Czwarta Dyrektywa Komisji

z dnia 5 grudnia 1972 r.

ustanawiająca wspólnotowe metody analizy do celów urzędowej kontroli pasz

(73/46/EWG)

KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH,

uwzględniając Traktat ustanawiający Europejską Wspólnotę Gospodarczą,

uwzględniając dyrektywę Rady z dnia 20 lipca 1970 r. [1] w sprawie wprowadzenia wspólnotowych metod pobierania próbek i analizy dla urzędowej kontroli pasz, zmienioną dyrektywą nr 72/275/EWG z dnia 20 lipca 1972 r. [2], w szczególności jej art. 2,

a także mając na uwadze, co następuje:

dyrektywa ta wymaga, aby urzędowe kontrole pasz były przeprowadzane z wykorzystaniem wspólnotowych metod pobierania próbek i analizy do celów sprawdzenia zgodności z wymogami wynikającymi z przepisów ustawowych, wykonawczych i administracyjnych dotyczących jakości i składu pasz;

dyrektywy nr 71/250/EWG z dnia 15 czerwca 1971 r. [3], 71/393/EWG z dnia 18 listopada 1971 r. [4] oraz 72/199/EWG z dnia 27 kwietnia 1972 r. [5] ustanowiły już szereg wspólnotowych metod analizy; postęp prac od tamtego czasu wskazuje na celowość przyjęcia czwartego zestawu metod;

środki przewidziane w niniejszej dyrektywie są zgodne z opinią Komitetu Zarządzającego ds. Pasz,

PRZYJMUJE NINIEJSZĄ DYREKTYWĘ:

Artykuł 1

Państwa Członkowskie wymagają, aby analizy stosowane w ramach urzędowych kontroli pasz do oznaczania poziomu wilgotności w tłuszczach zwierzęcych i roślinnych oraz olejach oraz zawartości magnezu i surowego włókna w paszach były przeprowadzane zgodnie z metodami opisanymi w załączniku I do niniejszej dyrektywy.

Przepisy ogólne, określone w Załączniku część 1 (Wprowadzenie) do pierwszej dyrektywy Komisji 71/250/EWG z dnia 15 czerwca 1971 r., stosuje się do metod opisanych w załączniku I do niniejszej dyrektywy.

Artykuł 2

Państwa Członkowskie wymagają, aby analizy stosowane w ramach urzędowych kontroli pasz w odniesieniu do ich zawartości retinolu (witaminy A), tiaminy (aneuryny, witaminy B1), kwasu askorbinowego i dehydroaskorbinowego (witaminy C) były przeprowadzane zgodnie z metodami opisanymi w załączniku II do niniejszej dyrektywy.

Przepisy ogólne, określone w Załączniku część I (Wprowadzenie) do pierwszej dyrektywy Komisji 71/250/EWG z dnia 15 czerwca 1971 r., z wyjątkiem części dotyczącej przygotowania próbki do analizy, stosuje się do metod opisanych w załączniku II do niniejszej dyrektywy.

Artykuł 3

Państwa Członkowskie wprowadzą w życie przepisy ustawowe, wykonawcze i administracyjne niezbędne do wykonania niniejszej dyrektywy najpóźniej do dnia 1 stycznia 1974 r. Niezwłocznie powiadamiają o tym Komisję.

Artykuł 4

Niniejsza dyrektywa jest skierowana do Państw Członkowskich.

Sporządzono w Brukseli, dnia 5 grudnia 1972 r.

W imieniu Komisji

S.L. Mansholt

Przewodniczący

[1] Dz.U. L 170 z 3.8.1970, str. 2.

[2] Dz.U. L 171 z 29.7.1972, str. 39.

[3] Dz.U. L 155 z 12.7.1971, str. 13.

[4] Dz.U. L 279 z 20.12.1971, str. 7.

[5] Dz.U. L 123 z 29.5.1972, str. 6.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK I

1. OZNACZANIE POZIOMU WILGOTNOŚCI W ZWIERZĘCYCH I ROŚLINNYCH OLEJACH I TŁUSZCZACH

1. Cel i zakres

Niniejsza metoda umożliwia oznaczenie zawartości wody i substancji lotnych w olejach i tłuszczach zwierzęcych i roślinnych.

2. Zasada

Próbka jest suszona w temperaturze 103 °C do momentu uzyskania stałej masy. Ubytek masy określany jest przez ważenie.

3. Aparatura

3.1. Płaskodenne naczynie o średnicy 8 - 9 cm i wysokości około 3 cm, wykonane z nierdzewnego materiału.

3.2. Termometr rtęciowy ze wzmocnioną bańką i rurką kompensacyjną na górnym końcu, wyskalowany od około 80 °C do przynajmniej 110 °C, o długości około 10 cm.

3.3. Łaźnia piaskowa lub elektryczna płyta grzejna.

