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►B REGULAMENTO (CEE) n.o 3942/92 DA COMISSÃO
de 22 de Dezembro de 1992
que estabelece o método de referência para a determinação do sitosterol e do estigmasterol no
butteroil
(JO L 399 de 31.12.1992, p. 29)
Alterado por:
Jornal Oficial
n.opágina data
►M1Regulamento(CEE)n.o2539/93daComissãode15deSetembrode1993 L233 1 16.9.1993
►M2Regulamento (CE) n.o175/1999 da Comissão de 26 de Janeiro de 1999 L20 22 27.1.1999
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REGULAMENTO (CEE) n.o 3942/92 DA COMISSÃO
de 22 de Dezembro de 1992
que estabelece o método de referência para a determinação do
sitosterol e do estigmasterol no butteroil
A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,
Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Euro-
peia,
Tendo em conta Regulamento (CEE) n.o804/68 do Conselho, de 27 de
Junho de 1968, que estabelece a organização comum de mercado nosector do leite e dos produtos lácteos(
1), com a última redacção que lhe
foi dada pelo Regulamento (CEE) n.o2071/92(2), e, nomeadamente, o
seu artigo 6.o,
Considerando que o butteroildeve ser submetido a marcação e que o
butteroilmarcado deve ser controlado em conformidade com o Regula-
mento (CEE) n.o3143/85 da Comissão(3), com a última redacção que
lhefoidadapeloRegulamento(CEE)n.o1264/92(4),e,nomeadamente,
os seus artigos 5.oe6 .o;
Considerando que o butteroildeve ser submetido a marcação e que os
produtos marcados devem ser controlados em conformidade com oRegulamento (CEE) n.
o570/88 da Comissão(5), com a última redacção
que lhe foi dada pelo Regulamento (CEE) n.o124/92(6), e, nomeada-
mente, os seus artigos 3.oe6 .o;
Considerando que o butteroildeve ser submetido a marcação e que o
butteroilmarcado deve ser controlado em conformidade com o Regula-
mento(CEE)n.o429/90daComissão(7),comaúltimaredacçãoquelhe
foi dada pelo Regulamento (CEE) n.o1264/92, e, nomeadamente, os
seus artigos 10.oe 11.o;
Considerando que a estrita observância das condições relativas à
marcação butteroilé essencial para anular o risco de utilizações não
autorizadas da manteiga subsidiada;
Considerando que, dada a importância da marcação para a correcta
aplicação dos regimes estabelecidos, é necessário definir métodoscomuns, aplicáveis do mesmo modo em toda a Comunidade, paradetecção de todos os marcadores exigidos por esses regimes; que essesmétodos devem, em especial garantir um tratamento idêntico de todosos operadores que tenham acesso aos mencionados regimes e eliminarcondições não equitativas de concorrência que, actualmente, podemdecorrer de diferentes métodos de análise nacionais;
Considerando que é difícil estabelecer simultaneamente os métodos de
referência para todos os marcadores; que o estabelecimento de ummétodo de referência para determinação do estigmasterol e do sitosterolnobutteroilconstitui um primeiro passo nesse sentido;
Considerando que as medidas previstas no presente regulamento estão
em conformidade com o parecer do Comité de Gestão do Leite e dosProdutos Lácteos,
(1)J On .oL 148 de 28. 6. 1968, p. 13.
(2)J On .oL 215 de 30. 7. 1992, p. 64.
(3)J On .oL 298 de 12. 11. 1985, p. 9.
(4)J On .oL 135 de 19. 5. 1992, p. 5.
(5)J On .oL 55 de 1. 3. 1988, p. 31.
(6)J On .oL 14 de 21. 1. 1992, p. 28.
(7)J On .oL 45 de 21. 2. 1990, p. 8.
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ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO:
Artigo 1.o
▼M1
O método de análise de referência para a determinação do teor deestigmasterol do butteroil,em conformidade com o artigo 6.
odo Regu-
lamento(CEE)n.o3143/85,oartigo6.odo►M2Regulamento(CE)n.o
2571/97 ◄ouoartigo11.odoRegulamento(CEE)n.o429/90,eparaa
determinaçãodoteorde β-sitosteroldo butteroil,emconformidadecom
o artigo 6.odo►M2Regulamento (CE) n.o2571/97 ◄, encontra-se
descrito em anexo.
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Obutteroilterá sido marcado correctamente se os resultados obtidos
obedeceremaoscritériosespecificadosnoponto8doanexodopresenteregulamento.
Artigo 2.
o
O presente regulamento entra em vigor no terceiro dia seguinte ao da
sua pubicação no Jornal Oficial das Comunidades Europeias .
