„ZAŁĄCZNIK XIX

OZNACZANIE SKŁADU I ZAWARTOŚCI STEROLI ORAZ ZWIĄZKÓW ALKOHOLOWYCH METODĄ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ NA KOLUMNACH KAPILARNYCH

1. ZAKRES

W ramach metody opisuje się sposoby oznaczania zawartości prostych i łącznych związków alkoholowych w oliwie z oliwek i oliwie z wytłoczyn z oliwek, jak również w mieszankach tych dwóch rodzajów oliwy.

Związki alkoholowe w oliwie i oliwie z wytłoczyn z oliwek obejmują alkohole alifatyczne, sterole i dialkohole triterpenowe.

2. ZASADA

Oliwa, do której dodano α-cholestanol i 1-eikozanol, pełniąca rolę wewnętrznego wzorca, jest zmydlana roztworem wodorotlenku potasu w etanolu, a następnie substancja niezmydlająca się jest ekstrahowana eterem dietylowym.

Poszczególne frakcje związków alkoholowych są oddzielane od substancji niezmydlającej się albo metodą chromatografii cienkowarstwowej na podstawowej płytce z żelu krzemionkowego (metoda referencyjna), albo metodą HPLC z wykorzystaniem kolumny z żelem krzemionkowym. Frakcja uzyskana w wyniku oddzielenia żelu krzemionkowego przekształcana jest w trimetylsilyletery i następnie poddawana analizie metodą chromatografii gazowej na kolumnach kapilarnych.

CZĘŚĆ 1

PRZYGOTOWANIE SUBSTANCJI NIEZMYDLAJĄCEJ SIĘ

1. ZAKRES

W niniejszej części opisano proces przygotowania i ekstrakcji substancji niezmydlającej się. Część ta obejmuje proces przygotowania i ekstrakcji substancji niezmydlającej się z oliwy z oliwek i oliwy z wytłoczyn z oliwek.

2. ZASADA

Porcja badana jest zmydlana poprzez gotowanie pod chłodnicą zwrotną wraz z roztworem wodorotlenku potasu w etanolu. Substancja niezmydlająca się jest ekstrahowana eterem dietylowym.

3. APARATURA

Typowe wyposażenie laboratoryjne, a w szczególności następujące urządzenia:

3.1. Kolba okrągłodenna o pojemności 250 ml wyposażona w chłodnicę zwrotną ze szlifem szklanym.

3.2. Rozdzielacz o pojemności 500 ml.

3.3. Kolby o pojemności 250 ml.

3.4. Mikrostrzykawki o pojemności 100 i 500 μl.

3.5. Cylindryczny lejek do sączenia z porowatą przegrodą G3 (porowatość 15–40 μm) o średnicy około 2 cm i głębokości 5 cm, przystosowany do filtracji w próżni i ze szlifem szklanym zewnętrznym.

3.6. Kolba stożkowa o pojemności 50 ml ze szlifem szklanym wewnętrznym, którą można połączyć z lejkiem do sączenia (3.5).

3.7. Probówka o pojemności 10 ml z lejkowatym dnem i szczelnym korkiem szklanym.

3.8. Eksykator z chlorkiem wapnia.

4. ODCZYNNIKI

4.1. Minimalne miano roztworu wodorotlenku potasu 85 %.

4.2. Roztwór wodorotlenku potasu w etanolu, w przybliżeniu roztwór 2 M. Rozpuścić 130 g wodorotlenku potasu (4.1), jednocześnie schładzając, w 200 ml wody destylowanej, następnie uzupełnić etanolem do objętości jednego litra (4.7). Roztwór przechowywać w dobrze zakorkowanej butelce z ciemnego szkła przez maksymalnie 2 dni.

4.3. Eter dietylowy do analiz.

4.4. Bezwodny siarczan sodu do analiz.

4.5. Aceton do chromatografii.

4.6. Eter dietylowy do chromatografii.

4.7. Etanol do analiz.

4.8. Octan etylu do analiz.

4.9. Wzorzec wewnętrzny, α-cholestanol o czystości większej niż 99 % (czystość należy sprawdzać metodą analizy GC).

4.10. 0,2 % wewnętrzny roztwór wzorcowy (m/V) α-cholestanolu w octanie etylu (4.8).

