2000R2870 — PT — 26.04.2016 — 002.001

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▼B

REGULAMENTO (CE) N.o 2870/2000 DA COMISSÃO

de 19 de Dezembro de 2000

que estabelece métodos de análise comunitários de referência aplicáveis no sector das bebidas espirituosas







A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS, Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia, Tendo em conta o Regulamento (CEE) n.o 1576/89 do Conselho, de 29 de Maio de 1989, que estabelece as regras gerais relativas à definição, à designação e à apresentação das bebidas espirituosas ( 1 ), com a última redacção que lhe foi dada pelo Acto de Adesão da Áustria, da Finlândia e da Suécia, e, nomeadamente, o n.o 8 do seu artigo 4.o, Considerando o seguinte: (1) O n.o 8 do artigo 4.o do Regulamento (CEE) n.o 1576/89 prevê a adopção de métodos de análise das bebidas espirituosas. Em caso de inspecção oficial ou litígio, devem ser utilizados métodos de referência que garantam a observância do Regulamento (CEE) n.o 1576/89 e do Regulamento (CEE) n.o 1014/90 da Comissão, de 24 de Abril de 1990, que estabelece as normas de aplicação para a definição, designação e apresentação das bebidas espirituosas ( 2 ), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CE) n.o 2140/98 ( 3 ). (2) Sempre que possível, é conveniente adoptar como métodos de análise comunitários de referência métodos que beneficiem do reconhecimento geral, procedendo para o efeito à respectiva descrição. (3) A fim de ter em conta os progressos científicos e as diferenças de equipamento dos laboratórios oficiais, é conveniente permitir, sob a responsabilidade do director do laboratório em questão, a aplicação de métodos baseados em princípios de medição diferentes dos utilizados nos métodos de referência descritos no anexo do presente regulamento, desde que tais métodos ofereçam garantias suficientes quanto a resultados e, em especial, satisfaçam os critérios estabelecidos no anexo da Directiva 85/591/CEE do Conselho, de 20 de Dezembro de 1985, relativa à introdução de modos de colheita de amostras e de métodos de análise comunitários para o controlo dos géneros destinados à alimentação humana ( 4 ), e que possa ser demonstrado que a exactidão, a repetibilidade e a reprodutibilidade dos resultados obtidos por esses métodos não excedem os limites que caracterizam os resultados obtidos pelos métodos de referência descritos no presente regulamento. Desde que tal condição seja respeitada, pode ser autorizada a aplicação de outros métodos de análise. Todavia, é conveniente especificar que, em caso de litígio, os métodos alternativos em questão não substituem os métodos de referência. (4) As medidas previstas no presente regulamento estão em conformidade com o parecer do Comité de Execução para as Bebidas Espirituosas, Considerando o seguinte: ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO:







Artigo 1.o

Os métodos de análise comunitários de referência aplicáveis no sector das bebidas espirituosas:

— em caso de controlo oficial, ou

— em caso de litígio,

a fim de garantir a observância do Regulamento (CEE) n.o 1576/89 e do Regulamento (CEE) n.o 1014/90 figuram no anexo do presente regulamento.

Artigo 2.o

Em derrogação do primeiro travessão do artigo 1.o, são admitidos outros métodos de análise, sob a responsabilidade do director do laboratório, desde que a exactidão e a precisão (repetibilidade e reprodutibilidade) dos mesmos sejam pelo menos equivalentes às dos métodos de análise de referência correspondentes, constantes do anexo.

Artigo 3.o

Quando não estiverem previstos métodos de análise comunitários de referência para a detecção e quantificação de substâncias presentes numa determinada bebida espirituosa, serão aplicáveis os métodos a seguir indicados:

a) Métodos de análise validados por processos reconhecidos internacionalmente que satisfaçam, em especial, os critérios estabelecidos no anexo da Directiva 85/591/CEE;

b) Métodos de análise conformes com as normas recomendadas pela Organização Internacional de Normalização (ISO);

c) Métodos de análise reconhecidos pela Assembleia Geral da Organização Internacional da Vinha e do Vinho (OIV) e publicados por iniciativa desta;

d) Na falta dos métodos referidos nas alíneas a), b) ou c), e com base em critérios de exactidão, repetibilidade e reprodutibilidade: — um método de análise aprovado pelo Estado-Membro em causa, — se necessário, qualquer outro método de análise apropriado.

Artigo 4.o

Para efeitos do disposto no presente regulamento, entende-se por:

a) «Limite de repetibilidade», o valor abaixo ou ao nível do qual se situa, com uma probabilidade de 95 % {ISO 3534-1}, a diferença absoluta entre dois resultados experimentais obtidos em condições de repetibilidade (mesmo operador, mesma aparelhagem, mesmo laboratório, num curto intervalo de tempo);

b) «Limite de reprodutibilidade», o valor abaixo ou ao nível do qual se situa, com uma probabilidade de 95 % {ISO 3534-1}, a diferença absoluta entre dois resultados experimentais obtidos em condições de reprodutibilidade (operadores diferentes, aparelhagem diferente e laboratórios diferentes);

c) «Exactidão», o grau de acordo entre o resultado experimental e o valor de referência reconhecido {ISO 3534-1}.

Artigo 5.o

O presente regulamento entra em vigor no sétimo dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial das Comunidades Europeias.

É aplicável a partir de 1 de Janeiro de 2001.

O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e directamente aplicável em todos os Estados-Membros.









ANEXO

DESCRIÇÃO DOS MÉTODOS DE ANÁLISE DE REFERÊNCIA A SEGUIR INDICADOS I. II. III. III.1. III.2. III.3. IV. V. VI. VII. VIII. IX. X.

I. MÉTODO DE REFERÊNCIA PARA A DETERMINAÇÃO DO TÍTULO ALCOOMÉTRICO VOLÚMICO DE BEBIDAS ESPIRITUOSAS

Introdução

O método de referência inclui dois apêndices:

Apêndice I : Preparação do destilado

Apêndice II : Determinação da densidade do destilado

1. Âmbito

O método é adequado para a determinação do título alcoométrico volúmico real de bebidas espirituosas.

2. Referências normativas

ISO 3696:1987: Water for analytical use — Specifications and test methods (Água para fins analíticos — Especificações e métodos de ensaio)

3. Termos e definições

3.1. Temperatura de referência:

A temperatura de referência para a determinação do título alcoométrico volúmico, da densidade e da densidade relativa de bebidas espirituosas é 20 °C.

Nota 1:

O termo «a t °C» é reservado para todas as determinações (de densidade ou título alcoométrico volúmico) expressas a temperaturas diferentes da temperatura de referência de 20 °C.

3.2. Densidade

Entende-se por «massa volúmica» a massa por unidade de volume de uma bebida espirituosa no vácuo a 20 °C. É expressa em quilograma por metro cúbico (símbolo ρ20 °C ou ρ20).

3.3. Densidade relativa:

Entende-se por «densidade relativa» a relação, expressa como número decimal, entre a densidade da bebida espirituosa a 20 °C e a densidade da água à mesma temperatura. É utilizado o símbolo d20 °C/20 °C ou d20/20 ou, quando não houver riscos de confusão, simplesmente d. A característica medida será obrigatoriamente especificada no certificado de análise através dos símbolos indicados.

Nota 2:

A densidade relativa pode ser obtida a partir da densidade ρ20 a 20 °C: ou em que 998,203 é a densidade da água a 20 °C.

3.4. Título alcoométrico volúmico real:

Entende-se por «título alcoométrico volúmico real» de uma bebida espirituosa o número de litros de álcool etílico contido em 100 l de uma mistura hidroalcoólica de densidade idêntica à da bebida espirituosa após destilação. Os valores de referência de título alcoométrico volúmico (% vol) a 20 °C em função da densidade a 20 °C a utilizar para diversas misturas hidroalcoólicas figuram no quadro internacional adoptado pela Organização Internacional de Metrologia Legal na sua Recomendação n.o 22.

A equação geral que relaciona o título alcoométrico volúmico e a densidade de uma mistura hidroalcoólica a uma dada temperatura figura na página 40, no capítulo 3, «Título alcoométrico volúmico», do anexo do Regulamento (CEE) n.o 2676/90 da Comissão (JO L 272 de 3.10.1990, p. 1) ou no manual de métodos de análise da OIV (1994, p. 17).

Nota 3:

No caso dos cremes e licores, cujos volumes é difícil medir com exactidão, pesa-se a amostra e começa-se por calcular o título alcoométrico mássico.

Fórmula de conversão:

em que:

TAM = título alcoométrico mássico

ρ20 (álcool) = 789,24 kg/m3

4. Princípio

Destilação e determinação do título alcoométrico volúmico do destilado por picnometria, densimetria electrónica ou densimetria com uma balança hidrostática.

APÊNDICE I: PREPARAÇÃO DO DESTILADO

1. Âmbito

Este método é adequado para a preparação de destilados destinados à determinação do título alcoométrico volúmico real de bebidas espirituosas.

2. Princípio

Destilação da bebida espirituosa para separar o álcool etílico e outros compostos voláteis das substâncias que não destilam.

3. Material e reagentes

3.1. Grânulos regularizadores da ebulição.

3.2. Emulsão antiespumante concentrada (para os licores cremosos).

4. Aparelhagem e equipamento

Aparelhagem corrente de laboratório, em particular:

4.1. Banho de água termostatizável entre 10 °C e 15 °C. Banho de água termostatizável a 20 °C (± 0,2 °C).

4.2. Balões volumétricos aferidos de 100 ml ± 0,1 % e 200 ml ± 0,15 % (classe A).

4.3. Aparelho de destilação: 4.3.1. Generalidades O aparelho de destilação utilizado deve respeitar as seguintes especificações: — minimização do número de uniões, com garantia de estanquidade do sistema, — inclusão de um dispositivo destinado a evitar o arrastamento do líquido em ebulição pelo vapor e a regularizar a destilação dos vapores ricos em álcool, — condensação rápida e total dos vapores alcoólicos, — recolha das primeiras fracções de destilado num meio aquoso. A fonte de calor deve estar equipada com um difusor de calor apropriado, para evitar reacções de tipo pirogénico por parte das matérias não destiladas. 4.3.2. A figura 1 representa um exemplo adequado de aparelho de destilação, constituída pelas seguintes partes: — balão de fundo redondo de 1 litro, com junta de vidro esmerilado normalizada, — coluna de rectificação com pelo menos 20 cm de altura (modelo Vigreux, por exemplo), — elemento de união com condensador directo (tipo West) de aproximadamente 10 cm de comprimento, aplicado verticalmente, — condensador de serpentina com 40 cm de comprimento, — alonga de recolha do destilado com descarga no fundo de um balão graduado no qual foi introduzida uma pequena quantidade de água,

Nota:

O aparelho acima descrito está previsto para amostras de, pelo menos, 200 ml. Pode, porém, ser adaptado a uma amostra mais pequena, desde que se utilize um balão de destilação mais pequeno munido de uma cabeça antiprojecções ou de outro dispositivo que evite arrastamentos.

5. Conservação da amostra a analisar

As amostras são mantidas à temperatura ambiente antes da análise.

6. Técnica

Observação preliminar:

A destilação pode ser igualmente efectuada pelo método publicado pela IUPAC (1968).

6.1. Verificação do aparelho de destilação. O aparelho utilizado deve permitir que: A destilação de 200 ml de uma solução hidroalcoólica de concentração conhecida próxima de 50 % vol não origine perdas de álcool superiores a 0,1 % vol.

6.2. Bebidas espirituosas de título alcoométrico inferior a 50 % vol. Medir 200 ml da bebida espirituosa num balão volumétrico. Registar a temperatura do líquido ou manter o mesmo à temperatura normalizada (20 °C). Vazar a amostra para o balão de fundo redondo do aparelho de destilação e lavar o balão volumétrico com três volumes de aproximadamente 20 ml de água destilada. Juntar as águas de lavagem ao conteúdo do balão de destilação. Nota: Esta diluição de 60 ml é suficiente para as bebidas espirituosas com menos de 250 g de extracto seco por litro. Caso contrário, para evitar reacções de pirólise, o volume das águas de lavagem deve ser, no mínimo, de 70 ml, se a concentração de extracto seco for de 300 g/l, 85 ml, para 400 g de extracto seco por litro, ou 100 ml, para 500 g de extracto seco por litro (caso de alguns cremes ou licores de frutos). Estes volumes serão ajustados proporcionalmente se o volume da amostra for diferente. Introduzir alguns grânulos regularizadores da ebulição (3.1) (e antiespumante no caso dos licores cremosos). Introduzir 20 ml de água destilada no balão volumétrico de 200 ml inicial, que será utilizado para recolher o destilado. Colocar o balão num banho de água fria (4.1) (10 °C a 15 °C no caso das bebidas espirituosas anisadas). Proceder à destilação, evitando os fenómenos de arrastamento e de carbonização e agitando de vez em quando o conteúdo do balão, até que o nível de destilado se situe alguns milímetros abaixo do traço de aferição do balão volumétrico. Quando a temperatura do destilado recolhido tiver baixado para a temperatura inícial do líquido ± 0,5 °C, completar o volume com água destilada até ao traço de aferição e homogeneizar. Este destilado será utilizado na determinação do título alcoométrico volúmico (apêndice II).

6.3. Bebidas espirituosas de título alcoométrico superior a 50 % vol. Medir 100 ml da bebida espirituosa com um balão volumétrico de 100 ml e vazar o líquido para o balão de fundo redondo do aparelho de destilação. Lavar várias vezes o balão volumétrico com água destilada e juntar as águas de lavagem ao conteúdo do balão de destilação de fundo redondo. Utilizar água suficiente para que o conteúdo do balão atinja cerca de 230 ml. Introduzir 20 ml de água destilada num balão volumétrico de 200 ml, que será utilizado para recolher o destilado. Colocar o balão num banho de água fria (4.1) (10 °C a 15 °C no caso das bebidas espirituosas anisadas). Proceder à destilação, agitando de vez em quando o conteúdo do balão, até que o nível de destilado se situe alguns milímetros abaixo do traço de aferição do balão volumétrico de 200 ml. Quando a temperatura do destilado recolhido tiver baixado para a temperatura inicial do líquido ± 0,5 °C, completar o volume com água destilada até ao traço de aferição e homogeneizar. Este destilado será utilizado na determinação do título alcoométrico volúmico (apêndice II). Nota: O título alcoométrico volúmico da bebida espirituosa é o dobro do título alcoométrico volúmico do destilado.

