1991R2568 — PT — 09.08.2012 — 024.001

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REGULAMENTO (CEE) N.o 2568/91 DA COMISSÃO

de 11 de Julho de 1991

relativo às características dos azeites e dos óleos de bagaço de azeitona, bem como aos métodos de análise relacionados







A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS, Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Europeia, Tendo em conta o Regulamento n.o 136/66/CEE do Conselho, de 22 de Setembro de 1966, que estabelece uma organização comum de mercado no sector das matérias gordas ( 1 ), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CEE) n.o 3577/90 ( 2 ), e, nomeadamente, o seu artigo 35.oA, Considerando que o anexo do Regulamento n.o 136/66/CEE estabelece as denominações e definições dos azeites e dos óleos de bagaço de azeitona comercializados no interior de cada Estado-membro, bem como nas trocas comerciais intracomunitárias e com países terceiros; Considerando que, para poder distinguir os diversos tipos de azeite e óleo de bagaço de azeitona, há que definir as características físico-químicas de cada um deles, bem como as características organolépticas dos azeites virgens, por forma a assegurar a pureza e a qualidade dos produtos em causa, sem prejuízo de outras disposições existentes na matéria; Considerando que é conveniente determinar de modo uniforme, em toda a Comunidade, a presença das características dos diversos tipos de azeite e óleo de bagaço de azeitona; que, para o efeito, é necessário estabelecer métodos comunitários de análise química e de apreciação organoléptica; que, no entanto, é conveniente autorizar, durante um período transitório, a utilização de outros métodos de análise aplicados nos Estados-membros, com a condição de, em caso de divergência de resultados, serem determinantes os obtidos de acordo com o método comum; Considerando que a definição das características físico-químicas dos azeites e óleos de bagaço de azeitona e o estabelecimento dos métodos de análise implicam a adaptação das notas complementares do capítulo 15 da Nomenclatura Combinada; Considerando que o método de avaliação das características organolépticas dos azeites virgens prevê a criação de júris de provadores seleccionados e formados; que é, por conseguinte, conveniente prever o prazo necessário para a instalação dessa estrutura; que, atendendo às dificuldades que serão sentidas por determinados Estados-membros na constituição dos júris de provadores, é conveniente autorizar o recurso a júris existentes em outros Estados-membros; Considerando que, para assegurar o correcto funcionamento do sistema dos direitos niveladores aplicáveis à importação de bagaços de azeitona, é conveniente prever um método único para a determinação do teor de óleo desses produtos; Considerando que, para não causar um prejuízo ao comércio, deve ser previsto um período limitado para o escoamento dos azeites e óleos de bagaço de azeitona acondicionados antes da entrada em vigor do presente regulamento; Considerando que deve, consequentemente, ser revogado o Regulamento (CEE) n.o 1058/77 da Comissão ( 3 ), com a última redacção que lhe foi dada pelo Regulamento (CEE) n.o 1858/ /88 ( 4 ); Considerando que o Comité de Gestão das Matérias Gordas não emitiu parecer no prazo fixado pelo seu presidente, ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO:







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Artigo 1.o

1. São considerados azeites virgens, na acepção do ponto 1, alíneas a), b) e c), do anexo do Regulamento n.o 136/66/CEE, os azeites que apresentem as características indicadas nos pontos 1 e 2 do anexo I do presente regulamento.

2. É considerado azeite lampante, na acepção do ponto 1, alínea c) do anexo do Regulamento n.o 136/66/CEE, o azeite que apresente as características indicadas no ponto 3 do anexo I do presente regulamento.

3. É considerado azeite refinado, na acepção do ponto 2 do anexo do Regulamento n.o 136/66/CEE, o azeite que apresente as características indicadas no ponto 4 do anexo I do presente regulamento.

4. É considerado azeite constituído por azeite refinado e azeites virgens, na acepção do ponto 3 do anexo do Regulamento n.o 136/66/CEE, o azeite que apresente as características indicadas no ponto 5 do anexo I do presente regulamento.

5. É considerado óleo de bagaço de azeitona bruto, na acepção do ponto 4 do anexo do Regulamento n.o 136/66/CEE, o óleo que apresente as características indicadas no ponto 6 do anexo I do presente regulamento.

6. É considerado óleo de bagaço de azeitona refinado, na acepção do ponto 5 do anexo do Regulamento n.o 136/66/CEE, o óleo que apresente as características indicadas no ponto 7 do anexo I do presente regulamento.

7. É considerado óleo de bagaço de azeitona, na acepção do ponto 6 do anexo do Regulamento n.o 136/66/CEE, o óleo que apresente as características indicadas no ponto 8 do anexo I do presente regulamento.

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Artigo 2.o

1. A determinação das características dos azeites e óleos de bagaço de azeitona previstas no anexo I do presente regulamento é efectuada de acordo com os seguintes métodos de análise:

— para a determinação dos ácidos gordos livres, expressos em percentagem de ácido oleico, o método constante do anexo II,

— para a determinação do índice de peróxidos, o método constante do anexo III,

▼M19

— para a determinação do teor de ceras, o método constante do anexo IV,

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— para a determinação do teor de esteróis, o método constante do anexo V,

— para a determinação do eritrodiol, e uvaol o método constante do anexo VI,

▼M21

— para a determinação da percentagem de monopalmitato de 2-glicerilo, o método constante do anexo VII,

▼M20 —————

▼B

— para a análise espectrofotométrica, o método constante do anexo IX,

— para a determinação dos ácidos gordos componentes, o método constante dos anexos XA e XB,

— para a determinação dos solventes halogenados voláteis, o método constante do anexo XI,

— para a avaliação das características organolépticas dos azeites virgens, o método constante do anexo XII, aplicado em conformidade com o n.o 2,

▼M20 —————

▼M11

— para a determinação dos estigmastadienos, o método constante do Anexo XVII,

▼M13

— para a determinação da composição de triglicéridos com NCE42, o método constante do anexo XVIII,

▼M19

— para a determinação dos teores de álcoois alifáticos, o método constante do anexo XIX,

▼M23

— para a determinação do teor de ceras, de ésteres metílicos de ácidos gordos e de ésteres etílicos de ácidos gordos por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar, o método constante do anexo XX.

▼M19

2. A verificação, pelas autoridades nacionais ou seus representantes, das características organolépticas dos azeites virgens será efectuada por júris de provadores aprovados pelos Estados-Membros.

As características organolépticas de um azeite referido no primeiro parágrafo serão consideradas conformes com a categoria de azeite declarada se um júri aprovado pelo Estado-Membro em causa confirmar a classificação atribuída.

Se o júri aprovado não confirmar a declaração no respeitante às características organolépticas da categoria de azeite declarada, as autoridades nacionais ou os seus representantes farão proceder, a pedido do interessado, a duas contra-análises por outros júris aprovados, das quais pelo menos uma será efectuada por um júri aprovado pelo Estado-Membro produtor em causa. As características em questão serão consideradas conformes com as declaradas se as duas contra-análises confirmarem a classificação declarada. Caso contrário, e sem prejuízo das sanções incorridas, as despesas das contra-análises serão imputadas ao interessado.

▼M17

3. A colheita de amostras para fins de verificação pelas autoridades nacionais ou seus representantes das características dos azeites previstas no n.o 1 é efectuada de acordo com as normas internacionais EN ISO 661 e EN ISO 5555, relativas à preparação das amostras para ensaio e à amostragem. Todavia, por derrogação ao ponto 6.8 da norma EN ISO 5555, para os lotes constituídos pelos referidos azeites em embalagens imediatas de capacidade igual ou inferior a 100 litros, a colheita das amostras é efectuada em conformidade com o anexo I A do presente regulamento.

▼M19

Sem prejuízo do disposto na norma EN ISO 5555 e no capítulo 6 da norma EN ISO 661, as amostras devem ser colocadas, o mais rapidamente possível, ao abrigo da luz e de temperaturas elevadas e ser enviadas para análise, ao laboratório, o mais tardar:

— de Outubro a Maio, no décimo dia útil após a colheita,

— de Junho a Setembro, no quinto dia útil após a colheita.

▼M17

4. ►M20 Para a verificação prevista no n.o 3, as análises referidas nos anexos II, III, IX, X e XII, bem como, se for caso disso, as contra-análises previstas pelas legislações nacionais, devem ser efectuadas antes do termo do prazo de durabilidade mínima. Se a colheita da amostra se efectuar mais de quatro meses antes do termo do prazo de durabilidade mínima, as análises em causa devem ser realizadas, o mais tardar, no quarto mês seguinte ao da colheita da amostra. Não se prevê qualquer prazo para as restantes análises previstas pelo referido regulamento. ◄

Salvo no caso de a colheita da amostra ter ocorrido menos de um mês antes do final do prazo de durabilidade mínima, se os resultados das análises não corresponderem às características da categoria de azeite ou de óleo de bagaço de azeitona declarada, o interessado é notificado, o mais tardar, um mês antes do final do período previsto no primeiro parágrafo.

▼M19

5. Para a determinação das características dos azeites pelos métodos previstos no n.o 1, comparar-se-ão directamente os resultados analíticos com os limites previstos no presente regulamento.

▼M20

Artigo 2.oA

A verificação, pelas autoridades nacionais ou pelos seus representantes, da conformidade de uma amostra dos azeites e dos óleos de bagaço de azeitona com a categoria declarada pode efectuar-se:

a) Quer realizando as análises previstas no anexo I, sendo irrelevante a ordem de realização;

b) Quer seguindo a ordem indicada no anexo I-B, relativo ao esquema de tomada de decisão, até à tomada de uma das decisões mencionadas no referido esquema.

▼M19 —————

▼M5

Artigo ►M19 3.o ◄

Caso se verifique que as características organolépticas de um azeite são diferentes das que decorrem da sua denominação, o Estado-membro em causa aplicará, sem prejuízo de outras sanções eventuais, sanções pecuniárias administrativas, cujo montante será determinado em função da gravidade da irregularidade detectada.

Para efeitos da avaliação da irregularidade, será nomeadamente tida em conta a evolução natural das características de um azeite que tenha sido conservado em condições normais.

No início de cada semestre, os Estados-membros informarão a Comissão do número e da natureza das irregularidades detectadas e das sanções aplicadas no decurso do semestre anterior.

▼M5

Artigo 4.o

▼M19

1. Para a apreciação e controlo das características organolépticas pelas autoridades nacionais ou representantes destas, os Estados-Membros podem aprovar júris de provadores.

As condições de aprovação serão estabelecidas pelos Estados-Membros, nomeadamente de modo a:

— satisfazer as condições do ponto 4 do anexo XII.

— assegurar que a formação do chefe do júri seja efectuada por um estabelecimento e em condições reconhecidos para o efeito pelo Estado-Membro.

— fazer depender a validade da aprovação dos resultados obtidos no quadro de um sistema de controlo anual instituído pelo Estado-Membro.

Cada Estado-Membro comunicará à Comissão a lista dos júris aprovados e as medidas tomadas em conformidade com o presente número.

▼M5

2. Caso um Estado-membro encontre dificuldades na criação de um júri de provadores no seu território, pode recorrer a um júri de provadores aprovado noutro Estado-membro.

3. Cada Estado-membro estabelecerá a lista dos júris de provadores criados por organizações profissionais ou interprofissionais, em conformidade com as condições estabelecidas no n.o 1 e velará pelo respeito dessas condições.

▼M19 —————

▼B

Artigo 6.o

1. O teor de ►C1 óleo de bagaço ◄ e outros resíduos da extracção do azeite (códigos NC 2306 90 11 e 2306 90 19) é determinado em conformidade com o método constante do anexo XV.

2. O teor de óleo referido no n.o 1 é expresso em percentagem do seu peso em relação ao extracto seco.

▼M20

Artigo 7.o

São aplicáveis as disposições comunitárias respeitantes à presença de contaminantes.

Relativamente ao teor de solventes halogenados, os limites para todas as categorias de azeite são os seguintes:

— teor máximo de cada solvente halogenado detectado 0,1 mg/kg,

— teor máximo da soma dos solventes halogenados detectados 0,2 mg/kg

▼B

Artigo 8.o

1. Cada Estado-membro comunicará à Comissão as medidas tomadas para aplicação do presente regulamento.

2. Os Estados-membros comunicarão à Comissão, no início de cada semestre, uma súmula dos dados analíticos das determinações efectuadas durante o semestre anterior.

Esses resultados são examinados pelo Comité de Gestão das Matérias Gordas, de acordo com o processo previsto no artigo 39.o do Regulamento n.o 136/66/CEE.

Artigo 9.o

É revogado o Regulamento (CEE) n.o 1058/77.

Artigo 10.o

1. O presente regulamento entra em vigor no terceiro dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial das Comunidades Europeias. No entanto, o método constante do anexo XII é aplicável a partir de ►M1 1 de Novembro de 1992 ◄ , salvo no que concerne às operações ligadas à intervenção.

▼M5

Este método não se aplica aos azeites virgens acondicionados antes de 1 de Novembro de 1992.

▼B

2. O presente regulamento não é aplicável aos azeites e óleos de bagaço de azeitona acondicionados antes da entrada em vigor do presente regulamento e comercializados até 31 de Outubro de 1992.

O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e directamente aplicável em todos os Estados-Membros.