4.11. Roztwór fenoloftaleiny, 10 g/l w etanolu (4.7).

4.12. 0,1 % (m/V) roztwór 1-eikozanolu w octanie etylu (wzorzec wewnętrzny).

5. PROCEDURA

Do kolby o pojemności 250 ml (pkt 3.1) wprowadzić przy użyciu mikrostrzykawki o pojemności 500 μl (pkt 3.4) pewną ilość wewnętrznego roztworu wzorcowego α-cholestanolu (pkt 4.10) i 1-eikozanolu (4.12) zawierającą ilość cholestanolu i eikozanolu odpowiadającą w przybliżeniu 10 % zawartości steroli i alkoholi w próbce. Na przykład w przypadku próbki zawierającej 5 g oliwy z oliwek dodać 500 μl roztworu α-cholestanolu (4.10) i 250 μL roztworu 1-eikozanolu (4.12). W przypadku oliwy z wytłoczyn oliwek dodać 1 500 μL zarówno roztworu α-cholestanolu (4.10), jak i 1-eikozanolu (4.12). Odparować do wysuszenia pod słabym strumieniem azotu w łaźni wypełnionej ciepłą wodą. Następnie po schłodzeniu kolby odważyć 5,00 ± 0,01 g suchej przefiltrowanej próbki w tej samej kolbie.

Uwaga 1: w przypadku zwierzęcych lub roślinnych olejów i tłuszczów zawierających znaczne ilości cholesterolu może wystąpić pik o czasie retencji identycznym z czasem retencji cholestanolu. W takich sytuacjach należy dokonać analizy frakcji steroli z dodaniem wewnętrznego wzorca i bez dodawania go.

Dodać 50 ml roztworu 2 M wodorotlenku potasu w etanolu (4.2) i niewielką ilość kamienia pumeksowego, uruchomić chłodnicę zwrotną i podgrzać do momentu lekkiego wrzenia, aż nastąpi zmydlenie (roztwór stanie się przejrzysty). Kontynuować podgrzewanie przez dalsze 20 minut, następnie wprowadzić 50 ml wody destylowanej od strony wylotu chłodnicy, odłączyć chłodnicę i schłodzić kolbę do temperatury około 30 °C.

Przenieść zawartość kolby ilościowo do rozdzielacza o pojemności 500 ml (3.2), używając kilku porcji wody destylowanej (50 ml). Dodać około 80 ml eteru dietylowego (4.6), mieszać energicznie przez około 60 sekund, obniżając okresowo ciśnienie przez przełączenie rozdzielacza i otwarcie zaworu odcinającego. Odstawić do całkowitego rozdzielenia się dwóch faz (uwaga 2). Następnie do drugiego rozdzielacza zebrać jak najdokładniej roztwór mydła. Przeprowadzić jeszcze dwie ekstrakcje na fazie wodno-alkoholowej w ten sam sposób przy użyciu 60–70 ml eteru dietylowego (4.6).

Uwaga 2: emulsję można wyeliminować, dodając niewielkie ilości etanolu (4.7).

Połączyć wszystkie trzy eterowe ekstrakty w jednym rozdzielaczu zawierającym 50 ml wody. Przemywać nadal wodą (50 ml), aż woda przestanie barwić się na różowy kolor po dodaniu kropli roztworu fenoloftaleiny (4.11). Po usunięciu wody popłucznej przefiltrować przez bezwodny siarczan sodu (4.4) do wcześniej zważonej kolby o pojemności 250 ml, płucząc rozdzielacz i filtr niewielkimi ilościami eteru dietylowego (4.6).

Odparować rozpuszczalnik przez destylację w wyparce obrotowej w temperaturze 30 °C w próżni. Dodać 5 ml acetonu (4.5) i usunąć całkowicie lotny rozpuszczalnik pod delikatnym strumieniem azotu. Suszyć pozostałość w piecu w temperaturze 103 ± 2 °C przez 15 minut. Schłodzić w eksykatorze i zważyć z dokładnością do 0,1 mg.

