2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 1
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►BDECISÃO DA COMISSÃO
►C1 de 14 de Agosto de 2002 ◄
que dá execução ao disposto na Directiva 96/23/CE do Conselho relativamente ao desempenho de
métodos analíticos e à interpretação de resultados
[notificada com o número C(2002) 3044]
(Texto relevante para efeitos do EEE)
(2002/657/CE)
(JO L 221 de 17.8.2002, p. 8)
Alterada por:
JornalOficial
n.opágina data
►M1 Decisão 2003/181/CE da Comissão de 13 de Março de 2003 L 71 17 15.3.2003
Rectificada por:
►C1 Rectificação, JO L 239 de 6.9.2002, p. 66 (2002/657/CE)
▼B
DECISÃO DA COMISSÃO
►C1 de 14 de Agosto de 2002 ◄
que dá execução ao disposto na Directiva 96/23/CE do Conselho
relativamente ao desempenho de métodos analíticos e à interpre-
tação de resultados
[notificada com o número C(2002) 3044]
(Texto relevante para efeitos do EEE)
(2002/657/CE)
A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,
Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia,
Tendo em conta a Directiva 96/23/CE do Conselho, de 29 de Abril de
1996, relativa às medidas de controlo a aplicar a certas substâncias e
aos seus resíduos nos animais vivos e respectivos produtos e que
revoga as Directivas 85/358/CEE e 86/469/CEE e as Decisões 89/187//CEE e 91/664/CEE (
1), e, nomeadamente, o n.o1, segundo parágrafo,
do seu artigo 15.o,
Considerando o seguinte:
(1) A presença de resíduos em produtos de origem animalé motivo
de preocupação em termos de saúde pública.
(2) A Decisão 98/179/CE da Comissão, de 23 de Fevereiro de 1998,que estabelece regras para a colheita das amostras oficiais autilizar na pesquisa de determinadas substâncias e seus resíduos
nos animais vivos e respectivos produtos (
2), determina que a
análise das amostras deve ser efectuada exclusivamente por labo-ratórios aprovados pela autoridade nacional competente para ocontrolo oficial de resíduos.
(3) É necessário garantir a qualidade e a comparabilidade dos resul-tados analíticos originados por laboratórios aprovados para ocontrolo oficial de resíduos. Para o efeito, devem usar-sesistemas de garantia da qualidade e, especificamente, aplicar
métodos validados em conformidade com procedimentos e crité-
rios de desempenho comuns e garantir a rastreabilidaderelativamente a normas comuns ou acordadas em comum.
(4) A Directiva 93/99/CEE do Conselho, de 29 de Outubro de 1993,relativa a medidas adicionais respeitantes ao controlo oficial dosgéneros alimentícios (
3), e a Decisão 98/179/CE exigem que os
laboratórios oficiais de controlo sejam acreditados em conformi-dade com a norma ISO 17025 (1) a partir de Janeiro de 2002.
Nos termos da Decisão 98/179/CE, os laboratórios autorizados
terão de participar num programa externo internacionalmentereconhecido de avaliação e acreditação do controlo de qualidade.Além disso, os laboratórios autorizados devem provar a suacompetência participando regularmente e com êxito emprogramas de comprovação de capacidade reconhecidos ou orga-
nizados pelos laboratórios de referência nacionais ou
comunitários.
(5) Para melhorar a coordenação, existe, ao abrigo da Directiva 96//23/CE, uma rede de laboratórios comunitários de referência,laboratórios nacionais de referência e laboratórios nacionais decontrolo.
(6) Em resultado dos avanços em química analítica desde a adopçãoda Directiva 96/23/CE, o conceito de métodos de rotina e demétodos de referência foi substituído por uma abordagembaseada em critérios, na qualse estabel ecem critérios de desem-2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 2
(1) JO L 125 de 23.5.1996, p. 10.
(2) JO L 65 de 5.3.1998, p. 31.
(3) JO L 290 de 24.11.1993, p. 14.
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penho e procedimentos para a validação de métodos de triagem e
de confirmação.
(7) É necessário determinar critérios comuns para a interpretaçãodos resultados dos ensaios efectuados pelos laboratórios oficiaisde controlo por forma a garantir uma implementação harmoni-zada da Directiva 96/23/CE.
(8) É necessário prever o estabelecimento progressivo de limitesmínimos de desempenho requerido (LMDR) dos métodos analí-ticos para as substâncias relativamente às quais não se encontre
definido um limite permitido e, em especial, para as substâncias
cuja utilização não seja autorizada ou seja expressamente proi-bida na Comunidade, por forma a garantir uma implementaçãoharmonizada da Directiva 96/23/CE.
(9) A Decisão 90/515/CEE da Comissão, de 26 de Setembro de1990, que adopta os métodos de referência para a pesquisa deresíduos de metais pesados e de arsénio (
1), a Decisão 93/256/
/CEE da Comissão, de 14 de Abrilde 1993, que estabel ece osmétodos a utilizar para a pesquisa de resíduos de substâncias
com efeito hormonale de substâncias com efeito tireostático (
2),
e a Decisão 93/257/CEE da Comissão, de 15 de Abrilde 1993,que estabelece os métodos de referência e a lista dos laboratóriosnacionais de referência para a pesquisa de resíduos (
3), com a
última redacção que lhe foi dada pela Decisão 98/536/CE (4),
foram reexaminadas a fim de atender à evolução dos conheci-
mentos científicos e técnicos, tendo-se verificado que estãodesactualizadas em termos do seu âmbito de aplicação e dassuas disposições, devendo por conseguinte ser revogadas pelapresente decisão.
(10) Deve ser fixado um período transitório, a fim de permitir que osmétodos de análise de amostras oficiais sejam adaptados aodisposto na presente decisão.
(11) As medidas previstas na presente decisão estão em conformidadecom o parecer do Comité Permanente da Cadeia Alimentar e daSaúde Animal,
ADOPTOU A PRESENTE DECISÃO:
Artigo 1.o
Objecto e âmbito de aplicação
A presente decisão prevê normas para os métodos analíticos a utilizar
na análise de amostras oficiais colhidas em conformidade com o artigo15.
o,n .o1, segunda frase, da Directiva 96/23/CE e especifica critérios
comuns para a interpretação dos resultados analíticos dos laboratóriosoficiais de controlo relativamente às referidas amostras.
A presente decisão não se aplica a substâncias relativamente às quais
exista legislação comunitária que estabeleça normas mais específicas.
Artigo 2.
o
Definições
Para efeitos da presente decisão, são aplicáveis as definições constantes
do►M1anexo I◄bem como as da Directiva 96/23/CE.2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 3
(1) JO L 286 de 18.10.1990, p. 33.
(2) JO L 118 de 14.5.1993, p. 64.
(3) JO L 118 de 14.5.1993, p. 75.
(4) JO L 251 de 11.9.1998, p. 39.
▼B
Artigo 3.o
Métodos analíticos
Os Estados-Membros devem garantir que as amostras oficiais colhidas
em conformidade com a Directiva 96/23/CE são analisadas recorrendoa métodos que:
a) Estejam documentados em instruções para análises, de preferência
conformes com a norma ISO 78-2 (6);
b) Estejam conformes com a parte 2 do ►
M1anexo I◄;
c) Tenham sido validados de acordo com os procedimentos descritos
na parte 3 do ►M1anexo I◄;
d) Respeitem os limites mínimos de desempenho requerido (LMDR)
relevantes a estabelecer em conformidade com o artigo 4.o
Artigo 4.o
Limites mínimos de desempenho requerido
Os Estados-Membros deverão garantir que os métodos analíticos utili-
zados para a detecção das seguintes substâncias cumprem os limitesmínimos de desempenho requeridos (LMDR) estabelecidos no anexoII relativamente às matrizes aí referidas:
a) cloranfenicol;
b) metabolitos de nitrofuranos;
c) medroxiprogesterona.
Artigo 5.
o
Controlo de qualidade
Os Estados-Membros assegurarão a qualidade dos resultados das
análises às amostras colhidas em conformidade com a Directiva 96/
/23/CE, em especialatravés de testes de monitorização e/ou de
resultados de calibração, em conformidade com o capítulo 5.9 danorma ISO 17025 (1).
Artigo 6.
o
Interpretação dos resultados
1. O resultado de uma análise deve ser considerado não conforme
caso se exceda o limite de decisão do método de confirmação para asubstância a analisar.
2. Caso se encontre estabelecido um limite permitido relativamente
a uma determinada substância, o limite de decisão é a concentração
acima da qualse pode decidir, com uma certeza estatística de 1- α,
que o limite permitido foi realmente excedido.
3. Caso, para uma determinada substância, não se encontre estabele-
cido um limite permitido, o limite de decisão é a concentração mais
baixa a que o método é capaz de detectar, com uma certeza estatísticade 1- α,se essa substância se encontra presente.
4. Relativamente às substâncias enumeradas no grupo A do anexo I
da Directiva 96/23/CE, o erro αdeverá ser de 1 % ou inferior. Para
outras substâncias, o erro αserá de 5 % ou inferior.
Artigo 7.
o
Revogação
São revogadas as Decisões 90/515/CEE, 93/256/CEE e 93/257/CEE.2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 4
▼M1
▼B
▼B
Artigo 8.o
Disposições transitórias
Os métodos para análise de amostras oficiais das substâncias referidas
no grupo A do anexo I da Directiva 96/23/CE que satisfaçam os crité-
rios estabelecidos nas Decisões 90/515/CEE, 93/256/CEE e 93/257/
/CEE podem ser utilizados por um período máximo de dois anos apósa entrada em vigor da presente decisão. Os métodos actualmente apli-cados às substâncias referidas no grupo B do anexo I da Directiva 96//23/CE devem estar conformes com o disposto na presente decisão omais tardar cinco anos após a data de aplicação da presente decisão.
Artigo 9.
o
Data de aplicação
A presente decisão é aplicável a partir de 1 de Setembro de 2002.
Artigo 10.o
Destinatários
Os Estados-Membros são os destinatários da presente decisão.2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 5
▼B
ANEXOI
CRITÉRIOSDEDESEMPENHOEOUTROSREQUISITOSEPROCEDI-
MENTOS APLICÁVEISAOS MÉTODOS ANALÍTICOS
1.DEFINIÇÕES
1.1. Exactidão: grau de concordância entre o resultado dum ensaio e o valor
de referência aceite (2). É determinada através da veracidade e da
precisão.
1.2. Erro alfa ( α):probabilidade de a amostra analisada ser conforme apesar
de se ter obtido um resultado não conforme («falsa decisão não
conforme»).
1.3. Substância a analisar: a substância que se deve detectar, identificar e/ou
quantificar bem como as substâncias dela derivadas que se possam
formar durante a análise.
1.4. Erro alfa ( β):probabilidade de a amostra analisada ser na realidade não
conforme, apesar de se ter obtido um resultado conforme («falsa
decisão conforme»).
1.5. Desvio sistemático: diferença entre o resultado esperado dum ensaio e
um valor de referência aceite (2).
1.6. Padrão de calibração: sistema de medição que relaciona a quantidade de
substância de interesse com uma base de referência.
1.7. Materialde referência certificado (MRC): um materialcom um
conteúdo específico de substância a analisar.
1.8. Co-cromatografia: um processo em que, antes da execução da cromato-
grafia, o extracto é dividido em duas partes. Uma das partes é
submetida a cromatografia sem qualquer tratamento prévio. A outra
parte é misturada com o padrão da substância a analisar. Procede-se à
cromatografia desta mistura. A quantidade adicionada de padrão de
substância a analisar deve ser semelhante ao teor previsto de substância
a analisar no extracto. Este método destina-se a melhorar a identifi-
cação da substância a analisar quando se utilizam métodos
cromatográficos, especialmente quando não se pode usar um padrão
interno adequado.
1.9. Estudo colaborativo: análise da mesma amostra com o mesmo método
para determinar as características de desempenho do método. O estudo
abrange as medições de erros aleatórios e o desvio sistemático do labo-
ratório.
1.10. Método de confirmação: método que fornece indicações completas ou
complementares para a identificação inequívoca de uma substância e,
caso necessário, a sua quantificação ao nívelrequerido.
1.11. Limite de decisão (CC α):limite a partir do qual se pode concluir que
uma amostra é não conforme com uma probabilidade de erro de α.
1.12. Capacidade de detecção (CCß): teor mais baixo de substância que pode
ser detectado, identificado e/ou quantificado numa amostra com uma
probabilidade de erro de β.Em caso de substâncias relativamente às
quais não se encontre definido um limite permitido, a capacidade de
detecção é a concentração mais baixa a que o método é capaz de
detectar amostras realmente contaminadas com uma certeza estatística
de 1 – β.No caso de substâncias com um limite permitido estabelecido,
isto significa que a capacidade de detecção é a concentração a que o
método é capaz de detectar concentrações no limite permitido com
uma certeza estatística de 1 – β.
