2008R0273 — PT — 01.07.2013 — 001.001

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REGULAMENTO (CE) N.o 273/2008 DA COMISSÃO

de 5 de Março de 2008

que estabelece normas de execução do Regulamento (CE) n.o 1255/1999 do Conselho no que respeita aos métodos a utilizar para a análise e a avaliação da qualidade do leite e dos produtos lácteos







A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS, Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Europeia, Tendo em conta o Regulamento (CE) n.o 1255/1999 do Conselho, de 17 de Maio de 1999, que estabelece a organização comum de mercado no sector do leite e dos produtos lácteos ( 1 ), nomeadamente os artigos 10.o e 15.o, o n.o 3 do artigo 26.o, o n.o 1 do artigo 29.o e o n.o 4 do artigo 31.o, Considerando o seguinte: (1) O Regulamento (CE) n.o 213/2001 da Comissão ( 2 ) estabelece as normas de execução do Regulamento (CE) n.o 1255/1999 do Conselho no que respeita aos métodos a utilizar para a análise e a avaliação da qualidade do leite e dos produtos lácteos. À luz da evolução técnica no domínio das metodologias de análise, é necessário proceder a novas alterações substanciais. Por motivos de clareza e de eficácia e tendo em conta o elevado número e a natureza técnica dessas alterações, o Regulamento (CE) n.o 213/2001 deve ser revogado e ser substituído por um novo regulamento. (2) As características de composição e de qualidade do leite e dos produtos lácteos fixadas no âmbito dos regimes previstos pelo Regulamento (CE) n.o 1255/1999 devem ser verificadas, de modo a garantir o seu cumprimento estrito. (3) Os métodos de referência a utilizar nas referidas verificações são, muitas vezes, métodos publicados por organismos internacionais, como o Comité Europeu de Normalização (CEN), a Federação Internacional dos Lacticínos (FIL), a Organização Internacional de Normalização (ISO) e a AOAC International (associação científica dedicada à excelência analítica), e regularmente actualizados pelos organismos em causa. Em certos casos, encontra-se estabelecido um método de referência comunitário; noutros casos, a regulamentação comunitária não especifica qualquer método de referência. A fim de garantir uma aplicação uniforme dos métodos de referência, deve ser estabelecida uma lista de métodos de referência, prevendo a possibilidade de a Comissão proceder às adaptações dessa lista que venham a revelar-se necessárias. (4) Não deve ser excluída a possibilidade de utilização de métodos de rotina, pelo que interessa especificar as condições mínimas para a sua utilização. (5) Para uma prática uniforme na avaliação dos resultados analíticos, há que estabelecer também procedimentos comuns, o mesmo sucedendo em relação ao exame organoléptico dos produtos em causa e ao reexame dos resultados que sejam objecto de contestação. (6) No que respeita a determinadas análises, não existem actualmente métodos de referência validados de aceitação internacional, pelo que não se encontram disponíveis quaisquer informações sobre variações interlaboratoriais de resultados analíticos. Assim, afigura-se oportuno fixar métodos a nível comunitário, validados em conformidade com normas estabelecidas internacionalmente e que possam ser aplicados como métodos de referência. (7) O Regulamento (CE) n.o 1898/2005 da Comissão ( 3 ) estabelece normas de execução do Regulamento (CE) n.o 1255/1999 do Conselho no que respeita a medidas com vista ao escoamento de nata, manteiga e manteiga concentrada no mercado comunitário e prevê a marcação da nata, da manteiga e da manteiga concentrada em certas circunstâncias, de modo a garantir a correcta utilização final desses produtos. A marcação é importante para um funcionamento adequado do regime. A fim de garantir a igualdade de tratamento de todos os operadores participantes, devem ser estabelecidos métodos comuns para a determinação de alguns desses marcadores. (8) Nos termos do artigo 9.o do Regulamento (CE) n.o 1255/1999, pode ser concedida uma ajuda à armazenagem privada dos queijos à base de leite de ovelha. O artigo 31.o do referido regulamento estipula que os mesmos produtos podem beneficiar de uma restituição especial. Está prevista a importação para a Comunidade em condições preferenciais, a partir de determinados países terceiros, de queijos à base de leite de ovelha, de leite de cabra e de leite de búfala ou de misturas de leites de ovelha, cabra e búfala. Em virtude das disposições supracitadas, é necessário verificar, mediante inspecções adequadas, que não foi incorporado leite de vaca nos produtos em causa. Consequentemente, deve estabelecer-se um método de referência comunitário para a detecção de leite de vaca, sem prejuízo da aplicação de métodos de rotina, desde que conformes a determinados critérios. (9) Nos termos do Regulamento (CEE) n.o 2921/90 da Comissão, de 10 de Outubro de 1990, relativo à concessão de ajudas ao leite desnatado com vista ao fabrico de caseína e de caseinatos ( 4 ), deve comprovar-se a ausência de coliformes. O método de referência internacionalmente aceite para a detecção de coliformes no leite e nos produtos lácteos é a norma ISO 4831. Com base nessa norma, foi estabelecido um método de referência comunitário para a detecção dos coliformes. (10) O Regulamento (CEE) n.o 2658/87 do Conselho, de 23 de Julho de 1987, relativo à nomenclatura pautal e estatística e à pauta aduaneira comum ( 5 ) diferencia as taxas dos direitos aduaneiros aplicáveis aos alimentos compostos para animais abrangidos pela posição pautal 2309, em função do teor de produtos lácteos. A fim de garantir a aplicação uniforme das disposições em causa, há que estabelecer um método de determinação do teor de lactose que mereça aceitação geral e cuja utilização seja obrigatória em todos os Estados-Membros. (11) O Regulamento (CE) n.o 1255/1999 estipula que a manteiga e o leite em pó desnatado destinados a intervenção e o leite em pó desnatado destinado à alimentação animal devem respeitar determinadas exigências de qualidade. É, pois, oportuno fixar métodos de referência para a verificação do cumprimento das referidas exigências. (12) Alguns métodos são estabelecidos pela primeira vez no presente regulamento. Deve ser previsto um prazo suficiente, a partir da data de entrada em vigor do presente regulamento, para que os laboratórios possam introduzir e começar a aplicar correctamente esses métodos. Sempre que um método de referência constante do anexo I seja revisto e publicado pela Organização de Desenvolvimento e Normas, deve ser concedido aos laboratórios um prazo de seis meses para actualizarem os seus procedimentos analíticos, de modo a cumprirem as novas normas. (13) As medidas previstas no presente regulamento estão em conformidade com o parecer do Comité de Gestão do Leite e dos Produtos Lácteos, Considerando o seguinte: ADOPTOU O PRESENTE REGULAMENTO:







CAPÍTULO I

DISPOSIÇÕES GERAIS

Artigo 1.o

Objecto e domínio de aplicação

1. O presente regulamento fixa determinados métodos de referência para a análise química, física e microbiológica e para o exame organoléptico do leite e dos produtos lácteos no âmbito dos regimes previstos pela organização comum de mercado no sector do leite e dos produtos lácteos, estabelecida pelo Regulamento (CE) n.o 1255/1999, bem como as regras de aplicação desses métodos.

2. A lista dos métodos de referência aplicáveis às análises referidas no n.o 1 é estabelecida no anexo I do presente regulamento.

3. A Comissão actualiza a lista em conformidade com o procedimento estabelecido no artigo 42.o do Regulamento (CE) n.o 1255/1999.

Artigo 2.o

Métodos de rotina

Podem ser utilizados métodos de rotina nas análises previstas pela legislação comunitária, na condição de serem devidamente calibrados e regularmente aferidos em relação ao método de referência. Os resultados são comparados tendo em conta os erros sistemáticos, a repetibilidade e a reprodutibilidade.

Em caso de litígio, os resultados obtidos pelo método de referência serão determinantes.

Os Estados-Membros informam a Comissão da utilização de métodos de rotina nas análises referidas no artigo 1.o







CAPÍTUILO II

MÉTODOS DE ANÁLISE

Artigo 3.o

Avaliação da conformidade de uma remessa com os limites legais

Com excepção da análise dos marcadores, o cumprimento das exigências legais de composição é avaliado com base no anexo II do presente regulamento.

Artigo 4.o

Exame organoléptico

1. No que respeita ao leite e aos produtos lácteos, com excepção da manteiga destinada à armazenagem pública, os Estados-Membros utilizam como método de referência para o exame organoléptico a norma IDF 99C:1997 ou outros métodos comparáveis, que comunicam à Comissão.

Para avaliar o desempenho dos provadores e a fiabilidade dos resultados dos exames organolépticos, aplicam-se os procedimentos descritos no anexo III.

2. No que respeita à manteiga destinada à armazenagem pública, aplicam-se os procedimentos descritos no anexo III para avaliar o desempenho dos provadores e a fiabilidade dos resultados dos exames organolépticos.

O método descrito no anexo IV é aplicado como método de referência para o exame organoléptico.

Artigo 5.o

Marcadores

1. O método de análise descrito no anexo V é utilizado como método de referência para a determinação do teor de triglicéridos do ácido enântico na manteiga, no butteroil e na nata.

2. O método de análise descrito no anexo VI é utilizado como método de referência para a determinação da vanilina na manteiga concentrada, na manteiga e na nata.

3. O método de análise descrito no anexo VII é utilizado como método de referência para a determinação do teor de éster etílico do ácido β-apo-8'-caroténico da manteiga concentrada e da manteiga.

4. O método de análise descrito no anexo VIII é utilizado como método de referência para a determinação do teor de β-sitosterol e de estigmasterol da manteiga e da manteiga concentrada.

5. Considera-se que a manteiga concentrada, a manteiga e a nata foram marcadas em conformidade com as regras comunitárias aplicáveis se os resultados obtidos corresponderem às especificações dos pontos 10 e 11 do anexo V e do ponto 8 dos anexos VI, VII e VIII.

Artigo 6.o

Detecção de caseína de leite de vaca

1. O método de análise de referência descrito no anexo IX é utilizado para garantir que o queijo que deve ser produzido exclusivamente com leite de ovelha, leite de cabra ou leite de búfala, ou com misturas de leites de ovelha, cabra e búfala, não contenha caseína de leite de vaca.

Considera-se que se encontra presente caseína de leite de vaca se o teor de caseína de leite de vaca da amostra analisada for igual ou superior ao teor da amostra de referência com 1 % de leite de vaca, conforme é descrito no anexo IX.

2. Os métodos de rotina para a detecção de caseína de leite de vaca nos queijos referidos no n.o 1 podem ser utilizados nas seguintes condições:

a) o limite de detecção é, no máximo, 0,5 % e

b) não podem observar-se falsos resultados positivos e

c) a caseína de leite de vaca é detectável com a sensibilidade requerida, mesmo após longos períodos de cura, como pode acontecer nas condições habituais de comercialização.

Caso alguma das condições acima referidas não seja satisfeita, devem ser usados os métodos de referência descritos no anexo IX.

Artigo 7.o

Detecção de coliformes

Para a detecção de coliformes na manteiga, no leite em pó desnatado, na caseína e nos caseinatos, utiliza-se o método de referência descrito no anexo X.

Artigo 8.o

Determinação do teor de lactose

O teor de lactose dos produtos incluídos na posição NC 2309 é determinado pelo método de referência descrito no anexo XI.

Artigo 9.o

Detecção de soro de coagulação

1. Para a detecção de soro de coagulação no leite em pó desnatado destinado à armazenagem pública, utiliza-se o método de referência descrito no anexo XII.

2. Para a detecção de soro de coagulação no leite em pó desnatado e misturas destinados à alimentação animal, utiliza-se o método de referência descrito no anexo XII. Caso seja detectada a presença de soro de coagulação, deve aplicar-se o anexo XIII.

Artigo 10.o

Detecção de leitelho

Para a detecção de leitelho no leite em pó desnatado, utiliza-se o método de referência descrito no anexo XIV.

Artigo 11.o

Detecção de resíduos de substâncias antimicrobianas

Para a detecção de resíduos de substâncias antimicrobianas no leite em pó desnatado, utiliza-se o método de referência descrito no anexo XV.

Artigo 12.o

Determinação do teor de leite em pó desnatado

Para a determinação do teor de leite em pó desnatado nos alimentos compostos para animais, utiliza-se o método de referência descrito no anexo XVI.

Artigo 13.o

Detecção de amido

Para a detecção de amido no leite em pó desnatado, no leite em pó desnaturado e nos alimentos compostos para animais utiliza-se o método de referência descrito no anexo XVII.

Artigo 14.o

Determinação do teor de humidade da nata desidratada

Para a determinação do teor de humidade da nata desidratada utiliza-se o método de referência descrito no anexo XVIII.

Artigo 15.o

Determinação do teor de humidade do leitelho ácido em pó

Para a determinação do teor de humidade do leitelho ácido em pó destinado a ser incorporado em alimentos para animais, utiliza-se o método de referência descrito no anexo XIX.

Artigo 16.o

Determinação do grau de pureza da matéria gorda láctea

Para a determinação do grau de pureza da matéria gorda láctea, utiliza-se o método de referência descrito no anexo XX.







CAPÍTULO III

DISPOSIÇÕES GERAIS E FINAIS

Artigo 17.o

Garantia da qualidade

As análises são realizadas por laboratórios que disponham de um sistema de garantia da qualidade analítica, incluindo procedimentos internos de controlo da qualidade. Os laboratórios não-acreditados participam em processos de avaliação da proficiência pelo menos uma vez por ano, não devendo os respectivos resultados divergir mais de 2σR (desvio-padrão da reprodutibilidade do método de referência) do valor consensual. Deve encontrar-se disponível para consulta, no laboratório, uma descrição pormenorizada dos sistemas utilizados.

Os laboratórios acreditados em conformidade com as normas referidas no artigo 12.o do Regulamento (CE) n.o 882/2004 do Parlamento Europeu e do Conselho, de 29 de Abril de 2004, relativo aos controlos oficiais realizados para assegurar a verificação do cumprimento da legislação relativa aos alimentos para animais e aos géneros alimentícios e das normas relativas à saúde e ao bem-estar dos animais ( 6 ) ficam isentos da obrigação de participar nessas avaliações da proficiência.

