Decyzja Komisji

z dnia 21 lutego 2002 r.

zmieniająca załącznik D do dyrektywy Rady 90/426/EWG w odniesieniu do badań diagnostycznych dotyczących afrykańskiego pomoru koni

(notyfikowana jako dokument nr C(2002) 556)

(Tekst mający znaczenie dla EOG)

(2002/160/WE)

KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH,

uwzględniając Traktat ustanawiający Wspólnotę Europejską,

uwzględniając dyrektywę Rady 90/426/EWG z dnia 26 czerwca 1990 r. w sprawie wymagań dotyczących zdrowia zwierząt, regulujących przemieszczanie i przywóz zwierząt z rodziny koniowatych z państw trzecich [1], ostatnio zmienioną decyzją 2001/298/WE [2], w szczególności jej art. 23,

a także mając na uwadze, co następuje:

(1) Załącznik D do dyrektywy 90/426/EWG opisuje badanie na odczyn wiązania dopełniacza, przeprowadzane w celu zdiagnozowania afrykańskiego pomoru koni.

(2) W listopadzie 2000 r. laboratorium referencyjne Wspólnoty w Algete w Hiszpanii było gospodarzem corocznego spotkania przedstawicieli krajowych laboratoriów referencyjnych ds. afrykańskiego pomoru koni Państw Członkowskich UE. Podczas spotkania przedstawiono naukowe dowody, że odczyn wiązania dopełniacza opisany obecnie w załączniku D do dyrektywy 90/426/EWG charakteryzuje się poważnymi ograniczeniami, w szczególności ze względu na fakt, iż nadaje się jedynie do wykrywania przeciwciał po wystąpieniu infekcji lub po szczepieniu. Ponadto badania te zostały w praktyce wyparte przez nowoczesne testy ELISA w prawie wszystkich laboratoriach znajdujących się na terytorium Wspólnoty oraz w głównych krajach wywozu.

(3) Zaakceptowane na szczeblu międzynarodowym badania laboratoryjne mające na celu wykrycie przeciwciał wirusa afrykańskiego pomoru koni zostały opisane wPodręczniku norm do badań diagnostycznych i szczepionek [3] Międzynarodowego Urzędu Epizootii (OIE); niemniej jednak aktualne wydanie wymienia tylko jeden z dostępnych testów ELISA.

(4) W związku z powyższym właściwe wydaje się wprowadzenie zmian do załącznika D do dyrektywy 90/426/EWG celem uwzględnienia rozwoju technicznego i norm zatwierdzonych na szczeblu międzynarodowym.

(5) Środki przewidziane w niniejszej decyzji są zgodne z opinią Stałego Komitetu Weterynaryjnego,

PRZYJMUJE NINIEJSZĄ DECYZJĘ:

Artykuł 1

Załącznik D do dyrektywy 90/426/EWG zastępuje się Załącznikiem do niniejszej decyzji.

Artykuł 2

Niniejsza decyzja skierowana jest do Państw Członkowskich.

Sporządzono w Brukseli, dnia 21 lutego 2002 r.

W imieniu Komisji

David Byrne

Członek Komisji

[1] Dz.U. L 224 z 18.8.1990, str. 42.

[2] Dz.U. L 102 z 12.4.2001, str. 63.

[3] Rozdział 2.1.11, wydanie czwarte 2000.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK

ZAŁĄCZNIK D

AFRYKAŃSKI POMÓR KONI

DIAGNOZA

Odczynniki chemiczne niezbędne do wykonania testów immunoabsorpcji enzymozależnej (ELISA) opisanych poniżej można otrzymać z laboratorium referencyjnego Wspólnoty lub z laboratoriów referencyjnych OIE zajmujących się afrykańskim pomorem koni.

1. KOMPETYCYJNY TEST ELISA W CELU WYKRYCIA PRZECIWCIAŁ WIRUSA AFRYKAŃSKIEGO POMORU KONI (ASHV) (TEST ZALECANY)

Kompetycyjny test ELISA stosuje się w celu wykrycia szczególnego rodzaju przeciwciał ASHV w surowicy wszystkich gatunków zwierząt z rodziny koniowatych. Surowica odpornościowa świnki morskiej (zwana dalej surowicą odpornościową świnki morskiej) o szerokim zasięgu, poliklonalna, odporna na ASHV, umożliwia wykrycie wszystkich znanych serotypów wirusa AHSV.

