Rozporządzenie Komisji (WE) nr 2091/2002 z dnia 26 listopada 2002 r. zmieniające rozporządzenie (WE) nr 2870/2000 ustanawiające wspólnotowe metody referencyjne dla analizy napojów spirytusowych



Dziennik Urzędowy L 322 , 27/11/2002 P. 0011 - 0027

CS.ES Rozdział 3 Tom 37 P. 395 - 411

ET.ES Rozdział 3 Tom 37 P. 395 - 411

HU.ES Rozdział 3 Tom 37 P. 395 - 411

LT.ES Rozdział 3 Tom 37 P. 395 - 411

LV.ES Rozdział 3 Tom 37 P. 395 - 411

MT.ES Rozdział 3 Tom 37 P. 395 - 411

PL.ES Rozdział 3 Tom 37 P. 395 - 411

SK.ES Rozdział 3 Tom 37 P. 395 - 411

SL.ES Rozdział 3 Tom 37 P. 395 - 411



Rozporządzenie Komisji (WE) nr 2091/2002 z dnia 26 listopada 2002 r. zmieniające rozporządzenie (WE) nr 2870/2000 ustanawiające wspólnotowe metody referencyjne dla analizy napojów spirytusowych KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH, uwzględniając Traktat ustanawiający Wspólnotę Europejską, uwzględniając rozporządzenie Rady (EWG) nr 1576/89 z dnia 29 maja 1989 r. określające ogólne zasady definicji, opisu i prezentacji napojów spirytusowych [1], zmienione przez Akt Przystąpienia Austrii, Finlandii i Szwecji, w szczególności jego art. 4 ust. 8, a także mając na uwadze, co następuje: (1) Rozporządzenie Komisji (WE) nr 2870/2000 z dnia 19 grudnia 2000 r. ustanawiające wspólnotowe metody referencyjne dla analizy napojów spirytusowych [2] przedstawia te metody w Załączniku. (2) W ramach realizacji części programu badawczego wspieranego przez Komisję, na podstawie przyjętej międzynarodowej procedury zostały uznane jako ważne i zgodne z normami cztery metody analizy do oznaczania transanetolu w napojach spirytusowych o aromacie anyżkowym, kwasu lukrecjowego i chalkonu w anyżówce oraz żółtka jaja w likierze jajecznym i likierze z dodatkiem jaj. (3) Te cztery metody mogą być uznane jako wspólnotowe metody referencyjne i muszą być dodane do Załącznika do rozporządzenia (WE) nr 2870/2000. (4) Środki przewidziane w niniejszym rozporządzeniu są zgodne z opinią Komitetu Wykonawczego ds. Napojów Alkoholowych, PRZYJMUJE NINIEJSZE ROZPORZĄDZENIE: Artykuł 1 W Załączniku do rozporządzenia (WE) nr 2870/2000 wprowadza się następujące zmiany: 1) W streszczeniu Załącznika skreśla się skrót "(p.m.)" w pkt V, VI, VII i IX. 2) W Załączniku do niniejszego rozporządzenia dodaje się po rozdziale III rozdziały V, VI, VII i IX. Artykuł 2 Niniejsze rozporządzenie wchodzi w życie siódmego dnia po jego opublikowaniu w Dzienniku Urzędowym Wspólnot Europejskich. Niniejsze rozporządzenie wiąże w całości i jest bezpośrednio stosowane we wszystkich Państwach Członkowskich. Sporządzono w Brukseli, dnia 26 listopada 2002 r. W imieniu Komisji Franz Fischler Członek Komisji [1] Dz.U. L 160 z 12.6.1989, str. 1. [2] Dz.U. L 333 z 29.12.2000, str. 20. -------------------------------------------------- ZAŁĄCZNIK V. ANETOL. OZNACZANIE TRANSANETOLU W NAPOJACH SPIRYTUSOWYCH METODĄ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ 1. Zakres Metoda ta jest odpowiednia do oznaczania transanetolu w napojach alkoholowych z aromatem anyżkowym przy użyciu kapilarnej chromatografii gazowej. 2. Odniesienia normatywne ISO 3696: 1987 Woda do zastosowań w laboratorium analitycznym – specyfikacje i metody testów (Water for analytical laboratory kuse – Specifications and test methods). 3. Zasada Stężenie transanetolu w destylacie alkoholowym jest oznaczone metodą chromatografii gazowej (GC). Taka sama ilość wg normy wewnętrznej np. 4-alliloanizolu (estragolu), gdy estragol nie jest naturalnie obecny w próbce, zostaje dodana do próbki testowej i do referencyjnego roztworu transanetolu o znanym stężeniu, które zostają następnie rozcieńczone 45 % roztworem alkoholu etylowego i bezpośrednio wstrzyknięte do systemu GC. Dla likierów o dużej zawartości cukrów przed przygotowaniem próbki i analizą konieczna jest ekstrakcja. 4. Odczynniki i materiały W czasie analizy należy używać jedynie odczynników o czystości przynajmniej 98 % i wody co najmniej klasy 3 według definicji ISO 3696. Chemikalia referencyjne należy przechowywać w chłodnej temperaturze (4 °C), z dala od światła, w aluminiowych pojemnikach lub w butelkach dla odczynników z barwionego (oranżowego) szkła. Zaleca się zaopatrzenie zatyczek (szklanych korków) do butelek w aluminiowe uszczelki. Przed użyciem transanetol musi być "odtajony" ze stanu krystalicznego, ale w takich przypadkach jego temperatura nie może nigdy przewyższać 35 °C. 4.1. Etanol (alkohol etylowy) 96 % vol. (CAS 64–17–5) 4.2. 1-metoksy-4-(1-propenyl) benzen; (transanetol) (CAS 4180–23–8) 4.3. 4-allilanizol, (estragol) (CAS 140–67–0), proponowany wzorzec wewnętrzny (internal standard – IS) 4.4. Etanol (alkohol etylowy) 45 % vol. Dodać 560 g wody destylowanej do 378 g etanolu 96 % vol. 4.5. Przygotowanie roztworu wzorcowego (mianowanego) Wszystkie roztwory wzorcowe należy przechowywać w temperaturze pokojowej (15 do 35 °C) z dala od światła, w aluminiowych pojemnikach lub w butelkach dla odczynników z barwionego (oranżowego) szkła. Zaleca się zaopatrzenie zatyczek (szklanych korków) do butelek w aluminiowe uszczelki. Transanetol i 4-allilanizol są praktycznie nierozpuszczalne w wodzie, dlatego też konieczne jest ich rozpuszczenie w niewielkiej ilości 96 % etanolu (4.1) przed dodaniem 45 % etanolu (4.4). Roztwory podstawowe muszą być świeżo przygotowywane każdego tygodnia. 