Artigo 18.o

Amostragem e contestação dos resultados das análises

1. A amostragem é efectuada em conformidade com a regulamentação relevante para o produto em causa. Caso não existam disposições específicas relativas à amostragem, aplicam-se as disposições da norma ISO 707IDF 50, Leite e produtos lácteos — Orientações para a amostragem.

2. Os relatórios laboratoriais dos resultados analíticos devem incluir elementos suficientes para a avaliação dos resultados em conformidade com os anexos II e XXI.

3. Para a realização das análises previstas pela legislação comunitária, devem colher-se amostras em duplicado.

4. Se um operador não aceitar determinados resultados analíticos, aplica-se o procedimento descrito no anexo XXI.

5. Se o fabricante conseguir provar, nos cinco dias úteis seguintes à colheita das amostras, que esta não foi efectuada correctamente, procede-se a nova colheita da amostra, na medida do possível. Caso não seja possível colher novas amostras, a remessa deve ser aceite.

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Artigo 19.o-A

Notificações

As notificações a que se refere o artigo 2.o, o artigo 4.o, n.o 1, e o anexo III, ponto C, são efetuadas em conformidade com o Regulamento (CE) n.o 792/2009 da Comissão ( 7 ).

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Artigo 20.o

Revogações

É revogado o Regulamento (CE) n.o 213/2001.

As referências ao regulamento revogado entendem-se como feitas ao presente regulamento, segundo o quadro de correspondência do anexo XXII.

Artigo 21.o

Entrada em vigor

O presente regulamento entra em vigor no terceiro dia seguinte ao da sua publicação no Jornal Oficial da União Europeia.

É aplicável a partir de 31 de Março de 2008.

O presente regulamento é obrigatório em todos os seus elementos e directamente aplicável em todos os Estados-Membros.









ANEXO I

(Artigo 1.o)

LISTA DOS MÉTODOS DE REFERÊNCIA

Índice Mín. = Mínimo, Máx. = Máximo, Anexo = Anexo do regulamento em causa, RSIMG = Resíduo seco isento de matéria gorda, IP = Índice de peróxidos, A = Aspecto, S = Sabor, C = Consistência, CTB = Contagem total de bactérias, Term = Contagem de bactérias termófilas, EM = Estado-Membro, IDF = Federação Internacional dos Lacticínos (FIL), ISO = Organização Internacional de Normalização, IUPAC = União Internacional de Química Pura e Aplicada, ADPI = Instituto Americano dos Lacticínios, LCA = Leite condensado açucarado, LNE = Leite ou nata evaporados.







PARTE A Regulamento da Comissão Produto Parâmetro Limite (1) Método de referência Observações Regulamento (CE) n.o 2771/1999 — Armazenagem pública Manteiga sem sal Matéria gorda Mín. 82 % m/m ISO 17189:2003IDF 194:2003 Água Até 16 % m/m ISO 3727-1:2001IDF 80-1:2001 RSIMG Até 2 % m/m ISO 3727-2:2001IDF 80-2:2001 Acidez da matéria gorda 1,2 mmole/100g de matéria gorda ISO 1740:2004IDF 6:2004 IP (máx.) 0,3 mequiv. oxigénio/1 000 g de matéria gorda ISO 3976:2006IDF 74:2006 Nota 1 Coliformes Não-detectáveis em 1 g Anexo X Nota 3 Matérias gordas não-lácteas Não-detectáveis na análise de triglicéridos Anexo XX Esteróis marcadores Não-detectáveis, β-sitosterol ≤ 40 mg/kg Anexo VIII Outros marcadores — vanilina Não-detectável Anexo VI — éster etílico do ácido caroténico ≤ 6 mg/kg Anexo VII — triglicéridos do ácido enântico Não-detectável Anexo V Características organolépticas Pelo menos 4 pontos em 5 para A, S e C Anexo IV Dispersão da água Pelo menos 4 pontos ISO 7586:1985IDF 112A:1989 Regulamento (CE) n.o 2771/1999 – Armazenagem privada Manteiga sem sal Matéria gorda Mín. 82 % m/m ISO 17189:2003IDF 194:2003 Água Até 16 % m/m ISO 3727-1:2001IDF 80-1:2001 RSIMG Até 2 % m/m ISO 3727-2:2001IDF 80-2:2001 Regulamento (CE) n.o 2771/1999 — Armazenagem privada Manteiga com sal Matéria gorda Mín. 80 % m/m ISO 17189:2003IDF 194:2003 Água Até 16 % m/m ISO 3727-1:2001IDF 80-1:2001 RSIMG (excluindo o sal) Até 2 % m/m ISO 3727-2:2001IDF 80-2:2001 Sal Até 2 % m/m ISO 15648:2004IDF 179:2004 Regulamento (CE) n.o 1898/2005, capítulo II Manteiga sem sal Matéria gorda Mín. 82 % m/m ISO 17189:2003IDF 194:2003 Matérias gordas não-lácteas Anexo XX Água Até 16 % m/m ISO 3727-1 2001IDF 80-1:2001 RSIMG Até 2 % m/m ISO 3727-2:2001IDF 80-2:2001 Marcadores: — esteróis Ver o anexo VIII Anexo VIII — vanilina Ver o anexo VI Anexo VI — éster etílico do ácido caroténico Ver o anexo VII Anexo VII — triglicéridos do ácido enântico Ver o anexo V Anexo V Regulamento (CE) n.o 1898/2005, capítulo II Manteiga com sal Matéria gorda Mín. 80 % m/m ISO 17189:2003IDF 194:2003 Matérias gordas não-lácteas Anexo XX Água Até 16 % m/m ISO 3727-1:2001IDF 80-1:2001 RSIMG (excluindo o sal) Até 2 % m/m ISO 3727-2:2001IDF 80-2:2001 Sal Até 2 % m/m ISO 15648:2004IDF 179:2004 Marcadores: — esteróis Ver o anexo VIII Anexo VIII — vanilina Ver o anexo VI Anexo VI — éster etílico do ácido caroténico Ver o anexo VII Anexo VII — triglicéridos do ácido enântico Ver o anexo V Anexo V Regulamento (CE) n.o 1898/2005, capítulo II Manteiga concentrada Matéria gorda Mín. 99,8 % m/m IDF 24:1964 Água e RSIMG Até 0,2 % m/m ISO 5536:2002IDF 23:2002 (humidade) IDF 24:1964 (RSIMG) Acidez da matéria gorda 1,2 mmole/100g de matéria gorda ISO 1740:2004IDF 6:2004 IP (máx.) 0,5 mequiv. oxigénio/1 000 g de matéria gorda ISO 3976:2006IDF 74:2006 Nota 1 Matérias gordas não-lácteas Ausência Anexo XX Sabor Característico Odor Ausência de odores estranhos Outros Ausência de agentes neutralizantes, antioxidantes e conservantes Marcadores: — esteróis Ver o anexo VIII Anexo VIII — vanilina Ver o anexo VI Anexo VI — éster etílico do ácido caroténico Ver o anexo VII Anexo VII — triglicéridos do ácido enântico Ver o anexo V Anexo V Regulamento (CE) n.o 1898/2005, capítulo II Nata Matéria gorda Mín. 35 % m/m ISO 2450:1999IDF 16 C:1987 Matérias gordas não-lácteas Anexo XX Marcadores: — esteróis Ver o anexo VIII Nota 2 — vanilina Ver o anexo VI Anexo VI — éster etílico do ácido caroténico Ver o anexo VII Nota 2 — triglicéridos do ácido enântico Ver o anexo V Anexo V Regulamento (CE) n.o 1898/2005, capítulo III Manteiga concentrada Matéria gorda Mín. 96 % m/m Nota 2 Matérias gordas não-lácteas Anexo XX RSIMG Até 2 % m/m Nota 2 Marcadores: — estigmasterol (95 % m/m) 15 g/100 kg de manteiga concentrada Anexo VIII — estigmasterol (85 % m/m) 17 g/100 kg de manteiga concentrada Anexo VIII — triglicéridos do ácido enântico 10,34 kg/t de manteiga concentrada Anexo V — éster etílico do ácido butírico e estigmasterol — éster etílico do ácido butírico — estigmasterol: Anexo VIII Nota 2 — éster etílico do ácido butírico e triglicéridos do ácido enântico — éster etílico do ácido butírico — triglicéridos do ácido enântico Anexo V Nota 2 lecitina (E 322) Até 0,5 % m/m Nota 2 NaC1 Até 0,75 % m/m ISO 15648:2004IDF 179:2004 Acidez da matéria gorda 1,2 mmole/100g de matéria gorda ISO 1740:2004IDF 6:2004 IP (máx.) Até 0,5 mequiv. oxigénio/1 000 g de matéria gorda ISO 3976:2006IDF 74:2006 Nota 1 Sabor Característico Odor Ausência de odores estranhos Outros Ausência de agentes neutralizantes, antioxidantes e conservantes Regulamento (CE) n.o 1898/2005, capítulo IV Manteiga sem sal Matéria gorda Mín. 82 % m/m ISO 17189:2003IDF 194:2003 Água Até 16 % m/m ISO 3727-1:2001IDF 80-1:2001 RSIMG Até 2 % m/m ISO 3727-2:2001IDF 80-2:2001 Regulamento (CE) n.o 1898/2005, capítulo IV Manteiga com sal Matéria gorda Mín. 80 % m/m ISO 17189:2003IDF 194:2003 Água Até 16 % m/m ISO 3727-1:2001IDF 80-1:2001 RSIMG (excluindo o sal) Até 2 % m/m ISO 3727-2:2001IDF 80-2:2001 Sal Até 2 % m/m ISO 15648:2004IDF 179:2004 Artigo 9.o e título II do Regulamento (CE) n.o 1255/1999 Queijo de leite de ovelha e/ou de leite de cabra Leite de vaca < 1 % m/m Anexo IX Regulamento (CE) n.o 2921/90 Anexo I — Caseína ácida Água Até 12,00 % m/m ISO 5550:2006IDF 78:2006 Matéria gorda Até 1,75 % m/m ISO 5543:2004IDF127:2004 Acidez livre Até 0,30 ml de solução 0,1 N NaOH/g ISO 5547:1978IDF 91:1979 Regulamento (CE) n.o 2921/90 Anexo I — Caseína-coalho Água Até 12,00 % m/m ISO 5550:2006IDF 78:2006 Matéria gorda Até 1,00 % m/m ISO 5543:2004IDF 127:2004 Cinzas Mín. 7,50 % m/m ISO 5545:1978 IDF 90:1979 Regulamento (CE) n.o 2921/90 Anexo I — Caseinatos Água Até 6,00 % m/m ISO 5550:2006IDF 78:2006 Proteínas lácteas Mín. 88,00 % m/m ISO 5549:1978IDF 92:1979 Matéria gorda e cinzas Até 6,00 % m/m ISO 5543:2004IDF 127:2004 Cinzas fixadas ISO 5544:1978IDF 89:1979 Cinzas ISO 5545:1978IDF 90:1979 Regulamento (CE) n.o 2921/90 Anexo II — Caseína ácida Água Até 10,00 % m/m ISO 5550:2006IDF 78:2006 Matéria gorda Até 1,50 % m/m ISO 5543:2004IDF 127:2004 Acidez livre Até 0,20 ml de solução 0,1 N de NaOH/g ISO 5547:1978IDF 91:1979 CTB (máx.) 30 000/ g ISO 4833:2003 Nota 3 Coliformes Ausência em 0,1 g Anexo X Nota 3 Term. (máx.) 5 000/ g ISO 4833:2003 Notas 3 e 4 Regulamento (CE) n.o 2921/90 Anexo II — Coalho — caseína Água Até 8,00 % m/m ISO 5550:2006IDF 78:2006 Matéria gorda Até 1,00 % m/m ISO 5543:2004IDF 127:2004 Cinzas Mín. 7,50 % m/m ISO 5545:1978IDF 90:1979 CTB (máx.) 30 000/ g ISO 4833:2003 Nota 3 Coliformes Ausência em 0,1 g Anexo X Nota 3 Term. (máx.) 5 000/ g ISO 4833:2003 Notas 3 e 4 Regulamento (CE) n.o 2921/90 Anexo II — Caseinatos Água Até 6,00 % m/m ISO 5550:2006IDF 78:2006 Proteínas lácteas Mín. 88,00 % m/m ISO 5549:1978IDF 92:1979 Matéria gorda e cinzas Até 6,00 % m/m ISO 5543:2004IDF 127:2004 ISO 5544:1978IDF 89:1979 ou ISO 5545:1978IDF 90:1979 CTB (máx.) 30 000/ g ISO 4833:2003 Nota 3 Coliformes Ausência em 0,1 g Anexo X Nota 3 Term. (máx.) 5 000/ g ISO 4833:2003 Notas 3 e 4 Regulamento (CE) n.o 2921/90 Anexo III — Caseinatos Água Até 6,00 % m/m ISO 5550:2006IDF 78:2006 Proteínas lácteas Mín. 85,00 % m/m ISO 5549:1978IDF 92:1979 Matéria gorda Até 1,50 % m/m ISO 5543:2004IDF 127:2004 Lactose Até 1,00 % m/m ISO 5548:2004IDF 106:2004 Cinzas Até 6,50 % m/m ISO 5544:1978IDF 89:1979 ou ISO 5545:1978IDF 90:1979 CTB (máx.) 30 000/ g ISO 4833:2003 Nota 3 Coliformes Ausência em 0,1 g Anexo X Nota 3 Term. (máx.) 5 000/ g ISO 4833:2003 Notas 3 e 4 Regulamento (CE) n.o 2799/1999 Alimentos compostos para animais e leite em pó desnatado (LPD) (para incorporação em alimentos para animais) Água (leitelho ácido em pó) Até 5 % m/m Anexo XIX Proteínas 31,4 % m/m, no mínimo, do resíduo seco isento de matéria gorda ISO 8968-123:2001IDF 20-123:2001 Água (LPD) Até 5 % m/m ISO 5537:2004IDF 26:2004 Matéria gorda (LPD) Até 11 % m/m ISO 1736:2000IDF 9C:1987 Soro de coagulação (LPD) Ausência Anexo XIII Nota 6 Amido (LPD) Ausência Anexo XVII Água (misturas) Até 5 % m/m da matéria não-gorda ISO 5537:2004IDF 26:2004 Matéria gorda (misturas) Directiva 84/4/CEE da Comissão (JO L 15 de 18.1.1984, p. 29) Soro de coagulação (misturas) Ausência Anexo XIII Teor de LPD (do produto final) Mín. 50 % m/m Anexo XVI Matéria gorda (no produto final) Mín. 2.5 % m/m ou 5 % m/m Directiva 84/4/CEE da Comissão (JO L 15 de 18.1.1984, p. 29) Nota 7 Amido (no produto final) Mín. 2 % m/m Anexo XVII Nota 8 Cobre (no produto final) 25 ppm Directiva 78/633/CEE da Comissão (JO L 206 de 26.7.1987, p. 43) Regulamento (CE) n.o 214/2001 LPD (processo spray) Matéria gorda Até 1,0 % m/m ISO 1736:2000IDF 9C:1987 Proteínas 31,4 % (2)m/m, no mínimo, do resíduo seco isento de matéria gorda ISO 8968-1/2:2001IDF 20-1/2:2001 Água Até 3,5 % m/m ISO 5537:2004IDF 26:2004 Acidez Até 19,5 ml de NaOH 0,1 N por 10 g de resíduo seco isentos de matéria gorda ISO 6091:1980IDF 86:1981 Lactatos Até 150 mg/100 g de resíduo seco isento de matéria gorda ISO 8069:2005IDF 69:2005 Fosfatase Negativo ISO 11816-1:2006IDF 155-1:2006 Índice de insolubilidade Até 0,5 ml a 24 °C ISO 8156:2005IDF 129:2005 Partículas queimadas Disco A ou B (15,0 mg) ADPI (1990) CTB 40 000/ g ISO 4833:2003 Nota 3 Coliformes Negativo/0,1 g Anexo X Nota 3 Leitelho Negativo Anexo XIV Soro de coagulação Negativo Anexo XII Soro ácido Negativo Nota 2 Agentes anti-microbianos Anexo XV (1) Sem prejuízo das exigências previstas no regulamento específico. (2) Até 1 de Setembro de 2009, o teor mínimo de proteínas deve atingir os 34 %.







