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►B DECISÃO DA COMISSÃO
de 15 de Julho de 1994
que estabelece as condições de sanidade anima l e a certificação veterinária para a importação de
sémen de bovino de países terceiros
(94/577/CE)
(JO L 221 de 26.8.1994, p. 26)
Alterada por:
Jornal Oficial
n.opágina data
►M1Decisão 1999/495/CE da Comissão de 1 de Julho de 1999 L 192 56 24.7.1999
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DECISÃO DA COMISSÃO
de 15 de Julho de 1994
que estabelece as condições de sanidade animal e a certificação
veterinária para a importação de sémen de bovino de países
terceiros
(94/577/CE)
A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,
Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia,
Tendo em conta a Directiva 88/407/CEE do Conselho, de 14 de Junho
de 1988, que fixa as exigências de polícia sanitária aplicáveis às trocascomerciais intracomunitárias e às importações de sémen de animais daespécie bovina (
1), com a última redacção que lhe foi dada pela Direc-
tiva 93/60/CEE (2), e, nomeadamente, os seus artigos 10.oe 11.o,
Considerando que a lista de países terceiros dos quais os Estados-
-membros autorizam a importação de sémen de bovinos domésticos, aseguir designada «a lista dos países terceiros», foi estabelecida pelaDecisão 90/14/CEE da Comissão (
3), alterada pela Decisão 91/
/276/CEE (4);
Considerando que a situação sanitária em Israel levou à proibição das
importações desse país, estabelecida pela Decisão 91/277/CEE daComissão (
5);
Considerando que, pelas Decisões 91/479/CEE (6), 91/549/CEE (7), 92/
/123/CEE (8), 92/124/CEE (9), 92/125/CEE (10), 92/126/CEE (11), 92/
/127/CEE (12), 92/128/CEE (13), 92/386/CEE (14), 92/387/CEE (15) e 92/
/445/CEE (16)da Comissão, foram estabelecidas as condições de sani-
dade anima leacertificação veterinária para a importação de sémen de
bovino dos Estados Unidos da América, Canadá, Polónia, Finlândia,Nova Zelândia, Áustria, Suíça, Suécia, Hungria, Noruega e Checoslová-quia, respectivamente;
Considerando que a Directiva 93/60/CEE, que deve ser aplicada nos
Estados-membros o mais tardar em 1 de Julho de 1994, altera a Direc-tiva 88/407/CEE, o que implica, por sua vez, a necessidade de alterar asdecisões acima mencionadas relativas a países terceiros; que, parasimplificar e clarificar a legislação comunitária no domínio em questão,é necessário reunir numa só as decisões acima referidas e revogar asque estão em vigor para cada país individualmente;
Considerando que, atendendo ao disposto no Acordo sobre o Espaço
Económico Europeu, não é necessário manter os certificados veteriná-rios para as importações de sémen de animais da espécie bovina prove-niente da Áustria, Finlândia, Noruega e Suécia;
Considerando que, em conformidade com o parecer do Comité cientí-
fico veterinário, é exigido um teste suplementar para a doença hemorrá-gica epizoótica;
(1)J On .oL 194 de 22. 7. 1988, p. 10.
(2)J On .oL 186 de 28. 7. 1993, p. 28.
(3)J On .oL 8 de 11. 1. 1990, p. 71.
(4)J On .oL 135 de 30. 5. 1991, p. 58.
(5)J On .oL 135 de 30. 5. 1991, p. 60.
(6)J On .oL 258 de 16. 9. 1991, p. 1.
(7)J On .oL 298 de 29. 10. 1991, p. 6.
(8)J On .oL 48 de 22. 2. 1992, p. 1.
(9)J On .oL 48 de 22. 2. 1992, p. 10.
(10)J On .oL 48 de 22. 2. 1992, p. 19.
(11)J On .oL 48 de 22. 2. 1992, p. 28.
(12)J On .oL 48 de 22. 2. 1992, p. 37.
(13)J On .oL 48 de 22. 2. 1992, p. 46.
(14)J On .oL 204 de 21. 7. 1992, p. 13.
(15)J On .oL 204 de 21. 7. 1992, p. 22.
(16)J On .oL 247 de 27. 8. 1992, p. 1.
