1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 1
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►BREGULAMENTO (CEE) N.o2568/91 DA COMISSÃO
de 11 de Julho de 1991
relativoàscaracterísticas dosazeitesedosóleosdebagaçodeazeitona,bemcomoaosmétodosde
análise relacionados
(JO L 248 de 5.9.1991, p. 1)
Alterado por:
Jornal Oficial
n.opágina data
►M1Regulamento (CEE) n.o3682/91 da Comissão de 17 de Dezembro de
1991L 349 36 18.12.1991
►M2Regulamento (CEE) n.o1429/92 da Comissão de 26 de Maio de 1992 L 150 17 2.6.1992
►M3Regulamento (CEE) n.o1683/92 da Comissão de 29 de Junho de 1992 L 176 27 30.6.1992
►M4Regulamento (CEE) n.o1996/92 da Comissão de 15 de Julho de 1992 L 199 18 18.7.1992
►M5Regulamento (CEE) n.o3288/92 da Comissão de 12 de Novembro de
1992L 327 28 13.11.1992
►M6Regulamento (CEE) n.o183/93 da Comissão de 29 de Janeiro de 1993 L 22 58 30.1.1993
►M7alterado pelo Regulamento (CEE) n.o826/93 da Comissão de 6 de
Abril de 1993L 87 6 7.4.1993
►M8Regulamento (CEE) n.o620/93 da Comissão de 17 de Março de 1993 L 66 29 18.3.1993
►M9Regulamento (CE) n.o177/94 da Comissão de 28 de Janeiro de 1994 L 24 33 29.1.1994
►M10Regulamento (CE) n.o2632/94 da Comissão de 28 de Outubro de 1994 L 280 43 29.10.1994
►M11Regulamento (CE) n.o656/95 da Comissão de 28 de Março de 1995 L 69 1 29.3.1995
►M12Regulamento (CE) n.o2527/95 da Comissão de 27 de Outubro de 1995 L 258 49 28.10.1995
Rectificado por:
►C1Rectificação, JO L 347 de 28.11.1992, p. 69 (2568/91)
►C2Rectificação, JO L 176 de 20.7.1993, p. 26 (183/93)
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REGULAMENTO (CEE) N.o2568/91 DA COMISSÃO
de 11 de Julho de 1991
relativo àscaracterísticas dosazeites e dosóleos de bagaçode azei-
tona, bem como aos métodos de análise relacionados
A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,
Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Euro-peia,
Tendo em conta o Regulamento n.
o136/66/CEE do Conselho, de 22 de
Setembro de 1966, que estabelece uma organização comum de mercado
no sector das matérias gordas(1), com a última redacção que lhe foi
dada pelo Regulamento (CEE) n.o3577/90(2), e, nomeadamente, o seu
artigo 35.oA,
Considerando que o anexo do Regulamento n.o136/66/CEE estabelece
as denominações e definições dos azeites e dos óleos de bagaço deazeitona comercializados no interior de cada Estado-membro, bem
como nas trocas comerciais intracomunitárias e com países terceiros;
Considerando que, para poder distinguir os diversos tipos de azeite e
óleo de bagaço de azeitona, há que definir as características físico--químicas de cada um deles, bem como as característicasorganolépticas dos azeites virgens, por forma a assegurar a pureza e aqualidade dos produtos em causa, sem prejuízo de outras disposiçõesexistentes na matéria;
Considerando que é conveniente determinar de modo uniforme, em
toda a Comunidade, a presença das características dos diversos tipos
de azeite e óleo de bagaço de azeitona; que, para o efeito, é necessárioestabelecer métodos comunitários de análise química e de apreciaçãoorganoléptica; que, no entanto, é conveniente autorizar, durante umperíodo transitório, a utilização de outros métodos de análise aplicados
nos Estados-membros, com a condição de, em caso de divergência de
resultados, serem determinantes os obtidos de acordo com o métodocomum;
Considerando que a definição das características físico-químicas dos
azeites e óleos de bagaço de azeitona e o estabelecimento dos métodosde análise implicam a adaptação das notas complementares do capítulo15 da Nomenclatura Combinada;
Considerando que o método de avaliação das características organolép-
ticas dos azeites virgens prevê a criação de júris de provadores
seleccionados e formados; que é, por conseguinte, conveniente prevero prazo necessário para a instalação dessa estrutura; que, atendendo àsdificuldades que serão sentidas por determinados Estados-membros naconstituição dos júris de provadores, é conveniente autorizar o recurso
a júris existentes em outros Estados-membros;
Considerando que, para assegurar o correcto funcionamento do sistema
dos direitos niveladores aplicáveis à importação de bagaços de azei-tona, é conveniente prever um método único para a determinação doteor de óleo desses produtos;
Considerando que, para não causar um prejuízo ao comércio, deve ser
previsto um período limitado para o escoamento dos azeites e óleos debagaço de azeitona acondicionados antes da entrada em vigor do
presente regulamento;
Considerando que deve, consequentemente, ser revogado o Regula-
mento (CEE) n.
o1058/77 da Comissão(3), com a última redacção que
lhe foi dada pelo Regulamento (CEE) n.o1858/ /88(4);1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 2
(1)J O n .o172 de 30. 9. 1966, p. 3025/66.
(2)J O n .oL 353 de 17. 12. 1990, p. 23.
(3)J O n .oL 128 de 24. 5. 1977, p. 6.
(4)J O n .oL 166 de 1. 7. 1988, p. 10.
▼B
Considerando que o Comité de Gestão das Matérias Gordas não emitiu
parecer no prazo fixado pelo seu presidente,
ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO:
Artigo 1.o
1. São considerados azeites virgens, na acepção do ponto 1, alíneas
a), b) e c), do anexo do Regulamento n.o136/66/CEE, os azeites que
apresentem as características indicadas nos pontos 1, 2 e 3 do anexo Ido presente regulamento.
2. É considerado azeite virgem lampante, na acepção do ponto 1,
alínea d), do anexo do Regulamento n.
o136/66/CEE, o azeite que apre-
sente as características indicadas no ponto 4 do anexo I do presenteregulamento.
3. É considerado azeite refinado, na acepção do ponto 2 do anexo do
Regulamento n.
o136/66/CEE, o azeite que apresente as características
indicadas no ponto 5 do anexo I do presente regulamento.
4. É considerado azeite, na acepção do ponto 3 do anexo do Regu-
lamento n.o136/66/CEE, o azeite que apresente as características
indicadas no ponto 6 do anexo I do presente regulamento.
5. É considerado óleo de bagaço de azeitona bruto, na acepção do
ponto 4 do anexo do Regulamento n.o136/66/CEE, o óleo que apre-
sente as características indicadas no ponto 7 do anexo I do presenteregulamento.
6. É considerado óleo de bagaço de azeitona refinado, na acepção do
ponto 5 do anexo do Regulamento n.
o136/66/CEE, o óleo que apre-
sente as características indicadas no ponto 8 do anexo I do presente
regulamento.
7. É considerado óleo de bagaço de azeitona, na acepção do ponto 6
do anexo do Regulamento n.o136/66/CEE, o óleo que apresente as
características indicadas no ponto 9 do anexo I do presente regula-mento.
Artigo 2.
o
1. A determinação das características dos azeites e óleos de bagaço
de azeitona previstas no anexo I do presente regulamento é efectuadade acordo com os seguintes métodos de análise:
— para a determinação dos ácidos gordos livres, expressos em percen-
tagem de ácido oleico, o método constante do anexo II,
— para a determinação do índice de peróxidos, o método constante do
anexo III,
— para a determinação dos álcoois alifáticos, o método constante do
anexo IV,
— para a determinação do teor de esteróis, o método constante do
anexo V,
— para a determinação do eritrodiol, e uvaol o método constante do
anexo VI,
— para a determinação dos ácidos gordos saturados em posição 2 nos
triglicéridos, o método constante do anexo VII,
— para a determinação do teor de trilinoleína, o método constante do
anexo VIII,
— para a análise espectrofotométrica, o método constante do anexo
IX,
— para a determinação dos ácidos gordos componentes, o método
constante dos anexos XA e XB,
— para a determinação dos solventes halogenados voláteis, o método
constante do anexo XI,
— para a avaliação das características organolépticas dos azeites
virgens, o método constante do anexo XII, aplicado em conformi-dade com o n.
o2,1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 3
▼B
— para a prova da refinação, o método constante do anexo XIII;
— para a determinação dos estigmastadienos, o método constante do
Anexo XVII.
2.►M3O analista, perito em análise sensorial ou assistido por
peritos, ◄procede à avaliação das características organolépticas de
acordo com o processo descrito na ficha de prova referida no anexoXII. No caso de o analista determinar características organolépticasdiferentes das correspondentes à denominação do produto, deve fazer
examinar a amostra por um júri de provadores, em conformidade com
o disposto no anexo XII.
A análise de revisão é efectuada pelo júri conforme as disposições
citadas.
Para a apreciação das características organolépticas para operações
ligadas ao regime de intervenção, o júri de provadores procederá aessa apreciação em conformidade com o disposto no anexo XII.
Artigo 3.
o
Até►M628 de Fevereiro de 1993 ◄, a introdução dos métodos de
análise previstos no artigo 2.onão obsta a que os Estados-membros
utilizem outros métodos experimentados e cientificamente válidos,desde que não resulte daí entrave à livre circulação dos produtos reco-nhecidos conformes à regulamentação nos termos dos métodos
comunitários. Antes de os utilizarem, os Estados-membros em causa
comunicarão esses métodos à Comissão.
No caso de um desses métodos dar um resultado diferente do determi-
nado pelo método comum, prima o resultado obtido em aplicação dométodo comum.
Artigo 3.
oA
Em caso de divergência quanto às características organolépticas de um
azeite que seja objecto de transacções comerciais, as partes interessadaspodem dirigir-se a um júri de provadores aprovado da sua escolha.
Artigo 3.
oB
Caso se verifique que as características organolépticas de um azeite são
diferentes das que decorrem da sua denominação, o Estado-membro emcausa aplicará, sem prejuízo de outras sanções eventuais, sanções pecu-niárias administrativas, cujo montante será determinado em função da
gravidade da irregularidade detectada.
Para efeitos da avaliação da irregularidade, será nomeadamente tida em
conta a evolução natural das características de um azeite que tenha sido
conservado em condições normais.
No início de cada semestre, os Estados-membros informarão a
Comissão do número e da natureza das irregularidades detectadas edas sanções aplicadas no decurso do semestre anterior.
Artigo 4.
o
1. Para efeitos da apreciação das características organolépticas, os
Estados-membros criarão júris de provadores encarregados do controlopúblico dessas características, os quais devem satisfazer as seguintescondições:
— ser constituídos por provadores seleccionados e formados de acordo
com as regras previstas pelo método do anexo XII,
— possuir as instalações e o material necessários à avaliação organo-
léptica, em conformidade com as regras previstas pelo método atráscitado,1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 4
▼M11
▼B
▼M5
▼M5
— utilizar o vocabulário específico da análise sensorial do azeite, a
folha do perfil e a tabela da pontuação previstos pelo referidométodo,
— assumir o compromisso de realizar as avaliações organolépticas
previstas no plano comunitário ou internacional aquando decontrolos periódicos e de sessões de harmonização de critérios depercepção,
— assumir o compromisso de fornecer anualmente à Comissão todas
as informações sobre as alterações registadas na constituição do
júri e o número de avaliações realizadas na qualidade de júri apro-vado.
Cada Estado-membro procederá à aprovação dos júris que satisfaçam
as condições acima descritas e que tenham sido criados no seu terri-
tório. Designará, de entre estes, o ou os júris encarregados das
análises de revisão.
Os júris criados pelos Estados-membros antes de 1 de Novembro de
1992, de acordo com as regras previstas pelo método referido no anexo
XII, serão considerados como aprovados na acepção do presente artigo.
Cada Estado-membro comunicará a lista dos júris aprovados à
Comissão e aos outros Estados-membros.
2. Caso um Estado-membro encontre dificuldades na criação de um
júri de provadores no seu território, pode recorrer a um júri de prova-
dores aprovado noutro Estado-membro.
3. Cada Estado-membro estabelecerá a lista dos júris de provadores
criados por organizações profissionais ou interprofissionais, em confor-
midade com as condições estabelecidas no n.
o1 e velará pelo respeito
dessas condições.
Artigo 5.o
As notas complementares 2, 3 e 4 do capítulo 15 da Nomenclatura
Combinada constantes do anexo I do Regulamento (CEE) n.o2658/87
do Conselho(1) são substituídas pelo texto constante do anexo XIV do
presente regulamento.
Artigo 6.o
1. O teor de ►C1óleo de bagaço ◄e outros resíduos da extracção
do azeite (códigos NC 2306 9011 e 2306 9019) é determinado emconformidade com o método constante do anexo XV.
2. O teor de óleo referido no n.
o1 é expresso em percentagem do
seu peso em relação ao extracto seco.
Artigo 7.o
São aplicáveis as disposições comunitárias respeitantes à presença de
substâncias indesejáveis para além das referidas no anexo XI.
Artigo 8.o
1. Cada Estado-membro comunicará à Comissão as medidas
tomadas para aplicação do presente regulamento.
2. Os Estados-membros comunicarão à Comissão, no início de cada
semestre, uma súmula dos dados analíticos das determinações efec-
tuadas durante o semestre anterior.
Esses resultados são examinados pelo Comité de Gestão das Matérias
Gordas, de acordo com o processo previsto no artigo 39.odo Regula-
mento n.o136/66/CEE.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 5
(1)J O n .oL 256 de 7. 9. 1987, p. 1.▼M6
▼B
▼B
Artigo 9.o
É revogado o Regulamento (CEE) n.o1058/77.
Artigo 10.o
1. O presente regulamento entra em vigor no terceiro dia seguinte ao
da sua publicação no Jornal Oficial das Comunidades Europeias .N o
entanto, o método constante do anexo XII é aplicável a partir de
►M11 de Novembro de 1992 ◄, salvo no que concerne às
operações ligadas à intervenção.
Este método não se aplica aos azeites virgens acondicionados antes de
1 de Novembro de 1992.
2. O presente regulamento não é aplicável aos azeites e óleos de
bagaço de azeitona acondicionados antes da entrada em vigor do
presente regulamento e comercializados até 31 de Outubro de 1992.
O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e
directamente aplicável em todos os Estados-Membros.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 6
▼M5
▼B
▼B
ANEXOS
Sumário
Anexo I: Características dos azeites e óleos de bagaço de azeitona …
Anexo II: Determinação da acidez …
Anexo III: Determinação do índice de peróxidos …Anexo IV: ►
M6Determinação do teor de ceras por intermédio de croma-
tografia gás-líquido com coluna capilar ◄…
Anexo V: Determinação da composição e do teor de esteróis por cromato-
grafia em fase gasosa com coluna capilar …
Anexo VI: Determinação do teor de eritrodiol e uvaol …Anexo VII: Determinação dos ácidos gordos na posição 2 nos triglicéridos
…
Anexo VIII: Determinação do teor de trilinoleína …Anexo IX: Análise por espectrofotometria no ultravioleta …
Anexo XA: Análise por cromatografia em fase gasosa de ésteres metílicos
de ácidos gordos …
Anexo XB: Preparação dos ésteres metílicos de ácidos gordos …
Anexo XI: Determinação do teor de solventes halogenados voláteis no
azeite …
Anexo XII: Exame organoléptico do azeite virgem …
Anexo XIII: ►
M6Neutralização e descoloração do azeite em
laboratório ◄…
Anexo XIV: Notas complementares 2, 3 e 4 do capítulo 15 da Nomenclatura
Combinada …
Anexo XV: Teor de óleo do bagaço de azeitona …
Anexo XVI: Determinação do índice de iodo …
Anexo XVII: Método de determinação dos estigmastadienos nos óleos vege-
tais ...1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 7
▼M11
ANEXOI
CARACTERÍSTICASDOS AZEITESE ÓLEOS DE BAGAÇO DE AZEITONA
Categoria Acidez %Índice de
peróxidos
meq O2/kgSolventes
haloge-
nados mg/
/kg (1)Ceras mg/
/kgÁcidos
gordos
saturados
na
posição 2
dostriglic-
éridos %Índice de
Estigmas-
tadieno-
s(2) mg/
/kgEritrodiol
+ Uvool
%Trilino-
leína %Colesterol
%Brasicas-
terol %Campes-
terol %Estignas-
terol %Betasitos-
terol (3)%Delta-7-
Estigmas-
tenol %Esteróis
totais mg/
/kg
1. Azeite virgem
extra M 1,0 M 20 M 0,20 M 250 M 1,3 M 0,15 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1000
2. Azeite virgem M 2,0 M 20 M 0,20 M 250 M 1,3 M 0,15 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 10003. Azeite virgem
corrente M 3,3 M 20 M 0,20 M 250 M 1,3 M 0,15 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1000
4. Azeite virgem
lampante m 3,3 m 20 m 0,20 M 350 M 1,3 M 0,50 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 — m 93,0 M 0,5 m 1000
5. Azeite refinado
refinado M 0,5 M 5 M 0,20 M 350 M 1,5 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1000
6. Azeite M 1,5 M 15 M 0,20 M 350 M 1,5 M 4,5 M 0,5 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 10007. Óleo de bagaço de
azeitona refinado m 2,0 — — — M 1,8 m 12 M 0,7 M 0,5 M 0,1 M 4,0 — m 93,0 M 0,5 m 2500
8. Óleo de bagaço de
azeitona refinado M 0,5 M 5 M 0,20 — M 2,0 m 12 M 0,6 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1800
9. Óleo de bagaço de
azeitona M 1,5 M 15 M 0,20 > 350 M 2,0 > 4,5 M 0,6 M 0,5 M 0,1 M 4,0 < Camp. m 93,0 M 0,5 m 1600
M = máximo, m = mínimo
(1) Limite total para os compostos detectados pelo detector de captura de electrões.
Para os compostos detectados individualmente o limite é de 0,10 mg/kg
(2) Soma de isómeros que podem (ou não) ser separados em coluna capilar.
(3) Delta-5-23-Estigmastadienol + Clerosterol + Sitosterol + Sitostanol + delta-5-Avenasterol + delta-5-Avenasterol + delta-5-24-Estigmastadie nol.
Nota:
Basta que uma dos característicos esteja fora dos limites fixados para que o produto seja desclassificado ou declarado não conforme quanto à sua purez a.▼M111991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 8
CategoriaComposição acídica
Somas (dos)
isómeros
transoleicosSoma (dos)
isómeros
transolino-
leicos e
translinolé-
nicos %K232K270K270com
aluminaDelta-KExame
organolép-
tico Mirístico %Linolénico
%Araquídico
%Eicosandíco
%Beénico %Lignocérico
%
1. Azeite virgem extra M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,05 M 0,05 M 2,50 M 0,20 M 0,10 M 0,01 m 6,5
2. Azeite virgem M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,05 M 0,05 M 2,60 M 0,25 M 0,10 M 0,01 m 5,5
3. Azeite virgem
corrente M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,05 M 0,05 M 2,60 M 0,25 M 0,10 M 0,01 m 3,5
4. Azeite virgem
lampante M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,10 M 0,10 M 3,70 M 0,25 M 0,11 — < 3,5
5. Azeite refinado M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,20 M 0,30 M 3,40 M 1,20 — M 0,16 —6. Azeite M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,2 M 0,2 M 0,20 M 0,30 M 3,30 M 1,00 — M 0,13 —7. Óleo de bagaço de
azeitona refinada M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,3 M 0,2 M 0,20 M 0,10 —————
8. Óleo de bagaço de
azeitona refinado M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,3 M 0,2 M 0,40 M 0,35 M 5,50 M 2,50 — M 0,25 —
9. Óleo de bagaço de
azeitona refinado M 0,05 M 0,9 M 0,6 M 0,4 M 0,3 M 0,2 M 0,40 M 0,35 M 5,30 M 2,00 — M 0,20 —
M = máximo, m = mínimo
Nota:
Basta que uma das características esteja fora dos limites fixados para que o produto seja desclassificado ou declarado não conforme quanto à sua purez a.
Para determinação da pureza, quando o K270ultrapassar o limite da respectiva categoria, é necessário fazer-se uma nova determinação do K270após passagem pela alumina.▼M111991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 9
▼B
ANEXOII
DETERMINAÇÃODA ACIDEZ
1. OBJECTIVO
Determinação dos ácidos gordos livres em azeites. O teor de ácidos
gordos livres é expresso em termos de acidez, calculada convencional-
mente, ou em índice de acidez.
1.1.Princípio
Dissolução da amostra numa mistura de solventes, seguida de titulação
dos ácidos gordos livres presentes com uma solução etanólica de hidró-
xido de potássio.
1.2.Reagentes
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica reconhecida e a água
a utilizar deve ser destilada ou de pureza equivalente.
1.2.1. Éter etílico e etanol a 95 % (V/V), mistura 1 + 1 em volume
Advertência: O éter etílico é muito inflamável e pode formar peróxidas
explosivos, pelo que deve ser utilizado com as devidas
precauções.
Neutraliza-se exactamente no momento de utilização com a solução de
hidróxido de potássio (ponto 1.2.2), em presença de 0,3 ml de solução
de fenolftaleína (ponto 1.2.3) por 100 ml de mistura.
Nota:Se não for possível utilizar éter etílico, poderá ser utilizada uma
mistura de solventes constituída por etanol e tolueno. Se
necessário, o etanol pode ser substituído por 2-propanol.
1.2.2. Solução etanólica titulada de hidróxido de potássio, c(KOH) — 0,1 mol/l
aproximadamente ou, se necessário, c(KOH) — 0,5 mol/l aproximada-
mente.
A concentração exacta da solução etanólica de hidróxido de potássio deve
ser conhecida e verificada antes da utilização. A solução deve ser incolor
ou amarelo-palha. Decantação para um frasco de vidro castanho fechado
com uma rolha de borracha.
Nota:Uma solução incolor estável de hidróxido de potássio pode ser
preparada do seguinte modo: mantém-se durante uma hora em
ebulição, sob refluxo, 1000 ml de etanol com 8 g de hidróxido de
potássio e 0,5 g de aparas de alumínio. Destila-se imediatamente.
Dissolve-se no destilado a quantidade necessária de hidróxido de
potássio. Deixa-se repousar durante vários dias e decanta-se o
líquido claro sobrenadante do precipitado de carbonato de potássio.
A solução pode também ser preparada sem destilação, do seguinte
modo:
Adicionam-se 4 ml de butilato de alumínio e deixa-se repousar a
mistura durante alguns dias. Decanta-se o líquido sobrenadante e
dissolve-se nele a quantidade necessária de hidróxido de potássio.
Esta solução está pronta para ser utilizada.
1.2.3. Fenolftaleína, solução de 10 g/l em etanol a 95—96 % (V/V) ou azul
alcalino (no caso de matérias gordas fortemente coradas), solução de
20 g/l em etanol a 95—96 % (V/V).
1.3.Aparelhos e utensílios
Material corrente de laboratório, designadamente:
1.3.1. Balança analítica.1.3.2. Erlenmeyer de 250 ml de capacidade.1.3.3. Galheta de 10 ml de capacidade, graduada em 0,05 ml.
1.4.Processo
1.4.1. Preparação da amostra para análise1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 10
▼B
A determinação é efectuada a partir da amostra filtrada. Se o teor total da
humidade e impurezas for inferior a 1 % a análise é efectuada na amostra
não filtrada.
1.4.2. Tomas de ensaio
Colhem-se as tomas de ensaio, de acordo com o índice de acidez presu-
mido, em conformidade com as indicações do quadro seguinte.
Índice de acidez presu-
midoPeso da toma de ensaio
(g)Precisão da pesagem da
toma de ensaio
< 1 20 0,05
1—4 10 0,024—15 2,5 0,01
15—75 0,5 0,001
> 75 0,1 0,0002
A pesagem deverá ser efectuada no erlenmeyer (ponto 1.3.2).
1.4.3. Determinação
Dissolve-se a toma em 50 a 100 ml de mistura éter/etanol (ponto 1.2.1)
previamente neutralizada. Titula-se, com agitação, com a solução de
hidróxido de potássio (ver nota 2) até à viragem do indicador (coloração
carmim da fenolftaleína persistente durante pelo menos 10 s).
Nota1:A solução etanólica de hidróxido de potássio (ponto 1.2.2) pode
ser substituída por solução aquosa de hidróxido de potássio ou de
sódio desde que o volume de água introduzido não conduza a
uma separação de fases.
Nota2:Se a quantidade necessária de solução de hidróxido de potássio a
0,1 mol/l ultrapassar 10 ml, utiliza-se uma solução a 0,5 mol/l.
Nota3:Se a solução se tornar turva durante a titulação, junta-se uma
quantidade suficiente da mistura de solventes (ponto 1.2.1) para
obter uma solução límpida.
1.5.Expressão da acidez em percentagem de ácido oleico
A acidez, expressa em percentagem em massa, é igual a:
V/C2c/C2M
1000/C2100
m¼V/C2c/C2M
10/C2m
em que:
V = é o volume consumido, expresso em mililitros de solução titulada
de hidróxido de potássio.
c = é a concentração exacta, em moles por litro, da solução titulada de
hidróxido de potássio utilizada.
M = é a massa molar, em gramas por mole, do ácido adoptado para a
expressão dos resultados (= 282).
m = é a massa, em gramas, da toma do ensaio.
Toma-se como resultado a média aritmética de duas determinações.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 11
▼B
ANEXOIII
DETERMINAÇÃODO ÍNDICEDE PERÓXIDOS
1. OBJECTIVO
A presente norma descreve um método para a determinação do índice de
peróxidos em óleos e gorduras.
2. DOMÍNIO DE APLICAÇÃO
A presente norma é aplicada a óleos e gorduras de origem animal e vegetal.
3. DEFINIÇÃO
O índice de peróxidos é a quantidade de substâncias presentes na amostra,
expressa em miliequivalentes de oxigénio activo por kg, capazes de oxidar
o iodeto de potássio nos condições operacionais descritas.
4. PRINCÍPIO
Tratamento da toma da amostra em estudo, dissolvida em ácido acético e
clorofórmio, com uma solução de iodeto de potássio. Titulação do iodo
libertado com uma solução padrão de tiossulfato de sódio.
5. APARELHOS E UTENSÍLIOS
Todo o equipamento usado deve estar isento de substâncias oxidantes ou
redutoras.
Nota:Não se lubrificam os contactos esmerilados.
5.1. Cápsula de vidro de 3 ml.5.2. Frascos com rolhas e juntas esmeriladas, de cerca de 250 ml de capacidade,
previamente secos e cheios de um gás inerte puro e seco (azoto ou, de
preferência, dióxido de carbono).
5.3. Galheta de 25 ou 50 ml, graduada em 0,1 ml.
6. REAGENTES
6.1. Clorofórmio, de qualidade analítica reconhecida, tornado sento de oxigénio
fazendo borbulhar uma corrente de gás inerte puro e seco.
6.2. Ácido acético glacial, de qualidade analítica reconhecida, tornado isento de
oxigénio fazendo borbulhar uma corrente de gás inerte puro e seco.
6.3. Solução aquosa saturada de iodeto de potássio, preparada recentemente e
isenta de iodo e iodatos.
6.4. Solução aquosa, rigorosamente titulada, imediatamente antes da utilização,
a 0,01 ou 0,002 N, de tiossulfato de sódio.
6.5. Solução de amido, obtida por dispersão recente em água, na proporção de
10 g/l, de amido natural solúvel.
7. AMOSTRA
A amostra deverá ser colhida e conservada na ausência de luz, devendo
ainda ser mantida a baixa temperatura e contida em recipientes de vidro
completamente cheios, hermeticamente fechados com rolhas de vidro esme-
rilado ou cortiça.
8. TÉCNICA
O ensaio deverá ser efectuado em presença de luz solar difusa ou luz artifi-
cial. Pesa-se numa cápsula de vidro (ponto 5.1) ou, na falta desta, num
frasco (ponto 5.2), com uma aproximação de 0,001 g, uma massa de toma
de acordo com o quadro seguinte, em conformidade com o índice de peró-
xidos presumido:1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 12
▼B
Índice de peróxidos presumido
(meq)Peso da toma
(g)
0 a 12 5,0 a 2,0
12 a 20 2,0 a 1,220 a 30 1,2 a 0,830 a 50 0,8 a 0,5
50 a 90 0,5 a 0,3
Abre-se o frasco (ponto 5.2) e introduz-se a cápsula de vidro contendo a
toma em estudo. Adicionam-se 10 ml de clorofórmio (ponto 6.1) e
dissolve-se a toma rapidamente, sobagitação. Adicionam-se 15 ml de
ácido acético glacial (ponto 6.2) e, de seguida, 1 ml de solução de iodeto
de potássio (ponto 6.3). Tapa-se rapidamente, agita-se durante 1 minuto, e
deixa-se durante exactamente 5 minutos na ausência de luz a uma tempera-
tura de 15 a 20 ºC.
Adicionam-se cerca de 75 ml de água destilada. Titula-se o iodo libertado
com a solução de tiossulfato de sódio (ponto 6.4) (solução 0,002 N para
valores presumidos inferiores a 12 e solução 0,01 N para valores presu-
midos superiores a 12), agitando vigorosamente e usando solução de
amido (ponto 6.5) como indicador.
Fazem-se duas determinações com a mesma amostra.