PARTE B Os métodos de referência incluídos na parte B podem ser utilizados para a análise de produtos abrangidos por qualquer dos regulamentos indicados na primeira coluna. Regulamento da Comissão Produto Código NC Parâmetro Limite Método de referência Observações Regulamento (CEE) n.o 2658/87 Regulamento (CE) n.o 2535/2001 Regulamento (CE) n.o 1282/2006 Leite e nata, não concentrados nem adicionados de açúcar ou de outros edulcorantes 0401 Matéria gorda (≤ 6 % m/m) Os limites são os referidos na descrição da posição NC do produto em causa, com as especificações adicionais, quando aplicáveis, que constam do Regulamento (CEE) n.o 3846/87 da Comissão (JO L 366 de 24.12.1987, p. 1), Parte 9 da nomenclatura dos produtos para exportação, ou do Regulamento (CE) n.o 2535/2001 (JO L 341 de 22.12.2001, p. 29) ISO 1211:2001IDF 1D:1996 Matéria gorda (> 6 % m/m) ISO 2450:1999IDF 16C:1987 Leite e nata, concentrados ou adicionados de açúcar ou de outros edulcorantes 0402 Matéria gorda (forma líquida) ISO 1737:1999IDF 13C:1987 Matéria gorda (forma sólida) ISO 1736:2000IDF 9C:1987 Proteínas ISO 8968-123:2001IDF 20-123:2001 Sacarose (teor normal) ISO 2911:2004IDF 35:2004 Sacarose (teor reduzido) Nota 2 Resíduo seco (LCA) ISO 6734:1989IDF 15B:1991 Resíduo seco (LNE) ISO 6731:1989IDF 21B:1987 Água (leite em pó) ISO 5537:2004IDF 26:2004 Água (nata em pó) Anexo XVIII Leitelho, leite e nata fermentados ou acidificados, mesmo concentrados, adicionados de açúcar ou de outros edulcorantes 0403 Matéria gorda ISO 1211:2001IDF 1D:1996 ISO 1736:2000IDF 9C:1987 ISO 2450:1999IDF 16 C:1987 ISO 7208:1999IDF 22B:1987 ISO 8262-3:2005IDF 124-3:2005 Proteínas ISO 8968-123:2001IDF 20-123:2001 Sacarose (teor normal) ISO 2911:2004IDF 35:2004 Sacarose (teor reduzido) Nota 2 Água (leitelho ácido em pó) Anexo XIX Água (leitelho doce em pó) ISO 5537:2004IDF 26:2004 Resíduo seco (outros produtos) Métodos aprovados pela autoridade competente Soro de leite, mesmo concentrado ou adicionado de açúcar ou de outros edulcorantes; produtos constituídos por componentes naturais do leite 0404 Matéria gorda ISO 1736:2000IDF 9C:1987 ISO 2450:1999IDF 16C:1987 ISO 7208:1999IDF 22B:1987 Proteínas ISO 8968-123:2001IDF 20-123:2001 Sacarose (teor normal) ISO 2911:2004IDF 35:2004 Sacarose (teor reduzido) Nota 2 0404 90 Proteínas ISO 8968 1/2 2001IDF 20-1/2:2001 Água IDF 21B:1987 Resíduo seco ISO 6734:1989IDF 15B:1991 (Produtos concentrados) ISO 6731:1989IDF 21B:1987 Manteiga e outras matérias gordas provenientes do leite; pastas de barrar de produtos provenientes do leite 0405 Matéria gorda (se ≤ 85 % m/m) ISO 17189:2003IDF 194:2003 Manteiga Água ISO 3727-1:2001IDF 80-1:2001 RSIMG ISO 3727-2:2001IDF 80-2:2001 NaCl ISO 15648:2004IDF 179:2004 Matéria gorda (se > 99 % m/m) IDF 24:1964 Butteroil Água (se a matéria gorda < 99 % m/m) ISO 5536:2002IDF 23:2002 Queijos e requeijão 0406 Matéria gorda ISO 1735:2004IDF 5:2004 Resíduo seco ISO 5534:2004IDF 4:2004 Resíduo seco (Ricotta) ISO 2920:2004IDF 58:2004 NaCl ISO 5943:2006IDF 88:2006 Lactose ISO 5765-1/2:2002IDF 79-1/2:2002 Regulamento (CEE) n.o 2658/87 Alimentos compostos para animais 2309 Lactose Anexo XI

Notas à lista de métodos de referência da União Europeia:

Nota 1: Isolamento da matéria gorda láctea conforme descrito na norma ISO 1740:1991 (proteção da luz).

Nota 2: Não foi estabelecido qualquer método de referência. Métodos aprovados pela autoridade competente.

Nota 3: Amostras a preparar em conformidade com a norma ISO 8261:2001IDF 122:2001.

Nota 4: Incubação durante 48h à temperatura de 55 °C, deve ter-se o cuidado de evitar a secagem do meio de cultura.

Nota 5: % m/m RSIMG = % m/m resíduo seco — % m/m matéria gorda.

Nota 6: Directiva 84/4/CEE da Comissão.

Nota 7: Regulamento (CE) n.o 2799/1999 da Comissão (JO L 340 de 31.12.1999, p. 3-27).

Nota 8: Directiva 78/633/CEE da Comissão.









ANEXO II

(Artigo 3.o)

AVALIAÇÃO DA CONFORMIDADE DE UMA REMESSA COM OS LIMITES LEGAIS

1. PRINCÍPIO

Nos casos em que a legislação relevante especifica procedimentos de amostragem, esses procedimentos devem ser seguidos. Nos restantes casos, utiliza-se uma amostra com pelo menos três unidades de amostragem, retiradas de forma aleatória da remessa submetida a controlo. Pode ser preparada uma amostra composta. O resultado obtido é comparado com os limites legais através do cálculo de um intervalo de confiança a 95 %, equivalente ao dobro do desvio-padrão, em que o desvio-padrão em causa dependerá: 1) de o método ter sido validado através de cooperação internacional, tendo sido estabelecidos valores para σr e σR, ou 2) caso o método de validação tenha sido desenvolvido internamente, de reprodutibilidade interna calculada. Esse intervalo de confiança corresponde então à incerteza do resultado decorrente do processo de medição.

2. MÉTODO VALIDADO ATRAVÉS DE COOPERAÇÃO INTERNACIONAL

Neste caso, terão sido estabelecidos o desvio-padrão da repetibilidade, σr, e o desvio-padrão da reprodutibilidade, σR, e o laboratório poderá demonstrar a conformidade com as características de desempenho do método validado.

Calcular a média aritmética

n

Calcular a incerteza expandida, (k = 2), de

Se o resultado final da medição, x, for calculado utilizando uma fórmula com a forma x = y 1 + y 2, x = y 1 – y 2, x = y 1 · y 2 ou x = y 1 / y 2, devem seguir-se os procedimentos habituais para a combinação dos desvios-padrão nesses casos.

A remessa será considerada não-conforme com o limite legal máximo, UL, quando:

Caso contrário, será considerada em conformidade com o UL.

A remessa será considerada não-conforme com o limite legal mínimo, LL, quando:

Caso contrário, será considerada em conformidade com o LL.

3. VALIDAÇÃO INTERNA E CÁLCULO DO DESVIO-PADRÃO DA REPRODUTIBILIDADE INTERNA

Se forem utilizados métodos diferentes dos especificados no presente regulamento cujo grau de precisão não tenha sido medido, será necessário proceder a uma validação interna. O desvio-padrão da repetibilidade interna, sir, e o desvio-padrão da reprodutibilidade interna, siR , serão então utilizados em vez de σr e de σ R , respectivamente, nas fórmulas de cálculo da incerteza expandida, U.

As regras de decisão são as que constam do ponto 1. Contudo, se uma remessa for considerada não-conforme com o limite legal, as medições terão de ser repetidas, utilizando o método especificado no presente regulamento, tomando-se em seguida uma decisão em conformidade com o ponto 1.









ANEXO III

(Artigo 4.o)

AVALIAÇÃO DOS PROVADORES E FIABILIDADE DOS RESULTADOS DOS EXAMES ORGANOLÉPTICOS

Indicam-se a seguir os procedimentos aplicáveis caso se utilizem métodos de pontuação (IDF — norma 99C:1997).

A. DETERMINAÇÃO DO «ÍNDICE DE REPETIBILIDADE»

Num período de 12 meses, devem ser analisadas em duplicado por um provador, em teste cego, pelo menos dez amostras. Normalmente, a análise será feita em várias sessões. Os resultados respeitantes a cada característica do produto são avaliados utilizando a seguinte fórmula:

em que:

wI : :índice de repetibilidade

xi1 : pontuação da primeira avaliação da amostra xi

xi2 : pontuação da segunda avaliação da amostra xi

n : número de amostras.

As amostras a avaliar devem ser representativas dos diferentes níveis de qualidade. O valor wI não deve ser superior a 1,5 (numa escala de 5 pontos).

B. DETERMINAÇÃO DO «ÍNDICE DE DESVIO»

Este índice deve ser utilizado para verificar se um provador utiliza a mesma escala de avaliação da qualidade que um grupo de provadores experientes. As pontuações atribuídas pelo provador são comparadas com a média das pontuações atribuídas pelo grupo de provadores.

Os resultados são avaliados de acordo com a seguinte fórmula:

em que:

xi1; xi2 : ver o ponto A)

; : pontuação média atribuída pelo grupo de provadores na primeira e segunda avaliações, respectivamente, da amostra xi

n : número de amostras (pelo menos 10 amostras em cada 12 meses)

As amostras a avaliar devem ser representativas dos diferentes níveis de qualidade. O valor D1 não deve ser superior a 1,5 (numa escala de 5 pontos).

Os Estados-Membros devem comunicar as dificuldades surgidas na aplicação deste procedimento.

Nos casos em que se verifique que um determinado provador excedeu o limite de 1,5 estabelecido para os índices de desvio ou de repetibilidade, o(s) perito(s) da autoridade oficial devem efectuar uma ou várias verificações do desempenho do mesmo, a amostras classificadas por esse provador nas semanas imediatas, ou acompanhar esse provador num ou mais exmaes por ele efectuados. É necessária uma supervisão aprofundada, que permita decidir se devem ou não continuar a utilizar-se os serviços do provador em questão. As constatações desses procedimentos devem ser documentadas e conservadas como elemento de prova para qualquer acção de seguimento.

C. COMPARAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS EM DIFERENTES REGIÕES DO MESMO ESTADO-MEMBRO E EM DIFERENTES ESTADOS-MEMBROS

Pelo menos uma vez por ano será organizado um ensaio que permita comparar os resultados obtidos pelos provadores de diferentes regiões, se for o caso. Se forem detectadas diferenças significativas, devem ser tomadas as medidas necessárias para identificar as razões dessas diferenças e para conseguir resultados comparáveis.

Os Estados-Membros podem organizar ensaios comparativos dos resultados obtidos pelos seus provadores e por provadores de Estados-Membros vizinhos. Caso sejam detectadas diferenças significativas, deve ser efectuado um estudo aprofundado, tendo em vista à obtenção de resultados comparáveis.

Os Estados-Membros devem comunicar à Comissão os resultados desses ensaios comparativos.









ANEXO IV

(Artigo 4.o)

EXAME ORGANOLÉPTICO DA MANTEIGA

1. OBJECTO

O presente método descreve um procedimento uniforme para o exame organoléptico da manteiga, aplicável em todos os Estados-Membros.

Para mais informações, consultar a versão actual da norma internacional IDF para o leite e produtos lácteos, IDF 99 — Partes 1, 2 e 3, relativas aos exames organolépticos.

2. DEFINIÇÕES

Entende-se por: «Exame organoléptico» (avaliação), a apreciação das características de um produto pelos órgãos dos sentidos.

«Júri», um grupo de provadores seleccionados que trabalha, durante a avaliação, sem comunicar e sem exercer quaisquer influências entre si.

«Provador», uma pessoa escolhida pela sua capacidade para a realização de exames organolépticos. O provador poderá ser uma pessoa sem muita experiência.

«Perito provador», uma pessoa com um elevado grau de percepção sensorial e com uma grande experiência em termos de metodologias de avaliação organoléptica, capaz de avaliar de forma coerente e fiável as características organolépticas de diversos produtos. Este tipo de provador terá de dispor de uma boa memória sensorial a longo prazo.

