Dziewiąta Dyrektywa Komisji

z dnia 31 lipca 1981 r.

ustanawiająca wspólnotowe metody analizy do celów urzędowej kontroli pasz

(81/715/EWG)

KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH,

uwzględniając Traktat ustanawiający Europejską Wspólnotę Gospodarczą;

uwzględniając dyrektywę Rady 70/373/EWG z dnia 20 lipca 1970 r. w sprawie wprowadzenia wspólnotowych metod pobierania próbek i analizy do celów urzędowej kontroli pasz [1], ostatnio zmienioną Aktem Przystąpienia Grecji, w szczególności jego art. 2,

a także mając na uwadze, co następuje:

dyrektywa wymaga, by urzędowa kontrola pasz była prowadzona przy użyciu wspólnotowych metod pobierania próbek i analizy do celów kontroli zgodności z wymaganiami wynikającymi z przepisów ustawowych, wykonawczych i administracyjnych dotyczących jakości i składu pasz;

dyrektywy Komisji 71/250/EWG z dnia 15 czerwca 1971 r. [2], 71/393/EWG z dnia 18 listopada 1971 r. [3], 72/199/EWG z dnia 27 kwietnia 1972 r. [4], 73/46/EWG z dnia 5 grudnia 1972 r. [5], 74/203/EWG z dnia 25 marca 1974 r. [6], 75/84/EWG z dnia 20 grudnia 1974 r. [7] oraz 76/372/EWG z dnia 1 marca 1976 r. [8] oraz 78/633/EWG [9] ustanowiły szereg metod analizy; postęp prac od tamtej pory wskazuje celowość przyjęcia dziewiątego zestawu metod;

środki przewidziane w niniejszej dyrektywie są zgodne z opinią Stałego Komitetu ds. Pasz,

PRZYJMUJE NINIEJSZĄ DYREKTYWĘ:

Artykuł 1

Państwa Członkowskie wymagają, by analizy do celów urzędowej kontroli pasz, na zawartość w nich awoparcyny i monensinu sodu były prowadzone zgodnie z metodami opisanymi w Załączniku do niniejszej dyrektywy.

Artykuł 2

Państwa Członkowskie wprowadzą w życie przepisy ustawowe, wykonawcze i administracyjne niezbędne do wykonania niniejszej dyrektywy do dnia 1 grudnia 1981 r. i niezwłocznie powiadomią o tym Komisję.

Artykuł 3

Niniejsza dyrektywa skierowana jest do Państw Członkowskich.

Sporządzono w Brukseli, dnia 31 lipca 1981 r.

W imieniu Komisji

Gaston Thorn

Przewodniczący

[1] Dz.U. L 170 z 3.8.1970, str. 2.

[2] Dz.U. L 155 z 12.7.1971, str. 13.

[3] Dz.U. L 279 z 20.12.1971, str. 7.

[4] Dz.U. L 123 z 29.5.1972, str. 6.

[5] Dz.U. L 83 z 30.3.1973, str. 21.

[6] Dz.U. L 108 z 22.4.1974, str. 7.

[7] Dz.U. L 32 z 5.2.1975, str. 26.

[8] Dz.U. L 102 z 15.4.1976, str. 8.

[9] Dz.U. L 206 z 29.7.1978, str. 43.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK

1. OZNACZANIE AWOPARCYNY POPRZEZ DYFUZJĘ NA PODŁOŻU AGAROWYM

1. CEL I ZAKRES METODY

Metoda służy oznaczaniu awoparcyny w paszach, koncentratach i premiksach. Dolna granica oznaczenia 2 mg/kg (2 ppm). W oznaczeniu awoparcyny może przeszkadzać obecność antybiotyków polieterowych.

2. ZASADA

Próbka jest ekstrahowana przy pomocy mieszaniny acetonu, wody i kwasu solnego. Działanie antybiotykowe ekstraktu jest oznaczane poprzez pomiar dyfuzji awoparcyny na podłożu agarowym, posianym bakteriami Bacillus subtilis. Dyfuzja objawia się tworzeniem stref hamujących rozwój mikroorganizmów. Przyjmuje się, że średnica tych stref jest wprost proporcjonalna do logarytmu stężenia antybiotyku w zakresie zastosowanych stężeń antybiotyku.