APÊNDICE II: DETERMINAÇÃO DA DENSIDADE DO DESTILADO

MÉTODO A: DETERMINAÇÃO DO TÍTULO ALCOOMÉTRICO VOLÚMICO REAL DE BEBIDAS ESPIRITUOSAS POR PICNOMETRIA

A.1. Princípio

Determinação do título alcoométrico volúmico a partir da densidade do destilado, medida por picnometria.

A.2. Material e reagentes

Salvo indicação em contrário, utilizar na análise apenas reagentes pro analise reconhecidos e água de grau não inferior a 3 (escala da norma ISO 3696:1987).

A.2.1. Solução de cloreto de sódio (2 % m/v). Para preparar 1 litro de solução, pesar 20 g de cloreto de sódio e dissolver com água até completar 1 litro.

A.3. Aparelhagem e equipamento

Aparelhagem corrente de laboratório, em particular:

A.3.1. Balança analítica com leitura mínima de 0,1 mg.

A.3.2. Termómetro certificado ou verificado com um termómetro certificado, com junta de vidro esmerilado, calibrado em décimas de grau entre 10 °C e 30 °C.

A.3.3. Picnómetro de vidro Pyrex, com cerca de 100 ml de capacidade, dotado de um termómetro amovível com junta de vidro esmerilado (A.3.2). O picnómetro deve dispor de um tubo lateral com 25 mm de comprimento e 1 mm de diâmetro interno máximo com extremidade em junta cónica esmerilada. Em caso de necessidade, poderão ser utilizados outros picnómetros descritos na norma ISO 3507, por exemplo de 50 ml.

A.3.4. Frasco-tara com volume exterior idêntico ao do picnómetro (aproximação de 1 ml) e massa igual à do picnómetro cheio com um líquido de densidade 1,01 (solução de cloreto de sódio A.2.1).

A.3.5. Camisa termicamente isolada à qual o picnómetro seja perfeitamente adaptável.

Nota 1:

O método de determinação da densidade de bebidas espirituosas no vácuo requer a utilização de uma balança de dois pratos, de um picnómetro e de um frasco-tara com o mesmo volume exterior, para cancelar permanentemente o efeito da impulsão do ar. Esta técnica simples pode ser aplicada utilizando uma balança de prato único, desde que o frasco-tara seja pesado a seguir, para atender às variações de impulsão do ar ao longo do tempo.

A.4. Técnica

Observações preliminares:

Esta técnica descreve a utilização de um picnómetro de 100 ml na determinação do título alcoométrico, para melhor exactidão. Pode, porém, ser utilizado um picnómetro mais pequeno, por exemplo de 50 ml.

A.4.1. Calibração do picnómetro

A calibração do picnómetro implica a determinação dos seguintes parâmetros:

— tara do picnómetro vazio,

— volume do picnómetro a 20 °C,

— massa do picnómetro cheio de água a 20 °C.

A.4.1.1. Calibração com uma balança de prato único Determinar: — massa (P) do picnómetro limpo e seco, — massa (P1) do picnómetro cheio de água a t °C, — massa (T0) do frasco-tara. A.4.1.1.1. Pesar o picnómetro limpo e seco, determinando P. A.4.1.1.2. Encher cuidadosamente o picnómetro com água destilada à temperatura ambiente e adaptar o termómetro. Secar cuidadosamente o exterior do picnómetro e colocá-lo na camisa termicamente isolada. Agitar, por inversões, até obter uma leitura de temperatura constante. Regular o nível do picnómetro pela extremidade superior do seu tubo lateral. Ler cuidadosamente a temperatura e, se necessário, corrigir esta última de eventuais inexactidões da escala de temperaturas. Pesar o picnómetro cheio de água, determinando P1. A.4.1.1.3. Pesar o frasco-tara, determinando T0. A.4.1.1.4. Cálculos — Tara do picnómetro vazio = P – m — em que m é a massa do ar contido no picnómetro. — m = 0,0012 × (P1 – P) — 0,0012 é a densidade do ar seco a 20 °C à pressão de 760 mm Hg. — Volume do picnómetro a 20 °C: — — em que Ft é o factor correspondente à temperatura t °C constante do quadro I do capítulo 1, «Massa volúmica e densidade relativa», do anexo do Regulamento (CEE) n.o 2676/90 (p. 10). — V20 °C será obrigatoriamente conhecido com uma aproximação de 0,001 ml. — Massa da água contida no picnómetro a 20 °C: em que 0,998203 é a densidade da água a 20 °C. — Se necessário, pode utilizar-se o valor de 0,99715 para a densidade no ar e calcular o título alcoométrico com base na densidade correspondente no ar constante dos quadros utilizados pelos serviços aduaneiros e de impostos especiais sobre o consumo do Reino Unido; nesse caso, não será feita qualquer correcção pela massa de ar deslocada do picnómetro.

A.4.1.2. Calibração com uma balança de dois pratos A.4.1.2.1. Colocar o frasco-tara no prato do lado esquerdo e o picnómetro limpo e seco, com a tampa de expansão, no prato do lado direito. Equilibrar os pratos colocando pesos no lado do picnómetro: p gramas A.4.1.2.2. Encher cuidadosamente o picnómetro com água destilada à temperatura ambiente e adaptar o termómetro. Secar cuidadosamente o exterior do picnómetro e colocá-lo na camisa termicamente isolada. Agitar, por inversões, até obter uma leitura de temperatura constante. Regular o nível do picnómetro pela extremidade superior do seu tubo lateral. Limpar o tubo lateral e colocar a tampa de expansão. Ler cuidadosamente a temperatura t °C e, se necessário, corrigir esta última de eventuais inexactidões da escala de temperaturas. Pesar o picnómetro cheio de água, determinando a massa (p′), em grama, necessária para estabelecer o equilíbrio. A.4.1.2.3. — Tara do picnómetro vazio = p + m — em que m é a massa do ar contido no picnómetro. — m = 0,0012 × (p – p′). — Volume do picnómetro a 20 °C: — — em que Ft é o factor correspondente à temperatura t °C constante do quadro I do capítulo 1, «Massa volúmica e densidade relativa», do anexo do Regulamento (CEE) n.o 2676/90 (p. 10). — V20 °C será obrigatoriamente conhecido com uma aproximação de 0,001 ml. — Massa da água contida no picnómetro a 20 °C: — — em que 0,998203 é a densidade da água a 20 °C.

A.4.2. Determinação do título alcoométrico da amostra em análise

A.4.2.1. Utilização de uma balança de prato único. A.4.2.1.1. Pesar o frasco-tara, determinando T1. A.4.2.1.2. Pesar o picnómetro com o destilado preparado (ver o apêndice I), determinando a sua massa, P2, a t °C. A.4.2.1.3. — — Massa do picnómetro vazio no momento da medição: — = P – m + dT. — (Massa do líquido contido no picnómetro a t °C: — = P2 – (P – m + dT). — Densidade a t °C em g/ml: — — A densidade a t °C (ρt) é expressa em kg/m3 multiplicando ρt °C por 1 000 . — Corrigir ρt para ρ20 utilizando o quadro de densidades ρT para misturas hidroalcoólicas (quadro II do apêndice II do manual de métodos de análise da OIV, 1994, p. 17-29). — Localizar no quadro, na linha horizontal correspondente à temperatura inteira T imediatamente inferior a t °C, a densidade imediatamente superior a ρt. Utilizar a diferença constante do quadro situada abaixo dessa densidade para calcular a densidade ρt da bebida espirituosa a essa temperatura inteira T. — Utilizando a linha correspondente a essa temperatura inteira, calcular a diferença entre a densidade ρ′ constante do quadro imediatamente superior a ρt e a densidade calculada ρt. Dividir essa diferença pela diferença constante do quadro à direita da densidade ρ′. O quociente constitui a parte decimal do título alcoométrico; a parte inteira do título alcoométrico encontra-se no topo da coluna em que figura a densidade ρ′ (título alcoométrico Dt). Outra possibilidade é manter o picnómetro num banho de água a 20 °C ± 0,2 °C quando se estiver a completar o volume até ao traço de aferição. A.4.2.1.4. Calcular o título alcoométrico real com base na densidade ρ20 e no quadro de título alcoométrico a seguir especificado: Quadro internacional do título alcoométrico volúmico (% vol) de misturas hidroalcoólicas a 20 °C em função da densidade a 20 °C adoptado pela Organização Internacional de Metrologia Legal na sua Recomendação n.o 22.

A.4.2.2. Utilização de uma balança com um único prato A.4.2.2.1. Pesar o picnómetro com o destilado preparado (ver a parte I), determinando a sua massa, p″, a t °C. A.4.2.2.2. — Massa do líquido contido no picnómetro a t °C: — = p + m – p″. — Densidade a t °C em g/ml: — — A densidade a t °C é expressa em kg/m3 e corrigida em função da temperatura, calculando-se o título alcoométrico a 20 °C conforme descrito para o caso da utilização de uma balança com um único prato.

A.5. Características operacionais do método (precisão)

A.5.1. Resultados estatísticos do teste interlaboratorial

Os dados a seguir discriminados foram obtidos com base num estudo internacional das características operacionais do método efectuado segundo uma metodologia internacionalmente acordada [1] [2].







Ano de realização do teste interlaboratorial 1 997 Número de laboratórios participantes 20 Número de amostras 6







Amostras A B C D E F Número de laboratórios considerado após eliminação dos casos anómalos 19 20 17 19 19 17 Número de casos anómalos (laboratórios) 1 — 2 1 1 3 Número de resultados aceite 38 40 34 38 38 34 Valor médio ( ) % vol 23,77 40,04 40,29 39,20 42,24 57,03 26,51 (*) 42,93 (*) 45,73 (*) 63,03 (*) Desvio-padrão da repetibilidade (Sr) % vol 0,106 0,176 0,072 0,103 0,171 0,190 Desvio-padrão relativo da repetibilidade (RSDr) (%) 0,42 0,44 0,18 0,25 0,39 0,32 Limite de repetibilidade (r) % vol 0,30 0,49 0,20 0,29 0,48 0,53 Desvio-padrão da reprodutibilidade (SR) % vol 0,131 0,236 0,154 0,233 0,238 0,322 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (RSDR) (%) 0,52 0,59 0,38 0,57 0,54 0,53 Limite de reprodutibilidade (R) % vol 0,37 0,66 0,43 0,65 0,67 0,90

MÉTODO B: DETERMINAÇÃO DO TÍTULO ALCOOMÉTRICO VOLÚMICO REAL DE BEBIDAS ESPIRITUOSAS POR DENSIMETRIA ELECTRÓNICA (BASEADO NA FREQUÊNCIA DE OSCILAÇÃO DE RESSONÂNCIA DA AMOSTRA NUMA CÉLULA DE OSCILAÇÃO)

B.1. Princípio

Determinação da densidade do líquido por medição electrónica das oscilações de um tubo em U sujeito a vibração. Esta medição baseia-se na alteração, pela massa da amostra adicionada, da frequência específica de oscilação de um sistema em oscilação.

B.2. Material e reagentes

Salvo indicação em contrário, utilizar na análise apenas reagentes pro analise reconhecidos e água de grau não inferior a 3 (escala da norma ISO 3696:1987).

B.2.1. Acetona (CAS 666-52-4) ou álcool absoluto.

B.2.2. Ar seco.

B.3. Aparelhagem e equipamento

Aparelhagem corrente de laboratório, em particular:

B.3.1. O densímetro electrónico utilizado nas medições deve ser tal que a densidade possa ser expressa em g/ml com cinco casas decimais. Nota 1: O densímetro deve ser colocado numa posição perfeitamente estável, isolado de qualquer vibração.

B.3.2. As leituras do densímetro só serão validadas se a célula de medição estiver ligada a um regulador de temperatura incorporado que garanta, pelo menos, uma estabilidade de temperatura de ± 0,02 °C. Nota 2: Uma regulação e um controlo precisos da temperatura na célula de medição assumem grande importância, pois um erro de 0,1 °C pode originar uma variação de densidade da ordem de 0,1 kg/m3.

B.3.3. Seringas de injecção de amostras ou injector automático de amostras.

B.4. Técnica

B.4.1. Calibrar o aparelho de acordo com as instruções de funcionamento do fabricante quando da primeira colocação em serviço. Proceder à sua recalibração regular e ao confronto com um padrão de referência certificado ou com uma solução de referência interna do laboratório aferida por um padrão de referência certificado.

B.4.2. B.4.2.1. Se necessário, limpar a célula com acetona ou álcool absoluto e secar com ar seco antes da medição. Lavar a célula com a amostra. B.4.2.2. Injectar a amostra na célula com uma seringa ou um injector automático, enchendo-a completamente. Eliminar todas as bolhas de ar durante o enchimento. A amostra deve apresentar-se homogénea e não deve conter partículas sólidas. As matérias em suspensão eventualmente presentes devem ser removidas por filtração antes da análise. B.4.2.3. Logo que a leitura estabilizar, registar a densidade ρ20 ou o título alcoométrico indicado pelo densímetro.

B.4.3. Quando for utilizada a densidade ρ20, calcular o título alcoométrico real com base nos quadros de título alcoométrico a seguir especificados. Quadro internacional do título alcoométrico volúmico (% vol) de misturas hidroalcoólicas a 20 °C em função da densidade a 20 °C adoptado pela Organização Internacional de Metrologia Legal na sua Recomendação n.o 22.

