1972L0199 — PT — 27.08.1999 — 005.001 — 1
Este documento constitui um instrumento de documentação e não vincula as instituições
►BTERCEIRA DIRECTIVADA COMISSÃO
de 27 de Abril de 1972
que fixa os métodos de análise comunitários para o controlo dos alimentos para animais
(72/199/CEE)
(JO L 123 de 29.5.1972, p. 6)
Alterada por:
Jornal Oficial
n.opágina data
►M1Directiva 81/680/CEE da Comissão de 30 de Julho de 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2Directiva 84/4/CEE da Comissão de 20 de Dezembro de 1983 L 15 28 18.1.1984
►M3Directiva 93/28/CEE da Comissão de 4 de Junho de 1993 L 179 8 22.7.1993
►M4Directiva 98/54/CE da Comissão de 16 de Julho de 1998 L 208 49 24.7.1998
►M5Directiva 1999/79/CE da Comissão de 27 de Julho de 1999 L 209 23 7.8.1999
▼B
TERCEIRA DIRECTIVADA COMISSÃO
de 27 de Abril de 1972
que fixa os métodos de análise comunitários para o controlo dos
alimentos para animais
(72/199/CEE)
A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,
Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Euro-
peia,
Tendo em conta a Directiva do Conselho, de 20 de Julho de 1970, rela-
tiva à introdução de modos de colheita de amostras e de métodos deanálise comunitárias para o controlo oficial de alimentos paraanimais (
1) e, nomeadamente, o seu artigo 2.o,
Considerando que a directiva atrás referida prevê que os controlos
oficiais dos alimentos para animais, para verificar se as condições pres-critas em virtudes de disposições legislativas, regulamentares ouadministrativas referentes à qualidade e composição de alimentos paraanimais, são respeitados e efectuados segundo modos de colheita de
amostra e métodos de análise comunitários;
Considerando que as Directivas n.
os71/250/CEE e 71/393/CEE da
Comissão, de 15 de Junho de 1971 (2) e de 18 de Novembro de
1971 (3), fixaram já um certo número de métodos de análise comuni-
tários; que, tendo em conta o estado de evolução dos trabalhos
efectuados desde então, é conveniente adoptar uma terceira série de
métodos;
Considerando que as medidas previstas na presente directiva estão
conformes com o parecer do Comité Permanente dos Alimentos para
Animais,
ADOPTOU A PRESENTE DIRECTIVA:
Artigo 1.o
Os Estados-membros determinaram que as análises para os controlos
oficiais de alimentos para animais, no que respeita ao teor de amido,
proteínas brutas solubilizáveis pela pepsina e pelo ácido clorídrico e
de gossipol livre e total, assim como à actividade da pepsina, sejamefectuadas segundo os métodos descritos no Anexo I da presente direc-tiva.
Artigo 2.o
Os Estados-membros determinarão que as análises para os controlosoficiais dos alimentos para animais com vista ►
M4 ◄
ao teor de ►M4 ◄tilosina, virginiamicina, sejam efec-
tuadas segundo os métodos descritos no Anexo II da presente directiva.
Artigo 3.o
Os Estados-membros porão em vigor em 1 de Julho de 1973, o mais
tardar, as disposições legislativas, regulamentares ou administrativasnecessárias para darem cumprimento às disposições da presente direc-tiva. Deste facto informarão imediatamente a Comissão.1972L0199 — PT — 27.08.1999 — 005.001 — 2
(1)J O n .oL 170 de 3. 8. 1970, p. 2.
(2)J O n .oL 155 de 12. 7. 1971, p. 13.
(3)J O n .oL 279 de 20. 12. 1971, p. 7.▼M1
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Artigo 4.o
Os Estados-membros são destinatários da presente directiva.1972L0199 — PT — 27.08.1999 — 005.001 — 3
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ANEXO I
1.DETERMINAÇÃODO AMIDO
MÉTODO POLARIMÉTRICO
1.Objectivo e domínio de aplicação
O presente método permite determinar o teor de amido e de produtos de
degradação deste elevado peso molecular em alimentos para animais, tendo
em vista verificar o respeito da Directiva 86/174/CEE e da Directiva 96/25/
/CE.
2.Princípio
O método compreende duas determinações. Na primeira, a amostra é tratada
a quente com ácido clorídrico diluído. Depois de clarificada e filtrada, mede-
-se o poder rotatório da solução por polarimetria.
Na segunda, a amostra é submetida a extracção com etanol a 40 %. Depois
de acidificado o filtrado com ácido clorídrico, clarificação e filtração, mede-
-se o poder rotatório tal como na primeira determinação.
A diferença entre as duas medições, multiplicada por um factor conhecido,
dá o teor de amido da amostra.
3.Reagentes
3.1. Ácido clorídrico a 25 % (m/m), d: 1,126.3.2. Ácido clorídrico a 1,128 % (m/v).
A concentração é verificada por titulação com uma solução 0,1 N de
hidróxido de sódio, na presença de vermelho de metilo a 0,1 % (m/v)
em etanol a 94 % (v/v). 10 ml = 30,94 ml de NaOH 0,1 N.
3.3. Solução de Carrez I: dissolver em água 21,9 g de acetato de zinco,
Zn CH
3COO ðÞ2:2H2O;e 3 g de ácido acético glacial. Completar o
volume até 100 ml com água.
3.4. Solução de Carrez II: dissolver em água 10,6 g de ferrocianeto de
potássio K 4ðFe CNðÞ6/C2/C3
:3H2O:Completar o volume até 100 ml com
água.
3.5. Etanol a 40 % (v/v), d: 0,948 a 20 ºC.
4.Aparelhagem
4.1. Erlenmeyer de 250 ml com esmerilado normalizado e condensador de
refluxo.
4.2. Polarímetro ou sacarímetro.
5.Procedimento
5.1.Preparação de amostra
Triturar a amostra de maneira a passar a totalidade da mesma por um
crivo de malha redonda de 0,5 mm de diâmetro.
5.2.Determinação do poder rotatório total (P ou S) (ver observação 7.1)
Pesar, com a aproximação de 1 mg, 2,5 g da amostra triturada para um
balão aferido de 100 ml. Adicionar 25 ml de ácido clorídrico (3.2),
agitar, para obter uma boa repartição da amostra, e adicionar mais
25 ml de ácido clorídrico (3.2). Introduzir o balão num banho de água
em ebulição e agitar enérgica e regularmente durante três minutos, para
evitar a formação de aglomerados. A quantidade de água do banho deve
ser suficiente para que este se mantenha em ebulição quando o balão for
introduzido. O balão não pode ser retirado do banho durante a agitação.
Exactamente 15 minutos depois, retirar o balão do banho, adicionar
30 ml de água fria e arrefecer imediatamente a 20 ºC.
Adicionar 5 ml da solução de Carrez I (3.3) e agitar durante um minuto.
Adicionar em seguida 5 ml da solução de Carrez II (3.4) e agitar de
novo durante um minuto. Completar o volume com água, homogeneizar
e filtrar. Se o filtrado não ficar perfeitamente límpido (o que é pouco1972L0199 — PT — 27.08.1999 — 005.001 — 4
▼M5
▼M5
frequente), recomeçar a análise utilizando uma quantidade maior das
soluções de Carrez I e II, por exemplo, 10 ml.
Medir, em seguida, o poder rotatório da solução num tubo de 200 mm
inserido no polarímetro ou no sacarímetro.
