10.

O anexo IV é substituído pelo seguinte texto e pelo seguinte gráfico: «ANEXO IV DETERMINAÇÃO DO TEOR DE CERAS POR INTERMÉDIO DE CROMATOGRAFIA GÁS-LÍQUIDO COM COLUNA CAPILAR 1. OBJECTIVO O presente método descreve um processo para a determinação do teor de ceras de algumas gorduras e óleos, nas condições de ensaio. O método pode ser utilizado, em particular, para distinguir o azeite obtido por pressão do azeite obtido por extracção (óleo de bagaço de azeitona). 2. PRINCÍPIO Após a adição de um padrão interno adequado, a gordura ou o óleo em causa é fraccionado por cromatografia numa coluna de silicagel hidratada. Recolhe-se a fracção eluída em primeiro lugar, nas condições de ensaio (fracção cuja polaridade é inferior à polaridade dos trigliceridos), procedendo-se à análise directa por cromatografia gás-líquido com coluna capilar. 3. EQUIPAMENTO 3.1. Erlenmeyer de 25 ml. 3.2. Coluna de vidro para cromatografia, com 15 mm de diâmetro interno e 30 a 40 cm de altura. 3.3. Aparelho de cromatografia em fase gasosa com coluna capilar, equipado com um sistema para a introdução directa da amostra na coluna, constituído por: 3.3.1. Forno com termóstato para as colunas, susceptível de manter a temperatura desejada com uma precisão de ± 1 °C. 3.3.2. Injector a frio para introdução directa na coluna. 3.3.3. Detector de ionização de chama e convertedor-amplificador. 3.3.4. Registador-integrador adequado para funcionamento com o convertedor-amplificador (ponto 3.3.3), com tempo de resposta não superior a um segundo e velocidade do papel variável. 3.3.5. Coluna capilar de vidro ou sílica fundida, com ►C1 10 a 15 m ◄ de comprimento e 0,25 a 0,32 mm de diâmetro interno, revestida internamente com líquido SE-52, SE-54 ou equivalente, numa espessura uniforme compreendida entre 0,10 e 0,30 μm. 3.4. Microsseringa de 10 μl adequada para injecção directa na coluna, com agulha de aço cementado. 4. REAGENTES 4.1. Silicagel 70-230 mesh, art. 7754 Merck. Colocar a silicagel numa mufla a 500 °C, durante quatro horas. Após arrefecimento, adicionar 2 % de água. Agitar bem, de modo a homogeneizar. Conservar ao abrigo da luz durante pelo menos 12 horas antes da utilização. 4.2. n-hexano para cromatografia. 4.3. Éter etílico para cromatografia. 4.4. n-heptano para cromatografia. 4.5. Solução padrão de araquidato de laurilo, a 0,1 % (m/v) em hexano (padrão interno). 4.6. Gás de arrastamento: hidrogénio, com um grau de pureza adequado para cromatografia gás-líquido. 4.7. Gases auxiliares: — hidrogénio, com um grau de pureza adequado para cromatografia gás-líquido, — ar, com um grau de pureza adequado para cromatografia gás-líquido. 5. PROCEDIMENTO 5.1. Separação da fracção que contém as ceras. 5.1.1. Preparação da coluna cromatográfica. Suspender 15 g de silicagel hidratada a 2 % em n-hexano anidro e introduzir na coluna. Deixar assentar espontaneamente e completar a operação por recurso a um vibrador eléctrico, de modo a tornar mais homogénea a camada cromatográfica. Fazer passar 30 ml de n-hexano para remover eventuais impurezas. 5.1.2. Cromatografia em coluna Pesar rigorosamente 500 mg de amostra num Erlenmeyer de 25 ml e adicionar uma quantidade adequada de padrão interno, em função do teor de ceras previsto. A título de exemplo, juntar 0,1 mg de araquidato de laurilo no caso de azeite e 0,25 a 0,50 mg no caso de óleo de bagaço de azeitona. Transferir a amostra para a coluna cromatográfica, preparada de acordo com o ponto 5.1.1, com o auxílio de duas porções de 2 ml de n-hexano. Deixar fluir o solvente até 1 mm acima da camada de silicagel. Iniciar a eluição cromatográfica, recolhendo 140 ml da mistura n-hexano/éter etílico na proporção de 99:1, de acordo com um fluxo de cerca de 15 gotas por cada 10 segundos (2,1 ml/minuto). Evaporar a fracção resultante num evaporador rotativo, até à eliminação de quase todo o solvente; remover os últimos 2 ou 3 ml do mesmo com o auxílio de uma corrente de azoto de fluxo reduzido e adicionar 10 ml de n-heptano. 5.2. Análise por cromatografia gás-líquido. 5.2.1. Operações preliminares; acondicionamento da coluna. 5.2.1.1. Instalar a coluna no cromatógrafo gás-líquido, ligando uma das extremidades ao sistema de injecção directa na coluna e a outra extremidade ao detector. Efectuar o controlo geral do sistema cromatográfico (operacionalidade dos circuitos de gases, eficiência do detector e do registador, etc.). 