B.5. Características operacionais do método (precisão)

B.5.1. Resultados estatísticos do teste interlaboratorial

Os dados a seguir discriminados foram obtidos com base num estudo internacional das características operacionais do método efectuado segundo uma metodologia internacionalmente acordada [1] [2].







Ano de realização do teste interlaboratorial 1 997 Número de laboratórios participantes 16 Número de amostras 6







Amostras A B C D E F Número de laboratórios considerado após eliminação dos casos anómalos 11 13 15 16 14 13 Número de casos anómalos (laboratórios) 2 3 1 — 1 2 Número de resultados aceite 22 26 30 32 28 26 Valor médio ( ) % vol 23,81 40,12 40,35 39,27 42,39 56,99 26,52 (*) 43,10 (*) 45,91 (*) 63,31 (*) Desvio-padrão da repetibilidade (Sr) % vol 0,044 0,046 0,027 0,079 0,172 0,144 Desvio-padrão relativo da repetibilidade (RSDr) (%) 0,17 0,12 0,07 0,19 0,39 0,24 Limite de repetibilidade (r) % vol 0,12 0,13 0,08 0,22 0,48 0,40 Desvio-padrão da reprodutibilidade (SR) % vol 0,054 0,069 0,083 0,141 0,197 0,205 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (RSDR) (%) 0,21 0,17 0,21 0,34 0,45 0,34 Limite de reprodutibilidade (R) % vol 0,15 0,19 0,23 0,40 0,55 0,58

MÉTODO C: DETERMINAÇÃO DO TÍTULO ALCOOMÉTRICO VOLÚMICO REAL DE BEBIDAS ESPIRITUOSAS POR DENSIMETRIA COM UMA BALANÇA HIDROSTÁTICA

C.1. Princípio

Determinação, por densimetria, com base no princípio de Arquimedes (segundo o qual um corpo imerso num líquido está sujeito a uma impulsão vertical do líquido, dirigida para cima, igual ao peso do líquido deslocado), do título alcoométrico de bebidas espirituosas com uma balança hidrostática.

C.2. Material e reagentes

Salvo indicação em contrário, utilizar na análise apenas reagentes pro analise reconhecidos e água de grau não inferior a 3 (escala da norma ISO 3696:1987).

C.2.1. Solução de lavagem do flutuador (hidróxido de sódio a 30 %, m/v)

Para preparar 100 ml, pesar 30 g de hidróxido de sódio e completar o volume com etanol a 96 % (v/v).

C.3. Aparelhagem e equipamento

Aparelhagem corrente de laboratório, em particular:

C.3.1. Balança hidrostática de prato único com sensibilidade de 1 mg.

C.3.2. Flutuador com volume mínimo de 20 ml, especialmente adaptado à balança, suspenso por um fio de diâmetro não superior a 0,1 mm.

C.3.3. Proveta cilíndrica de medição com uma marca de nível. A proveta deve ser tal que o flutuador caiba completamente no volume localizado abaixo da marca de nível. A superfície do líquido só pode ser atravessada pelo fio de suspensão. O diâmetro interno da proveta deve exceder em pelo menos 6 mm o diâmetro do flutuador.

C.3.4. Termómetro (ou sonda de medição da temperatura) graduado em graus e décimas de grau entre 10 °C e 40 °C, calibrado com uma exactidão de 0,05 °C.

C.3.5. Pesos calibrados por um organismo de certificação reconhecido.

Nota 1:

Também pode ser utilizada uma balança de dois pratos, cujo princípio de aplicação é descrito no capítulo 1, «Massa volúmica e densidade relativa», do anexo do Regulamento (CEE) n.o 2676/90 (p. 7).

C.4. Técnica

Entre cada medição, lavar o flutuador e a proveta com água destilada, secar com um papel macio de laboratório que não liberte fibras e enxaguar com a solução cuja densidade se pretende determinar. Proceder às medições logo que a aparelhagem estabilize, para limitar as perdas de álcool por evaporação.

C.4.1. Embora as balanças possuam, em geral, um sistema de calibração interno, a balança hidrostática utilizada deve poder ser calibrada com pesos certificados por um organismo oficial.

C.4.2. C.4.2.1. Encher a proveta até à marca com água bidestilada (ou água de pureza equivalente, por exemplo microfiltrada, com uma condutividade de 18,2 MΩ(/cm), a uma temperatura compreendida entre 15 °C e 25 °C, de preferência a 20 °C. C.4.2.2. Mergulhar o flutuador e o termómetro, agitar, efectuar a leitura da densidade do líquido no aparelho e, se necessário, corrigir a leitura, de modo que seja igual à da água à temperatura de medição.

C.4.3. C.4.3.1. Encher a proveta até à marca com uma mistura hidroalcoólica de título conhecido a uma temperatura compreendida entre 15 °C e 25 °C, de preferência a 20 °C. C.4.3.2. Mergulhar o flutuador e o termómetro, agitar e efectuar a leitura da densidade do líquido no aparelho (ou do título alcoométrico, se o aparelho o permitir). O título alcoométrico assim determinado deve ser idêntico ao anterior. Nota 2: Esta solução de título alcoométrico conhecido pode ser utilizada para calibrar o flutuador, em vez de água bidestilada.

C.4.4. C.4.4.1. Verter a amostra em análise para a proveta até ao traço de graduação. C.4.4.2. Mergulhar o flutuador e o termómetro, agitar e efectuar a leitura da densidade do líquido no aparelho (ou do título alcoométrico, se tal for possível). Se a densidade (ρt) for determinada a t °C, registar a temperatura. C.4.4.3. Corrigir ρt para ρ20 utilizando o quadro de densidades ρT para misturas hidroalcoólicas (quadro II do apêndice II do manual de métodos de análise da OIV, 1994, p. 17-29).

C.4.5. C.4.5.1. Mergulhar o flutuador na solução de limpeza do mesmo contida na proveta. C.4.5.2. Manter o flutuador mergulhado durante uma hora, rodando-o de vez em quando. C.4.5.3. Enxaguar com quantidades generosas de água da torneira, seguida de água destilada. C.4.5.4. Secar com um papel macio de laboratório que não liberte fibras. Proceder desta forma antes da primeira utilização do flutuador e depois, regularmente, sempre que necessário.

C.4.6. Calcular o título alcoométrico real com base na densidade ρ20 e no quadro de título alcoométrico a seguir especificado. Quadro internacional do título alcoométrico volúmico (% vol) de misturas hidroalcoólicas a 20 °C em função da densidade a 20 °C adoptado pela Organização Internacional de Metrologia Legal na sua Recomendação n.o 22.

C.5. Características operacionais do método (precisão)

C.5.1. Resultados estatísticos do teste interlaboratorial

Os dados a seguir discriminados foram obtidos com base num estudo internacional das características operacionais do método efectuado segundo uma metodologia internacionalmente acordada [1] [2].







Ano de realização do teste interlaboratorial 1 997 Número de laboratórios participantes 12 Número de amostras 6







Amostras A B C D E F Número de laboratórios considerado após eliminação dos casos anómalos 12 10 11 12 11 9 Número de casos anómalos (laboratórios) — 2 1 — 1 2 Número de resultados aceite 24 20 22 24 22 18 Valor médio ( ) % vol 23,80 40,09 40,29 39,26 42,38 57,16 26,51 (*) 43,09 (*) 45,89 (*) 63,44 (*) Desvio-padrão da repetibilidade (Sr) % vol 0,048 0,065 0,042 0,099 0,094 0,106 Desvio-padrão relativo da repetibilidade (RSDr) (%) 0,19 0,16 0,10 0,24 0,21 0,18 Limite de repetibilidade (r) % vol 0,13 0,18 0,12 0,28 0,26 0,30 Desvio-padrão da reprodutibilidade (SR) % vol 0,060 0,076 0,073 0,118 0,103 0,125 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (RSDR) (%) 0,24 0,19 0,18 0,29 0,23 0,21 Limite de reprodutibilidade (R) % vol 0,17 0,21 0,20 0,33 0,29 0,35

Figura 1. Aparelho de destilação para a determinação do título alcoométrico volúmico de bebidas espirituosas 1.Balão de fundo redondo de 1 litro com junta esférica de vidro esmerilado normalizada. 2.Coluna de rectificação de Vigreux com 20 cm. 3.Condensador directo (tipo West) de 10 cm. 4.Condensador de serpentina de 40 cm.

II. DETERMINAÇÃO DO EXTRACTO SECO TOTAL DE BEBIDAS ESPIRITUOSAS POR GRAVIMETRIA

1. Âmbito

O Regulamento (CEE) n.o 1576/89 só prevê a aplicação deste método à aquavit, cujo extracto seco não poderá exceder 15 g/l.

2. Referências normativas

ISO 3696:1987 Water for analytical use — Specifications and test methods (Água para fins analíticos — Especificações e métodos de ensaio).

3. Definição

O extracto seco total ou matéria seca total inclui todas as matérias não voláteis em condições físicas especificadas.

4. Princípio

Evaporação da bebida espirituosa num banho de água em ebulição, secagem em estufa e pesagem do extracto.

5. Aparelhagem e equipamento

5.1. Placa de evaporação cilíndrica de fundo plano com 55 mm de diâmetro.

5.2. Banho de água em ebulição.

5.3. Pipeta de 25 ml da classe A.

5.4. Estufa.

5.5. Exsicador.

5.6. Balança analítica com exactidão de 0,1 mg.

6. Colheita de amostras e amostras

Antes da análise conservar as amostras à temperatura ambiente.

7. Técnica

7.1. Pipetar 25 ml da bebida espirituosa, cujo extracto seco deve ser inferior a 15 g/l, para uma placa de evaporação cilíndrica de fundo plano com 55 mm de diâmetro, previamente tarada. Durante a primeira hora de evaporação, a placa deve permanecer sobre a tampa do banho de água, para evitar que o líquido entre em ebulição, o que poderia provocar perdas por projecção. Seguidamente, deixar a placa mais uma hora em contacto directo com o vapor produzido pelo banho de água.

7.2. Colocar a placa numa estufa regulada para 105 °C ± 3 °C e completar a secagem durante duas horas. Colocar a placa de evaporação num exsicador, deixar arrefecer e pesar a placa com o seu conteúdo.

8. Cálculos

A massa do extracto multiplicada por 40 corresponde ao extracto seco da bebida espirituosa, sendo este expresso em g/l, com uma casa decimal.

9. Características operacionais do método (precisão)

9.1. Resultados estatísticos do teste interlaboratorial

Os dados a seguir discriminados foram obtidos com base num estudo internacional das características operacionais do método efectuado segundo uma metodologia internacionalmente acordada [1] [2].







Ano de realização do teste interlaboratorial 1 997 Número de laboratórios participantes 10 Número de amostras 4







Amostras A B C D Número de laboratórios considerado após eliminação dos casos anómalos 9 9 8 9 Número de casos anómalos (laboratórios) 1 1 2 — Número de resultados aceite 18 18 16 18 Valor médio ( ) g/l 9,0 9,1 10,0 11,8 7,8 9,4 11,1 Desvio-padrão da repetibilidade (Sr) g/l 0,075 0,441 0,028 0,123 Desvio-padrão relativo da repetibilidade (RSDr) (%) 0,8 5,2 0,3 1,1 Limite de repetibilidade (r) g/l 0,2 1,2 0,1 0,3 Desvio-padrão da reprodutibilidade (SR) g/l 0,148 0,451 0,058 0,210 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (RSDR) (%) 1,6 5,3 0,6 1,8 Limite de reprodutibilidade (R) g/l 0,4 1,3 0,2 0,6

III. DETERMINAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS VOLÁTEIS E DE METANOL DE BEBIDAS ESPIRITUOSAS

III.1. OBSERVAÇÕES GERAIS

1. Definições

O Regulamento (CEE) n.o 1576/89 estabelece teores mínimos de compostos voláteis, além do etanol e do metanol, para uma série de bebidas espirituosas (rum, bebidas espirituosas de origem vitícola, bebidas espirituosas derivadas de frutos, etc.). Por convenção, e apenas para essas bebidas, considera-se que os teores em questão equivalem à soma das seguintes concentrações:

1. Ácidos voláteis, expressos em ácido acético;

2. Aldeídos, expressos em etanal através do somatório do etanal (acetaldeído) e das fracções etanálicas do 1,1-dietoxietano (acetal);

3. Os seguintes álcoois superiores: 1-propanol, 1-butanol, 2-butanol, 2-metil-1-propanol, expressos enquanto álcoois individualizados, e 2-metil-1-butanol e 3-metil-1-butanol, determinados enquanto álcoois individualizados ou os dois em conjunto;

4. Acetato de etilo.

Os métodos convencionados para a determinação dos compostos voláteis são os seguintes:

— ácidos voláteis: acidez volátil,

— aldeídos (etanal e acetal), acetato de etilo e álcoois: cromatografia em fase gasosa.

2. Análise de compostos voláteis por cromatografia em fase gasosa

A pesquisa por cromatografia em fase gasosa de compostos voláteis distintos dos acima indicados poderá ser um método particularmente interessante para determinar a origem das matérias-primas utilizadas na destilação e das condições reais em que esta última decorreu.

Algumas bebidas espirituosas contêm outros compostos voláteis, nomeadamente compostos aromáticos, característicos das matérias-primas utilizadas na obtenção do álcool, dos aromatizantes da bebida e de aspectos específicos da preparação desta. Esses compostos são importantes para avaliar a satisfação dos requisitos do Regulamento (CEE) n.o 1576/89.

