01991R2568 — PT — 04.12.2016 — 031.005

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▼B

REGULAMENTO (CEE) N.o 2568/91 DA COMISSÃO

de 11 de Julho de 1991

relativo às características dos azeites e dos óleos de bagaço de azeitona, bem como aos métodos de análise relacionados







▼M20

Artigo 1.o

1. São considerados azeites virgens, na acepção do ponto 1, alíneas a), b) e c), do anexo do Regulamento n.o 136/66/CEE, os azeites que apresentem as características indicadas nos pontos 1 e 2 do anexo I do presente regulamento.

2. É considerado azeite lampante, na acepção do ponto 1, alínea c) do anexo do Regulamento n.o 136/66/CEE, o azeite que apresente as características indicadas no ponto 3 do anexo I do presente regulamento.

3. É considerado azeite refinado, na acepção do ponto 2 do anexo do Regulamento n.o 136/66/CEE, o azeite que apresente as características indicadas no ponto 4 do anexo I do presente regulamento.

4. É considerado azeite constituído por azeite refinado e azeites virgens, na acepção do ponto 3 do anexo do Regulamento n.o 136/66/CEE, o azeite que apresente as características indicadas no ponto 5 do anexo I do presente regulamento.

5. É considerado óleo de bagaço de azeitona bruto, na acepção do ponto 4 do anexo do Regulamento n.o 136/66/CEE, o óleo que apresente as características indicadas no ponto 6 do anexo I do presente regulamento.

6. É considerado óleo de bagaço de azeitona refinado, na acepção do ponto 5 do anexo do Regulamento n.o 136/66/CEE, o óleo que apresente as características indicadas no ponto 7 do anexo I do presente regulamento.

7. É considerado óleo de bagaço de azeitona, na acepção do ponto 6 do anexo do Regulamento n.o 136/66/CEE, o óleo que apresente as características indicadas no ponto 8 do anexo I do presente regulamento.

▼M26

Artigo 2.o

1. A determinação das características dos azeites e dos óleos de bagaço de azeitona previstas no anexo I é efetuada de acordo com os seguintes métodos de análise:

a) Para determinação dos ácidos gordos livres, expressos em percentagem de ácido oleico, o método descrito no anexo II;

b) Para determinação do índice de peróxidos, o método descrito no anexo III;

c) Para determinação do teor de ceras, o método descrito no anexo IV;

d) Para determinação da composição e do teor de esteróis e de diálcoois triterpénicos por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar, o método descrito no anexo V;

e) Para determinação da percentagem de monopalmitato de 2-glicerilo, o método descrito no anexo VII;

f) Para a análise espetrofotométrica, o método descrito no anexo IX;

▼M28

g) Para determinação da composição de ácidos gordos, o método descrito no anexo X;

▼M26

h) Para determinação dos solventes halogenados voláteis, o método descrito no anexo XI;

i) Para avaliação das características organolépticas dos azeites virgens, o método descrito no anexo XII;

j) Para determinação dos estigmastadienos, o método descrito no anexo XVII;

k) Para determinação do teor de triacilgliceróis com NCE42, o método descrito no anexo XVIII;

▼M28

l) Para determinação do teor de álcoois alifáticos e de álcoois triterpénicos, o método descrito no anexo XIX;

▼M26

m) Para determinação do teor de ceras, de ésteres metílicos de ácidos gordos e de ésteres etílicos de ácidos gordos, o método descrito no anexo XX.

▼M28 —————

▼M26

2. A verificação, pelas autoridades nacionais ou por representantes destas, das características organolépticas de azeites virgens deve ser efetuada por júris de provadores aprovados pelos Estados-Membros.

As características organolépticas de um azeite referido no primeiro parágrafo serão consideradas conformes com a categoria de azeite declarada se um júri aprovado pelo Estado-Membro em causa confirmar a classificação atribuída.

Se o júri não confirmar a categoria declarada no respeitante às características organolépticas, as autoridades nacionais ou os representantes destas farão realizar sem demora, a pedido do interessado, duas contra-análises por outros júris aprovados, das quais pelo menos uma a efetuar por um júri aprovado pelo Estado-Membro produtor. As características em questão serão consideradas conformes com as declaradas se as duas contra-análises confirmarem a classificação declarada. Caso contrário, as despesas das contra-análises devem ser imputadas ao interessado.

3. A colheita de amostras para fins de verificação, pelas autoridades nacionais ou por representantes destas, das características dos azeites e dos óleos de bagaço de azeitona previstas no n.o 1 deve ser efetuada de acordo com as normas internacionais EN ISO 661, relativa à preparação das amostras para ensaio, e EN ISO 5555, relativa à amostragem. Todavia, por derrogação ao ponto 6.8 da norma EN ISO 5555, no caso dos lotes dos referidos azeites e óleos de bagaço de azeitona em embalagens imediatas, a colheita de amostras deve ser efetuada de acordo com o anexo IA do presente regulamento. No caso dos azeites e dos óleos de bagaço de azeitona a granel cuja amostragem não possa ser realizada de acordo com a norma EN ISO 5555, a amostragem deve ser realizada segundo as instruções da autoridade competente do Estado-Membro.

Sem prejuízo da norma EN ISO 5555 e do capítulo 6 da norma EN ISO 661, as amostras devem ser colocadas, o mais rapidamente possível, ao abrigo da luz e de temperaturas elevadas e ser enviadas para análise, ao laboratório, o mais tardar no quinto dia útil após a sua colheita. Caso contrário, as amostras devem ser conservadas de modo a que não se degradem nem deteriorem antes de chegarem ao laboratório, durante o seu transporte ou armazenagem.

4. Para efeitos da verificação prevista no n.o 3, as análises referidas nos anexos II, III, IX, XII e XX, bem como, se for caso disso, as contra-análises exigidas pela legislação nacional, devem, no caso dos produtos embalados, ser efetuadas antes do final do prazo de durabilidade mínima. No caso das amostras de azeites e de óleos de bagaço de azeitona a granel, as referidas análises devem ser efetuadas, o mais tardar, no sexto mês após aquele em que as amostras foram colhidas.

Não se estabelece nenhum prazo para as outras análises previstas no presente regulamento.

Salvo no caso de a colheita da amostra ter ocorrido menos de dois meses antes do final do prazo de durabilidade mínima, se os resultados das análises não corresponderem às características da categoria de azeite ou de óleo de bagaço de azeitona declarada, o interessado deve ser notificado, o mais tardar, um mês antes do final do período previsto no primeiro parágrafo.

5. Para a determinação das características dos azeites e dos óleos de bagaço de azeitona pelos métodos previstos no n.o 1, primeiro parágrafo, os resultados analíticos devem ser diretamente comparados com os limites estabelecidos no presente regulamento.

▼M25

Artigo 2.o-A

1. Para efeitos do disposto no presente artigo, entende-se por «azeite comercializado» a quantidade de azeites e de óleos de bagaço de azeitona de um determinado Estado-Membro que nele é consumida ou dele é exportada.

2. Os Estados-Membros devem zelar por que as verificações de conformidade sejam efetuadas seletivamente, com base em análises de risco, e com a frequência adequada, a fim de garantir que o azeite comercializado corresponde à categoria declarada.

3. Podem constituir critério de avaliação do risco:

a) A categoria de azeite ou de óleo de bagaço de azeitona, o período de produção, o preço dos azeites ou dos óleos de bagaço de azeitona em relação ao de outros óleos vegetais, as operações de lotação e de embalamento, as instalações e condições de armazenagem, o país de origem, o país de destino, o meio de transporte e o volume do lote;

b) A posição do operador na cadeia de comercialização, o volume e/ou valor comercializado pelo operador, a gama de azeites e de óleos de bagaço de azeitona que o operador comercializa e o tipo de atividade em causa (extração, armazenagem, refinação, lotação, embalamento ou venda a retalho);

c) Conclusões de verificações anteriores, incluindo o número e o tipo de defeitos detetados, a qualidade habitual dos azeites comercializados e o desempenho do equipamento utilizado;

d) A fiabilidade dos sistemas de garantia de qualidade ou de autocontrolo dos operadores, relativos à conformidade com as normas de comercialização;

e) O local da verificação, nomeadamente se é o primeiro ponto de entrada na União, o último ponto de saída da União ou o local onde o azeite ou o óleo de bagaço de azeitona é produzido, embalado, carregado ou vendido ao consumidor final;

f) Qualquer outra informação suscetível de indiciar um risco de não-conformidade.

4. Os Estados-Membros devem estabelecer previamente:

a) Os critérios de avaliação do risco de não-conformidade dos lotes;

b) Com base numa análise de risco, para cada categoria de risco, o número mínimo de operadores ou lotes, e/ou as quantidades mínimas, a submeter à verificação de conformidade.

O número mínimo de verificações de conformidade a efetuar por milhar de toneladas de azeite comercializado no Estado-Membro é de uma por ano.

5. Para verificarem a conformidade, os Estados-Membros devem:

a) Efetuar, por qualquer ordem, as análises previstas no anexo I; ou

b) Seguir a ordem indicada no esquema de tomada de decisão do anexo I-B, até que seja possível tomar uma das decisões nele referidas.

▼M19 —————

▼M25

Artigo 3.o

Caso se verifique que um azeite ou um óleo de bagaço de azeitona não corresponde à descrição da categoria alegada, o Estado-Membro em causa deve aplicar, sem prejuízo de outras sanções eventuais, sanções efetivas, proporcionadas e dissuasoras, a estabelecer em função da gravidade da irregularidade detetada.

Se as verificações revelarem irregularidades significativas, os Estados-Membros devem aumentar a frequência das verificações efetuadas em relação ao estádio de comercialização, à categoria de azeite ou de óleo de bagaço de azeitona, à origem dos mesmos ou a outros critérios.

▼M5

Artigo 4.o

▼M19

1. Para a apreciação e controlo das características organolépticas pelas autoridades nacionais ou representantes destas, os Estados-Membros podem aprovar júris de provadores.

As condições de aprovação serão estabelecidas pelos Estados-Membros, nomeadamente de modo a:

— satisfazer as condições do ponto 4 do anexo XII.

— assegurar que a formação do chefe do júri seja efectuada por um estabelecimento e em condições reconhecidos para o efeito pelo Estado-Membro.

— fazer depender a validade da aprovação dos resultados obtidos no quadro de um sistema de controlo anual instituído pelo Estado-Membro.

Cada Estado-Membro comunicará à Comissão a lista dos júris aprovados e as medidas tomadas em conformidade com o presente número.

▼M5

2. Caso um Estado-membro encontre dificuldades na criação de um júri de provadores no seu território, pode recorrer a um júri de provadores aprovado noutro Estado-membro.

3. Cada Estado-membro estabelecerá a lista dos júris de provadores criados por organizações profissionais ou interprofissionais, em conformidade com as condições estabelecidas no n.o 1 e velará pelo respeito dessas condições.

▼M19 —————

▼B

Artigo 6.o

1. O teor de ►C1 óleo de bagaço ◄ e outros resíduos da extracção do azeite (códigos NC 2306 90 11 e 2306 90 19 ) é determinado em conformidade com o método constante do anexo XV.

2. O teor de óleo referido no n.o 1 é expresso em percentagem do seu peso em relação ao extracto seco.

▼M20

Artigo 7.o

São aplicáveis as disposições comunitárias respeitantes à presença de contaminantes.

Relativamente ao teor de solventes halogenados, os limites para todas as categorias de azeite são os seguintes:

— teor máximo de cada solvente halogenado detectado 0,1 mg/kg,

— teor máximo da soma dos solventes halogenados detectados 0,2 mg/kg

▼M25

Artigo 7.o-A

As pessoas singulares ou coletivas e os agrupamentos que, para qualquer finalidade profissional ou comercial, detenham azeite ou óleo de bagaço de azeitona nalgum estádio compreendido entre a extração no lagar e o engarrafamento, inclusive, devem dispor de registos das entradas e saídas relativos a cada categoria de azeite ou de óleo de bagaço de azeitona.

Compete aos Estados-Membros assegurar que a obrigação estabelecida no primeiro parágrafo é devidamente cumprida.

▼M25

Artigo 8.o

1. Compete a cada Estado-Membro comunicar à Comissão as medidas que tomar para dar execução ao presente regulamento e informar a Comissão das alterações eventuais dessas medidas.

2. Compete igualmente aos Estados-Membros transmitir anualmente à Comissão, até 31 de maio, um relatório sobre a execução do presente regulamento no ano anterior. Devem constar desse relatório, pelo menos, os resultados das verificações de conformidade efetuadas aos azeites e aos óleos de bagaço de azeitona, apresentadas de acordo com o modelo do anexo XXI.

3. As comunicações referidas no presente regulamento devem ser efetuadas em conformidade com o Regulamento (CE) n.o 792/2009 da Comissão ( 1 ).

▼B

Artigo 9.o

É revogado o Regulamento (CEE) n.o 1058/77.

Artigo 10.o

1. O presente regulamento entra em vigor no terceiro dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial das Comunidades Europeias. No entanto, o método constante do anexo XII é aplicável a partir de ►M1 1 de Novembro de 1992 ◄ , salvo no que concerne às operações ligadas à intervenção.

▼M5

Este método não se aplica aos azeites virgens acondicionados antes de 1 de Novembro de 1992.