Efectua-se simultaneamente um ensaio em branco. Se o resultado do ensaio
em branco exceder 0,05 ml de solução de tiossulfato de sódio 0,01 N
(ponto 6.4), substituem-se os reagentes impuros.
9. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS
O índice de peróxidos (I.P.), expresso em miliequivalentes de oxigénio
activo por kg, é dado pela fórmula:
I:P:¼
V/C2N/C21000
m
onde:
V = é o número de mililitros de solução de tiossulfato de sódio (ponto
6.4) gasta no ensaio, com a correcção relativa ao ensaio em branco.
N = é a normalidade exacta da solução de tiossulfato de sódio utilizada.m = é a massa, expressa em gramas, da toma de amostra em estudo.
Toma-se como resultado a média aritmética das duas determinações efec-
tuadas.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 13
▼M6
ANEXOIV
DETERMINAÇÃO DO TEOR DE CERAS POR INTERMÉDIO DE
CROMATOGRAFIA GÁS-LÍQUIDOCOM COLUNA CAPILAR
1. OBJECTIVO
O presente método descreve um processo para a determinação do teor
de ceras de algumas gorduras e óleos, nas condições de ensaio.
O método pode ser utilizado, em particular, para distinguir o azeite
obtido por pressão do azeite obtido por extracção (óleo de bagaço de
azeitona).
2. PRINCÍPIO
Após a adição de um padrão interno adequado, a gordura ou o óleo em
causa é fraccionado por cromatografia numa coluna de silicagel hidra-
tada. Recolhe-se a fracção eluída em primeiro lugar, nas condições de
ensaio (fracção cuja polaridade é inferior à polaridade dos trigliceridos),
procedendo-se à análise directa por cromatografia gás-líquido com
coluna capilar.
3. EQUIPAMENTO
3.1. Erlenmeyer de 25 ml.3.2. Coluna de vidro para cromatografia, com 15 mm de diâmetro interno e
30 a 40 cm de altura.
3.3. Aparelho de cromatografia em fase gasosa com coluna capilar, equi-
pado com um sistema para a introdução directa da amostra na coluna,
constituído por:
3.3.1. Forno com termóstato para as colunas, susceptível de manter a tempe-
ratura desejada com uma precisão de ± 1 ºC.
3.3.2. Injector a frio para introdução directa na coluna.3.3.3. Detector de ionização de chama e convertedor-amplificador.3.3.4. Registador-integrador adequado para funcionamento com o conver-
tedor-amplificador (ponto 3.3.3), com tempo de resposta não superior
a um segundo e velocidade do papel variável.
3.3.5. Coluna capilar de vidro ou sílica fundida, com ►
C210 a 15 m ◄de
comprimento e 0,25 a 0,32 mm de diâmetro interno, revestida interna-
mente com líquido SE-52, SE-54 ou equivalente, numa espessura
uniforme compreendida entre 0,10 e 0,30 µm.
3.4. Microsseringa de 10 µl adequada para injecção directa na coluna, com
agulha de aço cementado.
4. REAGENTES
4.1. Silicagel 70-230 mesh, art. 7754 Merck.
Colocar a silicagel numa mufla a 500 ºC, durante quatro horas. Após
arrefecimento, adicionar 2 % de água. Agitar bem, de modo a homoge-
neizar. Conservar ao abrigo da luz durante pelo menos 12 horas antes
da utilização.
4.2. n-hexano para cromatografia.4.3. Éter etílico para cromatografia.4.4. n-heptano para cromatografia.4.5. Solução padrão de araquidato de laurilo, a 0,1 % (m/v) em hexano
(padrão interno).
4.6. Gás de arrastamento: hidrogénio, com um grau de pureza adequado
para cromatografia gás-líquido.
4.7. Gases auxiliares:
— hidrogénio, com um grau de pureza adequado para cromatografia
gás-líquido,
— ar, com um grau de pureza adequado para cromatografia gás-
-líquido.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 14
▼M6
5. PROCEDIMENTO
5.1. Separação da fracção que contém as ceras.5.1.1. Preparação da coluna cromatográfica.
Suspender 15 g de silicagel hidratada a 2 % em n-hexano anidro e
introduzir na coluna.
Deixar assentar espontaneamente e completar a operação por recurso a
um vibrador eléctrico, de modo a tornar mais homogénea a camada
cromatográfica. Fazer passar 30 ml de n-hexano para remover eventuais
impurezas.
5.1.2. Cromatografia em coluna
Pesar rigorosamente 500 mg de amostra num Erlenmeyer de 25 ml e
adicionar uma quantidade adequada de padrão interno, em função do
teor de ceras previsto. A título de exemplo, juntar 0,1 mg de araquidato
de laurilo no caso de azeite e 0,25 a 0,50 mg no caso de óleo de bagaço
de azeitona.
Transferir a amostra para a coluna cromatográfica, preparada de acordo
com o ponto 5.1.1, com o auxílio de duas porções de 2 ml de n-hexano.
Deixar fluir o solvente até 1 mm acima da camada de silicagel. Iniciar a
eluição cromatográfica, recolhendo 140 ml da mistura n-hexano/éter
etílico na proporção de 99:1, de acordo com um fluxo de cerca de 15
gotas por cada 10 segundos (2,1 ml/minuto).
Evaporar a fracção resultante num evaporador rotativo, até à eliminação
de quase todo o solvente; remover os últimos 2 ou 3 ml do mesmo com
o auxílio de uma corrente de azoto de fluxo reduzido e adicionar 10 ml
de n-heptano.
5.2. Análise por cromatografia gás-líquido.
5.2.1. Operações preliminares; acondicionamento da coluna.
5.2.1.1. Instalar a coluna no cromatógrafo gás-líquido, ligando uma das extremi-
dades ao sistema de injecção directa na coluna e a outra extremidade ao
detector.
Efectuar o controlo geral do sistema cromatográfico (operacionalidade
dos circuitos de gases, eficiência do detector e do registador, etc.).
5.2.1.2. No caso de a coluna ser utilizada pela primeira vez, é aconselhável
proceder ao seu acondicionamento. Fazer passar um fluxo ligeiro de
gás através da coluna, ligando em seguida o sistema. Aquecer gradua-
lmente até uma temperatura superior em pelo menos 20 ºC à
temperatura de trabalho (nota). Manter esta temperatura durante pelo
menos duas horas, regulando seguidamente o aparelho para as
condições de trabalho (regular o fluxo de gás, acender a chama, ligar
o registador electrónico, regular a temperatura do forno para a coluna,
regular o detector, etc.). Registar o sinal obtido com uma sensibilidade
pelo menos dupla da sensibilidade prevista para a execução da análise.
A linha de base deve apresentar-se linear e isenta de picos de qualquer
tipo, não devendo apresentar desvios.
A existência de um desvio rectilíneo negativo indica que as ligações da
coluna não foram efectuadas de um modo correcto; a existência de um
desvio positivo indica que a coluna não foi acondicionada de um modo
adequado.
Nota:a temperatura de acondicionamento deve, em todos os casos, ser
inferior em pelo menos 20 ºC à temperatura máxima especificada
para o eluente utilizado.
5.2.2. Escolha das condições de trabalho.5.2.2.1. As condições de trabalho são, em geral, as seguintes:
— temperatura da coluna: no início, 80 ºC, aumentando à taxa de 30
ºC/minuto até 120 ºC e, em seguida, programada para aumentar à
taxa de 5 ºC/minuto até 340 ºC;
— temperatura do detector: 350 ºC,— velocidade linear do gás de arrastamento (hidrogénio): 20 a 35 cm/
/segundo,
— sensibilidade do aparelho: 4 a 16 vezes a atenuação mínima,— sensibilidade do registador: 1 a 2 mV, a partir do início da escala,— velocidade do papel: 30 cm/hora,
— quantidade injectada: 0,5 a 1 µl de solução.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 15
▼M6
Estas condições podem ser alteradas em função das características da
coluna e do cromatógrafo (de modo a obter cromatogramas que satis-
façam as condições seguintes:
— o tempo de retenção do padrão interno C32 deverá ser de 25 ± dois
minutos e o pico mais representativo correspondente às ceras deverá
situar-se entre 60 e 100 % do início da escala).
5.2.2.2. Os parâmetros de integração dos picos devem ser determinados de
modo a obter uma estimativa correcta das áreas dos picos com inte-
resse.
5.2.3. Execução da análise
5.2.3.1. Efectuar uma toma de 1 µl de solução com a microsseringa de 10 µl;
manejar o êmbolo de modo a que a agulha não contenha nenhuma
porção de amostra. Introduzir a agulha no sistema de injecção e injectar
rapidamente após um a dois segundos. Retirar cuidadosamente a agulha
após cerca de cinco segundos.
5.2.3.2. Efectuar o registo até à eluição completa das ceras.
A linha de base deve satisfazer sempre as condições requeridas (ponto
5.2.1.2.).
5.2.4. Identificação dos picos
A identificação dos picos é efectuada com base nos tempos de retenção
que são comparados com os tempos de retenção conhecidos de misturas
de ceras analisadas em condições idênticas.
Na figura 1 apresenta-se um cromatograma relativo às ceras de um
azeite virgem.
5.2.5. Análise quantitativa5.2.5.1. Por recurso ao integrador, determinar as áreas dos picos correspon-
dentes ao padrão interno e aos ésteres alifáticos de C40 a C46.
5.2.5.2. Determinar o teor de cada um dos ésteres, expresso em mg/kg de
gordura, através da fórmula:
éster (mg/kg) =A
x·ms·►M91 000◄
As·m
em que:
Ax= área do pico de cada éster;
As= área do pico de araquidato de laurilo;
ms= massa de araquidato de laurilo adicionada, expressa em mg;
m = massa de amostra tomada para análise, expressa em g.
6. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS
Apresentar os teores das várias ceras, bem como a soma dos teores
expressos em mg/kg de gordura.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 16
▼M6
APÊNDICE
Determinaçãodavelocidade lineardogás
Injectar 1 a 3 µl de metano (ou propano) no cromatógrafo, regulado para as
condições normais de trabalho, e medir o tempo requerido pelo gás para
percorrer a coluna, desde o momento da injecção até ao registo do respectivo
pico (tM).
A velocidade linear, expressa em centímetros por segundo, é dada por L/tM,
sendo L o comprimento da coluna, expresso em centímetros, e tM o tempo de
retenção, expresso em segundos.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 17
▼M61991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 18
▼B
ANEXOV
DETERMINAÇÃODACOMPOSIÇÃOE DOTEORDEESTERÓISPOR
CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA COM COLUNA CAPILAR
1. OBJECTIVO
O método descreve o processo de determinação do teor de esteróis,
simples e totais, das matérias gordas.
2. FUNDAMENTO
A matéria gorda, adicionada de α-colestanol como padrão interno, é
saponificada com hidróxido de potássio em solução etanólica, em
seguida, o insaponificável é extraído com éter etílico.
A fracção esterólica é separada do extracto insaponificável por croma-
tografia em camada fina de gel de sílica básica; os esteróis recuperados
no gel de sílica são transformados em trimetilsililéteres e analisados por
cromatografia em fase gasosa em coluna capilar.
3. APARELHOS E UTENSÍLIOS
3.1. Balão de 250 ml, equipado com um refrigerador de refluxo com juntas
esmeriladas.
3.2. Ampola de decantação de 500 ml.3.3. Balões de 250 ml.
3.4. Equipamento completo para cromatografia em camada fina, com placas
de vidro de 20 × 20 cm.
3.5. Lâmpada de ultravioleta, de comprimento de onda de 366 ou 254 nm.
3.6. Micro-seringas de 100 e 500 µl.
3.7. Cadinho de fundo filtrante com porosidade G3 (poros de 15 a 40 µm)
de, aproximadamente, 2 cm de diâmetro e 5 cm de altura, com junta
adequada à filtração no vazio (junta esmerilada macho 12/21).
3.8. Frasco de kitasato de 50 ml com junta esmerilada fêmea 12/21,
adaptável ao cadinho de fundo filtrante (ponto 3.7).
3.9. Tubo de centrifugação de fundo cónico, de 10 ml, com rolha hermética.3.10. Cromatógrafo de gás adequado ao funcionamento com coluna capilar,
dotado de um sistema de separação, constituído por:
3.10.1. Forno com termóstato para a coluna, que permita manter a temperatura
desejada com uma precisão de ± 1 ºC.
3.10.2. Câmara de injecção e vaporização de temperatura regulável, com
elemento vaporizador de vidro persilanizado.
3.10.3. Detector de ionização de chama e conversor-amplificador.3.10.4. Registador-integrador adequado ao funcionamento com o conversor-
-amplificador.
3.10.5. Coluna capilar de vidro ou sílica fundida, de 20 a 30 m de compri-
mento, com 0,25 a 0,32 mm de diâmetro interno, coberta internamente
de líquido SE-52 ou SE-54 ou equivalente, com espessura uniforme
compreendida entre 0,10 e 0,30 µm.
3.10.6. Micro-seringa para cromatografia em fase gasosa de 10 µl com agulha
cementada.
4. REAGENTES
4.1. Hidróxido de potássio, em solução etanólica cerca de 2 N: dissolvem-
-se, com arrefecimento, 130 g de hidróxido de potássio (pureza mínima
85 %) em 200 ml de água destilada e completa-se até um litro com
etanol. A solução conserva-se em garrafas de vidro escuro bem
fechadas.
4.2. Éter etílico puro para análise.
4.3. Sulfato de sódio anidro puro para análise.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 19
▼B
4.4. Placas de vidro cobertas com gel de sílica, sem indicador de fluo-
rescência, de 0,25 mm de espessura (disponíveis no comércio, já
prontas para utilização).
4.5. Hidróxido de potássio, em solução etanólica 0,2 N: dissolvem-se 13 g
de hidróxido de potássio em 20 ml de água destilada e completa-se até
um litro com etanol.
4.6. Benzeno para cromatografia (ver ponto 5.2.2).4.7. Acetona para cromatografia.
4.8. Hexano para cromatografia.
4.9. Éter etílico para cromatografia.
4.10. Clorofórmio puro para análise.
4.11. Solução de referência para cromatografia em camada fina: colesterol ou
fitósterol em solução a ►
M62%◄(m/V) em clorofórmio.
4.12. 2 ′,7′-diclorofluoresceína, em solução etanólica a 0,2 % (m/V). Torna-
-se ligeiramente básica pela adição de algumas gotas de uma solução
alcoólica 2 N de hidróxido de potássio.
4.13. Piridina anidra para cromatografia.
4.14. Hexametildissilazano.
4.15. Trimetilclorossilano.4.16. Solução de verificação de trimetilsililéteres de esteróis: prepara-se no
momento da utilização a partir de esteróis puros ou de misturas de este-
róis obtidos de óleos que os contenham.
4.17. Alfa-colestanol, em solução a 0,2 % (m/V), em clorofórmio (padrão
interno).
4.18. Gás vector: hidrogénio ou hélio, puro para cromatografia em fase
gasosa.
4.19. Gases auxiliares:
— hidrogénio puro para cromatografia em fase gasosa,
— ar puro para cromatografia em fase gasosa.
5. TÉCNICA
5.1. Preparação do insaponificável
5.1.1. Introduzem-se no balão de 250 ml, por meio de micro-seringa de 500 µl,
um volume de solução de alfa-colestanol a 0,2 % (m/V) em clorofórmio
(ponto 4.17) que contenha uma quantidade de alfa-colestanol correspon-
dente a cerca de 10 % do teor de esteróis da alíquota da amostra a
colher para a determinação. Por exemplo, para 5 g de amostra é
necessário juntar 500 µl de solução de alfa-colestanol a 0,2 % (m/V),
se ser tratar de uma amostra de azeite e 1 500 µl, se se tratar de
►
M6 ◄óleo de bagaço de azeitona.
Evapora-se numa corrente de azoto até à secura e, em seguida, pesam-
-se exactamente 5 g de amostra seca e filtrada para o mesmo balão.
No caso dos óleos ►M6 ◄que contêm quantidades
consideráveis de colesterol, pode observar-se um pico com um tempo
de retenção idêntico ao do colestanol. Nesse caso, é necessário analisar
a fracção esterólica com e sem padrão interno ►M6ou utilizar, em
vez de colestanol, betulinol ◄.
5.1.2. Juntam-se 50 ml de ►C1solução etanólica de hidróxido de potássio 2
N◄, monta-se o refrigerador de refluxo e aquece-se em banho-maria
até uma ligeira ebulição, mantendo uma agitação enérgica até que se
produza a saponificação (a solução fica límpida). Continua-se a aquecer
durante 20 minutos, juntam-se 50 ml de água destilada que se faz
descer do alto do refrigerador, desliga-se o refrigerador e arrefece-se o
balão a cerca de 30º C.
5.1.3. Transvasa-se o conteúdo do balão quantitativamente para a ampola de
decantação de 500 ml, utilizando diversas vezes água destilada, num
total de aproximadamente 50 ml. Juntam-se cerca de 80 ml de éter
etílico, agita-se energicamente durante cerca de 30 segundos e deixa-se
que a separação se produza (nota 1).
Separa-se a fase aquosa inferior recolhendo-a numa outra ampola de
decantação.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 20
▼B
Procede-se ainda a duas extracções na fase aquosa, de acordo com as
mesmas modalidades, utilizando de cada vez 60-70 ml de éter etílico.
Nota1:As eventuais emulsões podem ser eliminadas juntando, com
um esguicho, uma pequena quantidade de álcool etílico ou
metílico.
5.1.4. Reúnem-se os extractos etéreos numa ampola de decantação e lava-se
com água destilada (50 ml de cada vez), até obter uma reacção neutra
da água de lavagem.
Elimina-se a água de lavagem, seca-se ►C1filtrando ◄com sulfato
de sódio anidro num balão de 250 ml previamente pesado, lavando o
funil e o filtro com pequenas quantidades de éter etílico.
5.1.5. Destila-se o éter até obter poucos mililitros, e seca-se em seguida sob
ligeiro vazio ou numa corrente de azoto; completa-se a secagem na
estufa a 100º C durante cerca de um quarto de hora e pesa-se após arre-
fecimento num exsicador.
5.2. Separação da fracção esterólica5.2.1. Preparação das placas básicas: imergem-se completamente as placas
com gel de sílica (ponto 4.4) na ►
C1solução etanólica 0,2 N ◄de
hidróxido de potássio (ponto 4.5) durante 10 segundos; em seguida,
deixam-se fechadas durante duas horas sobum exaustor e, por último,
colocam-se na estufa a 100º C durante uma hora.
Retiram-se da estufa e conservam-se num exsicador com cloreto de
cálcio até ao momento da utilização (as placas assim tratadas devem
ser utilizadas no prazo de quinze dias).
Nota2:A utilização de placas de gel de sílica básica para a separação
da fracção esterólica ►C1torna desnecessário ◄o trata-
mento do insaponificável com alumina. Deste modo, todos os
compostos de natureza ácida (ácidos gordos e outros) ficam
retidos na linha de partida. Assim, a mancha de esteróis fica
nitidamente separada da mancha de álcoois alifáticos e triterpé-
nicos.
5.2.2. Introduz-se na câmara de revelação das placas uma mistura de benzeno
e acetona a 95/5 (V/V) até uma altura de aproximadamente 1 cm. Pode
utilizar-se, em alternativa, uma mistura de hexano e éter etílico a 55/
/35 % (V/V). Fecha-se a câmara com uma tampa adequada e deixa-se
em repouso durante, pelo menos, meia hora, de modo a que se esta-
beleça o equilíbrio líquido/vapor. É possível fixar nas superfícies
internas da câmara folhas de papel de filtro que mergulham no eluente:
esta precaução permite reduzir em cerca de um terço o tempo de reve-
lação e obter uma eluição dos componentes mais uniforme e regular.
Nota3:A fim de obter condições de eluição perfeitamente reprodutí-
veis, a mistura deve ser mudada em cada ensaio.
5.2.3. Prepara-se uma solução a cerca de 5 % (m/V) de insaponificável (ponto
5.1.5) em clorofórmio e, com a micro-seringa de 100 µl, apõem-se na
placa cromatográfica (ponto 5.2.1), a aproximadamente 2 cm do bordo,
0,3 ml da solução supracitada numa linha contínua, o mais fina e
uniforme possível. No alinhamento da linha de partida deita-se, numa
das extremidades da placa, 2-3 µl da solução de referência de esteróis
(ponto 4.11), a fim de identificar a mancha de esteróis quando da
última revelação.
5.2.4. Coloca-se a placa na câmara da revelação, preparada como descrito no
ponto 5.2.2. A temperatura ambiente deve ser mantida entre 15 e 20º C.
Fecha-se imediatamente a câmara com a tampa e deixa-se eluir até que
a frente de solvente chegue a cerca de 1 cm do bordo superior da placa.
Em seguida, retira-se a placa da câmara de revelação e faz-se evaporar
o solvente numa corrente de ar quente, ou deixando a placa sobum
exaustor durante alguns momentos.
5.2.5. Nebuliza-se a placa, ligeira e uniformente, com a solução de 2,7-diclo-
rofluoresceína. Quando a placa é observada ao ultra-violeta, a mancha
de esteróis é identificada por alinhamento com a mancha obtida com a
solução de referência; delimita-se a mancha com um lápis preto ao
longo da margem de fluorescência.
5.2.6. Raspa-se com uma espátula metálica o gel de sílica na zona delimitada.
O material retirado, finamente triturado, é introduzido no cadinho de
fundo filtrante (ponto 3.7); juntam-se 10 ml de clorofórmio quente,
mistura-se cuidadosamente com a espátula metálica e filtra-se no vazio;
em seguida recolhe-se o filtrado no frasco de kitasato (ponto 3.8) ligado
ao cadinho de fundo filtrante.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 21
▼B
Lava-se o resíduo no cadinho três vezes com éter etílico (cerca de 10 ml
de cada vez) e recolhe-se o filtrado no frasco de kitasato adaptado ao
cadinho de fundo filtrante. Evapora-se o filtrado até se obter um
volume de cerca de 4 a 5 ml; transvasa-se a solução residual para um
tubo de centrifugação de 10 ml (ponto 3.9), previamente pesado, e seca-
-se aquecendo ligeiramente numa leve corrente de azoto. Deitam-se
algumas gotas de acetona, leva-se novamente à secura, coloca-se
durante cerca de 10 minutos na estufa a 105º C, deixa-se arrefecer no
exsicador e pesa-se.
O resíduo contido no tubo é constituído pela fracção esterólica.
5.3. Preparação dos trimetilsililéteres5.3.1. No tubo de centrifugação que contém a fracção esterólica, junta-se o
reagente de sililação, constituído por uma mistura de piridina, hexame-
tildissilazano e trimetilclorossilano 9 + 3 + 1 (V/V/V) (nota 4), numa
proporção de 50 µl por miligrama de esteróis, evitando qualquer
absorção de humidade (nota 5).
Nota4:Existem no comércio soluções prontas para utilização; além
disso, encontram-se também outros reagentes silanizantes
como, por exemplo, o N,O (trimetilsilil) acetamida + 1 % de
trimetilclorossilano, a diluir num volume igual de piridinaanidra.
5.3.2. Tapa-se o tubo de centrifugação agita-se cuidadosamente (sem virar)
até à solubilização completa dos esteróis. Deixa-se repousar durante
pelo menos 15 minutos, à temperatura ambiente e, em seguida, centri-
fuga-se durante alguns minutos: a solução límpida está pronta para
análise por cromatografia em fase gasosa.
Nota5:A ligeira opalescência que se pode eventualmente formar é
normal e não provoca qualquer perturbação. A formação de
um floculado branco ou o aparecimento de uma coloração
rosa indicam a presença de humidade ou a deterioração do
reagente. Neste caso, a análise deve ser repetida.
5.4. Análise por cromatografia em fase gasosa5.4.1. Operações preliminares, condicionamento da coluna
5.4.1.1. Instala-se a coluna num cromatógrafo de gás, ligando a extremidade da
entrada à câmara de injecção e a extremidade de saída ao detector.
Efectuam-se os controlos gerais do conjunto de cromatografia em fase
gasosa (hermeticidade do circuito dos gases, eficácia do detector,
eficácia do sistema de separação e do sistema de registo, etc.).
5.4.1.2. Se a coluna for utilizada pela primeira vez, é aconselhável proceder à
sua maturação. Faz-se passar um ligeiro fluxo gasoso e inicia-se um
aquecimento gradual até atingir uma temperatura pelo menos 20º C
superior à temperatura de trabalho (nota 6). Mantém-se essa tempera-
tura durante pelo menos duas horas; em seguida, leva-se o conjunto às
condições de funcionamento (regulação do fluxo gasoso e da separação,
inflamação da chama, ligação ao registador electrónico, regulação de
temperatura do forno para a coluna, do detector e do injector, etc.) e
regista-se o sinal com uma sensibilidade pelo menos duas vezes supe-
rior à prevista para a realização da análise. O traçado da linha base
obtida deve ser linear, isento de picos de qualquer natureza e não deve
apresentar derivações.
Uma derivação rectilínea negativa indica uma hermeticidade imperfeita
das ligações da coluna; uma derivação positiva indica um condiciona-
mento insuficiente da coluna.
Nota6:A temperatura de condicionamento deve ser sempre inferior
pelo menos 20º C à temperatura máxima prevista para o
líquido estacionário utilizado.
5.4.2. Escolha das condições de funcionamento
5.4.2.1. As condições de funcionamento normais são as seguintes:
— temperatura da coluna: 260º C ± 5º C,
— temperatura do evaporador: 280º C,— temperatura do detector: 290º C,
— velocidade linear do gás vector: hélio, 20 a 35 cm/s; hidrogénio, 30
a 50 cm/s,
— relação de separação: de 1/50 a 1/100,
— sensibilidade instrumental: 4 a 16 vezes a atenuação mínima,
— sensibilidade de registro: 1 a 2 mV em escala de fundo,1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 22
▼B
— velocidade do papel: 30 a 60 cm/hora,
— quantidade de substância injectada: 0,5 a 1 µl de solução TMSE.
Estas condições podem ser alteradas em função das características da
coluna e do cromatógrafo de gás, de modo a obter cromatogramas que
satisfaçam as seguintes condições:
— o tempo de retenção do beta-sitosterol deve ser de 20 ± 5 minutos,
— o pico do campesterol deve ser para o azeite (teor médio 3 %)
15 ± 2 % da escala de fundo e para o óleo de soja (teor médio
20 %) 80 ± 10 % da escala de fundo,
— deve-se verificar a separação de todos os esteróis presentes; é
necessário que os outros picos separados apresentem também uma
resolução completa, o que significa que o traçado do pico deve
voltar à linha base antes do arranque do pico seguinte. No entanto,
é tolerada uma resolução incompleta, desde que seja quantificável
segundo a perpendicular ao pico em TRR 1,02.
5.4.3. Execução da análise
5.4.3.1. Com a micro-seringa de 10 µl, colhe-se 1 µl de hexano, aspiram-se
0,5 µl de ar e sucessivamente 0,5 a 1 µl da solução da amostra; puxa-
-se ainda o êmbolo da seringa de modo a que a agulha fique vazia.
Introduz-se a agulha através da membrana da câmara de injecção e após
1-2 segundos, injecta-se rapidamente, retira-se a agulha devagar, cerca
de 5 segundos depois.
5.4.3.2. Procede-se ao registo até à eluição completa dos TMSE dos esteróis
presentes.
A linha base deve continuar a corresponder às condições exigidas
(ponto 5.4.1.2).
5.4.4. Identificação dos picos
A identificação individual dos picos é efectuada com base nos tempos
de retenção e em comparação com a mistura dos TMSE dos esteróis
cromatografados nas mesmas condições.
Os esteróis são eluídos pela seguinte ordem: colesterol, brassicasterol,
24-metilenocolesterol, campesterol, campestanol, estigmasterol, delta-7-
-campesterol, delta-5,23-estimastadienol, clerosterol, beta-sitosterol,
sitostanol, delta-5-avenasterol, delta-5,24-estigmastadienol, delta-7-
-estigmastenol, delta-7-avenasterol.
No quadro I são indicados os tempos de retenção relativos ao sitosterol,
para as colunas SE-52 e SE-54.
As figuras 1 e 2 apresentam cromatogramas típicos de alguns óleos.
5.4.5. Avaliação quantitativa
5.4.5.1. Procede-se com o integrador ao cálculo da área dos picos do alfa-coles-
tanol e dos outros esteróis. Não se consideram os eventuais picos de
compostos não incluídos na lista do quadro I. O coeficiente de resposta
para o α-colestanol deve ser igual a 1.
5.4.5.2. Calcula-se o teor de cada esterol, em mg/100 g de matéria gorda, do
seguinte modo:
Esterol x =Ax·ms·100
As·m
onde:
Ax= área do pico do esterol x ►M6 ◄.
As= área do pico do alfa-colestanol ►M6 ◄.
ms= massa de alfa-colestanol adicionada, em miligramas.
m = massa da amostra colhida para a determinação, em gramas.
6. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS
6.1. Determinam-se os teores de cada um dos esteróis em mg/100 g de
matéria gorda e a sua soma como «esteróis totais».
6.2. Calcula-se a percentagem de cada esterol a partir da relação entre a área
do respectivo pico e a soma das áreas dos picos de todos os esteróis.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 23
▼B
% do esterol x =Ax
A· 100
onde:
Ax= área do pico x.
