1973L0046 — PT — 13.08.1998 — 003.001 — 1
Este documento constitui um instrumento de documentação e não vincula as instituições
►BQUARTA DIRECTIVADA COMISSÃO
de 5 de Dezembro de 1972
queestabelecemétodosdeanálisecomunitáriosparaocontrolooficialdosalimentosparaanimais
(73/46/CEE)
(JO L 83 de 30.3.1973, p. 21)
Alterada por:
JornalOficial
n.opágina data
►M1 Directiva 81/680/CEE da Comissão de 30 de Julho de 1981 L 246 32 29.8.1981
►M2 Directiva 92/89/CEE da Comissão de 3 de Novembro de 1992 L 344 35 26.11.1992
►M3 Directiva 98/54/CE da Comissão de 16 de Julho de 1998 L 208 49 24.7.1998
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QUARTA DIRECTIVADA COMISSÃO
de 5 de Dezembro de 1972
que estabelece métodos de análise comunitários para o controlo
oficial dos alimentos para animais
(73/46/CEE)
A COMISSÃO DAS COMUNIDADES EUROPEIAS,
Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Euro-
peia,
Tendo em conta a Directiva do Conselho, de 20 de Julho de 1970, rela-
tiva à introdução de métodos de colheita de amostras e a métodos deanálise comunitários para o controlo oficial dos alimentos paraanimais (
1), alterada pela Directiva n.o72/275/CEE de 20 de Julho de
1972 (2) e, nomeadamente, o seu artigo 2.o,
Considerando que a referida directiva prevê que os controlos oficiais
dos alimentos para animais, para constatar se são respeitadas ascondições previstas, por força das disposições legislativas, regulamen-tares ou administrativas relativas à qualidade e composição dosalimentos para animais, sejam efectuados de acordo com os métodos
de colheita de amostras e métodos de análise comunitários;
Considerando que as Directivas n.
o71/250/CEE, n.o71/393/CEE e
n.o72/199/CEE da Comissão, de 15 de Junho de 1971 (3), 18 de
Novembro de 1971 (4) e 27 de Abrilde 1972 (5), fixaram já um deter-
minado número de métodos de análise comunitários; que, tendo emconta o avanço dos trabalhos efectuados desde então, se considera
conveniente adoptar uma quarta série de métodos;
Considerando que as medidas previstas na presente directiva estão em
conformidade com o parecer do Comité Permanente dos Alimentospara Animais;
ADOPTOU A PRESENTE DIRECTIVA:
Artigo 1.o
Os Estados-membros determinam que as análises para os controlosoficiais dos alimentos para animais, no que se refere ao teor em humi-dade das gorduras e dos óleos animais e vegetais, bem como os teoresem magnésio e em celulose bruta dos alimentos, sejam efectuadassegundo os métodos descritos no Anexo I da presente directiva.
Artigo 2.o
Os Estados-membros determinam que as análises para o controlo
oficialdos al imentos para animais, no que diz respeito aos seus teores
em rétinol(vitamina A), ►M3 ◄sejam efectuadas
segundo os métodos descritos no Anexo II da presente directiva.
Artigo 3.o
Os Estados-membros porão em vigor o mais tardar, em 1 de Janeiro de1974, as disposições legislativas, regulamentares ou administrativas1973L0046 — PT — 13.08.1998 — 003.001 — 2
(1)J O n .oL 170 de 3. 8. 1970, p. 2.
(2)J O n .oL 171 de 29. 7. 1972, p. 39.
(3)J O n .oL 155 de 12. 7. 1971, p. 13.
(4)J O n .oL 279 de 20. 12. 1971, p. 7.
(5)J O n .oL 123 de 29. 5. 1972, p. 6.▼M1
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▼M1
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necessárias para darem cumprimento à presente directiva. Desse facto
informarão imediatamente a Comissão.
Artigo 4.o
Os Estados-membros são destinatários da presente directiva.1973L0046 — PT — 13.08.1998 — 003.001 — 3
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ANEXO I
1.DOSAGEMDEHUMIDADENASGORDURASEÓLEOSANIMAISE
VEGETAIS
1.Objecto e domínio de aplicação
O método permite determinar o teor em humidade (água e outras matérias
voláteis) das gorduras e dos óleos animais e vegetais.
