6)

załącznik VII otrzymuje brzmienie: „ZAŁĄCZNIK VII OZNACZANIE ZAWARTOŚCI PROCENTOWEJ 2-MONOPALMITYNIANU GLICEROLU 1. CEL I ZAKRES STOSOWANIA Niniejsza metoda stanowi opis procedury analitycznej oznaczania zawartości procentowej kwasu palmitynowego w pozycji 2 triglicerydów metodą oznaczania 2-monopalmitynianu glicerolu. Niniejsza metoda dotyczy olejów roślinnych płynnych w temperaturze pokojowej (20 °C). 2. ZASADA Po przygotowaniu próbkę oleju poddaje się działaniu lipazy trzustkowej: częściowa i swoista hydroliza w pozycjach 1 i 3 cząsteczki triglicerydu powoduje pojawienie się monoglicerydów w pozycji 2. Zawartość procentowa 2-monopalmitynianu glicerolu we frakcji monoglicerydów jest oznaczana, po sililowaniu, metodą chromatografii gazowej na kolumnie kapilarnej. 3. APARATURA I MATERIAŁY EKSPLOATACYJNE 3.1. Kolba Erlenmeyera o pojemności 25 ml. 3.2. Zlewki o pojemności 100, 250 i 300 ml. 3.3. Szklana kolumna chromatograficzna (wewnętrzna średnica: 21–23 mm, długość: 400 mm), wyposażona w płytkę ze spieku szklanego i kranik. 3.4. Cylindry miarowe o pojemności 10, 50, 100 i 200 ml. 3.5. Kolby o pojemności 100 i 250 ml. 3.6. Wyparka obrotowa. 3.7. Probówki do wirowania o pojemności 10 ml, ze szlifowanym korkiem. 3.8. Wirówka do probówek o pojemności 10 i 100 ml. 3.9. Termostat umożliwiający utrzymanie temperatury na poziomie 40 °C ± 0,5 °C. 3.10. Biurety z podziałką co 1 i 2 ml. 3.11. Strzykawka podskórna o pojemności 1 ml. 3.12. Mikrostrzykawka o pojemności 100 μl. 3.13. Lejek, 1 000 ml. 3.14. Chromatograf gazowy do kolumn kapilarnych, wyposażony w dozownik do nastrzykiwania »na kolumnę« na zimno w celu bezpośredniego wprowadzania próbki do kolumny oraz w piecyk zapewniający utrzymanie wybranej temperatury z dokładnością do 1 °C. 3.15. Układ nastrzykowy »na kolumnę« na zimno, w celu bezpośredniego wprowadzenia próbki do kolumny. 3.16. Detektor płomieniowo-jonizacyjny i elektrometr. 3.17. Rejestrujący integrator współpracujący z elektrometrem, z szybkością odpowiedzi poniżej 1 sekundy, ze zmienną szybkością przesuwu papieru. 3.18. Kolumna kapilarna ze szkła lub z topionej krzemionki, o długości 8–12 m i średnicy wewnętrznej 0,25–0,32 mm, pokryta 5 % polimetylosiloksanem lub polifenylo-metylosiloksanem, o grubości 0,10–0,30 μm, którą można stosować w temperaturze 370 °C. 3.19. Mikrostrzykawka o pojemności 10 μl, wyposażona w igłę o utwardzonej powierzchni, o długości co najmniej 7,5 cm, przeznaczona do wykonywania bezpośrednich nastrzyków na kolumnę. 4. ODCZYNNIKI 4.1. Żel krzemionkowy o granulometrii w zakresie od 0,063 do 0,200 mm (70/280 mesh), przygotowany następująco: umieścić żel krzemionkowy w kapsule porcelanowej, suszyć w suszarce w temperaturze 160 °C przez 4 godziny, schłodzić do temperatury pokojowej w eksykatorze. Dodać objętość wody równoważną 5 % masy żelu krzemionkowego, w następujący sposób: do kolby Erlenmeyera o pojemności 500 ml odważyć 152 g żelu krzemionkowego i dodać 8 g wody destylowanej, zatkać kolbę i delikatnie wstrząsać do uzyskania równomiernego rozprowadzenia wody. Odstawić na co najmniej 12 godzin przed użyciem. 