Podstawę testu stanowi przerwanie reakcji między antygenem AHSV i surowicą odpornościową świnki morskiej przez próbkę testową surowicy. Przeciwciała AHSV w próbce surowicy będą konkurować z przeciwciałami pochodzącymi z surowicy odpornościowej świnki morskiej, w wyniku czego nastąpi osłabienie oczekiwanego koloru (następujące po dodaniu enzymu oznaczonego jako przeciwciało i substrat surowicy odpornościowej świnki morskiej). Surowica może być testowana w pojedynczym roztworze 1-5 (metodą testu plamkowego) lub za pomocą miareczkowania (metoda miareczkowania surowicy). Wartości wyhamowania procesu powyżej 50 % można potraktować jako wynik pozytywny.

Protokół testowy opisany poniżej jest wykorzystywany w regionalnym laboratorium referencyjnym zajmującym się afrykańskim pomorem koni w Pibright w Zjednoczonym Królestwie.

1.1. Procedura testowania

1.1.1. Przygotowanie płytek

1.1.1.1. Pokryć płytki ELISA antygenem AHSV, wyekstrahowanym z zainfekowanych hodowli komórek i rozpuszczonym w węglowym/dwuwęglowym roztworze buforowym o pH równym 9,6. Płytki inkubować przez całą noc w temperaturze 4 °C.

1.1.1.2. Umyć płytki trzykrotnie zanurzając w buforowanym roztworze chlorku sodu, fosforanu sodu i fosforanu potasu (PBS), pH 7,2-7,4, opróżniając jednocześnie baseniki, wysuszyć na materiale adsorpcyjnym.

1.1.2. Baseniki kontrolne

1.1.2.1. Miareczkować pozytywną kontrolę surowicy w podwójnych seriach rozcieńczenia 1 do 5 do 1 do 640 w poprzek kolumny 1 w buforze blokującym (PBS zawierającym 0,05 % (v/v) Tween-20, 5,0 % (v/v) odtłuszczonego mleka w proszku (Cadbury’s Marvel™) i 1 % (v/v) surowicy dorosłego żywca wołowego, co w rezultacie ma stanowić 50 μl/basenik.

1.1.2.2. Dodać 50 μl kontrolnej surowicy (wynik negatywny) w roztworze od 1 do 5 (10 μl surowicy + 40 μl buforu blokującego) do baseników A i B drugiej kolumny.

1.1.2.3. Dodać 100 μl/basenik buforu blokującego do baseników C i D w kolumnie 2 (obojętne).

1.1.2.4. Dodać 50 μl buforu blokującego do baseników E, F, G i H w kolumnie 2 (kontrola świnki morskiej).

1.1.3. Metoda testu plamkowego

1.1.3.1. Dodać roztwór 1 do 5 każdej z testowych surowic w buforze blokującym w celu zduplikowania beseników z kolumn 3-12 (10 μl surowicy + 40 μl buforu blokującego).

lub

1.1.4. Metoda miareczkowania surowicy

1.1.4.1. Przygotować podwójne serie roztworów każdej z próbek testowych (1 do 5 do 1 do 640) w roztworze buforowym w 8 basenikach każdej z kolumn 3-12.

następnie

1.1.5. Dodać 50 μl surowicy odpornościowej świnki morskiej, rozpuszczonej wcześniej w buforze blokującym do każdego baseniku, poza tymi obojętnymi przypisanymi do testu ELISA (w każdym baseniku powinno się znajdować 100 μl).

1.1.5.1. Inkubować przez godzinę w temperaturze 37 °C w wytrząsarce obrotowej.

1.1.5.2. Umyć płytki trzykrotnie i osuszyć jak poprzednio.

1.1.5.3. Dodać do każdego baseniku 50 μl królicze anty-IgG świnek morskich znaczone peroksydazą chrzanową, rozpuszczonej wcześniej w roztworze buforowym.

1.1.5.4. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w wytrząsarce obrotowej.

1.1.5.5. Umyć płytki trzykrotnie i osuszyć jak poprzednio.

1.1.6. Chromogen

Przygotować roztwór chromogenu OPD (OPD = ortofenylodiamina) zgodnie ze wskazówkami producenta (0,4 mg/ml w sterylnej destylowanej wodzie) bezpośrednio przed użyciem. Dodać substraty (wodę utlenioną = H2O2), aby otrzymać ostateczne stężenie 0,05 % (v/v) (1 do 2000 w 30-procentowym roztworze H2O2). Dodać 50 μl roztworu OPD do każdego baseniku i pozostawić płytki na 10 minut w umiarkowanej temperaturze. Powstrzymać reakcję, dodając 50 μl/basenik 1M kwasu siarkowego(H2SO4).

1.1.7. Odczyt wyniku

Odczytywać spektrofotometrycznie na 492 nm.

