ZAŁĄCZNIK II

SCHEMAT BADANIA DIAGNOSTYCZNEGO, WYKRYWANIA ORAZ IDENTYFIKACJI RALSTONIA SOLANACEARUM (SMITH) YABUUCHI ET AL.

ZAKRES BADANIA

Przedstawiony schemat opisuje różne procedury odnoszące się do:

i) diagnostyki śluzaka w bulwach ziemniaka oraz w roślinach ziemniaka i pomidora i niektórych innych roślinach żywicielskich;

ii) wykrywania Ralstonia solanacearum w próbach bulw ziemniaka, roślinach ziemniaka, pomidora i w innych roślinach żywicielskich, oraz w wodzie i glebie;

iii) identyfikacji Ralstonia solanacearum (R. solanacearum).

SPIS TREŚCI

Strona Zasady ogólne 40 SEKCJA I: Zastosowanie schematu badania 40 1. Schemat diagnostyki śluzaka (R. solanacearum) w bulwach ziemniaka oraz w bulwach ziemniaka oraz roślinach ziemniaka, pomidora lub innych roślinach żywicielskich z objawami śluzaka lub więdnięcia bakteryjnego 40 2. Schemat wykrywania oraz identyfikacji R. solanacearum w bezobjawowych próbach bulw ziemniaka 43 3. Schemat wykrywania oraz identyfikacji R. solanacearum w bezobjawowych próbach bulw ziemniaka, pomidora lub innych roślin żywicielskich 46 SEKCJA II: Szczegółowe metody wykrywania R. solanacearum w bulwach ziemniaka i roślinach ziemniaka, pomidora lub innych roślinach żywicielskich z objawami śluzaka lub więdnięcia bakteryjnego 48 1. Objawy 48 2. Szybkie testy przesiewowe 48 3. Posiew na podłoża selektywne 49 4. Testy identyfikacyjne dla R. solanacearum 49 SEKCJA III: 1. Szczegółowe metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w próbach bezobjawowych bulw ziemniaka 49 1.1. Przygotowanie próby 49 1.2. Badanie 51 2. Szczegółowe metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w próbach bezobjawowych ziemniaka, pomidora lub innych roślin 51 2.1. Przygotowanie próby 51 2.2. Badanie 52 SEKCJA IV: 1. Schemat wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w wodzie 53 2. Metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w wodzie 55 2.1. Przygotowanie próby 55 2.2. Badanie 55 SEKCJA V: 1. Schemat wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w glebie 56 2. Metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w glebie 58 2.1. Przygotowanie próby 58 2.2. Badanie 58 SEKCJA VI: Zoptymalizowane protokoły wykrywania i identyfikacji R. solanacearum 58 A. Testy diagnostyczne i wykrywanie 58 1. Badanie na obecność wycieków z wiązek przewodzących łodygi 58 2. Badanie na obecność granulek poly-β-hydroksymaślanu 58 3. Test aglutynacji serologicznej 59 4. Izolacja selektywna 60 4.1. Izolacja na podłoże selektywne 60 4.2. Procedura wzbogacenia 60 5. Test immunofluorescencyjny (test IF) 61 6. Reakcja łańcuchowa polimerazy (test PCR) 64 6.1. Metody oczyszczania DNA 65 a) Metoda zgodnie z Pastrik (2000) 65 b) Inne metody 65 6.2. PCR 66 6.3. Analiza produktu PCR 66 7. Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ (test FISH) 67 8. Testy immunoenzymosorbcyjne (testy ELISA) 69 a) ELISA pośrednie 69 b) DASI ELISA (test ELISA sandwiczowy pośredni) 70 9. Test biologiczny 71 B. Testy identyfikacyjne 72 1. Testy fizjologiczne i biochemiczne 72 2. Test IF 72 3. Test ELISA 73 4. Test PCR 73 5. Test FISH 73 6. Analiza kwasów tłuszczowych (FAP) 73 7. Metoda oznaczania szczepu 73 7.1. Określenie biowaru 73 7.2. Genomowe fingerprinting 74 7.3. Metody PCR 74 C. Testy potwierdzające 74 Dodatek 1 Laboratoria zajmujące się optymalizacją i zatwierdzeniem protokołów 76 Dodatek 2 Pożywki do izolacji i hodowli R. solanacearum 77 Dodatek 3 A. Dostępne w handlu znormalizowane materiały kontrolne 79 B. Przygotowanie kontroli 80 Dodatek 4 Skład buforów i sposób ich przygotowania 82 Dodatek 5 Określenie poziomu porażenia w testach IF i FISH 85 Dodatek 6 Zatwierdzone protokoły PCR i odczynniki 86 Dodatek 7 Zatwierdzone odczynniki do testu FISH 91 Dodatek 8 Hodowla oberżyny i pomidora 93 Literatura 94

ZASADY OGÓLNE

Dodatki zawierają zoptymalizowane protokoły dla różnych metod, zatwierdzonych odczynników i danych szczegółowych dotyczących przygotowania badania i materiałów kontrolnych. Dodatek 1 zawiera spis laboratoriów uwzględnionych w optymalizacji i zatwierdzeniu protokołów.

W związku z tym, że protokoły obejmują wykrywanie organizmu poddanego kwarantannie i wykorzystanie kultur żywych R. solanacearum jako materiału kontrolnego, konieczne będzie wykonanie procedur w odpowiednich warunkach kwarantanny przy użyciu odpowiednich urządzeń do usuwania odpadów oraz będąc w posiadaniu odpowiednich pozwoleń wydanych przez władze urzędowe odpowiedzialne za kwarantannę roślin.

Parametry badania muszą zapewnić zgodne i dające się odtworzyć wykrycie różnych poziomów R. solanacearum przy użyciu określonych wartości progowych wybranych metod.

Niezbędne jest dokładne przygotowanie pozytywnych kontroli

Przeprowadzanie badań zgodnie z wymaganymi wartościami progowymi zakłada również właściwe ustawienia, utrzymanie oraz kalibrację urządzeń, ostrożne obchodzenie się i przechowywanie odczynników i wszystkie środki niezbędne dla zapobiegnięcia kontaminacji próbek, np. oddzielenie kontroli pozytywnych od prób badanych. Dla uniknięcia błędów administracyjnych i innych błędów należy przestrzegać norm kontroli jakości, zwłaszcza dotyczących etykietowania i dokumentacji.

Podejrzenie o wystąpienie opisane w art. 4 ust. 2 dyrektywy 98/57/WE oznacza pozytywny wynik badań diagnostycznych lub przesiewowych wykonanych na próbie zgodnie z tym, co określono na poniższych schematach blokowych. Pozytywne pierwsze badanie przesiewowe (badanie IF, PCR/FISH, izolacja selektywna) musi zostać potwierdzone drugim badaniem przesiewowym w oparciu o inną zasadę biologiczną.

Jeżeli pierwsze badanie przesiewowe da wynik pozytywny, wówczas istnieje podejrzenie porażenia R. solanacearum i należy wykonać drugie badanie przesiewowe. Jeżeli drugie badanie przesiewowe da wynik pozytywny, wówczas podejrzenie zostaje potwierdzone (podejrzenie występowania) i należy wykonywać badania zgodnie ze schematem. Jeśli drugie badanie przesiewowe da wynik negatywny, wówczas próbę uznaje się za nieporażoną R. solanacearum.

Potwierdzenie obecności porażenia, o której mowa w art. 5 ust. 1 dyrektywy 98/57/WE, oznacza wyizolowanie i zidentyfikowanie czystej kultury R. solanacearum z potwierdzeniem patogeniczności.

SEKCJA I

SCHEMAT BADANIA

1. Schemat diagnozowania śluzaka w bulwach ziemniaka oraz R. solanacearum w bulwach ziemniaka oraz w roślinach ziemniaka, pomidora lub innych roślinach żywicielskich z objawami śluzaka lub więdnięcia bakteryjnego

Procedura badania jest przeznaczona dla bulw ziemniaka i roślin z objawami śluzaka lub więdnięcia bakteryjnego. Procedura ta obejmuje szybkie badanie przesiewowe, izolację patogenu z porażonej tkanki naczyniowej na pożywkę diagnostyczną (selektywną) oraz, w przypadku wyniku pozytywnego, identyfikację kultury jako Ralstonia solanacearum.

2. Schemat wykrywania oraz identyfikacji Ralstonia solanacearum w bezobjawowych próbach bulw ziemniaka

Zasada:

Procedura badania przeznaczona jest do wykrywania utajonych infekcji bulw ziemniaka. W przypadku wyniku pozytywnego przynajmniej dwóch badań przesiewowych3, w oparciu o różne zasady biologiczne, procedura musi zostać uzupełniona izolacją patogenu, po której wykonane zostaje – w przypadku izolacji typowych kolonii – potwierdzenie czystej kultury jako R. solanacearum. Pozytywny wynik tylko jednego badania przesiewowego nie jest wystarczający dla stwierdzenia, że próba jest podejrzana.

Badania przesiewowe i badania izolacji muszą pozwolić na wykrycie od 103 do 104 komórek/ml zawieszonego osadu, w kontroli pozytywnej załączonej do każdej serii badań.

3. Schemat wykrywania oraz identyfikacji Ralstonia solanacearum w bezobjawowych próbach roślin ziemniaka, pomidora lub innych roślin żywicielskich.

SEKCJA II

SZCZEGÓŁOWE METODY WYKRYWANIA RALSTONIA SOLANACEARUM W BULWACH ZIEMNIAKA I ROŚLINACH ZIEMNIAKA, POMIDORA LUB INNYCH ROŚLINACH ŻYWICIELSKICH Z OBJAWAMI ŚLUZAKA LUB WIĘDNIĘCIA BAKTERYJNEGO

1. Objawy (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

1.1. Objawy na ziemniaku

Roślina ziemniaka. Wczesnym stadium infekcji w polu jest więdnięcie liści od podstawy w kierunku wierzchołka rośliny w wysokiej temperaturze panującej w ciągu dnia oraz poprawa ich stanu w ciągu nocy. We wczesnych stadiach więdnięcia liście pozostają zielone, lecz później żółkną i rozwijają się nekrozy. Występuje również epinastia. W szybkim czasie więdnięcie jednego pędu lub całej rośliny staje się nieodwracalne i prowadzi do śmierci całej rośliny. Tkanka naczyniowa w łodygach przeciętych w poprzek więdnącej rośliny zwykle brązowieje, a z przeciętej powierzchni wypływa mleczny śluz bakteryjny lub można go wycisnąć z rośliny. Gdy uciętą łodygę wstawi się pionowo do wody, z wiązek naczyniowych będzie wypływać śluz.

Bulwa ziemniaka. Bulwy ziemniaka należy przecinać poprzecznie w pobliżu części przystolonowej lub podłużnie poprzez stolon. Wczesne stadium infekcji objawia się odbarwieniem szklistożółtym do lekko brązowego pierścienia naczyniowego, na którym po kilku minutach samoistnie zacznie pojawiać się kremowy wyciek. Później przebarwienie wiązek naczyniowych staje się bardziej brązowe, a nekrozy mogą objąć tkankę parenchymatyczną. W zaawansowanych stadiach choroby infekcja rozprzestrzenia się i obejmuje nie tylko części przystolonowej oraz oczka, z których mogą wypływać bakterie, co powoduje przyleganie cząstek glebowych. Mogą pojawić się czerwonawo-brązowe, lekko zapadnięte zmiany na naskórku z powodu wewnętrznego zapadania się tkanek naczyniowych. W zaawansowanych stadiach choroby częste jest występowanie wtórnego rozwoju zgnilizny grzybowej i bakteryjnej.

1.2. Objawy na pomidorze

Roślina pomidora. Pierwszym widocznym objawem jest zwiędły wygląd najmłodszych liści. W korzystnych dla patogenu warunkach środowiska (temperatura gleby około 25 °C, wysoka wilgotność powietrza) w ciągu kilku dni następuje epinastia oraz więdnięcie jednej strony lub całej rośliny, co prowadzi do pokładania się rośliny. W warunkach mniej korzystnych (temperatura gleby niższa od 21 °C) więdnięcie jest mniejsze, lecz na łodydze może rozwinąć się wiele nowych korzeni. Można zaobserwować tłustawy pasek dookoła łodygi, który świadczy o martwicy układu naczyniowego. Po przecięciu łodygi w poprzek odbarwione brązowe tkanki naczyniowe wydzielają krople białego lub żółtawego śluzu bakteryjnego.