A = soma das áreas de todos os esteróis.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 24
▼B
APÊNDICE
Determinaçãodavelocidade lineardogás
No cromatógrafo de gás, regulado para condições de funcionamento normais,
injectam-se 1 a 3 µl de metano (ou propano) e cronometra-se o tempo gasto
pelo gás para percorrer a coluna entre o momento da injecção e o da saída do
pico (tM).
A velocidade linear em cm/s é dada por l/t, onde l é o comprimento da coluna
em centímetros e t o tempo cronometrado em segundos.
Quadro I
Tempos de retenção relativos dos esteróis
Pi-
coIdentificaçãoTempos de retenção
relativos
Coluna
SE 54Coluna
SE 52
1 colesterol delta,5-colesteno-3-beta-ol 0,67 0,63
2 colestanol 5-alfa-colestano-3-beta-ol 0,68 0,64
3 brassicasterol [24S]-24-metil-delta,5,22-colestadieno-3-
-beta-ol0,73 0,71
4 24-metilenocolesterol 24-metileno-delta,5,24-colestadieno-3-beta-
-ol0,82 0,80
5 campesterol [24R]-24-metil-delta,5-colesteno-3-beta-ol 0,83 0,81
6 campestanol [24R]-24-metil-colestano-3-beta-ol 0,85 0,82
7 estigmasterol [24S]-24-etil-delta,5,22-colestadieno-3-
-beta-ol0,88 0,87
8 delta,7-campesterol [24R]-24-metil-delta,7-colesteno-3-beta-ol 0,93 0,92
9 delta,5,23-estigmasta-
dienol[24R,S]-24-etil-delta,5,23-colestadieno-3-
-beta-ol0,95 0,95
10 clerosterol [24S]-24-etil-delta,5,25-colestadieno-3-
-beta-ol0,96 0,96
11 beta-sitosterol [24R]-24-etil-delta,5-colesteno-3-beta-ol 1,00 1,00
12 sitostanol 24-etil-colestano-3-beta-ol 1,02 1,02
13 delta,5-avenasterol [24Z]-24-etilideno-delta,5-colesteno-3-beta-
-ol1,03 1,03
14 delta,5,24-estigmasta-
dienol[24R,S]-24-etil-delta,5,24-colestadieno-3-
-beta-ol1,08 1,08
15 delta,7-estigmasterol [24R,S]-24-etil-delta,7-colesteno-3-beta-ol 1,12 1,12
16 delta,7-avenasterol [24Z]-24-etilideno-delta,7-colesteno-3-beta-
-ol1,16 1,161991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 25
▼B
Figura 1
Cromatogramaemfasegasosadafracçãoesterólica deumazeitevirgem
1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 26
▼B
Figura 2
Cromatogramaemfasegasosadafracçãoesterólica deumazeiterefinado
1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 27
▼B
ANEXOVI
DETERMINAÇÃODO TEOR DE ERITRODIOLE UVAOL
PREÂMBULO
O eritrodiol (convencionalmente entendido como o conjunto dos dióis
eritrodiol e uvaol) é um constituinte da fracção insaponificável, carac-
terístico de alguns tipos de matérias gordas. A sua concentração é
apreciavelmente mais elevada em óleos de bagaço de azeitona do que
noutros óleos que o contêm (azeites virgens, óleo de grainha de uva),
pelo que a sua determinação pode servir para detectar a presença de
óleo de bagaço de azeitona.
1. OBJECTIVO
O método descreve o processo para determinar o eritrodiol de gorduras e
óleos.
2. PRINCÍPIO
A matéria gorda é saponificada com solução etanólica de hidróxido de
potássio, sendo posteriormente o insaponificável extraído com éter etílico
e purificado por passagem através de coluna de alumina.
Procede-se à separação do insaponificável por cromatografia em camada
fina em placa de gel de sílica, isolando-se as manchas correspondentes à
fracção esterólica e à fracção do eritrodiol.
Os esteróis e o eritrodiol recuperado da placa são convertidos nos respec-
tivos éteres trimetilsilílicos, cuja mistura é analisada por cromatografia
em fase gasosa. O resultado é expresso em percentagem de eritrodiol em
relação ao conjunto eritrodiol mais esteróis.
3. APARELHOS E UTENSÍLIOS
3.1. O mesmo equipamento descrito no anexo V (determinação do teor de
esteróis).
4. REAGENTES
4.1. Os mesmos reagentes descritos no anexo V (determinação do teor de
esteróis).
4.2. Solução de referência de eritrodiol a 0,5 % (m/V) em clorofórmio.
5. PROCESSO
5.1. Preparação do insaponificável
Procede-se de acordo com a descrição do ponto 5.1.2 do anexo V.
5.2.Separação do eritrodiol e dos esteróis
5.2.1. Veja-se o ponto 5.2.1 do anexo V.5.2.2. Veja-se o ponto 5.2.2 do anexo V.5.2.3. Prepara-se uma solução de insaponificável a 5 % (m/V) em clorofórmio.
Com o auxílio da ►
C1micro-seringa de 100µl ◄, apõem-se sobre uma
placa cromatográfica, a cerca de 1,5 cm do bordo ►C1inferior, 0,3
ml◄da dita solução, numa linha de partida o mais possível fina e
uniforme. Apõem-se também, numa extremidade da placa, como
referência, alguns mililitros de solução de colesterol e eritrodiol.
5.2.4. Coloca-se a placa na câmara de desenvolvimento, preparada de acordo
com o ponto 5.2.1. A temperatura ambiente deve ser cerca de 20º C.
Tapa-se rapidamente e elui-se até que a frente do solvente se encontre a
cerca de 1 cm do bordo superior da placa. Retira-se a placa da câmara e
evapora-se o solvente em corrente de ar quente.
5.2.5. Nebuliza-se a placa uniformemente com solução alcoólica de 2 ′,7′-
-diclorofluoresceína. O exame da placa ao ultra-violeta permite
identificar as manchas correspondentes aos esteróis e ao eritrodiol por
comparação com as manchas relativas às substâncias de referência. Deli-
mitam-se as manchas em estudo com o auxílio de um lápis, ligeiramente
fora das margens de fluorescência.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 28
▼B
5.2.6. Raspa-se o gel de sílica interior às áreas delimitadas com auxílio de uma
espátula metálica. Coloca-se o material assim recolhido da placa num
frasco de 50 ml, ao qual se adicionam 15 ml de clorofórmio quente.
Agita-se bem e filtra-se num cadinho de fundo filtrante transferindo o
gel de sílica para esse cadinho. Lava-se por três vezes com sucessivas
porções de 10 ml de clorofórmio quente, recolhe-se o filtrado num frasco
de 100 ml, previamente tarado, e leva-se à secura mediante aquecimento
suave em corrente de azoto, pesando-se de seguida.
5.3. Preparação dos éteres trimetilsilílicos
Procede-se de acordo com a descrição do ponto 5.3 do anexo V.
5.4. Análise por cromatografia em fase gasosa
Procede-se de acordo com a descrição do ponto 5.4 do anexo V. As
condições operacionais da análise cromatográfica devem ser tais que,
além de satisfazerem aos requisitos necessários para análise dos esteróis,
conduzam à separação dos éteres trimetilsilílicos do eritrodiol e do uvaol.
Procede-se em seguida à identificação dos picos (o eritrodiol e o uvaol
possuem tempos de retenção em relação ao β-sitosterol de cerca de 1,45
e 1,55, respectivamente) e ao cálculo das áreas, segundo um processo
idêntico ao adoptado para os esteróis.
6. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS
Percentagem de eritrodiol =A1+A2
A1+A2+ΣAesteróis× 100
onde:
A1= é a área do pico correspondente ao eritrodiol
►M6 ◄.
A2= é a área do pico correspondente ao uvaol
►M6 ◄.
ΣAAesteróis= é a soma das áreas correspondentes aos esteróis
presentes ►M6 ◄.
O resultado é arredondado às décimas.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 29
▼B
ANEXOVII
DETERMINAÇÃO DOS ÁCIDOS GORDOS NA POSIÇÃO 2 NOS
TRIGLICÉRIDOS
1. OBJECTIVO
A presente norma descreve um método para determinar a composição da
fracção de ácidos gordos de óleos e gorduras que se encontrem esterifi-
cados na posição 2 (ou posição interna) do glicerol.
2. DOMÍNIOS DE APLICAÇÃO
A presente norma é aplicável a óleos e gorduras com temperatura de fusão
inferior a 45º C, devido às particularidades da acção da lipase pancreática.
A norma não é aplicável sem reserva a óleos e gorduras possuindo teores
apreciáveis de ácidos gordos com doze ou menos átomos de carbono
(óleos de amendoim e noz de palma, bem como manteiga) ou ácidos
gordos altamente insaturados (com mais de quatro ligações duplas)
contendo vinte ou mais átomos de carbono (óleo de peixe ou de outros
animais marinhos) ou ainda ácidos gordos contendo outros grupos oxige-
nados além do carboxilo.
3. PRINCÍPIO
Possível neutralização de óleos ácidos e gorduras ácidas na presença de
um solvente.
Purificação mediante passagem através de coluna de alumina, seguida de
hidrólise parcial dos triglicéridos por acção da lipase pancreática durante
um tempo determinado. Separação dos monoglicéridos assim formados
por cromatografia em camada fina e metanólise dos mesmos. A análise
dos éteres metílicos é feita por cromatografia gás-líquido.
4. APARELHOS E UTENSÍLIOS
4.1. Balão de fundo redondo com capacidade de 100 ml.
4.2. Balão de fundo redondo com capacidade de 25 ml e com junta esmerilada.
4.3. Refrigerante de vidro com 1 m de comprimento, para adaptar ao balão
4.2.
4.4. Erlenmeyer de 250 ml de capacidade.4.5. Copo de 50 ml de capacidade.4.6. Ampola de decantação com 500 ml de capacidade.4.7. Coluna cromatográfica de vidro, com 13 mm de diâmetro interno e
400 mm de comprimento, equipada com um disco poroso de vidro e
uma tampa.
4.8. Tubo de centrifugação de 10 ml de capacidade, com rolha de vidro esme-
rilado.
4.9. Galheta de 5 ml de capacidade, graduada em 0,05 ml.4.10. Seringa hipodérmica com 1 ml de capacidade, equipada com uma agulha
fina.
4.11. Micro-seringa própria para gotas de 3-4 µl.4.12. Distribuidor para cromatografia em camada fina.4.13. Placas de vidro para cromatografia em camada fina, de 20 × 20 cm.4.14. Câmara de desenvolvimento de vidro para cromatografia ascendente em
camada fina, com tampa esmerilada, própria para placas de 20 × 20 cm.
4.15. Nebulizador para cromatografia em camada fina.4.16. Estufa regulada a 103 ± 2º C.4.17. Termóstato regulável entre 30 a 45º C, com uma precisão de 0,5º C.4.18. Evaporador rotativo.4.19. Agitador vibratório eléctrico, permitindo a agitação vigorosa do tubo de
centrifugação.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 30
▼B
4.20. Lâmpada de ultra-violeta para observação das placas cromatográficas.
Paraocontrolodaactividade dalipase:
4.21. Potenciómetro para medição de pH.
4.22. Agitador magnético.
4.23. Galheta com 5 ml de capacidade.4.24. Cronómetro.
Paraaeventual preparaçãodalipase:
4.25. Agitador mecânico, próprio para a dispersão e mistura de esteróis hetero-
géneos.
5. REAGENTES
5.1. n-Hexano ou, na sua falta, éter de petróleo (intervalo de ebulição 30-50º
C), para cromatografia.
5.2. 2-Propanol ou etanol a 95 % (V/V), de qualidade analítica reconhecida.5.3. 2-Propanol ou etanol, em solução aquosa a 1 + 1.
5.4. Éter dietílico, isento de peróxidos.
5.5. Acetona.5.6. Ácido fórmico com pureza mínima de 98 % (m/m).5.7. Solvente de desenvolvimento: mistura de n-hexano (ponto 5.1), éter
dietílico (ponto 5.4) e ácido fórmico (ponto 5.6) em proporções 70 + 30 + 1
(V/V/V).
5.8. Alumina activada para cromatografia, neutra, de grau Brockmann I.
5.9. Gel de sílica de qualidade apropriada para cromatografia em camada fina.5.10. Lipase pancreática de qualidade apropriada (notas 1 e 2).5.11. Solução aquosa a 120 g/l de hidróxido de sódio.
5.12. Solução aquosa 6 N de ácido clorídrico.
5.13. Solução aquosa a 220 g/l de cloreto de cálcio (CaCl
2).
5.14. Solução aquosa a 1 g/l de colato de sódio (qualidade enzimática).
5.15. Solução tampão: solução aquosa 1M de tris-hidroxi-metil-aminometano
levada a pH 8 mediante a adição de ácido clorídrico (ponto 5.12) (veri-
fica-se com o auxílio de potenciómetro medidor de pH).
5.16. Solução a 10 g/l de fenolftaleína em etanol a 95 % (V/V).5.17. Solução a 2 g/l de 2 ′,7′-diclorofluoresceína em etanol a 95 % (V/V),
ligeiramente alcalinizada mediante a adição de uma gota de solução 1 N
de hidróxido de sódio por 100 ml.
Paraaverificação daactividade dalipase:
5.18. Óleo neutralizado.5.19. Solução aquosa 0,1 N de hidróxido de sódio.5.20. Solução aquosa a 200 g/l de colato de sódio (qualidade enzimática).
5.21. Solução aquosa a 100 g/l de goma arábica.
6. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
Se a acidez da amostra for inferior a 3 %, determinada de acordo com o
anexo II, purifica-se directamente através de alumina (descrição no ponto
6.2). Se a acidez da amostra for superior a 3 %, determinada de acordo
com o anexo II, neutraliza-se com álcali, depois de dissolvida num
solvente do tipo descrito no ponto 6.1, passando de seguida através de
alumina, de acordo com o ponto 6.2.
6.1. Neutralização por álcali depois da dissolução
Introduz-se numa ampola de decantação (ponto 4.6) cerca de 10 g de óleo
virgem, adicionando 100 ml de hexano (ponto 5.1), 50 ml de 2-propanol
(ponto 5.2), umas gotas de solução de fenolftaleína (ponto 5.16) e uma1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 31
▼B
quantidade de solução de hidróxido de sódio (ponto 5.11) correspondente
à acidez livre de óleo com um excesso de 0,3 %.
Agita-se vigorosamente durante 1 minuto, adicionam-se 30 ml de água
destilada, agita-se de novo e deixa-se repousar.
Após a separação, remove-se a camada aquosa inferior de sabão.
Removem-se igualmente quaisquer eventuais camadas intermédias (muci-
lagem, matéria insolúvel). Lava-se a solução de óleo neutralizadoem
hexano com sucessivas porções de 25 a 30 ml de solução de 2-propanol
(ponto 5.3), até ao desaparecimento da coloração carmim da fenolftaleína.
Remove-se a maior parte do solvente por destilação em vazio no evapo-
rador rotativo (ponto 4.18) e seca-se o óleo a 30-40º C, no vazio, com
auxílio de uma corrente de azoto puro, até à remoção completa do
solvente.
6.2. Purificação através de alumina
Prepara-se uma suspensão de 15 mg de alumina activada (ponto 5.8) em
50 ml de hexano (ponto 5.1) a qual se verte, agitando, na coluna croma-
tográfica (ponto 4.7).
Deixa-se a alumina assentar lentamente, de modo que o solvente se
encontre a 1-2 mm da superfície superior. Deita-se cuidadosamente na
coluna uma solução de 5 g de óleo em 25 ml de hexano (ponto 5.1) e
recolhe-se a totalidade do efluente da coluna num balão de fundo redondo
(ponto 4.1).
7. PREPARAÇÃO DAS PLACAS CROMATOGRÁFICAS
Limpam-se as placas de vidro (ponto 4.13) com etanol, éter de petróleo e
acetona, de modo e eliminar quaisquer vestígios de matéria gorda.
Deitam-se num erlenmeyer (ponto 4.4) 30 g de gel de sílica (ponto 5.9),
adicionando 60 ml de água destilada. Tapa-se e agita-se vigorosamente
durante 1 minuto.
Transfere-se imediatamente a mistura para um distribuidor (ponto 4.12) e
revestem-se as placas limpas com uma camada de 0,25 mm de espessura.
Secam-se as placas ao ar durante 15 minutos e seguidamente na estufa
(ponto 4.16) a 103 ± 2º C. Arrefecem-se as placas num exsicador a tempe-
ratura ambiente, antes de usar.
(Existem no comércio placas já preparadas).
8. TÉCNICA
8.1. Hidrólise com lipase pancreática
Pesa-se no tubo de centrifugação (ponto 4.8) uma toma de cerca de 0,1 g
de amostra preparada; no caso de gorduras sólidas, dissolve-se em 0,2 ml
de hexano (ponto 5.1), aquecendo ligeiramente se necessário.
Adicionam-se 20 mg de lipase (ponto 5.10) e 2 ml de solução tampão
(ponto 5.15). Agita-se bem, mas cuidadosamente, e juntam-se em seguida
0,5 ml de solução de colato de cálcio (ponto 5.13).
Tapa-se o tubo com a rolha esmerilada, agita-se cuidadosamente (de modo
a evitar o contacto da solução com a rolha) e coloca-se de imediato o tubo
no termóstato (ponto 4.17), mantido a uma temperatura de 40 ± 0,5º C.
Agita-se manualmente durante 1 minuto exacto.
Remove-se o tubo do termóstato e agita-se vigorosamente com auxílio do
agitador eléctrico (ponto 4.19), durante 2 minutos exactos.
Arrefece-se de imediato sobágua corrente; adiciona-se 1 ml de ácido
clorídrico (ponto 5.12) e 1 ml de éter dietílico (ponto 5.4). Tapa-se de
novo e mistura-se vigorosamente com o auxílio do agitador eléctrico.
Deixa-se repousar e remove-se a camada orgânica com a seringa (ponto
4.10), após centrifugação, se necessário.
8.2. Separação dos monoglicéridos por cromatografia em camada fina
Apõe-se o extracto na placa cromatográfica com a micro-seringa (ponto
4.11), a cerca de 1,5 cm do bordo inferior, segundo uma faixa fina e
uniforme, tão estreita quanto possível. Coloca-se a placa na câmara de
desenvolvimento (ponto 4.14) bem saturada e elui-se com o solvente apro-
priado (ponto 5.7) a uma temperatura igual ou próxima de 20º C, até cerca
de 1 cm do bordo superior da placa.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 32
▼B
Seca-se a placa ao ar, à temperatura da câmara, e nebuliza-se com a
solução de 2 ′,7′-diclorofluoresceína (ponto 5.17), identifica-se a mancha
correspondente aos monoglicéridos (Rf próximo de 0,035) por observação
no ultravioleta (ponto 4.20).
8.3. Análise dos monoglicéridos por cromatografia gás-líquido
Remove-se a mancha obtida no ponto 8.2 com o auxílio de uma espátula
(evitando a remoção de componentes situados na linha base) e transfere-se
para o balão de metilação (ponto 4.2). Trata-se directamente a sílica remo-
vida de acordo com os métodos indicados no anexo XB alternativo, para
conversão dos monoglicéridos nos respectivos ésteres metílicos, e efectua-
-se a análise dos ésteres por cromatografia gás-líquido, conforme o anexo
XA, ponto 5.4.
9. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS
Calcula-se o teor de ácidos gordos na posição 2 arredondado às décimas
(nota 3).
10. NOTAS
Nota1:Verificação da actividade da lipase
Com um agitador apropriado prepara-se uma emulsão de óleo
mediante agitação de uma mistura de 165 ml de solução de
goma arábica (ponto 5.21), 15 g de gelo triturado e 20 ml de
óleo neutralizado (ponto 5.18).
Colocam-se num copo (ponto 4.5) 10 ml da emulsão e
adicionam-se sucessivamente 0,3 ml de solução de colato de
sódio (ponto 5.20) e 20 ml de água destilada.
Coloca-se o copo num termóstato mantido à temperatura de
37 ± 0,5º C (nota 4); inserem-se os eléctrodos no medidor de
pH (ponto 4.21) e o agitador magnético (ponto 4.22). Com o
auxílio de uma galheta (ponta 4.23), adiciona-se gota a gota a
solução de hidróxido de sódio (ponto 5.19) até se atingir um
valor de pH 8,5.
Junta-se uma quantidade suficiente de suspensão aquosa de lipase
(veja-se abaixo). No instante em que o potenciómetro indicar um
valor de 8,3, acciona-se o cronómetro (ponto 4.24) e adiciona-se
a solução de hidróxido de sódio (ponto 5.19) de modo a manter o
pH num valor de 8,3. Regista-se o volume de solução de álcali
consumida em cada minuto.
Anotam-se as observações sob a forma de um gráfico, com as
leituras correspondentes ao tempo em abcissas e o volume de
solução necessário para manter o pH constante em ordenadas.
Deste modo, deve obter-se no gráfico uma recta.
A suspensão aquosa de lipase, acima mencionada, deve possuir
uma concentração de 1/1000 (m/m). A quantidade de supensão
utilizada em cada ensaio deve ser tal que aproximadamente 1 ml
de solução de álcali seja consumida em 4 a 5 minutos.
Em geral, é necessário uma quantidade de 1 a 5 mg de pó. A
unidade de lipase é definida como a quantidade de enzimas capaz
de libertar 10 miliequivalentes de ácido por minuto. Deste modo,
a actividade A do pó usado, expressa em unidades de lipase por
miligrama, é dada pela fórmula:
A¼V/C210
m
onde:
V — é o volume de solução de hidróxido de sódio (ponto 5.19)
consumido por minuto (calculada a partir do gráfico).
m — é a massa, em miligramas, da amostra em pó em estudo.
Nota2:Preparação da lipase
É possível encontrar no comércio lipase com grau satisfatório de
actividade. Contudo, pode também preparar-se no laboratório, do
seguinte modo:
Arrefecem-se 5 kg de pâncreas de porco a 0º C; remove-se a
matéria gorda sólida periférica bem como o tecido conjuntivo e
tritura-se num almofariz de modo a obter um fluido pastoso.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 33
▼B
Agita-se esta pasta com auxílio do agitador (ponto 4.25) durante
4 a 6 horas, em 2,5 l de acetona anidra e centrifuga-se. Extrai-se
o resíduo três vezes com o mesmo volume de acetona e, seguida-
mente, extrai-se duas vezes com uma mistura de acetona e éter
etílico na proporção de 1 + 1 (V/V). Por fim, extrai-se duas vezes
com éter dietílico. Seca-se o resíduo no vazio durante 48 horas,
de modo a obter um pó estável, que deve ser armazenado no
frigorífico.
Nota3:Em qualquer caso, é aconselhável determinar o teor de ácidos
gordos totais da mesma amostra, uma vez que a comparação
com o teor de ácidos na posição 2 poderá auxiliar a interpretação
dos gráficos obtidos.
Nota4:A temperatura de hidrólise mantém-se a 37º C dado ser usado
óleo; deverá contudo manter-se a 40º C no caso do produto ser
gordura.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 34
▼B
ANEXOVIII
DETERMINAÇÃODO TEOR DE TRILINOLEÍNA
1. OBJECTIVO
Determinação da composição de triglicéridos em óleos e gorduras vegetais
em termos do número de átomos de carbono equivalentes por cromato-
grafia líquida de alta resolução.
A presente norma descreve um método para a separação e determinação
quantitativa do teor de triglicéridos de óleos vegetais em termos do seu
peso molecular e grau de insaturação, em função do respectivo número de
átomos de carbono (nota 1).
2. DOMÍNIO DE APLICAÇÃO
A presente norma é aplicável a todos os óleos vegetais contendo triglicé-
ridos de ácidos gordos de cadeia comprida. O método é aplicável em
particular à pesquisa de pequenas quantidades de óleos semi-sicativos (ricos
de ácido linoleico) em óleos vegetais contendo ácido oleico como ácido
gordo predominante, tais como azeite.
3. PRINCÍPIO
Separação dos triglicéridos de acordo com o respectivo número de átomos
de carbono, por cromatografia líquida de alta resolução de fase invertida e
interpretação dos cromatogramas.
4. APARELHOS E UTENSÍLIOS
4.1. Cromatógrafo para cromatografia líquida de alta resolução, permitindo o
controlo por termóstato da temperatura da coluna.
4.2. Seringa de injecção para tomas de 10 µl.4.3. Detector: refractómetro diferencial. A sensibilidade da escala deve ser de,
pelo menos, 10 unidades de índice de refracção.
4.4. Coluna: tubo de aço inoxidável com 250 mm de comprimento e 5 µm de
diâmetro interior, revestido internamente com partículas de sílica de 5 mm
de diâmetro, contendo 22-23 % do carbono sob a forma de octadecilsilano
(nota 2).
4.5. Registador ou integrador ou ambos.
5. REAGENTES
Os reagentes devem ser de qualidade analítica reconhecida. Os solventes de
eluição devem estar isentos de gases e podem ser reciclados várias vezes
sem prejuízo para as separações.
5.1. Clorofórmio.5.2. Acetona.5.3. Acetonitrilo.5.4. Solvente de eluição: mistura de acetonitrilo e acetona em proporções a
ajustar a fim de obter a separação desejada (começa-se com uma mistura
na proporção 50 + 50).
5.5. Solvente de solubilização: acetona ou mistura de acetona e clorofórmio na
proporção 1 + 1.
5.6. Triglicéridos de referência: podem ser utilizados triglicéridos comerciais
(tripalmitina, trioleína, etc.), sendo neste caso os tempos de retenção colo-
cados em função do respectivo número de átomos de carbono ou, em
alternativa, um cromatograma de referência obtido a partir do óleo de soja
(consultem-se: notas 3 e 4 e as figuras 1 e 2).
6. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
As soluções a 5 % (m/V) de cada uma das amostras a analisar são prepa-
radas mediante pesagem de uma toma de 0,5 ± 0,001 g da amostra em
causa num recipiente graduado, seguida da diluição até 10 ml com o
solvente de solubilização (ponto 5.5).1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 35
▼B
7. TÉCNICA
7.1. Liga-se o sistema cromatográfico. Efectua-se purga total do mesmo medi-
ante bombagem com o solvente de eluição segundo um fluxo de 1,5 ml/
/mm. Espera-se até à obtenção de uma linha base estável.
Injectam-se 10 µl de amostra preparada de acordo com o ponto 6.
8. CÁLCULO E EXPRESSÃO DOS RESULTADOS
Usa-se o método de normalização interna, isto é, considera-se que a soma
das áreas dos picos correspondentes aos diversos triglicéridos é igual a
100 %.
Calcula-se a percentagem relativa de cada triglicérido, de acordo com a
fórmula:
% triglicéridos =área do pico
soma das áreas dos picos× 100
exprimindo o resultado arredondado às décimas.
Nota1:A ordem de eluição pode ser determinada mediante cálculos dos
respectivos números de átomos de carbono, definidos em geral
pela expressão NCE = NC − 2n, em que NC representa o número
de átomos carbono e n o número de duplas ligações; o seu cálculo
pode efectuar-se de um modo muito mais preciso tomando em
conta a origem das duplas ligações. Se no,nlenlnrepresentarem o
número de duplas ligações atribuíveis aos ácidos oleico, linoleico e
linolénico, respectivamente, o correspondente número de átomos
de carbono pode ser calculado através da expressão seguinte, deri-
vada da anterior:
NCE = NC − dono−dlnl−dlnnln
sendo os coeficientes do,dledlncalculados em função dos triglicé-
ridos de referência. Nas condições especificadas no presente
processo, a relação obtida deverá ser próxima de:
NCE = NC − (2,60 no) − (2,35 nl) − (2,17 nln)
Nota2:Exemplos: Lichrosorb(Merck) RP18 Art 50333, ou equivalente.
Lichrosphere (Merck) 100 CH18 Art 50377, ou equiva-
lente.
Nota3:Com vários triglicéridos de referência é também possível calcular
a resolução em relação à trioleína,
α=r t′/rt′oleína
mediante o uso do tempo de retenção reduzido,rt′= rt − rt solvente.
O gráfico de log αem função de f (número de duplas ligações)
permite determinar os parâmetros de retenção referentes a todos
os triglicéridos de ácidos gordos contidos nos triglicéridos de
referência — veja-se a figura 2.
Nota4:A eficiência da coluna deve permitir uma separação nítida do pico
referente à trilinoleína e dos picos correspondentes aos triglicéridos
com rt adjacente.
Nota5:Em relação aos azeites virgens lampantes e aos óleos de bagaço de
azeitona brutos, para se obter uma boa separação do pico relativo à
trilinoleína dos picos adjacentes ou dos picos de eventuais
substâncias interferentes, é necessário purificar previamente o
azeite ou o óleo em conformidade com o seguinte método:
Fazer passar 200 ml do azeite ou óleo, não diluído, numa coluna
de sílica para extracção líquido-sólido (tipo SEP PAK sílica
cartridge-waters port. n.
o51900).
Os triglicéridos são eluídos com 20 ml de hexano anidro para
HPLC, durante, no máximo, 20 segundos.