▼B

2. O presente regulamento não é aplicável aos azeites e óleos de bagaço de azeitona acondicionados antes da entrada em vigor do presente regulamento e comercializados até 31 de Outubro de 1992.

O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e directamente aplicável em todos os Estados-Membros.









ANEXOS

Sumário







Anexo I: Características dos azeites e óleos de bagaço de azeitona Anexo I-A: Amostragem de azeites e óleos de bagaço de azeitona entregues em embalagens imediatas Anexo I-B: Esquema de decisão para verificação da conformidade de uma amostra de azeite com a categoria declarada Anexo II: Determinação dos ácidos gordos livres, método a frio Anexo III: Determinação do índice de peróxidos Anexo IV: Determinação do teor de ceras por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar Anexo V: Determinação da composição e do teor de esteróis e de diálcoois triterpénicos por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar Anexo VII: ►M21 Determinação da percentagem de monopalmitato de 2-glicerilo ◄ ▼M20 ————— ▼B Anexo IX: Análise por espetrofotometria no ultravioleta ▼M28 Anexo X: Determinação dos ésteres metílicos de ácidos gordos por cromatografia em fase gasosa ▼B Anexo XI: Determinação do teor de solventes halogenados voláteis no azeite Anexo XII: Método do conselho oleícola internacional para a avaliação organoléptica de azeites virgens ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B Anexo XV: Teor de óleo do bagaço de azeitona Anexo XVI: Determinação do índice de iodo Anexo XVII: Método para a determinação de estigmastadienos em óleos vegetais Anexo XVIII: Determinação da diferença entre o teor real e o teor teórico de triacilgliceróis com NCE42 Anexo XIX: ►M28 Determinação do teor de álcoois alifáticos e de álcoois triterpénicos por cromatografia em fase gasosa em coluna capilar ◄ ▼M23 Anexo XX: Método de determinação do teor de ceras, de ésteres metílicos de ácidos gordos e de ésteres etílicos de ácidos gordos por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar ▼M28 ————— ▼M25 Anexo XXI: Resultados das verificações de conformidade efetuadas aos azeites e aos óleos de bagaço de azeitona referidas no artigo 8.o, n.o 2

▼M31









ANEXO I

CARACTERÍSTICAS DOS AZEITES E ÓLEOS DE BAGAÇO DE AZEITONA

Características de qualidade







Categoria Acidez (%) (*) Índice de peróxidos mEq O2/kg (*) K232 (*) K268 ou K270 (*) Delta-K (*) Exame organolético Ésteres etílicos de ácidos gordos mg/kg (*) Mediana dos defeitos (Md) (*) Mediana do frutado (Mf) (*) 1. Azeite virgem extra ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 35 2. Azeite virgem ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 — 3. Azeite lampante > 2,0 — — — — Md > 3,5 (1) — — 4. Azeite refinado ≤ 0,3 ≤ 5 — ≤ 1,25 ≤ 0,16 — — — 5. Azeite (constituído por azeites refinados e azeites virgens) ≤ 1,0 ≤ 15 — ≤ 1,15 ≤ 0,15 — — — 6. Óleo de bagaço de azeitona bruto — — — — — — — — 7. Óleo de bagaço de azeitona refinado ≤ 0,3 ≤ 5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — — 8. Óleo de bagaço de azeitona ≤ 1,0 ≤ 15 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — — — (1) A mediana dos defeitos pode ser inferior ou igual a 3,5 se a mediana do frutado for igual a 0.

Características de pureza







Categoria Teor de ácidos gordos (1) Total dos isómeros transoleicos (%) Total de isómeros dos ácidos trans-linoleico + trans-linolénico (%) Estigmastadienos mg/kg (2) ►C4 Diferença: ECN42 (determinado por HPLC) e ECN42 (obtido por cálculo teórico) ◄ Monopalmitato de 2-glicerilo (%) Mirístico (%) Linolénico (%) Araquídico (%) Eicosenoico (%) Beénico (%) Lignocérico (%) 1. Azeite virgem extra ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ►C4 ≤ |0,2| ◄ ≤ 0,9 se % de ácido palmítico total ≤ 14 % ≤ 1,0 se % de ácido palmítico total > 14 % 2. Azeite virgem ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ►C4 ≤ |0,2| ◄ ≤ 0,9 se % de ácido palmítico total ≤ 14 % ≤ 1,0 se % de ácido palmítico total > 14 % 3. Azeite lampante ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,50 ►C4 ≤ |0,3| ◄ ≤ 0,9 se % de ácido palmítico total ≤ 14 % ≤ 1,1 se % de ácido palmítico total > 14 % 4. Azeite refinado ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 — ►C4 ≤ |0,3| ◄ ≤ 0,9 se % de ácido palmítico total ≤ 14 % ≤ 1,1 se % de ácido palmítico total > 14 % 5. Azeite (constituído por azeites refinados e azeites virgens) ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,30 — ►C4 ≤ |0,3| ◄ ≤ 0,9 se % de ácido palmítico total ≤ 14 % ≤ 1,0 se % de ácido palmítico total > 14 % 6. Óleo de bagaço de azeitona bruto ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,20 ≤ 0,10 — ►C4 ≤ |0,6| ◄ ≤ 1,4 7. Óleo de bagaço de azeitona refinado ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 — ►C4 ≤ |0,5| ◄ ≤ 1,4 8. Óleo de bagaço de azeitona ≤ 0,03 ≤ 1,00 ≤ 0,60 ≤ 0,50 ≤ 0,30 ≤ 0,20 ≤ 0,40 ≤ 0,35 — ►C4 ≤ |0,5| ◄ ≤ 1,2







Categoria Composição esterólica Esteróis totais (mg/kg) Eritrodiol e uvaol (%) (**) Ceras mg/kg (**) Colesterol (%) Brassicasterol (%) Campesterol (3) (%) Estigmasterol (%) Sitosterol β ap. (%) (4) Delta-7-Estigmastenol (3) (%) 1. Azeite virgem extra ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C42 + C44 + C46 ≤ 150 2. Azeite virgem ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C42 + C44 + C46 ≤ 150 3. Azeite lampante ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (5) C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (5) 4. Azeite refinado ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 5. Azeite (constituído por azeites refinados e azeites virgens) ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350 6. Óleo de bagaço de azeitona bruto ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (6) C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (6) 7. Óleo de bagaço de azeitona refinado ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350 8. Óleo de bagaço de azeitona ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5 C40 + C42 + C44 + C46 > 350

Notas:

a) Os resultados das análises devem ser expressos com um número de algarismos significativos idêntico ao previsto para cada característica. Se o algarismo seguinte for superior a 4, o último algarismo significativo deve ser aumentado de uma unidade.

b) Basta que uma das características esteja fora dos limites fixados para que o produto seja classificado noutra categoria ou declarado não conforme quanto à sua pureza, para os efeitos do presente regulamento.

c) O asterisco (*) associado a determinadas características de qualidade do azeite significa o seguinte: no caso do azeite lampante, que os limites correspondentes podem não ser observados simultaneamente; no caso dos azeites virgens, que a inobservância de um dos limites correspondentes implica uma mudança de categoria, mantendo-se, porém, a classificação numa das categorias de azeites virgens.

d) No caso dos óleos de bagaço de azeitona, os limites relativos às características assinaladas com dois asteriscos (**) podem não ser observados simultaneamente.









Apêndice

ESQUEMA DE DECISÃO

Esquema de decisão relativo ao campesterol para azeites virgens e azeites virgens extra:

Os outros parâmetros devem respeitar os limites estabelecidos no presente regulamento.

Esquema de decisão relativo ao delta-7-estigmastenol para:

— Azeites virgens e azeites virgens extra —

Os outros parâmetros devem respeitar os limites estabelecidos no presente regulamento.

— Óleos de bagaço de azeitona (brutos e refinados) —

▼M26









ANEXO I-A

AMOSTRAGEM DE AZEITES E ÓLEOS DE BAGAÇO DE AZEITONA ENTREGUES EM EMBALAGENS IMEDIATAS

O presente método de amostragem é aplicável a lotes de azeite ou óleo de bagaço de azeitona acondicionados em embalagens imediatas. O método de amostragem depende do volume da embalagem imediata (até 5 litros ou superior a 5 litros).

Entende-se por «lote» um conjunto de unidades de venda produzidas, fabricadas e acondicionadas em circunstâncias tais que o azeite ou óleo nelas contido seja considerado homogéneo relativamente a todas as características analíticas. A individualização dos lotes deve respeitar o disposto na Diretiva 2011/91/UE do Parlamento Europeu e do Conselho ( 8 ).

Entende-se por «incremento» a quantidade de azeite ou óleo de uma embalagem imediata, proveniente de um ponto aleatório do lote.

1. COMPOSIÇÃO DAS AMOSTRAS DE PARTIDA

1.1. Embalagens imediatas de volume não superior a 5 litros

Entende-se por «amostra de partida» de embalagens imediatas de volume não superior a 5 litros o número de incrementos provenientes do lote de acordo com o quadro 1.







Quadro 1 Composição mínima das amostras de partida Capacidade das embalagens imediatas Proveniência do azeite ou óleo da amostra de partida a) Igual ou superior a 1 litro a) Uma embalagem imediata b) Inferior a 1 litro b) Número mínimo de embalagens cuja capacidade total seja de, pelo menos, 1,0 litro

O Estado-Membro pode aumentar, em função das suas necessidades (por exemplo, realização da avaliação organoléptica por um laboratório diferente do que realiza as análises químicas, contra-análises, etc.), o número de embalagens estabelecido no quadro 1 para a amostra de partida.

1.2. Embalagens imediatas de volume superior a 5 litros

Entende-se por «amostra de partida» de embalagens imediatas de volume superior a 5 litros uma parte representativa do total de incrementos, obtida por um processo de redução de acordo com o quadro 2. A amostra de partida é obrigatoriamente constituída por vários exemplos.

Entende-se por «exemplo» da amostra de partida cada embalagem que a compõe.







Quadro 2 Número mínimo de incrementos Número de embalagens do lote Número mínimo de incrementos Até 10 1 Entre 11 e 150 2 Entre 151 e 500 3 Entre 501 e 1 500 4 Entre 1 501 e 2 500 5 > 2 500 , por cada 1 000 embalagens 1 incremento suplementar

A fim de reduzir o volume das embalagens imediatas que compõem a amostra, homogeneízam-se os incrementos para preparar a amostra de partida. Vertem-se os diversos incrementos para o mesmo recipiente e homogeneíza-se mexendo o azeite ou óleo, tomando a precaução de evitar ao máximo a incorporação de ar.

Verte-se a amostra de partida assim preparada numa série de embalagens de capacidade não inferior a 1,0 litro, passando cada uma delas a constituir um exemplo da amostra de partida.

O Estado-Membro pode aumentar, em função das suas necessidades (por exemplo, realização da avaliação organoléptica por um laboratório diferente do que realiza as análises químicas, contra-análises, etc.), o número de amostras de partida.

Deve proceder-se ao enchimento de cada embalagem de modo a reduzir ao mínimo a camada de ar superior, após o que se fecha convenientemente a embalagem e se procede à sua selagem, para evitar que possa haver interferências no produto que contém.

Rotulam-se os exemplos assim constituídos para que possam ser corretamente identificados.

2. ANÁLISES E RESULTADOS

2.1. Subdivide-se cada amostra primária em amostras de laboratório de acordo com o ponto 2.5 da norma EN ISO 5555, efetuando-se em seguida as análises pela ordem indicada no esquema de decisão constante do anexo IB ou por qualquer outra ordem aleatória.

2.2. Se todos os resultados das análises forem conformes com as características da categoria de azeite ou óleo declarada, todo o lote em causa é declarado conforme.

Se algum resultado das análises não for conforme com as características da categoria de azeite ou óleo declarada, todo o lote em causa é declarado não-conforme.

3. VERIFICAÇÃO DA CATEGORIA DO LOTE

3.1. A fim de verificar a categoria do lote, a autoridade competente pode aumentar o número de amostras de partida, colhidas em diversos pontos do lote, de acordo com o seguinte quadro:







Quadro 3 Número de amostras de partida em função da dimensão do lote Dimensão do lote (litros) Número de amostras de partida Inferior a 7 500 2 Igual ou superior a 7 500 e inferior a 25 000 3 Igual ou superior a 25 000 e inferior a 75 000 4 Igual ou superior a 75 000 e inferior a 125 000 5 Igual ou superior a 125 000 6 + uma por cada 50 000 litros suplementares

Cada incremento componente de uma amostra de partida deve ser colhido numa parte contínua do lote. É necessário anotar a localização de cada amostra de partida e identificá-la inequivocamente.

A constituição de cada amostra de partida deve processar-se conforme se refere nos pontos 1.1 e 1.2.

Em seguida, efetuam-se a cada amostra de partida as análises referidas no artigo 2.o, n.o 1.

3.2. Se algum dos resultados das análises referidas no artigo 2.o, n.o 1, de uma ou mais amostras de partida não for conforme com as características da categoria de azeite ou óleo declarada, todo o lote amostrado é declarado não-conforme.