1.13. Amostra fortificada: uma amostra enriquecida com uma quantidade
conhecida da substância a analisar.
1.14. Estudo interlaboratorial (comparação): organização, realização e
avaliação de ensaios da mesma amostra por dois ou mais laboratórios
de acordo com condições pré-estabelecidas para determinar o desem-
penho dos ensaios. Em função do seu objectivo, o estudo pode ser
classificado como estudo colaborativo ou estudo de aptidão.
1.15. Padrão interno (PI): uma substância que não se encontra presente na
amostra com propriedades físico-químicas tão semelhantes quanto
possívelàs da substância a identificar e que é adicionada a cada
amostra bem como a cada padrão de calibração.2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 6
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1.16. Amostra laboratorial: amostra destinada a inspecção ou análise, prepa-
rada para envio ao laboratório.
1.17. Nívelrequerido: a concentração da substância a anal isar numa amostra
que é significativa para determinar a sua conformidade com a legis-
lação.
1.18. Limite mínimo de desempenho requerido (LMDR): teor mínimo de uma
substância a analisar numa amostra que deve ser detectável e passível
de confirmação. Pretende harmonizar-se o desempenho analítico de
métodos relativos a substâncias para as quais não se encontre definido
um limite permitido.
1.19. Característica do desempenho: qualidade funcional que pode ser atri-
buída a um método analítico. Pode tratar-se, por exemplo, da
especificidade, da exactidão, da veracidade, da precisão, da repetibili-
dade, da reprodutibilidade, da recuperação, da capacidade de detecção
ou da robustez.
1.20. Critérios de desempenho: requisitos relativos a uma característica do
desempenho de acordo com os quais se pode considerar que o método
analítico é adequado para o efeito e dá origem a resultados fiáveis.
1.21. Limite permitido: um limite máximo de resíduos, um nível máximo ou
outra tolerância máxima para uma substância estabelecidos noutros
textos da legislação comunitária.
1.22. Precisão: grau de concordância entre resultados de ensaios indepen-
dentes obtidos em condições (pré-estabelecidas) específicas. O valor
da precisão é geralmente expresso em termos de imprecisão e normal-
mente calcula-se sob a forma de um desvio padrão do resultado do
ensaio. Uma menor precisão é indicada através dum elevado desvio
padrão (2).
1.23. Estudo de aptidão: análise da mesma amostra permitindo aos laborató-
rios que escolham os respectivos métodos, desde que estes sejam
utilizados em condições de rotina. O estudo deve realizar-se de acordo
com os guias ISO 43-1 (3) e 43-2 (4) e pode ser utilizado para avaliar a
reprodutibilidade dos métodos.
1.24. Método qualitativo: método analítico que identifica uma substância com
base nas suas propriedades químicas, biológicas ou físicas.
1.25. Método quantitativo: método analítico que determina a quantidade ou a
fracção mássica de uma substância de forma a poder exprimi-la através
de um valor numérico com as unidade apropriadas.
1.26. Ensaio em branco de reagentes: aplicação do método analítico
completo, omitindo a toma de ensaio ou utilizando, em vez desta, uma
quantidade equivalente de um solvente adequado.
1.27. Recuperação: percentagem da concentração realde uma substância
recuperada durante o processo analítico. É determinada aquando da
validação, caso não se encontre disponível um material de referência
certificado.
1.28. Materialde referência: materialpara o qualse confirmou uma ou várias
propriedades por recurso a um método validado, de modo a poder ser
utilizado na calibração de um aparelho ou na verificação de um método
de medição.
1.29. Repetibilidade: precisão em condições de repetibilidade (2).
1.30. Condições de repetibilidade: condições de obtenção de resultados de
ensaios independentes com o mesmo método, com materialde ensaio
idêntico, no mesmo laboratório, pelo mesmo operador e utilizando o
mesmo equipamento (2).
1.31. Reprodutibilidade: precisão em condições de reprodutibilidade (2)(4).
1.32. Condições de reprodutibilidade: condições de obtenção de resultados de
ensaios com o mesmo método, com materialde ensaio idêntico, em
laboratórios diferentes, com operadores diferentes e utilizando equipa-
mento diferente (2)(4).
1.33. Robustez: susceptibilidade de um método analítico a alterações das
condições experimentais, as quais podem ser expressas como uma lista
dos materiais da amostra, das substâncias a analisar, das condições de
armazenamento, das condições ambientais e/ou de preparação da
amostra em que o método pode ser aplicado tal como apresentado ou
com pequenas alterações específicas. Relativamente a todas as
condições experimentais que possam, na prática, estar sujeitas a
variações (por exemplo, estabilidade dos reagentes, composição da2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 7
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amostra, pH, temperatura), devem ser indicadas quaisquer alterações
susceptíveis de afectar os resultados analíticos.
1.34. Ensaio de amostra branca: aplicação do método analítico completo a
uma toma de ensaio retirada de uma amostra isenta da substância a
analisar.
1.35. Método de triagem: método utilizado para detectar a presença de uma
substância ou classe de substâncias ao nível requerido. Estes métodos
têm capacidade para processar um número elevado de amostras e são
utilizados para seleccionar, de um grande número de amostras, os resul-
tados potencialmente não conformes. São concebidos especificamente
para evitar a obtenção de falsos resultados conformes.
1.36. Estudo unilaboratorial (validação interna): estudo analítico envolvendo
um único laboratório utilizando um método para a análise de material
de ensaio idêntico ou diferente, em condições diferentes e ao longo de
intervalos de tempo justificadamente longos.
1.37. Especificidade: capacidade de um método distinguir a substância a
analisar de outras substâncias. Esta característica depende, essencial-
mente, da técnica de medição descrita, podendo todavia variar de
acordo com o tipo de composto ou de matriz.
1.38. Adição de padrão: procedimento em que a amostra para ensaio é divi-
dida em duas (ou mais) tomas de ensaio. Uma das tomas é analisada
sem qualquer tratamento prévio e às restantes, antes de se proceder à
análise, adicionam-se quantidades conhecidas de padrão da substância
a analisar. A quantidade de padrão de substância a analisar adicionado
deve ser entre duas e cinco vezes o teor previsto de substância a
analisar na amostra. Este procedimento destina-se a determinar o teor
de uma substância numa amostra, tendo em conta a recuperação do
processo analítico.
1.39. Padrão de substância a analisar: substância a analisar de teor e pureza
conhecidos e certificados, destinada a ser utilizada como referência no
processo analítico.
1.40. Substância: matéria com composição química específica ou definida e
seus metabolitos.
1.41. Toma de ensaio: quantidade de materialretirado da amostra para ensaio
e com base na qualse real iza efectivamente o ensaio ou a observação.
1.42. Amostra para ensaio: amostra preparada a partir de uma amostra labo-
ratoriale da qualse deverão retirar as tomas de ensaio.
1.43. Veracidade: grau de concordância entre o valor médio de uma longa
série de resultados de ensaios e um valor de referência aceite. A vera-
cidade é geralmente expressa como o desvio sistemático ou
enviesamento (2).
1.44. Unidades: as unidades descritas na norma ISO 31 (20) e na Directiva
71/354/CEE (19).
1.45. Validação: a confirmação, mediante exame, e o fornecimento de provas
cabais de que são respeitados os requisitos específicos para uma deter-
minada utilização pretendida (1).
1.46. Reprodutibilidade intralaboratorial: precisão obtida no mesmo labora-
tório em condições (pré-estabelecidas) específicas (relativas, por
exemplo, ao método, materiais de ensaio, operadores, ambiente) e ao
longo de intervalos de tempo justificadamente longos.
2.CRITÉRIOS DE DESEMPENHO E OUTROS REQUISITOS APLICÁ-
VEIS AOS MÉTODOS ANALÍTICOS
Além dos métodos descritos infra, podem ser utilizados para efeitos de triagem
ou confirmação outros métodos analíticos ou combinações de métodos desde
que se possa provar que satisfazem os requisitos relevantes estabelecidos na
presente decisão.
2.1. REQUISITOS GERAIS
2.1.1.Manipulação das amostras
As amostras devem ser obtidas, manipuladas e tratadas de modo a que a
probabilidade de detecção da substância a analisar seja máxima. Os
procedimentos para a manipulação das amostras devem evitar a possibi-
lidade de uma contaminação acidental ou da perda das substâncias a
analisar.2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 8
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2.1.2.Execução dos ensaios
2.1.2.1.Recuperação
Durante a análise das amostras, deve determinar-se a recuperação para
cada lote de amostras, caso se utilize um factor de correcção da recupe-
ração fixo. Se a recuperação se situar num intervalo limitado, pode
então utilizar-se o factor de correcção fixo. Caso contrário, deve usar-
-se o factor de recuperação obtido para cada lote específico, a menos
que se aplique o factor de recuperação específico da substância a
analisar na amostra, caso em que deve usar-se o método da adição de
padrão (ver ponto 3.5) ou um padrão interno para a determinação quan-
titativa da substância na amostra.
2.1.2.2.Especificidade
O método deve permitir fazer a distinção entre a substância a analisar e
outras substâncias, nas condições experimentais. Deve estimar-se em
que medida isto é possível. Devem usar-se estratégias para ultrapassar
qualquer interferência previsível de outras substâncias quando se
utilizar a técnica de medição descrita, nomeadamente substâncias
homólogas, análogas e metabolitos do resíduo em causa. A investigação
das interferências susceptíveis de resultar de componentes da matriz é
de importância primordial.
2.2. MÉTODOS DE TRIAGEM
Apenas se podem aplicar, para efeitos de triagem, em conformidade com a
Directiva 96/23/CE, as técnicas analíticas em relação às quais se possa demons-
trar, de forma documentada e reprodutível, que se encontram validadas e têm
uma taxa de falsos resultados conformes < 5 % (erro ß) ao nível requerido. Em
caso de suspeita de um resultado não conforme, este resultado deve ser confir-
mado através de um método de confirmação.
2.3. MÉTODOS DE CONFIRMAÇÃO PARA RESÍDUOS E CONTAMI-
NANTES ORGÂNICOS
Os métodos de confirmação para resíduos e contaminantes orgânicos devem
fornecer informações relativamente à estrutura química da substância a analisar.
Consequentemente, os métodos que utilizam apenas a análise cromatográfica,
sem recurso a um sistema de detecção baseado na espectrometria, não são
adequados para utilização isolada enquanto métodos de confirmação. Contudo,
se uma determinada técnica não possuir especificidade suficiente, a especifici-
dade desejada pode ser obtida através de processos analíticos constituídos por
combinações adequadas de processos de purificação, separação cromatográfica
e detecção espectrométrica.
Os seguintes métodos ou combinações de métodos são considerados adequados
para a identificação de resíduos ou contaminantes orgânicos relativamente aos
grupos de substâncias indicados:
Quadro 1
Métodos de confirmação adequadospara resíduos ou contaminantes orgânicos
Técnica de mediçãoSubstâncias anexo I 96/
/23/CELimitações
LC ou GC com detecção
por espectrometria de
massaGrupos A e B Apenas se usado após uma separação croma-
tográfica, quer em linha quer não
Apenas se se usarem técnicas de varrimento
totalou, com técnicas que não registem a tota-
lidade do espectro de massa, se se usarem pelomenos três (grupo B) ou 4 (grupo A) pontos
de identificação
LC ou GC com detecção
por espectrometria IVGrupos A e B Devem cumprir-se os requisitos específicos
aplicáveis à absorção na espectrometria IV
LC-DAD de varrimento
totalGrupo B Devem cumprir-se os requisitos específicos
aplicáveis à obsorção na espectrometria UV
LC-fluorescência Grupo B Apenas para moléculas que exibam fluo-
rescência inata e moléculas com fluorescência
após transformação ou derivação
2D-TLC-UV/VIS de varri-
mento totalGrupo B A cromatografia em camada fina de alta resu-
lução (HPTLC) bidimensional e a co-cromato-
grafia são obrigatórias2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 9
▼B
Técnica de mediçãoSubstâncias anexo I 96/
/23/CELimitações
GC-Detecção por captura
de electrõesGrupo B Apenas se se usarem duas colunas com polari-
dades diferentes
LC-imunograma Grupo B Apenas se se usarem, pelo menos, dois
sistemas cromatográficos diferentes ou um
segundo método de detecção independente
LC-UV/VIS (comprimento
de onda único)Grupo B Apenas se se usarem, pelo menos, dois
sistemas cromatográficos diferentes ou um
segundo método de detecção independente
2.3.1.Critérios de desempenho e requisitos comuns
Os métodos de confirmação devem fornecer informações relativamente
à estrutura química da substância a analisar. No caso de vários
compostos originarem uma resposta idêntica, então o método não
permite a distinção entre esses compostos. Os métodos que utilizam
apenas a análise cromatográfica, sem recurso a um sistema de detecção
baseado na espectrometria, não são adequados para utilização isolada
enquanto métodos de confirmação.