CZĘŚĆ 2

ODDZIELENIE FRAKCJI ZWIĄZKÓW ALKOHOLOWYCH

1. ZAKRES

Frakcje substancji niezmydlającej się przygotowanej w części 1 są oddzielane w poszczególnych związkach alkoholowych, alkoholach alifatycznych, sterolach i dialkoholach triterpenowych (erytrodiolu i uwaolu).

2. ZASADA

Substancja niezmydlająca się może zostać poddana frakcjonowaniu z wykorzystaniem podstawowej chromatografii cienkowarstwowej (metoda referencyjna) oraz ujawniona, zaś odpowiadające pasma mogą zostać zarysowane i wyekstrahowane. Alternatywną metodą oddzielenia jest metoda HPLC z wykorzystaniem kolumny z żelem krzemionkowym i detektora UV oraz poszczególnych zebranych frakcji. Alkohole alifatyczne i triterpenowe, a także sterole i dialkohole triterpenowe są wyodrębniane wspólnie.

3. APARATURA

Typowe wyposażenie laboratoryjne, a w szczególności następujące urządzenia:

3.1. Kompletny zestaw aparatury do analizy metodą chromatografii cienkowarstwowej łącznie z płytkami szklanymi 20 × 20.

3.2. Źródło światła ultrafioletowego o długości fal 366 lub 254 nm.

3.3. Mikrostrzykawki o pojemności 100 i 500 μl.

3.4. Cylindryczny lejek do sączenia z porowatą przegrodą G3 (porowatość 15–40 μm) o średnicy około 2 cm i głębokości 5 cm, przystosowany do filtracji w próżni i ze szlifem szklanym zewnętrznym.

3.5. Kolba stożkowa o pojemności 50 ml ze szlifem szklanym wewnętrznym, którą można połączyć z lejkiem do sączenia (3.4).

3.6. Probówka o pojemności 10 ml z lejkowatym dnem i szczelnym korkiem szklanym.

3.7. Eksykator z chlorkiem wapnia.

3.8. System HPLC składający się z: 3.8.1. podwójnej pompy; 3.8.2. ręcznego lub automatycznego dozownika wyposażonego w pętlę dozującą o pojemności 200 μL; 3.8.3. wbudowanego degazera; 3.8.4. detektora UV–VIS lub podczerwieni.

3.9. Kolumna HPLC (25 cm x 4 mm średnicy wewnętrznej) wypełniona żelem krzemionkowym 60 (o uziarnieniu 5 μm).

3.10. Filtr strzykawkowy o rozmiarze 0,45 μm.

3.11. Kolba stożkowa o pojemności 25 ml.

4. ODCZYNNIKI

4.1. Minimalne miano roztworu wodorotlenku potasu 85 %.

4.2. Roztwór wodorotlenku potasu w etanolu, w przybliżeniu roztwór 2 M. Rozpuścić 130 g wodorotlenku potasu (4.1), jednocześnie schładzając, w 200 ml wody destylowanej, następnie uzupełnić etanolem do objętości jednego litra (4.9). Roztwór przechowywać w dobrze zakorkowanej butelce z ciemnego szkła przez maksymalnie 2 dni.

4.3. Eter dietylowy do analiz.

4.4. Roztwór wodorotlenku potasu w etanolu, w przybliżeniu roztwór 0,2 M. Rozpuścić 13 g wodorotlenku potasu (4.1) w 20 ml wody destylowanej, następnie uzupełnić etanolem do objętości jednego litra (4.9).

4.5. Płytki szklane o wymiarach 20x20 pokryte żelem krzemionkowym, niezawierającym wskaźnika fluorescencyjnego, o grubości 0,25 mm (dostępne w handlu w postaci gotowej do użytku).

4.6. Aceton do chromatografii.

4.7. n-heksan do chromatografii.

4.8. Eter dietylowy do chromatografii.

4.9. Etanol do analiz.

4.10. Octan etylu do analiz.

4.11. Roztwór porównawczy stosowany w chromatografii cienkowarstwowej: roztwór cholesterolu, fitosterolu, alkoholi i erytrodiolu w octanie etylu o stężeniu 5 % (4.10).