4.5.1. Roztwór wzorcowy A Roztwór podstawowy transanetolu (stężenie: 2 g/l) Odważyć 40 mg transanetolu (4.2) w 20 ml kolbie pomiarowej (lub 400 mg w 200 ml itd..). Dodać trochę 96 % etanolu (4.1) i uzupełnić objętość przez dodanie 45 % vol. etanolu (4.4), dokładnie wymieszać. 4.5.2. Wzorzec wewnętrzny roztworu B Roztwór podstawowy według wzorca wewnętrznego, np. estragol (stężenie: 2 g/l) Odważyć 40 mg transanetolu (4.3) w 20 ml kolbie pomiarowej (400 mg w 200 ml itd..). Dodać trochę 96 % etanolu (4.1) i uzupełnić objętość przez dodanie 45 % vol. etanolu (4.4), dokładnie wymieszać. 4.5.3. Roztwory stosowane do sprawdzenia reakcji linearnej detektora płomieniowo-jonizacyjnego (FID – flame ionization detector) Na potrzeby analizy należy sprawdzić reakcję liniowości FID, biorąc pod uwagę zakres stężeń transanetolu w napojach alkoholowych od 0 g/l do 2,5 g/l. W procedurze analitycznej nieznane próbki napojów alkoholowych do analizy są rozcieńczane 10-krotnie (8.3). Dla warunków analizy przedstawionych w tej metodzie roztwory podstawowe odpowiadające stężeniom 0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, i 0,25 g/l transanetolu w próbce do analizy przygotowuje się następująco: pobrać 0,5, 1, 1,5, 2, i 2,5 ml roztworu podstawowego A (4.5.1) i pipetować do oddzielnych 20 ml kolb pomiarowych; pipetować do każdej kolby 2 ml wzorca wewnętrznego roztworu B (4.5.2) i uzupełnić objętość przez dodanie 45 % vol. etanolu (4.4), dokładnie wymieszać. Pusty roztwór (8.4) jest używany jako roztwór 0 g/l. 4.5.4. Roztwór wzorcowy C Pobrać 2 ml roztworu wzorcowego A (4.5.1) i pipetować do 20 ml kolby pomiarowej, następnie dodać 2 ml wzorca wewnętrznego roztworu B (4.5.2) i uzupełnić objętość przez dodanie 45 % vol. etanolu (4.4), dokładnie wymieszać. 5. Aparatura i wyposażenie 5.1. Kapilarny chromatograf gazowy z detektorem płomieniowo-jonizacyjnym (FID) i integrator lub inne urządzenie do obróbki danych umożliwiające pomiar wartości w punkcie maksymalnym lub powierzchni piku, z automatycznym próbnikiem lub sprzętem umożliwiającym ręczne wstrzyknięcie próbki. 5.2. Wtryskiwacz wieloczęściowy/nierozdzielny 5.3. Na przykład chromatograficzna kolumna kapilarna: Długość: 50 m Średnica wewnętrzna: 0,32 mm Grubość błonki (warstewki): 0,2 μm Faza stacjonarna: FFAP – zmodyfikowany kwas tereftalowy glikol polietylenowy usieciowany porowaty polimer. 5.4. Zwykły sprzęt laboratoryjny: Wysokiej klasy wolumetryczne szkło laboratoryjne, waga analityczna (dokładność: ± 0,1 mg). 6. Warunki chromatografii Rodzaj kolumny, jej wymiary, jak też warunki prowadzenia chromatografii gazowej powinny pozwolić na oddzielenie anetolu i wzorca wewnętrznego od siebie i od innych substancji zakłócających. Typowe warunki dla kolumny podanej w przykładzie 5.3 są następujące: 6.1. Gaz nośny: hel analityczny 6.2. Przepływ: 2 ml/min 6.3. Temperatura wtryskiwacza: 250 °C 6.4. Temperatura detektora: 250 °C 6.5. Stan temperatury pieca: izotermiczny, 180 °C, czas wykonania 10 minut 6.6. Objętość wstrzyknięcia: 1 μl, rozdział 1:40. 7. Próbki Próbki należy przechowywać w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem i zimnem. 8. Procedura 8.1. Sortowanie próbek na obecność estragolu W celu upewnienia się o niewystępowaniu w próbce estragolu pochodzenia naturalnego należy przeprowadzić ślepą próbę bez dodatku jakiegokolwiek wzorca wewnętrznego. Jeśli taka analiza wykaże występowanie estragolu pochodzenia naturalnego, należy wybrać inny wzorzec wewnętrzny (np. mentol). Pipetować 2 ml próbki do 20 ml kolby pomiarowej i uzupełnić objętość przez dodanie 45 % vol. etanolu (4.4), dokładnie wymieszać. 8.2. Przygotowanie niewiadomych próbek Pipetować 2 ml próbki do 20 ml kolby pomiarowej, a następnie dodać 2 ml wzorca wewnętrznego roztworu B (4.5.2) i uzupełnić objętość przez dodanie 45 % vol. etanolu (4.4), dokładnie wymieszać. 8.3. Próba ślepa Pipetować 2 ml wzorca wewnętrznego roztworu B (4.5.2) do 20 ml kolby pomiarowej i uzupełnić objętość przez dodanie 45 % vol. etanolu (4.4), dokładnie wymieszać. 8.4. Badanie liniowości Przed rozpoczęciem analizy należy sprawdzić liniowość reakcji płomieniowego detektora jonizacyjnego (FID) poprzez kolejne, prowadzone potrójnie badania wzorcowych roztworów liniowości (4.5.3). Od wartości uzyskanych z integratora dla punktu maksymalnego lub powierzchni piku dla każdego wstrzyknięcia sporządzić wykres stężenia ich roztworu macierzystego w g/l w zależności od współczynnika R dla każdego wstrzyknięcia. R = wartość w punkcie maksymalnym lub powierzchni piku dla transanetolu, podzielone przez odpowiadające wartości dla estragolu. W rezultacie powinien powstać wykres liniowy. 8.5. Oznaczenie Wstrzyknąć ślepy roztwór (8.3), dalej roztwór wzorcowy C (4.5.4), a następnie jeden z wzorców liniowości (4.5.3) działający jako próbka kontroli jakości (może być wybrany w odniesieniu do prawdopodobnego stężenia transanetolu w próbce niewiadomej), po czym pięć niewiadomych (8.2). Dla uzyskania stabilności analitycznej po każdych pięciu niewiadomych próbkach wstawić próbkę liniowości (kontroli jakości). 