5.3.Determinação do poder rotatório (P ′ou S ′) das substâncias solúveis em
etanol a 40 %
Introduzir, num balão aferido de 100 ml, 5 g de amostra, pesada com a
aproximação de 1 mg, e adicionar cerca de 80 ml de etanol (3.5) (ver a
observação 7.2). Deixar o balão em repouso à temperatura ambiente
durante 1 hora; durante esse lapso de tempo, agitar energicamente seis
vezes, para que a amostra fique bem misturada com o etanol. Completar
o volume até 100 ml com etanol (3.5), homogeneizar e filtrar. Pipetar
50 ml de filtrado (= 2,5 g de amostra) para um erlenmeyer de 250 ml,
adicionar 2,1 ml de ácido clorídrico (3.1) e agitar energicamente.
Adaptar um condensador de refluxo ao erlenmeyer e mergulhar este
num banho de água em ebulição. Exactamente 15 minutos depois, retirar
o erlenmeyer do banho, transferir o conteúdo para um balão aferido de
100 ml, lavar com um pouco de água fria e arrefecer a 20 ºC. Clarificar,
em seguida, com as soluções de Carrez I (3.3) e II (3.4), completar o
volume com água, homogeneizar, filtrar e medir o poder rotatório
como indicado em 5.2 (segundo e terceiro parágrafos).
6.Cálculo dos resultados
O teor percentual de amido é calculado como segue:
6.1.Medições polarimétricas
Percentagem de amido ¼2000 P - P0ðÞ
α½/C13820º
D
P = poder rotatório total, em graus de arco
P′= poder rotatório, em graus de arco, das substâncias solúveis em
etanol a 40 %
α½/C13820º
D= poder rotatório específico do amido puro. Os valores conven-
cionalmente admitidos para este factor são os seguintes:
+ 185,9º: amido de arroz
+ 185,4º: amido de batata
+ 184,6º: amido de milho
+ 182,7º: amido de trigo
+ 181,5º: amido de cevada.
+ 181,3º: amido de aveia
+ 184,0º: outros tipos de amidó e misturas de amidos de
alimentos compostos para animais.
6.2.Medidas sacarimétricas
Percentagem de amido ¼2000
α½/C13820º
D/C22N/C20;665 ðÞ /C2 S-S0ðÞ
100-26;6N/C2S-S0ðÞ
α½/C13820º
D
S = poder rotatório total, em graus sacarimétricos
S′= poder rotatório, em graus sacarimétricos, das substâncias solú-
veis em etanol a 40 %
N = peso, em grama, de sacarose, dissolvida em 100 ml de água,
correspondente a um poder rotatório de 100º sacarimétricos,
quando medido com um tubo de 200 mm
16,29 g para os sacarímetros franceses
26,00 g para os sacarímetros alemães20,00 g para os sacarímetros mistos.
α½/C138
20º
D= Poder rotatório específico do amido puro (ver 6.1).
6.3.Repetibilidade
A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efec-
tuadas com a mesma amostra não deve ultrapassar 0,4 %, em valor
absoluto, para teores de amido inferiores a 40 %, ou 1,1 %, em valor
relativo, para teores de amido iguais ou superiores a 40 %.1972L0199 — PT — 27.08.1999 — 005.001 — 5
▼M5
7.Observações
7.1. Se a amostra contiver mais de 6 % de carbonatos, expressos em carbo-
nato de cálcio, estes devem ser destruídos por tratamento com a
quantidade apropriada, exacta, de ácido sulfúrico diluído antes da deter-
minação do poder rotatório total.
7.2. No caso dos produtos com teor de lactose elevado, como o soro de leite
em pó ou o leite em pó desnatado, proceder como segue depois da
adição de 80 ml de etanol (3.5): adaptar um condensador de refluxo ao
balão e mergulhar este durante 30 minutos num banho de água a 50 ºC.
Em seguida, deixar arrefecer e prosseguir a análise como indicado em
5.3.
7.3. Caso estejam presentes em quantidades significativas, as matérias cons-
tituintes de alimentos para animais a seguir indicadas produzem
comprovadamente interferências na determinação do teor de amido por
polarimetria, daí podendo resultar resultados incorrectos:
— produtos derivados da beterraba (sacarina), nomeadamente polpa de
beterraba (sacarina), melaço de beterraba (sacarina), polpa de beter-
raba (sacarina) melaçada, vinassa de beterraba (sacarina), açúcar (de
beterraba),
— polpa de citrinos,
— sementes de linho; bagaço de linho, obtido por pressão; bagaço de
linho, obtido por extracção,
— colza; bagaço de colza, obtido por pressão; bagaço de colza, obtido
por extracção; cascas de colza,
— sementes de girassol; bagaço de girassol, obtido por extracção;
bagaço de girassol, parcialmente descascado, obtido por extracção,
— bagaço de copra (coco), obtido por pressão; bagaço de copra (coco),
obtido por extracção,
— polpa de batata,— leveduras desidratadas,— produtos ricos em inulina (por exemplo, lascas e farinha de tupi-
nambos);
— torresmos.
2.DETERMINAÇÃODO TEOR DE PROTEÍNA BRUTA
1.Objectivo e campo de aplicação
O presente método permite determinar o teor de proteína bruta dos alimentos
para animais com base no teor de azoto, determinado pelo método de Kjel-
dahl.
2.Princípio
A amostra é digerida com ácido sulfúrico, na presença de um catalisador. A
solução ácida é tornada alcalina por adição de uma solução de hidróxido de
sódio. A amónia é destilada e recolhida numa quantidade determinada de
ácido sulfúrico, cujo excesso é titulado com uma solução-padrão de hidró-
xido de sódio.
3.Reagentes
3.1. Sulfato de potássio.
3.2. Catalisador: óxido de cobre (II), CuO, ou sulfato de cobre (II) penta-
-hidratado, CuSO
4·5H2O.
3.3. Zinco granulado.
3.4. Ácido sulfúrico, ρ20= 1,84 g/ml.
3.5 Ácido sulfúrico, c(½H2SO4) = 0,5 mol/l.
3.6. Ácido sulfúrico, c(½H2SO4) = 0,1 mol/l.
3.7. Indicador de vermelho de metilo: dissolver 300 mg de vermelho de
metilo em 100 ml de etanol, σ= 95 — 96 % (v/v).
3.8. Solução de hidróxido de sódio (pode-se utilizar uma solução de pureza
técnica), β= 40 g/100 ml (m/v: 40 %).
3.9. Solução de hidróxido de sódio, c = 0,25 mol/l.3.10. Solução de hidróxido de sódio, c = 0,1 mol/l.1972L0199 — PT — 27.08.1999 — 005.001 — 6
▼M3
▼M3
3.11. Pedra-pomes finamente fragmentada, lavada em ácido clorídrico e
inflamada.
3.12. Acetanilida (p.f.= 114 ºC, N = 10,36 %).3.13. Sacarose (isenta de azoto).
4.Equipamento
Aparelho adequado para efectuar a digestão, destilação e titulação pelo
método de Kjeldahl.
5.Procedimento
5.1.Digestão
Pesar 1 grama de amostra com aproximação de ± 0,001 grama e trans-
ferir para o recipiente do aparelho de digestão. Adicionar 15 gramas de
sulfato de potássio (3.1), uma quantidade adequada de catalisador (3.2)
[0,3 a 0,4 grama de óxido de cobre (II) ou 0,9 a 1,2 gramas de sulfato
de cobre (II) penta-hidratado], 25 mililitros de ácido sulfúrico (3.4) e
alguns fragmentos de pedra-pomes (3.11), misturando. Aquecer modera-
damente a mistura, agitando ocasionalmente se necessário, até à
carbonização completa da massa e o desaparecimento da espuma.
Aquecer de um modo mais vigoroso até à ebulição; o aquecimento é
adequado quando se observar a condensação do ácido nas paredes do
recipiente. Evitar o sobreaquecimento lateral e a adesão de partículas
orgânicas às paredes. Quando a amostra assumir um tom verde claro,
continuar a ebulição durante mais duas horas, arrefecendo da seguida.