2.Princípio
A amostra é submetida a secagem a 103 ºC até que cesse a diminuição de
massa. A perca e massa é determinada por pesagem.
3.Aparelhagem — Instrumentos
3.1. Recipiente de fundo plano, em material resistente à corrosão, diâmetro:
8 a 9 cm, altura: cerca de 3 cm.
3.2. Termómetro de mercúrio com globo reforçado e câmara de dilatação na
extremidade superior, graduado de cerca de 80 ºC a pelo menos 110 ºC,
comprimento: cerca de 10 cm.
3.3. Banho de areia ou placa de aquecimento eléctrica.
3.4. Secador, contendo um desidratante eficaz.
3.5. Balança analítica.
4.Modo como operar
Pesar, com 1 mg de aproximação, cerca de 20 g da amostra homogeneizada
no recipiente (3.1) seco e com tara calculada, contendo o termómetro (3.2).
Aquecer em banho de areia ou na placa de aquecimento (3.3), agitando cons-
tantemente com ajuda do termómetro, de modo a que a temperatura atinja
90 ºC em cerca de 7 minutos.
Reduzir a intensidade do aquecimento, segundo a frequência em que as
bolhas sobem do fundo do recipiente. A temperatura não deverá ultrapassar
105 ºC.
Continuar a agitar, raspando o fundo do recipiente até que cesse a formação
de bolhas.
A fim de assegurar a eliminação total da humidade, repetir várias vezes o
aquecimento 103 ºC ± 2 ºC, arrefecendo até 93 ºC entre os aquecimentos
sucessivos. Em seguida deixar arrefecer no dessecador (3.4) até que atinga a
temperatura ambiente e pesar. Repetir esta operação até que a perda de massa
entre duas pesagens sucessivas não exceda mais de 2 mg.
N.B. Um aumento de massa da amostra após aquecimento repetido indica
uma oxidação da gordura. Neste caso calcular o resultado a partir da
pesagem efectuada imediatamente antes do começo do aumento de
massa.
5.Cálculo dos resultados
O teor em humidade por percentagem da amostra é dado pela fórmula:
M1/C0M2 ðÞ /C1100
M0
na qual:
M0= massa, em gramas, da amostra em ensaio,
M1= massa, em gramas, do recipiente com o respectivo conteúdo, antes
do aquecimento
M2= massa, em gramas, do recipiente com o respectivo conteúdo, após
aquecimento.
Os resultados inferiores a 0,05 por cento devem ser indicados através da
referência «menos de 0,05 por cento».
Repetibilidade
A diferença entre os resultados obtidos em duas determinações paralelas
efectuadas numa mesma amostra não deve exceder 0,05 por cento em valor
absoluto.1973L0046 — PT — 13.08.1998 — 003.001 — 4
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2.DOSAGEM EM MAGNÉSIO
— por espectrofotometria de absorção atómica —
1.Objecto e domínio de aplicação
O método permite dosear o magnésio existente nos alimentos para animais.
Este método está particularmente indicado para determinar os teores em
magnésio inferiores a 5 %.
2.Princípio
A amostra será incinerada e posta em solução no ácido clorídrico diluído. Se
não contiver substâncias orgânicas, será posta directamente em solução ácido
clorídrico diluído. A solução será diluída e o teor em magnésio é determi-
nado por espectrofotometria de absorção atómica a 285,2 nm,
comparativamente a soluções-padrão.
3.Reagentes
3.1. Ácido clorídrico p.a., d: 1,163.2. Ácido clorídrico p.a., d: 1,193.3. Magnésio em tira ou em fio, ou sulfato de magnésio MgSO
4.7 H2O p.a.
seco em vácuo à temperatura ambiente.
3.4. Solução de sal de estrôncio (clorato ou nitrato) a 2,5 (p/v) de estrôncio
(= 76,08 g de SrCl2.6 H2O p. a./1 ou 60,38 g de Sr (NO3)2p.a./1)
3.5. Solução-padrão de magnésio: pesar a cerca de 1 mg, 1 g magnésio (3.3),
ao qual se retirou previamente, com cuidado, a sua película de óxido, ou
uma quantidade correspondente de sulfato de magnésio (3.3), introduzi-
-lo num balão aferido para 1 000 ml, juntar 80 ml de ácido clorídrico
(3.1), deixar dissolver e completar até 1 000 ml com água. 1 ml desta
solução contém 1,000 mg de magnésio.