É aplicável a partir de 1 de Fevereiro de 1993.
O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e
directamente aplicável em todos os Estados-membros.
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ANEXO
DETERMINAÇÃO DO SITOSTEROL OU DO ESTIGMASTEROL NO
BUTTEROIL POR CROMATOGRAFIA GASOSA EM COLUNA
CAPILAR
1. OBJE CTIVO ECAMPO DEAPLICAÇÃO
O método descreve um processo para a determinação quantitativa do
sitosterol ou do estigmasterol no butteroil. Considera-se o sitosterol
como sendo a soma do β-sitosterol e do 22-di-hidro- β-sitosterol; os
outros sitosteróis são considerados insignificantes. O método é aplicávelàs amostras recebidas nos termos dos Regulamentos (CEE) n.
o3143/85,
(CEE) n.o570/88 e (CEE) n.o429/90.
2. PRINCÍPIO
Obutteroilé saponificado com uma solução etanólica de hidróxido de
potássio e os insaponificáveis são extraídos com éter etílico.
Os esteróis são convertidos em éteres trimetilsilílicos e são analisados
por cromatografia gasosa em coluna capilar, tomando como referênciaum padrão interno de betulina.
3. APARELHAGEM
3.1. Balãodesaponificaçãode150mililitros,equipadocomumcondensador
de refluxo com juntas esmeriladas.
3.2. Ampolas de decantação de 500mililitros.3.3. Balões de 250mililitros.3.4. Balões de 250mililitros, para equilíbrio da pressão, ou similar, para
recolha do éter etílico evaporado.
3.5. Colunadevidrocom350mm×20mm,comtampadevidrosinterisado.3.6. Banho de água ou manta de aquecimento.3.7. Tubos de reacção de 2mililitros.3.8. Cromatógrafodefasegasosautilizávelcomcolunacapilar,quedisponha
de um sistema de divisão da amostra constituído por:
3.8.1. forno termostatizado para colunas, capaz de manter a temperatura com
uma precisão de ±1 °C;
3.8.2. câmara de injecção e vaporização de temperatura: regulável;3.8.3. detector de ionização de chama com conversor/amplificador;3.8.4. integrador/registador adequado ao conversor/amplificador (3.8.3).3.9. Coluna capilar de sílica fundida totalmente revestida com BP1 ou equi-
valente, com uma espessura uniforme de 0,25mícron; a coluna devepermitir a resolução dos picos dos derivados trimetilsilílicos do lanos-terol e do sitosterol — é adequada uma coluna com 0,2milímetro dediâmetro interno e 12metros de comprimento revestida de BP1.
3.10. Uma microsseringa para cromatografia gasosa com 1 µl de capacidade e
agulha cementada.
4. REAGENTES
Todos os reagentes devem ser de grau analítico reconhecido. A água
utilizada deve ser água destilada ou água de grau de pureza pelo menosequivalente.
4.1. Etanol, com um grau de pureza de, pelo menos, 95%.4.2. Solução de hidróxido de potássio, a 60%: dissolver 600gramas de
hidróxido de potássio (mínimo: 85%) em água e completar o volume,com água, até um litro.
4.3. Betulina, com um grau de pureza de, pelo menos, 99% (Sigma Chemi-
cals Ltd.).
4.3.1. Soluções de padrão interno: betulina em éter etílico (4.4).4.3.1.1. A concentração da solução de betulina utilizada na determinação do
sitosterol deve ser 1,0mg/ml;
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4.3.1.2. A concentração da solução de betulina utilizada na determinação do
estigmasterol deve ser 0,4mg/ml;
4.4. Éter etílico, pro-análise (isento de peróxidos ou resíduos).4.5. Sulfato de sódio anidro granular, previamente seco, a 102 °C, durante
duas horas.
4.6. Reagente de sililação, por exemplo TRI-SIL (fornecido por Pierce
Chemical CO., número de catálogo 49001), ou equivalente.(ATENÇÃO: o TRI-SIL é inflamável, tóxico, corrosivo e, possivel-mente, cancerígeno. O pessoal do laboratório deve estar familiarizadocom os cuidados a ter com o TRI-SIL e tomar as precauções apro-priadas).
4.7. Lanosterol.4.8. Sitosterol com um grau de pureza (P), conhecido, não inferior a 90%.
Nota 1:o grau de pureza dos padrões utilizados na calibração deve ser
determinado pelo método da normalização. Considerar que todos osesteróis presentes na amostra figuram no cromatograma, que a área totaldos picos representa 100% dos esteróis e que todos os esteróisproduzem a mesma resposta do detector. A linearidade do sistema deveser assegurada para a gama de concentrações utilizada.