ANEXOS

Sumário







Anexo I: Características dos azeites Anexo I A: Amostragem de lotes de azeite ou óleo de bagaço de azeitona em embalagens imediatas de capacidade máxima de 100 litros Anexo I-B: Esquema de decisão Anexo II: ►M21 Determinacy dos ácidos gordos livres, método a frio ◄ Anexo III: Determinação do índice de peróxidos Anexo IV: ►M6 Determinação do teor de ceras por intermédio de cromatografia gás-líquido com coluna capilar ◄ Anexo V: Determinação da composição e do teor de esteróis por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar Anexo VI: Determinação do teor de eritrodiol e uvaol Anexo VII: ►M21 Determinação da percentagem de monopalmitato de 2-glicerilo ◄ ▼M20 ————— ▼B ▼M20 ————— ▼M19 ————— ▼B ▼M23 Anexo XX: Método de determinação do teor de ceras, de ésteres metílicos de ácidos gordos e de ésteres etílicos de ácidos gordos por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar

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ANEXO I

CARACTERÍSTICAS DOS AZEITES







Categoria Ésteres metílicos de ácidos gordos (FAME) e ésteres etílicos de ácidos gordos (FAEE) Índice de peróxidos mEq O2/kg (*) Ceras mg/kg (**) Monopalmitato de 2-glicerilo (%) Estigmastadieno mg/kg (1) Diferença entre o ECN42 determinado por HPLC e o ECN42 obtido por cálculo teórico K232 (*) K270 (*) Delta-K (*) Exame organoléptico Mediana dos defeitos (Md) (*) Exame organoléptico Mediana do frutado (Mf) (*) 1. Azeite virgem extra Σ FAME + FAEE ≤ 75 mg/kg ou 75 mg/kg <Σ FAME + FAEE ≤ 150 mg/kg e (FAEE/FAME) ≤ 1,5 ≤ 0,8 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 se % ácido palmítico total ≤ 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,50 ≤ 0,22 ≤ 0,01 Md = 0 Mf > 0 ≤ 1,0 se % ácido palmítico total > 14 % 2. Azeite virgem — ≤ 2,0 ≤ 20 ≤ 250 ≤ 0,9 se % ácido palmítico total ≤ 14 % ≤ 0,10 ≤ 0,2 ≤ 2,60 ≤ 0,25 ≤ 0,01 Md ≤ 3,5 Mf > 0 ≤ 1,0 se % ácido palmítico total > 14 % 3. Azeite lampante — > 2,0 — ≤ 300 (3) ≤ 0,9 se % ácido palmítico total ≤ 14 % ≤ 0,50 ≤ 0,3 — — — Md > 3,5 (2) — ≤ 1,1 se % ácido palmítico total > 14 % 4. Azeite refinado — ≤ 0,3 ≤ 5 ≤ 350 ≤ 0,9 se % ácido palmítico total ≤ 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 1,10 ≤ 0,16 — — ≤ 1,1 se % ácido palmítico total > 14 % 5. Azeite (constituído por azeites refinados e azeites virgens) — ≤ 1,0 ≤ 15 ≤ 350 ≤ 0,9 se % ácido palmítico total ≤ 14 % — ≤ 0,3 — ≤ 0,90 ≤ 0,15 — — ≤ 1,0 se % ácido palmítico total > 14 % 6. Óleo de bagaço de azeitona bruto — — — > 350 (4) ≤ 1,4 — ≤ 0,6 — — — — — 7. Óleo de bagaço de azeitona refinado — ≤ 0,3 ≤ 5 > 350 ≤ 1,4 — ≤ 0,5 — ≤ 2,00 ≤ 0,20 — — 8. Óleo de bagaço de azeitona — ≤ 1,0 ≤ 15 > 350 ≤ 1,2 — ≤ 0,5 — ≤ 1,70 ≤ 0,18 — —







Categoria Teor de ácidos (1) Soma dos isómeros transoleicos (%) Soma dos isómeros translinoleicos + translinolénicos (%) Composição esterólica Esteróis totais (mg/kg) Eritrodiol e uvaol (%) (**) Mirístico (%) Linolénico (%) Araquídico (%) Eicosenóico (%) Beénico (%) Lignocérico (%) Colesterol (%) Brassicasterol (%) Campesterol (%) Estigmasterol (%) Betasitosterol (%) (2) Delta-7- estigmastenol (%) 1. Azeite virgem extra ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 2. Azeite virgem ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,05 ≤ 0,05 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 3. Azeite lampante ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,10 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 (3) 4. Azeite refinado ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 5. Azeite (constituído por azeites refinados e azeites virgens) ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,2 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,30 ≤ 0,5 ≤ 0,1 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 000 ≤ 4,5 6. Óleo de bagaço de azeitona bruto ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,20 ≤ 0,10 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 — ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 2 500 > 4,5 (4) 7. Óleo de bagaço de azeitona refinado ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 800 > 4,5 8. Óleo de bagaço de azeitona ≤ 0,05 ≤ 1,0 ≤ 0,6 ≤ 0,4 ≤ 0,3 ≤ 0,2 ≤ 0,40 ≤ 0,35 ≤ 0,5 ≤ 0,2 ≤ 4,0 < Camp. ≥ 93,0 ≤ 0,5 ≥ 1 600 > 4,5

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ANEXO I-A

Amostragem dos azeites ou óleos de bagaço de azeitona entregues em embalagens imediatas de 100 litros de capacidade máxima

O presente método de amostragem é aplicável às entregas de azeite ou óleo de bagaço de azeitona com um volume máximo de 125 000 litros, acondicionados em embalagens imediatas de 100 litros de capacidade máxima.

Se o volume da entrega for superior a 125 000 litros, deve a mesma subdividir-se em lotes de volumes iguais ou inferiores a 125 000 litros. Se o volume da entrega for inferior a 125 000litros, a entrega em causa constituirá um lote. Nesse caso, o método é aplicável a cada lote.

O número mínimo de amostras de partida é determinado em função da dimensão do lote, em conformidade com o quadro constante do ponto 1.

A importância da amostra de partida é determinada em função da capacidade das embalagens imediatas, segundo o quadro constante do ponto 2.1.

As definições de «entrega», «amostra de partida» e «amostra de laboratório» são as referidas pela norma EN ISO 5555.

Entende-se por «lote» um conjunto de unidades de venda produzidas, fabricadas e acondicionadas em circunstâncias tais que o azeite contido em cada uma dessas unidades de venda seja considerado homogéneo relativamente a todas as características analíticas.

1. NÚMERO DE AMOSTRAS DE PARTIDA

O número mínimo de amostras de partida é estabelecido em função das dimensões do lote, de acordo com o seguinte quadro:







Dimensão do lote (litros) inferior a Número mínimo de amostras de partida 7 500 2 25 000 3 75 000 4 125 000 5

As embalagens imediatas de uma mesma amostra de partida devem ser escolhidas por contiguidade no lote.

Em caso de dúvida, o Estado-Membro aumentará o número de amostras de partida.

2. CONSTITUIÇÃO DE UMA AMOSTRA DE PARTIDA

2.1 Cada amostra de partida é constituída por:







Se as embalagens imediatas tiverem uma capacidade: A amostra de partida incide no azeite de: a) Superior ou igual a 5 litros a) Três embalagens imediatas b) Superior ou igual a 3 litros e inferior a 5 litros b) Três embalagens imediatas c) Superior ou igual a 2 litros e inferior a 3 litros c) Três embalagens imediatas d) Superior ou igual a 1 litro e inferior a 2 litros d) Seis embalagens imediatas e) Superior ou igual a 0,75 litros e inferior a 1 litro e) Seis embalagens imediatas f) Inferior 0,75 litros f) Três vezes o azeite do número mínimo de embalagens cuja capacidade total supere 1,5 litros

2.2 As amostras de partida devem ser mantidas nas embalagens imediatas até à realização das análises. O azeite das amostras de partida deve, em seguida, se for caso disso, ser subdividido em três amostras de laboratório com vista à realização:

a) Das análises referidas nos anexos II, III, IX e X;

b) Da análise referida no anexo XII;

c) Das outras análises.

2.3 As embalagens que constituem uma amostra de partida são subdivididas segundo os procedimentos de controlo previstos pelas legislações nacionais.

3. ANÁLISES E RESULTADOS

a) Cada amostra de partida referida no ponto 1 é subdividida em amostras de laboratório, em conformidade com o ponto 2.5 da norma EN ISO 5555, para ser submetida às seguintes análises: — determinação dos ácidos gordos livres, referida no n.o 1, primeiro travessão, do artigo 2.o, — determinação do índice de peróxidos, referida no n.o 1, segundo travessão, do artigo 2.o, — análise espectrofotométrica, referida no n.o 1, oitavo travessão, do artigo 2.o, — composição de ácidos gordos, referida no n.o 1, nono travessão, do artigo 2.o;

b) Se nem todos os resultados das análises referidas na alínea a) de, pelo menos, uma das amostras de partida colhidas do mesmo lote forem conformes às características da categoria de azeite declarada, o lote em causa, na sua totalidade, é declarado não conforme. Se os resultados das análises referidas na alínea a) de todas as amostras de partida colhidas do mesmo lote não forem homogéneos no que respeita às características de repetibilidade dos métodos utilizados, o lote é declarado, na sua totalidade, não homogéneo, devendo cada amostra de partida ser submetida às outras análises exigidas. Caso contrário, apenas uma das amostras de partida do referido lote deve ser submetida às outras análises exigidas;

c) Se o resultado de uma das análises referidas no segundo parágrafo da alínea b) não for conforme às características da categoria de azeite declarada, o lote em causa, na sua totalidade, é declarado não conforme. Se todos os resultados das análises referidas no segundo parágrafo da alínea b) forem conformes às características da categoria de azeite declarada, o lote em causa, na sua totalidade, é declarado conforme.

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ANEXO I-B

Esquema de tomada de decisão para a verificação da conformidade de uma amostra de azeite com a categoria declarada

A análise da conformidade de um azeite ou de óleo de bagaço de azeitona com a categoria declarada pode efectuar-se:

a) Quer realizando as análises previstas para verificar o respeito das características estipuladas no anexo I, sendo irrelevante a ordem de realização;

b) Quer realizando as análises previstas no esquema de tomada de decisão, pela ordem nele indicada, até à tomada de uma das decisões aí mencionadas.

As análises relativas aos contaminantes, necessárias para verificar a conformidade com as normas da Comunidade Europeia, devem ser realizadas separadamente.

O esquema de tomada de decisão aplica-se a todas as categorias de azeite e de bagaço de azeitona. Compõe-se de quadros numerados de 1 a 11 que devem ser abordados em função da declaração da categoria de azeite em presença e pela ordem prevista no quadro geral.

Para efeitos da leitura do quadro geral (quadro 11):

— a linha dupla (=) indica o caminho a seguir em caso de conformidade (resposta positiva) com as condições previstas na casa anterior. O pontilhado (…) indica, pelo contrário, o caminho a seguir em caso de não-conformidade,

— os títulos das casas constantes dos quadros 1 a 11 referem-se às análises previstas pelo presente regulamento, segundo as correspondências mencionadas no apêndice 1 do presente anexo,

— as letras nos círculos de decisão negativa dos quadros 1 a 11 remetem para informações indicativas constantes do apêndice 2 do presente anexo. Não implicam, por si sós, a obrigação de prosseguir as análises nem a correcção das presunções referidas.

Quadro geral

Quadro 1

Quadro 2

Quadro 3

Quadro 4

Quadro 5

Quadro 6

Quadro 7

Quadro 8

Quadro 9

Quadro 10

Quadro 11









Apêndice 1

Correspondência entre os anexos do presente regulamento e as análises referidas pelo esquema de tomada de decisão







▼M21 — Acidez Anexo II Determinação dos ácidos gordos livres, método a frio ▼M20 — Índice de peróxidos Anexo III Determinação do índice de peróxidos — Espectrofotometria no ultravioleta Anexo IX Análise por espectrofotometria no ultravioleta — Avaliação organoléptica Anexo XII Exame organoléptico do azeite virgem — Estigmasta – 3,5 — dieno Anexo XVII Método para a determinação dos estigamastadienos em óleos vegetais — Isómeros Trans dos ácidos gordos Anexo X-a e Análise dos ésteres metílicos de ácidos gordos por cromatografia em fase gasosa Anexo X-b Preparação dos ésteres metílicos dos ácidos gordos — Composição de ácidos gordos Anexo X-a e Análise por cromatografia em fase gasosa de ésteres metílicos de ácidos gordos Anexo X-b Preparação dos ésteres metílicos de ácidos gordos — ΔNCE42 Anexo XVIII Determinação do teor de triacilgliceróis com NCE42 (diferença entre o teor obtido por HPLC e o teor teórico) — Composição em esteróis e esteróis totais Anexo V Determinação da composição e do teor de esteróis por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar — Eritrodiol e Uvaol Anexo VI Determinação da composição de eritrodiol e uvaol — Ceras Anexo IV Determinação do teor de ceras por intermédio de cromatografia gáslíquido com coluna capilar — Álcoois alifáticos Anexo XIX Determinação dos teores de álcoois alifáticos por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar ▼M21 — Ácidos gordos saturados na posição 2 Anexo VII Determinação da percentagem de monopalmitato de 2-glicerilo ▼M20









Apêndice 2

Quadro 1

a) Ver azeite virgem ou lampante (critérios de qualidade, quadro 2, ou critérios de qualidade e pureza, quadro 4)

b) Ver azeite lampante (critérios de qualidade e pureza, quadro 4)

Quadro 2

a) Ver azeite lampante (critérios de qualidade e pureza, quadro 4)

b) Ver azeite virgem extra (critérios de qualidade, quadro 1)

Quadro 3

a) Presença de óleo refinado (azeite ou outros)

b) Presença de óleo de bagaço de azeitona

Quadro 4

a) Ver azeite virgem extra e azeite virgem (critérios de qualidade, quadros 1 e 2)

b) Presença de óleo refinado (azeite ou outros)

c) Presença de óleo de bagaço de azeitona

d) Presença de óleos esterificados

Quadro 7

a) Presença de óleo de bagaço de azeitona

b) Presença de óleos esterificados

Quadro 8

a) Presença de óleo refinado (azeite ou outros)

b) Ver azeite lampante (critérios de qualidade e pureza, quadro 4)

c) Presença de óleos esterificados

Quadro 11

a) Presença de óleos esterificados

▼B









ANEXO II

▼M21

DETERMINAÇÃO DOS ÁCIDOS GORDOS LIVRES, MÉTODO A FRIO

▼B

1. OBJECTIVO

Determinação dos ácidos gordos livres em azeites. O teor de ácidos gordos livres é expresso em termos de acidez, calculada convencionalmente, ou em índice de acidez.