9. Obliczanie współczynnika reakcji Przeprowadzić pomiary obszarów piku (przy pomocy integratora lub innego systemu obliczania danych) lub wysokości piku (całkowanie, integracja ręczna) dla transanetolu i pików wzorca wewnętrznego. 9.1. Obliczanie współczynnika reakcji (RFi) Współczynnik RFi oblicza się następująco: RFi = (Ci/obszar lub wysokość i)*(obszar lub wysokośćis/Cis) gdzie: Ci oznacza stężenie transanetolu w roztworze wzorcowym (mianowanym) A (4.5.1) Cis oznacza stężenie wzorca wewnętrznego w roztworze wzorcowym B (4.5.2) obszari oznacza obszar (lub wysokość) piku transanetolu obszaris oznacza obszar (lub wysokość) piku wzorca wewnętrznego RFi oblicza się z pięciu próbek roztworu C (4.5.4). 9.2. Analiza roztworów do testów reakcji liniowości Wstrzyknąć roztwory do testów reakcji liniowości (4.5.3). 9.3. Analiza próbki Wstrzyknąć roztwór niewiadomej próbki (8.2). 10. Obliczanie wyników Wzór na obliczanie stężenia transanetolu jest następujący: ci = Cis * (obszar lub wysokośći/obszar lub wysokośćis)*RFi gdzie: ci oznacza niewiadome stężenie transanetolu Cis oznacza stężenie wzorca wewnętrznego w niewiadomym (4.5.2) Obszar lub wysokośći stanowi obszar lub wysokość piku transanetolu Obszar lub wysokośćis stanowi obszar lub wysokość piku wzorca wewnętrznego RFi stanowi współczynnik reakcji (obliczany jak w 9.1) Stężenie transanetolu jest wyrażone w gramach na jeden litr, z dokładnością do jednego miejsca dziesiętnego. 11. Zapewnienie i kontrola jakości Chromatogramy powinny zapewniać oddzielenie anetolu i wzorca wewnętrznego od siebie i od innych substancji kolidujących. Wartość RFi jest obliczana z wyników pięciu wstrzyknięć roztworu C (4.5.4). Jeśli współczynnik zmienności (CV % = (odchylenie standardowe/średnie)*100)) wynosi ± 1 %, przeciętna wartość RFi może być przyjęta. Powyższą metodę należy stosować do obliczania stężenia transanetolu w próbce wybranej do kontroli jakości z roztworów kontroli liniowości (4.5.3). Jeśli średnie obliczone wyniki z analizy roztworu kontroli liniowości wybranego do próbki wewnętrznej kontroli jakości (IQC) są w granicach ± 2,5 % ich wartości teoretycznej, wówczas wyniki dla próbek niewiadomych mogą być przyjęte. 12. Traktowanie próbek napojów alkoholowych zawierających znaczną ilość cukru i próbki likieru przed analizą metodą chromatografii gazowej (GC). Ekstrakcja alkoholu z napoju alkoholowego zawierającego znaczną ilość cukru w celu umożliwienia oznaczenia stężenia transanetolu za pomocą kapilarnej chromatografii gazowej. 12.1. Zasada Pobiera się podwielokrotną część próbki likieru i dodaje się do niej wzorzec wewnętrzny w stężeniu równym stężeniu analitu (transanetolu) w likierze. Do tego dodaje się dodekanohydrat ortofosforanu sodowego i bezwodny siarczan amonowy. Otrzymana mieszanka zostaje dokładnie wstrząśnięta i schłodzona, a z wytworzonych w niej dwóch warstw zostaje usunięta górna warstwa alkoholu. Pobiera się podwielokrotną część tej warstwy alkoholu i rozcieńcza 45 % roztworem etanolu (4.4) (uwaga: na tym etapie nie dodaje się żadnego wzorca wewnętrznego, gdyż został on już dodany). Powstały roztwór zostaje poddany analizie metodą chromatografii gazowej. 12.2. Odczynniki i materiały Podczas ekstrakcji należy używać jedynie odczynników o czystości powyżej 99 %. 12.2.1. Bezwodny siarczan amonu, (CAS 7783-20-2). 12.2.2. Ortofosforan sodowy dwuzasadowy, dodekanohydrat (CAS 10039-32-4). 12.3. Aparatura i wyposażenie Kolby stożkowe, kolby rozdzielające, chłodziarka. 12.4. Procedura 12.4.1. Sortowanie próbek na obecność estragolu W celu upewnienia się o niewystępowaniu w próbce estragolu pochodzenia naturalnego należy przeprowadzić ślepą ekstrakcję (12.6.2) i analizę bez dodatku jakiegokolwiek wzorca wewnętrznego. Jeśli taka analiza wykaże występowanie estragolu pochodzenia naturalnego, należy wybrać inny wzorzec wewnętrzny. 12.4.2. Ekstrakcja Do stożkowej kolby pipetować 5 ml 96 % etanolu (4.1), odważyć do niej 50 mg wzorca wewnętrznego (4.3) i dodać 50 ml próbki. Dodać 12 g bezwodnego siarczanu amonu (12.2.1) i 8.6 g dodekahydratu dwuzasadowego ortofosforanu sodu (12.2.2). Zatkać kolbę stożkową. Wstrząsać kolbę co najmniej przez 30 minut. Można stosować mechaniczne urządzenie wstrząsające, oprócz pokrytego teflonem magnetycznego pręta mieszadłowego, gdyż teflon absorbuje pewną cześć analitu (składnika wykrywanego). Należy zwrócić uwagę na fakt niecałkowitego rozpuszczenia dodanych soli. Umieścić zakorkowaną kolbę w lodówce w temp. T < 5 C na co najmniej dwie godziny. Po tym czasie powinny się wytworzyć dwie wyraźne płynne warstwy i sucha pozostałość. Warstwa alkoholu powinna być wyraźnie klarowna, w przeciwnym razie należy umieścić kolbę z powrotem w lodówce, aż do uzyskania wyraźnego oddzielenia. Gdy warstwa alkoholu jest już odpowiednio klarowna, należy ostrożnie bez naruszania warstwy wodnej pobrać analit (np. 10 ml), umieścić w fiolce z oranżowego szkła i szczelnie zamknąć. 