3. MIKROORGANIZM: BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 (NCIB 8054)

3.1. Utrzymanie kultury macierzystej

Dokonać posiewu Bacillus subtilis na pożywce umieszczonej w próbówkach (4.1). i inkubować przez noc w temperaturze 30 °C. Przechowywać w lodówce w temperaturze około 4 °C. Ponownie dokonywać posiewu co miesiąc.

3.2. Przygotowanie zawiesiny przetrwalnikowej [1]

Zebrać przyrost ze świeżo przygotowanej powierzchni agaru (3.1) za pomocą 2-3 ml sterylnej wody. Użyć niniejszej zawiesiny do posiania 300 ml pożywki (4.1), zawartej w kolbie Rouxa i inkubować od trzech do pięciu dni w temperaturze 30 °C. Zebrać przyrost w 15 ml etanolu (4.2), po uprzednim sprawdzeniu przetrwalników pod mikroskopem, a następnie należy dobrze zamieszać. Niniejszą zawiesinę można przechowywać przynajmniej pięć miesięcy w temperaturze 4 °C.

4. POŻYWKI I ODCZYNNIKI

4.1. Pożywka [2]

Pepton | 6,0 g |

Trypton | 4,0 g |

Ekstrakt z drożdży | 3,0 g |

Ekstrakt z mięsa | 1,5 g |

Glukoza | 1,0 g |

Agar | 15,0 g |

Woda | 1000 ml |

pH 6,5 do 6,6 (po sterylizacji). | |

4.2. 20-procentowy etanol (stężenie objętościowe): rozcieńczyć 200 ml etanolu przy pomocy 800 ml wody.

4.3. Kwas solny o gęstości 1,18 do 1,19.

4.4. Wodorotlenek sodowy, roztwór o stężeniu molowym 2.

4.5. Buforowy roztwór fosforanu, stężenie molowe 0,1:

Dwuwodorofosforan potasu KH2PO4 (13,6 g).

Woda do 1000 ml.

Należy skorygować pH do 4,5

4.6. Mieszanina acetonu/wody/kwasu solnego (4.3): 65/32,5/2,5 (objętościowo/objętościowo/objętościowo).

4.7. Substancja podstawowa wzorcowa: siarczan awoparcyny o znanej aktywności.

5. ROZTWORY WZORCOWE

Rozpuścić dokładnie odważoną ilość około 10 mg substancji podstawowej (4.7) w roztworze buforowym fosforanu (4.5), a następnie rozcieńczyć tym roztworem buforowym, aby otrzymać roztwór podstawowy, zawierający 100 μg awoparcyny na mililitr. Roztwór ten przechowywany w zakorkowanej kolbie w temperaturze 4 °C jest stabilny maksymalnie przez siedem dni.

5.1. Dla premiksów

Na bazie roztworu podstawowego, rozcieńczając go stopniowo za pomocą roztworu buforowego (4.5), należy przygotować następujące roztwory:

S8 | 4,0 μg/ml |

S4 | 2,0 μg/ml |

S2 | 1,0 μg/ml |

S1 | 0,5 μg/ml |

5.2. Dla pasz

Na bazie roztworu podstawowego, rozcieńczając go stopniowo za pomocą roztworu buforowego (4.5), należy przygotować następujące roztwory:

S8 | 2,0 μg/ml |

S4 | 1,0 μg/ml |

S2 | 0,5 μg/ml |

S1 | 0,25 µg/ml |

6. PRZYGOTOWANIE EKSTRAKTU I ROZTWORÓW DO OZNACZANIA

6.1. Premiksy

Odważyć próbkę o wadze zaokrąglonej do 10,0 mg, tak aby zawierała wystarczającą ilość 10-100 mg awoparcyny. Przelać do 100 ml szklanej kolby miarowej zawierającej 60 ml mieszaniny (60 ml) i potrząsać przez 15 minut przy użyciu mechanicznej wstrząsarki. Sprawdzić pH i skorygować go do pH 2, jeśli to konieczne, przy użyciu kwasu solnego (4.3). Uzupełnić objętość przy pomocy mieszaniny (4.6) i dobrze wymieszać. Odfiltrować porcję przy użyciu odpowiedniego filtra papierowego (np. Whatman nr 1), wylewając pierwsze 5 ml filtratu. Należy wziąć podwielokrotną część próbki i skorygować jej współczynnik pH do 4,5 przy pomocy roztworu wodorotlenku sodu (4.4). Następnie należy rozcieńczyć ten roztwór przy pomocy roztworu buforowego (4.5), aby uzyskać oczekiwane stężenie awoparcyny wynoszące 4 μg/ml (= U8).

6.2. Pasze

Odważyć próbkę 50 g, i wstrząsać 100 ml mieszaniny (4.6) przez 30 minut przy użyciu mechanicznej wstrząsarki. Sklarować roztwór przy pomocy wirówki (przy użyciu zakorkowanych próbówek), następnie należy pobrać podwielokrotną część sklarowanego ekstraktu (patrz tabela poniżej) i skorygować współczynnik pH do 4,5 przy pomocy roztworu chlorowodorku sodu (4.4). Rozcieńczyć podwielokrotną część próbki przy pomocy roztworu buforowego (4.5), aby uzyskać U8 (patrz poniższa tabela).

Na bazie tego roztworu należy przygotować roztworu U4 (oczekiwana zawartość: 1 μg/ml), U2 (oczekiwana zawartość: 0,5 μg/ml) i U1 (oczekiwana zawartość: 0,25 μg/ml) metodą kolejnych rozcieńczeń (1 + 1) przy użyciu roztworu buforowego (4.5).

Zakładany poziom awoparcyny (mg/kg) | 5 | 7,5 | 10 | 15 | 20 | 40 |

Waga próbki (g ± 0, 1 g) | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |

Objętość mieszaniny (4.6) (ml) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |

Objętość sklarowanego ekstraktu (ml) | 20 | 15 | 20 | 15 | 20 | 10 |

Objętość końcowa (ml): U8 | 25 | 25 | 50 | 50 | 100 | 100 |

Oczekiwane stężenie U8 (μg/ml) | 2 | ok. 2 | 2 | ok. 2 | 2 | 2 |

7. PROCEDURA OZNACZANIA

7.1. Posiew odczynnika do oznaczania

Dokonać posiewu odczynnika do oznaczania (4.1) przy pomocy zawiesiny przetrwalnikowej (3.2) w temperaturze od 50 °C do 60 °C. Przy pomocy wstępnych prób na płytkach z odczynnikiem do oznaczania (4.1) należy ustalić ilość zawiesiny przetrwalnikowej niezbędnej do uzyskania największych i najczystszych stref hamujących reakcję przy różnych stężeniach awoparcyny.

7.2. Przygotowanie płytek

Dyfuzja w agarze jest wykonywana na płytkach z czterema stężeniami roztworu wzorcowego (S8, S4, S2, S1) oraz z czterema stężeniami roztworu do oznaczania (U8, U4, U2, U1). Powyższe cztery stężenia ekstraktu i wzorca muszą być koniecznie umieszczone na każdej płytce. Mając to na uwadze, należy wybrać odpowiednio duże płytki, które zmieszczą przynajmniej osiem otworów o średnicy 10-13 mm, przy czym odległość między środkami otworów, które mają być zrobione w podłożu agaru, nie może być mniejsza niż 30 mm. Próba może być wykonana na płytkach szklanych z pierścieniem z aluminium lub tworzywa sztucznego umieszczonym na górnej powierzchni, o średnicy 200 mm i 20 mm grubości.

Do płytek wlać odpowiednią ilość odczynnika (4.1), posianego zgodnie z opisem w ppkt 7.1, aby uzyskać 2-milimetrową warstewkę (60 ml na płytkę o średnicy 200 mm). Pozostawić do ustalenia poziomu powierzchni, następnie naciąć otwory i umieścić w nich dokładnie odmierzone objętości roztworów do oznaczania i wzorcowych (0,10-0,15 ml na dziurkę, zgodnie ze średnicą). Roztwór o każdym stężeniu należy stosować przynamniej cztery razy, tak aby każde oznaczenie podlegały ocenie 32 strefy hamujące.

