1976L0372 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 1
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►BSÉTIMA DIRECTIVADA COMISSÃO
de 1 de Março de 1976
que fica os métodos de análise comunitários para o controlo oficial dos alimentos para animais
(76/372/CEE)
(JO L 102 de 15.4.1976, p. 8)
Alterada por:
Jornal Oficial
n.opágina data
►M1Directiva 81/680/CEE da Comissão de 30 de Julho de 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2Directiva 92/95/CEE da Comissão de 9 de Novembro de 1992 L 327 54 13.11.1992
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SÉTIMA DIRECTIVADA COMISSÃO
de 1 de Março de 1976
que fica os métodos de análise comunitários para o controlo oficial
dos alimentos para animais
(76/372/CEE)
A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,
Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Euro-
peia,
Tendo em conta a Directiva do Conselho de 20 de Julho de 1970, rela-
tiva à introdução dos modos de recolha de amostras e de métodos de
análise comunitários para o controlo oficial dos alimentos paraanimais(
1), com a última redacção que lhe foi dada pelo Acto de
Adesão(2) e, nomeadamente, o seu artigo 2.o,
Considerando que a referida directiva prevê que os controlos oficiais
dos alimentos para animais destinados a verificar o respeito pelascondições exigidas por disposições legislativas, regulamentares ou
administrativas relativas à qualidade e composição dos alimentos para
animais sejam efectuadas mediante modos de recolha de amostras emétodos de análise comunitários;
Considerando que as Directivas 71/250/CEE, 71/393/CEE, 72/199/
/CEE, 73/46/CEE, 74/203/CEE e 75/84/CEE da Comissão,respectivamente de 15 de Junho de 1971(
3), 18 de Novembro de
1971(4), 27 de Abril de 1972(5), 5 de Dezembro de 1972(6), 25 de
Março de 1974(7), e 20 de Dezembro de 1974(8), ficaram já um certo
número de métodos de análise comunitários; que, tendo em conta oestado de adiantamento dos trabalhos desde então efectuados importaadoptar uma sétima série de métodos;
Considerando que as medidas previstas na presente diretiva estão em
conformidade com o parecer do Comité Permanente dos Alimentos
para Animais,
ADOPTOU A PRESENTE DIRECTIVA:
Artigo 1.o
Os Estados-membros deverão estipular que as análises destinadas ao
controlo oficial dos alimentos para animais sejam, no que diz respeitoao teor de aflatoxina B
1, efectuadas em conformidade com os métodos
descritos no Anexo à presente directiva.
Artigo 2.o
Os Estados-membros parão em vigor antes de 1 de Outubro de 1976 as
disposições da presente directiva. Deste facto informarão imediata-
mente a Comissão.
Artigo 3.o
Os Estados-membros são destinatários da presente directiva.1976L0372 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 2
(1)J O n .oL 170 de 3. 8. 1970, p. 2.
(2)J O n .oL 73 de 27. 3. 1972, p. 14.
(3)J O n .oL 155 de 12. 7. 1971, p. 13.
(4)J O n .oL 279 de 20. 12. 1971, p. 7.
(5)J O n .oL 123 de 29. 5. 1972, p. 6.
(6)J O n .oL 83 de 30. 3. 1973, p. 21.
(7)J O n .oL 108 de 22. 4. 1974, p. 7.
(8)J O n .oL 32 de 5. 2. 1975, p. 26.▼M1
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ANEXO
ELEMENTO DA AFLATOXINAB1
A. MÉTODO POR CROMATOGRAFIA MONODIMENSIONAL EM
CAMADA FINA
1. Objectivo e campo de aplicação
O método permite determinar o teor de aflatoxina B1das matérias-
-primas e dos alimentos simples, no entanto, não se aplica a polpa
de citrinos. O limite inferior de determinação é de 0,01 mg/kg
(10 ppb).
Na presença de substâncias de interferência que dificultem as deter-
minações, é necessário recomeçar a análise em conformidade com
o método descrito na parte B, «Determinação de aflatoxina B1, por
cromatografia líquida de alta resolução (HPLC)».
2. Princípio
Submete-se a amostra à extracção por clorofórmio. Filtra-se o
extracto e recolhe-se uma parte alíquota que em seguida se purifica
por cromatografia numa coluna de gel de sílica. Evapora-se o
líquido assim eluído e recolhe-se o seu resíduo com um volume
determinado de clorofórmio ou mistura de benzeno e acetonitrilo.
Submete-se uma parte alíquota desta solução a cromatografia em
camada fina, e determina-se por irradiação UV a quantidade de
aflatocina B1do cromatograma, visualmente ou por fluorometria
densitométrica, comparando com quantidades conhecidas de aflato-
cina B1-padrão. Deverá confirmar-se a detecção de aflatoxina B1extraída do alimento pelos processos adiante indicados.
3. Reagentes
NB:Na ausência de indicações especiais quanto à qualidade dos
reagentes, deverão utilizar-se reagentes da qualidade «para
análise».
3.1. Acetona.
3.2. Clorofórmio, estabilizado com 0,5 a 1,0 % de etanol a 96 % (v/v).
3.3. n-Hexano.3.4. Metanol.3.5. Éter dietílico anido, isento de peróxidos3.6. Mistura de benzeno e de acetonitrilo: 98/2 (v/v).3.7. Mistura de clorofórmio (3.2.) e Metanol (3.4.): 97/3 (v/v).3.8. Gel de sílice, para cromatografia em coluna, com granulometria de
0,05 a 0,20 mm.
3.9. Algodão hidrófilo, préviamente desengordurado com clorofórmio
ou lã de vidro.
3.10. Sulfato de sódio anidro, granulado.3.11. Gás inerte, por exemplo: azoto.3.12. Ácido clorídrico 1 N.3.13. Ácido sulfúrico a 50 % (v/v).3.14. Terra de infusórios (Hiflosupercel) lavada con ácido.
3.15. Gel de sílica G-HR ou equivalente, por cromatografia em camada
fina.
3.16. Solução-padrão, de clorofórmio (3.2.) e cerca de 0,1 µg de aflato-
xina B
1por milímetro da mistura de benzeno e acetonitrilo (3.6.),
preparada e verificada como se indica no ponto 7, contendo a
mesma quantidade de aflatoxina B 1.