4.8.1. Solução-padrão de sitosterol: preparar uma solução aproximadamente
0,5mg/ml (W1) de sitosterol (4.8) em éter etílico (4.4), com a precisãode 0,001mg/ml.
4.9. Estigmasterol com um grau de pureza (P), conhecido, não inferior a
90%.
4.9.1. Solução-padrão de estigmasterol: preparar uma solução aproximada-
mente0,2mg/ml(W1)deestigmasterol(4.9)eméteretílico(4.4),comaprecisão de 0,001mg/ml.
4.10. Solução para teste da resolução: preparar uma solução que contenha
0,05mg de lanosterol (4.7) e 0,5mg de sitosterol (4.8) por mililitro, eméter etílico (4.4).
5. TÉCNICA
5.1. Preparação das soluções-padrão para a cromatografia: o padrão interno
(4.3.1) deve ser adicionado à solução-padrão do esterol apropriado aomesmo tempo que for adicionado à amostra saponificada (5.2.2).
5.1.1. Solução-padrão cromatográfica de sitosterol: transferir um mililitro da
solução-padrão de sitosterol (4.8.1) para cada um de dois tubos dereação (3.7) e evaporar o éter etílico com uma corrente de azoto.Adicionar um mililitro da solução de padrão interno (4.3.1.1) e evaporaro éter etílico com uma corrente de azoto.
5.1.2. Solução-padrão cromatográfica de estigmasterol: transferir um mililitro
da solução-padrão de estigmasterol (4.9.1) para dois tubos de ensaio(3.7) e evaporar o éter etílico com uma corrente de azoto. Adicionar ummililitro do padrão interno (4.3.1.2) e evaporar o éter etílico com umacorrente de azoto.
5.2. Preparação dos insaponificáveis.5.2.1. Pesar, para um balão de 150mililitros (3.1), com a precisão de 1mili-
grama, aproximadamente um grama de butteroil(W2). Adicionar
50mililitros de etanol (4.1) e 10mililitros da solução de hidróxido depotássio (4.2). Adaptar o condensador de refluxo e aquecer a cerca de75°C,durante30minutos.Retirarocondensadorearrefecerobalãoaté
à temperatura ambiente, aproximadamente.
5.2.2. Se se pretender determinar o sitosterol, adicionar ao balão 1,0mililitro
da solução de padrão interno (4.3.1.1) ou, se se pretender determinar oestigmasterol, de padrão interno (4.3.1.2). Homogeneizar completa-mente. Transferir quantitativamente o conteúdo do balão para umaampola de decantação de 500mililitros (3.2), procedendo a lavagenscom 50mililitros de água e 250mililitros de éter etílico (4.4). Agitar aampola de decantação vigorosamente, durante dois minutos, e deixar asfases separarem-se. Escoar a fase aquosa inferior e proceder à lavagemda fase etérea, agitando a ampola com quatro alíquotas sucessivas de100mililitros de água.
Nota 2:para evitar a formação de uma emulsão é essencial que as duas
primeiras lavagens com água sejam efectuadas com precaução (proce-dendo a 10 inversões). Na terceira lavagem, pode-se agitar vigorosa-mente durante 30 segundos. Se se formar uma emulsão, esta pode ser
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eliminada através da adição de 5-10mililitros de etanol. Se se adicionar
etanol, é essencial proceder a mais duas lavagens vigorosas com água.
5.2.3. Passar a fase etérea, límpida e isenta de sabões, numa coluna de vidro
(3.5), contendo 30gramas de sulfato de sódio anidro (4.5). Recolher afase etérea num balão de 250mililitros (3.3). Introduzir um gránuloregularizador de ebulição e evaporar quase até à secura num banho deágua ou utilizando uma manta de aquecimento; recolher os solventesevaporados.
Nota 3:se o extracto que contém a amostra for levado à secura total, a
temperaturas muito elevadas, podem ocorrer perdas de esteróis.
5.3. Preparação dos éteres trimetilsilílicos.5.3.1. Transferir a solução etérea remanescente do balão para um tubo de
reação de dois mililitros (3.7), com dois mililitros de éter etílico, eevaporar o éter com uma corrente de azoto. Lavar o balão com maisduas alíquotas de dois mililitros de éter etílico, transferindo-as para otubo de ensaio e evaporando o éter, cada uma das vezes, com umacorrente de azoto.
