PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej L 54/1

ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (WE) nr 152/2009

z dnia 27 stycznia 2009 r.

ustanawiające metody pobierania próbek i dokonywania analiz do celów urzędowej kontroli pasz

(Tekst mający znaczenie dla EOG)

KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH,

uwzględniając Traktat ustanawiający Wspólnotę Europejską,

uwzględniając rozporządzenie (WE) nr 882/2004 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 29 kwietnia 2004 r. w sprawie kontroli urzędowych przeprowadzanych w celu sprawdzenia zgodności z prawem paszowym i żywnościowym oraz regułami dotyczącymi zdrowia zwierząt i dobrostanu zwierząt (1), w szczególności jego art. 11 ust. 4 lit. a), b) i c),

a także mając na uwadze, co następuje:

(1) Poniższe akty prawne przyjęto w celu wdrożenia dyrektywy 70/373/EWG i pozostają one w mocy zgodnie z art. 61 ust. 2 rozporządzenia (WE) nr 882/2004: — pierwsza dyrektywa Komisji 71/250/EWG z dnia 15 czerwca 1971 r. ustanawiająca wspólnotowe metody analizy do celów urzędowej kontroli pasz (2), — druga dyrektywa Komisji 71/393/EWG z dnia 18 listopada 1971 r. ustanawiająca wspólnotowe metody analiz do celów urzędowej kontroli pasz (3), — trzecia dyrektywa Komisji 72/199/EWG z dnia 27 kwietnia 1972 r. ustalająca wspólnotowe metody analiz do celów urzędowej kontroli pasz (4), — czwarta dyrektywa Komisji 73/46/EWG z dnia 5 grudnia 1972 r. ustanawiająca wspólnotowe metody analizy do celów urzędowej kontroli pasz (5), — pierwsza dyrektywa Komisji 76/371/EWG z dnia 1 marca 1976 r. ustanawiająca wspólnotowe metody pobierania próbek i dokonywania analizy do celów urzędowej kontroli pasz (6), — siódma dyrektywa Komisji 76/372/EWG z dnia 1 marca 1976 r. ustanawiająca wspólnotowe metody analizy do celów urzędowej kontroli pasz (7), — ósma dyrektywa Komisji 78/633/EWG z dnia 15 czerwca 1978 r. ustanawiająca wspólnotowe metody analizy do celów urzędowej kontroli pasz (8), — dziewiąta dyrektywa Komisji 81/715/EWG z dnia 31 lipca 1981 r. ustanawiająca wspólnotowe metody analizy do celów urzędowej kontroli pasz (9), — dziesiąta dyrektywa Komisji 84/425/EWG z dnia 25 lipca 1984 r. ustanawiająca wspólnotowe metody analizy do celów urzędowej kontroli pasz (10), — dyrektywa Komisji 86/174/EWG z dnia 9 kwietnia 1986 r. określająca metodę obliczania wartości energetycznej mieszanek paszowych dla drobiu (11), — jedenasta dyrektywa Komisji 93/70/EWG z dnia 28 lipca 1993 r. ustanawiająca wspólnotowe metody analiz do celów urzędowej kontroli pasz (12), — dwunasta dyrektywa Komisji 93/117/WE z dnia 17 grudnia 1993 r. ustanawiająca wspólnotowe metody analizy do celów urzędowej kontroli pasz (13), — dyrektywa Komisji 98/64/WE z dnia 3 września 1998 r. ustanawiająca wspólnotowe metody analiz do oznaczenia aminokwasów, surowych olejów i tłuszczów oraz olaquindoksu w paszach i zmieniająca dyrektywę 71/393/EWG (14), — dyrektywa Komisji 1999/27/WE z dnia 20 kwietnia 1999 r. ustanawiająca wspólnotowe metody analiz dla oznaczania amprolium, diklazurilu i karbadoksu w paszach oraz zmieniająca dyrektywy 71/250/EWG, 73/46/EWG i uchylająca dyrektywę 74/203/EWG (15), — dyrektywa Komisji 1999/76/WE z dnia 23 lipca 1999 r. ustanawiająca wspólnotową metodę analizy dla oznaczania lasalocidu soli sodowej w paszach (16), — dyrektywa Komisji 2000/45/WE z dnia 6 lipca 2000 r. ustanawiająca wspólnotowe metody analizy do celów oznaczania witaminy A, witaminy E i tryptofanu w paszach (17), — dyrektywa Komisji 2002/70/WE z dnia 26 lipca 2002 r. ustanawiająca wymagania dotyczące określania poziomów dioksyn i dioksynopochodnych polichlorowanych bifenyli (PCB) w paszach (18), — dyrektywa Komisji 2003/126/WE z dnia 23 grudnia 2003 r. w sprawie analitycznej metody określania składników pochodzenia zwierzęcego do celów urzędowej kontroli pasz (19).

(2) Ponieważ dyrektywę 70/373/EWG zastąpiono rozporządzeniem (WE) nr 882/2004, należy zastąpić akty wykonawcze do tej dyrektywy jednym rozporządzeniem. Jednocześnie metody powinny zostać dostosowane w świetle rozwoju wiedzy naukowej i technicznej. Metody, które straciły ważność w odniesieniu do ich celu, powinny zostać usunięte. Przewiduje się, że przepisy dotyczące pobierania próbek zostaną w odpowiednim czasie zaktualizowane w celu uwzględnienia nowych osiągnięć w zakresie produkcji, przechowywania, transportu i sprzedaży pasz, jednakże do tego czasu należy utrzymać istniejące przepisy dotyczące pobierania próbek.

(3) Należy zatem uchylić dyrektywy 71/250/EWG, 71/393/EWG, 72/199/EWG, 73/46/EWG, 76/371/EWG, 76/372/EWG, 78/633/EWG, 81/715/EWG, 84/425/EWG, 86/174/EWG, 93/70/EWG, 93/117/WE, 98/64/WE, 1999/27/WE, 1999/76/WE, 2000/45/WE, 2002/70/WE i 2003/126/WE.

(4) Środki przewidziane w niniejszym rozporządzeniu są zgodne z opinią Stałego Komitetu ds. Łańcucha Żywnościowego i Zdrowia Zwierząt,

PRZYJMUJE NINIEJSZE ROZPORZĄDZENIE:

Artykuł 1

Pobieranie próbek do celów urzędowej kontroli pasz, w zakresie oznaczania składników, dodatków oraz niepożądanych substancji, z wyjątkiem pozostałości pestycydów i mikroorganizmów, przeprowadzane jest zgodnie z metodami opisanymi w załączniku I.

Artykuł 2

Przygotowanie próbek do analizy i wyrażanie wyników odbywa się zgodnie z metodami opisanymi w załączniku II.

Artykuł 3

Badania do celów urzędowej kontroli pasz przeprowadzane są z wykorzystaniem metod określonych w załącznikach III (Metody analizy składu materiałów i mieszanek paszowych), IV (Metody analizy do celów kontroli poziomu dopuszczonych dodatków w paszach), V (Metody analizy do celów kontroli zawartości niepożądanych substancji w paszach) oraz VI (Metody analizy dotyczące oznaczania składników pochodzenia zwierzęcego do celów urzędowej kontroli pasz).

Artykuł 4

Wartość energetyczna mieszanek paszowych dla drobiu obliczana jest zgodnie z załącznikiem VII.

Artykuł 5

Określone w załączniku VIII metody analizy mające na celu kontrolę nielegalnej obecności w paszach dodatków, które już nie są dopuszczone, stosowane są do celów potwierdzania.

Artykuł 6

Dyrektywy 71/250/EWG, 71/393/EWG, 72/199/EWG, 73/46/EWG, 76/371/EWG, 76/372/EWG, 78/633/EWG, 81/715/EWG, 84/425/EWG, 86/174/EWG, 93/70/EWG, 93/117/WE, 98/64/WE, 1999/27/WE, 1999/76/WE, 2000/45/WE, 2002/70/WE i 2003/126/WE tracą moc.

Odesłania do uchylonych dyrektyw rozumiane są jako odesłania do niniejszego rozporządzenia i interpretuje zgodnie z tabelami korelacji w załączniku IX.

Artykuł 7

Niniejsze rozporządzenie wchodzi w życie dwudziestego dnia po jego opublikowaniu w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej.

Niniejsze rozporządzenie stosuje się od dnia 26 sierpnia 2009 r.

Niniejsze rozporządzenie wiąże w całości i jest bezpośrednio stosowane we wszystkich państwach członkowskich. Sporządzono w Brukseli dnia 27 sierpnia 2009 r. W imieniu Komisji Androulla VASSILIOU Członek Komisji

(1) Dz.U. L 165 z 30.4.2004, s. 1.

(2) Dz.U. L 155 z 12.7.1971, s. 13.

(3) Dz.U. L 279 z 20.12.1971, s. 7.

(4) Dz.U. L 123 z 29.5.1972, s. 6.

(5) Dz.U. L 83 z 30.3.1973, s. 21.

(6) Dz.U. L 102 z 15.4.1976, s. 1.

(7) Dz.U. L 102 z 15.4.1976, s. 8.

(8) Dz.U. L 206 z 29.7.1978, s. 43.

(9) Dz.U. L 257 z 10.9.1981, s. 38.

(10) Dz.U. L 238 z 6.9.1984, s. 34.

(11) Dz.U. L 130 z 16.5.1986, s. 53.

(12) Dz.U. L 234 z 17.9.1993, s. 17.

(13) Dz.U. L 329 z 30.12.1993, s. 54.

(14) Dz.U. L 257 z 19.9.1998, s. 14.

(15) Dz.U. L 118 z 6.5.1999, s. 36.

(16) Dz.U. L 207 z 6.8.1999, s. 13.

(17) Dz.U. L 174 z 13.7.2000, s. 32.

(18) Dz.U. L 209 z 6.8.2002, s. 15.

(19) Dz.U. L 339 z 24.12.2003, s. 78.

ZAŁĄCZNIK I METODY POBIERANIA PRÓBEK 1. CEL I ZAKRES STOSOWANIA METODY Próbki przeznaczone do urzędowej kontroli pasz pobierane są zgodnie z metodami opisanymi poniżej. Próbki otrzymane w ten sposób uważa się za reprezentatywne dla kontrolowanych partii. 2. PERSONEL POBIERAJĄCY PRÓBKI Próbki pobierane są przez osoby upoważnione do tego celu przez państwa członkowskie. 3. DEFINICJE Kontrolowana partia: ilość produktu stanowiąca partię, posiadająca cechy wystarczające do uznania jej za jednolitą. Próbka pierwotna: ilość produktu pobrana z jednego miejsca kontrolowanej partii. Próbka zbiorcza: sumaryczna ilość pierwotnych próbek pobranych z tej samej kontrolowanej partii. Próbka zredukowana: reprezentatywna część zbiorczej próbki otrzymana z niej w procesie redukcyjnym. Próbka końcowa: część zredukowanej próbki lub zhomogenizowanej próbki zbiorczej. 4. APARATURA I SPRZĘT 4.1. Sprzęt do pobierania próbek musi być wykonany z materiałów, które nie zanieczyszczą kontrolowanego produktu. Taki sprzęt może być urzędowo zatwierdzony przez państwa członkowskie. 4.2. Sprzęt zalecany do pobierania próbek pasz stałych 4.2.1. Ręczne pobieranie próbek 4.2.1.1. Szufelka o płaskim dnie i prostopadłych ściankach bocznych. 4.2.1.2. Sonda z otwieranymi okienkami lub przegrodami, której wymiary muszą być dostosowane do charakterystyki kontrolowanej partii (głębokość pojemnika, wymiary worka itp.) i do wielkości cząstek paszy. 4.2.2. Mechaniczne pobieranie próbek Zatwierdzone urządzenie mechaniczne może być użyte do pobierania próbek paszy w ruchu. 4.2.3. Rozdzielacz Urządzenie przeznaczone do dzielenia próbek w przybliżeniu na równe części może być stosowane do pobierania próbek pierwotnych oraz w celu przygotowania próbek zredukowanych i końcowych. 5. WYMAGANIA ILOŚCIOWE 5.A. W odniesieniu do kontroli zawartości substancji lub produktów jednolicie rozmieszczonych w paszy 5.A.1. Kontrolowana partia Rozmiar kontrolowanej partii musi umożliwiać pobranie próbek każdej części składowej. 5.A.2. Próbki pierwotne 5.A.2.1. Pasze sypkie: Minimalna liczba próbek pierwotnych: 5.A.2.1.1. waga kontrolowanych partii nie większa niż 2,5 tony siedem 5.A.2.1.2. waga kontrolowanych partii większa niż 2,5 tony √ dwudziestokrotność liczby ton metrycznych stanowiących wagę kontrolowanej partii (1), maksymalnie do 40 próbek pierwotnych 5.A.2.2. Pasze opakowane: Minimalna liczba opakowań, z których pobiera się próbki (2): 5.A.2.2.1. Opakowania o wadze większej niż 1 kg: 5.A.2.2.1.1. kontrolowana partia zawierająca od 1 do 4 opakowań wszystkie opakowania 5.A.2.2.1.2. kontrolowana partia zawierająca od 5 do 16 opakowań cztery 5.A.2.2.1.3 kontrolowana partia zawierająca ponad 16 opakowań √ liczba opakowań stanowiących kontrolowaną partię (1), maksymalnie do 20 opakowań 5.A.2.2.2. Opakowania o wadze nie większej niż 1 kg cztery 5.A.2.3. Pasze płynne lub półpłynne: Minimalna liczba pojemników, z których pobiera się próbki (2): 5.A.2.3.1. Pojemniki o objętości większej niż 1 l: 5.A.2.3.1.1. kontrolowana partia zawierająca od 1 do 4 pojemników wszystkie pojemniki 5.A.2.3.1.2. kontrolowana partia zawierająca od 5 do 16 pojemników cztery 5.A.2.3.1.3. kontrolowana partia zawierająca ponad 16 pojemników √ liczba pojemników stanowiących kontrolowaną partię (1), maksymalnie do dwudziestu pojemników 5.A.2.3.2. Pojemniki o objętości nie większej niż 1 l cztery 5.A.2.4. Bloki paszy i lizawki mineralne Minimalna liczba bloków lub lizawek, z których pobiera się próbki (2): jeden blok lub jedna lizawka na kontrolowaną partię 25 sztuk, maksymalnie do czterech bloków lub lizawek 5.A.3. Próbka zbiorcza Wymagana jest jedna próbka zbiorcza na kontrolowaną partię. Całkowita waga próbek pierwotnych tworzących próbkę zbiorczą jest nie mniejsza niż: 5.A.3.1. Pasze sypkie 4 kg 5.A.3.2. Pasze opakowane: 5.A.3.2.1. opakowania o wadze większej niż 1 kg 4 kg 5.A.3.2.2. opakowania o wadze nie większej niż 1 kg waga zawartości czterech oryginalnych opakowań 5.A.3.3. Pasze płynne lub półpłynne: 5.A.3.3.1. pojemniki o objętości większej niż 1 l 4 l 5.A.3.3.2. pojemniki o objętości nie większej niż 1 l objętość zawartości czterech oryginalnych opakowań 5.A.3.4. Bloki paszy i lizawki mineralne: 5.A.3.4.1. o wadze większej niż 1 kg 4 kg 5.A.3.4.2. o wadze nie większej niż 1 kg waga czterech oryginalnych bloków lub lizawek 5.A.4. Próbki końcowe Próbki końcowe otrzymywane są z próbki zbiorczej w wyniku redukcji, jeśli jest to konieczne. Wymagana jest analiza co najmniej jednej próbki końcowej. Ilość próbki końcowej potrzebnej do analizy jest nie mniejsza niż: Pasze stałe 500 g Pasze płynne lub półpłynne 500 ml 5.B. W odniesieniu do kontroli niepożądanych substancji lub produktów, które mogą być rozmieszczone niejednolicie w paszy, takich jak aflatoksyny, sporysz, rącznik pospolity i krotalaria w materiałach paszowych (3) 5.B.1. Kontrolowana partia: zob. 5.A.1. 5.B.2. Próbki pierwotne 5.B.2.1. Pasze sypkie: zob. 5.A.2.1. 5.B.2.2. Pasze pakowane: Minimalna liczba opakowań: 5.B.2.2.1. kontrolowana partia zawierająca od 1 do 4 opakowań wszystkie opakowania 5.B.2.2.2. kontrolowana partia zawierająca od 5 do 16 opakowań cztery 5.B.2.2.3. kontrolowana partia zawierająca ponad 16 opakowań √ liczba opakowań stanowiących kontrolowaną partię (1), maksymalnie do czterdziestu opakowań 5.B.3. Próbki zbiorcze Liczba próbek zbiorczych różni się w zależności od rozmiaru kontrolowanej partii. Minimalna liczba próbek zbiorczych na kontrolowaną partię jest podana poniżej. Całkowita waga próbek pierwotnych tworzących każdą próbkę zbiorczą jest nie mniejsza niż 4 kg 5.B.3.1. Pasze sypkie Waga kontrolowanej partii w tonach: Minimalna liczba próbek zbiorczych na kontrolowaną partię: do 1 1 od powyżej 1 do 10 2 od powyżej 10 do 40 3 powyżej 40 4 5.B.3.2. Pasze opakowane Rozmiar kontrolowanej partii w ilości opakowań: Minimalna liczba próbek zbiorczych na kontrolowaną partię: 1 do 16 1 17 do 200 2 201 do 800 3 powyżej 800 4 5.B.4. Próbki końcowe Próbki końcowe otrzymywane są z każdej próbki zbiorczej w wyniku redukcji. Wymagana jest analiza co najmniej jednej próbki końcowej na próbkę zbiorczą. Waga próbki końcowej do analizy nie może być mniejsza niż 500 g. 6. INSTRUKCJE POBIERANIA, PRZYGOTOWANIA I PAKOWANIA PRÓBEK 6.1. Uwaga ogólna Próbki należy pobierać i przygotowywać tak szybko, jak to możliwe, przy zachowaniu środków ostrożności gwarantujących, że produkt nie ulegnie zmianie lub zanieczyszczeniu. Stosowany sprzęt, a także powierzchnie i pojemniki przeznaczone na próbki muszą być czyste i suche. 6.2. Próbki pierwotne 6.2.A. W odniesieniu do kontroli substancji lub produktów jednolicie rozmieszczonych w paszy Próbki pierwotne należy pobrać losowo z całej partii przy zachowaniu w przybliżeniu jednakowej ich wielkości. 6.2.A.1. Pasze sypkie Kontrolowaną partię należy podzielić na równe w przybliżeniu części. Liczbę części odpowiadającą liczbie próbek pierwotnych wymaganej zgodnie z pkt 5.A.2. należy wybrać losowo i pobrać co najmniej jedną próbkę z każdej części. W stosownych przypadkach próbki mogą być pobierane, gdy kontrolowana partia paszy jest w ruchu (załadunek lub wyładunek). 6.2.A.2. Pasze opakowane Po wybraniu wymaganej liczby opakowań w celu pobrania próbek zgodnie z pkt 5.A.2, część zawartości każdego opakowania należy pobrać przy użyciu sondy lub szufelki. W miarę potrzeby, próbki należy pobierać po opróżnieniu każdego z opakowań oddzielnie. Jakiekolwiek zbrylenia należy rozbić (jeśli to konieczne odseparować je, po rozbryleniu, zwrócić do próbki), oddzielnie dla każdej próbki zbiorczej. 6.2.A.3. Jednorodne lub nadające się do homogenizacji pasze płynne lub półpłynne Po wybraniu wymaganej liczby pojemników w celu pobrania próbek zgodnie z pkt 5.A.2 należy w razie potrzeby zhomogenizować zawartość i pobrać próbkę z każdego pojemnika. Próbki pierwotne mogą być pobierane w trakcie opróżniania zawartości pojemnika. 6.2.A.4. Nienadające się do homogenizacji pasze płynne lub półpłynne Po wybraniu wymaganej liczby pojemników w celu pobrania próbek zgodnie z pkt 5.A.2, należy pobrać próbki z różnych poziomów pojemnika. Próbki mogą być także pobierane w trakcie opróżniania pojemników, przy czym pierwszą frakcję należy odrzucić. W każdym przypadku całkowita pobrana objętość nie może być mniejsza niż 10 l. 6.2.A.5. Bloki paszy i lizawki mineralne Po wybraniu wymaganej liczby bloków i lizawek w celu pobrania próbek zgodnie z pkt 5.A.2. należy pobrać część każdego bloku lub lizawki. 6.2.B. W odniesieniu do kontroli niepożądanych substancji lub produktów, które mogą być rozmieszczone niejednolicie w paszy, takich jak aflatoksyny, sporysz, rącznik pospolity i krotalaria w materiałach paszowych Kontrolowaną partię należy podzielić na pewną liczbę równych w przybliżeniu części, odpowiadającą liczbie próbek zbiorczych, określonej w pkt 5.B.3. Jeżeli liczba ta jest większa niż jeden, całkowita liczba pierwotnych próbek określona w pkt 5.B.2. musi być rozdzielona równo w przybliżeniu na wszystkie części. Następnie należy pobrać próbki o zbliżonej wielkości (4) tak, aby całkowita masa próbek z każdej części była nie mniejsza niż wymagane 4 kg dla każdej próbki zbiorczej. Próbki pierwotne pobierane z różnych części nie mogą być łączone. 6.3. Przygotowanie próbek zbiorczych 6.3.A. W odniesieniu do kontroli substancji lub produktów jednolicie rozmieszczonych w paszy Próbki pierwotne miesza się w jedną próbkę zbiorczą. 6.3.B. W odniesieniu do kontroli niepożądanych substancji lub produktów, które mogą być rozmieszczone niejednolicie w paszy, takich jak aflatoksyny, sporysz, rącznik pospolity i krotalaria w materiałach paszowych Pierwotne próbki z każdej części kontrolowanej partii należy zmieszać i podzielić na próbki zbiorcze w liczbie określonej w pkt 5.B.3, przy czym należy zanotować pochodzenie każdej próbki zbiorczej. 6.4. Przygotowanie próbek końcowych Materiał każdej próbki zbiorczej należy dokładnie wymieszać w celu otrzymania próbki jednolitej (5). Jeśli jest to konieczne, próbkę zbiorczą należy najpierw zredukowana do wielkości nie mniejszej niż 2 kg lub 2 l (próbka zredukowana) przy użyciu mechanicznego rozdzielacza lub metodą kwadratów. Należy przygotować co najmniej trzy próbki końcowe tej samej wielkości i dostosowane do ilościowych wymagań określonych w pkt 5.A.4 lub 5.B.4. Każdą próbkę należy umieścić w odpowiednim pojemniku. Należy podjąć wszelkie środki ostrożności, aby zapobiec zmianie składu próbki, zanieczyszczeniu lub sfałszowaniu, które mogą nastąpić w czasie transportu lub przechowywania. 6.5. Pakowanie próbek końcowych Pojemniki opakowań należy opieczętować i oznakować (wszelkie etykiety muszą być opieczętowane) w taki sposób, aby nie można było otworzyć pojemnika bez naruszania pieczęci. 7. PROTOKÓŁ POBIERANIA PRÓBEK Po każdym pobraniu próbek należy sporządzić protokół umożliwiający jednoznaczną identyfikację każdej kontrolowanej partii. 8. PRZEZNACZENIE PRÓBEK Z każdej próbki zbiorczej co najmniej jedną próbkę końcową należy niezwłocznie przesłać do laboratorium upoważnionego do prowadzenia badań wraz z informacjami niezbędnymi dla analityka. (1) Jeżeli uzyskana liczba nie jest liczbą całkowitą, należy ją zaokrąglić do następującej po niej liczby całkowitej. (2) W przypadku opakowań lub pojemników, których zawartość nie przekracza 1 kg lub 1 l, oraz bloków i lizawek o wadze nie większej niż 1 kg, próbkę pierwotną stanowi zawartość jednego oryginalnego opakowania lub pojemnika bądź jeden blok lub jedna lizawka. (3) Metody przewidziane w odniesieniu do 5.A stosuje się w kontroli aflatoksyny, sporyszu, rącznika pospolitego i krotalarii w paszach pełnoporcjowych i uzupełniających. (4) W przypadku pasz opakowanych pobiera się część zawartości opakowań przy użyciu sondy lub szufelki po uprzednim oddzielnym opróżnieniu opakowań, jeśli jest to konieczne. (5) Jakiekolwiek zbrylenia należy rozbić (jeśli to konieczne odseparować je, po rozbryleniu, zwrócić do próbki) oddzielnie dla każdej próbki zbiorczej.

ZAŁĄCZNIK II PRZEPISY OGÓLNE DOTYCZĄCE METODYKI ANALIZY PASZ A. PRZYGOTOWANIE PRÓBEK DO BADAŃ 1. Cel Poniżej opisany tryb postępowania dotyczy przygotowania do badań próbek końcowych, przesyłanych do laboratoriów kontrolnych po pobraniu zgodnie z przepisami określonymi w załączniku I. Próbkę do badań należy przygotować tak, aby odważone ilości, zgodnie z metodyką postępowania analitycznego, były jednorodne i reprezentatywne w odniesieniu do próbki końcowej. 2. Zalecane środki ostrożności Wybór trybu postępowania przy przygotowaniu próbek zależy od stosowanych metod analizy. Z tego względu bardzo ważne jest upewnienie się, czy wybrany tryb postępowania jest właściwy w odniesieniu do stosowanej metody analizy. Wszystkie konieczne czynności należy wykonywać w taki sposób, aby zapobiec zanieczyszczeniu i zmianie składu próbki do badań. Rozdrabnianie, mieszanie, przesiewanie należy wykonywać możliwie szybko, przy ograniczonym dostępie powietrza i światła do próbki do badań. Nie należy stosować młynków i rozdrabniaczy, które podczas pracy powodują nagrzewanie próbki do badań. W przypadku pasz szczególnie wrażliwych na ciepło zaleca się ręczne rozdrabnianie. Ponadto zastosowany sprzęt nie może stanowić źródła zanieczyszczenia pasz mikroelementami. Jeżeli przygotowanie próbki do badań nie może być przeprowadzone bez znacznych zmian poziomu wilgotności próbki, poziom jej wilgotności oznacza się przed i po przygotowaniu próbki do badań, zgodnie z metodą, o której mowa w załączniku III część A. 3. Sposób postępowania Podzielić próbkę na odpowiednie mniejsze próbki do celów analizy i celów referencyjnych, stosując stosowne techniki podziału, np. naprzemienne przekopywanie, przerzucanie miejscowe lub rotacyjne. Stożkowanie i dzielenie na ćwiartki nie są zalecane, ponieważ mogą dawać próbki o dużym błędzie podziału. Próbkę referencyjną przechowywać w odpowiednim czystym i suchym pojemniku, wyposażonym w hermetyczny korek i przygotować próbki do analizy o masie co najmniej 100 g w sposób opisany poniżej. 3.1. Pasze, które mogą być zmielone Jeżeli w metodyce postępowania analitycznego nie ustalono inaczej, po zmieleniu, jeżeli to konieczne, całą próbkę przesiać przez sito o otworach w kształcie kwadratów o bokach 1 mm (zgodnie z zaleceniem ISO R565). Unikać nadmiernego rozdrobnienia. Przesianą próbkę zamieszać i umieścić w odpowiednim, czystym i suchym pojemniku, wyposażonym w hermetyczny korek. Bezpośrednio przed odważeniem próbki do badań – powtórnie zamieszać. 3.2. Pasze, które mogą być zmielone po wysuszeniu Jeżeli w metodyce postępowania analitycznego nie ustalono inaczej, wysuszyć próbkę w celu obniżenia poziomu wilgotności do 8–12 %, zgodnie ze wstępną procedurą suszenia opisaną w pkt 4.3 w metodyce oznaczania wilgotności, o której mowa w załączniku III część A. Następnie postępować w sposób określony w pkt 3.1. 3.3. Pasze płynne lub półpłynne Próbkę umieścić w odpowiednim, czystym i suchym pojemniku, wyposażonym w hermetyczny korek. Bezpośrednio przed odważeniem próbki do badań – dokładnie zamieszać. 3.4. Inne pasze Próbki, które nie mogą być przygotowane w jeden z wyżej opisanych sposobów, należy przygotować w taki sposób, aby odważone ilości wymagane do metodyki postępowania analitycznego były jednorodne i reprezentatywne dla próbki końcowej. 4. Przechowywanie próbek Próbki należy przechowywać w temperaturze, która nie spowoduje zmiany ich składu. Próbki przeznaczone do badania witamin lub substancji, które są szczególnie wrażliwe na światło, należy przechowywać w brązowych, szklanych pojemnikach. B. PRZEPISY DOTYCZĄCE ODCZYNNIKÓW I APARATURY UŻYWANEJ W METODYCE POSTĘPOWANIA ANALITYCZNEGO 1. Jeżeli w metodyce postępowania analitycznego nie ustalono inaczej, wszystkie stosowane odczynniki muszą mieć stopień czystości do analizy. W przypadku oznaczania mikroelementów czystość odczynników należy sprawdzić przez wykonanie ślepej próby. Zależnie od uzyskanych wyników, może być konieczne dalsze oczyszczanie odczynników. 2. Jeżeli w metodyce postępowania analitycznego nie podano konkretnego rozpuszczalnika lub rozcieńczalnika, w przypadku czynności wymagających przygotowania roztworów, rozcieńczania, spłukiwania lub przemywania należy stosować wodę. Podstawowym wymogiem jest stosowanie wody demineralizowanej lub destylowanej. W szczególnych przypadkach, wymienionych w metodyce postępowania analitycznego, wodę należy oczyścić w specjalny sposób. 3. Ze względu na aparaturę i sprzęt, które zwykle stosuje się w laboratoriach kontrolnych, w metodyce postępowania analitycznego wymienia się tylko tę aparaturę i sprzęt, które wymagają szczególnego zastosowania lub mają specjalny charakter. Wszystkie urządzenia muszą być czyste, zwłaszcza gdy są oznaczane bardzo małe ilości substancji. C. STOSOWANIE METODYKI POSTĘPOWANIA ANALITYCZNEGO I WYRAŻANIE WYNIKÓW 1. Postępowanie ekstrakcyjne W kilku metodach określono konkretne postępowanie ekstrakcyjne. Z reguły można zastosować inne postępowanie ekstrakcyjne, niż to, o którym mowa w danej metodyce, pod warunkiem, że dowiedziono, iż w porównaniu z postępowaniem określonym w metodyce stosowane postępowanie ma równoważną wydajność ekstrakcji w odniesieniu do analizowanej matrycy. 2. Postępowanie oczyszczające W kilku metodach określono konkretne postępowanie oczyszczające. Z reguły można zastosować inne postępowanie oczyszczające, niż to, o którym mowa w danej metodyce, pod warunkiem, że dowiedziono, iż w porównaniu z postępowaniem określonym w metodyce stosowane postępowanie daje równoważne wyniki analityczne w odniesieniu do analizowanej matrycy. 3. Podawanie zastosowanych metod analitycznych w sprawozdaniu Na ogół w odniesieniu do oznaczania zawartości każdej substancji w paszy określona jest jedna metoda analityczna. Jeżeli podanych jest kilka metod, w sprawozdaniu z badań należy wymienić konkretną metodę zastosowaną w laboratorium kontrolnym. 4. Liczba oznaczeń Wynik podany w sprawozdaniu z badań stanowi średnią wartość co najmniej z dwóch oznaczeń wykonanych z oddzielnych części tej samej próbki i charakteryzuje się zadowalającą powtarzalnością. Jednakże w przypadku substancji niepożądanych, jeżeli wynik pierwszego oznaczenia jest znacznie (o > 50 %) niższy niż ustalona zawartość maksymalna, nie są konieczne dodatkowe oznaczenia, pod warunkiem, że stosowane jest odpowiednie postępowanie w odniesieniu do jakości. W przypadku kontroli deklarowanej zawartości substancji lub składnika, jeżeli wynik pierwszego oznaczenia potwierdza deklarowaną zawartość, tj. wyniki analizy mieszczą się w dopuszczalnym zakresie zmienności co do deklarowanej zawartości, nie są konieczne dodatkowe oznaczenia, pod warunkiem, że stosowane jest odpowiednie postępowanie w odniesieniu do jakości. W niektórych przypadkach dopuszczalny zakres zmienności określony jest w prawodawstwie, np. w dyrektywie Rady 79/373/EWG (1). 5. Podawanie wyników analizy w sprawozdaniu Wynik analizy należy wyrażać w sposób podany w metodyce postępowania analitycznego, zawierać odpowiednią liczbę cyfr znaczących i, jeżeli to konieczne, musi być korygowany do wilgotności próbki końcowej przed przygotowaniem. 6. Niepewność pomiaru i stopień odzysku w przypadku analizy substancji niepożądanych W odniesieniu do substancji niepożądanych w rozumieniu dyrektywy 2002/32/WE, w tym dioksyn i dioksynopodobnych polichlorowanych bifenyli (PCB), uznaje się, że produkt przeznaczony do żywienia zwierząt jest niezgodny pod względem ustalonej zawartości maksymalnej, w przypadku gdy wynik analizy wskazuje na przekroczenie zawartości maksymalnej z uwzględnieniem rozszerzonej niepewności pomiaru i poprawki na stopień odzysku. Badane stężenie po uwzględnieniu poprawki na stopień odzysku i odjęciu rozszerzonej niepewności pomiaru od wyniku stanowi podstawę oceny zgodności. Postępowanie to ma zastosowanie jedynie w przypadkach, gdy stosowana metoda analizy pozwala na ustalenie wartości niepewności pomiaru i stopnia odzysku (nie jest to możliwe np. w przypadku analizy mikroskopowej). Wynik analizy przedstawia się w sposób następujący (o ile stosowana metoda analizy pozwala na ustalenie wartości niepewności pomiaru i stopnia odzysku): a) jako skorygowany na stopień odzysku, przy czym stopień ten należy wskazać. Korekta na odzysk nie jest konieczna, jeśli stopień odzysku wynosi 90–110 %; b) jako x +/- U, gdzie x oznacza wynik analizy, a U rozszerzoną niepewność pomiaru, przy zastosowaniu współczynnika rozszerzenia w wysokości 2, który daje wynik w przedziale ufności ok. 95 %. Jeżeli wynik analizy jest jednak znacznie (o > 50 %) niższy niż ustalona zawartość maksymalna oraz pod warunkiem, że stosowane jest odpowiednie postępowanie w odniesieniu do jakości, a analiza wykonywana jest jedynie do celów sprawdzenia zgodności z przepisami prawnymi, wynik analizy można podać bez korekty na odzysk; w takim przypadku można pominąć podawanie stopnia odzysku i niepewności pomiaru. (1) Dz.U. L 86 z 6.4.1979, s. 30.

ZAŁĄCZNIK III METODY ANALIZY SKŁADU MATERIAŁÓW I MIESZANEK PASZOWYCH A. OZNACZANIE WILGOTNOŚCI 1. Cel i zakres stosowania metody Metoda służy do oznaczania wilgotności pasz. Należy zauważyć, że w przypadku pasz zawierających substancje lotne, np. kwasy organiczne, podczas oznaczania wilgotności oznaczana jest również znaczna ilość substancji lotnych. Metody nie stosuje się do badania produktów mlecznych występujących jako materiały paszowe, związków mineralnych, mieszanin składających się głównie ze związków mineralnych, tłuszczów i olejów pochodzenia zwierzęcego i roślinnego oraz nasion i owoców roślin oleistych. 2. Sposób przeprowadzenia metody Próbka jest suszona w warunkach dostosowanych do właściwości pasz. Obniżenie masy jest określane przez ważenie. Jeżeli pasze stałe zawierają duże ilości wilgotności, konieczne jest przeprowadzenie wstępnego suszenia. 3. Aparatura i sprzęt 3.1. Rozdrabniacz wykonany z materiałów niepochłaniających wilgotności, łatwy do czyszczenia, pozwalający na szybkie i równomierne rozdrobnienie materiału bez nadmiernego ogrzewania, w sposób ograniczający do minimum kontakt z powietrzem, spełniający wymagania określone w pkt 4.1.1 i pkt 4.1.2 (np. młotek, chłodzony wodą mikrorozdrabniacz, składany stożkowy młynek albo rozdrabniacz wolnoobrotowy lub wyposażony w koło zębate). 3.2. Waga analityczna ważąca z dokładnością do 1 mg. 3.3. Suche naczynka z nierdzewnego metalu lub ze szkła z przykrywkami umożliwiającymi hermetyczne zamknięcie, o powierzchni roboczej umożliwiającej równomierne rozprowadzenie badanej próbki w warstwie 0,3 g/cm2. 3.4. Suszarka elektryczna z termostatem (± 2 oC), dobrze wentylowana i pozwalająca na szybką regulację temperatury (1). 3.5. Termostatowana suszarka próżniowa zaopatrzona w pompę olejową oraz mechanizm umożliwiający nawiew gorącego suchego powietrza lub wprowadzenie czynnika suszącego (np. tlenku wapnia). 3.6. Eksykator z płytką z grubego perforowanego metalu lub porcelany, zawierający efektywny czynnik suszący. 4. Sposób postępowania Uwaga : Czynności opisane w tej części należy wykonywać natychmiast po otworzeniu opakowania próbki. Analizę należy wykonać co najmniej w 2 powtórzeniach. 4.1. Przygotowanie 4.1.1. Pasze inne niż określone w pkt 4.1.2 i pkt 4.1.3 Pobrać co najmniej 50 g próbki. Jeżeli to konieczne, rozdrobnić lub podzielić w taki sposób, aby zapobiec jakimkolwiek zmianom zawartości wilgotności (zob. pkt 6). 4.1.2. Zboża i kasze Pobrać co najmniej 50 g próbki. Rozdrobnić na cząstki, które przechodzą przez oczka sita o średnicy 0,5 mm co najmniej w 50 % i pozostają w ilości nie wyższej niż 10 % na sicie o oczkach o średnicy 1 mm. 4.1.3. Pasze ciekłe lub w postaci pasty, pasze z przewagą olejów lub tłuszczów Pobrać 25 g próbki, zważyć z dokładnością do 10 mg, dodać odpowiednią ilość bezwodnego piasku odważonego z dokładnością do 10 mg i zmieszać do uzyskania homogennego produktu. 4.2. Suszenie 4.2.1. Pasze inne niż określone w pkt 4.2.2 i 4.2.3 Zważyć, z dokładnością do 1 mg, naczynko z przykrywką (pkt 3.3). Do naczynka odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 5 g próbki i równo rozmieścić. Wstawić naczynko bez przykrywki do suszarki podgrzanej do temperatury 103 oC. Aby zapobiec nadmiernemu spadkowi temperatury, umieścić naczynko w suszarce tak szybko, jak to możliwe. Suszyć przez cztery godziny od czasu, gdy suszarka ponownie osiągnie temperaturę 103 oC. Nałożyć przykrywkę na naczynko, wyjąć je z suszarki, pozostawić do schłodzenia w eksykatorze (pkt 3.6) na 30 do 45 minut i zważyć z dokładnością do 1 mg. Pasze z przeważającym udziałem oleju lub tłuszczu suszyć ponownie w suszarce przez 30 minut w temperaturze 130 oC. Różnica pomiędzy dwoma ważeniami nie może przekraczać 0,1 % wilgotności. 4.2.2. Zboża, mąki, kasze i mączki Zważyć, z dokładnością do 0,5 mg, naczynko z przykrywką (pkt 3.3). Do naczynka odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 5 g rozdrobnionej próbki i równo rozmieścić. Wstawić naczynko bez przykrywki do suszarki podgrzanej do temperatury 130 oC. Aby zapobiec nadmiernemu spadkowi temperatury, umieścić naczynko w suszarce tak szybko, jak to możliwe. Suszyć przez dwie godziny od czasu, gdy suszarka ponownie osiągnie temperaturę 130 oC. Nałożyć przykrywkę na naczynko, wyjąć je z suszarki, pozostawić do schłodzenia w eksykatorze (pkt 3.6) na 30 do 45 minut i zważyć z dokładnością do 1 mg. 4.2.3. Mieszanki paszowe zawierające ponad 4 % sacharozy lub laktozy: materiały paszowe, takie jak chleb świętojański, hydrolizowane produkty zbożowe, słód jęczmienny, susz buraczany, hydrolizaty rybne i cukrowe, mieszanki z ponad 25 % udziałem soli mineralnych zawierających wodę krystalizacyjną. Zważyć, z dokładnością do 0,5 mg, naczynko z przykrywką (pkt 3.3). Do naczynka odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 5 g próbki i równo rozmieścić. Wstawić naczynko bez przykrywki do suszarki próżniowej (pkt 3.5), podgrzanej do temperatury od 80 do 85 oC. Aby zapobiec nadmiernemu spadkowi temperatury, umieścić naczynko w suszarce tak szybko, jak to możliwe. Podwyższyć ciśnienie do 100 Torr i pozostawić w celu wysuszenia na cztery godziny pod działaniem tego ciśnienia, w strumieniu gorącego, suchego powietrza albo stosując czynnik suszący (ok. 300 g na 20 próbek). W drugim przypadku odłączyć pompę próżniową po uzyskaniu odpowiedniego ciśnienia. Czas suszenia liczyć od chwili, gdy suszarka ponownie osiągnie temperaturę od 80 do 85 oC. Ostrożnie zrównać ciśnienie w suszarce z ciśnieniem atmosferycznym. Otworzyć suszarkę, szybko nałożyć przykrywkę na naczynko, wyjąć je z suszarki, pozostawić do schłodzenia w eksykatorze (pkt 3.6) na 30–45 minut i zważyć z dokładnością do 1 mg. Suszyć ponownie w suszarce próżniowej przez 30 minut o temperaturze od 80 do 85 oC i zważyć powtórnie. Różnica pomiędzy dwoma ważeniami nie może przekraczać 0,1 % wilgotności. 4.3. Suszenie wstępne 4.3.1. Pasze inne niż określone w pkt 4.3.2 Pasze stałe o wysokim poziomie wilgotności, trudne do rozdrabniania, należy poddać wstępnemu suszeniu w następujący sposób: Odważyć 50 g, z dokładnością do 10 mg, nierozdrobnionej próbki (pasze sprasowane lub zbrylone można w razie potrzeby wstępnie rozdzielić) do odpowiedniego naczynia (np. płytka aluminiowa o wymiarach 20 cm × 12 cm z obwódką o wysokości 0,5 cm). Suszyć w suszarce o temperaturze od 60 do 70 oC, aż poziom wilgotności obniży się do 8–12 %. Wyjąć próbkę z suszarki, pozostawić bez przykrycia do schłodzenia w laboratorium przez godzinę i zważyć z dokładnością do 10 mg. Szybko rozdrobnić, postępując w sposób określony w pkt 4.1.1, i suszyć w sposób określony w pkt 4.2.1 lub 4.2.3, w zależności od rodzaju paszy. 4.3.2. Zboża Ziarno zbóż o wilgotności wyższej niż 17 % należy poddać wstępnemu suszeniu w następujący sposób: Odważyć, z dokładnością do 10 mg, 50 g nierozdrobnionego ziarna do odpowiedniego naczynia (np. płytka aluminiowa o wymiarach 20 × 12 cm z obwódką o wysokości 0,5 cm). Suszyć w suszarce od 5 do 7 minut w temperaturze 130 oC. Wyjąć próbkę z suszarki, pozostawić bez przykrycia do schłodzenia w laboratorium przez dwie godziny i zważyć z dokładnością do 10 mg. Szybko rozdrobnić, postępując w sposób określony w pkt 4.1.2, i suszyć w sposób określony w pkt 4.2.2. 5. Obliczanie wyników Wilgotność (X) jako udział procentowy w próbce obliczana jest według następujących wzorów: 5.1. Suszenie bez wstępnego podsuszania gdzie: m = początkowa masa w g badanej próbki m0 = masa w g badanej próbki po wysuszeniu 5.2. Suszenie z podsuszaniem gdzie: m = początkowa masa w g badanej próbki m1 = masa w g badanej próbki po wstępnym podsuszaniu m2 = masa w g badanej próbki po rozdrobnieniu m0 = masa w g badanej próbki po wysuszeniu 5.3. Powtarzalność Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 0,2 % bezwzględnej wartości wilgotności. 6. Objaśnienia Jeżeli rozdrabnianie próbki jest konieczne i wpływa na poziom wilgotności w produkcie, wyniki analizy składników paszowych należy skorygować o poziom wilgotności w początkowym stanie próbki. B. OZNACZANIE WILGOTNOŚCI OLEJÓW I TŁUSZCZÓW POCHODZENIA ZWIERZĘCEGO I ROŚLINNEGO 1. Cel i zakres stosowania metody Metoda służy do oznaczania zawartości wody i substancji lotnych w tłuszczach i olejach pochodzenia zwierzęcego oraz roślinnego. 2. Sposób przeprowadzenia metody Próbka jest suszona w temperaturze 103 oC do uzyskania stałej masy (ubytek masy między dwoma kolejnymi ważeniami musi być równy lub mniejszy niż 1 mg). Ubytek masy jest określany metodą wagową. 3. Aparatura i sprzęt 3.1. Naczynie z płaskim dnem wykonane z materiału nierdzewnego, o średnicy od 8 do 9 cm i wysokości około 3 cm. 3.2. Termometr rtęciowy ze wzmocnionym zbiornikiem i ekspansyjną rurką w górnym końcu, z podziałką od 80 do co najmniej 110 oC i o długości około 10 cm. 3.3. Łaźnia piaskowa lub elektryczna płyta grzewcza. 3.4. Eksykator zawierający efektywny środek suszący. 3.5. Waga analityczna. 4. Sposób postępowania Odważyć, z dokładnością do 1 mg, około 20 g homogennej próbki do suchego, zważonego naczynia (3.1), zawierającego termometr (3.2). Ogrzewać na łaźni piaskowej lub płycie grzewczej (3.3) ciągle mieszając termometrem, tak aby uzyskać wzrost temperatury do 90 oC w czasie około 7 minut. Zmniejszyć ogrzewanie, obserwując częstotliwość odrywania się pęcherzyków powietrza od dna naczynia. Temperatura nie może przekroczyć 105 oC. Kontynuować mieszanie, pocierając dno naczynia do czasu, aż przestaną się tworzyć pęcherzyki. W celu całkowitego odparowania wilgotności, ogrzewać próbkę kilka razy do temperatury 103 oC ± 2 oC, schładzając do 93 oC pomiędzy kolejnymi ogrzewaniami. Następnie schłodzić próbkę do temperatury pokojowej w eksykatorze (3.4) i zważyć. Powtarzać ogrzewanie, dopóki ubytek masy pomiędzy dwoma kolejnymi ważeniami nie będzie większy niż 2 mg. Uwaga : Wzrost masy próbki po powtórnym ogrzewaniu wskazuje na utlenienie się tłuszczu. W takim przypadku do obliczenia wyniku wziąć ostatnią masę próbki, przed wzrostem jej masy. 5. Obliczanie wyników Wilgotność (X) jako udział procentowy w próbce obliczana jest według następującego wzoru: gdzie: m = masa w g badanej próbki m1 = masa w g naczynia z zawartością przed ogrzewaniem m2 = masa w g naczynia z zawartością po ogrzewaniu Wyniki oznaczania niższe niż 0,05 % należy zapisać, używając określenia „niższe niż 0,05 %”. Powtarzalność Różnica wilgotności pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 0,05 % wartości bezwzględnej. C. OZNACZANIE ZAWARTOŚCI BIAŁKA SUROWEGO 1. Cel i zakres stosowania metody Metoda służy do oznaczania zawartości białka surowego w paszach na podstawie zawartości azotu oznaczonego metodą Kjeldahla. 2. Sposób przeprowadzenia metody Próbka jest mineralizowana kwasem siarkowym w obecności katalizatora. Kwaśny roztwór jest alkalizowany z użyciem roztworu wodorotlenku sodu. Amoniak destyluje się i zbiera w znanej ilości roztworu kwasu siarkowego, którego nadmiar jest miareczkowany mianowanym roztworem wodorotlenku sodu. Ewentualnie uwolniony amoniak jest destylowany do nadmiaru roztworu kwasu borowego, a następnie miareczkowany roztworem kwasu chlorowodorowego lub siarkowego. 3. Odczynniki i roztwory 3.1. Siarczan potasu. 3.2. Katalizator: tlenek miedzi(II) CuO lub siarczan miedzi(II) CuSO4 5H2O pentahydrat. 3.3. Granulowany cynk. 3.4. Kwas siarkowy, ρ20 = 1,84 g/ml. 3.5. Kwas siarkowy, mianowany roztwór objętościowy o stężeniu c(H2SO4) = 0,25 mol/l. 3.6. Kwas siarkowy, mianowany roztwór objętościowy o stężeniu c(H2SO4) = 0,10 mol/l. 3.7. Kwas siarkowy, mianowany roztwór objętościowy o stężeniu c(H2SO4) = 0,05 mol/l. 3.8. Czerwień metylowa, wskaźnik: rozpuścić 300 mg czerwieni metylowej w 100 ml etanolu, σ = 95–96 % (v/v). 3.9. Wodorotlenek sodu (może być techniczny), roztwór o stężeniu β = 40 g/100 ml (m/v: 40 %). 3.10. Wodorotlenek sodu, mianowany roztwór objętościowy o stężeniu c(NaOH) = 0,25 mol/l. 3.11. Wodorotlenek sodu, mianowany roztwór objętościowy o stężeniu c(NaOH) = 0,10 mol/l. 3.12. Granulowany pumeks, przemyty kwasem chlorowodorowym i wyprażony. 3.13. Acetanilid (temperatura topnienia = 114 oC, zawartość N = 10,36 %). 3.14. Sacharoza, niezawierająca azotu. 3.15. Kwas borowy (H3BO3). 3.16. Roztwór czerwieni metylowej, wskaźnik: rozpuścić 100 mg czerwieni metylowej w 100 ml etanolu lub metanolu. 3.17. Roztwór zieleni bromokrezolowej: rozpuścić 100 mg zieleni bromokrezolowej w 100 ml etanolu lub metanolu. 3.18. Roztwór kwasu borowego (od 10 g/l do 40 g/l, w zależności od stosowanej aparatury i sprzętu) Przy stosowaniu kolorymetrycznego punktu końcowego do roztworów kwasu borowego należy dodać wskaźniki czerwieni metylowej i zieleni bromokrezolowej. Jeżeli przygotowuje się 1 l roztworu kwasu borowego, przed dostosowaniem objętości należy dodać 7 ml roztworu czerwieni metylowej (3.16) i 10 ml roztworu zieleni bromokrezolowej (3.17). Odczyn pH roztworu kwasu borowego może różnić się między seriami w zależności od użytej wody. Często do uzyskania pozytywnej próby ślepej konieczne jest dostosowanie pH przy pomocy małej objętości zasady. Uwaga : Dodanie ok. 3–4 ml NaOH (3.11) do 1 l kwasu borowego o stężeniu 10 g/l zwykle zapewnia dobre dostosowanie. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej oraz chronić przed światłem i źródłami oparów amoniaku. 3.19 Kwas chlorowodorowy, mianowany roztwór objętościowy o stężeniu c(HCl) = 0,10 mol/l. Uwaga : Można zastosować inne stężenia roztworów objętościowych (3.5, 3.6, 3.7, 3.10, 3.11 i 3.19), jeżeli zostanie to uwzględnione w obliczeniach. Stężenie należy podawać zawsze z dokładnością do czterech miejsc po przecinku. 4. Aparatura i sprzęt Aparatura i sprzęt odpowiedni do przeprowadzenia mineralizacji, destylacji i miareczkowania według metody Kjeldahla. 5. Sposób postępowania 5.1. Mineralizacja Odważyć, z dokładnością do 0,001 g, 1g próbki i przenieść do kolby aparatu do mineralizacji. Dodać 15 g siarczanu potasu (3.1), odpowiednią ilość katalizatora (3.2) (od 0,3 do 0,4 g tlenku miedzi(II) lub od 0,9 do 1,2 g pentahydratu siarczanu miedzi(II)), 25 ml kwasu siarkowego (3.4) oraz, w razie potrzeby, kilka granulek pumeksu (3.12) i zamieszać. Początkowo ogrzewać kolbę ostrożnie, w razie konieczności mieszając od czasu do czasu, aż do zwęglenia substancji i zaniku piany; następnie zwiększyć intensywność ogrzewania aż do trwałego wrzenia roztworu. Ogrzewanie jest właściwe, jeżeli wrzący kwas kondensuje się na ściankach kolby. Zapobiegać przegrzewaniu się ścianek i przylepianiu do nich organicznych cząstek. Od chwili gdy roztwór stanie się klarowny i przyjmie jasnozieloną barwę, kontynuować ogrzewanie przez dwie godziny, a następnie pozostawić do schłodzenia. 5.2. Destylacja Ostrożnie dodać do kolby ilość wody wystarczającą do całkowitego rozpuszczenia siarczanów. Pozostawić do schłodzenia, a następnie w razie potrzeby dodać kilka granulek cynku (3.3). Postępować zgodnie z pkt 5.2.1 lub 5.2.2. 5.2.1. Destylacja do kwasu siarkowego Umieścić w odbieralniku aparatu destylacyjnego odmierzone 25 ml kwasu siarkowego (3.5 lub 3.7), zależnie od przewidywanej zawartości azotu. Dodać kilka kropli wskaźnika czerwieni metylowej (3.8). Podłączyć kolbę mineralizacyjną do chłodnicy aparatu destylacyjnego i zanurzyć koniec chłodnicy w cieczy znajdującej się w kolbie odbieralnika na głębokość co najmniej 1 cm (zob. objaśnienia pkt 8.3). Powoli wlać 100 ml roztworu wodorotlenku sodu (3.9) do kolby mineralizacyjnej, nie dopuszczając do strat amoniaku (zob. objaśnienia pkt 8.1). Ogrzewać kolbę aż do całkowitego oddestylowania amoniaku. 5.2.2. Destylacja do kwasu borowego Jeżeli miareczkowanie zawartości amoniaku w destylacie wykonywane jest ręcznie, zastosowanie ma poniższe postępowanie. Jeżeli aparat destylacyjny jest w pełni zautomatyzowany i obejmuje miareczkowanie zawartości amoniaku w destylacie, należy stosować się do instrukcji producenta aparatu. Umieścić kolbę odbieralnika zawierającą od 25 do 30 ml roztworu kwasu borowego (3.18) pod ujściem chłodnicy w taki sposób, aby rurka doprowadzająca znajdowała się pod powierzchnią nadmiaru roztworu kwasu borowego. Ustawić aparat destylacyjny, aby podał 50 ml roztworu wodorotlenku sodu (3.9). Obsługiwać aparat destylacyjny zgodnie z instrukcjami producenta i oddestylować amoniak uwolniony w wyniku dodania roztworu wodorotlenku sodu. Zebrać destylat w roztworze kwasu borowego. Ilość destylatu (czas destylacji z parą wodną) zależy od zawartości azotu w próbce. Postępować zgodnie z instrukcjami producenta. Uwaga : W przypadku półautomatycznego aparatu destylacyjnego dodawanie nadmiaru wodorotlenku sodu i destylacja z parą wodną przeprowadzane są automatycznie. 5.3. Miareczkowanie Postępować zgodnie z pkt 5.3.1 lub 5.3.2. 5.3.1. Kwas siarkowy Miareczkować nadmiar kwasu siarkowego w kolbie odbieralnika roztworem wodorotlenku sodu (pkt 3.10 lub 3.11), w zależności od stężenia zastosowanego kwasu siarkowego, do uzyskania punktu końcowego. 5.3.2. Kwas borowy Miareczkować zawartość kolby odbieralnika mianowanym roztworem objętościowym kwasu chlorowodorowego (3.19) lub kwasu siarkowego (3.6) przy pomocy biurety i odczytać ilość zużytego titrantu. Przy stosowaniu kolorymetrycznego punktu końcowego punkt końcowy osiąga się w momencie pojawienia się pierwszego śladu różowego zabarwienia cieczy. Określić odczyt biurety z dokładnością do 0,05 ml. W wizualizacji punktu końcowego pomocna jest podświetlana płyta mieszadła magnetycznego lub detektor fotometryczny. Można to przeprowadzić automatycznie za pomocą parowego aparatu destylacyjnego z funkcją automatycznego miareczkowania. Przy obsłudze konkretnego aparatu destylacyjnego lub aparatu do miareczkowania stosować się do instrukcji producenta. Uwaga : Jeżeli stosowany jest system automatycznego miareczkowania, rozpoczyna się ono bezpośrednio po destylacji i stosowany jest 1 % roztwór kwasu borowego (3.18). Jeżeli stosowany jest w pełni automatyczny aparat destylacyjny, automatyczne miareczkowanie amoniaku można przeprowadzić również z wykryciem punktu końcowego przy pomocy potencjometrycznego systemu pH. W tym przypadku stosowany jest automatyczny aparat do miareczkowania z pehametrem. Pehametr musi być odpowiednio skalibrowany w zakresie od pH 4 do pH 7 za pomocą zwykłych laboratoryjnych metod kalibracji pH. Punkt końcowy pH w miareczkowaniu osiąga się przy wartości pH równej 4,6, co stanowi najwyższy punkt krzywej miareczkowania (punkt przegięcia). 5.4. Ślepa próba W celu potwierdzenia, że zastosowane odczynniki nie zawierają azotu, przeprowadzić ślepą próbę (mineralizację, destylację i miareczkowanie), stosując 1 g sacharozy (3.14) zamiast próbki. 6. Obliczanie wyników Obliczenia wykonywane są zgodnie z pkt 6.1 lub 6.2. 6.1. Obliczenia do miareczkowania zgodnie z pkt 5.3.1 Zawartość białka surowego jako udział procentowy w masie obliczana jest według następującego wzoru: gdzie: V0 = objętość w ml NaOH (3.10 lub 3.11) zużytego do ślepej próby V1 = objętość w ml NaOH (3.10 lub 3.11) zużytego do miareczkowania próbki c = stężenie w mol/l wodorotlenku sodu (3.10 lub 3.11) m = masa w g próbki 6.2 Obliczenia do miareczkowania zgodnie z pkt 5.3.2 6.2.1. Miareczkowanie kwasem chlorowodorowym Zawartość białka surowego jako udział procentowy w masie obliczana jest według następującego wzoru: gdzie: m = masa naważki w g c = stężenie w mol/l mianowanego roztworu objętościowego kwasu chlorowodorowego (3.19) V0 = objętość w ml kwasu chlorowodorowego użytego do próby ślepej V1 = objętość w ml kwasu chlorowodorowego użytego do naważki 6.2.2. Miareczkowanie kwasem siarkowym Zawartość białka surowego jako udział procentowy w masie obliczana jest według następującego wzoru: gdzie: m = masa naważki w g c = stężenie w mol/l mianowanego roztworu objętościowego kwasu siarkowego (3.6) V0 = objętość w ml kwasu siarkowego (3.6) użytego do próby ślepej V1 = objętość w ml kwasu siarkowego (3.6) użytego do naważki 7. Sprawdzenie metody 7.1. Powtarzalność Różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać: — 0,2 % wartości bezwzględnej, dla zawartości białka surowego niższej niż 20 %, — 1,0 % najwyższego wyniku, dla zawartości białka surowego od 20 do 40 %, — 0,4 % wartości bezwzględnej, dla zawartości białka surowego wyższej niż 40 %. 7.2. Dokładność Przeprowadzić analizę (mineralizację, destylację i miareczkowanie), stosując od 1,5 do 2,0 g acetanilidu (3.13) w obecności 1 g sacharozy (3.14); 1 g acetanilidu zużywa 14,80 ml kwasu siarkowego (3.5). Stopień odzysku musi wynosić co najmniej 99 %. 8. Objaśnienia 8.1. Sprzęt i aparatura mogą być obsługiwane ręcznie, półautomatycznie lub być całkowicie zautomatyzowane. W przypadku konieczności przeniesienia urządzenia pomiędzy etapami mineralizacji i destylacji, czynność tę należy wykonać bez jakichkolwiek strat. Jeżeli kolba aparatu destylacyjnego nie jest wyposażona we wkraplacz, dodać wodorotlenek sodu natychmiast przed podłączeniem kolby do chłodnicy, wlewając ciecz powoli po ściankach. 8.2. Jeżeli roztwór przechodzi w postać stałą, ponownie przeprowadzić oznaczanie, stosując większe ilości kwasu siarkowego (3.4) niż podano wyżej. 8.3. W przypadku produktów o niskiej zawartości azotu objętość kwasu siarkowego (3.7), która ma zostać dodana do kolby odbieralnika, może być w miarę potrzeby zmniejszona do 10 lub 15 ml i uzupełniona wodą do objętości 25 ml. 8.4. Do celów rutynowego badania można stosować inne metody analizy w odniesieniu do oznaczania białka surowego, ale metoda Kjeldahla opisana w niniejszej części C stanowi metodę referencyjną. Równoważność wyników uzyskanych inną metodą (np. DUMAS) w porównaniu z metodą referencyjną musi zostać wykazana odrębnie dla każdej matrycy. Ze względu na fakt, iż nawet po potwierdzeniu równoważności wyniki uzyskane inną metodą mogą się nieznacznie różnić od wyników uzyskanych metodą referencyjną, konieczne jest podanie w sprawozdaniu z badań metody analitycznej zastosowanej do oznaczenia białka surowego. D. OZNACZANIE MOCZNIKA 1. Cel i zakres stosowania metody Metoda służy do oznaczania zawartości mocznika w paszach. 2. Sposób przeprowadzenia metody Próbka ze środkiem klarującym tworzy w wodzie zawiesinę. Zawiesina jest filtrowana. Zawartość mocznika w filtracie jest oznaczana po dodaniu 4-dwumetyloaminobenzaldehydu (4-DMAB) poprzez pomiar gęstości optycznej przy długości fali 420 nm. 3. Odczynniki i roztwory 3.1. Roztwór 4-dwumetyloaminobezaldehydu: rozpuścić 1,6 g 4-DMAB w 100 ml 96 % etanolu i dodać 10 ml kwasu chlorowodorowego (ρ201,19 g/ml). Trwałość tego odczynnika wynosi nie więcej niż dwa tygodnie. 3.2. Roztwór Carreza I: rozpuścić w wodzie 21,9 g octanu cynkowego Zn(CH3COO)2 2H2O i 3 g lodowatego kwasu octowego. Uzupełnić do objętości 100 ml wodą. 3.3. Roztwór Carreza II: rozpuścić w wodzie 10,6 g żelazocyjanku potasowego K4Fe(CN)6 3H2O. Uzupełnić do objętości 100 ml wodą. 3.4. Aktywny węgiel nieabsorbujący mocznika (sprawdzony). 3.5. Roztwór 0,1 % (w/v) mocznika. 4. Aparatura i sprzęt 4.1. Mikser (tumbler): ok. 35 do 40 obr./min. 4.2. Probówki: 160 × 16 mm ze szklanymi, szlifowanymi korkami. 4.3. Spektrofotometr. 5. Sposób postępowania 5.1. Analiza próbki Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 2 g próbki i umieścić razem z 1 g aktywnego węgla (3.4) w kolbie miarowej o pojemności 500 ml. Dodać 400 ml wody i 5 ml roztworu Carreza I (3.2), mieszać przez ok. 30 sekund, a następnie dodać 5 ml roztworu Carreza II (3.3). Mieszać przez 30 minut w mikserze. Uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą, wstrząsnąć i przefiltrować. Do probówek ze szklanymi szlifowanymi korkami przenieść po 5 ml przezroczystego, bezbarwnego filtratu, dodać 5 ml roztworu 4-DMAB (3.1) i zamieszać. Wstawić probówki do łaźni wodnej ustawionej na temperaturę 20 oC (+/- 4 oC). Po 15 minutach zmierzyć gęstość optyczną roztworu próbki spektrofotometrem przy długości fali 420 nm. Pomiar porównać ze ślepą próbą odczynnikową. 5.2. Krzywa kalibracyjna Do kolb miarowych o pojemności 100 ml nalać 1, 2, 4, 5 i 10 ml roztworu mocznika (3.5) i uzupełnić do pełnej objętości kolb wodą. Odlać 5 ml każdego z roztworów, dodać do każdej kolby po 5 ml roztworu 4-DMAB (3.1), wymieszać i zmierzyć gęstość optyczną w podany wyżej sposób, porównując z roztworem kontrolnym zawierającym 5 ml 4-DMAB i 5 ml wody pozbawionej mocznika. Wykreślić krzywą kalibracyjną. 6. Obliczanie wyników Na podstawie krzywej kalibracyjnej oznaczyć zawartość mocznika w próbce. Wynik wyrazić jako udział procentowy w próbce. 7. Objaśnienia 7.1. W przypadku gdy zawartość mocznika jest wyższa niż 3 %, zmniejszyć masę próbki do 1 g lub rozcieńczyć pierwotny roztwór tak, aby w 500 ml nie znajdowało się więcej niż 50 mg mocznika. 7.2. W przypadku niskiej zawartości mocznika zwiększać masę próbki tak, aby filtrat pozostał przezroczysty i bezbarwny. 7.3. Jeśli próbka zawiera proste związki azotowe takie jak aminokwasy, gęstość optyczną należy mierzyć przy długości fali 435 nm. E. OZNACZANIE LOTNYCH ZWIĄZKÓW AZOTOWYCH I. METODA MIKRODYFUZYJNA 1. Cel i zakres stosowania metody Metoda służy do oznaczania w paszach zawartości lotnych związków azotowych, w przeliczeniu na amoniak. 2. Sposób przeprowadzenia metody Próbka jest ekstrahowana wodą, a roztwór – klarowany i filtrowany. Lotne związki azotowe są oddzielane metodą mikrodyfuzji z użyciem roztworu węglanu potasu, zbierane w roztworze kwasu borowego i miareczkowane kwasem siarkowym. 3. Odczynniki i roztwory 3.1. Kwas trójchlorooctowy, roztwór 20 % (w/v). 3.2. Wskaźnik: rozpuścić 33 mg zieleni bromokrezolowej i 65 mg czerwieni metylowej w 100 ml etanolu o stężeniu od 95 do 96 % (v/v). 3.3. Kwas borowy, roztwór: w kolbie miarowej o pojemności 1 l rozpuścić 10 g kwasu borowego w 200 ml etanolu o stężeniu od 95 do 96 % (v/v) i 700 ml wody. Dodać 10 ml wskaźnika (3.2). Zamieszać i, jeżeli to konieczne, doprowadzić barwę roztworu do jasnoczerwonej przez dodanie roztworu wodorotlenku sodu. 1 ml tego roztworu będzie pochłaniał maksymalnie 300 μg NH3. 3.4. Węglan potasu, roztwór nasycony: rozpuścić 100 g węglanu potasu w 100 ml wrzącej wody. Schłodzić i przefiltrować. 3.5. Kwas siarkowy o stężeniu 0,01 mol/l. 4. Aparatura i sprzęt 4.1. Mikser (tumbler): ok. 35 do 40 obr./min. 4.2. Szklane lub plastykowe naczynka Conwaya (zob. rysunek). 4.3. Mikrobiurety ze skalą 1/100 ml. 5. Sposób postępowania Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 10 g próbki do kolby miarowej o pojemności 200 ml i dodać 100 ml wody. Miksować w mikserze przez 30 minut. Dodać 50 ml roztworu kwasu trójchlorooctowego (3.1), uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą, energicznie wstrząsnąć i przefiltrować przez karbowany filtr. Pipetą wprowadzić 1 ml roztworu kwasu borowego (3.3) do środkowej części naczynka Conwaya i 1 ml filtratu próbki na obrzeże naczynka. Częściowo przykryć nasmarowaną przykrywką. Szybko dodać kroplami 1 ml nasyconego roztworu węglanu potasu (3.4) na obrzeże naczynka i zamknąć pokrywką, tak aby naczynko było hermetyczne. Obracać ostrożnie naczynkiem w płaszczyźnie poziomej, aby doprowadzić do zmieszania dwóch odczynników. Inkubować przez co najmniej cztery godziny w temperaturze pokojowej lub godzinę w temperaturze 40 oC. Mikrobiuretą (4.3) miareczkować lotne związki zaabsorbowane w kwasie borowym, stosując roztwór kwasu siarkowego (3.5). Ślepą próbę przeprowadzić w ten sam sposób, lecz bez próbki przeznaczonej do analizy. 6. Obliczanie wyników 1 ml H2SO4 o stężeniu 0,01 mol/l odpowiada 0,34 mg amoniaku. Przedstawić wynik jako udział procentowy w próbce. Powtarzalność Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać: — 10 % wartości względnej, dla zawartości amoniaku poniżej 1,0 %, — 0,1 % wartości bezwzględnej, dla zawartości amoniaku równej lub wyższej niż 1,0 %. 7. Objaśnienia Jeżeli zawartość amoniaku w próbce przekracza 0,6 %, rozcieńczyć filtrat. II. METODA DESTYLACYJNA 1. Cel i zakres stosowania metody Metoda służy do oznaczania zawartości lotnych związków azotowych, w przeliczeniu na amoniak, w mączkach rybnych niezawierających mocznika. Metoda ma zastosowanie dla zawartości amoniaku niższej niż 0,25 %. 2. Sposób przeprowadzenia metody Próbka jest ekstrahowana wodą, a uzyskany roztwór klarowany i filtrowany. Lotne związki azotowe są oddzielane w punkcie wrzenia poprzez dodanie tlenku magnezu i zbierane w określonej ilości kwasu siarkowego, którego nadmiar jest miareczkowany z użyciem roztworu wodorotlenku sodu. 3. Odczynniki i roztwory 3.1. Kwas trójchlorooctowy, roztwór 20 % (w/v). 3.2. Tlenek magnezu. 3.3. Emulsja zapobiegająca spienieniu (np. silikon). 3.4. Kwas siarkowy o stężeniu 0,05 mol/l. 3.5. Wodorotlenek sodu, roztwór o stężeniu 0,1 mol/l. 3.6. Czerwień metylowa, roztwór 0,3 % w alkoholu etylowym 95 %–96 % (v/v). 4. Aparatura i sprzęt 4.1. Mikser (tumbler): ok. 35–40 obr./min. 4.2. Aparat do destylacji typu Kjeldahla. 5. Sposób postępowania Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 10 g próbki do kolby miarowej o pojemności 200 ml i dodać 100 ml wody. Miksować w mikserze przez 30 minut. Dodać 50 ml roztworu kwasu trójchlorooctowego (3.1), uzupełnić do pełnej objętości kolby wodą, energicznie wstrząsnąć i filtrować przez karbowany filtr. Pobrać taką ilość klarownego filtratu, która odpowiada spodziewanej zawartości lotnych związków azotowych, co zwykle odpowiada objętości 100 ml. Rozcieńczyć do 200 ml, dodać 2 g tlenku magnezu (3.2) i kilka kropli emulsji zapobiegającej spienieniu (3.3). Roztwór musi wykazywać alkaliczność wobec papierka lakmusowego, w przeciwnym razie dodać nieco tlenku magnezu (3.2). Postępować zgodnie z pkt 5.2 i 5.3 metody analitycznej dotyczącej oznaczania zawartości białka surowego (część C niniejszego załącznika). Ślepą próbę przeprowadzić w ten sam sposób, lecz bez próbki przeznaczonej do analizy. 6. Obliczanie wyników 1 ml H2SO4 o stężeniu 0,05 mol/l odpowiada 1,7 mg amoniaku. Wynik wyrazić jako udział procentowy w próbce. Powtarzalność Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń, wykonanych dla tej samej próbki, nie może przekraczać 10 % wartości względnej amoniaku. F. OZNACZANIE AMINOKWASÓW (Z WYJĄTKIEM TRYPTOFANU) 1. Cel i zakres stosowania metody Metoda służy do oznaczania zawartości wolnych (syntetycznych i naturalnych) oraz całkowitych (związanych i wolnych peptydów) aminokwasów w paszach z użyciem analizatora aminokwasów. Metoda ma zastosowanie do następujących aminokwasów: cystyny (cysteiny), metioniny, lizyny, treoniny, alaniny, argininy, kwasu asparaginowego, kwasu glutaminowego, glicyny, histydyny, izoleucyny, leucyny, fenyloalaniny, proliny, seryny, tyrozyny i waliny. Metoda nie pozwala odróżnić soli aminokwasów, a także form D i L aminokwasów. Nie można jej stosować do oznaczania tryptofanu lub hydroksyanalogów aminokwasów. 2. Sposób przeprowadzenia metody 2.1. Wolne aminokwasy Wolne aminokwasy są ekstrahowane rozcieńczonym kwasem chlorowodorowym. Wyekstrahowane jednocześnie makrocząsteczki związków azotowych są wytrącane kwasem sulfosalicylowym i usuwane przez filtrowanie. Filtrowany roztwór jest dostosowany do pH 2,20. Aminokwasy są oddzielane w drodze chromatografii jonowymiennej i oznaczane z zastosowaniem reakcji z ninhydryną, poprzez fotometryczną detekcję przy 570 nm. 2.2. Aminokwasy całkowite Wybór sposobu postępowania zależy od oznaczanych aminokwasów. Cystynę (cysteinę) i metioninę przed hydrolizą poddać utlenianiu, odpowiednio do kwasu cysteinowego i sulfonu metioniny. Tyrozyna musi być oznaczana w hydrolizatach próbek niepoddanych utlenieniu. Pozostałe aminokwasy wymienione w pkt 1 mogą być oznaczane w próbce utlenionej albo niepoddanej utlenianiu. Utlenianie jest przeprowadzane w temperaturze 0 oC z użyciem mieszaniny kwasu nadmrówkowego i fenolu. Nadmiar odczynnika utleniającego jest rozkładany z użyciem dwusiarczku sodu. Utleniona albo niepoddana utlenianiu próbka jest hydrolizowana kwasem chlorowodorowym (3.20) przez 23 godziny. Hydrolizat jest dostosowany do pH 2,20. Aminokwasy są oddzielane w drodze chromatografii jonowymiennej i oznaczane na drodze reakcji z ninhydryną, przez fotometryczną detekcję przy 570 nm (440 nm w przypadku proliny). 3. Odczynniki i roztwory Należy stosować wodę podwójnie destylowaną lub podobnej jakości (przewodność < 10 μS). 3.1. Nadtlenek wodoru, w (w/w) = 30 %. 3.2. Kwas mrówkowy, w (w/w) = 98–100 %. 3.3. Fenol. 3.4. Dwusiarczyn sodu. 3.5. Wodorotlenek sodu. 3.6. Kwas 5-sulfosalicylowy dwuhydrat. 3.7. Kwas chlorowodorowy, gęstość około 1,18 g/ml. 3.8. Cytrynian trisodu, dwuhydrat. 3.9. 2,2' tiodwuetanol (tiodwuglikol). 3.10. Chlorek sodu. 3.11. Ninhydryna. 3.12. Eter naftowy o temperaturze wrzenia 40–60 oC. 3.13. Norleucyna lub inny związek odpowiedni do stosowania jako wzorzec wewnętrzny. 3.14. Azot gazowy (< 10 ppm tlenu). 3.15. 1-oktanol. 3.16. Aminokwasy. 3.16.1. Substancje wzorcowe określone w pkt 1. Czyste związki, niezawierające wody krystalizacyjnej. Suszyć w warunkach próżni w obecności P2O5 lub H2SO4 przez tydzień przed użyciem. 3.16.2. Kwas cysteinowy. 3.16.3. Sulfon metioniny. 3.17. Roztwór wodorotlenku sodu, c = 7,5 mol/l: Rozpuścić 300 g NaOH (3.5) w wodzie i uzupełnić kolbę do objętości 1 l wodą. 3.18. Roztwór wodorotlenku sodu, c = 1 mol/l: Rozpuścić 40 g NaOH (3.5) w wodzie i uzupełnić kolbę do objętości 1 l wodą. 3.19. Roztwór kwasu mrówkowego i fenolu: Zmieszać 889 g kwasu mrówkowego (3.2) z 111 g wody i dodać 4,73 g fenolu (3.3). 3.20. Mieszanina hydrolizująca, c = 6 mol HCl/l, zawierająca 1 g fenolu/l: Dodać 1 g fenolu (3.3) do 492 ml HCl (3.7) i uzupełnić kolbę do objętości 1 l wodą. 3.21. Mieszanina ekstrakcyjna, c = 0,1 mol HCl/l, zawierająca 2 % tiodwuglikolu: Pobrać 8,2 ml HCl (3.7), rozpuścić w około 900 ml wody, dodać 20 ml tiodwuglikolu (3.9) i uzupełnić kolbę do objętości 1 l wodą (nie mieszać bezpośrednio odczynników określonych w pkt 3.7 i 3.9.). 3.22. Kwas 5-sulfosalicylowy, ß = 6 %: Rozpuścić 60 g kwasu 5-sulfosalicylowego (3.6) w wodzie i uzupełnić kolbę do objętości 1 l wodą. 3.23. Mieszanina utleniająca (kwas nadmrówkowy – fenol): Zmieszać w małej zlewce 0,5 ml nadtlenku wodoru (3.1) z 4,5 ml roztworu kwasu mrówkowego i fenolu (3.19). Inkubować w temperaturze od 20 do 30 oC przez godzinę w celu utworzenia kwasu nadmrówkowego, następnie schłodzić w lodowej łaźni wodnej (15 minut) przed dodaniem tej mieszaniny do próbki. Uwaga: Unikać kontaktu ze skórą i nosić odzież ochronną. 3.24. Bufor cytrynianowy, c = 0,2 mol Na+/l, pH 2,20: Rozpuścić 19,61 g cytrynianu trisodu (3.8), 5 ml tiodwuglikolu (3.9), 1 g fenolu (3.3) i 16,50 ml HCl (3.7) w około 800 ml wody. Dostosować pH do 2,20. Uzupełnić do objętości 1 l wodą. 3.25. Bufor wymywający, przygotowany zgodnie z warunkami stosowanego analizatora (4.9). 3.26. Odczynnik ninhydrynowy, przygotowany zgodnie z warunkami stosowanego analizatora (4.9). 3.27. Wzorcowe roztwory aminokwasów. Roztwory te należy przechowywać w temperaturze niższej niż 5 oC. 3.27.1. Podstawowy wzorcowy roztwór aminokwasów (3.16.1). Każdy o stężeniu c = 2,5 μmol/ml, w kwasie chlorowodorowym. Mogą być otrzymane w handlu. 3.27.2. Podstawowe wzorcowe roztwory kwasu cysteinowego i sulfonu metioniny, c = 1,25 μmol/ml. Rozpuścić 0,2115 g kwasu cysteinowego (3.16.2) i 0,2265 g sulfonu metioniny (3.16.3) w buforze cytrynianowym (3.24) w kolbie miarowej o pojemności 1 l i uzupełnić do pełnej objętości kolby buforem cytrynianowym. Przechowywać w temperaturze niższej niż 5 oC nie dłużej niż przez 12 miesięcy. Roztworu nie stosuje się, jeżeli podstawowy wzorcowy roztwór (3.27.1) zawiera kwas cysteinowy i sulfon metioniny. 3.27.3. Podstawowy wzorcowy roztwór wzorca wewnętrznego, proponuje się zastosować norleucynę, c = 20 μmol/ml. Rozpuścić 0,6560 g norleucyny (3.13) w buforze cytrynianowym (3.24) w kolbie miarowej i uzupełnić kolbę do objętości 250 ml buforem cytrynianowym. Przechowywać w temperaturze niższej niż 5 oC nie dłużej niż przez 6 miesięcy. 3.27.4. Kalibracyjny roztwór wzorca aminokwasów do użycia z hydrolizatami, c = 5 nmol/50 μl kwasu cysteinowego i sulfonu metioniny i c = 10 nmol/50 μl innych aminokwasów. Rozpuścić 2,2 g chlorku sodu (3.10) w zlewce o pojemności 100 ml z 30 ml buforu cytrynianowego (3.24). Dodać 4,0 ml podstawowego roztworu wzorcowego aminokwasów (3.27.1), 4,0 ml podstawowego roztworu wzorcowego kwasu cysteinowego i sulfonu metioniny (3.27.2) i, jeżeli jest stosowany, 0,5 ml podstawowego wzorcowego roztworu wzorca wewnętrznego (3.27.3). Dostosować pH do 2,20 z użyciem roztworu wodorotlenku sodu (3.18). Przenieść ilościowo do kolby miarowej o pojemności 50 ml, uzupełnić do pełnej objętości kolby buforem cytrynianowym (3.24) i zmieszać. Przechowywać w temperaturze niższej niż 5 oC nie dłużej niż przez 3 miesiące. Zob. również objaśnienia pkt 9.1. 3.27.5. Kalibracyjny roztwór wzorca aminokwasów do stosowania z hydrolizatami przygotowanymi w sposób określony w pkt 5.3.3.1 i do użycia z ekstraktami (5.2). Roztwór kalibracyjny przygotowuje się w sposób określony w pkt 3.27.4, z pominięciem chlorku sodu. Przechowywać w temperaturze niższej niż 5 oC nie dłużej niż przez 3 miesiące. 4. Aparatura i sprzęt 4.1. Kolba okrągłodenna o pojemności 100 lub 250 ml z chłodnicą zwrotną. 4.2. Butelka ze szkła borokrzemowego o pojemności 100 ml z nakrętką pokrytą gumą/teflonem (np. Duran, Schott) do stosowania w suszarce. 4.3. Suszarka z silnym nawiewem i możliwością regulacji temperatury z dokładnością większą niż ±2 oC. 4.4. Pehametr (dokładność do trzech miejsc po przecinku). 4.5. Filtr membranowy (0,22 μm). 4.6. Wirówka. 4.7. Obrotowa wyparka próżniowa. 4.8. Mechaniczna wytrząsarka lub mieszadło magnetyczne. 4.9. Analizator aminokwasów lub wyposażenie do HPLC z kolumną jonowymienną, przystawką do ninhydryny, postkolumnową derywatyzacją i detektorem fotometrycznym. Kolumna jest wypełniona sulfonowaną żywicą polistyrenową mającą zdolność rozdziału aminokwasów od siebie i od innych składników reagujących z ninhydryną. Przepływ buforu i ninhydryny jest przeprowadzany przez pompy o stabilności przepływu ±0,5 % w czasie testowania kalibracyjnych roztworów, jak i analizy próbek. W niektórych analizatorach aminokwasów mogą być stosowane metody hydrolizy, w których hydrolizat zawiera stężenie sodu c = 0,8 mol/l i całą pozostałość kwasu mrówkowego z etapu utleniania. Inne analizatory nie dają zadowalającego rozdziału niektórych aminokwasów, jeżeli hydrolizat zawiera nadmiar kwasu mrówkowego lub wysokie stężenie jonów sodowych. W tym przypadku objętość kwasu jest zmniejszana przez odparowanie do objętości około 5 ml, które wykonuje się po hydrolizie i przed dostosowaniem pH. Odparowywanie należy prowadzić w warunkach próżni w temperaturze nie wyższej niż 40 oC. 5. Sposób postępowania 5.1. Przygotowanie próbki Rozdrobnić próbkę, tak aby przesiewała się przez oczka sita o średnicy 0,5 mm. Próbki o dużej zawartości wilgotności przed rozdrobnieniem należy wysuszyć albo suchym powietrzem o temperaturze nieprzekraczającej 50 oC, albo przez zamrożenie. Próbki o wysokiej zawartości tłuszczu przed rozdrobnieniem należy poddać ekstrakcji eterem naftowym (3.12). 5.2. Oznaczanie wolnych aminokwasów w paszach i premiksach Odważyć, z dokładnością do 0,2 mg, odpowiednią ilość (1–5 g) próbki przygotowanej w sposób określony w pkt 5.1 do kolby stożkowej i dodać 100 ml mieszaniny ekstrakcyjnej (3.21). Wstrząsać mieszaninę przez 60 minut, używając mechanicznej wytrząsarki lub mieszadła magnetycznego (4.8). Odstawić do sedymentacji osadu i pobrać pipetą 10 ml supernatantu roztworu do zlewki o objętości 100 ml. Dodać, mieszając, 5,0 ml roztworu kwasu sulfosalicylowego (3.22) i kontynuować mieszanie z użyciem mieszadła magnetycznego przez 5 minut. Przefiltrować lub odwirować supernatant w celu usunięcia osadu. Umieścić 10,0 ml otrzymanego roztworu w zlewce o objętości 100 ml, dostosować pH do 2,20 z użyciem roztworu wodorotlenku sodu (3.18), przenieść do wolumetrycznej kolby o odpowiedniej pojemności, z użyciem buforu cytrynianowego (3.24) i uzupełnić roztworem buforu cytrynianowego do pełnej objętości tej kolby (3.24). Jeżeli jest stosowany wzorzec wewnętrzny, dodać 1,00 ml podstawowego wzorcowego roztworu wzorca wewnętrznego (3.27.3) na każde 100 ml końcowego roztworu i uzupełnić roztworem buforu cytrynianowego (3.24) do pełnej objętości kolby. Przeprowadzić rozdział chromatograficzny w sposób określony w pkt 5.4. Jeżeli ekstrakty nie będą oznaczane tego samego dnia, należy przechowywać je w temperaturze niższej niż 5 oC. 5.3. Oznaczanie całkowitej zawartości aminokwasów 5.3.1. Utlenianie Odważyć, z dokładnością do 0,2 mg, od 0,1 do 1 g próbki przygotowanej w sposób określony w pkt 5.1 do: — kolby okrągłodennej o pojemności 100 ml (4.1) do hydrolizy otwartej (5.3.2.3), lub — kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml (4.1), jeżeli wymagane jest niskie stężenie sodu (5.3.3.1), lub — butelki o pojemności 100 ml z nakrętką (4.2), w przypadku hydrolizy zamkniętej (5.3.2.4). Odważona próbka musi zawierać około 10 mg azotu, a poziom wilgotności nie może przekraczać 100 mg. Umieścić kolbę lub butelkę w lodowej łaźni wodnej i oziębić do temperatury 0 oC, dodać 5 ml mieszaniny utleniającej (3.23) i zamieszać, używając szklanej bagietki z wygiętym końcem. Uszczelnić kolbę/butelkę wraz z bagietką, stosując hermetyczny film, umieścić wraz z lodową łaźnią wodną w lodówce o temperaturze 0 oC i pozostawić na 16 godzin. Po 16 godzinach wyjąć z lodówki i rozłożyć nadmiar odczynnika utleniającego przez dodanie 0,84 g dwusiarczynu sodu (3.4). Następnie postępować w sposób określony w pkt 5.3.2.1. 5.3.2. Hydroliza 5.3.2.1. Hydroliza próbek utlenionych Do utlenionej próbki, przygotowanej w sposób określony w pkt 5.3.1, dodać 25 ml mieszaniny hydrolizującej (3.20), zwracając uwagę, aby zmyć pozostałości próbki przywierające do bocznych ścianek naczynia i bagietki. W zależności od sposobu przeprowadzonej hydrolizy postępować w sposób określony w pkt 5.3.2.3 lub 5.3.2.4. 5.3.2.2. Hydroliza próbek nieutlenionych Odważyć, z dokładnością do 0,2 mg, od 0,1 do 1 g próbki przygotowanej w sposób określony w pkt 5.1 do kolby okrągłodennej o pojemności 100 lub 250 ml (4.1) lub do butelki o pojemności 100 ml z nakrętką (4.2). Odważona próbka musi zawierać około 10 mg azotu. Ostrożnie dodać 25 ml mieszaniny hydrolizującej (3.20) i zmieszać z próbką. Następnie postępować w sposób określony w pkt 5.3.2.3 lub 5.3.2.4. 5.3.2.3. Hydroliza otwarta Do kolby z mieszaniną, przygotowaną w sposób określony w pkt 5.3.2.1 lub 5.3.2.2, dodać 3 szklane perełki i gotować, utrzymując stan wrzenia ze zwrotem skroplin przez 23 godziny. Po zakończonej hydrolizie przemyć chłodnicę od dołu 5 ml buforu cytrynianowego (3.24). Odłączyć kolbę i schłodzić w łaźni lodowej. Następnie postępować w sposób określony w pkt 5.3.3. 5.3.2.4. Hydroliza zamknięta Umieścić butelkę zawierającą mieszaninę, przygotowaną w sposób określony w pkt 5.3.2.1 lub 5.3.2.2, w suszarce (4.3) w temperaturze 110 oC. W czasie 1 godziny hydrolizy, aby uniknąć gwałtownego wzrostu ciśnienia w wyniku powstawania substancji gazowych i wybuchu, umieścić nakrętkę na naczyniu. Nie zamykać naczynia korkiem. Po godzinie dokręcić nakrętkę i pozostawić w suszarce (4.3) przez 23 godziny. Po zakończeniu hydrolizy wyjąć butelkę z suszarki, ostrożnie odkręcić nakrętkę i umieścić butelkę w lodowej łaźni wodnej. Pozostawić do schłodzenia. W zależności od sposobu dostosowania pH (5.3.3) przenieść ilościowo zawartość butelki do zlewki lub kolby okrągłodennej o pojemności 250 ml, stosując bufor cytrynianowy (3.24). Następnie postępować w sposób określony w pkt 5.3.3. 5.3.3. Dostosowanie pH W zależności od tolerancji analizatora aminokwasów (4.9) na sód pH dostosowuje się w sposób określony w pkt 5.3.3.1 lub 5.3.3.2. 5.3.3.1. Dla systemów chromatograficznych (4.9) wymagających niskiego stężenia sodu Wskazane jest zastosowanie podstawowego wzorcowego roztworu wzorca wewnętrznego (3.27.3), gdy analizatory aminokwasów wymagają niskiego stężenia sodu, w przypadku gdy należy zredukować objętość kwasu. W tym przypadku dodać 2,00 ml podstawowego roztworu wzorca wewnętrznego (3.27.3) do hydrolizatu przed odparowaniem. Dodać 2 krople 1-oktanolu (3.15) do hydrolizatu otrzymanego w sposób określony w pkt 5.3.2.3 lub 5.3.2.4. Stosując obrotową wyparkę próżniową (4.7) zmniejszyć w warunkach próżni i w temperaturze 40 oC objętość do 5–10 ml. Jeżeli objętość roztworu zostanie przypadkowo zredukowana poniżej 5 ml, hydrolizat należy wyrzucić i powtórzyć analizę. Dostosować pH do 2,20 z użyciem roztworu wodorotlenku sodu (3.18) i postępować w sposób określony w pkt 5.3.4. 5.3.3.2. Dla pozostałych analizatorów aminokwasów (4.9) Pobrać hydrolizaty otrzymane w sposób określony w pkt 5.3.2.3 lub 5.3.2.4 i częściowo je zneutralizować poprzez mieszanie, ostrożnie dodając 17 ml roztworu wodorotlenku sodu (3.17), zwracając uwagę, aby temperatura roztworu nie była wyższa niż 40 oC. Dostosować pH do 2,20 w temperaturze pokojowej, dodając roztwór wodorotlenku sodu (3.17), a pod koniec roztwór wodorotlenku sodu (3.18). Następnie postępować w sposób określony w pkt 5.3.4. 5.3.4. Roztwór próbki do analizy chromatograficznej Przenieść ilościowo hydrolizaty o dostosowanym pH (5.3.3.1 lub 5.3.3.2) z użyciem buforu cytrynianowego (3.24) do kolby miarowej o pojemności 200 ml i uzupełnić do pełnej objętości kolby buforem cytrynianowym (3.24). Jeżeli wcześniej nie dodawano wzorca wewnętrznego, dodać 2,00 ml podstawowego wzorcowego roztworu wzorca wewnętrznego (3.27.3) i uzupełnić buforem cytrynianowym (3.24) do pełnej objętości kolby. Dokładnie zmieszać. Przejść do analizy chromatograficznej (5.4). Jeżeli roztwory próbek nie będą analizowane tego samego dnia, należy przechowywać je w temperaturze niższej niż 5 oC. 5.4. Chromatografia Przed analizą chromatograficzną doprowadzić ekstrakt (5.2) lub hydrolizat (5.3.4) do temperatury pokojowej. Wstrząsnąć mieszaniną i przefiltrować jej odpowiednią ilość przez filtr membranowy 0,22 μm (4.5). Otrzymany klarowny roztwór jest poddawany chromatografii jonowymiennej przy wykorzystaniu analizatora aminokwasów (4.9). Dozowanie wykonuje się ręcznie lub automatycznie. Ważne jest, aby na kolumnę nanieść takie same ilości roztworów z dokładnością ±0,5 % zarówno w przypadku analizy wzorców, jak i badanych próbek, z wyjątkiem gdy jest stosowany wzorzec wewnętrzny, oraz aby stosunek sodu do aminokwasu w roztworze badanej próbki był jak najbardziej zbliżony do tego w roztworze wzorcowym. Zasadniczo częstość przeprowadzania kalibracji zależy od stabilności odczynnika ninhydrynowego i od systemu analitycznego. Wzorzec lub próbka są wymywane buforem cytrynianowym (3.24), tak aby powierzchnia piku wzorca odpowiadała od 30 do 200 % powierzchni piku badanej próbki aminokwasu. Analiza chromatograficzna aminokwasów będzie różnić się nieznacznie w zależności od typu stosowanego analizatora i żywicy. Wybrany system musi mieć zdolność oddzielenia od siebie aminokwasów oraz od innych substancji dających z ninhydryną reakcje. W badanym zakresie stosowany system chromatograficzny musi dawać liniową odpowiedź na zmiany ilości aminokwasów dodawanych na kolumnę. W czasie analizy chromatograficznej opisany poniżej stosunek doliny do wysokości piku odnosi się do przypadku, gdy jest analizowany równomolowy roztwór oznaczanego aminokwasu. Równomolowy roztwór aminokwasu musi zawierać co najmniej 30 % maksymalnej zawartości każdego aminokwasu, który można aktualnie oznaczyć z użyciem danego analizatora aminokwasów (4.9). Dla oddzielenia treoniny od seryny stosunek doliny do wysokości piku niższego z pokrywających się aminokwasów na chromatografie nie może przekraczać 2:10, w przypadku gdy oznaczane są tylko cystyna (cysteina), metionina, treonina i lizyna, niewystarczające oddzielenie od sprzężonych pików będzie ujemnie wpływało na oznaczenie. Dla wszystkich innych aminokwasów rozdział musi być lepszy niż 1:10. System musi zapewniać oddzielenie lizyny od „artefaktów lizyny” i od ornityny. 6. Obliczanie wyników Powierzchnię pików próbki i wzorca mierzy się dla każdego pojedynczego aminokwasu i obliczana jest zawartość aminokwasu (X) w g/kg próbki. Jeżeli jest stosowany wzorzec wewnętrzny, wyrażenie należy pomnożyć przez: gdzie: A = powierzchnia piku hydrolizatu lub ekstraktu B = powierzchnia piku wzorcowego roztworu kalibracyjnego C = powierzchnia piku wzorca wewnętrznego w hydrolizacie lub ekstrakcie D = powierzchnia piku wzorca wewnętrznego w roztworze wzorcowym kalibracyjnym M = masa cząsteczkowa oznaczanego aminokwasu c = stężenie wzorca w μmol/ml m = masa próbki w g przeliczona na masę oryginalnej próbki w przypadku odtłuszczania lub podsuszania V = hydrolizat ogółem w ml (5.3.4) lub obliczona ogólna objętość w ml rozcieńczonego ekstraktu (6.1) Cystyna i cysteina są oznaczane jako kwas cysteinowy w hydrolizatach utlenionej próbki, ale są obliczane jak cystyna (C6H12N2O4S2, M 240,30 g/mol), stosując M 120,15 g/mol (= 0,5 × 240,30 g/mol). Metionina jest oznaczana jako sulfon metioniny w hydrolizatach utlenionej próbki, ale jest obliczana jak metionina, stosując M metioniny: 149,21 g/mol. Dodana wolna metionina jest oznaczana po ekstrakcji jako metionina, przy czym dla obliczeń stosowana jest taka sama wartość M. 6.1. Ogólną objętość rozcieńczonych ekstraktów (F) w przypadku oznaczania zawartości wolnych aminokwasów (5.2) obliczyć według następującego wzoru: V = objętość końcowego 7. Ocena metody Międzynarodowe badania porównawcze metody były przeprowadzone w 1990 r. z użyciem czterech pasz (mieszanki paszowej dla świń, mieszanki paszowej dla brojlerów, koncentratu białkowego i premiksu). Po odrzuceniu wyników odbiegających, średnie wyniki i odchylenia standardowe są przedstawione w tabelach zawartych w niniejszym punkcie: Średnie wielkości w g/kg Materiał badany Aminokwas Treonina Cystyna/cysteina Metionina Lizyna Mieszanka paszowa dla świń 6,94 n = 15 3,01 n = 17 3,27 n = 17 9,55 n = 13 Mieszanka paszowa dla brojlerów 9,31 n = 16 3,92 n = 18 5,08 n = 18 13,93 n = 16 Koncentrat białkowy 22,32 n = 16 5,06 n = 17 12,01 n = 17 47,74 n = 15 Premiks 58,42 n = 16 — 90,21 n = 16 98,03 n = 16 n = liczba uczestniczących laboratoriów. 7.1. Powtarzalność Powtarzalność wyrażona jako „odchylenie standardowe wewnątrz laboratorium” omawianego powyżej porównawczego badania jest przedstawiona w poniższych tabelach: Odchylenie standardowe wewnątrz laboratorium (Sr) w g/kg Materiał badany Aminokwas Treonina Cystyna/cysteina Metionina Lizyna Mieszanka paszowa dla świń 0,13 n = 15 0,10 n = 17 0,11 n = 17 0,26 n = 13 Mieszanka paszowa dla brojlerów 0,20 n = 16 0,11 n = 18 0,16 n = 18 0,28 n = 16 Koncentrat białkowy 0,48 n = 16 0,13 n = 17 0,27 n = 17 0,99 n = 15 Premiks 1,30 n = 16 — 2,19 n = 16 2,06 n = 16 n = liczba uczestniczących laboratoriów.

Współczynnik zmienności (%) dla odchylenia standardowego wewnątrz laboratorium (Sr) Materiał badany Aminokwas Treonina Cystyna/cysteina Metionina Lizyna Mieszanka paszowa dla świń 1,9 n = 15 3,3 n = 17 3,4 n = 17 2,8 n = 13 Mieszanka paszowa dla brojlerów 2,1 n = 16 2,8 n = 18 3,1 n = 18 2,1 n = 16 Koncentrat białkowy 2,7 n = 16 2,6 n = 17 2,2 n = 17 2,4 n = 15 Premiks 2,2 n = 16 — 2,4 n = 16 2,1 n = 16 n = liczba uczestniczących laboratoriów. 7.2. Odtwarzalność Wyniki odchylenia standardowego między laboratoriami otrzymane w wyniku przeprowadzenia omawianego powyżej porównawczego badania są przedstawione w poniższej tabeli: Odchylenie standardowe między laboratoriami (SR) w g/kg Materiał badany Aminokwas Treonina Cystyna/cysteina Metionina Lizyna Mieszanka paszowa dla świń 0,28 n = 15 0,30 n = 17 0,23 n = 17 0,30 n = 13 Mieszanka paszowa dla brojlerów 0,48 n = 16 0,34 n = 18 0,55 n = 18 0,75 n = 16 Koncentrat białkowy 0,85 n = 16 0,62 n = 17 1,57 n = 17 1,24 n = 15 Premiks 2,49 n = 16 — 6,20 n = 16 6,62 n = 16 n = liczba uczestniczących laboratoriów.

Współczynnik zmienności (%) dla odchylenia standardowego między laboratoriami (SR) Materiał badany Aminokwas Treonina Cystyna/cysteina Metionina Lizyna Mieszanka paszowa dla świń 4,1 n = 15 9,9 n = 17 7,0 n = 17 3,2 n = 13 Mieszanka paszowa dla brojlerów 5,2 n = 16 8,8 n = 18 10,9 n = 18 5,4 n = 16 Koncentrat białkowy 3,8 n = 16 12,3 n = 17 13,0 n = 17 3,0 n = 15 Premiks 4,3 n = 16 — 6,9 n = 16 6,7 n = 16 n = liczba uczestniczących laboratoriów. 8. Stosowanie materiałów odwoławczych Prawidłowe stosowanie metody należy weryfikować przez wykonywanie powtarzalnych oznaczeń certyfikowanych materiałów odwoławczych, jeżeli takie są dostępne. Zalecana jest także kalibracja z zastosowaniem certyfikowanych kalibracyjnych roztworów aminokwasów. 9. Objaśnienia 9.1. Z powodu różnic pomiędzy analizatorami aminokwasów końcowe stężenia kalibracyjnych roztworów aminokwasów wzorcowych (zob. 3.27.4 i 3.27.5) oraz hydrolizatu (zob. 5.3.4) należy traktować jako przykładowe. Zakres liniowej odpowiedzi aparatu należy sprawdzić dla wszystkich aminokwasów. Roztwór wzorcowy jest rozcieńczany buforem cytrynianowym, tak aby otrzymać powierzchnię piku o średnim zasięgu. 9.2. Jeżeli do analizy produktów hydrolizy jest wykorzystywany wysoko sprawny chromatograf cieczowy, należy zoptymalizować warunki doświadczalne analizy zgodnie z zaleceniami producenta. 9.3. Przy stosowaniu tej metody do pasz zawierających więcej niż 1 % chlorków (koncentraty, mieszanki mineralne, mieszanki paszowe uzupełniające) wyniki oznaczania metioniny mogą być zaniżone i należy stosować specjalne postępowanie. G. OZNACZANIE TRYPTOFANU 1. Cel i zakres stosowania metody Metoda służy do oznaczania zawartości całkowitego i wolnego tryptofanu w paszach. Metoda nie wyróżnia form D i L. 2. Sposób przeprowadzenia metody W celu oznaczenia całkowitego tryptofanu próbka jest hydrolizowana w środowisku zasadowym z użyciem nasyconego roztworu wodorotlenku baru i ogrzewana do 110 oC przez 20 godzin. Po hydrolizie dodawany jest wzorzec wewnętrzny. W celu oznaczenia wolnego tryptofanu próbka jest ekstrahowana w warunkach lekko kwaśnych w obecności wzorca wewnętrznego. Tryptofan i wzorzec wewnętrzny w hydrolizacie lub w ekstrakcie jest oznaczony metodą HPLC z detekcją fluorescencyjną. 3. Odczynniki i roztwory 3.1. Należy stosować wodę podwójnie destylowaną lub o porównywalnej jakości (przewodnictwo < 10 μS/cm). 3.2. Substancja wzorcowa: tryptofan (czystość/zawartość ≥ 99 %) suszony w próżni nad pięciotlenkiem fosforu. 3.3. Substancja wzorcowa wewnętrzna: α-metylo-tryptofan (czystość/zawartość ≥ 99 %) suszony w próżni nad pięciotlenkiem fosforu. 3.4. Wodorotlenek baru, oktahydrat (należy uważać, aby nie wystawiać Ba(OH)2 · 8H2O na nadmierne działanie powietrza, aby uniknąć tworzenia się BaCO3, który mógłby utrudniać oznaczenie) (zob. objaśnienia pkt 9.3). 3.5. Wodorotlenek sodu. 3.6. Kwas ortofosforowy, w (w/w) = 85 %. 3.7. Kwas chlorowodorowy, ρ20 = 1,19 g/ml. 3.8. Metanol do HPLC. 3.9. Eter naftowy o temperaturze wrzenia od 40 do 60 oC. 3.10. Roztwór wodorotlenku sodu, c = 1 mol/l: Rozpuścić 40,0 g NaOH (3.5) w wodzie i uzupełnić do objętości 1 l wodą (3.1). 3.11. Kwas chlorowodorowy, c = 6 mol/l: Odmierzyć 492 ml HCl (3.7) i uzupełnić do objętości 1 l wodą. 3.12. Kwas chlorowodorowy, c = 1 mol/l: Odmierzyć 82 ml HCl (3.7) i uzupełnić do objętości 1 l wodą. 3.13. Kwas chlorowodorowy, c = 0,1 mol/l: Odmierzyć 8,2 ml HCl (3.7) i uzupełnić do objętości 1 l wodą. 3.14. Kwas ortofosforowy, c = 0,5 mol/l: Odmierzyć 34 ml kwasu ortofosforowego (3.6) i uzupełnić do objętości 1 l wodą (3.1). 3.15. Stężony roztwór tryptofanu (3.2), c = 2,50 μmol/ml: W kolbie miarowej o pojemności 500 ml rozpuścić 0,2553 g tryptofanu (3.2) w kwasie chlorowodorowym (3.13) i uzupełnić do pełnej objętości kolby kwasem chlorowodorowym (3.13). Przechowywać w temperaturze - 18 oC nie dłużej niż przez 4 tygodnie. 3.16. Stężony roztwór wzorca wewnętrznego, c = 2,50 μmol/ml: W kolbie miarowej o pojemności 500 ml rozpuścić 0,2728 g α-metylo-tryptofanu (3.3) w kwasie chlorowodorowym (3.13) i uzupełnić do pełnej objętości kolby kwasem chlorowodorowym (3.13). Przechowywać w temperaturze - 18 oC nie dłużej niż przez 4 tygodnie. 3.17. Kalibracyjny roztwór wzorcowy tryptofanu i wzorca wewnętrznego: Odmierzyć 2,00 ml stężonego roztworu tryptofanu (3.15) i 2,00 ml stężonego roztworu wzorca wewnętrznego (α-metylo-tryptofanu) (3.16). Rozcieńczyć wodą (3.1) i metanolem (3.8) w przybliżeniu do tej samej objętości i tego samego stężenia metanolu (10–30 %) jak w końcowym hydrolizacie. Roztwór należy przygotować bezpośrednio przed użyciem. Chronić przed bezpośrednim działaniem światła podczas przygotowywania. 3.18. Kwas octowy. 3.19. 1,1,1-trichloro-2-metylo-2-propanol. 3.20. Etanoloamina w (w/w) > 98 %. 3.21. Roztwór 1 g 1,1,1-trichloro-2-metylo-2-propanolu (3.19) w 100 ml metanolu (3.8). 3.22. Faza ruchoma do HPLC: 3,00 g kwasu octowego (3.18) + 900 ml wody (3.1) +50,0 ml roztworu (3.21) 1,1,1-trichloro-2-metylo-2-propanolu (3.19) w metanolu (3.8) (1 g/100 ml). Dostosować pH do 5,00, stosując etanoloaminę (3.20). Uzupełnić do objętości 1 000 ml wodą (3.1). 4. Aparatura i sprzęt 4.1. Wyposażenie HPLC z detektorem spektrofluorometrycznym. 4.2. Kolumna do chromatografii cieczowej, 125 mm × 4 mm, C18, wypełnienie 3 μm lub równoważne. 4.3. Pehametr. 4.4. Kolba propylenowa o pojemności 125 ml, z szeroką szyjką i nakrętką. 4.5. Filtr membranowy, 0,45 μm. 4.6. Autoklaw, 110 (±2) oC, 1,4 (±0,1) bar. 4.7. Wstrząsarka mechaniczna lub mieszadło magnetyczne. 4.8. Mieszadło Vortex. 5. Sposób postępowania 5.1. Przygotowanie próbek Rozdrobnić próbkę tak, aby przesiewała się przez oczka sita o średnicy 0,5 mm. Próbki o dużej zawartości wilgotności przed rozdrobnieniem wysuszyć albo na powietrzu w temperaturze nieprzekraczającej 50 oC, albo przez wymrażanie. Próbki o wysokiej zawartości tłuszczu przed rozdrobnieniem należy poddać ekstrakcji eterem naftowym (3.9). 5.2. Oznaczanie wolnego tryptofanu (ekstrakt) Odważyć, z dokładnością do 1 mg, odpowiednią ilość (1–5 g) próbki przygotowanej w sposób określony w 5.1 do kolby stożkowej. Dodać 100,0 ml kwasu chlorowodorowego (3.13) i 5,00 ml stężonego roztworu wzorca wewnętrznego (3.16). Wstrząsać lub mieszać przez 60 minut z użyciem wstrząsarki mechanicznej lub mieszadła magnetycznego (4.7). Pozostawić do oddzielenia się osadu i przenieść pipetą 10,0 ml supernatantu roztworu do zlewki. Dodać 5 ml kwasu ortofosforowego (3.14). Dostosować pH do 3 z użyciem roztworu wodorotlenku sodu (3.10). Dodać odpowiednią ilość metanolu (3.8), aby uzyskać stężenie od 10 do 30 % metanolu w końcowej objętości. Przenieść do kolby miarowej o odpowiedniej pojemności i rozcieńczyć wodą do objętości właściwej dla chromatografii (objętość zbliżona do objętości kalibracyjnego roztworu wzorcowego (3.17)). Przefiltrować kilka ml roztworu przez filtr membranowy 0,45 μm (4.5) przed dozowaniem na kolumnę HPLC. Przeprowadzić chromatografię w sposób określony w pkt 5.4. Roztwór wzorcowy i ekstrakty chronić przed bezpośrednim działaniem światła słonecznego. Jeżeli jest niemożliwe dokonanie analizy ekstraktów tego samego dnia, ekstrakty można przechowywać w temperaturze 5 oC nie dłużej niż przez 3 dni. 5.3. Oznaczanie całkowitego tryptofanu (hydrolizat) Odważyć, z dokładnością do 0,2 mg, od 0,1 do 1 g próbki przygotowanej w sposób określony w pkt 5.1 do kolby propylenowej (4.4). Odważona próbka musi zawierać około 10 mg azotu. Dodać 8,4 g oktahydratu wodorotlenku baru (3.4) i 10 ml wody. Mieszać z użyciem mieszadła Vortex (4.8) lub mieszadła magnetycznego (4.7). Pozostawić osłonięty teflonem magnes w mieszaninie. Spłukać ściany naczynia z użyciem 4 ml wody. Nałożyć nakrętkę i zamknąć luźno naczynie. Przenieść kolbę do autoklawu (4.6) z wrzącą wodą i parą i utrzymywać ją w czasie od 30 do 60 minut. Zamknąć autoklaw i autoklawować w temperaturze 110 oC (±2) oC przez 20 godzin. Przed otwarciem autoklawu obniżyć temperaturę nieco poniżej 100 oC. W celu uniknięcia krystalizacji Ba(OH)2 · 8H2O dodać do ciepłej mieszaniny 30 ml wody o temperaturze pokojowej. Łagodnie wstrząsać lub mieszać. Dodać 2,00 ml stężonego roztworu wzorca wewnętrznego (α-metylo-tryptofanu) (3.16). Studzić naczynia w łaźni wodnej lub lodowej przez 15 minut. Następnie dodać 5 ml kwasu ortofosforowego (3.14). Utrzymując naczynie w zimnej łaźni, zobojętnić z użyciem HCl (3.11), mieszając, i dostosować pH do 3,0 z HCl (3.12). Dodać ilość metanolu konieczną do uzyskania stężenia od 10 do 30 % metanolu w końcowej objętości. Przenieść do kolby miarowej o odpowiedniej pojemności i rozcieńczyć wodą do objętości, koniecznej dla chromatografii (np. 100 ml). Dodanie metanolu nie może powodować wytrącania. Przefiltrować kilka ml roztworu przez filtr membranowy 0,45 μm (4.5) przed dozowaniem na kolumnę HPLC. Przeprowadzić chromatografię w sposób określony w 5.4. Roztwór wzorcowy i produkty hydrolizy chronić przed bezpośrednim działaniem światła słonecznego. Jeżeli jest niemożliwe dokonanie analizy produktów hydrolizy tego samego dnia, można je przechowywać w temperaturze 5 oC nie dłużej niż przez 3 dni. 5.4. Oznaczanie HPLC Poniższe parametry izokratycznej elucji są przykładowe. Dopuszczalne jest zastosowanie innych parametrów gwarantujących uzyskanie równoważnych wyników (zob. objaśnienia 9.1 i 9.2): Kolumna do chromatografii cieczowej (4.2): 125 mm × 4 mm, C18, wypełnienie 3 μm lub równoważne Temperatura kolumny: Temperatura pokojowa Faza ruchoma (3.22): 3,00 g kwasu octowego (3.18) + 900 ml wody (3.1) +50,0 ml roztworu (3.21) 1,1,1-trichloro-2-metylo-2-propanolu (3.19) w metanolu (3.8) (1g/100ml). Dostosować pH do 5,00 z użyciem etanoloaminy (3.20). Uzupełnić do objętości 1 l wodą (3.1) Prędkość przepływu: 1 ml/min Całkowity czas analizy chromatograficznej: około 34 minuty Długość fali przy detekcji: wzbudzenie: 280 nm, emisja: 356 nm. Dozowana objętość: 20 μl 6. Obliczanie wyników Zawartość tryptofanu (X) w g na 100 g próbki obliczana jest według poniższego wzoru: A = powierzchnia piku wzorca wewnętrznego, kalibracyjny roztwór wzorcowy (3.17) B = powierzchnia piku tryptofanu, ekstraktu (5.2) lub hydrolizatu (5.3) V1 = objętość w ml (2 ml) stężonego roztworu tryptofanu (3.15) dodanego do roztworu kalibracyjnego (3.17) c = stężenie w μmol/ml (= 2,50) stężonego roztworu tryptofanu (3.15) dodanego do roztworu kalibracyjnego (3.17) V2 = objętość w ml stężonego roztworu wzorca wewnętrznego (3.16) dodanego przy ekstrakcji (5.2) (= 5,00 ml) lub do hydrolizatu (5.3) (= 2,00 ml) C = powierzchnia piku wzorca wewnętrznego, ekstraktu (5.2) lub hydrolizatu (5.3) D = powierzchnia piku tryptofanu, kalibracyjnego roztworu wzorcowego (3.17) V3 = objętość w ml (= 2,00 ml) stężonego roztworu wzorca wewnętrznego (3.16) dodanego do kalibracyjnego roztworu wzorcowego (3.17) m = naważka próbki w g (skorygowana względem masy wyjściowej, jeżeli była podsuszana lub odtłuszczana) M = ciężar cząsteczkowy tryptofanu (= 204,23 g/mol) 7. Powtarzalność Różnica pomiędzy wynikami dwóch równoległych oznaczeń wykonanych dla tej samej próbki nie może przekraczać 10 % względem najwyższego wyniku. 8. Wyniki badań porównawczych We Wspólnocie Europejskiej przeprowadzono badania porównawcze (czwarte porównanie wyników różnych laboratoriów), w których trzy próbki były analizowane przez maksymalnie 12 laboratoriów w celu sprawdzenia metody hydrolizy. Na każdej próbce powtórzono analizy pięciokrotnie. Ich wyniki są przedstawione w poniższej tabeli: Próbka 1 Pasza dla świń Próbka 2 Pasza dla świń uzupełniona L-tryptofanem Próbka 3 Koncentrat paszowy dla świń L 12 12 12 n 50 55 50 Średnia [g/kg] 2,42 3,40 4,22 sr [g/kg] 0,05 0,05 0,08 r [g/kg] 0,14 0,14 0,22 CV r [%] 1,9 1,6 1,9 SR [g/kg] 0,15 0,20 0,09 R [g/kg] 0,42 0,56 0,25 CVR [%] 6,3 6,0 2,2 L = liczba laboratoriów n = liczba pojedynczych zachowanych wyników eliminujących wartości oddalone (według Cochrana, próba wartości oddalonych Dixona) sr = odchylenie standardowe powtarzalności SR = odchylenie standardowe odtwarzalności r = powtarzalność wyników R = odtwarzalność wyników CVr = współczynnik zmienności powtarzalności, w % CVR = współczynnik zmienności odtwarzalności, w % W innym badaniu porównawczym przeprowadzonym we Wspólnocie Europejskiej (trzecie porównanie wyników różnych laboratoriów) dwie próbki były analizowane przez maksymalnie 13 laboratoriów w celu sprawdzenia metody ekstrakcji wolnego tryptofanu. Na każdej próbce powtórzono analizy pięciokrotnie. Ich wyniki są przedstawione w poniższej tabeli: Próbka 4 Mieszanka pszenicy i soi Próbka 5 Mieszanka pszenicy i soi (= próbka 4) z dodatkiem tryptofanu (0,457 g/kg) L 12 12 n 55 60 Średnia [g/kg] 0,391 0,931 sr [g/kg] 0,005 0,012 r [g/kg] 0,014 0,034 CVr [%] 1,34 1,34 SR [g/kg] 0,018 0,048 R [g/kg] 0,050 0,134 CVR [%] 4,71 5,11 L = liczba laboratoriów n = liczba pojedynczych zachowanych wyników eliminujących wartości oddalone (według Cochrana, próba wartości oddalonych Dixona) sr = odchylenie standardowe powtarzalności SR = odchylenie standardowe odtwarzalności r = powtarzalność wyników R = odtwarzalność wyników CVr = współczynnik zmienności powtarzalności, w % CVR = współczynnik zmienności odtwarzalności, w % W kolejnym badaniu porównawczym przeprowadzonym we Wspólnocie Europejskiej cztery próbki były analizowane przez maksymalnie 7 laboratoriów w celu sprawdzenia metody hydrolizy tryptofanu. Na każdej próbce powtórzono analizy pięciokrotnie. Ich wyniki są przedstawione w poniższej tabeli. Próbka 1 Mieszanka paszowa dla świń (CRM 117) Próbka 2 Niskotłuszczowa mączka rybna (CRM 118) Próbka 3 Mączka sojowa (CRM 119) Próbka 4 Odtłuszczone mleko w proszku (CRM 120) L 7 7 7 7 n 25 30 30 30 Średnia [g/kg] 2,064 8,801 6,882 5,236 sr [g/kg] 0,021 0,101 0,089 0,040 r [g/kg] 0,059 0,283 0,249 0,112 CVr [%] 1,04 1,15 1,30 0,76 SR [g/kg] 0,031 0,413 0,283 0,221 R [g/kg] 0,087 1,156 0,792 0,619 CVR [%] 1,48 4,69 4,11 4,22 L = liczba laboratoriów n = liczba pojedynczych zachowanych wyników eliminujących wartości oddalone (według Cochrana, próba wartości oddalonych Dixona) sr = odchylenie standardowe powtarzalności SR = odchylenie standardowe odtwarzalności r = powtarzalność wyników R = odtwarzalność wyników CVr = współczynnik zmienności powtarzalności, w % CVR = współczynnik zmienności odtwarzalności, w % 9. Objaśnienia 9.1. Lepszy rozdział tryptofanu i α-metylo-tryptofanu może nastąpić przy uwzględnieniu następujących parametrów. Izokratyczna elucja po gradientowym czyszczeniu kolumny: Kolumna do chromatografii cieczowej: 125 mm × 4 mm, C18, wypełnienie 5 μm lub równoważne Temperatura kolumny: 32 oC Faza ruchoma: A: 0,01 mol/l KH2PO4/metanol, 95+5 (V+V) B: Metanol Program gradientowy: 0 min 100 % A 0 % B 15 min 100 % A 0 % B 17 min 60 % A 40 % B 19 min 60 % A 40 % B 21 min 100 % A 0 % B 33 min 100 % A 0 % B Prędkość przepływu: 1,2 ml/min Całkowity czas analizy chromatograficznej: około 33 minuty 9.2. Analiza chromatograficzna będzie się zmieniać w zależności od typu HPLC i materiału użytego do wypełnienia kolumny. Wybrany system musi umożliwić uzyskanie oddzielającej linii bazowej pomiędzy tryptofanem i wzorcem wewnętrznym. Ponadto ważne jest, aby produkty degradacji zostały dobrze oddzielone od tryptofanu i wzorca wewnętrznego. Hydrolizaty bez wzorca wewnętrznego należy poddać analizie w celu sprawdzenia linii bazowej stosownie do wzorca wewnętrznego względem zanieczyszczeń. Ważne jest, aby czas analizy był wystarczająco długi dla elucji wszystkich produktów degradacji, w przeciwnym razie ostatnie eluujące piki na chromatogramie mogą zakłócać kolejną analizę. W zakresie badanych stężeń układ chromatograficzny musi zapewniać liniową odpowiedź. Liniową odpowiedź należy mierzyć przy stałym (normalnym) stężeniu wzorca wewnętrznego i zmieniających się stężeniach tryptofanu. Ważne jest, aby wielkość pików tryptofanu i wzorca wewnętrznego zawierała się w liniowym zakresie układu HPLC z detekcją fluorescencyjną. Jeżeli piki tryptofanu lub wzorca wewnętrznego są zbyt małe lub zbyt duże, analizę należy powtórzyć przy zmienionej wielkości próbki lub jej objętości końcowej. 9.3. Wodorotlenek baru Fakt, że wodorotlenek baru z czasem jest coraz trudniejszy do rozpuszczenia, wpływa na nieklarowność roztworu do oznaczania HPLC, która może być przyczyną zaniżania wyników oznaczania tryptofanu. H. OZNACZANIE SUROWEGO OLEJU I TŁUSZCZU 1. Cel i zakres stosowania metody Metoda służy do oznaczania zawartości surowych olejów i tłuszczów w paszach. Nie stosuje się jej do analizy nasion i owoców roślin oleistych. Zastosowanie dwóch sposobów postępowania opisanych poniżej zależy od rodzaju i składu paszy oraz celu prowadzenia analizy. 1.1. Postępowanie A – Bezpośrednio ekstrahowane oleje i tłuszcze Postępowanie ma zastosowanie do materiałów paszowych pochodzenia roślinnego, z wyjątkiem tych, które zostały objęte zakresem postępowania B. 1.2. Postępowanie B – Całkowite surowe oleje i tłuszcze Postępowanie ma zastosowanie do materiałów paszowych pochodzenia zwierzęcego i wszystkich mieszanek paszowych. Jest stosowane do wszystkich materiałów, z których oleje i tłuszcze nie mogą być w całości wyekstrahowane bez uprzedniej hydrolizy (np. gluten, drożdże, białka ziemniaczane i produkty przetworzone np. poprzez ekstruzję, płatkowanie i ogrzewanie). 1.3. Interpretacja wyników We wszystkich przypadkach, w których wynik otrzymany przy zastosowaniu postępowania B jest wyższy od wyniku otrzymanego przy zastosowaniu postępowania A, wynik otrzymany przy zastosowaniu postępowania B należy traktować jako rzeczywisty. 2. Sposób przeprowadzenia metody 2.1. Postępowanie A Próbka jest poddawana ekstrakcji eterem naftowym. Roztwór jest oddestylowany, a pozostałość jest suszona i ważona. 2.2. Postępowanie B Próbka jest ogrzewana kwasem chlorowodorowym. Mieszanina jest oziębiana i filtrowana. Pozostałość jest przemywana i suszona, a następnie poddawana oznaczaniu przy zastosowaniu postępowania A. 3. Odczynniki i roztwory 3.1. Eter naftowy o zakresie temperatur wrzenia od 40 do 60 oC. Wartość bromowa musi być niższa niż 1, a pozostałość po odparowaniu niższa niż 2 mg/100 ml. 3.2. Siarczan sodu bezwodny. 3.3. Kwas chlorowodorowy, c = 3 mol/l. 3.4. Materiał wspomagający filtrację, np. Kieselgur, Hyflo-supercel. 4. Aparatura i sprzęt 4.1. Aparat do ekstrakcji. Jeżeli aparat jest wyposażony w syfon (jak np. aparat Soxhleta), prędkość skraplania musi wynosić około 10 cykli na godzinę. Jeżeli aparat nie ma syfonu, wówczas prędkość skraplania musi wynosić około 10 ml na minutę. 4.2. Gilzy do ekstrakcji, niezawierające substancji rozpuszczalnych w eterze naftowym, o porowatości odpowiadającej wymaganiom określonym w pkt 4.1. 4.3. Suszarka albo suszarka próżniowa, z możliwością ustawienia temperatury suszenia na 75 ± 3 oC, lub suszarka nawiewna z możliwością ustawienia temperatury na 100 ± 3 oC. 5. Sposób postępowania 5.1. Postępowanie A (zob. pkt 8.1) Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 5 g próbki, przenieść do gilzy ekstrakcyjnej (4.2) i przykryć beztłuszczowym zwitkiem waty bawełnianej. Umieścić gilzę w aparacie do ekstrakcji (4.1) i ekstrahować przez sześć godzin eterem naftowym (3.1). Zebrać ekstrakt eterowy do suchej, zważonej kolby zawierającej kawałki pumeksu (2). Oddestylować rozpuszczalnik. Suszyć pozostałość, umieszczając kolbę w suszarce (4.3) na półtorej godziny. Schłodzić w eksykatorze i zważyć. Suszyć ponownie przez 30 minut w celu zapewnienia stałej masy olejów i tłuszczów (ubytek masy między dwoma kolejnymi ważeniami nie może przekraczać 1 mg). 5.2. Postępowanie B Odważyć, z dokładnością do 1 mg, 2,5 g próbki (zob. pkt 8.2), umieścić w zlewce o pojemności 400 ml lub w kolbie stożkowej o pojemności 300 ml i dodać 100 ml kwasu chlorowodorowego (3.3) oraz kawałki pumeksu. Przykryć zlewkę szkiełkiem zegarkowym lub dopasować kolbę stożkową z chłodnicą zwrotną. Doprowadzić mieszaninę do spokojnego wrzenia w małym płomieniu palnika lub na płytce grzewczej i utrzymywać wrzenie przez godzinę. Nie dopuszczać do osadzania się produktu na ścianach naczynia. Schłodzić i dodać materiał wspomagający filtrację (3.4) w ilości zapobiegają