5.2.Destilação
Adicionar cuidadosamente uma quantidade de água adequada para a
dissolução completa dos sulfatos. Deixar arrefecer e adicionar alguns
grânulos de zinco (3.3).
Colocar no recipiente de recolha do dispositivo de destilação 25 milili-
tros, rigorosamente medidos, de ácido sulfúrico (3.5) ou (3.6), em
função de teor presumido de azoto. Adicionar algumas gotas de
vermelho de metilo (3.7).
Adaptar o recipiente de digestão ao refrigerante do dispositivo de desti-
lação, imergindo a extremidade do refrigerante no líquido contido no
recipiente de recolha, até uma profundidade mínima de 1 cm (ver a
observação 8.3). Juntar cuidadosamente 100 ml de solução de hidróxido
de sódio (3.8) ao recipiente de digestão, evitando perdas de amoníaco
(ver a observação 8.1).
Aquecer o recipiente até à destilação completa do amoníaco.
5.3.Titulação
Titular o excesso de ácido sulfúrico existente no recipiente de recolha
com a solução de hidróxido de sódio (3.9) ou (3.10), em função da
concentração de ácido sulfúrico utilizada, até atingir o ponto final.
5.Ensaio em branco
Com vista a confirmar a ausência de azoto nos reagentes, efectuar um
ensaio em branco (digestão, destilação e titulação), utilizando 1 g de
sacarose (3.13) em vez da amostra.
6.Cálculo dos resultados
O teor de proteínas totais é calculado de acordo com a seguinte fórmula:
V0/C0V1 ðÞ /C2 c/C20;014/C2100/C26;25
m
Em que
V0= Volume, expresso em ml, de NaOH (3.9 ou 3.10) utilizado no ensaio
em branco
V1= Volume, expresso em ml, de NaOH (3.9 ou 3.10) utilizado na titu-
lação da amostra
c = Concentração, expressa em mol/l, da solução de hidróxido de sódio
(3.9 ou 3.10)
m = Massa da amostra, empressa em gramas.1972L0199 — PT — 27.08.1999 — 005.001 — 7
▼M3
7.Comprovação do método
7.1.Repetibilidade
A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas, efec-
tuadas com a mesma amostra, não deve exceder:
— 0,2 %, em valor absoluto, para teores de proteína bruta inferiores
a2 0% ,
— 1,0 %, em valor relativo, em relação aos resultados mais
elevados, para teores de proteínas totais compreendidos
entre 20 % e 40 %,
— 0,4 %, em valor absoluto, para teores superiores a 40 %.
7.2.Exactidão
Efectuar a análise (digestão, destilação e titulação) de 1,5 a 2,0 gramas
de acetanilida (3.12), na presença de 1 grama de sacarose (3.13); 1
grama de acetanilida deverá consumir 14,80 mililitros de ácido sulfúrico
(3.5). A taxa de recuperação deve ser de, pelo menos, 99 %.
8.Observações
8.1. O aparelho a utilizar pode ser do tipo manual, semiautomático ou
automático. Se for necessário efectuar uma operação de transferência
entre os processos de digestão e destilação, não deverão observar-se
perdas. Se o recipiente do dispositivo de destilação não se encontrar
munido de uma ampola de carga, adicionar o hidróxido de sódio imedia-
tamente antes de adaptar o recipiente ao refrigerante, vertendo o líquido
cuidadosamente ao longo das paredes.
8.2. Se o resíduo da digestão solidificar, recomeçar o processo, utilizando
um volume de ácido sulfúrico (3.4) superior ao especificado.
8.3. No caso de produtos com baixo teor de azoto, o volume de ácido sulfú-
rico (3.6) a adicionar ao recipiente de recolha pode ser reduzido, se
necessário, para 10 ou 15 mililitros e diluído para 25 mililitros, com
água.
3.DOSEAMENTO DE PROTEÍNAS BRUTAS SOLUBILIZADAS PELA
PEPSINA E PELO ÁCIDO CLORÍDRICO
1.Objecto e domínio de aplicação
Este método permite determinar a fracção de proteínas brutas solubilizadas
pela pepsina e pelo ácido clorídrico em condições determinadas. O método
é aplicável a todos os alimentos.
2.Princípio
A mostra é submetida a um tratamento por uma solução clorídrica de pepsina
durante 48 h a 40 ºC. A suspensão é filtrada e o teor de azoto do filtrado
determinado segundo o método descrito para o doseamento das proteínas
brutas.
3.Reagentes
3.1. Ácido clorídrico, d: 1,125
3.2. Ácido clorídrico: 0,075 N.
3.3. Pepsina a 2,0 U/mg; esta actividade está definida e deve ser controlada
segundo o método referido na Parte 4 do presente Anexo.
3.4. Solução recém-preparada com cerca de 0,02 % (p/v) de pepsina em
ácido clorídrico (3.2.); actividade: 400 U/1.
3.5. Emulsão de anti-espuma (silicone por exemplo)
3.6. Todos os reagentes indicados ao ponto 3 do método de doseamento das
proteínas brutas
4.Instrumentos
4.1. Banho-maria ou estufa incubadora regulada a 40 ºC ± 1 ºC.1972L0199 — PT — 27.08.1999 — 005.001 — 8
▼B
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4.2. Aparalhos de mineralização e destilação segundo Kjeldahl.
5.Modo operatório
5.1.Obtenção da solução (ver observação 7.2.)
Introduzir 2 g de amostra pesada com a aproximação de 1 mg num
balão aferido de 500 ml e adicionar 450 ml de solução clorídrica de
pepsina (3.4.) previamente elevada a 40 ºC. Agitar de forma a evitar a
formação de aglomerados. Verificar que o pH da suspensão é inferior a
1,7. Colocar o balão no banho-maria ou na estufa incubadora (4.1.),
durante 48 horas. Agitar decorridas 8, 24 e 32 h. Após 48 h, adicionar
15 ml de ácido clorídrico (3.1.), arrefecer a 20 ºC, completar até 500 ml
com água e filtrar.
5.2.Mineralização
Recolher 250 ml do filtrado e introduzi-los no balão do destilador (4.2.).
Juntar os reagentes necessários à mineralização, como indicado no
método de doseamento das proteínas brutas, no ponto (5.1.), 2.afrase.
Homogeneizar e aquecer até à ebulição. Se houver formação de espuma,
juntar algumas gotas de emulsão anti-espuma (3.5.). Manter uma
ebulição viva até à evaporação quase completa da água. Eliminar com
precaução os últimos vestígios de água, reduzindo a intensidade do
aquecimento. Quando a solução aparecer límpida e incolor (verde claro
em presença do catalisador à base de cobre), prosseguir a ebulição
durante mais 1 hora. Em seguida, deixar arrefecer.
5.3.Destilação e titulação
Proceder como indicado no método de doseamento de proteínas brutas,
pontos (5.2.) e (5.3.).
5.4.Ensaio em branco
Efectuar um ensaio em branco, aplicando o modo operatório na ausência
da amostra para analisar.
6.Cálculo dos resultados
Deduzir o volume do ácido sulfúrico consumido no ensaio em branco do que
foi gasto pela amostra. 1 ml de ácido sulfúrico 0,1 N corresponde a 1,4 mg
de azoto.
Multiplicar a quantidade do azoto pelo factor 6,25. Expressar o resultado em
percentagem de amostra.
Reprodutibilidade
A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas na
mesma amostra não deve ultrapassar:
— 0,4 em valor absoluto, para os teores inferiores a 20 %,
— 2,0 %, em valor relativo, para os teores compreendidos entre 20 e 40 %;
— 0,8 em valor absoluto, para os teores superiores a 40 %.
7.Observações
7.1. Os valores obtidos pelo presente método não têm ligação directa com a
digestibilidade «in vivo».
7.2. Aos produtos cujo teor de matérias gordas ultrapasse 10 % deve ser
extraída previamente a gordura com éter de petróleo (eb. 40-60 ºC).