5.3.2. Proceder à sililação da amostra, adicionando um mililitro de TRI-SIL
(4.6). Tapar o tubo de reacção e agitar vigorosamente, para dissolver.No caso de a dissolução ser incompleta, aquecer a 65-70 °C. Deixar em
repousodurante,pelomenos,cincominutosantesdeprocederàinjecçãono cromatógrafo de fase gasosa. Proceder à sililação dos padrões domesmo modo que as amostras. Proceder à sililação da solução para testeda resolução (4.10) do mesmo modo que as amostras.
Nota 4:a sililação deve ser efectuada na ausência de água. A sililação
incompleta da betulina é revelada pela presença de um segundo pico,próximododabetulina.Apresençadeetanolduranteasililaçãointerferenesta reacção e poderá ser o resultado de lavagem inadequada na etapade extracção. Se este problema persistir, poderá ser acrescentada umaquinta lavagem, com agitação vigorosa durante 30 segundos, à etapa deextracção.
5.4. Análise por cromatografia em fase gasosa5.4.1. Selecção das condições operatórias
Montar o cromatógrafo de fase gasosa de acordo com as intruções do
fabricante.
Apresentam-se a seguir condições operatórias indicativas:
—temperaturadacoluna 265 °C,
—temperaturadoinjector 280 °C,
—temperaturadodetector 300 °C,
—caudaldogás-vector 0,6ml/minuto,—pressãodehidrogénio 84kPa,—pressãodear 155kPa,—divisãodaamostra:10:1a50:1;estarelaçãodeveseroptimizada
emfunçãodasinstruçõesdofabricantee,aseguir,deve-seasseguraralinearidadedarespostadodetectoremtodaagamadeconcentra-çõesutilizada.
Nota 5:é de especial importância que o injector seja limpo com regula-
ridade.
— volume injectado: 1 µl de solução (éter trimetilsilílico).
Deixar que o sistema atinja o equilíbrio e obter uma resposta suficiente-
mente estável antes de começar as análises.
As condições indicadas podem ser modificadas em função das caracte-
rísticas da coluna e do cromatógrafo de fase gasosa, de modo a obtercromatogramas que obedeçam às seguintes condições:
— o pico do sitosterol deve-se distinguir claramente do pico do lanos-
terol. A figura 1mostra o cromatograma típico que deve ser obtidocom a solução para teste da resolução (4.10), depois de submetida asililação,
— os tempos de retenção relativos dos esteróis que se indicam a seguir
devem ser, aproximadamente:
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Colesterol 1,0
Estigmasterol 1,3Sitosterol 1,5Betulina 2,5
— o tempo de retenção da betulina deve ser, aproximadamente, de
24minutos.
5.4.2. Execução da análise
Injectar 1 µl da solução-padrão sililada (estigmasterol ou sitosterol) e
ajustar os parâmetros de calibração do integrador.
Injectar novo volume de 1 µl da solução-padrão sililada para determinar
os factores de resposta da betulina.
Injectar 1 µl da solução-amostra sililada e medir as áreas dos picos.
Intervalar cada série de amostras com a injecção dos padrões. Comoorientação, proceder a seis injecções de amostra em cada série limitadapelos padrões.
Nota 6:a integração do pico do estigmasterol deve incluir as caudas
respectivas, definidas pelos pontos 1 ,2e3d a figura 2b.Ao calcular o
total de sitosterol, incluir na integração do pico do sitosterol a área dopico do 22-di-hidro-beta-sitosterol (estigmastanol), que é eluído imedia-tamente a seguir ao sitosterol (ver a figura 3b).
6. CÁLCULO DOS RESULTADOS
6.1. Determinar as áreas dos picos do esterol e da betulina nos padrões que
delimitam cada série de amostras e calcular R
1:
R1=área média dos picos do esterol no padrão
área média dos picos da betulina no padrão
Determinar as áreas dos picos do esterol (estigmasterol ou sitosterol) e
da betulina da amostra e calcular R2:
R2=área do pico na amostra
área do pico da betulina na amostra
W1= massa (em mg) de esterol contida em um mililitro de solução-
-padrão (4.8.1 ou 4.9.1).
W2= massa da amostra (em g) (5.2.1).
P = grau de pureza do esterol padrão (4.8 ou 4.9).
Teor de esterol da amostra em mg/kg =R2
R1×W1
W2×P×1 0 .
7. PRECIÃO DO MÉTODO
7.1. Repetibilidade7.1.1. Estigmasterol
A diferença entre os resultados de duas determinações, efectuadas
imediatamente uma a seguir à outra pelo mesmo operador, utilizando omesmo equipamento e testando a mesma amostra, não deve exceder10,2mg/kg.