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Considerando que relativamente ao Canadá só são efectuados, comintervalos de seis meses, testes de pré-colheita de rotina para essadoença; que é, pois necessário autorizar um período de transição para aintrodução da presente decisão relativamente ao Canadá, para que asautoridades veterinárias canadianas disponham de tempo suficiente paraintroduzir o novo teste no seu programa de rotina;
Considerando, ainda, que na sequência de progressos recentemente
efectuados quanto à compreensão da epidemiologia da febre catarral, aimportação de sémen de bovino da Austrália não pode ser permitida;
Considerando que se verifica existir, nos países constantes da lista dos
países terceiros, uma boa situação sanitária, controlada por serviçosveterinários bem estruturados e organizados no respeitante às doençastransmissíveis pelo sémen;
Considerando que as autoridades veterinárias responsáveis dos países
terceiros se comprometeram a notificar, num prazo de 24 horas, portelex ou telefax, a Comissão e os Estados-membros da confirmação daocorrência de quaisquer das doenças indicadas na lista A do GabineteInternacional de Epizootias (OIE), bem como de quaisquer alterações napolítica de vacinações contra as mesmas, ou, num prazo adequado, daocorrência de doenças constantes da lista B da OIE e de quaisquerpropostas de alterações das normas de importação relativas a animaisdomésticos ou ao seu sémen ou embriões;
Considerando que as autoridades veterinárias responsáveis dos países
constantes da lista dos países terceiros se comprometeram a controlaroficialmente a emissão de certificados prevista na presente decisão, bemcomo a garantir que todos os certificados, derrogações e resultadoslaboratoriais relevantes em que a certificação se possa ter baseadofiquem oficialmente arquivados durante, pelo menos, os doze mesesseguintes à data de expedição do sémen a que dizem respeito;
Considerando que as autoridades veterinárias responsáveis dos países
constantes da lista dos países terceiros se comprometeram a aprovaroficialmente centros de colheita de sémen para a exportação de sémende bovino para a Comunidade, em conformidade com o disposto noartigo 9.
oda Directiva 88/407/CEE;
Considerando que as condições sanitárias e a certificação veterinária
devem ser adaptadas em função da situação sanitária do país terceiro emquestão;
Considerando que as medidas previstas na presente decisão estão em
conformidade com o parecer do Comité veterinário permanente,
ADOPTOU A PRESENTE DECISÃO:
Artigo 1.o
Os Estados-membros autorizarão apenas a importação de sémen debovino que satisfaça as condições estabelecidas nos certificados da parte1 dos anexos A, B ,CeD , desde que seja proveniente dos países
terceiros constantes da parte 2 dos anexos A, B ,CeD , respectivamente.
No entanto, os Estados-membros autorizarão até 31 de Dezembro de
1994 a importação do Canadá de sémen de bovino colhido e transfor-mado em conformidade com a Decisão 91/549/CEE.
Artigo 2.
o
São revogadas as Decisões 91/479/CEE, 92/123/CEE, 92/124/CEE, 92/
/125/CEE, 92/126/CEE, 92/127/CEE, 92/128/CEE, 92/386/CEE, 92//387/CEE e 92/445/CEE.
A Decisão 91/549/CEE é revogada com efeitos a partir de 1 de Janeiro
de 1995.
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Artigo 3.o
O primeiro parágrafo do artigo 1.oé aplicável a partir de 1 de Janeiro de
1995.
Artigo 4.o
Os Estados-membros são os destinatários da presente decisão.
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ANEXO A
PARTE 1
CERTIFICADO SANITÁRIO
para a importação de sémen de bovino

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▼B
13. Eu, abaixo assinado, veterinário oficial, li e estou familiarizado com a Directiva 88/407/CEE do Conselho e
declaro que:
a) .................................................................................................... esteve indemne de pest e
(país de exportação)
bovina e de febre aftosa durante os doze meses imediatamente anteriores à colheita do sémen par a
exportação e até à data da sua expedição, não tendo sido efectuada nenhuma vacinação contra essa s
doenças durante o mesmo período;
b) O centro de colheita de sémen em que o sémen a exportar foi colhido:
i) foi aprovado ao abrigo das condições previstas no capítulo I do anexo A da Directiva 88/407/CEE,
ii) funcionava e era fiscalizado segundo as condições previstas no capítulo II do anexo A da Directiv a
88/407/CEE,
iii) esteve, durante o período com início 30 dias antes da data de colheita do sémen a exportar e termo 3 0
dias após a colheita (ou até à data de expedição, no caso de sémen fresco), indemne de raiva,
tuberculose, brucelose, carbúnculo bacteriano e peripneumonia contagiosa bovina;
c) Os bovinos presentes no centro de colheita de sémen:
i) são provenientes de efectivos e/ou nasceram de mães que satisfazem as condições previstas no capítul o
I do anexo B da Directiva 88/407/CEE,
ii) foram, antes de entrarem em isolamento, submetidos aos testes previstos no capítulo I do anexo B d a
Directiva 88/407/CEE,
iii) satisfizeram as condições de entrada em isolamento e reagiram negativamente aos testes previstos n o
capítulo I do anexo B da Directiva 88/407/CEE,
iv) foram submetidos, no caso de permanecerem no centro há pelo menos um ano, aos testes de rotin a
previstos no capítulo II do anexo B da Directiva 88/407/CEE;
d) O sémen a exportar:
i) é proveniente de dadores residentes em
.............................................................................................................................