O produto eluído é seco sobuma corrente de azoto e dissolvido
em isopropanol ou acetona (5 ml). Injectam-se 10-20 ml no
aparelho de HPLC. É necessário verificar que o teor de ácidos
gordos do azeite ou óleo seja o mesmo antes e depois da purifi-
cação, dentro dos limites de erro do método analítico adoptado.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 36
▼M11
▼B
Figura 1 — Cromatograma de uma amostra de óleo de soja
1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 37
▼B
Figura 2 — Gráfico de log αem função de f (número de duplas
ligações)
1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 38
▼B
ANEXOIX
ANÁLISEPOR ESPECTROFOTOMETRIA NO ULTRAVIOLETA
INTRODUÇÃO
A análise por espectrofotometria no ultravioleta pode fornecer indicações
sobre a qualidade de uma matéria gorda, o seu estado de conservação e as
modificações devidas ao processamento tecnológico.
As absorvâncias nos comprimentos de onda previstos no método são
devidas à presença de sistemas diénicos e triénicos conjugados. Os valores
destas absorvâncias são expressos em termos de extinção específica
(extinção de uma solução de matéria gorda a 1 g/100 ml no solvente pres-
crito, para um percurso óptico de 1 cm), designado por K (coeficiente de
extinção).
1. OBJECTIVO
O método descreve o processo de execução do exame espectrofotométrico
de matérias gordas no ultravioleta.
2. PRINCÍPIO DO MÉTODO
A matéria gorda em estudo é dissolvida num solvente apropriado, determi-
nando-se em seguida a extinção da solução no comprimento de onda
prescrito em relação ao solvente puro. As extinções específicas são calcu-
ladas a partir das leituras espectrofotométricas.
3. APARELHOS E UTENSÍLIOS
3.1. Espectrofotómetro para medição das extinções no ultravioleta, entre 220 e
360 nm, com possibilidade de leitura por cada unidade nanométrica.
3.2. Tinas de quartzo, com tampa, com um percurso óptico de 1 cm, não
devendo apresentar diferenças superiores a 0,01 unidades de extinção nas
leituras efectuadas com água ou outro solvente apropriado.
3.3. Balão aferido de 25 ml.
3.4. Coluna para cromatografia com uma parte superior com 270 mm de
comprimento e 35 mm de diâmetro e uma parte inferior com 270 mm de
comprimento e 10 mm de diâmetro.
4. REAGENTES
4.1. Iso-octano (2,2,4-trimetilpentano), para espectrofotometria, puro, devendo
apresentar, em relação à água destilada, uma transmitância não inferior a
60 % a 220 nm e não inferior a 95 % a 250 nm; ou como alternativas:
ciclo-hexano, para espectrofotometria, puro, devendo apresentar, em
relação à água destilada, uma transmitância não inferior a 40 % a 220 nm
e não inferior a 95 % a 250 nm ►M6 ◄.
4.2. Alumina básica para cromatografia em coluna, preparada e controlada de
acordo com a descrição do apêndice I.
4.3. n-Hexano para cromatografia.
5. TÉCNICA
5.1. A amostra a analisar deve estar perfeitamente homogénea e isenta de impu-
rezas em suspensão. Os óleos líquidos à temperatura ambiente são filtrados
em papel a uma temperatura próxima de 30º C; as gorduras sólidas são
homogeneizadas e filtradas a uma temperatura não superior a 10º C acima
da sua temperatura de fusão.
5.2. Pesa-se num balão aferido de 25 ml cerca de 0,25 g da amostra preparada
de acordo com o ponto anterior, completando o volume com o solvente
prescrito e homogeneiza-se. A solução obtida deve ser perfeitamente
límpida. No caso de a solução apresentar opalescência ou turvação, filtra-
-se rapidamente por papel.
5.3. Enche-se uma tina com a solução obtida e medem-se as extinções, usando
como referência o solvente utilizado, nos comprimentos de onda compreen-
didos entre 232 e 276 nm. Os valores medidos registados devem estar
compreendidos no intervalo de 0,1 a 0,8; no caso contrário, torna-se1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 39
▼M6
▼B
▼B
necessário repetir as medições recorrendo a soluções mais concentradas ou
mais diluídas.
5.4. No caso de ser requerida a determinação das extinções específicas, após a
passagem por alumina, procede-se do seguinte modo: introduzem-se na
coluna cromatográfica 30 g de alumina básica suspensa em hexano; quando
a alumina assentar, procede-se à eliminação do excesso de hexano até pelo
menos cerca de 1 cm acima do nível superior da alumina.
Dissolvem-se 10 g de matéria gorda, homogeneizada e filtrada de acordo
com a descrição do ponto 5.1, em 100 ml de hexano e verte-se na coluna
a solução assim obtida. Recolhe-se o eluído e evapora-se o solvente no
vazio a uma temperatura inferior a 25º C.
Procede-se de imediato conforme a descrição do ponto 5.2.
6. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS
6.1. Exprimem-se as extinções específicas (coeficientes de extinção) nos dife-
rentes comprimentos de onda, de acordo com a fórmula:
Kλ¼Eλ
c/C1s
em que:
Kλ= extinção específica no comprimento de onda λ.
Eλ= extinção medida no comprimento de onda λ.
c = concentração da solução em g/100 ml.s = espessura da tina em centímetros.
Os resultados arredondam-se às centésimas.
6.2. A análise espectrofotométrica do azeite de acordo com o método oficial
dos regulamentos oficiais da Comunidade Económica Europeia prevê a
determinação da extinção específica em solução no iso-octano, nos compri-
mentos de onda 232 e 276 nm, sendo a determinação de ∆K efectuada
segundo:
∆K¼K
m/C0Km/C04þKmþ4
2
onde:
Kmrepresenta a extinção específica no comprimento de onda m, correspon-
dente a um valor máximo de absorvância na gama de 270 nm.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 40
▼B
APÊNDICEI
Preparaçãodaaluminaecontrolodasuaactividade
A.1.1. Preparação da alumina
Introduz-se num recipiente susceptível de se fechar hermeticamente a
alumina seca na estufa a 380-400º C, durante 3 horas. Junta-se água
destilada na proporção de 5 ml por 100 g de alumina, fecha-se rapida-
mente o recipiente, agita-se várias vezes e deixa-se repousar durante
pelo menos 12 horas antes da utilização.
A.1.2. Controlo da actividade da alumina
Prepara-se uma coluna cromatográfica com 30 g de alumina. Procede-se
de acordo com a descrição do ponto 5.4. Faz-se passar através da coluna
uma mistura constituída por:
— 95 % de azeite virgem, com uma extinção específica a 268 nm infe-
rior a 0,18,
— 5 % de óleo de amendoim tratado com terra descorada durante o
processo de refinação, com uma extinção específica a 268 nm supe-
rior ou igual a 4.
Se a mistura, após passagem pela coluna, apresentar uma extinção
específica a 268 nm superior a 0,11, a alumina é aceitável. No caso
contrário, faz-se aumentar a hidratação (escalão de actividade).1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 41
▼B
APÊNDICEII
Aferiçãodoespectrofotómetro
A.2. O aparelho deve ser aferido periodicamente (pelo menos de 6 em 6
meses), tanto para a correspondência dos comprimentos de onda como
para a precisão da resposta.
A.2.1. A verificação da resposta do comprimento de onda pode ser feita medi-
ante lâmpada de vapor de mercúrio ou filtros apropriados.
A.2.2. Para verificação da célula fotoeléctrica e do fotomultiplicador, procede-
-se do seguinte modo: pesam-se 0,2 g de cromato de potássio puro para
espectroscopia e dissolvem-se numa solução de hidróxido de potássio
0,05 N até completar o volume de 100 ml num balão aferido. Retiram-
-se em seguida 25 ml exactos da solução obtida, transferem-se para um
balão aferido de 500 ml e completa-se o volume com a mesma solução
de hidróxido de potássio. Mede-se a extinção a 275 nm da nova solução,
tomando a solução de hidróxido de potássio como referência. A extinção
medida com uma tina de 1 cm de percurso óptico deverá ser de
0,200 ± 0,005.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 42
▼B
ANEXOXA
ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA DE ÉSTERES
METÍLICOS DE ÁCIDOSGORDOS
1. OBJECTIVO
A presente norma fornece uma orientação geral para a aplicação de
cromatografia em fase gasosa, mediante o uso de colunas de enchi-
mento ou capilares, para determinação qualitativa e quantitativa de
uma mistura de ésteres metílicos de ácidos gordos obtidos de acordo
com o método descrito no anexo XB.
2. REAGENTES
2.1.Gás vector
Gás inerte (azoto, hélio, árgon, hidrogénio, etc.) seco e com um teor de
oxigénio inferior a 10 mg/kg.
Nota1:O hidrogénio, usado como gás vector apenas em colunas capi-
lares, pode duplicar a rapidez da análise, sendo, porém,
perigoso.
Encontram-se disponíveis conselhos para a sua manipulação
com segurança.
2.2.Gases auxiliares
2.2.1. Hidrogénio (pureza > 99,9 %), isento de impurezas orgânicas.2.2.2. Ar ou oxigénio, isento de impurezas orgânicas.
2.3.Padrão de referência
Mistura de ésteres metílicos de ácido gordos puros ou os ésteres
metílicos de uma gordura de composição conhecida, de preferência
semelhante à gordura a analisar.
Devem ser tomadas precauções com vista a evitar a oxidação de ácidos
gordos polinsaturados.
3. APARELHOS E UTENSÍLIOS
As instruções fornecidas referem-se a equipamento vulgarmente utili-
zado para cromatografia em fase gasosa, mediante a utilização quer de
colunas de enchimento quer capilares e um detector de ionização de
chama. Quaisquer aparelhos susceptíveis de fornecer a eficiência e a
resolução especificadas no ponto 5.1.2 são apropriados.
3.1.Cromatógrafo de fase gasosa
O cromatógrafo de fase gasosa deve compreender os seguintes
elementos:
3.1.1. Sistema de injecção
Utiliza-se um sistema de injecção:
a) No caso de colunas de enchimento, com o menor espaço-morto
possível (o sistema de injecção deverá, neste caso, ser susceptível
de aquecimento a uma temperatura de 20º C a 50º C superior à
temperatura de coluna);
b) No caso das colunas capilares, com injector apropriado para uso
com este tipo de colunas, podendo apresentar divisão de fluxo
(«split») ou não ou injectores para injecção directa na coluna («on
column»).
Nota2:Na ausência de ácidos gordos com menos de 16 átomos de
carbono, poderá utilizar-se um injector equipado com uma
agulha móvel.
3.1.2. Forno
O forno deve ser susceptível de aquecer a coluna à temperatura mínima
de 260º C e de manter a temperatura desejada com uma precisão de 1º
C, no caso de colunas de enchimento, e de 0,1º C, no caso de colunas1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 43
▼B
capilares. Este último requisito é de particular importância quando se
utiliza um tubo de sílica fundida (quartzo).
Recomenda-se em todos os casos o uso de aquecimento com progra-
mação de temperatura, particularmente para ácidos gordos com menos
de 16 átomos de carbono.
3.1.3. Coluna de enchimento
3.1.3.1. Coluna de material inerte às substâncias a analisar (vidro ou aço
inoxidável), possuindo as dimensões seguintes:
a) Comprimento: 1 m a 3 m, poderá usar-se uma coluna relativamente
curta quando se encontram presentes ácidos gordos de cadeia longa
(superiores a C20). Na análise de ácidos com 4 a 6 átomos de
carbono, recomenda-se o uso de uma coluna de 2 m de compri-
mento;
b) Diâmetro interno: 2 mm a 4 mm.
Nota3:Quaisquer compostos polinsaturados com mais de três duplas
ligações que se encontrem eventualmente presentes poderão
sofrer decomposição numa coluna de aço inoxidável.
Nota4:Poderá usar-se um sistema de duas colunas de enchimento.
3.1.3.2. Enchimento, constituído pelos elementos seguintes:
a) Suporte: terra de infusórios lavada com ácido e silanizada ou outro
suporte inerte com uma gama limitada de granulometria (25 µm
entre os limites 125-200 µm), sendo as dimensões médias de cada
grão relacionadas com o diâmetro interno e o comprimento da
coluna;
b) Fase estacionária: líquido polar do tipo poliéster (tal como polissuc-
cinato de dietilenoglicol, polissuccinato de butanodiol, poliadipato
de etilenoglicol, etc.) ou qualquer outro líquido (designadamente
uma cianossilicona) susceptível de permitir a separação cromatográ-
fica desejada (veja-se o ponto 5). A fase estacionária deve ser de 5 %
(m/m) a 20 % (m/m) do enchimento. Para certas separações, pode
ser utilizada uma fase estacionária apolar.
3.1.3.3. Condicionamento da coluna
Aquece-se o forno gradualmente até 185º C, mantendo a coluna desli-
gada do detector, e faz-se passar através desta uma corrente de gás
inerte, à razão de 20-60 ml/minuto, durante um intervalo de tempo
mínimo de 16 horas, àquela temperatura e, seguidamente, de 2 horas a
195º C.
3.1.4. Coluna capilar
3.1.4.1. Tubo de material inerte às substâncias a analisar (geralmente vidro ou
sílica fundida). O diâmetro interno deve estar compreendido entre
0,2 mm e 0,8 mm. A superfície interna deve ser submetida a um trata-
mento apropriado (por exemplo, preparação da superfície ou
inactivação) antes de receber o revestimento correspondente à fase esta-
cionária. Na maioria dos casos é suficiente um comprimento de 25 m.
3.1.4.2. Fase estacionária, geralmente do tipo poliglicol (polietilenoglicol
20000), poliéster (polissuccinato de butanodiol) ou polissiloxano polar
(cianossiliconas).
Nota5:Existe o risco de os polissiloxanos polares originarem dificul-
dades na identificação e separação do ácido linolénico e de
ácidos em C20.
Os revestimentos devem ser finos, isto é, de 0,1 µm a 0,2 µm.
3.1.4.3. Instalação e condicionamento da coluna
Observam-se as precauções normais na instalação de colunas capilares,
isto é, na colocação da coluna no forno (suporte), escolhe-se a
montagem das juntas de forma a garantir a hermeticidade, adaptando
as extremidades da coluna no injector e no detector (redução de
espaços-mortos). Coloca-se a coluna sobum fluxo de gás vector [por
exemplo 0,3 bar (30 KPa) para uma coluna de 25 m de comprimento
e 0,3 mm de diâmetro interno].
Condiciona-se a coluna mediante programação de temperatura do forno
a uma frequência de 3º C/minuto, desde a temperatura ambiente até
uma temperatura 10º C inferior ao limite de decomposição da fase esta-
cionária. Mantém-se o forno a esta temperatura durante 1 hora, até à1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 44
▼B
estabilização da linha base. Voltar a 180º C, para trabalhar sob
condições isotérmicas.
Nota6:Encontram-se disponíveis no comércio colunas pré-condicio-
nadas apropriadas.
3.1.5. Detector
O detector deve, de preferência, ter a possibilidade de ser aquecido a
uma temperatura superior à coluna.
3.2.Seringa
A seringa deverá ter a capacidade máxima de 10 µl, e ser graduada em
divisões de 0,1 µl.
3.3.Registador
No caso de o cálculo da composição da mistura ser efectuado a partir
da curva registada, torna-se necessário o uso de um registador de alta
precisão, compatível com a restante aparelhagem. As características do
registador devem ser:
a) Velocidade de resposta inferior a 1,5 segundos, preferencialmente
inferior a 1 segundo (a velocidade de resposta é o tempo requerido
para a caneta passar de 0 a 90 %, após a introdução momentânea de
um sinal de 100 %);
b) Largura do papel: 20 cm, no mínimo;
c) Velocidade do papel ajustável a valores compreendidos entre 0,4 cm/
/minuto e 2,5 cm/minuto.
3.4.Integrador ou calculador (opcional)
O uso de um integrador ou calculador electrónico permite a realização
de cálculos rápidos e rigorosos. O aparelho a utilizar deve fornecer uma
resposta linear com a sensibilidade adequada e a correcção do desvio da
linha base deve ser satisfatória.
4. TÉCNICA
As técnicas descritas nos pontos 4.1 a 4.3 referem-se ao uso do detector
de ionização de chama.
Em alternativa, poderá usar-se um cromatógrafo gás-líquido equipado
com um catarómetro (cujo funcionamento se baseia em alterações da
condutibilidade térmica) como detector, tornando-se neste caso
necessário modificar as condições operatórias de acordo com o ponto 6.
4.1.Condições operatórias
4.1.1. Selecção das condições óptimas4.1.1.1. Coluna de enchimento
Relativamente à selecção das condições operatórias, devem tomar-se
em conta as variáveis seguintes:
a) Comprimento e diâmetro da coluna;
b) Natureza e quantidade da fase estacionária;
c) Temperatura da coluna;
d) Fluxo do gás vector;
e) Resolução requerida;
f) Quantidade da toma de ensaio, escolhida de modo a que o conjunto
formado pelo detector e o electrómetro forneça uma resposta linear;
g) Duração da análise.
De um modo geral, os valores fornecidos nos quadros 1 e 2 conduzem
aos resultados desejados, ou seja, um mínimo de 2000 pratos teóricos
por metro de coluna para o estearato de metilo e a sua eluição no inter-
valo de 15 minutos, aproximadamente.
Se o aparelho o permitir, a temperatura do injector deve ser próxima de
200º C e a temperatura do detector igual ou superior à temperatura da
coluna.
Como regra, a proporção entre a fluxo de hidrogénio que alimenta o
detector de ionização de chama e o fluxo de gás vector deve variar de1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 45
▼B
1:2 a 1:1, de acordo com o diâmetro da coluna. O fluxo de oxigénio
deverá ser 5 a 10 vezes superior ao fluxo de hidrogénio.
Quadro1
Diâmetro interno da coluna (mm) Fluxo de gás vector (ml/min)
2 1 5—2 5
3 2 0—4 0
4 4 0—6 0
Quadro2
Concentração da fase estacionária %
(m/m)Temperatura (ºC)
5 175
10 180
15 185
20 185
4.1.1.2. Coluna capilar
As propriedades de eficiência e permeabilidade das colunas capilares
conduzem a uma grande dependência entre a separação dos consti-
tuintes e a duração da análise, por um lado, e o fluxo de gás vector na
coluna, por outro.
Torna-se, deste modo, necessário optimizar as condições operacionais
mediante a regulação daquele fluxo (ou, mais simplesmente, das perdas
na coluna) consoante se pretenda melhorar as separações ou executar
uma análise rápida.
4.1.2. Determinação do número de pratos teóricos (eficiência) e da resolução
— (ver figura 1)
Efectua-se a análise de uma amostra de estearato de metilo e oleato de
metilo (resultantes, por exemplo, de manteiga de cacau) em proporções
aproximadamente equivalentes.
Escolhe-se a temperatura da coluna e o fluxo de gás vector de modo a
que o máximo do pico relativo ao estearato de metilo seja registado
cerca de 15 minutos depois do pico relativo ao solvente. Usa-se uma
quantidade de mistura de ésteres metílicos, de modo que o pico relativo
ao estearato de metilo ocorra a três quartos da escala completa, aproxi-
madamente.
Calcula-se o número de pratos teóricos, n (eficiência), através da
fórmula:
n¼16drI
WI/C20/C21
2
e a resolução, R, através da fórmula:
R¼2∆
WIþWII
em que:
drI — representa a distância de retenção, medida em milímetros, desde
o início do cromatograma até ao máximo do pico correspondente ao
estearato de metilo.
WI e WII — são as larguras, em milímetros, dos picos relativos ao
estearato de metilo e oleato de metilo, respectivamente, medidas entre
os pontos de intersecção das tangentes aos pontos de inflexão da curva
com a linha base.
∆— é a distância, em milímetros, entre os máximos dos picos corres-
pondentes ao estearato e oleato de metilo.
E o índice de resolução, lr, através da fórmula:1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 46
▼M2
▼M2
a
b
em que:
a representa a altura do pico mais baixo, medida em relação à linha de
base;
brepresenta a altura do mínimo do vale entre dois picos adjacentes,
medida em relação à linha de base.
Figura 1
Cromatogramas para a determinação do número de pratos teóricos (eficácia) e
da resolução
As condições operativas a escolher deverão permitir a obtenção de, pelomenos, 2 000 pratos teóricos por metro de coluna para o estearato de
metilo e uma resolução mínima de 1:25.
4.2.Toma de ensaio
Com o auxílio da seringa (ponto 4.2), recolhe-se 0,1 µl a 2 µl da
solução de ésteres metílicos, preparada de acordo com o anexo XB, e
injecta-se na coluna.
No caso de os ésteres não se encontrarem em solução, dissolvem-se em
heptano, de qualidade cromatográfica, na proporção de 10 mg/ml e
injectam-se 0,1 a 1 µl da solução assim obtida.
No caso de se pretender detectar constituintes presentes apenas em
vestígios a quantidade da toma deve ser aumentada (até 10 vezes).
4.3.Análise
Em geral, as condições de trabalho devem ser idênticas às descritas no
ponto 5.1.1. Contudo, é possível trabalhar a uma temperatura inferior
para a coluna, no caso da determinação de ácidos gordos com menos
de 12 átomos de carbono, ou a uma temperatura superior, para ácidos
gordos com mais de 20 átomos de carbono. Fortuitamente é possível
recorrer à programação de temperatura em ambos os casos. Se, por1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 47
▼B
▼B
exemplo, a amostra contiver ésteres metílicos de ácidos gordos com
menos de 12 átomos de carbono, injecta-se a amostra a 100º C (ou a
50-60º C, no caso de se encontrar presente ácido butírico), aumentando
a temperatura de imediato, a uma razão de 4º C/min a 8º C/min, até se
atingir o valor óptimo. Em alguns casos, podem combinar-se ambos os
procedimentos.
Após o aquecimento programado, continua-se a eluição a temperatura
constante até que todos os componentes tenham sido eluídos. Se o
aparelho não permitir um aquecimento programado, trabalha-se a duas
temperaturas fixas, entre 100 e 195º C.
Se possível, recomenda-se que a análise seja feita com duas fases esta-
cionárias de polaridades diferentes, com vista a verificar a ausência de
picos irresolúveis ou no caso da presença de C18:3 e C20:0 ou C18:3 e
C18:2 conjugados.
4.4.Obtenção do cromatograma de referência e dos gráficos de
referência
Procede-se à análise da mistura de padrão de referência (ponto 2.3)
usando as mesmas condições operativas seguidas para a amostra e
medem-se os tempos de retenção ou distâncias de retenção para os
ácidos gordos constituintes. Traçam-se, em papel semilogarítmico, para
qualquer grau de insaturação, os gráficos relativos ao logaritmo do
tempo ou distância de retenção em função do número de átomos de
carbono. Sob condições isotérmicas, os gráficos relativos a ácidos
gordos de cadeia linear com o mesmo grau de insaturação devem apre-
sentar-se soba forma de linhas rectas aproximadamente paralelas.
Torna-se necessário evitar condições favoráveis à ocorrência de picos
irresolúveis, isto é, em que a resolução é insuficiente para a separação
dos dois componentes.
5. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS
5.1.Análise qualitativa
Identificam-se os picos correspondentes aos ésteres metílicos da
amostra a partir dos gráficos preparados de acordo com o ponto 4.4,
recorrendo a interpolação, se necessário.
5.2.Analise quantitativa
5.2.1. Determinação da composição
Salvo em alguns casos excepcionais, deve usar-se o método de norma-
lização interna, ou seja, considerar que a totalidade dos componentes da
amostra se encontra representada no cromatograma, de modo à soma
das áreas relativas a todos os picos corresponder a 100 % dos consti-
tuintes (eluição total).
Se o equipamento incluir um integrador, usam-se os valores nele
obtidos. No caso contrário, determina-se a área referente a cada pico
mediante a multiplicação da altura pela largura a meia-altura, tomando
em conta, se necessário, as diversas atenuações utilizadas durante o
registo.
5.2.2. Método de cálculo
5.2.2.1. Caso geral
Calcula-se o teor de um dado constituinte, I, expresso em termos de
percentagem, em massa, de ésteres metílicos, mediante a determinação
de cem vezes o quociente da área do pico correspondente pela soma das
áreas de todos os picos, de acordo com a seguinta fórmula:
AI
ΣAI/C2100
onde:
AI = representa a área do pico relativo ao componente I.
ΣAI = representa a soma das áreas relativas à totalidade dos picos.
O resultado arredonda-se às décimas.
Nota7:Neste caso geral, considera-se que o resultado do cálculo
baseado nas áreas relativas representa uma percentagem em1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 48
▼B
massa. Para os casos em que tal considerando não é
permissível, veja-se o ponto 5.2.2.2.
5.2.2.2. Uso de factores de correcção
Em certos casos, particularmente na presença de ácidos gordos com
menos de 8 átomos de carbono ou de ácidos gordos com grupos secun-
dários, ou quando se usam detectores de condutibilidade térmica, ou
nos casos em que se requer particularmente o mais elevado grau de
precisão, torna-se necessário o uso de factores de correcção para
converter as percentagens relativas às áreas dos picos em percentagem
em massa de componentes.
Determinam-se os factores de correcção mediante um cromatograma
resultante da análise de uma mistura de referência de ésteres metílicos,
de composição conhecida, sobcondições operacionais idênticas às utili-
zadas para a amostra.
Para a mistura de referência, a percentagem em massa do componente I
é dada pela fórmula:
mI
Σm/C2100
onde:
mI = representa a massa do componente I na mistura de referência.
Σm = representa a soma das massas dos vários componentes da
mistura de referência.
A partir do cromatograma da mistura de referência (ponto 4.4), calcula-
-se a percentagem (área/área) relativa ao componente I, pela expressão:
AI
ΣA/C2100
onde:
AI = representa a área do pico relativo ao componente I.
ΣA = representa a soma das áreas correspondentes a todos os picos.
O factor de correcção é calculado segundo a expressão:
KI¼MI/C2ΣA
AI/C2Σm
Os factores de correcção são apresentados habitualmente em termos de
KC 1 6 de modo a que os factores relativos serão:
K0I¼KI
KC 1 6
O teor de cada componente I da amostra, expresso em termos de
percentagem em massa de ésteres metílicos, é dado por:
K0I/C2AI
ΣK0I/C2AI ðÞ/C2100
Os resultados arredondam-se às décimas.
5.2.2.3. Uso de padrão interno
Em certos casos (nomeadamente quando nem todos os ácidos gordos
são eluídos, o que acontece por exemplo quando se encontram presentes
ácidos com 4 e 6 átomos de carbono, juntamente com ácidos com 16 e
18 átomos de carbono, ou quando é necessário determinar o teor abso-
luto de um ácido gordo numa amostra) torna-se indispensável o uso de
um padrão interno. Para tal, recorre-se frequentemente ao uso dos
ácidos gordos com 5,15 ou 17 átomos de carbono. O factor de
correcção relativa ao padrão interno deve ser determinado (se existir).
A percentagem em massa de componente I, expressa em termos de
ésteres metílicos, é, assim, dada pela fórmula:
ms/C2K0I/C2AI
m/C2K0s/C2As/C21001991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 49
▼B
onde:
ms = representa a massa, em miligramas, do padrão interno.
m = representa a massa, em miligramas, da toma de ensaio.
K′s = representa o factor de correcção para o padrão interno (relativa-
mente a KC 1 6).
K′I = representa o factor de correcção para o componente I (relativa-
mente a KC 1 6).
As = representa a área do pico correspondente ao padrão interno.
AI = representa a área do pico correspondente ao componente I.
Os resultados arredondam-se às décimas.
6. CASO PARTICULAR DA DETERMINAÇÃO DOS ISÓMEROS
TRANS
É possível determinar o teor dos isómeros trans dos ácidos gordos com
um número de átomos de carbono compreendido entre 10 e 24 por
separação dos ésteres metílicos, utilizando colunas cromatográficas
capilares com uma polaridade específica.
6.1. Coluna capilar de sílica com diâmetro interno de 0,25 mm a 0,32 mm e
comprimento de 50 m, revestida interiormente de cianopropilsilicone; a
espessura do filme varia entre 0,1 e 0,3 µm (tipo SP 2340, tipo SP
2380, C.P. sil 88, Silor 10 e tipos similares).
6.2. Os ésteres metílicos são preparados pelo processo B descrito no anexo
X B. As substâncias gordas com acidez livre superior a 3 % deverão ser
previamente neutralizadas, conforme descrito no ponto 6.1 do anexo
VII.
6.3. As condições de trabalho da cromatografia em fase gasosa são, generi-
camente, as seguintes:
— temperatura da coluna programada de 150 ºC a 230 ºC (por
exemplo, 165 ºC durante 15 minutos e, a seguir, um aumento de
5 ºC por minuto até 200 ºC),
— temperatura do injector: 250 ºC, se for utilizado um sistema de
injector divisor ou a temperatura inicial da coluna, se a amostra for
introduzida directamente no topo da coluna (sistema «on column»),
— temperatura do detector: 250 ºC,— fluxo do gás vector (hélio e hidrogénio): 1,2 ml/minuto.
A quantidade injectada deve ser tal que, para a sensibilidade utilizada, a
altura do pico correspondente ao éster metílico do ácido araquídico seja
igual ou superior a 20 % da linha de base.
6.4. A identificação dos vários ésteres metílicos é efectuada com base nos
tempos de retenção, que são comparados com os tempos de retenção
de misturas de referência (como indicado no ponto 2.3).
Os ésteres dos ácidos gordos trans são eluídos antes dos isómeros cis
correspondentes. Na figura 2 apresenta-se um exemplo de cromato-
grama.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 50
▼M2
▼M2
Figura 2
Cromatograma-tipo em fase grazosa relativo à determinação dos ísomeros trans
dos ácidos gordos com coluna capilar.