4.12. 0,2 % roztwór 2,7-dichlorofluorosceiny w etanolu. Roztwór ten uzyskuje nieco zasadowy charakter w wyniku dodania kilku kropli 2 M roztworu wodorotlenku potasu w alkoholu (4.2).

4.13. Mieszanina n-heksanu (4.7)/eteru dietylowego (4.8) w proporcji 65:35 (V/V).

4.14. n-heksan (4.7)/eter dietylowy (4.8) w fazie ruchomej HPLC (1:1) (V/V).

5. METODA REFERENCYJNA: ODDZIELENIE ZWIĄZKÓW ALKOHOLOWYCH ZA POMOCĄ PODSTAWOWEJ PŁYTKI DO CHROMATOGRAFII CIENKOWARSTWOWEJ (TLC)

Przygotowanie podstawowych płytek do chromatografii cienkowarstwowej. Zanurzyć lub zamoczyć płytki z żelu krzemionkowego (4.5) na głębokość około 4 cm w 0,2 M roztworze wodorotlenku potasu w etanolu (4.4) na 10 sekund, następnie suszyć je w dygestorium przez dwie godziny i na koniec umieścić w piecu nagrzanym do temperatury 100 °C na godzinę.

Wyjąć z pieca i umieścić w eksykatorze z chlorkiem wapnia (3.7) aż do czasu ich użycia (płytki poddane takiej obróbce powinny być wykorzystane w ciągu 15 dni).

Napełnić komorę chromatograficzną mieszaniną heksanu i eteru dietylowego (4.13) (uwaga 3) do poziomu około 1 cm. Zamknąć komorę odpowiednią pokrywą i pozostawić na co najmniej godzinę w chłodnym miejscu w celu uzyskania równowagi układu ciecz-para. Na wewnętrznych powierzchniach komory można umieścić paski bibuły filtracyjnej zanurzone w eluencie. Pozwala to skrócić o około jedną trzecią czas przemieszczenia linii cieczy i uzyskać bardziej jednorodną i regularną elucję składników.

Uwaga 3: przy każdej analizie należy wymienić mieszaninę rozwijającą w celu uzyskania idealnie odtwarzalnych warunków elucji. Zamiennie można stosować rozpuszczalnik w postaci mieszaniny n-heksanu i eteru dietylowego w proporcji 50:50 (V/V).

Przygotować roztwór substancji niezmydlającej się w octanie etylu (4.10) o stężeniu około 5 % przygotowanej w części 1 i za pomocą mikrostrzykawki o pojemności 100 μl (3.3) nanieść 0,3 ml roztworu w postaci wąskiego i jednolitego pasma na dolnej części płytki chromatograficznej (4.5) w odległości 2 cm od dolnej krawędzi. Na linii pasma nanieść 2–3 μl roztworu porównawczego (4.11) w celu identyfikacji pasm steroli, dialkoholi triterpenowych i alkoholi po rozwinięciu.

Umieścić płytkę w komorze chromatograficznej (3.1). Temperaturę otoczenia należy utrzymywać w granicach 15–20 °C (uwaga 4). Bezzwłocznie zakryć komorę pokrywą i pozostawić w celu elucji składników aż do momentu, gdy czoło rozpuszczalnika dotrze na odległość około 1 cm od górnej krawędzi płytki. Wyjąć płytkę z komory chromatograficznej i odparować rozpuszczalnik w strumieniu gorącego powietrza lub umieścić w tym celu płytkę na chwilę w dygestorium.

Uwaga 4: wyższa temperatura mogłaby utrudniać oddzielenie.

Spryskać płytkę lekko i równomiernie roztworem 2,7-dichlorofluorosceiny (4.12) i pozostawić do wyschnięcia. Obserwując płytkę pod lampą ultrafioletową (3.2), pasma steroli, dialkoholi triterpenowych i alkoholi można zidentyfikować, przyrównując je do plamek uzyskanych za pomocą roztworu porównawczego (4.11). Zaznaczyć czarnym ołówkiem granice pasm wzdłuż krawędzi fluoryzujących (zob. rysunek 1 dotyczący płytki TLC).