4.Aparelhagem
4.1. Cadinho para incineração em platina, quartzo ou porcelana.4.2. Forno de muflar, eléctrico, com termóstato.
4.3. Espectrofotómetro de absorção atómica.
5.Modo de operar
5.1.Introdução em solução
5.1.1.Alimentos constituídos exclusivamente de substâncias minerais
Pesar, a cerca de 1 mg, 5 g de amostra e introduzi-los num balão
aferido a 500 ml , com 250 a 300 mlde água. Juntar 40 mlde
ácido clorídrico (3.1), trazer até ebulição e manter o líquido em
ebulição suave durante 30 minutos. Deixar arrefecer, completar
o volume com água, homogeneizar e filtrar para um copo de
precipitação seco, através de um filtro de pregas seco. Deitar
para os primeiros 30 mlda matéria fil trada.
Em presença de silício, tratar 5 g da amostra numa quantidade
suficiente (15 a 30 ml) de ácido clorídrico (3.2) evaporar a seco
sobre banho de água. Prosseguir conforme indicado, a partir da
terceira frase de 5.1.2.
5.1.2.Alimentos constituídos essencialmente de substâncias minerais.
Pesar, com 1 mg de aproximação, 5 g de amostra num cadinho
para incineração e incinerar a 550 ºC no forno de mufla, até à
obtenção de cinzas isentas de partículas carbonizadas. Para
eliminar o silício, juntar às cinzas uma quantidade suficiente (15
a 30 ml) de ácido clorídrico (3.2) e evaporar a seco sobre banho
de água. Secar seguidamente durante uma hora na estufa a 105 ºC.
Retomar o resíduo por 10 mlde ácido cl orídrico (3.1) e transferir
com a ajuda de água quente num balão aferido a 500 ml. Trazer
até ebulição, deixar arrefecer e completar o volume com água.
Homogeneizar e filtrar para um copo de precipitação seco através
de um filtro plissado seco. Rejeitar os 30 primeiros ml do
filtrado.1973L0046 — PT — 13.08.1998 — 003.001 — 5
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5.1.3.Alimentos constituídos essencialmente de substâncias orgânicas
Pesar, com 1 mg de aproximação, 5 g de amostra num cadinho
para incineração e incinerar a 550 ºC num forno de mufla, até
obtenção de cinzas isentas de partículas carbonizadas. Retomar
as cinzas por 5 mlde ácido cl orídrico (3.2), evaporar a seco sobre
um banho de água e secar seguidamente durante uma hora na
estufa a 105 ºC, para insolubilizar o silício. Retomar o resíduo
por 5 mlde ácido cl orídrico (3.1), transferir, com a ajuda de
água quente, para um balão aferido a 250 ml, trazer até ebulição,
deixar arrefecer e completar o volume com água. Homogeneizar e
filtrar para um copo de precipitação seco, através de um filtro
plissado seco. Rejeitar os primeiros 30 ml do filtrado.
5.2.Medida de absorção atómica
Preparar, diluindo a solução-padrão (3.5) em água, pelo menos 5
soluções de referência de concentrações crescentes, escolhidas em
função da zona de medida óptima do espectrofotómetro. Juntar a cada
solução 10 ml de solução de sal de estrôncio (3.4) e completar em
seguida o volume de 100 ml com água.
Diluir em água, uma parte alíquota do filtrado obtido em 5.1.1, 5.1.2 ou
5.1.3 de forma a obter uma concentração de magnésio compreendida nos
limites de concentração das soluções de referência.
A concentração de ácido clorídrico nesta solução não deve exceder
0,4 N. Juntar 10 ml de solução de sal de estrôncio (3.4) e completar
seguidamente o volume de 100 ml com água.
Medir a absorção da solução a dosear e das soluções de referência no
comprimento de onda de 285,2 nm.
6.Cálculo dos resultados
Calcular a quantidade de magnésio da amostra a partir das soluções de
referência. Exprimir o resultado em percentagem da amostra.
Repetibilidade
A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas na
mesma amostra não deverá exceder 5 %, em valor relativo.
