1978L0633 — PT — 19.08.1981 — 001.001 — 1
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►BOITAVA DIRECTIVADA COMISSÃO
de 15 de Junho de 1978
que fixa os métodos de análise comunitários para o controlo oficial dos alimentos para animais
(78/633/CEE)
(JO L 206 de 29.7.1978, p. 43)
Alterada por:
Jornal Oficial
n.opágina data
►M1Directiva 81/680/CEE da Comissão de 30 de Julho de 1981 L 246 32 29.8.1981
▼B
OITAVA DIRECTIVADA COMISSÃO
de 15 de Junho de 1978
que fixa os métodos de análise comunitários para o controlo oficial
dos alimentos para animais
(78/633/CEE)
A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,
Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Euro-
peia,
Tendo em conta a Directiva 70/373/CEE do Conselho, de 20 de Julho
de 1970, relativa à introdução das formas de recolha de amostras e dos
métodos de análise comunitários para o controlo oficial dos alimentospara animais(
1), com a última redacção que lhe foi dada pelo Acto de
Adesão e, nomeadamente, o seu artigo 2.o,
Considerando que a referida directiva prevê que o controlo oficial dos
alimentos para animais destinado a verificar se são respeitadas ascondições prescritas por disposições legislativas, regulamentares ouadministrativas relativas à qualidade e composição dos alimentos paraanimais, seja efectuado em conformidade com as formas de recolha de
amostras e os métodos de análise comunitários;
Considerando que as Directivas da Comissão 71/250/CEE de 15 de
Junho de 1971(
2), 71/393/CEE de 18 de Novembro de 1971(3), 72/
/199/CEE de 27 de Abril de 1972(4), 73/46/CEE de 5 de Dezembro de
1972(5), 74/203/CEE de 25 de Março de 1974(6), 75/84/CEE de 20 de
Dezembro de 1974(7) e 76/372/CEE de 1 de Março de 1976(8) fixaram
já um certo número de métodos de análise comunitários; que, tendo ematenção o estado de adiantamento dos trabalhos desde então efectuadosé conveniente adoptar uma oitava série de métodos;
Considerando que as medidas previstas na presente directiva estão em
conformidade com o parecer do Comité Permanente dos Alimentospara Animais,
ADOPTOU A PRESENTE DIRECTIVA:
Artigo 1.o
1. Os Estados-membros deverão determinar que as análises do teorde bacitracina-zinco, flavofosfolipol, ferro, cobre, manganés e zincoem alimentos para animais e destinadas ao controlo oficial destesúltimos sejam efectuadas em conformidade com os métodos descritosno anexo à presente directiva.
Artigo 2.o
Os Estados-membros põem em vigor, o mais tardar em 1 de Janeiro de
1981, as disposições legislativas, regulamentares e administrativas
necessárias para darem cumprimento à presente directiva. Deste factoinformarão imediatamente a Comissão.1978L0633 — PT — 19.08.1981 — 001.001 — 2
(1)J O n .oL 170 de 3. 8. 1970, p. 2.
(2)J O n .oL 155 de 12. 7. 1971, p. 13.
(3)J O n .oL 279 de 20. 12. 1971, p. 7.
(4)J O n .oL 123 de 29. 5. 1972, p. 6.
(5)J O n .oL 83 de 30. 3. 1973, p. 21.
(6)J O n .oL 108 de 22. 4. 1974, p. 7.
(7)J O n .oL 32 de 5. 2. 1975, p. 26.
(8)J O n .oL 102 de 15. 4. 1976, p. 8.▼M1
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Artigo 3.o
Os Estados-membros são destinatários da presente directiva.1978L0633 — PT — 19.08.1981 — 001.001 — 3
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ANEXO
1.DOSEAMENTO DA BACITRACINA-ZINCO POR DIFUSÃO EM
AGAR
1. FINALIDADE E OBJECTO DE APLICAÇÃO
Esta técnica permite dosear a bacitracina-zinco em alimentos, concen-
trados e misturas prévias. O limite inferior da dosagem é de 5 mg/kg
(5 ppm)(*). A técnica não é válida em presença de substâncias pertur-
badoras, em especial grandes quantidades de cobre ou ácido ascórbico.
2. PRINCÍPIO
A amostra é submetida a uma extracção a pH 2 mediante uma mistura
de metanol/água/ácido clorídrico. O extracto obtido é elevado a pH 6,5,
concentrado se necessário, e diluído. A sua actividade antibiótica é
determinada medindo a difusão da bactracina-zinco num meio à base
de agar semeado de Micrococcus luteus (syn.:M. flavus ). A difusão é
revelada pela formação de zonas de inibição do micro-organismo,
considerando-se ser o diâmetro dessas zonas directamente proporcional
ao logaritmo da concentração em antibiótico, relativamente ao leque
das concentrações utilizado.
3. MICRORGANISMO: MICROCOCCUS LUTEUS ATCC 10240
3.1.Conservação da estirpe
Semear o meio de cultura (4.1), em tudos inclinados, com Microcossus
luteus. Incubar 24 horas a 30-37 ºC, conservar em frigorífico a cerca de
4 ºC e renovar a sementeira de duas em duas semanas.
3.2.Preparação da suspensãobacteriana (a)
Recolher as bactérias de um tubo de agar (3.1) de preparação recente,
por meio de 2 a 3 ml de solução de cloreto de sódio (4.3). Semear em
superfície esta suspensão em 250 ml de meio de cultura (4.1) num
frasco de Roux e incubar 18 a 20 h a 30-37 ºC. Recolher as bactérias
em 25 ml de solução de cloreto de sódio (4.3) e homogeneizar. Diluir a
suspensão a 1/10 com a solução de cloreto de sódio (4.3). A trans-
missão luminosa da suspensão, medida a 650 nrn numa espessura de
1 cm por comparação com a solução de cloreto de sódio (4.3), deve
ser de cerca de 75 %.