4.2. n-heksan (do chromatografii). 4.3. Izopropanol. 4.4. Izopropanol, roztwór wodny 1/1 (V/V). 4.5. Lipaza trzustkowa. Użyta lipaza musi wykazywać aktywność w zakresie od 2,0 do 10 jednostek lipazy na mg (W handlu dostępne są lipazy trzustkowe o aktywności w zakresie od 2 do 10 jednostek na mg enzymu). 4.6. Roztwór buforowy tris-hydroksymetyloaminometan: roztwór wodny 1 M doprowadzony do pH 8 (kontrola potencjometryczna) stężonym HCI (1/1 V/V). 4.7. Cholan sodu, jakości enzymatycznej, roztwór wodny o stężeniu 0,1 % (roztwór ten należy wykorzystać w ciągu 15 dni od sporządzenia). 4.8. Chlorek wapnia, 22 % roztwór wodny. 4.9. Eter dietylowy do chromatografii. 4.10. Rozpuszczalnik rozwijający: mieszanina n-heksanu/eteru dietylowego (87/13) (V/V). 4.11. Wodorotlenek sodu, roztwór 12 % wagowo. 4.12. Fenoloftaleina, roztwór 1 % w etanolu. 4.13. Gaz nośny: wodór lub hel do chromatografii gazowej. 4.14. Gazy pomocnicze: – wodór w stężeniu minimum 99 %, pozbawiony wilgoci i substancji organicznych – oraz powietrze do chromatografii gazowej o takiej samej czystości. 4.15. Odczynnik wywołujący reakcję sililowania: mieszanina pirydyna/heksametylodisilazan/trimetylochlorosilan w proporcji 9/3/1 (V/V/V) (W handlu dostępne są roztwory gotowe do użycia. Można zastosować również inne odczynniki wywołujące reakcję sililowania, jak np. bis-trimetylosilyltrifluoraocetamid + 1 % trimetylochlorosilan, rozcieńczone taką samą objętością bezwodnika pirydyny). 4.16. Próbki wzorcowe: czyste monoglicerydy lub mieszaniny monoglicerydów o znanym składzie procentowym podobnym do występującego w próbce badanej. 5. PROCEDURA 5.1. Przygotowanie próbki 5.1.1. Oleje o wolnej kwasowości poniżej 3 % nie wymagają zobojętnienia przed wykonaniem chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym. Oleje o wolnej kwasowości powyżej 3 % muszą być zobojętnione zgodnie z ppkt 5.1.1.1. 5.1.1.1. Do lejka o pojemności 1 000 ml (3.13) wlać 50 g oleju i 200 ml n-heksanu. Dodać 100 ml izopropanolu i ilość roztworu wodorotlenku sodu o stężeniu 12 % (4.11) odpowiadającą wolnej kwasowości oleju powiększonej o 5 %. Wstrząsać energicznie przez jedną minutę. Dodać 100 ml wody destylowanej, ponownie wstrząsnąć i odstawić. Po dekantacji usunąć dolną warstwę mydła. Usunąć także wszystkie pośrednie warstwy (śluzy, substancje nierozpuszczalne). Płukać roztwór heksanu i zobojętnionego oleju kolejnymi porcjami 50–60 ml roztworu izopropanol/woda w proporcji 1/1 (V/V) (4.4), aż zniknie różowa barwa fenoloftaleiny. Usunąć większość heksanu za pomocą destylacji w próżni (wykorzystać do tego celu na przykład wyparkę obrotową) i przenieść olej do kolby o pojemności 100 ml (3.5). Suszyć olej w próżni do całkowitego usunięcia rozpuszczalnika. Pod koniec tej czynności kwasowość oleju musi wynosić poniżej 0,5 %. 