3.DETERMINAÇÃODO TEOR DE FIBRA BRUTA
1.Objectivo e campo de aplicação
O presente método permite efectuar o doseamento, em alimentos para
animais, de substâncias orgânicas isentas de gordura e insolúveis em meio
ácido e em meio alcalino, convencionalmente designadas por fibra bruta.
2.Resumo do processo
A amostra, eventualmente desengordurada, é tratada sucessivamente com
soluções de ácido sulfúrico e hidróxido de potássio em ebulição, de concen-
trações determinadas. O resíduo é separado por filtração num cadinho de
vidro sinterizado, lavado, seco, pesado e calcinado a uma temperatura
compreendida entre 475 e 500 ºC. A perda de massa resultante da calcinação
corresponde à fibra bruta presente na amostra em estudo.
3.Reagentes e auxiliares
3.1. Ácido sulfúrico, c = 0,13 mol/l.3.2. Agente antitensioactivo (por exemplo, n-octanol).3.3. Adjuvante de filtração (Celite 545 ou equivalente), aquecido a 500 ºC
durante quatro horas (8.6).
3.4. Acetona.3.5. Éter de petróleo — ponto de ebulição 40-60 ºC.
3.6. Ácido clorídrico, c = 0,5 mol/l.
3.7. Solução de hidróxido de potássio, c = 0,23 mol/l.1973L0046 — PT — 13.08.1998 — 003.001 — 6
▼M2
▼M2
4.Aparelhos e utensílios
4.1. Unidade de aquecimento para a digestão com ácido sulfúrico ou hidró-
xido de potássio, equipada com um suporte para o cadinho de filtração
(4.2) e com um tubo, munido de uma torneira, para a saída do líquido e
para efectuar o vácuo, por recurso eventuala ar comprimido. Cada dia,
antes do uso, proceder ao pré-aquecimento da unidade com água em
ebulição, durante cinco minutos.
4.2. Cadinho de filtração de vidro, com uma placa filtrante de vidro fundido
sinterizado de porosidade 40 - 90 µm. Antes da primeira utilização,
aquecer a 500 ºC durante alguns minutos, arrefecendo em seguida (8.6).
4.3. Proveta de ebulição com uma capacidade mínima de 270 ml, equipada
com um condensador de refluxo.
4.4. Estufa de secagem, termostatizada.4.5. Forno de mufla, termostatizado.4.6. Unidade de extracção a frio, constituída por um suporte para o cadinho
de filtração (4.2) e por um tubo de descarga equipado com torneira, para
efectuar o vácuo e para a saída do líquido.
4.7. Juntas para a montagem da unidade de aquecimento (4.1), cadinho de
filtração (4.2) e proveta de ebulição (4.3) para a ligação da unidade de
extracção a frio (4.6) e do cadinho.
5.Técnica
Pesar com a precisão de ± 0,001 g, 1 g de amostra, previamente preparada,
transferindo-a para o cadinho de filtração (4.2), (ver 8.1, 8.2 e 8.3) e
adicionar 1 g de adjuvante de filtração (3.3).
Montar a unidade de aquecimento (4.1) e o cadinho de filtração (4.2), adap-
tando em seguida a proveta de ebulição (4.3) ao cadinho. Adicionar à proveta
150 ml de ácido sulfúrico (3.1), em ebulição, juntando algumas gotas de
agente antitensioactivo (3.2), se necessário. Levar o líquido à ebulição em
5 ± 2 minutos, deixando ferver vigorosamente durante exactamente 30
minutos.
Abrir a torneira do tubo de descarga (4.1) e filtrar, sob vácuo, o ácido sulfú-
rico através do cadinho de filtração. Ainda sob vácuo, lavar o resíduo no
filtro com três porções sucessivas, de 30 ml cada, de água em ebulição. Asse-
gurar que o resíduo fica seco por aspiração, após cada lavagem.
Fechar a torneira e adicionar à proveta 150 mlde hidróxido de potássio (3.7)
em ebulição. Juntar algumas gotas de agente antitensioactivo (3.2). Levar o
líquido à ebulição em 5 ± 2 minutos, deixando ferver vigorosamente durante
exactamente 30 minutos. Filtrar o resíduo, lavando-o de modo idêntico ao
descrito no tratamento com ácido sulfúrico.