6.5. A eficácia da coluna, calculada de acordo com o ponto 4.1.2, deve
permitir a separação de determinados acoplamentos críticos, por
exemplo, o acoplamento da banda correspondente aos ácidos transiso-
leicos e do pico do ácido oleico, trans C18: 1/cis C18: 1, com índice
de resolução superior a 2.
6.6. A percentagem dos diversos ácidos gordos trans é calculada com base
na relação entre a área do pico correspondente e a soma das áreas de
todos os picos do cromatograma.
Serão consideradas as percentagens correspondentes aos seguintes
ácidos:
— trans-octadecenóicos (T 18: 1), indicados no anexo I do presente
regulamento como soma dos isómeros transoleicos,
— cis, trans e trans, cis-octadecadienóicos [(CT/TC) 18: 2], indicados
no anexo I do presente regulamento como soma dos isómeros trans-
linoleicos,
— trans, cis, trans; cis, cis, trans; cis, trans, cis; trans, cis, cis-octadeca-
trienóicos [(TCT + CCT + CTC + TCC) 18: 3], indicados no anexo
I do presente regulamento como soma dos isómeros translinolé-
nicos.
Nota8:tendo em conta as características particulares deste método,
apresentar os resultados com duas casas decimais.
►M27.◄CASO ESPECIAL
Uso de um catarómetro (baseado em alterações na condutibilidade
térmica) como detector.
Para a determinação qualitativa e quantitativa da composição de uma
mistura de ésteres metílicos de ácidos gordos poderá também ser usado
um cromatógrafo de fase gasosa equipado com um detector cujo funcio-
namento se baseia em alterações na condutibilidade térmica
(catarómetro). Neste caso, as condições operacionais descritas em 3 e
4 deverão ser modificadas de acordo com o quadro 3.
Para a análise quantitativa, usam-se os factores de correcção definidos
no ponto 5.2.2.2.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 51
▼B
▼B
Quadro3
Variável Condições
Coluna Comprimento: 2 a 4 metros
Diâmetro interno: 4 mm
Suporte Granulometria: compreendida
entre 160 e 200 µm
Concentração da fase estacionária 15 % (m/m) a 25 % (m/m)
Gás vector Hélio ou, na sua falta, hidrogénio
com um teor de oxigénio tão
baixo quanto possível
Gases auxiliares Nenhum
Temperatura do injector 40º C a 60º C superior à tempe-
ratura da coluna
Temperatura da coluna 180º C a 200º C
Fluxo do gás vector Geralmente compreendido entre
60 ml/min e 80 ml/min
Quantidade de amostra injectada Geralmente compreendida entre
0,5 e 2 µl
►M28.◄RELATÓRIO
O relatório deverá especificar os métodos utilizados para a preparação
dos ésteres metílicos e para a realização da análise cromatográfica, bem
como os resultados obtidos. Deverá mencionar igualmente quaisquer
condições operacionais não especificadas na presente norma interna-
cional, ou consideradas opcionais, assim como quaisquer
circunstâncias que possam ter influenciado os resultados.
O relatório deverá incluir todas as informações necessárias para a
completa identificação da amostra.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 52
▼B
ANEXOXB
PREPARAÇÃO DOS ÉSTERES METÍLICOS DE ÁCIDOS GORDOS
CONFORME O ANEXO VI, PONTOS I E II, DO REGULAMENTO
(CEE) N.o72/77 OU DE ACORDO COM PROCESSO A SEGUIR
DESCRITO
INTRODUÇÃO
A escolha do processo a seguir deve ser feita em função da composição
acídica e da acidez da matéria gorda a analisar, bem como da análise por
cromatografia em fase gasosa a efectuar.
Em particular:
— para matérias gordas que contêm ácidos gordos inferiores a C12, apenas
poderão ser efectuados processos em ampola fechada ou mediante o uso
de sulfato de dimetilo,
— para matérias gordas com acidez superior a 3 % apenas poderão ser
efectuados procedimentos que utilizem uma mistura metanol-ácido
clorídrico ou sulfato de dimetilo,
— para a determinação por cromatografia em fase gasosa de isómeros
trans apenas poderão ser efectuados processos que utilizem metilato de
sódio ou sulfato de dimetilo,
— o processo que utiliza mistura hexano-ácido sulfúrico deve ser seguido
na preparação de ésteres metílicos de matérias gordas em pequenas
quantidades, a separar por cromatografia em camada fina.
A presença de insaponificável em quantidades não superiores a 3 % pode
ser desprezada; nos restantes casos, os ésteres metílicos deverão ser prepa-
rados a partir dos ácidos gordos.
1. OBJECTIVO
Descrevem-se em seguida cinco processos para a preparação dos ésteres
metílicos de matéria gorda:
A. Com metilato de sódio;
B. Com metilato de sódio;
C. Com mistura metanol-ácido clorídrico;
D. Com sulfato de dimetilo;
E. Com mistura metanol-hexano-ácido sulfúrico.
Processo A
2. RESUMO DO PROCESSO
A matéria gorda em estudo é aquecida com metanol e metilato de sódio. Os
ésteres metílicos obtidos são extraídos com éter etílico.
3. APARELHOS E UTENSÍLIOS
3.1. Balão de 100 ml equipado com refrigerante, munido de um tubo com cal
sodada na extremidade superior e com juntas esmeriladas.
3.2. Provetas de 50 ml.3.3. Pipeta de 5 ml, graduada em 0,1 ml.3.4. Ampolas de decantação de 250 ml.3.5. Balão de 200 ml.
4. REAGENTES
4.1. Metanol anidro.4.2. Metilato de sódio, em solução aproximadamente a 1 g/100 ml em metanol:
prepara-se mediante a adição de 0,34 g de sódio metálico a 100 ml de
metanol anidro.
4.3. Éter etílico.
4.4. Cloreto de sódio em solução a 10 g/100 ml.4.5. Éter de petróleo, com 40-60º C de intervalo de ebulição.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 53
▼B
5. TÉCNICA
5.1. Introduz-se no balão de 100 ml 2 g de matéria gorda previamente sujeita a
secagem com sulfato de sódio anidro e filtrada. Juntam-se 35 ml de
metanol, adapta-se o refrigerante e leva-se à ebulição durante alguns
minutos.
5.2. Suspende-se o aquecimento, retira-se o refrigerante e juntam-se rapida-
mente 3,5 ml de solução de metilato de sódio. Adapta-se de novo o
refrigerante e leva-se à ebulição, sob refluxo, durante o mínimo de 3 horas.
A metilação considera-se completa quando toda a matéria gorda se tiver
dissolvido e a mistura resultante estiver perfeitamente límpida à tempera-
tura ambiente.
5.3. Arrefece-se o balão e verte-se a mistura numa ampola de decantação de
250 ml adicionando 35-40 ml de éter etílico, 100 ml de água destilada e
5-6 ml de solução de cloreto de sódio a 10 g/100 ml. Agita-se e espera-se
a separação das fases; transfere-se a fase aquosa para uma outra ampola de
decantação e extrai-se novamente com 25 ml de éter etílico.
Juntam-se as fases etéreas e adicionam-se 50 ml de éter de petróleo com
intervalo de ebulição de 40-60º C, provocando a eliminação e a separação
de vestígios de água. Lava-se a fase etérea com três porções sucessivas de
10-15 ml de água destilada, seca-se com sulfato de sódio anidro e filtra-se
por papel, recolhendo o filtrado num balão de 200 ml. Destila-se o
solvente, completando a evaporação em banho-maria, sob corrente de azoto
puro.
Processo B
2. RESUMO DO PROCESSO
A matéria gorda em estudo é tratada com metilato de sódio em solução
metanólica, numa ampola fechada a 85-90º C.
3. APARELHOS E UTENSÍLIOS
3.1. Ampola de vidro com paredes robustas, de cerca de 5 ml (altura 40-45 mm,
diâmetro 14-16 mm).
3.2. Pipeta de 1 ml graduada em 0,1 ml.
4. REAGENTES
4.1. Metilato de sódio, em solução aproximadamente a 1,5 g/100 ml em
metanol. Prepara-se mediante a adição de 0,50 g de sódio metálico a
100 ml de metanol anidro.
5. TÉCNICA
5.1. Introduz-se na ampola de vidro 2 g de matéria gorda, previamente sujeita a
secagem com sulfato de sódio anidro e filtrada. Adicionam-se 0,3 g (cerca
de 0,4 ml) de solução de metilato de sódio e fecha-se à chama.
5.2. Mantém-se a ampola durante 2 horas num banho a 85-90º C, agitando
ocasionalmente; a conclusão do processo infere-se da limpidez do conteúdo
da ampola, após a sedimentação do glicerol e dos resíduos dos reagentes.
5.3. Arrefece-se à temperatura ambiente. Abre-se a ampola apenas no momento
da utilização dos ésteres metílicos, que não necessitam de qualquer outro
tratamento antes da introdução no cromatógrafo de fase gasosa.
Processo C
2. RESUMO DO PROCESSO
A matéria gorda em estudo é tratada com mistura metanol-ácido clorídrico,
numa ampola fechada a 100º C.
3. APARELHOS E UTENSÍLIOS
3.1. Ampola de vidro, com paredes robustas, de cerca de 5 ml (altura 40-45 mm,
diâmetro 14-16 mm).
3.2. Pipetas graduadas de 1 e 2 ml.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 54
▼B
4. REAGENTES
4.1. Solução a 2 % (m/m) de ácido clorídrico em metanol. Prepara-se a partir de
ácido clorídrico gasoso e metanol anidro (nota 1).
4.2. Hexano de qualidade cromatográfica.
5. TÉCNICA
5.1. Introduzem-se na ampola de vidro 0,2 g de matéria gorda, previamente
sujeita a secagem com sulfato de sódio anidro e filtrada, e 2 ml de solução
de ácido clorídrico-metanol. Fecha-se a ampola à chama.
5.2. Mantém-se a ampola num banho-maria a 100º C durante 40 minutos.5.3. Arrefece-se a ampola em água corrente, abre-se, juntam-se 2 ml de água
destilada e 1 ml de hexano. Centrifuga-se e remove-se a fase correspon-
dente ao hexano, que se encontra pronta a utilizar.
Processo D
2. RESUMO DO PROCESSO
A matéria gorda em estudo é saponificada com solução metanólica de
hidróxido de potássio, sendo posteriormente tratada com sulfato de dime-
tilo. Após a adição de ácido clorídrico, aguarda-se a separação espontânea
dos ésteres metílicos formados. Mediante o tratamento sucessivo com
alumina, obtêm-se os ésteres metílicos com um elevado grau de pureza.
3. APARELHOS E UTENSÍLIOS
3.1. Balão de vidro de 20 ml, com paredes robustas, equipado com rolha esme-
rilada 10/19 e ganchos de segurança.
3.2. Refrigerante de 5 bolas, com juntas esmeriladas 10/19.
3.3. Filtros de vidro com septo poroso, de porosidade G2 e diâmetro de 20 mm.
3.4. Balão de vidro de fundo cónico, com cerca de 10 ml de capacidade.3.5. Seringas de 1 ml e 5 ml.
4. REAGENTES
4.1. Hidróxido de potássio, em solução a 10 g/100 ml em metanol de qualidade
cromatográfica.
4.2. Indicador verde bromocresol, em solução a 0,05 g/100 ml em metanol.4.3. Sulfato de dimetilo (d = 1,335 a 15º C).4.4. Ácido clorídrico concentrado, d = 1,19, diluído na proporção de 1:1 com
metanol de qualidade cromatográfica.
4.5. Alumina activada segundo Brokmann, para cromatografia de adsorção.
5. TÉCNICA
5.1. Introduz-se no balão de 20 ml, 7 g (cerca de 2,2 ml) de matéria gorda,
previamente sujeita a secagem com sulfato de sódio anidro e filtrada, e
adicionam-se 5 ml da solução de hidróxido de potássio e alguns regula-
dores de ebulição. Adapta-se o refrigerante e aquece-se brandamente
durante 5 minutos, sobagitação. A saponificação considera-se completa
quando a solução se apresentar límpida. Remove-se o refrigerante e arre-
fece-se sobágua corrente.
5.2. Juntam-se 2 gotas de indicador e, com auxílio de uma seringa, 1 ml de
sulfato de dimetilo, lentamente. Fecha-se hermeticamente o balão e agita-
-se durante 2 a 3 minutos, imergindo frequentemente o fundo do balão
num banho-maria. A reacção está completa quando o indicador passar de
azul a amarelo. Arrefece-se o balão sob água corrente, abre-se e
adicionam-se 5 ml de solução metanólica de ácido clorídrico.
5.3. Após agitação durante alguns segundos, coloca-se o balão em posição incli-
nada, imprimindo uma ligeira agitação que facilita o afloramento dos
ésteres metílicos soba forma de uma massa oleosa (nota A).
Removem-se os ésteres metílicos com o auxílio de uma seringa, intro-
duzem-se num balão de fundo cónico, junta-se um volume de alumina de
cerca de 1/4 do volume dos ésteres metílicos, agita-se e filtra-se por papel.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 55
▼B
NotaA:No caso de não ocorrer a separação espontânea dos ésteres
metílicos, adicionam-se 5 ml de água e agita-se.
Processo E
2. RESUMO DO PROCESSO
A matéria gorda em estudo é aquecida à ebulição com mistura metanol-
-hexano-ácido sulfúrico. Os ésteres metílicos obtidos são extraídos cométer de petróleo.
3. APARELHOS E UTENSÍLIOS
3.1. Balão de 20 ml, aproximadamente, equipado com tubo refrigerante, com
cerca de 1 metro de comprimento, e juntas esmeriladas.
3.2. Pipeta graduada de 5 ml.
3.3. Ampola de decantação de 50 ml.3.4. Provetas graduadas de 10 e 25 ml.
3.5. Balão de 15 ml, com fundo cónico.
4. REAGENTES
4.1. Reagente de metilação: mistura de metanol anidro-hexano-ácido sulfúrico
concentrado (d = 1,84) nas proporções de 75 + 25 + 1 em volume.
4.2. Éter de petróleo, com intervalo de ebulição a 40-60º C.4.3. Sulfato de sódio anidro.
5. TÉCNICA
5.1. Introduz-se no balão de 20 ml o material recuperado da camada fina,
adicionam-se 5 ml do reagente de metilação.
5.2. Coloca-se o refrigerante e aquece-se durante 30 minutos em banho-maria
(nota 2).
5.3. Transfere-se quantitativamente a mistura obtida para uma ampola de decan-
tação de 50 ml, diluindo com 10 ml de água destilada e 10 ml de éter de
petróleo. Agita-se vigorosamente, aguarda-se a separação das fases,
remove-se a fase aquosa e lava-se a fase etérea com duas porções de
20 ml de água destilada. Introduz-se na ampola de decantação uma pequena
quantidade de sulfato de sódio anidro, agita-se, deixa-se repousar durante
alguns minutos e filtra-se, recolhendo o filtrado num balão de fundo cónico
de 15 ml. Evapora-se o solvente em banho-maria, sob corrente de azoto.
Nota1:Podem preparar-se facilmente no laboratório pequenas quantidades
de ácido clorídrico gasoso por simples deslocamento a partir da
solução comercial (d = 1,18), adicionando nela gota a gota ácido
sulfúrico concentrado (d = 1,84). O gás libertado pode ser facil-
mente seco fazendo-o borbulhar em ácido sulfúrico concentrado.
Dado que o ácido clorídrico é absorvido pelo metanol de um
modo muito rápido, aconselha-se a tomada das precauções usuais
na sua dissolução, isto é, introduzir o gás através de um pequeno
funil invertido tocando a superfície do líquido. Podem preparar-se
previamente grandes quantidades de solução metanólica de ácido
clorídrico, que deverá ser mantida em recipientes com rolha de
vidro e armazenada ao abrigo da luz.
Nota2:A fim de controlar a ebulição, introduzem-se no balão alguns regu-
ladores de vidro e limita-se a temperatura do banho-maria a 90º C.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 56
▼B
ANEXOXI
DETERMINAÇÃO DO TEOR DE SOLVENTES HALOGENADOS
VOLÁTEIS NO AZEITE
1. FUNDAMENTO
Análise por cromatografia em fase gasosa segundo a técnica do espaço de
cabeça.
2. APARELHOS E UTENSÍLIOS
2.1. Aparelho de cromatografia em fase gasosa equipado com um detector de
captura de electrões (ECD).
2.2. Órgãos para o espaço de cabeça.2.3. Colunas de cromatografia em fase gasosa em tubo de vidro, com 2 metros
de comprimento, 2 mm de diâmetro interior e fase estacionária constituída
por OV101 a 10 % ou equivalente, impregnando terra de diatomáceas
calcinada, lavada com ácidos e silanizada, com granulometria de 80-100
Mesh (200-150 µm).
2.4. Gás vector e gás auxiliar: azoto para a cromatografia em fase gasosa com
detecção por captura de electrões.
2.5. Frascos de vidro de 10 a 15 ml sobre cujo gargalo se coloca um septo elas-
tómetro (teflon) ajustado por anel de alumínio sendo o conjunto fixado por
capsulador manual.
2.6. Capsulador manual.
2.7. Seringa para gás de 0,5 a 2 ml.
3. REAGENTES
3.1. Padrões: hidrocarbonetos halogenados voláteis com um grau de pureza
adequado para utilização em cromatografia em fase gasosa.
4. TÉCNICA
4.1. Pesam-se exactamente cerca de 3 g de azeite num frasco de vidro (ponto
1.5) a não reutilizar, fecha-se o frasco hermeticamente e mantém-se à
temperatura de 70º C durante uma hora. Recolhe-se com precisão, utili-
zando a seringa, um volume de 0,2 a 0,5 ml do espaço de cabeça.
Injecta-se na coluna do aparelho de cromatografia em fase gasosa, regulado
do seguinte modo:
— temperatura do injector: 150º C,
— temperatura da coluna: 70-80º C,— temperatura do detector: 200-250º C.
Podem igualmente utilizar-se outras temperaturas, desde que os resultados
sejam equivalentes.
4.2. Soluções de referência
Preparam-se soluções-padrão utilizando azeite refinado, sem vestígios de
solventes, com concentrações variáveis entre 0,05 e 1 mg/kg e em relação
com o teor presumido da amostra.
4.3. Avaliação quantitativa
Estabelece-se a relação entre as áreas ou altura dos picos dos cromato-
gramas da amostra e da solução-padrão que tenha a concentração
presumida mais próxima. Caso o desvio relativo seja superior a 10 % é
necessário voltar a proceder à análise por comparação com uma nova
solução-padrão, até que a sua concentração respeite o desvio relativo acima
mencionado.
4.4. Expressão dos resultados
Os resultados são expressos em mg/kg (ppm).O limite de detecção do processo é de 0,01 mg/kg.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 57
▼B
ANEXOXII
EXAME ORGANOLÉPTICO DO AZEITE VIRGEM
1. OBJECTIVO
O presente método tem por objectivo estabelecer os critérios necessários
para exame das características do «flavour» do azeite virgem e desen-
volver a metodologia necessária.
2. CAMPO DE APLICAÇÃO
O método descrito só é aplicável ao exame e classificação organoléptica
do azeite virgem utilizável no consumo directo. Limita-se a classificar o
azeite virgem numa escala numérica relacionada com a percepção dos
estímulos do seu «flavour» segundo apreciação de um grupo de prova-
dores seleccionados que constituem um júri.
3. VOCABULÁRIO GERAL DA ANÁLISE SENSORIAL
(Norma COI/T-20/Doc. n.o4 — «Análise sensorial: vocabulário geral
básico»).
4. VOCABULÁRIO ESPECÍFICO PARA O AZEITE
4.1. Sensações agradáveis, suscitadas pelos atributos característicos de quali-
dade dos azeites virgens:
Aofruto: «flavour» característico que lembra simultaneamente o cheiro e
o gosto de azeitona sã e fresca, colhida em óptima fase de maturação;
Afrutomaduro: «flavour» característico do azeite obtido a partir de azei-
tonas maduras geralmente de cheiro extinto e sabor adocicado;
A fruto verde: «flavour» característico do azeite obtido a partir de azei-
tonas ainda verdes
4.2. Sensações mais ou menos agradáveis em função da intensidade com que
são sentidas, que não devem ser consideradas como defeitos mas que têm
uma influência sobre a harmonia do frutado:
Amaçã: «flavour» característico do azeite que lembra o da maçã;
Doce:sabor agradável do azeite sem ser propriamente açucarado, no qual
não predominam os atributos amargo, adstringente e picante;
A erva:«flavour» característico de certos azeites, que lembra o da erva
recentemente ceifada;
Afolhaverde(amargo): «flavour» característico do azeite obtido a partir
de azeitonas demasiado verdes ou que foram moídas juntamente com
folhas e troncos;
Amargo: gosto característico do azeite obtido a partir de azeitonas verdes
ou no estádio de início do amadurecimento (pintor). Pode ser mais ou
menos agradável em função da sua intensidade;
Áspero:sensação característica de certos azeites cuja degustação provoca
uma reacção bucotáctil de adstringência;
Picante: sensação gustativa de picadas, características dos azeites produ-
zidos no início da campanha principalmente a partir de azeitonas ainda
verdes. Deve-se à acção de substâncias fenólicas sobre os terminais do
nervo trigémeo que se estendem por toda a cavidade bucal;
Aamêndoa: este «flavour» pode surgir com duas formas diferentes: uma,
típica da amêndoa verde, a outra, característica da amêndoa seca e sã que
pode ser confundida com um princípio de ranço. Nota-se um gosto rema-
nescente distinto quando o azeite permanece em contacto com a língua e
o palato. Associado aos azeites doces e de cheiro extinto;
Apagado ou extinto: «flavour» do azeite cujas características organolép-
ticas são muito ténues, devido à perda dos seus constituintes aromáticos;
A feno:«flavour» característico de certos azeites que lembra o da erva
mais ou menos fenada.
4.3. Sensações sempre desagradáveis, mesmo que sejam dificilmente perceptí-
veis, que devem ser consideradas como defeitos organolépticos:1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 58
▼M3
▼M3
A esparto: «flavour» característico do azeite obtido a partir de azeitonas
prensadas em capachos novos de esparto. Pode ser diferente consoante se
tratem de capachos fabricados a partir de esparto verde ou esparto seco;
A terra: «flavour» característico do azeite obtido a partir de azeitonas
colhidas com terra ou lamacentas e não lavadas. Em certos casos, este
«flavour» pode ser acompanhado de mofo;
A velho: «flavour» característico do azeite que permaneceu demasiado
tempo nos recipientes de armazenagem. Pode também ocorrer em azeites
acondicionados durante um período demasiado longo;
Agafa:«flavour» característico do azeite obtido a partir de azeitonas que
foram fortemente atacadas por larvas da mosca da oliveira (Dacus oleae);
Metálico: «flavour» que lembra o dos metais. É característico do azeite
que permaneceu prolongadamente em contacto com elementos ou superfí-
cies metálicas, em condições impróprias durante os processos de moenda,
batedura, prensagem ou armazenagem;
Amofo/húmido: «flavour» característico do azeite obtido a partir de azei-
tonas atacadas por fungos e leveduras, devido a terem permanecido
amontoadas e com humidade durante vários dias;
A ranço: «flavour» característico e comum a todos os óleos e gorduras
sujeitos a um processo de auto-oxidação na sequência de um contacto
prolongado com o ar. Este «flavour» é desagradável e irreversível;
A tulha: «flavour» característico do azeite obtido a partir de azeitonas
amontoadas, num estado de fermentação avançado;
Asalmoura: «flavour» do azeite obtido a partir de azeitonas conservadas
em soluções salinas;
Abagaço: «flavour» característico que lembra o bagaço de azeitona;
Saponoso: «flavour» que dá lugar a uma sensação olfacto-gustativa que
lembra a do sabão;
A água-ruça: «flavour» «flavour» característico adquirido pelo azeite na
sequência de uma má decantação e de um contacto prolongado com a
água-ruça;
Avinhado-avinagrado: «flavour» característico de certos azeites que
lembra ou vinho ou o vinagre. É devido fundamentalmente à formação
do ácido acético, acetato de etilo e etanol em quantidades superiores às
normais no aroma do azeite;
Apepino: «flavour» do azeite que se produz na sequência de um acondi-
cionamento hermético excessivamente prolongado, nomeadamente em
latas. É atribuído à formação de 2-6 nonadienal;
Cozido ou queimado: «flavour» característico do azeite, devido a um
aquecimento excessivo ou prolongado durante a sua obtenção, principal-
mente durante a termobatedura da pasta, se esta for realizada em
condições inadequadas;
A borra: «flavour» característico do azeite decantado das lias dos depó-
sitos e reservatórios subterrâneos (infernos);
Acapacho: «flavour» característico do azeite obtido a partir de azeitonas
prensadas em capachos sujos de resíduos fermentados;
A lubrificantes: cheiro do azeite obtido num lagar cujo equipamento de
extracção não foi objecto de eliminação adequada dos resíduos de
petróleo, massa consistente ou óleo mineral;
Encorpado: percepção característica de certos azeites cuja degustação
provoca uma sensação bucotáctil densa e pastosa.
5. COPO PARA A PROVA DE AZEITES
(Veja-se a Norma COI/T-20/Doc. n.o5 «Copo para prova de óleos»).
6. SALA DE PROVA
(Veja-se a Norma COI/T-20/Doc. n.o6 «Guia para a instalação da sala de
prova»).1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 59
▼B
▼B
7. UTENSÍLIOS
Cada cabina deve dispor dos utensílios necessários ao alcance do
provador, de modo que este possa cumprir convenientemente a sua tarefa,
nomeadamente:
— copos (normalizados) que contenham as amostras marcadas em
código com algarismos tomados ao acaso ou com um par de alga-
rismos e letras. As marcações devem ser feitas com lápis indelével e
inodoro,
— vidros de relógio, com as mesmas marcações, para cobrir os copos,— folha de pontuação (cf. figura 2), que contenha as instruções de utili-
zação,
— lápis ou esferográfica,— tabuleiros com rodelas de maçã,— copo com água à temperatura ambiente.
8. TÉCNICA
Esta secção estabelece os conhecimentos prévios necessários à realização
do exame organoléptico dos azeites virgens e tem por objectivo norma-
lizar o comportamento e a actuação dos provadores intervenientes, aos
quais cabe tomar conhecimento tanto das recomendações de carácter
geral como das recomendações específicas da prova dos azeites.
8.1.Função do organizador ou responsável do júri (ou grupo de prova-
dores)
O organizador do júri deve dispor de uma formação sólida, sendo um
especialista e um conhecedor dos tipos de azeite que encontrará no seu
trabalho. Ele é a figura-chave do júri e o responsável pela sua organi-zação e funcionamento. Deve convocar os provadores com antecedência
suficiente e esclarecê-los relativamente a qualquer dúvida que possa
surgir quanto à realização das provas, abstendo-se de sugerir qualquer
tipo de parecer acerca da amostra.
Será responsável pelo inventário dos utensílios, pela sua limpeza perfeita,
pela preparação e codificação das amostras bem como pela sua apresen-
tação aos provadores, em conformidade com o protocolo de ensaio, e pela
recolha de dados e respectivo tratamento estatístico, a fim de obter os
melhores resultados com o menor esforço.
O trabalho do responsável do júri exige capacidade sensorial, meticulosi-
dade na preparação dos ensaios, ordem rigorosa na sua excecução bem
como capacidade e paciência para planificar e efectuar os ensaios. Oresponsável do júri tem, além disso, por missão estimular a moral dos
componentes do grupo, fomentando entre eles o interesse, a curiosidade
e o espírito competitivo. Deve evitar que a sua opinião seja conhecida e
impedir que os critérios dominantes dos possíveis líderes se imponham
aos restantes provadores. É igualmente da sua competência o treino,
selecção e controlo dos provadores, a fim de verificar se estes mantêm
um nível adequado de aptidão.
8.2.Condições do ensaio
8.2.1. Volume da amostra
Cada copo deve conter 15 ml de azeite.
8.2.2. Temperatura da prova
As amostras de azeite a provar devem ser mantidas em copos à tempera-
tura de 28º C + 2º C. Esta temperatura foi escolhida por ser aquela a que
se observam com mais facilidade as diferenças organolépticas, à tempera-
tura normal, quando o azeite é utilizado como condimento. Outro motivo
para esta escolha é o facto das temperaturas mais baixas ou mais altas
produzirem uma relativa volatilização dos componentes aromáticos ou,
pelo contrário, a produção de substâncias voláteis próprias dos azeites
aquecidos.
8.2.3. Horário das provas
Para a prova de ►
C1azeites ◄, as horas óptimas de trabalho são as da
manhã; está provado que existem durante o dia períodos de percepção
óptima para o paladar e o olfacto.
As refeições são precedidas de um período de maior sensibilidade
olfacto-gustativa, seguindo-se uma diminuição da mesma.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 60
▼B
No entanto, este critério não deve ser levado ao extremo, a ponto de que
a fome possa constituir um factor de distracção dos provadores e originar
uma redução da sua capacidade de discriminação e, especialmente, dos
seus critérios de preferência e de aceitação.
9. PROVADORES
As pessoas que intervêm na qualidade de provadores nos ensaios organo-
lépticos dos azeites para consumo devem ser treinadas e seleccionadas em
função da sua capacidade de fazer a distinção entre amostras seme-
lhantes; deve ter-se em conta que a precisão é melhorada com o treino
(veja-se a secção correspondente).
