1990L0426 — PT — 23.02.2002 — 007.001 — 1
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►BDIRECTIVADO CONSELHO
de 26 de Junho de 1990
relativa às condições de polícia sanitária que regem a circulação de equídeos e as importações de
equídeos provenientes de países terceiros
(90/426/CEE)
(JO L 224 de 18.8.1990, p. 42)
Alterada por:
Jornal Oficial
n.opágina data
►M1Directiva 90/425/CEE do Conselho de 26 de Junho de 1990 L 224 29 18.8.1990
►M2Directiva 91/496/CEE do Conselho de 15 de Julho de 1991 L 268 56 24.9.1991
►M3Decisão 92/130/CEE da Comissão de 13 de Fevereiro de 1992 L 47 26 22.2.1992
►M4Directiva 92/36/CEE do Conselho de 29 de Abril de 1992 L 157 28 10.6.1992
►M5Decisão 2001/298/CE da Comissão de 30 de Março de 2001 L 102 63 12.4.2001
►M6Decisão 2002/160/CE da Comissão de 21 de Fevereiro de 2002 L 53 37 23.2.2002
Alterada por:
►A1Acto de Adesão da Áustria, da Finlândia e da Suécia C 241 21 29.8.1994
(adaptado pela Decisão 95/1/CE, Euratom, CECA do Conselho) L 1 1 1.1.1995
Rectificada por:►
C1Rectificação, JO L 296 de 27.10.1990, p. 66 (90/426/CEE)
▼B
DIRECTIVADO CONSELHO
de 26 de Junho de 1990
relativa àscondiçõesdepolícia sanitáriaqueregem acirculação de
equídeos e as importações de equídeos provenientes de países
terceiros
(90/426/CEE)
O CONSELHO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,
Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Euro-
peia e, nomeadamente, o seu artigo 43.o,
Tendo em conta a proposta da Comissão (1),
Tendo em conta o parecer do Parlamento Europeu (2),
Tendo em conta o parecer do Comité Económico e Social (3),
Considerando que os equídeos, enquanto animais vivos, são incluídos
na lista dos produtos enumerados no anexo II do Tratado;
Considerando que, a fim de assegurar um desenvolvimento racional da
produção de equídeos e de assim aumentar a produtividade do sector, é
necessário fixar, a nível comunitário, as regras que regem a circulação
de equídeos entre Estados-membros;
Considerando que a criação de equídeos, em especial de cavalos, se
integra, geralmente, no âmbito das actividades agrícolas; que a mesmaconstitui uma fonte de rendimentos para uma parte da populaçãoagrícola;
Considerando que é conveniente eliminar as disparidades existentes nos
Estados-membros em matéria de polícia sanitária, de modo a favoreceras trocas intracomunitárias de equídeos;
Considerando que, para permitir um desenvolvimento harmonioso das
trocas intracomunitárias, é necessário definir um regime comunitárioaplicável às importações provenientes de países terceiros;
Considerando que é conveniente, no que se refere aos equídeos regis-
tados acompanhados de um documento de identificação, regularigualmente as condições da sua circulação no território nacional;
Considerando que, para participar nas trocas, os equídeos devem satis-
fazer certos requisitos de polícia sanitária destinados a evitar a
propagação de doenças contagiosas; que se afigura ser particularmente
oportuno prever uma possível regionalização das medidas restritivas;
Considerando que, com o mesmo objectivo, é igualmente conveniente
fixar as condições relativas ao transporte;
Considerando que, para garantir o respeito dos requisitos previstos, se
revela necessário prever a emissão de um certificado sanitário por um
veterinário oficial, destinado a acompanhar os equídeos até ao local dedestino;
Considerando que a organização e o seguimento a dar aos controlos
efectuados pelo Estado-membro de destino e as medidas de salva-guarda a aplicar devem ser fixados no âmbito da regulamentação aadoptar para os controlos veterinários nas trocas intracomunitárias deanimais vivos na perspectiva da realização do mercado interno;
Considerando que é conveniente prever a possibilidade de controlos da
Comissão; que esses controlos devem ser efectuados em colaboração
com as autoridades nacionais competentes;
Considerando que a definição de um regime comunitário aplicável às
importações provenientes de países terceiros pressupõe o estabeleci-1990L0426 — PT — 23.02.2002 — 007.001 — 2
(1)J O n .oC 327 de 30. 12. 1989, p. 61.
(2)J O n .oC 149 de 18. 6. 1990.
(3)J O n .oC 62 de 12. 3. 1990, p. 46.
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mento de uma lista de países terceiros, ou de partes de países terceiros,
a partir dos quais podem ser importados equídeos;
Considerando que a escolha destes países deve ser baseada em critérios
de ordem geral, tais como o estado sanitário do gado, a organização eos poderes dos serviços veterinários e a regulamentação sanitária emvigor;
Considerando que além disso importa não autorizar as importações de
equídeos provenientes de países infectados, ou indemnes desde há
pouco tempo, por doenças contagiosas dos animais que apresentamum risco para o efectivo da Comunidade; que o mesmo se aplica àsimportações provenientes de países terceiros onde é efectuada vaci-nação contra essas doenças;
Considerando que as condições gerais aplicáveis às importações prove-
nientes de países terceiros devem ser completadas por condiçõesespeciais, estabelecidas em função da situação sanitária de cada umdos mesmos; que o carácter técnico e a diversidade dos critérios emque se devem basear estas condições especiais exigem para a sua defi-
nição o recurso a um procedimento comunitário flexível e rápido, no
decurso do qual se verifique uma estreita colaboração entre a Comissãoe os Estados-membros;
Considerando que, quando da importação de equídeos, a apresentação
de um certificado conforme com um modelo comum constitui um dos
meios eficazes para verificar a aplicação da regulamentação comuni-
tária; que esta regulamentação pode incluir disposições especiaissusceptíveis de variar consoante o país terceiro e que esse facto deveser tomado em consideração ao estabelecer-se os modelos do certifi-cado;
Considerando que é conveniente encarregar peritos veterinários da
Comunidade da verificação, nomeadamente nos países terceiros, documprimento dos requisitos da presente directiva;
Considerando que o controlo da importação deve incidir sobre a origem
e o estado sanitário dos equídeos;
Considerando que as regras gerais aplicáveis aos controlos a efectuar
aquando da importação devem ser definidos num contexto global;
Considerando que qualquer Estado-membro deve ter a possibilidade de
proibir imediatamente as importações provenientes de um país terceiro
sempre que estas possam apresentar um perigo para a saúde dos
animais; que, nesse caso é necessário, sem prejuízo de eventuais alte-rações da lista dos países autorizados a exportar para a Comunidade,assegurar imediatamente a coordenação da atitude dos Estados--membros em relação a esse país terceiro;
Considerando que as disposições da presente directiva deverão ser
revistas no âmbito da realização do mercado interno;
Considerando que é necessário prever um procedimento que institua
uma cooperação estreita e eficaz entre os Estados-membros e a
Comissão no seio do Comité Veterinário Permanente,
ADOPTOU A PRESENTE DIRECTIVA:
CAPÍTULO I