Após a última lavagem e secagem desligar o cadinho, com o seu conteúdo e
adaptá-lo à unidade de extracção a frio (4.6). Ligar o vácuo e lavar o resíduo
com três porções sucessivas, de 25 mlcada, de acetona (3.4), secando o
resíduo por aspiração, após cada lavagem.
Secar o cadinho de filtração até massa constante, na estufa, a 130 ºC. Após
cada secagem, arrefecer no exsicador e pesar de imediato. Colocar o cadinho
no forno de mufla, calcinando até massa constante, entre 475 e 500 ºC,
durante pelo menos 30 minutos.
Após cada calcinação, proceder ao arrefecimento na mufla e, em seguida no
exsicador, antes de pesar.
Efectuar um ensaio em branco. A perda de massa resultante da calcinação
não deverá neste caso, exceder 4 mg.
6.Cálculo dos resultados
O teor da fibra bruta, expresso em percentagem da amostra, é dado pela
expressão:
b/C0c ½/C138 /C2 100
a
sendo
a = massa da amostra, em g.
b = perda de massa, após calcinação durante a determinação, em g.
c = perda de massa, após calcinação durante o ensaio em branco, em g.1973L0046 — PT — 13.08.1998 — 003.001 — 7
▼M2
7.Repetibilidade
A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas, efectuadas
com a mesma amostra não deverá exceder:
— 0,3 em valor absoluto, para os teores de fibra bruta inferiores a 10 %,
— 3 %, em valor relativo, em relação aos resultados mais elevados, para os
teores de fibra bruta iguais ou superiores a 10 %.
8.Observações
8.1. Os alimentos para animais cujo teor de gordura bruta seja superior a
10 % deverão ser previamente desengordurados, por recurso a éter de
petróleo (3.5). Adaptar o cadinho de filtração (4.2) com a amostra
pesada à unidade de extracção a frio (4.6) e lavar, sob vácuo, com três
porções sucessivas, de 30 mlcada, de éter de petról eo (3.5). Secar a
amostra por aspiração. Adaptar o cadinho com o seu conteúdo à unidade
de aquecimento (4.1), continuando de acordo com a descrição efectuada
em 5.
8.2. Os alimentos para animais que contenham gorduras que não possam ser
extraídas directamente com éter de petróleo (3.5) deverão ser desengor-
durados de acordo com o método descrito em 8.1 e sujeitos a um novo
processo de desengorduramento, precedido do tratamento com ácido em
ebulição.
Após tratamento com ácido e lavagem subsequente, adaptar o cadinho
com o seu conteúdo à unidade de extracção a frio (4.6), lavando com
três porções sucessivas, de 30 mlcada, de acetona, seguidas de três
porções sucessivas, também de 30 ml, de éter de petróleo. Secar por
aspiração e continuar o processo de acordo com a descrição efectuada
em 5, começando pelo tratamento com hidróxido de potássio.
8.3. Se o teor dos alimentos para animais em carbonatos, expressos em
termos de carbonato de cálcio, exceder 5 %, adaptar o cadinho (4.2)
com a amostra pesada, à unidade de aquecimento (4.1). Lavar a amostra
com três porções sucessivas, de 30 mlcada, de ácido cl orídrico (3.6).
Após cada adição, deixar a amostra repousar durante cerca de um
minuto, antes de filtrar. Lavar com 30 ml de água, continuando de
acordo com a descrição efectuada em 5.
8.4. No caso da utilização de uma bateria de aparelhos (vários cadinhos
ligados à mesma unidade de aquecimento), não se deverá proceder a
dois doseamentos diferentes com a mesma amostra, na mesma série.
8.5. Se, após a ebulição, a filtração das soluções ácidas e alcalinas se revelar
difícil, proceder à introdução de ar comprimido pelo tubo de descarga da
unidade de aquecimento, continuando em seguida a filtração.
8.6. Com vista a prolongar a vida média dos cadinhos de filtração de vidro, é
conveniente não utilizar temperaturas de calcinação superiores a 500 ºC.