3.17. Solução-padrão qualitativa, com cerca de 0,1 µg de aflatoxina B1,e
B2por ml, em el clorofórmo (3.2.) ou mistura de benzeno e aceto-1976L0372 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 3
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nitrilo (3.6.). Estas concentrações são dadas a título indicativo,
devendo ser corrigidas de modo que se obtenha a mesma intensi-
dade de fluorescência com ambas as aflatoxinas.
3.18. Diluentes para revelação:
3.18.1. Clorofórmo (3.2.)/acetona (3.1.): 9/1 (v/v), tina não saturada;
3.18.2. Éter dietílico (3.5.)/metanol (3.4.)/água: 96/3/1 (v/v/v), tina não
saturada;
3.18.3. Éter dietílico (3.5.)/metanol (3.4.)/água: 94/4,5/1,5 (v/v/v), tina
saturada;
3.18.4. Clorofórmio (3.2.)/metanol (3.4.): 94/6 (v/v), tina saturada;
3.18.5 Clorofórmio (3.2.)/metanol (3.4.): 97/3 (v/v), tina saturada.
4. Material
4.1. Triturador — misturador
4.2. Aparalho para agitar ou agitador magnético.
4.3. Filtros franzidos Schleicher e Schül n.o588, ou equivalente com
24 cm de diâmetro.
4.4. Tubos de vidro para cromatografia, (diâmetro interno: 22 mm,
comprimento: 300 mm), com torneira de teflon e reservatório de
250 ml.
4.5. Aparelho para evaporação no vácuo, por rotação com balão de
500 ml de base circular.
4.6. Frascos cónicos de 500 ml, com tampa esmerilada.
4.7. Instrumentos para cromatografia em camada fina.
4.8. Placas de vidro para cromatografia em camada fina, com
200 × 200 mm, preparadas da seguinte maneira (as quantidades
indicadas são suficientes para cobrir cinco placas): introduzir 30 g
de gel de sílica G-HR (3.15.) num frasco cónico, juntar 60 ml de
água, tapar e agitar durante um minuto. Espalhar a suspensão sobre
as placas de forma a obter uma camada uniforme de 0,25 mm de
espessura. deixar secar ao ar e conservar em seguida num secador
com gel de sílica. No momento da utilização, activar as placas
mantendo-as durante uma hora em estufa a 110 º C.
Só deverão utilizar-se placas já preparadas na medida em que com
elas se obtenham resultados semelhantes aos das placas preparadas
como acima se indica.
4.9. Lámpada UV de ondas longas (360 nm), com uma intensidade de
irradiação que permita identificar com nitidez, a uma distância de
10 cm da lâmpada, uma mancha de 1,0 ng de aflatoxina B1sobre
a placa de cromatografia em camada fina.
4.10. Tubos de 10 ml, graduados, e com tampa de polietileno con
tapones de polietileno.
4.11. Espectrofotómetro UV
4.12. Fluordensitómetro (eventualmente).
5. Método
5.1. Preparação da amostra (ver «observações», parte C, ponto 1)
Triturar a amostra de modo a passar integralmente através de uma
peneira com malha de 1 mm (de harmonia com a recomendação
ISO R 565).
5.2. Extracção
Introduzir 50,0 g da amostra moída e homogeneizada num frasco
cónico de 500 ml (4.6.). Juntar 25 g de terra de infusórios (3.14.),
25 ml de água e 250 ml de clorofórmio (3.2.). Tapar o frasco,
sacudir ou agitar durante 30 minutos no aparelho (4.2.) e filtrar no
filtro franzido (4.3.). Deitar fora os 10 primeiros ml do filtrado e
recolher em seguida 50 ml.
5.3. Purificação en coluna
Colocar na extremidade inferior de um tubo para cromatografia
(4.4.) um tampão de algodão ou lã de vidro (3.9.), encher dois1976L0372 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 4
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terços do tubo com clorofórmio (3.2.) e juntar 5 g de sulfato de
sódio (3.10.).
Verificar se a superfície superior da camada de sulfato de sódio se
aoresenta plana e, seguidamente, juntar 10 g de gel de sílica, por
pequenas fracções (3.8.) Mexer com cuidado, após cada adição
fracções (3.8.). Mexer com cuidado, após cada adição, para
eliminar as bolhas de ar.
Deixar depositar, durante 15 minutos, e em seguida juntar com
precaução, 15 g de sulfato de sódio (3.10.). Deixar descer o líquido
até quase à superfície superior da camada de sulfato de sódio.
Misturar os 50 ml de extracto recolhido em (5.2.) com 100 ml de n-
-hexano (3.3.) e passar quantitativamente a mistura para a coluna.
Deixar descer o líquido até à superfície superior da camada de
sulfato de sódio. Retirar o líquido e juntar em seguida 100 ml de
éter dietílico (3.5.) deixando de novo descer o líquido até à
superfície superior da camada de sulfato de sódio. Durante estas
operações controlar o débito de líquido para que seja de 8 a 12 ml
por minuto e não deixar que a coluna fique em seco. Deitar fora os
líquidos vasados. Seguidamente, eluir com 150 ml da mistura de
clorofórmio e metanol (3.7.) e recolher a totalidade do líquido
eluído.
Proceder à evaporação do líquido eluído, practicamente a seco, sob
corrente de gaz inerte (3.11.) e a uma temperatura que não ultra-passe os 50 ºC, por meio do aparelho de evaporação por rotação
no vácuo (4.5.). Com clorofórmio (3.2.) ou mistura de benzeno e
acetonitrilo (3.6.), passar quantitativamente o resíduo para um tubo
de 10 ml (4.10.). Concentrar a solução sob corrente de gás inerte
(3.11.) e completar em seguida o volume, com clorofórmio (3.2.)
ou mistura de benzeno e acetonitrilo (3.6.), até obter 2,0 ml.
5.4. Cromatografia em camada fina
Colocar pontualmente sobre a placa para cromatografia em camada
fina (4.8.), a 2 cm de bordo inferior e com intervalos de 2 cm, os
volumes abaixo indicados de solução-padrão e de extracto:
— 10, 15, 20, 30 e 40 µl de solução-padrão de aflatoxina B
1(3.16.);
— 10 µl do extracto obtido em 5.3. e, sobrepostos nos mesmos
pontos, 20 µl de solução-padrão (3.16.);
— 10 y 20 µl do extracto obtido em 5.3.