Disposições gerais
Artigo 1.o
A presente directiva define as condições de polícia sanitária que regem
a circulação de equídeos entre Estados-membros e as importações deequídeos provenientes de países terceiros.1990L0426 — PT — 23.02.2002 — 007.001 — 3
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Artigo 2.o
Para efeitos da presente directiva, entende-se por:
a) «Exploração»: o estabelecimento agrícola ou de treino, a cavalariça
ou, de um modo geral, qualquer local ou instalação em que osequídeos são mantidos ou criados da forma habitual, qualquer queseja a sua utilização;
b) «Equídeos»: os animais domésticos ou selvagens das espécies
equina — incluindo as zebras — e asinina ou animais resultantesdos seus cruzamentos;
c) «Equídeos registados»: qualquer equídeo registado, tal como defi-
nido na Directiva 90/427/CEE (
1), identificado através de um
documento de identificação emitido pela autoridade de criação ou
qualquer outra autoridade competente do país de origem do equídeo
responsável pelo livro genealógico ou pelo registo da raça desseequídeo ou qualquer associação ou organização internacionalresponsável por cavalos para concursos ou corridas;
d) «Equídeos de talho»: os equídeos destinados a serem conduzidos ao
matadouro, directamente ou após passagem por um mercado ou
centro de concentração aprovados, para aí serem abatidos;
e) «Equídeos de criação e de rendimento»: os equídeos que não os
mencionados nas alíneas c) e d);
f) «Estado-membro ou país terceiro indemne de peste equina»: qual-
quer Estado-membro ou país terceiro em cujo território nenhuma
evidência clínica, serológica (nos equídeos não vacinados) ou epide-miológica permitiu constatar a existência de peste equina durante osúltimos dois anos e no qual a vacinação contra esta doença não foiefectuada durante os últimos doze meses;
g) «Doenças de declaração obrigatória»: as doenças mencionadas no
anexo A;
h) «Veterinário oficial»: o veterinário designado pela autoridade
central competente do Estado-membro ou de um país terceiro;
i) «Admissão temporária»: o estatuto de um equídeo registado prove-
niente de um país terceiro e autorizado a permanecer no território da
Comunidade durante um período inferior a noventa dias, a fixar pelaComissão de acordo com o procedimento previsto no artigo 24.
oem
função da situação sanitária do país de origem.
CAPÍTULO II
Regras para a circulação de equídeos
Artigo 3.o
Um Estado-membro apenas autorizará a circulação de equídeos regis-
tados no seu território e apenas expedirá equídeos para o território de
outro Estado-membro se estes preencherem as condições previstas nosartigos 4.
oe5 .o
Todavia, as autoridades competentes dos Estados-membros de destinopodem conceder derrogações gerais ou limitadas para a circulação deequídeos:
— que sejam montados ou conduzidos, para fins desportivos ou recrea-
tivos, em estradas que se encontrem na proximidade das fronteiras
internas da Comunidade,
— que participem em manifestações culturais ou afins ou em activi-
dades organizadas por organismos locais habilitados situados na
proximidade das fronteiras internas da Comunidade,
— destinados exclusivamente ao pasto ou ao trabalho, a título
temporário, na proximidade das fronteiras internas da Comunidade.
Os Estados-membros que fizerem uso desta autorização deverão
informar a Comissão do teor das derrogações concedidas.1990L0426 — PT — 23.02.2002 — 007.001 — 4
(1)J O n .oL 224 de 18. 8. 1990, p. 55.
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Artigo 4.o
1. Os equídeos não devem apresentar qualquer sintoma clínico de
doença aquando da inspecção. A inspecção deve ser efectuada nasquarenta e oito horas anteriores ao embarque ou carregamento dosequídeos. Contudo, para os equídeos registados, esta inspecção, semprejuízo do artigo 6.
o, só é exigida no caso das trocas intracomunitárias.
2. Sem prejuízo dos requisitos previstos no n.o5 para as doenças de
declaração obrigatória, o veterinário oficial deve, durante a inspecção,verificar que nenhum facto — inclusive a partir das declarações do
proprietário ou do criador — permite concluir que os equídeos esti-
veram em contacto com equídeos que apresentem uma infecção oudoença contagiosa no decurso dos quinze dias anteriores à inspecção.
3. Os equídeos não devem ser destinados a eliminação no âmbito de
um programa de erradicação de uma doença contagiosa aplicado numEstado-membro.
4. Os equídeos devem ser objecto de uma identificação que deverá
ser efectuada:
i) No que se refere aos cavalos registados, através do documento de
identificação previsto na Directiva 90/427/CEE (
1), documento esse
que deve designadamente comprovar a observância dos n.os5e6d o
artigo 5.oA validade desse documento deverá ser suspensa pelo
veterinário oficial enquanto durarem as proibições previstas no n.o5
ou no artigo 5.oO documento deverá ser restituído à autoridade que
o emitiu após o abate do cavalo registado. As regras de aplicaçãodesta alínea serão adoptadas pela Comissão segundo o procedimentoprevisto no artigo 24.
o;
ii) No que se refere aos equídeos de criação e de rendimento, segundo
um método de identificação a determinar pela Comissão, segundo oprocedimento previsto no artigo 24.
o
Até se iniciar a aplicação desse método, continuarão a ser aplicáveis
os métodos de identificação nacionais oficialmente aprovados, na
condição de serem notificados à Comissão e aos outros Estados--membros no prazo de três meses a contar da data de adopção dapresente directiva.
5. Para além do requisito previsto no artigo 5.
o, os equídeos não
devem provir de uma exploração que seja objecto de uma das seguintesmedidas de proibição:
a) Se nem todos os animais das espécies sensíveis à doença presentes
na exploração tiverem sido abatidos ou mortos, o período de proi-bição aplicado à exploração de origem deverá ser pelo menos igual:
— no caso de equídeos suspeitos de tripanosomose, a seis meses a
partir da data do último contacto ou possibilidade de contacto
com um equídeo doente. Todavia, se se tratar de um animal de
cobrição, a proibição deve ser aplicada até à sua castração,
— em caso de mormo ou de encefalomielite equina, a seis meses a
partir da data em que os equídeos atingidos tiverem sido elimi-
nados,
— em caso de anemia infecciosa, ao período necessário para que,
após a data de eliminação dos equídeos atingidos, os restantesanimais reagissem negativamente a dois testes de Coggins efec-tuados com um intervalo de três meses,
— a seis meses a partir do último caso de estomatite vesicular,
— a um mês, a partir do último caso de raiva verificado,
— a quinze dias a partir do último caso de carbúnculo bacteridiano
verificado.
b) Se todos os animais das espécies sensíveis presentes na exploração
tiverem sido abatidos ou mortos e as instalações desinfectadas, operíodo de proibição é de trinta dias, a contar da data em que osanimais foram eliminados e as instalações desinfectadas, excepto1990L0426 — PT — 23.02.2002 — 007.001 — 5
(1)J O n .oL 224 de 18. 8. 1990, p. 55.