«Pontuação», a avaliação organoléptica pelo júri, utilizando uma escala numérica. Deve ser utilizada uma nomenclatura de defeitos.

«Classificação», uma avaliação qualitativa realizada com base na pontuação.

«Documento de controlo», um documento utilizado para registar as pontuações individuais respeitantes a cada atributo e a classificação final do produto. (Este documento pode ser também utilizado para registar a composição química.)

3. SALA DE PROVA

Para mais informações, consultar as normas ISO 8589 e ISO/DIS 22935-2 IDF 99-2, ponto 7.

Devem ser tomadas precauções para que os provadores na sala de prova não sejam influenciados por factores externos.

A sala de prova deve estar isenta de cheiros estranhos e ser de fácil limpeza. As paredes devem ser de cor clara e não devem produzir reflexos.

A sala de prova e a sua iluminação devem ser tais que as propriedades dos produtos a classificar não sejam afectadas.

A sala deve estar equipada com um dispositivo adequado de controlo termostático, de modo a garantir uma temperatura constante da manteiga. Para a classificação, a manteiga deve encontrar-se a uma temperatura de 12 °C (±2 °C).

4. SELECÇÃO DOS PROVADORES

O provador deve estar familiarizado com as várias manteigas e ter competência para efectuar a classificação organoléptica. Essa competência deve ser avaliada regularmente (pelo menos uma vez por ano) pela autoridade competente.

4.1. Para mais informações sobre as exigências gerais e sobre os ensaios de avaliação que poderão ser efectuados antes da entrada oficial em funções de um novo provador, consultar a norma ISO/DIS 22935-1 IDF 99-1, pontos 4 (recrutamento) e 5.1 É fundamental uma formação contínua e que sejam regularmente organizadas sessões de carácter geral. Para mais informações sobre a formação dos membros do júri, consultar a norma ISO 8586-1.

4.2. A formação inicial deve abranger os seguintes domínios: — Teoria geral e importância prática do exame organoléptico; — Métodos, escalas e descrição das impressões sensoriais; — Detecção e reconhecimento de atributos sensoriais e termos específicos da análise sensorial; — Formação de base sobre o fabrico de manteiga; — Referências e amostras validadas que possam ajudar o provador a identificar sabores específicos e intensidades de sabor de produtos.

5. EXIGÊNCIAS RELATIVAS AO JÚRI

O número de provadores do júri deve ser ímpar, não podendo ser inferior a três. Os provadores devem ser, na sua maioria, funcionários da autoridade competente ou pessoas autorizadas que não trabalhem para a indústria dos laticínios.

O presidente do júri será responsável por todo o procedimento e poderá integrar o júri.

Antes do exame organoléptico, deve atender-se a diversos factores, de modo a optimizar o desempenho dos provadores:

— Os provadores não devem sofrer de nenhuma doença que possa afectar o seu desempenho. Se for esse o caso, o provador em questão deverá ser substituído por outro no júri;

— Os provadores devem apresentar-se com pontualidade para participar no exame organoléptico e certificar-se de que dispõem de tempo suficiente para efectuar o exame;

— Os provadores não poderão utilizar produtos fortemente odoríferos, tais como perfumes, loções para depois do barbear, desodorizantes, etc., e devem evitar alimentos fortemente aromatizados (nomeadamente muito temperados), etc.;

— Os provadores não podem fumar ou comer, nem beber qualquer líquido, com excepção de água, na meia-hora que preceder a avaliação.

6. DESEMPENHO

Todos os provadores devem participar regularmente em júris de exames organolépticos, a fim de conservarem as suas competências. A frequência dessa participação dependerá da quantidade e da produção de manteiga e será, quando possível, pelo menos mensal.

Os provadores mais experientes também devem participar todos os anos em alguns júris, se possível pelo menos uma vez por trimestre.

7. COLHEITA E PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

É essencial que a identidade das amostras não seja divulgada durante a avaliação, de forma a evitar qualquer eventual influência. As amostras devem ser codificadas.

A codificação deve ser organizada antes da avaliação. Deve ser imposta uma exigência de conservação da manteiga a uma determinada temperatura (6 °C ± 2 °C) durante o transporte para a sala de prova.

Quando o exame organoléptico for efectuado num armazém frigorífico, a amostra deve ser colhida utilizando uma sonda para manteiga. Se o exame organoléptico for efectuado noutro local que não um armazém frigorífico, devem ser colhidos pelo menos 500 g de amostra. Durante o exame, a manteiga deve ser conservada a uma temperatura de 12 °C (± 2 °C) (referência: no caso da norma ISO/DIS 22935-2 IDF 99-2, a temperatura de exame da manteiga é de 14 °C ± 2 °C). É fundamental evitar grandes desvios.

8. AVALIAÇÃO DO VALOR DE CADA ATRIBUTO

8.1. O exame organoléptico deve incidir nos três atributos seguintes: aspecto, consistência e sabor O «aspecto» abrange as seguintes características: cor, pureza aparente, ausência de contaminação física, ausência de crescimento de fungos e uniformidade da dispersão aquosa. A dispersão aquosa é verificada pela norma ISO 112A/1989. A «consistência» abrange as seguintes características: corpo, textura e firmeza. A aptidão para barrar da manteiga pode ser verificada através de meios físicos, caso um determinado Estado-Membro o entenda necessário para satisfazer as exigências dos seus consumidores. A Comissão poderá vir a adoptar uma metodologia harmonizada. O «corpo» é um termo relacionado com o grau de coesão do produto, à medida que vai sendo consumido. É normalmente associado à firmeza e à aptidão para barrar e deve ser uniforme em todo o produto. Está estreitamente relacionado com a textura e corresponde à capacidade do produto em termos de conservação da sua forma sob a acção da gravidade. Uma indicação do corpo é a resistência ao corte; pode ser medido mecanicamente ou através de compressão na boca ou entre os dedos. O «sabor» é a característica sentida na boca, fundamentalmente pelas papilas gustativas da língua. O «aroma» é a característica sentida pelo nariz e pelo sentido do olfato. Um desvio significativo da temperatura recomendada impossibilita uma avaliação fiável da consistência e do sabor. Por conseguinte, a temperatura tem uma importância capital. A classificação da manteiga deve ser adiada se a temperatura se encontrar fora do intervalo recomendado.

8.2. Cada atributo deve ser examinado organolepticamente de forma separada. A pontuação é atribuída de acordo com o quadro 1.

8.3. Pode ser desejável que, antes de iniciarem o exame, os provadores pontuem em conjunto o aspecto, consistência e sabor de uma ou mais amostras de referência, de modo a obter-se uniformidade.

8.4. A pontuação para a aceitação é a seguinte: No que respeita à atribuição das pontuações, consultar a parte 7 — Nomenclatura e descrição dos critérios de pontuação.



Máxima Exigida Aspecto 5 4 Consistência 5 4 Sabor/aroma 5 4 — Quando não for obtida a pontuação necessária, devem descrever-se os defeitos verificados. — A pontuação atribuída por cada provador a cada atributo deve ser registada no documento de controlo. — O produto é aceite ou rejeitado com base numa decisão adoptada por maioria. — Não devem ocorrer frequentemente (não mais do que uma vez em cada vinte amostras) casos em que as diferenças entre as pontuações individuais de cada atributo sejam superiores a um ponto. Se tal suceder, o presidente do júri deve verificar a competência do mesmo.

9. SUPERVISÃO

O presidente do júri, que deve ser um funcionário da autoridade competente e poderá integrar o júri, ficará genericamente responsável por todo o procedimento. Compete-lhe registar as pontuações individuais de cada atributo no documento de controlo e certificar a aceitação ou rejeição do produto.

10. NOMENCLATURA

Ver o quadro 2 anexo.

11. REFERÊNCIAS

FIL-IDF 99C:1997 Sensory evaluation of dairy products by scoring — Reference method

ISO/DIS 22935IDF 99 International Standard for Milk and Milk Products — Sensory analysis — Parts 1-3

ISO 8586-1 Sensory analysis — General guidance for selection, training and monitoring of assessors — Part 1

ISO 8589 sensory analysis — General guidance for the design of test rooms

FIL-IDF 112A:1989 Butter — Determination of water dispersion value







Quadro 1 Classificação da manteiga Aspecto Consistência Sabor + aroma Pontos N.o (1) Observações Pontos (classe qualitativa) N.o (1) Observações Pontos (classe qualitativa) N.o (1) Observações 5 Muito bom Tipo ideal Qualidade superior (sem humidade visível) 5 Muito boa Tipo ideal Qualidade superior (fácil de barrar) 5 Muito bom Tipo ideal Qualidade superior (aroma absolutamente puro e perfeito) 4 Bom (2) Sem defeitos evidentes 4 17 18 Boa (2) Dura Mole 4 Bom (2) Sem defeitos evidentes 3 1 2 3 4 5 6 7 8 Razoável (defeitos ligeiros) Aquoso, gotas de água visíveis Não homogéneo, bicolor Raiado Marmoreado Manchado Separação de óleo Coloração demasiado intensa Presença de ar aparente (poroso) 3 14 15 16 17 18 Razoável (defeitos ligeiros) Friável, quebradiça, grumosa Pastosa, massuda, gordurosa Pegajosa Dura Mole 3 21 22 25 27 33 34 35 Razoável (defeitos ligeiros) Impuro Sabor estranho Ácido Sabor a cozinhado, sabor a queimado Sabor a forragem Acre, amargo Demasiado salgado 2 1 3 4 5 6 10 11 12 Fraco (defeitos evidentes) Aquoso, gotas de água visíveis Raiado Marmoreado Manchado Separação de óleo Matérias estranhas Bolorento Sal não-dissolvido 2 14 15 16 17 18 Fraca (defeitos evidentes) Friável, quebradiça, grumosa Pastosa, massuda, gordurosa Pegajosa Dura Mole 2 21 22 23 25 32 33 34 35 36 38 Fraco (defeitos evidentes) Impuro Sabor estranho Sabor a velho Ácido Sabor a oxidado, sabor metálico Sabor a forragem Acre, amargo Demasiado salgado Sabor a bolor, pútrido Sabor a produtos químicos 1 1 3 4 5 6 7 9 10 11 12 Muito fraco (defeitos acentuados) Aquoso, gotas de água visíveis Raiado Marmoreado Manchado Separação de óleo Coloração demasiado intensa Granuloso Matérias estranhas Bolorento Sal não-dissolvido 1 14 15 16 17 18 Muito fraca (defeitos acentuados) Friável, quebradiça, grumosa Pastosa, massuda, gordurosa Pegajosa Dura Mole 1 22 24 25 26 28 29 30 31 32 34 35 36 37 38 Muito fraco (defeitos acentuados) Sabor estranho Sabor a queijo, sabor a queijo ácido Ácido Fermentado Sabor a bolor Rançoso Oleoso, sabor a peixe Seboso Sabor a oxidado, sabor metálico Acre, amargo Demasiado salgado Sabor a bolor, pútrido Sabor a malte Sabor a produtos químicos (1) Quadro 2. (2) Os defeitos da categoria «Bom» correspondem apenas a desvios muito ligeiros do tipo ideal.







Quadro 2 Nomenclatura dos defeitos da manteiga I. Aspecto 1. Aquoso, gotas de água visíveis 2. Não homogéneo, bicolor 3. Raiado 4. Marmoreado 5. Manchado 6. Separação de óleo 7. Coloração demasiado intensa 8. Presença de ar aparente (poroso) 9. Granuloso 10. Matérias estranhas 11. Bolorento 12. Sal não-dissolvido II. Consistência 14. Friável, quebradiça, grumosa 15. Pastosa, massuda, gordurosa 16. Pegajosa 17. Dura 18. Mole III. Sabor e aroma 20. Falta de sabor 21. Impuro (1) 22. Sabor estranho 23. Sabor a velho 24. Sabor a queijo, sabor a queijo ácido 25. Ácido 26. Fermentado 27. a) Sabor a cozido b) Sabor a queimado 28. Sabor a bolor 29. Rançoso 30. Oleoso, sabor a peixe 31. Seboso 32. a) Sabor a oxidado b) Sabor metálico 33. Sabor a forragem 34. Acre, amargo 35. Demasiado salgado 36. Sabor a bolor, pútrido 37. Sabor a malte 38. Sabor a produtos químicos (1) Esta designação só ocasionalmente deve ser utilizada, quando não seja possível uma descrição mais precisa do defeito.









ANEXO V

(Artigo 5.o)

DETERMINAÇÃO DO TEOR DE TRIGLICÉRIDOS DO ÁCIDO ENÂNTICO NA MANTEIGA, NO BUTTEROIL E NA NATA ATRAVÉS DA ANÁLISE DOS TRIGLICÉRIDOS POR CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA

1. OBJECTO

O presente método descreve um procedimento para a determinação do teor de triglicéridos do ácido enântico na manteiga, no butteroil e na nata.

2. TERMOS E DEFINIÇÕES

Teor de ácido enântico: teor de triglicéridos do ácido enântico, determinado pelo procedimento estabelecido no presente método.

Nota: O teor em ácido enântico é expresso em kg por tonelada de produto, no caso da manteiga e do butteroil, e em kg por tonelada de matéria gorda láctea, no caso da nata.

3. PRINCÍPIO

Extrai-se a matéria gorda láctea dos diferentes produtos, segundo a norma ISO 14156 IDF 172:2001. Determina-se quantitativamente o teor de triglicéridos do ácido enântico na matéria gorda extraída por cromatografia em fase gasosa (CG) em coluna capilar. Avalia-se o resultado obtido para a amostra utilizando triglicéridos do ácido capróico como padrão interno.

Nota: A tributirina também apresentou resultados satisfatórios como padrão interno.

4. REAGENTES

Utilizar apenas reagentes de grau analítico reconhecido.