(país de exportação)
no período de seis meses imediatamente anterior à colheita do sémen para exportação e que satisfaze m
as condições previstas no anexo C da Directiva 88/407/CEE,
ii) foi obtido de dadores que:
— se encontram num centro de colheita de sémen em que todos os bovinos foram, nos 12 mese s
imediatamente anteriores à colheita do sémen para exportação, submetidos, com resultados nega -
tivos, a um teste de seroneutralização ou a uma prova ELISA para a rinotraqueíte bovin a
infecciosa/vulvovaginite pustulosa infecciosa (1),
ou
— foram submetidos, com resultados negativos, a um teste de seroneutralização ou a uma prov a
ELISA para a rinotraqueíte bovina infecciosa/vulvovaginite pustulosa infecciosa nos 12 mese s
imediatamente anteriores à colheita de sémen para exportação (1),
ou
— são seropositivos, tendo sido vacinados em conformidade com o disposto no capítulo II do anexo B
da Directiva 88/407/CEE e apresentado resultados negativos num teste de seroneutralização o u
ELISA efectuado no centro aprovado de colheita de sémen antes da vacinação (1),
(1) Riscar o que não interessa.
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▼B
►(1)◄
►(2)◄
iii) foi transformado, armazenado e transportado de forma a satisfazer as condições previstas na Directiv a
88/407/CEE.
Feito em ........................................................,
(local)em ...............................................................
(data)
/SS74(Carimbo) (2)Assinatura (2): .......................................................................
Nome em letras de imprensa: .....................................................
Título oficial: . .......................................................................
►(2)◄
(2) A assinatura e o carimbo devem ter uma cor diferente da dos caracteres impressos.
►(1)M1
►(2)M1
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PARTE 2
Lista de países autorizados a utilizar o modelo de certificado sanitário
constante da parte 1 do anexo A
REPÚBLICA CHECAHUNGRIANOVA ZELÂNDIAPOLÓNIAROMÉNIASUÍÇAREPÚBLICA ESLOVACA
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▼B
ANEXO B
PARTE 1
CERTIFICADO SANITÁRIO
para a importação de sémen de bovino dos Estados Unidos da América

1994D0577 — PT — 05.07.1999 — 001.001 — 10
▼B
13. Eu, abaixo assinado, veterinário oficial, li e estou familiarizado com a Directiva 88/407/CEE do Conselho e
declaro que:
a) .................................................................................................... esteve indemne de pest e
(país de exportação)
bovina e de febre aftosa durante os doze meses imediatamente anteriores à colheita do sémen par a
exportação e até à data da sua expedição, não tendo sido efectuada nenhuma vacinação contra essa s
doenças durante o mesmo período;
b) O centro de colheita de sémen em que o sémen a exportar foi colhido:
i) foi aprovado ao abrigo das condições previstas no capítulo I do anexo A da Directiva 88/407/CEE,
ii) funcionava e era fiscalizado segundo as condições previstas no capítulo II do anexo A da Directiv a
88/407/CEE,
iii) esteve, durante o período com início 30 dias antes da data de colheita do sémen a exportar e termo 3 0
dias após a colheita (ou até à data de expedição, no caso de sémen fresco), indemne de raiva,
tuberculose, brucelose, carbúnculo bacteriano e peripneumonia contagiosa bovina;
c) Os bovinos presentes no centro de colheita de sémen:
i) são provenientes de efectivos e/ou nasceram de mães que satisfazem as condições previstas no capítul o
I do anexo B da Directiva 88/407/CEE,
ii) foram, antes de entrarem em isolamento, submetidos aos testes previstos no capítulo I do anexo B d a
Directiva 88/407/CEE,
iii) satisfizeram as condições de entrada em isolamento e reagiram negativamente aos testes previstos n o
capítulo I do anexo B da Directiva 88/407/CEE,
iv) foram submetidos, no caso de permanecerem no centro há pelo menos um ano, aos testes de rotin a
previstos no capítulo II do anexo B da Directiva 88/407/CEE;
d) O sémen a exportar:
i) é proveniente de dadores residentes em
.............................................................................................................................
(país de exportação)
no período de seis meses imediatamente anterior à colheita do sémen para exportação e que satisfaze m
as condições previstas no anexo C da Directiva 88/407/CEE,
ii) foi obtido de dadores que:
— se encontram num centro de colheita de sémen em que todos os bovinos foram, nos 12 mese s
imediatamente anteriores à colheita do sémen para exportação, submetidos, com resultados nega -
tivos, a um teste de seroneutralização ou a uma prova ELISA para a rinotraqueíte bovina infecciosa /
vulvovaginite pustulosa infecciosa (1),
ou
— foram submetidos, com resultados negativos, a um teste de seroneutralização ou a uma prov a
ELISA para a rinotraqueíte bovina infecciosa/vulvovaginite pustulosa infecciosa nos 12 mese s
imediatamente anteriores à colheita de sémen para exportação (1),
ou
— são seropositivos, tendo sido vacinados em conformidade com o disposto no capítulo II do anexo B
da Directiva 88/407/CEE e apresentado resultados negativos num teste de seroneutralização o u
ELISA efectuado no centro aprovado de colheita de sémen antes da vacinação (1),
(1) Riscar o que não interessa.