12.4.3. Przygotowanie ekstrahowanej próbki do analizy Doprowadzić ekstrakt (12.4.2) do uzyskania temperatury pokojowej. Pobrać 2 ml alkoholowej warstwy z ekstrahowanej i doprowadzonej do temperatury pokojowej próbki, pipetować do 20 ml kolby pomiarowej, uzupełnić objętość przez dodanie 45 % etanolu (4.4), dokładnie wymieszać. 12.5. Oznaczanie Zachować procedurę przedstawioną w 8.5. 12.6. Obliczanie wyników Przy obliczaniu wyników należy stosować następujący wzór: Ci = (mis/V)* (obszari/obszar is) *RFi gdzie: mis oznacza wagę pobranego (12.4.2) wzorca wewnętrznego (4.3) (w miligramach) V oznacza objętość niewiadomej próbki (50 ml) RFi oznacza współczynnik reakcji (9.1) obszari oznacza obszar piku transanetolu obszaris oznacza obszar piku wzorca wewnętrznego Wyniki są podane w gramach na jeden litr, z dokładnością do jednego miejsca dziesiętnego. 12.7. Kontrola i zapewnienie jakości Zachować procedurę przedstawioną w punkcie 11 powyżej. 13. Charakterystyka wyników stosowanej metody (dokładność) Wyniki statystyczne badania międzylaboratoryjnego: poniższe tabele podają wartości dla anetolu. Poniższe dane zostały uzyskane z badania wyników międzynarodowej metody przeprowadzonego według ustalonych procedur międzynarodowych Rok badania międzylaboratoryjnego | 1998 | Liczba laboratoriów | 16 | Liczba próbek | 10 | Analit | anetol | Anyżówka (Pastis): Próbki | A | B | C | D | E | F | Liczba laboratoriów pozostała po eliminacji wartości odstających | 15 | 15 | 15 | 13 | 16 | 16 | Liczba wartości odstających (laboratoriów) | 1 | 1 | 1 | 3 | – | – | Liczba przyjętych wyników | 30 | 30 | 30 | 26 | 16 | 16 | Średnia wartość g/l | 1,477 | 1,955 | 1,940 | 1,833 | 1,741 | 1,754 | Odchylenie standardowe powtarzalności (Sr) g/l | 0,022 | 0,033 | 0,034 | 0,017 | – | – | Względne odchylenie standardowe powtarzalności (RSDr) (%) | 1,5 | 1,7 | 1,8 | 0,9 | – | – | Granica powtarzalności (r) g/l | 0,062 | 0,093 | 0,096 | 0,047 | – | – | Odchylenie standardowe odtwarzalności (SR) g/l | 0,034 | 0,045 | 0,063 | 0,037 | 0,058 | 0,042 | Względne odchylenie standardowe odtwarzalności (RSDR) (%) | 2,3 | 2,3 | 3,2 | 2,0 | 3,3 | 2,4 | Granica odtwarzalności (R) g/l | 0,094 | 0,125 | 0,176 | 0,103 | 0,163 | 0,119 | Rodzaje próbki: A anyżówka (pastis), ślepe duplikaty B anyżówka (pastis), ślepe duplikaty C anyżówka (pastis), ślepe duplikaty D anyżówka (pastis), ślepe duplikaty E anyżówka (pastis), pojedyncze duplikaty F anyżówka (pastis), pojedyncze duplikaty Inne aromatyzowane anyżem napoje alkoholowe: Próbki | G | H | I | J | Liczba laboratoriów pozostała po eliminacji wartości odstających | 16 | 14 | 14 | 14 | Liczba wartości odstających (laboratoriów) | – | 2 | 1 | 1 | Liczba przyjętych wyników | 32 | 28 | 28 | 28 | Średnia wartość g/l | 0,7780,530* | 1,742 | 0,351 | 0,599 | Odchylenie standardowe powtarzalności (Sr) g/l | 0,020 | 0,012 | 0,013 | 0,014 | Względne odchylenie standardowe powtarzalności (RSDr) (%) | 3,1 | 0,7 | 3,8 | 2,3 | Granica powtarzalności (r) g/l | 0,056 | 0,033 | 0,038 | 0,038 | Odchylenie standardowe odtwarzalności (SR) g/l | 0,031 | 0,029 | 0,021 | 0,030 | Względne odchylenie standardowe odtwarzalności (RSDR) (%) | 4,8 | 1,6 | 5,9 | 5,0 | Granica odtwarzalności (R) g/l | 0,088 | 0,080 | 0,058 | 0,084 | Rodzaje próbek: G ouzo, rozdzielone poziomy* H anyżowka, ślepe duplikaty I aromatyzowany anyżkiem likier, duplikaty J aromatyzowany anyżkiem likier, duplikaty. VI. KWAS LUKRECJOWY. OZNACZANIE KWASU LUKRECJOWEGO METODĄ WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ 1. Zakres Metoda ta jest odpowiednia do oznaczania kwasu lukrecjowego w napojach alkoholowych aromatyzowanych anyżkiem z zastosowaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Rozporządzenie (EWG) nr 1576/89 określa, że każdy aromatyzowany anyżkiem napój alkoholowy nazywany "pastis" musi zawierać 0,05 i 0,5 g kwasu lukrecjowego na litr. 2. Odniesienia normatywne ISO 3696: 1987 Woda do zastosowań w laboratorium analitycznym – specyfikacje i metody testów (Water for analytical laboratory use – Specifications and test methods). 3. Zasada Stężenie kwasu lukrecjowego(glycyrrhizic acid) oznacza się przy zastosowaniu wysokosprawnościowej chromatografii cieczowej (HPLC) z detekcją promieniowania nadfioletowego (UV). Rozwór wzorcowy (mianowany) i próbka testowa są filtrowane i oddzielnie wstrzyknięte do systemu HPLC. 4. Odczynniki i materiały Do analizy należy używać wyłącznie odczynników klasy HPLC, bezwodnego etanolu i wody klasy 3 według definicji ISO 3696. 4.1. Etanol 96 % vol. (CAS 64-17-5). 4.2. Ammonium glycyrrhizinate, C42H62O16 · NH3 (sól amonowa kwasu lukrecjowego) (Mol. Wt.: 839,98)(CAS 53956-04-0): czystość co najmniej 90 % (Mol. Wt.: kwas lukrecjowy 822,94). 4.3. Kwas octowy lodowaty, CH3COOH (CAS 64-19-7). 4.4. Metanol, CH3OH (CAS 67-56-1). 4.5. Etanol 50 % vol. Dla 1000 ml w temp. 20 °C: - 96 % vol. etanol (4.1): 521 ml - Woda (2.0): 511 ml. 4.6. Przygotowanie roztworów elucyjnych dla chromatografii HPLC 4.6.1. Rozpuszczalnik elucyjny A (przykład) 80 części (objętościowo) wody (2.0) 20 części (objętościowo) kwasu octowego (4.3). Odgazowywać rozpuszczalnik elucyjny przez pięć minut Uwaga: Jeśli używana woda nie była poddana mikrofiltracji, zaleca się przefiltrowanie przygotowanego rozpuszczalnika elucyjnego przez filtr dla rozpuszczalników organicznych o wielkości porów mniejszej lub równej 0,45 μm. 4.6.2. Rozpuszczalnik elucyjny B Metanol (4.4) 4.7. Przygotowanie roztworów wzorcowych Wszystkie roztwory wzorcowe po upływie dwóch miesięcy muszą być przygotowywane na świeżo. 