ANEXO I-B

ESQUEMA DE DECISÃO PARA VERIFICAÇÃO DA CONFORMIDADE DE UMA AMOSTRA DE AZEITE COM A CATEGORIA DECLARADA

Quadro 1

Quadro 2

Quadro 3









Apêndice 1







Correspondência entre os anexos do presente regulamento e as análises referidas no esquema de decisão — Acidez Anexo II Determinação dos ácidos gordos livres, método a frio — Índice de peróxidos Anexo III Determinação do índice de peróxidos — Espetrometria no UV Anexo IX Análise por espectrofotometria no ultravioleta — Avaliação organoléptica Anexo XII Avaliação organoléptica de azeites virgens — Ésteres etílicos Anexo XX Método de determinação do teor de ceras, de ésteres metílicos de ácidos gordos e de ésteres etílicos de ácidos gordos por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar — 3,5-Estigmastadienos Anexo XVII Método para a determinação de estigmastadienos em óleos vegetais ▼M28 — Isómeros trans de ácidos gordos Anexo X Determinação dos ésteres metílicos de ácidos gordos por cromatografia em fase gasosa — Teor de ácidos gordos Anexo X Determinação dos ésteres metílicos de ácidos gordos por cromatografia em fase gasosa ▼M26 — ΔNCE42 Anexo XVIII Determinação do teor de triacilgliceróis com NCE42 (diferença entre o teor obtido por HPLC e o teor teórico) — Composição de esteróis e esteróis totais — Eritrodiol e uvaol Anexo V Determinação da composição e do teor de esteróis e de diálcoois triterpénicos por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar — Ceras Anexo IV Determinação do teor de ceras por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar ▼M28 — Álcoois alifáticos e álcoois triterpénicos Anexo XIX Determinação do teor de álcoois alifáticos e de álcoois triterpénicos por cromatografia em fase gasosa em coluna capilar ▼M26 — Ácidos gordos saturados na posição 2 Anexo VII Determinação da percentagem de monopalmitato de 2-glicerilo

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ANEXO II

DETERMINAÇÃO DOS ÁCIDOS GORDOS LIVRES, MÉTODO A FRIO

1. OBJETO E ÂMBITO DE APLICAÇÃO

O presente método descreve a determinação dos ácidos gordos livres em azeites e óleos de bagaço de azeitona. O teor de ácidos gordos livres é expresso em termos de acidez em percentagem de ácido oleico.

2. PRINCÍPIO

Dissolução da amostra numa mistura de solventes, seguida de titulação dos ácidos gordos livres presentes com uma solução de hidróxido de potássio ou de hidróxido de sódio.

3. REAGENTES

Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica reconhecida e a água a utilizar deve ser destilada ou de pureza equivalente.

3.1. Éter dietílico; etanol a 95 % (v/v), mistura 1:1 em volume Neutraliza-se exatamente no momento de utilização com a solução de hidróxido de potássio (3.2), em presença de 0,3 ml de solução de fenolftaleína (3.3) por 100 ml de mistura. Nota 1: O éter etílico é muito inflamável e pode formar peróxidos explosivos. Devem ser tomadas precauções especiais na sua utilização. Nota 2: Se não for possível utilizar éter etílico, poderá ser utilizada uma mistura de solventes constituída por etanol e tolueno. Se necessário, o etanol pode ser substituído por 2-propanol.

3.2. Solução etanólica ou aquosa titulada de hidróxido de potássio ou de sódio, c(KOH) [ou c(NaOH)] aproximadamente 0,1 mol/l ou, se necessário, c(KOH) [ou c(NaOH)] aproximadamente 0,5 mol/l. Existem no comércio soluções prontas a utilizar. A concentração exata da solução de hidróxido de potássio (ou de hidróxido de sódio) deve ser conhecida e verificada antes da utilização. Decantar para um frasco de vidro castanho fechado com uma rolha de borracha. A solução deve ser incolor ou amarelo-palha. Caso se observe separação de fases ao utilizar solução aquosa de hidróxido de potássio (ou de hidróxido de sódio), substituir a solução aquosa por uma solução etanólica. Nota 3: Uma solução incolor estável de hidróxido de potássio (ou de hidróxido de sódio) pode preparar-se do seguinte modo: mantêm-se em ebulição durante uma hora, com refluxo, 1 000 ml de etanol ou água com 8 g de hidróxido de potássio (ou de hidróxido de sódio) e 0,5 g de aparas de alumínio. Destila-se imediatamente. Dissolve-se no destilado a quantidade necessária de hidróxido de potássio (ou de hidróxido de sódio). Deixa-se repousar durante vários dias e decanta-se o líquido claro sobrenadante do precipitado de carbonato de potássio (ou de hidróxido de sódio). A solução pode também ser preparada sem destilação, do seguinte modo: Adicionam-se 4 ml de butilato de alumínio a 1 000 ml de etanol (ou água) e deixa-se repousar a mistura durante alguns dias. Decanta-se o líquido sobrenadante e dissolve-se nele a quantidade necessária de hidróxido de potássio (ou de hidróxido de sódio). Esta solução está pronta para ser utilizada.

3.3. Fenolftaleína [solução a 10 g/l em etanol a 95 %-96 % (v/v)], ou azul alcalino 6B ou timolftaleína [solução a 20 g/l em etanol a 95 %-96 % (v/v)]. No caso de óleos com coloração intensa, utiliza-se azul alcalino ou timolftaleína.

4. APARELHOS E UTENSÍLIOS

Material corrente de laboratório, designadamente:

4.1. Balança analítica;

4.2. Erlenmeyer de 250 ml;

4.3. Bureta de 10 ml classe A, graduada em 0,05 ml, ou bureta automática equivalente.

5. PROCEDIMENTO

5.1. Preparação da amostra para análise

Se a amostra estiver turva, deve ser filtrada.

5.2. Toma para análise

Colhem-se as amostras de acordo com o índice de acidez presumido, em conformidade com as indicações do quadro seguinte.







Acidez esperada (g ácido oleico/100 g) Peso da amostra (g) Exatidão da pesagem (g) 0 a 2 10 0,02 > 2 a 7,5 2,5 0,01 > 7,5 0,5 0 001

A pesagem deverá ser efetuada no erlenmeyer (4.2).

5.3. Determinação

Dissolve-se a amostra (5.2) em 50 a 100 ml de mistura éter/etanol (3.1) previamente neutralizada.

Titula-se, com agitação, com a solução de 0,1 mol/l de hidróxido de potássio (ou de hidróxido de sódio) (3.2) (ver nota 4), até à viragem do indicador (coloração carmim da fenolftaleína persistente durante pelo menos 10 s).

Nota 4: Se a quantidade de hidróxido de potássio (ou de hidróxido de sódio) 0,1 mol/l ultrapassar 10 ml, utiliza-se uma solução a 0,5 mol/l ou altera-se a massa da amostra de acordo com a acidez livre esperada e o quadro proposto.

Nota 5: Se a solução se tornar turva durante a titulação, junta-se uma quantidade suficiente da mistura de solventes (3.1) para obter uma solução límpida.

Efetuar-se-á uma segunda determinação apenas se o primeiro resultado for superior ao limite especificado para a categoria do azeite.

6. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

A acidez, expressa em percentagem de ácido oleico em massa, é igual a:

em que:

V = volume consumido, expresso em mililitros, de solução titulada de hidróxido de potássio (ou hidróxido de sódio).

c = concentração exata, em moles por litro, da solução titulada de hidróxido de potássio (ou hidróxido de sódio) utilizada.

M = 282 g/mol (massa molar), expressa em gramas por mole de ácido oleico;

m = massa da amostra para ensaio, em g.

O ácido oleico é expresso da seguinte forma:

a) duas casas decimais para valores entre 0 e 1, inclusive;

b) uma casa decimal para valores de 1 a 100.

▼M30









ANEXO III

DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE PERÓXIDOS

1. Âmbito de aplicação

O presente anexo descreve um método para a determinação do índice de peróxidos em óleos e gorduras de origem animal e vegetal.

2. Definição

O índice de peróxidos é a quantidade, expressa em miliequivalentes de oxigénio ativo por kg, de substâncias, presentes na amostra, capazes de oxidar o iodeto de potássio nos condições operacionais descritas.

3. Princípio

Tratamento da amostra em estudo, dissolvida em ácido acético e clorofórmio, com uma solução de iodeto de potássio. Titulação do iodo libertado com uma solução-padrão de tiossulfato de sódio.

4. Aparelhos e utensílios

Todo o equipamento usado deve estar isento de substâncias oxidantes ou redutoras.

Nota 1: Não se lubrificam os contactos esmerilados.

4.1. Cápsula de vidro de 3 ml.

4.2. Frascos com rolhas e juntas esmeriladas, de cerca de 250 ml de capacidade, previamente secos e cheios de um gás inerte puro e seco (azoto ou, de preferência, dióxido de carbono).

4.3. Bureta de 5 ml, 10 ml ou 25 ml de capacidade, graduada em, pelo menos, 0,05 ml, de preferência com ajustamento automático em zero, ou bureta automática equivalente.

4.4. Balança analítica.

5. Reagentes

5.1. Clorofórmio, de qualidade analítica reconhecida, tornado isento de oxigénio fazendo borbulhar uma corrente de gás inerte puro e seco.

5.2. Ácido acético glacial, de qualidade analítica reconhecida, tornado isento de oxigénio fazendo borbulhar uma corrente de gás inerte puro e seco.

5.3. Solução aquosa saturada de iodeto de potássio, preparada recentemente e isenta de iodo e iodatos. Dissolvem-se cerca de 14 g de iodeto de potássio em cerca de 10 ml de água à temperatura ambiente.

5.4. Solução aquosa de tiossulfato de sódio, rigorosamente titulada, imediatamente antes da utilização, a 0,01 mol/l (equivalente a 0,01 N).

Prepara-se diariamente a solução de tiossulfato de sódio a partir de uma solução titulada de 0,01 mol/l de tiossulfato de sódio antes da utilização, ou determina-se a molaridade exata. Como a experiência demonstra, a estabilidade é limitada e depende do valor do pH e do teor de dióxido de carbono livre. Utilizar para a diluição exclusivamente água recém-fervida, eventualmente purgada com azoto.

Recomenda-se o seguinte procedimento para determinar a molaridade exata da solução de tiossulfato de sódio:

Num balão aferido (250 ml ou 500 ml), pesam-se 0,27 g a 0,33 g de iodato de potássio (mKIO3), com a aproximação de 0,001 g, e diluem-se até ao traço de aferição com água recém-fervida (V2), arrefecida até à temperatura ambiente. Com uma pipeta, transferem-se 5 ml ou 10 ml desta solução de iodato de potássio (V1) para um Erlenmeyer de 250 ml. Adicionam-se 60 ml de água recém-fervida, 5 ml de ácido clorídrico 4 mol/l e 25 mg a 50 mg de iodeto de potássio ou 0,5 ml da solução saturada de iodeto de potássio. Titula-se a solução com a solução de tiossulfato de sódio (V3) para determinar a molaridade exata da solução de tiossulfato de sódio.

em que:

mKIO3 é a massa do iodato de potássio, em gramas,

V1 é o volume da solução de iodato de potássio, em mililitros (5 ml ou 10 ml),

V2 é o volume total da solução de iodato de potássio, em mililitros (250 ml ou 500 ml),

V3 é o volume da solução de tiossulfato de sódio, em mililitros,

wKIO3 é a pureza do iodato de potássio, em g/100 g,

MKIO3 é a massa molecular do iodato de potássio (214 g/mol),

T é a molaridade exata da solução de tiossulfato de sódio (mol/l).

5.5. Solução de amido, obtida por dispersão aquosa recente de amido natural solúvel, na proporção de 10 g/l. Podem também ser utilizados reagentes equivalentes.

6. Amostra

A amostra deve ser colhida e conservada ao abrigo da luz, a baixa temperatura e em recipientes de vidro completamente cheios, hermeticamente fechados com rolhas de vidro esmerilado ou cortiça.

7. Procedimento

O ensaio deve ser efetuado em presença de luz solar difusa ou luz artificial. Pesa-se numa cápsula de vidro (ponto 4.1) ou, na falta desta, num frasco (ponto 4.2), com uma aproximação de 0,001 g, uma massa da amostra de acordo com o quadro seguinte, em conformidade com o índice de peróxidos presumido:







Índice de peróxidos presumido (meq) Peso da toma (g) 0 a 12 5,0 a 2,0 12 a 20 2,0 a 1,2 20 a 30 1,2 a 0,8 30 a 50 0,8 a 0,5 50 a 90 0,5 a 0,3

Abre-se o frasco (ponto 4.2) e introduz-se a cápsula de vidro que contém a amostra em estudo. Adicionam-se 10 ml de clorofórmio (ponto 5.1.). Dissolve-se a amostra rapidamente, por agitação. Adicionam-se 15 ml de ácido acético (ponto 5.2) e, de seguida, 1 ml de solução de iodeto de potássio (ponto 5.3). Tapa-se rapidamente, agita-se durante 1 minuto e deixa-se durante exatamente 5 minutos ao abrigo da luz a uma temperatura de 15 a 25 °C.

Adicionam-se cerca de 75 ml de água destilada. Titula-se o iodo libertado com a solução de tiossulfato de sódio (ponto 5.4), agitando vigorosamente e usando solução de amido (ponto 5.5) como indicador.

Fazem-se duas determinações com a mesma amostra.

Efetua-se simultaneamente um ensaio em branco. Se o resultado do ensaio em branco exceder 0,05 ml da solução 0,01 N de tiossulfato de sódio (ponto 5.4), substituem-se os reagentes impuros.