4.DETERMINAÇÃODA ACTIVIDADEDA PEPSINA
1.Objecto e domínio de aplicação
Este método permite controlar a actividade da pepsina utilizada para o dose-
amento de proteínas brutas solubilizadas pela pepsina e pelo ácido clorídrico.
2.Princípio
A hemoglobina é tratada, em condições definidas, pela pepsina em meio
clorídrico. A fracção não hidrolizada das proteínas é precipitada pelo ácido
tricloroacético. Ao filtrado é adicionado hidróxido de sódio e do reagente de1972L0199 — PT — 27.08.1999 — 005.001 — 9
▼B
Folin-Ciocalteu. A densidade óptica desta solução é medida a 750 nm e a
quantidade de tirosina que lhe corresponde é lida numa curva-padrão.
Definição: A unidade de pepsina é definida como a quantidade desta enzima
que liberta, por minuto, nas condições do método, uma quantidade de grupos
hidroxiaril cuja coloração pelo reagente de Folin-Ciocalteu tem uma densi-
dade óptica correspondente à de uma mole de tirosina, nas mesmas
condições.
3.Reagentes
3.1. Ácido clorídrico 0,2 N.
3.2. Ácido clorídrico 0,06 N.
3.3. Ácido clorídrico 0,025 N.3.4. Solução a 5 % (p/v) de ácido tricloroacético3.5. Solução de hidróxido de sódio 0,5 N3.6. Reagente de Folin-Ciocalteu. Introduzir 100 g de tungstato de sódio
(Na
2WO4.2 H2O), 25 g de molibdato de sódio (Na2MoO4.2 H2O) e
700 ml de água num balão de fundo redondo de 2 l de colo esmerilado
normalizado. Juntar 50 ml de ácido fosfórico (d: 1,71) e 100 ml de ácido
clorídrico concentrado (d: 1,19), ajustar ao balão um refrigerador de
refluxo, aquecer até à ebulição e manter a solução em ebulição suave
durante 10 h. Deixar arrefecer, desligar o refrigerador de refluxo.
Adicionar 175 g de sulfato de lítio (Li2SO4.2 H2O), 50 ml de água e
1 ml de bromo. Ferver durante 15 minutos para eliminar o excesso de
bromo.
Deixar arrefecer, transvasar a solução num balão aferido de 1 litro,
completar o volume com água, homogeneizar e filtrar. Não poderá
subsistir qualquer coloração esverdeada. Antes de utilizar, diluir um
volume de reagente com dois volumes de água.
3.7. Solução de hemoglobina: Pesar uma quantidade de hemoglobina,
substrato proteico de Anson (cerca de 2 g) correspondente a 354 mg de
azoto (1) e introduzir num balão de 200 ml de colo esmerilado normali-
zado. Juntar alguns ml de ácido clorídrico (3.2.), ligar o balão à bomba
de vácuo e agitar até à dissolução completa da hemoglobina. Desligar o
vácuo e adicionar, agitando sempre, o ácido clorídrico (3.2.) para
completar a 100 ml. Preparar inmediatamente antes de utilizar .
3.8. Solução-padrão de tirosina: dissolver 181,2 mg de tirosina em ácido
clorídrico (3.1.) e completar para 1 litro com o mesmo ácido (soluç-
ãomãe). Recolher 20,0 ml e diluir para 100 ml pelo ácido clorídrico
(3.1.). 1 ml desta solução contém 0,2 mole de tirosina.
4.Instrumentos
4.1. Banho-maria, rgulado a 25 ºC ± 0,1 ºC por ultratermóstato.
4.2. Espectrofotómetro.4.3. Cronómetro, precisão: 1 segundo.4.4. Aparelho medidor de pH.
5.Modo operatório
5.1.Preparação da solução (v. observação 7.1)
Dissolver 150 mg de pepsina em 100 ml de ácido clorídrico (3.2.).
Recolher com uma pipeta 2 ml da solução, introduzi-los num balão
aferido de 50 ml e completar o volume com ácido clorídrico (3.3.). O
pH, verificado no aparelho medidor de pH, deve ser de 1,6 ± 0,1.
Mergulhar o balão no banho-maria (4.1.).
5.2.Hidrólise
Introduzir com a pipeta num tubo de ensaio 5,0 ml de solução de hemo-
globina (3.7.), elevar a temperatura a 25 ºC em banho-maria (4.1.),
adicionar 1,0 ml da solução de pepsina obtida em (5.1.) e misturar,
com uma haste de vidro engrossada numa extremidade, com cerca de1972L0199 — PT — 27.08.1999 — 005.001 — 10
(1) Determinar o teor de azoto por um semi-microkjeldahl (concentração teórica: 17,7 %
de azoto).
▼B
10 movimentos de vaivém. Manter o tubo de ensaio no banho a 25 ºC
durante 10 minutos, contados exactamente a partir da adição da solução
de pepsina (a duração e a temperatura devem ser rigorosamente respei-
tadas). Em seguida, juntar 10,0 ml de solução de ácido tricloroacético
(3.4.) a 25 ºC, homogeneizar e filtrar num filtro seco.
5.3.Desenvolvimento da coloração e medida da densidade óptica
Recolher com uma pipeta 5,0 ml do filtrado, introduzi-los num erlen-
meyer de 50 ml, adicionar 10,0 ml de solução de hidróxido de sódio
(3.5.) e, agitanto sempre, 3,0 ml do reagente diluído de Folin-Ciocalteu
(3.6.). Após 5 a 10 minutos, determinar a densidade óptica da solução
em espectrofotómetro, a 750 nm em «cuvettes» de 1 cm de espessura,
por comparação com a água.
5.4.Ensaio em branco
Para cada determinação, proceder a um ensaio em branco como se
segue: Introduzir num tubo de ensaio com uma pipeta 5,0 ml de solução
de hemoglobina (3.7.), elevar a temperatura a 25 ºC num banho-maria
(4.1.), adicionar 10,0 ml de solução de ácido tricloroacético (3.4.) a
25 ºC, homogeneizar e adicionar em seguida, 1,0 ml da solução de
pepsina obtida em (5.1.). Misturar com uma vareta de vidro e manter o
tubo de ensaio exactamente 10 minutos no banho-maria (4.1.) a 25 ºC.
Homogeneizar e filtrar num filtro seco. Prosseguir como indicado em
(5.3.).
5.5.Curva-padrão
Introduzir em erlenmeyer de 50 ml volumes de 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 e 5,0 ml
de solução-padrão de tirosina (3.8.), correspondente, respectivamente, a
quantidades de tirosina de 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1,0 moles. Completar a
série por um testemunho sem tirosina. Completar os volumes para
5,0 ml com ácido clorídrico (3.1.). Adicionar 10,0 ml de solução de
hidróxido de sódio (3.5.) e, agitando sempre 3,0 ml de reagente diluído
de Folin-Ciocalteu (3.6.). Medir a densidade óptica como indicado em
(5.3.), na última frase. Traçar a curva-podrão, correlacionando as densi-
dades ópticas com as quantidades de tirosina.
6.Cálculo dos resultados
Ler na curva-padrão a quantidade de tirosina, em mole, correspondente à
densidade óptica da solução corada, diminuída dos valores do ensaio em
branco.
A actividade da pepsina, em mole de tirosina por mg e por minuto, a 25 ºC, é
dada pela fórmula:
Unidades por mg V =mgðÞ ¼0;32 a
p
em que:
a — quantidade de tirosina, em µmole, lida na curva-padrão
p — peso em mg da quantidade de pepsina adicionada em 5.2.
7.Observações
7.1. A quantidade de pepsina a pôr em solução deve ser escolhida de
maneira a obter, na medição fotométrica final, uma densidade óptica de
0,35 ± 0.035.