Elaborar o cromatograma ao abrigo da luz, com um dos diluentes
indicados para o efeito (3.18.). A escolha do diluente, que deveráter sido feita previamente, faz-se colocando sobre a placa 12 µl da
solução-padrão qualitativa (3.17.) e verificando em seguida se as
aflatoxinas B
1eB2ficam completamente separadas durante a
operação.
Deixar evaporar os diluentes ao abrigo da luz e fazer em seguida a
irradiação com a lâmpada UV, colocando a placa a 10 cm da
distância da mesma (4.9.). A fluorescência das manchas da aflato-
xina B1é de cor azul.
5.5. Determinaçoes quantitativas
Proceder às determinações, visualmente ou por fluorometriadensito-
métrica, como adiante se indica:
5.5.1. Medição visual
Determinar a quantidade de aflatoxina B, existente no extracto
comparando a intensidade de fluorescência das respectivas manchas
com a das manchas da solução-padrão, se necessário por interpo-
lação-padrão deverá ser superior à dos 10 µl de extracto e dela
deverá apenas resultar uma mancha. Se a intensidade da fluo-
rescência dos 10 µl de extracto for superior à dos 40 µl da solução
padrão, diluir o extracto 10 ou 100 vezes antes de submeter a nova
cromatografia sobre camada fina, em clorofórmio (3.2.) ou na
mistura de benzeno e acetonitrilo (3.6.).
5.5.2. Medição por fluorometriadensitómétrica
Medir a intensidade da fluorescência das manchas de aflatoxina B1com o fluorodensitómetro (4.12.), utilizando um comprimento de
onda de excitação de 365 nm e um comprimento de onda de
emissão de 443 nm. Determinar a quantidade de aflatoxina B1dos1976L0372 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 5
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depósitos contidos no extracto comparando as intensidades de fluo-
rescência das manchas do extracto com as da solução-padrão.
5.6. Confirmação da detecção de aflatoxina B1
Confirmar a detecção de aflatoxina B1existente no extracto pelos
seguintes processos:
5.6.1. Tratamento por ácido sulfúrico
Pulverizar o cromatograma obtido em (5.4.) com ácido sulfúrico
(3.13.). Com a irradiação UV, a fluorescência das manchas de afla-
toxina B1deverá passar do azul ao amarelo.
5.6.2. Cromatografia bidimensional levando à formação de
aflatoxina B1— hemiacetal (aflatoxina B2a)
NB:As operações adiante descritas deverão ser efectuadas segundo
e esquema apresentado na figura 3.
5.6.2.1. Aplicação das soluãões
Traçar sobre uma placa de cromatografia (4.8.) duas rectas, para-
lelas respectivamente a dois lados contíguos da placa cada uma
6 cm de distância do lado a que é paralela. Estas rectas destinam-
-se a demarcar p movimento dos bordos dos diluentes. Com pipetas
capilares ou microseringas colocar sobre uma placa as sequintes
soluções:
—no ponto A: um volume de extracto purificado da amostra
obtida em (5.3.) contendo aproximadamente 2,5 nanogramas
de aflatoxina B1;
—nos pontos B e C: 25 µl de solução-padrão (3.16.).
5.6.2.2. Revelação
Elaborar o cromatograma segundo a direcção I com diluente para
revelação (3.18.1.) [uma camada de 1 cm em tina não saturada] aoabrigo da luz, até que o bordo do diluente atinja a linha de demar-
cação.
Retirar a placa da tina, deixando-a secar durante 5 minutos ao
abrigo da luz à temperatura ambiente. Pulverizá-la em seguida
com ácido clorídrico (3.12.), mas apenas ao longo de uma faixa
vem indicada a tracejado na figura 3, até ao seu escurecimento,
devendo o resto da placa ter sido protegido com uma placa de
vidro. Deixar reagir durante dez minutos na obscuridade e secar
por corrente de ar à temperatura ambiente.
Elaborar em seguida o cromatograma segundo a direcção II com
diluente de revelação (3.18.1.) [camada de 1 cm em tina não satu-
rada], ao abrigo da luz, até que o bordo do diluente atinja a linha
de demarcação. Retirar a placa da tina e deixar secar à temperatura
ambiente.
5.6.2.3. Interpretação do cromatograma
Examinar o cromatograma à luz (UV (4.9.) e observar a existência
ou não do seguinte:
a) Aparecimento de uma mancha fluorescente azul correspondente
à aflatoxina B
1proveniente da solução-padrão utilizada em C
(movimento na direcção I).
b) Aparecimento de uma mancha fluorescente azul correspondente
à aflatocina B1(que não reagiu ao ácido clorídrico) e de outra
mancha fluorescente azul, mais intensa correspondente à aflato-
xina B1-hemiacetal proveniente da solução-padrão utilizada em
B (movimento na direcção II).
c) Aparecimento de manchas semelhantes às indicadas na alínea
b), provenientes do extracto da amostra utilizado em A. A
posição dessas manchas define-se pela distância percorrida pela
aflatoxina B1, a partir do ponto A, na direcção I (igual à percor-
rida pela solução-padrão utilizada em C) seguida das distâncias
percorridas na direcção II pela aflatocina B1-hemiacetal (distân-
cias iguais às percorridas pela solução padrão utilizada em B).
As intensidades de fluorescência das manchas de hemiacetal
proveniente do extracto e da solução-padrão utilizada em B
deverão coincidir.1976L0372 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 6
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6. Cálculo dos resultados
6.1. A partir da medição visual
Calcula-se o teor de aflatoxina B1, em microgramas por quilograma
de amostra (ppb), mediante a seguinte fórmula:
S/C1Y/C1V
W/C1X
em que:
Y e X correspondem respectivamente aos volumes em microlitros
de solução-padrão de aflatoxina B1(3.16.) e de extracto com fluo-
rescências de intensidade semelhante;
S = concentração de aflatocina B1, em microprogramas por ml
de solução-padrão (3.16.);
V = volume final do extracto em microlitros, tendo em conta as
eventuais dilui-ões;
W = peso, em gramas, da quantidade da amostra de ensaio
correspondente ao colume de extracto submetido a purifi-
cação em coluna.