Za pomocą metalowej szpatułki zeskrobać żel krzemionkowy z zaznaczonego obszaru. Usunięty i dokładnie rozdrobniony materiał przenieść do lejka do sączenia (3.4). Dodać 10 ml gorącego octanu etylu (4.10), ostrożnie wymieszać za pomocą metalowej szpatułki i przefiltrować (w stosownych przypadkach w próżni), zbierając filtrat do kolby stożkowej (3.5) połączonej z lejkiem do sączenia.

Pozostałość na filtrze przepłukać trzykrotnie eterem dietylowym (4.3) (około 10 ml przy każdym płukaniu), zbierając filtrat do tej samej kolby połączonej z lejkiem, odparować filtrat do objętości 4–5 ml, przelać pozostały roztwór do zważonej wcześniej probówki o pojemności 10 ml (3.6), wysuszyć poprzez lekkie podgrzewanie w delikatnym strumieniu azotu, rozpuścić jeszcze raz kilkoma kroplami acetonu (4.6), ponownie wysuszyć. Pozostałość znajdująca się w probówce to frakcje steroli i dialkoholi triterpenowych lub alkoholi i alkoholi triterpenowych.

6. ODDZIELENIE FRAKCJI ALKOHOLOWEJ METODĄ HPLC

Substancja niezmydlająca się uzyskana w części 1 rozpuszcza się w 3 ml fazy ruchomej (4.14); przefiltrować roztwór za pomocą filtra strzykawkowego (3.10) i zachować.

Wstrzyknąć 200 μL przefiltrowanego roztworu niezmydlającego się do HPLC (3.8).

Przeprowadzić oddzielenie metodą HPLC z prędkością 0,8 ml/min, odrzucić ilość uzyskaną w ciągu pierwszych 5 min i zebrać do kolb stożkowych o pojemności 25 ml (3.11) ilość otrzymaną między 5 a 10 min. w przypadku alkoholi alifatycznych i triterpenowych oraz ilość otrzymaną między 11 a 25 min. w przypadku steroli oraz erytrodiolu i uwaolu (uwaga 5).

Oddzielenie można monitorować za pomocą detektora UV przy długości fali 210 nm lub detektora współczynnika refraktometrycznego (zob. rysunek 6).

Frakcje odparowuje się do wysuszenia i przygotowuje do analizy chromatograficznej.

Uwaga 5: należy dokładnie kontrolować ciśnienie pompy HPLC, eter dietylowy może zwiększyć ciśnienie, należy regulować przepływ, aby utrzymać ciśnienie pod kontrolą.

CZĘŚĆ 3

ANALIZA FRAKCJI ZWIĄZKÓW ALKOHOLOWYCH METODĄ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ

1. ZAKRES

Niniejsza część zawiera ogólne wytyczne dotyczące stosowania chromatografii gazowej na kolumnach kapilarnych do oznaczania składu jakościowego i ilościowego związków alkoholowych wyodrębnionych zgodnie z metodą określoną w części 2 niniejszej metody.

2. ZASADA

Frakcje zebrane z substancji niezmydlającej się z wykorzystaniem chromatografii cienkowarstwowej (TLC) lub metody HPLC są poddawane derywatyzacji do eterów trimetylosilanowych i poddawane analizie metodą chromatografii gazowej na kolumnach kapilarnych z systemem rozdziału strumienia i detektorem płomieniowo-jonizacyjnym.

3. APARATURA

Typowe wyposażenie laboratoryjne, a w szczególności następujące urządzenia:

3.1. Probówka o pojemności 10 ml z lejkowatym dnem i szczelnym korkiem szklanym.

3.2. Chromatograf gazowy współpracujący z kolumną kapilarną z systemem rozdziału strumienia, składający się z: 3.2.1. komory termostatycznej do kolumn w celu utrzymania wymaganej temperatury z dokładnością do ± 1 °C; 3.2.2. regulowanego termostatem zespołu dozowania z otworem wytryskowym ze szkła krzemowanego i z systemem rozdziału strumienia; 3.2.3. detektora płomieniowo-jonizacyjnego (FID); 3.2.4. systemu gromadzenia danych współpracującego z detektorem FID (3.10.3.), z możliwością całkowania ręcznego.