4. MEIO DE CULTURA E REAGENTES
4.1.Meio de conservação da estirpe (b)
Peptona de carne 6,0 g
Triptona 4,0 g
Extracto de levedura 3,0 gExtracto de carne 1,5 g
Glucose 1,0 g
Agar 15,0 gÁgua 1 000 ml
pH 6,5-6,6 (após esterilização)
4.2.Meio da base de doseamento (
b)
Triptona 10,0 g
Extracto de levedura 3,0 g
Extracto de carne 1,5 g
Glucose 1,0 gAgar 20,0 g
Tween 80 1 ml
Água 1 000 mlpH 6,5 (após esterilização)
4.3. Solução a 0,8 % (p/v) de cloreto de sódio: dissolver em água 8 g de
cloreto de sódio p.a.; diluir a 1 000 ml e esterilizar.1978L0633 — PT — 19.08.1981 — 001.001 — 4
(*) 1 mg de bacitracina-zinco (da qualidade utilizada em alimentos para animais) equivale
a 42 unidades internacionais (UI).
(a) Poderão ser utilizados outros métodos na medida em que se comprove produzirem uma
suspensão bacteriana análoga.
(b) Poderá ser utilizado qualquer meio de cultura comercial de composição análoga e que
dê os mesmos resultados.
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4.4. Mistura de metanol puro/água/ácido clorídrico p.a. (d: 1,18-1,19):
80(17,5/2,5 (v/v/v).
4.5.Tampão fosfato, pH 6,5:
Fosfato bipotásico K2HPO4p.a. 22,15 g
Fosfato monopotássico KH2PO4p.a. 27,85 g
Água até 1 000 ml
4.6. Ácido clorídrico p.a., d: 1,18-1,19
4.7. Ácido clorídrico p.a. 0,1 N
4.8. Solução 1 N de hidróxido de sódio p.a.4.9. Solução a 0,04 % (p/v) de púrpura de bromocresol:
dissolver 0,1 g de púrpura de bromocresol em 18,5 ml de solução 0,01 N
de hidróxido de sódio. Adicionar água até obter 250 ml e homoge-
neizar.
4.10. Substância-padrão: bacitracina-zinco de actividade conhecida (em UI).
5. SOLUÇÕES-PADRÃO
Pesar uma quantidade de bacitracina-zinco-padrão (4.10) correspon-
dente a 1 050 UI (conforme teor indicado). Adicionar 5 ml de ácido
clorídrico 0,1 N (4.7) e deixar repousar 15 minutos. Adicionar 30 ml
de água, corrigir o pH para 4,5 por meio do tampão fosfato pH 6,5
(4.5) (cerca de 4 ml), adicionar água até obter 50 ml e homogeneizar
(1 ml = 21 UI).
Preparar, a partir desta solução, e por diluições sucessivas com o
tampão fosfato pH 6,5 (4.5), as soluções seguintes:
S
80,42 UI/ml
S40,21 UI/ml
S20,105 UI/ml
S10,0525 UI/ml
6. PREPARAÇÃO DE EXTRACTO
6.1.Extracção
6.1.1.Concentrados, pré-misturas e alimentos minerais
Pesar 2 a 5 g de amostra, adicionar 30 ml de mistura (4.4) e agitar
durante uns segundos. Verificar se o pH está a cerca de 2. Agitar
durante 10 minutos, adicionar 30 ml de tampão fosfato ph 6,5 (4.5) e
agitar durante 15 minutos. Diluir com o tampão fosfato (4.5) para obter
uma concentração teórica de bacitracina-zinco de 0,42 UI/ml (= U8).
6.1.2.Concentrados proteicos
Pesar 10 g de amostra, adicionar 50 ml da mistura (4.4) e agitar durante
uns segundos. Verificar se o pH está sensivelmente a 2. Agitar durante
10 minutos, adicionar 50 ml de tampão fosfato pH 6,5 (4.5) e agitar
durante 15 minutos. Diluir com o tampão fosfato (4.5) para obter uma
concentração teórica de bacitracina-zinco de 0,42 UI/ml (= U8).
6.1.3.Outros alimentos
Pesar 10 g de amostra (20 g para uma concentração teórica de bacitra-
cina-zinco de 5 mg/kg), adicionar 25 ml da mistura (4.4) e
homogeneizar durante cerca de 10 minutos. Adicionar 25 ml de tampão
fosfato pH 6,5 (4.5), agitar durante 15 minutos e centrifugar. Recolher
20 ml da solução sobrenadante, corrigir o pH para 6,5 com a solução
1 N de hidróxido de sódio (4.8), utilizando como indicador a solução
de púrpura de bromocresol (4.9). Deixar evaporar, até obter cerca de
4 ml, num evaporador de rotação, a uma temperatura não superior a
35 º C. Diluir o resíduo em água para obter uma concentração teórica
de bacitracina-zinco de 0,42 UI/ml (= U8).
6.2.Soluções do extracto
Preparar a partir da solução U8por diluições sucessivas (1 + 1) com o
tampão fosfato (4.5), as soluções U4(concentração estimativa: 0,21 UI/
/ml), U2(concentração teórica: 0,105 UI/ml) e U1(concentração teórica:
0,0525 UI/ml).1978L0633 — PT — 19.08.1981 — 001.001 — 5
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7. REGRAS DE DOSEAMENTO
7.1.Inoculação do meio de cultura
Semear a cerca de 50 ºC o meio de base da dosagem (4.2) com a
suspensão bacteriana (3.2). Determinar previamente, através de ensaios
preliminares do meio (4.2) em placa, a quantidade de suspensão bacte-
riana necessária à obtenção, nas diferentes concentrações de
bacitracina-zinco, de zonas de inibição o mais extensas possível e ainda
bem definidas.
