Dyrektywa Komisji 92/95/EWG

z dnia 9 listopada 1992 r.

zmieniająca Załącznik do siódmej dyrektywy Komisji 76/372/EWG ustanawiającej wspólnotowe metody analizy do celów urzędowej kontroli pasz

KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH,

uwzględniając Traktat ustanawiający Europejską Wspólnotę Gospodarczą,

uwzględniając dyrektywę Rady 70/373/EWG z dnia 20 lipca 1970 r. w sprawie wprowadzenia wspólnotowych metod pobierania próbek i analizy do celów urzędowej kontroli pasz [1], ostatnio zmienioną Aktem Przystąpienia Hiszpanii i Portugalii, w szczególności jego art. 2,

a także mając na uwadze, co następuje:

siódma dyrektywa Komisji 76/372/EWG z dnia 1 marca 1976 r. ustanawiająca wspólnotowe metody analizy do celów urzędowej kontroli pasz [2], zmieniona dyrektywą 81/680/EWG [3], wyznacza metody wykorzystywane w celu oznaczenia aflatoksyny B1;

istnieją podstawy przyjęcia tych metod w świetle postępu w dziedzinie wiedzy technicznej i naukowej; w szczególności wskazane jest udostępnienie metody kontroli bardzo niskich granic aflatoksyny określonej przez dyrektywę Rady 74/63/EWG z dnia 17 grudnia 1973 r. w sprawie ustalenia najwyższych dopuszczalnych poziomów substancji i produktów niepożądanych w paszach [4], ostatnio zmienioną dyrektywą 91/132/EWG [5];

wskazane jest również udostępnienie metody oznaczenia aflatoksyny B1 w obecności mieszających się substancji, takich jak miąższ cytrusów;

środki przewidziane w niniejszej dyrektywie są zgodne z opinią Stałego Komitetu ds. Pasz,

PRZYJMUJE NINIEJSZĄ DYREKTYWĘ:

Artykuł 1

W Załączniku dyrektywy 76/372/WE wprowadza się zmiany zgodnie z Załącznikiem do niniejszej dyrektywy.

Artykuł 2

Państwa Członkowskie wprowadzą w życie przepisy ustawowe, wykonawcze i administracyjne, niezbędne do wykonania niniejszej dyrektywy i niezwłocznie powiadomią o tym Komisję.

Przepisy przyjęte przez Państwa Członkowskie zawierają odesłanie do niniejszej dyrektywy lub odesłanie takie powinno towarzyszyć ich urzędowej publikacji. Metody dokonywania takiego odesłania określane są przez Państwa Członkowskie.

Artykuł 3

Niniejsza dyrektywa skierowana jest do Państw Członkowskich.

Sporządzono w Brukseli, dnia 9 listopada 1992 r.

W imieniu Komisji

Ray Mac Sharry

Członek Komisji

[1] Dz.U. L 170 z 3.8.1970, str. 2.

[2] Dz.U. L 102 z 15.4.1976, str. 8.

[3] Dz.U. L 246 z 29.8.1981, str. 32.

[4] Dz.U. L 38 z 11.2.1974, str. 31.

[5] Dz.U. L 66 z 13.3.1991, str. 16.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK

I. W części A "Metoda jednokierunkowa chromatografii cienkowarstwowej" treść punktu 1 "Cel i zakres" otrzymuje brzmienie:

"1. Cel i zakres

Metoda ta umożliwia oznaczenie poziomu aflatoksyny B1 w surowcach i paszach. Niniejsza metoda nie może być stosowana w obecności miąższu cytrusów. Dolna granica oznaczania wynosi 0,01 mg/kg (10 ppb).

W obecności mieszających się substancji, konieczne jest powtórzenie analizy wykorzystującej metodę B (metodę wysokosprawnej chromatografii cieczowej)."

II. W części B "Metoda kierunkowej chromatografii cienkowarstwowej" treść otrzymuje brzmienie:

"B. OKREŚLENIE ZAWARTOŚCI AFLATOKSYNY B1. WYSOKOSPRAWNA CHROMATOGRAFIA CIECZOWA.