Para cada exame é necessário dispor de 8 a 12 provadores. No entanto, é
conveniente prever alguns provadores suplementares para cobrir eventuais
ausências.
9.1.Regras gerais de conduta a observar pelos candidatos e pelos prova-
dores
As presentes recomendações referem-se ao comportamento dos candi-
datos e provadores durante o seu trabalho.
O provador, após recepção da comunicação do responsável pelo júri
convidando-o a participar no exame organoléptico, deve estar em
condições de efectuá-lo nas horas indicadas e respeitar as seguintes
regras:
9.1.1. Abster-se-á de fumar pelo menos 30 minutos antes da hora marcada para
o exame.
9.1.2. Não utilizará qualquer perfume, cosmético ou sabão cujo cheiro possa
persistir no momento do ensaio. As mãos devem ser lavadas com um
sabão não perfumado ou pouco perfumado e depois enxaguadas e secas
tantas vezes quantas as necessárias para eliminar qualquer vestígio de
cheiro.
9.1.3. Nada comerá durante, pelo menos, uma hora antes da prova.9.1.4. No caso das suas condições fisiológicas estarem afectadas, nomeada-
mente o seu olfacto ou o seu paladar ou de se encontrar sobum efeito
psicológico qualquer que o impeça de se concentrar, deve prevenir o
responsável do júri de modo a que este o retire da prova ou tome as deci-
sões adequadas, tendo em conta a possibilidade de este provador se
afastar dos valores médios do resto dos membros do júri.
9.1.5. Uma vez cumpridas as regras anteriores, o provador deve instalar-se na
cabina que lhe é destinada, de modo tão ordenado e silencioso quanto
possível.
9.1.6. Uma vez sentado, deve verificar se o material de que necessita está em
ordem e é correcto bem como se a inscrição em código de cada copo
corresponde à do vidro de relógio que o tapa.
9.1.7. Deve ler atentamente as instruções constantes da folha de pontuação e
não começar o exame da amostra sem estar totalmente identificado e
familiarizado com o trabalho que deve realizar. Em caso de dúvida,
deve dirigir-se ao responsável do júri para discutir em privado as dificul-
dades encontradas.
9.1.8. O provador deve pegar no copo, mantendo-o tapado com o vidro de
relógio, incliná-lo ligeiramente e, nesta posição, dar-lhe uma volta
completa a fim de molhar o mais possível a sua superfície interna. Após
esta operação, deve retirar o vidro de relógio e cheirar a amostra com
inspirações suaves, lentas e intensas para poder formar um juízo sobre a
amostra sujeita à sua apreciação. A duração da olfacção não deve exceder
30 segundos. Se, neste período, o provador não tiver chegado a qualquer
conclusão, deve fazer uma pausa antes de proceder a uma nova tentativa.
Uma vez concluído o ensaio olfactivo, deve proceder à avaliação do
«flavour» (conjunto das sensações olfacto-gustativo-tácteis). Para tal,
deve tomar um pequeno gole de azeite, de cerca de 3 ml. É muito impor-
tante distribuir o azeite em toda a cavidade bucal, desde a partes laterais
e pela parte posterior até ao véu do palato; como se sabe, a percepção dos
quatro sabores fundamentais (doce, salgado, ácido e amargo) tem uma
intensidade variável consoante as diferentes zonas da língua e do palato.
Deve insistir-se sobre a necessidade de distribuir o azeite em quantidade
suficiente e muito lentamente pela parte posterior da língua até ao véu do
palato e garganta, concentrando a atenção sobre a ordem de aparecimento
dos estímulos amargo e picante; se não se proceder deste modo, com1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 61
▼B
alguns azeites estes dois estímulos podem passar despercebidos ou o
estímulo amargo ficar oculto pelo estímulo picante.
As aspirações breves e sucessivas, ao fazerem penetrar ar na boca,
permitem não só distribuir a amostra por toda a cavidade bucal mas
também apreender pela via retronasal os componentes voláteis aromá-
ticos.
A sensação táctil deve também ser tida em consideração. Assim, a
fluidez, o empastamento e o ardor ou queimadura devem ser anotados
logo que detectados e, se o ensaio o exigir, a sua intensidade será quanti-
ficada.
9.1.9. A apreciação organoléptica de um azeite virgem deve incidir numa única
amostra por sessão, a fim de evitar o efeito de contraste que poderia
provocar a prova imediata de outras amostras.
Dado que as provas sucessivas são afectadas pelo cansaço ou pela perda
de sensibilidade causada pelas precedentes, é necessário utilizar um
produto que elimine da boca os restos de azeite da prova anterior.
É recomendada a utilização de um pequeno pedaço de maçã de cerca de
15 g que, após mastigação, pode ser cuspido. Em seguida, deve lavar-se a
boca com um pouco de água à temperatura ambiente. Deixam-se passar
pelo menos 15 minutos antes de proceder à prova seguinte.
9.2.Pré-selecção dos candidatos
Cabe ao responsável do júri, mediante entrevistas pessoais, efectuar uma
pré-selecção cujo objectivo é o conhecimento da personalidade dos candi-
datos e das suas características. As exigências relativas às condições
fisiológicas e psicológicas que os candidatos devem preencher não são
muito rigorosas visto que, em princípio, qualquer pessoa normal é
susceptível de desenvolver esta actividade.
As condições em matéria de idade, sexo, certos hábitos (fumar), etc. são
consideradas secundárias relativamente a outros aspectos como a saúde, o
interesse pessoal e a disponibilidade de tempo para realizar este trabalho.
Por ocasião da entrevista, o responsável do júri deve explicar ao candi-
dato as características da função que irá assegurar e informá-lo acerca
do tempo aproximado que deverá dedicar-lhe. Em seguida, o responsável
do júri deve obter do candidato dados que lhe permitam avaliar o inte-
resse e motivação do candidato bem como a sua disponibilidade real de
tempo. O questionário a seguir indicado deverá servir de referência.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 62
▼B
(1)
Com base nestas informações, o organizador do júri procederá à pré-
-selecção. Serão eliminados os candidatos que mostrem pouco interesse
por este tipo de trabalho, com pouco tempo disponível ou incapazes de
expor as suas ideias.
9.3.Determinação do «limiar médio» do júri para os «atributos carac-
terísticos»
Escolhem-se cuidadosamente quatro azeites de modo que cada um deles
seja considerado representativo dos atributos: a tulha, avinhado, a ranço e
amargo, com uma intensidade tão marcada e clara quanto possível.
Colhe-se uma parte alíquota de cada um dos referidos azeites e preparam-
-se amostras com diferentes concentrações (proporção 1:2) por meio de
diluições sucessivas com um diluente adequado até que, nas duas ou três
últimas diluições, deixe de ser possível detectar a diferença relativamente
ao copo que contém apenas o diluente. Um último par será formado por
dois copos que contenham o diluente.
A série a começar pela concentração superior será formada por um total
de 8 copos.
Prepara-se uma quantidade suficiente de amostras com diferentes concen-
trações, a fim de se poderem entregar séries completas de cada atributo a
cada candidato.
A fim de poder estabelecer o «limiar médio» dos candidatos em relação a
cada atributo, é necessário apresentar-lhes um copo que contenha 15 ml
de qualquer das concentrações preparadas juntamente com outro copo que
contenha apenas 15 ml do diluente. Depois de realizado o exame, o
candidato deve indicar se o conteúdo dos copos é igual ou diferente. O
mesmo exame deve ser repetido no que respeita às concentrações
restantes do atributo estudado.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 63
(1) Diga qual o interesse que, na sua opinião, pode apresentar a prova organoléptica de
qualquer alimento ou, se preferir, do azeite.
▼B
Anota-se o número de respostas correctas ou repetidas do conjunto dos
candidatos para cada concentração e exprime-se em percentagem dos
ensaios efectuados.
Representam-se por ordem crescente, em abcissas, as concentrações
examinadas e, em ordenadas, a percentagem das identificações correctas
registadas para cada concentração.
A figura 1 representa um exemplo prático do que foi anteriormente
exposto. O limiar de detecção é definido sobre as abcissas, extrapolando
da curva o ponto da ordenada correspondente a 75 %, de respostas
correctas.
Esta concentração «limiar», que pode ser diferente para cada azeite de
partida visto que é função da intensidade do atributo presente, deve ser
semelhante para os diferentes grupos de candidatos dos diversos júris; a
mesma não está ligada a qualquer costume, hábito ou preferência tenden-
ciosa. Em consequência, trata-se de um ponto de referência comum a
qualquer grupo humano normal e pode servir para homogeneizar os dife-
rentes júris apenas em função da sua sensibilidade (palato-olfactiva).
A partir da concentração «limiar» do grupo assim obtida, procede-se do
seguinte modo:
Prepara-se uma série de concentrações crescentes e decrescentes, de
modo à «concentração limiar» se situar no ponto 10 dessa escala. Logica-
mente, as concentrações 11 e 12 serão mais diluídas e, em consequência,
será muito difícil detectar nas mesmas a presença do azeite com o atri-
buto escolhido.
A partir da concentração C10, as amostras restantes podem ser preparadas
por aplicação da seguinte fórmula:
C10 × an, onde «a» é uma constante, que corresponde ao factor de
diluição igual a 1,5, e «n» o expoente, que varia de 9 a −2.
Por exemplo: supondo que o limiar obtido para o azeite rançoso é igual a
0,32, C10 é igual a 0,32 e, como «a» é igual a 1,5, a série de amostras
terá as seguintes concentrações:
Amostra: 1 2 3 456789 1 0 1 1 1 2
Concentração: 12,30 8,20 5,47 3,65 2,43 1,62 1,08 0,72 0,48 0,32 0,21 0,14
Procedendo do mesmo modo para os três outros atributos, obter-se-ão, a
partir dos respectivos limiares calculados igualmente como atrás indicado,
escalas que terão intensidades aromáticas semelhantes para cada estímulo,
se bem que os azeites tenham à partida defeitos perceptíveis com intensi-
dades diferentes.
9.4.Selecção dos provadores pelo método de classificação de intensidade
A selecção deve realizar-se a partir de um número de candidatos duas ou
três vezes superior ao considerado necessário para a constituição da
equipa de provadores a fim de facilitar a escolha dos mais sensíveis ou
daqueles que mostrem uma maior capacidade discriminatória. É sempre
recomendado realizar ensaios com o mesmo produto que será depois
objecto de análise (por conseguinte, é necessário utilizar sempre azeite).1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 64
▼B
Figura 1
Na escolha do método, é conveniente ter presente, independentemente da
sua eficácia, que o processo a adoptar deve ser o mais económico
possível quanto à quantidade de azeite, ao número de amostras a utilizar
e ao tempo reservado à selecção. A eficácia de um processo de selecção
caracteriza-se pela escolha dos níveis óptimos das três variáveis depen-
dentes seguintes:
a) «Custo», determinado pelo número de ensaios;
b) «Proporção» de candidatos potencialmente aptos mas que podem ter
sido ocasionalmente eliminados na selecção;
c) «Proporção» de candidatos não aptos mas que, por um acaso
favorável, são aceites quando não o deviam ser.
O processo de selecção escolhido é o descrito em «The intensity rating
test» (ensaio de classificação de intensidade) das normas ASTM
(American Society for Testing and Materials) e STP (Special Technical
Publication) n.o440, página 53 e alterado em quatro pontos:
1. Redução do número de amostras da série.
2. Extensão dos atributos com o objectivo de aumentar o número de
notações palato-olfactivas em que se baseia a selecção, no intuito de
as adaptar aos defeitos mais comuns perceptíveis no azeite.
3. Variação da relação de concentração na série.
4. Tratamento estatístico dos resultados.
Material necessário
— Garrafas ou balões de 1 500 ml,
— Copos de prova, de vidro escuro,— Provetas de 10 ml, 15 ml, 1 000 ml e 1 500 ml.
Produtosnecessários
— Parafina Merck (referência 7.160, ►
C1DABB ◄, USP XX) ou
diluente oleoso inodoro e insípido (azeite ou similar, recentemente
refinado).
— Azeites: com «flavour» a tulha, avinhado, ranço e amargo.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 65
▼B
9.4.1. Técnica
Depois de preparadas as diluições, inicia-se a selecção partindo de 25
candidatos, de acordo com a metodologia a seguir explicada para cada
atributo:
1. Preparam-se séries de doze copos de prova, marcados em código (uma
série por candidato). Deitam-se em cada copo 15 ml de cada uma das
diferentes concentrações, preparadas segundo a fórmula C10 × anjá
referida.
2. Uma vez cheios e tapados com o vidro de relógio, os copos devem
permanecer na sala de prova a uma temperatura de 20-22 ºC durante
pelo menos uma hora antes de ser dado início aos ensaios, a fim de
equilibrar a sua temperatura com a temperatura ambiente.
3. O responsável do ensaio alinhará em seguida os doze copos de cada
série por ordem decrescente de concentração.
Em seguida, cada candidato é convidado a realizar o ensaio separada-
mente, de acordo com as seguintes instruções.
9.4.2. Instruções para o candidato
Os doze copos alinhados em frente do candidato contêm diluições de um
dos atributos: a tulha, avinhado, ranço e amargo, consoante o caso. Os
conteúdos dos copos distinguem-se uns dos outros pela intensidade do
cheiro, encontrando-se o de cheiro mais intenso na extrema esquerda, e
diminuindo grandualmente a intensidade do cheiro dos copos restantes
para a direita. O último copo da direita pode apresentar um cheiro tão
fraco que seja talvez impossível de detectar.
Procede-se do seguinte modo: familiarize-se com os cheiros libertados
pelos conteúdos dos copos da série. Para tal, comece pelo que se encontra
à direita (n.o12) e tente recordar a intensidade dos cheiros, sem no
entanto se cansar.
Quando considerar que está habituado à escala de concentração dos
cheiros libertados pelos copos da série, saia da sala.
Entretanto, o responsável do ensaio escolherá um copo da série e coloca-
-lo-á a seguir ao último da direita (n.o12), aproximando os restantes copos
para tapar o vazio deixado por aquele que escolheu. Volte, então, à sala
para continuar o ensaio.
A prova consiste no seguinte:
O copo que foi escolhido pelo responsável do ensaio deve voltar a ser
colocado no seu local exacto na série. Para tal, pode cheirá-lo e
compará-lo com os restantes copos tantas vezes quantas quiser, tendo
em conta que, ao pretender colocá-lo no local exacto da série, o cheiro
que do mesmo se liberta deve ser mais intenso do que o do copo colo-
cado imediatamente à direita e menos intenso do que o do copo
colocado imediatamente à esquerda. O ensaio deve ser repetido com três
outros copos.
A fim de facilitar o trabalho e a recolha das respostas, deve ser entregue a
cada candidato, além das intruções supra (ponto 9.4.2) o seguinte
formulário.
9.4.3. Obtenção dos resultados
Para facilitar a ordenação dos dados de cada um dos candidatos, o
responsável do júri deve anotá-los do seguinte modo:1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 66
▼B
9.4.4. Procedimento estatístico de pontuação
No caso concreto da selecção efectuada, os copos a repor no seu lugar
exacto devem ser os mesmos para todos os candidatos. Em conformidade
com os cálculos estatísticos realizados para o efeito, esses copos corres-
pondem, na ordem de série, aos locais a seguir indicados para cada um:
A tulha (At) Avinhado (Av) A ranço (Ra) Amargo (Am)
Copo n.oCopo n.oCopo n.oCopo n.o
(10, 5, 7, 2) (11, 3, 8, 6) (7, 4, 10, 2) (6, 3, 11, 9)
O número correspondente ao local ocupado pelos copos na ordem de
série não pode ser alterado, dado que os cálculos estatísticos para esse
ensaio foram realizados tendo em conta a probabilidade de os copos indi-
cados serem recolocados no seu local exacto ao acaso.
Não obstante, a fim de evitar a transmissão de informações de um candi-
dato a outro, o responsável do júri deve velar por que:
1. Os candidatos não possam comunicar entre si; os códigos sejam dife-
rentes para cada candidato.
2. Os candidatos não possam conhecer o lugar ocupado pelos copos que
foram retirados.
3. Seja variada a ordem de entrega dos copos a cada candidato, embora
sejam os mesmos para todos.
Cada candidato receberá em seguida uma pontuação em função dos resul-
tados que obteve. Para tal procede-se do seguinte modo:
Sejam ei
1,ei
2,…ei
12, os doze copos que contêm as doze concentrações
correspondentes a um atributo «i» (i = qualquer um dos quatro atributos:
a tulha, avinhado, a ranço e amargo), alinhados por ordem decrescente da
intensidade do atributo considerado.
Seja ekium dos copos escolhidos e K ′a posição assinalada pelo candidato
na série. Os valores de K e K ′são, portanto, números inteiros compreen-
didos entre 1 e 12, inclusive, que correspondem respectivamente à
posição real e à assinalada pelo candidato, para o copo seleccionado.
Seja T (desvio máximo admitido) um valor, previamente fixado, no nosso
caso igual a 3, de modo que se (K ′− K) > T, o candidato é automatica-
mente eliminado(1).
Em contrapartida, se (K ′−K )≤T, o candidato, em princípio, não é
eliminado e, por conseguinte, pode continuar o ensaio visto ser capaz de
colocar o atributo considerado no seu local exacto, ou pelo menos nos
locais imediatos mais próximos.
Neste caso a pontuação assinalada para um candidato quando este avaliar
um estímulo de um determinado atributo (concentração), por exemplo, da
série a tulha (At), é igual ao quadrado da diferença entre o número de
ordem que corresponde ao lugar exacto ocupado pelo copo na série e a
posição em que o candidato o voltou a colocar, ou seja:
Pr(At)=( K′−K )2
Dado que esta operação deve ser realizada por cada candidato para quatro
concentrações da série de cada atributo, a pontuação parcial para o refe-
rido atributo (por exemplo, At) seria a seguinte:
ZAt=PhAt+PjAt+PiAt+PmAt1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 67
(1) O responsável do júri deverá insistir junto do candidato para que o ensaio se realize de
forma razoável, ou seja, sem que se produza uma perca de sensibilidade por cansaço
olfactivo.
▼B
A fim de facilitar a compreensão, são apresentados os seguintes exem-
plos:
Exemplo n.o1: Suponhamos que as respostas do condidato A no que diz
respeito às quatro concentrações do atributo «i» retiradas da série são as
seguintes:
Posição exacta do
copo na série
(K)Posição em que o
copo foi colocado
pelo candidato
(K′)Afastamento da posição exacta
(K′−K )
7 7 7−7=0
4 5 4−5=−1
10 6 10 − 6 = 4 (1)
2 4 2−4=−2
(1) Este candidato foi eliminado, devido ao facto de o seu valor T > 3.
Exemplo n.o2: Suponhamos que um outro candidato reordena as quatro
concentrações do atributo considerado do seguinte modo:
Posição exacta do
copo na série
(K)Posição em que o
copo foi colocado
pelo candidato
(K′)Afastamento da posição exacta
(K′−K )
7 7 7−7=0
4 4 4−4=0
10 7 10 − 7 = 3
2 3 2−3=−1
Este candidato não é eliminado e a pontuação que lhe é atribuída em
relação a este atributo é de:
Zi=02+02+32+( −1 )2=1 0
A pontuação final do candidato para efeito da sua eventual selecção como
provador em função das respostas respeitantes aos quatro atributos consi-
derados é apresentada do seguinte modo:
PhAt+PjAt+PiAt+PmAt=ZAt
PhAv+PjAv+PiAv+PmAv=ZAv
PhRa+PjRa+PiRa+PmRa=ZRa
PhAm+PjAm+PiAm+PmAm=ZAm
Zifinal = ZAt+…+ZAm
em que:
At = A tulha,
Av = Avinhado,Ra = A ranço,Am = Amargo.
Trata-se agora de determinar até que valor máximo de Z é possível consi-
derar que o candidato possui bons níveis de percepção, de memória
olfactiva e da organização mental para dar a resposta adequada em
relação aos quatro atributos considerados. Naturalmente, Z é sempre um
valor positivo e Z = 0 significa que o candidato reconheceu e quantificou
correctamente o conjunto das dezasseis intensidades que lhe foram apre-
sentadas (quatro para cada atributo). Valores de Z diferentes de zero
indicam que o candidato reconheceu as zonas das escalas onde se situam
as intensidades escolhidas, mas que dentro delas não foi capaz de colocar
os atributos no seu lugar exacto devido ao facto de não possuir uma boa
capacidade de discriminação ligada a escala de intensidade que lhe foi
apresentada em relação a um ou vários dos atributos considerados.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 68
▼B
Desde modo, será necessário determinar um valor crítico Z tal que, em
caso do candidato colocar todos os copos ao acaso no interior das zonas
que reconheceu, a probabilidade de uma notação definitiva Z, inferior a
Zi, seja uma quantidade suficientemente pequena (x) que possa ser fixada
previamente.
Por outras palavras, é necessário assegurar que a probabilidade, com este
procedimento, de seleccionar um provador para o júri que não reúna as
condições de discriminação suficientes para as intensidades dos estímulos
utilizados com vista à selecção seja inferior a x.
Uma vez fixado o valor de x (no nosso caso, 0,05), a obtenção de Zidepende da distribuição da probabilidade da variável Z, dependendo esta
por sua vez das distribuições de probabilidade das variáveis p(K ′).
Realizados os cálculos estatísticos correspondentes, o valor obtido para Zié igual a 34.Uma vez obtida a pontuação Z para todos os candidatos, aqueles cuja
pontuação for superior a 34 devem ser eliminados.
Vejam-se, a título de exemplo, as pontuações dos candidatos A e B:
Atributos Candidato A Candidato B
A tulha ZAt=1 0 ZAt=1 2
Avinhado ZAv=1 0 ZAv=1 1
A ranço ZRa=1 0 ZRa=1 5
Amargo ZAm=4 ZAm=0
Σ=3 4 Σ=3 8
Os valores de Z para ambos os candidatos são de A = 34 e B = 38,
portanto será escolhido o candidato A e eliminado o candidato B. Depois
de excluir todos os candidatos que tenham obtido uma pontuação superior
a 34, os restantes são classificados em função dos valores Z até completar
a equipa de doze candidatos que desejamos reunir.
9.5.Treino
O treino tem como principais objectivos:
a) Familiarizar os provadores com as múltiplas variantes palato-olfac-
tivas e tácteis que oferecem os azeites virgens;
b) Familiarizar os provadores com a metodologia sensorial específica;
c) Aumentar a capacidade individual para reconhecer, identificar e quan-
tificar os atributos sensoriais;
d) Melhorar a sensibilidade e a memória relativamente aos diferentes
atributos considerados, a fim de conseguir juízos consistentes.
O período de treino consiste numa série de sessões, segundo as possibili-
dades da equipa e do estudo, durante as quais, após análise individual dos
azeites, os provadores discutem em conjunto com o responsável do júri as
dificuldades encontradas e comentam as qualificações a fim de unificar
os critérios e as opiniões.
O nível de treino conseguido após diversas sessões é avaliado observando
o aumento da percentagem de respostas correctas, no caso de utilização
de provas discriminatórias, ou analisando as variações das qualificações
individuais médias do grupo, quando se trata de provas escalares.
A utilidade prática deste período de treino tem sido amplamente discutida
mas actualmente é considerada muito eficaz e mesmo indispensável
quando se pretenda dispor de dados sensoriais exactos e precisos.
9.6.Verificação
As equipas de provadores muito treinados realizam habitualmente provas
regulares e contínuas com exames sensoriais que exigem um grande
esforço. O seu parecer, em muitas ocasiões, serve de base a decisões de
grande importância tecnológica e comercial pelo que, depois de terem
sido seleccionados e bem treinados, os provadores devem ser sujeitos a
verificações que garantam a fiabilidade dos resultados.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 69
▼B
É evidente que seria necessário, uma vez constituídos os júris e subme-
tidos a ensaios de rotina, verificar regularmente a sua competência com
intervalos adequados.
10. PROCESSO A SEGUIR PARA O EXAME ORGANOLÉPTICO DO
AZEITE VIRGEM
Reunidas as condições e os meios necessários indicados nas normas ante-
riormente citadas e seleccionado o grupo de provadores, cada um deles
deve cheirar e depois provar(1) o azeite sujeito a exame, contido num
copo de prova, a fim de analisar as percepções do olfacto, do paladar,
tácteis e quinestésicas por meio da folha da figura 2, onde será anotada
a respectiva presença e o valor da sua intensidade. Em seguida, deve
passar à fase da pontuação da qualidade doi azeite.
10.1.Utilização da folha da figura 2 (descrição do «flavour» e pontuação
da qualidade)
Na parte esquerda da folha estão indicadas algumas das percepções
sensoriais mais características que se encontram com maior frequência
nos azeites e que descrevem o seu «flavour». No caso de serem obser-
vados outros atributos que não correspondam às qualificações
enumeradas, o provador deve anotá-los na rubrica «outros» utilizando a
ou as qualificações que os descrevam com maior precisão.
Os atributos perceptíveis devem ser avaliados proporcionalmente à sua
intensidade pela indicação de um sinal (+) na casa correspondente, em
conformidade com o seguinte critério:
1 = quase imperceptível
2 = ligeiro
3 = médio
4 = grande
5 = extremo
Na parte direita da folha é estabelecida uma escala de um a nove pontos
(9 para a qualidade excepcional e 1 para a pior qualidade) que será utili-
zada pelo provador para dar uma pontuação única, de conjunto, das
características do azeite. Esta pontuação deve estar de acordo com as
virtudes e os defeitos do azeite, já anotados na parte esquerda da folha.
A primeira coluna («defeitos») da tabela de pontuação inclui cinco
rubricas, por conseguinte, a classificação dos azeites deve basear-se
fundamentalmente na ausência total ou na presença de «flavours» defei-
tuosos, bem como na maior ou menor gravidade ou intensidade dos
defeitos.
No entanto, como a escala de avaliação é de 9 pontos, é necessário ter em
conta pequenas variações ou certos aspectos, descritos na segunda coluna
«características», que contribuem de forma definitiva para decidir acerca
da pontuação total de qualidade.
10.2.Pontuação final
O responsável do júri deve recolher as pontuações atribuídas por cada um
dos provadores e, em seguida, verificar que os atributos e intensidades
com que foram apreendidos e anotados na «folha do perfil» são concor-
dantes, de modo aceitável, com a avaliação atribuída ao azeite na «tabela
de pontuação». No caso de registar uma diferença sensível, o responsável
do júri pedirá ao provador que reveja a sua folha de pontuação.
Se necessário o provador repetirá o ensaio.Finalmente, o responsável do júri deve recolher as pontuações de todo o
grupo e calculará a média aritmética e o erro típico (da média).
Se o erro típico for superior ao erro do método será repetido o ensaio por
todo o grupo.
O grupo repetirá as provas até obter três avaliações da amostra, unica-
mente em caso de análises de revisão. A pontuação final da amostra
será a média das três pontuações obtidas, com um decimal.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 70
(1) Poderá abster-se quando, ao cheirar, observe algum atributo extrema e intensamente
desagradável, anotando esse facto excepcional na folha de pontuação.
▼B
Se a nota da intensidade média do amargo, do picante ou de ambas for
superior a 2,5, dar-se-á ao azeite a pontuação correspondente e anotar-
-se-á que o mesmo é amargo ou picante ou amargo e picante.
Expressão dos resultados: o responsável do júri, com base na pontuação
média, determina a categoria em que a amostra é classificada, de acordo
com os limites previstos no anexo I. Para o efeito, o responsável do júri
aplica:
— durante a campanha de 1992/1993, uma tolerância de + 1,5,
— a partir da campanha de 1993/1994, uma tolerância de + 1,
se a pontuação média for igual ou superior a 5 pontos.
Todavia, para os azeites que sejam objecto de operações ligadas à inter-
venção, não é aplicada qualquer tolerância.
A diferença estatística, relativa aos valores de repetibilidade e reproduti-
bilidade do método, entre o resultado da análise e o limite regulamentar
está compreendida na tolerância referida nos parágrafos anteriores.
Caso, durante as campanhas atrás citadas, o interessado proceda à classi-
ficação do azeite sem aplicar a tolerância prevista, pode indicar na
embalagem de consumo imediato a notação organoléptica mínima do
produto, verificável durante o período de comercialização.
O responsável do júri apenas indicará no relatório de análise a categoria
em que a amostra é classificada. No caso de exame efectuado pelo
analista em conformidade com o n.o2, primeiro parágrafo, do artigo 2o,
esse analista aplicará o mesmo processo de determinação da categoria.
Nota:As amostras devem ser conservadas em recipientes fechados e no
frigorífico até ao momento da sua análise, devendo ser de novo
colocadas no frigorífico até que estejam concluídas as três
avaliações.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 71
▼M12
▼M9
▼M5
▼B
▼M3
Figura 2
Azeite virgem
EXAME ORGANOLÉPTICO: VOCABULÁRIODE BASE
1. OBJECTIVO
A presente norma tem por objectivo agrupar e definir os termos gerais
utilizados no exame organoléptico.
2. VOCABULÁRIO2.1.Terminologia geral
Exameorganolépticoouanálise sensorial (subst.)
Apreciação fisiológica das propriedades de um produto pelos órgãos dos
sentidos.
Percepção (subst.)1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 72
▼B
▼B
Tomada de consiência sensorial de objectos ou acontecimentos exteriores.