7.3. Inkubacja

Płytki poddać inkubacji przez 16-18 godzin w temperaturze 30 °C.

8. OCENA

Zmierzyć średnicę stref hamujących z dokładnością do 0,1 mm. Zapisać średnie wartości pomiarów dla każdego stężenia na papierze półlogarytmicznym, pokazując logarytm ze stężeń w zależności od średnicy stref hamujących. Wykreślić linie o najlepszej zgodności zarówno dla roztworu wzorcowego, jak i ekstraktu, zgodnie na przykład z przykładem podanym poniżej.

Wyznaczyć punkt o najlepszej zgodności dla najniższego poziomu wzorcowego (SL), stosując następujący wzór:

SL =

10

Wyznaczyć punkt o najlepszej zgodności dla najwyższego poziomu wzorcowego (SH) stosując wzór:

SH =

10

W podobny sposób należy obliczyć punkty o najlepszej zgodności dla najniższego poziomu ekstraktu (UL) oraz dla najwyższego poziomu ekstraktu (UH), wstawiając w powyższych wzorach w miejsce wartości S1, S2, S4 i S8 wartości U1, U2, U4 i U8.

Zapisać obliczone wartości SL i SH na tym samym papierze milimetrowym i połączyć je linią, łączącą punkty o najlepszej zgodności dla roztworu wzorcowego. W podobny sposób zapisać wartości UL i UH na papierze milimetrowym i połączyć je uzyskując linię, łączącą punkty o najlepszej zgodności dla ekstraktu.

W przypadku braku jakichkolwiek zakłóceń linie powinny być równoległe. Do celów praktycznych linie można uznać za równoległe, jeśli wartości (SH-SL) oraz (UH-UL) nie odbiegają więcej niż 10 % od ich wartości średniej.

Jeśli okaże się, że wykresy nie są równoległe, to albo U1 i S1 lub U8 i S8 mogą być odrzucone, a wartości SL, SH, UL oraz UH obliczone przy użyciu alternatywnego wzoru, który powinien dać linie, łączące punkty o najlepszej zgodności:

a′ )SL =5S1+ 2S2– S46 | lub | 5S2+ 2S4– S86 |

b′ )SH =5S4+ 2S2– S16 | lub | 5S8+ 2S4– S26 |

i podobnie dla wartości UL i UH. Alternatywne linie, łączące punkty o najlepszej zgodności muszą być sprawdzone pod kątem równoległości jak uprzednio. Fakt, iż wynik obliczono z trzech poziomów musi być odnotowany w sprawozdaniu końcowym.

Kiedy linie zostaną uznane za równoległe, obliczyć logarytm względnej aktywności (log A) za pomocą jednego z następujących wzorów.

Dla czterech poziomów:

log A =

U

+ U

+ U

+ U

– S

– S

– S

– S

8 × 0.602U4+ U8+ S4+ S8– U1– U2– S1– S2

Dla trzech poziomów:

log A =

U

+ U

+ U

– S

– S

– S

4 × 0,401U4+ S4– U1– S1

lub

log A =

U

+ U

+ U

– S

– S

– S

8 × 0,401U8+ S8–U2– S2

Rzeczywista aktywność = aktywność domniemana × aktywność względna

Jeśli okaże się, że względna aktywność nie mieści się w zakresie 0.5-2.0, to należy powtórzyć procedurę oznaczenia po odpowiednim skorygowaniu stężeń ekstraktu lub, jeśli to nie jest możliwe, roztworów wzorcowych. Kiedy nie można osiągnąć wartości względnej aktywności w wymaganym zakresie, to dowolny uzyskany wynik powinien być uznany za przybliżony, co powinno zostać odnotowane w sprawozdaniu końcowym.

W przypadku gdy linie nie są równoległe, powtórzyć oznaczenie. Jeśli nadal linie wykresów nie będą równoległe, oznaczenie jest uważane za niewystarczające.