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no caso do carbúnculo bacteridiano, para o qual o período de proi-
bição é de quinze dias.
As autoridades competentes podem estabelecer derrogações a estas
medidas de proibição para os hipódromos e terrenos de corrida e infor-
marão a Comissão sobre a natureza das derrogações concedidas.
6. No caso de um Estado-membro estabelecer ou ter estabelecido
um programa facultativo ou obrigatório de luta contra uma doença a
que os equídeos sejam sensíveis, pode submeter esse programa àComissão, nos seis meses seguintes à notificação da presente directiva,indicando, nomeadamente:
— a situação da doença no seu território,
— a justificação do programa, tendo em conta a importância da doença
e as suas vantagens custos/benefícios,
— a zona geográfica em que o programa vai ser aplicado,
— os diferentes estatutos aplicáveis aos estabelecimentos, as normas
que devem ser respeitadas para cada espécie e os processos de
testagem,
— os processos de controlo do programa,
— as ilações a tirar da perda do estatuto da exploração, seja por que
motivo for,
— as medidas a tomar em caso de resultados positivos verificados em
controlos efectuados nos termos do programa,
— o carácter não discriminatório entre as trocas em território do
Estado-membro em causa e as trocas intracomunitárias.
Os programas comunicados pelos Estados-membros serão analisados
pela Comissão. Se for caso disso, a Comissão aprovará essesprogramas, respeitando os critérios enunciados no parágrafo anterior,de acordo com o processo previsto no artigo 24.
oDe acordo com o
mesmo processo, podem ser indicadas as garantias complementares,gerais ou limitadas, que poderão ser exigidas. Essas garantias devem
ser, no máximo, equivalentes às que o Estado-membro aplica no
âmbito nacional.
Os programas apresentados pelos Estados-membros podem ser alte-
rados ou completados de acordo com o processo previsto no artigo25.
oDe acordo com o mesmo processo, pode ser aprovada uma alte-
ração ou um complemento a um programa anteriormente aprovado eàs garantias definidas nos termos do segundo parágrafo deste número.
Artigo 5.
o
1. Os Estados-membros não indemnes da peste equina, na acepção
do alínea f) do artigo 2.o, só poderão expedir equídeos provenientes da
parte do território considerada infectada, na acepção do n.o2 deste
artigo, nas condições fixadas no n.o3 deste artigo.
2. a) Uma parte do território de um Estado-membro será considerada
infectada pela peste equina se:
— no decorrer dos dois últimos anos, uma evidência clínica,
serológica (em animais não vacinados) e/ou epidemiológicativer permitido verificar a existência de peste equina,
ou
— no decorrer dos últimos 12 meses, tiver sido feita a vacinação
contra a peste equina.
b) A parte do território considerada infectada pela peste equina deve
incluir, no mínimo:
— uma zona de protecção com um raio de, pelo menos, 100
quilómetros em redor do foco de infecção,
— uma zona de vigilância com uma extensão mínima de 50
quilómetros para além dos limites da zona de protecção e naqual não tenha sido feita qualquer vacinação no decorrer dosúltimos 12 meses.1990L0426 — PT — 23.02.2002 — 007.001 — 6
▼M4
▼M4
c) As regras de controlo das medidas de luta relativas aos territórios
e zonas a que se referem as alíneas a) e b), assim como as derro-gações que lhes digam respeito, serão precisadas na Directiva 92/
/35/CEE (
1).
d) Todos os equídeos vacinados que se encontrem na zona de
protecção devem ser registados e identificados nos termos don.
o1 do artigo 6.oda Directiva 92/35/CEE.
O documento de identificação e/ou o certificado sanitário devem
incluir uma referência clara a essa vacinação.
3. Um Estado-membro só poderá expedir do território referido na
alínea b) do n.o2 os equídeos que satisfaçam as seguintes exigências:
a) Serem expedidos unicamente durante determinados períodos do ano,
em função da actividade dos insectos vectores, a fixar peloprocessos previsto no artigo 25.
o;
b) Não apresentarem qualquer sinal clínico de peste equina no dia da
inspecção referida no n.o1 do artigo 4.o;
c) — caso não tenham sido vacinados contra a peste equina, terem
sido submetidos e reagido negativamente, por duas vezes, a umteste de fixação do complemento para a peste equina descrito no
anexo D, com um intervalo compreendido entre 21 e 30 dias,
devendo o segundo teste ter sido efectuado nos 10 dias ante-riores à expedição,
— caso tenham sido vacinados, a vacinação não se ter realizado
durante os dois últimos meses e terem sido submetidos ao teste
de fixação descrito no anexo D, com os intervalos acima refe-ridos, sem que se tenha verificado um aumento de anticorpos.De acordo com o processo previsto no artigo 24.
o, a Comissão,
após parecer do Comité científico veterinário, pode reconheceroutros métodos de controlo;
d) Terem sido mantidos num centro de quarentena durante um período
mínimo de 40 dias antes da expedição;
e) Terem sido protegidos dos insectos vectores durante o período de
quarentena e de transporte do centro de quarentena para o local deexpedição.
Artigo 6.
o
Os Estados-membros que aplicam um regime alternativo de controlo
que oferece garantias equivalentes às previstas no n.o5 do artigo 4.o
para a circulação no seu território de equídeos e de equídeos registados,nomeadamente por meio do documento de identificação, podemconceder mutuamente, numa base de reciprocidade, uma derrogação
ao n.
o1, segunda frase, do artigo 4.oea on .o1, segundo travessão do
artigo 8.o
Do facto informarão a Comissão.