7.2. Duas unidades por mg obtidas pelo presente método correspondem a:
3,64 miliunidades Anson/mg (µmole de tirosina/mg min a 35,5 ºC) ou
36.400 unidades comerciais/g (µmole de tirosina/ g em 10 min a
35,5 ºC).
5.DOSEAMENTO DO GOSSIPOL LIVRE E TOTAL
1.Objecto e domínio de aplicação
Este método permite dosear o gossipol livre, o gossipol total e as substâncias
quimicamente aparentadas, nas sementes, farinhas e bagaços de algodão,
assim como nos alimentos compostos que os contêm. O limite inferior do
doseamento é de 20 ppm.1972L0199 — PT — 27.08.1999 — 005.001 — 11
▼B
2.Princípio
O gossipol é extraído em presença de 3-amino-1-propanol, quer por uma
mistura de isopropanol e de hexano para o doseamento do gossipol livre,
quer pela dimetilformamida, para o doseamento do gossipol livre, quer pela
dimetilformamida, para o doseamento do gossipol total. O gossipol é trans-
formado por meio de anilina em gossipol-dianilina, cuja densidade óptica é
medida em 440 nm.
3.Reagentes
3.1. Mistura de isopropanol-hexano: misturar 60 partes de isopraponol p.a.
com 40 partes de volume de hexano normal, volume por volume.
3.2. Solvente A: Deitar num balão aferido de 1 l, cerca de 500 ml da mistura
de isopropanol-hexano (3.1.), 2 ml de 3-amino-1-propanol, 8 ml de
ácido acético glacial e 50 ml de água. Completar o volume com a
mistura de isopropanol-hexano (3.1.). Este reagente é estável durante
uma semana.
3.3. Solvente B: Deitar, com uma pipeta, num balão aferido de 100 ml, 2 ml
de 3-amino-1-propanol e 10 ml de ácido acético glacial. Deixar arrefecer
até à tempertura ambiente e completar o volume com N,N-dimetilforma-
mida. Este reagente é estável durante uma semana.
3.4. Anilina p.a.: se a densidade óptica do ensaio em branco exceder 0,022,
destilar a anilina em pó de zinco, eliminando as primeiras e últimas
fracções de 10 % do líquido destilado. Em frasco bem rolhado de vidro
escuro e no frigorífico este reagente conserva-se vários meses.
3.5. Solução-padrão A de gossipol: Deitar, num balão aferido de 250 ml,
27,9 mg de acetato de gossipol. Dissolver e completar o volume com o
solvente A (3.2.). Introduzir com uma pipeta 50 ml desta solução num
balão aferido de 250 ml e completar o volume com o solvente A. A
concentração em gossipol desta solução é de 0,02 mg/ml. Deixar
repousar durante 1 hora à temperatura ambiente, antes de utilizar.
3.6. Solução-padrão B de gossipol: Deitar, num balão aferido de 50 ml,
27,9 mg de acetato de gossipol. Dissolver e completar o volume com o
solvente B (3.3.). A concentração em gossipol desta solução é de 0,5 mg/
/ml.
Conservados ao abrigo da luz, as soluções padrão A e B de gossipol são
estáveis durante 24 horas.
4.Instrumentos
4.1. Misturador basculante: cerca de 35 rotações por minuto4.2. Espectrofotómetro.
5.Modo operatório
5.1.Toma de ensaio
A toma de ensaio está relacionada com o que se calcula ser o teor de
gossipol da amostra total. É preferível trabalhar com uma pequena
toma de ensaio e com uma alíquota do filtrado relativamente importante,
de maneira a obter uma quantidade de gossipol suficiente para efectuar
uma medida fotométrica precisa. Para o doseamento do gossipol livre
nas sementes, nas farinhas e nos bagaços de algodão, a toma de ensaio
não deve exceder 1 g; para os alimentos compostos poderá atingir 5 g.
Na maioria dos casos, uma alíquota de 10 ml do filtrado é conveniente:
deverá conter 50 a 100 mg de gossipol. Para o doseamento de gossipol
total, a toma de ensaio poderá variar de 0,5 a 5 g para que uma alíquota
de 2 ml do filtrado contenha 40 a 200 µg de gossipol.
A análise deve ser feita a uma tempertura ambiente próxima de 20 ºC.
5.2.Doseamento do gossipol livre
Introduzir a toma de ensaio num balão de colo esmerilado de 250 ml,
com o fundo coberto de vidro moído. Adicionar com uma pipeta 50 ml
de solvente A (3.2.), rolhar o balão e misturar durante uma hora no
misturador-basculante. Filtrar num filtro seco e recolher o filtrado num
pequeno balão de colo esmerilado. Durante a filtração, cobrir o funil
com um vidro de relógio. Introduzir com uma pipeta em dois balões
aferidos de 25 ml (A e B) alíquotas idênticas de filtrado contendo 50 a
100 µg de gossipol. Completar eventualmente o volume para 10 ml com
o solvente A (3.2.). Completar em seguida para 25 ml o conteúdo do1972L0199 — PT — 27.08.1999 — 005.001 — 12
▼B
balão (A) com a mistura de isopropanol-hexano (3.1.). Esta solução será
utilizada como solução de referência para a medição da solução da
amostra.
Introduzir com uma pipeta 10 ml do solvente A (3.2.) respectivamente
em dois outros balões aferidos de 25 ml (C e D). Completar o conteúdo
do balão (C) com a mistura de isopropanol-hexano (3.1.). Esta solução
do ensaio em branco.
Adicionar 2 ml de anilina (3.4.) em cada um dos balões (D) e (B).
Aquecer durante 30 minutos num banho-maria em ebulição para fazer
desenvolver a coloração. Arrefecer até à temperatura ambiente,
completar para 25 ml com a mistura de isopropanol-hexano (3.1.),
homogeneizar e deixar repousar durante uma hora.
Determinar em espectrofotómetro a 440 nm, em cuvetes de vidro de
1 cm, a densidade óptica da solução do ensaio em branco (D), por
comparação com a solução de referência (C) e a densidade óptica da
solução da amostra (B) por comparação com a solução de referência
(A).
Subtrair a densidade óptica da solução do ensaio em branco da densi-
dade óptica da solução da amostra (= densidade óptica corrigida).
Calcular, a partir deste valor, o teor de gossipol livre, com indicado em
6.
5.3.Doseamento do gossipol total
Introduzir uma amostra contendo de 1 a 5 mg de gossipol num balão
aferido de 50 ml e adicionar 10 ml de solvente B (3.3.). Preparar simul-
taneamente um ensaio em branco, introduzindo 10 ml de solvente B
(3.3.) noutro balão aferido de 50 ml. Aquecer os dois balões durante
30 minutos num banho-maria em ebulição. Arrefecer até à temperatura
ambiente e completar o conteúdo de cada balão até ao volume de
aferição com a mistura de isopropanol-hexano (3.1.). Homogeneizar e
deixar depositar durante 10 a 15 minutos, filtrar em seguida e recolher
os filtrados em balões de colo esmerilado.
Deitar com uma pipeta 2 ml do filtrado da amostra em cada um de dois
outros balões aferidos de 25 ml e 2 ml do filtrado do ensaio em branco
em cada um de dois outros balões de 25 ml. Retirar um balão de cadà
série e completar os conteúdos respectivos para 25 ml com a mistura de
isopropanol-hexano (3.1.). Estas soluções serão utilizadas como soluções
de referência.
Adicionar 2 ml de anilina (3.4.), respectivamente, a cada um dos dois
outros balões. Aquecer durante 30 minutos num banho de água a ferver
para fazer desenvolver a coloração. Arrefecer até à temperatura ambi-
ente, completar para 25 ml com a mistura de isopropanol-hexano (3.1.),
homogeneizar e deixar repousar durante uma hora.