1. Cel i zakres

Niniejsza metoda służy oznaczeniu aflatoksyny B1 w paszach zwierzęcych, włącznie z tymi zawierającymi miąższ cytrusów. Dolna granica oznaczania wynosi 0,001 mg/kg (1 ppb).

2. Zasada

Próbka jest ekstrahowana chloroformem. Ekstrakt jest filtrowany, podwielokrotna porcja jest oczyszczana na filtrze Florisil po filtrze C18. Ostateczne oddzielenie i oznaczenie osiąga się poprzez wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) o odwróconej fazie kolumny C18, po której otrzymywana jest pokolumnowa pochodna z jodem w wodzie oraz wykrywaniem fluoroscencji.

Uwaga:

Mikotoksyny są wyjątkowo toksycznymi substancjami. Działania na nich powinny być wykonywane w odpowiednim wyciągu. Kiedy toksyny są w suchej formie, powinny zostać podjęte szczególne środki ostrożności, z powodu ich elektrostatycznego charakteru i wynikającej z niej tendencji do rozprzestrzeniania się w miejscach pracy.

3. Odczynniki

3.1. Chloroform stabilizowany alkoholem etylowym o stężeniu 0,5–1 % masowego. Patrz: notka 10.2.

3.2. Metanol, stopień HPLC w celu przygotowania 3.6.

3.3. Aceton.

3.4. Acetonitryl, czystość HPLC.

3.5. Eluting solvents: Przygotować dzień przed użyciem, lub usunąć powietrze w roztworach ultradźwiękami.

3.5.1. Mieszanina acetonu (3.3) i wody, 98 + 2 (v + v).

3.5.2. Mieszanina metanolu i wody (3.2), 80 + 20 (v + v).

3.5.3. Mieszanina acetonu i wody (3.3), 85 + 15 (v + v).

3.6. Faza ruchoma do HPLC

Mieszanina wody, metanolu (3.2) i acetonitrylu (3.4), 130 + 70 + 40 (v + v + v).

Uwaga:

Skład fazy ruchomej rozpuszczalnika może wymagać dostosowania, w zależności od charakterystyki wykorzystywanej kolumny HPLC.

3.7. Nasycony roztwór jodu: dodać 2 g jodu do 400 ml wody. Mieszać przez przynajmniej 90 min. i przefiltrować przez filtr membranowy (4.15). Chronić nasycony roztwór przed światłem w celu zapobieżenia fotodegradacji.

3.8. Celite 545 płukane kwasem, lub podobne.

3.9. Filtr Florisil (Waters SEP-PAK), lub podobny.

3.10. Filtr C18 (Waters SEP-PAK), lub podobny.

3.11. Gaz obojętny, np. azot.

3.12. Roztwór mianowany aflatoksyny B1 w chloroformie, stężenie 10 μg/ml. Sprawdzić stężenie roztworu w następujący sposób: ustalić widmo absorpcji roztworu między 330 i 370 nm za pomocą spektrofotometru (4.23). Zmierzyć wchłanianie (A) przy maksimum zbliżonym do 363 nm. Z wzoru obliczyć stężenie aflatoksyny B1 wyrażone w mikrogramach na ml roztworu:

Stężenie (μg/ml)=

= 13,991 × A

3.12.1. Przechowywanie roztworu mianowanego aflatoksyny B1 w chloroformie.

Przelać ilościowo 2,5 ml roztworu mianowanego aflatoksyny B1 (3.12) do 50 ml kolby miarowej oraz dostosować do oznaczenia chloroformem (3.1). Przechowywać ten roztwór w chłodnym i ciemnym miejscu (4 °C), dobrze uszczelnionym i opakowanym w folię aluminiową.

3.13. Roztwory wzorcowe aflatoksyny B1 HPLC.

Uwaga:

Wykorzystać szkło płukane kwasem w celu przygotowania tych roztworów (patrz: 4, Aparatura).