Organoléptico (adj.) (carácter ou propriedade)
Qualifica todo o carácter ou propriedade de um produto perceptível pelos
órgãos dos sentidos.
Perito(subst.) (No que diz respeito ao exame das características organo-
lépticas)
Provador especializado no exame organoléptico de um determinado
produto e que possui conhecimentos básicos em matéria de elaboração
do referido produto e das preferências do mercado.
Provador (subst.)
Pessoa perspicaz, sensível, seleccionada e treinada que avalia com os
órgãos dos sentidos as características organolépticas de um género
alimentício.
Júri(subst.)
Grupo de provadores resultantes de uma selecção, com treino especial e
que se reúne para efectuar, em condições controladas, o exame organo-
léptico do produto.
Sensação (subst.)
Fenómeno subjectivo resultante do estímulo de um sistema sensorial.
Esse fenómeno é subjectivamente discriminável e objectivamente
definível mediante o órgão sensorial considerado, em função da natureza
ou qualidade do estímulo, bem como da sua intensidade.
Sensibilidade (subst.)
Capacidade dos órgãos sensoriais que lhes permite perceber qualitativa e
quantitativamente um estímulo de fraca intensidade ou ligeiras diferenças
entre estímulos.
Prova(subst.)
Operação que consiste em perceber, analisar e julgar as características
organolépticas e, mais especialmente, as palato-olfactivas, tácteis e cines-
tésicas de um produto alimentar.
Aceitação (subst.)
Acto que consiste, para um indivíduo ou uma população, em admitir
favoravelmente um produto.
Harmonia (subst.)
Qualidade de um produto que provoca uma agradável sensação de
conjunto. Essa sensação é devida à percepção dos constituintes do
produto enquanto estímulos olfactivos, palatais-tácteis e cinestésicos, por
se encontrarem em relações de concentração adequadas.
Aceitabilidade (subst.)
Estado de um produto recebido favoravelmente por um indivíduo ou uma
população, em função das suas propriedades organolépticas.
Discriminação (subst.)
Diferenciação qualitativa ou quantitativa, ou ambas, entre dois ou mais
estímulos.
Compensação (subst.)
Resultado da interacção devida a um conjunto de estímulos de modo que
cada qual é percebido com menos intensidade do que se actuasse só.
Aspecto(subst.)
Conjunto de características organolépticas percebidas pelo órgão da
visão: dimensão, forma, cor, concentração, turvação, limpidez, fluidez,
espuma e efervescência. Este termo é preferível ao da «aparência».
Atributo(subst.)
Propriedade característica perceptível.
2.2.Terminologia relativa à fisiologia
Estímulo (subst.)1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 73
▼B
Agente físico ou químico que produz especificamente a resposta dos
receptores sensoriais externos ou internos.
Paladar(subst.)
Sentido cujos receptores estão localizados na boca, nomeadamente na
língua, e são activados por diferentes compostos em solução.
Palatal(adj.)
Qualifica a propriedade de um produto capaz de estimular o aparelho do
paladar, despertando as sensações correspondentes a um ou a vários dos
quatro sabores elementares: doce, salgado, ácido e amargo.
Receptor (subst.)
Estrutura especializada de um órgão sensorial exitável, capaz de receber
um estímulo e de convertê-lo em influxo nervoso.
Nota:os receptores são classificados segundo o tipo de energia associada
ao estímulo (luz, calor, som, etc.).
Olfacto(subst.)
Função do órgão olfactivo tendente à percepção e discriminação das
moléculas que a ele chegam, em fase gasosa, do exterior, por via nasal
directa ou indirecta.
Intensidade (subst.)
Grau de energia de uma qualidade mensurável por uma escala quantita-
tiva de valores superiores ao limiar.
Adaptação (subst.)
Modificação temporária da sensibilidade de percepção de estímulos
sensoriais devida a uma exposição contínua e repetida ao mesmo estímulo
ou a um estímulo semelhante.
Inibição(subst.)
Falta de resposta de um órgão sensorial ou de uma parte desse orgão,
apesar de submetido à acção de um estímulo adequado com uma intensi-
dade superior ao limiar.
Resposta (subst.)
Acção pela qual as células sensoriais respondem a um ou vários estímulos
relativos a uma modalidade sensorial definida.
Corpo(subst.)
Sensação táctil percebida na boca e que confere um grau de densidade,
viscosidade, consistência ou compacidade a um alimento.
Fragrância (subst.)
Cheiro fresco, suave e delicioso.
Sentir(verbo)
(Sentido activo aplicado ao olfacto)Designa a acção de percepção de um cheiro.Objectivo (adj.)
a) Qualifica aquilo que proporciona a representação real e verificável do
objecto, reduzindo ao mínimo os factores humanos (como por
exemplo: a preferência, o hábito, a afectividade);
b) Qualifica a técnica que, utilizando métodos sensoriais ou instrumen-
tais, permite reduzir ao mínimo os erros pessoais.
Nota:Não é recomendada a utilização do termo «instrumental» como
sinónimo de objectivo.
Subjectivo (adj.)
Qualifica aquilo que proporciona uma percepção condicionada pelo modo
de pensar e sentir pessoais e não apenas pelo estímulo.
Cinestesia (subst.)
Conjunto de sensações resultantes de uma pressão aplicada à amostra por
um movimento na cavidade bucal ou com os dedos (por exemplo, pressão
dos dedos no caso de um queijo).1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 74
▼B
Limiar(subst.)
LimiarabsolutoQuantidade mínima de um estímulo sensorial necessária:
a) Ao aparecimento de uma sensação (limiar de aparecimento ou de
detecção); ou
b) Ao reconhecimento da mesma sensação (limiar de identificação).
Limiardiferencial
Quantidade mínima de estímulo sensorial que origina uma diferença
perceptível da intensidade da sensação.
LimiarfinalQuantidade mínima de um estímulo acima da qual não é perceptível um
aumento da intensidade da sensação.
Limiarpreferencial
Valor quantitativo mínimo de um estímulo ou valor crítico supraliminar
desse estímulo correspondente ao aparecimento de uma resposta de
atracção ou de rejeição relativamente a um estímulo neutro, por exemplo
os estímulos entre uma solução açucarada e a água.
Nota:Deve distinguir-se entre «limiar absoluto de preferência» e «limiar
diferencial de preferência».
Subliminar (adj.)
Qualifica um estímulo que se situa abaixo do limiar considerado.Supraliminar (adj.)
Qualifica um estímulo que se situa acima do limiar considerado.
Fadigasensorial
Forma de adaptação sensorial correspondendo a uma diminuição da acui-
dade.
Sinérgico (subst.)
Efeito ou acção conjugada de substâncias determinadas, de modo que a
intensidade das características organolépticas resultantes do conjunto é
superior à de cada substância, se tivesse actuado isoladamente.
Efeito decontraste
Aumento da resposta às diferenças entre dois estímulos simultâneos ou
consecutivos.
Oposto ao «efeito de convergência».
Efeito deconvergênciaDiminuição da resposta às diferenças entre dois estímulos simultâneos ou
consecutivos.
Oposto ao «efeito de contraste».
2.3.Terminologia relativa às características organolépticas
Ácido(adj.):
a) Qualifica o sabor elementar provocado por soluções aquosas diluídas
da maioria dos ácidos (por exemplo, ácidos cítrico, láctico e tartárico);
b) Qualifica a propriedade das substâncias puras ou misturas cuja prova
provoca esse sabor.
O substantivo correspondente é «acidez».Acre(adj.)
Qualifica a sensação palato-olfactivo com predomínio de ácidos, geral-
mente de origem fermentativa, bem como os alimentos que produzem
essa sensação.
Alguns factores que contribuem para essa sensação estão relacionados
com o processo de fermentação dum alimento por exemplo acética ou
láctica.
Amargo(adj.):1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 75
▼B
a) Qualifica o sabor elementar provocado por soluções aquosas diluídas
de diversas substâncias como o quinino, a cafeína e determinados
heterósidos;
b) Qualifica a propriedade das substâncias puras ou suas misturas que, ao
serem provadas provocam esse sabor.
O substantivo correspondente é «amargor».Salgado(adj.)
a) Sensação característica perceptível mediante o sentido do paladar cujo
exemplo mais típico é a provocada por uma solução de cloreto de
sódio;
b) Qualifica a propriedade das substâncias puras ou misturas que na
prova revelam o referido sabor.
O substantivo correspondente é «salinidade».
Doce(adj.)
a) Qualifica o sabor elementar provocado pelas soluções aquosas de
diversas substâncias como a sacarose;
b) Qualifica a propriedade das substâncias puras ou misturas cuja prova
provoca esse sabor.
O substantivo correspondente é «doçura».Adstringente (adj.)
a) Qualifica a sensação complexa produzida na boca por uma solução
aquosa diluída de produtos como alguns taninos (por exemplo, os
sabores do dióspiro e do abrunho bravo);
b) Qualifica a propriedade das substâncias puras ou misturas que
produzem essa sensação.
O substantivo correspondente é «adstrirgência».
«Flavour» (subst.)
Conjunto das percepções dos estímulos palato-olfactivos, tácteis e quines-
tésicos que permitem identificar um alimento na boca e estabelecer um
critério, a diferentes níveis, favorável ou desfavorável ao mesmo.
Sabor(subst.)
a) Sensações percebidas pelo paladar quando este é estimulado por deter-
minadas substâncias solúveis;
b) Qualidade da sensação especial produzida por essas substâncias.
Saborelementar (subst.)
Cada um dos quatro sabores reconhecidos: doce, salgado, ácido e amargo.
Cheiro(subst.)
a) Conjunto das sensações percebidas pelo olfacto ao inspirar determi-
nadas substâncias voláteis;
b) Qualidade da sensação especial produzida por cada qual dessas
substâncias.
Aroma(subst.)
Sensações agradáveis percebidas pelo olfacto por via indirecta quando é
provado um alimento.
Nota:Em perfumaria e na linguagem corrente este termo é igualmente
aplicado às mesmas sensações percebidas por via nasal directa.
Gostoresidual (subst.)
Conjunto das sensações percebidas após desaparecer da boca o estímulo e
que diferem das anteriormente percebidas.
Aromático (adj.):
a) Qualifica a propriedade das substâncias puras ou misturas cuja prova
produz as sensações identificadas como «aroma»;
b) Qualifica os produtos que examinados por via nasal directa produzem
as sensações de fragrância e de frescura.
Textura(subst.)1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 76
▼B
Conjunto das características do estado sólido ou reológico de um
alimento capaz de estimular os receptores mecânicos durante a prova,
nomeadamente os situados na boca.
Nota:Este termo aplica-se unicamente às propriedades objectivas e não
às sensações produzidas as quais são designadas por termos gerais
como consistência, fibrosidade, untuosidade, etc.
Saborear (verbo)
Acção pela qual um alimento presente na boca entra em contacto com
todas as suas zonas sensíveis a fim de perceber as sensações bucais que
o mesmo provoca.
Nota:Este vocabulário pode ser enriquecido consultando as Normas
ISO5492, partes I, II, III, IV e V, e outras publicações, como a
elaborada por j. L. Magnen «Les cahiers techniques du centre nati-
onal de coordination des études et recherches sur la nutrition et
l'alimentation», etc.
COPO PARA PROVA DE AZEITES
1. OBJECTIVO
A presente norma tem por objectivo descrever as características do copo
destinado ao exame organoléptico dos ►C1azeites ◄comestíveis
(cheiro, sabor, «flavour»).
Descreve, além disso, o dispositivo de aquecimento necessário à obtenção
e manutenção da temperatura adequada para este exame.
2. DESCRIÇÃO DO COPO
O esquema da figura 1 pretende indicar as melhores características
desejáveis de um utensílio desta natureza cujos aspectos fundamentais
são a seguir especificados:
a) Estabilidade máxima, evitando a sua inclinação e o derramamento do
►C1azeite◄nele contido;
b) Forma facilmente adaptável às cavidades de um bloco que permita
aquecimento uniforme da base do copo;
c) Estreitamento do bocal para fornecer a concentração dos cheiros e
facilitar a sua identificação;
d) Vidro escuro, de modo que o provador não possa apreciar a cor do
►C1azeite◄, impedindo qualquer juízo antecipado e possibilidade
de observações de viés ou tendências que possam prejudicar a objecti-
vidade da determinação.
2.1.Dimensões
O esquema do copo é representado na figura 1, com as seguintes capaci-
dades:
— Capacidade total …............................ 130 ml ± 10 ml,
— Altura total … .................................. 60mm±1mm,
— Diâmetro do bocal ….......................... 50 mm ± 1 mm,— Diâmetro da parte mais larga …................ 70 mm ± 1 mm,— Diâmetro da base … ............................ 35mm±1mm,
— Espessura do vidro da parede …................ 1,5 mm ± 0,2 mm,— Espressura do vidro do fundo … ................ 5mm±1mm.
Cada copo deve ser acompanhado de um vidro de relógio cujo diâmetro
seja cerca de 10 mm superior ao do bocal. Este vidro servirá para tapar o
copo a fim de evitar a perda de aroma e a entrada de pó.
2.2.Características de fabrico
O copo deve ser de vidro resistente de cor escura, para impedir a apre-
ciação da cor do conteúdo, e isento de riscas e bolhas.
O bordo deve ser regular, liso e com rebordo.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 77
▼C1
▼B
▼B
O vidro deve ser recozido, para resistar às variações de temperatura que o
copo irá sofrer durante os ensaios.
2.3.Regras de emprego
A limpeza dos copos deve ser feita com sabão ou detergente não perfu-
mado, enxaguando-se depois diversas vezes até à eliminação total do
produto utilizado. Por último, os copos devem ser enxaguados com água
destilada e, depois de escorridos, secos numa estufa de secagem.
Não devem ser utilizados ácidos concentrados nem misturas cromosulfú-
ricas.
Os copos devem manter-se na estufa até à utilização ou guardarem-se
num armário que os proteja contra qualquer contaminação e de cheiros
estranhos.
Antes de cada utilização, é necessário verificar por olfacção que os copos
estão isentos de cheiros estranhos. Ao preparar o exame, deve ter-se o
cuidado de anotar o código de cada copo e o óleo correspondente. Esta
correspondência do código e do óleo só será conhecida pelo responsável
pelo ensaio.
3. DISPOSITIVO DE AQUECIMENTO DAS AMOSTRAS
O exame organoléptico das amostras deve ser feito a uma temperatura
determinada que se situa, para os óleos comestíveis, em 28 ± 2º C. Para
tanto, é necessário instalar no interior de cada cabina, ao alcance do
provador, um dispositivo de aquecimento (ver figura 2). Este dispositivo
consiste num bloco de alumínio imerso num banho de água regulado,
com termóstato, para obter uma temperatura uniforme. Este bloco inclui
uma série de cavidades onde se adaptam os fundos dos copos. A dife-
rença de temperatura entre o dispositivo de aquecimento e o óleo
contido nos copos dispostos nas cavidades dos diferentes blocos não
deve ser superior a + 2º C.
Figura 1 — Copo de prova
Dimensões (en mm)1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 78
▼B
Figura 2 — Dispositivo de aquecimento das amostras
(Dimensõesemmilimetros)
GUIA PARA A INSTALAÇÃODE UMA SALA DE PROVA
1. INTRODUÇÃO
A sala de prova destina-se a proporcionar ao grupo de provadores que
intervêm nos exames organolépticos um meio adequado, confortável e
normalizado que facilite o seu trabalho e contribua para melhorar a repe-
tibilidade e reprodutibilidade dos resultados.
2. OBJECTIVO
A presente norma tem por objectivo especificar as condições essenciais
que devem ser tidas em conta na instalação de uma sala de prova.
3. ESPECIFICAÇÕES GERAIS PARA A INSTALAÇÃO
Qualquer sala, independentemente da sua superfície (ver ponto 3.1), deve
corresponder às seguintes especificações:1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 79
▼B
A sala deve ser agradável e convenientemente iluminada (ver ponto 3.2),
mantendo um aspecto neutro. Para tal, recomenda-se a utilização de uma
tinta suave, lisa e clara para as paredes, de modo a criar um ambiente
relaxante(1).
A sala deve ser de fácil limpeza. Além disso, deve estar afastada de qual-
quer fonte de ruído pelo que será, de preferência, insonorizada. Estará
igualmente ao abrigo de cheiros estranhos, razão pela qual deve ser
dotada de um dispositivo eficaz de ventilação. No caso de se registarem
flutuações sensíveis da temperatura ambiente, a sala de prova deve dispor
de uma instalação de ar condicionado a fim de manter uma temperatura
de cerca de 20 a 22 ºC.
3.1.Dimensões
As dimensões da sala dependem frequentemente das possibilidades dos
laboratórios ou empresas. Em geral, deve ser suficientemente espaçosa
para permitir a instalação de cerca de dez cabinas, bem como de uma
zona para a preparação das amostras.
No entanto, quanto maior for o espaço reservado às instalações, melhor,
uma vez que poderão prever-se dependências anexas para, por exemplo,
limpar o material, arrumar as preparações culinárias e fazer reuniões de
«júris abertos».
3.2.Iluminação
A iluminação geral, que deve ser assegurada pela luz solar ou por
lâmpadas (por exemplo, tubos do tipo «luz do dia», deve ser uniforme,
regulável e com luz difusa.
3.3.Temperatura e estado higrométrico
O local deve ser mantido constantemente em condições térmicas e higro-
métricas agradáveis. Salvo em circunstâncias especiais, recomendam-se
manutenção de uma temperatura de 20—22 ºC e um estado higrométrico
de 60 a 70 % de humidade relativa.
4. DESCRIÇÕES DAS CABINAS
As cabinas para exame organoléptico devem ser instaladas lado a lado na
sala.
Devem ser idênticas e separadas entre si por divisórias suficientemente
altas e largas para isolar os provadores sentados.
As cabinas podem ser feitas de qualquer material adequado e de fácil
limpeza e conservação (por exemplo madeira, contraplacado, vitrificado,
painéis laminados, etc.). No caso de utilização de tintas, estas devem ser
totalmente inodoras após secagem.
Os assentos previstos em cada cabina devem ser confortáveis e de altura
regulável.
Cada cabina deve dispor igualmente de iluminação individual regulável,
tanto no que diz respeito à direcção como à intensidade.
É recomendável que as cabinas sejam dotadas de um botão ligado a um
dispositivo luminoso exterior que permita ao provador comunicar à
pessoa que dele se ocupa no exterior, sem distrair os restantes, que
terminou o ensaio, que deseja que lhe sejam entregues novas amostras,
que lhe falta determinado utensílio, que observou alguma irregularidade
ou ainda que deseja informações.
4.1.Dimensões
As cabinas devem ser suficientemente amplas e confortáveis. Em geral
terão as seguintes dimensões:
— largura:
0,75 m (sem lavatório),0,85 m (com lavatório),
— comprimento:
0,50 m (mesa),0,20 m (para a divisória),1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 80
(1) A cor da sala e a sua iluminação podem afectar os resultados dos exames organolép-
ticos.
▼B
— altura das divisões:
0,60 m no mínimo (a partir da mesa),
— altura da mesa:
0,75 m.
4.2.Disposição
A superfície da mesa deve ser de fácil limpeza.Uma parte dessa superfície deve ser reservada à montagem de um lava-
tório dotado de água corrente potável. Se tal não for possível, esse espaço
deve ser reservado à colocação de um recipiente (cuspideira) ou seme-
lhante.
Quando, durante a realização do ensaio, as amostras devam ser mantidas
a uma temperatura constante superior ou inferior à temperatura ambiente,
é conveniente dispor de um equipamento adequado a esse fim (banho-
-maria, placas de aquecimento, etc.).
Pode igualmente instalar-se uma prateleira, a cerca de 1,10 m do solo,
para arrumar diversos acessórios (copos, material miúdo, etc.).
No caso de a disposição das cabinas na sala de prova o permitir, é conve-
niente instalar um dispositivo que facilite a apresentação das amostras.
Este dispositivo pode ser uma portinhola de correr (figura 1) ou um
dispositivo giratório (figura 2) o que é especialmente indicado para os
copos ou taças de forma alta ou em forma de «passa-pratos» quando os
recipientes que contêm as amostras não são muito altos (figura 3).
A cabina deve, pelo menos, ter uma abertura suficiente que permita a
passagem dos tabuleiros de serviço e dos copos que contêm as amostras
a examinar.
5. INSTALAÇÕES COMPLEMENTARES
Se o espaço disponível o permitir, é conveniente prever salas separadas
para preparar as amostras (com fins culinários ou outros), arrumar os
copos ou utensílios bem como para realizar discussões prévias ou poste-
riores aos exames. Caso existam, estas salas devem estar sempre limpas e
não devem prejudicar, pelos seus cheiros, ruídos ou conversas das pessoas
nelas reunidas, o trabalho do júri na sala de prova.
5.1. A figura 4 apresenta um examplo esquemático de uma sala de prova e
das instalações complementares.
Nota:As condições anteriormente descritas são as ideais. Não obstante,
no caso de ser impossível dispor de uma sala reservada apenas
aos exames organolépticos, as provas poderão ser realizadas numa
sala que tenha as condições mínimas descritas (luz, temperatura,
ruídos e cheiros) instalando na mesa cabinas móveis a partir de
elementos desmontáveis, de modo a assegurar, no mínimo, a sepa-
ração pretendida entre cada provador.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 81
▼B
DISPOSIÇÃO DA CABINA
Figura 1
1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 82
▼B
DISPOSITIVO GIRATÓRIO DE APRESENTAÇÃO DAS AMOSTRAS
Figura 2
1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 83
▼B
«PASSA-PRATOS» PARA APRESENTAÇÃO DAS AMOSTRAS
Figura 3
1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 84
▼B
LABORATÓRIO DE ANÁLISE ORGANOLÉPTICA
Figura 4 — Exemplo de sala de prova
1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 85
▼B
ANEXOXIII
NEUTRALIZAÇÃO E DESCOLORAÇÃO DO AZEITE EM LABORA-
TÓRIO
1. NEUTRALIZAÇÃO E DESCOLORAÇÃO DO AZEITE EM LABORA-
TÓRIO
1.1. Neutralização do óleo
1.1.1. Aparelhos e utensílios
— copo de 300 ml de forma alta,
— centrifugadora de laboratório com tubos de 100 ml,
— copo de 250 ml,
— balões de 100 ml,— ampolas de decantação de um litro.
1.1.2. Reagentes
— solução aquosa de hidróxido de sódio a 12 g/100 ml,
— solução etanólica de fenolftaleína, a 1 g/100 ml,— hexano puro para análise,
— álcool isopropílico puro para análise.
1.1.3. Técnica
a) Óleos de acidez expressa em ácido oleico inferior a 30 %
Inroduzem-se, num copo de 300 ml de forma alta, 50 g de óleo
virgem e aquece-se a 65º C em bando-maria. Agitando lentamente
acrescenta-se uma quantidade de solução de hidróxido de sódio a
12 g/100 ml correspondente à acidez livre do óleo, com um excesso
de 5 %. Continua-se a agitar durante cinco minutos, mantendo a
temperatura a 65º C. Transfere-se o conjunto para tubos de centrifu-
gação de 100 ml, separa-se a pasta saponária por centrifugação.
Verte-se o óleo decantado para um copo de 250 ml e lava-se com
50-60 ml de água destilada a ferver, eliminando a camada aquosa
com a ajuda de um sifão. Repetem-se as lavagens até à eliminação
completa dos vestígios do sabão residual (desaparecimento da colo-
ração rosa da fenolftaleína).
Centrifuga-se o óleo para eliminar as pequenas quantidades de água
residual.
b) Óleos com acidez expressa em ácido oleico superior a 30 %
Introduzem-se, numa ampola de decantação de um litro, 50 g de óleo
virgem, 200 ml de hexano, 100 ml de álcool isopropílico e uma quan-
tidade de solução de hidróxido de sódio a 12 g/100 ml correspondente
à acidez livre do óleo, com um excesso de 0,3 %. Agita-se energica-
mente durante um minuto. Acrescentam-se 100 ml de água destilada,
agita-se de novo e deixa-se repousar.
Após separação das camadas deixa-se escoar a camada inferior que
contém os sabões. Entre as duas camadas (oleosa por cima e aquosa
por baixo) forma-se muitas vezes uma camada intermédia constituída
por mucilagens e substâncias insolúveis que deve ser igualmente
eliminada.
Procede-se em seguida à lavagem da solução hexânica de óleo neutro
com porções de 50-60 ml de uma solução de álcool isopropílico e
água destilada a 1 + 1 (V/V) até ao desaparecimento da coloração
rosa com fenolftaleína. Procede-se em seguida à eliminação completa
do hexano por destilação no vazio (por exemplo, evaporador rotativo).
1.2.Descoloração do óleo neutralizado
1.2.1. Aparelhos e utensílios
— balão de 250 ml com 3 bocas polidas que permita inserir:
a) um termómetro na escala de Celsius que permita fazer leituras até
90º C;
b) um agitador mecânico que gire de 250 a 300 voltas por minuto
equipado para o funcionamento no vazio;1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 86
▼M6
▼B
▼B
c) uma ligação à bomba de vazio.
— Bomba de vazio, munida de um manómetro, capaz de indicar pressões
de 15 a 30 milibares.
1.2.2. Técnica
Pesam-se no balão de 3 bocas cerca de 100 g de óleo neutralizado.
Insere-se o termómetro e o agitador, liga-se à bomba de vazio e aquece-
-se até 90º C agitando.
Mantém-se esta temperatura continuando a agitar até que o óleo a
analisar esteja totalmente livre de humidade (cerca de trinta minutos).
Interrompe-se então o vazio e acrescentam-se 2 a 3 g de terra activida.
Restabelece-se o vazio até à obtenção de uma pressão de 15 a 30 mili-
bares e, ainda a uma temperatura de 90º C, agita-se durante 30 minutos
a cerca de 250 voltas por minuto.
Em seguida, filtra-se a quente numa estufa de secagem a 50-60º C.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 87
▼M6
ANEXOXIV
NOTASCOMPELEMENTARES2,3E4DOCAPÍTULO15DANOMEN-
CLATURACOMBINADA
2. A. Só se classifica nas posições 1509e 1510 o azeite proveniente exclusiva-
mente do tratamento de azeitonas e cujas características analíticas
respeitantes aos teores de ácidos gordos e de esteróis são as seguintes:
Quadro I: teor de ácidos gordos em percentagem
dos ácidos gordos totaisQuadro II: teor de esteróis em percentagem dos
esteróis totais
Ácido mirístico M 0,1 Colesterol M 0,5
Ácido linolénico M 0,9 Brassicasterol M 0,2
Ácido araquídico M 0,7 Campesterol M 4,0
Ácido eicosanóico M 0,5 Estigmasterol (1) < Campesterol
Ácido beénico M 0,3 Beta-sitosterol (2) m 93,0
Ácido lignocérico M 0,5 Delta-7-estigmasterol M 0,5
m = mínimo
M = máximo
(1) Condição não aplicável aos azeites virgens lampantes (subposição 150910 10) e aos óleos de bagaço de
azeitona brutos (subposição 1510 0010).
(2) Delta-5,23-estigmastadienol + clerosterol + Beta−sitosterol + sitostanol + Delta-5-avenasterol + Delta-
-5,24-estigmastadienol.
Excluem-se das posições 1509 e 1510 os azeites modificados quimica-
mente (nomeadamente os azeites reesterificados) e as misturas de azeites
com óleos de outra natureza. A presença de azeite reesterificado ou de
óleos de outra natureza é determinada segundo os métodos indicados nos
anexos V, VII, X A e X B do Regulamento (CEE) n.o2568/91.
B. Só se classifica na subposição 150910 o azeite definido nos pontos I e II
infraobtido unicamente por processos mecânicos ou por outros processos
físicos, em condições, nomeadamente térmicas, que não alterem o óleo e
que não tenha sido submetido a qualquer tratamento além da lavagem,
decantação, centrifugação e filtração. Os óleos obtidos a partir de azei-
tonas através da utilização de solventes constam da posição 1510.
I. Considera-se como «azeite virgem lampante», na acepção da subpo-
sição 15091010, seja qual for a sua acidez, o azeite que apresente:
a) Um teor de ►M9ceras◄não superior a ►M9350◄mg/kg;
b) Um teor de eritrodiol e uvaol não superior a 4,5 %;
c) Um teor de ácidos gordos saturados na posição 2 dos trigliceridos
não superior a 1,3 %;
d) Uma soma de isómeros transoleicos inferior a 0,10 % e uma soma
de isómeros translinoleicos + translinolénicos inferior a 0,10 %;
e) E uma ou mais das seguintes características:
1. Um índice de peróxidos superior a 20 meq de oxigénio activo/
/kg;
2. Um teor de solventes halogenados voláteis totais superior a 0,2
mg/kg ou superior a 0,1 mg/kg relativamente a, pelo menos, um
deles;
3. Um coeficiente de extinção K270superior a 0,25 e, após trata-
mento do óleo pela alumina activada, não superior a 0,11; com
efeito, certos óleos com um teor de ácidos gordos livres,
expresso em ácido oleico, superior a 3,3 g por 100 g podem
ter, após passagem pela alumina activada, em conformidade
com o método constante do anexo IX do Regulamento (CEE)
n.o2568/91, um coeficiente de extinção K270superior a 0,10;
neste caso, após neutralização e descoloração efectuadas em
laboratório, em conformidade com o método constante do anexo
XIII do regulamento supracitado, devem apresentar as seguintes
características:
— um coeficiente de extinção K270não superior a 1,20,
— uma variação (K) do coeficiente de extinção na proximidade
de 270 nm superior a 0,01 e não superior a 0,16, ou seja:1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 88
▼M6
K=Km− 0,5 (Km−4+Km+4)
Km= designa o coeficiente de extinção do
comprimento de onda máximo da
curva de absorção na proximidade
de 270 nm,
Km−4en Km+4= designam os coeficientes de
extinção nos comprimentos de onda
inferior e superior em 4 nm à de Km;
4. Características organolépticas que revelem defeitos perceptíveis
com uma intensidade superior ao limite de aceitação, com um
resultado na análise sensorial inferior a 3,5 em conformidade
com o anexo XII do Regulamento (CEE) n.o2568/91.