Determinar a densidade óptica, como indicado em (5.2.) para o gossipol
livre. Calcular, a partir deste valor, o teor do gossipol total, como indi-
cado em 6.
6.Cálculo dos resultados
O cálculo dos resultados pode fazer-se, quer a partir da densidade óptica
específica (6.1.), quer por referência a uma curva-padrão (6.2.).
6.1.A partir da densidade óptica específica
Nas condições descritas, as densidades ópticas específicas são as
seguintes:
gossipol libre: E1%
1c m¼625
gossipol total: E1%
1c m¼600
O teor de gossipol livre ou total da amostra é dado pela seguinte
fórmula:
gossipol % ¼E/C11250
E1%
1c m/C1p/C1a
em que:
E = densidade óptica corrigida, determinada como indicado em (5.2.)1972L0199 — PT — 27.08.1999 — 005.001 — 13
▼B
p = amostra em g,
a = alíquota do filtrado em ml.
6.2.A partir de uma curva-padrão
6.2.1.Gossipol livre
Preparar duas séries de 5 balões aferidos de 25 ml. Em cada série,
introduzir com uma pipeta nos balões, respectivamente, 2,0 —
4,0 — 6,0 — 8,0 e 10,0 ml da solução-padrão A de gossipol
(3.5). Completar os volumes para 10 ml com solvente A (3.2.)
Completar cada série com um testemunho constituído por um
balão aferido de 25 ml contendo unicamente 10 ml de solvente
A (3.2.).
Completar para 25 ml o volume dos balões da primeira série
(incluindo o testemunho) com a mistura isopropanol-hexano
(3.1.) (série de referência).
Juntar 2 ml de anilina (3.4.) em cada balão da segunda série
(incluindo o testemunho). Aquecer durante 30 minutos num
banho-maria em ebulição para fazer desenvolver a coloração.
Arrefecer até à temperatura ambiente, completar o volume coma mistura de isopropanol-hexano (3.1.), homogeneizar e deixar
repousar durante 1 hora (série-podrão).
Determinar, nas condições indicadas em (5.2.), a densidade óptica
das soluções da série-padrão, por comparação com as soluções
correspondentes da série de referência. Traçar graficamente a
solução-padrão, inscrevendo as densidades ópticas em correlação
com as quantidades de gossipol (em µg).
6.2.2.Gossipol total
Preparar 6 balões aferidos de 50 ml. Introduzir no primeiro balão
10 ml de solvente B (3.3.) e nos outros, respectivamente, 2,0 —
4,0 — 6,0 — 8,0 e 10,0 ml da solução-padrão B de gossipol
(3.6.). Completar o conteúdo de cada balão para 10 ml com
solvente B (3.3.). Aquecer durante 30 minutos num banho-maria
em ebulição. Arrefecer até à temperatura ambiente, completar o
volume com a mistura de isopropanol-hexano (3.1.) e homoge-
neizar.
Introduzir 2, 0 ml destas soluções, respectivamente, em duas
séries de 6 balões aferidos de 25 ml. Completar para 25 ml o
conteúdo dos balões da primeira série com a mistura de isopro-
panol-hexano (3.1.) (série de referência).
Adicionar 2 ml de anilina (3.4.) a cada balão da 2.
asérie. Aquecer
durante 30 minutos num banho-maria em ebulição. Arefecer até à
temperatura ambiente, completar o volume com a mistura de
isopropanol-hexano (3.1.), homogeneizar e deixar repousar
durante 1 hora (série-padrão).
Determinar nas condições indicadas em (5.2.), a densidade óptica
das soluções da série-padrão, por comparação com as soluções
correspondentes da série de referência. Traçar graficamente a
curva-padrão, inscrevendo as densidades ópticas em correlação
com as quantidades de gossipol (em µg).
6.3.Reprodutibilidade
A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas, efec-
tuadas na mesma amostra, não deve ultrapassar:
— 15 %, em valor relativo, para os teores de gossipol inferiores a
500 ppm,
— 75 ppm, em valor absoluto, para os teores compreendidos entre 500
e 750 ppm,
— 10 %, em valor relativo, para os teores superiores a 750 ppm.1972L0199 — PT — 27.08.1999 — 005.001 — 14
▼B
ANEXO II
4.DOSEAMENTO DA TILOSINA
— por difusão em ágar-ágar —
1.Objecto e domínio de aplicação
Este método permite dosear a tilosina em alimentos, concentrados e pré-
-misturas. O limite inferior do doseamento é de 2 ppm.
2.Princípio
A amostra é tratada por uma solução de tampão fosfato a pH 8, previamente
aquecido a 80 ºC, e submetida em seguida a extracção pelo metanol. Após
centrifugação, o extracto é diluído e a sua actividade antibiótica determinada
pela medição da difusão da tilosina num meio de ágar-ágar, inoculado com a
Sarcina lutea . A difusão é indicada pela formação de zonas de inibição em
presença do microrganismo. O diâmetro destas zonas é directamente propor-
cional ao logaritmo da concentração do antibiótico.
3.Microrganismo Sarcina lutea ATCC n.o9341
3.1.Conservação da estirpe
InocularSarcina lutea em ágar-ágar inclinado em tubo, constituído pelo
meio de cultura (4.1.), com o pH ajustado a 7,0. Incuabar durante uma
noite a cerca de 35 ºC. Conservar a cultura no frigorífico e repicar todos
os meses para ágar-ágar inclinado.
3.2.Preparação da suspensão de bactérias
Recolher as bactérias de um tubo de ágar-ágar inclinado (3.1.) de prepa-
ração recente, com 2 a 3 ml de soro fisiológico (4.4.). Inocular com esta
suspensão um frasco de Roux contendo 250 ml do meio de cultura
(4.1.), com o pH ajustado a 7,0. Incubar durante 24 horas a 35 ºC, reco-
lher as bactérias com 25 ml de soro fisiológico (4.4.). Homogeneizar e
diluir esta suspensão para obter uma transmissão luminosa de cerca de
75 % a 650 nm.
Conservada no frigorífico, esta suspensão é utilizável durante uma
semana.
Por ensaios preliminares em placas com o meio de base de doseamento
(4.1.), determinar a quantidade de inóculo que permite obter, para as
diferentes conoentrações de tilosina utilizada, zonas de inibição tão
extensas quanto possível e que estejam ainda límidas. A inoculação do
meio de cultura é feita a 48—50 ºC.
4.Meios de cultura e reagentes
4.1.Meio de base do doseamento (1)
Glicose 1 g
Peptona trípsica 10 g
Extracto de carne 1,5 gExtracto de levedura 3 g
Ágar-ágar, conforme a qualidade 10 a 20 g
Água destilada para 1 000 ml
Ajustar no momento da utilização a pH 7,0 para a conservação da
estirpe e a preparação da suspensão de bactérias e a pH 2,0 para o dose-
amento.1972L0199 — PT — 27.08.1999 — 005.001 — 15
(1) Pode ser utilizado qualquer meio de cultura comercial, de composição análoga e condu-
zindo aos mesmos resultados.▼M4
▼B
▼B
4.2.Tampão fosfato pH 8
Fosfato monopotássico KH2PO40,523 g
Fosfato bipotássico K2HPO4p.a. 16,730 g
Água destilada para 1 000 ml
4.3.Tampão fosfato, pH 7
Fosfato monopotássico KH2PO4p.a. 5,5 g
Fosfato bipotássico K2HPO4p.a. 13,6 g
Água destilada para 1 000 ml
4.4. Soro fisiológico esterilizado
4.5. Metanol puro4.6. Metanol a 10 % (v/v)4.7. Mistura tampão fosfato (4.2.)/metanol puro: 60/40, em volume.4.8. Substância-padrão: tilosina de actividade conhecida.