6.2. A partir da fluorodensitometria
Calcula-se o teor de aflatoxina B1, em microgramas por quilograma
de amostra (ppb) mediante a seguinte fórmula:
S/C1V
W/C1Y
em que:
Y = volume em microlitoros do extracto colocado na placa (10
ou 20 µl);
S = quantidade de aflatoxina B1, em nanogramas (contida no
extracto colocado sobre a placa proporcional a Y), obtida
na mediçã0.
V = volume final do extracto em microlitros, cujo valor deverá
ter em conta as diluições que tenha sido necessário fazer;
W = peso em gramas, da amostra de ensaio correspondente ao
colume de extracto submetido a purificação em coluna.
7. Preparação e verificação da solução-padrão (3.16.)
7.1. Determinação da concentração de aflatocina B1
Preparar uma solução de aflatoxina B1— padrão em clorofórmio
(3.2.) ou mistura de benzeno e acetonitrilo (3.6.) a uma concen-
tração de 8 a 10 µg por mililitro e, com o espectrofotómetro
(4.11.), determinar o espectro de absorção entre 330 e 370 nm.
Medir a densidade óptica (a) 363 nm, caso tenha sido utilizada a
solução clorofórmica ou a 348 nm cas tenha sido utilizada a
mistura de benzeno e acetonitrilo.
Calcular a concentração de aflatoxina B1, em microgramas por
mililitro de solução, a partir das fórmulas seguintes:
312/C1A/C11000
20600(para a solução clorofórmica);
312/C1A/C11000
19800(para a solução com mistura de benzeno e acetoni-
trilo).
Efectuar, ao abrigo da luz, as diluições necessárias à obtenção de
uma solução-padrão de trabalho cuja concentração de aflatoxina
B1, seja aprocimadamente de 0,1 µg por mililitro. Conservada no
frigorífico a 4º C, esta solução mantém-se estável durante duas
semanas.1976L0372 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 7
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7.2. Verificação da pureza cromatográfica
Colocar sobre uma placa (4.8.) 5 µl de solução-padrão com 8-10 µg
de aflatoxina B1por mililitro (ver 7.1.). Elaborar o cromatograma
como se indica em (5.4.). A luz UV, a fluorescência apenas deverá
permitir a percepção de uma única mancha, não devendo observar-
-se qualquer fluorescência na zona em que se havia feito a primeira
deposição.
8. Possibilidade de repetição
A diferença entre os resultados e duas determinações paralelas,
efectuadas com a mesma amostra pelo mesmo analista não deverá
ultrapassar:
— 25 % em relação aos máximos valores obtidos com teores entre
10 e 20 µg/kg de aflatoxina B1,
— 5 µg, em valores absolutos, para teores entre 20 e 50 µg/kg,— 10 % em relação aos mácimos valores obtidos com teores supe-
riores a 50 µg/kg.
9. Reprodutibilidade
Ver «observações», parte C, ponto 2.
B. DETERMINAÇÃO DE AFLATOXINA B
1POR CROMATOGRAFIA
LÍQUIDA DE ALTA RESOLUÇÃO (HPLC)
1. Objectivo e campo de aplicação
O método permite determinar o teor de aflatoxina B1em alimentos
para animais, incluindo aqueles que contenham polpa de citrinos. O
limite inferior de determinação é de 0,001 mg/kg (1 ppb).
2. Resumo do processo
O método é baseado na separação por cromatografia líquida de alta
resolução (HPLC), com detecção de fluorescência. A amostra é
extraída com clorofórmio, sendo o extracto sujeito a filtração. Puri-
fica-se uma alíquota, por um cartucho de Florisil seguido de um
outro de C18. Para a separação final e doseamento recorre-se a
uma coluna de HPLC de fase inversa, derivatização post coluna
com uma solução aquosa de iodo e detecção por fluorescência.
NotaAs micotoxinas são substâncias extremamente tóxicas, pelo
que a sua manipulação deve ser efectuada em hottes. Devem ser
tomadas precauções especiais quando as micotoxinas se apresentam
sob forma liofilizada porque, pela sua natureza electrostática, têm
tendência para dispersão nas áreas de trabalho.
3. Reagentes e auxiliares
3.1. Clorofórmio, estabilizado com 0,5 a 1,0 % de etanol (m/m). Ver
ponto 10.2.
3.2. Metanol, para HPLC, para preparação de 3.6.
3.3. Acetona.3.4. Acetonitrilo, para HPLC.3.5. Solventes de eluição: preparar um dia antes de utilização ou
proceder à remoção do ar por meio de ultra-sons.
3.5.1. Mistura acetona (ponto 3.3) e água (98 + 2) (v + v).3.5.2. Mistura água e metanol (ponto 3.2) (80 + 20) (v + v).3.5.3. Mistura água e acetona (ponto 3.3) (85 + 15) (v + v).3.6. Fase móvel para HPLC:
Mistura água, metanol (ponto 3.2) e acetonitrilo (ponto 3.4)
(130 + 70 + 40) (v + v + v).
NotaA composição dos solventes a utilizar na fase móvel poderá
requerer ajustamentos, de acordo com o tipo de coluna utilizada em
HPLC.1976L0372 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 8
▼M2
▼M2
3.7. Solução aquosa saturada de iodo: adicionar 2 g de iodo a 400 ml de
água. Dissolver sob agitação, durante pelo menos 90 minutos e
filtrar com o auxílio de um filtro tipo Millipore (ponto 4.15).
Proteger a solução da luz, de modo a evitar processos de fotodegra-
dação.
3.8. Celite 545 lavada com ácido, ou equivalente.3.9. Cartucho de Florisil (Waters SEP-PAK), ou equivalente.3.10. Cartucho de C
18(Waters SEP-PAK), ou equivalente.
3.11. Gás inerte, por exemplo, azoto.
3.12. Solução-padrão de aflotoxina B1, em clorofórmio, concentração
10 µg/ml. Verificar a concentração da solução do seguinte modo:
traçar o espectro de absorção da solução entre 330 e 370 nm, por
meio de um espectrofotómetro (ponto 4.23). Medir a absorvência
(A) a um máximo de 363 nm. Calcular a concentração de aflato-
xina B1, expressa em microgramas por mililitro da solução, através
da fórmula:
Concentra¸ c˜ao èmg =ml ðÞ ¼312/C2A/C21000
22300¼13;991/C2A
3.12.1. Solução-mãe da solução-padrão de aflotoxina B1, em clorofórmio.
Transferir de um modo quantitativo, 2,5 ml da solução-padrão
(ponto 3.12) para um balão volumétrico de 50 ml, perfazendo com
clorofórmio (ponto 3.1), até ao traço de referência. Homogeneizar.