Dever-se-ão igualmente evitar quaisquer choques térmicos excessivos no
decurso dos ciclos de aquecimento e arrefecimento.1973L0046 — PT — 13.08.1998 — 003.001 — 8
▼B
ANEXO II
1.DOSAGEM DE RETINOL (VITAMINAA)
1.Objecto e domínio de aplicação
O método permite dosear o rétinol(vitamina A) nos al imentos, concen-
trados e pré-misturas. O limite inferior de dosagem é de 10 000 UI/kg
para alimentos fortemente pigmentados e de 4 000 UI/kg para os outros
produtos (1). Os produtos são classificados em dois grupos, segundo o seu
presumido teor em rétinol:
Grupo A: teores inferiores a 200 000 UI/kg,
Grupo B: teores iguais ou superiores a 200 000 UI/kg.
2.Princípio
A amostra é hidrolisada a quente por uma solução de hidróxido de
potássio em meio etanólico e em presença de um antioxigénio ou em
atmosfera de azoto. A mistura é submetida à extracção pelo 1,2-diclore-
tano. O extracto será evaporado a seco e retomado pelo éter de petróleo.
A solução é cromatografadasobre coluna de óxido de alumínio (para os
produtos do grupo B, a cromatografia só é exigida em certos casos). O
rétinolé doseado por espectrofotometria a 610 nm após desenvol vimento
de um complexo corado, segundo a reacção de Carr-Price, no caso de
produtos do grupo A; por espectrofotometria no UV a 325 nm no caso
de produtos do grupo B.
3.Reagentes
a)Utilizados para a análise de produtos dos grupos A e B
3.1. Étenola 96 % (v/v)3.2. Solução a 10 % (p/v) de ascorbato de sódio p.a., ou3.3. Azoto, purificado3.4. Solução a 50 % (p/v) de hidróxido de potássio p.a.
3.5. Solução de hidróxido de potassio 1 N
3.6. Solução de hidróxido de potássio 0,5 N3.7. 1,2-dicloretano p.a.3.8. Éter de petróleo, puro, ebulição 30-50 ºC. Se necessário purificar
como segue. Agitar 1 000 mlde éter de petról eo com proporções
de 20 mlde ácido sul fúrico concentrado até que o ácido fique
incolor. Eliminar o ácido e lavar o éter sucessivamente por
500 mlde água, duas vezes 250 mlde uma sol ução a 10 % de
hidróxido de sódio e três vezes 500 mlde água. El iminar a
camada aquosa, secar o éter durante 1 hora em carvão activo e
sulfato de sódio anidro, filtrar e destilar
3.9. Óxido de alumínio, estandardizado segundo Brokman: calcinar
durante 8 horas a 750 ºC, arrefecer em secafor e conservar em
frasco de vidro escuro, com rolha de rodar. Antes da utilização
em cromatografia, humidificar como segue: introduzir num
frasco de vidro escuro 10 g de óxido de alumínio e 0,7 ml de
água, fechar hermeticamente, aquecer durante 5 minutos em
banho de água a ferver, agitando energicamente. Deixar arre-
fecer, agitando. Verificar a actividade do óxido de alumínio
assim preparado, submetendo à análise, de acordo com o estipu-
lado em 5.3 e 5.4, uma quantidade conhecida de rétinol padrão
(3.17)
3.10. Óxido de alumínio básico, graduado de actividade I
3.11. Éter dietílico, puro. Eliminar os peróxidos e os traços de água
para cromatografia em coluna de óxido de alumínio básico
(3.10) (25 g de óxido de alumínio para 250 ml de éter dietílico)
3.12. Soluções de éter de petróleo (3.8) a 4,8, 12,16 e 20 % (v/v) de
éter dietílico (3.11)1973L0046 — PT — 13.08.1998 — 003.001 — 9
(1) 1 UI = 0,3 µg de rétinol.
▼B
3.13. Solução de sulfureto de sódio 0,5 mole na glicerina a 70 % (v/v)
preparada a partir de sulfureto de sódio p.a.