3.13.1. Roztwór wzorcowy 4 ng/ml.

Pozwolić kolbie miarowej z przechowywanym roztworem mianowanym (3.12.1) ogrzać się do temperatury pokojowej w folii aluminiowej (kilka godzin). Przenieść 400 μl przechowywanego roztworu mianowanego (200 ng aflatoksyny B1) do 50 ml kolby miarowej, oraz odparować roztwór do suchości w bieżącym gazie obojętnym (3.11).

Rozpuścić pozostałości otrzymane w około 20 ml mieszaninie wody/acetonu (3.5.3), dopełnić do oznaczenia mieszaniny wody/acetonu i dobrze wymieszać.

3.13.2. Roztwór wzorcowy, 3 ng/ml

Przelać ilościowo 7,5 ml roztworu wzorcowego (3.13.1) do 10 ml kolby miarowej, wykonać oznaczenie za pomocą mieszaniny wody/acetonu (3.5.3), i dobrze wymieszać.

3.13.3. Roztwór wzorcowy, 2 ng/ml

Przelać ilościowo 25 ml roztworu wzorcowego (3.13.1) do 50 ml kolby miarowej, wykonać oznaczenie za pomocą mieszaniny wody/acetonu (3.5.3) i dobrze wymieszać.

Niniejszy roztwór jest traktowany także jako wzorzec odniesienia jednostki miary, do wykorzystania w odniesieniu do powtarzających się wstrzyknięć podczas HPLC (5.5).

3.13.4. Roztwór wzorcowy, 1 ng/ml

Przelać ilościowo 2,5 ml roztworu wzorcowego (3.13.1) do 10 ml kolby miarowej, wykonać oznaczenie za pomocą mieszaniny wody/acetonu (3.5.3) i dobrze wymieszać.

3.14. Ampułka zawierająca mieszaninę stężeń aflatoksyn B1 B2, G1 i G2 około 1, 0,5, 1 i 0,5 μg/ml odpowiednio, w 1 ml chloroformie.

3.14.1. Chromatograficzny roztwór testowy.

Przelać zawartość ampułki (3.14) do zamykanej szklanym korkiem próbówki testowej lub zakręcanej fiolki. Przelać 40 μl tego roztworu do zamykanej szklanym korkiem próbówki testowej (płukanej kwasem) (4.22). Odparować chloroform w oparze gazu obojętnego (3.11) i ponownie rozpuścić w 10 ml mieszaniny wody/acetonu (3.5.3).

3.15. Odczynniki do testów potwierdzających (6).

3.15.1. Nasycony roztwór chlorku sodu.

3.15.2. Bezwodny, granulowany siarczan sodu.

4. Aparatura

Uwaga: wykorzystanie szkła niepłukanego kwasem do wodnych roztworów aflatoksyny może spowodować straty. Szczególną uwagę należy zwrócić na nowe szkło i szkło jednorazowe takie jak próbniki automatyczne lub pipety Pasteura. Dlatego szkło laboratoryjne wchodzące w kontakt z wodnymi roztworami aflatoksyn powinny moczone w być rozcieńczonym kwasie (np. kwasie siarkowym = 2 mol/1) przez kilka godzin, a później płukane wodą destylowaną w celu usunięcia wszelkich śladów kwasu (np. trzy razy, sprawdzić papierkiem pH). W praktyce, takie traktowanie jest konieczne w odniesieniu do kolby z okrągłym dnem (4.4), kolby miarowej, cylindrów pomiarowych, fiolek lub próbówek wykorzystywanych do roztworów wzorcowych oraz końcowego ekstraktu (szczególnie fiolki i próbniki próbne), oraz pipety Pasteura, jeżeli są wykorzystywane do przelewania roztworów wzorcowych lub ekstraktów.