No caso de o método recorrer à utilização de um padrão interno apro-
priado, este deve ser adicionado à toma de ensaio no início do processo
de extracção. Em função da disponibilidade, usar-se-ão quer formas
estáveis isotopicamente marcadas da substância a analisar, particular-
mente adequadas para a detecção por espectrometria de massa, quer
compostos que apresentem uma relação estrutural com a substância a
analisar.
Quando não se puder usar nenhum padrão interno adequado, a identifi-
cação da substância deve ser confirmada através de co-cromatografia.
Neste último caso, deve obter-se apenas um pico, cujo incremento na
altura (ou área) deverá ser equivalente à quantidade de substância a
analisar adicionada. No caso da cromatografia gasosa (GC) ou da
cromatografia líquida (LC), a largura do pico a metade da sua altura
máxima deverá estar compreendida entre 90 % e 110 % da largura
inicial, e os tempos de retenção deverão ser idênticos, com um desvio
de 5 %. Para métodos baseados em cromatografia em camada fina
(TLC), apenas a mancha presumivelmente devida à substância a
analisar deve sofrer uma intensificação; não deve observar-se o apareci-
mento de uma nova mancha e o aspecto visualda mesma não deve
sofrer alterações.
Os materiais de referência ou fortificados que contenham quantidades
conhecidas da substância a analisar, nas concentrações do limite permi-
tido ou do limite de decisão ou em concentrações próximas (amostra
não conforme de controlo), bem como os materiais conformes de
controlo e os reagentes para os ensaios em branco devem, de
preferência, ser utilizados através de todo o processo em simultâneo
com cada lote de amostras analisadas. A ordem de injecção dos
extractos no aparelho para análise é a seguinte: reagente para o ensaio
em branco, amostra conforme de controlo, amostra(s) a confirmar,
novamente amostra conforme de controlo e, finalmente, amostra não
conforme de controlo. Qualquer alteração a esta sequência deverá ser
justificada.
2.3.2.Critérios de desempenho e outros requisitos adicionais aplicáveis
aos métodos de análise quantitativos
2.3.2.1.Veracidade dos métodos quantitativos
No caso de análises repetidas de um material de referência certificado,
os intervalos indicativos para os desvios entre o valor médio da fracção
mássica corrigido pela recuperação determinado experimentalmente e o
valor certificado são os seguintes:
Quadro 2
Veracidade mínima dos métodos quantitativos
Fracção mássica Intervalo
≤1µg/kg – 50 % a + 20 %
>1 µg/kg a 10 µg/kg – 30 % a + 10 %
≤10µg/kg – 20 % a + 10 %2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 10
▼B
Quando estes MRC não estiverem disponíveis, aceita-se que a veraci-
dade das medições seja avaliada através da recuperação de quantidades
conhecidas da ou das substâncias a analisar adicionadas a uma matriz
em branco. Os dados corrigidos com a média da recuperação só são
aceitáveis se se inserirem nos intervalos constantes do quadro 2.
2.3.2.2.Precisão dos métodos quantitativos
O coeficiente de variação interlaboratorial (CV) para as análises repe-
tidas de um materialde referência ou de um materialfortificado, em
condições de reprodutibilidade, não devem exceder o nível calculado
através da equação de Horwitz. A equação é a seguinte:
CV = 2(1 - 0,5 log C)
em que C é a fracção mássica expressa sob a forma de uma potência de
10 (por exemplo, 1 mg/g = 10–3). No quadro 3 apresentam-se alguns
exemplos.
Quadro 3
ExemplosdeCVdereprodutibilidadeparamétodosquantitativosreferentes auminter-
valo de fracções mássicas da substância a analisar
Fracção mássica CV de reprodutibilidade (%)
1µg/kg (*)
10µg/kg (*)
100 µg/kg 23
1 000 µg/kg (1 mg/kg) 16
(*) Para fracções mássicas inferiores a 100 µg/kg, a aplicação da equação de Horwitz resulta em valores
inaceitavelmente elevados. Por conseguinte, os CV relativos a concentrações inferiores a 100 µg/kg
devem ser o mais baixos possível.
No que respeita às análises levadas a cabo em condições de repetibili-
dade, o CV intralaboratorial deve tipicamente situar-se entre metade e
dois terços dos valores supra-referidos. Para análises efectuadas em
condições de reprodutibilidade intralaboratorial, o CV intralaboratorial
não deve ser superior ao CV de reprodutibilidade.
No caso de substâncias com um limite permitido estabelecido, o método
deve alcançar uma reprodutibilidade intralaboratorial não superior ao
CV de reprodutibilidade correspondente a uma concentração de 0,5 ×
limite permitido.
2.3.3.Critérios de desempenho e outros requisitos aplicáveis à detecção
por espectrometria de massa
Os métodos de espectrometria de massa são adequados para serem
adoptados como métodos de confirmação apenas se usados após uma
separação cromatográfica, quer em linha quer não.
2.3.3.1.Separação cromatográfica
Para os procedimentos de GC-MS, a separação por cromatografia
gasosa deve ser efectuada utilizando colunas capilares. Para os procedi-
mentos de LC-MS, a separação cromatográfica deve ser efectuada
utilizando colunas para LC adequadas. Em qualquer dos casos, o tempo
de retenção mínimo aceitávelpara a substância a anal isar deve ser o
dobro do tempo de retenção correspondente ao volume morto da
coluna. O tempo de retenção (ou tempo de retenção relativo) da
substância a analisar na toma de ensaio deve estar em sintonia com o
do padrão de calibração dentro dum intervalo especificado de tempos
de retenção. O intervalo de tempos de retenção deve ser da ordem de
grandeza da capacidade de resolução do sistema cromatográfico. A
razão entre os tempos de retenção cromatográficos da substância a
analisar e do padrão interno, isto é, o tempo de retenção relativo da
substância a analisar, deve corresponder ao da solução de calibração
com uma tolerância de ± 0,5 % para a GC e ± 2,5 % para a LC.
2.3.3.2.Detecção por espectrometria de massa
A detecção por espectrometria de massa deve ser levada a efeito com a
utilização de técnicas de MS tais como o registo de espectros de massa
totais (varrimento total) ou a monitorização selectiva de iões (SIM) bem
como técnicas MS-MSntais como a monitorização selectiva de reacções2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 11
▼B
(SRM) ou outras técnicas adequadas de MS ou MS-MSncombinadas
como modos adequados de ionização. Na espectrometria de massa de
alta resolução (HRMS), a resolução deve tipicamente ser superior a
10 000 para todo o intervalo mássico a 10 % do vale.
Varrimento total: Quando a determinação por espectrometria de
massa for efectuada através do registo de espectros de varrimento total,
é obrigatória a presença, no espectro de referência do padrão de cali-
bração, de todos os iões de diagnóstico medidos (ião molecular,aductos característicos do ião molecular, iões fragmentados caracterís-
ticos e iões isótopos) com intensidades relativas superiores a 10 %.
SIM: Quando a determinação por espectrometria de massa for efec-
tuada por fragmentografia, o ião molecular deve, de preferência, ser
um dos iões de diagnóstico seleccionados (ião molecular, aductos carac-
terísticos do ião molecular, iões fragmentados característicos bem como
todos os seus iões isótopos). Os iões de diagnóstico seleccionados não
devem ter exclusivamente origem na mesma zona da molécula. A razão
sinal/ruído para cada ião de diagnóstico deve ser ≥3:1.
Varrimento totale SIM: As intensidades rel ativas dos iões detec-
tados, expressas como percentagem da intensidade do ião ou da
transição mais intensos, devem corresponder às do padrão de cali-
bração, quer se trate de soluções de padrão de calibração quer de
amostras fortificadas, em concentrações comparáveis, medidas nas
mesmas condições, com as tolerâncias seguintes:
Quadro 4
Tolerâncias máximas permitidas para as intensidades relativas de iões com diversas
técnicas de espectrometria de massa
Intensidade relativa
(% do pico de base)EI-GC-MS
(relativa)CI-GC-MS, GC-MSn
LC-MS, LC-MSn
(relativa)
>5 0% ±1 0% ±2 0%
>2 0%–5 0% ±1 5% ±2 5%
>1 0%–2 0% ±2 0% ±3 0%
≤10 % ± 50 % ± 50 %
Interpretação dos dados do espectro de massa: As intensidades
relativas dos iões de diagnóstico e/ou de pares de iões precursor/produto
devem ser identificadas através da comparação de espectros ou pela
integração dos sinais de riscas de massa unitária. Sempre que se apli-
carem correcções de fundo, devem fazer-se uniformemente em todo o
lote (ver quarto parágrafo do ponto 2.3.1) e indicar-se claramente.
Varrimento total: Sempre que os espectros de varrimento total
forem registados em espectrometria de massa simples, devem encon-
trar-se presentes, no mínimo, quatro iões com intensidades relativas ≥
10 % do pico de base. O ião molecular deve ser incluído se se encon-
trar presente no espectro de referência com uma intensidade relativa ≥
10 %. Pelo menos quatro iões devem situar-se dentro das tolerâncias
máximas permitidas para as intensidades relativas de iões (quadro 5).
Pode utilizar-se a pesquisa de dados de referência assistida por compu-
tador. Neste caso, a comparação dos dados do espectro de massa das
amostras para ensaio com os da solução de calibração tem de exceder
um factor crítico de concordância. Este factor deve ser determinado
durante o processo de validação para cada substância a analisar com
base nos espectros para os quais se cumpram os critérios descritos
infra. Deve verificar-se a variabilidade dos espectros causada pela
matriz da amostra e pelo desempenho do detector.
SIM: Sempre que os fragmentos forem medidos com outra técnica que
não a do varrimento total, deve usar-se um sistema de pontos de identi-
ficação para interpretar os dados. Para a confirmação das substâncias
enumeradas no grupo A do anexo I da Directiva 96/23/CE, é necessário
um mínimo de quatro pontos de identificação. Para a confirmação das
substâncias enumeradas no grupo B do anexo I da Directiva 96/23/CE,
é necessário um mínimo de três pontos de identificação. No quadro
infra mostra-se o número de pontos de identificação que cada uma
das técnicas básicas de espectrometria de massa pode proporcionar.
Contudo, para receber os pontos de identificação exigidos para a confir-
mação e para calcular o total dos pontos de identificação:
a) Deve medir-se um mínimo de, pelo menos, uma razão entre iões; e2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 12
▼B
b) Todas as razões entre iões relevantes medidas devem satisfazer os
critérios descritos supra ;e
c) Pode combinar-se um máximo de três técnicas diferentes para atingir
o número mínimo de pontos de identificação.
Quadro 5
Relação entre uma série de classes de fragmentos mássicos e os pontos de identificação
obtidos
Técnica de MS Pontos de identificação obtidos por ião
Espectrometria de massa de baixa resolução
(LR)1,0
LR-MSnião precursor 1,0
LR-MSnprodutos de transição 1,5
HRMS 2,0
HR- MSnião precursor 2,0
HR-MSnprodutos de transição 2,5
Notas:
(1) Cada ião só pode ser contabilizado uma vez.
(2) A GC-MS com a utilização da ionização por impacto electrónico é considerada uma técnica diferente
da GC-MS com ionização química.
(3) Podem usar-se substâncias a analisar diferentes para aumentar o número de pontos de identificação
unicamente se os derivados resultarem de reacções com mecanismos diferentes.
(4) Em relação às substâncias do grupo A do anexo I da Directiva 96/23/CE, se as seguintes técnicas
forem usadas no procedimento analítico: HPLC associada a espectrofotometria de varrimento total
com detecção por um sistema de díodos (DAD); ou HPLC associada a detecção por fluorescência; ou
HPLC associada a um imunograma; ou TLC bidimensionalassociada à detecção espectrométrica; podeatribuir-se um ponto de identificação, no máximo, desde que estejam satisfeitos os critérios relevantespara estas técnicas.
(5) Nos produtos de transição estão incluídos os produtos de segunda e de terceira geração.