1.2. Sposób prezentowania wyników

1.2.1. Używając pakietu oprogramowania, wydrukować wartości gęstości optycznej (OD) oraz procent zahamowania (PI) dla testowanej i kontrolnej surowicy w odniesieniu do wartości średniej policzonej na podstawie odnotowanych wyników czterech basenikach kontrolnych świnki morskiej. Odnotowane wartości OD i PI pozwolą ustalić, czy wyniki testu mieszczą się w akceptowalnych granicach. Wartość górnej granicy kontrolnej (UCL) i niższej granicy kontrolnej (LCL) gęstości optycznej dla świnki morskiej to odpowiednio 1,4 i 0,4. Graniczne miano roztworu miareczkowanego dla pozytywnych próbek kontrolnych, gdzie bazą jest PI = 50 % powinno wynosić 1 do 240 (w zakresie od 1 do 120 do 1 do 480). Każda płytka, która nie spełnia powyższych kryteriów, musi zostać odrzucona. Niemniej jednak, gdy miano roztworu surowicy kontrolnej jest wyższe od 1 do 480, a próbki testowe dają w dalszym ciągu wyniki negatywne, mogą one zostać zaakceptowane.

Podwojenie baseników z negatywną surowicą kontrolną i podwojone baseniki obojętne powinny dawać odpowiednio wyniki PI między + 25 % i – 25 % oraz + 95 % i + 105 %. Niespełnienie powyższych kryteriów nie unieważnia wyniku pochodzącego z danej płytki, ale sugeruje, że kolor tła cały czas się zmienia.

1.2.2. Próg diagnozy (wartość zahamowania) dla testu surowicy to 50 % (PI 50 %). Próbki dające wynik PI powyżej 50 % należy uznać za pozytywne. Próbki, w przypadku gdy PI jest mniejsze od 50 %, są negatywne.

Próbki w przypadku, których wartości PI są różne w podwojonych basenikach, raz powyżej progu a innym razem poniżej, uznaje się za niewiarygodne. Takie próbki można testować ponownie metodą testu plamkowego bądź miareczkowania. Próbki pozytywne mogą zostać poddane miareczkowaniu w celu określenia stopnia, w jakim ich wynik jest pozytywny.

Wzór testu metoda plamkową

- kont. = kontrola negatywna

+ kont. = kontrola pozytywna

ŚM kontrola = kontrola świnki morskiej

| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |

| + kont. | | Badane surowice | Badane surowice | Badane surowice | Badane surowice | Badane surowice | Badane surowice | Badane surowice | Badane surowice | Badane surowice | Badane surowice |

A | 1:5 | – kont. | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 |

B | 1:10 | – kont. | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 |

C | 1:20 | próba ślepa | | | | | | | | | | |

D | 1:40 | próba ślepa | | | | | | | | | | |

E | 1:80 | ŚM kontrola | | | | | | | | | | |

F | 1:160 | ŚM kontrola | | | | | | | | | | |

G | 1:320 | ŚM kontrola | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |

H | 1:640 | ŚM kontrola | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |

Badane surowice

- kont. = kontrola negatywna

+ kont. = kontrola pozytywna

ŚM kontrola = kontrola świnki morskiej

| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |

| + kont. | | Badane surowice | Badane surowice | Badane surowice | Badane surowice | Badane surowice | Badane surowice | Badane surowice | Badane surowice | Badane surowice | Badane surowice |

A | 1:5 | – kont. | 1:5 | | | | | | | | | 1:5 |

B | 1:10 | – kont. | 1:10 | | | | | | | | | 1:10 |

C | 1:20 | próba ślepa | 1:20 | | | | | | | | | 1:20 |

D | 1:40 | próba ślepa | 1:40 | | | | | | | | | 1:40 |

E | 1:80 | ŚM kontrola | 1:80 | | | | | | | | | 1:80 |

F | 1:160 | ŚM kontrola | 1:160 | | | | | | | | | 1:160 |

G | 1:320 | ŚM kontrola | 1:320 | | | | | | | | | 1:320 |

H | 1:640 | ŚM kontrola | 1:640 | | | | | | | | | 1:640 |

2. TEST POŚREDNI ELISA W CELU WYKRYCIA PRZECIWCIAŁ WIRUSA AFRYKAŃSKIEGO POMORU KONI (AHSV) (TEST ZALECANY)

Test opisany poniżej jest zgodny z opisem w rozdziale 2.1.11 Podręcznika norm dla badań diagnostycznych i szczepionek OIE, wydanie czwarte, 2000 r.