4.1. Młynek — mieszarka.

4.2. Sitko o otworach rozmiaru 1,0 mm, (ISO R 565).

4.3. Wytrząsarka mechaniczna.

4.4. Obrotowy próżniowy aparat wyparny, wyposażony w 150 do 250 ml kolby o okrągłym dnie.

4.5. Wysokosprawny chromatograf cieczowy, iniektor z pętlą odpowiednią dla wtrysku 250 ml. Patrz instrukcje producentów do częściowych lub całkowitych wypełnień pętli.

4.6. Analityczna kolumna HPLC: 3 μm lub wypełnienie 5 μm C18.

4.7. Pompa bezimpulsowa w celu dostarczania jodowego odczynnika pokolumnowego.

4.8. Zawór Valco o zerowej objętości martwej w kształcie litery T, stal nierdzewna (1/16” x 0,75 mm).

4.9. Spiralna cewka; Teflon lub stal nierdzewna. Wymiary od 3000 x 0,5 mm do 5000 x 0,5 mm zostały ocenione jako właściwe w połączeniu z 5 μm lub 3 μm kolumną HPLC.

4.10. Termostatycznie kontrolowana kąpiel wodna wyregulowana do 60 °C, z możliwością regulowania temperatury do 0,1 °C.

4.11. Detektor fluorescencji, o czułości przy 365 nm oraz emisji przy 435 nm długości fali. (W odniesieniu do instrumentów filtrujących: długość fali emisji > 400 nm). Możliwe jest wykrywanie przynajmniej 0,05 ng aflatoksyny B1. Można zastosować pewne ciśnienie tylne (np. restryktor, Teflon lub nakrętka ze stali nierdzewnej połączona z wylotem detektora), w celu likwidowania pęcherzyków powietrza w komorze przepływu.

4.12. Rejestrator paskowy.

4.13. Elektroniczny integrator (dodatkowo).

4.14. Żłobiona bibuła filtracyjna średnica: 24 cm, Macherey-Nagel 617 1/4 lub podobna.

4.15. Filtr membranowy z porami o rozmiarze 0,45 Jim, Millipore HAWP 04700 lub podobny.

4.16. 500 ml szklana kolba stożkowa z zatyczką.

4.17. Szklana kolumna (o wewnętrznej średnicy około 1 cm, długość około 30 cm), wyposażona w nasadkę typu Luer.

4.18. Zawór odcinający typu Luer odporny na chloroform (np. Bio-rad 7328017, Analytichem Al 6078, J.T. Baker 4514 lub podobny).

4.19. Odporna chemicznie strzykawka, 10 ml konektor typu Luer.

4.20. Strzykawka odpowiednia dla iniekcji 250 μl do HPLC (patrz: 4.5).

4.21. 100 ml mikrostrzykawka w celu przygotowania roztworów wzorcowych (Sprawdzić, że dokładność mieści się w 2 % wagowych).

4.22. 10 ml szklane skalowane próbówki z zatyczką.

4.23. Spektrofotometr odpowiedni dla dokonywania pomiarów w rejonie UV widma.

4.24. Wyposażenie do testu potwierdzającego (6).

4.24.1. 100 ml lejek rozdzielczy płukany kwasem z teflonowym zaworek odcinającym.

4.24.2. Blokada ogrzewania, od 40 do 50 °C.

5. Procedura.

5.1. Przygotowanie próbki

Rozkruszyć próbkę tak, aby przeszła przez sitko (4.2).

5.2. Porcja do badania

Odważyć 50 g przygotowywanej próbki testowej do kolby stożkowej (4.16).

5.3. Ekstrakcja

Dodać 25 g Celite'u (3.8), 250 ml chloroformu (3.1) oraz 25 ml wody do porcji testowej (5.2). Zamknąć kolbę, i potrząsać przez 30 minut w mechanicznej wytrząsarce (4.3). Przefiltrować przez filtr karbowany. Zebrać 50 ml filtratu. Jeżeli jest to konieczne, wziąć podwielokrotność filtratu i rozcieńczyć do 50 ml chloroformem, tak aby stężenie aflatoksyny B1 nie było wyższe niż 4 ng/ml.