1.1. Princípio

Dissolução da amostra numa mistura de solventes, seguida de titulação dos ácidos gordos livres presentes com uma solução etanólica de hidróxido de potássio.

1.2. Reagentes

Todos os reagentes devem ser de qualidade analítica reconhecida e a água a utilizar deve ser destilada ou de pureza equivalente.

1.2.1. Éter etílico e etanol a 95 % (V/V), mistura 1 + 1 em volume Advertência: O éter etílico é muito inflamável e pode formar peróxidas explosivos, pelo que deve ser utilizado com as devidas precauções. Neutraliza-se exactamente no momento de utilização com a solução de hidróxido de potássio (ponto 1.2.2), em presença de 0,3 ml de solução de fenolftaleína (ponto 1.2.3) por 100 ml de mistura. Nota: Se não for possível utilizar éter etílico, poderá ser utilizada uma mistura de solventes constituída por etanol e tolueno. Se necessário, o etanol pode ser substituído por 2-propanol.

1.2.2. Solução etanólica titulada de hidróxido de potássio, c(KOH) — 0,1 mol/l aproximadamente ou, se necessário, c(KOH) — 0,5 mol/l aproximadamente. A concentração exacta da solução etanólica de hidróxido de potássio deve ser conhecida e verificada antes da utilização. A solução deve ser incolor ou amarelo-palha. Decantação para um frasco de vidro castanho fechado com uma rolha de borracha. Nota: Uma solução incolor estável de hidróxido de potássio pode ser preparada do seguinte modo: mantém-se durante uma hora em ebulição, sob refluxo, 1000 ml de etanol com 8 g de hidróxido de potássio e 0,5 g de aparas de alumínio. Destila-se imediatamente. Dissolve-se no destilado a quantidade necessária de hidróxido de potássio. Deixa-se repousar durante vários dias e decanta-se o líquido claro sobrenadante do precipitado de carbonato de potássio. A solução pode também ser preparada sem destilação, do seguinte modo: Adicionam-se 4 ml de butilato de alumínio e deixa-se repousar a mistura durante alguns dias. Decanta-se o líquido sobrenadante e dissolve-se nele a quantidade necessária de hidróxido de potássio. Esta solução está pronta para ser utilizada.

1.2.3. Fenolftaleína, solução de 10 g/l em etanol a 95—96 % (V/V) ou azul alcalino (no caso de matérias gordas fortemente coradas), solução de 20 g/l em etanol a 95—96 % (V/V).

1.3. Aparelhos e utensílios

Material corrente de laboratório, designadamente:

1.3.1. Balança analítica.

1.3.2. Erlenmeyer de 250 ml de capacidade.

1.3.3. Galheta de 10 ml de capacidade, graduada em 0,05 ml.

1.4. Processo

1.4.1. Preparação da amostra para análise A determinação é efectuada a partir da amostra filtrada. Se o teor total da humidade e impurezas for inferior a 1 % a análise é efectuada na amostra não filtrada.

1.4.2. Tomas de ensaio Colhem-se as tomas de ensaio, de acordo com o índice de acidez presumido, em conformidade com as indicações do quadro seguinte.



Índice de acidez presumido Peso da toma de ensaio (g) Precisão da pesagem da toma de ensaio < 1 20 0,05 1—4 10 0,02 4—15 2,5 0,01 15—75 0,5 0,001 > 75 0,1 0,0002 A pesagem deverá ser efectuada no erlenmeyer (ponto 1.3.2).

1.4.3. Determinação Dissolve-se a toma em 50 a 100 ml de mistura éter/etanol (ponto 1.2.1) previamente neutralizada. Titula-se, com agitação, com a solução de hidróxido de potássio (ver nota 2) até à viragem do indicador (coloração carmim da fenolftaleína persistente durante pelo menos 10 s). Nota 1: A solução etanólica de hidróxido de potássio (ponto 1.2.2) pode ser substituída por solução aquosa de hidróxido de potássio ou de sódio desde que o volume de água introduzido não conduza a uma separação de fases. Nota 2: Se a quantidade necessária de solução de hidróxido de potássio a 0,1 mol/l ultrapassar 10 ml, utiliza-se uma solução a 0,5 mol/l. Nota 3: Se a solução se tornar turva durante a titulação, junta-se uma quantidade suficiente da mistura de solventes (ponto 1.2.1) para obter uma solução límpida.

1.5. Expressão da acidez em percentagem de ácido oleico

A acidez, expressa em percentagem em massa, é igual a:

em que:

V = é o volume consumido, expresso em mililitros de solução titulada de hidróxido de potássio.

c = é a concentração exacta, em moles por litro, da solução titulada de hidróxido de potássio utilizada.

M = é a massa molar, em gramas por mole, do ácido adoptado para a expressão dos resultados (= 282).

m = é a massa, em gramas, da toma do ensaio.

Toma-se como resultado a média aritmética de duas determinações.









ANEXO III

DETERMINAÇÃO DO ÍNDICE DE PERÓXIDOS

1. OBJECTIVO

A presente norma descreve um método para a determinação do índice de peróxidos em óleos e gorduras.

2. DOMÍNIO DE APLICAÇÃO

A presente norma é aplicada a óleos e gorduras de origem animal e vegetal.

3. DEFINIÇÃO

O índice de peróxidos é a quantidade de substâncias presentes na amostra, expressa em miliequivalentes de oxigénio activo por kg, capazes de oxidar o iodeto de potássio nos condições operacionais descritas.

4. PRINCÍPIO

Tratamento da toma da amostra em estudo, dissolvida em ácido acético e clorofórmio, com uma solução de iodeto de potássio. Titulação do iodo libertado com uma solução padrão de tiossulfato de sódio.

5. APARELHOS E UTENSÍLIOS

Todo o equipamento usado deve estar isento de substâncias oxidantes ou redutoras.

Nota:

Não se lubrificam os contactos esmerilados.

5.1. Cápsula de vidro de 3 ml.

5.2. Frascos com rolhas e juntas esmeriladas, de cerca de 250 ml de capacidade, previamente secos e cheios de um gás inerte puro e seco (azoto ou, de preferência, dióxido de carbono).

5.3. Galheta de 25 ou 50 ml, graduada em 0,1 ml.

6. REAGENTES

6.1. Clorofórmio, de qualidade analítica reconhecida, tornado sento de oxigénio fazendo borbulhar uma corrente de gás inerte puro e seco.

6.2. Ácido acético glacial, de qualidade analítica reconhecida, tornado isento de oxigénio fazendo borbulhar uma corrente de gás inerte puro e seco.

6.3. Solução aquosa saturada de iodeto de potássio, preparada recentemente e isenta de iodo e iodatos.

6.4. Solução aquosa, rigorosamente titulada, imediatamente antes da utilização, a 0,01 ou 0,002 N, de tiossulfato de sódio.

6.5. Solução de amido, obtida por dispersão recente em água, na proporção de 10 g/l, de amido natural solúvel.

7. AMOSTRA

A amostra deverá ser colhida e conservada na ausência de luz, devendo ainda ser mantida a baixa temperatura e contida em recipientes de vidro completamente cheios, hermeticamente fechados com rolhas de vidro esmerilado ou cortiça.

8. TÉCNICA

O ensaio deverá ser efectuado em presença de luz solar difusa ou luz artificial. Pesa-se numa cápsula de vidro (ponto 5.1) ou, na falta desta, num frasco (ponto 5.2), com uma aproximação de 0,001 g, uma massa de toma de acordo com o quadro seguinte, em conformidade com o índice de peróxidos presumido:







Índice de peróxidos presumido (meq) Peso da toma (g) 0 a 12 5,0 a 2,0 12 a 20 2,0 a 1,2 20 a 30 1,2 a 0,8 30 a 50 0,8 a 0,5 50 a 90 0,5 a 0,3

Abre-se o frasco (ponto 5.2) e introduz-se a cápsula de vidro contendo a toma em estudo. Adicionam-se 10 ml de clorofórmio (ponto 6.1) e dissolve-se a toma rapidamente, sob agitação. Adicionam-se 15 ml de ácido acético glacial (ponto 6.2) e, de seguida, 1 ml de solução de iodeto de potássio (ponto 6.3). Tapa-se rapidamente, agita-se durante 1 minuto, e deixa-se durante exactamente 5 minutos na ausência de luz a uma temperatura de 15 a 20 °C.

Adicionam-se cerca de 75 ml de água destilada. Titula-se o iodo libertado com a solução de tiossulfato de sódio (ponto 6.4) (solução 0,002 N para valores presumidos inferiores a 12 e solução 0,01 N para valores presumidos superiores a 12), agitando vigorosamente e usando solução de amido (ponto 6.5) como indicador.

Fazem-se duas determinações com a mesma amostra.

Efectua-se simultaneamente um ensaio em branco. Se o resultado do ensaio em branco exceder 0,05 ml de solução de tiossulfato de sódio 0,01 N (ponto 6.4), substituem-se os reagentes impuros.

9. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

O índice de peróxidos (I.P.), expresso em miliequivalentes de oxigénio activo por kg, é dado pela fórmula:

onde:

V = é o número de mililitros de solução de tiossulfato de sódio (ponto 6.4) gasta no ensaio, com a correcção relativa ao ensaio em branco.

N = é a normalidade exacta da solução de tiossulfato de sódio utilizada.

m = é a massa, expressa em gramas, da toma de amostra em estudo.

Toma-se como resultado a média aritmética das duas determinações efectuadas.

▼M21









ANEXO IV

DETERMINAÇÃO DO TEOR DE CERAS POR CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA COM COLUNA CAPILAR

1. OBJECTO

O presente método descreve um processo para a determinação do teor de ceras dos azeites. As ceras são separadas em função do número de átomos de carbono. O método pode ser utilizado, em particular, para distinguir o azeite obtido por pressão do azeite obtido por extracção (óleo de bagaço de azeitona).

2. PRINCÍPIO

Após a adição de um padrão interno adequado, a gordura ou o óleo em causa é fraccionado por cromatografia numa coluna de silicagel hidratada. Recolher a fracção eluída em primeiro lugar nas condições de ensaio (fracção cuja polaridade é inferior à polaridade dos triglicéridos), procedendo-se à análise directa por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar.

3. MATERIAL

3.1. Erlenmeyer de 25 ml.

3.2. Coluna de vidro para cromatografia em fase gasosa de diâmetro interior 15,0 mm, altura 30 a 40 cm, equipada com uma torneira.

3.3. Aparelho de cromatografia em fase gasosa adequado para o funcionamento com coluna capilar, equipado com um sistema para a introdução directa da amostra na coluna, constituído por: 3.3.1. Forno com termóstato para as colunas, com programação de temperatura. 3.3.2. Injector a frio para introdução directa na coluna. 3.3.3. Detector de ionização de chama e conversor-amplificador. 3.3.4. Registador-integrador adequado para funcionamento com o conversor-amplificador (ponto 3.3.3), com tempo de resposta não superior a um segundo e velocidade do papel variável. (É igualmente possível utilizar sistemas informatizados que prevejam a aquisição de dados de cromatografia em fase gasosa com um computador). 3.3.5. Coluna capilar de vidro ou de sílica fundida, com 8 m a 12 m de comprimento e 0,25 mm a 0,32 mm de diâmetro interno, revestida interiormente com um líquido estacionário, de espessura compreendida entre 010 e 0,30 μm. (Encontram-se no comércio líquidos de partição do tipo SE52 ou SE54, adequados ao fim em causa.)

3.4. Microsseringa de 10 μl adequada para injecção directa na coluna, com agulha de aço cementado.

3.5. Vibrador eléctrico.

3.6. Evaporador rotativo.

3.7. Mufla.

3.8. Balança analítica que garanta uma precisão de medição de + 0,1 mg.

3.9. Artefactos de vidro para laboratório.

4. REAGENTES

4.1. Silicagel com granulometria de 60 a 200 μm. Colocar o silicagel numa mufla a 500 °C durante quatro horas, no mínimo. Após arrefecimento, juntar 2 % de água em relação à quantidade de silicagel retirado. Agitar bem, de modo a homogeneizar. Conservar ao abrigo da luz durante pelo menos 12 horas antes da utilização.