III.2. DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS VOLÁTEIS APARENTADOS EM BEBIDAS ESPIRITUOSAS POR CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA: ALDEÍDOS, ÁLCOOIS SUPERIORES, ACETATO DE ETILO E METANOL

1. Âmbito

Este método é adequado para a determinação de 1,1-dietoxietano (acetal), 2-metil-1-butanol (álcool amílico), 3-metil-1-butanol (álcool isoamílico), metanol (álcool metílico), etanoato de etilo (acetato de etilo), 1-butanol (n-butanol), 2-butanol (sec-butanol), 2-metil-1-propanol (álcool isobutílico), 1-propanol (n-propanol) e etanal (acetaldeído) em bebidas espirituosas por cromatografia em fase gasosa. O método recorre a um padrão interno, por exemplo o 3-pentanol. As concentrações dos analitos são expressas em grama por 100 litros de álcool absoluto. Antes da análise é necessário determinar o título alcoométrico do produto. Entre as bebidas que podem ser analisadas por este método contam-se o whisky, o brandy, o rum, a aguardente de vinho, as aguardentes de frutos e a aguardente de bagaço de uvas.

2. Referências normativas

ISO 3696:1987: Water for analytical laboratory use — Specifications and test methods (Água para fins laboratoriais analíticos — Especificações e métodos de ensaio).

3. Definição

Entende-se por «compostos aparentados» as substâncias voláteis formadas juntamente com o etanol durante a fermentação, destilação ou maturação de bebidas espirituosas.

4. Princípio

A determinação dos compostos aparentados presentes numa bebida espirituosa é efectuada por injecção directa da mesma, eventualmente diluída, num sistema de cromatografia em fase gasosa. Antes da injecção é adicionado à bebida espirituosa um padrão interno adequado. A separação dos compostos aparentados é efectuada por programação da temperatura numa coluna apropriada e a detecção é efectuada com um detector de ionização de chama. A concentração de cada composto aparentado em relação ao padrão interno é determinada com base nos factores de resposta obtidos durante uma calibração efectuada em condições cromatográficas idênticas às seguidas na análise da bebida espirituosa.

5. Material e reagentes

Salvo indicação em contrário, utilizar apenas reagentes de pureza superior a 97 % adquiridos a um fornecedor acreditado (ISO) e acompanhados de um certificado de pureza, isentos de outros compostos aparentados na diluição utilizada nas análises (a confirmar por injecção de padrões de cada composto aparentado, à diluição utilizada nas análises, nas condições especificadas no ponto 6.4 para a cromatografia em fase gasosa), e exclusivamente água de grau não inferior a 3 (escala da norma ISO 3696). O acetal e o acetaldeído serão conservados ao abrigo da luz e a temperatura inferior a 5 °C; os restantes reagentes podem ser mantidos à temperatura ambiente.

5.1. Etanol absoluto (CAS 64-17-5).

5.2. Metanol (CAS 67-56-1).

5.3. 1-Propanol (CAS 71-23-8).

5.4. 2-Metil-1-propanol (CAS 78-33-1).

5.5. Padrões internos aceitáveis: 3-pentanol (CAS 584-02-1), 1-pentanol (CAS 71-41-0), 4-metil-1-pentanol (CAS 626-89-1) ou nonanoato de metilo (CAS 1731-84-6).

5.6. 2-Metil-1-butanol (CAS 137-32-6).

5.7. 3-Metil-1-butanol (CAS 123-51-3).

5.8. Acetato de etilo (CAS 141-78-6).

5.9. 1-Butanol (CAS 71-36-3).

5.10. 2-Butanol (CAS 78-92-2).

5.11. Acetaldeído (CAS 75-07-0).

5.12. Acetal (CAS 105-57-7).

5.13. Solução a 40 % (v/v) de etanol. Para preparar uma solução de etanol 400 ml/l, deitar 400 ml de etanol (5.1) num balão volumétrico de 1 litro, completar o volume com água e homogeneizar bem.

5.14. Preparação e conservação das soluções-padrão (processo utilizado no método validado) As soluções-padrão serão conservadas a uma temperatura inferior a 5 °C e preparadas de fresco todos os meses. As massas dos componentes e soluções serão registadas com uma aproximação de 0,1 mg. 5.14.1. Solução-padrão A Pipetar os reagentes a seguir indicados para um balão volumétrico de 100 ml que contenha já cerca de 60 ml da solução de etanol (5.13), para minimizar a evaporação de componentes, completar o volume com a mesma solução de etanol e homogeneizar. Registar a massa do balão e de cada componente adicionado e a massa total final do conteúdo.



Componente Volume (ml) Metanol (5.2) 3,0 1-Propanol (5.3) 3,0 2-Metil-1-propanol (5.4) 3,0 2-Metil-1-butanol (5.6) 3,0 3-Metil-1-butanol (5.7) 3,0 Acetato de etilo (5.8) 3,0 1-Butanol (5.9) 3,0 2-Butanol (5.10) 3,0 Acetaldeído (5.11) 3,0 Acetal (5.12) 3,0 Nota 1: Para minimizar as perdas por evaporação, é preferível adicionar o acetal e o acetaldeído em último lugar. 5.14.2. Solução-padrão B Pipetar 3 ml de 3-pentanol (ou de outro padrão interno adequado) (5.5) para um balão volumétrico de 100 ml que contenha já cerca de 80 ml da solução de etanol (5.13), completar o volume com a mesma solução de etanol e homogeneizar. Registar a massa do balão e de 3-pentanol (ou outro padrão interno adicionado) e a massa total final do conteúdo. 5.14.3. Solução-padrão C Pipetar 1 ml de solução A (5.14.1) e 1 ml de solução B (5.14.2) para um balão volumétrico de 100 ml que contenha já cerca de 80 ml da solução de etanol (5.13), completar o volume com a mesma solução de etanol e homogeneizar. Registar a massa do balão e de cada componente adicionado e a massa total final do conteúdo. 5.14.4. Solução-padrão D Para manter a continuidade analítica, preparar um padrão de controlo de qualidade utilizando o padrão A anteriormente preparado (5.14.1). Pipetar 1 ml de solução A (5.14.1) para um balão volumétrico de 100 ml que contenha já cerca de 80 ml da solução de etanol (5.13), completar o volume com a mesma solução de etanol e homogeneizar. Registar a massa do balão e de cada componente adicionado e a massa total final do conteúdo. 5.14.5. Solução-padrão E Pipetar 10 ml de solução B (5.14.2) para um balão volumétrico de 100 ml que contenha já cerca de 80 ml da solução de etanol (5.13), completar o volume com a mesma solução de etanol e homogeneizar. Registar a massa do balão e de cada componente adicionado e a massa total final do conteúdo. 5.14.6. Soluções-padrão utilizadas para verificar a linearidade da resposta do detector de ionização de chama Pipetar 0, 0,1, 0,5, 1,0 e 2,0 ml de solução A (5.14.1) e 1 ml de solução B (5.14.2) para uma série de balões volumétricos de 100 ml que contenham já cerca de 80 ml da solução de etanol (5.13), completar o volume com a mesma solução de etanol e homogeneizar. Registar a massa do balão e de cada componente adicionado e a massa total final do conteúdo. 5.14.7. Solução-padrão de controlo de qualidade Pipetar 9 ml de solução-padrão D (5.14.4) e 1 ml de solução-padrão E (5.14.5) para um balão de pesagem e homogeneizar. Registar a massa do balão e de cada componente adicionado e a massa total final do conteúdo.

6. Aparelhagem e equipamento

6.1. Aparelhagem preparada para a determinação da densidade e do título alcoométrico.

6.2. Balança analítica com uma aproximação de quatro casas decimais.

6.3. Cromatógrafo de fase gasosa com programação de temperatura equipado com um detector de ionização de chama e um integrador ou outro sistema de tratamento de dados para a medição das áreas ou alturas dos picos.

6.4. Coluna(s) para cromatografia em fase gasosa capaz(es) de efectuar a separação dos analitos com uma resolução mínima entre componentes individuais (excepto o 2-metil-1-butanol e o 3-metil-1-butanol) de 1,3. Nota 2: Foram consideradas adequadas as seguintes colunas e condições cromatográficas em fase gasosa exemplificativas: 1. Pré-coluna com 1 m de comprimento e 0,32 mm de diâmetro interno ligada a uma coluna CP-WAX 57 CB com 50 m de comprimento, 0,32 mm de diâmetro interno e 0,2 μm de espessura de filme (polietilenoglicol estabilizado), seguida de uma coluna Carbowax 400 com 50 m de comprimento, 0,32 mm de diâmetro interno e 0,2 μm de espessura de filme. (Ligação entre as colunas a estabelecer com elementos de encaixe forçado).



Gás vector e pressão de gás: Hélio (135 kPa) Temperatura na coluna: 35 °C durante 17 minutos, aumento de 35 °C para 70 °C à razão de 12 °C/minuto, manutenção a 70 °C durante 25 minutos Temperatura no injector: 150 °C Temperatura no detector: 250 °C Volume injectado: 1 μl (divisão da amostra: 20 a 100:1). 2. Pré-coluna com 1 m de comprimento e 0,32 mm de diâmetro interno ligada a uma coluna CP-WAX 57 CB com 50 m de comprimento, 0,32 mm de diâmetro interno e 0,2 μm de espessura de filme (polietilenoglicol estabilizado). (Ligação da pré-coluna a estabelecer com um elemento de encaixe forçado).



Gás vector e pressão de gás: Hélio (65 kPa) Temperatura na coluna: 35 °C durante 10 minutos, aumento de 35 °C para 110 °C à razão de 5 °C/minuto, aumento de 110 °C para 190 °C à razão de 30 °C/minuto, manutenção a 190 °C durante 2 minutos Temperatura no injector: 260 °C Temperatura no detector: 300 °C Volume injectado: 1 μl (divisão da amostra: 55:1). 3. Coluna de enchimento (5 % de CW 20M, Carbopak B) com 2 m de comprimento e 2 mm de diâmetro interno.



Temperatura na coluna: 65 °C durante 4 minutos, aumento de 65 °C para 140 °C à razão de 10 °C/minuto, manutenção a 140 °C durante 5 minutos, aumento de 140 °C para 150 °C à razão de 5 °C/minuto, manutenção a 150 °C durante 3 minutos Temperatura no injector: 65 °C Temperatura no detector: 200 °C Volume injectado 1 μl.

7. Colheita de amostras e amostras

7.1. Amostra remetida ao laboratório Determina-se (6.1) o título alcoométrico da cada amostra recebida.

8. Técnica (processo utilizado no método validado)

8.1. Toma para análise 8.1.1. Pesar um recipiente de pesagem adequado, devidamente rolhado, e registar a sua massa. 8.1.2. Pipetar 9 ml da amostra remetida ao laboratório para o recipiente e registar a sua massa (MAMOSTRA). 8.1.3. Adicionar 1 ml da solução-padrão E (5.14.5) e registar a sua massa (MPI). 8.1.4. Agitar vigorosamente a amostra (pelo menos 20 inversões). Antes das análises, conservar as amostras a temperatura inferior a 5 °C, para minimizar as perdas de matérias voláteis.

8.2. Branco 8.2.1. Utilizando uma balança com aproximação de quatro casas decimais (6.2), pesar um recipiente de pesagem adequado, devidamente rolhado, e registar a sua massa. 8.2.2. Pipetar 9 ml da solução 400 ml/l de etanol (5.13) para o recipiente e registar a sua massa. 8.2.3. Adicionar 1 ml da solução-padrão E (5.14.5) e registar a sua massa. 8.2.4. Agitar vigorosamente o conteúdo em análise (pelo menos 20 inversões). Antes das análises, conservar as amostras a temperatura inferior a 5 °C, para minimizar as perdas de matérias voláteis.

8.3. Teste preliminar Injectar solução-padrão C (5.14.3) para confirmar a separação de todos os analitos (excepto o 2-metil-1-butanol e o 3-metil-1-butanol) com uma resolução mínima de 1,3.

8.4. Calibração Verificar o estado de calibração conforme descrito a seguir. Confirmar a linearidade da resposta analisando sucessivamente, em triplicado, cada uma das soluções-padrão (5.14.6) com padrão interno utilizadas para o efeito. Com base nas áreas ou alturas dos picos obtidos pelo integrador para cada injecção, calcular a relação R correspondente a cada composto aparentado e representar graficamente R em função da relação (C) entre as concentrações do composto aparentado e do padrão interno. O traçado obtido deve ser linear, com um coeficiente de correlação não inferior a 0,99.

8.5. Determinação Injectar solução-padrão C (5.14.3) e duas soluções-padrão de controlo de qualidade (5.14.7). Prosseguir com as amostras desconhecidas (preparadas conforme descrito nos pontos 8.1 e 8.2), intervalando cada 10 amostras com um padrão de controlo de qualidade, para garantir estabilidade analítica. Injectar uma solução-padrão C (5.14.3) após cada conjunto de cinco amostras.

9. Cálculos

Pode recorrer-se a um sistema automático de tratamento de dados, desde que estes possam ser verificados com base nos princípios a seguir descritos.

Medir as áreas ou as alturas dos picos dos compostos aparentados e do padrão interno.

9.1. Cálculo dos factores de resposta A partir do cromatograma resultante da injecção da solução-padrão C (5.14.3), calcular os factores de resposta de cada composto aparentado através da equação (1). em que: PI = padrão interno Concentração do composto aparentado = concentração do composto aparentado na solução C (5.14.3) Concentração do PI = concentração do padrão interno na solução C (5.14.3). 9.1.2. Calcular a concentração de cada composto aparentado nas amostras através da equação (2). em que: MAMOSTRA = massa da amostra (8.1.2) MPI = massa do padrão interno (8.1.3) Concentração do PI = concentração do padrão interno na solução E (5.14.5) FR = factor de resposta calculado através da equação (1). 9.1.3. Calcular a percentagem de recuperação do valor-alvo de cada composto aparentado presente nos padrões de controlo de qualidade (5.14.7) através da equação (3). A concentração do analito no padrão de controlo de qualidade é calculada através das equações (1) e (2).

