2)

dodaje się część D w brzmieniu: „D. Metoda wytrawiania próbki zbiorczej z zastosowaniem metody magnetycznego mieszania /»izolacja na filtrze« i wykrywanie larw testem aglutynacji lateksowej Metoda ta jest uważana za równoważną jedynie w odniesieniu do badania mięsa świń domowych. 1. Aparatura oraz odczynniki a) nóż lub nożyczki i pinceta do pobierania próbek; b) tacki z oznaczonymi 50 polami, z których każde może pomieścić próbki o masie około 2 g mięsa, lub inne narzędzia zapewniające równorzędne gwarancje w odniesieniu do identyfikacji pochodzenia próbek; c) malakser z ostrym tnącym ostrzem. Jeżeli próbki są większe niż 3 g, należy użyć rozdrabniacza do mięsa z otworami o wymiarach od 2 do 4 mm lub nożyczek. W przypadku mięsa mrożonego lub języka (po usunięciu warstwy wierzchniej, której nie można wytrawić) potrzebny jest rozdrabniacz do mięsa, a rozmiar próbki należy znacznie zwiększyć; d) mieszadła magnetyczne z płytą grzejną o temperaturze regulowanej termostatem i pokrytymi teflonem prętami mieszadła o długości około 5 cm; e) szklane zlewki o pojemności 3 litrów; f) sita ze stali nierdzewnej o rozmiarach oczek 180 mikronów i średnicy zewnętrznej 11 cm; g) stalowy aparat do filtracji na filtry z siatką 20 μm z lejkiem stalowym; h) pompa próżniowa; i) zbiorniki z metalu lub tworzywa sztucznego o pojemności od 10 do 15 litrów do zbierania płynu trawiącego; j) wytrząsarka; k) folia aluminiowa; l) kwas solny 25 %; m) pepsyna o mocy 1:10 000 NF (Narodowy Receptariusz USA) odpowiadająca 1:12 500 BP (Farmakopea Brytyjska) lub 2 000 FIP (Międzynarodowa Federacja Farmacji) lub stabilizowana pepsyna płynna – minimum 660 j./ml (Farmakopea Europejska); n) woda z kranu podgrzana do temperatury 46–48 °C; o) waga o dokładności do 0,1 g; p) pipety w różnych rozmiarach (1, 10 i 25 ml), mikropipety zgodnie z instrukcjami producenta testu aglutynacji lateksowej oraz uchwyty do pipet; q) filtry nylonowe z siatką 20 mikronów i o średnicy dopasowanej do systemu filtracji; r) pinceta z tworzywa sztucznego lub stali 10–15 cm; s) probówki stożkowe o pojemności 15 ml; t) tłuczek o teflonowym lub stalowym zakończeniu w kształcie stożka pasujący do probówek stożkowych; u) termometr o dokładności do 0,5 °C i zakresie 1–100 °C; v) płytki zestawu do aglutynacji lateksowej z antygenem Trichin-L, zwalidowanego pod kodem nr EURLP_D_001/2011; w) roztwór buforowy ze środkiem konserwującym (rozcieńczalnik) zestawu do aglutynacji lateksowej z antygenem Trichin-L, zwalidowanego pod kodem nr EURLP_D_001/2011; x) roztwór buforowy z dodanym środkiem konserwującym (kontrola negatywna) zestawu do aglutynacji lateksowej z antygenem Trichin-L, zwalidowanego pod kodem nr EURLP_D_001/2011; y) roztwór buforowy z dodanymi antygenami Trichinella spirali i środkiem konserwującym (kontrola pozytywna) zestawu do aglutynacji lateksowej z antygenem Trichin-L, zwalidowanego pod kodem nr EURLP_D_001/2011; z) roztwór buforowy z cząstkami polistyrenu powleczonymi przeciwciałami z dodanym środkiem konserwującym (mikrocząsteczki lateksowe) zestawu do aglutynacji lateksowej z antygenem Trichin-L, zwalidowanego pod kodem nr EURLP_D_001/2011; aa) pałeczki jednorazowego użytku. 2. Pobieranie próbek Jak określono w rozdziale I (2). 3. Procedura I. W przypadku prób zbiorczych (100 g próbek jednocześnie) należy przestrzegać procedury określonej w lit. a)–i) rozdziału I pkt (3) (I). Ponadto należy zastosować następującą procedurę: a) W uchwycie filtra umieścić filtr nylonowy z siatką 20 mikronów. Do uchwytu z blokadą przymocować stożkowy filtracyjny lejek stalowy, a na lejku położyć stalowe sito o wielkości oczek 180 mikronów. Pompę próżniową połączyć z uchwytem filtra i ze zbiornikiem z metalu lub tworzywa sztucznego, do którego zbiera się płyn trawiący. b) Zatrzymać mieszanie i wlać płyn trawiący