02009R0152 — PT — 28.06.2022 — 008.001

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►B REGULAMENTO (CE) N.o 152/2009 DA COMISSÃO de 27 de Janeiro de 2009 que estabelece os métodos de amostragem e análise para o controlo oficial dos alimentos para animais (Texto relevante para efeitos do EEE) (JO L 054 de 26.2.2009, p. 1)

Alterado por:









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REGULAMENTO (CE) N.o 152/2009 DA COMISSÃO

de 27 de Janeiro de 2009

que estabelece os métodos de amostragem e análise para o controlo oficial dos alimentos para animais

(Texto relevante para efeitos do EEE)







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Artigo 1.o

A amostragem para efeitos de controlo oficial de alimentos para animais, em especial no que se refere à determinação de constituintes, incluindo material que contenha ou consista em ou que seja produzido a partir de organismos geneticamente modificados (OGM), de aditivos para a alimentação animal, como definidos pelo Regulamento (CE) n.o 1831/2003 do Parlamento Europeu e do Conselho ( 1 ), ou de substâncias indesejáveis, na aceção da Diretiva 2002/32/CE do Parlamento Europeu e do Conselho ( 2 ), é efetuada em conformidade com os métodos indicados no anexo I.

O método de amostragem estabelecido no anexo I é aplicável para o controlo de alimentos para animais no que se refere à determinação de resíduos de pesticidas, como definidos no Regulamento (CE) n.o 396/2005 do Parlamento Europeu e do Conselho ( 3 ), e para o controlo da conformidade com o Regulamento (UE) n.o 619/2011.

▼B

Artigo 2.o

A preparação das amostras para análise e a expressão dos resultados efectuam-se de acordo com os métodos descritos no anexo II.

Artigo 3.o

As análises para efeitos de controlo oficial dos alimentos para animais efectuam-se de acordo com os métodos descritos no anexo III (Métodos de análise para o controlo da composição das matérias-primas para a alimentação animal e dos alimentos compostos para animais), no anexo IV (Métodos de análise para o controlo do teor dos aditivos autorizados nos alimentos para animais), no anexo V (Métodos de análise para o controlo das substâncias indesejáveis nos alimentos para animais) e no anexo VI (Métodos de análise para a determinação dos constituintes de origem animal para o controlo oficial dos alimentos para animais).

Artigo 4.o

O valor energético dos alimentos compostos destinados a aves de capoeira é calculado em conformidade com o disposto no anexo VII.

Artigo 5.o

Usam-se, para efeitos de confirmação, os métodos de análise descritos no anexo VIII para o controlo da presença ilegal de aditivos que já não estão autorizados nos alimentos para animais.

Artigo 6.o

São revogadas as Directivas 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/CEE, 73/46/CEE, 76/371/CEE, 76/372/CEE, 78/633/CEE, 81/715/CEE, 84/425/CEE, 86/174/CEE, 93/70/CEE, 93/117/CE, 98/64/CE, 1999/27/CE, 1999/76/CE, 2000/45/CE, 2002/70/CE e 2003/126/CE.

As referências às directivas revogadas devem entender-se como sendo feitas para o presente regulamento e devem ser lidas de acordo com os quadros de correspondência constantes do anexo IX.

Artigo 7.o

O presente regulamento entra em vigor no vigésimo dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial da União Europeia.

É aplicável a partir de 26 de Agasto de 2009.

O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e directamente aplicável em todos os Estados-Membros.

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ANEXO I

MÉTODOS DE AMOSTRAGEM

1. OBJETO E ÂMBITO DE APLICAÇÃO

As amostras destinadas ao controlo oficial de alimentos para animais são recolhidas de acordo com os métodos seguidamente indicados. As amostras assim obtidas serão consideradas representativas das porções amostradas.

O objetivo das amostras representativas é obter uma pequena fração de um lote, correspondendo a determinação de quaisquer características particulares dessa fração ao valor médio das características do lote. O lote é amostrado colhendo repetidamente amostras elementares em várias posições únicas do lote. Essas amostras elementares são combinadas misturando-as de forma a obter uma amostra global a partir da qual são preparadas amostras finais representativas por divisão representativa.

Se a inspeção visual revelar uma diferença de qualidade entre as porções amostradas do alimento para animais e o resto do alimento para animais do mesmo lote, essas porções devem ser separadas do resto do alimento para animais e ser tratadas como sublote separado. Se não for possível dividir o alimento para animais em sublotes separados, o produto em causa é amostrado como lote único. Nesses casos, esse facto será mencionado no relatório de amostragem.

Sempre que um alimento para animais amostrado em conformidade com as disposições do presente regulamento não satisfaça os requisitos da UE e faça parte de um lote de alimentos para animais da mesma categoria ou descrição, presume-se que todos os alimentos para animais desse lote se encontram afetados da mesma forma, a menos que, na sequência de uma avaliação rigorosa, não sejam detetados indícios de que o resto do lote não cumpre os requisitos da UE.

2. DEFINIÇÕES

— Lote : quantidade identificada de alimentos para animais que se presume ter características uniformes, nomeadamente a origem, a variedade, o tipo de embalagem, o embalador, o expedidor ou a rotulagem; no caso de um processo de produção, uma quantidade do produto fabricada por uma unidade de produção de uma única unidade fabril que utilize parâmetros de produção uniformes ou por várias dessas unidades, quando produzida em ordem sequencial e armazenada em conjunto.

— Porção amostrada : lote ou uma parte identificada do lote ou sublote.

— Amostra selada : amostra selada de modo a impedir qualquer acesso à amostra sem quebrar ou remover o selo.

— Amostra elementar : quantidade colhida num ponto da porção amostrada.

— Amostra global : conjunto de amostras elementares colhidas da mesma porção amostrada.

— Amostra reduzida : parte da amostra global, obtida a partir desta através de um processo de redução representativa.

— Amostra final : parte da amostra reduzida ou da amostra global homogeneizada.

— Amostra laboratorial : amostra destinada ao laboratório (como recebida pelo laboratório), que pode ser uma amostra final, reduzida ou global.

3. DISPOSIÇÕES GERAIS

— Pessoal de amostragem: as amostras são colhidas por pessoas autorizadas para o efeito pela autoridade competente.

— A amostra tem de ser selada de modo a impedir qualquer acesso à amostra sem quebrar ou remover o selo. A marca do selo tem de ser claramente identificável e visível. Em alternativa, a amostra pode ser colocada num recipiente que terá de ser fechado de forma a não permitir a sua abertura sem danificação irreversível e a impedir a sua reutilização.

— Identificação da amostra: a amostra tem de estar marcada de modo indelével e identificada de forma a garantir uma relação inequívoca com o relatório de amostragem.

— Têm de ser obtidas, pelo menos, duas amostras finais a partir de cada amostra global: no mínimo, uma amostra para controlo (da aplicação) e uma destinada ao operador da empresa do setor dos alimentos para animais (para efeitos de recurso). Pode, eventualmente, ser obtida uma amostra final para efeitos de arbitragem. Caso a amostra global completa esteja homogeneizada, as amostras finais são obtidas a partir da amostra global homogeneizada, desde que esse procedimento não colida com as regras dos Estados-Membros em matéria de direitos do operador.

4. EQUIPAMENTO

4.1. O equipamento destinado à colheita de amostras deve ser fabricado com materiais que não contaminem os produtos amostrados. O equipamento destinado a ser utilizado várias vezes tem ser fácil de limpar para evitar contaminações cruzadas.

4.2. Equipamento recomendado para a amostragem dos alimentos sólidos 4.2.1. Amostragem manual 4.2.1.1. Pá de fundo plano e bordos verticais 4.2.1.2. Sonda de fenda longa ou compartimentada. As dimensões da sonda têm de ser adequadas às características da porção amostrada (profundidade do recipiente, dimensões do saco, etc.) e ao tamanho das partículas que compõem o alimento. Se a sonda tiver várias aberturas, para garantir que a amostra é colhida em diferentes sítios, as aberturas devem ser separadas por compartimentos ou por aberturas sequenciais. 4.2.2. Amostragem mecânica Podem ser utilizados aparelhos mecânicos apropriados para a amostragem de alimentos em movimento. Neste contexto, «apropriados» significa que, pelo menos, toda a secção do caudal é amostrada. A amostragem de alimentos em movimento (em caudais elevados) pode ser efetuada por sistemas automáticos de recolha de amostras. 4.2.3. Divisor Quando possível e apropriado, devem ser utilizados aparelhos destinados a dividir a amostra em partes aproximadamente iguais, para a preparação de amostras reduzidas de uma forma representativa.

5. REQUISITOS QUANTITATIVOS QUANTO AO NÚMERO DE AMOSTRAS ELEMENTARES

— Os requisitos quantitativos estabelecidos nos pontos 5.1 e 5.2 no que se refere ao número de amostras elementares são aplicáveis a porções com uma dimensão máxima de 500 toneladas e que podem ser amostradas de forma representativa. O procedimento de amostragem descrito é igualmente válido para quantidades superiores à porção máxima prescrita, desde que o número máximo de amostras elementares indicado nos quadros seguintes seja ignorado, passando a ser determinado pela fórmula de raiz quadrada apresentada na parte respetiva do procedimento (ver ponto 5.3), e na condição de a dimensão mínima da amostra global ser aumentada proporcionalmente. Tal não impede que um lote grande possa ser dividido em sublotes de menor dimensão e que cada sublote seja amostrado em conformidade com o procedimento descrito nos pontos 5.1 e 5.2.

— A dimensão da porção amostrada tem de ser suficiente para permitir a amostragem de todas as partes que a compõem.

— Para lotes ou sublotes muito grandes (> 500 toneladas) e para lotes cujo transporte ou armazenagem não permita uma amostragem segundo o procedimento estabelecido nos pontos 5.1 e 5.2 do presente capítulo, deve aplicar-se o procedimento de amostragem indicado no ponto 5.3.

— Se for legalmente exigida ao operador da empresa do setor de alimentos para animais a aplicação do presente regulamento no âmbito de um sistema obrigatório de controlo, o operador pode divergir dos requisitos quantitativos estabelecidos no presente capítulo, para ter em conta determinadas características operacionais, desde que demonstre cabalmente à autoridade competente a equivalência do procedimento de amostragem em termos de representatividade e após autorização dessa autoridade.

— Em casos excecionais, quando não seja possível aplicar o método de amostragem previsto no que diz respeito aos requisitos quantitativos, devido a danos comerciais inaceitáveis do lote (relacionados com o tipo de embalagem, meios de transporte, armazenagem, etc.), pode ser aplicado um método de amostragem alternativo, desde que seja tão representativo quanto possível e esteja plenamente descrito e documentado.

5.1. Requisitos quantitativos das amostras elementares respeitantes ao controlo de substâncias ou produtos repartidos uniformemente nos alimentos para animais

5.1.1. Alimentos sólidos a granel







Dimensão da porção amostrada Número mínimo de amostras elementares ≤ 2,5 toneladas 7 > 2,5 toneladas √ 20 vezes o número de toneladas que constituem a porção amostrada (*1), até 40 amostras elementares ( *1 ) Sempre que o número obtido for fracionário, deve ser arredondado para o inteiro imediatamente superior.

5.1.2. Alimentos líquidos a granel







Dimensão da porção amostrada Número mínimo de amostras elementares ≤ 2,5 toneladas ou ≤ 2 500 litros 4 (*1) > 2,5 toneladas ou > 2 500 litros 7 (*1) ( *1 ) No caso de não ser possível homogeneizar o líquido, o número de amostras elementares tem de ser aumentado.

5.1.3. Alimentos embalados

Os alimentos para animais (sólidos e líquidos) podem ser embalados em sacos, latas, barricas, etc., que são referidos no quadro enquanto unidades. As unidades de grande dimensão (≥ 500 kg ou litros) têm de ser amostradas em conformidade com as disposições estabelecidas para os alimentos a granel (ver pontos 5.1.1 e 5.1.2).







Dimensão da porção amostrada Número mínimo de unidades a partir do qual deve ser obtida (pelo menos) uma amostra elementar (*1) 1 a 20 unidades 1 unidade (*2) 21 a 150 unidades 3 unidades (*2) 151 a 400 unidades 5 unidades (*2) > 400 unidades ¼ do √ número de unidades que compõem a porção amostrada (*3), até 40 unidades ( *1 ) Sempre que a abertura de uma unidade possa afetar a análise (p. ex., no caso de alimentos húmidos perecíveis), a amostra elementar é composta pela unidade não aberta. ( *2 ) Para unidades cujo conteúdo não exceda 1 kg ou 1 litro, a amostra elementar é composta pelo conteúdo de uma unidade de origem. ( *3 ) Sempre que o número obtido for fracionário, deve ser arredondado para o inteiro imediatamente superior.

5.1.4. Alimentos em blocos e pedras minerais para lamber

Será considerado, no mínimo, um bloco ou pedra para lamber por cada porção amostrada de 25 unidades e, no máximo, quatro destes produtos.