Artigo 7.o
1. Os equídeos devem ser conduzidos, no mais curto espaço de
tempo, da exploração de proveniência para o local de destino, quer
directamente quer após passagem por um mercado ou centro deconcentração aprovados tal como definidos no n.
o6 do artigo 3.oda
Directiva 64/432/CEE, num meio de transporte e num espaço regular-mente limpos e desinfectados com um desinfectante e segundo umafrequência a definir pelo Estado-membro de expedição. Os veículos de
transporte devem ser construídos de modo a que as fezes, as camas de
palha ou as forragens dos equídeos não possam verter ou cair para forado veículo durante o transporte. O transporte deve ser efectuado deforma a assegurar uma protecção sanitária eficaz e o bem-estar dosequídeos.1990L0426 — PT — 23.02.2002 — 007.001 — 7
(1)J O n .oL 157 de 10. 6. 1992, p. 19▼B
▼B
2. O Estado-membro de destino pode, de uma maneira geral ou limi-
tada, conceder uma derrogação a alguns dos requisitos do n.o5d o
artigo 4.o, desde que o animal apresente uma marca particular esclare-
cendo que se destina a abate e que o certificado sanitário faça
referência a essa derrogação.
Em caso de concessão de tal derrogação, os equídeos para abate devem
ser conduzidos directamente ao matadouro designado, para seremabatidos num prazo não superior a cinco dias após a chegada ao mata-douro.
3. O veterinário oficial deve anotar num registo o número de identi-
ficação ou o número do documento de identificação do equídeo abatidoe enviar à autoridade competente do local de expedição, a pedido desta,
uma certidão que ateste o abate do equídeo.
Artigo 8.
o
1. Os Estados-membros velarão por que:
— os equídeos registados sejam acompanhados, ao abandonarem a
exploração respectiva, do documento de identificação previsto no
n.o4 do artigo 4.oe, se se destinarem às trocas instracomunitárias,
desse documento de identificação completado pelo atestado previstono anexo B,
— os equídeos de criação, rendimento ou de talho sejam acompa-
nhados, durante o transporte, de um certificado de inspecçãosanitária em conformidade com o anexo C.
O certificado ou, no caso de um documento de identificação, o boletim
que contém as informações sanitárias devem ser emitidos — semprejuízo do artigo 6.
o— nas quarenta e oito horas ou, o mais tardar,
no último dia útil antes do embarque, na ou nas línguas oficiais do
Estado-membro de expedição e de destino. A validade do certificadoé de dez dias. O certificado deve consistir num só folha.
2. As importações de equídeos que não os equídeos registados
podem ser efectuadas ao abrigo de apenas um certificado sanitário porlote, em vez de certificado individual a que se refere o segundotravessão do n.
o1.
Artigo 9.o
São aplicáveis as regras previstas na Directiva 90/425/CEE do
Conselho, de 26 de Junho de 1990, relativa aos controlos veterináriosaplicáveis ao comércio intracomunitário de certos animais vivos eprodutos, na perspectiva da realização do mercado interno (
1), nomea-
damente no que se refere aos controlos na origem, à organização e ao
seguimento a dar aos controlos a efectuar pelo Estado-membro dedestino, e às medidas de salvaguarda a tomar.
Artigo 10.
o
Os peritos veterinários da Comissão podem, na medida em que tal seja
necessária à aplicação uniforme da presente directiva e em colaboração
com as autoridades nacionais competentes, efectuar controlos no local.A Comissão informará os Estados-membros do resultado dos controlosefectuados.
O Estado-membro em cujo território for efectuado tal controlo
fornecerá aos peritos todo o apoio necessário para a realização da suamissão.
As regras de aplicação do presente artigo serão fixadas de acordo com
o procedimento previsto no artigo 24.
o1990L0426 — PT — 23.02.2002 — 007.001 — 8
(1)J O n .oL 224 de 18. 8. 1990, p. 29.▼M1
▼B
▼B
CAPÍTULO III
Regras para as importações provenientes de países terceiros
Artigo 11.o
1. Os equídeos importados na Comunidade devem satisfazer as
condições enunciadas nos artigos 12.oa 16.o
2. Até à data de entrada em vigor das decisões pertinentes adoptadasem aplicação dos artigos 12.
oa 16.o, os Estados-membros aplicarão às
importações de equídeos provenientes de países terceiros condiçõespelo menos equivalentes às que resultam da aplicação do capítulo II.
Artigo 12.
o
1. Para poderem ser importados, os equídeos devem ser provenientes
de países terceiros ou de partes de países terceiros constantes de umalista que figurará numa coluna especial a incluir na lista elaborada nos
termos do artigo 3.
oda Directiva 72/462/CEE.
2. Os procedimentos e critérios de elaboração, alteração e publi-
cação da lista de países terceiros ou partes de países terceiros
previstos no artigo 3.oda Directiva 72/462/CEE são aplicáveis à lista
válida para as importações de equídeos.
Artigo 13.o
1. Os equídeos devem provir de países terceiros:
a) Indemnes da peste equina;
b) Indemnes desde há dois anos da encefalomielite equina venezuelana
(VEE);
c) Indemnes desde há seis meses da tripanosomose e do mormo.
2. A Comissão, agindo de acordo com o procedimento previsto no
artigo 24.o, pode:
a) Decidir que o n.o1 apenas se aplica a uma parte do território de um
país terceiro.
No caso de regionalização dos requisitos relativos à peste equina,
devem ser no mínimo respeitadas as medidas previstas nos n.os2e
3 do artigo 5.o;
b) Exigir garantias adicionais em relação a doenças exóticas na Comu-
nidade.
Artigo 14.o
Antes da data do seu embarque com vista a expedição para o Estado-
-membro de destino, os equídeos devem ter permanecido, seminterrupção, no território ou numa parte do território de um paísterceiro ou, em caso de regionalização, na parte do território definidaem aplicação do n.
o2, alínea a), do artigo 13.o, durante um período a
fixar aquando da adopção das decisões a tomar em aplicação do artigo
15.o
Os equídeos devem provir de uma exploração colocada sob controlo
veterinário.
Artigo 15.o
A importação de equídeos do território de um país terceiro, ou de uma
parte do território de um país terceiro definida nos termos do n.o2
alínea a), do artigo 13.oconstante da lista elaborada nos termos do
n.o1 do artigo 12.o, só será autorizada se, para além dos requisitos do
artigo 13.o;
a) Os equídeos em questão satisfizerem as condições sanitárias adop-
tadas, segundo o procedimento previsto no artigo 24.o, para as
importações de equídeos desse país em função da espécie em causae das categorias de equídeos.1990L0426 — PT — 23.02.2002 — 007.001 — 9
▼B
Para fixar as condições de polícia sanitária em conformidade com o
parágrafo anterior, a referência de base a utilizar é a das normasprevistas nos artigos 4.
oe5 .o;e
b) Sempre que se trate de países terceiros não indemnes de estomatite
vesicular ou de arterite viral durante pelo menos seis meses, os
equídeos satisfizerem os requisitos seguintes:
i) Os equídeos devem provir de uma exploração indemne de esto-
matite vesicular desde há pelo menos seis meses e ter reagidonegativamente a um teste serológico antes da sua expedição;
ii) Para a arterite viral, os equídeos machos devem ter reagido nega-
tivamente — sem prejuízo da alínea ii) do artigo 19.
o—au m
teste serológico ou a um vírus de isolamento ou a qualquer outroteste aprovado nos termos do procedimento do artigo 24.
o, que
garanta que o animal se encontra indemne dessa doença.