4.7.1. Roztwór referencyjny C Z dokładnością do 0,1 mg odważyć 25 mg soli amonowej kwasu lukrecjowego (4.2) w 100 ml kolbie pomiarowej. Dodać trochę 50 % vol. etanolu (4.5) i rozpuścić sól amonową kwasu lukrecjowego. Po jej rozpuszczeniu dopełnić do znaku przez dodanie 50 % vol. etanolu (4.5). Przefiltrować przez filtr dla rozpuszczalników organicznych. 4.7.2. Roztwory wzorcowe stosowane do sprawdzania liniowości reakcji oprzyrządowania. Roztwór podstawowy (A)1,0 g/l przygotowuje się przez odważenie z dokładnością do 0,1 mg, 100 mg soli amonowej kwasu lukrecjowego w 100 ml kolbie pomiarowej. Dodać trochę 50 % vol. etanolu (4.5) i rozpuścić sól amonową kwasu lukrecjowego. Po jej rozpuszczeniu dopełnić do znaku przez dodanie 50 % vol. etanolu (4.5). Co najmniej cztery inne roztwory odpowiadające 0,05, 0,1, 0,25 i 0,5 g/l soli amonowej kwasu lukrecjowego przygotowuje się przez pipetowanie odpowiednio 5 ml, 10 ml, 25 ml i 50 ml roztworu podstawowego 1,0 g/l, w oddzielnych 100 ml kolbach pomiarowych. Następnie należy dopełnić do znaku przez dodanie 50 % vol. etanolu (4.5) i dokładnie wymieszać.. Wszystkie roztwory należy przefiltrować przez filtr dla rozpuszczalników organicznych. 5. Aparatura i wyposażenie 5.1. System rozdzielenia 5.1.1. Wysokosprawnościowy chromatograf cieczowy. 5.1.2. System pompowania umożliwiający z wielką dokładnością uzyskanie i utrzymanie stałego lub zaprogramowanego natężenia przepływu. 5.1.3. Spektrofotometryczny system wykrywania promieniowania nadfioletowego (UV): ustawienie na 254 nm. 5.1.4. System odgazowywania rozpuszczalnika. 5.2. Integrator lub rejestrator obliczeniowy, kompatybilny z pozostałymi elementami systemu. 5.3. Kolumna (przykład): Materiał: stal nierdzewna lub szkło Średnica wewnętrzna: 4–5 mm Długość: 100–250 mm Faza stacjonarna: krzemionka usieciowana z (najlepiej sferyczną) oktadecylową grupą funkcyjną (C18), maksymalny rozmiar cząstek: 5 μm. 5.4. Wyposażenie laboratoryjne 5.4.1. Waga analityczna o dokładności do 0,1 mg. 5.4.2. Pomiarowe szkło laboratoryjne klasy A. 5.4.3. Układ filtracji mikromembranowej dla małych objętości. 6. Warunki chromatografii 6.1. Charakterystyka elucji (wymywania): (przykład) - natężenie przepływu: 1 ml/minuta, - rozpuszczalnik A = 30 %, - rozpuszczalnik B = 70 %. 6.2. Wykrywanie: - UV = 254 nm 7. Procedura 7.1. Przygotowanie próbki alkoholu Przefiltrować, jeśli konieczne, przez filtr dla organicznych rozpuszczalników (średnica pora: 0,45 μm.). 7.2. Oznaczanie Po ustabilizowaniu warunków dla chromatografii, - wstrzyknąć 20 μl roztworu referencyjnego C (4.7.1), - wstrzyknąć 20 μl roztworu próbki, - porównać oba chromatogramy. Zidentyfikować piki kwasu lukrecjowego na podstawie ich czasów retencji. Przeprowadzić pomiary ich obszarów (lub wysokości) i obliczyć stężenie w g/l z dokładnością do dwóch liczb dziesiętnych, stosując następujące równanie: c= c ×h × P × 823H × 100 × 840 Gdzie: c oznacza stężenie (w gramach na litr) kwasu lukrecjowego w analizowanym napoju alkoholowym C oznacza stężenie (w gramach na litr) soli amonowej kwasu lukrecjowego w roztworze referencyjnym h oznacza obszar (lub wysokość) piku kwasu lukrecjowego w analizowanym napoju alkoholowym H oznacza obszar (lub wysokość) piku kwasu lukrecjowego w roztworze referencyjnym P oznacza stopień czystości referencyjnej soli amonowej kwasu lukrecjowego (w %) 823 oznacza masę jednej gramocząsteczki kwasu lukrecjowego 840 oznacza masę jednej gramocząsteczki soli amonowej kwasu lukrecjowego 8. Charakterystyka wyników stosowanej metody (dokładność) Wyniki statystyczne badania międzylaboratoryjnego: poniższa tabela przedstawia wartości dla kwasu lukrecjowego. Poniższe dane zostały uzyskane z badania wyników międzynarodowej metody przeprowadzonego według ustalonych procedur międzynarodowych. Rok badania międzylaboratoryjnego | 1998 | Liczba laboratoriów | 16 | Liczba próbek | 5 | Analit | kwas lukrecjowy | Próbki | A | B | C | D | E | Liczba laboratoriów pozostała po eliminacji wartości odstających | 13 | 14 | 15 | 16 | 16 | Liczba wartości odstających (laboratoriów) | 3 | 2 | 1 | – | – | Liczba przyjętych wyników | 26 | 28 | 30 | 32 | 32 | Średnia wartość g/l | 0,046 | 0,092(*)0,099 | 0,089 | 0,249 | 0,493 | Odchylenie standardowe powtarzalności (Sr) g/l | 0,001 | 0,001 | 0,001 | 0,002 | 0,003 | Względne odchylenie standardowe powtarzalności (RSDr) (%) | 1,5 | 1,3 | 0,7 | 1,0 | 0,6 | Granica powtarzalności (r) g/l | 0,002 | 0,004 | 0,002 | 0,007 | 0,009 | Odchylenie standardowe odtwarzalności (SR) g/l | 0,004 | 0,007 | 0,004 | 0,006 | 0,013 | Względne odchylenie standardowe odtwarzalności (RSDR) (%) | 8,6 | 7,2 | 4,0 | 2,5 | 2,7 | Granica odtwarzalności (R) g/l | 0,011 | 0,019 | 0,010 | 0,018 | 0,037 | Rodzaje próbek: A anyżówka (pastis), ślepe duplikaty B anyżówka (pastis), rozdzielone poziomy C anyżowka (pastis), ślepe duplikaty D anyżowka (pastis), ślepe duplikaty E anyżowka (pastis), ślepe duplikaty VII. CHALKONY. METODA WYSOKOSPRAWNOŚCIOWEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ DLA SPRAWDZANIA OBECNOŚCI CHALKONÓW W ANYŻÓWCE (PASTIS) 1. Zakres Metoda ta jest przydatna do oznaczenia obecności lub braku chalkonów w napojach alkoholowych aromatyzowanych anyżkiem. Chalkony są naturalnymi barwnikami rodziny flawonoidów obecnymi w korzeniu lukrecji (Glycyrrhiza glabra). Aby otrzymać nazwę "pastis", napój alkoholowy aromatyzowany anyżkiem musi zawierać chalkony (rozporządzenie (EWG) nr 1576/89). 