Para blocos ou pedras para lamber cujo peso unitário não exceda 1 kg, a amostra elementar é composta pelo conteúdo de um bloco ou pedra para lamber.

5.1.5. Forragens e outros alimentos grosseiros







Dimensão da porção amostrada Número mínimo de amostras elementares (*1) ≤ 5 toneladas 5 > 5 toneladas √ 5 vezes o número de toneladas que constituem a porção amostrada (*2), até 40 amostras elementares ( *1 ) É um facto que, em certas situações (p. ex. na silagem) não é possível recolher as amostras elementares exigidas, sem causar danos inaceitáveis ao lote. Nessas situações, pode ser aplicado um método alternativo de amostragem, devendo um guia para a amostragem desses lotes ser elaborado antes da entrada em aplicação do presente regulamento. ( *2 ) Sempre que o número obtido for fracionário, deve ser arredondado para o inteiro imediatamente superior.

5.2. Requisitos quantitativos das amostras elementares respeitantes ao controlo de constituintes ou substâncias suscetíveis de não estar repartidos uniformemente nos alimentos para animais

Estes requisitos quantitativos das amostras elementares devem ser aplicados nas seguintes situações:

— controlo de aflatoxinas, cravagem do centeio, outras micotoxinas e impurezas botânicas prejudiciais nas matérias-primas para alimentação animal,

— controlo da contaminação cruzada por um constituinte, incluindo material GM, ou por uma substância suscetíveis de não estar repartidos de forma uniforme nas matérias-primas para alimentação animal.

Sempre que a autoridade de controlo suspeitar fortemente de que essa distribuição não uniforme também se verifica em caso de contaminação cruzada por um constituinte ou substância em alimentos compostos, podem ser aplicados os requisitos quantitativos previstos no quadro abaixo.







Dimensão da porção amostrada Número mínimo de amostras elementares < 80 toneladas Ver requisitos quantitativos no ponto 5.1. O número de amostras elementares a colher tem ser multiplicado por 2,5. ≥ 80 toneladas 100

5.3. Requisitos quantitativos das amostras elementares no caso de lotes muito grandes

No caso de porções amostradas muito grandes (porções amostradas > 500 toneladas), o número de amostras elementares a colher = 40 amostras elementares + √ toneladas em relação ao controlo das substâncias ou produtos repartidos uniformemente nos alimentos para animais, ou 100 amostras elementares + √ toneladas em relação ao controlo de constituintes ou substâncias suscetíveis de não estar distribuídos uniformemente nas matérias-primas para alimentação animal.

6. REQUISITOS QUANTITATIVOS DA AMOSTRA GLOBAL







É necessária uma única amostra global por porção amostrada. Natureza dos alimentos para animais Dimensão mínima da amostra global (*1) (*2) 6.1. Alimentos a granel 4 kg 6.2. Alimentos embalados 4 kg (*3) 6.3. Alimentos líquidos ou semilíquidos 4 litros 6.4. Alimentos em blocos e pedras minerais para lamber: 6.4.1. Peso unitário superior a 1 kg 4 kg 6.4.2. Peso unitário não superior a 1 kg Quatro blocos ou pedras de origem 6.5. Forragem e outros alimentos grosseiros 4 kg (*4) ( *1 ) No caso de o alimento para animais amostrado ter elevado valor, pode ser obtida uma quantidade mais pequena de amostra global na condição de este facto estar descrito e documentado no relatório de amostragem. ( *2 ) Em conformidade com as disposições do Regulamento (UE) n.o 619/2011 da Comissão, de 24 de junho de 2011, que estabelece os métodos de amostragem e análise para o controlo oficial dos alimentos para animais no que respeita à presença de material geneticamente modificado cujo procedimento de autorização está pendente ou cuja autorização expirou (JO L 166 de 25.6.2011, p. 9), a amostra global para controlar a presença de material geneticamente modificado tem de conter, pelo menos, 35 000 sementes/grãos. Tal significa que para o milho a dimensão da amostra global deve ser de pelo menos 10,5 kg e para a soja de 7 kg. No caso de outras sementes e grãos de cereais como a cevada, o painço, a aveia, o arroz, o centeio, o trigo e a colza, a dimensão da amostra global de 4 kg corresponde a mais de 35 000 sementes. ( *3 ) No caso de alimentos embalados, pode também não ser possível atingir a dimensão de 4 kg para a amostra global devido à dimensão das unidades individuais. ( *4 ) No caso de forragem e alimentos grosseiros com baixa densidade relativa (por exemplo, o feno e a palha), a amostra global deve ter uma dimensão mínima de 1 kg.

7. REQUISITOS QUANTITATIVOS DAS AMOSTRAS FINAIS

Amostras finais

É exigida a análise de, pelo menos, uma amostra final. A dimensão da amostra final destinada a análise não pode ser inferior às quantidades seguintes:







Alimentos sólidos 500 g (*1) (*2) (*3) Alimentos líquidos ou semilíquidos 500 ml (*1) ( *1 ) Em conformidade com as disposições do Regulamento (UE) n.o 619/2011, a amostra final para o controlo da presença de material geneticamente modificado deve conter, pelo menos, 10 000 sementes/grãos. Tal significa que para o milho a dimensão da amostra final deve ser de pelo menos 3 000 g e para a soja de 2 000 g. No caso de outras sementes e grãos de cereais como a cevada, o painço, a aveia, o arroz, o centeio, o trigo e a colza, a dimensão da amostra final de 500 g corresponde a mais de 10 000 sementes. ( *2 ) Se a dimensão da amostra global for significativamente inferior a 4 kg ou litros (ver notas de rodapé, ponto 6), também pode ser colhida uma quantidade menor de amostra final na condição de este facto estar descrito e documentado no relatório de amostragem. ( *3 ) Em caso de amostragem de leguminosas de grão, cereais em grão e frutos de casca rija para determinação de resíduos de pesticidas, a dimensão mínima da amostra final é de 1 kg em conformidade com as disposições da Diretiva 2002/63/CE da Comissão (JO L 187 de 16.7.2002, p. 30).

8. MÉTODO DE AMOSTRAGEM PARA LOTES MUITO GRANDES OU LOTES ARMAZENADOS OU TRANSPORTADOS DE MODO A NÃO PERMITIR UMA AMOSTRAGEM DE TODO O LOTE

8.1. Princípios gerais

Sempre que o tipo de transporte ou armazenagem de um lote não permita colher amostras elementares em todo o lote, a amostragem deve ser, de preferência, efetuada enquanto o lote estiver em movimento.

No caso de grandes armazéns destinados a alimentos para animais, os operadores devem ser incentivados a instalar equipamentos nos armazéns que permitam uma amostragem (automática) em todo o lote armazenado.

Em caso de aplicação dos procedimentos de amostragem previstos no presente capítulo 8, o operador da empresa do setor de alimentos para animais ou o seu representante são informados acerca desses procedimentos. Se os referidos procedimentos de amostragem forem questionados pelo operador ou pelo seu representante, o operador ou o seu representante deve permitir que a autoridade competente proceda à amostragem em todo o lote a suas expensas.

8.2. Lotes grandes transportados por navio

8.2.1. Amostragem dinâmica de lotes grandes transportados por navio

A amostragem de lotes grandes nos navios deve ser preferencialmente realizada enquanto o produto está em movimento (amostragem dinâmica).

A amostragem é feita por porão, podendo os porões estar fisicamente separados. Todavia, os porões são esvaziados parcialmente um após outro, deixando essa separação física inicial de existir após a transferência para as instalações de armazenamento. A amostragem pode, portanto, ser efetuada em função da separação física inicial ou da separação existente após transferência para as referidas instalações.

A descarga de um navio pode durar vários dias. Normalmente, as amostras têm de ser colhidas a intervalos regulares durante todo o período de descarga. Contudo, nem sempre é possível ou apropriado para um inspetor oficial estar presente para amostragem durante toda a operação de descarga. Por conseguinte, é permitida a amostragem de uma parte (porção amostrada) da totalidade do lote. O número de amostras elementares é determinado em função da dimensão da porção amostrada.

Sempre que seja amostrada uma parte de um lote de alimentos para animais da mesma categoria ou descrição e seja considerado que essa parte do lote não satisfaz os requisitos da UE, presume-se que todos os alimentos para animais desse lote se encontram afetados da mesma forma, a menos que, na sequência de uma avaliação rigorosa, não sejam detetados indícios de que o resto do lote não cumpre os requisitos da UE.

Mesmo quando a amostragem oficial é efetuada de forma automática, é necessária a presença de um inspetor. Contudo, se a amostragem automática utilizar parâmetros preestabelecidos que não possam ser alterados durante a amostragem e se as amostras elementares forem recolhidas num recipiente selado, impedindo qualquer possível fraude, a presença de um inspetor só é exigida no início da amostragem, de cada vez que tenha de ser mudado o recipiente das amostras, e no final da amostragem.

8.2.2. Amostragem estática de lotes transportados por navio

No caso de a amostragem ser realizada de forma estática, têm de ser aplicados os procedimentos previstos para as instalações de armazenagem (silos) acessíveis pelo topo (ver ponto 8.4.1).

A amostragem tem de ser efetuada através da parte acessível (do topo) do lote/porão. O número de amostras elementares é determinado em função da dimensão da porção amostrada. Sempre que seja amostrada uma parte de um lote de alimentos para animais da mesma categoria ou descrição e seja considerado que essa parte do lote não satisfaz os requisitos da UE, presume-se que todos os alimentos para animais desse lote se encontram afetados da mesma forma, a menos que, na sequência de uma avaliação rigorosa, não sejam detetados indícios de que o resto do lote não cumpre os requisitos da UE.

8.3. Amostragem de lotes grandes armazenados em armazéns

A amostragem tem de ser efetuada através da parte acessível do lote. O número de amostras elementares é determinado em função da dimensão da porção amostrada. Sempre que seja amostrada uma parte de um lote de alimentos para animais da mesma categoria ou descrição e seja considerado que essa parte do lote não satisfaz os requisitos da UE, presume-se que todos os alimentos para animais desse lote se encontram afetados da mesma forma, a menos que, na sequência de uma avaliação rigorosa, não sejam detetados indícios de que o resto do lote não cumpre os requisitos da UE.

8.4. Amostragem de instalações de armazenagem (silos)

8.4.1. Amostragem de silos (facilmente) acessíveis pelo topo

A amostragem tem de ser efetuada através da parte acessível do lote. O número de amostras elementares é determinado em função da dimensão da porção amostrada. Sempre que seja amostrada uma parte de um lote de alimentos para animais da mesma categoria ou descrição e seja considerado que essa parte do lote não satisfaz os requisitos da UE, presume-se que todos os alimentos para animais desse lote se encontram afetados da mesma forma, a menos que, na sequência de uma avaliação rigorosa, não sejam detetados indícios de que o resto do lote não cumpre os requisitos da UE.

8.4.2. Amostragem de silos não acessíveis pelo topo (silos fechados)

8.4.2.1. Silos não acessíveis pelo topo (silos fechados) com dimensão > 100 toneladas

Os alimentos para animais armazenados neste tipo de silos não podem ser amostrados de forma estática. Por conseguinte, sempre que os alimentos para animais no silo tenham de ser amostrados e não exista possibilidade de movê-los, é estabelecido um acordo com o operador no sentido de informar o inspetor sobre o momento em que o silo será descarregado, para que possa ser realizada uma amostragem dinâmica dos alimentos.

8.4.2.2. Silos não acessíveis pelo topo (silos fechados) com dimensão < 100 toneladas

O procedimento de amostragem envolve a introdução num recipiente de uma quantidade de 50 kg a 100 kg e a recolha de uma amostra a partir dessa quantidade. A dimensão da amostra global corresponde a todo o lote e o número de amostras elementares é determinado em função da quantidade libertada do silo para o recipiente de amostragem. Sempre que seja amostrada uma parte de um lote de alimentos para animais da mesma categoria ou descrição e seja considerado que essa parte do lote não satisfaz os requisitos da UE, presume-se que todos os alimentos para animais desse lote se encontram afetados da mesma forma, a menos que, na sequência de uma avaliação rigorosa, não sejam detetados indícios de que o resto do lote não cumpre os requisitos da UE.

8.5. Amostragem de alimentos a granel em contentores grandes fechados

Muitas vezes, estes lotes só podem ser amostrados quando descarregados. Por vezes, não é possível proceder à descarga no ponto de importação ou de controlo, devendo a amostragem ter lugar quando os contentores são descarregados.

9. INSTRUÇÕES RELATIVAS À COLHEITA, À PREPARAÇÃO E AO ACONDICIONAMENTO DAS AMOSTRAS

9.1. Disposições gerais

As amostras devem ser colhidas e preparadas tão rapidamente quanto possível, tendo em conta as precauções necessárias para evitar que o produto seja alterado ou contaminado. Os instrumentos assim como as superfícies e os recipientes destinados a receber as amostras têm de estar limpos e secos.