5.4. Oczyszczanie (procedura powinna być przeprowadzana bez większych przerw).

Uwaga:

- chronić laboratorium, jeżeli analizy są wykonane, odpowiednio od światła dziennego. Może zostać to skutecznie osiągnięte poprzez wykorzystanie:

i) Folii absorbującej UV na oknach w połączeniu z przytłumionym światłem (nie bezpośrednie światło słoneczne);

ii) Zasłony lub rolety w połączeniu ze sztucznym światłem (fluorescencyjne próbówki są akceptowalne);

- roztwory zawierające aflatoksynę muszą być chronione przed światłem jak tylko jest to możliwe (trzymać w ciemności, wykorzystać folię aluminiową).

5.4.1. Oczyszczanie Florisil SEP-PAK.

5.4.1.1. Przygotowanie montażu kolumny-filtra

Załączyć zawór odcinający (4.18) krótszego rdzenia filtra Florisil (3.9) (patrz: wykres 1). Umyć filtr i usunąć wspomaganie poprzez wzięcie 10 ml chloroformu (3.1) oraz przepuszczenie 8 ml przez zawór odcinający szybko poprzez filtr wykorzystujący strzykawkę (4.19). Załączyć dłuższy rdzeń filtra do szklanej kolumny (4.17) i przepuścić pozostałe 2 ml chloroformu przez filtr w kolumnie. Zamknąć zawór. Usunąć strzykawkę.

5.4.1.2. Oczyszczanie

Dodać filtrat zebrany w 5.3 do montażu kolumny-filtra i osuszyć poprzez ciążenie. Spłukać 5 ml chloroformu (3.1), a następnie przez 20 ml metanolu (3.2). Zlać popłuczyny. Podczas tych czynności, zapewnić że montaż kolumny-filtra nie staje się suchy.

Przepłukać aflatoksynę B1 40 ml mieszaniny aceton-woda (3.5.1) oraz całość popłuczyn w kolbie o okrągłym dnie obrotowego aparatu wyparnego (4.4). Skupić popłuczyny na obrotowym aparacie wyparnym przy 40 °C do 50 °C do chyba że aceton nie jest już destylowany. (NB około 0,5 ml płynu pozostaje w kolbie w tym punkcie. Eksperymenty dowiodły, że dalsze parowanie nie jest szkodliwe i że kiedy pozostaje 0,5 ml płynu, nie ma żadnej wyraźnej ilości acetonu. Pozostałości acetonu mogą prowadzić do strat aflatoksyny B1 na filtrze C18). Dodać 1 ml metanolu (3.2), wirować kolbę w celu rozpuszczenia aflatoksyny B1 na ścianach kolby, dodać 4 ml wody i wymieszać. Rozłączyć i wyrzucić filter. Spłukać kolumnę szklaną wodą i przejść do kroków oczyszczania C18.

5.4.2. Oczyszczanie C18 SEP-PAK

5.4.2.1. Przygotowanie montażu kolumny-filtra.

Załączyć zawór odcinający (4.18) krótszego rdzenia filtra C18 (3.10) (patrz: wykres 1). Zalać filtr i usunąć wszelkie powietrze poprzez puszczenie 10 ml metanolu (3.2) przez zawór odcinający szybko poprzez filtr wykorzystujący strzykawkę (4.19) (bąbelki powietrza w filtrze widoczne są jako jasne punkty na szarawym tle). Weź 10 ml wody, i przepuść 8 ml przez filtr (Unikać wtłoczenia powietrza do filtra, w momencie zmiany z mentolu na wodę). Załączyć dłuższy rdzeń filtra do szklanej kolumny (4.17) i przepuścić pozostałe 2 ml wody przez filtr w kolumnie. Zamknąć zawór. Usunąć strzykawkę.