A Comissão agindo nos termos do procedimento previsto no
artigo 24.o, e após parecer do Comité Veterinário Científico,
pode delimitar as categorias de equídeos machos a que estaexigência será aplicável.
Artigo 16.
o
1. Os equídeos devem ser identificados nos termos do n.o4 do artigo
4.o, e ser acompanhados de um certificado passado por um veterinário
oficial do país terceiro exportador. O certificado deve:
a) Ser emitido no dia do carregamento dos equídeos com vista à expe-
dição para o Estado-membro de destino, ou no caso de cavalosregistados, no último dia útil antes do embarque;
b) Ser redigido pelo menos numa das línguas oficiais do Estado-
-membro de destino e numa das do Estado-membro onde se efectua
o controlo da importação;
c) Acompanhar os equídeos no seu exemplar original;
d) Atestar que os equídeos satisfazem as condições previstas pela
presente directiva e as fixadas em aplicação da mesma para aimportação proveniente do país terceiro;
e) Ser constituído de uma única folha;
f) Ser previsto para um único destinatário ou, no caso de equídeos
para abate, para um lote devidamente marcado e identificado.
Os Estados-membros informarão a Comissão no caso de fazerem
uso dessa possibilidade.
2. Este certificado deve ser redigido num formulário conforme com
o modelo elaborado de acordo com o procedimento previsto no artigo24.
o
Artigo 17.o
Serão efectuados controlos no local por peritos veterinários dosEstados-membros e da Comissão, a fim de verificar a efectiva apli-
cação das disposições da presente directiva e, nomeadamente, as do
n.
o2 do artigo 12.o
Se, durante uma inspecção efectuada em aplicação do presente artigo,forem constatados factos graves contra uma exploração, a Comissão
informará imediatamente os Estados-membros desse facto e adoptará
imediatamente uma decisão que inclua a suspensão provisória da apro-vação. Será tomada uma decisão definitiva a este respeito de acordocom o procedimento previsto no artigo 25.
o
Os peritos dos Estados-membros encarregados dos controlos são nome-ados pela Comissão sob proposta dos Estados-membros.
Os controlos são efectuados por conta da Comunidade, que assume as
despesas correspondentes.
A periodicidade e as modalidades dos controlos são determinadas de
acordo com o procedimento previsto no artigo 24.
o1990L0426 — PT — 23.02.2002 — 007.001 — 10
▼B
Artigo 18.o
1. À chegada ao Estado-membro de destino, os equídeos para abate
devem ser conduzidos a um matadouro, directamente ou após passagempor um mercado ou por um centro de concentração e, em conformidadecom as exigências de polícia sanitária, ser abatidos num prazo a fixaraquando da adopção das decisões a tomar em aplicação do artigo 15.
o
2. Sem prejuízo das condições especiais eventualmente fixadas deacordo com o procedimento previsto no artigo 24.
o, a autoridade
competente do Estado-membro de destino pode, devido a requisitos depolícia sanitária, designar o matadouro para o qual devem ser encami-nhados estes equídeos.
Artigo 19.
o
A Comissão, agindo de acordo com o procedimento previsto no artigo
24.o:
i) Pode limitar a importação proveniente de um país terceiro, ou de
uma parte de um país terceiro, a espécies ou categorias especiaisde equídeos;
ii) Define, em derrogação ao artigo 15.
o, as condições especiais em
que se pode efectuar a admissão temporária no território da Comu-
nidade ou a reintrodução nesse território após exportaçãotemporária de equídeos registados ou de equídeos destinados autilizações especiais;
iii) Determina as condições que permitem converter uma admissão
temporária em admissão definitiva.
CAPÍTULO IV
Disposições finais
Artigo 22.o
As disposições da presente directiva e, nomeadamente, as do n.o1,
segunda frase do artigo 4.oe dos artigos 6,.o,8 .oe 21.o, serão objecto
de reanálise antes de 1 de Janeiro de 1993, no âmbito das propostasdestinadas a assegurar a realização do mercado interno e sobre as quaiso Conselho se pronunciará por maioria qualificada.
Artigo 23.
o
Os anexos da presente directiva serão alterados pela Comissão de
acordo com o procedimento previsto no artigo 25.o
Artigo 24.o
1. Caso seja feita referência ao procedimento definido no presenteartigo, o Comité Veterinário Permanente, instituído pela Decisão 68//361/CEE (
1), a seguir denominado «comité», será imediatamente
consultado pelo presidente, quer por sua iniciativa quer a pedido do
representante de um Estado-membro.
2. O representante da Comissão submete à apreciação do comité um
projecto das medias a tomar. O comité emite o seu parecer sobre esteprojecto num prazo que o presidente pode fixar em função da urgência
da questão em causa. O parecer é emitido por maioria, nos termos
previstos no n.
o2 do artigo 148.odo Tratado para a adopção das deci-
sões que o Conselho é chamado a tomar sob proposta da Comissão.Nas votações no seio do comité, os votos dos representantes dosEstados-membros estão sujeitos à ponderação definida no mesmoartigo. O presidente não participa na votação.1990L0426 — PT — 23.02.2002 — 007.001 — 11
(1)J O n .oL 255 de 18. 10. 1968, p. 23.▼M2
▼B
▼B
3. A Comissão adopta as medidas projectadas desde que sejam
conformes com o parecer do comité.
4. Se as medidas projectadas não forem conformes com o parecer do
comité, ou na ausência de parecer, a Comissão submeterá sem demora
ao Conselho uma proposta relativa às medidas a tomar. O Conselhodelibera por maioria qualificada.
Se, no termo de um prazo de três meses a contar da data em que o
assunto lhe foi submetido, o Conselho não tiver deliberado, a Comissãoadoptará as medidas propostas, salvo no caso de o Conselho se terpronunciado contra as referidas medidas por maioria simples.
Artigo 25.
o
1. Sempre que seja feita referência ao procedimento definido no
presente artigo, o comité será imediatamente consultado pelo seu presi-
dente, quer por sua iniciativa quer a pedido do representante de um
Estado-membro.
2. O representante da Comissão submete à apreciação do comité um
projecto das medidas a tomar. O comité emite o seu parecer sobre esteprojecto num prazo de dois dias. O parecer é emitido por maioria, nostermos previstos no n.
o2 do artigo 148.odo Tratado para a adopção das
decisões que o Conselho é convidado a tomar sob proposta da
Comissão. Nas votações no seio do comité, os votos dos representantesdos Estados-membros estão sujeitos à ponderação definida no mesmoartigo. O presidente não participa na votação.