Conservar o balão hermeticamente fechado, envolvido em folha dealumínio, em local fresco (4 ºC) e ao abrigo da luz.
3.13. Soluções de calibração de aflatoxina B
1para HPLC.
NotaNa preparação das soluções utilizar material de vidro lavado
com ácido (ver ponto 4, Equipamento).
3.13.1. Solução de calibração de 4 ng/ml.
Deixar estabilizar, à temperatura ambiente, o balão que contém a
solução-mãe (ponto 3.12.1), envolvido na folha de alumínio,
durante algumas horas. Transferir 400 µl da solução-mãe (200 ng
de aflatoxina B1) para um balão volumétrico de 50 ml, evaporando
à secura sob uma corrente de gás inerte (ponto 3.11). Dissolver o
resíduo obtido com cerca de 20 ml da mistura água/acetona (ponto
3.5.3), completando até ao traço de referência com a mesma
solução. Homogeneizar.
3.13.2. Solução de calibração de 3 ng/ml.
Transferir quantitativamente 7,5 ml da solução de calibração (ponto
3.13.1) para um balão volumétrico de 10 ml e perfazer até ao traço
de referência com a mistura água/acetona (ponto 3.5.3). Homoge-
neizar.
3.13.3. Solução de calibração, de 2 ng/ml.
Transferir quantitativamente 25 ml da solução da calibração (ponto
3.13.1) para um balão volumétrico de 50 ml e perfazer até ao traço
de referência com a mistura água/acetona (ponto 3.5.3). Homoge-
neizar.
Esta solução deverá também ser utilizada para injecção repetida
durante o processo HPLC, sendo adiante designada por padrão de
referência (ponto 5.5).
3.13.4. Solução de calibração de 1 ng/ml.
Transferir quantitativamente 2,5 ml da solução de calibração (ponto
3.13.1) para um balão volumétrico de 10 ml e perfazer até ao traço
de referência com a mistura água/acetona (ponto 3.5.3). Homoge-
neizar.
3.14. Balão contendo uma mistura de aflatoxinas B1,B2,G1eG2de
concentrações aproximadas 1, 0,5, 1 e 0,5 µg/ml, respectivamente,
em 1 ml de clorofórmio.
3.14.1. Solução para ensaio cromotográfico.
Transferir o conteúdo do balão (ponto 3.14) para um tubo de ensaio
de vidro munido de rolha, ou para um frasco pequeno com tampa
de rosca. Transferir 40 µl desta solução para um tubo de vidro de1976L0372 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 9
▼M2
10 ml, munido de rolha (lavado com ácido) (ponto 4.22). Evaporar
o clorofórmio sob corrente de gás inerte (ponto 3.11) e dissolver de
novo, em 10 ml de mistura de água/acetona (ponto 3.5.3). Poderá
haver necessidade de guardar em local fresco e escuro, 6 a 8 horas,
até dissolução completa.
3.15. Reagentes para o ensaio de confirmação (ponto 6).3.15.1. Solução aquosa saturada da NaCI.3.15.2. Sulfato de sódio anidro, granulado.
4. Aparelhos e utensílios
Atenção: o uso de material de vidro que não tenha sido lavado
previamente com ácido, para as soluções aquosas de aflatoxinas,
pode ocasionar perdas. Deverão tomar-se cuidados especiais com
o uso de material de vidro novo e material de vidro não reutilizável
tal como frascos de auto-amostragem e pipetas Pasteur. Assim, todo
o material de vidro que tenha contacto com soluções aquosas de
aflatoxinas deve ser imerso em ácido (por exemplo, ácido sulfúrico,
C = 2 mol/l) durante algumas horas e, posteriormente, bem lavado
com água destilada, de modo a remover quaisquer vestígios deácido (por exemplo, três vezes, verificando com papel indicador).
Na prática, este tratado torna-se necessário para o balão de fundo
redondo (ponto 4.4), balões volumétricos, provetas, frascos ou
tubos utilizados para as soluções de calibração e para os extractos
finais (particularmente os fracos de auto-amostragem), bem como
as pipetas Pasteur eventualmente usadas para a transferência das
soluções de calibração ou dos extractos.
4.1. Triturador/misturador.
4.2. Crivo com malha de 1,0 mm (ISO R 565).
4.3. Agitador mecânico.4.4. Evaporador rotativo de vácuo, equipado com um balão de fundo
redondo de capacidade compreendida entre 150 e 250 ml.
4.5. Aparelho para cromatografia líquida de alta resolução, equipado
com injector apropriado para injecções de 250 µl. Ver instruções
do fabricante para enchimento total ou parcial do loop.
4.6. Coluna analítica para HPLC, com enchimento de C
18de 3 µm —
5 µm de partícula.
4.7. Bomba pneumática para o débito do reagente do iodo, post coluna .
4.8. Unta em T de volume morto nulo, em aço inoxidável (1/16 ″
× 0,75 mm).
4.9. Reactor em espiral de teflon ou aço inoxidável. As dimensões
compreendidas entre 3 000 × 0,5 mm e 5 000 × 0,5 mm têm-se
revelado apropriadas para combinação com colunas de HPLC de
partículas de 5 µm ou 3 µm.
4.10. Banho equipado com controlo termostático, ajustado para 60 ºC,
susceptível de regular a temperatura com uma precisão de ± 0,1 ºC.
4.11. Detector de fluorescência, susceptível de fornecer um comprimento
de onda de excitação da ordem de 365 nm e um comprimento de
onda de emissão da ordem de 435 nm (no caso de aparelhos com
filtro, o comprimento de onda de emissão deverá ser superior a
400 nm). Deverá ser possível a detecção de quantidades de aflato-
xina B1da ordem de 0,05 ng.
Com vista a eliminar eventuais bolhas de ar presentes na célula,
poderá ser necessário utilizar uma certa contra-pressão (por
exemplo, através da ligação de uma válvula ou espiral de teflon
ou de aço inoxidável, à saída do detector).