Zrekombinowane białko VP7 zostało wykorzystane jako antygen dla przeciwciał wirusa AHS ze względu na wysoki współczynnik czułości i specyficzności. Innymi zaletami są jego stabilność i to, że nie jest zaraźliwy.

2.1. Procedura testowania

2.1.1. Faza stała

2.1.1.1. Płytki ELISA pokrywa się odczynnikiem AHSV-4 VP7, rozpuszczonym w węglowym/dwuwęglanym buforze, pH 9,6. Płytki inkubować przez całą noc w temperaturze 4 °C.

2.1.1.2. Umyć płytki pięć razy destylowaną wodą zawierającą 0,01 % (v/v) Tween 20 (roztwór do mycia). Delikatnie postukać o materiał absorpcyjny, w celu usunięcia pozostałości po myciu.

2.1.1.3. Zblokować płytki buforowanym roztworem chlorku sodu, fosforanu sodu i fosforanu potasu (PBS) + 5 % (w/v) odtłuszczonego mleka (Nestlé Dry Skim Milk™), 200 μl/basenik przez 1 godzinę, w temperaturze 37 °C.

2.1.1.4. Usunąć roztwór blokujący, delikatnie stukając o materiał adsorpcyjny.

2.1.2. Próbki testowe

2.1.2.1. Próbki surowicy przeznaczone do testowania oraz pozytywną i negatywną surowicę kontrolną rozpuszcza się w stosunku 1 do 25 w PBS + 5 % (w/v) odtłuszczonego mleka + 0,05 % (v/v) Tween 20, 100 μl/basenik. Inkubować przez godzinę w temperaturze 37 °C.

Do miareczkowania przygotować podwójne serie roztworów, począwszy od stosunku 1 do 25 (100 μl/basenik), jedna płytka z surowicą na kolumnę, te same czynności należy wykonać w przypadku kontroli negatywnych i pozytywnych. Inkubować przez godzinę w temperaturze 37 °C.

2.1.2.2. Umyć płytki zgodnie z opisem w pkt 2.1.1.2.

2.1.3. Koniugat

2.1.3.1. Sporządzić 100 μl/basenik perydoskazę chrzanową (HRP) – znaczoną antykońską IgG gamma – globuliną rozpuszczoną w PBS + 5 % mleka + 0,05 % Tween 20, pH 7,2. Inkubować przez godzinę w temperaturze 37 °C.

2.1.3.2. Umyć płytki zgodnie z opisem w pkt 2.1.1.2.

2.1.4. Chromogen/substrat

2.1.4.1. Dodać 200 μl na basenik roztworu chromogenu/substratu (10 ml z 80,6 mM DMAB (dimetyloaminobenzaldehyd) + 10 ml w 1,56 mM MBTH (chlorowodorek hydrazonu 3-methylo-2-benzo-tiazoliny) + 5 μl H2O2).

Rozwój koloru zostanie powstrzymany poprzez dodanie 50 μl 3N H2SO4 po około 5-10 minutach (przed momentem, w którym negatywna kontrola zaczyna nabierać koloru).

Można stosować również inne chromogeny, takie jak ABTS (2,2’-azyno-bis-[3-etylbenzotiazolina-6-kwasu sulfonowego]), TMB (tetrametylobebzydyna), lub OPD (orthofenyldiamina).

2.1.4.2. Odczytu płytek dokonywać na 600 nm (lub 620 nm).

2.2. Interpretacja wyników

2.2.1. Ustalić wartość krytyczną, dodając 0,6 do wartości negatywnej kontroli (0,6 to odchylenie standardowe policzone na 30-elementowej grupie próbek negatywnej surowicy).

2.2.2. Próbki, których wartości absorpcji są niższe od wartości krytycznej, uznawane są za negatywne.

2.2.3. Próbki, których wartości absorpcji są niższe od wartości krytycznej powiększonej o + 0,15, uznawane są za pozytywne.

2.2.4. Próbki, których wartość absorpcji jest umiarkowana, są niewiarygodne i należy wtedy zastosować drugą technikę w celu potwierdzenia wyników.

3. TEST BLOKUJĄCY ELISA W CELU WYKRYCIA PRZECIWCIAŁ WIRUSA AFRYKAŃSKIEGO POMORU KONI (AHSV) (TEST ZALECANY)

Ten test został zaprojektowany w celu wykrywania określonych przeciwciał AHSV w surowicy dowolnego podejrzanego gatunku. VP7 jest głównym, antygenicznym, białkiem wirusowym AHSV i występuje w dziewięciu typach surowiczych. Przeciwciało monoklonalne (Mab) jest także skierowane przeciwko VP7, badanie charakteryzuje się wysokim poziomem czułości i specyficzności. Ponadto zrekombinowane przeciwciało VP7 jest całkowicie nieszkodliwe, co gwarantuje wysoki stopień bezpieczeństwa.