Quadro 6
Exemplos do número de pontos de identificação obtidos por diversas técnicas e suas
combinações (n = inteiro)
Técnica(s) Número de iões Pontos de identificação
GC-MS (EI ou CI) N n
GC-MS (EI e CI) 2 (EI) + 2 (CI) 4GC-MS (EI ou CI) 2 deri-
vados2 (derivado A) + 2 (deri-
vado B)4
LC-MS N n
GC-MS-MS 1 precursor e 2 de segunda
geração4
LC-MS-MS 1 precursor e 2 de segunda
geração4
GC-MS-MS 2 iões precursores, com 1
ião de segunda geração
cada5
LC-MS-MS 2 iões precursores, com 1
ião de segunda geração
cada5
LC-MS-MS-MS 1 precursor, 1 de segunda
geração e 2 de terceira
geração5,5
HRMS N 2 n
GC-MS e LC-MS 2 + 2 4
GC-MS e HRMS 2 + 1 42002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 13
▼B
2.3.4.Critérios de desempenho e outros requisitos aplicáveis à cromato-
grafia associada à detecção por infravermelhos
Picos adequados: Os picos adequados correspondem a máximos de
absorção no espectro de infravermelhos de um padrão de calibração
que satisfaçam os requisitos enumerados a seguir.
2.3.4.1.Detecção por infravermelhos
Máximo de absorção: Deve situar-se na gama de números de onda
4000-500 cm–1.
Intensidade de absorção: Não deve ser inferior a:
a) Uma absorvância molar específica de 40 relativamente à linha de
base do pico; ou
b) Uma absorvância relativa de 12,5 % da absorvância do pico mais
intenso na região 4000-500 cm–1,
quando ambas são medidas relativamente à absorvância zero, e 5 % da
absorvância do pico mais intenso na região 4000-500 cm–1, no caso de
ambas as medições se efectuarem relativamente à linha de base dos
seus picos.
Nota: Embora, do ponto de vista teórico, sejam preferíveis os picos
adequados descritos na alínea a), os picos referidos na alínea b) são
mais fáceis de determinar na prática.
Deve determinar-se o número de picos do espectro de infravermelhos
da substância a analisar cujas frequências correspondem a um pico
adequado no espectro do padrão de calibração, com uma margem de ±
1c m–1.
2.3.4.2.Interpretação dos dados do espectro de infravermelhos
Deve observar-se absorção em todas as regiões do espectro da
substância a analisar que correspondam a um pico adequado no
espectro de referência do padrão de calibração. No espectro de infraver-
melhos do padrão de calibração é necessária a presença de, pelo menos,
seis picos adequados. No caso de se encontrarem presentes menos de
seis picos adequados (7), o espectro em causa não pode ser utilizado
como espectro de referência. O «resultado», isto é, a percentagem de
picos adequados presentes no espectro de infravermelhos da substância
a analisar, deve ser de, pelo menos, 50. Quando não existir uma corres-
pondência exacta para um pico adequado, a região em causa do
espectro da substância a analisar deve ser consistente com a presença
de um pico correspondente. O processo descrito é aplicável apenas a
picos de absorção no espectro da amostra com uma intensidade de,pelo menos, três vezes o ruído entre picos.
2.3.5.Critérios de desempenho e outros requisitos aplicáveis à determi-
nação de uma substância utilizando LC em conjunto com outras
técnicas de detecção
2.3.5.1.Separação cromatográfica
No caso de se encontrar disponívelum materialadequado para tal
efeito, deve usar-se um padrão interno. Deverá tratar-se, de preferência,
de um padrão correlacionado com um tempo de retenção próximo do da
substância a analisar. A substância a analisar deve ser eluída no tempo
de retenção característico do padrão de calibração correspondente, nas
mesmas condições experimentais. O tempo de retenção mínimo
aceitávelpara uma substância a anal isar deve ser duas vezes o tempo
de retenção do volume morto da coluna. A razão entre o tempo de
retenção da substância a analisar e o do padrão interno, isto é, o tempo
de retenção relativo da substância a analisar, deve ser idêntico ao do
padrão de calibração na matriz adequada, com uma margem de ± 2,5 %.
2.3.5.2.Detecção por UV/VIS de varrimento total
Devem ser satisfeitos os critérios de desempenho para os métodos de
LC.
Os máximos de absorção no espectro da substância a analisar devem
ocorrer aos mesmos comprimentos de onda que os do padrão de cali-
bração, com uma margem determinada pela resolução do sistema de
detecção. No caso de detecção com sistema de díodos, a margem em
causa é, em geral, de ± 2 nm. Acima de 220 nm, o aspecto visual do
espectro da substância a analisar não deve diferir do espectro do padrão
de calibração nas zonas dos dois espectros com uma absorvância rela-
tiva≥10 %. Este critério é satisfeito quando, por um lado, se2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 14
▼B
encontram presentes os mesmos máximos e, por outro, quando em
nenhum dos pontos observados a diferença entre os dois espectros
excede 10 % da absorvância do padrão de calibração. Caso se utilize a
pesquisa e a concordância de dados de referência assistidas por compu-
tador, a comparação dos dados do espectro das amostras para ensaio
com os da solução de calibração deve exceder um factor crítico de
concordância. Este factor deve ser determinado durante o processo de
validação para cada substância a analisar com base nos espectros para
os quais se cumpram os critérios descritos supra . Deve verificar-se a
variabilidade dos espectros causada pela matriz da amostra e pelo
desempenho do detector.
2.3.5.3.Critérios de desempenho para a detecção fluorimétrica
Devem ser satisfeitos os critérios de desempenho para os métodos de
LC.
Este método aplica-se a moléculas que exibam fluorescência inata bem
como a moléculas com fluorescência após transformação ou derivação.
A selecção dos comprimentos de onda de excitação e de emissão
combinada com as condições cromatográficas deve ser feita de forma
a minimizar a ocorrência de componentes interferentes em extractos da
amostra em branco.
O valor máximo do pico mais próximo no cromatograma deve encon-
trar-se separado do pico correspondente à substância a analisar por uma
distância igual a, pelo menos, a largura total do pico da substância a
analisar a 10 % da sua altura máxima.
2.3.5.4.Critérios de desempenho para a determinação de uma substância a
analisar por LC-imunograma
A técnica de LC-imunograma não é adequada para utilização isolada
enquanto método de confirmação.
Devem ser satisfeitos os critérios relevantes para os métodos de LC.Os parâmetros pré-definidos relativos ao controlo de qualidade, por
exemplo, a ligação não específica, a ligação relativa das amostras de
controlo ou o valor da absorvância do branco, devem situar-se nos
limites obtidos durante a validação do ensaio.
O imunograma deve ser constituído por, no mínimo, cinco fracções.
Cada fracção deve ser inferior a metade da largura do pico.A fracção com o teor máximo em substância a analisar deve ser a
mesma para a amostra suspeita, para a amostra não conforme de
controlo e para o padrão.
2.3.5.5.Determinação de uma substância a analisar por LC com detecção por
UV/VIS (comprimento de onda único)
A técnica de LC com detecção por UV/VIS (comprimento de onda
único) não é adequada para utilização isolada enquanto método de
confirmação.
O valor máximo do pico mais próximo no cromatograma deve encon-
trar-se separado do pico correspondente à substância a analisar por uma
distância igual a, pelo menos, a largura total do pico da substância a
analisar a 10 % da sua altura máxima.
2.3.6.Critérios de desempenho e outros requisitos aplicáveis à determi-
nação de uma substância por 2-D TLC associada a uma detecção
por espectrometria de UV/VISde varrimento total
A cromatografia em camada fina de alta resolução (HPTLC) bidimensi-
onale a co-cromatografia são obrigatórias.
Os valores de Rf da substância a analisar devem corresponder aos
valores de Rf dos padrões com um limite de ± 5 %.
O aspecto visualda substância a anal isar não deve ser distinto do
aspecto visualda substância padrão.
Para manchas da mesma cor, a distância entre o centro da mancha refe-
rente à substância a analisar e o da mancha mais próxima deve ser, pelo
menos, metade da soma dos diâmetros das manchas.
O aspecto visualdo espectro da substância a anal isar não deve diferir
do aspecto visualdo espectro do padrão, talcomo descrito no respei-
tante à detecção por UV/VIS de varrimento total.2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 15
▼B
Caso se utilize a pesquisa e a concordância de dados de referência
assistidas por computador, a comparação dos dados do espectro das
amostras para ensaio com os da solução de calibração deve exceder
um factor crítico de concordância. Este factor deve ser determinado
durante o processo de validação para cada substância a analisar com
base nos espectros para os quais se cumpram os critérios descritos
supra . Deve verificar-se a variabilidade dos espectros causada pela
matriz da amostra e pelo desempenho do detector.
2.3.7.Critérios de desempenho e outros requisitos aplicáveis à determi-
nação de uma substância a analisar por GC combinada com
detecção por captura de electrões (ECD)
No caso de se encontrar disponívelum materialadequado para tal
efeito, deve usar-se um padrão interno. Deverá tratar-se, de preferência,
de uma substância correlacionada com um tempo de retenção próximo
do da substância a analisar. A substância a analisar deve ser eluída no
tempo de retenção característico do padrão de calibração correspon-
dente, nas mesmas condições experimentais. O tempo de retenção
mínimo aceitávelpara uma substância a anal isar deve ser duas vezes o
tempo de retenção do volume morto da coluna. A razão entre o tempo
de retenção da substância a analisar e o do padrão interno, isto é, o
tempo de retenção relativo da substância a analisar, deve ser idêntico
ao do padrão de calibração na matriz adequada, com uma margem de
± 0,5 %. O valor máximo do pico mais próximo no cromatograma
deve encontrar-se separado do pico correspondente à substância a
analisar por uma distância igual a, pelo menos, a largura total do pico
da substância a analisar a 10 % da sua altura máxima. Pode usar-se a
co-cromatografia para obter informação adicional.
2.4. MÉTODOS DE CONFIRMAÇÃO APLICÁVEIS AOS ELEMENTOS
As análises para a confirmação dos elementos químicos devem basear-se no
conceito da identificação inequívoca e da quantificação exacta e rigorosa através
das propriedades físico-químicas próprias do elemento químico em causa (por
exemplo, comprimento de onda característico da radiação emitida ou absorvida
pelo elemento, massa atómica) ao nível requerido.
Os seguintes métodos ou combinações de métodos são considerados adequados
para a identificação de elementos químicos:
Quadro 7
Métodos de confirmação adequados para elementos químicos
Técnica Parâmetro medido
Voltametria de redissolução anódica de impulsos
diferenciaisSinalel éctrico
Espectrometria de absorção atómica
Chama Comprimento de onda de absorção
Formação de hidretos Comprimento de onda de absorçãoVapor frio Comprimento de onda de absorção
Atomização electrotérmica (câmara de
grafite)Comprimento de onda de absorção
Espectrometria de emissão atómica
Plasma indutivo Comprimento de onda de emissão
Espectrometria de massa
Plasma indutivo Razão massa/carga
2.4.1.Critérios de desempenho e outros requisitos comuns aplicáveis aos
métodos de confirmação
Os materiais de referência ou fortificados que contenham quantidades
conhecidas da substância a analisar, nas concentrações do limite
máximo permitido ou do limite de decisão ou em concentrações
próximas (amostra não conforme de controlo), bem como os materiais
conformes de controlo e os reagentes para os ensaios em branco devem,
de preferência, ser utilizados através de todo o processo em simultâneo
com cada lote de amostras analisadas. A ordem de injecção recomen-
dada dos extractos no aparelho para análise é a seguinte: reagente para
o ensaio em branco, amostra conforme de controlo, amostra a2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 16
▼B
confirmar, amostra conforme de controlo e, finalmente, amostra não
conforme de controlo. Qualquer alteração a esta sequência deverá ser
justificada.
De um modo geral, a maioria das técnicas analíticas exigem a digestão
completa da matriz orgânica para a obtenção de soluções, antes da
determinação da substância a analisar. Este processo pode ser levado a
cabo através da mineralização por micro-ondas, que minimiza o risco
de perda e/ou contaminação das substâncias a analisar. Devem utilizar-
-se recipientes em Teflon descontaminados e de boa qualidade. Caso se
recorra a outros métodos de digestão húmida ou seca, devem estar
disponíveis as provas documentais que excluam potenciais perdas ou
fenómenos de contaminação. Como alternativa à digestão, pode, em
determinadas circunstâncias, escolher-se processos de separação (por
exemplo, a extracção) para separar as substâncias a analisar dos compo-
nentes da matriz e/ou concentrá-las para a sua introdução nos aparelhos
de análise.
No que respeita à calibração, quer seja externa quer baseada no método
da adição de padrão, deve prestar-se atenção em não exceder o inter-
valo de trabalho estabelecido para a análise. Em caso de calibração
externa, é obrigatório preparar os padrões de calibração numa solução
com composição tão semelhante quanto possível à da solução da
amostra. As correcções de fundo devem também ser aplicadas se tal
for exigido pelas condições específicas da análise.