5.Soluções padrão
Secar a substância-padrão (4.8.) durante 3 h a 60 ºC numa estufa de vácuo
(5 mm de mercúrio). Pesar 10 a 50 mg num balão aferido, dissolvê-los em
5 ml de metanol (4.5.) e diluir a solução com o tampão fosfato, pH 7 (4.3.)
para obter uma concentração de tilosina-base de 1 000 µg/ml.
A partir desta solução-mãe, preparar, diluindo com a mistura (4.7.), uma
solução-padrão de trabalho S
8contendo 2 µg de tilosina-base por ml.
Preparar em seguida, por meio de diluições sucessivas (1 + 1), com a mistura
(4.7), as seguintes concentrações:
S41 µg/ml
S20,5 µg/ml
S10,25 µg/ml
6.Extracção
Recolher, para os concentrados, uma toma de ensaio de 10 g; para as prémis-
turas e alimentos, uma toma de ensaio de 20 g. Adicionar 60 ml de tampão
fosfato, pH 8 (4.2.), previamente aquecido a 80 ºC, e homogeneizar durante 2
minutos (electrodoméstico, Ultra-turrax, etc.).
Em seguida, deixar repousar 10 minutos, adicionar 40 ml de metanol (4.5.) e
homogeneizar durante 5 minutos. Centrifugar, recolher uma alíquota do
extracto e diluir com a mistura (4.7.) para obter uma concentração teórica
de tilosina de 2 µg/ml (= U8). Preparar em seguida as concentrações U4,U2eU1, por meio de diluições sucessivas (1 + 1) com a mistura (4.7).
Para os teores inferiores a 10 ppm, fazer evaporar o extracto a seco num
evaporador rotativo a 35 ºC e ressuspender o resíduo em metanol a 40 %
(4.6).
7.Método de doseamento
7.1.Inoculação do meio de cultura
Inocular a 48—50 ºC o meio de base do doseamento (4.1.), ajustado a
pH 8,0 pela suspensão de bactérias (3.2.).
7.2.Preparação das placas
A difusão em ágar-ágar efectua-se em placas com as 4 concentrações da
solução-padrão (S8,S4,S2,S1) e as 4 concentrações do extracto (U8,U4,
U2,U1). Cada placa deve receber necessariamente as 4 concentrações do
padrão e do extracto.
Para este efeito, escolher as dimensões das placas de tal forma que se
possam fazer, no meio de ágar-ágar, pelo menos, 8 cavidades de 10 a
13 mm de diâmetro. Calcular a quantidade do meio de cultura inoculado
(7.1.) a utilizar, de forma a obter uma camada uniforme de cerca de1972L0199 — PT — 27.08.1999 — 005.001 — 16
▼B
2 mm de espessura. É preferível utilizar placas de Petri munidas de um
anel de alumínio ou de matéria plástica perfeitamente plana de 200 mm
de diâmetro e 20 mm de altura.
Introduzir com uma pipeta nas cavidades, quantidades rigorosamente
medidas de solução de antibiótico compreendida entre 0,10 e 0,15 ml,
conforme o diâmetro.
Para cada amostra, fazer, pelo menos, quatro repetições de difusão com
cada concentração, de forma a que cada doseamento seja objecto de
uma avaliação de 32 zonas de inibição.
7.3.Incubação
Incubar as placas durante uma noite a 35-37 ºC.
8.Avaliação
Medir o diâmetro das zonas de inibição, de preferência, por projecção.
Inscrever as medidas em papel semilogarítmico, correlacionando o logaritmo
das concentrações com os diâmetros das zonas de inibição. Traçar as rectas
da solução-padrão e do extracto. Na ausência de interferências as duas rectas
devem ser paralelas.
O logaritmo da actividade relativa é calculado por meio da seguinte fórmula:
U1þU2þU4þU8/C0S1/C0S2/C0S4/C0S8 ðÞ /C1 0;602
U4þU8þS4þS8/C0U1/C0U2/C0S1/C0S2
Actividade real = actividade esperada × actividade relativa.
9.Reprodutibilidade
A diferença entre os resultádos de duas determinações paralelas efectuadas na
mesma amostra não deve ultrapassar 10 %, em valor relativo.
5.DOSEAMENTO DA VIRGINIAMICINA
— por difusão em agar —
1.Objecto e domínio de aplicação
Este método permite dosear a virginiamicina nos alimentos e prémisturas. O
limite inferior do doseamento é de 2 mg/kg (2 ppm) (1).
2.Princípio
A amostra é submetida a uma extracção por uma solução metanólica de
Tween 80. O extracto é decantado ou centrifugado e em seguida diluído. A
sua actividade antibiótica é determinada pela medição da difusão da virginia-
micina num meio de agar inoculado com Micrococcus luteus . A difusão
revela-se pela formação de zonas de inibição do microrganismo. O diâmetro
dessas zonas é considerado como sendo directamente proporcional ao loga-
ritmo da concentração de antibiótico para a gama das concentrações
utilizadas.
3.Microrganismo: «Micrococcus luteus» ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB
8553)
3.1.Conservação da estirpe
Inocular o meio de cultura (4.1.) com «Micrococcus luteus», em tubos
inclinados. Incubar durante 24 horas a 30 ºC, conservar no frigorífico a
cerca de 4 ºC e renovar a inoculação de 15 em 15 dias.
3.2.Preparação da suspensão bacteriana (a)
Recolher as bactérias de um tubo de agar (3.1.) de preparação recente,
com 2 a 3 ml de solução de cloreto de sódio (4.3.). Inocular com esta1972L0199 — PT — 27.08.1999 — 005.001 — 17
(1) 1 mg de virginiamicina equivale a 1 000 unidades «UK».
(a) Podem ser utilizados outros métodos desde que esteja provado que produzem suspen-
sões bacterianas análogas.▼M2
▼M2
suspensão 250 ml do meio de cultura (4.1.) num frasco de Roux e
incubar durante dezoito a vinte horas a 30 ºC. Recolher as bactérias em
25 ml de solução de cloreto de sódio (4.3.) e homogeneizar.
Diluir a suspensão de1/10, com a solução de cloreto de sódio (4.3.). A
transmissão luminosa da suspensão, medida a 650 nm através de uma
espessura de 1 cm por comparação com a solução de cloreto de sódio
(4.3.), deve ser de cerca de 75 %. Esta suspensão pode ser conservada
uma semana a cerca de 4 ºC.
4.Meios de cultura e reagentes
4.1.Meio de conservação da estirpe e de base do doseamento (a)
Peptona de carne 6,0 g
Triptona 4,0 g
Extracto de levedura 3,0 g
Extracto de carne 1,5 g
Glucose 1,0 g
Agar 10,0 a 20,0 g
Água 1 000 ml
pH 6,5 (após esterilização)
4.2.Tampão fosfato, pH 6
Hidrogenofosfato de potássio, K2HPO42,0 g
Diidrogenofosfato de potássio, KH2PO48,0 g
Água para 1 000 ml
4.3. Solução a 0,8 % (p/v) de cloreto de sódio: dissolver em água 8 g de
cloreto de sódio, diluir para 1000 ml e esterilizar.
4.4. Metanol.4.5. Mistura de tampão fosfato (4.2.) e de metanol (4.4.): 80/20 (v/v).
4.6. Solução metanólica a 0,5 % (p/v) de Tween 80: dissolver 5 g de Tween
80 en metanol (4.4.) e diluir para 1 000 ml com metanol.
4.7. Substância-padrão: virginiamicina de actividade conhecida.
5.Soluções-padrão
Dissolver uma quantidade pesada com exactidão da substância-padrão (4.7.)
em metanol (4.4.) e diluir com metanol (4.4.) para obter uma solução-mãe a
1 000 µg de virginiamicina/ml. Conservada em frasco rolhado a 4 ºC, esta
solução é estável durante cinco dias.