8. Expressão dos resultados

O índice de peróxidos (I.P.), expresso em miliequivalentes de oxigénio ativo por kg, é dado pela fórmula:

em que:

V é o número de mililitros de solução de tiossulfato de sódio titulada (ponto 5.4) que se utilizou no ensaio, com a correção relativa ao ensaio em branco,

T é a molaridade exata da solução de tiossulfato de sódio (ponto 5.4) que se utilizou, em mol/l,

m é o peso, expresso em gramas, da amostra em estudo.

Toma-se como resultado a média aritmética das duas determinações efetuadas.

O resultado é arredondado às décimas.

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ANEXO IV

DETERMINAÇÃO DO TEOR DE CERAS POR CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA COM COLUNA CAPILAR

1. OBJECTO

O presente método descreve um processo para a determinação do teor de ceras dos azeites. As ceras são separadas em função do número de átomos de carbono. O método pode ser utilizado, em particular, para distinguir o azeite obtido por pressão do azeite obtido por extracção (óleo de bagaço de azeitona).

2. PRINCÍPIO

Após a adição de um padrão interno adequado, a gordura ou o óleo em causa é fraccionado por cromatografia numa coluna de silicagel hidratada. Recolher a fracção eluída em primeiro lugar nas condições de ensaio (fracção cuja polaridade é inferior à polaridade dos triglicéridos), procedendo-se à análise directa por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar.

3. MATERIAL

3.1. Erlenmeyer de 25 ml.

3.2. Coluna de vidro para cromatografia em fase gasosa de diâmetro interior 15,0 mm, altura 30 a 40 cm, equipada com uma torneira.

3.3. Aparelho de cromatografia em fase gasosa adequado para o funcionamento com coluna capilar, equipado com um sistema para a introdução directa da amostra na coluna, constituído por: 3.3.1. Forno com termóstato para as colunas, com programação de temperatura. 3.3.2. Injector a frio para introdução directa na coluna. 3.3.3. Detector de ionização de chama e conversor-amplificador. 3.3.4. Registador-integrador adequado para funcionamento com o conversor-amplificador (ponto 3.3.3), com tempo de resposta não superior a um segundo e velocidade do papel variável. (É igualmente possível utilizar sistemas informatizados que prevejam a aquisição de dados de cromatografia em fase gasosa com um computador). 3.3.5. Coluna capilar de vidro ou de sílica fundida, com 8 m a 12 m de comprimento e 0,25 mm a 0,32 mm de diâmetro interno, revestida interiormente com um líquido estacionário, de espessura compreendida entre 010 e 0,30 μm. (Encontram-se no comércio líquidos de partição do tipo SE52 ou SE54, adequados ao fim em causa.)

3.4. Microsseringa de 10 μl adequada para injecção directa na coluna, com agulha de aço cementado.

3.5. Vibrador eléctrico.

3.6. Evaporador rotativo.

3.7. Mufla.

3.8. Balança analítica que garanta uma precisão de medição de + 0,1 mg.

3.9. Artefactos de vidro para laboratório.

4. REAGENTES

4.1. Silicagel com granulometria de 60 a 200 μm. Colocar o silicagel numa mufla a 500 °C durante quatro horas, no mínimo. Após arrefecimento, juntar 2 % de água em relação à quantidade de silicagel retirado. Agitar bem, de modo a homogeneizar. Conservar ao abrigo da luz durante pelo menos 12 horas antes da utilização.

4.2. n-Hexano para cromatografia.

4.3. Éter etílico para cromatografia.

4.4. n-Heptano para cromatografia.

4.5. Solução padrão de araquidato de laurilo a 0,1 % (m/v) em hexano (padrão interno). (É igualmente possível utilizar palmitato de palmitilo ou estearato de miristilo.) 4.5.1. Soudan 1 (1-fenilazo-2-naftol)

4.6. Gás vector: hidrogénio ou hélio puro, com um grau de pureza adequado para cromatografia em fase gasosa.

4.7. Gases auxiliares: — hidrogénio, com um grau de pureza adequado para cromatografia em fase gasosa, — ar, com um grau de pureza adequado para cromatografia em fase gasosa.

5. PROCEDIMENTO

5.1. Preparação da coluna cromatográfica.

Suspender 15 g de silicagel (4.1) em n-hexano (4.2) e introduzir na coluna (3.2). Deixar assentar e completar a operação por recurso a um agitador eléctrico (3.5), de modo a tornar mais homogénea a camada cromatográfica. Fazer passar 30 ml de n-hexano para remover eventuais impurezas. Utilizando a balança (3.8), pesar rigorosamente 500 mg de amostra num Erlenmeyer de 25 ml (3.1) e adicionar uma quantidade adequada de padrão interno (4.5), em função do teor de ceras previsto. A título de exemplo, juntar 0,1 mg de araquidato de laurilo no caso de azeite e 0,25 a 0,50 mg no caso de óleo de bagaço de azeitona. Transferir a amostra para a coluna cromatográfica com o auxílio de duas porções de 2 ml de n-hexano (4.2).

Deixar fluir o solvente até 1 mm acima da camada de silicagel e fazer passar 70 ml de n-hexano suplementares para remover os n-alcanos naturalmente presentes. Iniciar a eluição cromatográfica, recolhendo 180 ml da mistura n-hexano/éter etílico na proporção de 99:1, de acordo com um fluxo de cerca de 15 gotas por cada 10 segundos. A eluição da amostra deve ser efectuada a uma temperatura ambiente de 22 °C + 4.

Notas:

— A mistura n-hexano/éter etílico (99:1) deve ser preparada diariamente.

— Para controlar visualmente a eluição correcta das ceras, é possível juntar à amostra em solução 100 μl de Soudan 1 a 1 % na mistura da eluição. Como o corante tem uma retenção intermédia entre as ceras e os triglicéridos, é conveniente suspender a eluição quando a coloração atingir o fundo da coluna cromatográfica, uma vez que todas as ceras já foram eluídas.

Evaporar a fracção resultante num evaporador rotativo (3.6), até à eliminação de quase todo o solvente. Remover os últimos 2 ml do mesmo com o auxílio de uma corrente de azoto de fluxo reduzido e adicionar 2-4 ml de n-heptano.

5.2. Análise por cromatografia em fase gasosa

5.2.1. Operações preliminares

Instalar a coluna no cromatógrafo de fase gasosa (3.3), ligando uma das extremidades ao sistema de injecção directa na coluna e a outra extremidade ao detector. Efectuar o controlo geral do sistema cromatográfico (operacionalidade dos circuitos de gases, eficiência do detector e do registador, etc.).

No caso de a coluna ser utilizada pela primeira vez, é aconselhável proceder ao seu acondicionamento. Fazer passar um fluxo ligeiro de gás através da coluna, ligando em seguida o sistema. Aquecer gradualmente até obter, ao fim de cerca de 4 horas, uma temperatura de 350 °C. Manter esta temperatura durante pelo menos duas horas, regulando seguidamente o aparelho para as condições de trabalho [regular o fluxo de gás, acender a chama, ligar o registador electrónico (3.3.4), regular a temperatura do forno para a coluna, regular o detector, etc.]. Registar o sinal obtido, com uma sensibilidade pelo menos duas vezes superior à sensibilidade prevista para a execução da análise. A linha de base deve apresentar-se linear e isenta de picos de qualquer tipo, não devendo apresentar desvios.

A ocorrência de um desvio linear negativo indica que as ligações da coluna não foram efectuadas de um modo correcto; a ocorrência de um desvio positivo indica que a coluna não foi acondicionada de um modo adequado.

5.2.2. Escolha das condições de trabalho

As condições de trabalho são, em geral, as seguintes:

— temperatura da coluna: —



20 °C/minuto 5 °C/minuto 20 °C/minuto No início 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— Temperatura do detector: 350 °C;

— volume injectado: 1 μl da solução (2-4 ml) de n-heptano;

— gás vector: hélio ou hidrogénio à velocidade linear óptima para o gás seleccionado (ver apêndice);

— sensibilidade instrumental: de forma a responder às condições a seguir descritas.

Estas condições podem ser ajustadas em função das características da coluna e do cromatógrafo de fase gasosa, de modo a obter uma separação de todas as ceras, uma resolução satisfatória dos picos (ver figura) e um tempo de retenção do padrão interno C32 de 18 ± 3 minutos. O pico mais representativo correspondente às ceras deverá situar-se em pelo menos 60 % do início da escala.

Os parâmetros de integração dos picos devem ser determinados de modo a obter uma estimativa correcta das áreas dos picos pertinentes.

Nota:Atendendo à temperatura final elevada, é admissível um desvio positivo, que não pode exceder 10 % da base da escala.

5.3. Execução da análise

Efectuar uma toma de 1 μl de solução com a microsseringa de 10 μl; manejar o êmbolo de modo a que a agulha não contenha nenhuma porção de amostra. Introduzir a agulha no sistema de injecção e injectar rapidamente após um a dois segundos. Retirar cuidadosamente a agulha após cerca de cinco segundos.

Efectuar o registo até à eluição completa das ceras.

A linha de base deve satisfazer sempre as condições requeridas.

5.4. Identificação dos picos

A identificação dos picos é efectuada com base nos tempos de retenção que são comparados com os tempos de retenção conhecidos de misturas de ceras analisadas em condições idênticas.

A figura representa um cromatograma relativo às ceras de um azeite virgem.

5.5. Avaliação quantitativa

Por recurso ao integrador, determinar as áreas dos picos correspondentes ao padrão interno e aos ésteres alifáticos C40 a C46.

Determinar o teor de cada um dos ésteres, expresso em mg/kg de gordura, através da fórmula:

Em que:

Ax = área do pico correspondente a cada éster, em milímetros quadrados;

As = área do pico correspondente ao padrão interno, em milímetros quadrados;

ms = massa do padrão interno adicionado, em miligramas;

m = massa de amostra tomada para análise, expressa em gramas.

6. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

Apresentar a soma dos teores das várias ceras de C40 a C46, expressos em mg/kg de gordura (ppm).

Nota:Os componentes a quantificar referem-se aos picos que correspondem a um número par de átomos de carbono (ésteres C40 a C46), de acordo com o exemplo de cromatograma das ceras de azeite indicado na figura seguinte. Se o éster C46 surgir em duplicado, para identificá-lo convém analisar a fracção das ceras de um óleo de bagaço de azeitona em que o pico C46 seja fácil de identificar por ser maioritário.

Os resultados arredondam-se às décimas.

Figura

Cromatograma das ceras de azeite ( 9 )

Legenda:

I.S. = Araquidato de laurilo

1 = Ésteres diterpénicos

2 + 2′ = Ésteres C40

3 + 3′ = Ésteres C42

4 + 4′ = Ésteres C44

5 = Ésteres C46

6 = Ésteres esteróis e álcoois triterpénicos









APÊNDICE

Determinação da velocidade linear do gás

Injectar 1 a 3 μl de metano (ou propano) no cromatógrafo de fase gasosa, regulado para as condições normais de trabalho, e medir o tempo requerido pelo gás para percorrer a coluna, desde o momento da injecção até ao registo do respectivo pico (tM).

A velocidade linear, expressa em centímetros por segundo, é dada por L/tM, sendo L o comprimento da coluna, expresso em centímetros, e tM o tempo de retenção, expresso em segundos.

▼M26









ANEXO V

DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO E DO TEOR DE ESTERÓIS E DE DIÁLCOOIS TRITERPÉNICOS POR CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA COM COLUNA CAPILAR

1. OBJETIVO

O método descreve um processo de determinação do teor de esteróis e de diálcoois triterpénicos, individuais e totais, de azeites e óleos de bagaço de azeitona.

2. PRINCÍPIO DO MÉTODO

Saponificação do azeite ou óleo, adicionado de α-colestanol como padrão interno, com hidróxido de potássio em solução etanólica; em seguida, extração com éter etílico do insaponificável.

Separação da fração esterólica e de diálcoois triterpénicos, do extrato insaponificável, por cromatografia em camada fina realizada em placas de sílica-gel alcalinizadas. Conversão da fração recuperada do sílica-gel em éteres trimetilsilílicos. Análise dos éteres por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar.

3. APARELHOS E UTENSÍLIOS

Material corrente de laboratório, nomeadamente:

3.1. Balão de 250 ml equipado com um condensador de refluxo com juntas esmeriladas.

3.2. Ampola de decantação de 500 ml.

3.3. Balões de 250 ml.

3.4. Equipamento completo para cromatografia em camada fina, com placas de vidro de 20 cm × 20 cm.

3.5. Lâmpada de ultravioleta de comprimento de onda de 254 nm ou 366 nm.

3.6. Microsseringas de 100 μl e 500 μl.

3.7. Cadinho cilíndrico de fundo filtrante com porosidade G3 (poros de 15 μm a 40 μm), de aproximadamente 2 cm de diâmetro e 5 cm de altura, adequado para filtração sob vácuo, com junta esmerilada macho.