2.4.2.Critérios de desempenho e outros requisitos adicionais aplicáveis
aos métodos de análise quantitativos
2.4.2.1.Veracidade dos métodos quantitativos
No caso de análises repetidas de um material de referência certificado
para elementos, o desvio entre o teor médio determinado experimental-
mente e o valor certificado não deve ultrapassar o limite de ± 10 %.
Quando estes MRC não estiverem disponíveis, aceita-se que a veraci-
dade das medições seja avaliada através da recuperação de quantidades
conhecidas do elemento adicionadas às amostras com teor desconhe-cido. Chama-se a atenção para o facto de que, ao contrário da
substância a analisar, o elemento adicionado não se encontra ligado
quimicamente à matriz reale, por conseguinte, os resul tados obtidos
com este método são menos fiáveis que os resultantes da utilização
dos MRC. Os dados relativos à recuperação só são aceitáveis se se
encontrarem num limite de ± 10 % do valor-alvo.
2.4.2.2.Precisão dos métodos quantitativos
No caso de análises repetidas de uma amostra em condições de repro-
dutibilidade intralaboratorial, o coeficiente de variação (CV)
intralaboratorial da média não deve exceder os seguintes valores:
Quadro 8
CV para métodos quantitativos referentes a um intervalo de fracções mássicas do
elemento
Fracção mássica CV (%)
≥10µg/kg a 100 µg/kg 20
> 100 µg/kg a 1 000 µg/kg 15
≥1 000 µg/kg 10
2.4.3.Requisitosespecíficosparaavoltametriaderedissoluçãoanódicade
impulsos diferenciais (DPASV)
A destruição completa da matéria orgânica nas amostras antes das
determinações por DPASV é extremamente importante. Os voltamo-
gramas não devem apresentar sinais largos causados pela presença de
materiais orgânicos. Os constituintes inorgânicos da matriz podem
influenciar a altura dos picos em DPASV. Por conseguinte, a quantifi-
cação deve ser efectuada através do método da adição de padrão.
Juntamente com o método, devem ser fornecidos modelos de voltamo-
gramas típicos de uma solução de amostra.
2.4.4.Requisitos específicos para a espectrometria de absorção atómica
(AAS)
Esta técnica é basicamente mono-elemento e, por conseguinte, exige a
optimização das condições experimentais em função do elemento2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 17
▼B
específico a quantificar. Sempre que possível, os resultados devem ser
verificados do ponto de vista quantitativo e qualitativo recorrendo a
riscas de absorção alternativas (idealmente, devem seleccionar-se duas
riscas diferentes). Os padrões de calibração devem ser preparados
numa solução cuja matriz corresponda tanto quanto possível à da
solução de amostra a medir (por exemplo, no que respeita à concen-
tração de ácido ou à composição). Para minimizar os valores obtidos
no ensaio em branco, todos os reagentes devem ter o mais elevado
grau de pureza disponível. Dependendo do modo escolhido para vapo-
rizar e/ou atomizar a amostra, distinguem-se diversos tipos de AAS.
2.4.4.1.Requisitos específicos para a AAS de chama
Para cada elemento, deve optimizar-se a regulação da aparelhagem. Em
especial, devem verificar-se a composição e o caudal do gás. Para evitar
interferências causadas pela absorção de fundo deve usar-se uma fonte
correctora contínua. No caso de se usarem matrizes desconhecidas, deve
verificar-se se é necessária a correcção de fundo.
2.4.4.2.Requisitos específicos para a AAS com câmara de grafite
Ao trabalhar com níveis ultravestigiais na câmara de grafite, a exac-
tidão é frequentemente afectada pela contaminação no laboratório. Por
conseguinte, devem usar-se reagentes de elevado grau de pureza, água
desionizada e recipientes em plástico inerte para a manipulação de
amostras e padrões. Para cada elemento, deve optimizar-se a regulação
da aparelhagem. Em especial, devem verificar-se as condições de pré-
-tratamento e de atomização (temperatura, tempo) e as alterações da
matriz.
O trabalho em condições de atomização isotérmicas (por exemplo, tubo
transversalem grafite aquecido com uma pl ataforma L'vov integrada)
(8) reduz a influência da matriz na atomização da substância a analisar.
É permitida a quantificação através de uma curva de calibração baseada
em medições de soluções padrão aquosas quando combinada com a
modificação da matriz e com a correcção de fundo de Zeeman (9).
2.4.5.Requisitos específicos para a espectrometria de absorção atómica
com formação de hidretos
Os compostos orgânicos que contêm elementos tais como arsénio,
bismuto, germânio, chumbo, antimónio, selénio, estanho e telúrio
podem ser muito estáveis e exigem uma decomposição oxidativa para
obter resultados correctos relativos ao teor total do elemento. Por conse-
guinte, recomenda-se a digestão por micro-ondas ou a incineração a
altas pressões em meio fortemente oxidante. Deve prestar-se grande
cuidado à conversão completa e reprodutível dos elementos nos respec-
tivos hidretos.
A formação de hidreto de arsénio em solução de ácido clorídrico com
NaBH4depende do estado de oxidação do arsénio (As III: formação
rápida, As V: período de formação mais longo). Para evitar uma perda
de sensibilidade na determinação do As V com a técnica de injecção de
fluxo, devido ao curto tempo de reacção neste sistema, o As V tem que
ser reduzido a As III após a decomposição oxidativa. São adequados
para este efeito o iodeto de potássio/ácido ascórbico ou a cisteína. As
soluções para ensaio em branco, soluções de calibração e soluções de
amostra devem sofrer o mesmo tratamento. O trabalho num sistema
descontínuo permite a determinação de ambas as espécies de arsénio
sem afectar a exactidão. Devido à formação retardada do hidreto de
As V, a calibração deve ser efectuada através da integração da área
dos picos. Deve optimizar-se a regulação da aparelhagem. O caudal do
gás que transfere o hidreto para o atomizador é particularmente impor-
tante e deve ser verificado.
2.4.6.Requisitos específicos para a espectrometria de absorção atómica
com vapor frio
O vapor frio é utilizado apenas no caso de mercúrio. É necessário um
especial cuidado durante a realização de toda a análise devido à volati-
lização e às perdas por adsorção de mercúrio elementar. Deve evitar-se
cuidadosamente a contaminação pelos reagentes ou pelo ambiente.
Os compostos orgânicos que contêm mercúrio necessitam de uma
decomposição oxidativa para obter resultados correctos para o teor total
em mercúrio. Para a decomposição, devem usar-se sistemas selados
com digestão por micro-ondas ou um incinerador de alta pressão. É
necessário um cuidado especialna l impeza do equipamento que esteve
em contacto com o mercúrio.2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 18
▼B
O trabalho com a técnica de injecção de fluxo é vantajoso. Para limites
de decisão mais baixos, recomenda-se a adsorção do mercúrio
elementar no adsorvente de ouro/platina seguido de dessorção térmica.
Devem evitar-se os contactos entre o adsorvente ou a célula com humi-
dade já que perturbam a medição.
2.4.7.Requisitos específicos para a espectrometria de emissão atómica
com plasma indutivo (ICP-AES)
A espectrometria de emissão atómica com plasma indutivo (10) é um
método de multi-elementos, permitindo a medição simultânea de vários
elementos. Para utilizar a ICP-AES, as amostras têm que ser primeira-
mente digeridas para decompor as matrizes orgânicas. Devem usar-se
sistemas selados com digestão por micro-ondas ou a incineração a altas
pressões. Para uma análise válida por ICP-AES, a calibração de instru-
mento e a selecção do elemento ou do comprimento de onda
desempenham um papel essencial. Para a calibração da aparelhagem,
no caso de curvas de calibração lineares, é geralmente apenas
necessário medir soluções de calibração com quatro concentrações,
uma vez que as curvas de calibração de ICP-AES são geralmente
lineares ao longo de quatro a seis ordens de grandeza da concentração.
A calibração do sistema ICP-AES deveria normalmente ser efectuada
com um padrão de multielementos, que deve ser preparado numa
solução que contenha a mesma concentração em ácido que a solução
de medição. Em relação à curva linear, devem verificar-se as concen-
trações dos elementos.
Para a medição da emissão das substâncias a analisar, devem selec-
cionar-se os comprimentos de onda adequados para as concentrações
dos elementos a determinar. Quando a concentração da substância a
analisar se encontrar fora do intervalo de trabalho de uma risca de
emissão, deve utilizar-se uma risca diferente. De início, escolhe-se a
risca de emissão mais sensível(sem interferência), a seguir sel ecciona-
-se uma risca menos sensível. Quando se trabalha no limite de detecção
ou perto dele, a melhor escolha é geralmente a risca mais sensível para
a correspondente substância a analisar. As interferências espectrais e de
fundo são as que causam as maiores dificuldades em ICP-AES. As
interferências possíveis são, por exemplo, deslocamento de fundo
simples, deslocamento de fundo com declive, sobreposição espectral
directa e deslocamento de fundo complexo. Cada uma destas interferên-
cias tem causas e soluções próprias. Dependendo das matrizes, devem
aplicar-se as correcções das interferências e a optimização dos parâme-
tros de funcionamento. Algumas interferências podem ser evitadas
através da diluição ou da adaptação das matrizes. Para cada lote de
amostras para ensaio analisadas, o material de referência e fortificado
contendo quantidades conhecidas da ou das substâncias a analisar assim
como o materialpara o ensaio em branco devem sofrer o mesmo trata-
mento que as amostras para ensaio. Para testar possíveis desvios, o
padrão deve ser verificado, por exemplo, após 10 amostras. Todos os
reagentes, assim como o gás plasma, devem ter o mais elevado grau
de pureza disponível.
2.4.8.Requisitos específicos para a espectrometria de massa com plasma
indutivo (ICP-MS)(11)
A determinação de elementos vestigiais de massa atómica média, como
o crómio, o cobre e o níquelpode ser objecto de forte interferência por
parte de outros iões isobáricos e poliatómicos. Este inconveniente só
pode ser remediado se se dispuser de uma capacidade de resolução de,
pelo menos, 7000-8000. As dificuldades associadas às técnicas de MS
incluem os desvios instrumentais, os efeitos da matriz e interferência
de iões moleculares (m/z < 80). São necessários padrões internos múlti-
plos abrangendo o mesmo intervalo mássico que os elementos a
determinar para corrigir os desvios instrumentais e os efeitos da matriz.
É necessária a decomposição completa da matéria orgânica nas amos-
tras antes das medições por ICP-MS. Talcomo no caso da AAS, após
a digestão em recipientes fechados, os elementos voláteis, tais como oiodo, devem ser transferidos para um estado de oxidação estável. As
interferências mais problemáticas resultam das combinações de iões
moleculares de árgon (gás plasma), hidrogénio, carbono, azoto e
oxigénio (ácidos de dissolução, impurezas do gás plasma e gases atmos-
féricos arrastados) com a matriz da amostra. Para evitar interferências, é
necessário uma digestão completa, as medições de fundo, a selecção
adequada das massas analíticas, por vezes associadas a uma abundância
reduzida (limite de detecção mais baixo) e dos ácidos de dissolução,
por exemplo, ácido nítrico.2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 19
▼B
Para os elementos a determinar, as interferências devem ser excluídas
pela adequada escolha das massas analíticas específicas, incluindo a
confirmação das relações isotópicas. Deve verificar-se a resposta instru-
mentalpara cada medição mediante a util ização dos padrões internos e
tendo em conta os factores de Fano.
3.VALIDAÇÃO
A validação deve demonstrar que o método analítico dá cumprimento aos crité-
rios aplicáveis às características relevantes do desempenho.
Diferentes objectivos de controlo exigem diferentes categorias de métodos. O
quadro seguinte determina quala característica do desempenho a verificar para
cada tipo de método.
Quadro 9
Classificação dosmétodos analíticos com as características dodesempenhoquedevem ser deter-
minadas
Limite de
detecção
CCBLimite de
decisão
CCαVeraci-
dade/Recu-
peraçãoPrecisãoSelectivi-
dade/Espe-
cificidadeAplicabili-
dade/
/Robustez/
/Estabili-
dade
Métodos
qualitativosT+–––++
C++––++
Métodos
quantita-
tivosT+––+++
C++++++
S = Métodos de triagem; C = Métodos de confirmação; + = A determinação é obrigatória
3.1. PROCEDIMENTOS DE VALIDAÇÃO
O presente capítulo fornece exemplos e/ou referências para os procedimentos de
validação dos métodos analíticos. Podem usar-se outras abordagens para
demonstrar que o método analítico cumpre os critérios e as características de
desempenho, desde que alcancem o mesmo nível e qualidade de informação.