1.3. Objawy na innych roślinach żywicielskich

Rośliny Solanum dulcamara oraz S. nigrum. W warunkach naturalnych objawy więdnięcia u tych żywicieli obserwuje się rzadko, chyba że temperatura gleby przekracza 25 °C lub poziomy inokulum są bardzo wysokie (np. jak dla S. nigrum rosnącej w pobliżu chorej rośliny ziemniaka lub pomidora). Gdy nie występuje więdnięcie, objawy są takie jak w przypadku pomidora. Rośliny S. dulcamara, które nie więdną, rosnące z łodygami i korzeniami w wodzie, mogą wykazywać wewnętrzne lekkie brązowawe przebarwienie wiązek przewodzących na przekroju poprzecznym podstawy łodygi lub na częściach znajdujących się pod wodą. Z przeciętych wiązek przewodzących mogą wydostawać się bakterie lub smugi śluzu, jeśli przecięta łodyga zostanie ustawiona pionowo w wodzie, nawet przy braku objawów więdnięcia.

2. Szybkie testy przesiewowe

Szybkie testy przesiewowe mogą ułatwić wstępną diagnozę, ale nie są niezbędne. Należy zastosować jeden lub kilka z poniższych zatwierdzonych testów:

2.1. Badanie na obecność wycieków z wiązek przewodzących łodygi

(Patrz: sekcja VI.A.1)

2.2. Wykrywanie granulek poli-β-hydroksymaślanu (PHB)

Charakterystyczne granulki PHB w komórkach R. solanacearum można zobaczyć, wybarwiając je na szkiełku przedmiotowym błękitem Nilu A lub czernią sudanową w utrwalonych termicznie rozmazach śluzu bakteryjnego z porażonej tkanki (patrz: sekcja VI.A.2).

2.3. Test aglutynacji serologicznej

(Patrz: sekcja VI.A.3.)

2.4. Inne testy

Dalsze odpowiednie badania przesiewowe to test IF (patrz: sekcja VI.A.5), Test FISH (patrz: sekcja VI.A.7), testy ELISA (patrz: sekcja VI.A.8) oraz test PCR (patrz: sekcja VI.A.6).

3. Posiew na podłoża selektywne

a) Pobrać wyciek z tkanki lub fragmenty przebarwionej tkanki z pierścienia wiązek przewodzących bulwy ziemniaka albo z wiązek łodygi rośliny ziemniaka, pomidora lub innych więdnących roślin żywicielskich. Zawiesić je w niewielkiej ilości sterylnej wody destylowanej lub 50 mM buforu fosforanowego (dodatek 4) i pozostawić na 5–10 minut.

b) Przygotować serię dziesięciokrotnych rozcieńczeń zawiesiny.

c) Przenieść 50–100 µl zawiesiny i jej rozcieńczeń na pożywkę uniwersalną (NA, YPGA lub SPA; patrz: dodatek 2) i/lub na pożywkę tetrazolową Kelmana (dodatek 2) i/lub na zatwierdzoną selektywną pożywkę (np. SMSA; patrz: dodatek 2). Nanieść i rozprowadzić zawiesinę na płytce. W razie potrzeby przygotować oddzielne płytki z rozcieńczoną zawiesiną R. solanacearum biowaru 2 jako kontrolę pozytywną.

d) Inkubować płytki przez 2–6 dni w temperaturze 28 °C. — Na pożywkach uniwersalnych wirulentne szczepy R. solanacearum rosną w postaci kolonii perłowo-białych, płaskich, nieregularnych i ciekłych, często z charakterystycznymi spiralami w środku. Awirulentne postacie R. solanacearum rosną jako małe, okrągłe, nieciekłe kolonie całkowicie kremowo-białe. — Na pożywce tetrazolowej Kelmana i SMSA spirale mają krwistoczerwony kolor. Awirulentne postacie R. solanacearum rosną jako małe, okrągłe, nieciekłe kolonie całe o głęboko czerwonej barwie oraz o maślanej konsystencji.

4. Testy identyfikacyjne dla R. solanacearum

Badania potwierdzające wstępną identyfikację szczepów R. solanacearum pokazano w sekcji VI.B.

SEKCJA III

1. Szczegółowe metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w próbach bezobjawowych bulw ziemniaka

1.1. Przygotowanie próby

Uwaga:

— Standardowa wielkość próby wynosi 200 bulw. Bardziej intensywne badania wymagają większej ilości testów na próbach tej wielkości. Większa liczba bulw w próbie będzie uniemożliwiać lub utrudniać interpretację wyników. Jednak gdy dostępna jest mniejsza niż 200 liczba bulw, procedurę tę można stosować z powodzeniem.

— Zatwierdzenie wszystkich opisanych niżej metod wykrywania oparte było na testowaniu prób złożonych z 200 bulw.

— Opisany poniżej ekstrakt z ziemniaków może być także wykorzystany do wykrywania bakterii bakteriozy pierścieniowej ziemniaka, Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus.

Fakultatywne czynności wstępne przed przygotowaniem próby:

a) Inkubować próby w temperaturze 25–30 °C przez okres do dwu tygodni przed badaniem, aby pomóc w namnożeniu populacji R. solanacearum.

b) Umyć bulwy. Użyć właściwych środków odkażających (związki chloru, gdy zastosowane ma być badanie PCR dla usunięcia DNA patogenu) i detergentów pomiędzy każda próbą. Wysuszyć bulwy na powietrzu. Ta procedura mycia jest szczególnie przydatna (lecz niewymagana) przy próbach z nadmiarem ziemi i w przypadku wykonywania testu PCR lub procedury bezpośredniej izolacji.

1.1.1. Usunąć czystym i zdezynfekowanym skalpelem lub nożem do warzyw skórkę z części przystolonowej każdej bulwy, w taki sposób, by odsłonić tkanki przewodzące. Starannie wyciąć mały stożek z tkanki przewodzącej z części przystolonowej i ograniczyć ilość tkanki innej niż przewodząca do minimum. (Patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Uwaga: Odłożyć na bok wszystkie (gnijące) bulwy z objawami śluzaka przechowywać i badać oddzielnie.

Jeżeli w czasie pobierania tkanki przystolonowej obserwuje się objawy nasuwające podejrzenie śluzaka, należy przeprowadzić wzrokowe badanie bulwy i przeciąć bulwę w części przystolonowej. Wszystkie przekroje bulw z podejrzanymi objawami powinny być pozostawione co najmniej przez dwie doby w temperaturze pokojowej, aby umożliwić korkowacenie i przechowywane w lodówce (w temperaturze 4–10 °C) we właściwych warunkach kwarantanny. Wszystkie bulwy, włącznie z tymi przejawiającymi podejrzane objawy, należy przechowywać zgodnie z załącznikiem III.

1.1.2. Fragmenty części przystolonowych umieścić w nieużywanych wcześniej pojemnikach jednorazowego użytku, które można szczelnie zamknąć (w przypadku powtórnego użycia pojemników należy je starannie oczyścić i zdezynfekować przy użyciu związków chloru). Pobrane fragmenty części przystolonowych najlepiej poddać obróbce niezwłocznie. Jeżeli jednak nie będzie to możliwe, przechować je w pojemniku bez dodatku roztworu buforowego w lodówce nie dłużej niż 72 godziny lub nie dłużej niż 24 godziny w temperaturze pokojowej.

Z pobranymi fragmentami części przystolonowych postępować według jednej z następujących procedur:

a) fragmenty tkanki przystolonowej pokryć dostateczną objętością (około 40 ml) buforu do ekstrakcji (dodatek 4) i mieszać na wytrząsarce obrotowej (50–100 obr./min) przez 4 godziny, utrzymując temperaturę poniżej 24 °C lub przez 16–24 godzin w lodówce; lub

b) fragmenty tkanki przystolonowej homogenizować z odpowiednią ilością (około 40 ml) buforu do ekstrakcji (dodatek 4) albo z użyciem miksera (np. Waring lub Ultra Thurax), albo przez rozdrabnianie w szczelnie zamkniętej jednorazowej torebce do maceracji (np. Stomacher lub Bioreba z polietylenu o dużej wytrzymałości, 150 x 250 mm; sterylizowane promieniowaniem), używając gumowego młotka lub odpowiedniego aparatu do rozdrabniania (np. Homex).

Uwaga/ jeśli próby są homogenizowane przy użyciu miksera, ryzyko kontaminacji między próbami jest znaczne. Należy podjąć odpowiednie środki ostrożności, aby nie dopuścić do powstania aerozolu lub rozlania w czasie procesu ekstrakcji. Należy się upewnić, że do każdej próby używane są świeżo wysterylizowane ostrza i naczynia miksera. Jeśli ma być stosowany test PCR, unikać przeniesienia DNA na pojemniki lub aparaty do rozdrabniania. JeFśli ma być zastosowany test PCR, zleca się rozdrabnianie w torebkach i stosowanie jednorazowych probówek.

1.1.3. Zdekantować supernatant. Jeśli jest zbyt mętny, sklarować – albo przez odwirowanie przy niskiej liczbie obrotów (przy nie więcej niż 180 g przez 10 minut w temperaturze 4–10 °C) lub przez filtrację w próżni (40–100 µm), myjąc filtr dodatkowym (~10 ml) buforem do ekstrakcji.

1.1.4. Zagęścić frakcję bakterii przez odwirowanie przy 7 000 g przez 15 minut (lub 10 000 g przez 10 minut) w temperaturze 4–10 °C i odrzucić supernatant bez naruszania osadu

1.1.5. Zawiesić powtórnie osad w 1,5 ml buforu do zawieszania osadu (dodatek 4). Stosować 500 µl do badań na obecność R. solanacearum, 500 µl na obecność Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus i 500 µl do celów porównawczych. Dodać sterylną glicerynę aż do uzyskania ostatecznego stężenia 10–25 % (obj./obj.) i dodać do 500 µl zawiesiny porównawczej i do pozostałej zawiesiny testowej, zworteksować i przechowywać w temperaturze od –16 do –24 °C (tygodnie) lub od –68 do –86 °C (miesiące). W czasie wykonywania testu przechowywać zawiesiny testowe w temperaturze 4–10 °C.

Wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie nie jest wskazane.

Jeśli konieczny jest transport ekstraktu, zapewnić dostawę w przenośnej lodówce w ciągu 24 lub 48 godzin.

1.1.6. Jest niezwykle ważne, aby w celu uniknięcia kontaminacji wszystkie kontrole pozytywne R. solanacearum i próby badać osobno. Odnosi się to zarówno do szkiełek IF, jak i do wszystkich testów.

1.2. Badanie

Patrz: schemat blokowy i opis testów i protokołów zoptymalizowanych znajdujące się w odpowiednich dodatkach:

Posiew na podłoża selektywne (patrz: sekcja VI.A.4)

Test IF (patrz: sekcja VI.A.5)

Test PCR (patrz: sekcja VI.A.6)

Test FISH (patrz: sekcja VI.A.7)

Testy ELISA (patrz: sekcja VI.A.8)

Test biologiczny (patrz: sekcja VI.A.9)

2. Szczegółowe metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w próbach bezobjawowych roślin ziemniaka, pomidora lub innych roślin żywicielskich

2.1. Przygotowanie próby

Uwaga: Przy wykrywaniu utajonych populacji R. solanacearum zaleca się przebadanie prób złożonych. Procedurę tę można łatwo zastosować do prób złożonych o wielkości do 200 części łodygi. Przy wykonywaniu badań powinny się one opierać o statystycznie reprezentatywną próbę badanej populacji rośliny.

2.1.1. Pobrać fragmenty łodygi o wielkości 1–2 cm do zamkniętego sterylnego pojemnika zgodnie z poniższą procedurą próbobrania:

Sadzonki pomidora w szkółce: Przy pomocy czystego zdezynfekowanego noża pobrać 1 cm fragment u podstawy każdej łodygi, tuż nad glebą.

Rośliny pomidora hodowane na polu lub w szklarni: Przy pomocy czystego zdezynfekowanego noża pobrać najniższy pęd boczny z każdej rośliny, ucinając go tuż nad połączeniem z łodygą główną. Z każdego pędu bocznego odciąć najniższy 1 cm fragment.

Inni żywiciele: Przy pomocy czystego zdezynfekowanego noża lub sekatora pobrać 1 cm fragment u podstawy każdej łodygi, tuż nad glebą. W przypadku S. dulcamara lub innych roślin żywicielskich rosnących w wodzie, pobrać 1–2 cm fragmenty z łodygi znajdującej się pod wodą lub rozłogi z korzeniami wodnymi.