7.2.Preparação das placas
A distribuição em meio de agar é feita em placas contendo as quatro
concentrações de solução-padrão (S8,S4,S2,S1) e as quatro concen-
trações do extracto (U8,U4,U2,U1). Cada placa terá necessariamente
de receber as quatro concentrações do padrão e do extracto, pelo que
devem para o efeito ser escolhidas placas cujas dimensões permitam a
abertura de pelo menos oito cavidades, de 10 a 13 mm de diâmetro e
cujos centros não distem entre si de mais de 30 mm, no meio de agar.
Podem ser utilizadas placas de vidro planas, debruadas com um anel de
alumínio ou matéria plástica, de 200 mm de diâmetro e 20 mm de
altura.
Introduzir nas placas a quantidade de meio (4.2), semeado como se
indica em 7.1, necessária à obtenção de uma camada de cerca de 2 mm
de espessura (50 ml para uma placa de 200 mm de diâmetro). Deixar
solidificar, abrir as cavidades e introduzir-lhes as soluções-padrão e do
extracto em volumes rigorosamente medidos (0,10 a 0,15 ml por cavi-
dade, conforme o diâmetro).
Repetir o processo pelo menos quatro vezes para cada concentração, de
modo a que cada análise compreenda a avaliação de 32 zonas de
inibição.
7.3.Incubação
Incubar as placas durante 16 a 18 horas, a cerca de 30 ºC.
8. AVALIAÇÃO
Medir o diâmetro das zonas de inibição até à aproximação de 0,1 mm.
Para cada concentração, registar os valores médios em papel semi-
-logarítmico, nele indicando o logaritmo das concentrações frente aos
diâmetros das zonas de inibição. Traçar as rectas resultantes mais repre-
sentativas da solução-padrão e do extracto procedendo, por exemplo, da
seguinte maneira.
Determinar o ponto mais representativo do nível mais baixo da solução-
-padrão (SL) com a ajuda da seguinte fórmula:
(a) SL ¼7S1þ4S2þS4/C02S8
10
Determinar o ponto mais representativo do nível mais elevado da
solução-padrão (SH) com a ajuda da seguinte fórmula:
(b) SH ¼7S8þ4S4þS2/C02S1
10
Determinar de igual modo os pontos mais representativos dos níveis
mais baixo (UL) e mais elebado (UH) do extracto substituindo S1,S2,
S4,eS8, nas fórmulas mencionadas, por U1,U2,U4eU8.
Inscrever os valores SL e SH no mesmo gráfico. Unindo os dois pontos,
obter-se-á a resultante mais representativa da solução-padrão. Proce-
dendo de idêntica maneira para UL e UH, obter-se-á a resultante mais
representativa do extracto.
Não havendo quaisquer interferências, as resultantes deveriam ser para-
lelas, Na prática, considerar-se-ão como sendo paralelas se (SH — SL)
e (UH — UL) não diferirem em mais de 10 % das respectivas médias.
Se as resultantes não forem paralelas, poder-se-á eliminar quer U1eS1,
quer U8eS8. Os valores SL, SH, UL e UH, que são os que permitem
obter as resultantes mais representativas, serão então calculados com a
ajuda das seguintes fórmulas:1978L0633 — PT — 19.08.1981 — 001.001 — 6
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(a′)5S1þ2S2/C0S4
6ou5S2þ2S4/C0S8
6
(b′)5S4þ2S2/C0S1
6ou5S8þ2S4/C0S2
6
e de fórmulas análogas para UL e UH. A utilização desta alternativa
deve, igualmente, ser objecto de uma verificação do paralelismo entre
as resultantes, como acima se indica. A obtenção de um resultado
proveniente de três níveis deve ser mencionada no boletim de análise.
Sempre que as resultantes forem consideradas como estando paralelas,
calcular o logaritmo da activadade relativa (log. A) mediante uma das
fórmulas seguintes.
Para 4 níveis
(c) log :A¼U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C20;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Para 3 níveis
(d) log :A¼U1þU2þU4/C0S1/C0S2/C0S4 ðÞ /C2 0;401
U4þS4/C0U1/C0S1
(d′) log :A¼U2þU4þU8/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C2 0;401
U8þS8/C0U2/C0S2
Actividade real = actividade teórica × actividade relativa.
Sempre que as resultantes forem consideradas como não estando para-
lelas,repetir. Se esta ainda não permitir atingir o paralelismo, calcular o
logaritmo da actividade relativa (log. A) por meio da fórmula (c). O
resultado obtido deverá, no entanto, ser considerado como aproximado,
facto que deverá ser mencionado no boletim de análise.
9. REPRODUTIBILIDADE
A diferença entre os resultados de duas determinações, efectuadas sobre
uma mesma amostra pelo mesmo analista, não deverá ultrapassar:
20 % do resultado mais elevado observado para os teores em bacitra-
cina-zinco de 5 a 25 mg/kg, 5 mg/kg, em valor absoluto, para os
teores entre 25 mg/kg e 50 mg/kg,
5 mg/kg, em valor absoluto, para os teores entre 25 mg/kg e 50 mg/kg,
10 % do resultado mais elevado observado para os teores superiores a
50 mg/kg.
2.DOSEAMENTODOFLAVOFOSFOLIPOLPORDIFUSÃOEMAGAR
1. FINALIDADE E OBJECTO DE APLICAÇÃO
Esta técnica permitirá dosear o flavofosfolipol em alimentos, concen-
trados e pré-misturas. O limite inferior da dosagem é de 1 mg/kg
(1 ppm).
2. PRINCÍPIO
A amostra é submetida a uma extracção por metanol diluído mediante
aquecimento por refluxo. O extracto é centrifugado, purificado se
necessário em resinas permutantes de iões e diluído. A sua actividade
antibiótica determina-se medindo a difusão do flavofosfolipol num
meio de agar, semeada com Staphylococcus aureus . A difusão é reve-
lada pela formação de zonas de inibição do micro-organismo, cujo
diâmetro se considera como sendo directamente proporcional ao loga-
ritmo da concentrações utilizadas.
