à verificação da possível de ­
gradação abiótica, preparados como descrito na alínea a), mas contendo, além disso, 50 mg/l de HgCl
 2 ou esterilizados por outros meios (por 
exemplo, tratamento em autoclave).  
43. Os produtos químicos em estudo e de referência hidrossolúveis são adicio ­
nados na forma de soluções-mãe aquosas (pontos 22, 23 e 24), de modo a 
obter uma concentração de 10 a 20 mg C/l.  
44. Os produtos químicos em estudo e de referência insolúveis em água são 
introduzidos nos frascos de diversas formas — ver o ponto 22, alíneas a)-e) —, consoante a sua natureza, antes ou depois da adição do meio inoculado, 
em função do método de tratamento do produto químico em estudo. Se for 
utilizado um dos métodos indicados no ponto 22, alíneas a) a e), os frascos F
 B — ponto 42, alínea b) — devem ser tratados de forma idêntica, mas sem 
o produto químico em estudo e o produto químico de referência.  
45. Os produtos químicos em estudo voláteis devem ser injetados nos frascos 
selados (ponto 47) com o auxílio de uma microsseringa. A dose é calculada com base no volume injetado e na densidade do produto.
 
46. Quando necessário, deve acrescentar-se água aos recipientes, de forma que o 
volume de líquido seja idêntico em todos eles. Deve garantir-se que a razão entre o espaço livre e o volume de líquido (geralmente 1:2), bem como a concentração do produto químico em estudo, sejam tais que a quantidade de 
oxigénio presente no espaço livre seja suficiente para permitir a biodegra ­
dação completa.
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47. Seguidamente, todas as garrafas são seladas, por exemplo, com rolhas de 
borracha butílica e cápsulas de alumínio. Os produtos químicos em estudo 
voláteis devem ser introduzidos nesta fase (ponto 45). Caso se pretenda monitorizar o decréscimo da concentração de COD da solução de ensaio e efetuar análises da concentração inicial de carbono inorgânico — controlos 
"estéreis"; ponto 42, alínea e) — ou outras determinações, colher uma 
amostra adequada do recipiente de ensaio. O recipiente de ensaio e o seu conteúdo são, em seguida, eliminados.
 
48. Os frascos selados são colocados num agitador rotativo — ponto 15, 
alínea d) —, com uma agitação suficiente para manter o conteúdo homo ­
geneizado e em suspensão (por exemplo, 150 a 200 rpm), e incubados, no 
escuro, à temperatura de 20 °C ± 1 °C.  
Amostragem  
49. O padrão de amostragem depende do período de latência e da taxa cinética 
de biodegradação do produto químico em estudo. Retiram-se frascos para 
análise no dia da colheita de amostras, que deve ocorrer, pelo menos, uma 
vez por semana, ou, caso se pretenda obter uma curva de degradação com ­
pleta, com uma frequência superior (por exemplo, duas vezes por semana). Retira-se do agitador o número necessário de frascos replicados, designada ­
mente F
 T , F B e F C e, se for caso disso, F  I e F S (ver o ponto 42). O ensaio 
prolonga-se, geralmente, por 28 dias. Se a curva de biodegradação exibir um patamar antes do 28.
 o dia, o ensaio pode ser concluído. Colher, para análise, 
amostras dos cinco frascos reservados para o 28.  o dia e utilizar os resultados 
para calcular os limites de confiança ou o coeficiente de variação da per ­
centagem de biodegradação. Os frascos respeitantes ao controlo da inibição e da degradação abiótica não necessitam de amostragem tão frequente quanto os restantes frascos; basta colher amostras no 1.
 o e no 28.  o dia. 
Análise do carbono inorgânico  
50. A produção de CO  2 nos frascos é determinada através da medição do 
aumento da concentração de carbono inorgânico (CI) durante a incubação. Recomendam-se dois métodos para a medição da quantidade de carbono 
inorgânico produzida no ensaio, que se descrevem a seguir. Dado que os 
métodos podem conduzir a resultados ligeiramente diferentes, deve ser uti ­
lizado apenas um deles por série de ensaios.
 
51. O método a) é recomendado se for provável que o meio contenha resíduos, 
nomeadamente, de filtros de fibra de vidro e/ou de produtos químicos em estudo insolúveis. Caso não se disponha de um analisador de carbono, esta 
análise poderá ser realizada por recurso a um cromatógrafo em fase gasosa. 
É importante que os frascos se encontrem à temperatura de ensaio, ou a uma temperatura próxima desta, quando se procede à análise do gás presente no espaço livre. O método b) pode ser de utilização mais fácil para os labora ­
tórios que utilizam analisadores de carbono para determinar o carbono inor ­
gânico. É importante que a solução de hidróxido de sódio (ponto 21) uti ­
lizada para converter o CO
 2 em carbonato seja preparada na altura ou que o 
seu teor de carbono inorgânico seja conhecido, a fim de que este parâmetro 
possa ser tido em conta no cálculo dos resultados dos ensaios — ver o 
ponto 66, alínea b).  
Método a): acidificação a pH < 3  
52. Antes de efetuar cada série de análises, o analisador de carbono inorgânico é 
calibrado utilizando uma substância com um teor-padrão de carbono inor ­
gânico — por exemplo, mistura a 1 % (m/m) de CO  2 em N  2 . Injeta-se ácido 
ortofosfórico concentrado (ponto 20) através do septo de cada frasco de amostra, de forma a reduzir o pH do meio para menos de 3 (adicionar, 
por exemplo, 1 ml a 107 ml de meio de ensaio). Os frascos são então 
recolocados no agitador. Após agitação durante uma hora à temperatura de ensaio, os frascos são removidos do agitador, colhendo-se alíquotas (por exemplo, 1 ml) de gás no espaço livre de cada frasco, que se injetam 
no analisador de carbono inorgânico. As concentrações de carbono inorgâ ­
nico são registadas em mg C/l.
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53. O princípio deste método reside em que, após acidificação a pH < 3 e 
equilíbrio a 20 °C, a constante de partição do CO  2 entre as fases gasosa 
e líquida nos frascos de ensaio, determinada em termos de concentração, ser de 1,0 (13). Este facto deve ser comprovado, para o sistema de ensaio, pelo menos uma vez, do seguinte modo:
 
Preparar frascos com teores de carbono inorgânico de 5 e 10 mg/l, por 
recurso a uma solução de carbonato de sódio (Na  2 CO 3 ) anidro em água 
isenta de CO  2 , preparada por acidificação de água a pH 6,5 com ácido 
ortofosfórico concentrado (ponto 20), na qual se fez borbulhar, de um dia 
para o outro, ar isento de CO  2 , e se neutralizou depois o pH com álcalis. 
Assegurar que a proporção entre o espaço livre e o volume de líquido é a mesma que nos ensaios (por exemplo, 1:2). Acidificar e deixar estabilizar do 
modo descrito no ponto 52, determinando de seguida as concentrações de 
carbono inorgânico no espaço livre e na fase líquida. Verificar se as concen ­
trações são iguais, dentro dos limites do erro experimental. Se não forem, o operador deve reexaminar os procedimentos. Não é necessário verificar em 
cada ensaio a partição do carbono inorgânico entre as fases gasosa e líquida. 
A verificação pode, em geral, ser efetuada aquando da calibração.
 
54. Caso se pretenda determinar a remoção do COD (apenas no caso de pro ­
dutos químicos solúveis em água), devem colher-se amostras da fase líquida de frascos distintos (não acidificados), que são filtradas por uma membrana e injetadas no analisador de COD. Estes frascos podem ser utilizados para 
outras análises, consoante necessário, com o objetivo de determinar a bio ­
degradação primária.
 
Método b): conversão de CO  2 a carbonato  
55. Antes de cada série de análises, o analisador de carbono inorgânico é 
calibrado com um padrão adequado — por exemplo, uma solução de bicar ­
bonato de sódio (NaHCO  3 ) em água isenta de CO  2 (ver o ponto 53), na 
gama de concentrações de carbono inorgânico de 0 a 20 mg/l. Injeta-se através do septo de cada frasco no qual se colhe uma amostra uma solução 
de hidróxido de sódio 7 M (ponto 21) — por exemplo, 1 ml em 107 ml de 
meio —, sendo esses frascos agitados durante 1 h à temperatura de ensaio. Utilizar a mesma solução de NaOH em todos os frascos retirados num determinado dia, mas não obrigatoriamente em todas as colheitas destas 
amostras ao longo do ensaio. Se forem necessários valores absolutos de 
concentrações de carbono inorgânico das amostras em branco quando de todas as colheitas de amostras, é necessário determinar o teor de carbono inorgânico da solução de NaOH em cada utilização. Remover os frascos em 
causa do agitador e colocá-los em repouso. Retirar com uma seringa volu ­
mes adequados (por exemplo, 50 a 1 000 μl) da fase líquida de cada frasco. 
Injetar as amostras no analisador de carbono inorgânico, registando as con ­
centrações deste obtidas. Deve assegurar-se que o aparelho é adequado às 
amostras alcalinas produzidas no presente método.
 
56. O princípio do método reside em que, após a adição de solução alcalina e a 
agitação, o teor de carbono inorgânico no espaço livre é insignificante. Este 
facto deve ser comprovado para cada sistema de ensaio pelo menos uma vez, por recurso a padrões de carbono inorgânico, mediante a adição de uma solução alcalina, estabilização e a determinação da concentração de carbono 
inorgânico no espaço livre e nas fases líquidas (ver o ponto 53). A concen ­
tração no espaço livre deve ser praticamente nula. Não é necessário verificar a absorção quase completa do CO
 2 em cada ensaio.  
57. Caso se pretenda determinar a remoção do COD (apenas no caso de pro ­
dutos químicos solúveis em água), devem colher-se amostras da fase líquida de frascos distintos sem solução alcalina adicionada, que são filtradas por uma membrana e injetadas no analisador de COD. Estes frascos podem ser 
utilizados para outras análises, consoante necessário, com o objetivo de 
determinar a biodegradabilidade primária.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1429
 
DADOS E RELATÓRIOS  
Cálculo dos resultados  
58. Pressupondo que a mineralização do produto químico em estudo em CO  2 é 
de 100 %, o teor de carbono inorgânico teórico (CITe) superior ao produ ­
zido nos frascos de ensaio em branco é igual ao COT adicionado a cada frasco no início dos ensaios, isto é:
 
CITe ¼ COT : 
A massa total (mg) de carbono inorgânico (CIT) em cada frasco é:  
CIT ¼ ðmg C na fase líquida  þ mg C no espaço livre Þ 
¼ ðV L Ü C L Þ þ ðV H Ü C H Þ Equação 1  
em que:  
V L = volume de líquido no frasco (litros);  
C L = concentração de carbono inorgânico no líquido (mg/l, expressa em 
carbono);  
V H = volume do espaço livre (litros);  
C H = concentração de carbono inorgânico no espaço livre (mg/l, expressa 
em carbono).  
O cálculo do CIT em ambos os métodos de análise utilizados para a deter ­
minação do carbono inorgânico no presente ensaio é descrito nos pontos 60 
e 61. A percentagem de biodegradação ( % D ), em ambos os casos, é dada 
por: 
% D ¼ ðTIC  t Ä TIC  b Þ 
TOC Ü 100 Equação 2  
em que:  
CIT  t = mg de CIT no frasco de ensaio, no instante  t; 
CIT  b = mg de CIT (em média) nos frascos de ensaio em branco, no ins ­
tante  t; 
COT = mg de COT almente no recipiente de ensaio.  
A percentagem de biodegradação (% D) é calculada para os frascos de 
ensaio (F  T ), de referência (F  C ) e, caso tenham sido incluídos, de controlo 
da inibição (F  I ), com base nas quantidades respetivas de CIT produzidas até 
ao instante da colheita de cada amostra.  
59. Caso se observe um aumento significativo do teor de CIT nos frascos de 
controlo estéreis (F  S ) no período de ensaio, pode concluir-se ter ocorrido 
degradação abiótica do produto químico em estudo, devendo este facto ser tido em conta no cálculo do parâmetro D na equação 2.
 
Acidificação para pH < 3  
60. Uma vez que a acidificação para pH < 3 e o posterior equilíbrio 
resultam na uniformização da concentração de carbono inorgânico total nas fases gasosa e líquida, apenas é necessário determinar a concentração 
de carbono inorgânico na fase gasosa. Aplica-se a equação 1
 
CIT ¼ ðV L þ V H Þ Ü C H ¼ V B Ü C H , em que V  B é o volume do frasco 
de soro.  
Conversão do CO  2 em carbonato  
61. No presente método, os cálculos são realizados como na equação 1, sem ter 
em conta a quantidade insignificante de carbono inorgânico na fase gasosa, 
ou seja,  V H Ü C H ¼ 0 e CIT ¼ V L Ü C L . ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1430
 
Expressão dos resultados  
62. A curva de biodegradação é obtida através da representação gráfica da 
percentagem de biodegradação (D) em função do tempo de incubação, indicando-se, se possível, a fase de latência, a fase de degradação, o período 
de 10 dias e a fase de patamar, que é a fase na qual já se atingiu a de ­
gradação máxima e a curva de biodegradação estabilizou. Se forem obtidos resultados comparáveis (diferença inferior a 20 %) para os recipientes de ensaio em paralelo, F
 T , representa-se graficamente uma curva média (ver o 
apêndice 2, figura 1); se tal não for o caso, representam-se as curvas rela ­
tivas a cada recipiente. Determina-se o valor médio da percentagem de biodegradação na fase de patamar ou identifica-se o valor mais elevado 
da mesma (por exemplo, quando a curva começa a infletir, na fase de 
patamar), mas, neste último caso, é importante verificar se o valor em causa não é anómalo. No relatório dos ensaios, este nível máximo de biodegra ­
dação deve ser expresso como "grau de biodegradação do produto químico 
em estudo". Se o número de recipientes de ensaio se tiver revelado insufi ­
ciente para definir uma fase de patamar, utilizam-se os dados determinados no último dia do ensaio para calcular um valor médio. Este valor (média de cinco replicados), serve de indicador da precisão de determinação da per ­
centagem de biodegradação. Indicar também o valor obtido no final do 
período de 10 dias.
 