5.1.2. Wprowadzić 1,0 g oleju przygotowanego w sposób wskazany powyżej do kolby Erlenmeyera o pojemności 25 ml (3.1) i rozpuścić go w 10 ml mieszaniny rozwijającej (4.10). Odstawić roztwór na co najmniej 15 minut przed wykonaniem chromatografii na kolumnie z żelem krzemionkowym. Jeżeli roztwór jest mętny, odwirować go w celu zapewnienia optymalnych warunków wykonywania chromatografii. (Można zastosować gotowe do użycia wkłady żelu krzemionkowego SPE o masie 500 mg). 5.1.3. Przygotowanie kolumny chromatograficznej Nanieść na kolumnę (3.3) około 30 ml rozpuszczalnika rozwijającego (4.10), za pomocą szklanej pałeczki wprowadzić wacik do dolnej części kolumny; przycisnąć w celu usunięcia powietrza. Przygotować w zlewce zawiesinę 25 g żelu krzemionkowego (4.1) w około 80 ml rozpuszczalnika rozwijającego i przelać ją do kolumny przy użyciu lejka. Sprawdzić, czy cały żel krzemionkowy został wprowadzony do kolumny; przemyć rozpuszczalnikiem rozwijającym (4.10), otworzyć kranik i poczekać, aż poziom płynu osiągnie wysokość około 2 mm poniżej górnego poziomu żelu krzemionkowego. 5.1.4. Chromatografia na kolumnie Do kolby Erlenmeyera o pojemności 25 ml (3.1) odważyć dokładnie 1,0 g próbki przygotowanej zgodnie z ppkt 5.1. Rozpuścić próbkę w 10 ml rozpuszczalnika rozwijającego (4.10). Wlać roztwór do kolumny chromatograficznej przygotowanej zgodnie z ppkt 5.1.3. Starać się nie poruszyć powierzchni kolumny. Otworzyć kranik i zlać roztwór próbki, aż osiągnie poziom żelu krzemionkowego. Rozwinąć poprzez dodanie 150 ml rozpuszczalnika rozwijającego. Ustawić szybkość przepływu na 2 ml/min (tak aby 150 ml przeszło przez kolumnę w ciągu około 60–70 minut). Zebrać odciek z kolumny do wcześniej wytarowanej kolby o pojemności 250 ml. Odparować rozpuszczalnik w próżni i usunąć jego resztkowe pozostałości pod strumieniem azotu. Zważyć kolbę i obliczyć ilość zebranego ekstraktu. (W przypadku korzystania z gotowych do użytku wkładów krzemionkowych SPE postępować następująco: wprowadzić 1 ml roztworu (5.1.2) do wkładów przygotowanych wcześniej przy użyciu 3 ml n-heksanu. Po perkolacji roztworu rozwinąć chromatogram poprzez dodanie 4 ml n-heksanu/eteru dietylowego w proporcji 9/1 (V/V). Zebrać odciek z kolumny do probówki o pojemności 10 ml i poddać go odparowywaniu do sucha pod strumieniem azotu. Poddać suchą pozostałość działaniu lipazy trzustkowej (5.2). Bezwzględnie konieczne jest sprawdzenie składu kwasów tłuszczowych przed przepuszczeniem i po przepuszczeniu przez wkład SPE). 5.2. Hydroliza przez lipazę trzustkową 5.2.1. Do probówki do wirowania odważyć 0,1 g oleju przygotowanego zgodnie z ppkt 5.1. Dodać 2 ml roztworu buforowego (4.6), 0,5 ml roztworu cholanu sodu (4.7) i 0,2 ml roztworu chlorku wapnia, dobrze wstrząsając po dodaniu każdej z tych substancji. Zamknąć probówkę szlifowanym korkiem i umieścić ją w termostacie o temperaturze 40 ± 0,5 °C. 5.2.2. Dodać 20 mg lipazy, ostrożnie wstrząsać (nie dopuszczając do zwilżenia korka) i włożyć probówkę do termostatu na dokładnie 2 minuty, następnie wyjąć ją, wstrząsać energicznie i dokładnie przez 1 minutę i odstawić do schłodzenia. 