1994D0577 — PT — 01.05.2004 — 003.001 — 1
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►BDECISÃO DA COMISSÃO
de 15 de Julho de 1994
que estabelece as condições de sanidade animal e a certificação veterinária para a importação de
sémen de bovino de países terceiros
(94/577/CE)
(JO L 221 de 26.8.1994, p. 26)
Alterada por:
JornalOficial
n.opágina data
►M1 Decisão 1999/495/CE da Comissão de 1 de Julho de 1999 L 192 56 24.7.1999
►M2 Decisão 2004/52/CE da Comissão de 9 de Janeiro de 2004 L 10 67 16.1.2004
Alterada por:
►A1 Acto relativo às condições de adesão da República Checa, da República
da Estónia, da República de Chipre, da República da Letónia, da Repú-blica da Lituânia, da República da Hungria, da República de Malta, da
República da Polónia, da República da Eslovénia e da República Eslo-
vaca e às adaptações dos Tratados em que se funda a União EuropeiaL 236 33 23.9.2003
▼B
DECISÃO DA COMISSÃO
de 15 de Julho de 1994
que estabelece as condições de sanidade animal e a certificação
veterinária para a importação de sémen de bovino de países
terceiros
(94/577/CE)
A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,
Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia,
Tendo em conta a Directiva 88/407/CEE do Conselho, de 14 de Junho
de 1988, que fixa as exigências de polícia sanitária aplicáveis às trocas
comerciais intracomunitárias e às importações de sémen de animais daespécie bovina (
1), com a última redacção que lhe foi dada pela Direc-
tiva 93/60/CEE (2), e, nomeadamente, os seus artigos 10.oe 11.o,
Considerando que a lista de países terceiros dos quais os Estados-
-membros autorizam a importação de sémen de bovinos domésticos, aseguir designada «a lista dos países terceiros», foi estabelecida pelaDecisão 90/14/CEE da Comissão (
3), alterada pela Decisão 91/276/
/CEE (4);
Considerando que a situação sanitária em Israell evou à proibição das
importações desse país, estabelecida pela Decisão 91/277/CEE daComissão (
5);
Considerando que, pelas Decisões 91/479/CEE (6), 91/549/CEE (7), 92/
/123/CEE (8), 92/124/CEE (9), 92/125/CEE (10), 92/126/CEE (11), 92/127/
/CEE (12), 92/128/CEE (13), 92/386/CEE (14), 92/387/CEE (15) e 92/445/
/CEE (16)da Comissão, foram estabelecidas as condições de sanidade
animale a certificação veterinária para a importação de sémen debovino dos Estados Unidos da América, Canadá, Polónia, Finlândia,Nova Zelândia, Áustria, Suíça, Suécia, Hungria, Noruega e Checos-lováquia, respectivamente;
Considerando que a Directiva 93/60/CEE, que deve ser aplicada nos
Estados-membros o mais tardar em 1 de Julho de 1994, altera a Direc-tiva 88/407/CEE, o que implica, por sua vez, a necessidade de alteraras decisões acima mencionadas relativas a países terceiros; que, para
simplificar e clarificar a legislação comunitária no domínio em questão,
é necessário reunir numa só as decisões acima referidas e revogar asque estão em vigor para cada país individualmente;
Considerando que, atendendo ao disposto no Acordo sobre o Espaço
Económico Europeu, não é necessário manter os certificados veteriná-rios para as importações de sémen de animais da espécie bovinaproveniente da Áustria, Finlândia, Noruega e Suécia;
Considerando que, em conformidade com o parecer do Comité cien-
tífico veterinário, é exigido um teste suplementar para a doençahemorrágica epizoótica;1994D0577 — PT — 01.05.2004 — 003.001 — 2
(1)J O n .oL 194 de 22. 7. 1988, p. 10.
(2)J O n .oL 186 de 28. 7. 1993, p. 28.
(3)J O n .oL 8 de 11. 1. 1990, p. 71.
(4)J O n .oL 135 de 30. 5. 1991, p. 58.
(5)J O n .oL 135 de 30. 5. 1991, p. 60.
(6)J O n .oL 258 de 16. 9. 1991, p. 1.
(7)J O n .oL 298 de 29. 10. 1991, p. 6.