3. MICRORGANISMO: STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 6538 P
3.1.Conservação da estirpe
Semear meio de cultura (4.1), em tubus inclinados, com Staphylococcus
aureus. Incubar 24 horas a 37 ºC, conservar em frigorífico a 4 ºC, apro-
ximadamente, e renovar a sementeira todos os meses.1978L0633 — PT — 19.08.1981 — 001.001 — 7
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3.2.Preparação da suspensãobacteriana (a)
Fazer a colheita de dois tubos que contemham a cultura-mãe (3.1) e
renovar a sementeira todas as semanas. Incubar 24 horas a 37 ºC e
conservar em frigorífico a 4 ºC aproximadamente.
24 horas antes da dosagem, semear com estas culturas dois a quatro
tubos inclinados contendo meio de cultura (4.1).
Incubar 16 a 18 horas a 37 ºC. Seguidamente, colocar em suspensão as
bactérias na solução de cloreto de sódio (4.3). A transmissão da luz na
suspensão, medida a 578 nm numa espessura de 1 cm por comparação
com a solução de cloreto de sódio, deverá ser de cerca de 40 %.
4. MEIOS DE CULTURA E REAGENTES
4.1.Meio de conservação da estirpe (b)
Peptona de carce 6,0 g
Triptona 4,0 gExtracto de levedura 3,0 gExtracto de carne 1,5 gGlucose 1,0 gAgar 15,0 gÁgua 1 000 mlpH 6,5 (após esterilização)
4.2.Meio de base do doseamento
4.2.1.Camada inferior (
c)
Peptona de carne 6,0 g
Extracto de levedura 3,0 gExtracto de carne 1,5 gAgar 10,0 gÁgua 1 000 mlpH 6,5 (após esterilização)
4.2.2.Camada a semear
Meio de cultura (4.1), adicionado de 2 g de emulsão anti-espuma de
silicone(
d).
4.3. Solução de cloreto de sódio a 0,4 % (p/v): dissolver em água 4 g de
cloreto de sódio p.a., diluir a 1 000 ml e esterilizar.
4.4. Metanol puro.
4.5. Metanol a 50 % (v/v): diluir 500 ml de metanol (4.4) por cada 500 ml
de água
4.6. Metanol a 80 % (v/v): diluir 800 ml de metanol (4.4) por cada 200 ml
de água.
4.7. Tri(hidroximetil)aminometano p.a.4.8. Solução metanólica, a 1,5 % (p/v) de cloreto de potássio: dissolver 1,5 g
de cloreto de potássio p.a. em 20 ml de água, adicionando metanol (4.4)
até à obtenção de um volume de 100 ml.
4.9. Permutador de catiões: Dowex 50 WX8, 20-50 mesh, forma Na (cat.
Serva n.
o41600) ou equivalente.
4.10. Permutador de aniões: Dowex 1X2, 50-100 mesh, forma Cl (cat. Serva
n.o41010) ou equivalente. Antes da utilização, manter o producto em
metanol a 80 % (4.6) durante 12-14 horas.
4.11. Lã de vidro.4.12. Papel indicador de pH (pH 6,6-8,1)4.13. Ácido ascórbico.4.14. Substância padrão: flavofosfolipol de actividade conhecida.1978L0633 — PT — 19.08.1981 — 001.001 — 8
(a) Poderão ser utilizados outros métodos desde que se prove produzirem idêntica
suspensão bacteriana.
(b) Poderá ser utilizado qualquer meio de cultura comercial, de composição análoga e que
dê os mesmos resultados como por exemplo o Oxoid Antibiotic Medium (CM 327),
adicionado de agar Oxoid n.o3 (L 13).
(c) Poderá ser utilizado qualquer meio de cultura comercial, de composição análoga e que
dê os mesmos resultados, como per exemplo o Oxoid Antibiotic Medium 2(CM 335),adicionado de agar Oxoid n.
o3 (L 13).
(d) Por ejemplo o SE 2, de Wacker Chemie GmbH, Munique.
▼B
5. MATERIAL
5.1. Tubo de vidro para cromatografia, com 9 mm de diâmetro interno e
150-200 mm de comprimento. torneira na parte mais afilada da extre-
midade inferior e rosca normalizada (para acoplamento do funil 5.2)
na extremidade superior.
5.2. Funil com reservatório de 250 ml. torneira e rosca normalizada.
5.3. Frasco cónico de 250 ml, com rosca normalizada.5.4. Refrigerador por refluxo, com rosca normalizada.
6. SOLUÇÕES PADRÃO
Dissolver uma quantidade rigorosamente pesada de substância-padrão
(4.14) em metanol a 50 % (4.5) e diluir, para obter uma sulução-mãe
de flavofosfolipol a 100 µg/ml. Conservada en frasco fechada a 4 ºC,
esta solução manter-se-á estável durante dois meses.
Preparar, a partir desta solução e por diluições sucessivas com metanol
a 50 % (4.5), as seguintes soluções:
S
80,2 µg/ml
S40,1 µg/ml
S20,05 µg/ml
S10,025µg/ml
7. PREPARAÇÃO DO EXTRACTO
7.1.Extracção
7.1.1.Concentrados, pré-misturas e alimentos minerais
Pesar de amostra 2 a 5 g e adicionar cerca de 150 mg de ácido ascór-
bico (4.13). Misturar com 150 mg de metanol a 50 % (4.5) num fasco
(5.3) e corrigir o pH para 8,1-8,2 mediante cerca de 400 mg de tri(hi-
droximetil)aminometano (4.7). Controlar o pH por meio de papel
indicador (4.12). Deixar macerar 15 minutos, corrigir novamente o pH
a 8,1-8,2 com tri(hidroximetil)aminometano (4.7) e ferver em seguida
durante 10 minutos sob refrigeração por refluxo (5.4), mexendo sempre.
Deixar arrefecer e em seguida centrifugar e decanter o extracto.