3.8. Frasco de kitasato de 50 ml com junta esmerilada fêmea, adaptável ao cadinho de fundo filtrante (3.7).

3.9. Tubo de centrifugação de fundo cónico, de 10 ml, com tampa de vidro hermética.

3.10. Cromatógrafo de fase gasosa adequado ao funcionamento com coluna capilar, dotado de um sistema de divisão de fluxo («split»), constituído por:

3.10.1. Forno termostatizado para a coluna, que permita manter a temperatura desejada com a aproximação de ± 1 °C;

3.10.2. Câmara de injeção de temperatura regulável, com elemento vaporizador de vidro persilanizado e sistema de divisão de fluxo;

3.10.3. Detetor de ionização de chama;

3.10.4. Sistema de aquisição de dados adequado para o detetor de ionização de chama (3.10.3.), com possibilidade de integração manual.

3.11. Coluna capilar de sílica fundida, com 20-30 m de comprimento e 0,25-0,32 mm de diâmetro interno, revestida interiormente com uma camada de difenil(5 %)-dimetil(95 %)polissiloxano (fase estacionária SE-52, SE-54 ou equivalente), de espessura uniforme compreendida entre 0,10 μm e 0,30 μm.

3.12. Microsseringa de 10 μl para cromatografia em fase gasosa, com agulha cementada, adequada para o sistema de injeção com divisão de fluxo.

3.13. Exsicador com dicloreto de cálcio.

4. REAGENTES

4.1. Hidróxido de potássio a 85 % (ou de título superior).

4.2. Solução etanólica aproximadamente 2 N de hidróxido de potássio.

Dissolver, com arrefecimento, 130 g de hidróxido de potássio (4.1) em 200 ml de água destilada e completar o volume até um litro com etanol (4.11). Esta solução conserva-se em garrafas de vidro escuro bem fechadas, durante, no máximo, dois dias.

4.3. Éter etílico para análises.

4.4. Solução etanólica aproximadamente 0,2 N de hidróxido de potássio.

Dissolver 13 g de hidróxido de potássio (4.1) em 20 ml de água destilada e completar o volume até um litro com etanol (4.11).

4.5. Sulfato de sódio anidro para análises.

4.6. Placas de vidro (20 cm x 20 cm) revestidas de uma camada de sílica-gel, sem indicador de fluorescência, com 0,25 mm de espessura (disponíveis no comércio prontas a utilizar).

4.7. Tolueno para cromatografia.

4.8. Acetona para cromatografia.

4.9. n-Hexano para cromatografia.

4.10. Éter etílico para cromatografia.

4.11. Etanol para análises.

4.12. Acetato de etilo para análises.

4.13. Solução de referência para cromatografia em camada fina: colesterol ou fitoesteróis e solução a 5 % de eritrodiol em acetato de etilo (4.12).

4.14. Solução etanólica a 0,2 % de 2,7-diclorofluoresceína. Adicionar algumas gotas da solução alcoólica 2 N de hidróxido de potássio (4.2) para tornar a solução ligeiramente básica.

4.15. Piridina anidra para cromatografia (ver a nota 5).

4.16. Hexametildissilazano para análises.

4.17. Trimetilclorossilano para análises.

4.18. Soluções-amostra dos éteres trimetilsilílicos dos esteróis:

A preparar no momento da utilização a partir dos esteróis e do eritrodiol provenientes dos azeites ou óleos que os contêm.

4.19. α-Colestanol de pureza superior a 99 % (a verificar por análise cromatográfica em fase gasosa).

4.20. Solução padrão interno a 0,2 % (m/v) de α-colestanol em acetato de etilo (4.12).

4.21. Solução a 10 g/l de fenolftaleína em etanol (4.11).

4.22. Gás vetor: hidrogénio ou hélio para cromatografia em fase gasosa.

4.23. Gases auxiliares: hidrogénio, hélio, nitrogénio e ar para cromatografia em fase gasosa.

4.24. Mistura 65:35 (v/v) de n-hexano (4.9) e éter etílico (4.10).

4.25. Reagente de sililação, constituído por uma mistura 9:3.1 (v/v/v) de piridina, hexametildissilazano e trimetilclorossilano.

5. TÉCNICA

5.1. Preparação do extrato insaponificável 5.1.1. Introduzir num balão de 250 ml (3.1), por meio de uma microsseringa de 500 μl (3.6), um volume da solução padrão interno de α-colestanol (4.20) que contenha uma quantidade de colestanol correspondente a cerca de 10 % do teor de esteróis da amostra. Por exemplo, para 5 g de amostra, adicionar 500 μl de solução de α-colestanol (4.20), caso se trate de azeite, e 1 500 μl, caso se trate de óleo de bagaço de azeitona. Evaporar em banho-maria com uma corrente ligeira de nitrogénio até à secura, arrefecer o balão e, em seguida, pesar exatamente 5±0,01 g de amostra seca e filtrada para o mesmo balão. Nota 1: No caso das matérias gordas vegetais e animais que contêm quantidades consideráveis de colesterol, pode observar-se um pico com tempo de retenção próximo do tempo de retenção do pico do colestanol. Nesse caso, é necessário analisar a fração esterólica em duplicado, com e sem padrão interno. 5.1.2. Juntar 50 ml de solução etanólica 2 N de hidróxido de potássio (4.2) e um pouco de pedra-pomes, montar o condensador de refluxo e aquecer em banho-maria até uma ligeira ebulição, até que se produza a saponificação (a solução fica límpida). Continuar a aquecer durante 20 minutos, juntar 50 ml de água destilada no alto do condensador, retirar este e arrefecer o balão a cerca de 30 °C. 5.1.3. Transferir quantitativamente o conteúdo do balão para uma ampola de decantação de 500 ml (3.2), utilizando diversas vezes água destilada (50 ml). Juntar cerca de 80 ml de éter etílico (4.10) e agitar energicamente durante cerca de 60 segundos. Libertar a pressão de vez em quando, invertendo a ampola e retirando a tampa. Deixar em repouso até à separação completa das duas fases (nota 2). Em seguida, separar a fase saponificada, tão completamente quanto possível, para outra ampola de decantação. Proceder a duas outras extrações análogas da fase hidroalcoólica, utilizando de cada vez 60-70 ml de éter etílico (4.10). Nota 2: As eventuais emulsões podem ser eliminadas juntando pequenas quantidades de etanol (4.11). 5.1.4. Reunir os três extratos etéreos numa ampola de decantação que já contenha 50 ml de água. Prosseguir a lavagem com água (50 ml), até a água deixar de produzir uma coloração rosada por adição de uma gota de solução de fenolftaleína (4.21). Uma vez eliminada a água de lavagem, filtrar através de sulfato de sódio anidro (4.5) para um balão de 250 ml previamente tarado. Lavar a ampola de decantação e o filtro com pequenas quantidades de éter etílico (4.10). 5.1.5. Evaporar o solvente por destilação sob vácuo, a 30 °C, num evaporador rotativo. Adicionar 5 ml de acetona e eliminar completamente o solvente volátil com uma ligeira corrente de ar. Secar o resíduo numa estufa a 103±2 °C, durante 15 minutos. Arrefecer num exsicador e pesar com a aproximação de 0,1 mg.

5.2. Separação da fração esterólica e de diálcoois triterpénicos (eritrodiol + uvaol) 5.2.1. Preparação das placas alcalinizadas para cromatografia em camada fina: imergir as placas com sílica-gel (4.6) cerca de 4 cm, durante 10 segundos, na solução etanólica 0,2 N de hidróxido de potássio (4.4); deixar secar durante duas horas numa câmara de exaustão e colocar numa estufa, a 100 °C, durante uma hora. Retirar as placas da estufa e conservar num exsicador com cloreto de cálcio (3.13) até à utilização (devem utilizar-se no prazo de 15 dias). Nota 3: A utilização de placas de sílica-gel alcalinizadas para a separação da fração esterólica torna desnecessário o tratamento da fração insaponificável com alumina. Deste modo, todos os compostos de natureza ácida (ácidos gordos e outros) ficam retidos na linha de partida e a banda de esteróis fica nitidamente separada da banda de álcoois alifáticos e triterpénicos. 5.2.2. Introduzir a mistura de hexano e éter etílico (4.24) na câmara de revelação das placas (nota 4), até uma altura de aproximadamente 1 cm. Fechar a câmara com uma tampa adequada e deixar em repouso durante, pelo menos, meia hora, num local fresco, de modo a que se estabeleça o equilíbrio líquido/vapor. Podem colocar-se nas superfícies internas da câmara folhas de papel de filtro que mergulham no eluente. Esta precaução permite reduzir o tempo de revelação em cerca de um terço e obter uma eluição mais uniforme e regular dos componentes. Nota 4: A fim de obter condições de eluição perfeitamente reprodutíveis, a mistura de revelação deve ser mudada em cada ensaio. Também pode utilizar-se um solvente constituído por uma mistura 50:50 (v/v) de n-hexano e éter etílico. 5.2.3. Preparar uma solução aproximadamente a 5 % do extrato insaponificável (5.1.5) em acetato de etilo (4.12) e, com a microsseringa de 100 μl, depositar na placa cromatográfica (5.2.1), a aproximadamente 2 cm do bordo inferior, 0,3 ml da solução supracitada numa linha contínua, fina e uniforme. No alinhamento da linha de partida, depositar 2-3 μl da solução de referência (4.13), a fim de identificar a banda de esteróis e de diálcoois triterpénicos após a revelação. 5.2.4. Colocar a placa na câmara de revelação, preparada de acordo com o ponto 5.2.2. A temperatura ambiente deve ser mantida entre 15 °C e 20 °C (nota 5). Tapar imediatamente a câmara e deixar eluir até que a frente de solvente chegue a cerca de 1 cm do bordo superior da placa. Retirar a placa da câmara de revelação e evaporar o solvente numa corrente de ar quente, ou deixando a placa sob um exaustor durante alguns momentos. Nota 5: Temperaturas mais elevadas podem dificultar a separação. 5.2.5. Nebulizar a placa, ligeira e uniformemente, com a solução de 2,7-diclorofluoresceína (4.14) e deixar a secar. Quando a placa é observada à luz ultravioleta, a banda de esteróis e de diálcoois triterpénicos pode ser identificada pelo alinhamento com a mancha obtida para a solução de referência (4.13). Delimitar a banda com um lápis preto ao longo da margem de fluorescência (ver uma placa de cromatografia em camada fina na figura 3). 5.2.6. Raspar, com uma espátula metálica, o sílica-gel da zona delimitada. Introduzir a matéria retirada, finamente triturada, no cadinho filtrante (3.7). Juntar 10 ml de acetato de etilo (4.12) quente, misturar cuidadosamente com a espátula metálica e filtrar sob vácuo. Recolher o filtrado no frasco de kitasato (3.8) ligado ao cadinho de fundo filtrante. Lavar o resíduo no cadinho três vezes com éter etílico (4.3) (cerca de 10 ml de cada vez) e recolher o filtrado no frasco de kitasato adaptado ao cadinho de fundo filtrante. Evaporar o filtrado até se obter um volume de 4-5 ml. Transferir a solução residual para um tubo de centrifugação de 10 ml (3.9), previamente tarado, e evaporar até à secura, aquecendo ligeiramente, numa ligeira corrente de nitrogénio. Deitar algumas gotas de acetona (4.8) e evaporar novamente até à secura. O resíduo contido no tubo é constituído pela fração esterólica e de diálcoois triterpénicos.

5.3. Preparação dos éteres trimetilsilílicos 5.3.1. No tubo de centrifugação que contém a fração esterólica e de diálcoois triterpénicos, juntar o reagente de sililação (4.25) (nota 6), na proporção de 50 μl por miligrama de esteróis e de diálcoois triterpénicos, evitando qualquer absorção de humidade (nota 7). Nota 6: Existem no comércio soluções prontas a utilizar. Estão igualmente disponíveis outros reagentes de sililação, como o bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida + 1 % de trimetilclorossilano, a diluir num volume igual de piridina anidra. Pode substituir-se a piridina por igual quantidade de acetonitrilo. 5.3.2. Tapar o tubo de centrifugação e agitar cuidadosamente (sem virar) até à solubilização completa dos compostos. Deixar repousar durante, pelo menos, 15 minutos, à temperatura ambiente e depois centrifugar durante alguns minutos. A solução límpida está pronta a ser analisada por cromatografia em fase gasosa. Nota 7: A ligeira opalescência eventualmente formada é normal e não provoca interferências. A formação de um floculado branco ou o aparecimento de uma coloração rosa indicam a presença de humidade ou deterioração do reagente. Nesse caso, a análise tem de ser repetida (apenas se for utilizado hexametildissilazano/trimetilclorossilano).