9.2. Amostras elementares

As amostras elementares têm de ser colhidas aleatoriamente em toda a porção de amostragem e apresentar dimensões aproximadamente equivalentes.

As amostras elementares têm uma dimensão mínima de 100 g ou 25 g em caso de alimentos grosseiros ou de forragem com baixa densidade relativa.

Sempre que, em conformidade com as regras dos procedimentos de amostragem estabelecidas no ponto 8, tenham de ser colhidas menos de 40 amostras elementares, a dimensão dessas amostras é determinada em função da dimensão exigida para a amostra global (ver ponto 6).

No caso de amostragem de pequenos lotes de alimentos embalados relativamente aos quais, de acordo com os requisitos quantitativos, tenha de ser colhido um número limitado de amostras elementares, cada amostra elementar será composta pelo conteúdo de uma unidade de origem cujo conteúdo não exceda 1 kg ou 1 litro.

Em caso de amostragem de alimentos embalados constituídos por pequenas unidades (p. ex., < 250 g), a dimensão das amostras elementares depende da dimensão de cada unidade.

9.2.1. Alimentos a granel

Sempre que adequado, a amostragem pode ser efetuada aquando da movimentação do lote (carga ou descarga).

9.2.2. Alimentos embalados

Após seleção do número requerido de unidades amostradas, como indicado no capítulo 5, procede-se à colheita de uma parte do conteúdo de cada unidade com o auxílio de uma sonda ou pá. Sempre que necessário, as amostras são colhidas depois de se esvaziar separadamente as unidades.

9.2.3. Alimentos líquidos ou semilíquidos homogéneos ou homogeneizáveis

Após seleção do número requerido de unidades amostradas, como indicado no capítulo 5, procede-se à colheita de uma quantidade em cada unidade após se ter homogeneizado o conteúdo, se necessário.

As amostras elementares podem ser colhidas aquando da descarga do produto.

9.2.4. Alimentos líquidos ou semilíquidos não homogeneizáveis

Após seleção do número requerido de unidades amostradas, como indicado no capítulo 5, procede-se à colheita das amostras a diferentes níveis.

As amostras podem igualmente ser colhidas aquando da descarga do produto, mas rejeitando as primeiras frações.

Nos dois casos, o volume total colhido não pode ser inferior a 10 litros.

9.2.5. Alimentos em blocos e pedras minerais para lamber

Após seleção do número requerido de blocos ou pedras para lamber amostradas, como indicado no capítulo 5, pode ser colhida uma parte de cada bloco ou pedra. Em caso de suspeita de bloco ou pedra não homogéneo, todo o bloco ou pedra pode ser colhido como amostra.

Para os blocos ou pedras para lamber cujo peso unitário não exceda 1 kg, cada amostra elementar é composta pelo conteúdo de um bloco ou pedra.

9.3. Preparação das amostras globais

As amostras elementares devem ser misturadas para formar uma só amostra global.

9.4. Preparação das amostras finais

O material da amostra global deve ser misturado cuidadosamente ( 4 ):

— Introduzir cada amostra num recipiente apropriado. Tomar todas as precauções necessárias para evitar qualquer modificação da composição da amostra ou qualquer contaminação ou adulteração que possam ocorrer no decurso do transporte ou armazenagem.

— No caso de controlo de constituintes ou substâncias repartidos uniformemente nos alimentos para animais, a amostra global pode ser reduzida de forma representativa para, pelo menos, 2,0 kg ou 2,0 litros (amostra reduzida) ( 5 ) de preferência utilizando um divisor mecânico ou automático. Para controlar a presença de resíduos de pesticidas em leguminosas de grão, cereais em grão e frutos de casca rija, a dimensão mínima da amostra reduzida será de 3 kg. Se a natureza dos alimentos para animais não permitir a utilização de um divisor ou não estiver disponível um divisor, a amostra pode ser reduzida pelo método dos quartos. A partir das amostras reduzidas, podem ser preparadas as amostras finais (para efeitos de controlo, recurso e arbitragem), tendo aproximadamente a mesma quantidade e respeitando os requisitos quantitativos indicados no capítulo 7. No caso de controlo de constituintes, incluindo material geneticamente modificado, ou de substâncias suscetíveis de não estar repartidos uniformemente nas matérias-primas para alimentação animal, a amostra global deve ser: — completamente homogeneizada e depois dividida em amostras finais ou — o 619/2011, a amostra reduzida deve conter, pelo menos, 35 000 sementes/grãos para obter amostras finais destinadas ao controlo, recurso e arbitragem contendo, no mínimo, 10 000 sementes de cereais [ver nota de rodapé (**) no capítulo 6 e nota de rodapé (*) no capítulo 7]. reduzida para, pelo menos, 2 kg ou 2 litros ( 6 ), utilizando um divisor mecânico ou automático. Apenas quando a natureza dos alimentos para animais não permita a utilização de um divisor, pode a amostra, se necessário, ser reduzida pelo método dos quartos. Para controlar a presença de material geneticamente modificado no âmbito do Regulamento (UE) n.619/2011, a amostra reduzida deve conter, pelo menos, 35 000 sementes/grãos para obter amostras finais destinadas ao controlo, recurso e arbitragem contendo, no mínimo, 10 000 sementes de cereais [ver nota de rodapé (**) no capítulo 6 e nota de rodapé (*) no capítulo 7].

9.5. Acondicionamento das amostras

Os recipientes são selados e rotulados de forma a impedir a sua abertura sem danificação do selo. O rótulo deve estar totalmente incorporado no selo.

9.6. Envio das amostras para o laboratório

As amostras são enviadas sem atrasos desnecessários para o laboratório de análises designado, juntamente com a informação necessária para proceder à análise.

10. REGISTO DA AMOSTRAGEM

Tem de ser efetuado um registo de cada amostra, identificando claramente cada porção amostrada e respetiva dimensão.

O registo deve igualmente mencionar qualquer desvio do procedimento de amostragem previsto no presente regulamento.

Além de disponibilizado ao laboratório de controlo oficial, o registo deve ser facultado ao operador da empresa do setor de alimentos para animais e/ou ao laboratório designado pelo operador.









ANEXO II

DISPOSIÇÕES GERAIS RELATIVAS AOS MÉTODOS DE ANÁLISE DOS ALIMENTOS PARA ANIMAIS

A. PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS PARA ANÁLISE

1. Objeto

Os procedimentos descritos infra referem-se à preparação para análise das amostras enviadas aos laboratórios de controlo, após uma amostragem efetuada segundo o disposto no anexo I.

As amostras laboratoriais têm de ser preparadas de forma que as quantidades colhidas, como previsto nos métodos de análise, sejam homogéneas e representativas das amostras finais.

2. Precauções a tomar

O procedimento de preparação da amostra adotado depende dos métodos de análise a utilizar e dos constituintes ou substâncias a controlar. Importa, pois, garantir que o procedimento aplicado se adequa ao método de análise utilizado e aos constituintes ou substâncias a controlar.

Todas as operações têm de ser efetuadas de forma a evitar tanto quanto possível a contaminação da amostra ou a alteração da sua composição.

Todas as triturações, misturas e peneiramentos devem ser efetuados rapidamente, evitando ao máximo expor a amostra ao ar e à luz. Não se devem usar moinhos ou trituradores suscetíveis de aquecer demasiado a amostra.

Recomenda-se a trituração manual para os alimentos particularmente sensíveis ao calor. Deve ainda garantir-se que o equipamento não seja uma fonte de contaminação.

Caso a amostra não possa ser preparada sem uma variação significativa do seu teor em humidade, esse teor deve ser determinado antes e depois da preparação pelo método estabelecido na parte A do anexo III.

3. Procedimento

3.1. Procedimento geral

A alíquota de teste é colhida da amostra final. Não se recomenda o uso do método dos quartos, dado que pode dar origem a alíquotas de teste com uma elevada margem de erro de divisão.

3.1.1. Alimentos que podem ser moídos tal como se encontram

— Misturar a amostra final peneirada e recolhê-la para um recipiente adequado, limpo, seco e com fecho hermético. Misturar de novo a fim de garantir uma homogeneização completa, imediatamente antes de colher a quantidade para análise (alíquota de teste).

3.1.2. Alimentos que podem ser moídos após secagem

— Salvo indicação específica em contrário nos métodos de análise, secar a amostra final de maneira a baixar o seu teor de humidade para 8 % a 12 %, utilizando o processo de secagem indicado no ponto 4.3 do método de determinação do teor de humidade referido na parte A do anexo III. Proceder, em seguida, como indicado no ponto 3.1.1.

3.1.3. Alimentos líquidos ou semilíquidos

— Recolher a amostra final para um recipiente adequado, limpo, seco e com fecho hermético. Misturar cuidadosamente a fim de garantir uma homogeneização completa, imediatamente antes de colher a quantidade para análise (alíquota de teste).

3.1.4. Outros alimentos

— Caso a amostra final não possa ser preparada por qualquer dos processos acima indicados, utilizar outro processo de preparação apropriado que garanta que as quantidades colhidas para análise (alíquota de teste) são homogéneas e representativas das amostras finais.

3.2. Procedimento específico em caso de análise por inspeção visual ou por microscopia ou quando toda a amostra global esteja homogeneizada

— Em caso de exame por inspeção visual (sem utilizar um microscópio), toda a amostra laboratorial é utilizada para exame.

— Em caso de exame microscópico, o laboratório pode reduzir a amostra global ou reduzir mais ainda a amostra reduzida. As amostras finais para efeitos de recurso e, eventualmente, de arbitragem, são colhidas segundo um procedimento equivalente ao procedimento adotado para obter a amostra final para efeitos de controlo da aplicação.

— Caso toda a amostra global esteja homogeneizada, as amostras finais são colhidas da amostra global homogeneizada.

4. Armazenamento das amostras

Conservar as amostras a uma temperatura que não altere a sua composição. As amostras destinadas a análise de vitaminas ou substâncias particularmente sensíveis à luz devem ser armazenadas em condições que impeçam que a amostra seja adversamente afetada pela luz.

B. DISPOSIÇÕES RELATIVAS AOS REAGENTES E EQUIPAMENTOS REQUERIDOS PELOS MÉTODOS DE ANÁLISE

1. Salvo indicação específica em contrário nos métodos de análise, todos os reagentes analíticos devem ter grau de pureza «para análise» (p.a.). Para a análise de vestígios, a pureza dos reagentes tem ser controlada mediante um ensaio em branco. Consoante o resultado obtido, poderá ou não vir a ser necessária a sua purificação suplementar.

2. Todas as operações de preparação de soluções, diluição e lavagem mencionadas nos métodos de análise sem indicações quanto à natureza do solvente ou diluente a utilizar significam que deverá ser utilizada água. Regra geral, a água deve ser desmineralizada ou destilada. Em certos casos, indicados nos métodos de análise, essa água tem de ser submetida a processos de purificação específicos.

3. Atendendo ao equipamento corrente normalmente presente nos laboratórios de controlo, o método de análise indica apenas o material especial ou os instrumentos e aparelhos que devam responder a determinadas condições. Esse material tem de estar bem limpo, em especial quando têm de ser determinadas quantidades ínfimas de substâncias.

C. APLICAÇÃO DOS MÉTODOS DE ANÁLISE E EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

1. Procedimento de extração

Vários métodos determinam um procedimento de extração específico. Regra geral, podem ser usados procedimentos de extração diferentes do indicado no método de análise, desde que o procedimento usado tenha dado provas de que proporciona, para a matriz em causa, a mesma eficiência de extração que o procedimento mencionado no método de análise.

2. Procedimento de purificação

Vários métodos determinam um procedimento de purificação específico. Regra geral, podem ser usados procedimentos de purificação diferentes do indicado no método de análise, desde que o procedimento usado tenha dado provas de que proporciona, para a matriz em causa, resultados analíticos equivalentes aos do procedimento mencionado no método de análise.

3. Número de determinações

No caso de análise de substâncias indesejáveis, se o resultado da primeira determinação for significativamente (> 50 %) inferior à especificação a controlar, não são necessárias determinações adicionais, desde que se tenham aplicado os procedimentos de qualidade adequados. Nos outros casos, é necessário um ensaio em duplicado (segunda determinação) para se excluir a possibilidade de contaminação cruzada interna ou de uma troca acidental de amostras. Para verificar a conformidade é utilizada a média das duas determinações, tendo em conta a incerteza de medição.

Nos casos em que o controlo incide sobre o teor declarado de uma substância ou ingrediente, se o resultado da primeira determinação confirmar o teor declarado, ou seja, se o resultado analítico se situar dentro da gama de variação aceitável desse teor, não são necessárias mais determinações, desde que se tenham aplicado os procedimentos de qualidade adequados. Nos outros casos, é necessário um ensaio em duplicado (segunda determinação) para se excluir a possibilidade de contaminação cruzada interna ou de uma troca acidental de amostras. Para verificar a conformidade, é utilizada a média das duas determinações, tendo em conta a incerteza de medição.