4.12. Registador contínuo.
4.13. Integrador electrónico (opcional).4.14. Papel de filtro plissado, diâmetro: 24 cm. Macherey-Nagel 617 1/4,
ou equivalente.
4.15. Filtro de membrana de porosidade 0,45 µm. Millipore HAWP
04700 ou equivalente.
4.16. Erlenmeyer de 500 ml, munido de rolha de vidro.1976L0372 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 10
▼M2
4.17. Coluna de vidro (diâmetro interno aproximado 1 cm, comprimento
aproximado 30 cm), equipada com uma ponta Luer.
4.18. Torneira Luer de nylonresistente ao clorofórmio (Bio-rad 7328017,
Analytichem A1 6078, J.T. Baker 4514 ou equivalente).
4.19. Seringa Luer de 10 ml, resistente ao ataque químico.
4.20. Seringa apropriada para HPLC, para injecções de 250 µl (ver ponto
4.5).
4.21. Microsseringa de 100 µl, para preparação das soluções de cali-
bração (verificar, por pesagem, que a precisão é da ordem de 2 %).
4.22. Tubos de vidro de 10 ml, munidos de rolha.4.23. Espectrofotómetro apropriado para determinações na zona do UV.4.24. Equipamento para o ensaio de confirmação (ponto 6).4.24.1. Ampola de decantação de 100 ml, com torneira de teflon, lavada
com ácido.
4.24.2. Unidade de aquecimento 40-50 ºC.
5. Técnica
5.1. Preparação da amostra para análise
Triturar a amostra de modo a que esta passe pelo crivo (ponto 4.2).
5.2. Toma para análise
Pesar para um Erlenmeyer (ponto 4.16) 50 g da amostra previa-
mente preparada.
5.3. Extracção
Adicionar 25 g de Celite (ponto 3.8), 250 ml de clorofórmio (ponto
3.1) e 25 ml de água à amostra (ponto 5.2). Rolhar o Erlenmeyer e
agitar durante 30 minutos com o auxílio de um agitador mecânico
(ponto 4.3). Filtrar através de filtro plissado (ponto 4.14), reco-
lhendo 50 ml de filtrado. Se necessário tomar uma alíquota do
filtrado e diluir para 50 ml em clorofórmio, de modo a que a
concentração de aflatoxina B
1não seja superior a 4 ng/ml.
5.4. Purificação da amostra (as operações devem efectuar-se sem inter-
rupções significativas).
Cuidados a ter:
— proteger convenientemente as salas de trabalho onde são efec-
tuadas as análises da luz do dia. Isto pode ser conseguido,
usando:
1. Janelas com filtros de radiação UV em associação com luz
difusa (evitar luz solar directa);
2. Cortinas ou persianas em associação com luz artificial (os
tubos de fluorescência são aceitáveis),
— proteger o mais possível da luz as soluções que contêm aflato-
xinas (armazenar em local escuro e envolver em folha de
alumínio).
5.4.1. Purificação por cartucho de Florisil.
5.4.1.1. Preparação do sistema coluna-cartucho.
Adaptar uma torneira (ponto 4.18) à extremidade mais curta do
cartucho de Florisil (ponto 3.9) (ver figura 1). Lavar o cartucho:
utilizando uma seringa de 10 ml (ponto 4.19), efectuar uma toma
de 10 ml de clorofórmio (ponto 3.1) e proceder à remoção do ar,
mediante a injecção pela torneira de 8 ml de clorofórmio,
fazendo-o passar rapidamente através do cartucho. Ligar a extremi-
dade mais longa do cartucho a uma coluna de vidro (ponto 4.17) e
fazer passar os restantes 2 ml de clorofórmio para a coluna, através
do cartucho. Fechar a torneira e remover a seringa.
5.4.1.2. Purificação.
Introduzir o filtrado recolhido no ponto 5.3 no conjunto coluna-
-cartucho de Florisil e fazer escoar por acção da gravidade. Lavar
com 5 ml de clorofórmio (ponto 3.1), seguidos de 20 ml de
metanol (ponto 3.2). Desprezar os eluídos. Durante a execução1976L0372 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 11
▼M2
destas operações, assegurar que o sistema coluna-cartucho não
seque.
Eluir a aflatoxina B1com 40 ml de mistura acetona/água (ponto
3.5.1), recolhendo a totalidade de eluído no balão de fundo redondo
do evaporador rotativo (ponto 4.4). Concentrar o eluído no evapo-
rador rotativo, a 40 º — 50 ºC, até terminar a destilação da acetona
(nota:nesta altura, permanecem no balão cerca de 0,5 ml de
líquido. A experiência tem revelado que o prosseguimento da
evaporação não prejudica o processo e que a quantidade de acetona
presente em 0,5 ml de líquido não é significativa. Resíduos de
acetona eventualmente presentes poderiam originar perdas de afla-
toxina B1no cartucho de C18). Juntar 1 ml de metanol (ponto 3.2),
agitar o balão, com vista a dissolver os resíduos de aflatoxina B1,
presentes nas paredes, e adicionar 4 ml de água, agitando. Desligar
e eliminar o cartucho de Florisil. Lavar a coluna com água e
guardá-la para o processo de purificação com C18.
5.4.2. Purificação por cartucho de C18
5.4.2.1. Preparação do sistema coluna-cartucho
Adaptar uma torneira (ponto 4.18) à extremidade mais curta de um
cartucho de C18(ponto 3.10) (ver figura 1). Com o auxílio de uma
seringa (ponto 4.19), remover o ar do cartucho, mediante a injecção
rápida pela torneira de 10 ml de metanol (ponto 3.2) (as bolhas de
ar no interior do invólucro são visíveis sob a forma de pontos lumi-
nosos num fundo acinzentado). Proceder à toma de 10 ml de água
numa outra seringa e fazer passar 8 ml através do cartucho (evitar a
introdução de ar no mesmo, durante a mudança do metanol para a
água). Adaptar a extremidade mais longa do cartucho à coluna devidro (ponto 4.17) e fazer passar os restantes 2 ml para a coluna,
através do cartucho. Fechar a torneira e remover a seringa.