3. A Comissão adopta as medidas projectadas desde que sejam
conformes com o parecer do comité.
4. Se as medidas projectadas não forem conformes com o parecer do
comité, ou na ausência de parecer, a Comissão submeterá sem demora
ao Conselho uma proposta relativa às medidas a tomar. O Conselho
delibera por maioria qualificada.
Se, no termo de um prazo de quinze dias a contar da data em que o
assunto lhe foi submetido, o Conselho não tiver deliberado, a Comissãoadoptará as medidas propostas, salvo no caso de o Conselho se terpronunciado contra as referidas medidas por maioria simples.
Artigo 26.
o
O artigo 34.oda Directiva 72/462/CEE é aplicável aos requisitos
previstos no capítulo III da presente directiva.
Artigo 27.o
Os Estados-membros porão em vigor as disposições legislativas, regu-
lamentares e administrativas necessárias para dar cumprimento à
presente directiva, o mais tardar em 1 de Janeiro de 1992. Desse factoinformarão a Comissão.
Artigo 28.
o
Os Estados-membros são destinatários da presente directiva.1990L0426 — PT — 23.02.2002 — 007.001 — 12
▼B
ANEXO A
DOENÇAS CUJA DECLARAÇÃOÉ OBRIGATÓRIA
As seguintes doenças estão sujeitas a uma declaração obrigatória:
— tripanosomose dos equídeos,
— mormo,— encefalomielite equina (sob todas as formas incluindo a VEE),— anemia infecciosa,— raiva,
— carbúnculo bacteridiano,
— peste equina,— estomalite vesicular.1990L0426 — PT — 23.02.2002 — 007.001 — 13
▼M3
ANEXO B
►(1)M51990L0426 — PT — 23.02.2002 — 007.001 — 14
▼M3
ANEXO C
1990L0426 — PT — 23.02.2002 — 007.001 — 15
▼M3
►(1)A1
►(2)M51990L0426 — PT — 23.02.2002 — 007.001 — 16
▼M6
ANEXO D
PESTE EQUINA
DIAGNÓSTICO
Os reagentes a utilizar no ensaio imunoenzimático (ELISA) seguidamente
descrito podem ser solicitados ao laboratório de referência da Comunidade
Europeia ou aos laboratórios de referência do OIE para a peste equina.
1. ENSAIO ELISA COMPETITIVO PARA A DETECÇÃO DE ANTICORPOS
CONTRA O VÍRUS DA PESTE EQUINA (AHSV) (ENSAIO RECOMEN-
DADO)
O ensaio ELISA competitivo é utilizado para a detecção de anticorpos
específicos de AHSV no soro de quaisquer espécies de equídeos. O imunos-
soro de cobaia anti-AHSV (adiante referenciado por «antissoro de cobaia»),
de espectro largo e policlonal, é específico do serogrupo, sendo adequado à
detecção de todos os serótipos do vírus AHS.
O princípio do ensaio consiste na competição entre um antissoro de cobaia e
a amostra do soro em análise para o antigénio AHSV. Os anticorpos anti-
-AHSV da amostra de soro em análise competem com os anticorpos do
antissoro de cobaia, resultando numa redução da coloração esperada por
adição de anticorpo anti-cobaia marcado com enzima e de substrato. Podem
utilizar-se soros com uma diluição única de 1: 5 (método de ensaio pontual)
ou, em alternativa, diluir-se sucessivamente a amostra para determinar o
título final (método de titulação do soro). São considerados positivos os
valores de inibição superiores a 50 %.
O protocolo a seguir descrito é utilizado pelo laboratório regional de
referência para a peste equina, em Pirbright, no Reino Unido.
1.1.Procedimento
1.1.1.Preparação das placas
1.1.1.1. Revestir placas ELISA com antigénio AHSV extraído de
culturas de células infectadas diluído em tampão carbonato-
-bicarbonato a pH 9,6. Incubar as placas ELISA de um dia para
o outro a 4 ºC.
1.1.1.2. Lavar as placas três vezes, enchendo e esvaziando os alvéolos
com tampão fosfato (PBS) a pH 7,2-7,4 e secar invertendo a
placa sobre papel absorvente.
1.1.2.Alvéolos-testemunha
1.1.2.1. Distribuir ao longo da coluna 1 diluições sucessivas de 1: 2 a
partir da diluição inicial, de 1: 5 até 1: 640, dos soros-teste-
munha positivos em tampão de bloqueio [PBS com 0,05 % (v/
/v) de Tween-20, 50 % (m/v) de leite em pó desnatado
(Cadbury's MarvelTM) e 1 % (v/v) de soro de bovino adulto],
de forma a obter um volume final de 50 µl/alvéolo.
1.1.2.2. Adicionar 50 µl de soro-testemunha negativo diluído a 1: 5
(10µl de soro + 40 µl de tampão de bloqueio) aos alvéolos A
e B da coluna 2.
1.1.2.3. Adicionar, por alvéolo, 100 µl de tampão de bloqueio nos
alvéolos C e D da coluna 2 (branco).
1.1.2.4. Distribuir 50 µl de tampão de bloqueio nos alvéolos E, F, G e
H da coluna 2 (testemunha de cobaia).
1.1.3.Método de ensaio pontual (diluição única da amostra)
1.1.3.1. Distribuir em duas séries de alvéolos das colunas 3 a 12
diluições a 1: 5 de cada soro em tampão de bloqueio (10 µl
soro em análise + 40 µl tampão de bloqueio).
ou
1.1.4.Método de titulação do soro (diluição seriada)
1.1.4.1. Distribuir, em oito alvéolos de cada uma das colunas 3 a 12,
diluições sucessivas para metade (de 1: 5 a 1: 640) de cada
amostra em tampão de bloqueio.
seguidamente1990L0426 — PT — 23.02.2002 — 007.001 — 17
▼M6
1.1.5. Adicionar 50 µl de anti-soro de cobaia, previamente diluído
com tampão de bloqueio, a todos os alvéolos da placa ELISA,
com excepção dos alvéolos correspondentes ao ensaio em
branco (desta forma, todos os alvéolos deverão conter um
volume final de 100 µl).
1.1.5.1. Incubar a 37 ºC durante uma hora, utilizando um agitador
orbital.
1.1.5.2. Lavar as placas três vezes e secar do modo descrito anterior-
mente.
1.1.5.3. Adicionar a cada alvéolo 50 µl de anticorpo de coelho anti-
-cobaia conjugado com peroxidase de rábano (HRP),
previamente diluído em tampão de bloqueio.