4.2. n-Hexano para cromatografia.

4.3. Éter etílico para cromatografia.

4.4. n-Heptano para cromatografia.

4.5. Solução padrão de araquidato de laurilo a 0,1 % (m/v) em hexano (padrão interno). (É igualmente possível utilizar palmitato de palmitilo ou estearato de miristilo.) 4.5.1. Soudan 1 (1-fenilazo-2-naftol)

4.6. Gás vector: hidrogénio ou hélio puro, com um grau de pureza adequado para cromatografia em fase gasosa.

4.7. Gases auxiliares: — hidrogénio, com um grau de pureza adequado para cromatografia em fase gasosa, — ar, com um grau de pureza adequado para cromatografia em fase gasosa.

5. PROCEDIMENTO

5.1. Preparação da coluna cromatográfica.

Suspender 15 g de silicagel (4.1) em n-hexano (4.2) e introduzir na coluna (3.2). Deixar assentar e completar a operação por recurso a um agitador eléctrico (3.5), de modo a tornar mais homogénea a camada cromatográfica. Fazer passar 30 ml de n-hexano para remover eventuais impurezas. Utilizando a balança (3.8), pesar rigorosamente 500 mg de amostra num Erlenmeyer de 25 ml (3.1) e adicionar uma quantidade adequada de padrão interno (4.5), em função do teor de ceras previsto. A título de exemplo, juntar 0,1 mg de araquidato de laurilo no caso de azeite e 0,25 a 0,50 mg no caso de óleo de bagaço de azeitona. Transferir a amostra para a coluna cromatográfica com o auxílio de duas porções de 2 ml de n-hexano (4.2).

Deixar fluir o solvente até 1 mm acima da camada de silicagel e fazer passar 70 ml de n-hexano suplementares para remover os n-alcanos naturalmente presentes. Iniciar a eluição cromatográfica, recolhendo 180 ml da mistura n-hexano/éter etílico na proporção de 99:1, de acordo com um fluxo de cerca de 15 gotas por cada 10 segundos. A eluição da amostra deve ser efectuada a uma temperatura ambiente de 22 °C + 4.

Notas:

— A mistura n-hexano/éter etílico (99:1) deve ser preparada diariamente.

— Para controlar visualmente a eluição correcta das ceras, é possível juntar à amostra em solução 100 μl de Soudan 1 a 1 % na mistura da eluição. Como o corante tem uma retenção intermédia entre as ceras e os triglicéridos, é conveniente suspender a eluição quando a coloração atingir o fundo da coluna cromatográfica, uma vez que todas as ceras já foram eluídas.

Evaporar a fracção resultante num evaporador rotativo (3.6), até à eliminação de quase todo o solvente. Remover os últimos 2 ml do mesmo com o auxílio de uma corrente de azoto de fluxo reduzido e adicionar 2-4 ml de n-heptano.

5.2. Análise por cromatografia em fase gasosa

5.2.1. Operações preliminares

Instalar a coluna no cromatógrafo de fase gasosa (3.3), ligando uma das extremidades ao sistema de injecção directa na coluna e a outra extremidade ao detector. Efectuar o controlo geral do sistema cromatográfico (operacionalidade dos circuitos de gases, eficiência do detector e do registador, etc.).

No caso de a coluna ser utilizada pela primeira vez, é aconselhável proceder ao seu acondicionamento. Fazer passar um fluxo ligeiro de gás através da coluna, ligando em seguida o sistema. Aquecer gradualmente até obter, ao fim de cerca de 4 horas, uma temperatura de 350 °C. Manter esta temperatura durante pelo menos duas horas, regulando seguidamente o aparelho para as condições de trabalho [regular o fluxo de gás, acender a chama, ligar o registador electrónico (3.3.4), regular a temperatura do forno para a coluna, regular o detector, etc.]. Registar o sinal obtido, com uma sensibilidade pelo menos duas vezes superior à sensibilidade prevista para a execução da análise. A linha de base deve apresentar-se linear e isenta de picos de qualquer tipo, não devendo apresentar desvios.

A ocorrência de um desvio linear negativo indica que as ligações da coluna não foram efectuadas de um modo correcto; a ocorrência de um desvio positivo indica que a coluna não foi acondicionada de um modo adequado.

5.2.2. Escolha das condições de trabalho

As condições de trabalho são, em geral, as seguintes:

— temperatura da coluna: —



20 °C/minuto 5 °C/minuto 20 °C/minuto No início 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

— Temperatura do detector: 350 °C;

— volume injectado: 1 μl da solução (2-4 ml) de n-heptano;

— gás vector: hélio ou hidrogénio à velocidade linear óptima para o gás seleccionado (ver apêndice);

— sensibilidade instrumental: de forma a responder às condições a seguir descritas.

Estas condições podem ser ajustadas em função das características da coluna e do cromatógrafo de fase gasosa, de modo a obter uma separação de todas as ceras, uma resolução satisfatória dos picos (ver figura) e um tempo de retenção do padrão interno C32 de 18 ± 3 minutos. O pico mais representativo correspondente às ceras deverá situar-se em pelo menos 60 % do início da escala.

Os parâmetros de integração dos picos devem ser determinados de modo a obter uma estimativa correcta das áreas dos picos pertinentes.

Nota:Atendendo à temperatura final elevada, é admissível um desvio positivo, que não pode exceder 10 % da base da escala.

5.3. Execução da análise

Efectuar uma toma de 1 μl de solução com a microsseringa de 10 μl; manejar o êmbolo de modo a que a agulha não contenha nenhuma porção de amostra. Introduzir a agulha no sistema de injecção e injectar rapidamente após um a dois segundos. Retirar cuidadosamente a agulha após cerca de cinco segundos.

Efectuar o registo até à eluição completa das ceras.

A linha de base deve satisfazer sempre as condições requeridas.

5.4. Identificação dos picos

A identificação dos picos é efectuada com base nos tempos de retenção que são comparados com os tempos de retenção conhecidos de misturas de ceras analisadas em condições idênticas.

A figura representa um cromatograma relativo às ceras de um azeite virgem.

5.5. Avaliação quantitativa

Por recurso ao integrador, determinar as áreas dos picos correspondentes ao padrão interno e aos ésteres alifáticos C40 a C46.

Determinar o teor de cada um dos ésteres, expresso em mg/kg de gordura, através da fórmula:

Em que:

Ax = área do pico correspondente a cada éster, em milímetros quadrados;

As = área do pico correspondente ao padrão interno, em milímetros quadrados;

ms = massa do padrão interno adicionado, em miligramas;

m = massa de amostra tomada para análise, expressa em gramas.

6. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

Apresentar a soma dos teores das várias ceras de C40 a C46, expressos em mg/kg de gordura (ppm).

Nota:Os componentes a quantificar referem-se aos picos que correspondem a um número par de átomos de carbono (ésteres C40 a C46), de acordo com o exemplo de cromatograma das ceras de azeite indicado na figura seguinte. Se o éster C46 surgir em duplicado, para identificá-lo convém analisar a fracção das ceras de um óleo de bagaço de azeitona em que o pico C46 seja fácil de identificar por ser maioritário.

Os resultados arredondam-se às décimas.

Figura

Cromatograma das ceras de azeite ( 5 )

Legenda:

I.S. = Araquidato de laurilo

1 = Ésteres diterpénicos

2 + 2′ = Ésteres C40

3 + 3′ = Ésteres C42

4 + 4′ = Ésteres C44

5 = Ésteres C46

6 = Ésteres esteróis e álcoois triterpénicos









APÊNDICE

Determinação da velocidade linear do gás

Injectar 1 a 3 μl de metano (ou propano) no cromatógrafo de fase gasosa, regulado para as condições normais de trabalho, e medir o tempo requerido pelo gás para percorrer a coluna, desde o momento da injecção até ao registo do respectivo pico (tM).

A velocidade linear, expressa em centímetros por segundo, é dada por L/tM, sendo L o comprimento da coluna, expresso em centímetros, e tM o tempo de retenção, expresso em segundos.

▼B









ANEXO V

DETERMINAÇÃO DA COMPOSIÇÃO E DO TEOR DE ESTERÓIS POR CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA COM COLUNA CAPILAR

1. OBJECTIVO

O método descreve o processo de determinação do teor de esteróis, simples e totais, das matérias gordas.

2. FUNDAMENTO

A matéria gorda, adicionada de α-colestanol como padrão interno, é saponificada com hidróxido de potássio em solução etanólica, em seguida, o insaponificável é extraído com éter etílico.

A fracção esterólica é separada do extracto insaponificável por cromatografia em camada fina de gel de sílica básica; os esteróis recuperados no gel de sílica são transformados em trimetilsililéteres e analisados por cromatografia em fase gasosa em coluna capilar.

3. APARELHOS E UTENSÍLIOS

3.1. Balão de 250 ml, equipado com um refrigerador de refluxo com juntas esmeriladas.

3.2. Ampola de decantação de 500 ml.

3.3. Balões de 250 ml.

3.4. Equipamento completo para cromatografia em camada fina, com placas de vidro de 20 × 20 cm.

3.5. Lâmpada de ultravioleta, de comprimento de onda de 366 ou 254 nm.

3.6. Micro-seringas de 100 e 500 μl.

3.7. Cadinho de fundo filtrante com porosidade G3 (poros de 15 a 40 μm) de, aproximadamente, 2 cm de diâmetro e 5 cm de altura, com junta adequada à filtração no vazio (junta esmerilada macho 12/21).

3.8. Frasco de kitasato de 50 ml com junta esmerilada fêmea 12/21, adaptável ao cadinho de fundo filtrante (ponto 3.7).

3.9. Tubo de centrifugação de fundo cónico, de 10 ml, com rolha hermética.

3.10. Cromatógrafo de gás adequado ao funcionamento com coluna capilar, dotado de um sistema de separação, constituído por: 3.10.1. Forno com termóstato para a coluna, que permita manter a temperatura desejada com uma precisão de ± 1 °C. 3.10.2. Câmara de injecção e vaporização de temperatura regulável, com elemento vaporizador de vidro persilanizado. 3.10.3. Detector de ionização de chama e conversor-amplificador. 3.10.4. Registador-integrador adequado ao funcionamento com o conversor-amplificador. 3.10.5. Coluna capilar de vidro ou sílica fundida, de 20 a 30 m de comprimento, com 0,25 a 0,32 mm de diâmetro interno, coberta internamente de líquido SE-52 ou SE-54 ou equivalente, com espessura uniforme compreendida entre 0,10 e 0,30 μm. 3.10.6. Micro-seringa para cromatografia em fase gasosa de 10 μl com agulha cementada.

4. REAGENTES

4.1. Hidróxido de potássio, em solução etanólica cerca de 2 N: dissolvem-se, com arrefecimento, 130 g de hidróxido de potássio (pureza mínima 85 %) em 200 ml de água destilada e completa-se até um litro com etanol. A solução conserva-se em garrafas de vidro escuro bem fechadas.

4.2. Éter etílico puro para análise.

4.3. Sulfato de sódio anidro puro para análise.

4.4. Placas de vidro cobertas com gel de sílica, sem indicador de fluorescência, de 0,25 mm de espessura (disponíveis no comércio, já prontas para utilização).

4.5. Hidróxido de potássio, em solução etanólica 0,2 N: dissolvem-se 13 g de hidróxido de potássio em 20 ml de água destilada e completa-se até um litro com etanol.

4.6. Benzeno para cromatografia (ver ponto 5.2.2).

4.7. Acetona para cromatografia.

4.8. Hexano para cromatografia.

4.9. Éter etílico para cromatografia.

4.10. Clorofórmio puro para análise.

4.11. Solução de referência para cromatografia em camada fina: colesterol ou fitósterol em solução a ►M6 2 % ◄ (m/V) em clorofórmio.

4.12. 2′, 7′ -diclorofluoresceína, em solução etanólica a 0,2 % (m/V). Torna-se ligeiramente básica pela adição de algumas gotas de uma solução alcoólica 2 N de hidróxido de potássio.

4.13. Piridina anidra para cromatografia.

4.14. Hexametildissilazano.

4.15. Trimetilclorossilano.

4.16. Solução de verificação de trimetilsililéteres de esteróis: prepara-se no momento da utilização a partir de esteróis puros ou de misturas de esteróis obtidos de óleos que os contenham.

4.17. Alfa-colestanol, em solução a 0,2 % (m/V), em clorofórmio (padrão interno).

4.18. Gás vector: hidrogénio ou hélio, puro para cromatografia em fase gasosa.

4.19. Gases auxiliares: — hidrogénio puro para cromatografia em fase gasosa, — ar puro para cromatografia em fase gasosa.