(8)J O n .oL 48 de 22. 2. 1992, p. 1.
(9)J O n .oL 48 de 22. 2. 1992, p. 10.
(10)J O n .oL 48 de 22. 2. 1992, p. 19.
(11)J O n .oL 48 de 22. 2. 1992, p. 28.
(12)J O n .oL 48 de 22. 2. 1992, p. 37.
(13)J O n .oL 48 de 22. 2. 1992, p. 46.
(14)J O n .oL 204 de 21. 7. 1992, p. 13.
(15)J O n .oL 204 de 21. 7. 1992, p. 22.
(16)J O n .oL 247 de 27. 8. 1992, p. 1.
▼B
Considerando que relativamente ao Canadá só são efectuados, com
intervalos de seis meses, testes de pré-colheita de rotina para essadoença; que é, pois necessário autorizar um período de transição para
a introdução da presente decisão relativamente ao Canadá, para que as
autoridades veterinárias canadianas disponham de tempo suficiente paraintroduzir o novo teste no seu programa de rotina;
Considerando, ainda, que na sequência de progressos recentemente
efectuados quanto à compreensão da epidemiologia da febre catarral,a importação de sémen de bovino da Austrália não pode ser permitida;
Considerando que se verifica existir, nos países constantes da lista dos
países terceiros, uma boa situação sanitária, controlada por serviços
veterinários bem estruturados e organizados no respeitante às doenças
transmissíveis pelo sémen;
Considerando que as autoridades veterinárias responsáveis dos países
terceiros se comprometeram a notificar, num prazo de 24 horas, portelex ou telefax, a Comissão e os Estados-membros da confirmação daocorrência de quaisquer das doenças indicadas na lista A do GabineteInternacionalde Epizootias (OIE), bem como de quaisquer al terações
na política de vacinações contra as mesmas, ou, num prazo adequado,
da ocorrência de doenças constantes da lista B da OIE e de quaisquerpropostas de alterações das normas de importação relativas a animaisdomésticos ou ao seu sémen ou embriões;
Considerando que as autoridades veterinárias responsáveis dos países
constantes da lista dos países terceiros se comprometeram a controlaroficialmente a emissão de certificados prevista na presente decisão,bem como a garantir que todos os certificados, derrogações e resultados
laboratoriais relevantes em que a certificação se possa ter baseado
fiquem oficialmente arquivados durante, pelo menos, os doze mesesseguintes à data de expedição do sémen a que dizem respeito;
Considerando que as autoridades veterinárias responsáveis dos países
constantes da lista dos países terceiros se comprometeram a aprovaroficialmente centros de colheita de sémen para a exportação de sémende bovino para a Comunidade, em conformidade com o disposto no
artigo 9.
oda Directiva 88/407/CEE;
Considerando que as condições sanitárias e a certificação veterinária
devem ser adaptadas em função da situação sanitária do país terceiroem questão;
Considerando que as medidas previstas na presente decisão estão em
conformidade com o parecer do Comité veterinário permanente,
ADOPTOU A PRESENTE DECISÃO:
Artigo 1.o
Os Estados-membros autorizarão apenas a importação de sémen de
bovino que satisfaça as condições estabelecidas nos certificados da
parte 1 dos anexos A, B, C e D, desde que seja proveniente dos paísesterceiros constantes da parte 2 dos anexos A, B, C e D, respectiva-mente.
No entanto, os Estados-membros autorizarão até 31 de Dezembro de
1994 a importação do Canadá de sémen de bovino colhido e transfor-mado em conformidade com a Decisão 91/549/CEE.
Artigo 2.
o
São revogadas as Decisões 91/479/CEE, 92/123/CEE, 92/124/CEE, 92/
/125/CEE, 92/126/CEE, 92/127/CEE, 92/128/CEE, 92/386/CEE, 92/387//CEE e 92/445/CEE.
A Decisão 91/549/CEE é revogada com efeitos a partir de 1 de Janeiro
de 1995.1994D0577 — PT — 01.05.2004 — 003.001 — 3
▼B
Artigo 3.o
O primeiro parágrafo do artigo 1.oé aplicável a partir de 1 de Janeiro
de 1995.