63. Representar, do mesmo modo, a curva correspondente ao produto químico 
de referência (F  C ), bem como, se for caso disso, a curva relativa ao controlo 
da eliminação abiótica (F  S ) e a curva relativa ao controlo da inibição (F  I ). 
64. Registar os teores de carbono inorgânico total presentes nos ensaios em 
branco (F  B ), bem como, se for caso disso, os teores de CIT presentes nos 
frascos F  S (controlo da eliminação abiótica).  
65. Calcular a degradação (D) para os recipientes F  I a partir do rendimento 
teórico de carbono inorgânico previsto apenas com base no componente 
de referência da mistura. Se, no dia 28, [(D  FC ( 1 ) – D  FI ( 2 ))/D  FC ] x 100 > 
25 %, pode presumir-se que o produto químico em estudo inibe a atividade do inóculo, facto que permite justificar os valores reduzidos de D
 FT obtidos 
nas condições de ensaio. Neste caso, pode repetir-se o ensaio com uma 
concentração mais baixa, reduzindo, de preferência, o CID no inóculo e o CIT formado nos ensaios em branco, dado que, se assim não for, a redução da concentração reduzirá a precisão do método. Em alternativa, pode 
utilizar-se outro inóculo. Se, no frasco F
 S (controlo da eliminação abiótica), 
se observar um aumento significativo (> 10 %) da quantidade de CIT, é possível que tenham ocorrido processos de degradação abiótica.
 
Validade dos resultados  
66. Um ensaio é considerado válido se:  
a) a percentagem média de degradação nos recipientes que contêm o pro ­
duto químico de referência (F  C ) for superior a 60 % até ao 14.  o dia de 
incubação; e  
b) a quantidade média de CIT presente nos ensaios em branco (F  B ) no final 
do ensaio for superior a 3 mg C/l.  
Se estes valores-limite não forem satisfeitos, repetir o ensaio com um inó ­
culo proveniente de outra fonte e/ou rever os procedimentos utilizados. Por 
exemplo, caso se registe uma elevada produção de carbono inorgânico no 
ensaio em branco, deve seguir-se o procedimento indicado nos pontos 27 a 32.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1431  
( 1 ) Percentagem de degradação nos recipientes F  C , que contêm a substância de referência. 
( 2 ) Percentagem de degradação nos recipientes F  I.
 67. Se o produto químico em estudo não gerar 60 % do teor de carbono inor ­
gânico teórico e tiver sido demonstrado que não tem efeitos inibidores 
(ponto 65), pode repetir-se o ensaio com uma concentração mais elevada de inóculo (até 30 mg de lamas ativadas por litro e 100 ml de efluente por litro) ou com inóculos provenientes de outras fontes, nomeadamente nos 
casos em que a degradação se tenha situado na gama de 20 a 60 %.
 
Interpretação dos resultados  
68. A obtenção de uma biodegradação superior a 60 % do carbono inorgânico 
teórico no período de 10 dias do presente ensaio demonstra que o produto 
químico em estudo é facilmente biodegradável em condições aeróbias.  
69. Se o referido valor de 60 % não for atingido, determinar o pH no meio 
presente nos frascos que não tenham sido acidificados nem alcalinizados; 
um valor inferior a 6,5 pode indicar a ocorrência de nitrificação. Nesse caso, repetir o ensaio com uma solução-tampão de concentração mais elevada.
 
Relatório dos ensaios  
70. Elaborar um quadro com a percentagem de degradação para cada frasco de 
ensaio (F  T ), de referência (F  C ) e, se for caso disso, de controlo da inibição 
(F I ), para cada dia de colheita de amostras. Se forem obtidos resultados 
comparáveis para os frascos replicados, traçar a curva da percentagem média 
de degradação (% D) em função do tempo. Registar o CIT nos frascos 
correspondentes aos ensaios em branco (F  B ) e aos controlos estéreis (F  S ), 
bem como o COD e/ou outros parâmetros, além da percentagem de remo ­
ção. 
71. Determinar o valor médio da percentagem de degradação na fase de pata ­
mar, ou utilizar o valor mais elevado, se a curva de biodegradação começar 
a infletir na fase de patamar, e apresentar um deles como "grau de biode ­
gradação do produto químico em estudo". Neste último caso, importa ga ­
rantir que o valor mais elevado não é um resultado anómalo.  
72. O relatório do ensaio deve incluir as seguintes informações:  
Produto químico em estudo:  
— denominação comum, denominação química, número CAS, fórmula es ­
trutural e propriedades físico-químicas pertinentes,  
— grau de pureza do produto químico (presença de impurezas).  
Condições experimentais:  
— referência ao presente método,  
— descrição do sistema de ensaio utilizado (por exemplo, volume dos 
recipientes, proporção espaço livre/volume de líquido, método de agita ­
ção, etc.),  
— introdução do produto químico em estudo e do produto químico de 
referência no sistema de ensaio: concentração de ensaio utilizada, e quantidade de carbono introduzida, em cada frasco de ensaio, bem como os solventes eventualmente utilizados,
 
— pormenores relativos ao inóculo utilizado, bem como a qualquer pré- 
-tratamento e pré-acondicionamento,  
— temperatura de incubação,  
— validação do princípio de análise do carbono inorgânico,  
— principais características do analisador de carbono inorgânico (e de 
quaisquer outros métodos analíticos utilizados),  
— número de replicados.  
Resultados:  
— dados não tratados e valores de biodegradabilidade calculados, na forma 
de quadros,  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1432
 
— gráfico da percentagem de degradação em função do tempo, para o 
produto químico em estudo e o produto químico de referência, fase de 
latência, fase de degradação, período de 10 dias e declive,  
— percentagem de remoção na fase de patamar, no final do ensaio e após o 
período de 10 dias,  
— motivos de uma eventual rejeição de resultados dos ensaios,  
— quaisquer outros factos relevantes ligados ao procedimento seguido,  
— discussão dos resultados.  
REFERÊNCIAS:  
(1) Capítulo C.4 deste anexo: "Determinação da biodegradabilidade 'fácil' — 
Ensaio da libertação de CO  2 " (método C.4-C).  
(2) Sturm R.N. (1973): Biodegradability of Nonionic surfactants: screening test 
for predicting rate and ultimate biodegradation.  J. A. Oil Chem. Soc . 50: 
159-167.  
(3) Larson R.J. (1979): Estimation of biodegradation potential of xenobiotic 
organic chemicals.  Appl. Env. Microbiol . 38: 1153-1161.  
(4) Larson R.J., Hansmann M.A., Bookland E.A. (1996): Carbon dioxide reco ­
very in ready biodegradability tests: mass transfer and kinetic constants.  
Chemosphere  33: 1195-1210.  
(5) ISO 9439 (1990; revista em 1999). Water Quality — Evaluation of ultimate 
aerobic biodegradability of organic compounds in aqueous medium — Carbon dioxide evolution Test (Sturm).
 
(6) US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3110 Carbon dioxide evolution test. Office Prevention Pesticides and Toxic 
Substances. Washington, DC.  
(7) US EPA (1996). Fate, Transport and Transformation Test Guideline. 835. 
3100. Aerobic aquatic biodegradation. Office Prevention Pesticides and 
Toxic Substances. Washington, DC.  
(8) Gledhill W.E. (1975). Screening test for assessment of biodegradability: 
Linear alkyl benzene sulfonate.  Appl. Microbiol . 30: 922-929.  
(9) Weytjens D., Van Ginneken I., Painter H.A. (1994): The recovery of carbon 
dioxide in the Sturm test for ready biodegradability.  Chemosphere  28: 
801-812.  
(10) Ennis D.M., Kramer A. (1975): A rapid microtechnique for testing biode ­
gradability of nylons and polyamides.  J. Food Sci . 40: 181-185.  
(11) Ennis D.M., Kramer A., Jameson C.W., Mazzoccki P.H., Bailey P. (1978).  
Appl. Env. Microbiol . 35: 51-53.  
(12) Boatman R., Cunningham S.L., Ziegler D.A. (1986). A method for measu ­
ring the biodegradation of organic chemicals.  Env. Toxicol. Chem.  5: 
233-243.  
(13) Struijs J., Stoltenkamp J. (1990): Head space determination of evolved 
carbon dioxide in a biodegradability screening test.  Ecotox. Env. Safety  
19: 204-211.  
(14) Birch R.R., Fletcher R.J. (1991): The application of dissolved inorganic 
carbon measurements to the study of aerobic biodegradability.  Chemosphere  
23: 507-524.  
(15) Birch R.R., Biver C., Campagna R., Gledhill W.E., Pagga U., Steber J., 
Reust H., Bontinck W.J. (1989): Screening of chemicals for anaerobic 
biodegradation.  Chemosphere  19: 1527-1550.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1433
 
(16) ISO 14593 (1999) Water Quality — Evaluation of ultimate aerobic biode ­
gradability of organic compounds in an aerobic medium-method by analysis 
of inorganic carbon in sealed vessels (C0  2 headspace test).  
(17) Battersby N.S. (1997): The ISO headspace C0  2 biodegradation test.  Che­
mosphere  34: 1813-1822.  
(18) US EPA (1996). Fate, Transport and Transportation. 835.3120. Sealed ves ­
sel carbon dioxide production test. Office, Prevention Pesticides and Toxic Substance. Washington, DC.
 
(19) Battersby N.S., Ciccognani D., Evans M.R., King D., Painter H.A., Peter ­
son D.R., Starkey M. (1999): An "inherent" biodegradability test for oil 
products: description and results of an international ring test.  Chemosphere  
38: 3219-3235.  
(20) Capítulo C.4 deste anexo: "Determinação da biodegradabilidade 'fácil'".  
(21) OCDE (1988). OECD Ring-test of methods for determining ready biode ­
gradability: Chairman’s report (M. Hashimoto; MITI) and final report (Ki ­
tano, M., Takatsuki, M.; CITI). Paris.  
(22) Capítulo C.11 deste anexo: "Biodegradação — Lamas Ativadas: Ensaios de 
Inibição da Respiração".  
(23) Struijs J., Stoltenkamp-Wouterse M.J., Dekkers A.L.M. (1995): A rationale 
for the appropriate amount of inoculum in ready biodegradability tests.  
Biodegradation  6: 319-327.  
(24) UE (1999). Ring-test of the ISO Headspace CO  2 method: application to 
surfactants: Surfactant Ring Test-1, Report EU4697. Water Research Cen ­
tre, Maio de 1999. Medmenham, SL7 2HD, Reino Unido.  
(25) ISO 10634 (1996). Water Quality — Guidance for the preparation and 
treatment of poorly water-soluble organic compounds for the subsequent evaluation of their biodegradability in an aqueous medium.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1434
 
Apêndice 1  
ABREVIATURAS E DEFINIÇÕES  
CI: carbono inorgânico.  
CO  2 Te: o dióxido de carbono teórico (mg) é a quantidade calculada do dióxido 
de carbono que seria produzido a partir do teor de carbono medido ou conhecido do produto químico em estudo, quando totalmente mineralizado; também pode 
ser expresso em mg de dióxido de carbono libertado por mg de produto químico 
em estudo.
 
COD:  o carbono orgânico dissolvido é o carbono orgânico presente na solução 
ou que passa através de um filtro de 0,45 micra ou que permanece no sobrena ­
dante após centrifugação a cerca de 4 000 g (aproximadamente 40 000 ms  -2 ) 
durante 15 minutos.  
CID:  carbono inorgânico dissolvido.  
CITe:  carbono inorgânico teórico.  
CIT:  carbono inorgânico total.  
Facilmente biodegradável:  classificação arbitrária atribuída aos produtos quími ­
cos que satisfazem os critérios de determinados ensaios específicos de verificação 
da biodegradabilidade total; dado o grau de exigência destes ensaios, presume-se 
que esses produtos químicos são fácil e completamente biodegradados num ambiente aquático, em condições aeróbias.
 
Período de dez dias:  período de dez dias imediatamente após ter sido alcançado 
o nível de biodegradação de 10 %.  
Biodegradabilidade inerente:  classificação atribuída aos produtos químicos 
para os quais existem provas inequívocas de biodegradação (primária ou total) 
num ensaio de biodegradabilidade.  
Biodegradação aeróbia total:  nível de degradação alcançado quando o produto 
químico em estudo é totalmente consumido pelos microrganismos, produzindo dióxido de carbono, água, sais minerais e novos componentes celulares micro ­
bianos (biomassa).
 
Mineralização:  degradação completa de um produto químico orgânico em CO  2 
e H  2 O, em condições aeróbias, ou em CH  4 , CO  2 e H  2 O, em condições anaeró ­
bias. 
Fase de latência:  período que decorre do início do ensaio até à aclimatação e/ou 
adaptação dos microrganismos responsáveis pela degradação e ao surgimento de um grau detetável de biodegradação do produto químico ou matéria orgânica em estudo (p. ex.: 10 % da biodegradação teórica máxima, ou menos, consoante a 
precisão da técnica de medição).
 