4.1. n-Hexano

4.2. Padrão de triglicéridos do ácido capróico, com grau de pureza mínimo de 99 %

4.3. Padrão de triglicéridos do ácido enântico, com grau de pureza mínimo de 99 %

4.4. Sulfato de sódio anidro (Na2SO4)

5. EQUIPAMENTO

Material corrente de laboratório, nomeadamente:

5.1. Balança analítica de precisão com a aproximação de 1 mg

5.2. Balões aferidos de 10 ml e de 20 ml

5.3. Tubos de centrífuga, com 30 ml

5.4. Evaporador rotativo

5.5. Forno capaz de manter uma temperatura constante de 50 ± 5 °C

5.6. Papel de filtro de porosidade média, com cerca de 15 cm de diâmetro

5.7. Equipamento de cromatografia em fase gasosa 5.7.1. Cromatógrafo em fase gasosa equipado com um injector com ou sem divisor da amostra ou com injecção na coluna e com um detector de ionização por chama (FID) 5.7.2. Coluna para CG, com uma fase estacionária (enchimento) que tenha sido utilizada com sucesso na separação de triglicéridos (100 % de dimetilpolissiloxano ou 5 % de fenilpolissiloxano — 95 % de metilpolissiloxano). Seleccionar a fase estacionária, o comprimento da coluna (entre 4 m e 15 m), o seu diâmetro interno (entre 0,22 mm e 0,5 mm) e a espessura do filme (0,12 μm ou mais) em função da experiência adquirida no laboratório e do sistema de injecção utilizado. A coluna escolhida deve permitir tanto a separação completa entre os picos do solvente e dos triglicéridos do ácido capróico como uma resolução suficiente, ao nível da linha de base, entre os picos dos triglicéridos dos ácidos capróico e enântico. Apresentam-se, em seguida, alguns exemplos das condições aplicáveis. 5.7.2.1. Exemplo de condições aplicáveis (utilização de um injector com divisor da amostra): — Gás transportador: hélio — Pressão à entrada da coluna: 100 kPa — Coluna: coluna com enchimento de sílica fundida, 12 m de comprimento, 0,5 mm de diâmetro interno e 0,1 μm de espessura de filme — Fase estacionária: 100 % de dimetilpolissiloxano ou 5 % de fenilpolissiloxano — 95 % de dimetilpolissiloxano (por exemplo: HT5) — Temperatura na coluna: temperatura inicial de 130 °C, mantida durante 1 minuto, aumentada ao ritmo de 20 °C/min até 260 °C e depois ao ritmo de 30 °C/min até 360 °C; manter a 360 °C durante 10 minutos — Temperatura do detector: 370 °C — Temperatura do injector: 350 °C — Rácio de divisão da amostra: 1:30 — Quantidade de amostra a injectar: 1 μl 5.7.2.2. Exemplo de condições aplicáveis (utilização de um injector na coluna): — Gás transportador: hidrogénio (sistema de fluxo constante) — Pressão à entrada da coluna: 89 kPa — Coluna: coluna com enchimento de sílica fundida, 4 m de comprimento, 0,32 mm de diâmetro interno e 0,25 μm de espessura de filme — Fase estacionária: 5 % de fenilpolissiloxano — 95 % de dimetilpolissiloxano — Temperatura na coluna: temperatura inicial de 60 °C, mantida durante 2 minutos, aumentada ao ritmo de 35 °C/min até 340 °C e mantida a essa temperatura durante 5 minutos — Temperatura do detector: 350 °C — Quantidade de amostra a injectar: 1 μl

5.8. Seringa para injecção, capacidade de 5 μl

6. AMOSTRAGEM

É importante que o laboratório receba uma amostra que seja verdadeiramente representativa e que não tenha sido danificada nem alterada durante o transporte ou armazenagem.

A amostragem não está contemplada no método descrito nesta norma internacional. A norma IDF: standard 50C:1995 ou ISO 707-1997 — Leite e produtos lácteos — Métodos de amostragem descreve um método de amostragem recomendado.

7. PROCEDIMENTO

7.1. Preparação da amostra de ensaio e da toma para análise

Aplicar os procedimentos da norma ISO 14156 IDF 172:2001.

7.1.1. Butteroil, manteiga

7.1.1.1. Derreter 50-100 g da amostra de ensaio no forno (5.5).

7.1.1.2. Colocar 0,5-1,0 g de sulfato de sódio anidro (5.4) num papel de filtro dobrado.

7.1.1.3. Filtrar a matéria gorda através do papel de filtro com sulfato de sódio anidro, recolhendo o filtrado num frasco conservado no forno (5.5). Durante a decantação da manteiga derretida para o papel de filtro, não pode haver transferências de soro.

7.1.2. Nata

7.1.2.1. Aquecer a amostra de ensaio até á temperatura de 20 ± 2 °C.

7.1.2.2. Misturar ou agitar bem a amostra.

7.1.2.3. Diluir uma quantidade adequada de amostra de ensaio de modo a obter 100 ml de toma para análise com uma fracção mássica de matéria gorda aproximadamente igual a 4 %.

7.1.2.4. Aplicar o mesmo procedimento utilizado para o leite crú e para o leite homogeneizado (ver a norma ISO 14156 IDF 172:2001, §8.3), a fim de extrair a matéria gorda da nata.

7.1.2.5. Pesar com uma aproximação de 1 mg, num balão aferido de 10 ml (5.2), 1 g da matéria gorda extraída. Juntar 1 ml da solução 7.2.2. Completar até 10 ml com n-hexano (4.1) e homogeneizar.

7.1.2.6. Colocar 1 ml da solução 7.1.1.2 num balão aferido de 10 ml (5.2) e completar até 10 ml com n-hexano (4.1).

7.2. Preparação dos padrões de calibração

7.2.1. Dissolver 100 mg de triglicéridos do ácido enântico (4.3) em 10 ml de n-hexano (4.1).

7.2.2. Dissolver 100 mg de triglicéridos do ácido capróico (4.2) em 10 ml de n-hexano (4.1).

7.2.3. Colocar 1 ml da solução 7.2.2 num balão aferido de 10 ml (5.2) e completar até 10 ml com n-hexano (4.1).

7.2.4. Colocar 1 ml da solução 7.2.1 e 1 ml da solução 7.2.2 num balão aferido de 10 ml (5.2) e completar até 10 ml com n-hexano (4.1).

7.2.5. Colocar 1 ml da solução 7.2.4 num balão aferido de 10 ml (5.2) e completar até 10 ml com n-hexano (4.1).

7.3. Análise cromatográfica

7.3.1. Injectar duas vezes 1 μl da solução-padrão 7.2.5.

7.3.2. Injectar 1 μl de cada solução de amostra em análise. Nota: Caso seja adoptado o sistema de injecção na coluna, deve utilizar-se uma diluição maior, tanto para as amostras como para as soluções-padrão.

7.3.3. Repetir a operação 7.3.1 a cada 3 amostras, de modo a enquadrar as amostras entre duas injecções de padrão. Os resultados basear-se-ão na média dos factores de resposta dos cromatogramas dos padrões.

8. CÁLCULO DOS RESULTADOS

Em cada cromatograma, integrar a área dos picos correspondentes aos triglicéridos dos ácidos enântico e capróico.

Proceder deste modo em relação a cada uma das sequências entre duas injecções de solução-padrão, ou seja, para cada série de amostras enquadradas, as duas injecções de solução-padrão imediatamente antes dessas amostras funcionarão como primeiro padrão (STD1) e as duas injecções de solução-padrão injectadas imediatamente após as mesmas amostras funcionarão como segundo padrão (STD2).

8.1. Calibração

8.1.1. Calcular o factor de resposta para cada duplicado de STD1, Rf1(a) e Rf1(b): Rf1 (a) ou (b) = (Área do pico de triglicéridos do ácido capróico/Área do pico de triglicéridos do ácido enântico) × 100 Calcular a média dos factores de resposta, Rf1: Rf1 = (Rf1(a) + Rf1(b)) / 2

8.1.2. Calcular, da mesma forma, a média dos factores de resposta de STD2, Rf2.

8.1.3. Calcular a média dos factores de resposta, Rf: Rf = (Rf1 + Rf2) / 2

8.2. Amostras de ensaio

Para cada cromatograma das amostras compreendidas entre o STD1 e o STD2, calcular o teor de ácido enântico, C (kg/t):

C = (Área do pico de triglicéridos do ácido enântico × Rf × 100)/(Área do pico de triglicéridos do ácido capróico × Wt × 1 000)

em que:

— Wt = peso da toma de matéria gorda (g),

— 100 = volume de diluição da amostra,

— 1 000 = factor de conversão (de μg/g para kg/t)

No caso das amostras de manteiga, tomar em consideração o teor de matéria gorda e calcular um valor de concentração corrigido, Cmanteiga (kg/t de manteiga):

Cmanteiga = CMG × F,

em que F teor de matéria gorda da manteiga.

9. PRECISÃO

Apresentam-se no ponto 12 mais informações pormenores sobre um ensaio de comparação interlaboratorial relativo à manteiga em conformidade com as normas ISO 5725-1 e ISO 5725-2, referentes à precisão.

Os valores dos limites de repetibilidade e de reprodutibilidade são expressos em relação ao nível de probabilidade de 95 %, podendo não ser aplicáveis a gamas de concentrações e a matrizes diferentes das referidas.

9.1. Repetibilidade

A diferença absoluta entre dois resultados de ensaio independentes, obtidos por aplicação do mesmo método a matérias em estudo idênticas, no mesmo laboratório e pelo mesmo operador, utilizando o mesmo equipamento num curto intervalo de tempo, não deve exceder em mais de 5 % dos casos 0,35 kg/t.

9.2. Reprodutibilidade

A diferença absoluta entre dois resultados de ensaio independentes, obtidos por aplicação do mesmo método a matérias em estudo idênticas, em laboratórios diferentes, por operadores diferentes, utilizando equipamentos diferentes, não deve exceder em mais de 5 % dos casos 0,66 kg/t.

10. LIMITES DE TOLERÂNCIA: LIMITES INFERIORES (QUANTIDADE INSUFICIENTE)

10.1. Para verificar se o produto foi marcado de forma adequada, devem colher-se três amostras do produto marcado.

10.2. Manteiga e manteiga concentrada 10.2.1. A taxa de incorporação é de 11 kg de triglicéridos do ácido enântico com grau de pureza mínimo de 95 % por tonelada de manteiga, ou seja, 10,45 kg/t. 10.2.2. Os resultados obtidos para as três amostras na análise do produto são utilizados para verificar a taxa e homogeneidade da incorporação do marcador, sendo o menor desses resultados comparado com os seguintes limites: — 9,51 kg/t (95 % da taxa mínima de incorporação de triglicéridos do ácido enântico com grau de pureza mínimo de 95 %, uma única determinação), — 6,89 kg/t (70 % da taxa mínima de incorporação de triglicéridos do ácido enântico com grau de pureza mínimo de 95 %, uma única determinação), — A concentração de marcador da amostra com o resultado mais baixo é conjugada com uma interpolação entre 9,51 kg/t e 6,89 kg/t.

10.3. Nata 10.3.1. A taxa de incorporação é de 10 kg de triglicéridos do ácido enântico com grau de pureza mínimo de 95 % por tonelada de matéria gorda láctea, ou seja, 9,50 kg/tonelada de matéria gorda láctea marcada. 10.3.2. Os resultados obtidos para as três amostras na análise do produto são utilizados para verificar a taxa e homogeneidade da incorporação do marcador, sendo o menor desses resultados comparado com os seguintes limites: — 8,60 kg/t (95 % da taxa mínima de incorporação de triglicéridos do ácido enântico com grau de pureza mínimo de 95 %, uma única determinação), — 6,23 kg/t (70 % da taxa mínima de incorporação de triglicéridos do ácido enântico com grau de pureza mínimo de 95 %, uma única determinação), — A concentração do marcador na amostra com o resultado mais baixo é conjugada com uma interpolação entre 8,60 kg/t e 6,23 kg/t.

11. LIMITES DE TOLERÂNCIA: LIMITES SUPERIORES (QUANTIDADE EXCEDIDA EM MAIS DE 20 %)

11.1. Para verificar se o produto foi marcado de forma adequada, devem colher-se três amostras do produto marcado.

11.2. Manteiga e manteiga concentrada 11.2.1. Os resultados obtidos para as três amostras na análise do produto são utilizados para verificar a taxa e homogeneidade da incorporação do marcador, sendo a média desses resultados comparada com o seguinte limite: — Limite superior: 12,96 kg/t.

11.3. Nata 11.3.1. Os resultados obtidos para as três amostras na análise do produto são utilizados para verificar a taxa e homogeneidade da incorporação do marcador, sendo a média desses resultados comparada com o seguinte limite: — Limite superior: 11,82 kg/t.

12. INFORMAÇÕES ADICIONAIS: ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS DA DETERMINAÇÃO DE TRIENANTOATOS NA MATÉRIA GORDA BUTÍRICA, ATRAVÉS DE ANÁLISE DOS TRIGLICÉRIDOS

Foram efectuados quatro ensaios em colaboração para a determinação do teor de trienantoatos na manteiga marcada.

A primeira prova circular contou com a participação de nove laboratórios, não tendo sido especificado qualquer método analítico a utilizar.

A segunda prova circular contou com a participação de dez laboratórios, tendo sido utilizados quatro métodos diferentes:

— Determinação quantitativa do heptanoato de metilo utilizando n-nonano ou nonanoato de metilo como padrão interno;

— Determinação quantitativa dos trienantoatos utilizando tricaproatos como padrão interno;

— Determinação quantitativa do heptanoato de metilo utilizando uma amostra/mistura de calibração;

— Determinação quantitativa do heptanoato de metilo utilizando uma mistura de calibração.

Por outro lado, no caso das análises de ésteres metílicos de ácidos gordos (FAME), foram utilizados dois procedimentos diferentes de metilação (De Francesco e Christopherson & Glass).

Tendo em conta os resultados obtidos, seleccionaram-se dois métodos para a terceira prova circular:

— Determinação quantitativa do heptanoato de metilo utilizando n-nonano ou nonanoato de metilo como padrão interno;

— Determinação quantitativa dos trienantoatos utilizando tricaproatos como padrão interno.

Os resultados de sete laboratórios mostraram que o método FAME tem uma variabilidade mais elevada, pelo que foi decidido utilizar apenas a determinação dos trienantoatos na forma de triglicéridos, procedendo à determinação quantitativa dos trienantoatos utilizando tricaproatos como padrão interno. A análise dos triglicéridos é efectuada em coluna capilar.

Para a quarta prova circular, foram distribuídas quatro amostras (A, B, C e D), tendo apresentado resultados nove laboratórios (quadros 1-2).

Dois laboratórios (Alemanha e UE) analisaram as amostras pelo método FAME.