7.1.2.Outros alimentos
Pesar 5 a 30 g de amostra contendo pelo menos 30 µg de flavofosfo-
lipol. Misturar com 150 ml de metanol a 50 % (4.5) num frasco (5.3)
e corrigir o pH para 8,1-8,2, com cerca de 400 mg de tri(hidroximetil)a-
minometano (4.7), e seguidamente ferver durante 10 minutos sob
refrigeração por refluxo (5.4), mexendo sempre. Deixar arefecer e em
seguida centrifugar e decantar o extracto.
7.2.Purificação (esta operação pode ser dispensada para concentrados,
pré-misturas e alimentos minerais).
Musturar 110 ml de extracto em 11 g de permutador de catiões (4.9) e
ferver durante um minuto sob refigeração por refluxo (5.4), mexendo
sempre. Separar o permutador de catiões por centrifugação ou filtragem.
Misturar 100 ml de extracto com 150 ml de metanol (4.4) e deixar
repousar a solução 12 a 15 horas a 4 ºC. Eliminar a substância flocu-
lenta por filtigem a frio.
Fechar a extremidade inferior de um tubo (5.1) com tampão de 1ã de
vidro (4.11), deitar no tubo 5 ml de permutador de aniões (4.10) e lavar
a coluna com 100 ml de metanol a 80 % (4.6). Transvasar em sequida
para a coluna, com o funil (5.2), um volume de 100 ml, pelo menos, de
filtrado, que teoricamente contenha 16 µg de flavofosfolipol (200 ml
por cada 30 g de alimento a 1 ppm). Se necessário diluir o filtrado
antes de o transvasar para a coluna, com metanol a 80 % (4.6) para
obter uma concentração teórica de flavofosfolipol de 16 µg por 100 ml.
Regular o caudal de saída do líquido para cerca de 2 ml por minuto.
Eliminar a totalidade do filtrado. Lavar em seguida a coluna com
50 ml de metanol a 80 % (4.6) e eliminar o filtrado.
Eluir o flavofosfilipol pela solução metanólica de cloreto de potássio
(4.8), mantendo o caudal de saída a cerca de 2 ml por minuto. Recolher
50 ml de líquido eluído para uma proveta graduada, adicionar 30 ml de
água e homogeneizar. O teor de flavofosfolipol desta solução deverá ser
de 0,2 µg/ml (= U8).1978L0633 — PT — 19.08.1981 — 001.001 — 9
▼B
7.3.Soluções do extracto
Se necessário (em particular nos casos em que for dispensada a purifi-
cação), diluir o extracto obtido em 7.1.1 com metanol a 50 % (4.5) para
obter uma concentração teórica de flavofosfolipol de 0,2 µg/ml (= U8).
Preparar, a partir da solução U8por diluições sucessivas (1 + 1) com
metanol a 50 % (4.5), as soluções U4(concentração teórica: 0,1 µg/
/ml), U2(concentração teórica: 0,005 µg/ml) e U1(concentração teórica:
0,025 µg/ml).
8. REGRAS DE DOSEAMENTO
8.1.Inoculação do meio de cultura
Semar com a suspensão bacteriana (3.2) o meio de base do doseamento
(4.2.2), a cerca de 50 ºC. Determinar, por ensaios preliminares com o
meio (4.2.2) em placas, a quantidade de suspensão bacteriana necessária
à obtenção, para as diferentes concentrações em flovofosfolipol, de
zonas de inibição tão amplas quanto possível que sejam ainda bem defi-
nidas (aproximadamente 30 ml por litro).
8.2.Preparação das placas
A difusão em agar é feita em placas contendo as quatro concentrações
da solução-padrão S8,S4,S2,S1) e as quatro concentrações do extracto
(U8,U4,U2,U1). Cada placa terá obrigatoriamentede receber as quatro
concentrações-padrão e de extracto. Para o efeito, escolher placas cujas
dimensões permitam a abertura no meio de agar, de pelo menos oito
cavidades de 10 a 13 mm de diâmetro e cujos centros não distem
menos de 30 mm entre si. Podem ser utilizadas placas de vidro,
debruadas com aro de alumínio ou substância plástica, de 200 mm de
diâmetro e 20 mm de altura.
Introduzir nas placas uma doze de meio (4.2.1) que permita obter uma
camada de aproximadamente 1,5 mm de espessuar (45 ml, para uma
placa de 200 mm de diâmetro). Deixar solidificar e adicionar o meio
(4.2.2), semeado como indicado em 8.1, em quantidade suficiente para
a obtenção de uma camada de 1 mm de espessura (30 ml para uma
placa de 200 mm de diâmetro). Deixar solidificar, abrir as cavidades e
nelas depositar os volumes, rigorosamente medidos, das soluções-
-padrão e do extracto (0,10 a 0,15 ml por cavidade, conforme o
diâmetro).
Fazer pelo menos quatro repetições do ensaio para cada concentração,
de forma a que cada determinação englobe a avaliação de 32 zonas de
inibição.
8.3.Incubação
Incubar as placas durante 16 a 18 horas, a 28-30 ºC.
9. AVALIAÇÃO
Medir o diâmetro das zonas de inibição até à aproximação de 0,1 mm.
Para cada concentração, registar os valores médios em papel semi-
-logarítmico colocando o logaritmo no alinhamento dos diâmetros das
zonas de inibição. Traçar as resultantes mais representativas da
solução-padrão e do extracto procedendo, por exemplo, da seguinte
maneira:
Determinar o ponto mais representativo do nível mais baixo observado
na solução-padrão (SL), através da fórmula seguinte:
(a) SL ¼7S1þ4S2þS4/C02S8
10
Determinar o ponto mais representativo do nível mais elevado obser-
vado na solução-padrão (SH) por meio da fórmula seguinte:
(b) SH ¼7S8þ4S4þS2/C02S1
10
Determinar da mesma forma os pontos mais representativos do extracto,
tanto para o seu nível mais baixo (UL) como para o seu nível mais
elevado (UH), substituindo S1,S2,S4yS8, nas fórmulas supramencio-
nadas, por U1,U2,U4yU8.