Em certos casos, a gama de variação aceitável encontra-se estabelecida na legislação, nomeadamente no Regulamento (CE) n.o 767/2009 do Parlamento Europeu e do Conselho, de 13 de julho de 2009, relativo à colocação no mercado e à utilização de alimentos para animais, que altera o Regulamento (CE) n.o 1831/2003 do Conselho e revoga as Diretivas 79/373/CEE do Conselho, 80/511/CEE da Comissão, 82/471/CEE do Conselho, 83/228/CEE do Conselho, 93/74/CEE do Conselho, 93/113/CE do Conselho e 96/25/CE do Conselho e a Decisão 2004/217/CE da Comissão ( 7 ).

4. Notificação do método de análise utilizado

O relatório de análise deve mencionar o método de análise utilizado.

5. Notificação do resultado analítico

O resultado analítico, que deve ser expresso em conformidade com as indicações dadas no método de análise e conter o devido número de algarismos significativos, pode, caso necessário, ser corrigido em função do teor de humidade apresentado pela amostra final antes da sua preparação para análise.

6. Incerteza de medição e taxa de recuperação no caso da análise de substâncias indesejáveis

No que diz respeito às substâncias indesejáveis na aceção da Diretiva 2002/32/CE, um produto destinado à alimentação animal é considerado não conforme com o limite máximo fixado se se considerar que o resultado analítico, relativo a um alimento com um teor de humidade de 12 %, ultrapassará o limite máximo tendo em conta a incerteza expandida de medição e a correção em função da recuperação. Para avaliar a conformidade, usa-se a concentração analisada, corrigida em função da recuperação, e subtrai-se a incerteza expandida de medição. Este procedimento só é aplicável nos casos em que o método de análise permita estimar a incerteza da medição e a correção em função da recuperação (por exemplo, não é possível no caso da análise microscópica).

O resultado analítico será apresentado do seguinte modo (na medida em que o método de análise utilizado permita estimar a incerteza de medição e a taxa de recuperação):

a) Corrigido em função da recuperação, indicando o nível de recuperação. Se a taxa de recuperação se situar entre 90 % e 110 % não é necessário efetuar a correção;

b) Como «x +/– U», em que x é o resultado analítico e U é a incerteza expandida de medição, utilizando um fator de expansão de 2, que permite obter um nível de confiança de cerca de 95 %.

Todavia, se o resultado da análise for significativamente (> 50 %) inferior à especificação a controlar e se a análise se destinar exclusivamente a verificar a observância das disposições legislativas, desde que se tenham aplicado os procedimentos de qualidade adequados, o resultado analítico pode ser notificado sem correção em função da recuperação e, nestes casos, não é necessário transmitir os valores da taxa de recuperação nem da incerteza de medição.

▼B









ANEXO III

MÉTODOS DE ANÁLISE PARA O CONTROLO DA COMPOSIÇÃO DAS MATÉRIAS-PRIMAS PARA A ALIMENTAÇÃO ANIMAL E DOS ALIMENTOS COMPOSTOS PARA ANIMAIS

A. DETERMINAÇÃO DA HUMIDADE

1. Objecto e âmbito de aplicação

Este método permite determinar o teor de humidade dos alimentos para animais. Se os alimentos contiverem substâncias voláteis, como por exemplo ácidos orgânicos, deve ter-se em conta que, a par do teor de humidade, também se mede uma quantidade significativa de substâncias voláteis.

O método não abrange a análise dos produtos lácteos enquanto matérias-primas para a alimentação animal, a análise das substâncias minerais e das misturas essencialmente compostas de substâncias minerais, a análise das gorduras e óleos animais e vegetais nem a análise das sementes e frutos oleaginosos.

2. Princípio

A amostra é dessecada em condições definidas que variam em função da natureza do alimento. A perda de massa é determinada por pesagem. É necessário proceder a uma pré-dessecação sempre que se trate de alimentos sólidos com um elevado teor de humidade.

3. Equipamento

3.1. Triturador construído num material que não absorva a humidade, fácil de limpar e que permita uma trituração rápida e uniforme sem provocar aquecimento sensível, que evite o mais possível o contacto com o ar exterior, e que satisfaça as exigências indicadas nos pontos 4.1.1 e 4.1.2 (por exemplo, microtrituradores de martelos ou com arrefecimento por água, moinhos de cones desmontáveis, trituradores de movimento lento ou de discos dentados).

3.2. Balança analítica com uma sensibilidade de 0,1 miligrama.

3.3. Recipientes secos de metal inoxidável ou de vidro, munidos de uma tampa hermética; superfície útil que permita obter uma repartição da amostra da ordem dos 0,3 g/cm2.

3.4. Estufa isotérmica (± 2 oC) de aquecimento eléctrico, com uma regulação rápida da temperatura e convenientemente ventilada ( 8 ).

3.5. Estufa de vácuo, com aquecimento eléctrico regulável, munida de uma bomba de óleo e quer de um dispositivo de introdução de ar quente seco, quer de um agente desidratante (por ex., óxido de cálcio).

3.6. Exsicador com placa de metal ou de porcelana espessa, perfurada, contendo um agente desidratante eficaz.

4. Procedimento

N.B. : As operações descritas nesta secção devem ser efectuadas imediatamente após a abertura das embalagens que contêm as amostras. As análises devem ser efectuadas pelo menos em duplicado.

4.1. Preparação

4.1.1. Alimentos com excepção dos mencionados nos pontos 4.1.2 e 4.1.3

Tomar pelo menos 50 g da amostra. Se for necessário, triturar ou dividir de maneira apropriada para evitar qualquer variação do teor de humidade (ver ponto 6).

4.1.2. Cereais e sêmolas grossas

Tomar pelo menos 50 g da amostra. Moer em partículas, das quais pelo menos 50 % passem por uma peneira de malhas de 0,5 mm e não deixem mais de 10 % de resíduos sobre outro crivo de malhas redondas de 1 mm.

4.1.3. Alimentos líquidos ou pastosos, alimentos constituídos essencialmente de matérias gordas

Tomar e pesar, com uma aproximação de 10 mg, cerca de 25 g da amostra, adicionar-lhe uma quantidade apropriada de areia anidra, com uma aproximação de 10 mg, misturar até à obtenção de um produto homogéneo.

4.2. Dessecação

4.2.1. Alimentos com excepção dos mencionados nos pontos 4.2.2 e 4.2.3

Tarar, com uma aproximação de 1 mg, um recipiente (3.3) com a tampa. Pesar dentro dele, com uma aproximação de 1 mg, cerca de 5 g da amostra repartindo-a uniformemente. Colocar o recipiente destapado na estufa previamente aquecida a 103 oC. Introduzir o recipiente o mais rapidamente possível, para evitar que a temperatura da estufa desça demasiado. Deixar secar durante quatro horas, a partir do momento em que a estufa tiver atingido de novo a temperatura de 103 oC. Colocar a tampa no recipiente, retirar este da estufa, deixar arrefecer 30 a 45 minutos no exsicador (3.6) e pesar com uma aproximação de 1 mg.

No caso de alimentos constituídos essencialmente de matérias gordas, efectuar uma dessecação suplementar de 30 minutos na estufa a 130 oC. A diferença entre as duas pesagens não deve exceder o valor correspondente a 0,1 % de humidade.

4.2.2. Cereais, farinhas, sêmolas grossas e finas

Tarar, com uma aproximação de 0,5 mg, um recipiente (3.3) com a tampa. Pesar dentro dele, com uma aproximação de 1 mg, cerca de 5 g da amostra triturada, repartindo-a uniformemente. Colocar o recipiente destapado na estufa previamente aquecida a 130 oC. Introduzir o recipiente o mais rapidamente possível, para evitar que a temperatura da estufa desça demasiado. Deixar secar durante duas horas, a partir do momento em que a estufa tiver atingido de novo a temperatura de 130 oC. Colocar a tampa no recipiente, retirar este da estufa, deixar arrefecer 30 a 45 minutos no exsicador (3.6) e pesar com uma aproximação de 1 mg.

4.2.3. Alimentos compostos contendo mais de 4 % de sacarose ou de lactose: matérias-primas para a alimentação animal tais como alfarroba, produtos cereais hidrolisados, germes de malte, rodelas de beterraba, solúveis de peixe e açúcares; alimentos compostos com mais de 25 % de sais minerais contendo água de cristalização

Tarar, com uma aproximação de 0,5 mg, um recipiente (3.3) com a tampa. Pesar dentro dele, com uma aproximação de 1 mg, cerca de 5 g da amostra repartindo-a uniformemente. Colocar o recipiente destapado na estufa de vácuo (3.5) previamente aquecida a uma temperatura entre 80 e 85 oC. Introduzir o recipiente o mais rapidamente possível, para evitar que a temperatura da estufa desça demasiado.

Elevar a pressão a 100 Torr e deixar secar a esta pressão durante quatro horas, quer sob uma corrente de ar seco e quente, quer por meio de um agente desidratante (cerca de 300 g para 20 amostras). Neste último caso, desligar a bomba de vácuo quando a pressão indicada tiver sido atingida. Contar o tempo de secagem a partir do momento em que a estufa tiver atingido de novo a temperatura de 80 a 85 oC. Reduzir cuidadosamente a pressão no interior da estufa até à pressão atmosférica. Abrir a estufa, tapar imediatamente o recipiente, retirá-lo da estufa, deixar arrefecer durante 30 a 45 minutos no exsicador (3.6) e pesar com uma aproximação de 1 mg. Proceder a uma dessecação complementar de 30 minutos na estufa de vácuo a uma temperatura entre 80 e 85 oC e pesar novamente. A diferença entre as duas pesagens não deve exceder o valor correspondente a 0,1 % de humidade.

4.3. Pré-dessecação

4.3.1. Alimentos, com excepção dos mencionados no ponto 4.3.2

Os alimentos sólidos cujo teor de humidade é elevado e torna a trituração difícil devem ser pré-dessecados como se segue:

Pesar, com uma aproximação de 10 mg, 50 g de amostra não triturada (pode efectuar-se uma divisão grosseira, se necessário, no caso dos alimentos comprimidos ou aglomerados) num recipiente apropriado (por exemplo, numa placa de alumínio de 20 × 12 cm com um bordo de 0,5 cm). Deixar secar numa estufa a uma temperatura entre 60 e 70 oC até que o teor de humidade seja reduzido para um valor entre 8 e 12 %. Retirar da estufa, deixar arrefecer a descoberto no laboratório durante uma hora e pesar com uma aproximação de 10 mg. Triturar imediatamente, como indicado no ponto 4.1.1 e efectuar a dessecação como indicado nos pontos 4.2.1 ou 4.2.3 segundo a natureza do alimento.

4.3.2. Cereais

Os grãos com uma taxa de humidade superior a 17 % devem ser pré-dessecados como se segue:

Pesar, com uma aproximação de 10 mg, 50 g de grãos não moídos num recipiente apropriado (por exemplo, numa placa de alumínio de 20 × 12 cm com bordo de 0,5 cm). Deixar secar numa estufa durante 5 a 7 minutos, à temperatura de 130 oC. Retirar da estufa, deixar arrefecer a descoberto no laboratório durante duas horas e pesar, com uma aproximação de 10 mg. Moer imediatamente, como indicado no ponto 4.1.2 e efectuar a dessecação, como indicado no ponto 4.2.2.

5. Cálculo dos resultados

O teor de humidade (X), em percentagem da amostra, é dado pelas seguintes fórmulas:

5.1. Dessecação sem pré-dessecação

em que:

m = massa inicial da amostra, em gramas,

m0 = massa da amostra seca, em gramas.

5.2. Dessecação com pré-dessecação

em que:

m = massa inicial da amostra, em gramas,

m1 = massa da amostra, depois da pré-dessecação, em gramas,

m2 = massa da amostra depois da trituração ou moagem, em gramas,

m0 = massa da amostra seca, em gramas.

5.3. Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder 0,2 % do valor absoluto da humidade.

6. Observações

Se for necessária uma trituração e dela resultar uma variação do teor de humidade do produto, os resultados da análise que dizem respeito aos componentes do alimento devem ser corrigidos de acordo com o teor de humidade da amostra inicial.

B. DETERMINAÇÃO DA HUMIDADE NAS MATÉRIAS GORDAS ANIMAIS E VEGETAIS

1. Objecto e âmbito de aplicação

O método permite determinar o teor em humidade (água e outras matérias voláteis) das gorduras e dos óleos animais e vegetais.

2. Princípio

A amostra é seca a 103 oC até peso constante (a perda de peso entre duas pesagens sucessivas deve ser inferior a 1 mg). A perda de peso é determinada por pesagem.