Dado o número reduzido de laboratórios, foram efectuados cálculos estatísticos tanto em relação ao conjunto completo de dados (figuras 1-2), incluindo os resultados obtidos pelo método FAME, como em relação aos dados provenientes da análise de triglicéridos.

Determinação de casos anómalos:

— Amostra A. Os testes de Dixon, de Cochran e de Grubbs aos níveis de 1 % e de 5 % evidenciaram um laboratório com resultados anómalos.

— Amostra B. O teste de Grubbs ao nível de 5 % evidenciou um laboratório com resultados anómalos.

— Amostra C. Os testes de Dixon e de Grubbs aos níveis de 1 % e de 5 % evidenciaram um laboratório com resultados anómalos.

— Amostra D. Os testes de Dixon e de Grubbs aos níveis de 1 % e de 5 % evidenciaram um laboratório com resultados anómalos.

O laboratório que apresentou resultados anómalos foi excluído dos cálculos.

Cabe aqui notar que os resultados obtidos pelo método FAME nunca foram considerados anómalos pelos testes efectuados.

Parâmetros de precisão

Os quadros 1 e 2 mostram os resultados de todos os laboratórios e os parâmetros de precisão calculados em relação a um número aceitável de laboratórios (8), mas que, infelizmente, não se referem sempre ao mesmo método analítico.

Os quadros 3 e 4 mostram os resultados obtidos apenas pelo método dos triglicéridos (TG) e os parâmetros de precisão correspondentes. A aceitação desses parâmetros está dependente da aceitação do reduzido número de laboratórios (6).

As figuras 2 e 3 mostram os desvios-padrão da repetibilidade, Sr, e os desvios-padrão da reprodutibilidade, SR, calculados para as quatro amostras, dos dois conjuntos de dados acima descritos.

O quadro 5 mostra os valores de Sr e de SR, juntamente com os correspondentes valores agregados e com os parâmetros r e R globais.

Finalmente, foram calculadas as diferenças críticas para um nível de probabilidade de 95 % (CrD95).







Quadro 1 Resultados estatísticos dos métodos TG + FAME* Amostra A R1 R2 Média Número de laboratórios considerado após eliminação dos casos anómalos 8 RENNES FR1 11,0 11,1 11,1 N.o de casos anómalos 1 RIKILT NL 11,2 11,2 11,2 Casos anómalos DК ZPLA DE* 11,6 11,8 11,7 Valor médio 11,3 ADAS GB 11,4 11,2 11,3 Valor real 11,0 CNEVA FR2 11,4 11,4 11,4 Desvio-padrão da repetibilidade (Sr) 0,09 LODI IT 11,1 11,3 11,2 Desvio-padrão relativo da repetibilidade (RSDr %) 0,80 EELA FI 11,3 11,2 11,3 Repetibilidade r (95 %) 0,26 ISPRA UE* 11,0 11,0 11,0 Repetibilidade relativa r % 2,24 D.V.F.A. DK 13,3 11,8 12,6 Desvio-padrão da reprodutibilidade (SR) 0,23 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (RSDR %) 2,04 Reprodutibilidade R (95 %) 0,84 Reprodutibilidade relativa R % 5,71 Amostra B R1 R2 Média Número de laboratórios considerado após eliminação dos casos anómalos 8 RENNES FR1 12,7 12,8 12,8 N.o de casos anómalos 1 RIKILT NL 13,5 13,3 13,4 Casos anómalos DK ZPLA DE* 14,0 13,8 13,9 Valor médio 13,4 ADAS GB 13,4 13,5 13,5 Valor real 13,5 CNEVA FR2 13,3 13,4 13,4 Desvio-padrão da repetibilidade (Sr) 0,14 LODI IT 13,9 13,5 13,7 Repetitibilidade relativa de sd (RSDr %) 1,04 EELA FI 13,4 13,2 13,3 Repetibilidade r (95 %) 0,40 ISPRA UE* 13,2 13,3 13,3 Repetibilidade relativa r % 2,91 D.V.F.A. DK 14,1 14,8 14,5 Desvio-padrão da reprodutibilidade (SR) 0,35 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (RSDR %) 2,61 Reprodutibilidade R (95 %) 0,99 Reprodutibilidade relativa R % 7,31







Quadro 2 Resultados estatísticos dos métodos TG + FAME* Amostra C R1 R2 Média Número de laboratórios considerado após eliminação dos casos anómalos 8 RENNES FR1 8,9 9,2 9,1 N.o de casos anómalos 1 RIKILT NL 9,2 9,3 9,3 Casos anómalos DK ZPLA DE* 9,2 9,4 9,3 Valor médio 9,3 ADAS GB 9,5 9,3 9,4 Valor real 9,3 CNEVA FR2 9,4 9,4 9,4 Desvio-padrão da repetibilidade (Sr) 0,14 LODI IT 9,2 9,5 9,4 Repetitibilidade relativa de sd (RSDr %) 1,50 EELA FI 9,4 9,6 9,5 Repetibilidade r (95 %) 0,40 ISPRA UE* 9,4 9,3 9,4 Repetibilidade relativa r % 4,20 D.V.F.A. DK 10,7 10,9 10,8 Desvio-padrão da reprodutibilidade (SR) 0,17 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (RSDR %) 1,82 Reprodutibilidade R (95 %) 0,47 Reprodutibilidade relativa R % 5,10 Amostra D R1 R2 Média Número de laboratórios considerado após eliminação dos casos anómalos 8 RENNES R1 1,6 1,6 1,6 N.o de casos anómalos 1 RIKILT NL 2,1 2,1 2,1 Casos anómalos DK ZPLA DE* 2,3 2,3 2,3 Valor médio 2,1 ADAS GB 2,1 2,2 2,2 Valor real 2,1 CNEVA FR2 2,1 2,1 2,1 Desvio-padrão da repetibilidade (Sr) 0,08 LODI IT 2,2 1,9 2,1 Desvio-padrão relativo da repetitibilidade (RSDr %) 3,81 EELA FI 2,3 2,3 2,3 Repetibilidade r (95 %) 0,22 ISPRA UE* 2,3 2,3 2,3 Repetibilidade relativa r % 10,67 D.V.F.A. DK 3,4 2,9 3,2 Desvio-padrão da reprodutibilidade (SR) 0,24 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (RSDR %) 11,43 Reprodutibilidade R (95 %) 0,67 Reprodutibilidade relativa R % 32,00







Quadro 3 Resultados estatísticos dos métodos TG + FAME* Amostra A R1 R2 Média Número de laboratórios considerado após eliminação dos casos anómalos 6 RENNES FR1 11,0 11,1 11,1 N.o de casos anómalos 1 RIKILT NL 11,2 11,2 11,2 Casos anómalos DК ADAS GB 11,4 11,2 11,3 Valor médio 11,2 CNEVA FR2 11,4 11,4 11,4 Valor real 11,0 LODI IT 11,1 11,3 11,2 Desvio-padrão da repetibilidade (Sr) 0,09 EELA FI 11,3 11,2 11,3 Desvio-padrão relativo da repetitibilidade (RSDr %) 0,80 D.V.F.A. DK 13,3 11,8 12,6 Repetibilidade r (95 %) 0,25 Repetibilidade relativa r % 2,24 Desvio-padrão da reprodutibilidade (SR) 0,13 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (RSDR %) 1,16 Reprodutibilidade R (95 %) 0,36 Reprodutibilidade relativa R % 3,25 Amostra B R1 R2 Média Número de laboratórios considerado após eliminação dos casos anómalos 6 RENNES FR1 12,7 12,8 12,8 N.o de casos anómalos 1 RIKILT NL 13,5 13,3 13,4 Casos anómalos DК ADAS GB 13,4 13,5 13,5 Valor médio 13,3 CNEVA FR2 13,3 13,4 13,4 Valor real 13,5 LODI IT 13,9 13,5 13,7 Desvio-padrão da repetibilidade (Sr) 0,15 EELA FI 13,4 13,2 13,3 Desvio-padrão relativo da repetitibilidade (RSDr %) 1,13 D.V.F.A. DK 14,1 14,8 14,5 Repetibilidade r (95 %) 0,42 Repetibilidade relativa r % 3,16 Desvio-padrão da reprodutibilidade (SR) 0,33 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (RSDR %) 2,48 Reprodutibilidade R (95 %) 0,93 Reprodutibilidade relativa R % 6,94







Quadro 4 Resultados estatísticos do método TG Amostra C R1 R2 Média Número de laboratórios considerado após eliminação dos casos anómalos 6 RENNES FR1 8,9 9,2 9,1 N.o de casos anómalos 1 RIKILT NL 9,2 9,3 9,3 Casos anómalos DК ADAS GB 9,5 9,3 9,4 Valor médio 9,3 CNEVA FR2 9,4 9,4 9,4 Valor real 9,3 LODI IT 9,2 9,5 9,4 Desvio-padrão da repetibilidade (Sr) 0,15 EELA FI 9,4 9,6 9,5 Desvio-padrão relativo da repetitibilidade (RSDr %) 1,61 D.V.F.A. DK 10,7 10,9 10,8 Repetibilidade r (95 %) 0,42 Repetibilidade relativa r % 4,51 Desvio-padrão da reprodutibilidade (SR) 0,19 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (RSDR %) 2,04 Reprodutibilidade R (95 %) 0,53 Reprodutibilidade relativa R % 5,71 Amostra D R1 R2 Média Número de laboratórios considerado após eliminação dos casos anómalos 6 RENNES FR1 1,6 1,6 1,6 N.o de casos anómalos 1 RIKILT NL 2,1 2,1 2,1 Casos anómalos DK Valor médio 2,1 ADAS GB 2,1 2,2 2,2 Valor real 2,1 CNEVA FR2 2,1 2,1 2,1 Desvio-padrão da repetibilidade (Sr) 0,09 LODI IT 2,2 1,9 2,1 Desvio-padrão relativo da repetibilidade (RSDr %) 4,29 EELA FI 2,3 2,3 2,3 Repetibilidade r (95 %) 0,26 D.V.F.A. DK 3,4 2,9 3,2 Repetibilidade relativa 12,01 Desvio-padrão da reprodutibilidade (SR) 0,25 Desvio-padrão relativo da reprodutibilidade (RSDR %) 11,90 Reprodutibilidade R (95 %) 0,69 Reprodutibilidade relativa R % 33,32







Quadro 5 Repetibilidade e reprodutibilidade (com o método FAME) N.o de laboratórios anómalos Casos anómalos Repetibilidade Sr (95 %) Reprodutibilidade SR (95 %) Amostra A 8 1 0,09 0,23 Amostra B 8 1 0,14 0,35 Amostra C 8 1 0,14 0,17 Amostra D 8 1 0,08 0,24 Valor ponderado 0,116 0,256 R R Valor agregado * 2,8 0,324 0,716 CrD95 = 0,40 Grau de pureza mínima estabelecido para os trienantoatos = 95 % Limite mínimo estabelecido para os trienantoatos na matéria gorda butírica = 11 kg/t Tomando em consideração a diferença crítica para um nível de probabilidade de 95 %, a média dos dois resultados não deve ser inferior a: no caso de incorporação de trienantoatos com grau de pureza de 95 %, 10,05 kg/t.







Repetibilidade e reprodutibilidade (sem o método FAME) N.o de laboratórios Casos anómalos Repetibilidade Sr (95 %) Reprodutibilidade SR (95 %) Amostra A 6 1 0,09 0,13 Amostra B 6 1 0,15 0,33 Amostra C 6 1 0,15 0,19 Amostra D 6 1 0,09 0,25 Valor agregado 0,124 0,237 r R Valor agregado * 2,8 0,347 0,663 CrD95 = 0,36 Grau de pureza mínima estabelecido para os trienantoatos = 95 % Limite mínimo estabelecido para os trienantoatos na matéria gorda butírica = 11 kg/t Tomando em consideração a diferença crítica para um nível de probabilidade de 95 %, a média dos dois resultados não deve ser inferior a: no caso de incorporação de trienantoatos com grau de pureza de 95 %, 10,09 kg/t.

Figura 1 ( 8 )

Resultados experimentais: Amostra A

Resultados experimentais: Amostra B

Resultados experimentais: Amostra C

Resultados experimentais: Amostra D

Figura 2

Desvio-padrão da repetibilidade e da reprodutivibilidade (TG+FAME)

Figura 3

Desvio-padrão da repetibilidade e da reprodutivibilidade (TG)

Figura 4

Exemplo com utilização de injector na coluna









ANEXO VI

(Artigo 5.o)

DETERMINAÇÃO DO TEOR DE VANILINA DA MANTEIGA CONCENTRADA, MANTEIGA OU NATA POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA

1. OBJECTO E ÂMBITO DE APLICAÇÃO

O presente método descreve um procedimento para a determinação quantitativa de vanilina na manteiga concentrada, na manteiga ou na nata.

2. PRINCÍPIO

Extracção de uma quantidade conhecida de amostra utilizando uma mistura de isopropanol/etanol/acetonitrilo (1:1:2). Precipitação da maior parte da matéria gorda por refrigeração a uma temperatura compreendida entre –15 °C e –20 °C, seguida de centrifugação.

Após diluição com água, determinação do teor de vanilina por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).

3. EQUIPAMENTO

Material corrente de laboratório, nomeadamente:

3.1. Congelador apto a funcionar a temperaturas compreendidas entre –15 °C e –20 °C.

3.2. Seringas descartáveis de 2 ml.

3.3. Microfiltros de membrana com poros de 0,45 μm, resistentes a uma solução com 5 % de solução de extracção (4.4).

3.4. Sistema de cromatografia líquida constituído por uma bomba (caudal de 1,0 ml/minuto), um injector (injecção automática ou manual de 20 μl), um detector de UV (regulado para 306 nm, com 0,01 Å para toda a escala), um registador ou integrador e um termóstato de coluna regulado para 25 °C.

3.5. Coluna analítica (250 mm × 4,6 mm de diâmetro interno) com enchimento LiChrospher RP 18 (Merck, 5 μm) ou equivalente.

3.6. Pré-coluna (cerca de 20 mm × 3 mm de diâmetro interno) com enchimento a seco de LiChrospher RP 18 (5-10 μm) ou equivalente.

3.7. Centrifugadora que atinja uma velocidade de 2 000 rpm.

4. REAGENTES

Todos os reagentes utilizados devem ser de qualidade analítica reconhecida.