Podczas próbobrania w danym miejscu zaleca się przebadanie statystycznie reprezentatywnej próby składającej się z przynajmniej 10 roślin z miejsca próbobrania każdego potencjalnego żywiciela. Wykrycie patogenu będzie najbardziej wiarygodne późną wiosną, latem i jesienią, choć u wieloletnich Solanum dulcamara rosnących w ciekach wodnych porażenie naturalne można wykrywać przez cały rok. Znani żywiciele to samosiewy ziemniaka (groundkeeper), Solanum dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium i inni członkowie rodziny Solanaceae. Inni żywiciele to Pelargonium spp. oraz Portulaca oleracea. Niektóre gatunki chwastów europejskich, których korzenie lub ich rizosfera w pewnych szczególnych warunkach środowiskowych mogą potencjalnie stanowić rezerwuar populacji R. solanacearum biowar 2/rasa 3, to: Atriplex hastata, Bidens pilosa, Cerastium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus scleratus, Rorippa spp, Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Tussilago farfarra oraz Urtica dioica.

Uwaga: Na tym etapie można zastosować wizualne badanie na obecność wewnętrznych objawów (przebarwienie wiązek naczyniowych lub wyciek śluzu bakteryjnego). Odłożyć na bok wszystkie fragmenty łodygi wykazujące objawy i przebadać je oddzielnie (patrz: sekcja II).

2.1.2. Zdezynfekować fragmenty łodygi krótko przy pomocy 70 % alkoholu etylowego i natychmiast wytrzeć je do sucha przy pomocy bibuły. Po czym poddać fragmenty łodyg jednej z następujących procedur:

a) fragmenty pokryć dostateczną objętością (około 40 ml) buforu do ekstrakcji (dodatek 4) i mieszać na wytrząsarce obrotowej (50–100 obr./min) przez 4 godziny, utrzymując temperaturę poniżej 24 °C lub przez 16–24 godzin w lodówce; lub

b) rozpocząć procedurę bezzwłocznie, miażdżąc odcinki w mocnej torebce do maceracji (np. Stomacher lub Bioreba) z odpowiednią ilością buforu ekstrakcyjnego (dodatek 4), używając gumowego młotka lub odpowiedniego urządzenia do rozdrabniania (np. Homex). Jeśli nie jest to możliwe, przechowywać odcinki łodyg nie dłużej niż 72 godziny w lodówce lub nie dłużej niż 24 godziny w temperaturze pokojowej.

2.1.3. Zdekantować supernatant po ustaleniu się przez 15 minut.

2.1.4. Dalsze klaryfikowanie ekstraktu lub zagęszczanie frakcji bakteryjnej zwykle nie jest wymagane, ale można je osiągnąć przez filtrację i/lub odwirowanie, jak opisano w częściach III.1.1.3–1.1.5.

2.1.5. Podzielić czysty lub stężony ekstrakt z próby na dwie równe części. W czasie przeprowadzania testu jedną połowę trzymać w temperaturze 4–10 °C, a drugą połowę – z 10–25 % (obj./obj.) – sterylnego glicerolu przechowywać w temperaturze –16 do –24 °C (tygodnie) lub –68 do –86 °C (miesiące), jeśli wymagane są dalsze testy.

2.2. Badanie

Patrz: schemat blokowy i opis testów i protokołów zoptymalizowanych znajdujące się w odpowiednich dodatkach:

Posiew na podłoża selektywne (patrz: sekcja VI.A.4)

Test IF (patrz: sekcja VI.A.5)

Test PCR (patrz: sekcja VI.A.6)

Test FISH (patrz: sekcja VI.A.7)

Testy ELISA (patrz: sekcja VI.A.8)

Test biologiczny (patrz: sekcja VI.A.9)

SEKCJA IV

1. Schemat wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w wodzie

2. Metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w wodzie

Zasada

Zatwierdzony schemat wykrywania opisany w tej sekcji dotyczy wykrywania patogenu w próbach wód powierzchniowych i można go zastosować do badania prób ścieków z obróbki ziemniaków lub ścieków ciekłych. Ważne jest jednak, aby pamiętać, że oczekiwana czułość wykrywania zmienia się w zależności od substratu. Na czułość badania izolacji wpływ mają populacje konkurujących bakterii saprofitycznych, które są na ogół o wiele większe przy przetwarzaniu ziemniaków i w ściekach niż w wodzie powierzchniowej. Zakłada się, że poniższy schemat wykryje zaledwie 103 komórek na litr w wodzie powierzchniowej, natomiast czułość wykrywania przy przetwarzaniu ziemniaków lub w ściekach będzie prawdopodobnie znacznie niższa. Z tego powodu zaleca się badać ścieki po ich utylizacji (np. sedymentacji lub przefiltrowaniu), w czasie których to operacji zmniejszają się populacje saprofityczne. Ograniczenia czułości schematu badania powinno się wziąć pod uwagę przy ocenie wiarygodności wszelkich uzyskanych wyników negatywnych. Schemat ten był z powodzeniem stosowany w pracach badawczych dla ustalenia występowania lub braku patogenu w wodzie powierzchniowej, jednak należy pamiętać o jego ograniczeniach przy używaniu go do podobnych badań ścieków pochodzących z obróbki ziemniaków lub ścieków ciekłych.

2.1. Przygotowanie próby

Uwaga:

— Wykrycie R. solanacearum w wodzie powierzchniowej jest najbardziej pewne późną wiosną, latem i jesienią, gdy temperatura wody przekracza 15 °C.

— Wielokrotne próbobranie w różnych okresach w powyższym terminie w wyznaczonych punktach zwiększa prawdopodobieństwo wykrycia dzięki zmniejszeniu skutków zmian klimatycznych.

— Pod uwagę należy wziąć skutki ulewnych deszczów i lokalizację cieków wodnych dla uniknięcia skutków nadmiernego rozwodnienia, co może wpływać na zamaskowanie obecności patogenu.

— Próby wody należy pobrać w sąsiedztwie roślin żywicielskich, jeśli takie występują.

2.1.1. W wybranych punktach próbobrania pobrać próby wody, wypełniając nią jednorazowe sterylne probówki lub butelki na głębokości, o ile to możliwe, poniżej 30 cm i w promieniu 2 m od brzegu. W przypadku ścieków pochodzących z obróbki ziemniaków lub ścieków ciekłych, próby należy pobrać z punktu usuwania ścieków. Zaleca się stosowanie prób o wielkości do 500 ml na punkt próbobrania. Jeśli preferowane są próby mniejsze, zaleca się pobieranie prób przynajmniej 3 razy z każdego punktu próbobrania, z czego każda próba składa się z 2 podprób, każda o objętości minimum 30 ml. Przy intensywnych badaniach należy wybrać przynajmniej 3 punkty próbobrania na odcinku cieku wodnego o długości 3 km i zagwarantować, że zostaną pobrane próby również z dopływów.

2.1.2. Próby transportować w niskiej temperaturze (4–10 °C), bez dostępu światła i przebadać w ciągu 24 godzin.

2.1.3. W miarę potrzeby przy pomocy jednej z poniższych metod można zagęścić frakcję bakteryjną:

a) wirować 30–50 ml podpróby w 10 000 g przez 10 minut (lub 7 000 g przez 15 minut), najlepiej w temperaturze 4–10 °C, usunąć zawiesinę i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu do zawieszania osadu (dodatek 4);

b) przeprowadzić filtrację membranową (minimalny rozmiar porów 0,45 µm), po której przemyć filtr 5–10 ml buforu do zwieszania osadu i zebrać popłuczyny. Metoda ta ma zastosowanie do większych objętości wody zawierającej małą ilość saprofitów.

Zagęszczania nie poleca się zazwyczaj dla prób ścieków pochodzących z obróbki ziemniaków lub ścieków ciekłych, ponieważ zwiększona populacja konkurujących bakterii saprofitycznych hamuje wykrywanie Ralstonia solanacearum.

2.2. Badanie

Patrz: schemat blokowy i opis badań we właściwych protokołach.

SEKCJA V

1. Schemat wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w glebie

2. Metody wykrywania i identyfikacji R. solanacearum w glebie

Zasada

Zatwierdzony schemat wykrywania opisany w tej sekcji dotyczy wykrywania patogenu w próbach gleby, lecz można go również wykorzystać do badania prób stałego lub ciekłego odpadu z obróbki ziemniaka. Ważne jest jednak, aby pamiętać, że metody te nie są wystarczająco czułe do zagwarantowania wykrywania nisko i/lub nieregularnie rozproszonych populacji Ralstonia solanacearum, które mogą występować w naturalnie porażonych próbach tych substratów.

Przy ocenie wiarygodności wszelkich uzyskanych wyników negatywnych, jak również przy badaniu w celu określenia obecności lub nieobecności patogenu w glebie i odpadach powinno się wziąć pod uwagę ograniczenia czułości schematu badania. Najbardziej wiarygodnym badaniem obecności patogenu w glebie jest posadzenie żywiciela podatnego na chorobę i kontrolowanie go pod względem porażenia, lecz nawet przy tej metodzie niskie poziomy porażenia nie zostaną wykryte.

2.1. Przygotowanie próby

2.1.1. Próbobranie gleby z pola powinno być wykonane zgodnie ze standardowymi zasadami stosowanymi dla prób nicieniowych. Należy pobrać 0,5–1 kg ziemi dla każdej próby z 60 miejsc na każde 0,3 ha z głębokości 10–20 cm (lub w siatce 7 x 7 metrów). Jeśli istnieje podejrzenie występowania patogenu, należy zwiększyć liczbę punktów poboru do 120 na 0,3 ha. Przed badaniem próby trzymać w temperaturze 12–15 °C. Próby osadów z obróbki ziemniaków i ścieków należy sporządzić, pobierając łącznie 1 kg z punktów próbobrania, tak aby były reprezentatywne dla całkowitej wielkości badanego osadu. Przed badaniem dobrze wymieszać każdą próbę.

2.1.2. Podpróby 10–25 g ziemi lub osadu zawiesić w 60–150 ml buforu ekstrakcyjnego (dodatek 4) i wytrząsać na wstrząsarce obrotowej (250 obr./min) przez okres do 2 godzin. W razie potrzeby w rozdrobnieniu może pomóc dodanie 0,02 % sterylnego Tween-20 i 10–20 g sterylnego żwiru.

2.1.3. W czasie badania utrzymywać zawiesinę w temperaturze 4 °C.

2.2. Badanie

Patrz: schemat blokowy i opis badań we właściwych protokołach.

SEKCJA VI

ZOPTYMALIZOWANE PROTOKOŁY WYKRYWANIA I IDENTYFIKACJI R. SOLANACEARUM

A. TESTY DIAGNOSTYCZNE I WYKRYWANIE

1. Badanie na obecność wycieków z wiązek przewodzących łodygi

Obecność R. solanacearum w więdnących łodygach ziemniaka lub pomidora lub innych roślin żywicielskich można stwierdzić, wykonując poniższe proste badanie wstępne: uciąć łodygę tuż nad poziomem gleby. Umieścić odciętą powierzchnię łodygi w probówce napełnionej czystą wodą. Po kilku minutach można zaobserwować charakterystyczny samoczynny wypływ śluzu bakteryjnego z przeciętych wiązek przewodzących.

2. Badanie na obecność granulek poly-β-hydroksymaślanu

1. Przygotować rozmaz śluzu bakteryjnego z porażonej tkanki albo rozmaz z 48-godzinnej hodowli na pożywce YPGA lub SPA (dodatek 2) na szkiełku mikroskopowym.

2. Przygotować rozmazy kontroli pozytywnej ze szczepu biowar 2 R. solanacearum, oraz jeśli konieczne, przygotować rozmaz kontroli negatywnej PHB sp.

3. Pozostawić rozmazy do wyschnięcia i przesunąć dolną część szkiełka kilkakrotnie w płomieniu palnika, w celu utrwalenia rozmazu.