3. Equipamento

3.1. Cápsula de fundo plano, em material resistente à corrosão, diâmetro: 8 a 9 cm, altura: cerca de 3 cm.

3.2. Termómetro com globo reforçado e câmara de dilatação na extremidade superior, graduado de cerca de 80 oC a pelo menos 110 oC, comprimento: cerca de 10 cm.

3.3. Banho de areia ou placa de aquecimento eléctrica.

3.4. Exsicador, contendo um agente desidratante eficaz.

3.5. Balança analítica.

4. Procedimento

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, cerca de 20 g da amostra homogeneizada na cápsula (3.1) seca e com tara calculada, contendo o termómetro (3.2). Aquecer em banho de areia ou placa de aquecimento (3.3), agitando constantemente com a ajuda do termómetro, de modo a que a temperatura atinja 90 oC em cerca de 7 minutos.

Reduzir a intensidade do aquecimento, atendendo à frequência com que as bolhas sobem do fundo do recipiente. A temperatura não deverá ultrapassar 105 oC. Continuar a agitar, raspando o fundo da cápsula até que cesse a formação de bolhas.

A fim de assegurar a eliminação total da humidade, repetir várias vezes o aquecimento a 103 oC ± 2oC, arrefecendo até 93 oC entre aquecimentos sucessivos. Em seguida deixar arrefecer no exsicador (3.4) até que atinja a temperatura ambiente e pesar. Repetir esta operação até que a perda de massa entre duas pesagens sucessivas não exceda 2 mg.

N.B. : Um aumento de massa da amostra após aquecimento repetido indica uma oxidação da gordura. Neste caso, calcular o resultado a partir da pesagem efectuada imediatamente antes do começo do aumento de massa.

5. Cálculo dos resultados

O teor de humidade (X) em percentagem da amostra é dado pela fórmula:

em que:

m = massa da amostra em ensaio, em gramas,

m1 = massa da cápsula com o respectivo conteúdo, antes do aquecimento, em gramas,

m2 = massa da cápsula com o respectivo conteúdo, após aquecimento, em gramas.

Os resultados inferiores a 0,05 % devem ser registados com a referência «inferior a 0,05 %».

Repetibilidade

A diferença entre os resultados obtidos em duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder 0,05 % em valor absoluto.

C. DETERMINAÇÃO DO TEOR DE PROTEÍNA BRUTA

1. Objecto e âmbito de aplicação

O presente método permite determinar o teor de proteína bruta dos alimentos para animais com base no teor de azoto, determinado pelo método de Kjeldahl.

2. Princípio

A amostra é mineralizada com ácido sulfúrico, na presença de um catalisador. A solução ácida é alcalinizada por adição de uma solução de hidróxido de sódio. O amoníaco é destilado e recolhido numa quantidade determinada de ácido sulfúrico, cujo excesso é titulado com uma solução-padrão de hidróxido de sódio.

Alternativamente, o amoníaco libertado é destilado numa solução de ácido bórico em excesso, seguido de titulação com uma solução de ácido clorídrico ou sulfúrico.

3. Reagentes

3.1. Sulfato de potássio.

3.2. Catalisador: óxido de cobre (II) CuO ou sulfato de cobre (II) penta-hidratado CuSO4 · 5H2O.

3.3. Zinco granulado.

3.4. Ácido sulfúrico, ρ20 = 1,84 g/ml.

3.5. Ácido sulfúrico, solução volumétrica padrão, c(H2SO4) = 0,25 mol/l.

3.6. Ácido sulfúrico, solução volumétrica padrão, c(H2SO4) = 0,10 mol/l.

3.7. Ácido sulfúrico, solução volumétrica padrão, c(H2SO4) = 0,05 mol/l.

3.8. Indicador vermelho de metilo; dissolver 300 mg de vermelho de metilo em 100 ml de etanol, σ = 95-96 % (v/v).

3.9. Solução de hidróxido de sódio (pode utilizar-se uma solução de pureza técnica), β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %).

3.10. Hidróxido de sódio, solução volumétrica padrão, c(NaOH) = 0,25 mol/l.

3.11. Hidróxido de sódio, solução volumétrica padrão, c(NaOH) = 0,10 mol/l.

3.12. Pedra-pomes granulada, lavada em ácido clorídrico e inflamada.

3.13. Acetanilida (p.f.=114 oC, teor de N = 10,36 %).

3.14. Sacarose (isenta de azoto).

3.15. Ácido bórico (H3BO3).

3.16. Solução de indicador vermelho de metilo: dissolver 100 mg de vermelho de metilo em 100 ml de etanol ou metanol.

3.17. Solução de verde de bromocresol: dissolver 100 mg de verde de bromocresol em 100 ml de etanol ou metanol.

3.18. Solução de ácido bórico (10 g/l a 40 g/l, em função do equipamento utilizado).

Se se aplicar a detecção colorimétrica do ponto final, deve adicionar-se os indicadores vermelho de metilo e bromocresol às soluções de ácido bórico. Se se preparar um litro de solução de ácido bórico, adicionam-se, antes de ajustar o volume, 7 ml de solução de indicador vermelho de metilo (3.16) e 10 ml de solução de verde de bromocresol (3.17).

O pH das soluções de ácido bórico preparadas pode diferir em função da água usada. Por vezes, é necessário efectuar um ajuste com um pequeno volume de uma solução alcalina a fim de obter um resultado positivo no ensaio em branco.

Nota: Com a adição de cerca de 3 a 4 ml de NaOH (3.11) a um litro de ácido bórico 10 g/l consegue-se normalmente um bom ajuste. A solução deve ser armazenada à temperatura ambiente e ao abrigo da luz e de fontes de vapores de amoníaco.

3.19. Ácido clorídrico, solução volumétrica padrão, c(HCl) = 0,10 mol/l.

Nota: Podem usar-se outras concentrações das soluções volumétricas (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11, e 3.19) desde que se efectue a respectiva correcção no cálculo dos resultados. As concentrações devem sempre ser expressas com quatro casas decimais.

4. Equipamento

Equipamento adequado para efectuar a mineralização, a destilação e a titulação pelo método de Kjeldahl.

5. Procedimento

5.1. Mineralização

Pesar, com uma aproximação de 0,001 g, 1 g de amostra e transferi-la para o recipiente do aparelho de mineralização. Adicionar 15 g de sulfato de potássio (3.1), uma quantidade adequada de catalisador (3.2) [0,3 a 0,4 g de óxido de cobre (II) ou 0,9 a 1,2 g de sulfato de cobre (II) penta-hidratado], 25 ml de ácido sulfúrico (3.4) e, se necessário, alguns grânulos de pedra-pomes (3.12), misturando.

Começar por aquecer moderadamente a mistura, agitando ocasionalmente se necessário, até à carbonização completa da massa e o desaparecimento da espuma. Aquecer seguidamente de um modo mais vigoroso até à ebulição; o aquecimento é adequado quando se observar a condensação do ácido nas paredes do recipiente. Evitar o sobreaquecimento lateral e a adesão de partículas orgânicas às paredes.

Quando a solução ficar límpida e assumir um tom verde claro, continuar a ebulição durante mais duas horas, arrefecendo de seguida.

5.2. Destilação

Adicionar cuidadosamente uma quantidade de água adequada para a dissolução completa dos sulfatos. Deixar arrefecer e adicionar, se necessário, alguns grânulos de zinco (3.3). Proceder de acordo com o disposto nos pontos 5.2.1 ou 5.2.2.

5.2.1. Destilação com recolha em ácido sulfúrico

Colocar no balão de recolha do dispositivo de destilação 25 ml, rigorosamente medidos, de ácido sulfúrico (3.5) ou (3.7), em função do teor presumido de azoto. Adicionar algumas gotas de vermelho de metilo (3.8).

Adaptar o recipiente de mineralização ao refrigerante do dispositivo de destilação, imergindo a extremidade do refrigerante no líquido contido no balão de recolha, até uma profundidade mínima de 1 cm (ver a observação 8.3). Juntar cuidadosamente 100 ml de solução de hidróxido de sódio (3.9) ao recipiente de mineralização, evitando perdas de amoníaco (ver a observação 8.1). Aquecer o recipiente até à destilação completa do amoníaco.

5.2.2. Destilação com recolha em ácido bórico

Sempre que a titulação do teor de amoníaco no destilado for realizada manualmente, aplica-se o procedimento mencionado a seguir. Se a unidade de destilação for totalmente automatizada e incluir a titulação do teor de amoníaco no destilado, seguir as instruções do fabricante.

Colocar um balão de recolha com 25 a 30 ml da solução de ácido bórico (3.18) sob a saída do refrigerante de forma que o tubo de saída se situe sob a superfície da solução de ácido bórico em excesso. Regular a unidade de destilação de forma a adicionar 50 ml da solução de hidróxido de sódio (3.9). Colocar a unidade de destilação em funcionamento de acordo com as instruções do fabricante e destilar o amoníaco libertado com a adição da solução de hidróxido de sódio. Recolher o destilado na solução de ácido bórico. A quantidade de destilado (duração da destilação por arrastamento de vapor) depende da quantidade de azoto na amostra. Seguir as instruções do fabricante.

Nota : Numa unidade de destilação semiautomática, a adição de hidróxido de sódio em excesso e a destilação por arrastamento de vapor são realizadas automaticamente.

5.3. Titulação

Proceder de acordo com o disposto nos pontos 5.3.1 ou 5.3.2.

5.3.1. Ácido sulfúrico

Titular o excesso de ácido sulfúrico existente no balão de recolha com a solução de hidróxido de sódio (3.10) ou (3.11), em função da concentração de ácido sulfúrico utilizada, até atingir o ponto final.

5.3.2. Ácido bórico

Com o auxílio de uma bureta, titular o conteúdo do balão de recolha com a solução volumétrica padrão de ácido clorídrico (3.19) ou com a solução volumétrica padrão de ácido sulfúrico (3.6) e registar o volume de solução titulante usada.

Se se aplicar a detecção colorimétrica do ponto final, este é atingido assim que a solução começa a mudar de cor para rosa. A leitura da bureta é feita com uma aproximação de 0,05 ml. A visualização do ponto final pode ser facilitada pelo uso de uma placa de agitação magnética dotada de iluminação ou de um detector fotométrico.

Esta operação pode ser feita automaticamente se se usar um dispositivo de destilação por arrastamento de vapor com titulação automática.

Para o funcionamento do destilador ou destilador/titulador, seguir as instruções do fabricante.

Nota: Quando se usa um sistema de titulação automática, a titulação começa assim que se dá início à destilação e usa-se a solução de ácido bórico a 1 % (3.18). Se se recorrer a uma unidade de destilação totalmente automatizada, a titulação do amoníaco também se pode fazer com a detecção do ponto final através de um sistema potenciométrico de medição do pH. Neste caso, usa-se um titulador automático com um medidor de pH. O medidor de pH deve estar devidamente calibrado no intervalo de pH 4 a 7, segundo procedimentos laboratoriais normais. O ponto final da titulação é atingido a um pH de 4,6 , correspondente ao ponto de inflexão da curva de titulação (ponto de maior declive).

5.4. Ensaio em branco

Com vista a confirmar a ausência de azoto nos reagentes, efectuar um ensaio em branco (mineralização, destilação e titulação) utilizando 1 g de sacarose (3.14) em vez da amostra.

6. Cálculo dos resultados

Os cálculos efectuam-se em conformidade com o referido nos pontos 6.1 ou 6.2.

6.1. Cálculo para a titulação efectuada segundo o método exposto em 5.3.1

O teor de proteína bruta, expresso em percentagem em massa, é dado pela fórmula seguinte:

em que:

V0 = Volume, expresso em ml, de NaOH (3.10 ou 3.11) utilizado no ensaio em branco.

V1 = Volume, expresso em ml, de NaOH (3.10 ou 3.11) utilizado na titulação da amostra.

c = Concentração, expressa em mol/l, da solução de hidróxido de sódio (3.10 ou 3.11).

m = Massa da amostra, expressa em gramas.

6.2. Cálculo para a titulação efectuada segundo o método exposto em 5.3.2

6.2.1. Titulação com ácido clorídrico

O teor de proteína bruta, expresso em percentagem em massa, é dado pela fórmula seguinte:

em que:

m = Massa da amostra, expressa em gramas.

c = Concentração, expressa em mol/l, da solução volumétrica padrão de ácido clorídrico (3.19).

V0 = Volume, em ml, de ácido clorídrico utilizado no ensaio em branco.

V1 = Volume, em ml, de ácido clorídrico utilizado na titulação da amostra.

6.2.2. Titulação com ácido sulfúrico

O teor de proteína bruta, expresso em percentagem em massa, é dado pela fórmula seguinte:

em que:

m = Massa da amostra, expressa em gramas.

c = Concentração, expressa em mol/l, da solução volumétrica padrão de ácido sulfúrico (3.6).

V0 = Volume, em ml, de ácido sulfúrico (3.6) utilizado no ensaio em branco.