5.4.2.2. Purificação
Transferir quantitativamente para a coluna (ponto 4.17) o extracto
recolhido no ponto 5.4.1.2 e lavar o balão com duas porções de
5 ml de mistura água/metanol (ponto 3.5.2), deixando escoar por
acção da gravidade. Durante a execução destas operações, evitar a
secagem do sistema coluna-cartucho (se ocorrer a formação de
bolhas de ar no estreitamento próximo do cartucho interromper o
fluxo e bater levemente no topo da coluna, de forma a eliminá-las,
retomando em seguida as operações). Eluir com 25 ml de mistura
água/metanol (ponto 3.5.2), desprezando o eluído. Eluir a aflato-
xina B
1com 50 ml de mistura água/acetona (ponto 3.5.3) e
recolher a totalidade do eluído num balão volumétrico de 50 ml.
Completar até ao traço de referência com água e homogeneizar; a
solução resultante é utilizada no ensaio cromatográfico (ponto 5.5).
Atenção: Em geral, não é necessário filtrar o extracto final antes
do processo de HPLC. Se, contudo, se verificar a neces-
sidade de tal operação, dever-se-á evitar o uso de filtros à
base de celulose, susceptíveis de ocasionar perdas de
aflatoxina B1. Poder-se-ão utilizar filtros de teflão.
5.5. Cromatografia líquida de alta resolução.
(Ver a figura 2 para a montagem do equipamento). Prever o tempo
suficiente para permitir o condicionamento e a estabilização dos
aparelhos, antes do uso.
Nota 1
Os valores indicados para os fluxos do solvente e do reagente post
coluna são fornecidos a título meramente indicativo, podendo
necessitar de ajustamentos, em função das características da coluna,
de HPLC.
Nota 2
A eficiência da resposta do detector para as aflatoxinas depende da
temperatura, razão pela qual se deve efectuar a compensação do
desvio (ver figura 3), através da injecção de uma quantidade fixa
de padrão de referência de aflatoxina B1(ponto 3.13.3), com inter-
valos regulares (por exemplo, de três em três injecções). Os valores
dos picos de aflatoxina B1entre estes padrões de referência podem
ser corrigidos, usando o valor médio das respostas, desde que a
diferença observada entre os valores dos picos das respostas conse-
cutivas, correspondentes aos padrões de referência, seja reduzida
(< 10 %). Por tal facto, devem-se efectuar as injecções ininterrupta-
mente. Se for necessário proceder a uma interrupção, a última1976L0372 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 12
▼M2
injecção anterior e a primeira injecção posterior a esta deverão ser
de padrão de referência (ponto 3.13.3). Na medida em que a curva
de calibração se apresenta sob a forma de uma recta que passa pela
origem, a determinação das quantidades de aflatoxina B1nos
extractos da amostra efectua-se directamente por referência aos
padrões adjacentes.
5.5.1. Regulação da bomba de HPLC
Regular a bomba do aparelho de HPLC (ponto 4.5) de modo a
obter um fluxo de 0,5 ou 0,3 ml/min, para uma coluna de HPLC
de 5 µm ou 3 µm de partícula (ponto 4.6) respectivamente, utili-
zando a fase móvel (ponto 3.6).
5.5.2. Regulação da bomba para a reacção post coluna
Regular a bomba (ponto 4.7) de modo a obter um fluxo de 0,2-
-0,4 ml/min de solução aquosa saturada de iodo (ponto 3.7). A
título indicativo: é aconselhável a utilização de fluxos da ordem
de 0,4 ou 0,2 ml/min, associados a fluxos da fase móvel (ponto
3.6) de 0,5 ml/min e 0,3 ml/min, respectivamente.
5.5.3. Detector de fluorescência
Regular o detector de fluorescência (ponto 4.11), para um compri-
mento de onda de excitação de 365 nm e um comprimento de onda
de emissão de 435 nm (no caso de aparelhos com filtro: superior a
400 nm). Ajustar o atenuador de modo a obter, para 1 ng de aflato-
xina B1, uma deflexão da caneta do registador de cerca de 80 % da
escala total.
5.5.4. Injector
Injectar, para todas as soluções, quantidades da ordem de 250 µl,
procedendo de acordo com as instruções do fabricante do injector.
5.5.5. Verificação da separação cromatográfica
Injectar a solução para ensaio cromatográfico (ponto 3.14.1). As
inflexões observadas na curva registada deverão ser inferiores a
5 % da soma das alturas dos picos adjacentes.
5.5.6. Verificação da estabilidade do sistema
Antes da cada série de análises, proceder à injecção repetida de
padrão de referência (ponto 3.13.3), até obtenção de picos com
áreas estáveis (nota:os picos produzidos pela aflatoxina B1não
deverão apresentar, em injecções consecutivas, diferenças supe-
riores a 6 %). Proceder de imediato à verificação da linearidade
(ponto 5.5.7).
5.5.7. Verificação de linearidade
Injectar as soluções de calibração de aflatoxina B1(ponto 3.13.1 a
3.13.4). Utilizar em cada terceira injecção o padrão de referência
(ponto 3.13.3), para correcção do desvio das respostas (nota:os
picos relativos ao padrão de referência não deverão apresentar dife-
renças superiores a 10 % em 90 minutos). Corrigir o desvio de
acordo com a fórmula indicada no ponto 7. O gráfico de calibração
deve apresentar a forma de uma recta que passa pela origem, com
um erro padrão inferior a duas vezes o valor estimado de Y. Os
valores encontrados não deverão diferir em mais de 3 % dos
valores nominais. Se os requisitos forem satisfeitos, prosseguir de
imediato. No caso contrário, identificar e corrigir as causas do
problema, antes de continuar o processo.
5.5.8. Injecção dos extractos da amostra
Injectar os extractos da amostra purificada (ponto 5.4.2.2). Após
cada série de dois extractos da amostra, repetir a injecção do
padrão de referência (ponto 3.13.3), de acordo com a ordem
seguinte: padrão de referência, extracto, extracto, padrão de
referência, extracto, extracto, padrão de referência, etc.
6. Ensaio de confirmação
6.1. Tratamento subsequente do extracto (ponto 5.4.2.2)
Juntar 5 ml de solução de NaCI (ponto 3.15.1) ao extracto final
obtido no ponto 5.4.2.2. Extrair três vezes com 2 ml de clorofórmio
((ponto 3.1) durante um minuto, por recurso à ampola de decan-
tação (ponto 4.24.1). Verter os extractos de clorofórmio recolhidos
e combinados, numa proveta de 10 ml, através de cerca de 1 g de1976L0372 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 13
▼M2
sulfato de sódio (ponto 3.15.2). Poder-se-á usar um funil de
pequenas dimensões (diâmetro de 4 cm), colocando na parte infe-
rior um pedaço de algodão coberto com cerca de 1 g de sulfato de
sódio (ponto 3.15.2).