Test opiera się na przerwaniu reakcji między rekombinantem VP7, wraz z momentem skierowania antygenu na płytkę przeznaczoną na badanie ELISA, a zespolonym przeciwciałem monoklonalnym (Mab) właściwym dla VP7. Przeciwciało w testowej surowicy zablokuje reakcję między antygenem a przeciwciałem monoklonalnym (Mab), co w rezultacie zredukuje intensywność koloru.

Test opisany poniżej jest przeprowadzany w laboratorium referencyjnym Wspólnoty Europejskiej zajmującym się afrykańskim pomorem koni w Algete, w Hiszpanii.

3.1. Procedura testowania

3.1.1. Płytki ELISA

3.1.1.1. Pokryć płytki substratem AHSV-4 VP7 rozpuszczonym w węglowym/dwuwęglowym buforze, pH 9,6. Inkubować przez całą noc w temperaturze 4 °C.

3.1.1.2. Umyć płytki pięciokrotnie w buforowanym roztworze chlorku sodu, fosforanu sodu i fosforanu potasu (PBS) zawierającym 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST).

3.1.1.3. Ustabilizować płytkę, wykorzystując roztwór stabilizujący (w celu umożliwienia długotrwałego przechowywania w temperaturze 4 °C bez utraty aktywności) i wysuszyć na materiale absorpcyjnym.

3.1.2. Próbki testowe i kontrole

W celu przesiewu: | rozpuścić surowicę testową i kontrolną w stosunku 1 do 10 bezpośrednio na płytce w PBST tak, aby otrzymać 100 μl/basenik. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. |

W celu miareczkowania: | przygotować podwójne serie roztworów surowicy oraz kontroli pozytywnych (100 μl/basenik), począwszy od stosunku 1 w 10 do 1 w 280 w ośmiu basenikach. Kontrola negatywna testowana jest w roztworze 1 do 10. |

3.1.2.1. 3.1.2.2. 3.1.3. Koniugat

Dodać 50 μl/basenik przed rozcieńczeniem peroksydozy chrzanowej (HRP) znaczonej Mab (monoklonalne przeciwciała właściwe dla VP7) do każdego baseniku i wymieszać delikatnie do uzyskania jednorodności. Inkubować przez 30 min w temperaturze 37 °C.

3.1.4. Umyć płytki pięciokrotnie w PBST i osuszyć jak wyżej.

3.1.5. Chromogen/substrat

Dodać 100 μl/basenik roztwór choromogenu/substratu (1ml ABTS (2,2’-Azyno-bis-[6-kwas sulfonowy 3-ethylbenzotiazoliny]) 5 mg/ml + 9 ml buforu substratu (0,1 M buforu cytrynianu fosforanu o pH = 4, zawierającego 0,03 % H2O2] i inkubować przez 10 min w temperaturze pokojowej. Rozwój koloru zatrzymuje się przez dodanie 100 μl/basenik 2 % (w/v) SDS (dodecylosiarczan sodu).

3.1.6. Odczyt

Odczytywać na 405 nm czytnika ELISA.

3.2. Interpretacja wyników

3.2.1. Sprawdzanie ważności badania

Test jest ważny, jeżeli optyczna gęstość (OD) kontroli negatywnej (NC) jest większa niż 1,0, a w przypadku pozytywnych (PC) OD jest mniejsze niż 0,2.

3.2.2. Wskaźniki

Pozytywny wskaźnik NC -

NC - PC × 0,3

Negatywny wskaźnik NC -

NC - PC × 0,2

Gdzie NC to wartość optycznej gęstości dla kontroli negatywnej (OD), a PC stanowi wartość (OD) dla kontroli pozytywnej.

3.2.3. Interpretacja wyników

W przypadku próbki z OD niższą od wartości pozytywnego wskaźnika, wynik należy uznać za pozytywny i przyjąć, że antyciała AHSV są obecne.

Próbki z OD wyższą od wartości negatywnego wskaźnika należy uznać za pozbawione przeciwciał AHSV (wynik negatywny).

Próbki, w przypadku których wyniki OD mieszczą się między wartościami pozytywnego i negatywnego wskaźnika, należy uznać za niewiarygodne i pobrać ponownie próbki od zwierząt po upływie od dwóch do trzech tygodni.

--------------------------------------------------