1.1.5.4. Incubar a 37 ºC durante uma hora, utilizando um agitador
orbital.
1.1.5.5. Lavar as placas três vezes e secar do modo descrito anterior-
mente.
1.1.6.Cromogénio
Preparar a solução de cromogénio (OPD = orto-fenildiamina) de
acordo com as instruções dos fabricantes (0,4 mg/ml em água
destilada estéril), imediatamente antes da utilização. Adicionar
substrato (peróxido de hidrogénio = H2O2) de forma a obter
uma concentração final de 0,05 % (v/v) (1: 2000 numa solução
de H2O2a 30 %), no caso de uma solução a 30 %. Adicionar
50µl de solução de OPD a cada alvéolo e deixar as placas
durante 10 minutos à temperatura ambiente. Suspender a
reacção por adição a cada alvéolo de 50 µl de ácido sulfúrico
(H2SO4) 1M.
1.1.7.Determinações espectrofotométricas
Efectuar as determinações espectrofotométricas da densidade
óptica (DO) a 492 nm.
1.2.Expressão dos resultados
1.2.1. Com recurso a um programa informático, obter os valores de DO
e as percentagens de inibição (PI) correspondentes aos soros em
análise e aos soros-testemunha, com base nos valores médios
referentes aos quatro alvéolos com soro-testemunha de cobaia.
Os valores de DO e PI são utilizados para determinar se os resul-
tados dos ensaios se situam num intervalo aceitável. Os valores
extremos (superior e inferior) de DO dos soros-testemunha de
cobaia situam-se entre 1,4 e 0,4, respectivamente. Para uma PI
de 50 %, o título final da testemunha positiva deverá ser de
1: 240 (variação de 1: 120 a 1: 480). As placas que não sejam
conformes aos referidos critérios deverão ser rejeitadas. Todavia,
se o título do soro-testemunha positivo exceder 1: 480 e as amos-
tras em análise permanecerem negativas, são aceitáveis as
amostras em análise negativas.
Ambos os alvéolos com soro-testemunha negativo e ambos os
alvéolos correspondentes ao ensaio em branco deverão apresentar
valores de PI compreendidos entre + 25 % e – 25 %, e entre + 95
e + 105 %, respectivamente. Se tal não suceder, não deverá
rejeitar-se a placa, havendo contudo que ter em conta a possibili-
dade de estar a desenvolver-se uma coloração de fundo.
1.2.2. O limite positivo ( cut-off) para os soros em análise é de 50 %
(PI = 50 %). As amostras que apresentem valores de PI supe-
riores a 50 % são consideradas positivas; as amostras que
apresentem valores de PI inferiores a 50 % são consideradas
negativas.
As amostras que apresentem, nos alvéolos repetidos, valores de
PI superiores e inferiores ao limiar são consideradas duvidosas,
podendo ser objecto de nova análise pelo método de ensaio
pontual e por titulação. Poderão também titular-se as amostras
positivas, de forma a obter indicações quanto ao grau de positivi-
dade.1990L0426 — PT — 23.02.2002 — 007.001 — 18
▼M6
Representação esquemática do ensaio pontual
1 2 3456789 1 0 1 1 1 2
+ ve. Cont. Soros em análise
A 1:5 – ve. Cont. 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
B 1:10 – ve. Cont. 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
C 1:20 Branco
D 1:40 Branco
E 1:80 GP Cont.
F 1:160 GP Cont.
G 1:320 GP Cont. 1234567891 0
H 1:640 GP Cont. 1234567891 0
– ve. Cont. = testemunha negativa
+ ve. Cont. = testemuna positiva
GP Cont. = testemunha de cobaia
Representação esquemática do método de titulação sérica
1 2 3 456789 1 0 1 11 2
+ ve. Cont. Soros em análise
A 1:5 – ve. Cont. 1:5 1:5
B 1:10 – ve. Cont. 1:10 1:10
C 1:20 Branco 1:20 1:20
D 1:40 Branco 1:40 1:40
E 1:80 GP Cont. 1:80 1:80
F 1:160 GP Cont. 1:160 1:160
G 1:320 GP Cont. 1:320 1:320H 1:640 GP Cont. 1:640 1:640
– ve. Cont. = testemunha negativa
+ ve. Cont. = testemunha positiva
GP Cont. = testemunha de cobaia
2. ENSAIO ELISA INDIRECTO PARA A DETECÇÃO DE ANTICORPOS
CONTRA O VÍRUS DA PESTE EQUINA (AHSV) (MÉTODO RECOMEN-
DADO)
O ensaio seguidamente descrito é conforme à descrição apresentada no ponto
2.1.11 do Manual de normas para ensaios de diagnóstico e vacinas do OIE
(quarta edição, 2000).
A proteína recombinante VP7 tem sido utilizada como antigénio para a deter-
minação de anticorpos contra o virus AHS com um elevado grau de
sensibilidade e especificidade. O facto de a proteína em causa ser estável e
não ser infecciosa constitui outra vantagem.1990L0426 — PT — 23.02.2002 — 007.001 — 19
▼M6
2.1.Procedimento
2.1.1.Fase sólida
2.1.1.1. Revestir as placas ELISA com proteína recombinante VP7 de
AHSV-4 diluída em tampão de carbonato/bicarbonato a pH 9,6.
Incubar as placas de um dia para o outro a 4 ºC.
2.1.1.2. Lavar as placas cinco vezes com água destilada contendo 0,01 %
(v/v) de Tween 20 (solução de lavagem). Inverter e bater leve-
mente com as placas num material absorvente, para a remoção
de resíduos da solução de lavagem.
2.1.1.3. Bloquear as placas mediante a adição a cada alvéolo de 200 µl
de PBS com 5 % (m/v) de leite desnatado (leite em pó desna-
tado NestléTM, incubando a 37 ºC durante uma hora.
2.1.1.4. Remover a solução de bloqueio; inverter e bater levemente com
as placas num material absorvente.
2.1.2.Amostras em análise
2.1.2.1. Diluir as amostras de soro em análise, bem como os soros das
testemunhas positiva e negativa, na proporção 1: 25, em
PBS + 5 % (m/v) leite desnatado + 0,05 % (v/v) Tween 20,
adicionando 100 µl a cada alvéolo. Incubar a 37 ºC durante
uma hora.
Preparar nos alvéolos de cada coluna (100 µl/alvéolo) diluições
sucessivas para metade de cada soro (diluição inicial 1: 25),
procedendo da mesma forma com as testemunhas positiva e
negativa. Incubar a 37 ºC durante uma hora.