b)Utilizados exclusivamente para a análise dos produtos do grupo A
3.14. Benzeno p.a., cristalizável3.15. Clorofórmio p.a. Eliminar o étanol, o fosgeno e os traços de água
por cromatografia em coluna de óxido de alumínio básico (3.10)
(50 g de óxido de alumínio para 200 ml de clorofórmio) convém
cromatografar uma segunda vez os 50 primeiros mlde el uato
3.16 Reagente segundo Carr-Price: Agitar cerca de 25 g de tricloreto
de antimónio p.a. (conservado em secador) com 100 mlde cl oro-
fórmio (3.15) até saturação da solução. Um leve depósito de
tricloreto de antimónio não prejudica. Juntar 2 ml de anidrido
acético p.a. Conservar em geleira num frasco de vidro escuro
com rolha de rodar. Duração de conservação: várias semanas
3.17. Rétinolpadrão, control ado por espectrofotometria
c)Utilizados exclusivamente para a análise de produtos do grupo B
3.18. Isopropanol, para cromatografia
4.Aparelhagem
4.1. Banho de água
4.2. Aparelho rotativo para evaporação em vácuo com balões redondos de
diferentes capacidades
4.3. Tubos para cromatografia, em vidro (comprimento: 30 mm, diâmetro
interno: cerca de 3 mm)
4.4. Espectrofotómetro com cuvetes de 10 mm de espessura (em quartzo
para medições em UV)
4.5. Lâmpada UV, 365 nm
5.Modo de operar
N.B. Todas as manipulações devem fazer-se ao abrigo de luz directa,
eventualmente num aparelho de vidro escuro.
5.1.Colheita
Tomar uma colheita de amostra dividida, proporcional ao presumido
teor em vitamina A, seja:
0,1 a 1,0 g para os concentrados (teores superiores a 20 000 UI/g),
3,0 a 5,0 g para as pré-misturas (teores compreendidos entre 400 e
20 000 UI/g),
10 a 20 g para as misturas minerais,
30 g para os produtos do grupo A
Introduzir imediatamente a colheita num balão de 500 ml de tampa
de rodar.
5.2.Hidrólise e extracção (
2)
Juntar sucessivamente à col heita 40 mlde étanol(3.1), 2 mlde
solução de ascorbato de sódio (3.2) (2), 10 ml de solução de hidró-
xido de potássio (3.4) e 2 ml de solução de sulfureto de sódio (3.13).
Aquecer durante 30 minutos a 70-80 ºC sob refrigerante de refluxo e
seguidamente deixar arrefecer sob corrente de água. Juntar 50 mlde
étanol (3.1) e 100 ml (colhidos com pipeta) de 1,2-dicleritano (3.7).
Agitar energicamente e decantar o líquido sobrenadante numa ampola
de decantar. Juntar na ampola 150 ml de solução de hidróxido de
potássio (3.5), agitar durante 10 segundos e deixar repousar até sepa-
ração das fases. Recolher a fase dicloretânia (fase inferior) numa
ampola de decantar, juntar 40 ml de solução de hidróxido de potássio
(3.6), agitar durante 10 segundos e deixar repousar até separação das1973L0046 — PT — 13.08.1998 — 003.001 — 10
(2) A adição de ascorbato de sódio não é necessária quando a hidrólise é efectuada em
atmosfera de azoto.(
1) Para os alimentos de aleitamento e os produtos com tendência para se aglomerarem ou
incharem, «dobrar» a quantidade dos reagentes indicados em 5.2, primeiro e segundo
parágrafos.
▼B
fases. Recolher a fase dicloretânica numa ampola de decantar e lavar
6 a 8 vezes com ajuda de porções de 40 mlde água, até à ausência de
alcalino (experiência com fenólftalina). Recolher a fase dicloretânica
e eliminar os últimos traços de água com a ajuda de tiras de papel de
filtro.
Evaporar a seco uma parte alíquota da solução, a vácuo e sobre
banho de água à temperatura de 40 ºC. Retomar rapidamente o
resíduo por 5 mlde éter de petról eo (3.8).
Para os produtos do grupo A , cromatografar como indicado em 5.3.1.
Para os produtos do grupo B , transferir a solução num balão aferido
de 50 ml, completar o volume com éter de petróleo (3.8), homoge-
neizar e medir a densidade óptica como indicado em 5.4.2.
5.3.Cromatografia
5.3.1.Produtos do grupo A
Encher um tubo para cromatografia (4.3), até à altura de
200 mm, com óxido de alumínio (3.9) previamente impreg-
nado de éter de petróleo (3.8). Introduzir a solução obtida em
5.2 no tubo e juntar imediatamente 20 mlde éter de petról eo
(3.8).
Eluar sucessivamente em porções de 10 ml das soluções de
éter de petróleo a 4, 8, 12, 16 e 20 % de éter dietílico (3.12),
em vácuo parcial, ou sob pressão, sendo a velocidade de esco-
amento de 2 a 3 gotas por segundo.