5.2.3. Dodać 1 ml eteru dietylowego, zatkać korkiem i wstrząsać energicznie, następnie odwirować i przenieść roztwór eteru do czystej i suchej probówki przy użyciu mikrostrzykawki. 5.3. Przygotowanie pochodnych silanizowanych i chromatografii gazowej 5.3.1. Przy użyciu mikrostrzykawki wprowadzić 100 μl roztworu (5.2.3) do probówki ze stożkowym dnem o pojemności 10 ml. 5.3.2. Usunąć rozpuszczalnik pod słabym strumieniem azotu, dodać 200 μl odczynnika wywołującego reakcję sililowania (4.15), zatkać probówkę i odstawić na 20 minut. 5.3.3. Po 20 minutach dodać od 1 do 5 ml n-heksanu (zależnie od warunków chromatografowania): uzyskany roztwór jest gotowy do chromatografii gazowej. 5.4. Chromatografia gazowa Warunki robocze są następujące: — temperatura urządzenia nastrzykującego (nastrzyk »na kolumnę«) niższa od temperatury wrzenia roztworu (68 °C), — temperatura detektora: 350 °C, — temperatura kolumny: zaprogramowanie temperatury pieca: 60 °C przez 1 minutę, ze zwiększaniem temperatury o 15 °C na minutę aż do 180 °C, następnie o 5 °C na minutę do 340 °C, następnie 340 °C przez 13 minut, — gaz nośny: wodór lub hel, z regulacją do odpowiedniej liniowej szybkości przepływu w celu uzyskania rozdzielczości przedstawionej na rysunku 1. Czas retencji triglicerydu C54 musi wynosić 40 ± 5 minut (patrz: rysunek 2); (Wskazane powyżej warunki robocze zostały zaproponowane orientacyjnie. Każdy operator musi je zoptymalizować w celu uzyskania pożądanej rozdzielczości. Wysokość piku odpowiadającego 2-monopalmitynianowi glicerolu musi wynosić minimum 10 % skali rejestratora), — ilość nastrzykiwanej substancji: 0,5–1 μl roztworu (5 ml) n-heksanu (5.3.3.). 5.4.1. Identyfikacja pików Poszczególne monoglicerydy są identyfikowane według czasów retencji oraz przez porównanie z pikami uzyskanymi ze standardowymi mieszaninami monoglicerydów analizowanymi w tych samych warunkach. 5.4.2. Ocena ilościowa Oblicza się pole pod każdym pikiem przy użyciu elektronicznego integratora. 6. PREZENTACJA WYNIKÓW Zawartość procentową monopalmitynianu glicerolu oblicza się na podstawie stosunku pola pod odpowiednim pikiem do sumy pól pod pikami wszystkich monoglicerydów (patrz: rysunek 2), na podstawie wzoru: Glyceril monopalmitate (%): gdzie: Ax = pole pod pikiem odpowiadającym monopalmitynianowi glicerolu ΣA = suma pól pod wszystkimi pikami monoglicerydów Wynik należy podać z dokładnością do jednego miejsca po przecinku. 7. SPRAWOZDANIE Z ANALAIZY Sprawozdanie z testu powinno zawierać: — odwołanie do niniejszej metody, — wszelkie informacje niezbędne do pełnej identyfikacji próbki, — wynik analizy, — wszelkie odchylenia od metody będące wynikiem decyzji zainteresowanych stron lub zaistniałe z innego powodu, — dane identyfikujące laboratorium, datę analizy i podpisy osób odpowiedzialnych za tę ostatnią. Rysunek 1 Chromatogram produktów reakcji sililowania uzyskanych po zadziałaniu lipazą na rafinowaną oliwę z oliwek, do której dodano 20 % zestryfikowanego oleju (100 %) Rysunek 2 Chromatogram: A) nie