Artigo 4.o
Os Estados-membros são os destinatários da presente decisão.1994D0577 — PT — 01.05.2004 — 003.001 — 4
▼B
ANEXO A
PARTE 1
CERTIFICADO SANITÁRIO
para a importação de sémen de bovino
1994D0577 — PT — 01.05.2004 — 003.001 — 5
▼B
1994D0577 — PT — 01.05.2004 — 003.001 — 6
▼B
►(1) (2)M11994D0577 — PT — 01.05.2004 — 003.001 — 7
▼A1
PARTE 2
Lista dos países autorizados a utilizar o modelo de certificado sanitário
constante da Parte I do Anexo A
NOVA ZELÂNDIA
ROMÉNIA
SUÍÇA1994D0577 — PT — 01.05.2004 — 003.001 — 8
▼B
ANEXO B
PARTE 1
CERTIFICADO SANITÁRIO
para a importação de sémen de bovino dos Estados Unidos da América
1994D0577 — PT — 01.05.2004 — 003.001 — 9
▼B
1994D0577 — PT — 01.05.2004 — 003.001 — 10
▼B
►(1) (2)M11994D0577 — PT — 01.05.2004 — 003.001 — 11
▼B
PARTE 2
Listadepaísesautorizadosautilizaromodelodecertificadosanitáriocons-
tante da parte 1 do anexo B
ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA1994D0577 — PT — 01.05.2004 — 003.001 — 12
▼B
ANEXO C
PARTE 1
CERTIFICADO SANITÁRIO
para a importação de sémen de bovino
1994D0577 — PT — 01.05.2004 — 003.001 — 13
▼B
1994D0577 — PT — 01.05.2004 — 003.001 — 14
▼B
►(1) (2)M11994D0577 — PT — 01.05.2004 — 003.001 — 15
▼B
PARTE 2
Listadepaísesautorizadosautilizaromodelodecertificadosanitáriocons-
tante da parte 1 do anexo C
CANADÁ: Com excepção da região de Okanagan Valley da British Columbia,
definida como a área delimitada por uma linha traçada a partir deum ponto na fronteira do Canadá com os Estados Unidos da
América de 120º 15 ′de longitude e 49º de latitude, para norte até
um ponto de 199º 35 ′de longitude e 50º 30 ′de latitude, para
nordeste até um ponto de 199º de longitude e 50º 45 ′de latitude e
para sulaté um ponto na fronteira do Canadá com os Estados
Unidos da América de 188º 15 ′de longitude e 49º de latitude.1994D0577 — PT — 01.05.2004 — 003.001 — 16
▼B
ANEXO D
PARTE 1
CERTIFICADO SANITÁRIO
para a importação de sémen de bovino
1994D0577 — PT — 01.05.2004 — 003.001 — 17
▼B
1994D0577 — PT — 01.05.2004 — 003.001 — 18
▼B
►(1) (2)M11994D0577 — PT — 01.05.2004 — 003.001 — 19
▼B
PARTE 2
Lista depaíses terceiros autorizadosa utilizar o modelo decertificado sani-
tário constante da parte 1 do anexo D
AUSTRÁLIA1994D0577 — PT — 01.05.2004 — 003.001 — 20
▼B
ANEXO E
Protocolo para uma prova de imunoabsorção enzimática de bloqueio ou
competitiva utilizando um anticorpo monoclonal específico de grupo para
a detecção dos anticorpos do vírus da febre catarral
PROVA ELISA COMPETITIVA UTILIZANDO O ANTICORPO MONO-
CLONAL 3-17-A3
A prova permite detectar anticorpos para todos os serotipos conhecidos do vírus
da febre catarral(VFC).
O fundamento da prova é a interrupção da reacção entre o antigénio do VFC e
um anticorpo monoclonal específico de grupo (3-17-A3) por adição de soro de
ensaio a diferentes diluições. Os anticorpos do VFC presentes no soro de ensaio
bloqueiam a reactividade do anticorpo monoclonal (AMC), o que origina uma
redução do desenvolvimento esperado da cor resultante da adição de substrato
enzimático.
MATERIAL E REAGENTES
1. Placas de microtítulo de fundo plano.
2. Antigénio: preparado conforme descrito.3. Tampão de bloqueio: 5 % (p/v) pó de leite seco «Marvel», 0,1 % (v/v)
Tween -20 (fornecido em xarope monolaurato de polioxietileno sorbitol) em
sistema tampão fosfatado (STF).