9.2. Apresentação final dos resultados A conversão dos resultados obtidos para as amostras de μg/g para grama por 100 l de álcool absoluto é efectuada através da equação (4) em que ρ = densidade em kg/m3. Os resultados são apresentados com três algarismos significativos e um máximo de uma casa decimal (por exemplo: 11,4 g por 100 l de álcool absoluto).

10. Garantia de qualidade e controlo de qualidade (no método validado)

Através da equação (2), calcular a concentração de cada composto aparentado nas soluções-padrão de controlo de qualidade preparadas conforme descrito nos pontos 8.1.1 a 8.1.4. Através da equação (3), calcular a percentagem de recuperação do valor-alvo. A análise poderá prosseguir se os resultados analisados relativamente a cada composto aparentado não se afastarem mais de 10 % dos valores teóricos respectivos. Caso contrário, será necessário investigar a origem da inexactidão e tomar medidas correctivas apropriadas.

11. Características operacionais do método (precisão)

Resultados estatísticos do teste interlaboratorial: os quadros seguintes reúnem os valores referentes aos seguintes compostos: etanal, acetato de etilo, acetal, etanal total, metanol, 2-butanol, 1-propanol, 1-butanol, 2-metil-1-propanol, 2-metil-1-butanol, 3-metil-1-butanol.

Os dados a seguir discriminados foram obtidos com base num estudo internacional das características operacionais do método efectuado segundo uma metodologia internacionalmente acordada.







Ano de realização do teste interlaboratorial 1 997 Número de laboratórios participantes 32 Número de amostras 5 Analito etanal







Amostras A B C D E Número de laboratórios considerado após eliminação dos casos anómalos 28 26 27 27 28 Número de casos anómalos (laboratórios) 2 4 3 3 2 Número de resultados aceite 56 52 54 54 56 Valor médio ( ) μg/g 63,4 71,67 130,4 38,4 28,6 13,8 (*) 52,2 (*) Desvio-padrão da repetibilidade (Sr) μg/g 3,3 1,9 6,8 4,1 3,6 Desvio-padrão relativo da repetibilidade (RSDr) (%) 5,2 2,6 5,2 15,8 8,9 Limite de repetibilidade (r) μg/g 9,3 5,3 19,1 11,6 10,1 Desvio-padrão da reprodutibilidade (SR) μg/g 12 14 22 6,8 8,9 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (RSDR) (%) 18,9 19,4 17,1 26,2 22,2 Limite de reprodutibilidade (R) μg/g 33,5 38,9 62,4 19,1 25,1







Ano de realização do teste interlaboratorial 1 997 Número de laboratórios participantes 32 Número de amostras 5 Analito Acetato de etilo







Amostras A B C D E Número de laboratórios considerado após eliminação dos casos anómalos 24 24 25 24 24 Número de casos anómalos (laboratórios) 2 2 1 2 2 Número de resultados aceite 48 48 50 48 48 Valor médio ( ) μg/g 96,8 1 046 120,3 112,5 99,1 91,8 (*) 117,0 (*) Desvio-padrão da repetibilidade (Sr) μg/g 2,2 15 2,6 2,1 2,6 Desvio-padrão relativo da repetibilidade (RSDr) (%) 2,3 1,4 2,1 2,0 2,4 Limite de repetibilidade (r) μg/g 6,2 40,7 7,2 5,8 7,3 Desvio-padrão da reprodutibilidade (SR) μg/g 6,4 79 8,2 6,2 7,1 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (RSDR) (%) 6,6 7,6 6,8 6,2 6,6 Limite de reprodutibilidade (R) μg/g 17,9 221,9 22,9 17,5 20,0







Ano de realização do teste interlaboratorial 1 997 Número de laboratórios participantes 32 Número de amostras 5 Analito acetal







Amostras A B C D E Número de laboratórios considerado após eliminação dos casos anómalos 20 21 22 17 21 Número de casos anómalos (laboratórios) 4 3 2 4 3 Número de resultados aceite 40 42 44 34 42 Valor médio ( ) μg/g 35,04 36,46 68,5 20,36 15,1 6,60 (*) 28,3 (*) Desvio-padrão da repetibilidade (Sr) μg/g 0,58 0,84 1,6 0,82 1,9 Desvio-padrão relativo da repetibilidade (RSDr) (%) 1,7 2,3 2,3 6,1 8,7 Limite de repetibilidade (r) μg/g 1,6 2,4 4,4 2,3 5,3 Desvio-padrão da reprodutibilidade (SR) μg/g 4,2 4,4 8,9 1,4 3,1 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (RSDR) (%) 12,1 12,0 13,0 10,7 14,2 Limite de reprodutibilidade (R) μg/g 11,8 12,2 25,0 4,0 8,7







Ano de realização do teste interlaboratorial 1 997 Número de laboratórios participantes 32 Número de amostras 5 Analito etanal total







Amostras A B C D E Número de laboratórios considerado após eliminação dos casos anómalos 23 19 22 21 22 Número de casos anómalos (laboratórios) 1 5 2 3 2 Número de resultados aceite 46 38 44 42 44 Valor médio ( ) μg/g 76,5 85,3 156,5 45,4 32,7 15,8 (*) 61,8 (*) Desvio-padrão da repetibilidade (Sr) μg/g 3,5 1,3 6,5 4,4 3,6 Desvio-padrão relativo da repetibilidade (RSDr) (%) 4,6 1,5 4,2 14,2 7,6 Limite de repetibilidade (r) μg/g 9,8 3,5 18,3 12,2 10,0 Desvio-padrão da reprodutibilidade (SR) μg/g 13 15 24,1 7,3 9,0 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (RSDR) (%) 16,4 17,5 15,4 23,7 19,1 Limite de reprodutibilidade (R) μg/g 35,2 41,8 67,4 20,3 25,2







Ano de realização do teste interlaboratorial 1 997 Número de laboratórios participantes 32 Número de amostras 5 Analito metanol







Amostras A B C D E Número de laboratórios considerado após eliminação dos casos anómalos 26 27 27 28 25 Número de casos anómalos (laboratórios) 4 3 3 1 4 Número de resultados aceite 52 54 54 56 50 Valor médio ( ) μg/g 319,8 2 245 1 326 83,0 18,6 61,5 (*) 28,9 (*) Desvio-padrão da repetibilidade (Sr) μg/g 4,4 27 22 1,5 1,3 Desvio-padrão relativo da repetibilidade (RSDr) (%) 1,4 1,2 1,7 2,1 5,6 Limite de repetibilidade (r) μg/g 12,3 74,4 62,5 4,3 3,8 Desvio-padrão da reprodutibilidade (SR) μg/g 13 99 60 4,5 2,8 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (RSDR) (%) 3,9 4,4 4,6 6,2 11,8 Limite de reprodutibilidade (R) μg/g 35,2 278,3 169,1 12,5 7,9







Ano de realização do teste interlaboratorial 1 997 Número de laboratórios participantes 32 Número de amostras 4 Analito 2-butanol







Amostras A B C E Número de laboratórios considerado após eliminação dos casos anómalos 21 27 29 22 Número de casos anómalos (laboratórios) 4 3 1 3 Número de resultados aceite 42 54 58 44 Valor médio ( ) μg/g 5,88 250,2 27,57 5,83 14,12 (*) Desvio-padrão da repetibilidade (Sr) μg/g 0,40 2,2 0,87 0,64 Desvio-padrão relativo da repetibilidade (RSDr) (%) 6,8 0,9 3,2 6,4 Limite de repetibilidade (r) μg/g 1,1 6,1 2,5 1,8 Desvio-padrão da reprodutibilidade (SR) μg/g 0,89 13 3,2 0,87 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (RSDR) (%) 15,2 5,1 11,5 8,7 Limite de reprodutibilidade (R) μg/g 2,5 35,5 8,9 2,4







Ano de realização do teste interlaboratorial 1 997 Número de laboratórios participantes 32 Número de amostras 5 Analito 1-propanol







Amostras A B C D E Número de laboratórios considerado após eliminação dos casos anómalos 29 27 27 29 29 Número de casos anómalos (laboratórios) 2 4 3 2 2 Número de resultados aceite 58 54 54 58 58 Valor médio ( ) μg/g 86,4 3 541 159,1 272,1 177,1 229,3 (*) 222,1 (*) Desvio-padrão da repetibilidade (Sr) μg/g 3,0 24 3,6 2,3 3,3 Desvio-padrão relativo da repetibilidade (RSDr) (%) 3,4 0,7 2,3 0,9 1,6 Limite de repetibilidade (r) μg/g 8,3 68,5 10,0 6,4 9,1 Desvio-padrão da reprodutibilidade (SR) μg/g 5,3 150 6,5 9,0 8,1 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (RSDR) (%) 6,1 4,1 4,1 3,6 4,1 Limite de reprodutibilidade (R) μg/g 14,8 407,2 18,2 25,2 22,7







Ano de realização do teste interlaboratorial 1 997 Número de laboratórios participantes 32 Número de amostras 5 Analito 1-butanol







Amostras A B C Número de laboratórios considerado após eliminação dos casos anómalos 20 22 22 Número de casos anómalos (laboratórios) 4 4 6 Número de resultados aceite 40 44 44 Valor médio ( ) μg/g 3,79 5,57 7,54 Desvio-padrão da repetibilidade (Sr) μg/g 0,43 0,20 0,43 Desvio-padrão relativo da repetibilidade (RSDr) (%) 11,2 3,6 5,6 Limite de repetibilidade (r) μg/g 1,1 0,6 1,2 Desvio-padrão da reprodutibilidade (SR) μg/g 0,59 0,55 0,82 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (RSDR) (%) 15,7 9,8 10,8 Limite de reprodutibilidade (R) μg/g 1,7 1,5 2,3







Ano de realização do teste interlaboratorial 1 997 Número de laboratórios participantes 32 Número de amostras 5 Analito 2-metil-1-propanol







Amostras A B C D E Número de laboratórios considerado após eliminação dos casos anómalos 28 31 30 26 25 Número de casos anómalos (laboratórios) 3 0 1 5 6 Número de resultados aceite 56 62 60 52 50 Valor médio ( ) μg/g 174,2 111,7 185,0 291,0 115,99 246,8 (*) 133,87 (*) Desvio-padrão da repetibilidade (Sr) μg/g 2,3 1,6 2,5 1,8 0,74 Desvio-padrão relativo da repetibilidade (RSDr) (%) 1,3 1,4 1,3 0,7 0,6 Limite de repetibilidade (r) μg/g 6,4 4,5 6,9 5,0 2,1 Desvio-padrão da reprodutibilidade (SR) μg/g 8,9 8,9 9,7 6,0 6,2 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (RSDR) (%) 5,1 8,0 5,2 2,2 5,0 Limite de reprodutibilidade (R) μg/g 24,9 24,9 27,2 16,9 17,4







Ano de realização do teste interlaboratorial 1 997 Número de laboratórios participantes 32 Número de amostras 5 Analito 2-mettil-1-butanol







Amostras A B C D E Número de laboratórios considerado após eliminação dos casos anómalos 25 26 25 27 25 Número de casos anómalos (laboratórios) 3 2 3 1 2 Número de resultados aceite 50 52 50 54 50 Valor médio ( ) μg/g 113,0 48,3 91,6 72,1 39,5 45,2 (*) 61,5 (*) Desvio-padrão da repetibilidade (Sr) μg/g 2,1 1,5 1,7 2,3 2,3 Desvio-padrão relativo da repetibilidade (RSDr) (%) 1,9 3,1 1,8 3,9 4,5 Limite de repetibilidade (r) μg/g 6,0 4,2 4,7 6,4 6,3 Desvio-padrão da reprodutibilidade (SR) μg/g 7,4 3,8 6,6 4,7 4,5 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (RSDR) (%) 6,6 7,9 7,2 8,1 8,8 Limite de reprodutibilidade (R) μg/g 20,8 10,7 18,4 13,3 12,5







Ano de realização do teste interlaboratorial 1 997 Número de laboratórios participantes 32 Número de amostras 5 Analito 3-metil-1-butanol







Amostras A B C D E Número de laboratórios considerado após eliminação dos casos anómalos 23 23 24 27 21 Número de casos anómalos (laboratórios) 5 5 4 1 6 Número de resultados aceite 46 46 48 54 42 Valor médio ( ) μg/g 459,4 242,7 288,4 142,2 212,3 120,4 (*) 245,6 (*) Desvio-padrão da repetibilidade (Sr) μg/g 5,0 2,4 3,4 2,4 3,2 Desvio-padrão relativo da repetibilidade (RSDr) (%) 1,1 1,0 1,2 1,8 1,4 Limite de repetibilidade (r) μg/g 13,9 6,6 9,6 6,6 9,1 Desvio-padrão da reprodutibilidade (SR) μg/g 29,8 13 21 8,5 6,7 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (RSDR) (%) 6,5 5,2 7,3 6,5 2,9 Limite de reprodutibilidade (R) μg/g 83,4 35,4 58,8 23,8 18,7

▼M2

III.3. DETERMINAÇÃO DA ACIDEZ VOLÁTIL DE BEBIDAS ESPIRITUOSAS

1. Âmbito

O método foi validado num estudo interlaboratorial relativo a rum, brandy, bagaço e aguardentes de frutos, a níveis que variam entre 30 mg/l e 641 mg/l.

2. Referências normativas

ISO 3696: 1987 Água para fins analíticos — Especificações e métodos de ensaio.

3. Definições

3.1. A acidez volátil é calculada deduzindo a acidez fixa da acidez total.

3.2. A acidez total é a acidez titulável.

3.3. A acidez fixa é a acidez do resíduo após evaporação da bebida espirituosa até à secura.

4. Princípio

A acidez total e a acidez fixa são determinadas por titulação ou por potenciometria.

5. Material e reagentes

Salvo indicação em contrário, utilizar na análise apenas reagentes pro analise reconhecidos e água de grau não inferior a 3 (escala da norma ISO 3696:1987).