5.4.2.2. Oczyszczanie

Przelać ekstrakt zebrany w 5.4.1.2 ilościowo do szklanej kolumny (4.17), płucząc kolbę dwukrotnie 5 ml mieszaniny wody/metanolu (3.5.2) i osuszyć poprzez ciążenie. Podczas tych czynności, zapewnić że montaż kolumny-filtra nie staje się suchy. (Jeżeli bąbelki powietrza zaczynają powstawać w konstrukcji w niewielkiej odległości od filtra, zatrzymać przepływ i odblokuj zawór kolumny szklanej w celu usunięcia bąbelków powietrza. Wtedy kontynuuj). Przepłukać 25 ml mieszaniny wody/metanolu. Zlać popłuczyny. Przepłukać aflatoksynę B1 50 ml mieszaniną wody/metanolu (3.5.3), i zebrać całość popłuczyn do 50 ml kolby miarowej. Dopełnić do oznaczenia metanolem i wymieszać. Otrzymany roztwór testowy używany jest w chromatografii (5.5).

Uwaga:

Filtracja końcowego ekstraktu przed HPLC nie jest zwykle konieczna. Jeżeli uznana jest za niezbędną, nie należy używać filtrów celulozowych, ponieważ mogą one prowadzić do strat aflatoksyny B1. Można używać filtrów teflonowych.

5.5. Wysokosprawna chromatografia cieczowa

(patrz: wykres 2 w celu przygotowania wyposażenia). Dać odpowiedni czas na konfekcjonowanie i ustabilizowanie instrumentów.

Uwaga 1:

Tempo przepływu ustalone dla fazy ruchomej i odczynnika pokolumnowego są wyłącznie wskazówkami. Mogą być przystosowane zależnie od charakterystyki kolumny HPLC.

Uwaga 2:

Wskazanie detektora na aflatoksynę B1 zależy od temperatury, dlatego należy zrekompensować za osad (Patrz wykres 3). Poprzez wstrzyknięcie określonej ilości wzorca odniesienia jednostki miary aflatoksyny B1 (3.13.3) w regularnych odstępach czasu (tj. co trzecie wstrzyknięcie), piki aflatoksyny B1 o wartości między wzorcem odniesienia jednostki miary mogą być poprawione wykorzystując środki odpowiedzi, pod warunkiem że różnice pomiędzy odpowiedziami kolejnych wzorców odniesienia jednostki miary są bardzo małe (< 10 %). Dlatego wstrzyknięcia muszą być dokonane bez przerw. Jeżeli przerwa jest konieczna, ostatnie wstrzyknięcie przed przerwaniem i pierwsze wstrzyknięcie po przerwie muszą być wzorcem odniesienia jednostki miary (3.13.3). Ponieważ krzywa kalibracyjna jest liniowa i przechodzi przez oryginał, ilości aflatoksyny B1 w ekstraktach próbek ustalone są bezpośrednio poprzez odniesienie do odpowiedniego wzorca.

5.5.1. Ustawienia pompy HPLC

Ustawić pompę HPLC (4.5) w celu umożliwienia przepływu z prędkością 0,5 lub 0,3 ml/min w odniesieniu do 5 μm lub 3 μm kolumny HPLC (4.6) odpowiednio wykorzystującej fazę ruchomą (3.6).

5.5.2. Ustawienia pompy pokolumnowej

Ustawić pompę (4.7) w celu umożliwienia przepływu z prędkością 0,2 do 0,4 ml/min roztworu wody nasyconej jodem (3.7). Jako prosta wskazówka: zalecany jest przepływ z prędkością około 0,4 lub 0,2 ml/min w połączeniu z przepływem z prędkością 0,5 i 0,3 ml/min fazy ruchomej (3.6) odpowiednio.

5.5.3. Detektor fluorescencji

Ustawić detektor fluorescencji (4,11) do exc. = 365 nm i em = 435 nm (instrument filtrowy; > 400 nm). Dostosować wzmacniacz detektora w celu otrzymania około 80 % całkowitej skali odchyleń igły rejestratora w odniesieniu do 1 ng aflatoksyny B1

5.5.4. Wtryskiwacz

W odniesieniu do wszystkich roztworów, wstrzyknąć ilości 250 μl zgodnie z instrukcjami producenta iniektora.