Fase de degradação:  período que decorre do final da fase de latência até ao 
momento em que se atinge 90 % da degradação máxima.  
Fase de patamar:  fase na qual já se atingiu a degradação máxima e a curva de 
biodegração estabiliza.  
Produto químico em estudo:  qualquer substância ou mistura à qual seja apli ­
cado o presente método de ensaio.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1435
 
Apêndice 2  
Exemplo de curva de biodegradação  
Figura 1  
Biodegradação do 1-octanol no ensaio do CO  2 no espaço livre
  
Glossário  
biodegradação  
fase de degradação  
nível máximo de biodegradação  
fase de patamar  
período de 10 dias  
período de ensaio (dias)  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1436
 
C.30.  BIOACUMULAÇÃO EM OLIGOQUETAS TERRESTRES  
INTRODUÇÃO  
1. Este método de ensaio é equivalente ao da  Test Guideline 317  (TG 317) da 
OCDE (2010). Entre os métodos de ensaio relativos ao destino ambiental, 
foram publicados, respetivamente em 1996 e em 2008, "Bioconcentração: 
ensaio dinâmico no peixe" — capítulo C.13 deste anexo (49) e "Bioacu ­
mulação em oligoquetas bentónicos sedimentares" (53). A extrapolação dos dados de bioacumulação em meio aquático para organismos terrestres como 
as minhocas é difícil, senão impossível. São atualmente utilizados modelos 
de cálculo baseados na lipofilia do produto químico — p. ex., 14 e 37 — para avaliar a bioacumulação de produtos químicos no solo, tal como cons ­
ta, por exemplo, do documento de orientação técnica da UE (19). A neces ­
sidade de um método de ensaio aplicável ao compartimento específico foi já 
abordada — p. ex., 55. Um tal método é particularmente importante para avaliar o envenenamento secundário nas cadeias alimentares terrestres (4). Há diversos métodos de ensaio nacionais que têm por objeto a bioacumu ­
lação noutros organismos que não os peixes — p. ex., 2 e 72. A  American 
Society for Testing and Materials  preparou um método de medição da 
bioacumulação causada por solos contaminados em minhocas ( Eisenia feti ­
da, Savigny) e oligoquetas da família  Enchytraeidae  (3). Um método in ­
ternacionalmente aceite para a determinação da bioacumulação num solo 
enriquecido com determinado produto químico irá melhorar a avaliação dos riscos dos produtos químicos nos ecossistemas terrestres — p. ex., 25 e 29.
 
2. Os invertebrados geófagos estão expostos aos produtos químicos presentes 
no solo. Entre eles, os oligoquetas terrestres desempenham um papel im ­
portante na estrutura e na função dos solos (15)(20). Vivem no solo e, em parte, à superfície (sobretudo na manta morta) e representam frequentemente as espécies mais abundantes em termos de biomassa (54). Por causarem 
bioturbação do solo e por servirem de presa, estes animais podem ter grande 
influência na biodisponibilização de produtos químicos a outros organismos predadores, quer invertebrados — p. ex., ácaros e coleópteros, cf. 64 —, quer vertebrados — p. ex., raposas e gaivotas, cf. 18 e 62. No apêndice 5 
são referidas algumas espécies de oligoquetas terrestres atualmente utiliza ­
das em ensaios ecotoxicológicos.
 
3. O guia da ASTM para ensaios laboratoriais de toxicidade do solo e de 
bioacumulação na minhoca  Eisenia fetida  e no oligoqueta  Enchytraeus 
albidus  (3) fornece muitas informações essenciais e úteis para a execução 
deste método de ensaio da bioacumulação no solo. Outros documentos 
referidos neste método de ensaio são o capítulo C.13 — "Bioconcentração: 
ensaio dinâmico no peixe" (49) — deste anexo e o  Test Guideline 315  da 
OCDE —  Bioaccumulation on Sediment-dwelling Benthic Oligochaetes  
(bioacumulação em oligoquetas bentónicos sedimentares), (53). Os resulta ­
dos práticos referidos em estudos e publicações sobre bioacumulação no 
solo — p. ex., 1, 5, 11, 12, 28, 40, 43, 45, 57, 59, 76, 78 e 79 — são também uma importante fonte de informação para este método de ensaio.
 
4. O método é maioritariamente aplicável a produtos químicos orgânicos neu ­
tros e estáveis, que têm tendência para ser adsorvidos no solo. Permite 
estudar a bioacumulação de compostos organometálicos estáveis que se 
associam ao solo e é também aplicável a metais e outros oligoelementos.  
CONDIÇÃO PRÉVIA  
5. Para medir a bioacumulação de um produto químico em oligoquetas terres ­
tres, foram realizados ensaios com metais pesados — p. ex., 63 — e com 
produtos químicos orgânicos persistentes que acusam valores de log K  ow 
entre 3,0 e 6,0 — p. ex., 40. Esses ensaios também se aplicam a:  
— produtos químicos com log K  ow superior a 6,0 (superidrofóbicos),  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1437
 
— produtos químicos pertencentes a classes de produtos químicos orgâni ­
cos com potencial reconhecido de bioacumulação em organismos vivos 
(por exemplo, produtos químicos tensioativos ou altamente adsorvíveis),  
— produtos químicos com potencial de bioacumulação dedutível das suas 
características estruturais (por exemplo, análogos de produtos químicos com potencial de bioacumulação conhecido) e
 
— metais.  
6. Antes de se iniciar o estudo, devem ser obtidos elementos identificativos do 
produto químico em causa, como: nome comum, denominação química (preferivelmente a denominação IUPAC), fórmula estrutural, número de registo CAS, grau de pureza, precauções de segurança, condições de con ­
servação adequadas e métodos de análise. Devem também ser conhecidos os 
seguintes dados:
 
a) solubilidade em água;  
b) coeficiente de partição octanol/água, K  ow ; 
c) coeficiente de partição solo-água, expresso como K  oc ; 
d) pressão de vapor;  
e) degradabilidade (por exemplo, no solo e na água);  
f) metabolitos conhecidos.  
7. Podem ser utilizados no estudo produtos químicos com ou sem marcação 
radioativa. No entanto, para facilitar a análise, recomenda-se a utilização dos primeiros. A decisão deve ser tomada com base nos limites de deteção ou na obrigatoriedade de medir o produto químico parental e os seus metabo ­
litos. Se for utilizado um produto químico com marcação radioativa e forem 
medidos os resíduos radioativos totais, importa que os resíduos com mar ­
cador radioativo presentes quer no solo quer nos organismos em estudo sejam caracterizados em termos de percentagem de produto químico paren ­
tal e de percentagens de produtos químicos marcados não parentais — por 
exemplo, em amostras recolhidas em estado estacionário ou no final da fase de absorção — para permitir calcular o fator de bioacumulação (BAF) do 
produto químico parental e dos metabolitos pertinentes deste no solo (cf. 
ponto 50). O método aqui descrito poderá ter de ser modificado — por exemplo, a fim de se dispor de biomassa suficiente — para medir produtos químicos orgânicos sem marcação radioativa ou metais. Na medição dos 
resíduos radioativos totais (por contagem de cintilação em meio líquido após 
extração, combustão ou solubilização dos tecidos), o fator de bioacumulação baseia-se no produto químico parental e nos metabolitos deste. O cálculo do BAF deve preferencialmente ter por base a concentração do produto quí ­
mico parental nos organismos e os resíduos radioativos totais. Seguidamen ­
te, por razões de comparabilidade entre os resultados dos diversos ensaios de bioacumulação, calcula-se a partir do BAF o fator de acumulação biota-solo (BSAF), normalizado em relação ao teor de lípidos dos vermes 
e ao teor de carbono orgânico do solo.
 
8. A toxicidade do produto químico em estudo para as espécies utilizadas no 
ensaio deve ser conhecida: por exemplo, a concentração com efeitos (CE  x ) 
ou a concentração letal (CL  x ) relativas ao tempo de duração da fase de 
absorção — p. ex., 19. A concentração do produto químico em estudo 
deve ser, preferencialmente, cerca de 1 % da CL  50 aguda assintótica do 
mesmo e pelo menos dez vezes superior ao limite de deteção do prosuto químico no solo pelo método de análise utilizado. Se possível, deve ser dada preferência a valores de toxicidade derivados de estudos de longa 
duração a efeitos subletais (51)(52). Se não estiverem disponíveis tais dados, 
um teste de toxicidade aguda dará informações úteis — p. ex., 23.
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1438
 
9. Deve dispor-se de um método de análise adequado, com exatidão, precisão 
e sensibilidade conhecidas, para determinar quantitativamente o produto 
químico nas soluções de ensaio, no solo e na matéria biológica, juntamente com os pormenores da preparação e da armazenagem das amostras e as correspondentes fichas de dados de segurançal. Devem também ser conhe ­
cidos os limites analíticos de deteção do produto químico no solo e nos 
tecidos dos vermes. Se for utilizado no ensaio um produto químico marcado com
 14 C, devem ser conhecidas a radioatividade específica (em Bq.mol  –1 ) e 
a percentagem de radioatividade associada a impurezas. A radioatividade 
específica do produto químico em estudo deve ser suficientemente elevada 
para facilitar as análises, e as concentrações de ensaio não devem induzir efeitos tóxicos.
 
10. O ensaio pode ser executado com solo artificial ou natural. Antes de se 
iniciar o ensaio, importa conhecer as características do solo natural utilizado, 
como, por exemplo, a origem ou os componentes do solo, o pH, o teor de 
carbono orgânico, a distribuição granulométrica (percentagem de areia, de limo e de argila) e a capacidade de retenção de água — (3)(48).
 
PRINCÍPIO DO ENSAIO  
11. Os parâmetros que caracterizam a bioacumulação de um produto químico 
incluem o fator de bioacumulação (BAF), a constante de velocidade de absorção (k
 s ) e a constante de velocidade de eliminação (k  e ). Estes parâme ­
tros são definidos no apêndice 1.  
12. O ensaio compreende duas fases: a fase de absorção (exposição) e a fase de 
eliminação (pós-exposição). Durante a fase de absorção, são expostos ao 
solo, previamente enriquecido com o produto químico em estudo, grupos replicados de vermes. Paralelamente aos vermes cobaias, mantêm-se em condições idênticas, mas sem o produto químico em estudo, grupos de 
vermes de controlo. Mede-se a massa seca e o teor de lípidos dos organis ­
mos sujeitos ao ensaio. Para o efeito, podem utilizar-se vermes do grupo de controlo. Os valores de fundo analíticos (ensaios em branco) podem ser obtidos analisando amostras dos vermes de controlo e do solo. Para a 
fase de eliminação, os vermes são transferidos para um solo isento do 
produto químico em estudo. É sempre necessária uma fase de eliminação, a menos que a absorção do produto químico durante a fase de exposição tenha sido insignificante. A fase de eliminação fornece informações sobre a 
velocidade à qual o produto químico é excretado pelos organismos sujeitos 
ao ensaio — p. ex., 27. Se, durante a fase de absorção, não tiver sido atingido um estado estacionário, a determinação dos parâmetros cinéticos — fator de bioacumulação cinético BAFk, constante de velocidade de ab ­
sorção e constante de velocidade de eliminação — deve basear-se preferen ­
cialmente num ajustamento simultâneo aos resultados das fases de absorção e de eliminação. A concentração do produto químico no interior ou à 
superfície dos vermes é monitorizada ao longo de ambas as fases do ensaio.
 
13. Durante a fase de absorção, são feitas medições a intervalos de amostragem 
que podem chegar a 14 dias (família  Enchytraeidae ) ou a 21 dias (minho ­
cas) até ser atingido o estado estacionário (11)(12)(67). O estado estacioná ­
rio ocorre quando o gráfico da concentração nos vermes em função do tempo é paralelo ao eixo do tempo, e três análises sucessivas da concen ­
tração feitas em amostras colhidas a intervalos de pelo menos dois dias 
variam entre si, no máximo, 20 %, com base em comparações estatísticas (p. ex., análise da variância, análise de regressão).
 
14. A fase de eliminação consiste em transferir os organismos sujeitos ao ensaio 
para recipientes que contêm o mesmo substrato, mas sem o produto químico 
em estudo. Durante a fase de eliminação, são feitas medições a intervalos de 
amostragem que podem chegar a 14 dias (família  Enchytraeidae ) ou a 21 
dias (minhocas), a menos que determinações analíticas anteriores tenham mostrado uma redução de 90 % dos resíduos do produto químico nos ver ­
mes. A concentração do produto químico nos vermes no final da fase de 
eliminação é indicada como correspondente a resíduos não eliminados. O
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fator de bioacumulação em estado estacionário (BAF  ss ) é calculado prefe ­
rencialmente como quociente entre a concentração nos vermes (C  a ) e a 
concentração no solo (C  s ) em estado estacionário aparente e também 
como fator de bioacumulação cinético, BAF  K , dado pelo quociente entre 
a constante de velocidade de absorção do solo (k  s ) e a constante de velo ­
cidade de eliminação (k  e ) (ver definições no apêndice 1), assumindo uma 
cinética de primeira ordem (ver cálculos no apêndice 2). Se a cinética de primeira ordem for manifestamente inaplicável, devem ser empregues outros modelos.
 
15. A constante de velocidade de absorção, a constante de velocidade de eli ­
minação (ou as constantes, se forem utilizados outros modelos), o fator de 
bioacumulação cinético (BAF  K ) e, se possível, os limites de confiança de 
cada um destes parâmetros são calculados por meios informáticos a partir de equações de modelo (ver orientações no apêndice 2). A adequação de um modelo pode ser determinada a partir, por exemplo, do coeficiente de cor ­
relação ou do coeficiente de determinação (coeficientes próximos de 1 
indicam boa adequação) ou da lei do qui-quadrado. A amplitude do erro-padrão ou do limite de confiança dos parâmetros estimados pode tam ­
bém dar uma boa indicação da adequação do modelo.
 