5.1. Solução 0.01 M de hidróxido de sódio (NaOH)

5.2. Indicador misto. Pesar 0,1 g de carmim de índigo e 0,1 g de vermelho de fenol. Dissolver em 40 ml de água, completando com etanol até perfazer 100 ml.

6. Aparelhagem e equipamento

Aparelhagem indireta de laboratório, material de vidro de grau A e os seguintes elementos:

6.1. Bomba de água

6.2. Evaporador rotativo ou banho de ultrassons

6.3. Equipamento para a titulação potenciométrica (facultativo)

7. Colheita de amostras e amostras

As amostras devem ser armazenadas à temperatura ambiente até às análises.

8. Procedimento

8.1. Acidez total

8.1.1. Preparação da amostra

A bebida espirituosa é irradiada com ultrassons (dispersão ultrassónica) ou agitada durante dois minutos sob vácuo para eliminar o dióxido de carbono, se necessário.

8.1.2. Titulação

Pipetar 25 ml da bebida espirituosa num balão Erlenmeyer de 500 ml.

Adicionar cerca de 200 ml de água destilada, fervida e arrefecida (preparada diariamente), e 2 a 6 gotas de indicador misto (5.2).

Titular com a solução 0.01 M de hidróxido de sódio (5.1) até a cor amarelo-esverdeada se alterar para violeta, no caso das bebidas espirituosas incolores, e de amarelo-acastanhada para vermelho-acastanhada, no caso de bebidas de cor castanha.

A titulação pode ser igualmente efetuada por potenciometria, a pH 7,5.

Seja n1 ml o volume da solução 0.01 M de hidróxido de sódio adicionada.

8.1.3. Cálculos

O teor de acidez total (AT), expresso em miliequivalentes por litro de álcool, é igual a 0,4 × n1.

O teor de acidez total (AT′), expresso em mg de ácido acético por litro de álcool, é igual a 24 × n1.

8.2. Acidez fixa

8.2.1. Preparação da amostra

Evaporar até à secura 25 ml da bebida espirituosa:

Pipetar 25 ml da bebida espirituosa numa placa de evaporação cilíndrica de fundo plano com 55 mm de diâmetro. Durante a primeira hora de evaporação, a placa deve permanecer sobre a tampa do banho de água, para evitar que o líquido entre em ebulição, o que poderia provocar perdas por projeção.

Colocar a placa de evaporação num forno de secagem a 105 °C durante duas horas para completar a secagem. Deixar a placa arrefecer num exsicador.

8.2.2. Titulação

Dissolver o resíduo remanescente após evaporação com água destilada, fervida e arrefecida (preparada diariamente), perfazer um volume de cerca de 100 ml e adicionar 2 a 6 gotas de indicador misto (5.2).

Titular com a solução 0.01 M de hidróxido de sódio (ponto 5.1).

A titulação pode ser igualmente efetuada por potenciometria, a pH 7,5.

Seja n2 ml o volume da solução 0.01 M de hidróxido de sódio adicionada.

8.2.3. Cálculos

A acidez total (AT), expressa em miliequivalentes por litro de álcool, é igual a 0,4 × n2.

A acidez fixa (AF), expressa em mg de ácido acético por litro de bebida espirituosa, é igual a 24 × n2.

9. Cálculo da acidez volátil

9.1. Expressa em miliequivalentes por L: Sejam: AT = acidez total em miliequivalentes por L AF = acidez fixa em miliequivalentes por L Acidez volátil, AV, em miliequivalentes por L é igual a: AT – AF

9.2. Expressa em mg de ácido acético por L: Sejam: AT′ = acidez total expressa em mg de ácido acético por L AF′ = acidez fixa expressa em mg de ácido acético por L Acidez volátil, AV, expressa em mg de ácido acético por L é igual a: AT′ – AF′

9.3. Expresso em g de ácido acético por hectolitro de álcool puro a 100 % vol. é igual a: em que A é o título alcoométrico volúmico da bebida espirituosa.

10. Características do desempenho do método (precisão)

10.1. Resultados estatísticos do teste interlaboratorial

Os dados a seguir discriminados foram obtidos com base num estudo internacional das características operacionais do método efetuado segundo uma metodologia internacionalmente acordada [1] [2].







Ano de realização do teste interlaboratorial 2000 Número de laboratórios 18 Número de amostras 6







Amostras A B C D E F Número de laboratórios considerado após eliminação dos casos anómalos 16 18 18 14 18 18 Número de casos anómalos (laboratórios) 2 4 Número de resultados aceites 32 36 36 28 36 36 Mean value [mg/L] 272* 241* 30 591* 641* 46 107 492 Desvio-padrão da repetibilidade, sr [mg/l] 8,0 3,6 15,0 3,7 6,7 8,5 Desvio-padrão relativo da repetibilidade, RSDr [%] 3,1 11,8 2,4 8,0 6,2 1,7 Limite de repetibilidade, r [mg/l] 23 10 42 10 19 24 Desvio-padrão da repetibilidade, SR [mg/l] 8,5 8,4 25,0 4,55 13,4 24,4 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade, RSDR [%] 3,3 27,8 4,1 9,9 12,5 5,0 Limite de reprodutibilidade, R [mg/l] 24 23 70 13 38 68

Tipos de amostra:

A Aguardente de ameixa; duplicados com teores diferentes *

B Rum I; duplicados cegos

C Rum II; duplicados com teores diferentes*

D Slibovitz; duplicados cegos

E Brandy; duplicados cegos

F Bagaço; duplicados cegos

[1] «Protocol for the Design, Conduct and Interpretation of Method- Performance Studie», Horwitz, W. (1995) Pure and Applied Chemistry 67, 332-343.

[2] Horwitz, W. (1982) «Analytical Chemistry 54, 67A-76A».

▼M1

V. ANETOLE. DETERMINAÇÃO DO TRANS-ANETOLE EM BEBIDAS ESPIRITUOSAS POR CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA

1. Âmbito

Este método é adequado para a determinação do trans-anetole em bebidas espirituosas anisadas por cromatografia em fase gasosa em coluna capilar.

2. Referências normativas

ISO 3696:1987 Water for analytical laboratory use — Specifications and test methods (Água para fins laboratoriais analíticos — Especificações e métodos de ensaio).

3. Princípio

Determinação da concentração de trans-anetole na bebida espirituosa por cromatografia em fase gasosa. Adição da mesma quantidade de um padrão interno — por exemplo 4-alilanisol (estragol), se não estiver naturalmente presente na amostra — à toma para análise e a uma solução de referência de trans-anetole de concentração conhecida e diluição de ambas com uma solução a 45 % de etanol; injecção directa de ambas no sistema de cromatografia em fase gasosa. No caso dos licores com teor de açúcares elevado, é necessária uma extracção antes da preparação e análise da amostra.

4. Material e reagentes

O grau de pureza mínimo dos reagentes a utilizar nas análises é de 98 %. Utilizar exclusivamente água de grau não inferior a 3 (escala da norma ISO 3696).

Os produtos químicos de referência serão conservados no frio (cerca de 4 °C), ao abrigo da luz, em recipientes de alumínio ou garrafas de reagentes de vidro ambarizado. As tampas devem, de preferência, ser dotadas de uma vedação de alumínio. Se o trans-anetole se encontrar no estado cristalino, será necessário liquefazê-lo antes de o utilizar, mas sem que a temperatura exceda 35 °C.

4.1. Etanol a 96 % vol. (CAS 64-17-5)

4.2. 1-metoxi-4-(1-propenil) benzeno (trans-anetole) (CAS 4180-23-8)

4.3. 4-alilanisol (estragol) (CAS 140-67-0), padrão interno sugerido

4.4. Etanol a 45 % vol. Adicionar 560 g de água destilada a 378 g de etanol a 96 % vol.

4.5. Preparação das soluções-padrão Todas as soluções-padrão serão conservadas à temperatura ambiente (15 °C-35 °C), ao abrigo da luz, em recipientes de alumínio ou garrafas de reagentes de vidro ambarizado. As tampas devem, de preferência, ser dotadas de uma vedação de alumínio. O trans-anetole e o 4-alilanisol são praticamente insolúveis em água, pelo que é necessário dissolvê-los numa pequena quantidade de etanol a 96 % vol. (4.1) antes de adicionar o etanol a 45 % vol (4.4). As soluções de reserva devem ser preparadas de fresco todas as semanas. 4.5.1. Solução-padrão A Solução de reserva de trans-anetole (concentração: 2 g/l) Pesar 40 mg de trans-anetole (4.2) num balão volumétrico de 20 ml (ou 400 mg num balão de 200 ml, etc.). Juntar uma pequena quantidade de etanol a 96 % vol. (4.1), completar o volume com etanol a 45 % vol (4.4) e homogeneizar bem. 4.5.2. Solução do padrão interno, B Solução de reserva do padrão interno, por exemplo estragol (concentração: 2 g/l) Pesar 40 mg de estragol (4.3) num balão volumétrico de 20 ml (ou 400 mg num balão de 200 ml, etc.). Juntar uma pequena quantidade de etanol a 96 % vol (4.1), completar o volume com etanol a 45 % vol (4.4) e homogeneizar bem. 4.5.3. Soluções utilizadas para verificar a linearidade de resposta do detector de ionização de chama É necessário verificar a linearidade de resposta do detector de ionização de chama na análise para uma gama de concentrações de trans-anetole em bebidas espirituosas compreendida entre 0 g/l e 2,5 g/l. Na análise, as amostras de teor desconhecido de bebidas espirituosas a analisar devem ser diluídas dez vezes (8.3). Para as condições analíticas descritas no método, preparam-se como segue soluções de reserva correspondentes às concentrações de 0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2 e 0,25 g/l de trans-anetole na amostra a analisar: pipetar 0,5, 1, 1,5, 2 e 2,5 ml da solução de reserva A (4.5.1) para uma série de balões volumétricos de 20 ml; pipetar para cada balão 2 ml da solução do padrão interno, B (4.5.2), completar o volume com etanol a 45 % vol. (4.4) e homogeneizar bem. Para solução de concentração 0 g/l é utilizado o branco (8.4). 4.5.4. Solução-padrão C Pipetar 2 ml da solução-padrão A (4.5.1) para um balão volumétrico de 20 ml, adicionar 2 ml da solução do padrão interno, B (4.5.2), completar o volume com etanol a 45 % vol. (4.4) e homogeneizar bem.

5. Aparelhagem e equipamento

5.1. Cromatógrafo de fase gasosa de coluna capilar equipado com um detector de ionização de chama e um integrador ou outro sistema de tratamento de dados para a medição das áreas ou alturas dos picos e um amostrador automático ou os dispositivos necessários para a injecção manual das amostras.

5.2. Injector com/sem divisor da amostra (split/splitless)

5.3. Coluna capilar, por exemplo: Comprimento: 50 m Diâmetro interno: 0,32 mm Espessura do filme: 0,2 μm Fase estacionária: FFAP — polímero poroso reticulado de ácido tereftálico e polietilenoglicol, modificado

5.4. Material corrente de laboratório: material de vidro volumétrico da classe A, balança analítica (precisão: ± 0,1 mg).

6. Condições cromatográficas

O tipo e dimensões da coluna e as condições cromatográficas em fase gasosa devem permitir separar o anetole do padrão interno e ambos das substâncias interferentes eventualmente presentes. Condições típicas da coluna indicada como exemplo (5.3):

6.1. Gás vector: hélio pro analise

6.2. Caudal: 2 ml/minuto

6.3. Temperatura no injector: 250 °C

6.4. Temperatura no detector: 250 °C

6.5. Condições de temperatura da fornalha: isotérmica a 180 °C; tempo de funcionamento: 10 minutos.

6.6. Volume injectado: 1 μl, com divisão (split) de 1:40

7. Amostras

As amostras devem ser armazenadas à temperatura ambiente, ao abrigo da luz e de baixas temperaturas.

8. Técnica

8.1. Pesquisa de estragol na amostra

Para garantir que o estragol não está naturalmente presente na amostra, proceder-se-á a uma análise em branco, sem adição do padrão interno. Se o estragol estiver naturalmente presente, será necessário escolher outro padrão interno (por exemplo mentol).

Pipetar 2 ml da amostra para um balão volumétrico de 20 ml, completar o volume com etanol a 45 % vol. (4.4) e homogeneizar bem.

8.2. Preparação das amostras de teor desconhecido

Pipetar 2 ml da amostra para um balão volumétrico de 20 ml, adicionar 2 ml da solução do padrão interno, B (4.5.2), completar o volume com etanol a 45 % vol. (4.4) e homogeneizar bem.

8.3. Branco

Pipetar 2 ml da solução do padrão interno, B (4.5.2), para um balão volumétrico de 20 ml, completar o volume com etanol a 45 % vol. (4.4) e homogeneizar bem.

8.4. Teste de linearidade

Antes de iniciar as análises, é necessário confirmar a linearidade de resposta do detector de ionização de chama, analisando, para o efeito, em triplicado, cada solução-padrão de verificação da linearidade (4.5.3).

Com base nas áreas ou alturas dos picos obtidas pelo integrador para cada injecção, representar graficamente a concentração da solução-mãe respectiva, em g/l, em função da relação R correspondente.

R = altura ou área do pico do trans-anetole dividida pela altura ou área do pico do estragol.

Deve ser obtido um traçado linear.

8.5. Determinação

Injectar sucessivamente o branco (8.3), a solução-padrão C (4.5.4), um dos padrões de verificação da linearidade (4.5.3), que agirá como amostra de controlo de qualidade (a escolher em função da concentração provável de trans-anetole na amostra de teor desconhecido), e cinco amostras de teor desconhecido (8.2). Para garantir estabilidade analítica, injectar uma amostra de verificação da linearidade (controlo de qualidade) após cada conjunto de cinco amostras de teor desconhecido.