2.1.2.2. Lavar as placas do modo descrito em 2.1.1.2.2.1.3.Conjugado
2.1.3.1. Distribuir por cada alvéolo 100 µl de anti-gama globulina de
cavalo conjugada com peroxidase de rábano (HRP) diluída em
PBS + 5 % de leite + 0,05 % Tween 20 a pH 7,2. Incubar a
37 ºC durante uma hora.
2.1.3.2. Lavar as placas do modo descrito em 2.1.1.2.2.1.4.Cromogénio/Substrato
2.1.4.1. Distribuir por cada alvéolo 200 µl de solução cromogénio/
/substrato [10 ml DMAB (dimetilaminobenzaldeído) + 10 ml
MBTH (cloridrato de 3-metil-2-benzotiazolino-hidrazona) + 5 µl
H
2O2).
O desenvolvimento da coloração é suspenso pela adição de 50 µl
de H2SO43N decorridos 5-10 minutos (antes do início da colo-
ração da testemunha negativa).
Podem utilizar-se outros cromogénios, tais como ABTS (ácido
2,2'-azino-bis[3-etilbenzotiazolino-6-sulfónico]), TMB (tetra-
metil-benzidina) ou OPD (orto-fenildiamina).
2.1.4.2. Efectuar as leituras espectrofotométricas da densidade óptica
(DO) a 600 nm (ou 620 nm).
2.2.Interpretação dos resultados
2.2.1. Calcular o valor-limite (cut-off) adicionando 0,6 ao valor obtido
para a testemunha negativa (0,6 é o desvio-padrão obtido com
um grupo de 30 soros negativos).
2.2.2. As amostras que apresentarem valores de absorvância inferiores
ao valor-limite são consideradas negativas.
2.2.3. As amostras que apresentarem valores de absorvância superiores
ao valor-limite acrescido de 0,15 são consideradas positivas.
2.2.4. As amostras que apresentem valores de absorvância intermédios
são duvidosas, devendo utilizar-se outra técnica para confirmar o
resultado.
3. ENSAIO ELISA DE BLOQUEIO PARA A DETECÇÃO DE ANTICORPOS
CONTRA O VÍRUS DA PESTE EQUINA (AHSV) (ENSAIO RECOMEN-
DADO)
O ensaio ELISA de bloqueio é concebido para a detecção de anticorpos
específicos anti-AHSV em soros de quaisquer espécies sensíveis. A VP71990L0426 — PT — 23.02.2002 — 007.001 — 20
▼M6
constitui a principal proteína antigénica vírica do AHSV, sendo conservada
nos nove serótipos. Uma vez que o anticorpo monoclonal (Mab) também é
dirigido contra o VP7, o ensaio apresenta um elevado nível de sensibilidade
e especificidade. Além disso, o antigénio recombinante VP7 é totalmente
inócuo, proporcionando, assim, um elevado grau de segurança.
O princípio do ensaio consiste no bloqueio por anticorpos da amostra da
reacção entre o antigénio recombinante VP7, ligado à placa ELISA, e o
Mab conjugado específico da proteína recombinante VP7. Os anticorpos do
soro da amostra em análise bloqueiam a reacção entre o antigénio e o Mab,
resultando numa redução da coloração.
O ensaio seguidamente descrito é utilizado no laboratório de referência da
Comunidade Europeia para a peste equina, em Algete (Espanha).
3.1.Procedimento
3.1.1.Placas ELISA
3.1.1.1. Revestir as placas ELISA com proteína recombinante AHSV-4
VP7 diluída em tampão de carbonato-bicarbonato a pH 9,6.
Incubar a 4 ºC de um dia para o outro.
3.1.1.2. Lavar as placas cinco vezes com PBS contendo 0,05 % (v/v) de
Tween 20 (PBST).
3.1.1.3. Estabilizar as placas revestidas com o antigénio por tratamento
com uma solução adequada (de forma a permitir a armaze-
nagem a seco, a 4 ºC, por períodos longos, sem perda de
actividade) e secar invertendo a placa sobre um material absor-
vente.
3.1.2.Amostras em análise e testemunhas
3.1.2.1. Para rastreio: Diluir em PBST, directamente na placa, os soros
em análise e soros-testemunha na proporção
1: 10, de modo a obter um volume final de
100 µl/alvéolo. Incubar a 37 ºC durante uma
hora.
3.1.2.2. Para titulação: Distribuir por oito alvéolos (100 µl/alvéolo)
diluições sucessivas para metade (de 1: 10 a
1: 1 280) dos soros em análise e soros-teste-
munha positivos. As testemunhas negativas são
analisadas numa diluição de 1: 10.
3.1.3.Conjugado
Adicionar a cada alvéolo 50 µl de Mab (anticorpo monoclonal
específico de VP7) anti-VP7) conjugado com HRP, previamente
diluído, e misturar suavemente de forma a garantir a homoge-
neidade. Incubar a 37 ºC durante 30 minutos.
3.1.4. Lavar as placas cinco vezes com PBST e secar do modo atrás
descrito.
3.1.5.Cromogénio/Substrato
Adicionar a cada alvéolo 100 µl de solução cromogénio/
/substrato constituída por 1 ml de ABTS (ácido 2,2'-azino-
-bis[3-etilbenzotiazolino-6-sulfónico]) na concentração de 5 mg/
/ml e 9 ml de tampão-substrato (0,1M tampão de fosfato-citrato
de pH 4 com 0,03 % H2O2) e incubar à temperatura ambiente
durante 10 minutos. O desenvolvimento da coloração é
suspenso mediante a adição, a cada alvéolo, de 100 µl de SDS
(dodecilsulfato de sódio) a 2 % (m/v).
3.1.6.Determinações
Efectuar a leitura da DO a 405 nm com recurso a um leitor para
placas ELISA.
3.2.Interpretação dos resultados
3.2.1.Validação do ensaio
O ensaio é válido se a densidade óptica (DO) da testemunha
negativa (TN) for superior a 1,0 e a DO da testemunha positiva
(TP) for inferior a 0,2.1990L0426 — PT — 23.02.2002 — 007.001 — 21
▼M6
3.2.2.Cálculo dos valores-limite
Valor-limite positivo TN - [(TN-TP) × 0.3]
Valor-limite negativo TN - [(TN-TP) × 0.2]
Em que TN representa a DO da testemunha negativa e TP a DO
da testemunha positiva.
3.2.3.Interpretação dos resultados
As amostras com DO inferior ao valor-limite positivo devem ser
consideradas positivas em relação aos anticorpos anti-AHSV.
As amostras com DO superior ao valor-limite negativo devem ser
consideradas negativas em relação aos anticorpos anti-AHSV.
As amostras com DO compreendida entre os dois valores refe-
ridos deverão ser consideradas duvidosas, devendo recolher-se
novas amostras decorridas duas a três semanas.1990L0426 — PT — 23.02.2002 — 007.001 — 22