Inscrever os valores SL e SH no mesmo gráfico. Unindo os dois pontos,
obtém-se a resultante mais representativa da solução-padrão. Proce-1978L0633 — PT — 19.08.1981 — 001.001 — 10
▼B
dendo da mesma forma para UL e UH, obtém-se a resultante mais
representativa do extracto.
Caso não tenha havido interferências, estas resultantes deverão ser
parlelas. Na prática, considerar-se-ão como estando paralelas se (SH-
-SL) e (UH-UL) não se afastarem em mais de 10 % da sua mediana.
Se as resultantes não forem paralelas, poder-se-á eliminar quer U1eS1quer U8eS8. Os valores SL, SH, UL e UH, que são os que permitem
obter as resultantes mais fiéis, serão então calculados mediante as
seguintes fórmulas:
(a′)S L¼5S1þ2S2/C0S4
6ou5S2þ2S4/C0S8
6
(b′)S H¼5S4þ2S2/C0S1
6ou5S8þ2S4/C0S2
6
e fórmulas análogas para UL e UH. Nesta alternativa deve igualmente
verificar-se o paralelismo das resultantes, como acima se indica. Deve
ser mencionada no boletim de análise a obtenção de um resultado
proveniente de três níveis.
Sempre que as resultantes forem consideradas como estando paralelas,
calcular o logaritmo da actividade relativa (log. A) por intermédio das
fórmulas seguintes.
Para 4 níveis
(c) log :A¼U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C2 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Para 3 níveis
(d) log :A¼U1þU2þU4/C0S1/C0S2/C0S4 ðÞ /C2 0;401
U4þS4/C0U1/C0S1
(d′) log :A¼U2þU4þU8/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C2 0;401
U8þS8/C0U2/C0S2
Actividade real = actividade teórica × actividade relativa
Sempre que as resultantes não forem consideradas como estando para-
lelas,repretir a determinação. Se esta ainda não permitir atingir o
paralelismo, calcular o logaritmo da actividade relativa (log. A) por
meio da fórmula (c). O resultado obtido deverá, no entanto, ser consi-
derado como meramente aproximativo, disso devendo ser feita menção
no boletim de análise.
10. REPRODUTIBILIDADE
A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas com a
mesma amostra e pelo mesmo analista não deverão ultrapassar:
0,5 mg/kg, em valor absoluto, para teores de flavofosfolipol entre 1 e
2 mg/kg,
25 % do resultado mais elevado para teores entre 2 mg/kg e áte 10 mg/
/kg,
20 % do resultado mais elevado para teores entre 10 mg/kg e até 25 mg/
/kg,
5 mg/kg, em valor absoluto, para teores entre 25 mg/kg e até 50 mg/kg,
10 % do resultado mais elevado para teores superiores a 50 mg/kg.
3.DOSEAMENTO DOS OLIGO-ELEMENTOS FERRO, COBRE,
MANGANÉS E ZINCO
1. FINALIDADE E OBJECTO DE APLICAÇÃO
Esta técnica permite dosear os oligo-elementos ferro, cobre, manganés e
zinco em alimentos para animais. São os seguintes os valores de deter-
minação mínimos:
ferro (Fe) 20 mg/kg,
cobre(Cu) 10 mg/kgmanganés(Mn) 20 mg/kg1978L0633 — PT — 19.08.1981 — 001.001 — 11
▼B
cinco(Zn) 20 mg/kg
2. PRINCÍPIO
A amostra é colocada em solução no ácido clorídrico, após a eventual
destruição de substâncias orgânicas. Os elementos ferro, cobre,
manganés e zinco são determinados, após a diluição apropiada, por
espectrometria de absorção atómica.
3. REAGENTES
Observações préviasA água utilizada na prepração dos reagentes e das soluções necessárias
ao processo de análise deverá estar isenta dos catiões a determinar,
devendo obter-se mediante dupla destilação num aparelho de borosili-
cato ou de quartzo, ou por dupla troca em resina permutadora de iões.
Os reagentes devem ser, pelo menos, da qualidade «para análise» (p.a.).
A ausência do elemento a determinar deve ser verificada por um ensaio
em branco. Os reagentes podem, se necessário, ser bubmentidos a uma
maior purificação.
As soluções-padrão adiante descritas poderão ser substituídas por
soluções-padrão comerciais, desde que venham garantidas e sejam
testadas antes da sua utilização.
3.1. Ácido clorídrico p.a.d: 1,19.3.2. Ácido clorídrico p.a., 6 N.3.3. Ácido clorídrico p.a., 0,5 N.3.4. Ácido fluorídrico a 38-40 % (v/v), com um tero de ferro inferior a 1 mg/
/1 e resíduo de evaporação inferior a 10 mg (expressos em sulfatos)/1.
3.5. Ácido sulfúrico p.a., d: 1,84.3.6. Água oxigenada p.a., a aproximadamente 100 vol. de oxigénio (30 %
em peso).
3.7. Solução-padrão de ferro (1 000 µg Fe/ml): dissolver 1 g de arame de
ferro p.a. em 200 ml de ácido clorídrico 6 N (3.2), adicionar 16 ml de
água oxigenada (3.6) e completar o volume com água até atingir 1 litro.
3.7.1. Solução-padrão de trabalho (100 µg Fe/ml): diluir la solucção-padrão
(3.7) em água, na proporção 1 + 9.
3.8. Solução-podrão de cobre (100 µg Cu/ml): dissolver 1 g de cobre em pó
p.a. em 25 ml de ácido clorídrico 6 N (3.2), adicionar 5 ml de água
oxigenada (3.6) e completar a solução com água até obter o volume
de 1 litro.
3.8.1. Solução-padrão de trabalho (10 µg Cu/ml): diluir a solução-padrão (3.8)
em água na proporção de 1 + 9; diluir em seguida esta solução em
água, na proporção de 1 + 9.