4. Anticorpo monoclonal (AMC): 3-17-A3 (fornecido na forma de sobrenadante
da cultura de tecidos de hibridoma), armazenado a − 20 ºC ou liofilizado,
diluído a 1/50 com um tampão de bloqueio antes da utilização, dirigido
contra o polipeptido p7 específico do grupo.
5. Conjugado: globulina de coelho anti-rato (adsorvida e eluída), conjugada
com peroxidase de rábano silvestre e mantida ao abrigo da luz a 4 ºC.
6. Substrato e cromogénio: 0,2 g de ortofenileno diamina (OFD) dissolvidos
num tampão que consiste em 2,553 g de ácido cítrico e 4,574 g de hidroge-
nortofosfato dissódico perfazendo até 500 mlcom água destil ada, dividido
em alíquotas de 25 ml e mantido ao abrigo da luz a − 20 ºC; imediatamente
antes da utilização, são adicionados 12 µl/25 ml de peróxido de hidrogénio
(30 % p/v).
MANIPULAR CUIDADOSAMENTE O OFD — UTILIZAR LUVAS DE
BORRACHA — SUSPEITA DE EFEITO MUTAGÉNICO
7. Ácido sulfúrico 1 molar: 26,6 ml de ácido, adicionados a 473,4 ml de água
destilada.
NÃO ESQUECER — ADICIONAR SEMPRE O ÁCIDO À ÁGUA, nunca a
água ao ácido.
8. Agitador orbital.
9. Leitor de placa ELISA (a prova pode ser lida visualmente).1994D0577 — PT — 01.05.2004 — 003.001 — 21
▼B
1994D0577 — PT — 01.05.2004 — 003.001 — 22
▼B
PROTOCOLO DE ENSAIO
Controlo em branco
A faixa 1, de A a H, representa um controlo em branco que compreende o anti-
génio do VFC e o conjugado. Pode ser utilizado para aferir o leitor ELISA.
Controlo do AMCA faixa 2, de A a H, representa o controlo do AMC e compreende o antigénio
do VFC, o AMC e o conjugado. Trata-se de um controlo negativo. A média dos
valores da densidade óptica desta faixa de controlo corresponde ao valor de
inibição de 0 %.
Controlo positivoA faixa 3, de A a H, representa o controlo positivo. Compreende o antigénio do
VFC, as diluições de antisoro positivo do VFC, o AMC e o conjugado. Trata-se
de um indicador de que o ensaio está a decorrer com normalidade, devendo ser
obtidos, de ensaio para ensaio, níveis de inibição equivalentes.
Soros de ensaioNo formato de ensaio atrás indicado podem ser ensaiados 18 soros com as
diluições de 1/2, 1/4, 1/8 e 1/16. Obter-se-ão, desta forma, informações relativas
ao título do anticorpo nos soros a ensaiar. A gama de diluições poderia ser alar-
gada para obter títulos finais de diluição do soro. Por outro lado, para estudos
serológicos em grande escala, o soro pode ser ensaiado a uma única diluição
(1/4) ou a duas diluições (1/2 e 1/4) como prova rápida de controlo.
TÉCNICA
1. Diluir o antigénio do VFC até à concentração pré-titulada em STF. Proceder
à dissociação ultra-sónica para dispersar os agregados do vírus (não dispondo
do aparelho necessário, pipetar vigorosamente) e adicionar 50 µla todas as
cavidades da placa ELISA. Bater ligeiramente nos bordos da placa para
dispersar o antigénio.
2. Incubar a 37 ºC durante 60 minutos num agitador orbital. Lavar as placas
passando-as três vezes por água e esvaziar as cavidades com STF não estéril
e secar com um papelabsorvente.
3. Adicionar 50 µlde tampão de bl oqueio por cavidade. Adicionar os soros de
ensaio e um soro positivo nas cavidades apropriadas e diluir o conteúdo da
placa com a ajuda de uma pipeta de canais múltiplos. Não adicionar soro
nem ao controlo em branco nem ao controlo do AMC.