9. Cálculo do factor de resposta

Medir as áreas (com um integrador ou outro sistema de tratamento de dados) ou as alturas (por integração manual) dos picos do trans-anetole e do padrão interno.

9.1. Cálculo do factor de resposta (RFi)

O factor de resposta é calculado do seguinte modo:

Em que:

Ci é a concentração de trans-anetole na solução-padrão A (4.5.1)

Cpi é a concentração de padrão interno na solução B (4.5.2)

área i é a área (ou altura) do pico do trans-anetole

áreapi é a área (ou altura) do pico do padrão interno

O RFi é calculado a partir das cinco amostras de solução C (4.5.4).

9.2. Análise das soluções de verificação da linearidade de resposta

Injectar as soluções de verificação da linearidade de resposta (4.5.3).

9.3. Análise da amostra

Injectar a amostra de teor desconhecido (8.2).

10. Cálculo dos resultados

A fórmula de cálculo da concentração de trans-anetole é a seguinte:

Em que:

ci é a concentração desconhecida de trans-anetole

Cpi é a concentração de padrão interno na amostra de teor desconhecido (4.5.2)

área ou alturai é a área (ou altura) do pico do trans-anetole

área ou alturapi é a área (ou altura) do pico do padrão interno

RFi é o factor de resposta (calculado conforme indicado em 9.1)

A concentração de trans-anetole é expressa em grama por litro, com uma casa decimal.

11. Garantia de qualidade e controlo de qualidade

Os cromatogramas devem evidenciar a separação do anetole e do padrão interno entre si e de ambos de qualquer substância interferente. O valor de RFi é calculado a partir dos resultados das cinco injecções de solução C (4.5.4). Se o coeficiente de variação [CV (%) = desvio padrão/média*100] não exceder mais ou menos 1 %, o valor médio de RFi será aceitável.

O cálculo anterior será utilizado para determinar a concentração de trans-anetole na amostra seleccionada para o controlo de qualidade entre as soluções de verificação da linearidade (4.5.3).

Se os resultados médios calculados a partir da análise da solução de verificação da linearidade seleccionada para amostra de controlo de qualidade interno não se afastarem mais ou menos 2,5 % do valor teórico respectivo, os resultados obtidos para as amostras de teor desconhecido serão aceitáveis.

12. Tratamento de amostras de bebidas espirituosas com teores de açúcares elevados e de amostras de licores antes da análise por cromatografia em fase gasosa

Extracção do álcool da bebida espirituosa com teor de açúcares elevado, para possibilitar a determinação da concentração de trans-anetole por cromatografia em fase gasosa em coluna capilar.

12.1. Princípio

Toma-se uma alíquota da amostra de licor e adiciona-se-lhe o padrão interno, de modo a obter uma concentração semelhante à do analito (trans-anetole) no licor. Adiciona-se em seguida fosfato de sódio dodeca-hidratado e sulfato de amónio anidro. Agita-se bem a mistura resultante, arrefece-se, obtém-se a separação de duas fases e retira-se a fase (alcoólica) superior. Toma-se uma alíquota da fase alcoólica e dilui-se com solução de etanol a 45 % vol. (4.4) (nota: neste caso, não se adiciona padrão interno, por já ter sido anteriormente adicionado). Analisa-se a solução resultante por cromatografia em fase gasosa.

12.2. Material e reagentes

O grau de pureza mínimo dos reagentes a utilizar na extracção é de 99 %.

12.2.1. Sulfato de amónio anidro (CAS 7783-20-2)

12.2.2. Fosfato dibásico de sódio dodeca-hidratado (CAS 10039-32-4)

12.3. Aparelhagem e equipamento

Erlenmeyers, ampolas de decantação, frigorífico.

12.4. Técnica

12.4.1. Pesquisa de estragol na amostra

Para garantir que o estragol não está naturalmente presente na amostra, proceder-se-á a uma extracção em branco (12.6.2) e a análise será efectuada sem adição do padrão interno. Se o estragol estiver naturalmente presente, será necessário escolher outro padrão interno.

12.4.2. Extracção

Pipetar 5 ml de etanol a 96 % vol. (4.1) para um erlenmeyer e adicionar 50 mg do padrão interno (4.3), pesados no erlenmeyer, e 50 ml de amostra. Adicionar 12 g de sulfato de amónio anidro (12.2.1) e 8,6 g de fosfato dibásico de sódio dodeca-hidratado (12.2.2). Rolhar o erlenmeyer.

Agitar o erlenmeyer durante, pelo menos, 30 minutos. Pode ser utilizado um agitador mecânico, mas não uma barra de agitação magnética revestida a teflon, que absorveria parte do analito. Os sais adicionados não se dissolverão completamente.

Colocar o erlenmeyer tapado no frigorífico, a temperatura inferior a 5 °C, durante pelo menos duas horas.

Devem separar-se duas fases líquidas distintas e um resíduo sólido. A fase alcoólica deve ser límpida; caso não seja, recolocar o recipiente no frigorífico até a separação dar lugar a uma fase límpida.

Quando a fase alcoólica se apresentar límpida, tomar cuidadosamente uma alíquota (por exemplo, 10 ml), sem perturbar a fase aquosa, colocá-la num frasco de vidro ambarizado e fechar bem este último.

12.4.3. Preparação da amostra extraída a analisar

Deixar o extracto (12.4.2) em repouso até atingir a temperatura ambiente.

Pipetar 2 ml da fase alcoólica da amostra extraída à temperatura ambiente para um balão volumétrico de 20 ml, completar o volume com etanol a 45 % vol. (4.4) e homogeneizar bem.

12.5. Determinação

Proceder como indicado em 8.5.

12.6. Cálculo dos resultados

Os resultados são calculados pela seguinte fórmula:

Em que:

mpi é a massa (em miligrama) de padrão interno (4.3) tomada (12.4.2)

V é o volume da amostra de teor desconhecido (50 ml)

RFi é o factor de resposta (9.1)

áreai é a área do pico do trans-anetole

áreapi é a área do pico do padrão interno

Os resultados são expressos em grama por litro, com uma casa decimal.

12.7. Garantia de qualidade e controlo de qualidade

Proceder como indicado em 11.

13. Características operacionais do método (precisão)

Resultados estatísticos do teste interlaboratorial:

Os quadros seguintes reúnem os valores referentes ao anetole.

Os dados a seguir discriminados foram obtidos com base num estudo internacional das características operacionais do método, efectuado segundo uma metodologia internacionalmente acordada.





Ano de realização do teste interlaboratorial 1998 Número de laboratórios 16 Número de amostras 10 Analito anetole



Amostras A B C D E F Número de laboratórios considerado após eliminação dos casos anómalos 15 15 15 13 16 16 Número de casos anómalos (laboratórios) 1 1 1 3 — — Número de resultados aceite 30 30 30 26 16 16 Valor médio g/l 1,477 1,955 1,940 1,833 1,741 1,754 Desvio-padrão da repetibilidade (Sr) g/l 0,022 0,033 0,034 0,017 — — Desvio-padrão relativo da repetibilidade RSDr) (%) 1,5 1,7 1,8 0,9 — — Limite de repetibilidade (r) g/l 0,062 0,093 0,096 0,047 — — Desvio-padrão da reprodutibilidade (SR) g/l 0,034 0,045 0,063 0,037 0,058 0,042 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (RSDR) (%) 2,3 2,3 3,2 2,0 3,3 2,4 Limite de reprodutibilidade (R) g/l 0,094 0,125 0,176 0,103 0,163 0,119 Tipos de amostra: A Pastis, duplicados cegos B Pastis, duplicados cegos C Pastis, duplicados cegos D Pastis, duplicados cegos E Pastis, amostra singela F Pastis, amostra singela



Amostras G H I J Número de laboratórios considerado após eliminação dos casos anómalos 16 14 14 14 Número de casos anómalos (laboratórios) — 2 1 1 Número de resultados aceite 32 28 28 28 Valor médio g/l 0,778 0,530 (*) 1,742 0,351 0,599 Desvio-padrão da repetibilidade (Sr) g/l 0,020 0,012 0,013 0,014 Desvio-padrão relativo da repetibilidade (RSDr) (%) 3,1 0,7 3,8 2,3 Limite de repetibilidade (r) g/l 0,056 0,033 0,038 0,038 Desvio-padrão da reprodutibilidade (SR) g/l 0,031 0,029 0,021 0,030 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (RSDR) (%) 4,8 1,6 5,9 5,0 Limite de reprodutibilidade (R) g/l 0,088 0,080 0,058 0,084 Tipos de amostra: G Ouzo, duplicados com teores diferentes (*) H Anis, duplicados cegos I Licor anisado, duplicados J Licor anisado, duplicados

VI. ÁCIDO GLICIRRÍZICO. DETERMINAÇÃO DO ÁCIDO GLICIRRÍZICO POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA

1. Âmbito

Este método é adequado para a determinação do ácido glicirrízico em bebidas espirituosas anisadas por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). O Regulamento (CEE) n.o 1576/89 especifica que a bebida espirituosa anisada denominada «pastis» deve conter entre 0,05 g e 0,5 g de ácido glicirrízico por litro.

2. Referências normativas

ISO 3696:1987 Water for analytical laboratory use — Specifications and test methods (Água para fins laboratoriais analíticos — Especificações e métodos de ensaio).

3. Princípio

Determinação da concentração de ácido glicirrízico por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), com detecção no ultravioleta. Filtração de uma solução-padrão e da toma para análise e injecção directa de ambas, separadamente, no sistema cromatográfico de HPLC.

4. Material e reagentes

Utilizar nas análises apenas reagentes para HPLC, etanol absoluto e água de grau 3 (escala da norma ISO 3696).

4.1. Etanol a 96 % vol. (CAS 64-17-5)

4.2. Glicirrizinato de amónio, C42H62O16.NH3 (sal de amónio do ácido glicirrízico) Massa molecular: 839,98; CAS 53956-04-0; grau de pureza mínimo: 90 %. Massa molecular do ácido glicirrízico: 822,94.

4.3. Ácido acético glacial, CH3COOH (CAS 64-19-7)

4.4. Metanol, CH3OH (CAS 67-56-1)

4.5. Etanol a 50 % vol. Para preparar 1 000 ml, a 20 °C: — 521 ml de etanol a 96 % vol. (4.1), — 511 ml de água (2.0).

4.6. Preparação das soluções de eluição para a HPLC 4.6.1. Solvente de eluição A (exemplo) 80 partes (por volume) de água (2.0) 20 partes (por volume) de ácido acético (4.3) Desgasificar o solvente de eluição durante cinco minutos. Nota: Se a água utilizada não tiver sido microfiltrada, é conveniente filtrar o solvente de eluição preparado com um filtro para solventes orgânicos, de porosidade igual ou inferior a 0,45 μm. 4.6.2. Solvente de eluição B Metanol (4.4).

4.7. Preparação das soluções-padrão Todas as soluções-padrão devem ser preparadas de fresco após dois meses. 4.7.1. Solução de referência C Pesar, com a aproximação de 0,1 mg, 25 mg de glicirrizinato de amónio (4.2) num balão volumétrico de 100 ml. Adicionar um pouco de etanol a 50 % vol (4.5) e dissolver o glicirrizinato de amónio. Uma vez dissolvido, completar o volume até ao traço de aferição com etanol a 50 % vol (4.5). Filtrar com um filtro para solventes orgânicos. 4.7.2. Soluções-padrão (utilizadas para verificar a linearidade de resposta dos aparelhos) Preparar uma solução de reserva de 1,0 g/l, pesando, com a aproximação de 0,1 mg, 100 mg de glicirrizinato de amónio num balão volumétrico de 100 ml. Adicionar um pouco de etanol a 50 % vol (4.5) e dissolver o glicirrizinato de amónio. Uma vez dissolvido, completar o volume até ao traço de aferição com etanol a 50 % vol. (4.5). Preparar, pelo menos, quatro outras soluções de 0,05 g/l, 0,1 g/l, 0,25 g/l e 0,5 g/l de glicirrizinato de amónio, pipetando, respectivamente, 5 ml, 10 ml, 25 ml e 50 ml da solução de reserva de 1,0 g/l para uma série de balões volumétricos de 100 ml. Completar o volume até ao traço de aferição com etanol a 50 % vol. (4.5) e homogeneizar bem. Filtrar todas as soluções com um filtro para solventes orgânicos.

5. Aparelhagem e equipamento

5.1. Sistema de separação

5.1.1. Equipamento para cromatografia líquida de alta eficiência

5.1.2. Sistema de bombagem que permita obter e manter um caudal constante ou programado com grande precisão

5.1.3. Sistema espectrofotométrico de detecção no ultravioleta, regulado para 254 nm

5.1.4. Sistema de desgasificação do solvente

5.2. Integrador ou registador informatizado, de características compatíveis com o resto do sistema

5.3. Coluna (exemplo): Material: aço inoxidável ou vidro Diâmetro interno: 4 mm a 5 mm Comprimento: 100 mm a 250 mm Fase estacionária: sílica reticulada com um grupo funcional octadecílico (C18, de preferência esférico) e granulometria máxima de 5 μm.

5.4. Equipamento de laboratório 5.4.1. Balança analítica com a precisão de 0,1 mg 5.4.2. Material de vidro volumétrico da classe A 5.4.3. Dispositivo de membranas microfiltrantes para volumes pequenos

6. Condições cromatográficas

6.1. Eluição (exemplo): — Caudal: 1 ml/minuto, — solvente A = 30 %, — solvente B = 70 %.

6.2. Detecção: — UV = 254 nm

7. Técnica

7.1. Preparação da amostra de bebida espirituosa

Se necessário, filtrar com um filtro para solventes orgânicos (porosidade de 0,45 μm).