16. Para reduzir a variabilidade dos resultados dos ensaios de produtos químicos 
muito lipofílicos, os fatores de bioacumulação devem ser expressos em 
relação ao teor de lípidos e ao teor de carbono orgânico (kg de carbono orgânico no solo. kg
 –1 de lípidos nos vermes). Esta abordagem baseia-se no 
facto de que, para algumas classes de produtos químicos, há uma relação 
clara entre o potencial de bioacumulação e a lipofilia, relação essa bem 
estabelecida no caso dos peixes (47). Há uma relação entre o teor de lípidos dos peixes e a bioacumulação dos produtos químicos em causa. Em orga ­
nismos bentónicos, foram descobertas correlações similares — p. ex., 30 e 
44. Esta correlação foi igualmente demonstrada em oligoquetas terrestres — 
p. ex., 5, 6, 7 e 14. Se se dispuser de tecido suficiente, o teor de lípidos dos vermes sujeitos ao ensaio pode ser determinado na mesma matéria biológica utilizada para determinar a concentração do produto químico em estudo. 
Alternativamente, podem utilizar-se animais de controlo para medir o teor 
de lípidos.
 
VALIDADE DOS ENSAIOS  
17. Para que um ensaio seja válido, devem ser cumpridos os seguintes critérios, 
quer por parte dos organismos de controlo quer por parte dos organismos expostos:
 
— no final do ensaio, a mortalidade total durante as fases de absorção e de 
eliminação não pode exceder 10 % (minhocas) ou 20 % (família  Enchy­
traeidae ) do número total de vermes introduzidos;  
— para  Eisenia fetida  e E. andrei , a perda média de massa, medida no final 
da fase de absorção e no final da fase de eliminação, não pode exceder 
20 % da massa fresca inicial da respetiva fase.  
DESCRIÇÃO DO MÉTODO  
Espécies sujeitas a ensaio  
18. Para estudar a bioacumulação, recomenda-se várias espécies de oligoquetas 
terrestres. As mais utilizadas —  Eisenia fetida  ou E. andrei  (família  Lum­
bricidae ) e Enchytraeus albidus , E. crypticus  ou E. luxuriosus  (família  
Enchytraeidae ) — são descritas no apêndice 5.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1440
 
Dispositivos  
19. Deve ser evitada a utilização, em qualquer parte do equipamento, de mate ­
riais capazes de dissolver ou adsorver o produto químico em estudo ou de permitir fugas de outros produtos químicos ou que tenham um efeito ad ­
verso nos animais sujeitos ao ensaio. Servem recipientes normalizados re ­
tangulares ou cilíndricos, de materiais quimicamente inertes e com capaci ­
dade adequada à carga, isto é, ao número de vermes sujeitos ao ensaio. Pode ser utilizado aço inoxidável, plástico ou vidro em qualquer equipa ­
mento que entre em contacto com os meios de ensaio. Os recipientes de 
ensaio devem ser adequadamente cobertos para impedir a fuga dos vermes, mas permitindo uma entrada de ar suficiente. No caso de produtos químicos 
com coeficiente de adsorção elevado, como os piretroides sintéticos, pode 
ser necessário vidro silanizado. Em tais situações, importa descartar o equi ­
pamento após a utilização (49). Devem ser impedidas fugas de produtos químicos com marcação radioativa e de produtos químicos voláteis. Devem 
ser utilizadas armadilhas (por exemplo, garrafas de vidro para lavagem de 
gases) contendo absorventes capazes de reter os resíduos que se evaporem dos recipientes de ensaio.
 
Solo 
20. A qualidade do solo ensaiado deve permitir a sobrevivência e, preferivel ­
mente, a reprodução dos organismos durante os períodos de aclimatação e 
de ensaio, sem apresentarem aspeto ou comportamento anormal. É neces ­
sário que os vermes se enterrem no solo.  
21. Como substrato para o ensaio é recomendado o solo artificial descrito no 
capítulo C.8 deste anexo — (48). No apêndice 4 é descrita a preparação do solo artificial a utilizar nos ensaios de bioacumulação e são feitas recomen ­
dações sobre a armazenagem de solos artificiais. O solo artificial seco ao ar 
pode ser armazenado à temperatura ambiente até à sua utilização.
 
22. Contudo, também solos naturais de locais não poluídos podem servir para 
ensaio e/ou para cultura. Devem conhecer-se, no mínimo, as suas caracte ­
rísticas seguintes: origem (local de recolha), pH, teor de carbono orgânico, 
distribuição granulométrica (percentagem de areia, de limo e de argila), capacidade máxima de retenção de água (WHC
 max ) e teor percentual de 
água (3). A pesquisa de micropoluentes no solo ou nos seus componentes 
antes da utilização deverá proporcionar informações úteis. Caso se utilize 
solo natural proveniente de terras agrícolas, as amostras não devem ser colhidas menos de um ano após o último tratamento com produtos fitofar ­
macêuticos ou da última aplicação de estrume de animais, nem menos de 
seis meses após o último tratamento com fertilizantes orgânicos (50). Na 
referência 3 são descritos procedimentos de manipulação de solos naturais antes da sua utilização em ensaios laboratoriais de ecotoxicologia com oligoquetas. O tempo de armazenagem de solos naturais em laboratório 
deve ser o mais curto possível.
 
Aplicação do produto químico em estudo  
23. O produto químico é incorporado no solo. As suas propriedades físico- 
-químicas devem ser tidas em conta. Os produtos químicos hidrossolúveis devem ser completamente dissolvidos em água antes da sua mistura com o 
solo. O procedimento de enriquecimento recomendado para produtos quí ­
micos pouco hidrossolúveis consiste em incorporar o produto químico em estudo num ou mais dos componentes do solo (artificial). Por exemplo, a areia quartzítica (ou uma parte dela) pode ser embebida numa solução do 
produto químico com um solvente orgânico adequado que, em seguida, é 
lentamente evaporado até a areia secar. A fração impregnada pode então ser misturada com o solo humedecido. A grande vantagem deste procedimento é que não se introduz nenhum solvente no solo. Se for utilizado solo 
natural, o produto químico em estudo pode ser adicionado enriquecendo, 
pelo método atrás descrito para solo artificial, uma porção do solo seca ao
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ar, ou misturando o produto químico no solo húmido, com subsequente 
evaporação se se tiver utilizado um agente solubilizante. Em geral, deve 
evitar-se o mais possível o contacto de solo húmido com solventes. Ter em conta o seguinte (3):
 
— se se utilizar um solvente que não água, importa que seja hidromiscível 
e/ou possa ser removido (por evaporação, por exemplo,), deixando no 
solo apenas o produto químico em estudo,  
— se se recorrer a um controlo do solvente, não é necessário controlo 
negativo. O controlo do solvente deve conter a mais elevada concen ­
tração de solvente adicionado ao solo e utilizar solvente do mesmo lote 
que serviu para preparar a solução-mãe. A toxicidade e a volatilidade do solvente e a solubilidade do produto químico em estudo no solvente escolhido devem ser os critérios principais para a seleção de um agente 
solubilizante adequado.
 
24. No caso dos produtos químicos pouco solúveis em água ou em solventes 
orgânicos, podem misturar-se (com almofariz e pilão, por exemplo,) 2,0- -2,5 g de areia quartzítica finamente moída por cada recipiente de ensaio 
com a quantidade do produto químico em estudo, até obter a concentração 
de ensaio desejada. Esta mistura de areia quartzítica e produto químico é misturada cuidadosamente com o solo previamente humedecido, adicio ­
nando água desionizada até obter o teor de humidade necessário. A mistura 
final é distribuída pelos recipientes de ensaio. Repete-se o procedimento 
para cada concentração de ensaio e prepara-se também um controlo adequa ­
do, com 2,0-2,5 g de areia quartzítica finamente moída em cada recipiente.
 
25. Após o enriquecimento, determina-se a concentração do produto químico no 
solo. A distribuição homogénea do produto no solo deve ser verificada antes de se introduzirem os organismos que vão ser sujeitos ao ensaio. Deve indicar-se o método utilizado para o enriquecimento, bem como as razões 
da escolha de um determinado procedimento de enriquecimento (24).
 
26. Antes de se adicionar os organismos, deve, idealmente, estabelecer-se um 
equilíbrio entre o solo e a água intersticial, para o que se recomenda um período de quatro dias a 20 °C. Para muitos produtos químicos orgânicos 
pouco hidrossolúveis, o tempo necessário para alcançar um verdadeiro equi ­
líbrio entre as frações adsorvida e dissolvida pode ser de dias ou meses. Dependendo da finalidade do estudo — por exemplo, quando se trata de imitar as condições ambientais —, o solo enriquecido poderá ter de ser 
"envelhecido" por um período mais longo — por exemplo, no caso dos 
metais, três semanas a 20 °C (22).
 
Cultura dos organismos a ensaiar  
27. De preferência, deve ter-se uma cultura permanente dos vermes no labora ­
tório. O apêndice 5 dá orientações sobre métodos de cultura laboratorial de  
Eisenia fetida  e de  E. andrei , bem como de espécies da família  Enchytraei ­
dae — ver também 48, 51 e 52.  
28. Os vermes utilizados nos ensaios devem estar isentos de doenças, anomalias 
e parasitas visíveis.  
REALIZAÇÃO DO ENSAIO  
29. Os organismos sujeitos a ensaio são expostos ao produto químico em estudo 
durante a fase de absorção, que deve durar 14 dias (família  Enchytraeidae ) 
ou 21 dias (minhocas), a menos que se demonstre que o estado estacionário 
foi alcançado.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1442
 
30. Para a fase de eliminação, os vermes são transferidos para um solo isento do 
produto químico em estudo. A primeira amostra deve ser colhida entre 4 e 
24 horas após o início da fase de eliminação. O apêndice 3 contém exem ­
plos de programação da colheita de amostras para uma fase de absorção de 21 dias e uma fase de eliminação de 21 dias.
 
Organismos sujeitos aos ensaios  
31. Em muitas espécies terrestres da família  Enchytraeidae , a massa individual 
é bastante baixa (por exemplo, 5-10 mg de massa húmida por indivíduo no 
caso de  Enchytraeus albidus  e menos no caso de  E. crypticus  ou E. luxu­
riosus ). Para efetuar as pesagens e as análises químicas, pode ser necessário 
juntar os vermes de cada recipiente de replicação (ou seja, todos os vermes 
de um recipiente de replicação para se obter um resultado único de análise 
de tecido). A cada replicado são adicionados vinte espécimes de  Enchy­
traeidae , devendo ser utilizados pelo menos três replicados. Se o limite de 
deteção analítico do produto químico em estudo for elevado, poderão ser 
necessários mais vermes. Para as espécies com maior massa individual 
(Eisenia fetida  e E. andrei ), podem ser utilizados recipientes de replicação 
com um só espécime.  
32. As minhocas utilizadas num ensaio devem ter massa similar (por exemplo, 
cada espécime de  Eisenia fetida  e E. andrei  deve ter massa de 250-600 mg). 
Os espécimes da família  Enchytraeidae  (por exemplo, da espécie  Enchy­
traeus albidus ) devem ter um comprimento de aproximadamente 1 cm. 
Todos os vermes utilizados num ensaio devem provir da mesma fonte e 
ser adultos com clitélio (ver apêndice 5). Uma vez que a massa e a idade do 
animal podem ter influência nos valores do BAF (por exemplo, devido a variações no teor de lípidos e/ou à presença de ovos), tais parâmetros devem ser registados com exatidão e tidos em conta na interpretação dos resulta ­
dos. Por outro lado, durante o período de exposição, podem surgir casulos 
de ovos, o que terá também efeito nos valores do BAF. Recomenda-se a pesagem de uma subamostra dos vermes antes do ensaio, a fim de estimar os valores médios da massa húmida e da massa seca.
 
33. Deve utilizar-se um rácio elevado solo/vermes, a fim de minimizar o de ­
créscimo da concentração do produto químico no solo durante a fase de absorção. Para as espécies  Eisenia fetida  e E. andrei , recomenda-se um 
valor mínimo de 50 g de massa seca de solo por cada verme e, para a 
família  Enchytraeidae , um mínimo de 10-20 g de massa seca de solo por 
cada recipiente de ensaio. Os recipientes devem conter uma camada de solo de 2-3 cm no caso de vermes da família  Enchytraeidae  ou de 4-5 cm no 
caso das minhocas.
 
34. Os vermes a ensaiar são retirados da cultura (no caso da família  Enchy­
traeidae , por exemplo, com recurso a pinças de joalheiro). Transfere-se 
animais adultos para solo não tratado, para aclimatação, e alimentam-se (cf. ponto 36). Se as condições de ensaio diferirem das condições de cultura, 
deverá ser suficiente uma fase de aclimatação de 24-72 horas para adaptar 
os vermes às condições de ensaio. Terminada a aclimatação, os vermes são transferidos para vasos de vidro (por exemplo, placas de Petri) com água limpa, para ser lavados, e em seguida são pesados, antes da sua colocação 
no solo de ensaio. Antes da pesagem, a água em excesso deve ser removida 
dos vermes, percutindo-os delicadamente contra as bordas da placa ou secando-os com cuidado por meio de um toalhete de papel ligeiramente humedecido.
 
35. Deve observar-se e registar-se o comportamento dos organismos sujeitos a 
ensaio, em termos de enterramento no solo. Nos ensaios com minhocas, os animais (de controlo ou expostos) enterram-se normalmente ao cabo de algumas horas; este comportamento deve ser confirmado, o mais tardar, 
24 h após a colocação dos vermes nos recipientes de ensaio. Se as minhocas 
não se enterrarem (por exemplo, mais de 10 % delas ao cabo de mais de metade da fase de absorção), é sinal de que as condições do ensaio não são adequadas ou de que as minhocas não estão saudáveis. Nesse caso, o ensaio 
deve ser interrompido e repetido. Os vermes da família  Enchytraeidae  vi­
vem sobretudo nos poros intersticiais do solo e é frequente o seu tegumento
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estar só parcialmente em contacto com o substrato circundante; considera-se 
que, nesta família, a exposição dos vermes que se enterram é equivalente à 
dos que não se enterram, pelo que a ausência de enterramento não exige necessariamente a repetição do ensaio.
 