A validação pode também ser efectuada através da realização de um estudo
interlaboratorial tal como estabelecido pelo Codex Alimentarius , pela ISO ou
pela IUPAC (12) ou segundo métodos alternativos como os estudos unilaborato-
riais ou a validação interna (13) (14). O presente capítulo centra-se nos estudos
unilaboratoriais (validação interna) utilizando uma abordagem modular . Esta
abordagem consiste em:
1. Um conjunto de características de desempenho comuns, independentes do
modelo de validação utilizado; e
2. Procedimentos mais específicos dependentes do modelo, tal como descritos
no quadro 10.
Quadro 10
Parâmetros de desempenho independentes e dependentes do modelo
Validação
Parâmetros de desempenho inde-
pendentes do modeloParâmetros de desempenho dependentes do modelo
Características de desempenho
comuns (3.1.1)Abordagem convencionalda
validação (3.1.2)Abordagem da validação interna
(3.1.3)
Especificidade Recuperação Recuperação
Veracidade Repetibilidade Repetibilidade
Robustez: pequenas alterações Reprodutibilidade intralabora-
torialReprodutibilidade intralaborato-
rial2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 20
▼B
Validação
Parâmetros de desempenho inde-
pendentes do modeloParâmetros de desempenho dependentes do modelo
Estabilidade Reprodutibilidade Reprodutibilidade
Limite de decisão (CC α) Limite de decisão (CC α)
Capacidade de detecção
(CC β)Capacidade de detecção (CC β)
Curvas de calibração Curvas de calibração
Robustez: grandes alterações Robustez
3.1.1.Parâmetros de desempenho independentes do modelo
Independentemente da abordagem de validação seleccionada, devem
determinar-se as características de desempenho mencionadas a seguir.
Para minimizar a carga de trabalho, pode utilizar-se uma abordagem
cuidadosamente projectada e consistente estatisticamente para combinar
as experiências executadas para determinar diferentes parâmetros.
3.1.1.1.Especificidade
Para os métodos analíticos, é importante a capacidade de discriminação
entre a substância a analisar e substâncias aparentadas (isómeros, meta-
bolitos, produtos de degradação, substâncias endógenas, componentes
da matriz, etc.). Para verificar as interferências, são necessárias duas
abordagens.
Por conseguinte, devem seleccionar-se as substâncias potencialmente
interferentes e as amostras para ensaios em branco relevantes devem
ser analisadas para detectar a presença de possíveis interferentes e para
estimar o efeito das interferências.
— Seleccionar uma gama de compostos quimicamente aparentados
(metabolitos, derivados, etc.) ou outras substâncias susceptíveis de
serem encontradas com o composto em causa e que possam estar
presentes nas amostras.
— Analisar um número adequado de amostras em branco representa-
tivas (n≥20) e verificar as possíveis interferências (sinais, picos,
vestígios iónicos) na zona em que se prevê a eluição da substância a
analisar.
— Adicionalmente, devem fortificar-se amostras em branco representa-
tivas numa concentração relevante com substâncias que possam
interferir na identificação e/ou na quantificação da substância a
analisar.
— Após a análise, investigar se:
— a presença pode conduzir a uma falsa identificação,
— a identificação da substância a analisar é impedida pela presença
de um ou vários interferentes, ou
— a quantificação é apreciavelmente influenciada.
3.1.1.2.Veracidade
No presente ponto, descreve-se a determinação da veracidade (um dos
componentes da exactidão). A veracidade só pode ser estabelecida
através de um materialde referência certificado (MRC). Deve usar-se
um MRC sempre que esteja disponível. O procedimento encontra-se
detalhadamente descrito na norma ISO 5725-4 (5). É apresentado um
exemplo a seguir.
— Analisar seis amostras idênticas do MRC em conformidade com as
instruções para o método.
— Determinar a concentração da substância a analisar presente em
cada uma daquelas amostras.
— Calcular a média, o desvio padrão e o coeficiente de variação ( %)
para estas concentrações.
— Calcular a veracidade dividindo a concentração média detectada
pelo valor certificado (medido como concentração) e multiplicando
por 100, para exprimir o resultado sob a forma de uma percen-
tagem.
Veracidade (%) = concentração média detectada corrigida pela recupe-
ração × 100/valor certificado.2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 21
▼B
Se não estiver disponívelnenhum MRC, em vez da veracidade, a recu-
peração pode ser determinada da forma indicada no ponto 4.1.2.1 infra.
3.1.1.3.Aplicabilidade/robustez (pequenas alterações)
Estes estudos utilizam a introdução deliberada pelo laboratório de
pequenas variações razoáveis e a observação das suas consequências.
Devem ser efectuados estudos prévios para a selecção de factores do
pré-tratamento, da limpeza e da análise da amostra, susceptíveis de
influenciarem os resultados da medição. Estes factores podem incluir o
analista, a fonte e a idade dos reagentes, solventes, padrões e extractos
de amostra, a taxa de aquecimento, a temperatura, o pH assim como
muitos outros factores que se podem verificar no laboratório. Estes
factores devem ser alterados numa ordem de grandeza coerente com
os desvios geralmente encontrados entre laboratórios.
— Identificar possíveis factores que possam influenciar os resultados.
— Variar levemente cada factor.— Realizar um teste de robustez utilizando a abordagem de Youden
(15) (16). (Nesta fase, podem usar-se outros métodos aprovados.
Contudo, a abordagem de Youden minimiza o tempo e o esforço
exigidos). A abordagem de Youden é de concepção factorialfrac-
cionária. Não se podem detectar as interacções entre os diversos
factores.
— Quando se verificar que um factor influencia significativamente os
resultados das medições, devem fazer-se mais experiências para
decidir quanto aos limites de aceitabilidade deste factor.
— Os factores que influenciam significativamente os resultados devem
ser claramente identificados no protocolo do método.
A ideia de base não é o estudo de uma alteração de cada vez mas sim a
introdução de diversas variações ao mesmo tempo. A título de exemplo,
sejam A, B, C, D, E, F, G os valores nominais de sete factores dife-
rentes susceptíveis de influenciarem os resultados quando os seus
valores forem alterados ligeiramente. Sejam os seus valores alternativos
designados pelas mesmas letras minúsculas a, b, c, d, e, f e g. Daquiresultam 2 (
7) ou 128 combinações possíveis.
É possívelescol her um subconjunto de oito destas combinações com
uma relação equilibrada entre maiúsculas e minúsculas (quadro 11).
Devem fazer-se oito determinações, com uma combinação dos factores
escolhidos (A-G). Os resultados das determinações são apresentados no
quadro 11 infra como S-Z.
Quadro 11
Concepção de experiência para os estudos de robustez (pequenasalterações)
Valor do
factor FCombinação de determinações n.o
12345678
A / a AAAAa a a a
B / b BBbBBBb b
C / c CcCcCcCc
D / d D DddddD D
E/e E e E e e E e E
F / f FffFFffF
G/g G g g G g G G g
Resultado
observado RSTUV W XYZ
Para os cálculos, ver exemplos de testes à robustez no ponto 3.3.
3.1.1.4.Estabilidade
Observou-se que a insuficiente estabilidade da substância a analisar ou
dos constituintes da matriz durante o armazenamento ou a análise
podem dar origem a desvios significativos no resultado da análise.
Além disso, deve verificar-se a estabilidade do padrão de calibração
em solução. Geralmente, a estabilidade da substância a analisar está
bem caracterizada em várias condições de armazenamento. A monitori-2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 22
▼B
zação das condições de armazenamento faz parte do sistema normalde
acreditação do laboratório. Para os casos em que a estabilidade não for
conhecida, dão-se seguidamente exemplos sobre a forma de a deter-
minar.
Estabilidade da substância a analisar em solução— Preparar uma solução-mãe fresca da ou das substâncias a analisar e
diluir tal com especificado nas instruções da análise de modo a
poder preparar alíquotas suficientes (por exemplo, 40) de cada
concentração seleccionada (em redor do limite mínimo de desem-
penho requerido no que respeita a substâncias relativamente às
quais não se encontre definido um limite permitido em redor do
limite permitido para outras substâncias). Preparar soluções da
substância a analisar usada para a fortificação com padrão e para a
solução final de análise, bem como qualquer outra solução com
interesse (por exemplo, padrões derivados).
— Medir o teor da substância a analisar na solução recentemente
preparada de acordo com as instruções da análise.
— Colocar volumes adequados em recipientes apropriados, rotular e
armazenar de acordo com o plano seguinte:
Quadro 12
Plano para a determinação da estabilidade de uma substância a analisar em solução
–2 0º C +4º C +2 0º C
Escuro 10 alíquotas 10 alíquotas 10 alíquotas
Luz 10 alíquotas
— O tempo de armazenamento pode ser seleccionado como 1, 2, 3 e 4
semanas ou maior, caso necessário, por exemplo, até ao primeiro
fenómeno de degradação observáveldurante a identificação e/ou a
quantificação. Devem registar-se o tempo de armazenamento
máximo e as condições de armazenamento óptimas.
— O cálculo da concentração da ou das substâncias a analisar em cada
alíquota deve ser efectuado considerando como 100 % a solução
dessa substância recentemente preparada aquando da análise.
Substância a analisar restante % = Ci× 100/Cfresca
Ci= concentração no momento i
Cfresca= concentração da solução fresca
Estabilidade da ou das substâncias a analisar na matriz— Sempre que possível, devem usar-se amostras reais. Quando isso
não for possível, deve usar-se a matriz fortificada com a substância
a analisar.
— Se estiver disponívelmaterialrealpara amostra, a sua concentração
deve ser determinada enquanto o materialainda está fresco. Após 1,
2, 4 e 20 semanas podem tomar-se mais alíquotas do material e
determinar as respectivas concentrações. Os tecidos devem ser
armazenados a um mínimo de - 20 ºC ou inferior caso necessário.
— Caso não se encontrar disponívelmaterialrealpara amostra, deve
tomar-se algum material em branco e homogeneizá-lo. O material
deve ser dividido em cinco alíquotas. Cada alíquota deve ser fortifi-
cada com a substância a analisar, preparada de preferência numa
pequena quantidade de solução aquosa. Uma alíquota deve ser
analisada imediatamente. As restantes devem ser armazenadas a
um mínimo de - 20 ºC ou inferior, caso necessário, e analisadas
após 1, 2, 4 e 20 semanas.
3.1.1.5.Curvas de calibração
Quando as curvas de calibração são usadas para quantificação:
— Na construção da curva devem usar-se, pelo menos, cinco níveis
(incluindo o zero).
— Deve descrever-se o intervalo de trabalho da curva de calibração.— Deve indicar-se a equação da curva e o grau de ajuste dos dados à
curva.
— Devem mencionar-se os intervalos de aceitabilidade dos parâmetros
da curva.2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 23
▼B
Sempre que seja necessária uma calibração em série baseada numa
solução padrão, devem indicar-se intervalos aceitáveis para os parâme-
tros da curva de calibração, os quais podem variar em cada série.
3.1.2.Procedimentos convencionais de validação
O cálculo dos parâmetros de acordo com os métodos convencionais
exige a realização de diversas experiências isoladas. Cada característica
do desempenho deve ser determinada para cada alteração importante
(versupra o ponto consagrado à aplicabilidade/robustez). No que
respeita aos métodos multi-substâncias, podem analisar-se várias
substâncias em simultâneo, desde que se tenham previamente excluído
possíveis interferências relevantes. De modo semelhante, podem deter-
minar-se diversas características do desempenho. Por conseguinte, para
minimizar a carga de trabalho, aconselha-se, tanto quanto possível,
combinar as experiências (por exemplo, a repetibilidade e a reprodutibi-
lidade intralaboratorial com a especificidade, a análise das amostras em
branco para determinar o limite de decisão e controlar a especificidade).
3.1.2.1.Recuperação
Caso não exista um MRC disponível, a recuperação deve ser determi-
nada através de experiências com uma matriz em branco fortificada,
usando, por exemplo, o esquema seguinte:
— seleccionar 18 alíquotas de um material em branco e fortificar três
grupos de seis alíquotas com 1, 1,5 e 2 vezes o limite mínimo de
desempenho requerido ou com 0,5, 1 e 1,5 vezes o limite permitido,
— analisar as amostras e calcular a concentração presente em cada
amostra,
— utilizando a equação referida abaixo, calcular a recuperação para
cada amostra,
— calcular a recuperação média e o CV dos seis resultados de cada
nível,
— % Recuperação = 100 × teor medido/nívelde fortificação.