4. Preparat wybarwić błękitem nilu lub czernią sudanowa i obserwować pod mikroskopem zgodnie z poniższym opisem.

Badanie z błękitem Nilu:

a) Zanurzyć utrwalony rozmaz w 1 % wodnym roztworze błękitu nilu A i inkubować przez 10 minut w temperaturze 55 °C.

b) Zlać roztwór barwiący. Opłukać krótko pod kranem z bieżącą wodą. Usunąć nadmiar wody bibułą.

c) Zanurzyć rozmaz w 8 % wodnym roztworze kwasu octowego i inkubować przez 1 minutę w temperaturze otoczenia.

d) Opłukać krótko pod kranem z bieżącą wodą. Usunąć nadmiar wody bibułą.

e) Ponownie zwilżyć rozmaz kroplą wody i nałożyć szkiełko przykrywkowe.

f) Oglądać rozmaz pod mikroskopem epifluorescencyjnym w świetle 450 nm, pod warstwą oleju immersyjnego, przy powiększeniu 600–1 000 razy, używając do tego celu obiektywu olejowego lub wodnego.

g) Sprawdzić, czy pojawi się jasna, pomarańczowa fluorescencja granulek PHB. Sprawdzić także w świetle normalnym, czy wewnątrz komórek znajdują się granulki i czy morfologia komórek ma cechy typowe dla R. solanacearum.

Badanie z czernią sudanową:

a) Zanurzyć utrwalony rozmaz w 0,3 % roztworze czerni sudanowej B w 70 % alkoholu etylowym i inkubować przez 10 minut w temperaturze otoczenia.

b) Zlać roztwór barwiący i krótko płukać pod bieżącą wodą z kranu, usuwając nadmiar wody bibułą.

c) Zanurzyć szkiełka na chwilę w ksylenie i osuszyć na bibule. Uwaga: Ksylen jest substancją szkodliwą dla zdrowia, dlatego należy przedsięwziąć odpowiednie środki bezpieczeństwa i pracować w dygestorium.

d) Zanurzyć szkiełka w 0,5 % (w/v) wodnym roztworze safraniny i pozostawić na 10 sekund w temperaturze otoczenia. Uwaga: Safranina jest substancją szkodliwą dla zdrowia, dlatego należy przedsięwziąć odpowiednie środki bezpieczeństwa i pracować w dygestorium.

e) Wypłukać delikatnie wodą z kranu, osuszyć na bibule i nałożyć szkiełko przykrywkowe.

f) Oglądać wybarwiony rozmaz pod mikroskopem, stosując światło przechodzące, pod warstwą olejku immersyjnego, przy powiększeniu 1 000 razy z użyciem obiektywu olejowego.

g) Granulki PHB w komórkach R. solanacearum wybarwiają się na kolor czarno-niebieski, a ściany komórkowe na różowo.

3. Test aglutynacji serologicznej

Aglutynacja komórek R. solanacearum w śluzie bakteryjnym lub ekstrakcie z tkanek symptomatycznych jest najlepiej widoczna przy użyciu zatwierdzonych przeciwciał (patrz: dodatek 3) oznaczonych odpowiednio zabarwionymi markerami, takimi jak czerwone komórki Staphylococcus aureus lub zabarwione elementy lateksowe. Używając zestawu dostępnego w obrocie handlowym (patrz: dodatek 3), należy postępować zgodnie ze wskazówkami producenta. W przeciwnym razie należy wykonać następującą procedurę:

a) Wymieszać krople zawiesiny przeciwciał i śluzu bakteryjnego (ok. 5 µl każdej) na okienkach szkiełek z wieloma zagłębieniami.

b) Przygotować kontrolę pozytywną i negatywną przy użyciu zawiesin R. solanacearum biowar 2 i szczepu heterogenicznego.

c) Mieszając delikatnie przez 15 sekund, można zaobserwować aglutynację w próbach pozytywnych.

4. Izolacja selektywna

4.1. Izolacja na podłoże selektywne

Uwaga: Przed użyciem tej metody po raz pierwszy, należy wykonać wstępne badania mające zagwarantować odtwarzalność wykrywania rzędu 103 do 104 jednostek R. solanacearum tworzących kolonie na ml dodany do ekstraktu prób, które uprzednio zostały przetestowane jako negatywne.

Należy użyć właściwie zatwierdzonej pożywki selektywnej, takiej jak SMSA (zmodyfikowanej przez Elphinstone et al., 1996; patrz: dodatek 2).

Należy uważać, aby odróżnić R. solanacearum od innych bakterii będących w stanie rozwinąć kolonie na pożywce. Poza tym, kolonie R. solanacearum mogą wykazywać morfologię nietypową, jeśli płytki są przepełnione lub obecne są również bakterie antagonistyczne. Jeśli podejrzewa się występowanie skutków konkurencji lub antagonizmu, próby należy ponownie przebadać z użyciem innego testu.

Najwyższej czułości wykrywania przy użyciu tej metody można oczekiwać przy użyciu świeżo przygotowanych ekstraktów. Jednak metoda ta jest używana również w odniesieniu do ekstraktów przechowywanych w glicerynie w temperaturze –68 do –86 °C.

Jako kontrole pozytywne należy przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenia zawiesiny 106 cfu na ml wirulentnego szczepu biowar 2 R. solanacearum (np. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). Dla uniknięcia ewentualnej kontaminacji kontrole pozytywne należy przygotować w ścisłej separacji od badanych prób.

W przypadku każdej nowo przygotowanej partii pożywki selektywnej przed użyciem jej do przebadania rutynowych prób należy sprawdzić jej przydatność do wzrostu patogenu.

Kontrole pozytywne traktować w sposób identyczny, jak próbę(-y).

4.1.1. Zastosować odpowiednią technikę rozcieńczeń płytkowych w celu zapewnienia, że wszelkie saprofityczne populacje tworzące kolonie zostają rozcieńczone. Nanieść 50–100 µl na płytkę ekstraktu i każdego rozcieńczenia.

4.1.2. Inkubować płytki w temperaturze 28 °C. Oglądanie płytek rozpocząć po 48 godzinach, a potem kontynuować codziennie do 6 dni. Typowe kolonie R. solanacearum na pożywce SMSA są mlecznobiałe, płaskie, nieregularne oraz ciekłe, a po 3 dniach inkubacji ich środek staje się od różowego do krwistoczerwonego z wewnętrznymi smugami lub spiralami. (Patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Uwaga: Na tej pożywce tworzą się czasami nietypowe kolonie R. solanacearum. Mogą być małe, okrągłe, całkiem czerwone i nieciekłe lub tylko częściowo ciekłe i w związku z tym mogą występować problemy z odróżnieniem ich od bakterii saprofitycznych tworzących kolonie.

4.1.3. W celu uzyskania pojedynczych kolonii oczyścić kolonie wstępne przez pasażowanie lub metodą rozcieńczeń płytkowych R. solanacearum na pożywce odżywczej (patrz: dodatek 2).

4.1.4. W celu krótkotrwałego przechowywania trzymać kultury w sterylnej wodzie (pH 6–8, bez chloru) w temperaturze pokojowej w ciemności lub w celu długotrwałego przechowywania w odpowiedniej pożywce krioochronnej lub w temperaturze –68 do –86 °C lub w postaci liofilizowanej.

4.1.5. Zidentyfikować czyste kultury (patrz: sekcja VI.B.) i wykonać test patogeniczności (patrz: sekcja VI. C).

Interpretacja wyników posiewu na podłoże selektywne

Wynik posiewu na podłoże selektywne jest negatywny w przypadku, gdy po 6 dniach nie obserwuje się żadnych kolonii bakteryjnych, albo jeżeli nie odnaleziono żadnych kolonii o morfologii charakterystycznej dla R. solanacearum, pod warunkiem że nie podejrzewa się inhibicji kolonii wskutek konkurencji lub antagonizmu przez inne bakterie i że na płytkach z kontrolą pozytywną potwierdzono obecność kolonii charakterystycznych dla R. solanacearum.

Wynik posiewu na podłoże selektywne jest pozytywny, jeżeli wyizolowano kolonie o morfologii charakterystycznej dla R. solanacearum.

4.2. Procedura wzbogacenia

Należy użyć zatwierdzonej pożywki wzbogacającej, takiej jak zmodyfikowana pożywka Wilbrink (patrz: dodatek 2).

Procedurę tę można wykorzystywać do selektywnego zwiększania populacji R. solanacearum w ekstraktach i zwiększenia czułości wykrywania. Procedura ta również skutecznie rozcieńcza inhibitory reakcji PCR (1:100). Należy jednak pamiętać, że wzbogacenie R. solanacearum może się nie udać wskutek konkurencji lub antagonizmu ze strony organizmów saprofitycznych, które często są równocześnie wzbogacane. Z tego powodu izolacja R. solanacearum ze wzbogaconych kultur pożywki może okazać się trudna. Poza tym, jako że można zwiększyć populację serologicznie zbliżonych saprofitów, zaleca się stosowanie konkretnych przeciwciał monoklinalnych raczej niż przeciwciał poliklonalnych, gdy stosowany ma być test ELISA.

4.2.1. Przy wzbogacaniu do testu PCR przenieść 100 µl ekstraktu do 10 ml pożywki wzbogaconej (dodatek 2) uprzednio umieszczonej w zlewkach lub kolbach pozbawionych DNA. Przy wzbogacaniu do testu ELISA można użyć większych proporcji ekstraktu do pożywki (np. 100 µl w 1,0 ml pożywki wzbogaconej).

4.2.2. Inkubować przez 72 godziny w temperaturze od 27 do 30 °C w hodowli wstrząsanej lub statycznej, a przykrywka powinna luźno przylegać do probówki, tak by umożliwić dostęp do powietrza.

4.2.3. Dobrze wymieszać przed użyciem w teście ELISA lub teście PCR.

4.2.4. Ze wzbogaconą pożywką postępować w taki sam sposób, jak z próbą w powyższych testach.

Uwaga: Jeśli przewiduje się zahamowanie procesu wzbogacenia R. solanacearum z powodu wysokich populacji niektórych konkurujących bakterii saprofitycznych, lepsze wyniki może dać wzbogacenie ekstraktów przed odwirowaniem lub innymi sposobami zagęszczania patogenu.

5. Test IF

Zasada

Stosowanie testu IF jako głównego testu przesiewowego jest zalecane z uwagi na wykazaną zdolność osiągania wymaganych progów wykrywalności.

Kiedy test IF jest stosowany jako główny test przesiewowy, a wynik IF jest dodatni, konieczne jest zastosowanie izolacji, testu PCR lub FISH jako drugiego testu przesiewowego. Kiedy test IF jest stosowany jako drugi test przesiewowy, a odczyt IF jest dodatni, do zakończenia analizy wymagane jest przeprowadzanie dalszych testów, zgodnie ze schematem blokowym.

Uwaga: Należy używać zatwierdzonego źródła przeciwciał przeciw r. solanacearum (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Zaleca się, aby dla każdej nowej partii przeciwciał określać miano. Miano jest określane jako największe rozcieńczenie, przy którym zachodzi optymalna reakcja w czasie testowania zawiesiny od 105do 106 komórek na ml homologicznego szczepu R. solanacearum i przy użyciu odpowiedniego koniugatu izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC), zgodnie z zaleceniami producenta. Stężone przeciwciała poliklonalne powinny mieć miano IF przynajmniej 1:2 000. W czasie przeprowadzania testu przeciwciała powinny być stosowane przy stężeniu roboczym (WD) bliskim lub równym mianu.

Test powinien być przeprowadzany na świeżo przygotowanych ekstraktach z prób. Jeśli to konieczne, może być z powodzeniem przeprowadzany na ekstraktach przechowywanych w temperaturze od –68 do –86 °C w glicerolu. Glicerol może być usunięty z próby przez dodanie 1 ml buforu do zawieszania osadu (dodatek 4), powtórne odwirowanie przez 15 minut przy 7 000 g i powtórne zawieszenie w równej objętości buforu do zawieszania osadu. Często nie jest to konieczne, zwłaszcza jeśli preparaty z prób były utrwalane na szkiełkach przy pomocy opalania.

Przygotować oddzielne szkiełka kontroli pozytywnej szczepu homologicznego lub innego szczepu odniesienia R. solanacearum zawieszonego w ekstrakcie z ziemniaka, jak szczegółowo opisano w dodatku 3B, oraz ewentualnie w buforze.

W miarę możliwości na to samo szkiełko należy nanieść jako podobną kontrolę naturalnie zainfekowane tkanki (zachowane w formie liofilizowanej lub zamrożone w temperaturze od –16 do –24 °C).

Jako kontrolę negatywną na R. solanacearum stosować ekstrakty prób, które wcześniej dały w teście wynik ujemny.

Standaryzowane pozytywne i negatywne materiały kontrolne do wykorzystania w teście są wymienione w dodatku 3.