2. Odniesienia normatywne ISO 3696: 1987 Woda do zastosowań w laboratorium analitycznym – specyfikacje i metody testów (Water for analytical laboratory use – Specifications and test methods). 3. Zasada Przygotowuje się referencyjny roztwór ekstraktu korzenia lukrecji. Obecność lub brak chalkonów ustala się za pomocą wysokosprawnościowej chromatografii cieczowej (HPLC) z wykrywaniem promieni nadfioletowych (UV). 4. Odczynniki i materiały Do analizy należy używać wyłącznie odczynników klasy HPLC, etanolu 96 % vol i wody klasy 3 według definicji ISO 3696. 4.1. Etanol 96 % vol. (CAS 64-17-5) 4.2. Acetonitryl, CH3CN, (CAS 75-05-8) 4.3. Substancja referencyjna: Glycyrrhiza glabra: lukrecja, "słodki korzeń" Grubo zmielone korzenie lukrecji (Glycyrrhiza glabra). Przeciętne rozmiary sztywnych cząstek (ziaren): długość: 10–15 mm, grubość: 1–3 mm. 4.4. Octan sodu, CH3COONa, (CAS 127-09-3) 4.5. Kwas octowy lodowaty, CH3COOH, (CAS 64-19-7) 4.6. Przygotowanie roztworów 4.6.1. Etanol 50 % obj. Dla 1000 ml w temp. 20 °C: - 96 % vol. etanol (4.1): 521 ml, - Woda (2.0): 511 ml. 4.6.2. Rozpuszczalnik A: acetonitryl Acetonitryl (4.2) o czystości analitycznej HPLC. Odgazowanie 4.6.3. Rozpuszczalnik B: 0,1 M roztwór buforowy octanu sodu, pH 4,66. Odważyć 8,203 g octanu sodu (4.4), dodać 6,005 g lodowatego kwasu octowego (4.5) i uzupełnić do 1000 ml wodą (2) w kolbie pomiarowej. 5. Przygotowanie ekstraktu referencyjnego z korzenia lukrecji Glycyrrhiza glabra (4.3) 5.1. Odważyć 10 g zmielonego korzenia lukrecji (Glycyrrhiza glabra) (4.3) i umieścić w kulistej kolbie destylacyjnej - dodać 100 ml 50 % vol. etanolu (4.6.1), - gotować przez godzinę pod chłodnicą zwrotną, - filtrować, - odstawić filtrat do późniejszego wykorzystania. 5.2. Odzyskać z filtra ekstrakt lukrecji - umieścić w kulistej kolbie destylacyjnej, - dodać 100 ml 50 % vol. etanolu (4.6.1), - gotować przez godzinę pod chłodnicą zwrotną, - flitować. Odstawić filtrat do późniejszego wykorzystania. 5.3. Ekstrakcja z korzenia lukrecji musi być przeprowadzona kolejno trzy razy. 5.4. Połączyć trzy filtraty. 5.5. Odparować fazę rozpuszczalnika (5.4) na wyparce rotacyjnej. 5.6. Rozpuścić szczątkowy ekstrakt (5.5), dodając 100 ml 50 % vol. etanolu (4.6.1). 6. Aparatura i wyposażenie 6.1. System rozdzielenia. 6.1.1. Wysokosprawnościowy chromatograf cieczowy. 6.1.2. System pompowania umożliwiający z wielką dokładnością uzyskanie i utrzymanie stałego lub zaprogramowanego natężenia przepływu. 6.1.3. Spektrofotometryczny system wykrywania promieniowania nadfioletowego (UV)/widzialnego: możliwość ustawienia na 254 nm i 370 nm. 6.1.4. System odgazowywania rozpuszczalnika: 6.1.5. Piec kolumny z możliwością ustawienia na temperaturę 40 ± 0,1 °C. 6.2. Integrator lub rejestrator obliczeniowy, kompatybilny z pozostałymi elementami systemu 6.3. Kolumna Materiał: stal nierdzewna lub szkło Średnica wewnętrzna: 4–5 mm Faza stacjonarna: krzemionka usieciowana z (najlepiej sferyczną) oktadecylową grupą funkcyjną (C18), maksymalny rozmiar cząstek: 5 μm. 6.4. Zwykłe wyposażenie laboratoryjne, w tym: 6.4.1. waga analityczna o dokładności do ± 0,1 mg; 6.4.2. Aparat destylacyjny z chłodnicą zwrotną, zawierający np.: - 250 ml kulistą kolbę ze znormalizowanym złączem szlifowym, - chłodnica zwrotna o długości 30 cm, oraz - źródło ciepła (poprzez odpowiednie przygotowania należy unikać jakichkolwiek reakcji pyrogenicznych obejmujących substancję ekstrahowaną). 6.4.3. Obrotowy aparat wyparny. 6.4.4. Układ filtracyjny (np. lejek Buchnera). 6.5. Warunki chromatografii (przykład). 6.5.1. Charakterystyka elucji (wymywania) rozpuszczalników A (4.6.2) i B (4.6.3): - w ciągu 15 minut przesunięcie z 20/80 (v/v) do 50/50 (v/v) gradienta, - w ciągu 5 minut przesunięcie z 50/50 (v/v) do 75/25 (v/v) gradienta, - w ciągu 5 minut jednakowa moc przy 75/25 (v/v), - stabilizacja kolumny pomiędzy wstrzyknięciami, - przez 5 minut jednakowa moc przy 20/80 (v/v). 6.5.2. Natężenie przepływu: 1 ml/min. 6.5.3. Ustawienia detektora UV (promieniowania nadfioletowego): detektor musi być ustawiony na 370 nm w celu wykrycia obecności chalkonów, a następnie na 254 nm dla wykrycia kwasu lukrecjowego. Uwaga: zmiana długości fali (z 370 nm na 254 nm) musi być przeprowadzona 30 sekund przed początkiem piku elucji kwasu lukrecjowego. 7. Procedura 7.1. Przygotowanie próbki alkoholu Przefiltrować przez filtr dla rozpuszczalników organicznych (średnica pora: 0,45 μm). 7.2. Przygotowanie resztkowego ekstraktu lukrecji (5.6) Przed analizą rozcieńczyć w stosunku 1: 10 50 % vol. etanolem (4.6.1). 7.3. Oznaczanie 7.3.1. Wstrzyknąć 20 μl przygotowanego ekstraktu lukrecji (7.2). Przeprowadzić analizę przy zastosowaniu warunków chromatografii przedstawionych powyżej (6.5). 7.3.2. Wstrzyknąć 20 μl próbki (7.1) (próbka napoju alkoholowego aromatyzowanego anyżem). Przeprowadzić analizę, stosując przedstawione powyżej (6.5). warunki chromatografii. 7.3.3. Porównać oba chromatografy, między którymi musi być duże podobieństwo w strefie wyjścia chalkonu (podczas wykrywania przy 370 nm w warunkach analizy jak przedstawiono powyżej) (patrz rys. 1). 8. Chromatogram charakterystyki anyżówki (pastis) +++++ TIFF +++++ 9. Charakterystyka wyników metody (dokładność) Wyniki badań: poniższa tabela podaje wyniki dotyczące rozpoznania obecności lub nieobecności chalkonów w "pastis" i napojach alkoholowych aromatyzowanych anyżem. Poniższe dane zostały uzyskane z badania wyników międzynarodowej metody przeprowadzonego według ustalonych procedur międzynarodowych. Rok badania międzylaboratoryjnego | 1998 | Liczba laboratoriów | 14 | Liczba próbek | 11 | Analit | chalkony | Próbki | A | B | C | D | E | F | Liczba laboratoriów pozostała po eliminacji wartości odstających | 14 | 14 | 14 | 14 | 14 | 13 | Liczba wartości odstających (laboratoriów) | – | – | – | – | – | 1 [1] | Liczba przyjętych wyników | 28 | 14 | 14 | 28 | 28 | 26 | Liczba wyników na obecność chalkonów | 28 | 14 | 14 | 0 | 28 | 0 | Liczba wyników na nieobecność chalkonów | 0 | 0 | 0 | 28 | 0 | 26 | Poprawne wyniki (%) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | Próbki | G | H | I | J | K | Liczba laboratoriów pozostała po eliminacji wartości odstających | 14 | 14 | 14 | 14 | 14 | Liczba wartości odstających (laboratoriów) | – | – | – | – | – | Liczba przyjętych wyników | 28 | 14 | 14 | 28 | 28 | Liczba wyników na obecność chalkonów | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | Liczba wyników na nieobecność chalkonów | 28 | 14 | 14 | 28 | 28 | Poprawne wyniki (%) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | Rodzaje próbek: A pastis, ślepe duplikaty B pastis, próbka pojedyncza C pastis, próbka pojedyncza D "pastis" (niezawierający chalkonów), ślepe próbki E "pastis" (niezawierający chalkonów), ślepe próbki F likier aromatyzowany anyżem (niezawierający chalkonów), ślepe próbki G likier aromatyzowany anyżem (niezawierający chalkonów), ślepe próbki H ouzo (niezawierający chalkonów), pojedyncza próbka I ouzo (niezawierające chalkonów), pojedyncza próbka J anyż (niezawierający chalkonów), ślepe próbki K "pastis" (niezawierający chalkonów), ślepe próbki IX. ŻÓŁTKO JAJA. OZNACZANIE STĘŻENIA ŻÓŁTKA JAJA W NAPOJACH SPIRYTUSOWYCH – METODA FOTOMETRYCZNA 1. Zakres Metoda ta jest stosowana do oznaczania stężenia żółtka jaja w zakresie od 40 do 250 g/l w likierze jajecznym i likierze z dodatkiem jaj. 2. Odniesienia normatywne ISO 3696: 1987 Woda do zastosowań w laboratorium analitycznym – specyfikacje i metody testów 1897 (Water for analytical laboratory use – Specifications and test methods.) 3. Zasada Rozpuszczalne w etanolu, obecne w żółtku jaja związki fosforu zostają ekstrahowane i oznaczone fotometrycznie jako związek kompleksowy molibdenianu fosforu. 4. Odczynniki i materiały 4.1. Woda dwukrotnie destylowana 4.2. Ziemia okrzemkowa 4.3. Etanol 96 % vol. (CAS 64-17-5) 4.4. 15 % roztwór octanu magnezu (CAS 16674-78-5) 4.5. 10 % kwas siarkowy (CAS 7664-93-9) 4.6. 1 N kwasu siarkowego. 4.7. Roztwór 0,16 g/l diwodorofosforanu potasu (CAS 778-77-0), KH2PO4 4.8. Odczynnik do oznaczania fosforanu: rozpuścić 20 g heptamolibdenianu amonu (CAS 12054-85-2), (NH4)6Mo7O24 · 4H2O w 400 ml wody w temp. 50 °C; w drugim naczyniu rozpuścić 1 g wanadianu amonu (CAS 7803-55-6), NH4VO3 w 300 ml gorącej wody, dopuścić do ostygnięcia, a następnie dodać 140 ml stężonego kwasu azotowego (CAS 7697-37-2). Połączyć schłodzone roztwory w 1000 ml kolbie pomiarowej i uzupełnić do znaku 1000 ml. 5. Aparatura i wyposażenie 5.1. 100 ml stożkowa kolba 5.2. Kąpiel ultradźwiękowa (lub mieszadło indukcyjne) 5.3. 100 ml kolba pomiarowa 5.4. 20 °C kąpiel wodna 5.5. Filtr (Whatman nr 4 lub ekwiwalent) 5.6. Tygiel porcelanowy (lub platynowy) 5.7. Kąpiel wodna z wrzącej wody 5.8. Płyta grzejna 5.9. Piec muflowy 5.10. 50 ml kolba pomiarowa 5.11. 20 ml kolba pomiarowa 5.12. Spektrofotometr ustawiony na 420 nm 5.13. 1 cm kuweta. 6. Próbki Próbki są przechowywane przed analizą w temperaturze pokojowej. 7. Procedura 7.1. Przygotowanie próbki 7.1.1. Odważyć 10 g próbki do 100 ml kolby stożkowej (5.1). 7.1.2. Dodawać stopniowo w małych porcjach 70 ml etanolu (4.3), z wirowaniem przy każdym dodaniu, i umieścić w kąpieli ultradźwiękowej (5.2) na 15 minut (lub mieszać mieszaninę mieszadłem magnetycznym (5.2) przez 10 minut w temperaturze pokojowej). 7.1.3. Przenieść zawartość kolb do 100 ml kolby pomiarowej (5.3) z popłuczynami etanolu (4.3). Nastawić do znaku kalibracji z etanolem (4.3) i umieścić kolby w 20 °C kąpieli wodnej (5.4). Wyregulować do znaku kalibracji przy 20 °C. 7.1.4. Dodać niewielką ilość ziemi okrzemkowej (4.2) i filtrować (5.5), odrzucając pierwsze 20 ml. 7.1.5. Przenieść 25 ml filtratu do porcelanowego (lub platynowego) tygla (5.6). Następnie filtrat musi być zagęszczony poprzez delikatne odparowywanie w kąpieli we wrzącej wodzie (5.7), z dodatkiem 5 ml 15 % roztworu octanu magnezu (4.4). 7.1.6. Umieścić tygle na płycie grzejnej (5.8) i podgrzewać aż do wysuszenia. 7.1.7. Spopielić pozostałość przez podgrzanie do żarzenia w 600 °C w piecu muflowym (5.9) aż do uzyskania białego popiołu. Proces ten ma trwać przez minimum półtorej godziny, ale można również zostawić przez noc. 7.1.8. Rozpuścić popiół w 10 ml 10 % kwasu siarkowego (4.5) i przenieść wraz z popłuczynami wody destylowanej (4.1) do 50 ml kolby pomiarowej (5.10), dopełnić do znaku wodą destylowaną w temperaturze pokojowej. (4.1). 5 ml alikwot (jednakowa objętość roztworu rozdzielana do probówek) tego rozpuszczonego popiołu ma być używany do przygotowania próbnego roztworu do fotometrycznego oznaczania fosforanu. 7.2. Fotometryczne oznaczanie (analiza) fosforanu. 7.2.1. Roztwór porównawczy 7.2.1.1. Umieścić 10 ml 10 % kwasu siarkowego (4.5) w 50 ml kolbie pomiarowej (5.10) i uzupełnić do znaku wodą destylowaną (4.1). 7.2.1.2. Dodać do 5 ml alikwotu tego roztworu (7.2.1.1), zawartego w 20 ml kolbie pomiarowej (5.11), 1 ml jednonormalnego roztworu kwasu siarkowego (1 N) (4.6) i 2 ml odczynnika do oznaczania fosforanu (4.8) i dopełnić wodą destylowaną do 20 ml (4.1). 7.2.1.3. Zakorkować luźno zatyczką, potrząsnąć i grzać w kąpieli z wrzącej wody (5.7) przez 10 minut, następnie schłodzić w 20 °C kąpieli wodnej (5.4) przez 20 minut. 7.2.1.4. Wypełnić 1 cm kuwetę (5.13) tym porównawczym roztworem. 7.2.2. Roztwór próbny 7.2.2.1. Dodać do 5 ml alikwotu roztworu popiołu (7.2.1.1), zawartego w 20 ml kolbie pomiarowej (5.11), 1 ml jednonormalnego roztworu kwasu siarkowego (1 N) (4.6) i 2 ml odczynnika dla oznaczania fosforanu (4.8) i dopełnić wodą destylowaną do 20 ml (4.1). 7.2.2.2. Zatkać luźno zatyczką, wstrząsnąć i grzać w kąpieli z wrzącej wody (5.7) przez 10 minut, następnie schłodzić w 20 °C kąpieli wodnej (5.4) przez 20 minut. 7.2.2.3. Wytworzony w wyniku powyższych czynności żółty roztwór należy niezwłocznie poddać analizie spektrofotometrycznej (5.12) w 1 cm kuwecie (5.13) przy 420 nm, w stosunku do roztworu porównawczego (7.2.1.4). 7.2.3. Krzywa wzorcowania 7.2.3.1. Dla uzyskania krzywej wzorcowania dodać 2 ml alikwotów odczynnika fosforanu (4.8) do 20 ml kolb pomiarowych (5.11), z których każda zawiera odpowiednio 1ml jednonormalnego kwasu siarkowego (4.6) i 0, 2, 4, 6, 8 i 10 ml roztworu diwodorofosforanu potasu (4.7) i uzupełnić woda destylowaną do znaku 20 ml (4.1). 7.2.3.2. Zatkać luźno zatyczką, wstrząsnąć i grzać w kąpieli z wrzącej wody (5.7) przez 10 minut, następnie schłodzić w 20 °C kąpieli wodnej (5.4) przez 20 minut i poddać analizie spektrofotometrycznej (5.12) w 1 cm kuwecie (5.13) przy 420 nm, w stosunku do roztworu porównawczego (7.2.1.4). 7.2.3.3. Konstrukcja krzywej wzorcowania roztwór diwodorofosforanu (ml) | 0 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | P2O5 (mg) | 0 | 0,167 | 0,334 | 0,501 | 0,668 | 0,835 | 8. Przedstawienie wyników Zawartość żółtka jaja w g/l oblicza się z następującego wzoru: g/l żółtka jaja = mg P O × 110 × gęstość (density)E/40 gdzie: 110 oznacza przelicznik dla całkowitego P2O5 w g w 100 g żółtka jaja mg P2O5 oznacza wartość ustaloną z krzywej wzorcowania gęstość (density) oznacza masę właściwą na jednostkę objętości (g/ml) likieru na bazie jaj w temp. 20 °C E oznacza wagę likieru na bazie jaj w g 40 oznacza współczynnik rozcieńczenia dla 5 ml alikwotu roztworu popiołu. 9. Charakterystyka wyników metody (dokładność) Statystyczne wyniki badań międzylaboratoryjnych: poniższa tabela podaje wartości dla żółtka jaja. Poniższe dane zostały uzyskane z badania wyników międzynarodowej metody przeprowadzonego według ustalonych międzynarodowych procedur. Rok badania międzylaboratoryjnego | 1998 | Liczba laboratoriów | 24 | Liczba próbek | 5 | Analiz: | żółtko jaja | Próbki | A | B | C | D | E | Liczba laboratoriów pozostała po eliminacji wartości odstających | 19 | 20 | 22 | 20 | 22 | Liczba wartości odstających (laboratoriów) | 3 | 4 | 2 | 4 | 2 | Liczba przyjętych wyników | 38 | 40 | 44 | 40 | 44 | Wartość średnia | 147,3 | 241,1 | 227,4 | 51,9*72,8* | 191,1 | Odchylenie standardowe powtarzalności (Sr) g/l | 2,44 | 4,24 | 3,93 | 1,83 | 3,25 | Względne odchylenie standardowe powtarzalności (RSDr) (%) | 1,7 | 1,8 | 1,8 | 2,9 | 1,7 | Granica powtarzalności (r) g/l | 6,8 | 11,9 | 11,0 | 5,1 | 9,1 | Odchylenie standardowe odtwarzalności (SR) g/l | 5,01 | 6,06 | 6,66 | 3,42 | 6,87 | Względne odchylenie standardowe odtwarzalności (RSDR) (%) | 3,4 | 2,5 | 2,9 | 5,5 | 3,6 | Granica odtwarzalności (R) g/l | 14,0 | 17,0 | 18,7 | 9,6 | 19,2 | Rodzaje próbek A Advocaat, ślepe duplikaty B Advocaat, ślepe duplikaty C Advocaat, ślepe duplikaty D Advocaat (rozcieńczony), rozdzielone poziomy* E Advocaat, ślepe duplikaty [1] niezgodne wyniki dwóch duplikatów uznaje się za spowodowane błędem pobierania próbek --------------------------------------------------