II. Considera-se como «outro azeite virgem» na acepção da subposição
15091090 o azeite que apresente as seguintes características:
a) Uma acidez, expressa em ácido oleico, não superior a 3,3 g/100 g;
b) Um índice de peróxidos não superior a 20 meq de oxigénio activo/
/kg;
c) Um teor de ►M9ceras◄não superior a ►M9250◄mg/kg;
d) Um teor de solventes halogenados voláteis totais não superior a 0,2
mg/kg e, relativamente a cada um destes, um teor não superior a
0,1 mg/kg;
e) Um coeficiente de extinção K270não superior a 0,25 e, após
passagem do azeite em alumina activada, a 0,10;
f) Uma variação do coeficiente de extinção (K) na proximidade de
270 nm não superior a 0,01;
g) Características organolépticas que revelem defeitos perceptíveis
com uma intensidade inferior ao limite de aceitação, com um
resultado na análise sensorial igual ou superior a 3,5 em conformi-
dade com o anexo XII do Regulamento (CEE) n.o2568/91;
h) Um teor de eritrodiol + uvaol não superior a 4,5 %;
i) Um teor de ácidos gordos saturados na posição 2 dos trigliceridos
não superior a 1,3 %;
j) Uma soma dos isómeros transoleicos inferior a 0,03 % e uma soma
de isómeros translinoleicos + translinolénicos inferior a 0,03 %.
C. Classifica-se na subposição 15099000o azeite obtido por tratamento dos
azeites das subposições 15091010 e/ou 15091090, mesmo lotados com
azeite virgem, e que apresentem as seguintes características:
a) Uma acidez, expressa em ácido oleico, não superior a 3,3 g/100 g;
b) Um teor de ►M9ceras◄não superior a 350 mg/kg;
c) Um coeficiente de extinção K270não superior a 1,20;
d) Uma variação do coeficiente de extinção ( ∆K) na proximidade de
270 nm não superior a 0,16;
e) Um teor de erotridiol e uvaol não superior a 4,5 %;
f) Um teor de ácidos gordos saturados na posição 2 dos trigliceridos não
superior a 1,5 %;
g) Uma soma de isómeros transoleicos inferior a 0,20 % e uma soma de
isómeros translinoleicos + translinolénicos inferior a 0,30 %.
D. Consideram-se como «óleos em bruto», na acepção da subposição
15100010, os óleos, nomeadamente de bagaço de azeitona, que apre-
sentem as seguintes características:
a) Uma acidez, expressa em ácido oleico, igual ou superior a 2 g/100 g;
b) Um teor de eritrodiol e uvaol igual ou superior a 12 %;
c) Um teor de ácidos gordos saturados na posição 2 dos trigliceridos não
superior a 1,8 %;
d) Uma soma de isómeros transoleicos inferior a 0,20 % e uma soma dos
isómeros translinoleicos + translinolénicos inferior a 0,10 %.
E. Classificam-se na subposição 15100090os óleos obtidos por tratamento
dos óleos da subposição 1510 0010, mesmo lotados com azeite virgem,
e os que não apresentem as características dos óleos referidos nas notas
complementares 2 B, 2 C e 2 D. Os óleos da presente subposição devem1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 89
▼M9
▼M6
▼M6
apresentar um teor de ácidos gordos saturados na posição 2 dos triglice-
ridos não superior a 2 %, uma soma dos isómeros transoleicos inferior a
0,40 % e uma soma dos isómeros translinoleicos + translinolénicos infe-
rior a 0,35 %.
3. Excluem-se das subposições 1522 0031e 15220039:
a) Os resíduos provenientes do tratamento de matérias gordas que conte-
nham óleo cujo índice de iodo, determinado segundo o método constante
do anexo XVI do Regulamento (CEE) n.o2568/91, seja inferior a 70 ou
superior a 100;
b) Os resíduos provenientes do tratamento das matérias gordas que conte-
nham óleo cujo índice de iodo esteja compreendido entre 70 e 100, mas
cuja superfície do pico com um tempo de retenção do Beta-sitosterol(1),
determinado em conformidade com o anexo V do Regulamento (CEE) n.o
2568/91, represente menos de 93 % da superfície total dos picos dos este-róis.
4. Os métodos de análise a utilizar na determinação das características dos
produtos acima mencionados são os constantes dos anexos do Regulamento(CEE) n.
o2568/91.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 90
(1) Delta-5,23-estigmastadienol + clerosterol ►C2+ Beta-sistosterol ◄+ sitostanol +
Delta-5-avenasterol + Delta-5,24-estigmastadienol.
▼B
ANEXOXV
1. TEOR DE ÓLEO DO BAGAÇO DE AZEITONA
1.1.Aparelhos e utensílios
— aparelho de Soxhlet munido de um balão de 200 a 250 ml,
— banho de aquecimento eléctrico (banho de areia, banho de água, etc.)
ou placa de aquecimento,
— balança analítica,
— estufa regulada a 80 ºC, no máximo,— estufa com aquecimento eléctrico munido de um depósito de termore-
gulação regulado a 103 ºC ± 2 ºC, que permita realizar uma insuflação
de ar ou uma pressão reduzida,
— triturador mecânico fácil de limpar e que permita a trituração sem aque-
cimento e sem diminuição sensível do teor de água e de óleo,
— cartucho de extracção e algodão hidrófilo ou filtro de papel, isento de
produtos extraíveis pelo hexano,
— exsicador,— peneiro com orifícios de 1 mm de diâmetro,— pedra-pomes em pequenos grãos, previamente seca.
1.2.Reagentes
n-Hexano técnico cujo resíduo, na evaporação completa, deve ser inferior a
0,002 g por 100 ml.
2. TÉCNICA2.1.Preparação da amostra para análise
Tritura-se a amostra para laboratório, se necessário, num triturador mecâ-
nico previamente bem limpo a fim de a reduzir a partículas que possam
atravessar completamente o peneiro.
Utiliza-se cerca de um vigésimo da amostra para perfazer a limpeza do
triturador, deita-se essa parte fora, tritura-se o restante que se recolhe,
mistura-se com cuidado e analisa-se sem demora.
2.2.Toma
Pesa-se com uma precisão de 0,01 g, logo após o final da trituração, uma
toma para análise com aproximadamente 10 g.
2.3.Preparação do cartucho de extracção
Coloca-se a toma no cartucho e tapa-se este com o tampão de algodão
hidrófilo. No caso de se ter utilizado um filtro de papel, embala-se amoedura nesse papel.
2.4.Pré-secagem
Se o bagaço estiver muito húmido (teor de água e de matérias voláteis
superior a 10 %) efectua-se uma pré-secagem colocando durante um espaço
de tempo conveniente o cartucho cheio (ou filtro de papel) na estufa aque-
cida a 80 ºC, no máximo, para reduzir o teor de água e de matérias voláteis
a menos de 10 %.
2.5.Preparação do balão
Pesa-se, com uma precisão de 1 mg, o balão contendo 1 a 2 grãos de pedra-
-pomes, previamente seco na estufa a 103 ºC ± 2 ºC e depois arrefecido
durante pelo menos uma hora num exsicador.
2.6.Primeira extracção
Coloca-se no aparelho de Soxhlet o cartucho (ou filtro de papel) que
contém a toma. Verte-se para o balão a quantidade necessária de hexano.
Adapta-se o balão ao aparelho de Soxhlet, coloca-se o conjunto sobre um
banho com aquecimento eléctrico. Regula-se o aquecimento em condições
tais que o refluxo seja pelo menos de três gotas por segundo (ebulição
moderada, não tumultuosa).1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 91
▼B
Após quatro horas de extracção, deixa-se arrefecer. Tira-se o cartucho do
aparelho de Soxhlet e coloca-se numa corrente de ar a fim de eliminar a
maior parte do solvente que o impregna.
2.7.Segunda extracção
Despeja-se o cartucho no microtriturador e tritura-se o mais possível.
Volta-se a colocar quantitativamente a mistura no cartucho e este no
aparelho de Soxhlet.
Recomeça-se a extracção ainda durante duas horas utilizando o mesmo
balão que contém a primeira extracção.
A solução obtida no balão de extracção deve ser límpida. Se o não for,
filtra-se por filtro de papel lavando várias vezes o primeiro balão e o filtro
com hexano. Recolhe-se o filtrado e o solvente de lavagem num segundo
balão previamente seco e pesado com uma precisão de 1 mg.
2.8.Eliminação do solvente e pesagem do extracto
Expulsa-se, por destilação sobre banho de aquecimento eléctrico, a maior
parte do solvente. Eliminam-se os últimos vestígios de solvente aquecendo
o balão na estufa a 103 ºC ± 2 ºC durante 20 minutos. Facilita-se esta
eliminação quer insuflando ar de vez em quando ou de preferência um gás
inerte quer submetendo-o a pressão reduzida.
Deixa-se arrefecer o balão num exsicador durante pelo menos uma hora e
pesa-se com uma precisão de 1 mg.
Volta-se a aquecer durante 10 minutos nas mesmas condições, arrefece-se
no exsicador e pesa-se.
A diferença entre os resultados destas duas pesagens deve ser inferior ou
igual a 10 mg. Se não, volta-se a aquecer durante períodos de dez minutos,
seguidos de arrefecimento e de pesagem, até que a diferença de massa seja
no máximo igual a 10 mg. Tenha-se em consideração a última pesagem do
balão.
Efectuam-se duas determinações na mesma amostra para análise.
3. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS
3.1.Cálculos
a) O extracto, expresso em percentagem em massa, do produto tal como se
apresenta é:
S=m1×100
m0
onde: S é a percentagem em massa do extracto do produto tal como
se apresenta.
m0é a massa, em gramas, da toma.
m1é a massa, em gramas, do extracto após secagem.
Toma-se como resultado a média aritmética de duas determinações se as
condições de repetibilidade estiverem prenchidas.
O resultado exprime-se arredondado às décimas.
b) O extracto é referido à matéria seca utilizando a seguinte fórmula:
S×100
100 − U= extracto em % gordo/seco
onde:
S = é percentagem em massa do extracto do produto tal como se
apresenta [ver alínea a].
U = é o seu teor de água e de matérias voláteis.
3.2.Repetibilidade
A diferença entre os resultados das duas determinações, efectuadas simulta-
neamente ou rapidamente uma após a outra pelo mesmo analista, não deve
ser superior a 0,2 g de extracto com hexano para 100 g de amostra.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 92
▼B
No caso contrário, repete-se a análise com outras duas tomas. Se ainda
desta vez a diferança ultrapassar 0,2 g, toma-se como resultado a média
aritmética das quatro determinações efectuadas.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 93
▼B
ANEXOXVI
DETERMINAÇÃODO ÍNDICEDE IODO
1. OBJECTIVO
Determinação do índice de iodo de óleos e gorduras animais e vegetais, a
seguir denominados gorduras.
2. DEFINIÇÃO
No final da presente norma internacional, aplicar-se-á a seguinte definição:
2.1. Índice de iodo: o peso de iodo absorvido pela amostra nas condições de
trabalho que se especificam na presente norma internacional.
O índice de iodo expressa-se em gramas de iodo por 100 g de amostra.
3. RESUMO DO PROCESSO
Dissolução de uma toma de amostra num solvente seguida da adição de
reagente de Wijs. Após um intervalo de tempo determinado, adição de
solução de iodeto de potássio e água, titulação do iodo libertado com uma
solução de tiossulfato de sódio.
4. REAGENTES
Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica reconhecida.
4.1. Iodeto de potássio, solução a 100 g/l, isenta de iodato e iodo livre.4.2. Amido, solução:
Dissolvem-se 5 g de amido solúvel em 30 ml de água, adiciona-se esta
mistura a 1 000 ml de água em ebulição, mantém-se em ebulição durante
3 minutos e deixa-se arrefecer.
4.3. Tiossulfato de sódio, solução titulada:
c (Na
2S2O35H2O) = 0,1 mol/l, titulada não mais de 7 dias antes da utili-
zação.
4.4. Solvente, preparado mediante mistura de volumes iguais de ciclohexano e
ácido acético.
4.5. Reagente de Wijs, contendo monocloreto de iodo em ácido acético.
Deverá usar-se reagente Wijs de origem comercial.
Nota:O reagente contém 9 g de ICI3+ 9 g I em ácido acético.
5. APARELHOS E UTENSÍLIOS
Material de uso corrente em laboratório, nomeadamente o seguinte:
5.1. Cápsulas pequenas de vidro apropriadas para nelas pesar a toma e intro-
duzi-las depois nos erlenmeyers (ponto 5.2).
5.2. Erlenmeyers, de 500 ml de capacidade, equipados com rolhas de vidro
esmerilado e completamente secos.
6. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA PARA ANÁLISE
A amostra homogeneizada é seca com sulfato de sódio e filtrada.
7. TÉCNICA
7.1. Toma
A massa da toma varia de acordo com o valor esperado do índice de iodo,
como se indica no quadro 1.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 94
▼B
Quadro1
Índice de iodo esperado Massa da toma (g)
inferior a 5 3,00
5 a 20 1,00
21 a 50 0,40
51 a 100 0,20
101 a 150 0,13
151 a 200 0,10
Pesa-se a toma de ensaio com aproximação a 0,1 mg numa cápsula
pequena de vidro (ponto 5.1).
7.2. Determinação
Introduz-se a toma num erlenmeyer de 500 ml (ponto 5.2). Juntam-se 20 ml
do solvente (ponto 4.4), para dissolver a gordura. Adicionam-se exacta-
mente 25 ml de reagente Wijs (ponto 4.6), coloca-se a rolha, agita-se o
conteúdo e coloca-se o erlenmeyer no escuro. Não utilizar a sucção com a
boca para medir por pipeta o reagente de Wijs.
De um modo similar, procede-se à preparação de um ensaio em branco
com o solvente e o reagente, mas sem a toma de gordura.
Para amostras com um índice de iodo inferior a 150, mantêm-se os erlen-
meyers no escuro durante 1 hora; para amostras com um índice de iodo
superior a 150 e para produtos polimerizados ou oxidados em quantidade
apreciável, durante 2 horas.
No final do intervalo de tempo prescrito, deitam-se 20 ml de solução de
iodeto de potássio (ponto 4.1) e 150 ml de água em cada erlenmeyer.
Titula-se com a solução volumétrica padrão de tiossulfato de sódio (ponto
4.3), até a coloração amarela, devida à presença de iodo, ter praticamente
desaparecido. Adicionam-se algumas gotas da solução de amido (ponto 4.2)
e continua-se a titulação até à coloração azul desaparecer após agitação
bastante vigorosa.
Nota:a determinação potenciométrica do ponto final é permitida.
7.3. Número de determinações
Efectuam-se duas determinações para cada amostra em estudo.
8. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS
O índice de iodo é dado pela expressão:
12;69 c V 1/C0V2 ðÞ
m
onde:
c = representa a concentração exacta, expressa em moles por litro, de
solução titulada de tiossulfato de sódio (ponto 4.3) utilizada.
V1= representa o volume, expresso em mililitros, da solução titulada de
tiossulfato de sódio (ponto 4.3) gasto no ensaio em branco.
V2= representa o volume, expresso em mililitros, da solução titulada de
tiossulfato de sódio (ponto 4.3) gasto na determinação.
m = representa a massa, expressa em gramas, da toma (ponto 7.1).
Considera-se como resultado a média aritmética das duas determinações,
desde que as exigências de repetibilidade (ponto 11.2) sejam satisfeitas.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 95
▼M11
ANEXOXVII
MÉTODO PARA A DETERMINAÇÃO DE ESTIGMASTADIENOS EM
ÓLEOS VEGETAIS
1. OBJECTIVO
Determinação de estigmastadienos em óleos vegetais que contenham
concentrações reduzidas destes hidrocarbonetos, nomeadamente azeites
virgens e óleos de bagaço de azeitona.
2. ÂMBITO
O método é aplicável a todos os óleos vegetais, embora as determinações
apenas sejam fiáveis nos casos em que o teor de hidrocarbonetos em
causa esteja compreendido entre de 0,01 e 4,0 mg/kg. O método é parti-
cularmente adequado para detectar a presença de óleos vegetais refinados
(azeite, óleo de bagaço de azeitona, óleo de girassol, óleo de palma, etc.)
em azeites virgens, uma vez que, contrariamente a estes últimos, os
azeites refinados contêm estigmastadienos.
3. PRINCÍPIO
Isolamento da matéria insaponificável, seguido de separação da fracção
que contém hidrocarbonetos esteróides por cromatografia em coluna de
silicagel e análise por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar.
4. EQUIPAMENTO
4.1. Balões de 250 ml adequados para uso com refrigerante de refluxo.4.2. Ampolas de decantação de 500 ml.4.3. Balões de fundo redondo de 100 ml.4.4. Evaporador rotativo.4.5. Coluna de vidro para cromatografia (1,5-2,0 cm de diâmetro interno e 50
cm de comprimento), equipada com uma torneira de teflon e um tampão
de lã de vidro ou um disco de vidro sinterizado. Para preparar a coluna de
silicagel, deitar hexano na coluna cromatográfica até uma altura aproxi-
mada de 5 cm, enchendo de seguida com uma suspensão de silicagel em
hexano (15 g em 40 ml), com o auxílio de várias porções de hexano.
Deixar assentar, com o eventual recurso a uma ligeira vibração. Adicionar
sulfato de sódio anidro até uma altura aproximada de 0,5 cm e eluir o
excesso de hexano.
4.6. Cromatógrafo de fase gasosa equipado com um detector de ionização de
chama, um injector com divisão de fluxo ou um sistema de injecção
directa na coluna a frio e forno com programação de temperatura com
precisão de ± 1 ºC.
4.7. Coluna capilar de sílica fundida para cromatografia em fase gasosa (0,25
ou 0,30 mm de diâmetro interno e 25 m de comprimento), revestidas com
uma fase de fenilmetilsilicone a 5 %, de 0,25 mm de espessura.
Nota1.
Podem utilizar-se outras colunas de polaridade idêntica inferior.
4.8. Registador-integrador com possibilidade de integração entre dois mínimos
consecutivos.
4.9. Microsseringa de 5-10 ml para cromatografia em fase gasosa, com agulha
cementada.
4.10. Manta ou placa de aquecimento.
5. REAGENTES
Salvo indicação em contrário, todos os reagentes devem ser de qualidade
analítica. Deve utilizar-se água destilada ou de grau de pureza equiva-
lente.
5.1. Hexano ou mistura de alcanos com intervalo de ebulição 65-70 ºC, desti-
lada numa coluna de rectificação.
Nota2.
O solvante deve ser destilado, com vista a remover as impurezas.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 96
▼M11
5.2. Etanol a 96 % v/v.
5.3. Sulfato de sódio anidro.5.4. Solução alcoólica de hidróxido de potássio a 10 %. Adicionar 10 ml de
água a 50 g de hidróxido de potássio, agitar e dissolver a mistura em
etanol, até perfazer 500 ml.
Nota3.
Em repouso, a solução alcoólica de hidróxido de potássio adquire uma
coloração acastanhada, pelo que deve preparar-se diariamente antes do
uso e armazenar-se, pelo que deve preparar-se diariamente antes do usoe armazenar-se em recipientes de vidro escuro, devidamente rolhados.
5.5. Silicagel 60 para cromatografia em coluna, 70-230 mesh (Merck ref.
7734 ou similar)
Nota4.
De um modo geral, a silicagel pode ser utilizada directamente, sem qual-
quer tratamento prévio. Contudo, alguns lotes podem exibir uma
actividade reduzida, originando separações cromatográficas deficientes.
Nestas circunstâncis, a silicagel deve ser tratada do seguinte modo: desac-
tivar a silicagel por aquecimento a 500 ºC durante 4 horas. Após o
aquecimento, colocar a silicagel num exsicador, transferindo-a, após arre-
fecimento, para um balão rolhado. Adicionar 2 % de água e agitar até que
deixem de observar-se aglomerados e o pó flua livremente.
Caso os lotes de silicagel originem cromatogramas com picos atribuíveis
a interferências, a silicagel deve ser tratada de modo supra. Como alter-
nativa, pode utilizar-se silicagel de qualidade extra (Merck, ref. 7754).
5.6. Solução-mãe (200 ppm) de colesta-3,5-dieno (Sigma, 99 % de pureza) em
hexano (10 mg em 50 ml).
5.7. Solução-padrão de colesta-3,5-dieno em hexano, numa concentração de
20 ppm, obtida por diluição da solução supra.
Nota5.
Se mantidas a uma temperatura inferior a 4 ºC, as soluções 5.6 e 5.7 não
sofrem deterioração durante um período de, pelo menos, 4 meses.
5.8. Solução de n-nonacosano em hexano com uma concentração aproximada
de 100 ppm.
5.9. Gás de arrastamento para cromatografia: hélio ou hidrogénio com um
grau de pureza de 99,9990 %.
5.10. Gases auxiliares para o detector de ionização de chama: hidrogénio com
um grau de pureza de 99,9990 % ou ar depurado.
6. PROCEDIMENTO6.1.Preparação da matéria insaponificável:
6.1.1. Pesar 20 ± 0,1 g de óleo num balão de 250 ml (4.1), adicionando 1 ml de
solução-padrão de colesta-3,5-dieno (20 mg) e 75 ml de solução alcoólica
de hidróxido de potássio a 10 %. Adaptar o refrigerante e aquecer à
ebulição ligeira durante 30 minutos. Remover o balão da fonte de calor
e deixar arrefecer ligeiramente (não deixar arrefecer até à temperatura
ambiente, uma vez que a amostra poderá aderir ao fundo do balão).
Adicionar 100 ml de água e transferir a solução para uma ampola de
decantação (4.2), com o auxílio de 100 ml de hexano. Agitar a mistura
vigorosamente durante 30 segundos e deixar separar as fases.
Nota6.
Caso se observe a formação de uma emulsão persistente, adicionar
pequenas quantidades de etanol
6.1.2. Transferir a fase aquosa inferior para outra ampola de decantação e
extrair novamente com 100 ml de hexano. Como anteriormente, recolher
a fase inferior, lavando os extractos de hexano (combinados numa
terceira ampola de decantação) com três porções de 100 ml de mistura
etanol-água (1 : 1), até obter pH neutro.
6.1.3. Tratar a solução de hexano com sulfato de sódio anidro (50 g), lavar com
20 ml de hexano e evaporar à secura num evaporador rotativo a 30 ºC e
pressão reduzida.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 97
▼M11
6.2.Separação da fracção que contém hidrocarbonetos esteróides:
6.2.1. Remover o resíduo com o auxílio de duas porções de 1 ml de hexano,
transferir para a coluna, de modo a que o nível da solução atinja no
topo da camada de sulfato de sódio, e iniciar a eluição cromatográfica
com hexano, a um fluxo aproximado de 1 ml/min. Desprezar os primeiros
25-30 ml de eluído e recolher os 40 ml seguintes. Transferir a fracção
recolhida para um balão de fundo redondo em 100 ml (4.3).
Nota7.
A primeira fracção contém os hidrocarbonetos saturados (figura 1a) e a
segunda os hidrocarbonetos esteróides. O prosseguimento da eluição
permite obter esqualeno e compostos afins. Para uma separação adequada
dos hidrocarbonetos saturados e esteróides, é necessário optimizar os
volumes das diversas fracções. Assim, o volume da primeira fracção
deve ser ajustado de modo a que, aquando da análise da segundo fracção,
os picos relativos aos hidrocarbonetos saturados sejam pouco intensos
(veja-se a figura 1c); se estes picos estiverem ausentes e a intensidade
do pico-padrão for reduzida, o volume deve ser reduzido. De qualquer
modo, não é necessário efectuar a separação completa dos componentes
da primeira e da segunda fracção, uma vez que, no caso de se ajustarem
as condições de trabalho de acordo com 6.3.1, não ocorre a sobreposição
dos picos durante a análise cromatográfica. Em geral, a optimização do
volume da segunda fracção não é também necessária, em virtude da sepa-
ração adequada dos restantes componentes. Todavia, a presença de um
pico intenso com um tempo de retenção aproximadamente 1,5 minutos
inferior ao pico relativo ao padrão resulta de uma separação deficiente,
sendo atribuível ao esqualeno.
6.2.2. Evaporar a segunda fracção num evaporador, a 30 ºC e pressão reduzida,
até à secura, e dissolver imediatamente o resíduo em 0,2 ml de hexano.
Manter a solução no frigorífico até efectuar a análise.
Nota8.
Os resíduos 6.1.3 e 6.2.2 não devem permanecer a seco, à temperatura
ambiente. Logo que obtidos, deve adicionar-se solvente, devendo as
soluções resultantes ser armazenadas no frigorífico.
6.3.Cromatrografia em fase gasosa:
6.3.1. Condições de trabalho no caso de injecção com divisão de fluxo:
— temperatura do injector: 300 ºC,
— temperatura do detector: 320 ºC.
— integrador-registrador: os parâmetros de integração devem ser selec-
cionados de modo a obter uma estimativa adequada das áreas.
Recomenda-se um modo de integração entre dois mínimos consecu-
tivos,
— sensibilidade: cerca de 16 vezes superior à atenuação mínima,
— quantidade de solução a injectar: 1ml,
— programação de temperatura: temperatura inicial de 235 ºC durante 6
minutos, aumentando de seguida à razão de 2 ºC/min até atingir
285 ºC,
— injector com divisão de fluxo na proporção 1: 15,
— gás de arrastamento: hélio ou hidrogénio, a uma pressão aproximada
de 120 kPa.
Estas condições podem ser ajustadas em função das características do
cromatógrafo e da coluna, de modo a que, no cromatograma, o pico
correspondente ao padrão interno ocorra a cerca de 5 minutos do tempo
referido em 6.3.2 e tenha uma intensidade equivalente a, pelo menos 80 %
da escala.
Deve proceder-se à verificação do sistema mediante a injecção de uma
mistura de solução-mãe de colestadieno (5.6) e n-nonacosano (5.8). O
pico correspondente ao colesta-3,5-dieno deve surgir antes do pico corres-pondente ao n-nonacosano (veja-se a figura 1c); se tal não suceder, pode
proceder-se de dois modos: reduzir a temperatura do forno ou utilizar
uma coluna de polaridade inferior.
6.3.2. Identificação dos picos
O pico correspondente ao padrão interno surge a cerca de 19 minutos; o
estigmasta-3,5-dieno possui um tempo de retenção relativo de aproxima-
damente 1,29 (veja-se a figura 1b). O estigmasta-3,5-dieno é
acompanhado de pequenas quantidades de um isómero que não origina,
em geral, um pico independente. Todavia, se a coluna possuir uma
elevada polaridade ou um elevado poder de resolução, poderá surgir um1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 98
▼M11
pico pouco intenso imediatamente antes do pico relativo ao estigmasta-
-3,5-dieno (veja-se a figura 2). De modo a assegurar que a eluição dos
estigmastadienos produza um único pico, é aconselhável substituir a
coluna por outra menos polar ou de diâmetro interno superior.
Nota9.
Pode obter-se um pico de referência para os estigmastadienos através da
aplicação do método para a determinação de hidrocarbonetos esteróides a
óleos vegetais; os estigmastadienos originam um pico característico, facil-
mente identificável.
6.3.3. Análise quantitativa
O teor de estigmastadienos é determinado por recurso à fórmula:mg/kg de estigmastadienos =
As/C2Mc
Ac/C2Mo
em que: Ab= área do pico relativo aos estigmastadienos (ou soma
das áreas dos picos correspondentes aos dois
isómeros, se for caso disso).
Ac= área do pico relativo ao padrão interno (colesta-
dieno).
Mc= massa de padrão adicionada, em microgramas.
Mo= massa de óleo, em gramas.
Limite de detecção: cerca de 0,01 mg/kg.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 99
▼M11
Figura 1
Cromatogramas obtidos na análise de amostras de azeite com uma coluna
capilar de sílica fundida (0,25 mm de diâmetro interno e 25 m de compri-
mento), revestida com uma película de fenilmetilsilicone a 5 % de
0,25 mm de espessura.
a) Primeira fracção (30 ml) de um azeite virgem, adicionda do padrão.
c) Segunda fracção (40 ml) de um azeite contendo 0,10 mg/kg de estig-
mastadienos.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 100
▼M11
d) Segunda fracção (40 ml), contendo uma pequena quantidade da
primeira fracção.
Figura 2
Cromatogramas obtidos na análise de uma amostra de azeite refinado
com uma coluna DB-5, em que se observa o pico correspondente ao
isómero do estigmasta-3,5-dieno.1991R2568 — PT — 31.10.1995 — 013.001 — 101