5. TÉCNICA

5.1. Preparação do insaponificável 5.1.1. Introduzem-se no balão de 250 ml, por meio de micro-seringa de 500 μl, um volume de solução de alfa-colestanol a 0,2 % (m/V) em clorofórmio (ponto 4.17) que contenha uma quantidade de alfa-colestanol correspondente a cerca de 10 % do teor de esteróis da alíquota da amostra a colher para a determinação. Por exemplo, para 5 g de amostra é necessário juntar 500 μl de solução de alfa-colestanol a 0,2 % (m/V), se ser tratar de uma amostra de azeite e 1 500 μl, se se tratar de ►M6 ————— ◄ óleo de bagaço de azeitona. Evapora-se numa corrente de azoto até à secura e, em seguida, pesam-se exactamente 5 g de amostra seca e filtrada para o mesmo balão. No caso dos óleos ►M6 ————— ◄ que contêm quantidades consideráveis de colesterol, pode observar-se um pico com um tempo de retenção idêntico ao do colestanol. Nesse caso, é necessário analisar a fracção esterólica com e sem padrão interno ►M6 ou utilizar, em vez de colestanol, betulinol ◄ . 5.1.2. Juntam-se 50 ml de ►C1 solução etanólica de hidróxido de potássio 2 N ◄ , monta-se o refrigerador de refluxo e aquece-se em banho-maria até uma ligeira ebulição, mantendo uma agitação enérgica até que se produza a saponificação (a solução fica límpida). Continua-se a aquecer durante 20 minutos, juntam-se 50 ml de água destilada que se faz descer do alto do refrigerador, desliga-se o refrigerador e arrefece-se o balão a cerca de 30° C. 5.1.3. Transvasa-se o conteúdo do balão quantitativamente para a ampola de decantação de 500 ml, utilizando diversas vezes água destilada, num total de aproximadamente 50 ml. Juntam-se cerca de 80 ml de éter etílico, agita-se energicamente durante cerca de 30 segundos e deixa-se que a separação se produza (nota 1). Separa-se a fase aquosa inferior recolhendo-a numa outra ampola de decantação. Procede-se ainda a duas extracções na fase aquosa, de acordo com as mesmas modalidades, utilizando de cada vez 60-70 ml de éter etílico. Nota 1: As eventuais emulsões podem ser eliminadas juntando, com um esguicho, uma pequena quantidade de álcool etílico ou metílico. 5.1.4. Reúnem-se os extractos etéreos numa ampola de decantação e lava-se com água destilada (50 ml de cada vez), até obter uma reacção neutra da água de lavagem. Elimina-se a água de lavagem, seca-se ►C1 filtrando ◄ com sulfato de sódio anidro num balão de 250 ml previamente pesado, lavando o funil e o filtro com pequenas quantidades de éter etílico. 5.1.5. Destila-se o éter até obter poucos mililitros, e seca-se em seguida sob ligeiro vazio ou numa corrente de azoto; completa-se a secagem na estufa a 100° C durante cerca de um quarto de hora e pesa-se após arrefecimento num exsicador.

5.2. Separação da fracção esterólica 5.2.1. Preparação das placas básicas: imergem-se completamente as placas com gel de sílica (ponto 4.4) na ►C1 solução etanólica 0,2 N ◄ de hidróxido de potássio (ponto 4.5) durante 10 segundos; em seguida, deixam-se fechadas durante duas horas sob um exaustor e, por último, colocam-se na estufa a 100° C durante uma hora. Retiram-se da estufa e conservam-se num exsicador com cloreto de cálcio até ao momento da utilização (as placas assim tratadas devem ser utilizadas no prazo de quinze dias). Nota 2: A utilização de placas de gel de sílica básica para a separação da fracção esterólica ►C1 torna desnecessário ◄ o tratamento do insaponificável com alumina. Deste modo, todos os compostos de natureza ácida (ácidos gordos e outros) ficam retidos na linha de partida. Assim, a mancha de esteróis fica nitidamente separada da mancha de álcoois alifáticos e triterpénicos. 5.2.2. Introduz-se na câmara de revelação das placas uma mistura de benzeno e acetona a 95/5 (V/V) até uma altura de aproximadamente 1 cm. Pode utilizar-se, em alternativa, uma mistura de hexano e éter etílico a 55/35 % (V/V). Fecha-se a câmara com uma tampa adequada e deixa-se em repouso durante, pelo menos, meia hora, de modo a que se estabeleça o equilíbrio líquido/vapor. É possível fixar nas superfícies internas da câmara folhas de papel de filtro que mergulham no eluente: esta precaução permite reduzir em cerca de um terço o tempo de revelação e obter uma eluição dos componentes mais uniforme e regular. Nota 3: A fim de obter condições de eluição perfeitamente reprodutíveis, a mistura deve ser mudada em cada ensaio. 5.2.3. Prepara-se uma solução a cerca de 5 % (m/V) de insaponificável (ponto 5.1.5) em clorofórmio e, com a micro-seringa de 100 μl, apõem-se na placa cromatográfica (ponto 5.2.1), a aproximadamente 2 cm do bordo, 0,3 ml da solução supracitada numa linha contínua, o mais fina e uniforme possível. No alinhamento da linha de partida deita-se, numa das extremidades da placa, 2-3 μl da solução de referência de esteróis (ponto 4.11), a fim de identificar a mancha de esteróis quando da última revelação. 5.2.4. Coloca-se a placa na câmara da revelação, preparada como descrito no ponto 5.2.2. A temperatura ambiente deve ser mantida entre 15 e 20° C. Fecha-se imediatamente a câmara com a tampa e deixa-se eluir até que a frente de solvente chegue a cerca de 1 cm do bordo superior da placa. Em seguida, retira-se a placa da câmara de revelação e faz-se evaporar o solvente numa corrente de ar quente, ou deixando a placa sob um exaustor durante alguns momentos. 5.2.5. Nebuliza-se a placa, ligeira e uniformente, com a solução de 2,7-diclorofluoresceína. Quando a placa é observada ao ultra-violeta, a mancha de esteróis é identificada por alinhamento com a mancha obtida com a solução de referência; delimita-se a mancha com um lápis preto ao longo da margem de fluorescência. 5.2.6. Raspa-se com uma espátula metálica o gel de sílica na zona delimitada. O material retirado, finamente triturado, é introduzido no cadinho de fundo filtrante (ponto 3.7); juntam-se 10 ml de clorofórmio quente, mistura-se cuidadosamente com a espátula metálica e filtra-se no vazio; em seguida recolhe-se o filtrado no frasco de kitasato (ponto 3.8) ligado ao cadinho de fundo filtrante. Lava-se o resíduo no cadinho três vezes com éter etílico (cerca de 10 ml de cada vez) e recolhe-se o filtrado no frasco de kitasato adaptado ao cadinho de fundo filtrante. Evapora-se o filtrado até se obter um volume de cerca de 4 a 5 ml; transvasa-se a solução residual para um tubo de centrifugação de 10 ml (ponto 3.9), previamente pesado, e seca-se aquecendo ligeiramente numa leve corrente de azoto. Deitam-se algumas gotas de acetona, leva-se novamente à secura, coloca-se durante cerca de 10 minutos na estufa a 105° C, deixa-se arrefecer no exsicador e pesa-se. O resíduo contido no tubo é constituído pela fracção esterólica.

5.3. Preparação dos trimetilsililéteres 5.3.1. No tubo de centrifugação que contém a fracção esterólica, junta-se o reagente de sililação, constituído por uma mistura de piridina, hexametildissilazano e trimetilclorossilano 9 + 3 + 1 (V/V/V) (nota 4), numa proporção de 50 μl por miligrama de esteróis, evitando qualquer absorção de humidade (nota 5). Nota 4: Existem no comércio soluções prontas para utilização; além disso, encontram-se também outros reagentes silanizantes como, por exemplo, o N,O (trimetilsilil) acetamida + 1 % de trimetilclorossilano, a diluir num volume igual de piridina anidra. 5.3.2. Tapa-se o tubo de centrifugação agita-se cuidadosamente (sem virar) até à solubilização completa dos esteróis. Deixa-se repousar durante pelo menos 15 minutos, à temperatura ambiente e, em seguida, centrifuga-se durante alguns minutos: a solução límpida está pronta para análise por cromatografia em fase gasosa. Nota 5: A ligeira opalescência que se pode eventualmente formar é normal e não provoca qualquer perturbação. A formação de um floculado branco ou o aparecimento de uma coloração rosa indicam a presença de humidade ou a deterioração do reagente. Neste caso, a análise deve ser repetida.

5.4. Análise por cromatografia em fase gasosa 5.4.1. Operações preliminares, condicionamento da coluna 5.4.1.1. Instala-se a coluna num cromatógrafo de gás, ligando a extremidade da entrada à câmara de injecção e a extremidade de saída ao detector. Efectuam-se os controlos gerais do conjunto de cromatografia em fase gasosa (hermeticidade do circuito dos gases, eficácia do detector, eficácia do sistema de separação e do sistema de registo, etc.). 5.4.1.2. Se a coluna for utilizada pela primeira vez, é aconselhável proceder à sua maturação. Faz-se passar um ligeiro fluxo gasoso e inicia-se um aquecimento gradual até atingir uma temperatura pelo menos 20° C superior à temperatura de trabalho (nota 6). Mantém-se essa temperatura durante pelo menos duas horas; em seguida, leva-se o conjunto às condições de funcionamento (regulação do fluxo gasoso e da separação, inflamação da chama, ligação ao registador electrónico, regulação de temperatura do forno para a coluna, do detector e do injector, etc.) e regista-se o sinal com uma sensibilidade pelo menos duas vezes superior à prevista para a realização da análise. O traçado da linha base obtida deve ser linear, isento de picos de qualquer natureza e não deve apresentar derivações. Uma derivação rectilínea negativa indica uma hermeticidade imperfeita das ligações da coluna; uma derivação positiva indica um condicionamento insuficiente da coluna. Nota 6: A temperatura de condicionamento deve ser sempre inferior pelo menos 20° C à temperatura máxima prevista para o líquido estacionário utilizado. 5.4.2. Escolha das condições de funcionamento 5.4.2.1. As condições de funcionamento normais são as seguintes: — temperatura da coluna: 260° C ± 5° C, — temperatura do evaporador: 280° C, — temperatura do detector: 290° C, — velocidade linear do gás vector: hélio, 20 a 35 cm/s; hidrogénio, 30 a 50 cm/s, — relação de separação: de 1/50 a 1/100, — sensibilidade instrumental: 4 a 16 vezes a atenuação mínima, — sensibilidade de registro: 1 a 2 mV em escala de fundo, — velocidade do papel: 30 a 60 cm/hora, — quantidade de substância injectada: 0,5 a 1 μl de solução TMSE. Estas condições podem ser alteradas em função das características da coluna e do cromatógrafo de gás, de modo a obter cromatogramas que satisfaçam as seguintes condições: — o tempo de retenção do beta-sitosterol deve ser de 20 ± 5 minutos, — o pico do campesterol deve ser para o azeite (teor médio 3 %) 15 ± 2 % da escala de fundo e para o óleo de soja (teor médio 20 %) 80 ± 10 % da escala de fundo, — deve-se verificar a separação de todos os esteróis presentes; é necessário que os outros picos separados apresentem também uma resolução completa, o que significa que o traçado do pico deve voltar à linha base antes do arranque do pico seguinte. No entanto, é tolerada uma resolução incompleta, desde que seja quantificável segundo a perpendicular ao pico em TRR 1,02. 5.4.3. Execução da análise 5.4.3.1. Com a micro-seringa de 10 μl, colhe-se 1 μl de hexano, aspiram-se 0,5 μl de ar e sucessivamente 0,5 a 1 μl da solução da amostra; puxa-se ainda o êmbolo da seringa de modo a que a agulha fique vazia. Introduz-se a agulha através da membrana da câmara de injecção e após 1-2 segundos, injecta-se rapidamente, retira-se a agulha devagar, cerca de 5 segundos depois. 5.4.3.2. Procede-se ao registo até à eluição completa dos TMSE dos esteróis presentes. A linha base deve continuar a corresponder às condições exigidas (ponto 5.4.1.2). 5.4.4. Identificação dos picos A identificação individual dos picos é efectuada com base nos tempos de retenção e em comparação com a mistura dos TMSE dos esteróis cromatografados nas mesmas condições. Os esteróis são eluídos pela seguinte ordem: colesterol, brassicasterol, 24-metilenocolesterol, campesterol, campestanol, estigmasterol, delta-7-campesterol, delta-5,23-estimastadienol, clerosterol, beta-sitosterol, sitostanol, delta-5-avenasterol, delta-5,24-estigmastadienol, delta-7-estigmastenol, delta-7-avenasterol. No quadro I são indicados os tempos de retenção relativos ao sitosterol, para as colunas SE-52 e SE-54. As figuras 1 e 2 apresentam cromatogramas típicos de alguns óleos. 5.4.5. Avaliação quantitativa 5.4.5.1. Procede-se com o integrador ao cálculo da área dos picos do alfa-colestanol e dos outros esteróis. Não se consideram os eventuais picos de compostos não incluídos na lista do quadro I. O coeficiente de resposta para o α-colestanol deve ser igual a 1. 5.4.5.2. Calcula-se o teor de cada esterol, em mg/100 g de matéria gorda, do seguinte modo: onde: Ax = área do pico do esterol x ►M6 ————— ◄ . As = área do pico do alfa-colestanol ►M6 ————— ◄ . ms = massa de alfa-colestanol adicionada, em miligramas. m = massa da amostra colhida para a determinação, em gramas.

6. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

6.1. Determinam-se os teores de cada um dos esteróis em mg/100 g de matéria gorda e a sua soma como «esteróis totais».

6.2. Calcula-se a percentagem de cada esterol a partir da relação entre a área do respectivo pico e a soma das áreas dos picos de todos os esteróis. onde: Ax = área do pico x. A = soma das áreas de todos os esteróis.









APÊNDICE

Determinação da velocidade linear do gás

No cromatógrafo de gás, regulado para condições de funcionamento normais, injectam-se 1 a 3 μl de metano (ou propano) e cronometra-se o tempo gasto pelo gás para percorrer a coluna entre o momento da injecção e o da saída do pico (tM).