Este método convencionalpara a determinação da recuperação é uma
variante do método da adição de padrão descrito em 3.5, em que:
— a amostra é considerada como uma amostra em branco em vez
duma amostra a analisar,
— consideram-se o rendimento (1) e a recuperação (2) semelhantes para
as duas tomas de ensaio,
— as amostras para ensaio têm a mesma massa e os extractos para
tomas de ensaio o mesmo volume,
— a quantidade de padrão de calibração adicionada à segunda toma de
ensaio (fortificada) designa-se por xADD.( xADD=ρA.VA),
— x1 é o valor medido para o branco e x2 o valor medido para a
segunda toma de ensaio (fortificada).
— Então: % Recuperação = 100 (x2 — x1)/xADD.
Sempre que alguma das condições supra -referidas não estiver satisfeita
(ou se julgar não satisfeita), então deve realizar-se o procedimento
completo para a determinação da recuperação através do método da
adição de padrão talcomo descrito no ponto 3.5.
3.1.2.2.Repetibilidade
— Preparar um conjunto de amostras com matrizes idênticas, fortifi-
cadas com a substância a analisar de modo a obter concentraçõesequivalentes a 1, 1,5 e 2 vezes o limite mínimo de desempenho
requerido ou a 0,5, 1 e 1,5 vezes o limite permitido.
— Para cada nível, a análise deve ser realizada com, pelo menos, seis
réplicas.
— Analisar as amostras.— Calcular a concentração detectada para cada amostra.— Calcular a concentração média, o desvio padrão e o coeficiente de
variação ( %) das amostras fortificadas.
— Repetir estes passos pelo menos mais duas vezes.2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 24
(1) Rendimento: a fracção mássica da substância a analisar contida na amostra que se
encontra presente no extracto final.
(2) Recuperação (neste caso): a fracção mássica da substância a analisar adicionada à
amostra que se encontra presente no extracto final. No resto do documento, assume-seque o rendimento e a recuperação são iguais e, por conseguinte, usa-se apenas o tremo
«recuperação».
▼B
— Calcular a concentração média global e os CV para as amostras
fortificadas.
3.1.2.3.Reprodutibilidade intralaboratorial
— Preparar um conjunto de amostras de materiais de ensaio especifi-
cados (com matrizes idênticas ou diferentes), fortificadas com a ouas substâncias a analisar de modo a obter concentrações equiva-
lentes a 1, 1,5 e 2 vezes o limite mínimo de desempenho requerido
ou a 0,5, 1 e 1,5 vezes o limite permitido.
— Para cada nível, a análise deve ser realizada com, pelo menos, seis
réplicas.
— Repetir estes passos pelo menos mais duas vezes com operadores
diferentes e condições ambientais diferentes, por exemplo, lotes
diferentes de reagentes, solventes, etc., temperatura ambiente dife-
rente, instrumentação diferente, etc., se possível.
— Analisar as amostras.— Calcular a concentração detectada para cada amostra.— Calcular a concentração média, o desvio padrão e o coeficiente de
variação ( %) das amostras fortificadas.
3.1.2.4.Reprodutibilidade
Sempre que se tiver que verificar a reprodutibilidade, os laboratórios
devem participar em estudos colaborativos de acordo com a norma
ISO 5725-2 (5).
3.1.2.5.Limite de decisão (CC α)
O limite de decisão deve ser estabelecido de acordo com os requisitos
de identificação ou de identificação e quantificação talcomo definidos
nos «Critérios de desempenho e outros requisitos aplicáveis aos
métodos analíticos» (parte 2).
Em caso de substâncias relativamente às quais não se encontre definido
um limite permitido, o CC αpode ser estabelecido:
— quer através do procedimento da curva de calibração de acordo com
a norma ISO 11843 (17) (aqui referido como o valor líquido crítico
da variável). Neste caso, deve usar-se material em branco, fortifi-
cado no nívelmínimo de desempenho requerido e acima desse
nívelem passos equidistantes. Anal isar as amostras. Após a identi-
ficação, representar graficamente o sinalem função da concentração
adicionada. O limite de decisão é igual à concentração correspon-
dente à ordenada na origem mais 2,33 vezes o desvio padrão da
reprodutibilidade intralaboratorial. Este método aplica-se apenas a
ensaios quantitativos ( α= 1 %).
— quer analisando pelo menos 20 materiais em branco por matriz de
modo a poder calcular a razão sinal/ruído no intervalo de tempo
em que se espera obter a substância a analisar. Pode usar-se como
limite de decisão três vezes a razão sinal/ruído. Este método é
aplicável tanto a ensaios quantitativos como qualitativos.
Em caso de substâncias com um limite permitido definido, o CC αpode
ser estabelecido:
— quer através do procedimento da curva de calibração de acordo com
a norma ISO 11843 (17) (aqui referido como o valor líquido crítico
da variável). Neste caso, deve usar-se material em branco, fortifi-
cado em redor do limite permitido em passos equidistantes.
Analisar as amostras. Após a identificação, representar graficamente
o sinalem função da concentração adicionada. O l imite de decisão
(α= 5 %) é igualà concentração correspondente ao l imite permitido
mais 1,64 vezes o desvio padrão da reprodutibilidade intralaborato-
rial,
— quer analisando pelo menos 20 materiais em branco por matriz
fortificados com a ou as substâncias a analisar no limite permitido.
O limite de decisão ( α= 5 %) é igualà concentração ao l imite
permitido mais 1,64 vezes o correspondente desvio padrão.
Ver também o artigo 5.
oe o ponto 3.2.
3.1.2.6.Capacidade de detecção (CC β)
A capacidade de detecção deve ser determinada de acordo com os
requisitos de triagem, de identificação ou de identificação e quantifi-
cação talcomo definidos (ver parte 2).2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 25
▼B
Em caso de substâncias relativamente às quais não se encontre definido
um limite permitido, o CC βpode ser estabelecido:
— quer através do procedimento da curva de calibração de acordo com
a norma ISO 11843 (17) (aqui referido como o valor líquido
mínimo detectávelda variável ). Neste caso, deve usar-se material
em branco representativo, fortificado ao nívelmínimo de desem-
penho requerido e abaixo desse nívelem passos equidistantes.
Analisar as amostras. Após a identificação, representar graficamente
o sinalem função da concentração adicionada. A capacidade de
detecção ( β= 5 %) é igualà concentração correspondente ao l imite
de decisão mais 1,64 vezes o desvio padrão da reprodutibilidade
intralaboratorial do teor médio medido no limite de decisão,
— quer analisando pelo menos 20 materiais em branco por matriz
fortificados com a ou as substâncias a analisar no limite de decisão.
Analisar as amostras e identificar as substâncias. A capacidade de
detecção ( β= 5 %) é igual ao valor do limite de decisão mais 1,64
vezes o desvio padrão da reprodutibilidade intralaboratorial do teor
medido,
— quando não estiverem disponíveis resultados quantitativos, a capaci-
dade de detecção pode ser determinada através da investigação de
materialem branco fortificado no l imite de decisão e acima desse
limite. Neste caso, o nível de concentração no qual apenas se obtém
≤5 % de falsos resultados conformes é igual à capacidade de
detecção do método. Por conseguinte, devem realizar-se, pelo
menos, 20 investigações para, pelo menos, um nível de concen-
tração de modo a garantir uma base sustentávelpara esta
determinação.
Em caso de substâncias relativamente às quais se encontre definido um
limite permitido, o CC βpode ser estabelecido:
— quer através do procedimento da curva de calibração de acordo com
a norma ISO 11843 (17) (aqui referido como o valor líquido
mínimo detectávelda variável ). Neste caso, deve usar-se material
em branco representativo, fortificado em redor do limite permitido
em passos equidistantes. Analisar as amostras e identificar a ou as
substâncias. Calcular o desvio padrão do teor médio medido no
limite de decisão. A capacidade de detecção ( β= 5 %) é igualà
concentração correspondente ao valor do limite de decisão mais
1,64 vezes o desvio padrão da reprodutibilidade intralaboratorial,
— quer analisando pelo menos 20 materiais em branco por matriz
fortificados com a ou as substâncias a analisar no limite de decisão.
A capacidade de detecção ( β= 5 %) é igual ao valor do limite de
decisão mais 1,64 vezes o correspondente desvio padrão.
Ver também ponto 3.2.
3.1.2.7.Robustez (grandes alterações)
O método analítico deve ser testado em diferentes condições experi-
mentais que incluem, por exemplo, espécies diferentes, matrizes
diferentes ou condições de amostragem diferentes. As alterações intro-
duzidas devem ser importantes. A importância destas alterações pode
ser avaliada, por exemplo, utilizando a abordagem de Youden (15)
(16). Deve determinar-se cada característica do desempenho relativa-
mente a todas as grandes alterações que tenham comprovadamente um
efeito significativo sobre o desempenho do ensaio.
3.1.3.Validação de acordo com modelos alternativos
Sempre que se aplicarem procedimentos de validação alternativos,
devem ser estabelecidos no protocolo de validação o modelo e a estra-
tégia subjacentes, juntamente com os respectivos pré-requisitos,
pressupostos e fórmulas ou, pelo menos, devem ser fornecidas referên-
cias quanto à sua disponibilidade. É apresentado a seguir um exemplo
de uma abordagem alternativa. Quando se aplica, por exemplo, o
modelo de validação interna, determinam-se as características do
desempenho de forma a permitir a validação das grandes alterações no
âmbito do mesmo procedimento de validação. Para o efeito, é
necessário conceber um plano experimental para a validação.
3.1.3.1.Plano experimental
Deve ser concebido um plano experimental em função do número de
espécies e factores diferentes que estão a ser investigados. Assim, a
primeira fase de todo o procedimento de validação deve ter em conta
as populações de amostras que, no futuro, serão analisadas no labora-
tório, a fim de seleccionar as espécies mais importantes e os factores
que possam influenciar os resultados das medições. Posteriormente,2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 26
▼B
deve seleccionar-se a gama de concentrações de uma forma adaptada
aos objectivos e de acordo com o nívelrequerido.
Exemplo:
— Podem investigar-se simultaneamente várias substâncias a analisar
utilizando o método analítico que está a ser validado.
— Foram identificadas duas variações do factor principal(A e B). Os
factores principais constituem a base em que se combinam os níveis
dos factores. Entre estes factores principais podem incluir-se
factores como a espécie ou a matriz. Neste exemplo, o factor prin-
cipalapresentou variações a dois níveis, ou seja, foram consideradas
duas espécies diferentes (espécies A e B). Regra geral, é possível
fazer variar os factores principais a mais de dois níveis, o que só
vai aumentar o número de análises a realizar.
— Os factores seleccionados devem ser objecto de variação a dois
níveis (indicados quer como + quer como –).
Quadro 13
Exemplos de factores considerados importantes para um procedimento de validação
Sexo do animal(factor 1)
Raça (factor 2)
Condições de transporte (factor 3)
Condições de armazenamento (factor 4)Frescura da amostra (factor 5)Condições de engorda (factor 6)
Operadores diferentes com experiência diferente (factor 7)
Quadro 14
Plano experimental possível para o exemplo supra
Espécie Factor 1 Factor 2 Factor 3 Factor 4 Factor 5 Factor 6 Factor 7Amostra
n.o
A ++++–+– 1
A+ + – – + – – 2
A +–+–––+ 3
A +––++++ 4
A– + + – + + + 5
A –+–+––+ 6
A ––+++–– 7
A –––––+– 8
B +++++–+ 9
B+ + – – – + + 1 0
B +–+–++– 1 1B+ – – + – – – 1 2
B –++–––– 1 3
B –+–+++– 1 4
B– – + + – + + 1 5
B ––––+–+ 1 6
Uma vez que cada amostra (cada combinação de níveis de factores)
deve ser fortificada com quatro concentrações diferentes em torno do
nívelrequerido e deve ser anal isada uma amostra em branco para cada
nível, terão de ser realizadas 5 x 16 = 80 análises para toda a expe-
riência de validação.
Destes 80 resultados de medições, é possível calcular (13) (14):2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 27
▼B
Recuperação
— Repetibilidade por nível de concentração (sir);
— Reprodutibilidade intralaboratorial por nível de concentração (siR);
— Limite de decisão (CC α);
— Capacidade de detecção (CC β);
— Curva de potências (taxa de erro βem função da concentração —
ver ponto 3.1.3.2);
— Robustez a grandes alterações; a robustez a pequenas alterações
pode determinar-se de acordo com o ponto 3.1.1.3;
— 16 curvas de calibração relacionadas com as amostras;— 1 curva de calibração global;— Intervalo de previsão da curva de calibração global;— Desvios induzidos pela matriz (s
mat);
— Desvios induzidos pelo processo da análise (srun);
— Efeitos dos factores isolados nos resultados das medições.