5.4. Análise por cromatografia em fase gasosa 5.4.1. Operações preliminares, condicionamento da coluna capilar. 5.4.1.1. Instalar a coluna (3.11) no cromatógrafo de fase gasosa, ligando a extremidade de entrada à câmara de injeção com divisão de fluxo e a extremidade de saída ao detetor. Efetuar as verificações gerais da unidade de cromatografia em fase gasosa (hermeticidade do circuito dos gases, eficácia do detetor, eficácia do sistema de divisão de fluxo e do sistema de registo, etc.). 5.4.1.2. Se a coluna for utilizada pela primeira vez, é aconselhável condicioná-la. Para isso, faz-se passar um ligeiro fluxo gasoso pela coluna, liga-se a unidade de cromatografia em fase gasosa e aquece-se gradualmente, até atingir uma temperatura pelo menos 20 °C acima da temperatura de trabalho (nota 8). Mantém-se essa temperatura durante, pelo menos, duas horas. Em seguida, leva-se toda a unidade às condições de funcionamento (regulação do fluxo gasoso e da divisão de fluxo, inflamação da chama, ligação ao sistema de computação, regulação da temperatura da coluna, do detetor e do injetor, etc.) e regista-se o sinal com uma sensibilidade pelo menos duas vezes superior à pretendida para a análise. O traçado da linha de base obtida deve ser linear, sem qualquer pico ou desvio. Um desvio retilíneo negativo indica hermeticidade imperfeita das ligações da coluna; se for positivo, indica condicionamento inadequado da mesma. Nota 8: A temperatura de condicionamento deve ser sempre inferior, em pelo menos 20 °C, à temperatura máxima especificada para a fase estacionária utilizada. 5.4.2. Escolha das condições de funcionamento 5.4.2.1. As condições de funcionamento são as seguintes: — temperatura da coluna: 260 °C ± 5 °C; — temperatura do injetor: 280-300 °C; — temperatura do detetor: 280-300 °C; — velocidade linear do gás vetor: hélio, 20-35 cm/s; hidrogénio, 30-50 cm/s; — Divisão de fluxo («split»): de 1/50 a 1/100; — sensibilidade instrumental: 4 a 16 vezes a atenuação mínima; — sensibilidade de registo: 1 a 2 mV em toda a escala; — quantidade de substância injetada: 0,5-1 μl de solução de éteres trimetilsilílicos. Estas condições podem ser alteradas em função das características da coluna e do cromatógrafo de fase gasosa, de modo a obter cromatogramas que satisfaçam as seguintes condições: — tempo de retenção do pico do β-sitosterol: 20 minutos ± 5 minutos; — pico do campesterol: para o azeite (teor médio de 3 %), 20 ± 5 % da escala; para o óleo de soja (teor médio de 20 %), 80 ± 10 % da escala; — separação de todos os esteróis presentes. É necessário que, além de se apresentarem separados, os picos apresentem também resolução completa, ou seja, o traçado do pico deve voltar à linha base antes do arranque do pico seguinte. No entanto, é tolerada uma resolução incompleta, desde que o pico a TRR 1,02 (sitostanol) seja quantificável segundo a perpendicular. 5.4.3. Técnica analítica 5.4.3.1. Com a microsseringa de 10 μl, tomar 1 μl de hexano, aspirar 0,5 μl de ar e, em seguida, 0,5-1 μl da solução da amostra. Puxar um pouco mais o êmbolo da seringa, para que a agulha fique vazia. Introduzir a agulha através da membrana do injetor e, transcorridos 1 s a 2 s, injetar rapidamente. Passados cerca de 5 s, retirar a agulha devagar. Também pode utilizar-se um injetor automático. 5.4.3.2. Proceder ao registo até à eluição completa dos éteres trimetilsilílicos dos diálcoois triterpénicos presentes. A linha de base deve continuar a corresponder às condições exigidas (ponto 5.4.1.2). 5.4.4. Identificação dos picos Identificam-se individualmente os picos com base nos tempos de retenção, por comparação com misturas de éteres trimetilsilílicos de esteróis e de diálcoois triterpénicos, cromatografadas nas mesmas condições (ver o apêndice). A ordem de eluição dos esteróis e dos diálcoois triterpénicos é a seguinte: colesterol, brassicasterol, ergosterol, 24-metilenocolesterol, campesterol, campestanol, estigmasterol, Δ7-campesterol, Δ5,23-estigmastadienol, clerosterol, ß-sitosterol, sitostanol, Δ5-avenasterol, Δ5,24-estigmastadienol, Δ7-estigmastenol, Δ7-avenasterol, eritrodiol e uvaol. O quadro 1 mostra os tempos de retenção do ß-sitosterol para colunas SE-52 e SE-54. As figuras 1 e 2 apresentam cromatogramas típicos de determinados azeites. 5.4.5. Avaliação quantitativa 5.4.5.1. Recorrendo ao sistema de computação, calcular a área dos picos do α-colestanol e dos esteróis e diálcoois triterpénicos. Não se consideram os eventuais picos de compostos não incluídos na lista do quadro 1 (não se efetua o cálculo para o ergosterol). Considera-se igual a 1 o coeficiente de resposta para o α-colestanol. 5.4.5.2. Calcula-se a concentração de cada esterol, em mg/kg de matéria gorda, do seguinte modo: em que: Ax = área do pico do esterol x, em unidades do sistema de computação; As = área do pico do α-colestanol, em unidades do sistema de computação; ms = massa de α-colestanol adicionada, em miligramas; m = massa da toma de amostra para a determinação, em gramas.

6. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

6.1. Exprime-se a concentração de cada esterol em mg/kg de matéria gorda e a soma das concentrações respetivas como «esteróis totais».

Exprime-se a concentração de cada esterol, do eritrodiol e do uvaol com uma casa decimal.

A concentração de esteróis totais é expressa sem casas decimais.

▼M28

6.2. Calcula-se a percentagem de cada esterol a partir da relação entre a área do pico respetivo e a soma das áreas dos picos de todos os esteróis:

em que:

Ax = área do pico do esterol x;

ΣA = soma das áreas dos picos de todos os esteróis.

▼M26

6.3. β-Sitosterol aparente: Δ5,23-estigmastadienol + clerosterol + β-sitosterol + sitostanol + Δ5-avenasterol + Δ5,24-estigmastadienol.

6.4. Cálculo da percentagem de eritrodiol e uvaol:

em que:

ΣA = soma das áreas dos picos de todos os esteróis, em unidades do sistema de computação;

Er = área do pico do eritrodiol, em unidades do sistema de computação;

Uv = área do pico do uvaol, em unidades do sistema de computação.









Apêndice

Determinação da velocidade linear do gás

Injetam-se 1 a 3 μl de metano (ou propano) no cromatógrafo de fase gasosa, regulado para as condições de funcionamento normais, e cronometra-se o tempo gasto pelo gás para percorrer a coluna, entre o momento da injeção e o da saída do pico (tM).

A velocidade linear, em cm/s, é dada por L/tM, sendo L o comprimento da coluna, em centímetros, e tM o tempo cronometrado, em segundos.







Quadro 1 Tempos de retenção relativos dos esteróis Pico Identificação Tempos de retenção relativos Coluna SE 54 Coluna SE 52 1 Colesterol Δ5-Colesten-3ß-ol 0,67 0,63 2 Colestanol 5α-Colestan-3ß-ol 0,68 0,64 3 Brassicasterol (24S)-24-Metil-Δ5,22-colestadien-3ß-ol 0,73 0,71 * Ergosterol (24S)-24-Metil-Δ5,7,22-colestatrien-3ß-ol 0,78 0,76 4 24-Metilenocolesterol 24-Metileno-Δ5,24-colestadien-3ß-o1 0,82 0,80 5 Campesterol (24R)-24-Metil-Δ5-colesten-3ß-ol 0,83 0,81 6 Campestanol (24R)-24-Metilcolestan-3ß-ol 0,85 0,82 7 Estigmasterol (24S)-24-Etil-Δ5,22-colestadien-3ß-ol 0,88 0,87 8 Δ-7-Campesterol (24R)-24-Metil-Δ7-colesten-3ß-ol 0,93 0,92 9 Δ-5,23-Estigmastadienol (24R,S)-24-Etil-Δ5,23-colestadien-3ß-ol 0,95 0,95 10 Clerosterol (24S)-24-Etil-Δ5,25-colestadien-3ß-ol 0,96 0,96 11 ß-Sitosterol (24R)-24-Etil-Δ5-colesten-3ß-ol 1,00 1,00 12 Sitostanol 24-Etilcolestan-3ß-ol 1,02 1,02 13 Δ-5-Avenasterol (24Z)-24-Etilideno-Δ-colesten-3ß-ol 1,03 1,03 14 Δ-5-24-Estigmastadienol (24R,S)-24-Etil-Δ5,24-colestadien-3ß-ol 1,08 1,08 15 Δ-7-Estigmastenol (24R,S)-24-Etil-Δ7-colesten-3ß-ol 1,12 1,12 16 Δ-7-avenasterol (24Z)-24-Etilideno-Δ7-colesten-3ß-ol 1,16 1,16 17 Eritrodiol 5α-Olean-12-en-3ß,28-diol 1,41 1,41 18 Uvaol Δ12-Ursen-3ß,28-diol 1,52 1,52

Figura 1

Cromatograma de cromatografia em fase gasosa da fração esterólica e de diálcoois triterpénicos de um azeite lampante (com padrão interno)

Figura 2

Cromatograma de cromatografia em fase gasosa da fração esterólica e de diálcoois triterpénicos de um azeite refinado (com padrão interno)

Figura 3

Placa de cromatografia em camada fina de um óleo de bagaço de azeitona, com indicação da zona a raspar para determinação dos esteróis e dos diálcoois triterpénicos

1 – Esqualeno.

2 – Álcoois triterpénicos e alifáticos.

3 – Esteróis e diálcoois triterpénicos.

4 – Zona de partida e ácidos gordos livres.

▼M26 —————









▼B

O resultado é arredondado às décimas.

▼M21









ANEXO VII

DETERMINAÇÃO DA PERCENTAGEM DE MONOPALMITATO DE 2-GLICERILO

1. OBJECTIVO E CAMPO DE APLICAÇÃO

O presente método descreve o procedimento analítico para a determinação da percentagem de ácido palmítico em posição 2 dos triglicéridos através da avaliação do monopalmitato de 2-glicerilo.

Este método é aplicável aos óleos vegetais líquidos à temperatura ambiente (20 °C).

2. PRINCÍPIO

Após preparação, a amostra de azeite é sujeita à acção da lipase pancreática: uma hidrólise parcial e específica nas posições 1 e 3 da molécula de triglicérido determina a formação de monoglicéridos na posição 2. A percentagem de monopalmitato de 2-glicerilo na fracção monoglicerídica é determinada, após sililação, por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar.

3. APARELHOS E UTENSÍLIOS

3.1. Erlenmeyer de 25 ml

3.2. Provetas de 100, 250 e 300 ml

3.3. Coluna cromatográfica de vidro, com 21-23 mm de diâmetro interno e 400 mm de comprimento, equipada com um disco poroso de vidro e uma tampa

3.4. Tubos de ensaio graduados de 10, 50, 100 e 200 ml

3.5. Balões de 100 e 250 ml

3.6. Evaporador rotativo

3.7. Tubos de centrifugadora de fundo cónico, com cerca de 10 ml de capacidade, com rolha esmerilada

3.8. Centrifugadora para tubos de 10 e 100 ml

3.9. Termóstato que permita manter a temperatura a 40 °C + 0,5 °C

3.10. Pipetas graduadas de 1 e 2 ml

3.11. Seringa hipodérmica de 1 ml

3.12. Microsseringa de 100 μl

3.13. Ampola de decantação de 1 000 ml

3.14. Cromatografia de fase gasosa adequado para colunas capilares, equipado com um dispositivo de injecção na coluna («on column») a frio, para a introdução directa da amostra na coluna, e um forno passível de manter a temperatura escolhida com uma precisão de 1 °C.

3.15. Injector na coluna a frio para a introdução directa da amostra na coluna

3.16. Detector de ionização de chama e electrómetro

3.17. Registador-integrador adequado ao funcionamento com o electrómetro, com um tempo de resposta não superior a um segundo e com uma velocidade de papel variável

3.18. Coluna capilar de vidro ou de sílica fundida, com 8 m a 12 m de comprimento e 0,25 mm a 0,32 mm de diâmetro interno, revestida de metilpolissiloxano ou fenilmetilpolissiloxano a 5 %, de espessura compreendida entre 0,10 μm e 0,30 μm, que possa ser utilizada a 370 °C

3.19. Microsseringa de 10 μl com agulha cementada com, pelo menos, 7,5 cm de comprimento, para injecção directa na coluna

4. REAGENTES

4.1. Silicagel com granulometria compreendida entre 0,063 e 0,200 mm (70/280 mesh), preparado do seguinte modo: colocar o silicagel numa cápsula de porcelana, secar na estufa a 160 °C durante 4 horas e deixar arrefecer até à temperatura ambiente num exsicador. Juntar um volume de água equivalente a 5 % do peso de silicagel, do seguinte modo: num Erlenmeyer de 500 ml, pesar 152 g de silicagel e juntar 8 g de água destilada; tapar e agitar suavemente para obter uma repartição uniforme da água. Deixar repousar durante pelo menos 12 horas antes do uso.

4.2. n-Hexano para cromatografia

4.3. Isopropanol

4.4. Isopropanol em solução aquosa 1/1 (V/V)

4.5. Lipase pancreática. A lipase utilizada deve ter uma actividade compreendida entre 2,0 e 10 unidades de lipase por mg. (Existem no comércio lipases pancreáticas com uma actividade compreendida entre 2 e 10 unidades por mg de enzima.)

4.6. Solução tampão de tris-hidroximetilaminometano: solução aquosa 1M levada a pH 8 (controlo potenciométrico) por adição de HCl concentrado (1:1 V/V)

4.7. Solução aquosa a 0,1 % de colato de sódio (qualidade enzimática), que deve ser utilizada no prazo de 15 dias após a preparação.