3.9. Solução-padrão de magnanés (1 000 µg Mn/ml): dissolver 1 g de
manganés em pó p.a. em 25 ml de ácido clorídrico 6 N (3.2) e
adicionar água até à obtenção de 1 litro.
3.9.1. Solução-padrão de trabalho (10 µg Mn/ml): diluir aasolução-padrão
(3.9) em água na proporção de 1 + 9; diluir seguidamente em água a
solução obtida, na porporção de 1 + 9.
3.10. Solução-padrão de zinco (1 000 µg Zn/ml): dissolver 1 g de zinco, em
barra ou placa p.a., em 25 ml de ácido clorídrico 6 N (3.2) e adicionar
água até obter o volume 1 litro.
3.10.1. Solução-padrão de trabalho (10 µg Zn/ml): diluir a solução-padrão
(3.10) em água na proporção de 1 + 9; diluir em seguida esta solução
em água, na proporção de 1 + 9.
3.11. Solução de cloreto de lantâneo: dissolver 12 g de óxido de lantâneo em
150 ml de água, adicionar 100 ml de ácido clorídrico 6 N (3.2) e
completar a solução com água até obter 1 litro.
4. MATERIAL
4.1. Mufla de temperatura regulável e controlável.4.2. Copos em borosilicato, resistentes. Recomenda-se a utilização de mate-
rial que sirva exclusivamente para dosagens de olig-elementos.1978L0633 — PT — 19.08.1981 — 001.001 — 12
▼B
4.3. Cápsulas de platino, ou eventualmente quartzo.
4.4. Espectrofotómetro de absorção atómica, de características de sensibili-
dade e precisão de medida compativeis com as exigências desta técnica.
5. MÉTODO
5.1.Amostra contendo compostos orgânicos.
5.1.1.Incineração e preparação da solução a analisar (*)
i) Colocar de 5 a 10 g de amostra, pesadas até à aproximação de
0,2 mg, numa cápsula de quartzo ou platina (4.3) [ver nota b)], secar
em estufa a 150 ºC e introduzir a cápsula na mufla (4.1) a frio.
Fechar a mufla [ver nota c)] e elevar progressivamente a sua tempe-
ratura por forma a que atinja aproximadamente 450 ºC a 475 ºC em
90 minutos. Manter esta temperatura durante 4 a 16 horas (durante a
noite, por exemplo) para eliminar a substância carbonosa, abrir em
seguida a mufla e deixar arrefecer [ver nota d)].
Humedecer as cinzas com água a transvasá-las em seguida para um
copo 250 ml. Lavar a cápsula com 5 ml de ácido clorídrico (3.1) e
transvasar, lentamente e com precaução, a solução de lavagem para
o copo (poderá produzir-se uma reacção violenta pela formação de
CO2.). Em seguida adicionar gota a gota o ácido clorídrico (3.1),
mexendo o conteúdo do copo até que cesse a efervescência.
Evaporar a seco, mexendo regularmente com uma vareta.
Juntar ao resíduo 15 ml de ácido clorídrico 6 N (3.2) e, em seguida,
eproximadamente 120 ml de água. Misturar com a vareta, deixá-la
no copo, cobrindo-o com um vidro de relógio. Levar lentamente a
ebulição e ferver em lume brando até que a dissolução das cinzas
deixe de ser visível. Filtrar com papel filtro, sem cinzas, e recolher
o filtrado para um balão de aferição de 250 ml. Lavar o copo e o
filtro em 5 ml de ácido clorídrico 6 N (3.2) quente e duas vezes
em água a ferver. Completar o volume com água (a concentração
em HC1 é aproximadamente de 0,5 N).
ii) Se o resíduo que ficou no filtro for de cor negra (carbonosa) levá-lo
de novo ao forno e incinerá-lo a 450-475 ºC. Esta incineração, que
requer apenas algumas horas (3 a 5 horas, aproximadamente),
consider-se-á terminada quando as cinzas se apresentarem de cor
branca ou quase branca. Dissolver o resíduo em aproximadamente
2 ml de ácido clorídrico (3.1), evaporá-lo a seco e adicionar 5 ml
de ácido clorídrico 6 N (3.2). Aquecer, filtrar a solução para o balão
de aferição e completar o volume com água (a concentração em
HC1 é de aproximadamente 0,5 N).
Nota:
a) Convém chamar a atenção para o risco, durante o doseamento dos
oligo-elementos, de contaminação designadamente pelo zinco, cobre
e ferro. É por essa razão que os instrumentos utilizados na prepa-
ração das amostras devem estar isentos destes metais.
Para reduzir o risco de contaminação, é conveniente trabalhar numa
atmosfera isenta de peiras, com material rigorosamente limpo e
vidros cuidadosamente lavados. O doseamento do zinco é especial-
mente propício à contaminação, em especial por matérias
provenientes dos vidros, reagentes, poeira, etc.
b) Calcular o peso da amostra a incinerar em função do teor estimado
de oligo-elementos a dosear no alimento e da sensibilidade do
espectrofotómetro utilizado. Para certos alimentos pobres em oligo-
-elementos, poderá ser necessário colher uma amostra de 10 a 20 g e
limitar o volume da solução final a 100 ml.
c) Incinerar num forno fechado, sem injecção de ar nem de oxigénio.1978L0633 — PT — 19.08.1981 — 001.001 — 13
(*) As forragens verdes (frescas ou desidratadas) são susceptíveis de conter grandes quan-
tidades de sílica vegetal que pode reter oligo-elementos que devem ser elimindos. Asamostras destes alimentos devem ser submetidas ao seguinte tratamento: efectuar a
operação 5.1.1 i) até ao estádio da filtração. Lavar duas vezes em água a ferver o
papel filtro que contém o resíduo insolúvel e colocá-10 numa capsula de platina(4.3). Incinerar na mufla (4.1) a uma temperatura inferior a 550 ºC até desaparecercompletamente toda a substância carbonosa. Deixar arrefecer, juntar algumas gotasde água, deitar em seguida 10 a 15 ml de ácido fluorídrico (3.4) e evaporar a seco, a
aproximadamente 150 ºC. Se o resíduo ainda contiver sílica, dissolvê-la em alguns ml
de ácido fluorídrico (3.4) e evaporar a seco. Juntar 5 gotas de ácido sulfúrico (3.5) eaquecer até ao desaparecimento do fumo branco. Juntar 5 ml de ácido clorídrico 6 N(3.2) e aproximadamente 30 ml de água, aquecer, filtrar a solução num balão deaferição de 250 ml e completar o volume com água (a concentração em HC1 é apro-
ximadamente de 0,5 N). Prosseguir a operação a partir do ponto 5.1.3.