4. Imediatamente após a adição dos soros de ensaio, diluir o AMC em tampão
de bloqueio (a uma diluição pré-titulada) e adicionar 50 µla todas as cavi-
dades da placa, excepto ao controlo em branco.
5. Incubar a 37 ºC durante 60 minutos num agitador orbital. Lavar três vezes
com STF e secar com um papelabsorvente.
6. Diluir o concentrado de coelho anti-rato a 1/5 000 num tampão de bloqueio e
adicionar 50 µla todas as cavidades da pl aca.
7. Incubar a 37 ºC durante 60 minutos num agitador orbital. Lavar três vezes
com STF e secar com um papelabsorvente.
8. Descongelar o OFD e, imediatamente antes da utilização, adicionar 12 µlde
peróxido de hidrogénio a 30 % por cada 25 mlde OFD. Adicionar 50 µla
todas as cavidades da placa. Aguardar que a cor se desenvolva durante apro-
ximadamente 10 minutos e parar a reacção com ácido sulfúrico 1 molar (50 µl
por cavidade). A cor deve-se desenvolver nas cavidades de controlo AMC e
nas cavidades que contêm soros sem anticorpos do VFC.
9. Examinar e registar as placas, ou visualmente ou com recurso a um leitor
espectrofotométrico.
ANÁLISE DOS RESULTADOS
Calcular o valor médio da densidade óptica (DO) a partir dos controlos AMC.
Esse valor representa o valor de inibição de 0 %. Os valores da densidade óptica
dos soros a testar são expressos em valores de inibição percentuais e calculados
por meio da fórmula seguinte:
Valores de inibi¸ c˜ao percentuais ¼100/C0
DO na presen¸ ca do soro de ensaio
DO na ausˆ encia do soro de ensaio/C2100
Os valores de inibição superiores a 40 % para uma diluição do soro a 1/4 são
considerados positivos. A leitura visual é possível visto uma inibição de 40 %
ser o mais baixo valor facilmente visível a olho nu.1994D0577 — PT — 01.05.2004 — 003.001 — 23
▼B
PREPARAÇÃO DO ANTIGÉNIO DO VFC PARA O MÉTODO ELISA
1. Lavar três vezes dez roux de células BHK-21 confluentes com um meio
«Eagle» isento de soro e infectar com o serotipo 1 do vírus da febre catarral
num meio «Eagle» isento de soro.
2. Incubar a 37 ºC e examinar diariamente o efeito citopatogénico (ECP).
3. Quando o ECP se tornar manifesto em 80 a 90 % da camada de células de
cada roux, recolher o vírus por agitação, destacando as células aderentes ao
vidro.
4. Centrifugar a 2 000 a 3 000 rpm (rotações por minuto) para agregar as
células.
5. Eliminar a fracção sobrenadante e colocar novamente as células em
suspensão em aproximadamente 30 mlde STF que contenha 1 % de
«Sarkosyl» e 2 ml de fluoreto de fenolmetilsulfonil (tampão lise). Isto
pode provocar uma gelificação das células, podendo ser adicionado mais
lise para reduzir esse efeito.
Nota: o fluoreto de fenolmetilsulfonil é uma substância perigosa; manipular
com muito cuidado.
6. Proceder à dissociação das células durante 60 segundos utilizando uma
sonda ultra-sónica a uma amplitude de 30 mícrons.
7. Centrifugar a 10 000 rpm durante 10 minutos.8. Recolher a fracção sobrenadante a + 4 ºC e colocar o agregado de células
remanescente em 10 a 20 mlde l ise.
9. Proceder à dissociação ultra-sónica e clarificar, recolher a fracção sobrena-
dante em cada fase, num totalde três vezes.
10. Reunir as fracções sobrenadantes e centrifugar a 24 000 rpm durante 120
minutos a uma temperatura de + 4 ºC sobre uma almofada de 5 ml de
sucrose a 40 % (p/v em STF) utilizando tubos de centrifugação Beckmann
de 30 mle um rotor SW 28.
11. Eliminar a fracção sobrenadante, escorrer cuidadosamente os tubos e
suspender novamente o agregado em STF por dissociação ultra-sónica.
Recolher o antigénio em alíquotas a − 70 ºC.