4.8. Solução aquosa a 22 % de cloreto de cálcio

4.9. Éter etílico para cromatografia

4.10. Eluente: mistura n-hexano/éter etílico (87:13) (V/V)

4.11. Solução a 12 % da amostra de hidróxido de sódio

4.12. Solução de fenolftaleína a 1 % em etanol

4.13. Gás vector: hidrogénio ou hélio, para cromatografia em fase gasosa

4.14. Gases auxiliares: hidrogénio de pureza mínima 99 %, isento de humidade e de substâncias orgânicas; ar para cromatografia em fase gasosa, com o mesmo grau de pureza

4.15. Reagente de silanização: mistura de piridina, hexametildissilazano e trimetilclorossilano 9:3:1 (v/v/v). [Existem no comércio soluções prontas a utilizar. É possível utilizar outros reagentes silanizantes, como uma mistura de bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida com 1 % de trimetilclorossilano, a diluir num volume igual de piridina anidra.]

4.16. Amostras de referência: monoglicéridos puros ou misturas de monoglicéridos com uma composição em percentagem conhecida, semelhante à da amostra.

5. PROCEDIMENTO

5.1. Preparação da amostra

5.1.1. Os azeites com acidez livre inferior a 3 % não necessitam de ser neutralizados antes da cromatografia em coluna de silicagel. Os azeites com acidez livre superior a 3 % devem ser sujeitos à neutralização, em conformidade com o ponto 5.1.1.1. 5.1.1.1. Deitar 50 g de azeite e 200 ml de n-hexano na ampola de decantação de 1 000 ml (3.13). Juntar 100 ml de isopropanol e uma quantidade da solução de hidróxido de sódio a 12 % (4.11) correspondente à acidez livre do azeite majorada de 5 %. Agitar energicamente durante um minuto. Juntar 100 ml de água destilada, agitar de novo e deixar repousar. Após a decantação, eliminar a camada inferior que contém os sabões. Remover igualmente as eventuais camadas intermédias (mucilagem, matérias insolúveis). Lavar a solução de óleo neutralizado em hexano com sucessivas porções de 50-60 ml da solução de isopropanol/água 1:1 (V/V) (4.4), até ao desaparecimento da coloração carmim da fenolftaleína. Remover a maior parte do solvente por destilação sob vácuo no evaporador rotativo e transferir o azeite para um balão de 100 ml (3.5). Secar o azeite sob vácuo até à eliminação total do solvente. No final desta operação, a acidez do azeite deve ser inferior a 0,5 %.

5.1.2. Introduzir 1,0 g de azeite preparado como indicado acima num Erlenmeyer de 25 ml (3.1) e dissolver em 10 ml de eluente (4.10). Deixar repousar a solução durante, pelo menos, 15 minutos, antes da cromatografia em coluna de silicagel. Se a solução estiver turva, centrifugá-la para garantir condições óptimas para a cromatografia. [É possível utilizar cartuchos de silicagel de extracção em fase sólida (SPE) de 500 mg prontos a ser utilizados.]

5.1.3. Preparação da coluna cromatográfica Deitar na coluna (3.3) cerca de 30 ml de eluente (4.10), introduzir um pouco de algodão na parte inferior da coluna com a ajuda de uma varinha de vidro; apertar para eliminar o ar. Preparar, numa proveta, uma suspensão de 25 g de silicagel (4.1) em cerca de 80 ml de eluente e deitar na coluna utilizando um funil. Verificar que o silicagel foi integralmente introduzido na coluna; lavar com eluente (4.10), abrir a torneira e deixar escorrer até que o nível deste desça até cerca de 2 mm acima do nível superior do silicagel.

5.1.4. Cromatografia em coluna Num Erlenmeyer de 25 ml (3.1), pesar rigorosamente 1,0 g de amostra preparada em conformidade com o ponto 5.1. Abrir a torneira e deixar escoar a solução da amostra até esta atingir o nível do silicagel. Eluir com 150 ml de eluente. Ajustar o fluxo a 2 ml/min (de forma a que passem na coluna 150 ml em cerca de 60 ou 70 minutos). Recolher o eluído num balão de 250 ml, previamente tarado. Evaporar o solvente sob vácuo e eliminar os últimos vestígios do mesmo numa corrente de azoto. Pesar o balão e determinar o extracto recuperado. Caso se utilizem cartuchos de silicagel SPE prontos a serem utilizados, proceder do seguinte modo: introduzir 1 ml de solução (5.1.2) nos cartuchos previamente preparados com 3 ml de n-hexano Depois de filtrar a solução, eluir com 4 ml de n-hexano/éter etílico a 9:1 (v/v). Recuperar o eluído num tubo de 10 ml e evaporá-lo numa corrente de azoto até à secura. Submeter o resíduo seco à acção da lipase pancreática (5.2). (É fundamental verificar a composição em ácidos gordos antes e depois de passar pelo cartucho SPE).

5.2. Hidrólise com lipase pancreática

5.2.1. Num tubo da centrifugadora, pesar 0,1 g de azeite preparado em conformidade com o ponto 5.1. Adicionar 2 ml de solução tampão (4.6), 0,5 ml de solução de colato de sódio (4.7) e 0,2 ml de solução de cloreto de cálcio, agitando bem após cada adição. Tapar o tubo com a rolha esmerilada e colocá-lo no termóstato a 40 + 0,5 °C.

5.2.2. Adicionar 20 mg de lipase, agitar cuidadosamente (evitando o contacto da solução com a rolha) e colocar o tubo no termóstato durante exactamente dois minutos. Em seguida, retirar, agitar energicamente durante 1 minuto e deixar arrefecer.

5.2.3. Adicionar 1 ml de éter etílico, tapar e agitar energicamente; centrifugar e, com uma microsseringa, transferir a solução de éter para um tubo limpo e seco.

5.3. Preparação dos derivados silanizados e da cromatografia em fase gasosa

5.3.1. Com uma microsseringa, introduzir 100 μl de solução (5.2.3) num tubo de fundo cónico de 10 ml.

5.3.2. Eliminar o solvente em corrente ligeira de azoto, juntar 200 μl de reagente de silanização (4.15), tapar o tubo e deixar repousar durante 20 minutos.

5.3.3. Passados 20 minutos, juntar entre 1 e 5 ml de n-hexano (em função das condições cromatográficas): a solução resultante está pronta para a cromatografia em fase gasosa.

5.4. Cromatografia em fase gasosa

As condições de funcionamento são as seguintes:

— Temperatura do injector (injector em coluna) inferior à temperatura de ebulição do solvente (68 °C).

— Temperatura do detector: 350 °C;

— Temperatura na coluna: programação da temperatura do forno: 60 °C durante 1 minuto, aumentando 15 °C por minuto até 180 °C, seguindo-se 5 °C por minuto até 340 °C e, finalmente, 340 °C durante 13 minutos.

— Gás vector: hidrogénio ou hélio, regulado à velocidade linear adequada para obter a resolução reflectida na figura 1. O tempo de retenção do triglicérido C54 deve ser de 40 + 5 minutos (ver figura 2). (As condições de trabalho indicadas são propostas a título indicativo. Cada operador deverá optimizar as condições para alcançar a resolução pretendida. A altura do pico correspondente ao monopalmitato de 2-glicerilo deve ter uma altura mínima igual a 10 % da escala do registador.)

— Volume injectado: 0,5-1 μl de solução (5 ml) de n-hexano (5.3.3).

5.4.1. Identificação dos picos

Os monoglicéridos individuais são identificados em função dos respectivos tempos de retenção obtidos, comparando com os correspondentes a misturas-padrão de monoglicéridos analisadas mas mesmas condições.

5.4.2. Avaliação quantitativa

A área referente a cada pico é calculada utilizando um integrador electrónico.

6. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

Calcular a percentagem de monopalmitato de glicerilo com base na relação entre a área do respectivo pico e a soma das áreas dos picos de todos os monoglicéridos (ver figura 2), de acordo com a seguinte fórmula:

Glycéril monopalmitate (%):

Em que:

Ax = área do pico relativo ao monopalmitato de glicerilo

ΣA = soma das áreas correspondentes a todos os picos de monoglicéridos

Os resultados arredondam-se às décimas.

7. RELATÓRIO DA ANÁLISE

O relatório da análise deve especificar:

— a referência ao presente método;

— toda a informação necessária para a completa identificação da amostra;

— os resultados da análise;

— os eventuais desvios em relação ao presente método, quer se trate de uma decisão das partes interessadas ou por qualquer outra razão;

— os dados de identificação do laboratório, a data da análise e a assinatura dos responsáveis da mesma.

Figura 1

Cromatograma dos produtos da reacção de silanização obtidos pela acção da lipase num azeite refinado adicionado de 20 % de azeite esterificado (100 %).

[Key: «acides gras libres» = ácidos gordos livres; «Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée» = azeite refinado + 20 % azeite esterificado; «1-2 monopalmitoléine» = 1-2 monopalmitoleína; «1-2 mono C18 insat.» = 1-2 mono C18 insaturado]

Figura 2

Cromatograma de:

A) Azeite não esterificado, após tratamento com lipase; após silanização; nestas condições (coluna capilar de 8 a 12 m), a fracção de ceras é eluída ao mesmo tempo que a fracção de diglicéridos, ou pouco depois. Após lipase, o teor de triglicéridos não deve exceder 15 %. Legenda: 1 = Ácidos gordos livres 2 = Monoglicéridos 3 = Diglicéridos 4 = Triglicéridos * = 2-Monopalmitina ** = Triglicérido C54

Cromatograma de:

B) azeite esterificado após tratamento com lipase; após silanização; nestas condições (coluna capilar de 8 a 12 m), a fracção de ceras é eluída ao mesmo tempo que a fracção de diglicéridos ou pouco depois. Após lipase, o teor de triglicéridos não deve exceder 15 %. Legenda: 1 = Ácidos gordos livres 2 = Monoglicéridos 3 = Diglicéridos 4 = Triglicéridos * = 2-Monopalmitina ** = Triglicérido C54

8. NOTAS

PREPARAÇÃO DA LIPASE

Existem no comércio lipases com uma actividade satisfatória. Também é possível prepará-las no laboratório da forma seguinte:

Arrefecer 5 kg de pâncreas fresco de porco a 0 °C. Remover a matéria gorda sólida periférica, bem como o tecido conjuntivo, e triturar num almofariz de modo a obter um fluido pastoso. Agitar esta pasta durante 4 a 6 horas, em 2,5 l de acetona anidra, e centrifugar. Extrair o resíduo mais três vezes com o mesmo volume de acetona anidra e, seguidamente, extrair duas vezes com uma mistura de acetona e éter etílico na proporção de 1:1 (V/V). Por fim, extrair duas vezes com éter etílico.

Secar o resíduo sob vácuo durante 48 horas, de modo a obter um pó estável, que se conserva no frigorífico por um período prolongado, ao abrigo da humidade.

CONTROLO DA ACTIVIDADE DA LIPASE

Prepara-se uma emulsão de azeite do seguinte modo:

Agitar durante 10 minutos, num agitador, uma mistura de 165 ml de solução de goma arábica a 100g/l, 15 g de gelo triturado e 20 ml de azeite neutralizado.

Num copo de 50 ml, colocar sucessivamente 10 ml da emulsão, 0,3 ml de solução de colato de sódio a 0,2g/ml e 20 ml de água destilada.

Colocar o copo num termóstato regulado a 37 °C; introduzir os eléctrodos do medidor de pH e o agitador de hélice.

Com o auxílio de uma pipeta, adicionar gota a gota uma solução de hidróxido de sódio 0,1 N até ser atingido o valor de pH 8,3.

Juntar um volume de suspensão de pó de lipase em água (0,1 g/ml de lipase). No instante em que o medidor de pH indicar um valor de 8,3, accionar o cronómetro e adicionar a solução de hidróxido de sódio, gota a gota, ao ritmo necessário para manter um pH de 8,3. Anotar o volume de solução consumido por minuto.

Anotar as observações num sistema de eixos coordenados, em que as abcissas correspondem ao tempo e as ordenadas aos mililitros de solução alcalina 0,1 N consumidos para manter o pH constante. Deve obter-se um gráfico linear.

A actividade da lipase, medida em unidades de lipase por mg, é dada pela fórmula seguinte:

em que:

A = actividade em unidades lipase/mg

V = número de mililitros de solução de hidróxido de sódio 0,1 N por minuto (calculados a partir do gráfico)

N = normalidade da solução de hidróxido de sódio

m = massa, em mg, da lipase para análise.

A unidade de lipase é definida como a quantidade de enzimas que permite libertar 10 miliequivalentes de ácido por minuto.

▼M20 —————

▼M28









ANEXO IX

ANÁLISE POR ESPETROFOTOMETRIA NO ULTRAVIOLETA

INTRODUÇÃO

A análise espetrofotométrica no ultravioleta pode fornecer indicações sobre a qualidade de uma matéria gorda, o estado de conservação desta e as modificações devidas aos processos tecnológicos a que foi sujeita. As absorvências nos comprimentos de onda especificados no método são devidas à presença de sistemas diénicos e triénicos conjugados, resultantes de processos de oxidação e/ou de práticas de refinação. Os valores destas absorvências são expressos em termos de extinção específica

– extinção de uma solução a 1 % (m/v) da matéria gorda no solvente prescrito, numa célula de 10 mm –, convencionalmente designada por K e também por «coeficiente de extinção».

1. OBJETIVO

Este anexo descreve o processo de realização de análises espectrofotométricas no ultravioleta ao azeite.