9. POWTARZALNOŚĆ

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzonych na tej samej próbce przez tego samego analityka, nie powinna przekraczać:

- 2 mg/kg, w wartościach bezwzględnych dla zawartości awoparcyny w przedziale 2—10 mg/kg,

- 20 % w przypadku najwyższej zawartości awoparcyny w przedziale 10—25 mg/kg,

- 5 mg/kg, w wartościach bezwzględnych dla zawartości awoparcyny w przedziale 25—50 mg/kg,

- 10 % w przypadku najwyższej zawartości powyżej 50 mg/kg.

2. OZNACZANIE MONENSINU SODOWEGO POPRZEZ DYFUZJĘ NA PODŁOŻU AGAROWYM

1. CEL I ZAKRES METODY

Metoda służy oznaczaniu monensinu sodowego w paszach, koncentratach i premiksach. Dolna granica oznaczenia 10 mg/kg (10 ppm) [3].

2. ZASADA

Próbka jest ekstrahowana przy pomocy 90-procentowego metanolu. Ekstrakt jest poddawany właściwym procedurom w zależności od zawartości monensinu sodowego w próbce. Działanie antybiotykowe jest oznaczane poprzez pomiar dyfuzji monensinu sodowego w podłożu agaru, posianym bakteriami Bacillus subtilis. Dyfuzję widać po utworzeniu się stref hamujących rozwój mikroorganizmów. Przyjmuje się, że średnica tych stref jest bezpośrednio proporcjonalna do logarytmu stężenia antybiotyku w zakresie stosowanych stężeń antybiotyku. Czułość tego układu do oznaczania zawartości monensinu sodowego jest mniejsza w przypadku obecności jonów sodu.

3. MIKROORGANIZM: BACILLUS SUBTILIS ATCC 6633 (NCIB 8054)

3.1. Utrzymanie kultury macierzystej

Dokonać posiewu Bacillus subtilis na pożywce umieszczonej w próbówkach (4.1) i inkubować przez noc w temperaturze 30 °C. Przechowywać w lodówce w temperaturze około 4 °C. Ponawiać posiew co miesiąc.

3.2. Przygotowanie zawiesiny przetrwalnikowej [4]

Zebrać przyrost z ostatnio przygotowanego wyciągu agaru (3.1) przy pomocy 2-3 ml sterylnej wody. Tak przygotowaną zawiesinę używać do posiewu 300 ml pożywki (4.1), zawartej w kolbie Rouxa i inkubować od trzech do pięciu dni w temperaturze 30 °C. Zebrać przyrost w 15 ml 20-procentowego etanolu (4.3), po uprzednim sprawdzeniu przetrwalników pod mikroskopem i dobrym wymieszaniu. Niniejszą zawiesinę można przechowywać przynajmniej pięć miesięcy w temperaturze 4 °C.

4. POŻYWKI I ODCZYNNIKI

4.1. Pożywka [5]

Trypton | 10,0 g |

Ekstrakt z drożdży | 3,0 g |

Ekstrakt z mięsa | 1,5 g |

Glukoza | 1,0 g |

Agar (zgodnie z jakością) | 10,0 g do 20,0 g |

Woda | 1000 ml |

pH 6,5 (po sterylizacji) | |

4.2. Odczynnik do oznaczania

Glukoza | 10,0 g |

Ekstrakt z drożdży | 2,5 g |

Wodorofosforan dwupotasowy K2HPO4 | 0,69 g |

Dwuwodorofosforan potasu KH2PO4 | 0,45 g |

Agar (zgodnie z jakością) | 10,0 g do 20,0 g |

Woda | 1000 ml |

pH 6 (po sterylizacji) | |

4.3. 20-procentowy etanol (objętościowo): rozpuścić 200 ml etanolu w 800 ml wody.

4.4. Metanol bezwodny.

4.5. 90-procentowy metanol (objętościowo): rozpuścić 900 ml metanolu (4.4) w 100 ml wody.

4.6. 50-procentowy metanol (objętościowo): rozpuścić 500 ml metanolu (4.4) w 500 ml wody.

4.7. Granulowany tlenek glinowy (alcoa F, wielkość oczka siatki 20; aktywowany tlenek glinowy UGI: F. Lancaster & Co. lub równoważny).

4.8. Substancje wzorcowe: monensin sodowy o znanej aktywności (np. z Międzynarodowego Laboratorium Norm Biologicznych. Centralne Laboratorium Weterynaryjne. Weybridge, UK Surrey KT 15 3 NB).

5. APARATURA

5.1. Obrotowa wyparka próżniowa z 250-mililitrową kolbą o okrągłym dnie.

5.2. Szklana probówka dla chromatografii, średnica wewnętrzna: 25 mm, długość: 400 mm, przy czym otwarty koniec ma średnicę 2 mm.

5.3. Szklana probówka dla chromatografii, średnica wewnętrzna: 11 mm, długość ok. 300 mm, przy czym otwarty koniec ma średnicę 2 mm.

6. ROZTWORY WZORCOWE

Rozpuścić dokładnie odważoną ilość około 10 mg substancji podstawowej (4.8) w metanolu (4.4), a następnie rozcieńczyć, aby otrzymać roztwór podstawowy, zawierający 800 μg monensinu sodowego na mililitr. Roztwór ten przechowywany w zakorkowanej kolbie w temperaturze 4 °C jest stabilny maksymalnie przez maksymalnie dwa tygodnie.

Na bazie roztworu podstawowego, rozcieńczając go stopniowo za pomocą 50-procentowego metanolu (4.6), należy przygotować następujące roztwory:

S8 | 8,0 μg/ml |

S4 | 4,0 μg/ml |

S2 | 2,0 μg/ml |

S1 | 1,0 μg/ml |

7. PRZYGOTOWANIE EKSTRAKTU

7.1. Ekstrakcja

7.1.1. Premiksy

Odważyć próbkę o wadze 2 mg, dodać 100 ml 90-procentowego metanolu (4.5), poddać homogenizacji i odwirowaniu przez kilka minut. Rozcieńczyć ciecz sklarowaną nad osadem przy pomocy 50-procentowego metanolu (4.6), aby uzyskać oczekiwaną zawartość monensinu sodu wynoszącą 8 μg/ml (= U8).

7.1.2. Pasze z zawartością monensinu sodu co najmniej 50 ppm

Odważyć próbkę od 10 do 20 g, dodać 100 ml 90-procentowego metanolu (4.5), homogenizować przez 15 minut i odstawić do osadzenia się.

Do wąskiego końca probówki szklanej (5.2) włożyć zatyczkę z waty i dodać tlenku glinowego (4.7), a następnie delikatnie pobierać aż poziom w kolumnie osiągnie 75-80 mm.

Zlać ciecz znad osadu ekstraktu do kolumny z tlenkiem glinowym i zebrać filtrat. Rozcieńczyć 30 ml filtratu przy pomocy 50 ml wody. Kolejne rozcieńczenia należy wykonywać stosując 50-procentowy metanol (4.6), aby uzyskać oczekiwaną zawartość monensinu sodu w wysokości 8 μg/ml (= U8).

7.1.3. Pasze z zawartością monensinu sodu poniżej 50 ppm (do poziomu 10 ppm)

Odważyć próbkę od 10 do 20 g, dodać 100 ml 90-procentowego metanolu (4.5), homogenizować przez 15 minut i odwirować w celu sklarowania.

Aby uzyskać próbkę zawierającą 20 ppm monensinu sodu, należy wziąć 40 ml cieczy sklarowanej nad osadem, natomiast w celu uzyskania próbki zawierającej 10 ppm należy wziąć 80 ml i odparować do sucha w próżni na obrotowej wyparce (5.1) w maksymalnej temperaturze 40 °C. Resztę należy rozpuścić w 10 ml 90-procentowego metanolu (4.5).

Do wąskiego końca probówki szklanej (5.2) włożyć zatyczkę z waty i dodać tlenku glinowego (4.7), a następnie delikatnie pobierać aż poziom w kolumnie osiągnie 75-80 mm.

Zlać ciecz znad osadu ekstraktu do kolumny z tlenkiem glinowym i zebrać filtrat. Przepłukać kolumnę 10 ml 90-procentowego metanolu (4.5) i wymieszać popłuczyny z filtratem.

Odparować roztwór do sucha w próżni przy użyciu wyparki obrotowej (5.1) w temperaturze poniżej 40 °C. Resztę należy rozpuścić w 10 ml bezwodnego metanolu (4.4) i uzupełnić objętość wodą do 20 ml. Odwirować roztwór z szybkością przynajmniej 4000 obrotów na minutę przez minimum pięć minut. Do kolejnych rozcieńczeń należy używać 50-procentowego metanolu (4.6), aby uzyskać oczekiwaną zawartość monensinu sodu w wysokości 8 μg/ml (= U8).

7.2. Roztwory do oznaczania

Na bazie roztworu U8 należy przygotować roztwory U4 (oczekiwana zawartość: 4 μg/ml), U2 (oczekiwana zawartość: 2 μg/ml) i U1 (oczekiwana zawartość: 1 μg/ml) metodą kolejnych rozcieńczeń (1 + 1) przy użyciu 50-procentowego metanolu (4.6).

8. PROCEDURA OZNACZANIA

8.1. Posiew czynnika do oznaczania

Dokonać posiewu czynnika do oznaczania (4.2) za pomocą zawiesiny przetrwalnikowej (3.2) w temperaturze od 50 °C do 60 °C. Przy pomocy wstępnych prób na płytkach z odczynnikiem do oznaczania (4.2) należy ustalić ilość zawiesiny przetrwalnikowej niezbędnej do uzyskania największych i najczystszych stref hamujących reakcję przy różnych poziomach stężenia monensinu sodu.

8.2. Przygotowanie płytek

Dyfuzję w agarze wykonuje się na płytkach z czterema stężeniami roztworów wzorcowych (S8, S4, S2, S1) oraz z czterema stężeniami roztworu do oznaczania (U8, U4, U2, U1). Powyższe cztery stężenia ekstraktu i wzorzec muszą być koniecznie umieszczone na każdej płytce. Mając to na uwadze, należy wybrać odpowiednio duże płytki, które zmieszczą przynajmniej osiem otworów o średnicy od 10 do 13 mm, przy czym odległość między środkami otworów, które mają być zrobione w podłożu agaru, nie może być mniejsza niż 30 mm. Próba może być wykonana na płytkach szklanych z pierścieniem z aluminium lub tworzywa sztucznego umieszczonym na górnej powierzchni, o średnicy 200 mm i 20 mm grubości.

Do płytek należy wlać odpowiednią ilość odczynnika (4.2), posianego zgodnie z opisem w pkt 8.1, aby uzyskać 2 mm warstewkę (60 ml na płytkę o średnicy 200 mm). Zostawić przez chwilę, aby powierzchnia się wyrównała, następnie nawiercić otwory i umieścić w nich dokładnie odmierzone objętości roztworów do oznaczania i wzorcowych (od 0,10 do 0,15 ml na otwór, zgodnie ze średnicą). Roztwór o każdym stężeniu należy stosować przynamniej cztery razy, tak aby każde oznaczenie podlegały ocenie 32 strefy hamujące.

8.3. Inkubacja

Inkubować płytki około 18 godzin w temperaturze od 35 do 37 °C.

9. OCENA

Zmierzyć średnicę stref hamujących z dokładnością do 0,1 mm. Zapisać średnie wartości pomiarów dla każdego stężenia na papierze półlogarytmicznym, pokazując logarytm ze stężeń w zależności od średnicy stref hamujących. Wykreślić linie o najlepszej zgodności zarówno dla roztworu wzorcowego, jak i ekstraktu, na przykład jak poniżej.