▼B
d) A temperatur indicada pelo pirómetro não deverá ultrapassar os
475 ºC.
5.1.2.Determinação espectrofotométrica.
5.1.2.1. Preparação das soluções de aferição
Preparar por cada oligo-elemento a dosear um grama de cada solução
de aferição, a partir das soluções-padrão de trabalho 3.7.1, 3.8.1, 3.9.1
e 3.10.1, de modo a que cada solução de aferição fique com uma
concentração em HC1 de aproximadamente 0,5 N e, no caso do ferro,
do manganés e do zinco, uma concentração em cloreto de lantâneo
correspondente a 0,1 % de lantâneo (p/v). As concentrações de oligo-
-elementos escolhidas deverão situar-se na zona de sensibilidade do
espetrofotómetro utilizado. Os quadros adiante apresentados indicam, a
título de exemplo, alguns tipos de composição da solução de aferição;
poderá ser necessário, conforme o tipo e a sensibilidade do espectrofo-
tómetro utilizado, optar por outras concentrações.
Ferro
µg Fe/ml 0 0,5 1 2 3 4 5
ml de solução de
trabalho-padrão
(3.7.1)
(1 ml = 100 µg Fe) 0 0,5 1 2 3 4 5
+ ml HC1 6 N
(3.2)7 7 77777
+ 10 ml de solução de cloreto de lantâneo (3.11); completar o volume
com água até obter 100 ml.
Cobre
µg Cu/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
ml de solução de
trabalho-padrão
(3.8.1)
(1 ml = 10 µg CU) 0 1 2 4 6 8 10
+ ml HC1 6 N
(3.2)88888 1 08
Completar o volume com água até obter 100 ml.
Manganés
µg Mn/ml 0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
ml de solução de
trabalho-padrão
(3.9.1)
(1 ml = 10 µg Mn) 0 1 2 4 6 8 10
+ ml HC1 6 N
(3.2)777777 7
+ 10 ml de solução de cloreto de lantâneo (3.11); completar o volume
com água até obter 100 ml.
Zinco
µg Zn/ml 0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8
ml de solução de
trabalho-padrão
(3.10.1)
(1 ml = 10 µg Zn) 0 0,5 1 2 4 6 8
+ ml HC1 6 N
(3.2)7 7 777771978L0633 — PT — 19.08.1981 — 001.001 — 14
▼B
µg Zn/ml 0 0,05 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8
+ 10 ml de solução de cloreto de lantâneo (3.11), completar o volume
com água até obter 100 ml.
5.1.2.2. Preparação da solução a analisar
Para o doseamento do cobre, a solução preparada como indicado em
5.1.1 poderá, regra geral, ser utilizada directamente. Se for necessário
incluir a concentração de cobre no leque das concentrações das
soluções de aferição, poderá intriduzir-se por pipeta uma parte alíquota
num balão de aferição de 100 ml e completado o volume obtido com
ácido clorídrico 0,5 N (3.3) (ver tambén o ponto 8, «Observações»).
5.1.2.3. Ensaio em branco
Efectuar sem a amostra um ensaio em branco que inclua todas as etapes
constantes do método. A solução de aferição «O» não deve ser utilizada
como «branco».
5.1.2.4. Medição da absorção atómica
Medir a absorção das soluções de aferição e da solução a analisar utili-
zando uma chama oxidante ar-acetileno com os seguintes comprimentos
de onda:
Fe 248,3 nm
Cu 324,8 nm
Mn 279,5 nm
Zn 213,8 nm.
Repetir quatro vezes cada medição.
5.2. Compostos minerais
Na ausência de matérias orgânicas é inutil a incineração prévia. Seguir
o método a partir do segundo parágrafo do ponto 5.5.1 i). Pode ser
dispensada a evaporação em presença de ácido fluorídrico.
6. CÁLCULO DOS RESULTADOS
Calcular a concentração de oligo-elementos na solução a analisar, por
meio de uma curva de aferição, e exprimir o resultado em mg de olig-
-elemento por dada kg de amostra (ppm).
7. REPRODUTIBILIDADE
A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efec-
tuadas com uma mesma amostra pelo mesmo analista não deverá
ultrapassar:
— 5 mg/kg, em valor absoluto, para os teores de olig-elemento visado
inferiores a 50 mg/kg,
— 10 % do mais alto valor obtido nos teores entre 50 e 100 mg/kg,— 10 mg/kg, em valor absoluto, para os teores entre 100 e 200 mg/kg,— 5 % do mais alto valor obtido em teores superiores a 200 mg/kg.
8. OBSERVAÇÕES
A presença de grandes quantidades de fosfatos poderá influir no dosea-
mento do ferro, manganés e zinco. Esta interferência deve ser corrigida
pela adição de uma solução de cloreto de lantâneo (3.11). Se, no
entanto a amostra tiver um quociente de ponderação de
CaþMg
p>2;podera ser dispensada a adição da solução de cloreto
de lantâneo (3.11) à solução a analisar e às soluções de aferição.1978L0633 — PT — 19.08.1981 — 001.001 — 15