3.3. Kolumna kapilarna wypełniona żelem krzemionkowym o długości 20–30 m, o wewnętrznej średnicy 0,25–0,32 mm, pokryta w 5 % difenylem i w 95 % dimetylopolisiloksanem (faza stacjonarna SE-52 lub SE-54 lub podobna), o jednakowej grubości wynoszącej 0,10–0,30 μm.

3.4. Mikrostrzykawka o pojemności 10 μl przeznaczona do chromatografii gazowej z umocowaną na stałe igłą do rozdzielania strumienia.

4. ODCZYNNIKI

4.1. Bezwodnik pirydyny do chromatografii.

4.2. Heksametyldizylazyna do analiz.

4.3. Trimetylchlorosilan do analiz.

4.4. Roztwory próbek eterów trimetylosilanowych steroli. Należy je przygotować tuż przed użyciem ze steroli i erytrodiolu uzyskanych z zawierających je olejów.

4.5. Roztwory mianowane eterów trimetylosilanowych alkoholi alifatycznych od C20 do C28. Można je sporządzić z mieszanin czystych alkoholi, w momencie gdy są potrzebne do użycia.

4.6. Gaz nośny: czysty wodór lub hel, do chromatografii gazowej.

4.7. Gazy pomocnicze: czysty wodór, hel, azot i powietrze do celów chromatografii gazowej.

4.8. Odczynnik wywołujący reakcję sililowania składający się z mieszaniny pirydyny/heksametylodisilazanu/trimetylochlorosilanu w proporcji 9:3:1 (V/V/V).

4.9. n-heksan do chromatografii.

5. PRZYGOTOWANIE TRIMETYLSILYLOETERÓW

Do probówki (3.1) zawierającej frakcje związków alkoholowych dodać odczynnik wywołujący reakcję sililowania (4.8) (uwaga 6) w ilości 50 μl na każdy miligram związków alkoholowych, w sposób pozwalający uniknąć wchłaniania wilgoci (uwaga 7).

Uwaga 6: w handlu dostępne są gotowe roztwory. Inne odczynniki sililujące, takie jak na przykład bis-trimetylsilyltrifluoracetamid + 1 % trimetylochlorosilanu, który musi zostać wymieszany z taką samą ilością bezwodnika pirydyny, również są dostępne. Pirydynę można zastąpić taką samą ilością acetonitrylu.

Uwaga 7: pojawienie się lekkiej opalizacji jest zjawiskiem normalnym i nie stanowi żadnej nieprawidłowości. Pojawienie się białej zawiesiny lub różowego koloru wskazuje na obecność wilgoci w odczynniku lub pogorszenie jego jakości. W takich przypadkach badanie należy powtórzyć (tylko w przypadku zastosowania heksametylodisilazanu/trimetylochlorosilanu).

Zamknąć probówkę (3.1) korkiem i ostrożnie wstrząsać (bez odwracania) aż do całkowitego rozpuszczenia się związków. Pozostawić na co najmniej 15 minut w temperaturze otoczenia, a następnie wirować przez kilka minut. Przejrzysty roztwór można poddać analizie metodą chromatografii gazowej.

6. ANALIZA METODĄ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ

6.1. Czynności wstępne, przygotowanie kolumn kapilarnych

Osadzić kolumnę (3.3) w chromatografie gazowym, podłączając końcówkę wlotową do dozownika z rozdziałem strumienia, a końcówkę wylotową do detektora.

Dokonać ogólnych kontroli zespołu chromatografu gazowego (szczelność układu zasilania gazem, wydajność detektora, wydajność systemu dzielenia strumienia i systemu zapisu itd.).