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►(1)◄
►(2)◄
iii) foi transformado, armazenado e transportado de forma a satisfazer as condições previstas na Directiv a
88/407/CEE,
iv) é proveniente de dadores que, num laboratório aprovado, foram submetidos por duas vezes, com u m
intervalo não superior a 12 meses, aos testes a seguir indicados, antes e depois da colheita (a amostr a
de sangue para o segundo dos testes referidos deve ser colhida pelo menos 21 dias após a colheita d o
sémen para exportação):
— uma prova ELISA do bloqueio para a febre catarral, em conformidade com o anexo E,
— uma prova de imunodifusão em ágar-gel em conformidade com o anexo E e um teste de neutrali -
zação do vírus para todos os serotipos da doença hemorrágica epizoótica cuja existência no paí s
exportador é conhecida.
Feito em ........................................................,
(local)em ...............................................................
(data)
/SS74(Carimbo) (2)Assinatura (2): .......................................................................
Nome em letras de imprensa: .....................................................
Título oficial: . .......................................................................
►(2)◄
(2) A assinatura e o carimbo devem ter uma cor diferente da dos caracteres impressos.
►(1)M1
►(2)M1
1994D0577 — PT — 05.07.1999 — 001.001 — 12
▼B
PARTE 2
Lista de países autorizados a utilizar o modelo de certificado sanitário
constante da parte 1 do anexo B
ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA
1994D0577 — PT — 05.07.1999 — 001.001 — 13
▼B
ANEXO C
PARTE 1
CERTIFICADO SANITÁRIO
para a importação de sémen de bovino

1994D0577 — PT — 05.07.1999 — 001.001 — 14
▼B
13. Eu, abaixo assinado, veterinário oficial, li e estou familiarizado com a Directiva 88/407/CEE do Conselho e
declaro que:
a) ........................................................................................................................... es teve indemne de pest e
(país de exportação)
bovina e de febre aftosa durante os doze meses imediatamente anteriores à colheita do sémen par a
exportação e até à data da sua expedição, não tendo sido efectuada nenhuma vacinação contra essa s
doenças durante o mesmo período;
b) O centro de colheita de sémen em que o sémen a exportar foi colhido:
i) foi aprovado ao abrigo das condições previstas no capítulo I do anexo A da Directiva 88/407/CEE,
ii) funcionava e era fiscalizado segundo as condições previstas no capítulo II do anexo A da Directiv a
88/407/CEE,
iii) esteve, durante o período com início 30 dias antes da data de colheita do sémen a exportar e termo 3 0
dias após a colheita (ou até à data de expedição, no caso de sémen fresco), indemne de raiva,
tuberculose, brucelose, carbúnculo bacteriano e peripneumonia contagiosa bovina;
c) Os bovinos presentes no centro de colheita de sémen:
i) são provenientes de efectivos e/ou nasceram de mães que satisfazem as condições previstas no capítul o
I do anexo B da Directiva 88/407/CEE,
ii) foram, antes de entrarem em isolamento, submetidos aos testes previstos no capítulo I do anexo B d a
Directiva 88/407/CEE,
iii) satisfizeram as condições de entrada em isolamento e reagiram negativamente aos testes previstos n o
capítulo I do anexo B da Directiva 88/407/CEE,
iv) foram submetidos, no caso de permanecerem no centro há pelo menos um ano, aos testes de rotin a
previstos no capítulo II do anexo B da Directiva 88/407/CEE;
d) O sémen a exportar:
i) é proveniente de dadores residentes em
.............................................................................................................................
(país de exportação)
no período de seis meses imediatamente anterior à colheita do sémen para exportação e que satisfaze m
as condições previstas no anexo C da Directiva 88/407/CEE,
ii) foi obtido de dadores que:
— se encontram num centro de colheita de sémen em que todos os bovinos foram, nos 12 mese s
imediatamente anteriores à colheita do sémen para exportação, submetidos, com resultados nega -
tivos, a um teste de seroneutralização ou a uma prova ELISA para a rinotraqueíte bovin a
infecciosa/vulvovaginite pustulosa infecciosa (1),
ou
— foram submetidos, com resultados negativos, a um teste de seroneutralização ou a uma prov a
ELISA para a rinotraqueíte bovina infecciosa/vulvovaginite pustulosa infecciosa nos 12 mese s
imediatamente anteriores à colheita de sémen para exportação (1),
ou
— são seropositivos, tendo sido vacinados em conformidade com o disposto no capítu1o II do anexo B
da Directiva 88/407/CEE e apresentado resultados negativos num teste de seroneutralização o u
ELISA efectuado no centro aprovado de colheita de sémen antes da vacinação (1),
(1) Riscar o que não interessa.
1994D0577 — PT — 05.07.1999 — 001.001 — 15
▼B
►(1)◄
►(2)◄
iii) foi transformado, armazenado e transportado de forma a satisfazer as condições previstas na Directiv a
88/407/CEE,
iv) foi obtido de de dadores que:
— se encontravam no centro aprovado em 1 de Julho de 1994, ou
— deram entrada no centro aprovado após l de Julho de 1994, tendo antes dessa entrada, sid o
submetidos, com resultados negativos, aos testes a seguir indicados para a febre catarral e a doenç a
hemorrágica epizoótica num laboratório aprovado
e sido, em ambos os casos, submetidos de seis em seis meses num laboratório aprovado, co m
resultados negativos, aos testes seguintes:— uma prova ELISA do bloqueio para a febre catarral, em conformidade com o anexo E,— uma prova de imunodifusão em ágar-gel em conformidade com o anexo E e um teste de neutrali
-
zação do vírus para todos os serotipos da doença hemorrágica epizoótica cuja existência no paí s
exportador é conhecida.
Feito em. .........................................................,
(local)em................................................................
(data)
/SS74(Carimbo) (2)Assinatura (2): .......................................................................
Nome em letras de imprensa: .....................................................
Título oficial: . .......................................................................
►(2)◄
(2) A assinatura e o carimbo devem ter uma cor diferente da dos caracteres impressos.
►(1)M1
►(2)M1
1994D0577 — PT — 05.07.1999 — 001.001 — 16
▼B
PARTE 2
Lista de países autorizados a utilizar o modelo de certificado sanitário
constante da parte 1 do anexo C
CANADÁ: Com excepção da região de Okanagan Valley da British Columbia,
definida como a área delimitada por uma linha traçada a partir deum ponto na fronteira do Canadá com os Estados Unidos daAmérica de 120 °15 /prime1de longitude e 49 °de latitude, para norte até
um ponto de 199 °35 /prime1de longitude e 50 °30 /prime1de latitude, para
nordeste até um ponto de 199 °de longitude e 50 °45 /prime1de latitude e
para sul até um ponto na fronteira do Canadá com os EstadosUnidos da América de 188 °15 /prime1de longitude e 49 °de latitude.
1994D0577 — PT — 05.07.1999 — 001.001 — 17
▼B
ANEXO D
PARTE 1
CERTIFICADO SANITÁRIO
para a importação de sémen de bovino

1994D0577 — PT — 05.07.1999 — 001.001 — 18
▼B
13. Eu, abaixo assinado, veterinário oficial, li e estou familiarizado com a Directiva 88/407/CEE do Conselho e
declaro que:
a) ............................................................................................................................. ...... esteve indemne de pest e
(país de exportação)
bovina e de febre aftosa durante os doze meses imediatamente anteriores à colheita do sémen par a
exportação e até à data da sua expedição, não tendo sido efectuada nenhuma vacinação contra essa s
doenças durante o mesmo período;
b) O centro de colheita de sémen em que o sémen a exportar foi colhido:
i) foi aprovado ao abrigo das condições previstas no capítulo I do anexo A da Directiva 88/407/CEE,
ii) funcionava e era fiscalizado segundo as condições previstas no capítulo II do anexo A da Directiv a
88/407/CEE,
iii) esteve, durante o período com início 30 dias antes da data de colheita do sémen a exportar e termo 3 0
dias após a colheita (ou até à data de expedição, no caso de sémen fresco), indemne de raiva,
tuberculose, brucelose, carbúnculo bacteriano e peripneumonia contagiosa bovina;
c) Os bovinos presentes no centro de colheita de sémen:
i) são provenientes de efectivos e/ou nasceram de mães que satisfazem as condições previstas no capítul o
I do anexo B da Directiva 88/407/CEE,
ii) foram, antes de entrarem em isolamento, submetidos aos testes previstos no capítulo I do anexo B d a
Directiva 88/407/CEE,
iii) satisfizeram as condições de entrada em isolamento e reagiram negativamente aos testes previstos n o
capítulo I do anexo B da Directiva 88/407/CEE,
iv) foram submetidos, no caso de permanecerem no centro há pelo menos um ano, aos testes de rotin a
previstos no capítulo II do anexo B da Directiva 88/407/CEE;
d) O sémen a exportar:
i) é proveniente de dadores residentes em
.............................................................................................................................
(país de exportação)
no período de seis meses imediatamente anterior à colheita do sémen para exportação e que satisfaze m
as condições previstas no anexo C da Directiva 88/407/CEE,
ii) foi obtido de dadores que:
— se encontram num centro de colheita de sémen em que todos os bovinos foram, nos 12 mese s
imediatamente anteriores à colheita do sémen para exportação, submetidos, com resultados nega -
tivos, a um teste de seroneutralização ou a uma prova ELISA para a rinotraqueíte bovin a
infecciosa/vulvovaginite pustulosa infecciosa (1),
ou
— foram submetidos, com resultados negativos, a um teste de seroneutralização ou a uma prov a
ELISA para a rinotraqueíte bovina infecciosa/vulvovaginite pustulosa infecciosa nos 12 mese s
imediatamente anteriores à colheita de sémen para exportação (1),
ou
— são seropositivos, tendo sido vacinados em conformidade com o disposto no capítu1o II do anexo B
da Directiva 88/407/CEE e apresentado resultados negativos num teste de seroneutralização o u
ELISA efectuado no centro aprovado de colheita de sémen antes da vacinação (1),
(1) Riscar o que não interessa.
1994D0577 — PT — 05.07.1999 — 001.001 — 19
▼B
►(1)◄
►(2)◄
iii) foi transformado, armazenado e transportado de forma a satisfazer as condições previstas na Directiv a
88/407/CEE,
iv) é proveniente de dadores que, num laboratório aprovado, foram submetidos por duas vezes, com u m
intervalo não superior a 12 meses, aos testes a seguir indicados, antes e depois da colheita (a amostr a
de sangue para o segundo dos testes referidos deve ser colhida pelo menos 21 dias após a colheita d o
sémen para exportação):
— uma prova ELISA do bloqueio para a febre catarral, em conformidade com o anexo E,
— uma prova de imunodifusão em ágar-gel em conformidade com o anexo E e um teste de neutrali -
zação do vírus para todos os serotipos da doença hemorrágica epizoótica cuja existência no paí s
exportador é conhecida,
— um teste de seroneutralização para o vírus Akabane.
Feito em. .........................................................,
(local)em................................................................
(data)
/SS74(Carimbo) (2)Assinatura (2): .......................................................................
Nome em letras de imprensa: .....................................................
Título oficial: . .......................................................................
►(2)◄
(2) A assinatura e o carimbo devem ter uma cor diferente da dos caracteres impressos.
►(1)M1
►(2)M1
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PARTE 2
Lista de países terceiros autorizados a utilizar o modelo de certificado
sanitário constante da parte 1 do anexo D
AUSTRÁLIA
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ANEXO E
Protocolo para uma prova de imunoabsorção enzimática de bloqueio ou
competitiva utilizando um anticorpo monoclonal específico de grupo para a
detecção dos anticorpos do vírus da febre catarral
PROVA ELISA COMPETITIVA UTILIZANDO O ANTICORPO MONO-
CLONAL 3-17-A3
A prova permite detectar anticorpos para todos os serotipos conhecidos do vírus
da febre catarral (VFC).
O fundamento da prov a é a interrupção da reacção entre o antigénio do VFC e
um anticorpo monoclonal específico de grupo (3-17-A3) por adição de soro deensaio a diferentes diluições. Os anticorpos do VFC presentes no soro de ensaiobloqueiam a reactividade do anticorpo monoclonal (AMC), o que origina umaredução do desenvolvimento esperado da cor resultante da adição de substratoenzimático.
MATERIAL E REAGENTES
1. Placas de microtítulo de fundo plano.
2. Antigénio: preparado conforme descrito.3. Tampão de bloqueio : 5 % (p/v) pó de leite seco «Marvel», 0,1 % (v/v)
Tween-20 (fornecido em xarope monolaurato de polioxietileno sorbitol) em
sistema tampão fosfatado (STF).
4. Anticorpo monoclonal (AMC): 3-17-A3 (fornecido na forma de sobrenadante
da cultura de tecidos de hibridoma), armazenado a − 20 °C ou liofilizado,
diluído a 1/50 com um tampão de bloqueio antes da utilização, dirigido contrao polipeptido p7 específico do grupo.
5. Conjugado: globulina de coelho anti-rato (adsorvida e eluída), conjugada com
peroxidase de rábano silvestre e mantida ao abrigo da luz a 4 °C.
6. Substrato e cromogénio: 0,2 g de ortofenileno diamina (OFD) dissolvidos
num tampão que consiste em 2,553 g de ácido cítrico e 4,574 g de hidroge-nortofosfato dissódico perfazendo até 500 ml com água destilada, dividido emalíquotas de 25 ml e mantido ao abrigo da luz a − 20 °C; imediatamente antes
da utilização, são adicionados 12 µl/25 ml de peróxido de hidrogénio (30 %
p/v).
MANIPULAR CUIDADOSAMENTE O OFD — UTILIZAR LUVAS DE
BORRACHA — SUSPEITA DE EFEITO MUTAGÉNICO
7. Ácido sulfúrico 1 molar: 26,6 ml de ácido, adicionados a 473,4 ml de água
destilada.
NÃO ESQUECER — ADICIONAR SEMPRE O ÁCIDO À ÁGUA, nuncaa
água ao ácido.
8. Agitador orbital.9. Leitor de placa ELISA (a prova pode ser lida visualmente).
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FORMATO DE ENSAIO
PROTOCOLO DE ENSAIO
Controlo em branco
A faixa 1, de A a H, representa um controlo em branco que compreende o
antigénio do VFC e o conjugado. Pode ser utilizado para aferir o leitor ELISA.
Controlo do AMC
A faixa 2, d eAaH , representa o controlo do AMC e compreende o antigénio do
V F C ,oA M Ceoc onjugado. Trata-se de um controlo negativo. A média dos
valores da densidade óptica desta faixa de controlo corresponde ao valor deinibição de 0 %.
Controlo positivo
A faixa 3, d eAaH , representa o controlo positivo. Compreende o antigénio do
VFC, as diluições de antisoro positivo do VFC, o AM Ceoconjugado. Trata-se
de um indicador de que o ensaio está a decorrer com normalidade, devendo serobtidos, de ensaio para ensaio, níveis de inibição equivalentes.
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Sorosde ens aio
No formato de ensaio atrás indicado podem ser ensaiados 18 soros com as
diluições de 1/2, 1/4, 1/8 e 1/16. Obter-se-ão, desta forma, informações relativasao título do anticorpo nos soros a ensaiar. A gama de diluições poderia seralargada para obter títulos finais de diluição do soro. Por outro lado, para estudosserológicos em grande escala, o soro pode ser ensaiado a uma única diluição(1/4) ou a duas diluições (1/2 e 1/4) como prova rápida de controlo.
TÉCNICA
1. Diluir o antigénio do VFC até à concentração pré-titulada em STF. Proceder à
dissociação ultra-sónica para dispersar os agregados do vírus (não dispondodo aparelho necessário, pipetar vigorosamente) e adicionar 50 µl a todas as
cavidades da placa ELISA. Bater ligeiramente nos bordos da placa paradispersar o antigénio.
2. Incubar a 37 °C durante 60 minutos num agitador orbital. Lavar as placas
passando-as três vezes por água e esvaziar as cavidades com STF não estéril esecar com um papel absorvente.
3. Adicionar 50 µl de tampão de bloqueio por cavidade. Adicionar os soros de
ensaio e um soro positivo nas cavidades apropriadas e diluir o conteúdo daplaca com a ajuda de uma pipeta de canais múltiplos. Não adicionar soro nemao controlo em branco nem ao controlo do AMC.
4. Imediatamente após a adição dos soros de ensaio, diluir o AMC em tampão
de bloqueio (a uma diluição pré-titulada) e adicionar 50 µl a todas as
cavidades da placa, excepto ao controlo em branco.
5. Incubar a 37 °C durante 60 minutos num agitador orbital. Lavar três vezes
com STF e secar com um papel absorvente.
6. Diluir o concentrado de coelho anti-rato a 1/5 000 num tampão de bloqueio e
adicionar 50 µl a todas as cavidades da placa.
7. Incubar a 37 °C durante 60 minutos num agitador orbital. Lavar três vezes
com STF e secar com um papel absorvente.
8. Descongelar o OFD e, imediatamente antes da utilização, adicionar 12 µld e
peróxido de hidrogénio a 30 % por cada 25 ml de OFD. Adicionar 50 µla
todas as cavidades da placa. Aguardar que a cor se desenvolva duranteaproximadamente 10 minutos e parar a reacção com ácido sulfúrico 1 molar(50µl por cavidade). A cor deve-se desenvolver nas cavidades de controlo
AMC e nas cavidades que contêm soros sem anticorpos do VFC.
9. Examinar e registar as placas, ou visualmente ou com recurso a um leitor
espectrofotométrico.
ANÁLISE DOS RESULTADOS
Calcular o valor médio da densidade óptica (DO) a partir dos controlos AMC.
Esse valor representa o valor de inibição de 0 %. Os valores da densidade ópticados soros a testar são expressos em valores de inibição percentuais e calculadospor meio da fórmula seguinte:
Valores de inibição percentuais = 100 − DO na presença do soro de ensaioDO na
ausência do soro de ensaio × 100
Os valores de inibição superiores a 40 % para uma diluição do soro a 1/4 são
considerados positivos. A leitura visual é possível visto uma inibição de 40 % sero mais baixo valor facilmente visível a olho nu.
PREPARAÇÃO DO ANTIGÉNIO DO VFC PARA O MÉTODO ELISA
1. Lavar três vezes dez roux de células BHK-21 confluentes com um meio
«Eagle» isento de soro e infectar com o serotipo 1 do vírus da febre catarralnum meio «Eagle» isento de soro.
2. Incubar a 37 °C e examinar diariamente o efeito citopatogénico (ECP).
3. Quando o ECP se tornar manifesto em 80 a 90 % da camada de células de
cada roux, recolher o vírus por agitação, destacando as células aderentes aovidro.
4. Centrifugar a 2 000 a 3 000 rpm (rotações por minuto) para agregar as
células.
5. Eliminar a fracção sobrenadante e colocar novamente as células em
suspensão em aproximadamente 30 ml de STF que contenh a1%d e
«Sarkosyl »e2m ld e fluoreto de fenolmetilsulfonil (tampão lise). Isto pode
provocar uma gelificação das células, podendo ser adicionado mais lise parareduzir esse efeito.
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Nota:o fluoreto de fenolmetilsulfonil é uma substância perigosa; manipular
com muito cuidado.
6. Proceder à dissociação das células durante 60 segundos utilizando uma
sonda ultra-sónica a uma amplitude de 30 mícrons.
7. Centrifugar a 10 000 rpm durante 10 minutos.8. Recolher a fracção sobrenadant ea+4 °C e colocar o agregado de células
remanescente em 10 a 20 ml de lise.
9. Proceder à dissociação ultra-sónica e clarificar, recolher a fracção sobrena-
dante em cada fase, num total de três vezes.
10. Reunir as fracções sobrenadantes e centrifugar a 24 000 rpm durante 120
minutos a uma temperatura de + 4 °C sobre uma almofada de 5 ml de
sucrose a 40 % (p/v em STF) utilizando tubos de centrifugação Beckmannde 30 ml e um rotor SW 28.
11. Eliminar a fracção sobrenadante, escorrer cuidadosamente os tubos e
suspender novamente o agregado em STF por dissociação ultra-sónica.Recolher o antigénio em alíquotas a − 70 °C.
TITULAÇÃO DO ANTIGÉNIO DO VFC PARA O MÉTODO ELISA
A titulação do antigénio da febre catarral para o método ELISA é feita pelo
método indirecto ELISA. Titulação de diluições a 1/2 do antigénio contra umadiluição constante (1/50) de anticorpo monoclonal 3-17-A3. O protocolo é oseguinte:
TÉCNICA
1. Diluir o antigénio da VFC em STF ao longo de uma placa de microtítulo
numa série de diluições a 1/2 (50 µl/cavidade) utilizando uma pipeta de canais
múltiplos.
2. Incubar durante uma hora a 37 °C num agitador orbital.
3. Lavar três vezes as placas com STF.4. Adicionar 50 µl de anticorpo monoclonal 3-17-A3 (diluído a 1/50) a cada
uma das cavidades da placa de microtítulo.
5. Incubar durante uma hora a 37 °C num agitador orbital.
6. Lavar três vezes as placas com STF.7. Adicionar 50 µl de globulina de coelho anti-rato conjugada com peroxidase
de rábano silvestre, diluída numa concentração pré-titulada óptima, a cadacavidade da placa de microtítulo.
8. Incubar durante uma hora a 37 °C num agitador orbital.
9. Adicionar um substrato e um cromogénio como indicado atrás. Parar a
reacção após 10 minutos por meio da adição de ácido sulfúrico 1 molar (50 µl
por cavidade).
No ensaio competitivo, o anticorpo monoclonal deve encontrar-se em excesso,
devendo por essa razão ser escolhida uma diluição de antigénio que se encontrena curva de titulação (e não na zona de planalto) que resulte numa densidadeóptica de aproximadamente 0,8 após 10 minutos.
Protocolo para uma prova de imunodifusão em ágar-gel para a detecção dos
anticorpos da doença hemorrágica epizoótica
A prova de imunodifusão em ágar-gel é realizada de acordo com o protocolo
seguinte:
MATERIAL E REAGENTES
1. Antigénio
Preparar o antigénio, precipitando num sistema de cultura de células compa-
tível com a multiplicação rápida serótipo(s) adequado(s) do vírus da doençaepizoótica hemorrágica. São recomendadas as células BHK ou Vero. O anti-génio está presente no fluido sobrenadante no termo do crescimento do vírus,mas, para ser eficaz, a sua concentração deve ser 50 a 100 vezes superior.Esta concentração obtém-se através de qualquer método padrão de concen-tração de proteínas; o vírus do antigénio pode ser inactivado por meio daadição de 0,3 % (v/v) de beta-propiolactona.
2. Soro de controlo positivo conhecido
Utilizando o soro internacional de referência e antigénio, é produzido um
soro-tipo nacional, padronizado para obtenção de uma proporção óptimarelativamente ao soro internacional de referência, liofilizado e utilizado comoo soro de controlo conhecido em cada ensaio.
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3. Soro de ensaio.
TÉCNICA
1. Deitar agaros ea1% preparada num tampão de borato ou de barbitol de
sódio, com um pH entre 8,5 e 9,0 numa placa de Petri a uma profundidademínima de 3,0 mm.
2. Cria-se no ágar uma estrutura de sete cavidades isentas de humidade, cada
uma com 5,0 mm de diâmetro. A estrutura consiste numa cavidade central eseis cavidades dispostas num círculo com um raio de 3 mm.
3. Preencher a cavidade central com o antigénio padrão. As cavidades circun-
dantes 2 ,4e6s ã o preenchidas com soro positivo e as 1 ,3e5co mo soro de
ensaio.
4. O sistema é colocado em incubação durante um período que pode ir até 72
horas à temperatura ambiente numa câmara húmida fechada.
INTERPRETAÇÃO
Um soro de ensaio é positivo caso resulte na formação de uma linha de precipi-
tina específica com o antigénio e numa linha de identidade total com o soro decontrolo. O soro de ensaio é negativo caso se não forme uma linha específica ecaso não deforme a linha correspondente ao soro de controlo. As placas de Petridevem ser examinadas contra um fundo escuro e com uma iluminação indirecta.