estryfikowanej oliwy z oliwek, po zadziałaniu na nią lipazą; po sililowaniu; w podanych warunkach (kolumna kapilarna 8–12 m) frakcja wosków ulega elucji równocześnie z frakcją diglicerydów lub nieco później. Po zadziałaniu lipazą zawartość triglicerydów nie powinna przekraczać 15 %. Chromatogram: B) oliwy estryfikowanej po zadziałaniu lipazą; po sililowaniu; w tych warunkach (kolumna kapilarna 8–12 m) frakcja wosków ulega elucji równocześnie z frakcją diglicerydów lub nieco później. Po zadziałaniu lipazą zawartość triglicerydów nie powinna przekraczać 15 %. 8. UWAGI Uwaga 1. PRZYGOTOWANIE LIPAZY W handlu dostępne są lipazy o zadowalającej aktywności. Możliwe jest również ich przygotowanie w laboratorium w następujący sposób: Schłodzić w 0 °C 5 kg świeżej trzustki wieprzowej. Usunąć tłuszcz stały i otaczającą go tkankę łączną i utrzeć w młynku do uzyskania płynnej pasty. Wymieszać tę pastę z 2,5 litra bezwodnego acetonu w czasie od 4 do 6 godzin, następnie odwirować. Poddać pozostałość jeszcze trzykrotnej ekstrakcji taką samą objętością bezwodnego acetonu, a następnie dwukrotnej ekstrakcji mieszaniną acetonu i eteru dietylowego w stosunku 1 do 1 (V/V) i dwukrotnej ekstrakcji eterem dietylowym. Suszyć pozostałość w próżni przez 48 godzin w celu uzyskania stabilnego proszku nadającego się do przechowywania przez dłuższy czas w lodówce, w miejscu chronionym przed wilgocią. Uwaga 2. KONTROLA DZIAŁANIA LIPAZY Przygotować emulsję oliwy z oliwek w następujący sposób: Wstrząsać przez 10 minut w mieszadle mieszaninę składającą się ze 165 ml roztworu gumy arabskiej o stężeniu 100 g/l, 15 g skruszonego lodu i 20 ml wcześniej zobojętnionej oliwy z oliwek. Do zlewki o pojemności 50 ml wlać 10 ml tej emulsji, a następnie 0,3 ml roztworu cholanu sodu o stężeniu 0,2 g/ml i 20 ml wody destylowanej. Umieścić zlewkę w termostacie, którego temperatura utrzymywana jest na poziomie 37 °C; umieścić w nim elektrody pH-metru i mieszadło spiralne. Za pomocą biurety dodawać kroplami 0,1 N roztwór wodorotlenku sodu, aż pH osiągnie wartość 8,3. Dodać dostateczną objętość wodnej zawiesiny lipazy w proszku (0,1 g/ml lipazy). Z chwilą gdy pH-metr wskaże 8,3, włączyć stoper i rozpocząć wkraplanie roztworu wodorotlenku sodu z prędkością umożliwiającą utrzymanie pH na poziomie 8,3. Co minutę zapisywać objętość zużytego roztworu. Nanieść zanotowane wartości na diagram, zaznaczając na osi odciętych czas, a na osi rzędnych liczby mililitrów 0,1 N roztworu zasadowego zużytego w celu utrzymania stałego pH. W wyniku tego powinno się otrzymać linię prostą. Aktywność lipazy wyrażoną w jednostkach lipazowych na mg oblicza się według następującego wzoru: gdzie: A oznacza aktywność w jednostkach lipazowych/mg V oznacza liczbę mililitrów 0,1 N roztworu wodorotlenku sodu na minutę (obliczoną na podstawie wykresu) N oznacza normalność roztworu wodorotlenku sodu m oznacza masę w mg oznaczanej lipazy. Jednostkę lipazową definiuje się jako ilość enzymu uwalniającą 10 mikroekwiwalentów kwasu na minutę.”;