Wyznaczyć punkt o najlepszej zgodności dla najniższego poziomu wzorcowego (SL) stosując następujący wzór:

SL =

10

Wyznaczyć punkt o najlepszej zgodności dla najwyższego poziomu wzorcowego (SH) stosując wzór:

SH =

10

W podobny sposób należy obliczyć punkty o najlepszej zgodności dla najniższego poziomu ekstraktu (UL) oraz dla najwyższego poziomu ekstraktu (UH) wstawiając w powyższych wzorach wartości U1, U2, U4 i U8 w miejsce wartości S1, S2, S4 i S8.

Zapisać obliczone wartości SL i SH na tym samym papierze milimetrowym i połączyć je linią łączącą punkty o najlepszej zgodności dla wzorcowego roztworu. W podobny sposób zapisać wartości UL i UH na papierze milimetrowym i połączyć je uzyskując linię łączącą punkty o najlepszej zgodności dla ekstraktu.

W przypadku braku jakichkolwiek zakłóceń linie powinny być równoległe. Do celów praktycznych linie można uznać za równoległe, jeśli wartości (SH-SL) oraz (UH-UL) nie odbiegają więcej niż 10 % od ich wartości średniej.

Jeśli okaże się, że wykresy nie są równoległe, to albo U1 i S1 lub U8 i S8 mogą być odrzucone, a wartości SL, SH, UL oraz UH obliczone przy użyciu alternatywnego wzoru, który powinien dać linie łączące punkty o najlepszej zgodności:

a′ )SL =5S1+ 2S2– S46 | lub | 5S2+ 2S4– S86 |

b′ )SH =5S4+ 2S2– S16 | lub | 5S8+ 2S4– S26 |

i podobnie dla wartości UL i UH. Alternatywne linie, łączące punkty o najlepszej zgodności, powinny być sprawdzone pod kątem równoległości, tak jak poprzednio. To, że wyniki zostały otrzymane przy użyciu trzech różnych poziomów, należy odnotować w sprawozdaniu końcowym.

Kiedy linie zostaną uznane za równoległe, obliczyć logarytm względnej aktywności (log A) za pomocą jednego z następujących wzorów.

Dla czterech poziomów:

log A =

U

+ U

+ U

+ U

– S

– S

– S

– S

8 × 0,602U4+ U8+ S4+ S8−U1– U2– S1– S2

Dla trzech poziomów:

log A =

U

+ U

+ U

– S

– S

– S

4 × 0,401+S4– U1– S1

lub

× 0,401

U

+ S

– U

– S

2

Rzeczywista aktywność = aktywność domniemana x aktywność względna

Jeśli okaże się, że względna aktywność nie mieści się w zakresie 0,5-2,0, to należy powtórzyć procedurę oznaczenia po odpowiednim skorygowaniu stężeń ekstraktu lub, jeśli to nie jest możliwe, roztworów wzorcowych. Kiedy nie można osiągnąć wartości względnej aktywności w wymaganym zakresie, to dowolny uzyskany wynik powinien być uznany za przybliżony, co powinno zostać odnotowane w sprawozdaniu końcowym.

W przypadku gdy linie nie są równoległe, należy powtórzyć oznaczenie. Jeśli nadal linie wykresów nie będą równoległe to należy oznaczenie uznać za niezadowalające.

10. POWTARZALNOŚĆ

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzonych na tej samej próbce, przez tego samego analityka, nie powinna przekraczać:

- 20 % w przypadku najwyższej zawartości monensinu sodu w przedziale od 10 do 25 mg/kg,

- 5 mg/kg, w wartościach bezwzględnych dla zawartości monensinu sodu w przedziale od 25 do 50 mg/kg,

- 10 % w przypadku najwyższej zawartości powyżej 50 mg/kg.

[1] Można stosować inne metody, pod warunkiem że zostało ustalone, że dają one podobne roztwory przetrwalnikowe.

[2] Można zastosować dowolną pożywkę dostępną w handlu, o podobnym składzie i dającą takie same rezultaty.

[3] 1 mg monensinu sodowego jest równoważny 1000 jednostkom UK.

[4] Można stosować inne metody, pod warunkiem że zostało ustalone, że dają one podobne roztwory przetrwalnikowe.

[5] Można zastosować dowolną pożywkę dostępną w handlu, o podobnym składzie i dającą takie same rezultaty.

--------------------------------------------------