A velocidade linear em cm/s é dada por l/t, onde l é o comprimento da coluna em centímetros e t o tempo cronometrado em segundos.







Quadro I Tempos de retenção relativos dos esteróis Pico Identificação Tempos de retenção relativos Coluna SE 54 Coluna SE 52 1 colesterol delta,5-colesteno-3-beta-ol 0,67 0,63 2 colestanol 5-alfa-colestano-3-beta-ol 0,68 0,64 3 brassicasterol [24S]-24-metil-delta,5,22-colestadieno-3-beta-ol 0,73 0,71 4 24-metilenocolesterol 24-metileno-delta,5,24-colestadieno-3-beta-ol 0,82 0,80 5 campesterol [24R]-24-metil-delta,5-colesteno-3-beta-ol 0,83 0,81 6 campestanol [24R]-24-metil-colestano-3-beta-ol 0,85 0,82 7 estigmasterol [24S]-24-etil-delta,5,22-colestadieno-3-beta-ol 0,88 0,87 8 delta,7-campesterol [24R]-24-metil-delta,7-colesteno-3-beta-ol 0,93 0,92 9 delta,5,23-estigmastadienol [24R,S]-24-etil-delta,5,23-colestadieno-3-beta-ol 0,95 0,95 10 clerosterol [24S]-24-etil-delta,5,25-colestadieno-3-beta-ol 0,96 0,96 11 beta-sitosterol [24R]-24-etil-delta,5-colesteno-3-beta-ol 1,00 1,00 12 sitostanol 24-etil-colestano-3-beta-ol 1,02 1,02 13 delta,5-avenasterol [24Z]-24-etilideno-delta,5-colesteno-3-beta-ol 1,03 1,03 14 delta,5,24-estigmastadienol [24R,S]-24-etil-delta,5,24-colestadieno-3-beta-ol 1,08 1,08 15 delta,7-estigmasterol [24R,S]-24-etil-delta,7-colesteno-3-beta-ol 1,12 1,12 16 delta,7-avenasterol [24Z]-24-etilideno-delta,7-colesteno-3-beta-ol 1,16 1,16

Figura 1

Cromatograma em fase gasosa da fracção esterólica de um azeite virgem

Figura 2

Cromatograma em fase gasosa da fracção esterólica de um azeite refinado









ANEXO VI

DETERMINAÇÃO DO TEOR DE ERITRODIOL E UVAOL

PREÂMBULO

O eritrodiol (convencionalmente entendido como o conjunto dos dióis eritrodiol e uvaol) é um constituinte da fracção insaponificável, característico de alguns tipos de matérias gordas. A sua concentração é apreciavelmente mais elevada em óleos de bagaço de azeitona do que noutros óleos que o contêm (azeites virgens, óleo de grainha de uva), pelo que a sua determinação pode servir para detectar a presença de óleo de bagaço de azeitona.

1. OBJECTIVO

O método descreve o processo para determinar o eritrodiol de gorduras e óleos.

2. PRINCÍPIO

A matéria gorda é saponificada com solução etanólica de hidróxido de potássio, sendo posteriormente o insaponificável extraído com éter etílico e purificado por passagem através de coluna de alumina.

Procede-se à separação do insaponificável por cromatografia em camada fina em placa de gel de sílica, isolando-se as manchas correspondentes à fracção esterólica e à fracção do eritrodiol.

Os esteróis e o eritrodiol recuperado da placa são convertidos nos respectivos éteres trimetilsilílicos, cuja mistura é analisada por cromatografia em fase gasosa. O resultado é expresso em percentagem de eritrodiol em relação ao conjunto eritrodiol mais esteróis.

3. APARELHOS E UTENSÍLIOS

3.1. O mesmo equipamento descrito no anexo V (determinação do teor de esteróis).

4. REAGENTES

4.1. Os mesmos reagentes descritos no anexo V (determinação do teor de esteróis).

4.2. Solução de referência de eritrodiol a 0,5 % (m/V) em clorofórmio.

5. PROCESSO

5.1. Preparação do insaponificável Procede-se de acordo com a descrição do ponto 5.1.2 do anexo V.

5.2. Separação do eritrodiol e dos esteróis 5.2.1. Veja-se o ponto 5.2.1 do anexo V. 5.2.2. Veja-se o ponto 5.2.2 do anexo V. 5.2.3. Prepara-se uma solução de insaponificável a 5 % (m/V) em clorofórmio. Com o auxílio da ►C1 micro-seringa de 100 μl ◄ , apõem-se sobre uma placa cromatográfica, a cerca de 1,5 cm do bordo ►C1 inferior, 0,3 ml ◄ da dita solução, numa linha de partida o mais possível fina e uniforme. Apõem-se também, numa extremidade da placa, como referência, alguns mililitros de solução de colesterol e eritrodiol. 5.2.4. Coloca-se a placa na câmara de desenvolvimento, preparada de acordo com o ponto 5.2.1. A temperatura ambiente deve ser cerca de 20° C. Tapa-se rapidamente e elui-se até que a frente do solvente se encontre a cerca de 1 cm do bordo superior da placa. Retira-se a placa da câmara e evapora-se o solvente em corrente de ar quente. 5.2.5. Nebuliza-se a placa uniformemente com solução alcoólica de 2′, 7′ -diclorofluoresceína. O exame da placa ao ultra-violeta permite identificar as manchas correspondentes aos esteróis e ao eritrodiol por comparação com as manchas relativas às substâncias de referência. Delimitam-se as manchas em estudo com o auxílio de um lápis, ligeiramente fora das margens de fluorescência. 5.2.6. Raspa-se o gel de sílica interior às áreas delimitadas com auxílio de uma espátula metálica. Coloca-se o material assim recolhido da placa num frasco de 50 ml, ao qual se adicionam 15 ml de clorofórmio quente. Agita-se bem e filtra-se num cadinho de fundo filtrante transferindo o gel de sílica para esse cadinho. Lava-se por três vezes com sucessivas porções de 10 ml de clorofórmio quente, recolhe-se o filtrado num frasco de 100 ml, previamente tarado, e leva-se à secura mediante aquecimento suave em corrente de azoto, pesando-se de seguida.

5.3. Preparação dos éteres trimetilsilílicos Procede-se de acordo com a descrição do ponto 5.3 do anexo V.

5.4. Análise por cromatografia em fase gasosa Procede-se de acordo com a descrição do ponto 5.4 do anexo V. As condições operacionais da análise cromatográfica devem ser tais que, além de satisfazerem aos requisitos necessários para análise dos esteróis, conduzam à separação dos éteres trimetilsilílicos do eritrodiol e do uvaol. Procede-se em seguida à identificação dos picos (o eritrodiol e o uvaol possuem tempos de retenção em relação ao β-sitosterol de cerca de 1,45 e 1,55, respectivamente) e ao cálculo das áreas, segundo um processo idêntico ao adoptado para os esteróis.

6. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

onde:

A1 = é a área do pico correspondente ao eritrodiol ►M6 ————— ◄ .

A2 = é a área do pico correspondente ao uvaol ►M6 ————— ◄ .

AAesteróis = é a soma das áreas correspondentes aos esteróis presentes ►M6 ————— ◄ .

O resultado é arredondado às décimas.

▼M21









ANEXO VII

DETERMINAÇÃO DA PERCENTAGEM DE MONOPALMITATO DE 2-GLICERILO

1. OBJECTIVO E CAMPO DE APLICAÇÃO

O presente método descreve o procedimento analítico para a determinação da percentagem de ácido palmítico em posição 2 dos triglicéridos através da avaliação do monopalmitato de 2-glicerilo.

Este método é aplicável aos óleos vegetais líquidos à temperatura ambiente (20 °C).

2. PRINCÍPIO

Após preparação, a amostra de azeite é sujeita à acção da lipase pancreática: uma hidrólise parcial e específica nas posições 1 e 3 da molécula de triglicérido determina a formação de monoglicéridos na posição 2. A percentagem de monopalmitato de 2-glicerilo na fracção monoglicerídica é determinada, após sililação, por cromatografia em fase gasosa com coluna capilar.

3. APARELHOS E UTENSÍLIOS

3.1. Erlenmeyer de 25 ml

3.2. Provetas de 100, 250 e 300 ml

3.3. Coluna cromatográfica de vidro, com 21-23 mm de diâmetro interno e 400 mm de comprimento, equipada com um disco poroso de vidro e uma tampa

3.4. Tubos de ensaio graduados de 10, 50, 100 e 200 ml

3.5. Balões de 100 e 250 ml

3.6. Evaporador rotativo

3.7. Tubos de centrifugadora de fundo cónico, com cerca de 10 ml de capacidade, com rolha esmerilada

3.8. Centrifugadora para tubos de 10 e 100 ml

3.9. Termóstato que permita manter a temperatura a 40 °C + 0,5 °C

3.10. Pipetas graduadas de 1 e 2 ml

3.11. Seringa hipodérmica de 1 ml

3.12. Microsseringa de 100 μl

3.13. Ampola de decantação de 1 000 ml

3.14. Cromatografia de fase gasosa adequado para colunas capilares, equipado com um dispositivo de injecção na coluna («on column») a frio, para a introdução directa da amostra na coluna, e um forno passível de manter a temperatura escolhida com uma precisão de 1 °C.

3.15. Injector na coluna a frio para a introdução directa da amostra na coluna

3.16. Detector de ionização de chama e electrómetro

3.17. Registador-integrador adequado ao funcionamento com o electrómetro, com um tempo de resposta não superior a um segundo e com uma velocidade de papel variável

3.18. Coluna capilar de vidro ou de sílica fundida, com 8 m a 12 m de comprimento e 0,25 mm a 0,32 mm de diâmetro interno, revestida de metilpolissiloxano ou fenilmetilpolissiloxano a 5 %, de espessura compreendida entre 0,10 μm e 0,30 μm, que possa ser utilizada a 370 °C

3.19. Microsseringa de 10 μl com agulha cementada com, pelo menos, 7,5 cm de comprimento, para injecção directa na coluna

4. REAGENTES

4.1. Silicagel com granulometria compreendida entre 0,063 e 0,200 mm (70/280 mesh), preparado do seguinte modo: colocar o silicagel numa cápsula de porcelana, secar na estufa a 160 °C durante 4 horas e deixar arrefecer até à temperatura ambiente num exsicador. Juntar um volume de água equivalente a 5 % do peso de silicagel, do seguinte modo: num Erlenmeyer de 500 ml, pesar 152 g de silicagel e juntar 8 g de água destilada; tapar e agitar suavemente para obter uma repartição uniforme da água. Deixar repousar durante pelo menos 12 horas antes do uso.

4.2. n-Hexano para cromatografia

4.3. Isopropanol

4.4. Isopropanol em solução aquosa 1/1 (V/V)

4.5. Lipase pancreática. A lipase utilizada deve ter uma actividade compreendida entre 2,0 e 10 unidades de lipase por mg. (Existem no comércio lipases pancreáticas com uma actividade compreendida entre 2 e 10 unidades por mg de enzima.)

4.6. Solução tampão de tris-hidroximetilaminometano: solução aquosa 1M levada a pH 8 (controlo potenciométrico) por adição de HCl concentrado (1:1 V/V)

4.7. Solução aquosa a 0,1 % de colato de sódio (qualidade enzimática), que deve ser utilizada no prazo de 15 dias após a preparação.

4.8. Solução aquosa a 22 % de cloreto de cálcio

4.9. Éter etílico para cromatografia

4.10. Eluente: mistura n-hexano/éter etílico (87:13) (V/V)

4.11. Solução a 12 % da amostra de hidróxido de sódio

4.12. Solução de fenolftaleína a 1 % em etanol

4.13. Gás vector: hidrogénio ou hélio, para cromatografia em fase gasosa

4.14. Gases auxiliares: hidrogénio de pureza mínima 99 %, isento de humidade e de substâncias orgânicas; ar para cromatografia em fase gasosa, com o mesmo grau de pureza

4.15. Reagente de silanização: mistura de piridina, hexametildissilazano e trimetilclorossilano 9:3:1 (v/v/v). [Existem no comércio soluções prontas a utilizar. É possível utilizar outros reagentes silanizantes, como uma mistura de bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida com 1 % de trimetilclorossilano, a diluir num volume igual de piridina anidra.]

4.16. Amostras de referência: monoglicéridos puros ou misturas de monoglicéridos com uma composição em percentagem conhecida, semelhante à da amostra.

5. PROCEDIMENTO

5.1. Preparação da amostra

5.1.1. Os azeites com acidez livre inferior a 3 % não necessitam de ser neutralizados antes da cromatografia em coluna de silicagel. Os azeites com acidez livre superior a 3 % devem ser sujeitos à neutralização, em conformidade com o ponto 5.1.1.1. 5.1.1.1. Deitar 50 g de azeite e 200 ml de n-hexano na ampola de decantação de 1 000 ml (3.13). Juntar 100 ml de isopropanol e uma quantidade da solução de hidróxido de sódio a 12 % (4.11) correspondente à acidez livre do azeite majorada de 5 %. Agitar energicamente durante um minuto. Juntar 100 ml de água destilada, agitar de novo e deixar repousar. Após a decantação, eliminar a camada inferior que contém os sabões. Remover igualmente as eventuais camadas intermédias (mucilagem, matérias insolúveis). Lavar a solução de óleo neutralizado em hexano com sucessivas porções de 50-60 ml da solução de isopropanol/água 1:1 (V/V) (4.4), até ao desaparecimento da coloração carmim da fenolftaleína. Remover a maior parte do solvente por destilação sob vácuo no evaporador rotativo e transferir o azeite para um balão de 100 ml (3.5). Secar o azeite sob vácuo até à eliminação total do solvente. No final desta operação, a acidez do azeite deve ser inferior a 0,5 %.