V1 = Volume, em ml, de ácido sulfúrico (3.6) utilizado na titulação da amostra.

7. Verificação do método

7.1. Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder:

— 0,2 %, em valor absoluto, para teores de proteína bruta inferiores a 20 %,

— 1,0 % do maior dos valores, para teores de proteína bruta compreendidos entre 20 % e 40 %,

— 0,4 %, em valor absoluto, para teores superiores a 40 %.

7.2. Exactidão

Efectuar a análise (mineralização, destilação e titulação) de 1,5 a 2,0 g de acetanilida (3.13), na presença de 1 g de sacarose (3.14); 1 g de acetanilida deverá consumir 14,80 ml de ácido sulfúrico (3.5). A taxa de recuperação deve ser de, pelo menos, 99 %.

8. Observações

8.1. O equipamento utilizado pode ser de tipo manual, semiautomático ou automático. Se for necessário efectuar uma operação de transferência entre os processos de mineralização e destilação, não deverão observar-se perdas. Se o recipiente do dispositivo de destilação não se encontrar munido de uma ampola de carga, adicionar o hidróxido de sódio imediatamente antes de adaptar o recipiente ao refrigerante, vertendo o líquido cuidadosamente ao longo das paredes.

8.2. Se o resíduo da mineralização solidificar, recomeçar o processo, utilizando um volume de ácido sulfúrico (3.4) superior ao especificado.

8.3. No caso de produtos com baixo teor de azoto, o volume de ácido sulfúrico (3.7) a adicionar ao balão de recolha pode ser reduzido, se necessário, para 10 ou 15 ml e diluído para 25 ml com água.

8.4. Em análises de rotina, pode recorrer-se a métodos alternativos para a determinação da proteína bruta, mas o método Kjeldahl descrito na presente parte C é o método de referência. Deve demonstrar-se, para cada matriz individualmente, a equivalência dos resultados obtidos com o método alternativo (por exemplo, DUMAS) em comparação com o método de referência. Dado que os resultados obtidos com métodos alternativos, mesmo depois de verificada a sua equivalência, podem apresentar um pequeno desvio em relação aos resultados derivados do método de referência, é necessário mencionar no relatório analítico o método de análise usado na determinação da proteína bruta.

D. DETERMINAÇÃO DA UREIA

1. Objecto e âmbito de aplicação

Esta técnica permite determinar o teor de ureia em alimentos para animais.

2. Princípio

Suspende-se a amostra em água juntamente com um agente clarificante e filtra-se. Determina-se o teor de ureia do filtrado, após a adição de 4-dimetilaminobenzaldeído (4-DMAB), medindo a densidade óptica a um comprimento de onda de 420 nm.

3. Reagentes

3.1. Solução de 4-dimetilaminobenzaldeído: dissolver 1,6 g de 4-DMAB em 100 ml de etanol a 96 % e juntar 10 ml de ácido clorídrico (ρ20: 1,19 g/ml). O tempo de conservação máximo deste reagente é de duas semanas.

3.2. Solução de Carrez I: dissolver em água 21,9 g de acetato de zinco, Zn(CH3COO)2 · 2H2O, e 3 g de ácido acético glacial. Perfazer o volume de 100 ml com água.

3.3. Solução de Carrez II: dissolver em água 10,6 g de ferrocianeto de potássio K4Fe(CN)6 · 3H2O. Perfazer o volume de 100 ml com água.

3.4. Carvão activado, não absorvente da ureia (a verificar).

3.5. Solução de ureia a 0,1 % (m/v).

4. Equipamento

4.1. Misturador (agitador): cerca de 35 a 40 rotações por minuto.

4.2. Tubos de ensaio: 160 × 16 mm, com tampa esmerilada.

4.3. Espectrofotómetro.

5. Procedimento

5.1. Análise da amostra

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, 2 g de amostra, introduzi-la com 1 g de carvão activado (3.4) num balão volumétrico de 500 ml. Juntar 400 ml de água e 5 ml de solução de Carrez I (3.2), agitar durante cerca de 30 segundos e juntar em seguida 5 ml de solução de Carrez II (3.3). Misturar durante 30 minutos no misturador. Completar o volume com água, agitar e filtrar.

Recolher 5 ml de filtrado límpido e incolor e transferi-los para os tubos de ensaio de tampa esmerilada, juntar 5 ml de solução de 4-DMAB (3.1) e misturar. Colocar os tubos em banho-maria a 20 oC (± 4 oC). Decorridos 15 minutos, medir a densidade óptica da solução de amostra, com o espectrofotómetro a 420 nm. Comparar com a solução de reagentes feita no ensaio em branco.

5.2. Curva de calibração

Recolher volumes de 1, 2, 4, 5 e 10 ml de solução de ureia (3.5), introduzi-los em balões volumétricos de 100 ml, completando os volumes com água. De cada um dos balões, retirar 5 ml de solução e juntar 5 ml de solução de 4-DMAB, homogeneizar e medir a densidade óptica, como referido, por comparação com uma solução de referência com 5 ml de 4-DMAB e 5 ml de água, isenta de ureia. Traçar a curva de calibração.

6. Cálculo dos resultados

A partir da curva de calibração, determinar a quantidade de ureia na amostra.

Exprimir o resultado em percentagem da amostra.

7. Observações

7.1. Para teores de ureia superiores a 3 %, reduzir a amostra de ensaio para 1 g, ou diluir a solução inicial, para que o teor de ureia por cada 500 ml não seja superior a 50 mg.

7.2. Para teores de ureia pouco elevados, aumentar o peso da amostra de ensaio, sem deixar no entanto que a quantidade de amostra para análise impeça o filtrado de ficar límpido e incolor.

7.3. Se a amostra contiver compostos azotados simples, tais como aminoácidos, é aconselhável efectuar a medição da densidade óptica ao comprimento de onda de 435 nm.

E. DETERMINAÇÃO DAS BASES AZOTADAS VOLÁTEIS

I. POR MICRODIFUSÃO

1. Objecto e âmbito de aplicação

O método permite determinar o teor de bases azotadas voláteis, expressas em amoníaco, dos alimentos para animais.

2. Princípio

A amostra é extraída com água, a solução é clarificada e filtrada. As bases azotadas voláteis são separadas por microdifusão com uma solução de carbonato de potássio, recolhidas numa solução de ácido bórico e tituladas com ácido sulfúrico.

3. Reagentes

3.1. Ácido tricloroacético, solução a 20 % (m/v).

3.2. Indicador: dissolver 33 mg de verde de bromocresol e 65 mg de vermelho de metilo em 100 ml de etanol a 95-96 % (v/v).

3.3. Solução de ácido bórico: num balão volumétrico de 1 litro, dissolver 10 g de ácido bórico em 200 ml de etanol a 95-96 % (v/v) e 700 ml de água. Juntar 10 ml de indicador (3.2). Misturar e, se necessário, ajustar a coloração da solução a vermelho claro, por adição de uma solução de hidróxido de sódio. 1 ml desta solução permite fixar, no máximo, 300 μg de NH3.

3.4. Solução saturada de carbonato de potássio: dissolver 100 g de carbonato de potássio em 100 ml de água em ebulição. Deixar arrefecer e filtrar.

3.5. Ácido sulfúrico 0,01 mol/l.

4. Equipamento

4.1. Misturador basculante: cerca de 35 a 40 rotações por minuto.

4.2. Células de Conway (v. esquema) de vidro ou matéria plástica.

4.3. Microburetas, com graduação de 1/100 ml.

5. Procedimento

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, 10 g de amostra e introduzir num balão volumétrico de 200 ml com 100 ml de água. Misturar ou agitar durante 30 minutos no misturador basculante. Adicionar 50 ml de solução de ácido tricloroacético (3.1), completar o volume com água, agitar vigorosamente e filtrar num filtro de pregas.

Introduzir com a pipeta, na parte central da célula de Conway, 1 ml de solução de ácido bórico (3.3) e, na parte periférica, 1 ml do filtrado da amostra. Cobrir parcialmente com a tampa com silicone. Introduzir rapidamente na parte periférica 1 ml de solução saturada de carbonato de potássio (3.4) e fechar hermeticamente a tampa. Agitar suavemente a célula dando-lhe um movimento de rotação num plano horizontal, para misturar os dois reagentes. Deixar incubar durante quatro horas, pelo menos, à temperatura ambiente, ou, então, durante uma hora a 40 oC.

Titular as bases voláteis na solução de ácido bórico por meio de ácido sulfúrico (3.5), utilizando uma microbureta (4.3).

Efectuar um ensaio em branco aplicando o mesmo método, na ausência de amostra a analisar.

6. Cálculo dos resultados

1 ml de H2SO40,01 mol/l corresponde a 0,34 mg de amoníaco.

Exprimir o resultado em percentagem da amostra.

Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder:

— 10 % em valor relativo, para os teores de amoníaco inferiores a 1,0 %,

— 0,1 % em valor absoluto, para os teores de amoníaco iguais ou superiores a 1,0 %.

7. Observações

Se o teor de amoníaco da amostra for superior a 0,6 %, diluir o filtrado inicial.

CONWAY CELL

Scale 1/1

II. POR DESTILAÇÃO

1. Objecto e âmbito de aplicação

Este método permite determinar o teor de bases azotadas voláteis, expressas em amoníaco, das farinhas de peixe que praticamente não contêm ureia. Só pode ser utilizado para os teores de amoníaco inferiores a 0,25 %.

2. Princípio

A amostra é extraída com água, a solução é clarificada e filtrada. As bases azotadas voláteis são separadas, no ponto de ebulição, por adição de óxido de magnésio e recolhidas numa quantidade determinada de ácido sulfúrico cujo excesso é titulado por meio de uma solução de hidróxido de sódio.

3. Reagentes

3.1. Ácido tricloroacético, solução a 20 % (m/v).

3.2. Óxido de magnésio.

3.3. Emulsão antiespuma (silicone por ex.).

3.4. Ácido sulfúrico 0,05 mol/l.

3.5. Solução de hidróxido de sódio 0,1 mol/l.

3.6. Solução de vermelho de metilo a 0,3 % em etanol a 95-96 % (v/v).

4. Equipamento

4.1. Misturador basculante: cerca de 35 a 40 rotações por minuto.

4.2. Aparelho de destilação do tipo Kjeldahl.

5. Procedimento

Pesar, com uma aproximação de 1 mg, 10 g da amostra e introduzir num balão volumétrico de 200 ml com 100 ml de água. Misturar ou agitar durante 30 minutos no misturador basculante. Adicionar 50 ml de solução de ácido tricloroacético (3.1), completar o volume com água, agitar vigorosamente e filtrar num filtro de pregas.

Recolher uma quantidade do filtrado límpido que seja adequada em função da concentração presumida de bases azotadas voláteis (geralmente 100 ml). Diluir para 200 ml e adicionar 2 g de óxido de magnésio (3.2) e algumas gotas de emulsão antiespuma (3.3). O pH da solução deve ser alcalino quando verificado com papel tornesol; se não o for, adicionar mais óxido de magnésio (3.2). Proceder de acordo com o disposto nos pontos 5.2 e 5.3 da parte C do presente anexo relativa ao método de determinação do teor de proteína bruta.

Efectuar um ensaio em branco aplicando o mesmo método, na ausência de amostra a analisar.

6. Cálculo dos resultados

1 ml de H2SO40,05 mol/l corresponde a 1,7 mg de amoníaco.

Exprimir o resultado em percentagem da amostra.

Repetibilidade

A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas com a mesma amostra não deve exceder, em valor relativo, 10 % de amoníaco.

F. DETERMINAÇÃO DOS AMINOÁCIDOS (COM EXCEPÇÃO DO TRIPTOFANO)

1. Objecto e âmbito de aplicação

O presente método destina-se à determinação do teor de aminoácidos livres (naturais e de síntese) e aminoácidos totais (ligados e livres) em alimentos para animais, utilizando um analisador de aminoácidos. O método é aplicável ao doseamento dos seguintes aminoácidos: cistina/cisteína, metionina, lisina, treonina, alanina, arginina, ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, fenilalanina, prolina, serina, tirosina e valina.

O método não permite distinguir as formas D e L, nem os sais de aminoácidos. Não é aplicável ao doseamento do triptofano nem de derivados hidroxilados de aminoácidos.

2. Princípio

2.1. Aminoácidos livres

Os aminoácidos livres são extraídos com ácido clorídrico diluído. As macromoléculas azotadas co-extraídas são precipitadas com ácido sulfossalicílico e removidas por filtração. O pH do filtrado é ajustado a 2,20 . Os aminoácidos são separados por cromatografia de troca iónica e determinados fotometricamente a 570 nm, após reacção com ninidrina.

2.2. Aminoácidos totais

O procedimento a adoptar depende dos aminoácidos a dosear. A cistina/cisteína e a metionina necessitam de oxidação a ácido cisteico e a metionina sulfona, respectivamente, antes da hidrólise. A tirosina é determinada nos hidrolisados de amostras não oxidadas. Todos os restantes aminoácidos referidos no ponto 1 podem ser determinados a partir de amostras oxidadas ou não oxidadas.