2. PRINCÍPIO DO MÉTODO

Dissolve-se uma amostra no solvente estabelecido e mede-se a absorvência da solução em relação ao solvente puro, nos comprimentos de onda prescritos.

Calculam-se as extinções específicas a 232 nm e 268 nm em iso-octano ou a 232 nm e 270 nm em ciclo-hexano, à concentração de 1 % (m/v), numa célula de 10 mm.

3. APARELHOS E UTENSÍLIOS

3.1. Espetrofotómetro para medições no ultravioleta, entre 220 nm e 360 nm, com possibilidade de leitura por unidade nanométrica. Recomenda-se a verificação regular da exatidão e da reprodutibilidade das escalas de absorvência e de comprimento de onda, bem como da luz parasita. 3.1.1. Escala de comprimento de onda: Esta verificação pode ser efetuada com um material de referência constituído por um filtro ótico de vidro dopado com óxido de hólmio ou por uma solução de óxido de hólmio (selada ou não), que possui bandas de absorção distintas. Estes materiais de referência foram concebidos para a verificação e calibração das escalas de comprimento de onda de espetrofotómetros do visível e do ultravioleta com largura de banda espetral nominal igual ou inferior a 5 nm. Efetuam-se as medições em relação a um branco de ar, no intervalo de comprimentos de onda compreendido entre 640 nm e 240 nm, de acordo com as instruções que acompanham os materiais de referência. A cada alteração da largura da fenda, corrige-se a linha de base com a trajetória do feixe luminoso livre. Os comprimentos de onda padrão figuram no certificado do material de referência. 3.1.2. Escala de absorvência: Esta verificação pode ser efetuada com materiais de referência selados disponíveis no comércio, constituídos por soluções ácidas de dicromato de potássio a determinadas concentrações e com valores certificados de absorvência a λmáx (quatro soluções de dicromato de potássio em ácido perclórico, seladas em quatro células de quartzo para UV, para medir a linearidade e a exatidão fotométrica de referência no ultravioleta). Efetuam-se as medições das soluções de dicromato de potássio em relação a um branco do ácido utilizado, após correção da linha de base, de acordo com as instruções que acompanham o material de referência. Os valores de absorvência figuram no certificado do material de referência. Outro modo de verificar a resposta da célula fotoelétrica e do fotomultiplicador: pesam-se 0,2000 g de cromato de potássio puro para espectrofotometria e dissolvem-se numa solução 0,05 N de hidróxido de potássio num balão aferido de 1 000 ml, completando o volume até ao traço de aferição. Tomam-se exatamente 25 ml da solução obtida, transferem-se para um balão aferido de 500 ml e dilui-se até ao traço de aferição com a mesma solução de hidróxido de potássio. Mede-se a extinção desta solução a 275 nm, utilizando a solução de hidróxido de potássio como referência. A extinção medida com uma célula de 1 cm de percurso ótico deve ser de 0,200 ± 0,005.

3.2. Células retangulares de quartzo com tampa, adequadas para medições no ultravioleta (220 nm a 360 nm), com percurso ótico de 10 mm. Quando cheias de água ou de outro solvente adequado, as células não devem apresentar entre elas diferenças superiores a 0,01 unidades de extinção.

3.3. Balões volumétricos de 25 ml com traço de aferição, classe A.

3.4. Balança analítica com aproximação de 0,0001 g.

4. REAGENTES

Salvo indicação em contrário, utilizam-se unicamente nas análises reagentes de qualidade analítica reconhecida e água destilada ou desmineralizada ou de pureza equivalente.

Solventes: iso-octano (2,2,4-trimetilpentano), para as medições a 232 nm e 268 nm, ou ciclo-hexano, para as medições a 232 nm e 270 nm, de absorvência inferior a 0,12 a 232 nm e inferior a 0,05 a 270 nm, comparativamente a água destilada, medida numa célula de 10 mm.

5. TÉCNICA

5.1. A amostra deve estar perfeitamente homogénea e estar isenta de impurezas em suspensão. Se assim não for, terá de ser filtrada com papel de filtro a cerca de 30 °C.

5.2. Pesam-se rigorosamente, num balão aferido de 25 ml, com a aproximação de 1 mg, cerca de 0,25 g da amostra, preparada de acordo com o ponto anterior, completando o volume com o solvente prescrito até ao traço de aferição e homogeneizando. Deve obter-se uma solução perfeitamente límpida. No caso de a solução apresentar opalescência ou turvação, filtra-se rapidamente com papel de filtro. NOTA: Em geral, é suficiente uma massa de 0,25-0,30 g para medir absorvências de azeites virgens e azeites virgens extra a 268 nm e 270 nm. Para medições a 232 nm, é normalmente necessária uma massa de 0,05 g de amostra, pelo que habitualmente se preparam duas soluções distintas. Para medir absorvências de óleos de bagaço de azeitona, azeites refinados e azeites adulterados, cuja absorvência é maior, é normalmente suficiente uma quantidade mais pequena de amostra, por exemplo 0,1 g.

5.3. Se necessário, corrige-se a linha de base (220-290 nm) com solvente em ambas as células de quartzo (amostra e referência), enche-se a célula de quartzo da amostra com a solução em estudo e medem-se as extinções a 232, 268 ou 270 nm comparativamente ao solvente utilizado como referência. Os valores de extinção registados devem estar compreendidos entre 0,1 e 0,8 ou na gama de linearidade do espetrofotómetro (a qual deve ser verificada). Caso contrário, repetem-se as medições utilizando soluções mais concentradas ou mais diluídas, consoante o caso.

5.4. Uma vez medida a absorvência a 268 nm ou a 270 nm, mede-se a absorvência a λmáx, λmáx + 4 e λmáx – 4. Utilizam-se estes valores de absorvência para determinar a variação da extinção específica (ΔΚ). NOTA: Considera-se que o valor de λmáx é 268 nm para o solvente iso-octano e 270 nm para o solvente ciclo-hexano.

6. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

6.1. As extinções específicas (coeficientes de extinção) registadas nos diversos comprimentos de onda calculam-se pela seguinte fórmula: em que: Kλ = extinção específica no comprimento de onda λ, Eλ = extinção medida no comprimento de onda λ, c = concentração da solução, em g/100 ml, s = percurso ótico na célula de quartzo, em cm; Os resultados são arredondados às centésimas.

6.2. Variação da extinção específica (ΔΚ) A variação do valor absoluto da extinção específica (ΔΚ) é dada por: em que Km é a extinção específica no comprimento de onda correspondente à absorção máxima do solvente utilizado (270 nm ou 268 nm). Os resultados são arredondados às centésimas.









ANEXO X

DETERMINAÇÃO DOS ÉSTERES METÍLICOS DE ÁCIDOS GORDOS POR CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA

1. OBJETIVO

Este anexo fornece orientações sobre a determinação por cromatografia em fase gasosa de ácidos gordos livres e ligados em matérias gordas vegetais, após conversão dos ácidos em ésteres metílicos de ácidos gordos (FAME)

Convertem-se os ácidos gordos ligados dos triacilgliceróis e, dependendo do método de esterificação, os ácidos gordos livres em ésteres metílicos de ácidos gordos, que são determinados por cromatografia em fase gasosa em coluna capilar.

O método descrito neste anexo permite determinar ésteres metílicos de ácidos gordos de C12 a C24, incluindo ésteres metílicos de ácidos gordos saturados, monoinsaturados cis e trans e poli-insaturados cis e trans.

2. PRINCÍPIO

Determinam-se quantitativamente os ésteres metílicos de ácidos gordos por cromatografia em fase gasosa. Preparam-se os ésteres de acordo com a parte A, após o que se injetam e vaporizam no injetor. Separam-se os ésteres em colunas analíticas de polaridade e comprimento específicos. Para detetar os ésteres, utiliza-se um detetor de ionização de chama. As condições analíticas são descritas na parte B.

O gás vetor (fase móvel) utilizado na cromatografia em fase gasosa de ésteres metílicos de ácidos gordos com detetor de ionização de chama é hidrogénio ou hélio. O hidrogénio acelera a separação e permite obter picos mais nítidos. A fase estacionária é uma camada microscópica constituída por um filme líquido fino numa superfície sólida inerte de sílica fundida.

À medida que percorrem a coluna capilar, os compostos volatilizados em análise interagem com a fase estacionária que reveste a superfície interior da coluna. Devido à interação diferente com os diversos compostos, estes eluem em tempos diferentes, constituindo cada um deles o tempo de retenção do composto em causa para a série de parâmetros analíticos considerada. Identifica-se cada composto por comparação do tempo de retenção correspondente.

PARTE A

PREPARAÇÃO DOS ÉSTERES METÍLICOS DOS ÁCIDOS GORDOS DO AZEITE E DO ÓLEO DE BAGAÇO DE AZEITONA

1. OBJETIVO

Esta parte descreve a preparação dos ésteres metílicos de ácidos gordos. Compreende métodos para a preparação dos ésteres metílicos de ácidos gordos de azeites e de óleo de bagaço de azeitona.

2. DOMÍNIO DE APLICAÇÃO

Preparam-se os ésteres metílicos de ácidos gordos de azeites e de óleo de bagaço de azeitona por transesterificação à temperatura ambiente com solução metanólica de hidróxido de potássio. A necessidade de purificar a amostra antes da transesterificação depende do teor de ácidos gordos livres da amostra e do parâmetro analítico a determinar. A decisão pode ser tomada com base no quadro seguinte:







Categoria do azeite ou óleo Método Azeite virgem com acidez ≤ 2,0 % 1. Ácidos gordos 2. Ácidos gordos trans 3. ΔNCE42 (após purificação por extração em fase sólida com sílica-gel) Azeite refinado Azeite constituído por azeite refinado e azeites virgens Óleo de bagaço de azeitona refinado Óleo de bagaço de azeitona Azeite virgem com acidez > 2,0 % Óleo de bagaço de azeitona bruto 1. Ácidos gordos (após purificação por extração em fase sólida com sílica-gel) 2. Ácidos gordos trans (após purificação por extração em fase sólida com sílica-gel) 3. ΔNCE42 (após purificação por extração em fase sólida com sílica-gel)

3. MÉTODO

3.1. Transesterificação à temperatura ambiente com solução metanólica de hidróxido de potássio

3.1.1. Princípio

Formação dos ésteres metílicos por transesterificação com uma solução metanólica de hidróxido de potássio, como fase intermédia antes da saponificação.

3.1.2. Reagentes

3.1.2.1. Metanol com teor de humidade não superior a 0,5 % (m/m).

3.1.2.2. Hexano para cromatografia.

3.1.2.3. Heptano para cromatografia.

3.1.2.4. Éter dietílico estabilizado para análise.

3.1.2.5. Acetona para cromatografia.

3.1.2.6. Solvente de eluição para purificação do azeite ou óleo por cromatografia em coluna/extração em fase sólida: mistura 87:13 (v/v) de hexano e éter dietílico.

3.1.2.7. Solução metanólica aproximadamente 2 M de hidróxido de potássio: dissolvem-se 11,2 g de hidróxido de potássio em 100 ml de metanol.

3.1.2.8. Cartuchos de sílica-gel de 1 g (6 ml) para extração em fase sólida.

3.1.3. Utensílios

3.1.3.1. Tubos de ensaio com tampa de rosca e junta de PTFE, com 5 ml de capacidade.

3.1.3.2. Pipetas graduadas ou automáticas de 2 ml e 0,2 ml.

3.1.4. Purificação das amostras de azeite ou de óleo

Se necessário, purificam-se as amostras passando o azeite ou óleo por um cartucho de sílica-gel para extração em fase sólida. Coloca-se um cartucho de sílica-gel (3.1.2.8) num aparelho de eluição sob vazio e lava-se com 6 ml de hexano (3.1.2.2). A lavagem não é efetuada sob vazio. Introduz-se a seguir na coluna uma solução de aproximadamente 0,12 g do azeite ou óleo em 0,5 ml de hexano (3.1.2.2). Empurra-se e elui-se esta solução com 10 ml de hexano/éter dietílico na proporção 87:13 (v/v) (3.1.2.6). Combinam-se os eluatos, homogeneiza-se e divide-se o volume total em dois volumes semelhantes. Evapora-se um dos volumes até à secura, num evaporador rotativo, sob pressão reduzida, à temperatura ambiente. Dissolve-se o resíduo em 1 ml de heptano. A solução obtida está pronta para a análise dos ácidos gordos por cromatografia em fase gasosa. Evapora-se o segundo volume e dissolve-se o resíduo em 1 ml de acetona, para a análise dos triacilgliceróis por HPLC, se necessário.

3.1.5. Procedimento

Num tubo de ensaio com tampa de rosca de 5 ml (3.1.3.1), pesa-se aproximadamente 0,1 g da amostra de azeite ou óleo. Juntam-se 2 ml de heptano (3.1.2.2) e agita-se. Juntam-se 0,2 ml da solução metanólica de hidróxido de potássio (3.1.2.7), tapa-se com a tampa com junta de PTFE, fecha-se bem e agita-se energicamente durante 30 segundos. Deixa-se repousar até a parte superior da solução ficar límpida. Decanta-se a camada superior, que contém os ésteres metílicos. A solução de heptano está pronta para ser injetada no cromatógrafo de fase gasosa. É aconselhável manter esta solução no frigorífico até à análise croma