5.1.2. Introduzir 1,0 g de azeite preparado como indicado acima num Erlenmeyer de 25 ml (3.1) e dissolver em 10 ml de eluente (4.10). Deixar repousar a solução durante, pelo menos, 15 minutos, antes da cromatografia em coluna de silicagel. Se a solução estiver turva, centrifugá-la para garantir condições óptimas para a cromatografia. [É possível utilizar cartuchos de silicagel de extracção em fase sólida (SPE) de 500 mg prontos a ser utilizados.]

5.1.3. Preparação da coluna cromatográfica Deitar na coluna (3.3) cerca de 30 ml de eluente (4.10), introduzir um pouco de algodão na parte inferior da coluna com a ajuda de uma varinha de vidro; apertar para eliminar o ar. Preparar, numa proveta, uma suspensão de 25 g de silicagel (4.1) em cerca de 80 ml de eluente e deitar na coluna utilizando um funil. Verificar que o silicagel foi integralmente introduzido na coluna; lavar com eluente (4.10), abrir a torneira e deixar escorrer até que o nível deste desça até cerca de 2 mm acima do nível superior do silicagel.

5.1.4. Cromatografia em coluna Num Erlenmeyer de 25 ml (3.1), pesar rigorosamente 1,0 g de amostra preparada em conformidade com o ponto 5.1. Abrir a torneira e deixar escoar a solução da amostra até esta atingir o nível do silicagel. Eluir com 150 ml de eluente. Ajustar o fluxo a 2 ml/min (de forma a que passem na coluna 150 ml em cerca de 60 ou 70 minutos). Recolher o eluído num balão de 250 ml, previamente tarado. Evaporar o solvente sob vácuo e eliminar os últimos vestígios do mesmo numa corrente de azoto. Pesar o balão e determinar o extracto recuperado. Caso se utilizem cartuchos de silicagel SPE prontos a serem utilizados, proceder do seguinte modo: introduzir 1 ml de solução (5.1.2) nos cartuchos previamente preparados com 3 ml de n-hexano Depois de filtrar a solução, eluir com 4 ml de n-hexano/éter etílico a 9:1 (v/v). Recuperar o eluído num tubo de 10 ml e evaporá-lo numa corrente de azoto até à secura. Submeter o resíduo seco à acção da lipase pancreática (5.2). (É fundamental verificar a composição em ácidos gordos antes e depois de passar pelo cartucho SPE).

5.2. Hidrólise com lipase pancreática

5.2.1. Num tubo da centrifugadora, pesar 0,1 g de azeite preparado em conformidade com o ponto 5.1. Adicionar 2 ml de solução tampão (4.6), 0,5 ml de solução de colato de sódio (4.7) e 0,2 ml de solução de cloreto de cálcio, agitando bem após cada adição. Tapar o tubo com a rolha esmerilada e colocá-lo no termóstato a 40 + 0,5 °C.

5.2.2. Adicionar 20 mg de lipase, agitar cuidadosamente (evitando o contacto da solução com a rolha) e colocar o tubo no termóstato durante exactamente dois minutos. Em seguida, retirar, agitar energicamente durante 1 minuto e deixar arrefecer.

5.2.3. Adicionar 1 ml de éter etílico, tapar e agitar energicamente; centrifugar e, com uma microsseringa, transferir a solução de éter para um tubo limpo e seco.

5.3. Preparação dos derivados silanizados e da cromatografia em fase gasosa

5.3.1. Com uma microsseringa, introduzir 100 μl de solução (5.2.3) num tubo de fundo cónico de 10 ml.

5.3.2. Eliminar o solvente em corrente ligeira de azoto, juntar 200 μl de reagente de silanização (4.15), tapar o tubo e deixar repousar durante 20 minutos.

5.3.3. Passados 20 minutos, juntar entre 1 e 5 ml de n-hexano (em função das condições cromatográficas): a solução resultante está pronta para a cromatografia em fase gasosa.

5.4. Cromatografia em fase gasosa

As condições de funcionamento são as seguintes:

— Temperatura do injector (injector em coluna) inferior à temperatura de ebulição do solvente (68 °C).

— Temperatura do detector: 350 °C;

— Temperatura na coluna: programação da temperatura do forno: 60 °C durante 1 minuto, aumentando 15 °C por minuto até 180 °C, seguindo-se 5 °C por minuto até 340 °C e, finalmente, 340 °C durante 13 minutos.

— Gás vector: hidrogénio ou hélio, regulado à velocidade linear adequada para obter a resolução reflectida na figura 1. O tempo de retenção do triglicérido C54 deve ser de 40 + 5 minutos (ver figura 2). (As condições de trabalho indicadas são propostas a título indicativo. Cada operador deverá optimizar as condições para alcançar a resolução pretendida. A altura do pico correspondente ao monopalmitato de 2-glicerilo deve ter uma altura mínima igual a 10 % da escala do registador.)

— Volume injectado: 0,5-1 μl de solução (5 ml) de n-hexano (5.3.3).

5.4.1. Identificação dos picos

Os monoglicéridos individuais são identificados em função dos respectivos tempos de retenção obtidos, comparando com os correspondentes a misturas-padrão de monoglicéridos analisadas mas mesmas condições.

5.4.2. Avaliação quantitativa

A área referente a cada pico é calculada utilizando um integrador electrónico.

6. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

Calcular a percentagem de monopalmitato de glicerilo com base na relação entre a área do respectivo pico e a soma das áreas dos picos de todos os monoglicéridos (ver figura 2), de acordo com a seguinte fórmula:

Em que:

Ax = área do pico relativo ao monopalmitato de glicerilo

ΣA = soma das áreas correspondentes a todos os picos de monoglicéridos

Os resultados arredondam-se às décimas.

7. RELATÓRIO DA ANÁLISE

O relatório da análise deve especificar:

— a referência ao presente método;

— toda a informação necessária para a completa identificação da amostra;

— os resultados da análise;

— os eventuais desvios em relação ao presente método, quer se trate de uma decisão das partes interessadas ou por qualquer outra razão;

— os dados de identificação do laboratório, a data da análise e a assinatura dos responsáveis da mesma.

Figura 1

Cromatograma dos produtos da reacção de silanização obtidos pela acção da lipase num azeite refinado adicionado de 20 % de azeite esterificado (100 %).

[Key: «acides gras libres» = ácidos gordos livres; «Huile d’olive raffinée + 20 % huile estérifiée» = azeite refinado + 20 % azeite esterificado; «1-2 monopalmitoléine» = 1-2 monopalmitoleína; «1-2 mono C18 insat.» = 1-2 mono C18 insaturado]

Figura 2

Cromatograma de:

A) Azeite não esterificado, após tratamento com lipase; após silanização; nestas condições (coluna capilar de 8 a 12 m), a fracção de ceras é eluída ao mesmo tempo que a fracção de diglicéridos, ou pouco depois. Após lipase, o teor de triglicéridos não deve exceder 15 %. Legenda: 1 = Ácidos gordos livres 2 = Monoglicéridos 3 = Diglicéridos 4 = Triglicéridos * = 2-Monopalmitina ** = Triglicérido C54

Cromatograma de:

B) azeite esterificado após tratamento com lipase; após silanização; nestas condições (coluna capilar de 8 a 12 m), a fracção de ceras é eluída ao mesmo tempo que a fracção de diglicéridos ou pouco depois. Após lipase, o teor de triglicéridos não deve exceder 15 %. Legenda: 1 = Ácidos gordos livres 2 = Monoglicéridos 3 = Diglicéridos 4 = Triglicéridos * = 2-Monopalmitina ** = Triglicérido C54

8. NOTAS

Existem no comércio lipases com uma actividade satisfatória. Também é possível prepará-las no laboratório da forma seguinte:

Arrefecer 5 kg de pâncreas fresco de porco a 0 °C. Remover a matéria gorda sólida periférica, bem como o tecido conjuntivo, e triturar num almofariz de modo a obter um fluido pastoso. Agitar esta pasta durante 4 a 6 horas, em 2,5 l de acetona anidra, e centrifugar. Extrair o resíduo mais três vezes com o mesmo volume de acetona anidra e, seguidamente, extrair duas vezes com uma mistura de acetona e éter etílico na proporção de 1:1 (V/V). Por fim, extrair duas vezes com éter etílico.

Secar o resíduo sob vácuo durante 48 horas, de modo a obter um pó estável, que se conserva no frigorífico por um período prolongado, ao abrigo da humidade.

Prepara-se uma emulsão de azeite do seguinte modo:

Agitar durante 10 minutos, num agitador, uma mistura de 165 ml de solução de goma arábica a 100g/l, 15 g de gelo triturado e 20 ml de azeite neutralizado.

Num copo de 50 ml, colocar sucessivamente 10 ml da emulsão, 0,3 ml de solução de colato de sódio a 0,2g/ml e 20 ml de água destilada.

Colocar o copo num termóstato regulado a 37 °C; introduzir os eléctrodos do medidor de pH e o agitador de hélice.

Com o auxílio de uma pipeta, adicionar gota a gota uma solução de hidróxido de sódio 0,1 N até ser atingido o valor de pH 8,3.

Juntar um volume de suspensão de pó de lipase em água (0,1 g/ml de lipase). No instante em que o medidor de pH indicar um valor de 8,3, accionar o cronómetro e adicionar a solução de hidróxido de sódio, gota a gota, ao ritmo necessário para manter um pH de 8,3. Anotar o volume de solução consumido por minuto.

Anotar as observações num sistema de eixos coordenados, em que as abcissas correspondem ao tempo e as ordenadas aos mililitros de solução alcalina 0,1 N consumidos para manter o pH constante. Deve obter-se um gráfico linear.

A actividade da lipase, medida em unidades de lipase por mg, é dada pela fórmula seguinte:

em que:

A = actividade em unidades lipase/mg

V = número de mililitros de solução de hidróxido de sódio 0,1 N por minuto (calculados a partir do gráfico)

N = normalidade da solução de hidróxido de sódio

m = massa, em mg, da lipase para análise.

A unidade de lipase é definida como a quantidade de enzimas que permite libertar 10 miliequivalentes de ácido por minuto.

▼M20 —————

▼B









ANEXO IX

ANÁLISE POR ESPECTROFOTOMETRIA NO ULTRAVIOLETA

INTRODUÇÃO

A análise por espectrofotometria no ultravioleta pode fornecer indicações sobre a qualidade de uma matéria gorda, o seu estado de conservação e as modificações devidas ao processamento tecnológico.

As absorvâncias nos comprimentos de onda previstos no método são devidas à presença de sistemas diénicos e triénicos conjugados. Os valores destas absorvâncias são expressos em termos de extinção específica (extinção de uma solução de matéria gorda a 1 g/100 ml no solvente prescrito, para um percurso óptico de 1 cm), designado por K (coeficiente de extinção).

1. OBJECTIVO

O método descreve o processo de execução do exame espectrofotométrico de matérias gordas no ultravioleta.

2. PRINCÍPIO DO MÉTODO

A matéria gorda em estudo é dissolvida num solvente apropriado, determinando-se em seguida a extinção da solução no comprimento de onda prescrito em relação ao solvente puro. As extinções específicas são calculadas a partir das leituras espectrofotométricas.

3. APARELHOS E UTENSÍLIOS

3.1. Espectrofotómetro para medição das extinções no ultravioleta, entre 220 e 360 nm, com possibilidade de leitura por cada unidade nanométrica.

3.2. Tinas de quartzo, com tampa, com um percurso óptico de 1 cm, não devendo apresentar diferenças superiores a 0,01 unidades de extinção nas leituras efectuadas com água ou outro solvente apropriado.

3.3. Balão aferido de 25 ml.

▼M6

3.4. Coluna para cromatografia com uma parte superior com 270 mm de comprimento e 35 mm de diâmetro e uma parte inferior com 270 mm de comprimento e 10 mm de diâmetro.

▼B

4. REAGENTES

4.1. Iso-octano (2,2,4-trimetilpentano), para espectrofotometria, puro, devendo apresentar, em relação à água destilada, uma transmitância não inferior a 60 % a 220 nm e não inferior a 95 % a 250 nm; ou como alternativas: ciclo-hexano, para espectrofotometria, puro, devendo apresentar, em relação à água destilada, uma transmitância não inferior a 40 % a 220 nm e não inferior a 95 % a 250 nm ►M6 ————— ◄ .

4.2. Alumina básica para cromatografia em coluna, preparada e controlada de acordo com a descrição do apêndice I.

4.3. n-Hexano para cromatografia.

5. TÉCNICA

5.1. A amostra a analisar deve estar perfeitamente homogénea e isenta de impurezas em suspensão. Os óleos líquidos à temperatura ambiente são filtrados em papel a uma temperatura próxima de 30° C; as gorduras sólidas são homogeneizadas e filtradas a uma temperatura não superior a 10° C acima da sua temperatura de fusão.