A oxidação é realizada a 0 oC, com uma mistura ácido perfórmico/fenol. O excesso de reagente de oxidação é decomposto com bissulfito de sódio. A amostra, oxidada ou não, é hidrolisada com ácido clorídrico (3.20) durante 23 horas. O pH do hidrolisado é ajustado a 2,20 . Os aminoácidos são separados por cromatografia de troca iónica e determinados fotometricamente a 570 nm (440 nm no caso da prolina), após reacção com ninidrina.

3. Reagentes

Deve utilizar-se água bidestilada ou de qualidade equivalente (condutividade inferior a 10 μS).

3.1. Peróxido de hidrogénio, 30 % (m/m).

3.2. Ácido fórmico, 98-100 % (m/m).

3.3. Fenol.

3.4. Bissulfito de sódio.

3.5. Hidróxido de sódio.

3.6. Ácido 5-sulfossalicílico di-hidratado.

3.7. Ácido clorídrico (densidade aproximada 1,18 g/ml).

3.8. Citrato trissódico di-hidratado.

3.9. 2,2 '-Tiodietanol (tiodiglicol).

3.10. Cloreto de sódio.

3.11. Ninidrina.

3.12. Éter de petróleo, intervalo de ebulição: 40 a 60 oC.

3.13. Norleucina ou outro composto adequado, para ser usado como padrão interno.

3.14. Azoto gasoso (teor de oxigénio inferior a 10 ppm).

3.15. 1-Octanol.

3.16. Aminoácidos.

3.16.1. Substâncias-padrão referidas no ponto 1. Os produtos devem ser puros e não conter água de cristalização. Secar sob vácuo, com P2O5 ou H2SO4, durante uma semana, antes de usar.

3.16.2. Ácido cisteico.

3.16.3. Metionina sulfona.

3.17. Solução de hidróxido de sódio 7,5 mol/l.

Dissolver 300 g de NaOH (3.5) em água, e perfazer o volume de 1 litro.

3.18. Solução de hidróxido de sódio 1 mol/l.

Dissolver 40 g de NaOH (3.5) em água e perfazer o volume de 1 litro.

3.19. Solução de ácido fórmico/fenol.

Misturar 889 g de ácido fórmico (3.2) com 111 g de água e adicionar 4,73 g de fenol (3.3).

3.20. Mistura de hidrólise (HCl 6 mol/l contendo 1 g de fenol/l).

Adicionar 1 g de fenol (3.3) a 492 ml de HCl (3.7) e perfazer com água o volume de 1 litro.

3.21. Mistura de extracção (HCl 0,1 mol/l contendo 2 % de tiodiglicol). Diluir 8,2 ml de HCl (3.7) em cerca de 900 ml de água, adicionar 20 ml de tiodiglicol (3.9) e perfazer com água o volume de 1 litro (não misturar directamente os reagentes 3.7 e 3.9).

3.22. Ácido 5-sulfossalicílico, 6 % (m/v).

Dissolver 60 g de ácido 5-sulfossalicílico (3.6) em água, e perfazer o volume de 1 litro.

3.23. Mistura oxidante (ácido perfórmico/fenol).

Misturar, num pequeno matraz, 0,5 ml de peróxido de hidrogénio (3.1) com 4,5 ml de solução de ácido fórmico/fenol (3.19). Tapar e manter a 20-30 oC durante uma hora, de modo a obter ácido perfórmico. Arrefecer num banho de gelo (15 minutos) e adicionar à amostra.

Cuidado: evitar o contacto com a pele e utilizar vestuário de protecção.

3.24. Tampão citrato (0,2 mol Na+/l; pH = 2,20 ).

Dissolver 19,61 g de citrato de sódio (3.8), 5 ml de tiodiglicol (3.9), 1 g de fenol (3.3) e 16,50 ml de HCl (3.7) em cerca de 800 ml de água. Ajustar o pH a 2,20 . Perfazer o volume de 1 l com água.

3.25. Tampões de eluição, preparados em função do aparelho utilizado (4.9).

3.26. Reagente de ninidrina, preparado em função do aparelho utilizado (4.9).

3.27. Soluções-padrão de aminoácidos. Estas soluções devem ser armazenadas a uma temperatura inferior a 5 oC.

3.27.1. Solução-mãe padrão de aminoácidos (3.16.1).

c = 2,5 μmol/ml de cada aminoácido em ácido clorídrico.

Disponíveis no comércio.

3.27.2. Solução-mãe padrão de ácido cisteico e metionina sulfona, c = 1,25 μmol/ml.

Dissolver, num balão volumétrico de 1 litro, 0,2115 g de ácido cisteico (3.16.2) e 0,2265 g de metionina sulfona (3.16.3) em tampão citrato (3.24), completando o volume com o mesmo tampão. Armazenar a uma temperatura inferior a 5 oC, por um período não superior a 12 meses. Esta solução não é necessária no caso de a solução-mãe padrão (3.27.1) conter ácido cisteico e metionina sulfona.

3.27.3. Solução-mãe de padrão interno, por exemplo norleucina (c = 20 μmol/ml).

Dissolver, num balão volumétrico de 250 ml, 0,6560 g de norleucina (3.13) em tampão citrato (3.24), completando o volume com o mesmo tampão. Armazenar a uma temperatura inferior a 5 oC, por um período não superior a 6 meses.

3.27.4. Solução de calibração de aminoácidos-padrão para uso com os hidrolisados (c = 5 nmol/50 μl de ácido cisteico e metionina sulfona; c = 10 nmol/50 μl dos restantes aminoácidos). Dissolver, num matraz de 100 ml, 2,2 g de cloreto de sódio (3.10) em 30 ml de tampão citrato (3.24). Adicionar 4,00 ml de solução-mãe padrão de aminoácidos (3.27.1), 4,00 ml de solução-mãe padrão de ácido cisteico e metionina sulfona (3.27.2) e 0,50 ml de solução-mãe de padrão interno (3.27.3), se for caso disso. Ajustar o pH a 2,20 com solução de hidróxido de sódio (3.18).

Transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 50 ml, completar o volume com tampão citrato (3.24) e homegeneizar.

Armazenar a uma temperatura inferior a 5 oC, por um período não superior a 3 meses.

Ver igualmente a observação do ponto 9.1.

3.27.5. Solução de calibração de aminoácidos-padrão para uso com os hidrolisados obtidos de acordo com o ponto 5.3.3.1, bem como com os extractos referidos no ponto 5.2. A solução de calibração é preparada em conformidade com o ponto 3.27.4, suprimindo o cloreto de sódio.

Armazenar a uma temperatura inferior a 5 oC, por um período não superior a 3 meses.

4. Equipamento

4.1. Balão de fundo redondo de 100 ml ou 250 ml equipado com um condensador de refluxo.

4.2. Frasco de vidro borossilicato de 100 ml munido de tampa de rosca com revestimento de borracha ou teflon (por exemplo, Duran, Schott) para uso em estufa.

4.3. Estufa munida de um sistema de ventilação e de um sistema de regulação de temperatura com exactidão superior a ± 2 oC.

4.4. Medidor de pH (com leitura às milésimas).

4.5. Filtro de membrana (porosidade 0,22 μm).

4.6. Centrífuga.

4.7. Evaporador rotativo de vácuo.

4.8. Agitador mecânico ou magnético.

4.9. Analisador de aminoácidos ou aparelho para HPLC munido de uma coluna de troca iónica, derivatização pós-coluna com ninidrina e detector fotométrico.

O enchimento da coluna é de resinas de poliestireno sulfonado que permitem separar os aminoácidos entre si, bem como de outros produtos com reacção positiva à ninidrina. A estabilidade do fluxo das bombas que controlam o caudal do tampão de eluição e do reagente de ninidrina deve ser de cerca de ±0,5 %, quer durante o ensaio de calibração, quer durante a execução da análise.

Em alguns analisadores de aminoácidos, é possível utilizar procedimentos de hidrólise cujos hidrolisados contenham uma concentração de sódio superior a 0,8 mol/l, bem como a totalidade do ácido fórmico residual do processo de oxidação. Noutros analisadores, a separação de determinados aminoácidos não é satisfatória caso os produtos de hidrólise contenham um excesso de ácido fórmico e/ou uma concentração elevada de ião sódio. Nestes casos, o volume de ácido é reduzido, por evaporação, a cerca de 5 ml, após a hidrólise e antes do ajuste do pH. A evaporação deve ser realizada sob vácuo, a uma temperatura não superior a 40 oC.

5. Procedimento

5.1. Preparação da amostra

A amostra é moída a uma granulometria inferior a 0,5 mm. As amostras com elevado teor de humidade devem ser secas ao ar, a uma temperatura não superior a 50 oC, ou liofilizadas, antes da moagem. Se o seu teor de matérias gordas for elevado, as amostras terão de ser submetidas a uma extracção com éter de petróleo (3.12) antes da moagem.

5.2. Determinação de aminoácidos livres em alimentos para animais e pré-misturas

Pesar num erlenmeyer, com uma aproximação de 0,2 mg, uma quantidade adequada (1-5 g) de amostra preparada de acordo com o ponto 5.1 e adicionar 100,0 ml de mistura de extracção (3.21). Agitar durante 60 minutos em agitador mecânico ou magnético (4.8). Deixar sedimentar e pipetar 10,0 ml de solução sobrenadante para um matraz de 100 ml.

Adicionar, sob agitação, 5,0 ml de solução de ácido sulfossalicílico (3.22), mantendo a agitação durante 5 minutos. Filtrar ou centrifugar o sobrenadante, de modo a remover qualquer precipitado. Colocar 10,0 ml da solução resultante num matraz de 100 ml e ajustar o pH a 2,20 com solução de hidróxido de sódio (3.18). Transferir para um balão volumétrico de volume adequado e completar até à marca com tampão citrato (3.24).

Caso se utilize um padrão interno, adicionar 1,00 ml (3.27.3) por cada 100 ml de solução final, antes de completar até à marca com tampão (3.24).

Efectuar a análise cromatográfica de acordo com o ponto 5.4.

Se os extractos não forem sujeitos a cromatografia no mesmo dia, devem ser armazenados a uma temperatura inferior a 5 oC.

5.3. Determinação dos aminoácidos totais

5.3.1. Oxidação

Pesar, com uma aproximação de 0,2 mg, entre 0,1 e 1 g de amostra preparada (5.1):

— num balão de fundo redondo de 100 ml (4.1), no caso de hidrólise em sistema aberto (5.3.2.3),

— num balão de fundo redondo de 250 ml (4.1), caso seja necessário um teor de sódio reduzido (5.3.3.1),

— num frasco de 100 ml munido de tampa de rosca (4.2), no caso de hidrólise em sistema fechado (5.3.2.4).

A toma de amostra para ensaio deve ter um teor aproximado de azoto de 10 mg e um teor de humidade não superior a 100 mg.

Colocar o balão ou o frasco num banho de gelo, arrefecer a 0 oC, adicionar 5 ml de mistura oxidante (3.23) e misturar com uma vareta de vidro de ponta recurva. Tapar o balão ou o frasco contendo a vareta com película impermeável ao ar, e colocar o conjunto constituído pelo recipiente tapado e o banho de gelo no frigorífico, a 0 oC, durante 16 horas. Após este período, retirar do frigorífico e decompor o excesso de oxidante por adição de 0,84 g de bissulfito de sódio (3.4).

Continuar de acordo com o descrito no ponto 5.3.2.1.

5.3.2. Hidrólise

5.3.2.1. Hidrólise de amostras oxidadas

À amostra oxidada como descrito no ponto 5.3.1, adicionar 25 ml de mistura de hidrólise (3.20) tendo o cuidado de arrastar quaisquer resíduos de amostra das paredes do recipiente e da vareta.

Proceder em conformidade com o ponto 5.3.2.3 ou 5.3.2.4, em função do tipo de hidrólise.

5.3.2.2. Hidrólise de amostras não oxidadas

Pesar num balão de fundo redondo de 100 ml ou 250 ml (4.1) ou num frasco munido de tampa de rosca (4.2), com uma aproximação de 0,2 mg, 0,1 a 1 g de amostra preparada (5.1). A toma de amostra para ensaio deve ter um teor aproximado de azoto de 10 mg. Adicionar cuidadosamente 25 ml da mistura de hidrólise (3.20) e misturar. Proceder de acordo com o descrito no ponto 5.3.2.3 ou 5.3.2.4.

5.3.2.3. Hidrólise em sistema aberto

Juntar 3 pérolas de vidro como reguladores de ebulição à mistura preparada de acordo com o ponto 5.3.2.1 ou 5.3.2.2 e manter em ebulição contínua, sob refluxo, durante 23 horas. Após a hidrólise, lavar o condensador pelo topo, com 5 ml de tampão citrato (3.24). Desmontar o conjunto e arrefecer o balão num banho de gelo.