4.1. Isopropanol.

4.2. Etanol a 96 % (v/v).

4.3. Acetonitrilo.

4.4. Solução de extracção Misturar isopropanol (4.1), etanol (4.2) e acetonitrilo (4.3) na proporção 1:1:2 (v/v).

4.5. Vanilina (4-hidroxi-3-metoxibenzaldeído) ≥ 98 % 4.5.1. Solução de reserva de vanilina (500 μg/ml) Pesar, com a aproximação de 0,1 mg, cerca de 50 mg (CM mg) de vanilina (4.5) num balão aferido de 100 ml, adicionar 25 ml de solução de extracção (4.4) e completar com água. 4.5.2. Solução-padrão de vanilina (10 μg/ml) Pipetar 5 ml de solução de reserva de vanilina (4.5.1) para um balão aferido de 250 ml e completar com água. 4.5.3. Metanol para HPLC 4.5.4. Ácido acético glacial 4.5.5. Água para HPLC 4.5.6. Fase móvel para HPLC Misturar 300 ml de metanol (4.5.3) com cerca de 500 ml de água (4.5.5) e 20 ml de ácido acético (4.5.4) num balão aferido de 1 000 ml, completando o volume com água (4.5.5). Filtrar através de um filtro de 0,45 μm (3.3).

5. PROCEDIMENTO

5.1. Preparação da amostra de ensaio

5.1.1. Manteiga

Aquecer a amostra até a mesma começar a fundir. Evitar sobreaquecimentos locais a cerca de 30 °C. A manteiga não pode, em caso algum, separar-se em duas fases. Quando a amostra se tornar suficientemente plástica, homogenizá-la por agitação. Mexer a manteiga durante 15 s antes de retirar uma amostra. Pesar cerca de 5 g (SM g) de manteiga, com a aproximação de 1 mg, num balão aferido de 100 ml.

5.1.2. Manteiga concentrada

Imediatamente antes da recolha da amostra, colocar o recipiente com a manteiga concentrada numa estufa regulada para 40-50 °C, até à fusão completa. Misturar a amostra agitando ou mexendo e evitando a formação de bolhas de ar devido a uma agitação excessiva. Pesar cerca de 4 g (SM g) de manteiga concentrada, com a aproximação de 1 mg, num balão aferido de 100 ml.

5.1.3. Nata

Aquecer a amostra em banho-maria ou numa estufa a uma temperatura de 35-40 °C. Repartir a matéria gorda de forma homogénea por agitação e, se necessário, mexendo. Arrefecer rapidamente a amostra até 20 ± 2 °C. A amostra deve apresentar um aspecto homogéneo; caso contrário, recomeçar a operação. Pesar cerca de 10 g (SM g) de nata, com a aproximação de 1 mg, num balão aferido de 100 ml.

5.2. Preparação da solução a analisar

Adicionar cerca de 75 ml de solução de extracção (4.4) à amostra de ensaio (5.1.1, 5.1.2 ou 5.1.3), agitar ou sacudir vigorosamente durante cerca de 15 minutos e completar o volume com a solução de extracção (4.4). Transferir cerca de 10 ml do extracto obtido para um tubo de ensaio munido de rolha. Colocar o tubo no frigorífico (3.1) e deixar em repouso cerca de 30 minutos. Centrifugar o extracto frio durante 5 minutos a cerca de 2 000 rpm e decantar de imediato. Deixar a solução decantada atingir a temperatura ambiente. Pipetar 5 ml da solução decantada para um balão aferido de 100 ml e completar o volume com água. Filtrar uma alíquota através de um microfiltro de membrana (3.3), utilizando uma seringa (3.2). O filtrado encontra-se pronto para a determinação por HPLC.

5.3. Calibração

Pipetar 5 ml de solução-padrão de vanilina (4.5.2) para um balão aferido de 100 ml. Adicionar 5 ml de solução de extracção (4.4) e completar com água até à marca. A concentração de vanilina desta solução é de 0,5 μg/ml.

5.4. Determinação por HPLC

Estabilizar o sistema cromatográfico durante cerca de 30 minutos. Injectar a solução-padrão (5.3). Repetir o procedimento até que a diferença entre as áreas ou alturas dos picos correspondentes a duas injecções consecutivas seja inferior a 2 %. Nas condições descritas, o tempo de retenção da vanilina é de cerca de 9 minutos. Analisar a solução-padrão (5.3) em duplicado, injectando um volume de 20 μl. Injectar 20 μl das soluções a analisar (5.2). Determinar a área ou a altura de cada pico de vanilina obtido. Repetir a injecção duplicada de solução-padrão (5.3) após cada 10 injecções da solução a analisar (5.2).

6. CÁLCULO DOS RESULTADOS

Calcular a área (ou a altura) média (AC) dos picos da vanilina correspondentes às injecções de cada lote de soluções a analisar injectadas entre duplicados da solução-padrão (quatro áreas ou alturas no total).

Calcular o factor de resposta (R):

em que CM representa a massa de vanilina em mg (4.5.1).

O teor (mg/kg) de vanilina (C) da amostra em análise é dado pela seguinte fórmula:

em que:

AS = área ou altura do pico de vanilina correspondente à amostra em análise

SM = massa da amostra em análise, em g (5.1.1, 5.1.2 ou 5.1.3)

Nota: Na determinação do teor de vanilina da nata, deve exprimir-se a concentração do marcador em mg/kg de matéria gorda butírica, multiplicando C por 100/f, sendo f o teor de matéria gorda da nata, expresso em % (m/m).

20 = factor relacionado com as diluições da solução-padrão e da amostra a analisar

0,96 = factor de correcção do teor de matéria gorda da primeira diluição da amostra a analisar

Nota: Podem utilizar-se as alturas dos picos, em vez da área respectiva (ver o ponto 8.3).

7. PRECISÃO DO MÉTODO

7.1. Repetibilidade (r)

A diferença entre os resultados de duas determinações, efectuadas com o menor intervalo de tempo possível pelo mesmo operador, utilizando o mesmo equipamento, com materias de ensaio idênticas, não deve exceder 16 mg/kg.

7.2. Reprodutibilidade (R)

A diferença entre os resultados de duas determinações, efectuadas por operadores de laboratórios diferentes, utilizando equipamentos diferentes, com matérias de ensaio idênticas, não deve exceder 27 mg/kg.

8. LIMITES DE TOLERÂNCIA

8.1. Para verificar a homogeneidade da marcação do produto, devem colher-se três amostras do produto marcado.

8.2. Marcador obtido a partir de baunilha ou de vanilina sintética 8.2.1. A taxa de incorporação de 4-hidroxi-3-metoxibenzaldeído é de 250 g por tonelada de manteiga concentrada ou de manteiga. No caso da marcação de nata, a taxa de incorporação é de 250 g por tonelada de matéria gorda láctea. 8.2.2. Os resultados obtidos para as três amostras na análise do produto são utilizados para verificar a taxa e homogeneidade da incorporação do marcador, sendo o menor desses resultados comparado com os seguintes limites: — 220,8 mg/kg (95 % da taxa mínima de incorporação), — 158,3 mg/kg (70 % da taxa mínima de incorporação). A concentração de marcador da amostra com o resultado mais baixo é conjugada com uma interpolação entre 220,8 mg/kg e 158,3 mg/kg.

8.3. Marcador obtido exclusivamente a partir de vagens de baunilha ou de extractos integrais de vagens de baunilha 8.3.1. A taxa de incorporação de 4-hidroxi-3-metoxibenzaldeído é de 100 g por tonelada de manteiga concentrada ou de manteiga. No caso marcação de nata, a taxa de incorporação é de 100 g por tonelada de matéria gorda láctea. 8.3.2. Os resultados obtidos para as três amostras na análise do produto são utilizados para verificar a taxa e homogeneidade da incorporação do marcador, sendo o menor desses resultados comparado com os seguintes limites: — 78,3 mg/kg (95 % da taxa mínima de incorporação), — 53,3 mg/kg (70 % da taxa mínima de incorporação). A concentração de marcador na amostra com o resultado mais baixo é conjugada com uma interpolação entre 78,3 mg/kg e 53,3 mg/kg.

9. NOTAS

9.1. Para uma taxa de incorporação de 250 mg/kg de butteroil, a taxa de recuperação da vanilina adicionada varia entre 97,0 e 103,8. O teor médio determinado foi de 99,9 %, com um desvio-padrão de 2,7 %.

9.2. A solução-padrão contém 5 % de solução de extracção, para compensar o alargamento dos picos provocado pela presença de 5 % da solução de extracção das amostras a analisar. A quantificação pode, assim, ser feita com base na altura dos picos.

9.3. A análise baseia-se numa curva de calibração linear, com ordenada na origem igual a zero.

9.4. Utilizando para o efeito diluições apropriadas da solução-padrão (4.5.2), deve confirmar-se a linearidade na primeira vez que se efectuem as análises e, posteriormente, a intervalos regulares e depois de qualquer modificação ou reparação do equipamento de HPLC. A vanilina pode ser degradada em ácido vanilínico, divalinina ou noutros compostos pela actividade de enzimas intrínsecos da nata não-pasteurizada ou de produtos à base dessa nata.









ANEXO VII

(Artigo 5.o)

DETERMINAÇÃO DO TEOR DE ÉSTER ETÍLICO DO ÁCIDO β-APO-8'-CAROTÉNICO NA MANTEIGA CONCENTRADA E NA MANTEIGA POR ESPECTROMETRIA

1. Objecto e âmbito de aplicação

O presente método descreve um procedimento para a determinação quantitativa do éster etílico do ácido β-apo-8'-caroténico (éster apo-caroténico) na manteiga concentrada e na manteiga. O éster apo-caroténico representa a soma de todas as substâncias presentes num extracto de amostras obtido nas condições descritas no método, que absorve luz a 440 nm.

2. Princípio

Dissolve-se a matéria gorda butírica é dissolvida em éter de petróleo e mede-se a absorvância a 440 nm. Dtermina-se o teor de éster apo-caroténico em relação a um padrão externo.

3. Equipamento

3.1. Pipetas graduadas, com capacidades de 0,25, 0,50, 0,75 e 1,0 ml.

3.2. Espectrofotómetro adequado para utilização a 440 nm (e na gama de 447-449 nm), equipado com células com 1 cm de percurso óptico.

3.3. Balões aferidos de 20 ml e 100 ml.

3.4. Balança analítica capaz de pesar com a aproximação de 1 mg, com leitura das décimas de miligrama.

3.5. Estufa, 45 ± 1 °C.

3.6. Filtros sem cinzas, de filtração rápida.

4. Reagentes

Todos os reagentes devem ser de grau analítico reconhecido.

4.1. Suspensão de éster apo-caroténico (aproximadamente 20 %) 4.1.1. Determinar o teor da suspensão do seguinte modo: Aquecer a suspensão a 45-50 °C e homogeneizar na embalagem original, sem a abrir. Pesar cerca de 400 mg num balão aferido de 100 ml, dissolver em 20 ml de clorofórmio (4.4) e completar o volume com ciclo-hexano (4.5). Diluir 5 ml desta solução até 100 ml, com ciclo-hexano (solução A). Diluir 5 ml de solução A até 100 ml, com ciclo-hexano. Medir a absorvância a 447-449 nm (medir a absorvância máxima em relação a um branco de ciclo-hexano, utilizando células com 1 cm de percurso óptico). Teor de éster apo-caroténico, P (%) = (Absmáx × 40 000)/(Msusp × 2 550) ou: (Absmax /2 550) × (100/5) × (100/5) × (100/Msusp) Absmax = absorvância máxima da solução medida Msusp = massa da suspensão (g) 2 550 = valor de referência da absorvância (1 %, 1 cm) P = Pureza (teor) da suspensão (%) Nota: A suspensão de éster ap-ocaroténico é sensível ao ar, ao calor e à luz. Pode ser armazenada durante cerca de doze meses em local fresco, no recipiente original fechado (selado em atmosfera de azoto). Após abertura, o conteúdo deve ser utilizado num prazo curto. 4.1.2. Solução-padrão de éster apo-caroténico, aproximadamente 0,2 mg/ml Pesar cerca de 0,100 g, com a aproximação de 1 mg, de suspensão de éster apo-caroténico (4.1.1) (W), dissolver em éter de petróleo (4.2), transferir quantitativamente para um balão aferido de 100 ml e completar o volume até à marca com éter de petróleo. Esta solução contém (W × P) / 10 mg/ml de éster apo-caroténico. Nota: A solução deve ser armazenada em local fresco, ao abrigo da luz. Eliminar a solução que não tenha sido utilizada no prazo de um mês.

4.2. Éter de petróleo (40-60 °C).

4.3. Sulfate de sódio anidro granulado, previamente seco a 102 °C durante duas horas.

4.4. Clorofórmio.

4.5. Ciclo-hexano.

5. PROCEDIMENTO

5.1. Preparação da amostra de ensaio

5.1.1. Manteiga concentrada

Derreter a amostra numa estufa a cerca de 45 °C.

5.1.2. Manteiga

Derreter a amostra numa estufa a cerca de 45 °C e filtrar uma quantidade representativa com um filtro que contenha cerca de 10 g de sulfato de sódio anidro (4.3), ao abrigo de luz forte natural ou artificial e mantendo uma temperatura de 45 °C. Recolher uma quantidade apropriada de matéria gorda butírica.

5.2. Determinação

Pesar, com a aproximação de 1 mg, cerca de 1 g de manteiga concentrada (ou de matéria gorda butírica separada (5.1.2)), (M). Transferir quantitativamente para um balão aferido de 20 ml (V), utilizando éter de petróleo (4.2), completar até à marca e misturar cuidadosamente.

Transferir uma alíquota para uma célula de 1 cm e medir a absorvância a 440 nm, em relação a um branco de éter de petróleo. Obter a concentração de éster apo-caroténico na solução a partir da curva de calibração (C μg/ml).

5.3. Calibração

Pipetar 0, 0,25, 0,5, 0,75 e 1,0 ml de solução-padrão de éster apo-caroténico (4.1.2) para cinco balões aferidos de 100 ml. Diluir com éter de petróleo (4.2) até completar o volume e misturar.