Alimentação  
36. É necessário alimentar os vermes quando se utiliza um solo com baixo teor 
de carbono orgânico total. Caso se utilize um solo artificial, recomenda-se 
uma frequência de alimentação semanal (ou seja, os vermes são alimentados uma vez por semana), com 7 mg de esterco seco por 1 g de solo seco no caso das minhocas e com 2-2,5 mg de flocos de aveia moídos por 1 g de 
solo seco no caso da família  Enchytraeidae  (11). A primeira ração alimentar 
deve ser misturada com o solo imediatamente antes da colocação dos or ­
ganismos a ensaiar. É preferível utilizar o mesmo tipo de alimento que nas culturas (ver apêndice 5).
 
Luz e temperatura  
37. Os ensaios devem ser realizados segundo um ciclo controlado de 16 horas 
de luz e 8 de obscuridade, preferencialmente com uma intensidade de 400-800 lx na zona dos recipientes de ensaio (3). A temperatura deve ser 
de 20 ± 2 °C ao longo de todo o ensaio.
 
Concentrações de ensaio  
38. É utilizada uma única concentração. As situações em que se exijam concen ­
trações adicionais devem ser justificadas. Se a toxicidade (CE  x ) do produto 
químico em estudo for próxima do limite de deteção analítico, recomenda-se 
a utilização de um produto químico marcado radioativamente com elevada 
radioatividade específica. Para metais, a concentração deve ser superior ao nível de fundo nos tecidos e no solo.
 
Replicados  
39. Para as medições cinéticas (fase de absorção e fase de eliminação), o nú ­
mero mínimo de recipientes de replicação expostos é de três por cada 
ponto de amostragem. O número total de replicados preparados deve ser suficiente para abranger todos os tempos de amostragem durante a fase de 
absorção e a fase de eliminação.
 
40. Para as observações e medições biológicas (quociente entre massa seca e 
massa húmida, teor de lípidos, etc.) e para a análise das concentrações de 
fundo nos vermes e no solo, devem ser constituídos pelo menos doze 
recipientes de replicação de um controlo negativo (colheita de amostras em quatro recipientes no início da fase de absorção, em quatro no final da fase de absorção e em quatro no final da fase de eliminação), se não tiver 
sido utilizado outro solvente além da água. Se for utilizado um qualquer 
agente solubilizante para a aplicação do produto químico em estudo, deve-se ensaiar, além dos replicados expostos, um controlo do solvente (colheita de amostras em quatro recipientes de replicação no início da fase de absorção, 
em quatro no final da fase de absorção e em quatro no final da fase de 
eliminação), contendo todos os componentes, com exceção do produto quí ­
mico em estudo. Neste caso, podem também ser constituídos quatro reci ­
pientes de replicação adicionais de um controlo negativo (sem solvente), 
para amostragem opcional no final da fase de absorção. Estes replicados 
podem ser comparados biologicamente com o controlo do solvente a fim de obter informações sobre uma eventual influência do solvente nos organis ­
mos sujeitos ao ensaio. Recomenda-se a constituição de um número sufi ­
ciente de recipientes de replicação adicionais de reserva (por exemplo, oito) 
para exposição e controlo(s).
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Frequência das medições da qualidade do solo  
41. No início e no final da fase de absorção e da fase de eliminação medem-se 
o pH e o teor de humidade do solo. A temperatura no local do ensaio é medida continuamente. O teor de humidade do solo deve ser verificado uma 
vez por semana, pesando os recipientes de ensaio e comparando as massas 
obtidas com as massas iniciais (isto é, no início do ensaio). As perdas de água devem ser repostas com água desionizada.
 
Colheita de amostras e análise dos vermes e do solo  
42. O apêndice 3 contém exemplos de programação da colheita de amostras 
para a fase de absorção e para a fase de eliminação em ensaios de bio ­
acumulação realizados com minhocas e com vermes da família  Enchytraei ­
dae. 
43. Antes da colocação dos vermes, durante a fase de absorção e durante a fase 
de eliminação, colhe-se amostras de solo dos recipientes de ensaio para 
determinar a concentração do produto químico em estudo. Durante o ensaio, 
determina-se as concentrações do produto químico nos vermes e no solo. Em geral, mede-se as concentrações totais no solo. Facultativamente, pode 
medir-se as concentrações na água intersticial, caso em que, antes do início 
do estudo, deve conhecer-se os fundamentos disso e deve dispor-se dos métodos adequados (elementos a incluir posteriormente no relatório).
 
44. Colhe-se amostras dos vermes e do solo em, pelo menos, seis ocasiões 
durante a fase de absorção e a fase de eliminação. Se a estabilidade do 
produto químico em estudo for demonstrada, pode reduzir-se o número de análises ao solo. Recomenda-se a análise de, pelo menos, três replicados no início e no final da fase de absorção. Se a concentração no solo medida no 
final da fase de absorção diferir em mais de 30 % da medida no início, 
devem também ser analisadas as amostras de solo colhidas noutras datas.
 
45. A cada tempo de colheita de amostras, os vermes do replicado em causa são 
retirados do solo (por exemplo, espalhando o solo do replicado sobre um 
tabuleiro raso e colhendo os vermes com pinças de joalheiro) e lavados 
rapidamente em água num tabuleiro raso de vidro ou aço. Remove-se a água em excesso (cf. ponto 34). Transfere-se os vermes cuidadosamente para um recipiente previamente tarado e pesando-se de imediato, incluindo o con ­
teúdo do trato digestivo.
 
46. No caso das minhocas ( Eisenia  sp.), deixam-se evacuar o trato digestivo de 
um dia para o outro — por exemplo, sobre papel de filtro humedecido, numa placa de Petri coberta (cf. ponto 34). Após essa purga, determina-se a 
massa dos vermes, a fim de avaliar um eventual decréscimo da biomassa 
durante o ensaio (ver critérios de validade no ponto 17). No caso dos vermes da família  Enchytraeidae , a pesagem e a análise de tecidos são 
efetuadas sem purga do trato digestivo, por esta ser tecnicamente difícil 
devido às pequenas dimensões destes animais. Terminada a pesagem final, 
os vermes devem ser occisados de imediato, pelo método mais adequado (por exemplo, com azoto líquido ou por congelamento a temperaturas in ­
feriores a -18 °C).
 
47. Durante a fase de eliminação, os vermes substituem o conteúdo contami ­
nado do trato digestivo por solo limpo. Quer isto dizer que, no caso de animais que não purgaram o trato digestivo (vermes da família  Enchytraei ­
dae, neste caso) integrantes de amostras colhidas imediatamente antes da 
fase de eliminação, as medições incluem solo contaminado presente no trato 
digestivo. Em relação aos oligoquetas aquáticos, considera-se que, após as primeiras 4 a 24 horas da fase de eliminação, a maior parte do conteúdo contaminado do trato digestivo foi substituída por sedimento limpo — p. 
ex., 46. Observou-se o mesmo em minhocas em estudos sobre a acumulação 
de cádmio e zinco com marcação radioativa (78). Nos vermes da família  
Enchytraeidae , que não purgaram o trato digestivo, a concentração desta 
primeira amostra da fase de eliminação pode ser considerada como concen ­
tração nos tecidos após purga do trato digestivo. Para atender à diluição da 
concentração do produto químico em estudo por solo não contaminado, durante a fase de eliminação, a massa do conteúdo do trato digestivo pode ser estimada a partir do quociente entre a massa húmida de vermes 
e a massa das suas cinzas ou do quociente entre a massa seca de vermes e a 
massa das suas cinzas.
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48. As amostras de solo e de vermes devem, de preferência, ser analisadas 
imediatamente após a remoção (ou seja, no prazo de um a dois dias), a 
fim de evitar degradações ou outras perdas, e é recomendável calcular as velocidade aproximadas de absorção e de eliminação no decurso do ensaio. Se a análise for adiada, as amostras devem ser armazenadas por um método 
adequado — por exemplo, ultracongelamento ( ≤ -18 °C).
 
49. Deve confirmar-se se a precisão e a reprodutibilidade da análise química, 
bem como a recuperação do produto químico em estudo das amostras de solo e das amostras de vermes, são satisfatórias para o método em questão. 
Devem indicar-se a eficácia da extração, o limite de deteção e o limite de 
quantificação. Do mesmo modo, deve confirmar-se que o produto químico em estudo não é detetável nos recipientes de controlo em concentrações superiores ao nível de fundo. A concentração do produto químico em estudo 
(C
 a ), se for > 0 nos vermes de controlo, deve ser incluída no cálculo dos 
parâmetros cinéticos (cf. apêndice 2). Ao longo de todo o ensaio, as amos ­
tras devem ser manipuladas de modo a minimizar contaminações e perdas (resultantes, por exemplo, da adsorção do produto químico em estudo no 
dispositivo de colheita das amostras).
 
50. Caso se estude um produto químico com marcação radioativa, é possível 
analisar o produto químico parental e os seus metabolitos. A determinação quantitativa do produto químico parental e dos seus metabolitos em estado 
estacionário ou no final da fase de absorção fornece informações importan ­
tes. As amostras devem então ser limpas, para que possa determinar-se quantitativamente apenas o produto químico parental. Se a um único meta ­
bolito corresponderem mais de 10 % da radioatividade total na(s) amostra(s) 
analisada(s), é recomendável identificá-lo.
 
51. Devem ser registadas e indicadas a recuperação global e a recuperação do 
produto químico nos vermes, no solo e em eventuais armadilhas com ab ­
sorventes para reter o produto químico evaporado.  
52. O agrupamento dos espécimes que constituem a amostra colhida num de ­
terminado recipiente de ensaio é aceitável em relação aos vermes da família  
Enchytraeidae , que são menores do que as minhocas. Se o agrupamento 
implicar a redução do número de replicados, os procedimentos estatísticos 
aplicáveis aos dados sofrerão limitações. Se forem exigíveis um procedi ­
mento estatístico e uma representatividade estatística específicos, deve ser utilizado no ensaio um número de recipientes de replicação adequado ao 
agrupamento, ao procedimento e à representatividade pretendidos.
 
53. Recomenda-se que o BAF seja expresso em função da massa seca total e, 
quando necessário (ou seja, no caso de produtos químicos muito hidrofóbi ­
cos), também em função do teor de lípidos. Devem ser utilizados métodos 
adequados para determinar o teor de lípidos (alguns dos métodos existentes 
— p. ex., 31 e 58 — têm de ser adaptados para o efeito). Estes métodos recorrem a uma técnica de extração com clorofórmio/metanol. No entanto, para evitar os solventes clorados, deve utilizar-se uma versão modificada do 
método de Bligh e Dyer (9), descrita na referência (17). Como os vários 
métodos podem não conduzir a resultados idênticos, importa explicar o método utilizado. Sempre que possível, isto é, quando se dispuser de tecido suficiente, a análise dos lípidos deve, idealmente, ser feita na mesma amos ­
tra ou no mesmo extrato que a análise do produto químico em estudo, 
porquanto os lípidos têm frequentemente de ser removidos do extrato antes de este poder ser analisado cromatograficamente (49). Alternativamente, pode utilizar-se animais de controlo para medir o teor de lípidos, que serve 
em seguida para normalizar os valores do BAF. Esta última metodologia 
reduz a contaminação do equipamento com o produto químico em estudo.
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DADOS E RELATÓRIOS  
Tratamento dos resultados  
54. A curva de absorção do produto químico em estudo é obtida exprimindo em 
função do tempo a concentração do produto no interior ou à superfície dos vermes durante a fase de absorção, em escalas aritméticas. Quando a curva atinge um patamar ou estado estacionário (ver definições no apêndice 1), 
calcula-se o fator de bioacumulação em estado estacionário BAF
 ss pela 
seguinte fração:  
C a em estado estacionário ou no final da fase de absorção  ðmédiaÞ 
C s em estado estacionário ou no final da fase de absorção  ðmédiaÞ 
C a Ca é a concentração do produto químico em estudo no organismo sujeito 
ao ensaio;  
C s é a concentração do produto químico em estudo no solo.  
55. Se não for atingido estado estacionário (ou seja, se a curva não atingir um 
patamar), deve ser determinado o BAF  K , baseado nas constantes de velo ­
cidade, em vez do BAF  ss , como se segue:  
— determina-se o fator de acumulação (BAF  K ) como quociente k  s /k e, 
— de preferência, as velocidades de absorção e de eliminação calculam-se 
simultaneamente (cf. equação 11 no apêndice 2),  
— a constante de velocidade de eliminação (k  e ) é normalmente determinada 
a partir da curva de eliminação (ou seja, da linha que representa a concentração do produto químico nos vermes durante a fase de elimi ­
nação). A constante de velocidade de absorção (k
 s ) é então calculada em 
função de k  e e de um valor de C  a derivado da curva de absorção — ver 
no apêndice 2 uma descrição destes métodos. Para obter o fator BAF  K e 
as constantes de velocidade k  s e k  e , é preferível recorrer a métodos 
informáticos de estimativa de parâmetros não lineares. Se, manifesta ­
mente, a curva de eliminação não obedecer a uma cinética de primeira 
ordem, devem ser utilizados modelos mais complexos.  
Relatório dos ensaios  
56. Elementos a constar do relatório dos ensaios:  
Produto químico em estudo:  
— todas as informações disponíveis sobre toxicidade aguda e a longo prazo 
(p. ex., CE  x , CL  x , NOEC) para oligoquetas que vivem no solo,  
— grau de pureza, estado físico e propriedades físico-químicas — p. ex., 
log K  ow , hidrossolubilidade,  
— dados de identificação química: proveniência do produto químico em 
estudo, identidade e concentração dos solventes eventualmente utiliza ­
dos, 
— se o produto químico tiver marcação radioativa, a posição precisa dos 
átomos marcados, a radioatividade específica e a pureza radioquímica.  
Espécies sujeitas ao ensaio:  
— denominação científica, estirpe, origem, pré-tratamentos eventuais, acli ­
matação, idade, gama de dimensões, etc.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1447
 
Condições de realização dos ensaios:  
— procedimento de ensaio utilizado,  
— tipo e características da iluminação utilizada e fotoperíodo(s),  
— protocolo do ensaio (por exemplo, número e tamanho dos recipientes, 
massa de solo e espessura da camada de solo, número de replicados, 
número de vermes por replicado, número de concentrações de ensaio, duração da fase de absorção e da fase de eliminação, frequência da colheita de amostras),
 
— justificação da escolha do material dos recipientes de ensaio,  
— método de preparação e aplicação do produto químico em estudo e 
razões da escolha desse método,  
— concentrações de ensaio nominais, bem como as médias e os 
desvios-padrão dos valores medidos nos recipientes de ensaio e o mé ­
todo de obtenção desses valores,  
— origem dos componentes do solo artificial ou — se se utilizar um meio 
natural — origem do solo, descrição de eventuais pré-tratamentos, re ­
sultados dos controlos (sobrevivência, evolução da biomassa, reprodu ­
ção), características do solo — pH, teor de carbono orgânico total, 
distribuição granulométrica (percentagem de areia, de limo e de argila), capacidade máxima de retenção de água, teor percentual de água no início e no final do ensaio e quaisquer outras medições efetuadas,
 
— explicação do tratamento das amostras de solo e de vermes, incluindo 
elementos sobre a preparação, a armazenagem, os procedimentos de 
enriquecimento do solo com o produto químico em estudo, a extração, 
os procedimentos de análise (e sua precisão) do produto químico nos vermes e no solo, o teor de lípidos (se for medido) e as recuperações do produto químico em estudo.
 