Proceder de acordo com o ponto 5.3.3.

5.3.2.4. Hidrólise em sistema fechado

Colocar o frasco que contém a mistura preparada de acordo com o ponto 5.3.2.1 ou 5.3.2.2 numa estufa (4.3) a 110 oC. Durante a primeira hora, colocar a tampa de rosca no topo do frasco sem contudo o vedar, de modo a evitar um aumento da pressão devido aos gases libertados e o consequente risco de explosão. Em seguida, vedar o frasco com a tampa de rosca e manter em estufa (4.3) durante 23 horas. Após a hidrólise, remover o frasco da estufa, abri-lo cuidadosamente e colocá-lo num banho de gelo, até arrefecer.

Com o auxílio de tampão citrato (3.24), transferir quantitativamente o conteúdo do frasco para um matraz ou um balão de fundo redondo de 250 ml, em função do procedimento de ajuste do pH a utilizar (ponto 5.3.3).

Proceder de acordo com o ponto 5.3.3.

5.3.3. Ajuste do pH

Para o ajuste do pH, proceder de acordo com o ponto 5.3.3.1 ou 5.3.3.2, em função da tolerância do analisador de aminoácidos (4.9) ao sódio.

5.3.3.1. Sistemas cromatográficos que necessitem de um teor reduzido de sódio

É aconselhável utilizar uma solução-mãe de padrão interno (3.27.3), no caso de analisadores de aminoácidos que necessitem de um teor reduzido de sódio (uma vez que o volume de ácido deve ser reduzido).

Neste caso, adicionar 2,00 ml de solução-mãe de padrão interno (3.27.3) ao hidrolisado, antes da evaporação.

Adicionar 2 gotas de 1-octanol (3.15) ao hidrolisado obtido de acordo com os pontos 5.3.2.3 ou 5.3.2.4.

Em evaporador rotativo (4.7), reduzir o volume a 5-10 ml, sob vácuo, a 40 oC. Se, acidentalmente, o volume for reduzido a menos de 5 ml, o produto deve ser rejeitado e a análise recomeçada.

Ajustar o pH a 2,20 com solução de hidróxido de sódio (3.18), e proceder de acordo com o referido no ponto 5.3.4.

5.3.3.2. Restantes analisadores de aminoácidos (4.9)

Neutralizar parcialmente o hidrolisado obtido de acordo com 5.3.2.3 ou 5.3.2.4 mediante a adição cuidadosa, sob agitação, de 17 ml de solução de hidróxido de sódio (3.17), mantendo a temperatura inferior a 40 oC.

Ajustar o pH a 2,20 , à temperatura ambiente, com as soluções de hidróxido de sódio (3.17) e (3.18). Proceder de acordo com o ponto 5.3.4.

5.3.4. Solução de amostra para cromatografia

Com o auxílio de tampão citrato (3.24), transferir quantitativamente o produto de hidrólise com o pH ajustado (5.3.3.1 ou 5.3.3.2) para um balão volumétrico de 200 ml, completando até à marca com o mesmo tampão.

No caso de não se ter adicionado ainda um padrão interno, juntar 2,00 ml da solução-mãe de padrão interno (3.27.3) e completar até à marca com tampão citrato (3.24). Homogeneizar.

Efectuar a análise cromatográfica de acordo com o ponto 5.4.

Se as soluções de amostra não forem analisadas no mesmo dia, devem ser conservadas a uma temperatura inferior a 5 oC.

5.4. Cromatografia

Antes de iniciar a análise cromatográfica, deixar estabilizar o extracto (5.2) ou o produto de hidrólise (5.3.4) à temperatura ambiente. Agitar a mistura e filtrar uma quantidade adequada com filtro de membrana de 0,22 μm (4.5). A solução límpida resultante é sujeita a cromatografia de troca iónica no analisador de aminoácidos (4.9).

A injecção pode ser manual ou automática. A quantidade de solução utilizada na análise dos padrões e das amostras deve ser constante, com uma aproximação de ± 0,5 %, excepto no caso de se utilizar um padrão interno; a razão entre as concentrações de sódio e de aminoácidos na solução-padrão e na amostra deve ser tão próxima quanto possível.

Em geral, a frequência dos ensaios de calibração depende da estabilidade do reagente de ninidrina e do sistema analítico. O padrão ou a amostra são diluídos com tampão citrato (3.24), de modo a que a área dos picos dos aminoácidos produzidos pelo padrão seja 30-200 % da área dos correspondentes picos dos aminoácidos da amostra.

A cromatografia dos aminoácidos varia ligeiramente em função do tipo de analisador e da resina utilizada. O sistema escolhido deve permitir a separação dos aminoácidos entre si, bem como dos restantes produtos com reacção positiva à ninidrina. Além disso, o sistema deverá dar uma resposta linear à alteração das quantidades de aminoácidos injectadas, na gama das concentrações utilizadas.

Durante a cromatografia, as razões entre a altura do vale e a altura do pico referidas infra aplicam-se na análise de uma solução equimolar (dos aminoácidos a determinar). A solução equimolar de aminoácidos deve conter, pelo menos, 30 % da quantidade máxima de cada aminoácido que pode ser determinada com exactidão no analisador de aminoácidos (4.9).

Para a separação treonina-serina, se os respectivos picos estiverem parcialmente sobrepostos, a razão entre a altura do vale e a altura do menor dos dois picos sobrepostos no cromatograma não deve exceder 2:10. Caso se pretenda determinar apenas a cistina/cisteína, a metionina, a treonina e a lisina, a má resolução de dois picos adjacentes afecta a quantificação. No que respeita aos restantes aminoácidos, a separação deve ser superior a 1:10.

O sistema deve assegurar a separação da lisina das substâncias afins e da ornitina.

6. Cálculo dos resultados

Procede-se à determinação da área do pico correspondente a cada aminoácido presente na amostra e no padrão, sendo o respectivo teor (X), expresso em g por kg de amostra, calculado pela fórmula:

Caso tenha sido utilizado um padrão interno, multiplicar pelo factor:

A = área do pico do hidrolisado ou do extracto

B = área do pico da solução-padrão de calibração

C = área do pico do padrão interno, no hidrolisado ou no extracto

D = área do pico do padrão interno, na solução-padrão de calibração

M = massa molecular do aminoácido doseado

c = concentração da solução-padrão, expressa em μmol/ml

m = massa da amostra, corrigida em caso de secagem ou desengorduramento, expressa em g

V = volume do hidrolisado (5.3.4) ou volume de diluição total do extracto (6.1), expressos em ml

A cistina e a cisteína são determinadas na forma de ácido cisteico, no hidrolisado da amostra oxidada, sendo expressas em cistina (C6H12N2O4S2, M = 240,30 g/mol), considerando M = 120,15 g/mol (0,5 × 240,30 g/mol).

A metionina é determinada na forma de metionina sulfona, no hidrolisado da amostra oxidada, sendo expressa em metionina, considerando M = 149,21 g/mol.

A metionina livre adicionada é determinada na forma de metionina, após extracção, utilizando o mesmo valor de massa molecular.

6.1. O volume total de diluição dos extractos (F), para a determinação dos aminoácidos livres (5.2), é calculado do seguinte modo:

V = em que V representa o volume do extracto final.

7. Avaliação do método

O método foi testado num estudo internacional de comparação interlaboratorial realizado em 1990 com base em quatro tipos de alimentos para animais (alimento misto para suínos, alimento composto para frangos, concentrado proteico e pré-mistura). Após eliminação dos valores anómalos, obtiveram-se para a média e o desvio-padrão os valores que se apresentam nos quadros seguintes:







Médias, expressas em g/kg Material de referência Aminoácidos Treonina Cistina/Cisteína Metionina Lisina Alimento misto para suínos 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Alimento composto para frangos 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Concentrado proteico 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Pré-mistura 58,42 n = 16 — 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = número de laboratórios participantes.

7.1. Repetibilidade

Apresentam-se de seguida os valores relativos à repetibilidade, expressos em termos de desvio-padrão intralaboratorial, obtidos na comparação interlaboratorial mencionada, para os aminoácidos em estudo:







Desvio-padrão intralaboratorial (Sr), expresso em g/kg Material de referência Aminoácidos Treonina Cistina/Cisteína Metionina Lisina Alimento misto para suínos 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Alimento composto para frangos 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Concentrado proteico 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Pré-mistura 1,30 n = 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = número de laboratórios participantes.







Coeficiente de variação, expresso em percentagem, do desvio-padrão intralaboratorial (Sr) Material de referência Aminoácidos Treonina Cistina/Cisteína Metionina Lisina Alimento misto para suínos 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Alimento composto para frangos 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Concentrado proteico 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Pré-mistura 2,2 n = 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = número de laboratórios participantes.

7.2. Reprodutibilidade

Apresentam-se no quadro seguinte os valores do desvio-padrão interlaboratorial obtidos na comparação interlaboratorial mencionada:







Desvio-padrão interlaboratorial (SR), expresso em g/kg Material de referência Aminoácidos Treonina Cistina/Cisteína Metionina Lisina Alimento misto para suínos 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Alimento composto para frangos 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Concentrado proteico 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Pré-mistura 2,49 n = 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = número de laboratórios participantes.







Coeficiente de variação, expresso em percentagem, do desvio-padrão interlaboratorial (SR) Material de referência Aminoácidos Treonina Cistina/Cisteína Metionina Lisina Alimento misto para suínos 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Alimento composto para frangos 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Concentrado proteico 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Pré-mistura 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = número de laboratórios participantes.

8. Utilização de materiais de referência

Deve verificar-se a aplicação correcta do método mediante a realização de ensaios em duplicado com materiais de referência certificados, quando disponíveis. Recomenda-se a calibração com soluções de calibração de aminoácidos certificadas.

9. Observações

9.1. Em virtude das diferenças entre os analisadores de aminoácidos, deve tomar-se como orientação a concentração final das soluções de calibração dos aminoácidos-padrão (3.27.4 e 3.27.5) e do hidrolisado (5.3.4).

A zona de resposta linear do aparelho deve ser verificada para todos os aminoácidos.

A solução-padrão é diluída com tampão citrato de modo que os picos surjam no meio dessa zona.

9.2. Quando se utilizar um aparelho de HPLC para análise dos hidrolisados, as condições experimentais devem ser optimizadas de acordo com as recomendações do fabricante.

9.3. A aplicação do método a alimentos para animais com mais de 1 % de cloretos (concentrados, minerais, suplementos) pode originar uma subestimação da metionina, sendo por isso necessário um tratamento especial.

G. DETERMINAÇÃO DO TRIPTOFANO

1. Objecto e âmbito de aplicação

O método permite determinar o triptofano livre e total em alimentos para animais. As formas D e L não são distinguidas.

2. Princípio

Para a determinação do triptofano total, procede-se à hidrólise da amostra em condições alcalinas com uma solução saturada de hidróxido de bário que se aquece em seguida a 110 oC durante 20 horas. Depois de concluída a hidrólise, adiciona-se um padrão interno.

Para a determinação do triptofano livre, efectua-se uma extracção da amostra em condições moderadamente ácidas na presença de um padrão interno.

O triptofano e o padrão interno no hidrolisado ou no extracto são determinados por cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) com detecção por fluorescência.

3. Reagentes

3.1. Água bidestilada ou de qualidade equivalente (condutividade inferior a 10 μS/cm).

3.2. Substância-padrão: triptofano (grau de pureza/teor ≥ 99 %) seco sob vácuo na presença de pentóxido de fósforo.

3.3. Padrão interno: α-metiltriptofano (grau de pureza/teor ≥ 99 %) seco sob vácuo na presença de pentóxido de fósforo.

3.4. Hidróxido de bário octa-hidratado (tomar as devidas precauções para não expor excessivamente o Ba(OH)2.8H2O ao ar, para evitar a formação de BaCO3, que poderia perturbar a determinação) (ver as observações do ponto 9.3).

3.5. Hidróxido de sódio.

3.6. Ácido ortofosfórico, w = 85 %.

3.7. Ácido clorídrico, ρ20 = 1,19 g/ml.

3.8. Metanol de qualidade equivalente para HPLC.

3.9. Éter de petróleo, intervalo de ebulição: 40 a 60 oC.

3.10. Solução de hidróxido de sódio 1 mol/l:

Dissolver 40,0 g de NaOH (3.5) em água e completar o volume com água (3.1) até perfazer 1 litro.

3.11. Ácido clorídrico 6 mol/l:

Misturar 492 ml de HCl (3.7) com água (3.1) até perfazer 1 litro.

3.12. Ácido clorídrico 1 mol/l:

Misturar 82 ml de HCl (3.7) com água (3.1) até perfazer 1 litro.

3.13. Ácido clorídrico 0,1 mol/l:

Misturar 8,2 ml de HCl (3.7) com água (3.1) até perfazer