TITULAÇÃODO ANTIGÉNIO DO VFC PARA O MÉTODO ELISA
A titulação do antigénio da febre catarral para o método ELISA é feita pelo
método indirecto ELISA. Titulação de diluições a 1/2 do antigénio contra uma
diluição constante (1/50) de anticorpo monoclonal 3-17-A3. O protocolo é oseguinte:
TÉCNICA
1. Diluir o antigénio da VFC em STF ao longo de uma placa de microtítulo
numa série de diluições a 1/2 (50 µl/cavidade) utilizando uma pipeta de
canais múltiplos.
2. Incubar durante uma hora a 37 ºC num agitador orbital.
3. Lavar três vezes as placas com STF.
4. Adicionar 50 µl de anticorpo monoclonal 3-17-A3 (diluído a 1/50) a cada
uma das cavidades da placa de microtítulo.
5. Incubar durante uma hora a 37 ºC num agitador orbital.
6. Lavar três vezes as placas com STF.7. Adicionar 50 µl de globulina de coelho anti-rato conjugada com peroxidase
de rábano silvestre, diluída numa concentração pré-titulada óptima, a cada
cavidade da placa de microtítulo.
8. Incubar durante uma hora a 37 ºC num agitador orbital.
9. Adicionar um substrato e um cromogénio como indicado atrás. Parar a
reacção após 10 minutos por meio da adição de ácido sulfúrico 1 molar (50
µlpor cavidade).
No ensaio competitivo, o anticorpo monoclonal deve encontrar-se em excesso,
devendo por essa razão ser escolhida uma diluição de antigénio que se encontre
na curva de titulação (e não na zona de planalto) que resulte numa densidade
óptica de aproximadamente 0,8 após 10 minutos.1994D0577 — PT — 01.05.2004 — 003.001 — 24
▼B
Protocolo para uma prova de imunodifusão em ágar-gel para a detecção
dos anticorpos da doença hemorrágica epizoótica
A prova de imunodifusão em ágar-gel é realizada de acordo com o protocolo
seguinte:
MATERIAL E REAGENTES
1. Antigénio
Preparar o antigénio, precipitando num sistema de cultura de células
compatível com a multiplicação rápida serótipo(s) adequado(s) do vírus da
doença epizoótica hemorrágica. São recomendadas as células BHK ou Vero.
O antigénio está presente no fluido sobrenadante no termo do crescimento do
vírus, mas, para ser eficaz, a sua concentração deve ser 50 a 100 vezes supe-
rior. Esta concentração obtém-se através de qualquer método padrão de
concentração de proteínas; o vírus do antigénio pode ser inactivado por
meio da adição de 0,3 % (v/v) de beta-propiolactona.
2. Soro de controlo positivo conhecido
Utilizando o soro internacional de referência e antigénio, é produzido um
soro-tipo nacional, padronizado para obtenção de uma proporção óptima rela-
tivamente ao soro internacional de referência, liofilizado e utilizado como o
soro de controlo conhecido em cada ensaio.
3. Soro de ensaio.
TÉCNICA
1. Deitar agarose a 1 % preparada num tampão de borato ou de barbitolde
sódio, com um pH entre 8,5 e 9,0 numa placa de Petri a uma profundidade
mínima de 3,0 mm.
2. Cria-se no ágar uma estrutura de sete cavidades isentas de humidade, cada
uma com 5,0 mm de diâmetro. A estrutura consiste numa cavidade centrale
seis cavidades dispostas num círculo com um raio de 3 mm.
3. Preencher a cavidade centralcom o antigénio padrão. As cavidades circun-
dantes 2, 4 e 6 são preenchidas com soro positivo e as 1, 3 e 5 com o soro
de ensaio.
4. O sistema é colocado em incubação durante um período que pode ir até 72
horas à temperatura ambiente numa câmara húmida fechada.
INTERPRETAÇÃO
Um soro de ensaio é positivo caso resulte na formação de uma linha de precipi-
tina específica com o antigénio e numa linha de identidade total com o soro de
controlo. O soro de ensaio é negativo caso se não forme uma linha específica e
caso não deforme a linha correspondente ao soro de controlo. As placas de Petri
devem ser examinadas contra um fundo escuro e com uma iluminação indirecta.1994D0577 — PT — 01.05.2004 — 003.001 — 25