As concentrações aproximadas das soluções variam de 0 a 2 μg/ml e são calculadas rigorosamente a partir da concentração da solução-padrão (4.1.2) (W × P)/10 mg/ml. Medir as absorvâncias a 440 nm, em relação a um branco de éter de petróleo (4.2).

Traçar um gráfico com os valores da absorvância no eixo das ordenadas e as concentrações de éster apo-caroténico no eixo das abcissas. Calcular a equação da curva-padrão.

6. CÁLCULO DOS RESULTADOS

6.1. O teor de éster apo-caroténico, expresso em mg/kg de produto, é dado por: Manteiga concentrada: (C × V)/M Manteiga: 0,82 (C × V)M em que: C = teor de éster apo-caroténico (μg/ml) obtido a partir da curva de calibração (5.3) V = volume (ml) da solução de ensaio (5.2) M = massa (g) da toma para análise (5.2) 0,82 = factor de correcção, devido ao teor de matéria gorda da manteiga

7. PRECISÃO DO MÉTODO

7.1. Repetibilidade

7.1.1. Análise da manteiga

A diferença entre os resultados de duas determinações, efectuadas com o menor intervalo de tempo possível pelo mesmo operador, utilizando o mesmo equipamento, com matérias de ensaio idênticas, não deve exceder 1,4 mg/kg.

7.1.2. Análise da manteiga concentrada

A diferença entre os resultados de duas determinações, efectuadas com o menor intervalo de tempo possível pelo mesmo operador, utilizando o mesmo equipamento, matérias de ensaio idênticas, não deve exceder 1,6 mg/kg.

7.2. Reprodutibilidade

7.2.1. Análise da manteiga

A diferença entre os resultados de duas determinações, efectuadas por operadores de laboratórios diferentes, utilizando equipamentos diferentes, com matérias de ensaio idênticas, não deve exceder 4,7 mg/kg.

7.3. Análise da manteiga concentrada

A diferença entre os resultados de duas determinações, efectuadas por operadores de laboratórios diferentes, utilizando equipamentos diferentes, com matérias de ensaio idênticas, não deve exceder 5,3 mg/kg.

7.4. Fonte dos parâmetros de precisão

Os parâmetros de precisão foram determinados com base em testes efectuados em 1995, em onze laboratórios, a doze amostras marcadas de manteiga (seis duplicados em teste cego) e doze amostras marcadas de manteiga concentrada (seis duplicados em teste cego).

8. LIMITES DE TOLERÂNCIA

8.1. Para verificar se o produto foi marcado de forma adequada, devem colher-se três amostras do produto marcado.

8.2. Manteiga 8.2.1. A taxa de incorporação para a manteiga, tendo em conta a absorvância de fundo, é de 22 mg/kg. 8.2.2. Os resultados obtidos para as três amostras na análise do produto são utilizados para verificar a taxa e homogeneidade da incorporação do marcador, sendo o menor desses resultados comparado com os seguintes limites: — 17,7 mg/kg (95 % da taxa mínima de incorporação), — 12,2 mg/kg (70 % da taxa mínima de incorporação). A concentração de marcador da amostra com o resultado mais baixo é conjugada com uma interpolação entre 17,7 mg/kg e 12,2 mg/kg.

8.3. Manteiga concentrada 8.3.1. A taxa de incorporação para a manteiga concentrada, tendo em conta a absorvância de fundo, é de 24 mg/kg. Os resultados obtidos para as três amostras na análise do produto são utilizados para verificar a taxa e homogeneidade da incorporação do marcador, sendo o menor desses resultados comparado com os seguintes limites: — 19,2 mg/kg (95 % da taxa mínima de incorporação), — 13,2 mg/kg (70 % da taxa mínima de incorporação). A concentração de marcador da amostra com o resultado mais baixo é conjugada com uma interpolação entre 19,2 mg/kg e 13,2 mg/kg.









ANEXO VIII

(Artigo 5.o)

DETERMINAÇÃO DO SITOSTEROL OU DO ESTIGMASTEROL NA MANTEIGA E NA MANTEIGA CONCENTRADA POR CROMATOGRAFIA EM FASE GASOSA EM COLUNA CAPILAR

1. OBJECTO E ÂMBITO DE APLICAÇÃO

O presente método descreve um procedimento para a determinação quantitativa do sitosterol ou do estigmasterol na manteiga e na manteiga concentrada. Considera-se o sitosterol como a soma do β-sitosterol e do 22-di-hidro-β-sitosterol, sendo os restantes sitosteróis considerados desprezáveis.

2. PRINCÍPIO

Saponifica-se a manteiga ou manteiga concentrada com uma solução etanólica de hidróxido de potássio e extraem-se os insaponificáveis com éter dietílico.

Convertem-se os esteróis em éteres trimetilsilílicos e analisam-se por cromatografia em fase gasosa em coluna capilar, em relação a um padrão interno de betulina.

3. EQUIPAMENTO

3.1. Balão de saponificação de 150 ml, munido de um condensador de refluxo com juntas esmeriladas.

3.2. Ampolas de decantação de 500 ml.

3.3. Balões de 250 ml.

3.4. Balões de 250 ml ou capacidade similar, para equilíbrio da pressão, para a recolha do éter etílico evaporado.

3.5. Coluna de vidro com 350 mm × 20 mm, com tampa de vidro sinterizado.

3.6. Banho-maria ou manta de aquecimento.

3.7. Tubos de reacção de 2 ml.

3.8. Cromatógrafo de fase gasosa utilizável com coluna capilar, equipado com um sistema de divisão da amostra e constituído por: 3.8.1. Uma câmara termostática para colunas, capaz de manter a temperatura pretendida com a aproximação de ±1 °C; 3.8.2. Uma unidade de vaporização com regulação de temperatura; 3.8.3. Um detector de ionização por chama com conversor-amplificador; 3.8.4. Um integrador-registador adequado ao conversor-amplificador (3.8.3).

3.9. Coluna capilar de sílica fundida totalmente revestida com BP1 ou equivalente (ou qualquer outra coluna de resolução pelo menos idêntica), com uma espessura uniforme de 0,25 μm; a coluna deve permitir a resolução dos picos dos derivados trimetilsilílicos do lanosterol e do sitosterol. É recomendável uma coluna com 0,2 mm de diâmetro interno e 12 m de comprimento, revestida com BP1.

3.10. Microsseringa para cromatografia em fase gasosa, com 1 μl de capacidade e agulha temperada.

4. REAGENTES

Todos os reagentes devem ser de grau analítico reconhecido. A água utilizada deve ser destilada ou de pureza pelo menos equivalente.

4.1. Etanol com grau de pureza mínimo de 95 %.

4.2. Solução de hidróxido de potássio a 60 %: dissolver 600 g de hidróxido de potássio (grau de pureza mínimo de 85 %) em água e completar o volume até um litro com água.

4.3. Betulina com grau de pureza mínimo de 99 %. 4.3.1. Soluções de betulina em éter dietílico (4.4). 4.3.1.1. A concentração da solução de betulina utilizada na determinação do sitosterol deve ser de 1,0 mg/ml. 4.3.1.2. A concentração da solução de betulina utilizada na determinação do estigmasterol deve ser 0,4 mg/ml.

4.4. Éter dietílico de pureza analítica (isento de peróxidos e de resíduos).

4.5. Sulfato de sódio anidro granulado, previamente seco a 102 °C durante duas horas

4.6. Reagente de sililação, por exemplo o TRI-SIL (fornecido pela Pierce Chemical Co., número de catálogo 49001), ou equivalente (importante: o TRI-SIL é inflamável, tóxico, corrosivo e possivelmente cancerígeno. O pessoal de laboratório deve estar familiarizado com os cuidados a ter com o TRI-SIL e tomar as precauções apropriadas).

4.7. Lanosterol.

4.8. Sitosterol de grau de pureza conhecido, não inferior a 90 % (P). Nota 1: O grau de pureza dos padrões utilizados na calibração deve ser determinado pelo método da normalização. Considerar que todos os esteróis presentes na amostra figuram no cromatograma, que a área total dos picos representa 100 % dos esteróis e que todos os esteróis produzem a mesma resposta do detector. A linearidade do sistema deve ser validada para a gama de concentrações utilizada. 4.8.1. Solução-padrão de sitosterol: preparar, com a aproximação de 0,001 mg/ml, uma solução a cerca de 0,5 mg/ml (W1) de sitosterol (4.8) em éter dietílico (4.4).

4.9. Estigmasterol de grau de pureza (P) conhecido, não inferior a 90 %. 4.9.1. Solução-padrão de estigmasterol: preparar, com a aproximação de 0,001 mg/ml, uma solução a cerca de 0,2 mg/ml (W1) de estigmasterol (4.9) em éter dietílico (4.4).

4.10. Solução de teste da resolução: preparar uma solução a 0,05 mg/ml de lanosterol (4.7) e 0,5 mg/ml de sitosterol (4.8) em éter dietílico (4.4).

5. PROCEDIMENTO

5.1. Preparação das soluções-padrão para cromatografia

o padrão interno (4.3.1) deve ser adicionado à solução-padrão do esterol apropriado ao mesmo tempo que for adicionado à amostra saponificada (5.2.2).

5.1.1. Solução-padrão cromatográfica de sitosterol: transferir 1 ml da solução-padrão de sitosterol (4.8.1) para cada um de dois tubos de reacção (3.7) e purgar o éter dietílico com uma corrente de azoto. Adicionar 1 ml do padrão interno (4.3.1.1) e purgar o éter dietílico com uma corrente de azoto.

5.1.2. Solução-padrão cromatográfica de estigmasterol: transferir 1 ml da solução-padrão de estigmasterol (4.9.1) para dois tubos de reacção (3.7) e purgar o éter dietílico com uma corrente de azoto. Adicionar 1 ml do padrão interno (4.3.1.2) e purgar o éter dietílico com uma corrente de azoto.

5.2. Preparação dos insaponificáveis

5.2.1. Fundir a amostra de manteiga a uma temperatura não superior a 35 °C, misturando bem por agitação. Pesar num balão de 150 ml (3.1), com a aproximação de 1 mg, cerca de 1 g de manteiga (W2) ou de manteiga concentrada (W2). Adicionar 50 ml de etanol (4.1) e 10 ml da solução de hidróxido de potássio (4.2). Instalar o condensador de refluxo e aquecer, a cerca de 75 °C, durante 30 minutos. Retirar o condensador e arrefecer o balão aproximadamente até à temperatura ambiente.

5.2.2. Se se pretender determinar o sitosterol, adicionar ao balão 1,0 ml da solução do padrão interno (4.3.1.1); se se pretender determinar o estigmasterol, adicionar ao balão 1,0 ml da solução do padrão interno (4.3.1.2). Homogeneizar. Transferir quantitativamente o conteúdo do balão para uma ampola de decantação de 500 ml (3.2), lavando primeiro com 50 ml de água e depois com 250 ml de éter dietílico (4.4). Agitar o funil de decantação vigorosamente durante dois minutos e deixar as fases separarem-se. Escoar a fase aquosa inferior e lavar a fase etérea, agitando a ampola com quatro alíquotas sucessivas de 100 ml de água. Nota 2: Para evitar a formação de emulsões, é essencial que as duas primeiras lavagens com água sejam efectuadas com precaução (procedendo a 10 inversões). Na terceira lavagem, pode agitar-se vigorosamente durante 30 segundos. Se se formar uma emulsão, esta pode ser eliminada através da adição de 5-10 ml de etanol. Se se adicionar etanol, é essencial proceder a mais duas lavagens vigorosas com água.

5.2.3. Passar a fase etérea, límpida e isenta de sabões, por uma coluna de vidro (3.5) que contenha 30 g de sulfato de sódio anidro (4.5). Recolher a fase etérea num balão de 250 ml (3.3). Introduzir um grânulo regularizador da ebulição e evaporar quase até à secura num banho de água ou com uma manta de aquecimento, recolhendo os solventes evaporados. Nota 3: Se um extracto da amostra for levado à secura total, a temperaturas muito elevadas, podem ocorrer perdas de esteróis.

5.3. Preparação dos éteres trimetilsilílicos

5.3.1. Transferir a solução etérea remanescente, do balão, para um tubo de reacção de 2 ml (3.7), com 2 ml de éter dietílico, e purgar o éter com uma corrente de azoto. Lavar o balão com mais duas alíquotas de 2 ml de éter dietílico, transferindo-as para o tubo de reacção e purgando o éter, de cada uma das vezes, com uma corrente de azoto.

5.3.2. Proceder à sililação da amostra, adicionando 1 ml de TRI-SIL (4.6). Tapar o tubo de reacção e agitar vigorosamente, para dissolver. Caso a dissolução não seja completa, aquecer a 65-70 °C. Deixar em repouso durante pelo menos cinco minutos, antes de proceder à injecção no cromatógrafo de fase gasosa. Proceder à sililação dos padrões do mesmo modo que as amostras. Proceder à sililação da solução de teste da resolução (4.10) do mesmo modo que as amostras. Nota 4: A sililação deve ser efectuada em meio anidro. A sililação incompleta da betulina é revelada pela presença de um segundo pico, próximo do pico correspondente à betulina. A presença de etanol durante a sililação interfere nesse processo, podendo resultar de uma lavagem inadequada na etapa de extracção. Se este problema persistir, poderá ser efectuada uma quinta lavagem na etapa de extracção, com agitação vigorosa durante 30 segundos.

5.4. Análise por cromatografia em fase gasosa

5.4.1. Selecção das condições operatórias

Programar o cromatógrafo de acordo com as instruções do fabricante.

Apresentam-se a seguir condições operatórias indicativas:

— temperatura da coluna: 265 °C

— temperatura do injector: 265 °C

— temperatura do detector: 300 °C

— caudal do gás transportador: 0,6 ml/min

— pressão de hidrogénio: 84 kPa

— pressão de ar: 155 kPa

— divisão da amostra: de 10:1 a 50:1; esta relação deve ser optimizada de acordo com as instruções do fabricante e a linearidade da resposta do detector, devendo em seguida ser validada em toda a gama de concentrações utilizada. — Nota 5: É particularmente importante que a câmara de injecção seja limpa com regularidade.

— quantidade de amostra a injectar: 1 μl de solução de éteres trimetilsilílicos

Deixar que o sistema atinja o equilíbrio e obter uma resposta suficientemente estável antes de iniciar as análises.

As cond