Estas características do desempenho permitem a avaliação detalhada do
nívelde desempenho do método, uma vez que não só se investiga a
influência dos factores isoladamente mas também as combinações rele-
vantes desses factores. Com o auxílio desta concepção de experiência, é
possível decidir se se deve excluir da curva de calibração global algum
dos factores seleccionados, porque se desvia significativamente do
desvio padrão dos outros factores.
3.1.3.2.Curva de potências
A curva de potências proporciona informações sobre a capacidade de
detecção do método na gama de concentrações seleccionada. Refere-se
ao risco de erro βna aplicação do método investigado. A curva de
potências permite o cálculo das capacidades de detecção para as respec-
tivas categorias (triagem, confirmação) ou tipos (qualitativo ou
quantitativo) de métodos para um determinado erro β(por exemplo,
5 %).2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 28
▼B
Figura 1:
Curva de potências
A figura 1 mostra um exemplo do estabelecimento gráfico da capaci-
dade de detecção (CC β)de um método analítico. Este método
específico apresenta um risco remanescente de tomar uma decisão falsa
de 5 % a uma concentração de 0,50 µg/kg. A uma concentração de 0,55
µg/kg, o risco de tomar uma falsa decisão conforme diminui para 1 %.
3.1.3.3.Reprodutibilidade
A determinação da reprodutibilidade de um método através do método
do estudo unilaboratorial (validação interna) exige a participação repe-
tida em estudos de aptidão, em conformidade com os Guias ISO 43-1 e
43-2 (4). Os laboratórios podem escolher os respectivos métodos, desde
que estes sejam utilizados em condições de rotina. O desvio padrão do
laboratório pode ser usado para avaliar a reprodutibilidade do método.2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 29
▼B
3.2. REPRESENTAÇÃO GRÁFICA DOS DIFERENTES LIMITES ANALÍ-
TICOS
Figura 2:
Substâncias para as quais não se encontra definido um limite permitido
2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 30
▼B
Figura 3:
Substâncias para as quais se encontra definido um limite permitido
2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 31
▼B
3.3. EXEMPLO DE CÁLCULO PARA UM TESTE À ROBUSTEZ A
PEQUENAS ALTERAÇÕES DE ACORDO COM A ABORDAGEM DE
YOUDEN (16)
Comparação das médias (A)
AA=Σ(Ai)/4
AB=Σ(Bi)/4
AC=Σ(Ci)/4
AD=Σ(Di)/4
AE=Σ(Ei)/4
AF=Σ(Ei)/4
AG=Σ(Gi)/4
Aa=Σ(ai)/4
Ab=Σ(bi)/4
Ac=Σ(ci)/4
Ad=Σ(di)/4
Ae=Σ(ei)/4
Af=Σ(fi)/4
Ag=Σ(gi)/4Comparar as médias das letras maiúsculas (AAaAG) com as médias das minús-
culas correspondentes (AaaAg). Se um factor tiver influência, a diferença será
significativamente maior que as diferenças dos outros factores.
Um método robusto não deve ser afectado por alterações encontradas quase de
certeza entre laboratórios.
Caso não se verifiquem diferenças dignas de nota, a medida mais realista do
erro aleatório é dada pelas sete diferenças.
Diferenças (Di) Quadrados das diferenças (Di2)
Da=A – a = Σ(Ai)–Σ(ai)
Db= B–b= Σ(Bi)–Σ(bi)
Dc=C – c = Σ(Ci)–Σ(ci)
Dd= D–d= Σ(Di)–Σ(di)
De=E – e = Σ(Ei)–Σ(ei)
Df=F – f = Σ(Fi)–Σ(fi)
Dg= G–g= Σ(Gi)–Σ(gi)Da2= valor a
Db2= valor b
Dc2= valor c
Dd2= valor d
De2= valor e
Df2= valor f
Dg2= valor g
Desvio padrão das diferenças Di(sDi):
Sempre que o sDifor significativamente maior que o desvio padrão do método
realizado em condições de reprodutibilidade intralaboratorial (ver supra ) pode
deduzir-se que o conjunto dos factores tem influência no resultado, mesmo que
cada factor isoladamente não influencie significativamente, e que o método não
é suficientemente robusto face às alterações escolhidas.
3.4. EXEMPLOS DE CÁLCULOS PARA O PROCEDIMENTO DE VALI-
DAÇÃO INTERNA
Exemplos e cálculos para o protocolo de validação interna tal como descritos no
ponto consagrado à validação de acordo com modelos alternativos (ponto 3.1.3)(13) (14).
3.5. EXEMPLOS DE CÁLCULO PARA O MÉTODO DA ADIÇÃO DE
PADRÃO
Divide-se uma amostra para ensaio com teor T na substância a analisar em duas
tomas de ensaio 1 e 2 com massas m
1em1. A toma de ensaio 2 é fortificada
com um volume VAde uma solução da substância a analisar com concentração
ρA. Após as etapas de extracção e purificação do método obtêm-se dois extractos
das tomas de ensaio com volumes V1eV2. Assume-se a recuperação da
substância a analisar como rc. Ambos os extractos são analisados com um
método de medição com sensibilidade b dando, respectivamente, respostas analí-
ticas de x1ex2.
Se se considerar que rc e b são os mesmos para a substância a analisar nas
amostras nativa e fortificada, então o teor T pode ser calculado como:
T=x1.V1.ρA.VA/(x2.V2.m1-x1.V1.m2)
O método permite a determinação da recuperação rc. Para esse efeito, adicional-
mente ao ensaio descrito supra , parte do extracto da toma de ensaio 1 (volume2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 32
▼B
V3) é fortificado com uma quantidade conhecida ρB.VBda substância a analisar,
fazendo o respectivo ensaio. Sendo a resposta analítica x3, a recuperação é:
rc = x2.V1.V2.ρB.VB/[x3.V1.V3(T.m2+ρA.VA)-x2.V2.T.m1(V3-VB)]
Além disso, é ainda possível calcular a sensibilidade b, como:
b=x1.V1/rc.T.m1
Encontram-se descritos todos os pormenores e as condições de aplicação (18).
4.ABREVIATURASUTILIZADAS
AAS Espectrometria de absorção atómica (Atomic Absorption Spectro-
metry)
AES Espectrometria de emissão atómica (Atomic Emission Spectrometry)AOAC-I Associação dos Químicos Analíticos Oficiais Internacional (Associa-
tion of Official Analytical Chemists International)
B Fracção ligada (imunoensaios)CI Ionização química (Chemicalionisation)
MRC Materialde referência certificado
CV Coeficiente de variação2-D BidimensionalDAD Detecção com sistema de díodos (Diode array detection)DPASV Voltametria de redissolução anódica de impulsos diferenciaisECD Detecção por captura de electrões (Electron Capture Detection)EI Ionização por impacto electrónico (Electronic Impact Ionisation)GC Cromatografia gasosa (Gas Chromatography)HPLC Cromatografia líquida de alta resolução (High Performance Liquid
Chromatography)
HPTLC Cromatografia em camada fina de alta resolução (High Performance
Thin Layer Chromatography)
HRMS (Espectrometria de massa) de alta resolução (High Resolution Mass
Spectrometry)
ICP-AES Espectrometria de emissão atómica com plasma indutivo (Inducti-
vely Coupled Plasma-Atomic Emission Spectrometry)
ICP-MS Espectrometria de massa com plasma indutivo (Inductively Coupled
Plasma-Mass Spectrometry)
IV InfravermelhoISO Organização Internacionalde Normal ização (InternationalStandard
Organisation)
LC Cromatografia líquida (Liquid Chromatography)LR(MS) (Espectrometria de massa) de baixa resolução [Low Resolution
(Mass Spectrometry)]
LMDR Limite mínimo de desempenho requerido
MS Espectrometria de massa (Mass Spectrometry)
m/z Razão massa/cargaRf Migração relativa à frente de solvente (cromatografia em camada
fina)
DPRL Desvio padrão relativo do laboratórioSIM Monitorização selectiva de iões (Selected Ion Monitoring)TLC Cromatografia em camada fina (Thin Layer Chromatography)
UV Luz ultravioleta
VIS Luz visível
5.REFERÊNCIAS
(1) ISO 17025: 1999 Generalrequirement for the competence of cal ibration
and testing laboratories
(2) ISO 3534-1: 1993 Statistical Methods for quality control — Vol. 1
vocabulary and symbols
(3) ISO Guide 43-1:1997 Proficiency testing by interlaboratory compari-
sons — Part 1: Development and operation of proficiency testing
shemes2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 33
▼B
(4) ISO Guide 43-2:1997 Proficiency testing by interlaboratory compari-
sons — Part 2: Selection and use of proficiency testing schemes by
laboratory accreditation bodies
(5) ISO 5725:1994 Accuracy (trueness and precision) of measurement
methods and results — Part 1: General principles and definitions; ISO
5725-2 Part 2: Basic method for the determination of repeatability and
reproducibility of a standard measurement method; Part 4: Basic
methods for the determination of the trueness of a standard measure-
ment method
(6) ISO 78-2:1999 Chemistry — Layouts for standards — Part 2: Methods
of chemicalanal ysis
(7) W.G de Ruig and J.M Weseman «A new approach to confirmation by
infrared spectrometry» J. Chemometrics 4 (1990) 61-77
(8) See e.g. May, T.W., Brumbaugh, W.G., 1982, Matrix modifier and
L'vov platform for elimination of matrix interferences in the analysis
of fish tissues for lead by graphite furnace atomic absorption spectro-
metry: Analytical Chemistry 54(7):1032-1037 (90353)
(9) Applications of Zeeman Graphite Furnace Atomic Absorption Spectro-
metry in the ChemicalLaboratory and in Toxicol ogy, C. Minoia, S.
Caroli (Eds.), Pergamon Press (Oxford), 1992, pp. xxvi + 675
(10) Inductively Coupled Plasmas in Analytical Atomic Spectrometry, A.
Montaser, D. W. Golighty (Eds.), VCH Publishers, Inc. (New York),
1992
(11) Plasma Source Mass Spectrometry Developments and Applications, G.
Holland, S. D. Tanner (Eds.), The Royal Society of Chemistry, 1997,
pp. 329
(12) IUPAC (1995), Protocolfor the design, conduct and interpretation of
method-performance studies, Pure & Applied Chem, 67, 331
(13) Jülicher, B., Gowik, P. and Uhlig, S. (1998) Assessment of detection
methods in trace analysis by means of a statistically based in-house
validation concept. Analyst, 120, 173
(14) Gowik, P., Jülicher, B. and Uhlig, S. (1998) Multi-residue method for
non-steroidal anti-inflammatory drugs in plasma using high perfor-
mance liquid chromatography-photodiode-array detection. Method
description and comprehensive in-house validation. J. Chromatogr.,
716, 221
(15) OAC-I Peer Verified Methods, Policies and Procedures, 1993, AOAC
International, 2200 Wilson Blvd., Suite 400, Arlington, Virginia
22201-3301, USA
(16) W.J. Youden; Steiner, E.H.; «StatisticalManualof the AOAC–Associa-
tion of OfficialAnal yticalChemists», AOAC-I, Washington DC: 1975,
p. 35 ff
(17) ISO 11843:1997 Capability of detection — Part 1: Terms and defini-
tions, Part 2: Methodology in the linear calibration case Part 2:
Methodology in the linear calibration case
(18) R.W. Stephany & L.A. van Ginkel: «Yield or recovery: a world of
difference». Proceedings 8thEuro Food Chem, Vienna, Austria
September 18-20 (1995) Federation of European ChemicalSocieties,
Event 206. ISBN 3-900554-17X, page 2-9
(19) Directiva 71/354/CEE do Conselho, de 18 de Outubro de 1971, relativa
à aproximação das legislações dos Estados-Membros respeitantes às
unidades de medida (JO L 243 de 29.10.1971, p. 29)
(20) ISO 31-0:1992 Quantities and units — Part 0: Generalprincipl es2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 34
▼M1
ANEXO II
Limites mínimos de desempenho requeridos
Substância e/ou metabolito Matrizes LMDR
Cloranfenicol Carne
Ovos 0,3 µg/kg
Leite
Urina
Produtos de aquicultura
Mel
Acetato de medroxiprogesterona Gordura de rins de suíno 1 µg/kg
Metabólitos de nitrofuranos:
— Furazolidona Carne de aves 1 µg/kg para todas
— Furaltadona Produtos de aquicultura
— Nitrofurantoína
— Nitrofurazona2002D0657 — PT — 15.03.2003 — 001.001 — 35