7.2. Determinação

Depois de estabilizadas as condições cromatográficas:

— injectar 20 μl da solução de referência C (4.7.1),

— injectar 20 μl da solução da amostra,

— comparar os dois cromatogramas. Identificar os picos do ácido glicirrízico a partir dos tempos de retenção respectivos. Medir as áreas (ou alturas) desses picos e calcular a concentração em g/l, com duas casas decimais, utilizando a seguinte equação: — — Em que: — c é a concentração, em grama por litro, de ácido glicirrízico na bebida espirituosa analisada; C é a concentração, em grama por litro, de glicirrizinato de amónio na solução de referência, h é a área (ou altura) do pico do ácido glicirrízico da bebida espirituosa analisada, H é a área (ou altura) do pico do ácido glicirrízico da solução de referência P é o grau de pureza, em percentagem, do glicirrizinato de amónio de referência 823 é a massa de uma mole de ácido glicirrízico 840 é a massa de uma mole de glicirrizinato de amónio

8. Características operacionais do método (precisão)

Resultados estatísticos do teste interlaboratorial:

O quadro seguinte reúne os valores referentes ao ácido glicirrízico.

Os dados a seguir discriminados foram obtidos com base num estudo internacional das características operacionais do método, efectuado segundo uma metodologia internacionalmente acordada.





Ano de realização do teste interlaboratorial 1998 Número de laboratórios 16 Número de amostras 5 Analito ácido glicirrízico



Amostras A B C D E Número de laboratórios considerado após eliminação dos casos anómalos 13 14 15 16 16 Número de casos anómalos (laboratórios) 3 2 1 — — Número de resultados aceite 26 28 30 32 32 Valor médio g/l 0,046 0,092 (*) 0,099 0,089 0,249 0,493 Desvia-padrão da repetibilidade (Sr) g/l 0,001 0,001 0,001 0,002 0,003 Desvio-padrão da repetibilidade (RSDr) (%) 1,5 1,3 0,7 1,0 0,6 Limite de repetibilidade (r) g/l 0,002 0,004 0,002 0,007 0,009 Desvio-padrão da reprodutibilidade (SR) g/l 0,004 0,007 0,004 0,006 0,013 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (RSDR) (%) 8,6 7,2 4,0 2,5 2,7 Limite de reprodutibilidade (R) g/l 0,011 0,019 0,010 0,018 0,037 Tipos de amostra: A Pastis, duplicados cegos B Pastis, duplicados com teores diferentes (*) C Pastis, duplicados cegos D Pastis, duplicados cegos E Pastis, duplicados cegos

VII. CALCONAS. MÉTODO DE VERIFICAÇÃO DA PRESENÇA DE CALCONAS EM PASTIS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA

1. Âmbito

Este método é adequado para a pesquisa de calconas em bebidas espirituosas anisadas. As calconas são corantes da família dos flavonóides naturalmente presentes na raiz do alcaçuz (Glycyrrhiza glabra).

Uma bebida espirituosa só poderá ser designada por «pastis» se contiver calconas [Regulamento (CEE) n.o 1576/89].

2. Referências normativas

ISO 3696:1987 Water for analytical laboratory use — Specifications and test methods (Água para fins laboratoriais analíticos — Especificações e métodos de ensaio).

3. Princípio

Preparação de uma solução de referência de extracto de alcaçuz. Determinação da presença ou ausência de calconas por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), com detecção no ultravioleta.

4. Material e reagentes

Utilizar nas análises apenas reagentes para HPLC. Utilizar etanol a 96 % vol. Utilizar exclusivamente água de grau 3 (escala da norma ISO 3696).

4.1. Etanol a 96 % vol. (CAS 64-17-5)

4.2. Acetonitrilo, CH3CN (CAS 75-05-8)

4.3. Substância de referência: Glycyrrhiza glabra (alcaçuz) Raízes de alcaçuz (Glycyrrhiza glabra) trituradas. Dimensões médias dos fragmentos: 10-15 mm de comprimento; 1-3 mm de espessura.

4.4. Acetato de sódio, CH3COONa (CAS 127-09-3)

4.5. Ácido acético glacial, CH3COOH (CAS 64-19-7)

4.6. Preparação das soluções 4.6.1. Etanol a 50 % vol Para preparar 1 000 ml, a 20 °C: — etanol a 96 % vol. (4.1): 521 ml, — água (2.0): 511 ml. 4.6.2. Solvente A: acetonitrilo Acetonitrilo (4.2) para HPLC. Desgasificar. 4.6.3. Solvente B: solução tampão 0,1 M de acetato de sódio, pH 4,66 Pesar 8,203 g de acetato de sódio (4.4), juntar 6,005 g de ácido acético glacial (4.5) e completar o volume até 1 000 ml com água (2) num balão volumétrico.

5. Preparação do extracto de referência de glycyrrhiza glabra (4.3)

5.1. Pesar 10 g de raiz de alcaçuz (Glycyrrhiza glabra) (4.3) triturada para um balão de destilação de fundo plano. — Adicionar 100 ml de etanol a 50 % vol. (4.6.1). — Manter em ebulição sob refluxo durante uma hora. — Filtrar. — Guardar o filtrado para mais tarde.

5.2. Recuperação do extracto de alcaçuz do filtro — Colocar o filtro num balão de destilação de fundo plano. — Adicionar 100 ml de etanol a 50 % vol. (4.6.1). — Manter em ebulição sob refluxo durante uma hora. — Filtrar. Guardar o filtrado para mais tarde.

5.3. Efectuar a extracção da raiz de alcaçuz por três vezes, sucessivamente

5.4. Juntar os três filtrados

5.5. Evaporar o solvente (de 5.4) num evaporador rotativo

5.6. Adicionar 100 ml de etanol a 50 % vol. (4.6.1) ao resíduo do extracto (de 5.5)

6. Aparelhagem e equipamento

6.1. Sistema de separação

6.1.1. Equipamento para cromatografia líquida de alta eficiência

6.1.2. Sistema de bombagem que permita obter e manter um caudal constante ou programado a alta pressão.

6.1.3. Sistema espectrofotométrico de detecção no ultravioleta/visível, regulável para 254 nm e 370 nm.

6.1.4. Sistema de desgasificação do solvente.

6.1.5. Fornalha da coluna, regulável a 40 °C ± 0,1 °C.

6.2. Integrador ou registador informatizado, de características compatíveis com o resto do sistema de separação.

6.3. Coluna Material: aço inoxidável ou vidro Diâmetro interno: 4 mm a 5 mm Fase estacionária: sílica reticulada com um grupo funcional octadecílico (C18) e granulometria máxima de 5 μm (fase reticulada).

6.4. Equipamento corrente de laboratório, nomeadamente: 6.4.1. Balança analítica (precisão ± 0,1 mg). 6.4.2. Dispositivo de destilação com condensador de refluxo, incluindo, por exemplo: — um balão de fundo plano de 250 ml com junta de vidro esmerilado normalizada, — um condensador de refluxo de 30 cm, e — uma fonte de calor (tomar as providências necessárias para evitar qualquer reacção pirogénica das matérias em extracção). 6.4.3. Evaporador rotativo 6.4.4. Dispositivo de filtração (funil de Büchner)

6.5. Condições cromatográficas (exemplo) 6.5.1. Condições de eluição dos solventes A (4.6.2) e B (4.6.3): — gradiente de variação de 20/80 (v/v) para 50/50 (v/v) em 15 minutos, — gradiente de variação de 50/50 (v/v) para 75/25 (v/v) em cinco minutos, — manutenção a 75/25 (v/v) durante cinco minutos, — estabilização da coluna entre as injecções, — manutenção a 20/80 (v/v) durante cinco minutos. 6.5.2. Caudal: 1 ml/minuto 6.5.3. Regulação do detector de UV: Regular o detector para 370 nm para a detecção da presença de calconas e, em seguida, para 254 nm, para a detecção do ácido glicirrízico. Nota: A mudança de comprimento de onda (de 370 nm para 254 nm) deve ser efectuada 30 segundos antes do início do pico de eluição do ácido glicirrízico.

7. Técnica

7.1. Preparação da amostra de bebida espirituosa

Filtrar com um filtro para solventes orgânicos (porosidade de 0,45 μm).

7.2. Preparação do extracto residual de alcaçuz (5.6)

Preparar uma diluição 1:10 com etanol a 50 % vol. (4.6.1) antes da análise.

7.3. Determinação.

7.3.1. Injectar 20 μl do extracto de alcaçuz preparado (7.2). Efectuar a análise nas condições cromatográficas acima descritas (6.5).

7.3.2. Injectar 20 μl da amostra (7.1) da bebida espirituosa anisada. Efectuar a análise nas condições cromatográficas acima descritas (6.5).

7.3.3. Comparar os dois cromatogramas. Devem ser muito semelhantes na zona de saída das calconas, durante a detecção a 370 nm nas condições cromatográficas acima descritas (ver a figura 1).

8. Cromatograma característico de um pastis

Figura 1:

Cromatograma obtido pelo método acima descrito, revelador da presença de calconas num «pastis». Os picos 1 a 8 correspondem às calconas; o pico 9 ao ácido glicirrízico.

9. Características operacionais do método (precisão)

Resultados do teste interlaboratorial:

O quadro seguinte apresenta as características operacionais do método de reconhecimento da presença ou ausência de calconas em «pastis» e bebidas espirituosas anisadas.

Os dados a seguir discriminados foram obtidos com base num estudo internacional das características operacionais do método, efectuado segundo uma metodologia internacionalmente acordada.





Ano de realização do teste interlaboratorial 1998 Número de laboratórios 14 Número de amostras 11 Analitos calconas



Amostras A B C D E F Número de laboratórios considerado após eliminação dos casos anómalos 14 14 14 14 14 13 Número de casos anómalos (laboratórios) — — — — — 1 (1) Número de resultados aceite 28 14 14 28 28 26 Número de confirmações da presença de calconas 28 14 14 0 28 0 Número de confirmações da ausência de calconas 0 0 0 28 0 26 Percentagem de resultados correctos (%) 100 100 100 100 100 100 (1) Incoerência dos resultados de dois duplicados, atribuída a um erro de constituição da amostra.



Amostras G H I J K Número de laboratórios considerado após eliminação dos casos anómalos 14 14 14 14 14 Número de casos anómalos (laboratórios) — — — — — Número de resultados aceite 28 14 14 28 28 Número de confirmações da presença de calconas 0 0 0 0 0 Número de confirmações da ausência de calconas 28 14 14 28 28 Percentagem de resultados correctos (%) 100 100 100 100 100 Tipos de amostra: A Pastis, duplicados cegos B Pastis, amostra singela C Pastis, amostra singela D «Pastis» (sem calconas), duplicados cegos E «Pastis» (sem calconas), duplicados cegos F Licor anisado (sem calconas), duplicados cegos G Licor anisado (sem calconas), duplicados cegos H Ouzo (sem calconas), amostra singela I Ouzo (sem calconas), amostra singela J Anis (sem calconas), duplicados cegos K «Pastis» (sem calconas), duplicados cegos

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VIII. AÇÚCARES TOTAIS

1. Âmbito

O método de HPLC-IR é aplicável no que se refere à determinação dos açúcares totais (expressos em açúcar invertido) das bebidas espirituosas, com exceção dos licores que contêm ovos e produtos lácteos.

O método foi validado num estudo interlaboratorial relativo a pastis, anis destilado, licor de cereja, crème de (seguido do nome do fruto ou da matéria-prima utilizados) e crème de cassis, a níveis que variam entre 10,86 g/l e 509,7 g/l. No entanto, a linearidade da resposta do instrumento foi demonstrada em relação ao intervalo de concentração entre 2,5 g/l e 20,0 g/l.

Este método não se destina a determinar baixos níveis de açúcares.

2. Referências normativas

ISO 3696:1987 Água para fins analíticos — Especificações e métodos de ensaio.

3. Princípio

Análises de cromatografia líquida de alta resolução de soluções de açúcar, a fim de determinar a sua concentração de glicose, frutose, sacarose, maltose e lactose.

Este método utiliza uma fase estacionária alquilamina e deteção refratométrica diferencial, sendo utilizado apenas como exemplo. A utilização de resinas de permuta aniónica como fase estacionária seria igualmente possível.

4. Material e reagentes

4.1. Glicose (CAS 50-99-7), pelo menos 99 % pura.

4.2. Frutose (CAS 57-48-7), pelo menos 99 % pura.

4.3. Sacarose (CAS 57-50-1), pelo menos 99 % pura.

4.4. Lactose (CAS 5965-66-2), pelo menos 99 % pura.

4.5. Maltose mono-hidratada (CAS 6363-53-7), pelo menos 99 % pura.

4.6. Acetonitrilo puro (CAS 75-05-8) para análise por HPLC.

4.7. Água destilada ou desmineralizada, de preferência microfiltrada.

4.8. Solventes (exemplo) O solvente de eluição é composto por: 75 partes por volume de acetonitrilo (4.6), 25 partes por volume de água destilada (4.7.). Passar o hélio a baixo ritmo durante 5 a 10 minutos antes de o utilizar para eliminar o gás. Se a água utilizada não tiver sido microfiltrada, o solvente deve ser filtrado com um filtro para solventes orgânicos, com um poro de dimensão inferior ou igual a 0,45 μm.

4.9. Etanol absoluto (CAS 64-17-5).

4.10. Solução de etanol (5 %, v/v).

4.11. Preparação da solução-mãe padrão (20 g/l) Introduzir 2 g de cada um dos açúcares a analisar (4.1. a 4.5.) e transferi-los sem perdas para um balão volumétrico de 100 ml. (NB: 2,11 g de maltose mono-hidratada é equivalente a 2 g de maltose). Adaptar para 100 ml com uma solução com 5 % vol. de álcool (4.10.), agitar e armazenar a cerca de + 4 °C. Preparar uma nova solução-mãe, uma vez por semana.

4.12. Preparação das soluções-padrão de trabalho (2,5; 5,0; 7,5; 10,0 e 20,0 g/