Resultados:  
— mortalidade dos vermes de controlo e dos vermes de cada recipiente de 
ensaio e eventuais comportamentos anormais observados (por exemplo, os vermes evitam o solo, não se verifica a reprodução de vermes da 
família  Enchytraeidae  num ensaio de bioacumulação, etc.),
 
— quociente entre massa seca e massa húmida, quer do solo quer dos 
organismos sujeitos ao ensaio (útil para a normalização),  
— massa húmida dos vermes em cada tempo de colheita de amostras; no 
caso das minhocas, a massa húmida no início do ensaio e em cada 
tempo de colheita de amostras antes e depois da purga do trato diges ­
tivo, 
— teor de lípidos dos organismos sujeitos ao ensaio (se for medido),  
— curvas indicando a cinética de absorção e de eliminação do produto 
químico nos vermes e o intervalo de tempo até ao estado estacionário,  
— C  a e C  s (com desvio-padrão e intervalo, se for caso disso) para cada 
tempo de colheita de amostras (C  a expressa em g por kg de massa 
húmida e de massa seca do corpo inteiro; C  s expressa em g por kg de 
massa húmida e por kg de massa seca do solo). Se for necessário um fator de acumulação biota-solo (BSAF) (por exemplo, para comparação 
dos resultados de dois ou mais ensaios realizados em animais com 
diferentes teores de lípidos), C
 a pode também ser expressa em g por kg 
de lípidos do organismo e C  s pode ser expressa em g por kg de carbono 
orgânico do solo,  
— BAF (expresso em kg de solo por kg de vermes), constante de veloci ­
dade de absorção do solo (k  s , expressa em g de solo por kg de vermes 
por dia) e constante de velocidade de eliminação (k  e , expressa em dia  –1 ); 
adicionalmente, pode indicar-se o BSAF (expresso em kg de carbono 
orgânico do solo por kg de lípidos dos vermes),  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1448
 
— se tiverem sido medidas: percentagens do produto químico parental, dos 
metabolitos deste e dos resíduos ligados (ou seja, percentagem do pro ­
duto químico em estudo que não pode ser extraído por métodos de extração comuns) detetadas no solo e nos animais sujeitos ao ensaio,
 
— métodos utilizados para as análises estatísticas dos dados.  
Avaliação dos resultados:  
— coerência dos resultados com os critérios de validade referidos no 
ponto 17,  
— resultados inesperados ou inabituais — por exemplo, eliminação incom ­
pleta do produto químico pelos animais sujeitos ao ensaio.  
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(48) Capítulo C.8 deste anexo —  Toxicidade em relação às minhocas . 
(49) Capítulo C.13 deste anexo —  Bioconcentração: ensaio dinâmico com peixe . 
(50) Capítulo C.21 deste anexo —  Microorganismos no solo: ensaio de trans ­
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Apêndice 1  
DEFINIÇÕES  
Bioacumulação  é o aumento que a concentração do produto químico em estudo 
sofre no interior ou à superfície de um organismo, relativamente à concentração do mesmo produto no meio circundante. A bioacumulação resulta dos processos de bioconcentração e bioamplificação (cf.  infra) .
 
Bioconcentração  é o aumento que a concentração do produto químico em estudo 
sofre no interior ou à superfície de um organismo, em consequência da absorção do produto exclusivamente a partir do meio circundante (ou seja, através da 
superfície do corpo e através do solo ingerido), relativamente à concentração 
do mesmo produto no meio circundante.
 
Bioamplificação  é o aumento que a concentração do produto químico em estudo 
sofre no interior ou à superfície de um organismo, sobretudo em consequência da 
absorção de alimentos ou presas contaminados, relativamente à concentração do mesmo produto nesses alimentos ou presas. A bioamplificação pode conduzir à transferência do produto químico para as cadeias alimentares, com acumulação.
 
Eliminação  de um produto químico em estudo é a perda desse produto pelos 
tecidos do organismo sujeito ao ensaio, mediante processos ativos ou passivos, perda essa que ocorre independentemente da presença ou ausência do produto 
químico no meio circundante.
 
Fator de bioacumulação  (BAF) em qualquer momento da fase de absorção 
deste ensaio de bioacumulação é o quociente entre a concentração do produto 
químico no interior ou à superfície do organismo sujeito ao ensaio (C  a — em g 
por kg de massa seca de verme) e a concentração do produto químico no meio circundante (C
 s — em g por kg de massa seca de solo); as unidades em que se 
exprime o BAF são kg de solo por kg de verme.  
Fator de bioacumulação em estado estacionário  (BAF  ss ) é o BAF em estado 
estacionário, sem variação significativa ao longo de um período prolongado, mantendo-se constante durante esse período a concentração do produto químico 
no meio circundante (C
 s — em g por kg de massa seca de solo).  
O fator de bioacumulação , quando calculado diretamente pelo quociente entre a 
constante de velocidade de absorção do solo e a constante de velocidade de 
eliminação do solo (k  s e k e — cf.  infra) , é designado fator de bioacumulação 
cinético (BAF  K ). 
Fator de acumulação biota-solo  (BSAF) é o quociente entre a concentração do 
produto químico em estudo no interior ou à superfície do organismo sujeito ao 
ensaio, normalizada relativamente ao teor de lípidos, e a concentração do mesmo produto químico no solo, normalizada relativamente ao teor de carbono orgânico, em estado estacionário. C
 a é então expressa em g por kg de lípidos do organismo 
e C  s em g por kg de teor orgânico do solo; as unidades em que se exprime o 
BSAF são kg de carbono orgânico por kg de lípidos.  
Patamar  ou estado estacionário  é o equilíbrio entre os processos de absorção e 
de eliminação que ocorrem simultaneamente durante a fase de exposição. 
No gráfico do BAF em função do tempo, o estado estacionário é atingido quando a curva se torna uma linha paralela ao eixo do tempo e três cálculos sucessivos do BAF em amostras colhidas com intervalos de, pelo menos, dois dias não 
diferem mais de 20 % entre si, sem que haja diferenças significativas entre os 
três períodos de amostragem. No caso de produtos químicos de absorção lenta, são mais adequados intervalos de sete dias (49).
 
Coeficiente de partição carbono orgânico-água  (K  oc ) é o quociente entre a 
concentração de um produto químico no interior ou à superfície da fração de carbono orgânico de um solo e a concentração do mesmo produto químico na água, em condições de equilíbrio.
 
Coeficiente de partição octanol-água  (K  ow , por vezes também representado por 
P ow ), é o quociente entre a solubilidade de um produto químico em n-octanol e a 
solubilidade do mesmo produto químico na água, em condições de equilíbrio. O 
logaritmo de K  ow (log K  ow ) é utilizado como indicador do potencial de bioacu ­
mulação de produtos químicos em organismos aquáticos.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1454
 
Fase de absorção  ou de exposição  é o período durante o qual os organismos 
sujeitos ao ensaio estão expostos ao produto químico em estudo.  
Constante de velocidade de absorção do solo  (k s ) é o valor numérico que 
define o ritmo (ou taxa) de aumento da concentração do produto químico em estudo no interior ou à superfície do organismo sujeito ao ensaio, em resultado 
da fase de absorção de solo; k
 s é expressa em g de solo por kg de verme por dia.  
Fase de eliminação  é o período, depois de os organismos sujeitos ao ensaio 
serem transferidos de um meio contaminado para um meio isento do produto químico em estudo, durante o qual é estudada a eliminação (ou perda líquida) do 
produto químico por esses organismos.
 
Constante de velocidade de eliminação  (k e ) é o valor numérico que define o 
ritmo (ou taxa) de redução da concentração do produto químico em estudo no interior ou à superfície do organismo sujeito ao ensaio, depois de o organismo 
sujeito ao ensaio ser transferido de um meio que contém o produto químico para 
um meio dele isento; k
 e é expressa em dia  -1 . 
Produto químico em estudo  é qualquer substância ou mistura à qual seja apli ­
cado este método de ensaio.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1455
 
Apêndice 2  
Cálculo dos parâmetros de absorção e de eliminação  
O principal parâmetro final de um ensaio de bioacumulação é o fator de bio ­
acumulação — BAF. O BAF pode ser calculado dividindo a concentração no organismo sujeito ao ensaio, C
 a , pela concentração no solo, C  s , em estado esta ­
cionário. Se não se atingir o estado estacionário durante a fase de absorção, 
calcula-se o BAF  K a partir das constantes de velocidade, em vez do BAF  ss . 
Deve, porém, indicar-se se o BAF é ou não baseado nas concentrações em estado estacionário.
 
O meio habitual para obter o fator de bioacumulação cinético (BAF  K ), a cons­
tante de velocidade de absorção do solo (k  s ) e a constante de velocidade de 
eliminação (k  e ) são métodos informáticos de estimativa de parâmetros não linea ­
res — por exemplo, com base nos modelos descritos na referência (68). Dado um 
conjunto de dados sequenciais de concentração em função do tempo e as equa ­
ções de modelo:  
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c (equação 1)  
ou 
C a ¼ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c (equação 2)  
em que  
C a = concentração do produto químico nos vermes [g por kg de massa húmida 
ou seca]  
k s = constante de velocidade de absorção nos tecidos [g de solo por kg de 
verme por dia]  
C s = concentração do produto químico no solo [g por kg de massa húmida ou 
seca]  
k e = constante de velocidade de eliminação [dia  -1 ] 
t c = tempo decorrido até ao final da fase de absorção,  
esses programas informáticos calculam os valores de BAF  K , k s e k e . 
Se a concentração de fundo nos vermes não expostos — por exemplo, no dia 0 
— diferir significativamente de zero (pode, por exemplo, ser o caso relativamente 
aos metais), essa concentração de fundo (C  a,0 ) deve ser incluída nas equações, 
transformando-as em:  
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c (equação 3)  
e 
C a ¼ C a;0 þ k s 
k e Ü C s ðe –k e ðtÄtcÞ Ä e –k e t Þ t > t  c (equação 4)  
Nos casos em que, durante a fase de absorção, se observa ao longo do tempo um 
decréscimo significativo da concentração do produto químico no solo, podem utilizar-se os seguintes modelos — p. ex., 67 e 79:
 
C s ¼ C 0 ðe –k 0 t Þ (equação 5)  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1456
 
em que  
C s = concentração do produto químico no solo [g por kg de massa húmida ou 
seca]  
k 0 = constante de velocidade de degradação no solo [dia  -1 ] 
C 0 = concentração inicial do produto químico no solo [g por kg de massa 
húmida ou seca]  
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü ðe –k 0 t Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c (equação 6)  
C a ¼ k s 
k e Ä k 0 Ü e –k 0 tc Ä e –k e tc ä e ÄkðtÄtcÞ t > t  c (equação 7)  
em que  
C a = concentração do produto químico nos vermes [g por kg de massa húmida 
ou seca]  
k s = constante de velocidade de absorção nos tecidos [g de solo por kg de 
verme por dia]  
k 0 = constante de velocidade de degradação no solo [dia  -1 ] 
k e = constante de velocidade de eliminação [dia  -1 ] 
t c = tempo decorrido até ao final da fase de absorção.  
Se durante a fase de absorção for atingido o estado estacionário (ou seja, se 
t = ∞), a equação 1  
C a ¼ k s 
k e Ü C s ð1 Ä e –k e t Þ 0 < t < t  c (equação 1)  
pode ser reduzida a:  
C a ¼ k s 
k e Ü C s 
ou 
C a=C s ¼ k s=k e ¼ BAF  K (equação 8)  
Então k  s /k e x C  s é uma aproximação à concentração do produto químico nos 
tecidos dos vermes em estado estacionário (C  a,ss ). 
O fator de acumulação biota-solo (BSAF) pode ser calculado pela seguinte 
fórmula:  
BSAF ¼ BAF  K ä f oc 
f lip (equação 9)  
em que f  oc é a fração de carbono orgânico do solo e f  lip é a fração de lípidos dos 
vermes, ambas preferencialmente determinadas em amostras colhidas no âmbito 
do ensaio e baseadas, ambas, na massa seca ou na massa húmida.  
As constantes cinéticas de eliminação podem ser modelizadas utilizando os dados 
da fase de eliminação e aplicando a equação de modelo  infra  e um método 
informático de estimativa de parâmetros não lineares. Se o gráfico dos dados 
em função do tempo indicar um decréscimo exponencial constante da concen ­
tração do produto químico nos animais, pode utilizar-se um modelo monocom ­
partimental (equação 9) para descrever a eliminação ao longo do tempo. 
C a ðtÞ ¼ C a;ss Ü e –k e t (equação 10)  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1457
 
Os processos de eliminação revelam-se por vezes bifásicos, com rápido decrés ­
cimo de C  a durante as primeiras fases da eliminação e perda mais lenta do 
produto químico em estudo nas fases posteriores — p. ex., 27 e 68. As duas fases podem ser interpretadas admitindo que há dois compartimentos distintos no organismo, que eliminam a velocidades diferentes o produto químico em estudo. 
Nestes casos, deve consultar-se literatura específica — p. ex., 38, 39, 40 e 78.
 