Używać wielopunktowych szkiełek mikroskopowych, najlepiej z 10 okienkami, o średnicy co najmniej 6 mm.

Kontrole pozytywne traktować w sposób identyczny, jak próbę(-y).

5.1. Przygotować szkiełka do badań, stosując jedną z poniższych procedur:

i) dla prób zawierających stosunkowo niewiele skrobi: Odmierzyć pipetą standardową objętość (15 l odpowiada 6 mm średnicy okienka – dla większych okienek odmierzyć odpowiednio większą objętość) w rozcieńczeniu 1/100 zawieszonego osadu ziemniaka na pierwsze okienko. Następnie odmierzyć pipetą podobną objętość nierozcieńczonego osadu (1/1) na pozostałe okienka w szeregu. Drugi szereg można wykorzystać do powtórzenia badania lub można go przeznaczyć do analizy drugiej próby, patrz: rysunek 1;

ii) dla innych osadów: Przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenia (1/10, 1/100) zawieszonego osadu w buforze do zawieszania osadu. Odmierzyć standardową objętość (15 l odpowiada 6 mm średnicy okienka – dla większych okienek odmierzyć proporcjonalnie większą objętość) zawiesiny na szereg okienek. Drugi szereg można wykorzystać do powtórzenia badania lub można go przeznaczyć do analizy drugiej próby, patrz: rysunek 2.

5.2. Wysuszyć krople w temperaturze otoczenia lub ogrzewając je w temperaturze od 40 do 45 °C. Utrwalić komórki bakteryjne na szkiełku przez ogrzanie (15 minut w temp. 60 °C), albo umieszczenie w płomieniu, lub też za pomocą 95 % alkoholu etylowego zgodnie ze szczegółowymi instrukcjami dostawcy przeciwciał.

W miarę potrzeby utrwalone szkiełka można przechowywać zamrożone w suchym pojemniku przez jak najkrótszy okres (maksymalnie przez 3 miesiące) przed dalszym badaniem.

5.3. Procedura IF

i) Przygotować szkiełka tak jak opisano w ust. 5.1 ppkt i): Przygotować zestaw dwukrotnych rozcieńczeń. Pierwsze okienko powinno mieć 1/2 miana (T/2), pozostałe 1/4 miana (T/4), 1/2 miana (T/2), miano (T) i dwukrotność miana (2T).

ii) Przygotować szkiełka do badania, jak opisano w ust. 5.1 ppkt ii): Przygotować rozcieńczenie robocze (WD) przeciwciał w buforze IF. Rozcieńczenie robocze ma wpływ na specyficzność.

Rysunek 1 Przygotowanie szkiełka roboczego według 5.1 i) i 5.3 i)

Rozcieńczenia próby ponownie zawieszonego osadu w buforze 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1  Rozcieńczenie ponownie zawieszonego osadu (T = miano) T/2 T/4 T/2 T 2T  Dwukrotne rozcieńczenia surowicy/przeciwciała Próba 1 1 2 3 4 5 Powtórzenie próby 1 lub próba 2 6 7 8 9 10





Rysunek 2 Przygotowanie szkiełka roboczego według ust. 5.1 ppkt ii) i 5.3 ppkt ii)

Rozcieńczenie robocze surowicy/przeciwciała 1/1 1/10 1/100 puste puste  Dziesięciokrotne rozcieńczenia ponownie zawieszonego osadu Próba 1 1 2 3 4 5 Powtórzenie próby 1 lub próba 2 6 7 8 9 10

5.3.1. Ułożyć szkiełka na wilgotnej bibule. Pokryć całkowicie każde okienko rozcieńczonymi przeciwciałami. Objętość nakładanej surowicy musi być równa objętości nakładanego ekstraktu.

W przypadku braku szczegółowych instrukcji od dostawcy przeciwciał należy zastosować następującą procedurę:

5.3.2. Inkubować szkiełka na wilgotnym papierze pod przykryciem przez 30 minut w temperaturze otoczenia (18–25 °C).

5.3.3. Strząsnąć krople surowicy ze szkiełek i przepłukać szkiełka starannie buforem IF. Zanurzyć je na 5 minut w buforze IF – Tween (dodatek 4), a następnie w buforze IF. Unikać powstawania aerozoli i przenoszenia kropelek, co mogłoby doprowadzić do kontaminacji miedzy próbami. Ostrożnie usunąć nadmiar wilgoci przez delikatne osuszanie bibułą.

5.3.4. Ułożyć szkiełka na wilgotnym papierze. Pokryć okienka do badań oraz okienko FTIC rozcieńczonym koniugatem FTIC, stosowanym do oznaczania miana. Objętość koniugatu nałożonego na okienka musi być identyczna z objętością zastosowanych przeciwciał.

5.3.5. Inkubować szkiełka na wilgotnym papierze pod przykryciem przez 30 minut w temperaturze otoczenia (18–25 °C).

5.3.6. Strząsnąć krople surowicy ze szkiełek. Obmyć i przepłukać tak jak poprzednio (5.3.3).

Ostrożnie usunąć nadmiar wilgoci.

5.3.7. Na każde okienko nanieść po 5–10 l 0,1 M buforu fosforanowego-glicerynowego (dodatek 4) albo podobną ilością dostępnego w obrocie utrwalacza i przykryć je szkiełkiem nakrywkowym.

5.4. Odczytywanie testu IF

5.4.1. Sprawdzić szkiełka pod mikroskopem epifluorescencyjnym z filtrem właściwym dla wzbudzenia FITC, pod olejkiem imersyjnym lub wodą, przy powiększeniu 500–1 000 razy. Okienka przeglądać wzdłuż dwóch średnic pod kątem prostym oraz dookoła obwodu. Sprawdzić przynajmniej 40 pól mikroskopowych w okienkach niezawierających komórek lub zawierających ich małą ilość.

Sprawdzić najpierw okienko z kontrolą pozytywną. Komórki muszą fluoryzować jasno i być zupełnie wybarwione przy określonym mianie przeciwciał lub rozcieńczeniu roboczym. Badanie IF (sekcja VI.A.5) należy powtórzyć, jeżeli wybarwienie nie jest właściwe.

5.4.2. Poszukiwać w okienkach szkiełek testowych jaskrawo fluoryzujących komórek, o charakterystycznej dla R. solanacearum morfologii (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intensywność fluorescencji musi być równoważna intensywności wykazywanej przez pozytywny szczep kontrolny przy tym samym rozcieńczeniu surowicy. Komórki niecałkowicie wybarwione lub komórki o słabej fluorescencji należy odrzucić.

W przypadku podejrzenia kontaminacji badanie należy powtórzyć. Tak może być w przypadku gdy wszystkie szkiełka w partii wykazują komórki pozytywne z powodu kontaminacji buforu lub jeśli komórki pozytywne zostają odnalezione (poza okienkami szkiełek) na powierzchni szkiełka.

5.4.3. Ze specyficznością testu immunofluorescencyjnego wiąże się nieodłącznie kilka problemów. W osadzie z części przystolonowych bulw ziemniaka i odcinka łodygi prawdopodobne jest występowanie w tle populacji fluoryzujących komórek o nietypowej morfologii oraz bakterii saprofitycznych o wielkości i morfologii podobnej do R. solanacearum i dających reakcje krzyżowe.

5.4.4. Uwzględniać wyłącznie fluoryzujące komórki o typowych wymiarach i morfologii przy mianie lub rozcieńczeniu roboczym, takim jak w 5.3.

5.4.5. Interpretacja wyników testu IF:

i) Jeżeli stwierdzono obecność fluoryzujących komórek o charakterystycznej morfologii, trzeba oszacować średnią liczbę typowych komórek w polu widzenia mikroskopu oraz obliczyć liczbę komórek typowych przypadająca na ml ponownie zawieszonego osadu (dodatek 5). Wynik IF jest dodatni dla prób z przynajmniej 5 x 103 komórek na ml zawieszonego osadu. Próba uznawana jest za potencjalnie porażoną i wymagane są dalsze testy.

ii) Odczyt IF jest negatywny dla prób o liczbie komórek mniejszej niż 5 x 103 na ml zawieszonego osadu, a próba uznawana jest za negatywną. Kolejne testy nie są wymagane.

6. Test PCR

Zasada

Przy wykorzystaniu testu PCR jako podstawowego badania przesiewowego i uzyskaniu w nim pozytywnego wyniku jako drugie badanie przesiewowe należy wykonać izolację lub test IF. Gdy test PCR jest stosowany jako drugie badanie przesiewowe, a odczyt jest pozytywny, dla zakończenia diagnozy wymagane jest dalsze badanie zgodne ze schematem blokowym.

Pełne wykorzystanie tej metody jako głównego badania przesiewowego zaleca się tylko wtedy, jeśli posiada się specjalistyczną, fachową wiedzę na ten temat.

Uwaga: Wstępne badanie przy użyciu tej metody powinno pozwolić na uzyskanie odtwarzalnego wykrywania rzędu od 103 do 104 komórek R. solanacearum przypadających na ml dodanych do ekstraktów prób, które w poprzednim badaniu wypadły negatywnie. Dla uzyskania maksymalnych poziomów czułości i specyficzności we wszystkich laboratoriach wymagane może być przeprowadzenie eksperymentów optymalizujących.

Należy używać zatwierdzonych odczynników PCR i protokołów (patrz: dodatek 6). Zaleca się wybór metody z kontrolą wewnętrzną.

Należy zastosować odpowiednie środki bezpieczeństwa w celu uniknięcia kontaminacji próbki docelowym DNA. Test PCR powinni wykonywać doświadczeni technicy w wyspecjalizowanych laboratoriach biologii molekularnej, tak aby zminimalizować możliwość kontaminacji docelowym DNA.

Kontrola negatywna (dla ekstrakcji DNA i procedur PCR) powinna być zawsze wykonywana jako ostatnia próba w procedurze tak, aby jasno stwierdzić, czy pojawiło się jakiekolwiek przeniesienie DNA.

W badaniu PCR należy zawrzeć następujące kontrolę negatywne:

— ekstrakt próby, który poprzednio został uznany za negatywny dla R. solanacearum,

— próby kontrolne buforu używanego do ekstrakcji bakterii i DNA z próby,

— mieszaninę do reakcji PCR.

Należy zawrzeć następujące kontrole pozytywne::

— zawiesiny osadu, do którego dodano R. solanacearum (przygotowanie patrz: dodatek 3 B),

— zawiesinę 106 komórek przypadających na ml wirulentnego izolatu R. solanacearum zawieszonego w wodzie (np. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; patrz: dodatek 3 B),

— w miarę możliwości korzystać również z ekstraktów DNA z kontroli pozytywnych DNA otrzymanych z testu PCR.

Dla uniknięcia potencjalnej kontaminacji, kontrole pozytywne przygotować w miejscu oddzielonym od prób, które mają być badane.

Ekstrakty stanowiące próby powinny być w jak największym stopniu pozbawione ziemi. W pewnych warunkach radzi się więc, aby ekstrakty przygotować z mytych ziemniaków, jeśli mają zostać zastosowane protokoły PCR.

Standaryzowane pozytywne i negatywne materiały kontrolne do wykorzystania w teście są wymienione w dodatku 3.

6.1. Metody oczyszczania DNA

Użyć opisanych powyżej kontroli pozytywnych i negatywnych (patrz: dodatek 3).

Kontrole pozytywne traktować w sposób identyczny, jak próbę(-y).

Dostępnych jest wiele metod oczyszczania docelowego DNA, ze złożonych substratów próby, które usuwają inhibitory PCR i inne reakcje enzymatyczne i koncentrują docelowe DNA w ekstrakcie próby. Metoda przedstawiona poniżej została zoptymalizowana do użytku z zatwierdzoną metodą PCR przedstawioną w dodatku 6.

a) Metoda zgodnie z Pastrik (2000)

1. Odmierzyć pipetą 220 µl buforu do lizy (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) do 1,5 ml probówki Eppendorfa.

2. Dodać 100 µl ekstraktu i umieścić w jednostce grzewczej lub łaźni wodnej w temp. 95 °C na 10 min.

3. Trzymać probówkę w lodzie przez 5 min.

4. Dodać 80 µl roztworu lizozymowego (50 mg lizozymu przypadających na ml w 10 mM Tris-HCl, pH 8,0) i inkubować w temp. 37 °C przez 30 min.

5. Dodać 220 µl roztworu Easy DNA® A (Invitrogen), dobrze wymieszać przez worteksowanie i inkubować w temp. 65 °C przez 30 min.

6. Dodać 100 µl roztworu Easy DNA® B (Invitrogen), energicznie wymieszać przez worteksowanie, aż w probówce uwolni się osad i próbka będzie równomiernie lepka.

7. Dodać 500 µl chloroformu i wymieszać przez worteksowanie, aż lepkość spadnie i mieszanina będzie jednorodna.

8. Odwirować przy 15 000 g przez 20 min w temp. 4 °C, aby wytrącić fazy i utworzyć międzyfazę.

9. Przenieść górną fazę do świeżej probówki typu Eppendorf.

10. Dodać 1 ml 100 % alkoholu etylowego (–20 °C), krótko wymieszać przez worteksowanie i inkubować na lodzie przez 10 min.

11. Wirować przy 15 000 g przez 20 min w temp. 4 °C i usunąć alkohol etylowy z osadu.

12. Dodać 500 µl 80 % alkoholu etylowego (–20 °C) i wymieszać przez odwracanie probówki.

13. Wirować przy 15 000 g przez 10 min w temp. 4 °C, zostawić osad i usunąć etanol.

14. Zostawić osad do wysuszenia powietrzem lub w wirówce do suszenia DNA.

15. Zawiesić ponownie osad w 100 µl sterylnej UPW i zostawić w temperaturze pokojowej przez przynajmniej 20 minut.

16. Przechowywać w temp. –20 °C, aż będzie potrzebny do badania PCR.

17. Oddzielić wszelki biały osad, wirując i użyć 5 µl zawiesiny zawierającej DNA do testu PCR.

b) Inne metody

Można zastosować inne metody ekstrakcji DNA, np. Qiagen DNeasy Plant Kit, pod warunkiem że dowiedzione zostało, że są równie skuteczne w oczyszczaniu DNA pochodzącego z prób kontrolnych zawierających od 103 do 104 komórek patogenu przypadających na ml.

6.2. PCR

6.2.1. Przygotować matryce testowe i kontrolne dla PCR według zatwierdzonych protokołów (sekcja VI.A.6). Przygotować jedno dziesięciokrotne rozcieńczenie DNA z ekstraktu próby (1:10 w UPW).

6.2.2. Przygotować odpowiednią mieszaninę reakcyjną PCR i wymieszać w nieskażonym środowisku zgodnie z opublikowanymi protokołami (dodatek 6). W miarę możliwości radzi się użyć multipleksowego protokołu PCR zawierającego również wewnętrzną kontrolę PCR.

6.2.3. Dodać 2–5 µl ekstraktu DNA przypadającego na 25 µl objętości reakcji PCR w sterylnych probówkach do PCR według protokołów PCR (patrz: dodatek 6).

6.2.4. Dodać negatywną kontrolę zawierającą tylko mieszaninę reakcyjną PCR. Wymieszać i w miejsce próby dodać to samo źródło UPW, które było używane w mieszaninie PCR.

6.2.5. Umieścić probówki w tym samym termocyklerze, który używany był do badań wstępnych i uruchomić właściwie zoptymalizowany program PCR (dodatek 6).

6.3. Analiza produktu PCR

6.3.1. Rozdzielić produkty PCR metodą elektroforezy na żelu agarozowym. Użyć przynajmniej 12 µl zwielokrotnionej mieszaniny reakcyjnej DNA z każdej próby zmieszanej z 3 µl buforu obciążającego (dodatek 6) w 2,0 % (w/v) żelu agarozowym w buforze trisacetate-EDTA (TAE) (dodatek 6) przy 5–8 V przypadających na cm. Użyć odpowiedniego markera DNA, np. 100 bp ladder.

6.3.2. Uwidocznić paski DNA odbarwiając żel w bromku etydyny (0,5 mg/l) przez 30–60 min, stosując właściwe środki ostrożności przy obchodzeniu się z tym mutagenem.

6.3.3. Oglądać wybarwiony żel w transiluminatorze UV (λ = 302 nm), szukając zamplifikowanych produktów PCR o oczekiwanym rozmiarze (dodatek 6) i udokumentować wyniki.

6.3.4. Dla wszystkich nowych wyników/przypadków weryfikować autentyczność amplikonu PCR, przeprowadzając analizę z użyciem enzymów restrykcyjnych na próbce pozostałego zamplifikowanego DNA przez inkubację w optymalnej temperaturze i przez odpowiedni czas z właściwym enzymem i buforem (patrz: dodatek 6). Rozdzielić strawione fragmenty za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym jak wcześniej i oglądać charakterystyczny układ fragmentów strawionych przez enzymy restrykcyjne w transiluminatorze UV po uprzednim barwieniu bromkiem etydyny. Porównać z niestrawioną i strawioną kontrolą pozytywną

Interpretacja wyników testu PCR:

Wynik testu PCR jest negatywny, jeśli nie wykryto specyficznego dla R. solanacearum fragmentu amplikonu PCR o oczekiwanym rozmiarze w danej próbie, a taki fragment znaleziono we wszystkich kontrolach pozytywnych (w przypadku multipleksowego PCR ze specyficznymi dla rośliny starterami kontroli wewnętrznej: drugi produkt PCR o oczekiwanym rozmiarze musi zostać zamplifikowany w danej próbie).

Wynik testu PCR jest pozytywny, jeżeli wykryto specyficzny amplikon dla R. solanacearum o oczekiwanym rozmiarze i wzorze restrykcyjnym (jeśli taki jest wymagany), pod warunkiem, że nie jest on namnożony z jakiejkolwiek negatywnej próby kontrolnej. Wiarygodne potwierdzenie pozytywnego wyniku można również uzyskać, powtarzając badanie przy pomocy drugiego zestawu primerów PCR (dodatek 6).

Uwaga: Może istnieć podejrzenie inhibicji PCR, jeśli oczekiwany amplikon zostanie uzyskany z kontroli pozytywnej zawierającej R. solanacearum w wodzie, lecz z pozytywnych prób kontrolnych z R. solanacearum w ekstrakcie z ziemniaka uzyskano wyniki negatywne. W multipleksowych protokołach PCR z wewnętrznymi kontrolami PCR, na inhibicję reakcji wskazuje fakt, że nie został uzyskany żaden z dwóch amplikonów.

Jeśli z jednej lub większej ilości kontroli negatywnych uzyskano oczekiwany amplikon, wówczas można podejrzewać kontaminację.

7. Test FISH

Zasada

Jeżeli test FISH używany jest jako pierwsze badanie przesiewowe, a wynik jego jest pozytywny, należy wykonać izolację lub badanie IF jako drugie, obowiązkowe badanie przesiewowe. Gdy test FISH jest stosowany jako drugie badanie przesiewowe, a odczyt jest pozytywny, dla zakończenia diagnozy wymagane jest dalsze badanie zgodne ze schematem blokowym.

Uwaga: Użyć zatwierdzonych, specyficznych dla R. solanacearum sond oligonukleotydowych (patrz: dodatek 7). Badanie wstępne przy użyciu tej metody powinno pozwolić na odtwarzalne wykrywanie przynajmniej 103–104 komórek R. solanacearum przypadających na ml dodanych do ekstraktów prób, w stosunku do których uprzednio uzyskano wynik negatywny.

Następującą procedurę najlepiej jest stosować w przypadku świeżo przygotowanego ekstraktu z próby, lecz można ją stosować również w odniesieniu do ekstraktu przechowywanego w glicerynie w temperaturze od –16 do –24 °C lub od –68 do –86 °C.

Jako kontroli negatywnej użyć ekstraktu próby, w stosunku do której uprzednio uzyskano wynik negatywny dla R. solanacearum.

Jako kontrole pozytywne przygotować zawiesiny zawierające 105 do 106 komórek przypadających na ml R. solanacearum biowar 2 (np. szczep NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, patrz: dodatek 3) w buforze fosforanowym 0,01M (PB) z 3–5-dniowej hodowli). Przygotować oddzielne szkiełka kontroli pozytywnej z homogenicznego szczepu lub innego szczepu referencyjnego R. solanacearum, zawieszonego w ekstrakcie z ziemniaka, zgodnie z opisem w dodatku 3 B.

Stosowanie znakowanej FITC eubakteryjnej sondy oligonukleotydowej daje możliwość kontrolowania procesu hybrydyzacji, ponieważ barwione będą wszystkie eubakterie obecne w próbie.

Znormalizowane pozytywne i negatywne materiały kontrolne dostępne do użycia przy tym badaniu wymieniono w dodatku 3 A).

Kontrole pozytywne traktować w sposób identyczny, jak próbę(-y).

7.1. Utrwalanie ekstraktu z ziemniaka

Poniższa procedura oparta jest na pracy Wullings et al., (1998):

7.1.1. Przygotować roztwór utrwalający (patrz: dodatek 7).

7.1.2. Odmierzyć pipetą 100 µl ekstraktu z każdej próby do probówki Eppendorfa i odwirować przez 7 min przy 7 000 g.

7.1.3. Usunąć supernatant i rozpuścić osad w 200 µl utrwalacza przygotowanego < 24 godzin wcześniej. Odwirować i inkubować przez 1 godzinę w lodówce.

7.1.4. Odwirować przez 7 min przy 7 000 g, usunąć supernatant i zawiesić ponownie osad w 75 µl 0,01M PB (patrz: dodatek 7).

7.1.5. Nanieść po 16 µl utrwalonych zawiesin na czyste szkiełko wielopunktowe tak, jak pokazano na rys. 7.1. Na szkiełko nakładać dwie różne próby, nierozcieńczone i w rozcieńczeniu 1:100, używając 10 µl ekstraktu, aby uzyskać rozcieńczenie 1:100 (w 0,01M PB). Pozostały roztwór próby (49 µl) może być przechowywany w –20 °C po dodaniu 1 objętości 96 % etanolu. W przypadku jeśli test FISH wymaga powtórzenia, usunąć etanol przez wirowanie i dodać tę samą ilość 0,01M PB (zworteksować).

Rysunek 7.1. Rozkład na szkiełku FISH

Próba 1 Puste Puste Puste Próba 2 okienko 1 okienko 2 okienko 3 okienko 4 okienko 5 Próba 1 Puste Puste Puste Próba 2 okienko 6 okienko 7 okienko 8 okienko 9 okienko 10 Szkiełko nakrywkowe 1 Szkiełko nakrywkowe 2

7.1.6. Wysuszyć szkiełka na powietrzu (lub na płycie do suszenia szkiełek w temperaturze 37 °C) i utrwalić w płomieniu.

W tym momencie procedurę można przerwać i kontynuować hybrydyzację w dniu następnym. Szkiełka powinny być przechowywane w suchym miejscu pozbawionym kurzu. w temperaturze pokojowej.

7.2. Hybrydyzacja

7.2.1. Odwodnić komórki w serii rozcieńczeń alkoholu etylowego o stężeniach 50 %, 80 % i 96 % przez 1 minutę w każdym. Wysuszyć szkiełka na powietrzu w statywie na szkiełka.

7.2.2. Przygotować wilgotną komorę do inkubacji wykładając dno hermetycznego pojemnika bibułą lub papierem filtracyjnym nasączonym w 1x mieszaninie hybrydyzacyjnej (hybmix) (dodatek 7). Wstępnie inkubować pojemnik w cieplarce do hybrydyzacji w temperaturze 45 °C przez przynajmniej 10 minut.

7.2.3. Nanieść po 10 μl roztworu do hybrydyzacji (dodatek 7) na 8 okienek (okienka 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 oraz 10; patrz: rys. 7.1) z każdego szkiełka, pozostawiając dwa okienka środkowe (3 i 8) puste.

7.2.4. Przykryć szkiełkami nakrywkowymi (24 x 24 mm) pierwsze i ostatnie 4 okienka, tak aby nie uwięzić przy tym powietrza. Umieścić szkiełka we wstępnie ogrzanej wilgotnej komorze i hybrydyzować przez 5 godzin w cieplarce w 45 °C w ciemności.

7.2.5. Przygotować 3 zlewki zawierające 1 l Milli Q (stopień molekularny) wody, 1 l 1x mieszaniny hybrydyzacyjnej (334 ml 3x hybmix i 666 ml Milli Q wody) oraz 1 l 1/8x hybmix (42 ml 3x hybmix oraz 958 ml Milli Q wody). Inkubować wstępnie każdą z nich w łaźni wodnej w 45 °C.

7.2.6. Usunąć szkiełka nakrywkowe ze szkiełek i umieścić szkiełka w statywie.

7.2.7. Usunąć nadmiar sondy, inkubując przez 15 min w zlewce z 1x mieszaniny hybrydyzacyjnej w temperaturze 45 °C.

7.2.8. Przenieść statyw do szkiełek do 1/8 hybmix roztworu wymywającego i inkubować przez następne 15 min.

7.2.9. Zanurzyć szkiełka na krótko w Milli Q wodzie i umieścić na bibule filtracyjnej. Usunąć nadmiar wilgoci pokrywając powierzchnie delikatnie bibułą filtracyjną. Odmierzyć pipetą 5–10 μl roztworu utrwalającego zapobiegającego odbarwieniu (np. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA lub równoważny) na każde okienko i nałożyć duże szkiełko nakrywkowe (24 x 60 mm) na powierzchnię całego szkiełka.

7.3. Odczyt testu FISH

7.3.1. Oglądać szkiełka natychmiast, używając mikroskopu dostosowanego do mikroskopii epifluoroscencyjnej pod powiększeniem 630 lub 1 000 x, pod olejkiem imersyjnym. Przy filtrze odpowiednim dla izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC), komórki eubakteryjne (w tym większość komórek Gram ujemnych) są zabarwione na kolor fluorescencyjno zielony. Przy stosowaniu filtra do 5-izotiocyjanianu tetrametylorodaminy barwione komórki Cy3 R. solanacearum są fluoryzująco czerwone. Porównać morfologię komórek z tą w kontroli pozytywnej. W przypadku niewłaściwego zabarwienia test FISH (sekcja VI.A.7) należy powtórzyć. Okienka przeglądać wzdłuż dwóch średnic pod kątem prostym oraz dookoła obwodu. Sprawdzić przynajmniej 40 pól mikroskopowych w okienkach niezawierających komórek lub zawierających ich małą ilość.

7.3.2. Poszukiwać w okienkach szkiełek testowych jaskrawo fluoryzujących komórek, o charakterystycznej dla R. solanacearum morfologii (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intensywność fluorescencji musi być taka sama lub większa niż szczepu użytego jako kontrola pozytywna. Komórki niecałkowicie wybarwione lub komórki o słabej fluorescencji należy odrzucić.

7.3.3. W przypadku podejrzenia kontaminacji badanie należy powtórzyć. Tak może być w przypadku gdy wszystkie szkiełka w partii pokazują komórki pozytywne z powodu kontaminacji buforu lub jeśli odnalezione zostaną komórki pozytywne (poza okienkami szkiełek) na powierzchni szkiełka.

7.3.4. Ze specyficznością testu FISH wiąże się nieodłącznie kilka problemów. W osadzie z części przystolonowych bulw ziemniaka i fragmentów łodygi prawdopodobne jest występowanie w tle populacji fluoryzujących komórek o nietypowej morfologii oraz dających reakcje krzyżowe bakterii saprofitycznych o wielkości i budowie podobnej do R. solanacearum choć znacznie rzadziej niż w przypadku testu IF.

7.3.5. Pod uwagę brać należy jedynie fluoryzujące komórki o typowym rozmiarze i morfologii.

7.3.6. Interpretacja wyników testu FISH:

i) Prawidłowe wyniki testu FISH uzyskuje się, jeśli przy użyciu filtra FITC zaobserwuje się jasne zielone komórki fluorescencyjne o rozmiarze i morfologii typowej dla R. solanacearum i jeśli zaobserwuje się jasne fluorescencyjne czerwone komórki przy użyciu filtra rodaminowego we wszystkich kontrolach pozytywnych, a nie zaobserwuje się ich w żadnej kontroli negatywnej. Jeżeli stwierdzono obecność fluoryzujących komórek o charakterystycznej morfologii, trzeba oszacować średnią liczbę typowych komórek w polu widzenia mikroskopu oraz obliczyć liczbę komórek typowych przypadająca na ml ponownie zawieszonego osadu (dodatek 4). Próbki o odczycie 5 x 103 typowych komórek przypadających na ml ponownie zawieszonego osadu uznaje się za potencjalnie porażone. Konieczne wykonanie jest dalszych badań. Odczyt jest negatywny przy mniej niż 5 x 103 komórek typowych przypadających na ml zawieszonego osadu.

ii) Test FISH jest negatywny, jeśli fluoryzujące czerwone komórki o rozmiarze i morfologii typowej dla R. solanacearum nie zostaną wykryte przy użyciu filtra rodaminy, pod warunkiem zaobserwowania typowych fluoryzujących na czerwono komórek w preparatach kontroli pozytywnych przy użyciu filtra rodaminowego.

8. Testy ELISA

Zasada

Test ELISA możne być używany wyłącznie jako badanie fakultatywne wraz z badaniem IF, PCR lub FISH ponieważ ma ono niską czułość. Przy użyciu testu DAS ELISA, konieczne jest zastosowanie wzbogacenia i przeciwciał monoklonalnych (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Wzbogacenie prób przed użyciem w teście ELISA może okazać się pomocne dla zwiększenia czułości tego badania, lecz może się nie powieść z powodu konkurencji ze strony innych organizmów obecnych w próbie.

Uwaga: Należy używać zatwierdzonego źródła przeciwciał przeciw R. solanacearum (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Zaleca się, aby dla każdej nowej partii przeciwciał określać miano. Miano określa się jako największe rozcieńczenie, przy którym pojawia się optymalna reakcja w trakcie badania zawiesiny zawierającej 105 do 106 komórek przypadających na ml szczepu homogenicznego R. solanacearum i przy użyciu właściwych koniugatów przeciwciał zgodnie z zaleceniami producenta. Podczas badań rutynowych używa się dostępnych w handlu przeciwciał w rozcieńczeniu roboczym zbliżonym do wartości miana.

Określić miano przeciwciał na zawiesinie 105 do 106 komórek przypadających na ml homogenicznego szczepu R. solanacearum.

Dołączyć ekstrakt z próby, w przypadku którego uprzednie badanie wykazało negatywne wyniki na R. solanacearum i zawiesinę niereagujących krzyżowo bakterii w buforze fosforanowym (PBS) jako kontrolę negatywną.

Jako kontroli pozytywnej użyć ekstraktu próby, w przypadku którego uprzednie badanie dało negatywne wyniki, wymieszanego z 103 do 104 komórek przypadających na ml R. solanacearum biowar 2 (np. szczep NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, patrz: dodatek 2 A i B). Dla porównania wyników na każdej płytce wykorzystać standardową zawiesinę zawierającą 105 do 106 komórek przypadających na ml w PBS R. solanacearum. Należy upewnić się, że na płytce titracyjnej kontrole pozytywne są właściwie oddzielone od prób badanych.

Znormalizowane pozytywne i negatywne materiały kontrolne dostępne do użycia przy tym badaniu wymieniono w dodatku 3 A.

Kontrole pozytywne traktować w sposób identyczny jak próbę(-y).

Zatwierdzone zostały dwa protokoły testu ELISA:

a) Pośredni test ELISA (Elphinstone i wsp., 1995)

1. Użyć 100-200 µl ekstraktu próby. (Ogrzewanie przez 4 minuty w temperaturze 100 °C w łaźni wodnej lub bloku grzewczym może w pewnych wypadkach zredukować niespecyficzne wyniki).

2. Dodać tę samą objętość podwójnie stężonego buforu powlekającego (dodatek 4) i zworteksować.

3. Nałożyć po 100 l do każdej z co najmniej dwóch studzienek na płytce (np. Nunc-Polysorp lub równoważny). Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze 4 °C.

4. Usunąć ekstrakty ze studzienek. Przepłukać studzienki trzykrotnie buforem PBS-Tween (dodatek 4), pozostawiając w studzience ostatni roztwór używany do płukania na przynajmniej 5 minut.

5. Przygotować stosowne rozcieńczenia przeciwciał przeciw R. solanacearum w buforze blokującym (dodatek 4). W przypadku zatwierdzonych komercyjnych przeciwciał, użyć zalecanych rozcieńczeń (zazwyczaj o stężeniu dwukrotnie większym niż miano).

6. Nałożyć po 100 l do każdej studzienki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.

7. Usunąć roztwór przeciwciał ze studzienek i wypłukać jak poprzednio (pkt 4).

8. Przygotować właściwe rozcieńczenia drugich przeciwciał koniugatu alkalicznej fosfatazy w buforze blokującym. Nałożyć po 100 l do każdej studzienki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.

9. Usunąć koniugaty przeciwciał ze studzienek i wypłukać jak poprzednio (pkt 4).

10. Dodać 100 µl roztworu substratu fosfatazy alkalicznej (dodatek 4) do każdej studzienki. Inkubować w ciemności w temperaturze otoczenia i odczytać absorbancję przy 405 nm w regularnych odstępach, w ciągu 90 minut.

b) DASI ELISA

1. Przygotować stosowne rozcieńczenia przeciwciał poliklonalnych przeciw R. solanacearum w buforze powlekającym pH 9,6 (dodatek 4). Dodać 200 µl do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 4–5 godz. lub przy 4 °C przez 16 godz.

2. Wypłukać studzienki trzykrotnie przy użyciu buforu PBS-Tween (dodatek 4). Dodać 190 µl ekstraktu próby do co najmniej 2 studzienek. Dodać także kontrolę pozytywną i negatywną do dwóch studzienek przypadających na płytkę. Inkubować przez 16 godz. w temperaturze 4 °C.

3. Wypłukać studzienki trzykrotnie przy użyciu buforu PBS-Tween (dodatek 4).

4. Przygotować stosowne rozcieńczenia specyficznych dla R. solanacearum przeciwciał monoklonalnych w PBS (dodatek 4) zawierających również 0,5 % albuminy z surowicy bydlęcej (BSA) oraz dodać 190 µl do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godz.

5. Wypłukać studzienki trzykrotnie przy użyciu buforu PBS-Tween (dodatek 4).

6. Przygotować stosowne rozcieńczenie koniugatu anty-mysich immunoglobin z fosfatazą alkaliczną w PBS. Dodać 190 µl do każdej studzienki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godz.

7. Wypłukać studzienki trzykrotnie przy użyciu buforu PBS-Tween (dodatek 4).

8. Przygotować roztwór substratu alkalicznej fosfatazy zawierający 1 mg fosfatazy p-nitrofenylu przypadającego na ml buforu substratowego (dodatek 4). Dodać 200 µl do każdej studzienki. Inkubować w ciemności w temperaturze otoczenia i odczytać absorbancję przy 405 nm w regularnych odstępach, w ciągu 90 minut.

Interpretacja wyników testu ELISA

Wynik testu ELISA jest negatywny, gdy średnia gęstość optyczna (OD) odczytywana w dwóch powtórzeniach ze studzienek próby wynosi < 2x OD dla studzienki kontroli negatywnej, pod warunkiem że OD dla kontroli pozytywnych studzienek kontrolnych wynosi powyżej 1,0 (po 90 minutach inkubacji z substratem) i więcej niż podwójna OD uzyskana dla negatywnych ekstraktów prób.

Wynik testu ELISA jest pozytywny, gdy odczyty średniej gęstości optycznej OD próby w dwóch powtórzeniach wynoszą > 2x OD w negatywnym ekstrakcie próby pod warunkiem, że odczyt OD dla wszystkich kontroli pozytywnych wynosi < 2x tych w studzienkach kontroli pozytywnych.

Negatywne odczyty testu ELISA w studzienkach kontroli pozytywnych wskazują, że badanie nie zostało wykonane poprawnie lub że zostało zahamowane. Pozytywne odczyty testu ELISA w studzienkach kontroli negatywnych wskazują na kontaminację lub pojawienie się niespecyficznego wiązania przeciwciał.

9. Test biologiczny

Uwaga: Wstępne testy przy użyciu tej metody powinny pozwolić na powtarzalne wykrywanie od 103 do 104 jednostek tworzących kolonie R. solanacearum. na ml dodanych do ekstraktów prób, które we wcześniejszych testach dały wyniki ujemne (sposób przygotowania opisano w dodatku 3).

Najwyższej czułości wykrywania można oczekiwać, kiedy stosuje się świeżo przygotowane ekstrakty i zapewnia się optymalne warunki wzrostu. Metodę tę można jednak z powodzeniem stosować do ekstraktów, które były przechowywane pod glicerolem w temp. od –68 do –86 °C.