5.2.1.2. No caso de a coluna ser utilizada pela primeira vez, é aconselhável proceder ao seu acondicionamento. Fazer passar um fluxo ligeiro de gás através da coluna, ligando em seguida o sistema. Aquecer gradualmente até uma temperatura superior em pelo menos 20 °C à temperatura de trabalho (nota). Manter esta temperatura durante pelo menos duas horas, regulando seguidamente o aparelho para as condições de trabalho (regular o fluxo de gás, acender a chama, ligar o registador electrónico, regular a temperatura do forno para a coluna, regular o detector, etc.). Registar o sinal obtido com uma sensibilidade pelo menos dupla da sensibilidade prevista para a execução da análise. A linha de base deve apresentar-se linear e isenta de picos de qualquer tipo, não devendo apresentar desvios. A existência de um desvio rectilíneo negativo indica que as ligações da coluna não foram efectuadas de um modo correcto; a existência de um desvio positivo indica que a coluna não foi acondicionada de um modo adequado. a temperatura de acondicionamento deve, em todos os casos, ser inferior em pelo menos 20 °C à temperatura máxima especificada para o eluente utilizado. 5.2.2. Escolha das condições de trabalho. 5.2.2.1. As condições de trabalho são, em geral, as seguintes: — temperatura da coluna: no início, 80 °C, aumentando à taxa de 30 °C/minuto até 120 °C e, em seguida, programada para aumentar à taxa de 5 °C/minuto até 340 °C; — temperatura do detector: 350 °C, — velocidade linear do gás de arrastamento (hidrogénio): 20 a 35 cm/segundo, — sensibilidade do aparelho: 4 a 16 vezes a atenuação mínima, — sensibilidade do registador: 1 a 2 mV, a partir do início da escala, — velocidade do papel: 30 cm/hora, — quantidade injectada: 0,5 a 1 μl de solução. Estas condições podem ser alteradas em função das características da coluna e do cromatógrafo (de modo a obter cromatogramas que satisfaçam as condições seguintes: — o tempo de retenção do padrão interno C32 deverá ser de 25 ± dois minutos e o pico mais representativo correspondente às ceras deverá situar-se entre 60 e 100 % do início da escala). 5.2.2.2. Os parâmetros de integração dos picos devem ser determinados de modo a obter uma estimativa correcta das áreas dos picos com interesse. 5.2.3. Execução da análise 5.2.3.1. Efectuar uma toma de 1 μl de solução com a microsseringa de 10 μl; manejar o êmbolo de modo a que a agulha não contenha nenhuma porção de amostra. Introduzir a agulha no sistema de injecção e injectar rapidamente após um a dois segundos. Retirar cuidadosamente a agulha após cerca de cinco segundos. 5.2.3.2. Efectuar o registo até à eluição completa das ceras. A linha de base deve satisfazer sempre as condições requeridas (ponto 5.2.1.2.). 5.2.4. Identificação dos picos A identificação dos picos é efectuada com base nos tempos de retenção que são comparados com os tempos de retenção conhecidos de misturas de ceras analisadas em condições idênticas. Na figura 1 apresenta-se um cromatograma relativo às ceras de um azeite virgem. 5.2.5. Análise quantitativa 5.2.5.1. Por recurso ao integrador, determinar as áreas dos picos correspondentes ao padrão interno e aos ésteres alifáticos de C40 a C46. 5.2.5.2. Determinar o teor de cada um dos ésteres, expresso em mg/kg de gordura, através da fórmula: éster (mg/kg) = Ax · ms · 100As· m em que: Ax = área do pico de cada éster; As = área do pico de araquidato de laurilo; ms = massa de araquidato de laurilo adicionada, expressa em mg; m = massa de amostra tomada para análise, expressa em g. 6. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS Apresentar os teores das várias ceras, bem como a soma dos teores expressos em mg/kg de gordura. APÊNDICE Determinação da velocidade linear do gás Injectar 1 a 3 μl de metano (ou propano) no cromatógrafo, regulado para as condições normais de trabalho, e medir o tempo requerido pelo gás para percorrer a coluna, desde o momento da injecção até ao registo do respectivo pico (tM). A velocidade linear, expressa em centímetros por segundo, é dada por L/tM, sendo L o comprimento da coluna, expresso em centímetros, e tM o tempo de retenção, expresso em segundos.»