7.1.2. Sitosterol
A diferença entre os resultados de duas determinações, efectuadas
imediatamente uma a seguir à outra pelo mesmo operador, utilizando omesmo equipamento e testando a mesma amostra, não deve exceder3,6% da média das determinações.
7.2. Reprodutibilidade7.2.1. Estigmasterol
A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas por
operadoresdelaboratóriosdiferentes,utilizandoequipamentodiferenteetestando a mesma amostra, não deve exceder 25,3mg/kg.
7.2.2. Sitosterol
A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas por
operadoresdelaboratóriosdiferentes,utilizandoequipamentodiferentee
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testando o mesmo material, não deve exceder 8,9% da média dasdeterminações.
7.3. Origem dos dados relativos à precisão
Os dados relativos à precisão foram determinados com base num testeefectuadoem1991,queenvolveunovelaboratórioseseisamostras(trêsduplicados em teste cego) para o estigmasterol de seis amostras (trêsduplicados em teste cego) para o sitosterol.
8. TOLERÂNCIAS
▼
M28.1. Devem ser recolhidas três amostras do produto marcado, por forma a
verificar a correcção da sua marcação.
▼B8.2. Estigmasterol8.2.1. A taxa de incorporação de estigmasterol é de 150gramas de estigmas-
terol com grau de pureza de, pelo menos, 95% por tonelada de butte-
roil, isto é, 142,5mg/kg; ou 170gramas de estigmasterol com grau de
pureza de, pelo menos, 85% por tonelada de butteroil, isto é, 144,5mg/
/kg
▼
M28.2.2. Os resultados das três amostras obtidas com a análise do produto serão
utilizados para comprovar a taxa e a homogeneidade de incorporação do
marcador e o menor destes resultados será comparado com os limites
que se seguem [tendo em conta a diferença crítica para um nível deprobabilidade de 95% (CrD95)]:— 120,0 mg/kg (95% da taxa mínima de incorporação no que respeita
ao estigmasterol com um grau de pureza de 95%),
— 122,0 mg/kg (95% da taxa mínima de incorporação no que respeita
ao estigmasterol com um grau de pureza de 85%),
— 84,0 mg/kg (70% da taxa mínima de incorporação no que respeita
ao estigmasterol com um grau de pureza de 95%),
— 86,0 mg/kg (70% da taxa mínima de incorporação no que respeita
ao estigmasterol com um grau de pureza de 85%).
Deve usar-se a concentração de marcador na amostra que apresente oresultado mais baixo e uma interpolação respectivamente entre 120,0mg/kg e 84,0 mg/kg, ou entre 122,0 mg/kg e 86,0 mg/kg.
▼
B8.3. Sitosterol8.3.1. A taxa de incorporação de sitosterol é de 600gramas de sistosterol com
grau de pureza de, pelo menos, 90% por tonelada de butteroil, isto é,
540mg/kg.
▼
M28.3.2. Os resultados das três amostras obtidas com a análise do produto serão
utilizados para comprovar a taxa e a homogeneidade de incorporação do
marcador e o menor destes resultados será comparado com os limites
que se seguem [tendo em conta a diferença crítica para um nível deprobabilidade de 95% (CrD95)]:— 486,0 mg/kg (95% da taxa mínima de incorporação no que respeita
ao sitosterol com um grau de pureza de 90%),
— 358,0 mg/kg (70% da taxa mínima de incorporação no que respeita
ao sitosterol com um grau de pureza de 90%).
Deve usar-se a concentração de marcador na amostra que apresente oresultado mais baixo e uma interpolação entre 486,0 mg/kg e 358,0mg/kg.
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Figura 1: Cromatograma da solução para teste da resolução.
É preferível uma resolução completa, isto é, o traçado do pico do
lanosterol deve voltar à linha de base antes de iniciar a definição dopico do sitosterol, se bem que uma resolução incompleta seja admis-sível.

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Figura 2a:
Padrão de estigmasterol

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Figura 2b
Amostar de butteroildesnaturada com estigmasterol
NOTA:a integração do pico do estigmasterol deve incluir as caudas respectivas,
definida pelos pontos 1, 2 e 3.
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Figura 3a:
Padrão de β-sitosterol

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▼B
Figura 3b:
Amostra de butteroildesnaturada com β-sitosterol
NOTA:é frequente o β-sitosterol conter uma impureza (identificada como estig-
mastanol)queéeluídaimediatamenteaseguirao β-sitosterol.Aocalcularototal
deβ-sitosterol presente devem-se somar as áreas dos dois picos.