Protokół ten oparty jest o publikację Janse (1988):

9.1. Dla każdej próby użyć 10 roślin testowych wrażliwej odmiany pomidora (np. »Moneymaker« lub odmiany o podobnej podatności określonej w badaniu laboratoryjnym) w stadium trzeciego właściwego liścia. Szczegóły hodowli zamieszczono w dodatku 8. Alternatywnie można użyć roślin oberżyny (np. odmiany »Black Beauty« lub odmian o podobnej podatności), używać wyłącznie roślin w stadium 2–3 liści do pełnego rozwoju trzeciego liścia właściwego. Wykazano, że w przypadku użycia oberżyny obserwowane symptomy były słabsze i rozwijały się wolniej. W miarę możliwości zaleca się używanie sadzonek pomidora.

Rozdzielić po 100 µl ekstraktu próby pomiędzy rośliny testowe.

9.2.1. Inokulacja za pomocą strzykawki

Inokulować łodygi roślin powyżej liścieni za pomocą strzykawki z igłą do iniekcji podskórnej (nie mniejszej niż 23 G). Próbę rozdzielić między rośliny testowe.

9.2.2. Inokulacja przez nacięcie

Trzymając roślinę między dwoma palcami, nanieść na łodygę kroplę (średnio 5–10 µl) zawieszonego osadu w miejscu między liścieniami i pierwszym liściem.

Za pomocą sterylnego skalpela wykonać ukośne nacięcie, o długości 1,0 cm i na głębokość średnio 2/3 grubości łodygi, rozpoczynając od miejsca naniesienia kropli osadu.

Ranę zamknąć sterylną wazeliną ze strzykawki.

9.3. Stosując tę samą technikę, zainokulować 5 sadzonek zawiesiną wodną 105 do 106 komórek przypadających na ml, przygotowaną z 48 godz. kultury wirulentnego biowar 2 szczepu R. solanacearum jako kontrolę pozytywną oraz buforem do zawieszania osadu (dodatek 4) jako kontrolę negatywną. W celu uniknięcia kontaminacji oddzielić kontrolę pozytywną i negatywną od pozostałych roślin testowych.

9.4. Utrzymywać rośliny testowe w warunkach kwarantanny przez okres do 4 tygodni, w temperaturze 25–30 °C w wilgotności względnej z właściwym podlewaniem, aby zapobiec podtopieniu lub więdnięciu z powodu braku wody. Dla uniknięcia kontaminacji inkubować rośliny zainokulowanej kontroli pozytywnej i negatywnej na wyraźnie oddzielonych stołach w szklarni lub komorze wzrostu lub, w przypadku ograniczonej przestrzeni, zapewnić restrykcyjne oddzielenie pomiędzy procesami. Jeśli rośliny należące do różnych prób muszą być inkubowane w pobliżu, oddzielić je odpowiednimi ekranami. Przy nawożeniu, podlewaniu, kontrolowaniu i innych procedurach, należy bardzo uważać, aby unikać kontaminacji. Bardzo ważne jest, aby w szklarni lub komorze hodowlanej nie było żadnych owadów, ponieważ mogą one z próby na próbę przenosić bakterie.

Obserwować objawy więdnięcia, epinastii, chlorozy i/lub zahamowania rozwoju.

9.5. Wyizolować z porażonych roślin (sekcja II.3) i zidentyfikować oczyszczone kultury typowe dla R. solanacearum (sekcja VI. B).

9.6. Jeśli w okresie 3 tygodni nie zaobserwuje się żadnych objawów, wykonać IF/PCR/izolację na próbie zbiorczej złożonej z 1 cm fragmentów łodyg każdej badanej rośliny wziętej z odcinka powyżej miejsca inokulacji. Jeśli wynik testu jest pozytywny, wykonać posiew metodą rozcieńczeń płytkowych (sekcja 4.1).

9.7. Zidentyfikować wszelkie oczyszczone kultury typowe dla R. solanacearum (sekcja VI. B).

Interpretacja wyników testu biologicznego:

Prawidłowe wyniki testu biologicznego są uzyskiwane, kiedy rośliny stanowiące kontrolę pozytywną wykazują typowe objawy, bakterie z tych roślin mogą być reizolowane, a na roślinach będących kontrolą negatywną nie występują objawy.

Test biologiczny daje wynik negatywny, jeżeli rośliny nie zostały porażone przez R. solanacearum, pod warunkiem że obecność kultury R. solanacearum wykryto w kontrolach pozytywnych.

Test biologiczny daje wynik pozytywny, gdy rośliny testowe są porażone przez R. solanacearum.

B. TESTY IDENTYFIKACYJNE

Zidentyfikować czyste kultury typowe dla R. solanacearum przy użyciu co najmniej dwóch z poniższych testów opartych na różnych zasadach biologicznych.

Dołączyć znane szczepy referencyjne, tam gdzie to stosowne, dla każdego wykonywanego badania (patrz: dodatek 3).

1. Testy fizjologiczne i biochemiczne

Określić następujące właściwości fenotypu, które standardowo występują lub nie w R. solanacearum, zgodnie z metodami Lelliotta i Steada (1987), Klementa et al. (1990), Schaad (2001).

Test Oczekiwany wynik Produkcja barwnika fluorescencyjnego – Obecność poli-β -hydroksymaślanu + Test oksydacyjno/fermentacyjny (O/F) O+/F- Katalaza + Aktywność oksydazy + Redukcja azotanu + Wykorzystywanie cytrynianu + Wzrost przy 40 °C – Wzrost w 1 % NaCl + Wzrost w 2 % NaCl – Aktywność hydrolazy argininy – Upłynnianie żelatyny – Hydroliza skrobi – Hydroliza esuliny – Produkcja lewanu –

2. Test IF

2.1. Przygotować zawiesinę około 106 komórek przypadających na ml w buforze IF (dodatek 4).

2.2. Przygotować serię dwukrotnych rozcieńczeń odpowiedniej surowicy (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

2.3. Zastosować procedurę IF (sekcja VI.A.5).

2.4. Wynik testu IF jest dodatni, jeśli miano IF badanej kultury jest równoważne mianu z kontroli pozytywnej.

3. Test ELISA

Uwaga: Jeżeli wykonywane są tylko 2 testy identyfikacyjne, poza tą metodą, nie należy używać kolejnego badania serologicznego.

3.1. Przygotować zawiesinę około 108 komórek przypadających na ml 1X PBS (dodatek 4).

3.2. Zastosować odpowiednią procedurę testu ELISA ze specyficznymi przeciwciałami monoklonalnymi przeciw R. solanacearum.

3.3. Wynik testu ELISA jest dodatni, jeśli odczyt ELISA uzyskany z badanej kultury wynosi przynajmniej połowę tego uzyskanego dla kontroli pozytywnej.

4. Test PCR

4.1. Przygotować zawiesinę około 106 komórek przypadających na ml w sterylnej wodzie o stopniu molekularnym.

4.2. Podgrzać 100 µl zawiesiny komórek w zamkniętych probówkach w bloku grzejnym lub wrzącej łaźni wodnej w temperaturze 100 °C przez 4 minuty. Próbki mogą być następnie przechowywane do momentu, kiedy będą potrzebne w temp. od –16 do –24 °C.

4.3. Użyć właściwych procedur PCR dla namnożenia specyficznych dla R. solanacearum amplikonów (np. Seal et al. (1993); Pastrik i Maiss (2000); Pastrik et al. (2002); Boudazin et al. (1999); Opina et al. (1997), Weller et al. (1999).

4.4. Pozytywna identyfikacja R. solanacearum następuje, jeśli amplikony PCR są tego samego rozmiaru i posiadają te same polimorfizmy restrykcyjne długości fragmentu, co dla szczepu kontroli pozytywnej.

5. Test FISH

5.1. Przygotować zawiesinę około 106 komórek przypadających na ml w UPW.

5.2. Zastosować procedurę FISH (sekcja VI.A.7) przynajmniej z dwoma pozytywnymi specyficznymi dla R. solanacearum sondami oligonukleotydowymi (dodatek 7).

5.3. Wynik testu FISH jest dodatni, jeśli takie same reakcje uzyskuje się z kultury badanej oraz kontroli pozytywnej.

6. Analiza kwasów tłuszczowych (FAP)

6.1. Hodować kulturę na trypticase soy agar (Oxoid) przez 48 godzin w temperaturze 28 °C.

6.2. Zastosować odpowiednią metodę FAP (Janse, 1991; Stead, 1992).

6.3. Badanie FAP daje wynik pozytywny, gdy profil kultury badanej jest identyczny z profilem dla kontroli pozytywnej. Obecność charakterystycznych kwasów tłuszczowych takich jak 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH oraz 18:1 2OH, a brak 16:0 3OH w dużym w stopniu wskazuje na występowanie Ralstonia sp.

7. Metoda oznaczania szczepu

Wykonanie oznaczenia szczepu przy użyciu z jednej z następujących metod zaleca się dla każdego nowego przypadku izolacji R. solanacearum.

Dołączyć znane szczepy referencyjne, tam gdzie to stosowne, dla każdego wykonywanego badania (patrz: dodatek 3).

7.1. Określenie biowaru

R. solanacearum dzieli się na biowary ze względu na ich zdolność do wytwarzania i/lub utleniania trzech cukrów i trzech alkoholi heksozowych (Hayward, 1964 i Hayward et al., 1990). Podłoże wzrostowe do badania browarów opisano w dodatku 2. Badanie można z powodzeniem wykonać szczepiąc podłoże czystymi kulturami R. solanacearum i inkubując w temperaturze 28 °C. Jeśli podłoże rozdzieli się do sterylnych 96 studzienek płytki (200 µl na studzienkę), w ciągu 72 godzin można zaobserwować zmianę barwy z oliwkowo zielonej na żółtą, co wskazuje na pozytywny wynik badania.

Biowar 1 2 3 4 5 Wykorzystanie: Maltozy – + + – + Laktozy – + + – + D (+) celobiozy – + + – + Mannitolu – – + + + Sorbitolu – – + + – Dulcytolu – – + + –

Dodatkowe badania różnicujące biowar 2 na podfenotypy

Biovar 2A (Na całym świecie) Biovar 2A (W Chile i Kolumbii) Biovar 2T (W obszarach tropikalnych) Wykorzystanie trehalozy – + + Wykorzystanie mezoinozytolu + – + Wykorzystanie D-rybozy – – + Aktywność pektolityczna (1) niska niska wysoka

7.2. Genomowe fingerprinting

Różnicowanie molekularne szczepów kompleksu R. solanacearum można zrealizować na drodze kilku technik, w tym:

7.2.1. Analizą restrykcyjnego polimorfizmu długości fragmentu (RFLP) (Cook et al., 1989).

7.2.2. Powtarzanego sekwencjonowania PCR przy użyciu REP, BOX i starterów ERIC (Louws et al., 1995; Smith et al. (1995).

7.2.3. Analizą mnożonego polimorfizmu długości fragmentu (AFLP) (Van der Wolf et al., 1998).

7.3. Metody PCR

Specyficzne startery PCR (Pastrik et al., 2002; patrz: dodatek 6) można użyć do rozróżnienia szczepów należących do działu 1 (biowary 3, 4 i 5) i działu 2 (biowary 1, 2A i 2T) R. solanacearum, zgodnie z pierwotną definicją analizy RFLP (Cook et al., 1989) oraz 16S sekwencjonowania rDNA (Taghavi et al., 1996).

C. TESTY POTWIERDZAJĄCE

Test patogeniczności musi być wykonany jako końcowe potwierdzenie diagnozy występowania R. solanacearum oraz do określania wirulencji kultur zidentyfikowanych jako R. solanacearum.

1. Przygotować inokulum 106 komórek na 1 ml z badanej kultury hodowanej przez 24–48 godzin i szczep kontroli pozytywnej R. solanacearum (np. NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; patrz: dodatek 3).

2. Zainokulować 5–10 wrażliwych sadzonek pomidora lub oberżyny w stadium trzeciego właściwego liścia (Patrz: sekcja VI.A.9).

3. Inkubować przez okres do 2 tygodni w temperaturze 25–28 °C w wysokiej wilgotności względnej z właściwym podlewaniem, aby zapobiec powstaniu stresu z powodu podtopienia lub zbytniego wysuszenia. Przy czystych kulturach, typowe więdnięcie powinno się uzyskać w ciągu 15 dni. Jeśli po tym okresie nie ma objawów, nie można potwierdzić, że kultura jest patogeniczną formą R. solanacearum.

4. Izolacji dokonywać z roślin wykazujących objawy porażenia w następujący sposób.