Jeżeli kolumna zostaje użyta po raz pierwszy, zaleca się jej przygotowanie: przepuścić powoli przez kolumnę strumień gazu, następnie włączyć zespół chromatografu gazowego i rozpocząć stopniowe podgrzewanie do temperatury co najmniej 20 °C powyżej temperatury roboczej (uwaga 8). Utrzymywać taką temperaturę przez co najmniej dwie godziny, następnie ustawić zespół w trybie pracy (regulacja strumienia gazu i układu rozdzielania, zapalenie płomienia, połączenie z systemem obliczeniowymi, regulacja temperatury kolumny, detektora i dozownika itd.), a następnie rejestrować sygnał z czułością co najmniej dwa razy większą niż przewidziana czułość analizy. Przebieg linii podstawowej musi mieć charakter liniowy, bez jakichkolwiek pików i bez przesunięcia. Ujemne przesunięcie prostej linii wskazuje na nieszczelność połączeń kolumn; przesunięcie dodatnie wskazuje na niedostateczne przygotowanie kolumny.

Uwaga 8: temperatura przygotowania kolumn musi zawsze być co najmniej o 20 °C niższa niż maksymalna temperatura określona dla fazy stacjonarnej.

6.2. Warunki robocze

Należy zoptymalizować program temperatury i natężenie przepływu gazu nośnego, tak aby otrzymać chromatogramy podobne do chromatogramów przedstawionych na rysunkach 3–6.

Poniższe parametry zostały zbadane i stwierdzono, że są użyteczne:

6.2.1. Alkohole alifatyczne

Programowanie pieca 180 °C (8 min.) → 260 °C (w temp. 5 °C/min) → 260 °C (15 min.) Temperatura dozownika 280 °C Temperatura detektora 290 °C Prędkość liniowa gazu nośnego Hel (20–30 cm/s); wodór (30–50 cm/s) Stosunek strumienia dzielonego 1:50–1:100 Wstrzykiwana porcja 0,5–1 μl roztworu TMSE

6.2.2. Sterole i dialkohole triterpenowe

Programowanie pieca stała temperatura 260 ± 5 °C Temperatura dozownika 280–300 °C Temperatura detektora 280–300 °C Prędkość liniowa gazu nośnego Hel (20–30 cm/s); wodór (30–50 cm/s) Stosunek strumienia dzielonego 1:50–1:100 Wstrzykiwana porcja 0,5–1 μl roztworu TMSE

Warunki te mogą być zmieniane zgodnie z charakterystyką kolumny i chromatografu gazowego w celu uzyskiwania chromatogramów spełniających następujące wymogi:

— Czas retencji w przypadku alkoholu C26 wynosi 18 ± 5 minut.

— Pik dla alkoholu C22 wynosi 80 ± 20 % wartości pełnego zakresu skali dla oliwy z oliwek i 40 ± 20 % wartości pełnego zakresu skali dla oliwy z wytłoczyn z oliwek.

— Czas retencji w przypadku piku ß-sitosterolu powinien wynosić 20 ± 5 min.

— Pik kampesterolu powinien wynosić: w przypadku oliwy z oliwek (średnia zawartość 3 %) 20 ± 5 % w pełnej skali.

— Należy oddzielić wszystkie występujące sterole. Oprócz całkowitego oddzielenia od siebie piki muszą także być całkowicie rozdzielone, co oznacza, że wykres piku musi łączyć się z linią podstawową, zanim przejdzie w następny pik. Niepełna rozdzielczość jest jednak tolerowana, pod warunkiem że pik w punkcie RRT 1,02 (sitostanol) może zostać oznaczony ilościowo na podstawie linii prostopadłej.

6.3. Procedura analityczna

Za pomocą mikrostrzykawki (3.4) o pojemności 10 μl pobrać 1 μl heksanu, zassać 0,5 μl powietrza i następnie 0,5–1 μl roztworu próbki. Pociągnąć dalej tłoczek w celu opróżnienia igły. Wprowadzić igłę przez membranę dozownika i po jednej, dwóch sekundach szybko wstrzyknąć, a następnie powoli wyjąć igłę po około pięciu sekundach. Można zastosować także dozownik automatyczny.

Prowadzić rejestrację do całkowitego wyeluowania TMSE obecnych w próbce odpowiednich związków alkoholowych. Linia podstawowa powinna nadal spełniać wymogi odpowiednich warunków roboczych (6.2.1 lub 6.2.2).