5.5.5. Kontrola rozdzielania metodą chromatograficzną

Wstrzyknij testowy roztwór do chromatografii (3.14.1). Doliny powinny być mniejsze niż 5 % sumy wysokości pików przylegających pików.

5.5.6. Kontrola stabilizacji systemu

Przed każdą serią analiz, wstrzyknąć odpowiednio wzorzec odniesienia jednostki miary (3.13.3), dopóki stabilne zakresy pików nie zostaną osiągnięte (NB Odpowiedzi pików na aflatoksynę B1 pomiędzy kolejnymi wstrzyknięciami nie powinny różnić się więcej niż o 6 %). Przystępować niezwłocznie do kontroli liniowości (5.5.7).

5.5.7. Kontrola liniowości

Wstrzyknąć roztwór wzorcowy aflatoksyny B1 (3.13.1 do 3.13.4). co trzecie wstrzyknięcie wykorzystuje wzorzec odniesienia jednostki miary (3.13.3), w celu korekty osadu w odpowiedzi (NB Odpowiedzi pików na ten wzorzec odniesienia jednostki miary nie może różnić się o więcej niż 10 % w ciągu 90 minut). Poprawić osady zgodnie z wzorem w 7. Wykres kalibracji powinien być liniowy i przechodzić przez oryginał, w ramach dwóch standardowych błędów szacunków Y. Znalezione wartości nie mogą różnić się o więcej niż 3 % od wartości nominalnych. Jeżeli te wymagania zostaną spełnione, kontynuować niezwłocznie. Jeżeli nie, zidentyfikować i skorygować źródła problemu przed kontynuacją.

5.5.8. Wstrzyknięcie ekstraktów próbek

Wstrzyknąć oczyszczone ekstrakty próbek (5.4.2.2). Co dwa ekstrakty próbek powtórzyć wstrzyknięcie wzorca odniesienia jednostki miary (3.13.3) zgodnie z następującą sekwencją: wzorzec odniesienia jednostki miary, ekstrakt, ekstrakt, wzorzec odniesienia jednostki miary, ekstrakt, ekstrakt, wzorzec odniesienia jednostki miary itd.

6. Test potwierdzający

6.1. Dalsze postępowanie z ekstraktem (5.4.2.2)

Dodać 5 ml roztworu chlorku sodowego (3.15.1) do końcowego ekstraktu otrzymanego w 5.4.2.2. Ekstrahuj trzy razy każdą 2 ml chloroformu (3.1) na minutę, w lejku rozdzielczym (4.24.1). Wlać połączone ekstrakty chloroformudo około 1 g siarczanu sodowego (3.15.2) do 10 ml próbówki testowej. Mały lejek rozdzielczy (średnica: 4 cm) może być wykorzystany z kawałkiem bawełny w swojej konstrukcji, pokrytym około 1 g siarczanu sodowego.

Umyć warstwę siarczanu sodowego kilkoma ml chloroformu i zebrać je w tej samej próbówce testowej. Odparuj ekstrakt chloroformu do suchości w tej samej próbówce testowej wykorzystując blok grzewczy (4.24.2) i ponownie rozpuść w 1 ml chloroformu.

6.2. Przygotowanie instrument pochodny oraz chromatografii cienkowarstwowej.

Patrz Załącznik dyrektywy Rady 76/372/EWG metoda A, punkt 5.6.2.