O caroteno é eluído em primeiro lugar (1). O rétinolé geral -
mente eluído em solução de éter de petróleo em 20 % de éter
dietílico (3.12). A eluição é controlada sob luz IV (breve irra-
diação da coluna por uma lâmpada de mercúrio). A banda
fluorescente de rétinol separa-se nitidamente das bandas
amarelas de xantofila que a seguem. Recolher a fracção de
eluato contendo o rétinol num erlenmeyer.
5.3.2.Produtos do grupo B
A cromatografia não deve ser efectuada se as medidas de
densidade óptica obtidas em 5.4.2 não estão em conformidade
com as indicações dadas em 5.4.2.
Se a cromatografia se afigura necessária, introduzir na coluna
cromatográfica uma parte alíquota da solução em éter de
petróleo obtido em 5.2, contendo cerca de 500 UI de rétinol,
e cromatografar como indicado em 5.3.1.
5.4.Medida de densidade óptica
5.4.1.Produtos do grupo A
Evaporar a seco, em vácuo, o eluato contendo o rétinol, obtido
em 5.3.1. Retomar o resíduo por 2 mlde benzeno (3.14).
Tomar 0,3 mldesta sol ução e juntar 3 mlde reagente segundo
Carr-Price (3.16). Desenvolve-se uma coloração azul. Medir á
densidade óptica no espectrofotómetro a 610 nm, extacamente
30 segundos após o início da reacção. Determinar o teor em
rétinol, em referência a uma curva-padrão obtida a partir de
soluções de benzeno de concentrações crescentes em rétinol
padrão tratados pelo reagente segundo Carr-Price (2 a 16 UI
de vitamina A padrão (3.17) por 0,3 mlde benzeno (3.14) +
3 mldo reagente segundo Carr-Price (3.16). A curva padrão
deve ser controlada regularmente e em certos intervalos de
tempo, com a ajuda do padrão e de uma solução, preparada
de fresco, do reagente segundo Carr-Price.
5.4.2.Produtos do grupo B
Tomar uma parte alíquota da solução em éter de petróleo
obtido em 5.2, contendo cerca de 200 UI de rétinol. Evaporar
a seco, em vácuo, e retomar o resíduo por 25 mlde isopro-
panol(3.18). Medir a densidade óptica com o
espectrofotómetro a 325, 310 e 334 nm. O máximo de1973L0046 — PT — 13.08.1998 — 003.001 — 11
(1) O teor em caroteno pode ser determinado pela medida da densidade óptica a 450 nm;
E1%
1c m¼2 600 :
▼B
absorção situa-se a 325 nm. O teor em rétinolA da sol ução é
calculado como segue:
E325. 18,30 = UI de rétinol
contudo, os relatórios das densidades ópticas
E310:E325eE334:E325
devem ser de 6:7 = 0,857.Se um destes relatórios se afasta sensivelmente deste valor
((0,830 ou) 0,880), a medida das densidades ópticas deve ser
precedida de uma cromatografia, segundo o processo indicado
em 5.3.2. Se a medida das densidades ópticas efectuada, após a
cromatografia, indica que os relatórios citados se afasta ainda
sensivelmente do valor 0,857 ((0,830 ou) 0,880), a dosagem
deve ser efectuada segundo o processo indicado para os
produtos do grupo A.
6.Cálculo dos resultados
Calcular o teor em rétinol da amostra, tendo em conta do peso da amostra
em ensaio e das diluições efectuadas no decurso da análise. Exprimir o
resultado em UI de rétinol por quilo.
Repetibilidade
A diferença entre os resultados de duas determinações paralelas efectuadas
na mesma amostra, não deve exceder:
— 20 %, em valor relativo, para os teores em rétinol inferiores a
75 000 UI/kg,
— 15 000 UI para os teores compreendidos entre 75 000 e 150 000 UI/kg,— 10 %, em valor relativo, para os teores compreendidos entre 150 000 e
250 000 UI/kg,
— 25 000 UI para os teores compreendidos entre 250 000 e 500 000 UI/
/kg,
— 5 %, em valor relativo, para os teores superiores a 500 000 UI/kg.1973L0046 — PT — 13.08.1998 — 003.001 — 12
▼M3