Preparar a partir desta solução por diluições sucessivas, com a mistura (4.5.),
as soluções seguintes:
S
81 µg/ml
S40,5 µg/ml
S20,25 µg/ml
S10,125 µg/ml
6.Preparação do extracto e das soluções
6.1.Extracção
6.1.1.Produtos cujo teor de virginiamicina não seja superior a 100 mg/
/kg
Pesar 50,0 g de amostra. Adicionar 200 ml de solução (4.6.),
agitar durante 30 minutos, em seguida deixar depositar ou centri-
fugar. Recolher 20 ml do sobrenadante e evaporar até 5 ml, num
evaporador rotativo, a uma temperatura não superior a 40 ºC.
Diluir o resíduo com a mistura (4.5.) para obter uma concen-
tração teórica de virginiamicina de 1 µg/ml (= U8).1972L0199 — PT — 27.08.1999 — 005.001 — 18
(a) Pode ser utilizado qualquer meio de cultura comercial de composição análoga e que dê
os mesmos resultados.
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6.1.2.Produtos cujo teor de virginiamicina seja superior a 100 mg/kg
Pesar uma quantidade de amostra não superior a 10,0 g e
contendo de 1 a 50 mg de virginiamicina. Juntar 100 ml de
solução (4.6.), agitar durante 30 minutos, em seguida deixar
depositar ou centrifugar. Diluir o sobrenadante com a mistura
(4.5.) para obter uma concentração de virginiamicina de 1 µg/ml
(= U8).
6.2.Soluções do extracto
Preparar a partir da solução U8por diluições sucessivas (1 + 1), com a
mistura (4.5.), as soluções U4(concentração teórica: 0,5 µg/ml), U2(concentração teórica: 0,25 µg/ml) e U1(concentração teórica: 0,125 µg/
/ml).
7.Modalidades de doseamento
7.1.Inoculação do meio de cultura
Inocular a cerca de 50 ºC o meio de base de doseamento (4.1.) com a
suspensão bacteriana (3.2.). Por meio de ensaios preliminares em placas
com o meio (4.1.), determinar a quantidade de suspensão bacteriana que
permite obter, para as diferentes concentrações de virginiamicina, zonas
de inibição tão extensas quanto possível, que ainda sejam límpidas.
7.2.Preparação das placas
A difusão em agar efectua-se em placas com as quatro concentrações da
solução-padrão (S8,S4,S2,S1) e as quatro concentrações do extracto (U8,
U4,U2,U1). Cada placa tem de receber as quatro concentrações do
padrão e do extracto. Para este efeito, escolher a dimensão das placas
de tal forma que se possam cavar no meio de agar pelo menos oito cavi-
dades de 10 a 13 mm de diâmetro cujos centros distem pelo menos
30 mm uns dos outros. Podem utilizar-se como placas, placas de Peetri
tendo sobreposto um anel de alumínio ou de matéria plástica de 200 mm
de diâmetro e 20 mm de altura.
Introduzir nas placas uma quantidade do meio (4.1.), inoculado como
indicado em (7.1.), que permita obter uma camada de cerca de 2 mm
de espessura (60 ml para uma caixa de 200 mm de diâmetro). Deixar
solidificar, fazer as cavidades e depositar nelas os volumes exactamente
medidos das soluções-padrão e do extracto (0,10 a 0,15 ml por cavidade,
conforme o diâmetro). Fazer pelo menos quatro repetições de cada
concentração, de forma que cada determinação seja objecto de uma
avaliação de 32 zonas de inibição.
7.3.Incubação
Incubar as placas durante dezasseis a dezoito horas, a 30 ºC ± 2 ºC.
8.Avaliação
Medir o diâmetro das zonas de inibição com a aproximação de 0,1 mm. Para
cada concentração, registar as medidas médias em papel semi-logarítmico,
marcando o logaritmo das concentrações em correlação com o diâmetro das
zonas de inibição. Traçar as rectas mais ajustadas para a solução-padrão e
para o extracto, procedendo, por exemplo, como se segue:
Determinar o ponto mais apropriado do nível mais baixo da solução-padrão
(SL) aplicando a fórmula:
(a) SL ¼7s1þ4s2þs4/C02s8
10
Determinar o ponto mais apropriado do nível mais elevado da solução-padrão
(SH), aplicando a fórmula:
(b) SH ¼7s8þ4s4þs2/C02s1
10
Determinar da mesma maneira os pontos mais apropriados do extracto para o
nível mais baixo (UL) e o nível mais elevado (UH) substituindo, nas
fórmulas acima mencionadas, S1,S2,S4eS8por U1,U2,U4,U8.1972L0199 — PT — 27.08.1999 — 005.001 — 19
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Inscrever os valores SL e SH no mesmo gráfico. Unindo os dois pontos
obtém-se a recta mais ajustada para a solução-padrão. Procedendo da mesma
maneira para UL e UH, obtém-se a recta mais ajustada para o extracto.
Na ausência de qualquer interferência, as rectas devem ser paralelas. Na
prática, consideram-se paralelas quando (SH-SL) e (UH-UL) não diferem
mais de 10 % da sua média.
Se as linhas não forem paralelas, pode eliminar-se quer U1eS1, quer U8eS8.
Os valores SL, SH, UL e UH que permitem obter as rectas mais ajustadas
são então calculados por meio das seguintes fórmulas:
(a′)S L ¼5s1þ2s2/C0s4
6ou5s2þ2s4/C0s8
6
(b′)S H ¼5s4þ2s2/C0s1
6ou5s8þ2s4/C0s2
6
e de fórmulas análogas para UL e UH. A utilização desta alternativa, impõe
que sejam respeitados os mesmos critérios de paralelismo.
A obtenção de um resultado proveniente de três níveis deve ser mencionado
no boletim de análise.
Sendo as rectas consideradas paralelas, calcular o logaritmo da actividade
relativa (log. A) por meio de uma das fórmulas seguintes, segundo o número
de níveis (4 ou 3) utilizados para a avaliação do paralelismo.
Para 4 níveis:
(c) log :A¼u1þu2þu4þu8/C0s1/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;602
u4þu8þs4þs8/C0u1/C0u2/C0s1/C0s2
Para 3 níveis:
(d) log :A¼u1þu2þu4/C0s1/C0s2/C0s4 ðÞ /C2 0;401
u4þs4/C0u1/C0s1
ou
(d′) log :A¼u2þu4þu8/C0s2/C0s4/C0s8 ðÞ /C2 0;401
u8þs8/C0u2/C0s2
Actividade do extracto do extracto da amostra = actividade do padrão corres-
pondente × A:
(U8=S8×A )
Se a actividade relativa se encontrar fora da gama dos valores compreendidos
entre 0,5 e 2,0, repetir a determinação procedendo a ajustamentos das
concentrações do extracto ou, eventualmente, das soluções-padrão. Quando
esta actividade não puder ser introduzida na gama dos valores adequados, o
resultado deve ser considerado como aproximado e esta indicação deve ser
anotada no boletim de análise.
Quando as rectas forem consideradas não paralelas, repetir a determinação.
Se o paralelismo nunca for conseguido, a determinação deve ser considerada
não satisfatória.
Exprimir o resultado em miligramas de virginiamicina por quilograma de
alimento.
9.Reprodutibilidade
A diferença entre os resultados de duas determinações efectuadas na mesma
amostra pelo mesmo analista não deve ultrapassar:
2 mg/kg, em valor absoluto, para os teores de virginiamicina inferiores a
10 mg/kg,
20 % do resultado mais elevado para os teores de 10 a 25 mg/kg,
5 mg/kg, em valor absoluto, para os teores de 25 a 50 mg/kg,10 % do resultado mais elevado para os teores superiores a 50 mg/kg.1972L0199 — PT — 27.08.1999 — 005.001 — 20