5.2. Pesa-se num balão aferido de 25 ml cerca de 0,25 g da amostra preparada de acordo com o ponto anterior, completando o volume com o solvente prescrito e homogeneiza-se. A solução obtida deve ser perfeitamente límpida. No caso de a solução apresentar opalescência ou turvação, filtra-se rapidamente por papel.

5.3. Enche-se uma tina com a solução obtida e medem-se as extinções, usando como referência o solvente utilizado, nos comprimentos de onda compreendidos entre 232 e 276 nm. Os valores medidos registados devem estar compreendidos no intervalo de 0,1 a 0,8; no caso contrário, torna-se necessário repetir as medições recorrendo a soluções mais concentradas ou mais diluídas.

5.4. No caso de ser requerida a determinação das extinções específicas, após a passagem por alumina, procede-se do seguinte modo: introduzem-se na coluna cromatográfica 30 g de alumina básica suspensa em hexano; quando a alumina assentar, procede-se à eliminação do excesso de hexano até pelo menos cerca de 1 cm acima do nível superior da alumina. Dissolvem-se 10 g de matéria gorda, homogeneizada e filtrada de acordo com a descrição do ponto 5.1, em 100 ml de hexano e verte-se na coluna a solução assim obtida. Recolhe-se o eluído e evapora-se o solvente no vazio a uma temperatura inferior a 25° C. Procede-se de imediato conforme a descrição do ponto 5.2.

6. EXPRESSÃO DOS RESULTADOS

6.1. Exprimem-se as extinções específicas (coeficientes de extinção) nos diferentes comprimentos de onda, de acordo com a fórmula: em que: Kλ = extinção específica no comprimento de onda λ. Eλ = extinção medida no comprimento de onda λ. c = concentração da solução em g/100 ml. s = espessura da tina em centímetros. Os resultados arredondam-se às centésimas.

6.2. A análise espectrofotométrica do azeite de acordo com o método oficial dos regulamentos oficiais da Comunidade Económica Europeia prevê a determinação da extinção específica em solução no iso-octano, nos comprimentos de onda 232 e 276 nm, sendo a determinação de ΔK efectuada segundo: onde: Km representa a extinção específica no comprimento de onda m, correspondente a um valor máximo de absorvância na gama de 270 nm.









APÊNDICE I

Preparação da alumina e controlo da sua actividade

A.1.1. Preparação da alumina

Introduz-se num recipiente susceptível de se fechar hermeticamente a alumina seca na estufa a 380-400° C, durante 3 horas. Junta-se água destilada na proporção de 5 ml por 100 g de alumina, fecha-se rapidamente o recipiente, agita-se várias vezes e deixa-se repousar durante pelo menos 12 horas antes da utilização.

A.1.2. Controlo da actividade da alumina

Prepara-se uma coluna cromatográfica com 30 g de alumina. Procede-se de acordo com a descrição do ponto 5.4. Faz-se passar através da coluna uma mistura constituída por:

— 95 % de azeite virgem, com uma extinção específica a 268 nm inferior a 0,18,

— 5 % de óleo de amendoim tratado com terra descorada durante o processo de refinação, com uma extinção específica a 268 nm superior ou igual a 4.

Se a mistura, após passagem pela coluna, apresentar uma extinção específica a 268 nm superior a 0,11, a alumina é aceitável. No caso contrário, faz-se aumentar a hidratação (escalão de actividade).









APÊNDICE II

Aferição do espectrofotómetro

A.2. O aparelho deve ser aferido periodicamente (pelo menos de 6 em 6 meses), tanto para a correspondência dos comprimentos de onda como para a precisão da resposta. A.2.1. A verificação da resposta do comprimento de onda pode ser feita mediante lâmpada de vapor de mercúrio ou filtros apropriados. A.2.2. Para verificação da célula fotoeléctrica e do fotomultiplicador, procede-se do seguinte modo: pesam-se 0,2 g de cromato de potássio puro para espectroscopia e dissolvem-se numa solução de hidróxido de potássio 0,05 N até completar o volume de 100 ml num balão aferido. Retiram-se em seguida 25 ml exactos da solução obtida, transferem-se para um balão aferido de 500 ml e completa-se o volume com a mesma solução de hidróxido de potássio. Mede-se a extinção a 275 nm da nova solução, tomando a solução de hidróxido de potássio como referência. A extinção medida com uma tina de 1 cm de percurso óptico deverá ser de 0,200 ± 0,005.









ANEXO XA

ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA DE ÉSTERES METÍLICOS DE ÁCIDOS GORDOS

1. OBJECTIVO

A presente norma fornece uma orientação geral para a aplicação de cromatografia em fase gasosa, mediante o uso de colunas de enchimento ou capilares, para determinação qualitativa e quantitativa de uma mistura de ésteres metílicos de ácidos gordos obtidos de acordo com o método descrito no anexo XB.

2. REAGENTES

2.1. Gás vector

Gás inerte (azoto, hélio, árgon, hidrogénio, etc.) seco e com um teor de oxigénio inferior a 10 mg/kg.

Nota 1:

O hidrogénio, usado como gás vector apenas em colunas capilares, pode duplicar a rapidez da análise, sendo, porém, perigoso.

Encontram-se disponíveis conselhos para a sua manipulação com segurança.

2.2. Gases auxiliares

2.2.1. Hidrogénio (pureza > 99,9 %), isento de impurezas orgânicas.

2.2.2. Ar ou oxigénio, isento de impurezas orgânicas.

2.3. Padrão de referência

Mistura de ésteres metílicos de ácido gordos puros ou os ésteres metílicos de uma gordura de composição conhecida, de preferência semelhante à gordura a analisar.

Devem ser tomadas precauções com vista a evitar a oxidação de ácidos gordos polinsaturados.

3. APARELHOS E UTENSÍLIOS

As instruções fornecidas referem-se a equipamento vulgarmente utilizado para cromatografia em fase gasosa, mediante a utilização quer de colunas de enchimento quer capilares e um detector de ionização de chama. Quaisquer aparelhos susceptíveis de fornecer a eficiência e a resolução especificadas no ponto 5.1.2 são apropriados.

3.1. Cromatógrafo de fase gasosa

O cromatógrafo de fase gasosa deve compreender os seguintes elementos:

3.1.1. Sistema de injecção

Utiliza-se um sistema de injecção:

a) No caso de colunas de enchimento, com o menor espaço-morto possível (o sistema de injecção deverá, neste caso, ser susceptível de aquecimento a uma temperatura de 20° C a 50° C superior à temperatura de coluna);

b) No caso das colunas capilares, com injector apropriado para uso com este tipo de colunas, podendo apresentar divisão de fluxo («split») ou não ou injectores para injecção directa na coluna («on column»).

Nota 2:

Na ausência de ácidos gordos com menos de 16 átomos de carbono, poderá utilizar-se um injector equipado com uma agulha móvel.

3.1.2. Forno

O forno deve ser susceptível de aquecer a coluna à temperatura mínima de 260° C e de manter a temperatura desejada com uma precisão de 1° C, no caso de colunas de enchimento, e de 0,1° C, no caso de colunas capilares. Este último requisito é de particular importância quando se utiliza um tubo de sílica fundida (quartzo).

Recomenda-se em todos os casos o uso de aquecimento com programação de temperatura, particularmente para ácidos gordos com menos de 16 átomos de carbono.

3.1.3. Coluna de enchimento

3.1.3.1. Coluna de material inerte às substâncias a analisar (vidro ou aço inoxidável), possuindo as dimensões seguintes: a) Comprimento: 1 m a 3 m, poderá usar-se uma coluna relativamente curta quando se encontram presentes ácidos gordos de cadeia longa (superiores a C20). Na análise de ácidos com 4 a 6 átomos de carbono, recomenda-se o uso de uma coluna de 2 m de comprimento; b) Diâmetro interno: 2 mm a 4 mm. Nota 3: Quaisquer compostos polinsaturados com mais de três duplas ligações que se encontrem eventualmente presentes poderão sofrer decomposição numa coluna de aço inoxidável. Nota 4: Poderá usar-se um sistema de duas colunas de enchimento.

3.1.3.2. Enchimento, constituído pelos elementos seguintes: a) Suporte: terra de infusórios lavada com ácido e silanizada ou outro suporte inerte com uma gama limitada de granulometria (25 μm entre os limites 125-200 μm), sendo as dimensões médias de cada grão relacionadas com o diâmetro interno e o comprimento da coluna; b) Fase estacionária: líquido polar do tipo poliéster (tal como polissuccinato de dietilenoglicol, polissuccinato de butanodiol, poliadipato de etilenoglicol, etc.) ou qualquer outro líquido (designadamente uma cianossilicona) susceptível de permitir a separação cromatográfica desejada (veja-se o ponto 5). A fase estacionária deve ser de 5 % (m/m) a 20 % (m/m) do enchimento. Para certas separações, pode ser utilizada uma fase estacionária apolar.

3.1.3.3. Condicionamento da coluna Aquece-se o forno gradualmente até 185° C, mantendo a coluna desligada do detector, e faz-se passar através desta uma corrente de gás inerte, à razão de 20-60 ml/minuto, durante um intervalo de tempo mínimo de 16 horas, àquela temperatura e, seguidamente, de 2 horas a 195° C.

3.1.4. Coluna capilar

3.1.4.1. Tubo de material inerte às substâncias a analisar (geralmente vidro ou sílica fundida). O diâmetro interno deve estar compreendido entre 0,2 mm e 0,8 mm. A superfície interna deve ser submetida a um tratamento apropriado (por exemplo, preparação da superfície ou inactivação) antes de receber o revestimento correspondente à fase estacionária. Na maioria dos casos é suficiente um comprimento de 25 m.

3.1.4.2. Fase estacionária, geralmente do tipo poliglicol (polietilenoglicol 20 000), poliéster (polissuccinato de butanodiol) ou polissiloxano polar (cianossiliconas). Nota 5: Existe o risco de os polissiloxanos polares originarem dificuldades na identificação e separação do ácido linolénico e de ácidos em C20. Os revestimentos devem ser finos, isto é, de 0,1 μm a 0,2 μm.

3.1.4.3. Instalação e condicionamento da coluna Observam-se as precauções normais na instalação de colunas capilares, isto é, na colocação da coluna no forno (suporte), escolhe-se a montagem das juntas de forma a garantir a hermeticidade, adaptando as extremidades da coluna no injector e no detector (redução de espaços-mortos). Coloca-se a coluna sob um fluxo de gás vector [por exemplo 0,3 bar (30 KPa) para uma coluna de 25 m de comprimento e 0,3 mm de diâmetro interno]. Condiciona-se a coluna mediante programação de temperatura do forno a uma frequência de 3° C/minuto, desde a temperatura ambiente até uma temperatura 10° C inferior ao limite de decomposição da fase estacionária. Mantém-se o forno a esta temperatura durante 1 hora, até à estabilização da linha base. Voltar a 180° C, para trabalhar sob condições isotérmicas. Nota 6: Encontram-se disponíveis no comércio colunas pré-condicionadas apropriadas.

3.1.5. Detector

O detector deve, de preferência, ter a possibilidade de ser aquecido a uma temperatura superior à coluna.

3.2. Seringa

A seringa deverá ter a capacidade máxima de 10 μl, e ser graduada em divisões de 0,1 μl.

3.3. Registador

No caso de o cálculo da composição da mistura ser efectuado a partir da curva registada, torna-se necessário o uso de um registador de alta precisão, compatível com a restante aparelhagem. As características do registador devem ser:

a) Velocidade de resposta inferior a 1,5 segundos, preferencialmente inferior a 1 segundo (a velocidade de resposta é o tempo requerido para a caneta passar de 0 a 90 %, após a introdução momentânea de um sinal de 100 %);

b) Largura do papel: 20 cm, no mínimo;

c) Velocidade do papel ajustável a valores compreendidos entre 0,4 cm/minuto e 2,5 cm/minuto.

3.4. Integrador ou calculador (opcional)

O uso de um integrador ou calculador electrónico permite a realização de cálculos rápidos e rigorosos. O aparelho a utilizar deve fornecer uma resposta linear com a sensibilidade adequada e a correcção do desvio da linha base deve ser satisfatória.

4. TÉCNICA

As técnicas descritas nos pontos 4.1 a 4.3 referem-se ao uso do detector de ionização de chama.

Em alternativa, poderá usar-se um cromatógrafo gás-líquido equipado com um catarómetro (cujo funcionamento se baseia em alterações da condutibilidade térmica) como detector, tornando-se neste caso necessário modificar as condições operatórias de acordo com o ponto 6.

4.1. Condições operatórias

4.1.1. Selecção das condições óptimas 4.1.1.1. Coluna de enchimento Relativamente à selecção das condições operatórias, devem tomar-se em conta as variáveis seguintes: a) Comprimento e diâmetro da coluna; b) Natureza e quantidade da fase estacionária; c) Temperatura da coluna; d) Fluxo do gás vector; e) Resolução requerida; f) Quantidade da toma de ensaio, escolhida de modo a que o conjunto formado pelo detector e o electrómetro forneça uma resposta linear; g) Duração da análise. De um modo geral, os valores fornecidos nos quadros 1 e 2 conduzem aos resultados desejados, ou seja, um mínimo de 2 000 pratos teóricos por metro de coluna para o estearato de metilo e a sua eluição no intervalo de 15 minutos, aproximadamente. Se o aparelho o permitir, a temperatura do injector deve ser pr