Lavar a camada de sulfato com alguns mililitros de clorofórmio,
recolhendo na mesma proveta ou ampola. Evaporar à secura o
extracto de clorofórmio na proveta, por recurso à unidade de aque-
cimento (ponto 4.24.2), redissolvendo-o em 1 ml de clorofórmio.
6.2. Preparação do derivado e cromatografia em camada fina
Ver Directiva 76/372/CEE do Conselho, anexo, método A, ponto
5.6.2.
7. Cálculo e resultados
Calcular o teor de aflatoxina B1presente na amostra, expresso em
µg/kg, por recurso à fórmula seguinte:
Teor de aflatoxina B 1em èmg =kg¼m/C2Vext
Vm/C2M/C2Vf
Vc
na qual:
m = quantidade de aflatoxina B1, em expressa em ng, represen-
tada pelo pico B1da amostra, calculada do modo que se
segue:
m¼P amostraðÞ
Ps t1ðÞ þPs t2ðÞ/C22rs tðÞ
sendo:
P(amostra) = área do pico correspondente à aflatoxina B1na
amostra.
B(st1) = área do pico correspondente à aflatoxina B1no
padrão de referência precedente (ponto 3.13.3).
P(st2) = área do pico correspondente à aflatoxina B1no
padrão de referência seguinte (ponto 3.13.3).
r(st) = quantidade de aflatoxina B1, no padrão de
referência (ponto 3.13.3) injectado, expressa em ng.
Vm= volume do extracto de amostra injectado, expresso
em ml.
Vext= volume final do extracto de amostra, expresso em
mililitros, tendo em atenção qualquer diluição que
tenha sido efectuada (ver ponto 5.3).
M = massa da amostra, expressa em gramas.V
f= volume de filtrado transferido para o cartucho de
Florisil (ponto 5.4.1.2), expresso em mililitros.
Vc= volume de clorofórmio utilizado para a extracção
da amostra, expresso em mililitros.
Seguindo o procedimento descrito no presente método, a fórmula
referida reduz-se a:
teor de aflatoxina B1, em µg/kg = 20 × m.
7.1. O cálculo dos resultados pode-se também fazer por recurso à
medida da altura dos picos.
8. Repetibilidade:
ver ponto 10.1.
9. Reprodutibilidade:
ver ponto 10.1.1976L0372 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 14
▼M2
10. Observações
10.1. Precisão
Um estudo interlaboratorial(1), efectuado à escala internacional
com alimentos compostos para animais, forneceu, no que respeita
à repetibilidade e à reprodutibilidade, os resultados que se apre-
sentam no quadro 1. O termo repetibilidade (r) aqui utilizado
define-se como a razão máxima que, com uma probabilidade de
95 %, não é significativa na comparação de dois valores obtidos
para a mesma amostra, no mesmo laboratório e nas mesmas
condições. O termo reprodutibilidade (R) é definido de um modo
análogo, no que se refere à comparação de dois laboratórios dife-
rentes. Em conformidade com a norma ISO 3534-1977, no ponto
2.35(2) e a Decisão 89/610/CEE da Comissão(3), os valors de r e
R encontram-se também indicados no quadro 1 sob a forma de
coeficientes de variação.
Quadro 1
Repetibilidade (r) e reprodutibilidade (R), expressas sob a
forma de razões e respectivos coeficientes de variação
(15 laboratórios)
Nível r R CVr(*) CVR
(µg/kg) (%) (%)
8 & 14 1,4 1,7 11 18
(*) CV = coeficiente de variação
10.2. Estabilização do clorofórmio (ponto 3.1)
As características de adsorção do cartucho de Florisil podem-se
alterar se o elemento estabilizador for outro que não o etanol. Isto
deve ser verificado de acordo com o ponto 10.3, sempre que o
clorofórmio descrito não for o disponível.
10.3. Exactidão
A aplicação correcta do método deve ser verificada através de
determinações em duplicado, efectuadas com materiais de
referência garantidos. Na ausência destes, a eficiência do método
deverá ser verificada através de ensaios de recuperação, efectuados
com amostras em branco. A diferença entre a média e o valor real,
expressa em percentagem do valor real, dever-se-á situar entre os
limites − 20 % a + 10 %.1976L0372 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 15
(1) Egmond, H.P. van, Heisterkamp, S.H. and Paulsch, W.E. (1991). Food Additives and
Contaminants 8, 17-29.
(2) ISO 3534-1977
(3)J O n .oL 351 van 2. 12. 1989, p. 39.
▼M2
Figura 1: sistema coluna-cartucho
Figura 2: diagrama do sistema de cromatografia líquida, com deri-
vatização pós-coluna1976L0372 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 16
▼M2
Figura 3: compensação do desvio relativo à resposta da aflatoxina
B1por injecção do padrão de referência (ponto 3.13.3), a inter-
valos de tempo regulares
C. OBSERVAÇOES RELATIVAS AOS MÉTODOS A E B
1.Desengorduramento
As amostras que contenham mais de 5 % de substâncias gordas devem ser
desengorduradas com éter de petróleo (eb. 40-50 ºC) após a preparação indi-
cada em (5.1.). Nestes casos, os resultados da análise devem referir-se ao
peso da amostra antes de ter sido desengordurada.
2.Reprodutibilidade dos resultados
La reprodutibilidade dos resultados, isto é, a variabilidade entre os resultados
obtidos por dois ou mais laboratórios a partir de uma mesma amostra, foi
avaliada em:
± 50 % média dos resultados obtidos com valores médios entre 10 e 20 µg/
/kg, de aflatoxina B1/kg;
± 10 µg/kg relativamente à média obtido com valores médios entre 20 e
50 µg/kg,
± 20 % da média obtida com valores médios superiores a 50 µg/kg.1976L0372 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 17
▼B
▼B
ANEXO
Figura 1
Figura 21976L0372 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 18
▼B
Figura 31976L0372 — PT — 10.11.1992 — 002.001 — 19