do lejka przez sito. Przepłukać zlewkę 250 ml ciepłej wody. Płyn do płukania wlać do stacji filtracyjnej po skutecznym przefiltrowaniu płynu trawiącego. c) Za pomocą pincety zdjąć membranę filtracyjną, trzymając ją za brzegi. Złożyć membranę filtracyjną co najmniej na cztery i umieścić w probówce stożkowej o pojemności 15 ml. d) Wepchnąć membranę filtracyjną na dno probówki stożkowej o pojemności 15 ml za pomocą tłuczka i docisnąć kilkakrotnie zdecydowanymi ruchami, przy czym tłuczek powinien być umieszczony w środku złożonej membrany, zgodnie z instrukcjami producenta. e) Dodać rozcieńczalnik do probówki stożkowej o pojemności 15 ml za pomocą pipety i homogenizować membranę filtracyjną za pomocą tłuczka powtarzalnymi ruchami o małej amplitudzie, unikając gwałtownych ruchów, aby ograniczyć rozpryskiwanie cieczy, zgodnie z instrukcjami producenta. f) Każdą próbkę, kontrolę negatywną i kontrolę pozytywną należy umieścić na różnych polach płytki do aglutynacji za pomocą pipety, zgodnie z instrukcjami producenta. g) Dodać mikrocząsteczki lateksowe do każdego pola płytki do aglutynacji za pomocą pipety, zgodnie z instrukcjami producenta, nie pozwalając, aby zetknęły się z próbkami/kontrolami. Następnie na każdym polu mikrocząsteczki lateksowe delikatnie wymieszać patyczkiem jednorazowego użytku do momentu pokrycia przez homogeniczną ciecz całego pola. h) Umieścić płytkę do aglutynacji na wytrząsarce, zgodnie z instrukcjami producenta. i) Przerwać wytrząsanie po czasie podanym w instrukcji producenta, wyjąć płytkę do aglutynacji na gładką powierzchnię i odczytać wyniki reakcji. W przypadku próbki dodatniej muszą pojawić się skupiska paciorków. W przypadku próbki ujemnej zawiesina pozostaje jednorodna, a skupiska paciorków nie pojawiają się. j) Cały sprzęt mający styczność z mięsem należy dokładnie odkazić między kolejnymi analizami przez zanurzenie przez kilka sekund w ciepłej wodzie (60–90 °C). Powierzchnie, na których pozostały resztki mięsa lub inaktywowane larwy, można oczyścić za pomocą czystej gąbki i wody z kranu. Po zakończeniu procedury można dodać kilka kropli detergentu w celu odtłuszczenia aparatury. Następnie każdy element należy kilkakrotnie dokładnie przepłukać w celu usunięcia wszystkich śladów detergentu. k) Tłuczek należy starannie odkażać między kolejnymi analizami przez zanurzenie przez kilka sekund w co najmniej 250 ml ciepłej wody (60–90 °C). Resztki mięsa lub inaktywowane larwy, które mogły zostać na powierzchni, należy usunąć za pomocą czystej gąbki i wody z kranu. Po zakończeniu procedury można dodać kilka kropli detergentu w celu odtłuszczenia tłuczka. Następnie tłuczek należy kilkakrotnie dokładnie przepłukać w celu usunięcia wszystkich śladów detergentu. II. Próba zbiorcza składająca się z mniej niż 100 g, jak określono w rozdziale I (3) (II) W przypadku prób zbiorczych składających się z mniej niż 100 g należy przestrzegać procedury określonej w rozdziale I (3) (II). III. Dodatnie lub wątpliwe wyniki W przypadku dodatniego lub wątpliwego wyniku badania próbki zbiorczej testem aglutynacji lateksowej od każdej świni pobiera się kolejne 20 g próbki, zgodnie z rozdziałem I 2 a). 20 g próbek od pięciu świń należy połączyć i poddać badaniu metodą opisaną w pkt I. W ten sposób należy przebadać próbki od 20 grup po pięć świń każda. W przypadku dodatniego wyniku testu aglutynacji lateksowej uzyskanego od grupy pięciu świń należy pobrać kolejne 20 g próbek od świń w grupie i każdą poddać oddzielnemu badaniu jedną z metod opisanych w rozdziale I. Próbki pasożytów należy przechowywać w 90 % alkoholu etylowym w celu konserwacji i identyfikacji na poziomie gatunku w laboratorium referencyjnym UE lub krajowym laboratorium referencyjnym. Po zebraniu pasożytów należy odkazić płyny dodatnie przez podgrzanie do co najmniej 60 °C.”.