6.4. Identyfikacja pików

Zidentyfikować poszczególne piki na podstawie czasów retencji oraz przez porównanie z mieszaniną alkoholi alifatycznych i triterpenowych lub steroli i TMSE dialkoholi triterpenowych poddanych analizie w takich samych warunkach. Chromatogram frakcji alkoholi alifatycznych i triterpenowych przedstawiono na rysunku 3, a odpowiadające chromatogramy steroli i dialkoholi triterpenowych – na rysunku 2.

Alkohole alifatyczne podlegają elucji w następującej kolejności: C20-ol (I.S.), C22-ol, C23-ol, C24-ol, C25-ol, C26-ol, C27-ol i C28-ol.

Sterole i dialkohole triterpenowe podlegają elucji w następującej kolejności: cholesterol, brassikasterol, ergosterol, 24-metylen-cholesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, Δ7-kampesterol, Δ5,23-stigmastadienol, klerosterol, ß-sistosterol, sitostanol, Δ5-awenasterol, Δ5,24-stigmastadienol, Δ7-stigmastenol, Δ7-awenasterol, erytrodiol i uwaol.

6.5. Ocena ilościowa

Powierzchnie pików 1-eikozanolu i alkoholi alifatycznych C22, C24, C26 i C28 oblicza się za pomocą systemu odbioru danych. Współczynnik odpowiedzi w przypadku 1-eikozanolu przyjmuje się jako równy 1.

Obliczyć powierzchnie pików α-cholestanolu i steroli oraz dialkoholi triterpenowych za pomocą systemu obliczeniowego. Pominąć związki, które nie są ujęte w tabeli 1 (nie należy uwzględniać w obliczeniach ergosterolu). Współczynnik odpowiedzi w przypadku α-cholestanolu przyjmuje się jako równy 1.

Obliczyć stężenie każdego poszczególnego związku alkoholowego w mg/kg substancji tłuszczowej w następujący sposób:

gdzie:

Ax = powierzchnia piku w przypadku związku alkoholowego x, zgodnie z obliczeniami w systemie obliczeniowym. As = powierzchnia piku 1-eikozanolu/α-cholestanolu, zgodnie z obliczeniami w systemie obliczeniowym. ms = masa dodanego 1-eikozanolu/α-cholestanolu, w miligramach. m = masa próbki użytej do oznaczenia, w gramach.

7. PRZEDSTAWIENIE WYNIKÓW

Podać stężenie poszczególnych alkoholi alifatycznych i triterpenowych w mg/kg substancji tłuszczowej i ich sumę jako »całkowitą zawartość alkoholi alifatycznych«. Całkowita zawartość to suma C22, C24, C26 i C28.

Skład każdego z poszczególnych związków alkoholowych należy podać z dokładnością do jednego miejsca po przecinku.

Całkowite stężenie steroli musi być podane jako liczba całkowita bez przecinka dziesiętnego.

Procentową zawartość każdego sterolu obliczyć na podstawie stosunku powierzchni odpowiedniego piku do sumy powierzchni pików steroli:

gdzie:

Ax = powierzchnia piku dla sterolu x. ΣA = suma powierzchni pików dla steroli.

APP β -sitosterol: Δ5,23-stigmastadienol + klerosterol + β-sitosterol + sitostanol + Δ5-awenasterol + Δ5,24-stigmastadienol.

Obliczyć procentową zawartość erytrodiolu i uwaolu:

gdzie:

AEr = powierzchnia erytrodiolu, zgodnie z obliczeniami w systemie obliczeniowym. AUv = powierzchnia uwaolu, zgodnie z obliczeniami w systemie obliczeniowym. Σ ΑΤ = suma powierzchni piku dla steroli + erytrodiolu + uwaolu, zgodnie z obliczeniami w systemie obliczeniowym.

Oprócz obliczenia względnego procentowego udziału poszczególnych steroli i dialkoholi triterpenowych oraz całkowitego stężenia steroli należy – zgodnie z poniższymi wzorami – obliczyć stężenie erytrodiolu i uwaolu oraz ich sumę w mg/kg substancji tłuszczowej:

gdzie: