1973L0046 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 1
Este documento constitui um instrumento de documentação e não vincula as instituições
►BQUARTA DIRECTIVADA COMISSÃO
de 5 de Dezembro de 1972
queestabelecemétodosdeanálisecomunitáriosparaocontrolooficialdosalimentosparaanimais
(73/46/CEE)
(JO L 83 de 30.3.1973, p. 21)
Alterada por:
JornalOficial
n.opágina data
►M1 Directiva 81/680/CEE da Comissão de 30 de Julho de 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2 Directiva 92/89/CEE da Comissão de 3 de Novembro de 1992 L 344 35 26.11.1992
▼B
QUARTA DIRECTIVADA COMISSÃO
de 5 de Dezembro de 1972
que estabelece métodos de análise comunitários para o controlo
oficial dos alimentos para animais
(73/46/CEE)
A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,
Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Euro-
peia,
Tendo em conta a Directiva do Conselho, de 20 de Julho de 1970, rela-
tiva à introdução de métodos de colheita de amostras e a métodos de
análise comunitários para o controlo oficial dos alimentos paraanimais (
1), alterada pela Directiva n.o72/275/CEE de 20 de Julho de
1972 (2) e, nomeadamente, o seu artigo 2.o,
Considerando que a referida directiva prevê que os controlos oficiais
dos alimentos para animais, para constatar se são respeitadas as
condições previstas, por força das disposições legislativas, regulamen-
tares ou administrativas relativas à qualidade e composição dosalimentos para animais, sejam efectuados de acordo com os métodosde colheita de amostras e métodos de análise comunitários;
Considerando que as Directivas n.
o71/250/CEE, n.o71/393/CEE e
n.o72/199/CEE da Comissão, de 15 de Junho de 1971 (3), 18 de
Novembro de 1971 (4) e 27 de Abrilde 1972 (5), fixaram já um deter-
minado número de métodos de análise comunitários; que, tendo emconta o avanço dos trabalhos efectuados desde então, se consideraconveniente adoptar uma quarta série de métodos;
Considerando que as medidas previstas na presente directiva estão em
conformidade com o parecer do Comité Permanente dos Alimentospara Animais;
ADOPTOU A PRESENTE DIRECTIVA:
Artigo 1.o
Os Estados-membros determinam que as análises para os controlos
oficiais dos alimentos para animais, no que se refere ao teor em humi-
dade das gorduras e dos óleos animais e vegetais, bem como os teoresem magnésio e em celulose bruta dos alimentos, sejam efectuadassegundo os métodos descritos no Anexo I da presente directiva.
Artigo 2.o
Os Estados-membros determinam que as análises para o controlooficialdos al imentos para animais, no que diz respeito aos seus teoresem rétinol(vitamina A), tiamina (aneurina, vitamina B
1), ácido ascór-
bico e dehidroascórbico (vitamina C) sejam efectuadas segundo osmétodos descritos no Anexo II da presente directiva.1973L0046 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 2
(1)J O n .oL 170 de 3. 8. 1970, p. 2.
(2)J O n .oL 171 de 29. 7. 1972, p. 39.
(3)J O n .oL 155 de 12. 7. 1971, p. 13.
(4)J O n .oL 279 de 20. 12. 1971, p. 7.
(5)J O n .oL 123 de 29. 5. 1972, p. 6.▼M1
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▼M1
Artigo 3.o
Os Estados-membros porão em vigor o mais tardar, em 1 de Janeiro de
1974, as disposições legislativas, regulamentares ou administrativas
necessárias para darem cumprimento à presente directiva. Desse factoinformarão imediatamente a Comissão.
Artigo 4.
o
Os Estados-membros são destinatários da presente directiva.1973L0046 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 3
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ANEXO I
1.DOSAGEMDEHUMIDADENASGORDURASEÓLEOSANIMAISE
VEGETAIS
1.Objecto e domínio de aplicação
O método permite determinar o teor em humidade (água e outras matérias
voláteis) das gorduras e dos óleos animais e vegetais.
2.Princípio
A amostra é submetida a secagem a 103 ºC até que cesse a diminuição de
massa. A perca e massa é determinada por pesagem.
3.Aparelhagem — Instrumentos
3.1. Recipiente de fundo plano, em material resistente à corrosão, diâmetro:
8 a 9 cm, altura: cerca de 3 cm.
3.2. Termómetro de mercúrio com globo reforçado e câmara de dilatação na
extremidade superior, graduado de cerca de 80 ºC a pelo menos 110 ºC,
comprimento: cerca de 10 cm.
3.3. Banho de areia ou placa de aquecimento eléctrica.
3.4. Secador, contendo um desidratante eficaz.
3.5. Balança analítica.
4.Modo como operar
Pesar, com 1 mg de aproximação, cerca de 20 g da amostra homogeneizada
no recipiente (3.1) seco e com tara calculada, contendo o termómetro (3.2).
Aquecer em banho de areia ou na placa de aquecimento (3.3), agitando cons-
tantemente com ajuda do termómetro, de modo a que a temperatura atinja
90 ºC em cerca de 7 minutos.
Reduzir a intensidade do aquecimento, segundo a frequência em que as
bolhas sobem do fundo do recipiente. A temperatura não deverá ultrapassar
105 ºC.
Continuar a agitar, raspando o fundo do recipiente até que cesse a formação
de bolhas.
A fim de assegurar a eliminação total da humidade, repetir várias vezes o
aquecimento 103 ºC ± 2 ºC, arrefecendo até 93 ºC entre os aquecimentos
sucessivos. Em seguida deixar arrefecer no dessecador (3.4) até que atinga a
temperatura ambiente e pesar. Repetir esta operação até que a perda de massa
entre duas pesagens sucessivas não exceda mais de 2 mg.
N.B. Um aumento de massa da amostra após aquecimento repetido indica
uma oxidação da gordura. Neste caso calcular o resultado a partir da
pesagem efectuada imediatamente antes do começo do aumento de
massa.
5.Cálculo dos resultados
O teor em humidade por percentagem da amostra é dado pela fórmula:
M1/C0M2 ðÞ /C1100
M0
na qual:
M0= massa, em gramas, da amostra em ensaio,
M1= massa, em gramas, do recipiente com o respectivo conteúdo, antes
do aquecimento
M2= massa, em gramas, do recipiente com o respectivo conteúdo, após
aquecimento.
Os resultados inferiores a 0,05 por cento devem ser indicados através da
referência «menos de 0,05 por cento».
Repetibilidade
A diferença entre os resultados obtidos em duas determinações paralelas
efectuadas numa mesma amostra não deve exceder 0,05 por cento em valor
absoluto.1973L0046 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 4
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2.DOSAGEM EM MAGNÉSIO
— por espectrofotometria de absorção atómica —
1.Objecto e domínio de aplicação
O método permite dosear o magnésio existente nos alimentos para animais.
Este método está particularmente indicado para determinar os teores em
magnésio inferiores a 5 %.
2.Princípio
A amostra será incinerada e posta em solução no ácido clorídrico diluído. Se
não contiver substâncias orgânicas, será posta directamente em solução ácido
clorídrico diluído. A solução será diluída e o teor em magnésio é determi-
nado por espectrofotometria de absorção atómica a 285,2 nm,
comparativamente a soluções-padrão.
3.Reagentes
3.1. Ácido clorídrico p.a., d: 1,163.2. Ácido clorídrico p.a., d: 1,193.3. Magnésio em tira ou em fio, ou sulfato de magnésio MgSO
4.7 H2O p.a.
seco em vácuo à temperatura ambiente.
3.4. Solução de sal de estrôncio (clorato ou nitrato) a 2,5 (p/v) de estrôncio
(= 76,08 g de SrCl2.6 H2O p. a./1 ou 60,38 g de Sr (NO3)2p.a./1)
3.5. Solução-padrão de magnésio: pesar a cerca de 1 mg, 1 g magnésio (3.3),
ao qual se retirou previamente, com cuidado, a sua película de óxido, ou
uma quantidade correspondente de sulfato de magnésio (3.3), introduzi-
-lo num balão aferido para 1 000 ml, juntar 80 ml de ácido clorídrico
(3.1), deixar dissolver e completar até 1 000 ml com água. 1 ml desta
solução contém 1,000 mg de magnésio.
4.Aparelhagem
4.1. Cadinho para incineração em platina, quartzo ou porcelana.4.2. Forno de muflar, eléctrico, com termóstato.
4.3. Espectrofotómetro de absorção atómica.
5.Modo de operar
5.1.Introdução em solução
5.1.1.Alimentos constituídos exclusivamente de substâncias minerais
Pesar, a cerca de 1 mg, 5 g de amostra e introduzi-los num balão
aferido a 500 ml , com 250 a 300 mlde água. Juntar 40 mlde
ácido clorídrico (3.1), trazer até ebulição e manter o líquido em
ebulição suave durante 30 minutos. Deixar arrefecer, completar
o volume com água, homogeneizar e filtrar para um copo de
precipitação seco, através de um filtro de pregas seco. Deitar
para os primeiros 30 mlda matéria fil trada.
Em presença de silício, tratar 5 g da amostra numa quantidade
suficiente (15 a 30 ml) de ácido clorídrico (3.2) evaporar a seco
sobre banho de água. Prosseguir conforme indicado, a partir da
terceira frase de 5.1.2.
5.1.2.Alimentos constituídos essencialmente de substâncias minerais.
Pesar, com 1 mg de aproximação, 5 g de amostra num cadinho
para incineração e incinerar a 550 ºC no forno de mufla, até à
obtenção de cinzas isentas de partículas carbonizadas. Para
eliminar o silício, juntar às cinzas uma quantidade suficiente (15
a 30 ml) de ácido clorídrico (3.2) e evaporar a seco sobre banho
de água. Secar seguidamente durante uma hora na estufa a 105 ºC.
Retomar o resíduo por 10 mlde ácido cl orídrico (3.1) e transferir
com a ajuda de água quente num balão aferido a 500 ml. Trazer
até ebulição, deixar arrefecer e completar o volume com água.
Homogeneizar e filtrar para um copo de precipitação seco através
de um filtro plissado seco. Rejeitar os 30 primeiros ml do
filtrado.1973L0046 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 5
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5.1.3.Alimentos constituídos essencialmente de substâncias orgânicas
Pesar, com 1 mg de aproximação, 5 g de amostra num cadinho
para incineração e incinerar a 550 ºC num forno de mufla, até
obtenção de cinzas isentas de partículas carbonizadas. Retomar
as cinzas por 5 mlde ácido cl orídrico (3.2), evaporar a seco sobre
um banho de água e secar seguidamente durante uma hora na
estufa a 105 ºC, para insolubilizar o silício. Retomar o resíduo
por 5 mlde ácido cl orídrico (3.1), transferir, com a ajuda de
água quente, para um balão aferido a 250 ml, trazer até ebulição,
deixar arrefecer e completar o volume com água. Homogeneizar e
filtrar para um copo de precipitação seco, através de um filtro
plissado seco. Rejeitar os primeiros 30 ml do filtrado.
5.2.Medida de absorção atómica
Preparar, diluindo a solução-padrão (3.5) em água, pelo menos 5
soluções de referência de concentrações crescentes, escolhidas em
função da zona de medida óptima do espectrofotómetro. Juntar a cada
solução 10 ml de solução de sal de estrôncio (3.4) e completar em
seguida o volume de 100 ml com água.
Diluir em água, uma parte alíquota do filtrado obtido em 5.1.1, 5.1.2 ou
5.1.3 de forma a obter uma concentração de magnésio compreendida nos
limites de concentração das soluções de referência.
A concentração de ácido clorídrico nesta solução não deve exceder
0,4 N. Juntar 10 ml de solução de sal de estrôncio (3.4) e completar
seguidamente o volume de 100 ml com água.
Medir a absorção da solução a dosear e das soluções de referência no
comprimento de onda de 285,2 nm.
6.Cálculo dos resultados
Calcular a quantidade de magnésio da amostra a partir das soluções de
referência. Exprimir o resultado em percentagem da amostra.
Repetibilidade
A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas na
mesma amostra não deverá exceder 5 %, em valor relativo.
3.DETERMINAÇÃODO TEOR DE FIBRA BRUTA
1.Objectivo e campo de aplicação
O presente método permite efectuar o doseamento, em alimentos para
animais, de substâncias orgânicas isentas de gordura e insolúveis em meio
ácido e em meio alcalino, convencionalmente designadas por fibra bruta.
2.Resumo do processo
A amostra, eventualmente desengordurada, é tratada sucessivamente com
soluções de ácido sulfúrico e hidróxido de potássio em ebulição, de concen-
trações determinadas. O resíduo é separado por filtração num cadinho de
vidro sinterizado, lavado, seco, pesado e calcinado a uma temperatura
compreendida entre 475 e 500 ºC. A perda de massa resultante da calcinação
corresponde à fibra bruta presente na amostra em estudo.
3.Reagentes e auxiliares
3.1. Ácido sulfúrico, c = 0,13 mol/l.3.2. Agente antitensioactivo (por exemplo, n-octanol).3.3. Adjuvante de filtração (Celite 545 ou equivalente), aquecido a 500 ºC
durante quatro horas (8.6).
3.4. Acetona.3.5. Éter de petróleo — ponto de ebulição 40-60 ºC.
3.6. Ácido clorídrico, c = 0,5 mol/l.
3.7. Solução de hidróxido de potássio, c = 0,23 mol/l.1973L0046 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 6
▼M2
▼M2
4.Aparelhos e utensílios
4.1. Unidade de aquecimento para a digestão com ácido sulfúrico ou hidró-
xido de potássio, equipada com um suporte para o cadinho de filtração
(4.2) e com um tubo, munido de uma torneira, para a saída do líquido e
para efectuar o vácuo, por recurso eventuala ar comprimido. Cada dia,
antes do uso, proceder ao pré-aquecimento da unidade com água em
ebulição, durante cinco minutos.
4.2. Cadinho de filtração de vidro, com uma placa filtrante de vidro fundido
sinterizado de porosidade 40 - 90 µm. Antes da primeira utilização,
aquecer a 500 ºC durante alguns minutos, arrefecendo em seguida (8.6).
4.3. Proveta de ebulição com uma capacidade mínima de 270 ml, equipada
com um condensador de refluxo.
4.4. Estufa de secagem, termostatizada.4.5. Forno de mufla, termostatizado.4.6. Unidade de extracção a frio, constituída por um suporte para o cadinho
de filtração (4.2) e por um tubo de descarga equipado com torneira, para
efectuar o vácuo e para a saída do líquido.
4.7. Juntas para a montagem da unidade de aquecimento (4.1), cadinho de
filtração (4.2) e proveta de ebulição (4.3) para a ligação da unidade de
extracção a frio (4.6) e do cadinho.
5.Técnica
Pesar com a precisão de ± 0,001 g, 1 g de amostra, previamente preparada,
transferindo-a para o cadinho de filtração (4.2), (ver 8.1, 8.2 e 8.3) e
adicionar 1 g de adjuvante de filtração (3.3).
Montar a unidade de aquecimento (4.1) e o cadinho de filtração (4.2), adap-
tando em seguida a proveta de ebulição (4.3) ao cadinho. Adicionar à proveta
150 ml de ácido sulfúrico (3.1), em ebulição, juntando algumas gotas de
agente antitensioactivo (3.2), se necessário. Levar o líquido à ebulição em
5 ± 2 minutos, deixando ferver vigorosamente durante exactamente 30
minutos.
Abrir a torneira do tubo de descarga (4.1) e filtrar, sob vácuo, o ácido sulfú-
rico através do cadinho de filtração. Ainda sob vácuo, lavar o resíduo no
filtro com três porções sucessivas, de 30 ml cada, de água em ebulição. Asse-
gurar que o resíduo fica seco por aspiração, após cada lavagem.
Fechar a torneira e adicionar à proveta 150 mlde hidróxido de potássio (3.7)
em ebulição. Juntar algumas gotas de agente antitensioactivo (3.2). Levar o
líquido à ebulição em 5 ± 2 minutos, deixando ferver vigorosamente durante
exactamente 30 minutos. Filtrar o resíduo, lavando-o de modo idêntico ao
descrito no tratamento com ácido sulfúrico.
Após a última lavagem e secagem desligar o cadinho, com o seu conteúdo e
adaptá-lo à unidade de extracção a frio (4.6). Ligar o vácuo e lavar o resíduo
com três porções sucessivas, de 25 mlcada, de acetona (3.4), secando o
resíduo por aspiração, após cada lavagem.
Secar o cadinho de filtração até massa constante, na estufa, a 130 ºC. Após
cada secagem, arrefecer no exsicador e pesar de imediato. Colocar o cadinho
no forno de mufla, calcinando até massa constante, entre 475 e 500 ºC,
durante pelo menos 30 minutos.
Após cada calcinação, proceder ao arrefecimento na mufla e, em seguida no
exsicador, antes de pesar.
Efectuar um ensaio em branco. A perda de massa resultante da calcinação
não deverá neste caso, exceder 4 mg.
6.Cálculo dos resultados
O teor da fibra bruta, expresso em percentagem da amostra, é dado pela
expressão:
b/C0c ½/C138 /C2 100
a
sendo
a = massa da amostra, em g.
b = perda de massa, após calcinação durante a determinação, em g.
c = perda de massa, após calcinação durante o ensaio em branco, em g.1973L0046 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 7
▼M2
7.Repetibilidade
A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas, efectuadas
com a mesma amostra não deverá exceder:
— 0,3 em valor absoluto, para os teores de fibra bruta inferiores a 10 %,
— 3 %, em valor relativo, em relação aos resultados mais elevados, para os
teores de fibra bruta iguais ou superiores a 10 %.
8.Observações
8.1. Os alimentos para animais cujo teor de gordura bruta seja superior a
10 % deverão ser previamente desengordurados, por recurso a éter de
petróleo (3.5). Adaptar o cadinho de filtração (4.2) com a amostra
pesada à unidade de extracção a frio (4.6) e lavar, sob vácuo, com três
porções sucessivas, de 30 mlcada, de éter de petról eo (3.5). Secar a
amostra por aspiração. Adaptar o cadinho com o seu conteúdo à unidade
de aquecimento (4.1), continuando de acordo com a descrição efectuada
em 5.
8.2. Os alimentos para animais que contenham gorduras que não possam ser
extraídas directamente com éter de petróleo (3.5) deverão ser desengor-
durados de acordo com o método descrito em 8.1 e sujeitos a um novo
processo de desengorduramento, precedido do tratamento com ácido em
ebulição.
Após tratamento com ácido e lavagem subsequente, adaptar o cadinho
com o seu conteúdo à unidade de extracção a frio (4.6), lavando com
três porções sucessivas, de 30 mlcada, de acetona, seguidas de três
porções sucessivas, também de 30 ml, de éter de petróleo. Secar por
aspiração e continuar o processo de acordo com a descrição efectuada
em 5, começando pelo tratamento com hidróxido de potássio.
8.3. Se o teor dos alimentos para animais em carbonatos, expressos em
termos de carbonato de cálcio, exceder 5 %, adaptar o cadinho (4.2)
com a amostra pesada, à unidade de aquecimento (4.1). Lavar a amostra
com três porções sucessivas, de 30 mlcada, de ácido cl orídrico (3.6).
Após cada adição, deixar a amostra repousar durante cerca de um
minuto, antes de filtrar. Lavar com 30 ml de água, continuando de
acordo com a descrição efectuada em 5.
8.4. No caso da utilização de uma bateria de aparelhos (vários cadinhos
ligados à mesma unidade de aquecimento), não se deverá proceder a
dois doseamentos diferentes com a mesma amostra, na mesma série.
8.5. Se, após a ebulição, a filtração das soluções ácidas e alcalinas se revelar
difícil, proceder à introdução de ar comprimido pelo tubo de descarga da
unidade de aquecimento, continuando em seguida a filtração.
8.6. Com vista a prolongar a vida média dos cadinhos de filtração de vidro, é
conveniente não utilizar temperaturas de calcinação superiores a 500 ºC.
Dever-se-ão igualmente evitar quaisquer choques térmicos excessivos no
decurso dos ciclos de aquecimento e arrefecimento.1973L0046 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 8
▼B
ANEXO II
1.DOSAGEM DE RETINOL (VITAMINAA)
1.Objecto e domínio de aplicação
O método permite dosear o rétinol(vitamina A) nos al imentos, concen-
trados e pré-misturas. O limite inferior de dosagem é de 10 000 UI/kg
para alimentos fortemente pigmentados e de 4 000 UI/kg para os outros
produtos (1). Os produtos são classificados em dois grupos, segundo o seu
presumido teor em rétinol:
Grupo A: teores inferiores a 200 000 UI/kg,
Grupo B: teores iguais ou superiores a 200 000 UI/kg.
2.Princípio
A amostra é hidrolisada a quente por uma solução de hidróxido de
potássio em meio etanólico e em presença de um antioxigénio ou em
atmosfera de azoto. A mistura é submetida à extracção pelo 1,2-diclore-
tano. O extracto será evaporado a seco e retomado pelo éter de petróleo.
A solução é cromatografadasobre coluna de óxido de alumínio (para os
produtos do grupo B, a cromatografia só é exigida em certos casos). O
rétinolé doseado por espectrofotometria a 610 nm após desenvol vimento
de um complexo corado, segundo a reacção de Carr-Price, no caso de
produtos do grupo A; por espectrofotometria no UV a 325 nm no caso
de produtos do grupo B.
3.Reagentes
a)Utilizados para a análise de produtos dos grupos A e B
3.1. Étenola 96 % (v/v)3.2. Solução a 10 % (p/v) de ascorbato de sódio p.a., ou3.3. Azoto, purificado3.4. Solução a 50 % (p/v) de hidróxido de potássio p.a.
3.5. Solução de hidróxido de potassio 1 N
3.6. Solução de hidróxido de potássio 0,5 N3.7. 1,2-dicloretano p.a.3.8. Éter de petróleo, puro, ebulição 30-50 ºC. Se necessário purificar
como segue. Agitar 1 000 mlde éter de petról eo com proporções
de 20 mlde ácido sul fúrico concentrado até que o ácido fique
incolor. Eliminar o ácido e lavar o éter sucessivamente por
500 mlde água, duas vezes 250 mlde uma sol ução a 10 % de
hidróxido de sódio e três vezes 500 mlde água. El iminar a
camada aquosa, secar o éter durante 1 hora em carvão activo e
sulfato de sódio anidro, filtrar e destilar
3.9. Óxido de alumínio, estandardizado segundo Brokman: calcinar
durante 8 horas a 750 ºC, arrefecer em secafor e conservar em
frasco de vidro escuro, com rolha de rodar. Antes da utilização
em cromatografia, humidificar como segue: introduzir num
frasco de vidro escuro 10 g de óxido de alumínio e 0,7 ml de
água, fechar hermeticamente, aquecer durante 5 minutos em
banho de água a ferver, agitando energicamente. Deixar arre-
fecer, agitando. Verificar a actividade do óxido de alumínio
assim preparado, submetendo à análise, de acordo com o estipu-
lado em 5.3 e 5.4, uma quantidade conhecida de rétinol padrão
(3.17)
3.10. Óxido de alumínio básico, graduado de actividade I
3.11. Éter dietílico, puro. Eliminar os peróxidos e os traços de água
para cromatografia em coluna de óxido de alumínio básico
(3.10) (25 g de óxido de alumínio para 250 ml de éter dietílico)
3.12. Soluções de éter de petróleo (3.8) a 4,8, 12,16 e 20 % (v/v) de
éter dietílico (3.11)1973L0046 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 9
(1) 1 UI = 0,3 µg de rétinol.
▼B
3.13. Solução de sulfureto de sódio 0,5 mole na glicerina a 70 % (v/v)
preparada a partir de sulfureto de sódio p.a.
b)Utilizados exclusivamente para a análise dos produtos do grupo A
3.14. Benzeno p.a., cristalizável3.15. Clorofórmio p.a. Eliminar o étanol, o fosgeno e os traços de água
por cromatografia em coluna de óxido de alumínio básico (3.10)
(50 g de óxido de alumínio para 200 ml de clorofórmio) convém
cromatografar uma segunda vez os 50 primeiros mlde el uato
3.16 Reagente segundo Carr-Price: Agitar cerca de 25 g de tricloreto
de antimónio p.a. (conservado em secador) com 100 mlde cl oro-
fórmio (3.15) até saturação da solução. Um leve depósito de
tricloreto de antimónio não prejudica. Juntar 2 ml de anidrido
acético p.a. Conservar em geleira num frasco de vidro escuro
com rolha de rodar. Duração de conservação: várias semanas
3.17. Rétinolpadrão, control ado por espectrofotometria
c)Utilizados exclusivamente para a análise de produtos do grupo B
3.18. Isopropanol, para cromatografia
4.Aparelhagem
4.1. Banho de água
4.2. Aparelho rotativo para evaporação em vácuo com balões redondos de
diferentes capacidades
4.3. Tubos para cromatografia, em vidro (comprimento: 30 mm, diâmetro
interno: cerca de 3 mm)
4.4. Espectrofotómetro com cuvetes de 10 mm de espessura (em quartzo
para medições em UV)
4.5. Lâmpada UV, 365 nm
5.Modo de operar
N.B. Todas as manipulações devem fazer-se ao abrigo de luz directa,
eventualmente num aparelho de vidro escuro.
5.1.Colheita
Tomar uma colheita de amostra dividida, proporcional ao presumido
teor em vitamina A, seja:
0,1 a 1,0 g para os concentrados (teores superiores a 20 000 UI/g),
3,0 a 5,0 g para as pré-misturas (teores compreendidos entre 400 e
20 000 UI/g),
10 a 20 g para as misturas minerais,
30 g para os produtos do grupo A
Introduzir imediatamente a colheita num balão de 500 ml de tampa
de rodar.
5.2.Hidrólise e extracção (
2)
Juntar sucessivamente à col heita 40 mlde étanol(3.1), 2 mlde
solução de ascorbato de sódio (3.2) (2), 10 ml de solução de hidró-
xido de potássio (3.4) e 2 ml de solução de sulfureto de sódio (3.13).
Aquecer durante 30 minutos a 70-80 ºC sob refrigerante de refluxo e
seguidamente deixar arrefecer sob corrente de água. Juntar 50 mlde
étanol (3.1) e 100 ml (colhidos com pipeta) de 1,2-dicleritano (3.7).
Agitar energicamente e decantar o líquido sobrenadante numa ampola
de decantar. Juntar na ampola 150 ml de solução de hidróxido de
potássio (3.5), agitar durante 10 segundos e deixar repousar até sepa-
ração das fases. Recolher a fase dicloretânia (fase inferior) numa
ampola de decantar, juntar 40 ml de solução de hidróxido de potássio
(3.6), agitar durante 10 segundos e deixar repousar até separação das1973L0046 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 10
(2) A adição de ascorbato de sódio não é necessária quando a hidrólise é efectuada em
atmosfera de azoto.(
1) Para os alimentos de aleitamento e os produtos com tendência para se aglomerarem ou
incharem, «dobrar» a quantidade dos reagentes indicados em 5.2, primeiro e segundo
parágrafos.
▼B
fases. Recolher a fase dicloretânica numa ampola de decantar e lavar
6 a 8 vezes com ajuda de porções de 40 mlde água, até à ausência de
alcalino (experiência com fenólftalina). Recolher a fase dicloretânica
e eliminar os últimos traços de água com a ajuda de tiras de papel de
filtro.
Evaporar a seco uma parte alíquota da solução, a vácuo e sobre
banho de água à temperatura de 40 ºC. Retomar rapidamente o
resíduo por 5 mlde éter de petról eo (3.8).
Para os produtos do grupo A , cromatografar como indicado em 5.3.1.
Para os produtos do grupo B , transferir a solução num balão aferido
de 50 ml, completar o volume com éter de petróleo (3.8), homoge-
neizar e medir a densidade óptica como indicado em 5.4.2.
5.3.Cromatografia
5.3.1.Produtos do grupo A
Encher um tubo para cromatografia (4.3), até à altura de
200 mm, com óxido de alumínio (3.9) previamente impreg-
nado de éter de petróleo (3.8). Introduzir a solução obtida em
5.2 no tubo e juntar imediatamente 20 mlde éter de petról eo
(3.8).
Eluar sucessivamente em porções de 10 ml das soluções de
éter de petróleo a 4, 8, 12, 16 e 20 % de éter dietílico (3.12),
em vácuo parcial, ou sob pressão, sendo a velocidade de esco-
amento de 2 a 3 gotas por segundo.
O caroteno é eluído em primeiro lugar (1). O rétinolé geral -
mente eluído em solução de éter de petróleo em 20 % de éter
dietílico (3.12). A eluição é controlada sob luz IV (breve irra-
diação da coluna por uma lâmpada de mercúrio). A banda
fluorescente de rétinol separa-se nitidamente das bandas
amarelas de xantofila que a seguem. Recolher a fracção de
eluato contendo o rétinol num erlenmeyer.
5.3.2.Produtos do grupo B
A cromatografia não deve ser efectuada se as medidas de
densidade óptica obtidas em 5.4.2 não estão em conformidade
com as indicações dadas em 5.4.2.
Se a cromatografia se afigura necessária, introduzir na coluna
cromatográfica uma parte alíquota da solução em éter de
petróleo obtido em 5.2, contendo cerca de 500 UI de rétinol,
e cromatografar como indicado em 5.3.1.
5.4.Medida de densidade óptica
5.4.1.Produtos do grupo A
Evaporar a seco, em vácuo, o eluato contendo o rétinol, obtido
em 5.3.1. Retomar o resíduo por 2 mlde benzeno (3.14).
Tomar 0,3 mldesta sol ução e juntar 3 mlde reagente segundo
Carr-Price (3.16). Desenvolve-se uma coloração azul. Medir á
densidade óptica no espectrofotómetro a 610 nm, extacamente
30 segundos após o início da reacção. Determinar o teor em
rétinol, em referência a uma curva-padrão obtida a partir de
soluções de benzeno de concentrações crescentes em rétinol
padrão tratados pelo reagente segundo Carr-Price (2 a 16 UI
de vitamina A padrão (3.17) por 0,3 mlde benzeno (3.14) +
3 mldo reagente segundo Carr-Price (3.16). A curva padrão
deve ser controlada regularmente e em certos intervalos de
tempo, com a ajuda do padrão e de uma solução, preparada
de fresco, do reagente segundo Carr-Price.
5.4.2.Produtos do grupo B
Tomar uma parte alíquota da solução em éter de petróleo
obtido em 5.2, contendo cerca de 200 UI de rétinol. Evaporar
a seco, em vácuo, e retomar o resíduo por 25 mlde isopro-
panol(3.18). Medir a densidade óptica com o
espectrofotómetro a 325, 310 e 334 nm. O máximo de1973L0046 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 11
(1) O teor em caroteno pode ser determinado pela medida da densidade óptica a 450 nm;
E1%
1c m¼2 600 :
▼B
absorção situa-se a 325 nm. O teor em rétinolA da sol ução é
calculado como segue:
E325. 18,30 = UI de rétinol
contudo, os relatórios das densidades ópticas
E310:E325eE334:E325
devem ser de 6:7 = 0,857.Se um destes relatórios se afasta sensivelmente deste valor
((0,830 ou) 0,880), a medida das densidades ópticas deve ser
precedida de uma cromatografia, segundo o processo indicado
em 5.3.2. Se a medida das densidades ópticas efectuada, após a
cromatografia, indica que os relatórios citados se afasta ainda
sensivelmente do valor 0,857 ((0,830 ou) 0,880), a dosagem
deve ser efectuada segundo o processo indicado para os
produtos do grupo A.
6.Cálculo dos resultados
Calcular o teor em rétinol da amostra, tendo em conta do peso da amostra
em ensaio e das diluições efectuadas no decurso da análise. Exprimir o
resultado em UI de rétinol por quilo.
Repetibilidade
A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas
na mesma amostra, não deve exceder:
— 20 %, em valor relativo, para os teores em rétinol inferiores a
75 000 UI/kg,
— 15 000 UI para os teores compreendidos entre 75 000 e 150 000 UI/kg,— 10 %, em valor relativo, para os teores compreendidos entre 150 000 e
250 000 UI/kg,
— 25 000 UI para os teores compreendidos entre 250 000 e 500 000 UI/
/kg,
— 5 %, em valor relativo, para os teores superiores a 500 000 UI/kg.
2.DOSAGEM DA TIAMINA (ANEURINA,VITAMINAB
1)
1.Objecto e domínio de aplicação
O método permite dosear a tiamina (aneurina, vitamina B1) nos alimentos, os
concentrados e as pré-misturas. O limite inferior de dosagem é de 5 ppm.
2.Princípio
A amostra é tratada a quente pelo ácido sulfúrico diluído e hidrolisado segui-
damente por via enzimática. A solução obtida é submetida a uma oxidação
alcalina. O tiocromo formado é extraído por isobutanol e doseado por fluori-
metria.
3.Reagentes
3.1. Solução padrão de tiamina a 100 µg/ml: dissolver 112,3 mg de clori-
drato de tiamina muito pura, previamente seca a vazio até peso
constante, em 1000 mlde ácido sul fúrico 0,2 N (3.2). A frio e na
obscuridade esta solução é estável durante um mês.
3.2. Acido sulfúrico 0,2 N
3.3. Metabisulfito de sódio, Na2S2O5, puro
3.4. Solução a 20 % (p/v) de ferrocianeto de potássio p.a.
3.5. Solução a 25 % (p/v) de hidróxido de potássio p.a.
3.6. Mistura oxidante: misturar 2 mlde sol ução de ferrocianeto de potássio
(3.4) com 48 mlde sol ução de hidróxido de potássio (3.5). Esta
mistura não se conserva mais que 4 h
3.7. Isobutanol, p.a.
3.8. Solução de acetato de sódio 2,5 N3.9. Preparação multienzimática contendo protease, fosfatase e amilase (por
ex: clarase)
3.10. Étanola 96 % (v/v)1973L0046 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 12
▼B
4.Aparelhagem
4.1. Banho de água
4.2. Centrifugadora (3 500 t/m) com tubos de 30 a 50 ml, munidos de
tampas de rodar.
4.3. Fluorímetro
5.Modo de operar
5.1.Hidrólise enzimática
Introduzir em dois balões aferidos A e B, de 250 ml, quantidades
idênticas da amostra, finamente dividida, contendo cerca de 100 µg de
tiamina e 125 mlde ácido sul fúrico (3.2). Juntar, ainda, apenas no balão
A, 1,0 mlde sol ução padrão (3.1) (padrão interno).
Agitar vigorosamente, levar os balões a um banho de água fervente e
mantê-los ai durante 15 minutos, agitando de vez em quando. Deixar
arrefecer até cerca de 45 ºC. Juntar em cada balão 20 ml de solução de
acetato de sódio (3.8) e 0,5 g de preparação multienzimática (3.9),
deixar repousar seguidamente durante 20 minutos, à temperatura ambi-
ente. Juntar 20 ml de solução de acetato de sódio (3.8), completar o
volume com água, homogeneizar e filtrar. Recolher os filtrados A e B
após ter eliminado os 15 primeiros ml. Preparar as soluções seguintes.
5.1.1.Solução testemunha T
Introduzir num tubo centrifugador (4.2), 5 mldo fil trado A e
cerca de 10 mg de metabisulfito de sódio (3.3). Mergulhar o
tubo, durante 15 minutos, num banho de agúa fervente e deixar
arrefecer seguidamente até à temperatura ambiente.
5.1.2.Soluções A (padrão interno) e B (amostra)
Introduzir 5 mldo fil trado A num tubo centrifugador (4.2) e 5 ml
do filtrado B noutro tubo centrifugador (4.2).
5.2.Oxidação
Juntar às soluções T, A e B, 5 ml da mistura oxidante (3.6) e, após um
minuto, 10 mlde isobutamol(3.7). Fechar os tubos e agitar vigorosa-
mente durante 5 segundos. Deixar repousar durante 1 minuto e
centrifugar para separar as fases. Tomar em cada tubo 5 mlda fase
isobutanólica, introduzi-los respectivamente em balões aferidos a 25 ml,
completar o volume por étanol (3.10) e homogeneizar (= extractos T, A
e B).
5.3.Medida da fluroescência
Efectuar as medidas ao longo da ondora para a qual o fluorímetro dá
uma resposta óptima à fluorescência do tiocromo. Irradiar a cerca de
365 nm.
Ajustar o instrumento a zero, com o auxílio do extracto T. Medir a
intensidade da fluorescência dos extractos A e B.
6.Cálculo dos resultados
O teor em µg de tiamina por kg de amostra é dado pela fórmula:
d/C1b
a/C0b ðÞ c
na qual:
a = intensidade da fluorescência do extracto A (padrão interno)
b = intensidade da fluorescência do extracto B (amostra)
c = peso da amostra de ensaio em gd = quantidade de tiamina em µg acrescentada à amostra em ensaio
(padrão interno).
Repetibilidade
A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas
sobre a mesma amostra não deve exceder:
10 %, em valor relativo, para os teores inferiores a 500 ppm e
5 %, em valor relativo, para os teores iguais ou superiores a 550 ppm.1973L0046 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 13
▼B
3.DOSAGEM DE ÁCIDO ASCÓRBICO E DE ÁCIDO DE HIDRO-
ASCÓRBICO(VITAMINAC)
1.Objecto e domínio de aplicação
O método permite dosear a soma dos ácidos ascórbico e hidroascórbico (vita-
mina C) nos alimentos, concentrados e pré-misturas. O limite inferior da
dosagem é de 5 ppm. Os produtos são classificados em dois grupos, segundo
o seu teor presumido, em vitamina C:
Grupo A: teores inferiores a 10 g/kg
Grupo B: teores iguais ou superiores a 10 g/kg.
2.Princípio
A amostra, colocada em suspensão numa solução diluída de ácido metafosfó-
rico, é submetida a extracção por clorofórmio. A fase aquosa é tratada por
uma solução de 2,6-diclorofenol-indofenol, para transformar o ácido ascór-
bico em ácido dehidroascórbico, e seguidamente por uma solução de 2,4-
-dinitrofenilidrazina. A hidrazona formada é extraída atráves de uma mistura
de acetato de étilo, de ácido acético glacial e de acetona. A solução é croma-
tografada sobre uma coluna de «geleia» de sílico, o eluato é evaporado a
seco e o resíduo é dissolvido em ácido sulfúrico diluído. A densidade óptica
da solução é medida por fotómetro a 509 nm.
Para os produtos do grupo A , o eluato resultante da cromatografia em
coluna, é submetido, ainda, a uma cromatografia em camada fina, para isolar
a hidrazona.
3.Reagentes
3.1. Solução padrão a 0,05 % de ácido L-ascórbico: dissolver 50 mg de
ácido L-ascórbico p.a. em cerca de 20 mlde sol ução de ácido metafos-
fórico (3.2) e completar com água até 100 ml. Preparar imediatamente
antes da utilização
3.2. Solução a 10 % (p/v) de ácido metafosfórico: dissolver em água 200 g
de ácido metafosfórico p.a., triturados em almofariz, e completar com
água até 2 000 ml. Conservar a 4 ºC. Renovar após uma semana
3.3. Clorofórmio p.a.3.4. Solução a 0,5 % (p/v) de 2,6-diclorofenol-indofenol p.a. Preparar
imediatamente antes da utilização.
3.5. Auxiliar de filtração (S. e S. n.
o121 ou equivalente)
3.6. Solução ácida a 2 % (p/v) de 2,4-dinitrofenilidrazina: dissolver 2 g de
2,4-dinitrofenilidrazina em 100 ml de ácido sulfúrico diluído (25 ml de
ácido sulfúrico p.a., d: 1,84, diluídos em 100 ml através de agúa). Ao
frio, esta solução conserva-se uma semana
3.7. Azoto ou
3.8. Anidrido carbónico3.9. Mistura de acetato de étilo p.a./ácido acético glacial/acetona p.a.: 96/2/
/2 em vol.
3.10. Mistura de diclorometano p.a./ácido acético glacial: 97/3 em vol.3.11. Geleia de sílico, granulometria: 0,05 a 0,2 mm3.12. Geleia de sílico H, segundo Stahl, para cromatografia em camada fina3.13. Ácido sulfúrico diluído: introduzir 105 ml de água num balão aferido
para 200 ml, completar o volume com ácido sulfurico p.a., d: 1,84
3.14. Solvente de eluição para cromatografia em camada fina: misturar 75 ml
de éter dietílico p.a. 4,0 ml de ácido acético a 96 % (p/v) p.a. Renovar
após 2 a 3 cromatografias.
4.Aparelhagem
4.1. Banho de água regulada a 20 ºC por ultratermóstato
4.2. Centrifugadora (3 500 t/m) com tubos de 40 a 50 ml, munidos de
tampas de rodar
4.3. Aparelho rotativo, para evaporação em vácuo, com balões de 250 ml1973L0046 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 14
▼B
4.4. Tubos para cromatografia, em vidro (comprimento: 100 mm, diâmetro
interno: 20 mm), com placa de vidro (por ex: tubos de Allihn)
4.5. Espectrofotómetro ou colorímetro com filtros, com cuvetes de 10 mm de
epessura
4.6. Aparelhagem para cromatógrafo em camada fina, com placas de geleia
de sílico (3.12), espessura de camada: 0,5 a 0,6 mm (servem as placas
prontas para uso). Secar as placas durante 2h 30 a 3h na estufa a
120—130 ºC. Deixar arrefecer e conservar seguidamente em secador
durante pelo menos 24h antes de utilizar
4.7. Estufa, regulada para 120—130 ºC.
5.Modo de operar
5.1.Extracção
Introduzir em dois balões aferidos para 250 ml, A e B, com tampa de
rodar, quantidades idênticas à amostra, dividida finamente, contendo
cercade 200 µg de vitamina C. Juntar, somente, no balão A, 0,4 ml de
solução padrão (3.1) e homogeneizar, agitando ligeiramente (padrão
interno).
Juntar em cada balão 30 ml de clorofórmio (3.3) e 25 ml de solução de
ácido metafosfórico (3.2) a 4 ºC. Agitar rapidamente e em seguida
deixar repousar 10 a 15 minutos. Juntar 25 mlde água, tapar os bal ões,
agitar vigorosamente durante 10 segundos e deixar arrefecer 10 a 15
minutos em banho de água (4.1). Centrifugar para separar a fase aquosa
de fase clorofórmica. Prosseguir as operações simultaneamente sobre os
extractos aquosos A (padrão interno) e B, como indicado seguidamente.
5.2.Oxidação
Com uma pipeta, tomar 40 ml da solução aquosa sobrenadante (ligeira-
mente turva) obtida em 5.1, introduzir num tubo de reacção com tampa
de rodar, juntar 0,5 a 1 ml de solução de 2,6-diclorofenol-indofenol (3.4)
e homogeneizar. Forma-se uma coloração vermelha que deve persistir
pelo menos 15 minutos. Juntar em seguida cerca de 300 mg de auxiliar
de filtração (3.5), agitar e filtrar em filtro de pregas, seco. O filtrado não
tem obrigatoriamente que ser límpido.
5.3.Reacção com a 2,4-dinitrofenilidrazina e extracção da hidrazona
Com a pipeta, tomar 10 ml do filtrado obtido em 5.2, introduzi-los num
tubo centrifugador (4.2), juntar 2 ml de solução de 2,4-dinitrofenilidra-
zina (3.6) e homogeneizar. Fazer passar rapidamente pelo tubo uma
corrente de azoto ou de ácido carbónico (3.8), tapar o tubo e mergulhá-
-lo durante cerca de 15 h (uma noite) em banho de água (4.1). Juntar
seguidamente 3 mlde água, 20 mlde mistura acetato de étil o/ácido
acético glacial/acetona (3.9) e cerca de 800 mg de auxiliar de filtração
(3.5). Tapar o tubo, agitar vigorosamente durante 30 segundos e centri-
fugar. Introduzir 15 mlda fase sobrenadante num bal ão de evaporação,
e evaporar sob pressão reduzida no evaporador rotativo (4.3) até
obtenção de um resíduo oleoso. Dissolver o resíduo em 2 ml da mistura
acetato de étilo/ácido acético glacial/acetona (3.9) aquecendo a 50 ºC,
deixar arrefecer, juntar 10 mlda mistura dicl orometano/ácido acético
glacial (3.10) e homogeneizar.
5.4.Cromatografia em coluna
Encher um tubo para cromatografia (4.4) até uma altura de 30 mm, com
a mistura diclorometano/ácido acético glacial (3.10). Colocar em
suspensão (agitando vigorosamente) 5 g de geleia de sílico (3.11) em
30 ml da mistura diclorometano/ácido acético glacial (3.10), deitar a
suspensão no tubo. Deixar formar depósito e comprimir seguidamente
sob fraca pressão de azoto (3.7).
Transvazar no tubo a solução obtida em 5.3, lavar o balão com uma
pequena quantidade da mistura diclorometano/ácido acético glacial
(3.10) e transvazar no tubo. Seguidamente encher este com a mistura
(3.10) e prosseguir a lavagem da coluna com a mesma (3 a 4 porções
de cerca de 5 ml) até obtenção de um eluato incolor. Eliminar a fracção
de eluato colorido de amarelo.
Eluir a zona avermelhada no cimo da coluna pela mistura de acetato de
étilo/ácido acético glacial/acetona (3.9), recolher o eluato e evaporar a
seco.
5.4.1.Para os produtos do grupo A (teores em vitamina C inferiores a
10 g/kg) dissolver o resíduo em 2,0 ml da mistura acetato de1973L0046 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 15
▼B
étilo/ácido acético glacial/acetona (3.9) e proceder imediatamente
à cromatografia em camada fina, como indicado em 5.5.
5.4.2.Para os produtos do Grupo B (teores em vitamina C iguais ou
superiores a 10 g/kg) , retomar o resíduo oleoso em 4,0 ml de
ácido sulfúrico diluído (3.13), agitar vigorosamente para dissolver
completamente o resíduo e proceder à medida da densidade
óptica como indicado em 5.6.
5.5.Cromatografia em camada fina
Efectuar duas vezes as operações indicadas seguidamente. Depositar,
sob forma de marca, na placa para cromatografia em camada fina (4.6)
0,5 ml da solução obtida em 5.4.1. Desenvolver durante, pelo menos, 20
minutos com ácido solvente de eluição (3.14), em cuba saturada, até
separação nítida da zona de hidrazona colorida em rosa. Deixar secar
ao ar. Delimitar a zona rosa, raspar esta com a ajuda de uma espátula
e transferir quantitativamente a massa pulverulente num tubo para
cromatografia (4.4).
El uir sucessivamente, uma vez em 2 mle duas vezes em 1,5 mlde
mistura acetato de étilo/ácido acético glacial/acetona (3.9). Recolher o
eluato num pequeno balão (a última fracção deve ser incolor). Evaporar
a seco, retomar o resíduo oleoso em 4,0 ml de ácido sulfúrico diluído
(3.13) agitar vigorosamente para dissolver completamente o resíduo e
proceder à medida da densidade óptica.
5.6.Medida da densidade óptica
Medir a densidade óptica no fotómetro a 509 nm, 20 a 30 minutos
depois da colocação em solução do resíduo em ácido sulfúrico. Efectuar
as medidas por comparação com o ácido sulfúrico diluído (3.13).
5.7.Ensaio a branco
Na ausência de amostra efectuar um ensaio a branco, aplicando o
mesmo modo de operar.
6.Cálculo dos resultados
O teor em g de vitamina C por kg de amostra é dado pela fórmula:
c/C0a ðÞ /C1 2
b/C0c ðÞ /C1 10 d
na qual:
a = densidade óptica do branco
b = densidade óptica da solução do padrão internoc = densidade óptica da solução da amostrad = peso, em gramas, da amostra em ensaio.
RepetibilidadeA diferença entre os resultados de duas determinações paralelas, efectuadas
em relação à mesma amostra, não deverá exceder 10 %, em valor relativo,
para os teores em vitamina C inferiores a 10 g/kg e 5 %, em valor relativo,
para os teores iguais ou superiores a 10 g/kg.1973L0046 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 16