7. Obliczanie wyników

Obliczyć zawartość aflatoksyny B1 (mm/kg) obecnej w próbce, wykorzystując wzór:

Zawartość aflatoksyny B1 w μg/kg =

m × V

V

× M ×

VfVc

gdzie:

m m =

P

+ P

× 2 r

st

P (próbka) = powierzchnia piku aflatoksyny B1 w odniesieniu do próbki

P(st.1) = powierzchnia piku aflatoksyny B1 wynikająca z poprzedniego wstrzyknięcia wzorca odniesienia jednostki miary (3.13.3)

P(st.2) = powierzchnia piku aflatoksyny B1 wynikająca z następującego wstrzyknięcia wzorca odniesienia jednostki miary (3.13.3)

r(st.) = wstrzyknięta ilość aflatoksyny B1 we wzorcu odniesienia jednostki miary (3.13.3) w ng

Vm = ilość wstrzykniętego ekstraktu próbki w ml

Vext = końcowa wielkość ekstraktu próbki w ml, pozwalająca na każde dokonane rozcieńczenie (5.3)

M = masa próbki w g

Vf = ilość filtratu przelanego do filtra Florisil (5.4.1.2) w ml

Vc = ilość chloroformu, wykorzystywanego w wyekstrahowaniu próbki w ml

Jeżeli procedura następuje tak jak w protokole, wzór ogranicza się do:

Zawartości aflatoksyny B1 w μg/kg = 20 x m.

7.1. Obliczenia wyników mogą także dokonywane przez pomiar wysokości pików.

8. Powtarzalność

Patrz: punkt 10.1

9. Odtwarzalność

Patrz: punkt 10.1

10. Uwagi

10.1. Dokładność

Wspólne studium [1], przeprowadzone na poziomie międzynarodowym na mieszanych paszach dostarczyło wyników w odniesieniu do powtarzalności i odtwarzalności wskazanej w tabeli 1. Pojęcie powtarzalność r) użyte tutaj jest zdefiniowane jako największy stosunek, który nie jest istotny przy 95 % poziomu prawdopodobieństwa w odniesieniu do porównania dwóch odczytów tej samej próbki w tym samym laboratorium na podobnych warunkach. Pojęcie odtwarzalność (R) jest podobnie definiowane w odniesieniu do porównywania dwóch laboratoriów. Zgodnie z ISO 3534 — 1977, 2.35 [2] i decyzją Komisji 89/610/EWG [3] r oraz R podane są także w tabeli 1 w odniesieniu do wskaźników zróżnicowania.

Tabela 1

Powtarzalność (r) i odtwarzalność (R) wyrażona jako stopy i odpowiednie współczynniki zmian

(15 laboratoriów)

Poziom | r | R | CV, f [4] | CVR |

(µg/kg) | | | (%) | (%) |

8 & 14 | 1,4 | 1,7 | 11 | 18 |

"CV 10.2. Stabilizacja chloroformu (3.1)

Charakterystyka adsorpcji filtra Florisil może zmieniać się jeżeli wykorzystywane są stabilizatory inne niż alkohol etylowy. Powinno to zostać zweryfikowane zgodnie z 10.3 jeżeli opisany chloroform nie jest dostępny.

10.3. Dokładność

Poprawne zastosowania metody powinny być zweryfikowane poprzez powielone pomiary certyfikowanego materiału odniesienia. Jeżeli nie jest to dostępne, wykonanie metody powinno być zweryfikowane przez wznowienie eksperymentów dokonane na wzmocnionych czystych próbkach. Odchylenie środka od wartości rzeczywistej, wyrażonej w procentach wartości rzeczywistej, nie mieści się poza granicami -20 do + 10 %.

+++++ TIFF +++++

Rysunek 1: Montaż kolumna-filtr

+++++ TIFF +++++

Rysunek 2. Diagram przepływu systemu LC system z jodową pochodną postkolumnową

+++++ TIFF +++++

Rysunek 3. Skompensowanie osadów w odpowiedzi aflatoksyny B1 poprzez wzorzec odniesienia jednostki miary (3.13.3) w regularnych odstępach"

[1] Egmond, H.P. van, Heisterkamp, S.H. and Paulsch, W.E. (1991). Zanieczyszczenia oraz dodatki do żywności 8, 17–29.

[2] ISO 3534–1977.

[3] Dz.U. L 351 z 2.12.1989, str. 39.

[4] "współczynnik zmienności

--------------------------------------------------