Por meio das equações de modelo  supra,  os parâmetros cinéticos (k  s e k e ) podem 
também ser calculados de uma só vez aplicando o modelo de cinética de primeira ordem simultaneamente a todos os dados da fase de absorção e da fase de 
eliminação. Para a descrição de um método que permita esse cálculo combinado 
das constantes de velocidade de absorção e de eliminação, consultar, por exem ­
plo, as referências 41, 73 e 70.
 
C a ¼ " 
K s 
K e · C s ð1 Ä e –k e t Þ Ü ðm ¼ 1Þ # 
þ " 
K s 
k e Ü C s ðe ÄK e ðtÄt c Þ Ä e –K e t Þ Ü ðm ¼ 2Þ # 
(equação 11)  
Nota:  Se os parâmetros de absorção e de eliminação forem estimados simulta ­
neamente a partir dos dados combinados de absorção e de eliminação, o 
"m" que aparece na equação 11 é um descritor que permite ao programa informático associar os subtermos da equação aos conjuntos de dados da 
fase respetiva e efetuar corretamente os cálculos (m = 1 para a fase de 
absorção, m = 2 para a fase de eliminação).
 
Estas equações de modelo devem, porém, ser utilizadas com precaução, em 
especial se, durante o ensaio, ocorrerem alterações da biodisponibilidade ou da 
(bio)degradação do produto químico em estudo — p. ex., (79).  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1458
 
Apêndice 3  
EXEMPLOS DE PROGRAMAÇÃO DE ENSAIOS DE BIOACUMULAÇÃO 
NO SOLO  
Ensaio em minhocas  
a) Fase de absorção, com oito datas de colheita de amostras para cálculo dos 
parâmetros cinéticos  
Dia Atividade  
– 6 O solo preparado é condicionado durante 48 h; 
– 4 A fração de solo é enriquecida com a solução do produto quí ­
mico em estudo; deixa-se evaporar os solventes; misturam-se os 
componentes do solo; distribui-se o solo pelos recipientes de ensaio; estabelece-se o equilíbrio com as condições do ensaio 
durante quatro dias (três semanas no caso de solo enriquecido 
com metais); 
– 3 a – 1 Os organismos que vão ser sujeitos ao ensaio são separados da 
cultura, para aclimatação; os componentes do solo são preparados e humedecidos; 
0 Mede-se a temperatura e o pH do solo; são retiradas amostras de 
solo dos recipientes enriquecidos e dos controlos do solvente, para determinar a concentração do produto químico em estudo; 
adiciona-se ração alimentar; as minhocas são pesadas e distribuí ­
das aleatoriamente pelos recipientes de ensaio; separa-se suba ­
mostras suficientes de minhocas para determinar os valores ana ­
líticos de fundo, a massa húmida, a massa seca e o teor de 
lípidos; pesa-se todos os recipientes de ensaio, para verificar o 
teor de humidade do solo; verifica-se a alimentação de ar, se for utilizado um sistema de ensaio fechado; 
1 Verifica-se a alimentação de ar e regista-se o comportamento das 
minhocas e a temperatura; colhe-se amostras do solo e das mi ­
nhocas para determinar a concentração do produto químico em 
estudo; 
2 O mesmo que no dia 1; 3 Verifica-se a alimentação de ar, o comportamento das minhocas e 
a temperatura; 
4 O mesmo que no dia 1; 
5 - 6 O mesmo que no dia 3; 
7 O mesmo que no dia 1; adiciona-se ração alimentar; verifica-se o 
teor de humidade do solo, pesando novamente os recipientes de 
ensaio; repõe-se a água evaporada; 
8 - 9 O mesmo que no dia 3; 
10 O mesmo que no dia 1; 
11 - 13 O mesmo que no dia 3; 
14 O mesmo que no dia 1; adiciona-se ração alimentar; verifica-se o 
teor de humidade do solo, pesando novamente os recipientes de 
ensaio; repõe-se a água evaporada; 
15 - 16 O mesmo que no dia 3; 
17 O mesmo que no dia 1; 
18 - 20 O mesmo que no dia 3;
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1459
 
Dia Atividade  
21 O mesmo que no dia 1; mede-se a temperatura e o pH do solo; 
verifica-se o teor de humidade do solo, pesando novamente os recipientes de ensaio; termina a fase de absorção; transfere-se as minhocas dos replicados expostos restantes para recipientes con ­
tendo solo limpo, com vista à fase de eliminação (sem purga do 
trato digestivo); colhe-se amostras de solo e de minhocas dos controlos do solvente. 
As atividades de pré-exposição (fase de estabelecimento do equi ­
líbrio) devem ser programadas tendo em conta as propriedades do produto químico em estudo. 
As atividades descritas para o dia 3 devem ser executadas dia ­
riamente (pelo menos em dias úteis).
 
b) Fase de eliminação  
Dia Atividade  
– 6 Os componentes do solo são preparados e humedecidos; o solo 
preparado é condicionado durante 48 h; 
– 4 Mistura-se os componentes do solo; distribui-se o solo pelos 
recipientes de ensaio; incuba-se nas condições de ensaio durante 
4 dias; 
0 (final da fase de 
absorção) Mede-se a temperatura e o pH do solo; as minhocas são pesadas 
e distribuídas aleatoriamente pelos recipientes de ensaio; adiciona-se ração alimentar; transferem-se as minhocas dos repli ­
cados expostos restantes para recipientes contendo solo limpo; 
colhem-se amostras do solo e das minhocas quatro a seis horas 
mais tarde, para determinar a concentração do produto químico em estudo; 
1 Verifica-se a alimentação de ar e regista-se o comportamento das 
minhocas e a temperatura; colhe-se amostras do solo e das mi ­
nhocas para determinar a concentração do produto químico em 
estudo; 
2 O mesmo que no dia 1; 
3 Verificam-se a alimentação de ar, o comportamento das minhocas 
e a temperatura; 
4 O mesmo que no dia 1; 
5 - 6 O mesmo que no dia 3; 
7 O mesmo que no dia 1; adiciona-se ração alimentar; verifica-se o 
teor de humidade do solo, pesando novamente os recipientes de 
ensaio; repõe-se a água evaporada; 
8 - 9 O mesmo que no dia 3; 
10 O mesmo que no dia 1; 
11 - 13 O mesmo que no dia 3; 
14 O mesmo que no dia 1; adiciona-se ração alimentar; verifica-se o 
teor de humidade do solo, pesando novamente os recipientes de ensaio e compensando a água evaporada; 
15 - 16 O mesmo que no dia 3; 
17 O mesmo que no dia 1;
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1460
 
Dia Atividade  
18 - 20 O mesmo que no dia 3; 
21 O mesmo que no dia 1; mede-se a temperatura e o pH do solo; 
verifica-se o teor de humidade do solo, pesando novamente os 
recipientes de ensaio; colhe-se amostras de solo e de minhocas dos controlos do solvente. 
Antes de se iniciar a fase de eliminação, o solo deve ser prepa ­
rado do mesmo modo que antes de se iniciar a fase de absorção. 
As atividades descritas para o dia 3 devem ser executadas dia ­
riamente (pelo menos em dias úteis).
 
Ensaio em vermes da família  Enchytraeidae  
a) Fase de absorção, com oito datas de colheita de amostras, para cálculo dos 
parâmetros cinéticos  
Dia Atividade  
– 6 O solo preparado é condicionado durante 48 h; 
– 4 A fração de solo é enriquecida com a solução do produto quí ­
mico em estudo; deixa-se evaporar os solventes; mistura-se os 
componentes do solo; distribui-se o solo pelos recipientes de ensaio; estabelece-se o equilíbrio com as condições do ensaio durante quatro dias (três semanas no caso de solo enriquecido 
com metais); 
– 3 a – 1 Os organismos que vão ser sujeitos ao ensaio são separados da 
cultura, para aclimatação; prepara-se e humedece-se os compo ­
nentes do solo; 
0 Mede-se a temperatura e o pH do solo; colhe-se amostras de solo 
dos recipientes enriquecidos e dos controlos do solvente, para determinar a concentração do produto químico em estudo; 
adiciona-se ração alimentar ao solo; os vermes são pesados e 
distribuídos aleatoriamente pelos recipientes de ensaio; separa-se subamostras suficientes de vermes para determinar os valores analíticos de fundo, a massa húmida, a massa seca e o 
teor de lípidos; pesa-se todos os recipientes de ensaio, para ve ­
rificar o teor de humidade do solo; verifica-se a alimentação de ar, se for utilizado um sistema de ensaio fechado; 
1 Verifica-se a alimentação de ar e regista-se o comportamento dos 
vermes e a temperatura; colhe-se amostras do solo e dos vermes, 
para determinar a concentração do produto químico em estudo; 
2 O mesmo que no dia 1; 
3 Verifica-se a alimentação de ar, o comportamento dos vermes e a 
temperatura; 
4 O mesmo que no dia 1; 
5 - 6 O mesmo que no dia 3; 
7 O mesmo que no dia 1; adiciona-se ração alimentar ao solo; 
verifica-se o teor de humidade do solo, pesando novamente os recipientes; repõe-se a água evaporada; 
9 O mesmo que no dia 1; 
10 O mesmo que no dia 3;
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1461
 
Dia Atividade  
11 O mesmo que no dia 1; 
12 - 13 O mesmo que no dia 3; 
14 O mesmo que no dia 1; adiciona-se ração alimentar ao solo; 
mede-se a temperatura e o pH do solo; verifica-se o teor de 
humidade do solo, pesando novamente os recipientes de ensaio; 
termina a fase de absorção; transfere-se os vermes dos replicados expostos restantes para recipientes contendo solo limpo, com vista à fase de eliminação (sem purga do trato digestivo); 
colhe-se amostras de solo e de vermes dos controlos do solvente. 
As atividades de pré-exposição (fase de estabelecimento do equi ­
líbrio) devem ser programadas tendo em conta as propriedades do produto químico em estudo. 
As atividades descritas para o dia 3 devem ser executadas dia ­
riamente (pelo menos em dias úteis).
 ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1462
 
Apêndice 4  
Solo artificial — recomendações de preparação e armazenagem  
Dado que podem não estar disponíveis ao longo de todo o ano solos naturais de 
uma determinada origem e que a presença de organismos indígenas e de micro ­
poluentes pode influenciar o ensaio, recomenda-se para este um substrato artifi ­
cial, o solo artificial a que se refere o capítulo C.8 deste anexo —  Toxicidade em 
relação às minhocas  (48). Várias espécies cobaias podem sobreviver, 
desenvolver-se e reproduzir-se neste solo, garantindo-se uma estandardização 
máxima e a comparabilidade intralaboratorial e interlaboratorial das condições de ensaio e de cultura.
 
Componentes do solo 
Turfa: 10 % Turfa de  Sphagnum , em conformidade com 
o Test Guideline 207  da OCDE (48); 
Areia quartzítica: 70 % Areia quartzítica industrial (seca ao ar); gra ­
nulometria: mais de 50 % das partículas de ­
vem situar-se no intervalo 50-200 μm, mas 
todas devem ser ≤ 2 mm; 
Argila caulinítica: 20 % Teor de caulinite ≥ 30 %; 
Carbonato de cál ­
cio: ≤ 1 % CaCO  3 , pulverizado, quimicamente puro.  
Opcionalmente, pode reduzir-se o teor de carbono orgânico do solo artificial — 
por exemplo, baixando o teor de turfa para 4-5 % do solo seco e subindo correspondentemente o teor de areia. Com esta redução do teor de carbono orgânico, podem diminuir-se as possibilidades de adsorção do produto químico 
em estudo ao solo (carbono orgânico) e pode favorecer-se a disponibilização do 
produto aos vermes (74). Foi demonstrado que as espécies  Enchytraeus albidus  e 
Eisenia fetida  podem cumprir os critérios de validade relativos à reprodução 
quando sujeitas a ensaio em solos naturais com teor de carbono orgânico inferior 
— p. ex., 2,7 % (33)(61). A experiência adquirida revela que o mesmo se pode 
também conseguir em solo artificial com 5 % de turfa.
 
Preparação  
Os componentes secos do solo são misturados cuidadosamente (por exemplo, 
num misturador laboratorial grande). Esta operação deve ser executada cerca de uma semana antes do início do ensaio. Depois de misturados, os componentes 
secos devem ser humedecidos com água desionizada pelo menos 48 horas antes 
da aplicação do produto químico em estudo, a fim de equilibrar ou estabilizar a acidez. Para determinar o pH, utiliza-se uma mistura 1:5 de solo com uma solução 1 M de KCl. Se o valor do pH não estiver dentro do intervalo requerido 
(6,0 ± 0,5), adiciona-se ao solo uma quantidade suficiente de CaCO
 3 ou 
prepara-se um novo lote de solo.  
A capacidade máxima de retenção de água do solo artificial é determinada de 
acordo com a norma ISO 11268-2 (35). Pelo menos dois dias antes do início do ensaio, o solo artificial seco é humedecido, adicionando água desionizada ou reconstituída até se obter aproximadamente metade do teor final de água. O 
teor final de água deve situar-se entre 40 % e 60 % da capacidade máxima de 
retenção de água. No início do ensaio, o solo previamente humedecido é dividido em tantos lotes quantas as concentrações e os controlos utilizados no ensaio, e o teor de humidade é ajustado para 40 % a 60 % da capacidade máxima de 
retenção de água com a solução do produto químico em estudo e/ou adicionando 
água desionizada ou reconstituída. O teor de humidade é determinado no início e no final do ensaio (a 105 °C). Deve ser o teor ótimo para a espécie sujeita ao ensaio (o teor de humidade pode também ser verificado do seguinte modo: 
espremendo o solo delicadamente na mão, devem aparecer pequenas gotas de 
água entre os dedos).
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Armazenagem  
Os componentes secos do solo artificial podem ser armazenados à temperatura 
ambiente do laboratório até à sua utilização. O solo preparado e previamente 
humedecido pode ser armazenado em local fresco até três dias antes do seu enriquecimento; deve minimizar-se a evaporação de água. O solo enriquecido com o produto químico em estudo deve ser utilizado de imediato, a menos que 
haja indicações de que o solo em questão pode ser armazenado sem afetar a 
toxicidade e a biodisponibilidade do produto químico em causa. Podem então ser armazenadas amostras do solo enriquecido, respeitando as condições recomenda ­
das para o produto químico em estudo, até à realização das análises.
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Apêndice 5  
Espécies de oligoquetas terrestres recomendadas para ensaios de 
bioacumulação no solo  
Minhocas  
A espécie recomendada para os ensaios é a  Eisenia fetida  (Savigny 1826), per ­
tencente à família  Lumbricidae  e dividida desde 1972 em duas subespécies —  
Eisenia fetida  e Eisenia andrei  (10). Segundo Jaenike (36), trata-se de duas 
espécies separadas. A  Eisenia fetida  é facilmente identificável pelas listras ama ­
relas brilhantes intersegmentais, ao passo que a  Eisenia andrei  tem cor vermelha 
escura uniforme. Originárias provavelmente da região do Mar Negro, estão hoje distribuídas por todo o mundo, sobretudo em  habitats  antropogenicamente mo ­
dificados, como as montureiras de compostagem. Ambas podem ser utilizadas 
para ensaios ecotoxicológicos e de bioacumulação.
 
A Eisenia fetida  e a E. andrei  são comercializadas, por exemplo, como isco para 
pesca. Em comparação com outros vermes da família  Lumbricidae , têm um ciclo 
de vida curto, atingindo a maturidade por volta dos 2 ou 3 meses (à temperatura ambiente do laboratório). A temperatura ótima para elas é de 20 a 24 °C. Pre ­
ferem substratos relativamente húmidos, com pH próximo da neutralidade e teor 
elevado de matéria orgânica. Como estas espécies têm sido amplamente utiliza ­
das em ensaios ecotoxicológicos estandardizados desde há uns 25 anos, a sua criação em cultura está bem estabelecida (48)(77).
 
Ambas as espécies podem ser cultivadas numa ampla gama de resíduos de 
origem animal. O meio de cultura recomendado pela ISO é uma mistura 50:50 
de esterco de cavalo ou de bovino com turfa (35). O meio deve ter um pH de 6 a 7 (regulado com carbonato de cálcio) e baixa condutividade iónica (menos de 6 mS/cm ou menos de 0,5 % de concentração salina) e não deve estar excessiva ­
mente contaminado com amoníaco ou urina. Pode também ser utilizado um solo 
comercial para jardinagem, sem aditivos, solo artificial correspondente à norma da OCDE (48) ou uma mistura 50:50 de ambos. O substrato deve estar húmido, mas não encharcado. São adequadas caixas de cultura de 10 a 50 litros.
 
Para obter minhocas de idade e massa normalizadas, é melhor iniciar a cultura 
com casulos de ovos. Por conseguinte, junta-se minhocas adultas a uma caixa de 
cultura com substrato fresco, para produzir casulos. A experiência demonstra que 
uma densidade populacional próxima dos 100 vermes adultos por kg de substrato (massa húmida) conduz a boas taxas de reprodução. Ao cabo de 28 dias, retira-se as minhocas adultas. Os vermes provenientes da eclosão dos ovos são utilizados 
nos ensaios quando atingem a maturidade, ou seja, a partir dos dois meses de 
idade, mas não ultrapassando os 12 meses.
 
Os vermes destas duas espécies podem ser considerados saudáveis se se movi ­
mentarem através do substrato, não tentarem abandoná-lo e se reproduzirem continuamente. Movimentos muito lentos ou um posterior de cor amarelada 
(no caso da  Eisenia fetida ) indicam exaustão do substrato. Nesse caso, 
recomenda-se substrato fresco e/ou um número mais reduzido de animais por caixa.
 
Referências selecionadas adicionais  
Gerard B.M. (1964). Synopsis of the British fauna. No. 6  Lumbricidae . Linnean 
Soc. London, 6: 1-58.  
Graff O. (1953). Die Regenwürmer Deutschlands. Schr. Forsch. Anst. Land ­
wirtsch. 7: 1-81.  
Römbke J., Egeler P., Füll C. (1997). Literaturstudie über Bioakkumulationstests 
mit Oligochaeten im terrestrischen Medium. Bericht für das UBA F + E 206 03 
909, 86 S.  
Rundgren S. (1977). Seasonality of emergence in lumbricids in southern Sweden.  
Oikos  28: 49-55.  
Satchell J.E. (1955). Some aspects of earthworm ecology.  Soil Zoology  (Kevan): 
180-201.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1465
 
Sims R.W. e Gerard B.M. (1985). A synopsis of the earthworms.  Linnean Soc. 
London  31: 1-171.  
Tomlin A.D. (1984). The earthworm bait market in North America.  In: Earth­
worm Ecology - from Darwin to vermiculture. Satchell J.E. (ed.), Chapman & Hall, Londres. 331-338 pp.
 
Vermes da família  Enchytraeidae  
A espécie recomendada para os ensaios é a  Enchytraeus albidus  (Henle 1837), 
uma das maiores da família  Enchytraeidae  de anelídeos oligoquetas (pode atingir 
15 mm) e com distribuição mundial — p. ex., 8. A  Enchytraeus albidus  
encontra-se em  habitats  marinhos, limosos ou terrestres, sobretudo em matéria 
orgânica em decomposição (algas, produtos de compostagem) e raramente em prados (42). Esta ampla tolerância ecológica e algumas variações morfológicas 
indicam que poderá haver diversas raças ou subespécies.
 
A Enchytraeus albidus  é comercializada como alimento para peixes. Deve 
verificar-se se a cultura está contaminada por outras espécies, normalmente me ­
nores (60). Se houver contaminação, lavam-se todos os vermes numa placa de 
Petri e selecionam-se em seguida, por meio de um estereomicroscópio, grandes 
espécimes adultos de  Enchytraeus albidus , para iniciar uma nova cultura. 
Rejeitam-se todos os restantes indivíduos. O ciclo de vida da espécie é curto, pois a maturidade é atingida entre os 33 dias (a 18 °C) e os 74 dias (a 12 °C). 
Somente culturas mantidas no laboratório sem problemas durante pelo menos 
cinco semanas (uma geração) devem ser utilizadas nos ensaios.
 
Há outras espécies do género  Enchytraeus  igualmente adequadas, com destaque 
para a  Enchytraeus luxuriosus,  que tem o seu  habitat  verdadeiramente no solo e 
que foi descrita pela primeira vez na referência (65). Se forem utilizadas outras espécies de  Enchytraeus , importa identificá-las claramente e justificar a seleção.
 
A Enchytraeus crypticus  (Westheide & Graefe 1992) é uma espécie pertencente 
ao mesmo grupo da  Enchytraeus luxuriosus . Não está provado que ocorra no 
campo, tendo sido descrita apenas em culturas de minhocas e montureiras de compostagem (Römbke 2003). Por conseguinte, desconhece-se as suas exigências 
ecológicas originais. Contudo, estudos laboratoriais recentes em vários solos 
naturais confirmaram que esta espécie tem uma tolerância ampla em relação a propriedades do solo como o pH e a textura (Jänsch  et al.  2005). Em anos 
recentes, foi frequentemente utilizada em estudos ecotoxicológicos, dada a sim ­
plicidade da sua criação e da sua sujeição a ensaio (p. ex., Kuperman  et al.  
2003). É, porém, pequena (3-12 mm, com 7 mm em média — Westheide e Müller 1996), o que dificulta a sua manipulação, a comparar com a  Enchytraeus 
albidus . Se esta espécie for utilizada em vez da  Enchytraeus albidus , o recipiente 
de ensaio pode ser menor. Por outro lado, deve ter-se em conta que esta espécie 
se reproduz muito rapidamente, tendo um período de geração inferior a 20 dias a 20 ± 2 °C (Achazi  et al.  1999) ou mesmo mais curto se a temperatura for mais 
elevada.
 
Os vermes da espécie  Enchytraeus albidus  (bem como de outras espécies con ­
géneres) podem ser criados em grandes caixas de plástico (por exemplo, de 30 × 60 × 10 cm ou de 20 × 12 × 8 cm, as dimensões adequadas para a cultura de 
vermes de pequeno tamanho), cheias com uma mistura de solo artificial e de solo 
para jardinagem, não contaminado e sem aditivos. O material de compostagem deve ser evitado, pois pode conter produtos químicos tóxicos, como metais pesados. Antes da utilização, deve remover-se qualquer fauna do solo de cultura, 
mediante três ciclos de ultracongelamento. Pode também utilizar-se solo artificial 
puro, mas a taxa de reprodução poderá ser mais lenta, em comparação com a obtida com substratos mistos. O substrato deve ter um pH de 6,0 ± 0,5. A cultura é mantida numa incubadora à temperatura de 15 ± 2 °C, sem luz. Devem 
evitar-se sempre temperaturas superiores a 23 °C. O solo, artificial ou natural, 
deve estar húmido, mas não encharcado. Pressionando o solo suavemente com a mão, devem aparecer apenas gotículas de água. Devem evitar-se sempre condi ­
ções anóxicas (por exemplo, se se utilizar uma tampa, esta deve ter orifícios em 
número suficiente para uma boa renovação do ar). Deve arejar-se o solo da 
cultura, mexendo-o cuidadosamente uma vez por semana.
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Os vermes devem ser alimentados pelo menos uma vez por semana,  ad libitum , 
com flocos de aveia, que se colocam numa cavidade da superfície e se cobrem 
em seguida com solo. Se no recipiente restar alimento da última ministração, a quantidade distribuída deve ser ajustada em conformidade. Se se tiverem desen ­
volvido fungos, o alimento restante deve ser substituído por uma nova porção de 
flocos. A fim de estimular a reprodução, a aveia pode ser complementada, de 
duas em duas semanas, com proteínas em pó enriquecidas com vitaminas (à venda no comércio). Ao cabo de três meses, os animais são transferidos para uma cultura ou um substrato de reprodução, recentemente preparados. Os flocos 
de aveia, que têm de ser guardados em recipientes herméticos, devem ser tratados 
em autoclave ou aquecidos antes da sua ministração, para evitar infeções por ácaros — p. ex.,  Glyzyphagus  sp., Astigmata, Acarina, ou  Hypoaspis (Cosmo ­
laelaps) miles , Gamasida, Acarina. Após a desinfeção, os flocos são moídos, para 
poderem ser facilmente espalhados na superfície do solo. Uma outra fonte pos ­
sível de alimento é o fermento de padaria ou a comida para peixes TetraMin
 ® . 
Em geral, as condições de cultura são satisfatórias se os vermes não tentarem 
abandonar o substrato, se movimentarem rapidamente através do solo, exibirem 
uma superfície externa brilhante, sem partículas de solo pegadas, e tiverem uma 
coloração mais ou menos esbranquiçada e se forem visíveis vermes de diferentes idades. Na verdade, os vermes podem ser considerados saudáveis se se reprodu ­
zirem continuamente.
 
Referências selecionadas adicionais  
Achazi R.K., Fröhlich E., Henneken M., Pilz C. (1999). The effect of soil from 
former irrigation fields and of sewage sludge on dispersal activity and colonizing success of the annelid  Enchytraeus crypticus  (Enchytraeidae , Oligochaeta ). 
Newsletter on  Enchytraeidae  6: 117-126.
 
Jänsch S., Amorim M.J.B., Römbke J. (2005). Identification of the ecological 
requirements of important terrestrial ecotoxicological test species.  Environ. Re ­
views  13: 51-83.  
Kuperman R.G., Checkai R.T., Simini M., Phillips C.T., Kolakowski J.E., Kur ­
nas C.W., Sunahara G.I. (2003). Survival and reproduction of  Enchytraeus cryp ­
ticus  (Oligochaeta , Enchytraeidae ) in a natural sandy loam soil amended with the 
nitro-heterocyclic explosives RDX and HMX.  Pedobiologia  47: 651-656.  
Römbke J. (2003). Ecotoxicological laboratory tests with enchytraeids: A review.  
Pedobiologia  47: 607-616.  
Westheide W. e Graefe U. (1992). Two new terrestrial Enchytraeus species 
(Oligochaeta , Annelida ). J. Nat. Hist.  26: 479-488.  
Westheide W. e Müller M.C. (1996). Cinematographic documentation of enchy ­
traeid morphology and reproductive biology.  Hydrobiologia  334: 263-267.  ▼M4 2008R0440 — PT — 24.08.2014 — 005.001 — 1467