3.4. Eksykator zawierający skuteczny środek osuszający.

3.5. Waga analityczna.

4. Procedura

Z dokładnością do 1 mg odważyć 20 g ujednorodnionej próbki do suchego, zważonego naczynia (ppkt 3.1) zawierającego termometr (ppkt 3.2). Podgrzewać na łaźni piaskowej lub płycie grzejnej (ppkt 3.3) stale mieszając termometrem tak, aby uzyskać temperaturę 90 °C w około 7 minut.

Obniżyć ciepło, obserwując częstotliwość, z którą bąbelki podnoszą się z dna naczynia. Temperatura nie może przekraczać 105 °C. Kontynuować mieszanie, skrobiąc dno naczynia, dopóki bąbelki nie przestaną się tworzyć.

W celu zapewnienia całkowitego usunięcia wilgotności należy kilka razy podgrzewać ponownie próbkę do temperatury 103 °C ± 2 °C, studząc do 93 °C między kolejnymi podgrzewaniami. Następnie zostawić próbkę w eksykatorze (ppkt 3.4) celem ostudzenia do temperatury pokojowej. Powtarzać niniejszą operację, dopóki ubytek masy między dwoma kolejnymi ważeniami nie będzie przekraczał 2 mg.

Uwaga:

Przyrost masy próbki po powtarzanym podgrzewaniu wskazuje na utlenianie się tłuszczu. W takim przypadku obliczyć wynik z ważenia przeprowadzonego bezpośrednio, zanim masa zaczęła przyrastać.

5. Obliczanie wyników

Zawartość wilgoci, wyrażona jako udział procentowy w próbce, obliczana jest z następującego wzoru:

·

M

o

gdzie:

M0 = masa badanej próbki w gramach;

M1 = masa naczynia wraz z jego zawartością przed podgrzewaniem, w gramach;

M2 = masa naczynia wraz z zawartością po podgrzewaniu, w gramach;

Wyniki o wartości mniejszej niż 0,05 % muszą być odnotowane jako "mniej niż 0,05 %".

Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń zawartości wilgoci przeprowadzonych na tej samej próbce nie może przekraczać 0,05 % wartości bezwzględnej.

2. OZNACZANIE ZAWARTOŚCI MAGNEZU

— metodą spektrofotometrii absorpcji atomowej —

1. Cel i zakres

Niniejsza metoda umożliwia oznaczenie zawartości magnezu w paszach. Nadaje się ona w szczególności do oznaczania zawartości magnezu mniejszej od 5 %.

2. Zasada

Próbka jest spopielana i rozpuszczana w rozcieńczonym kwasie solnym. Jeśli nie zawiera żadnych substancji organicznych, jest rozpuszczana bezpośrednio w rozcieńczonym kwasie solnym. Roztwór jest rozcieńczany, a zawartość magnezu oznaczana metodą atomowej spektrofotometrii absorpcyjnej przy długości fali 285,2 nm przez porównanie z roztworami wzorcowymi.

3. Odczynniki

3.1. Czysty kwas solny o gęstości 1,16.

3.2. Czysty stężony kwas solny o gęstości 1,19.

3.3. Taśma lub drut magnezowy lub heptahydrat siarczanu magnezu wysuszony w temperaturze pokojowej.

3.4. Roztwór soli strontu (chlorek lub azotan) 2,5 % (procent wagowy), strontu (= 76,08 g czystego SrCl26H2O lub 60,38 g czystego Sr(NO3)2).

3.5. Wzorcowy roztwór magnezu: z dokładnością do 1 mg odważyć 1 g magnezu (ppkt 3.3), po starannym usunięciu z niego powłoki tlenkowej lub odpowiadającą ilość (10,143 g) heptahydratu siarczanu magnezu (ppkt 3.3). Umieścić w 1-litrowej kolbie miarowej, dodać 80 ml kwasu solnego (ppkt 3.1), zostawić do rozpuszczenia i uzupełnić wodą do 1000 ml. 1 ml tego roztworu zawiera 1,000 mg magnezu.

4. Aparatura

4.1. Platynowe, kwarcowe lub porcelanowe tygle do spopielania.

4.2. Elektryczny piec muflowy z termostatem.

4.3. Spektrometr do pomiaru absorpcji atomowej.

5. Procedura

5.1. Przygotowanie roztworu próbki

5.1.1. Pasze składające się wyłącznie z substancji mineralnych

Z dokładnością do 1 mg odważyć 5 g próbki do kolby miarowej o pojemności 500 ml zawierającej 250-300 ml wody. Dodać 40 ml kwasu solnego (ppkt 3.1), doprowadzić do wrzenia i łagodnie gotować przez 30 minut. Pozostawić do ostygnięcia, uzupełnić do pełnej objętości wodą, wymieszać i przefiltrować do suchej zlewki przez suchy filtr harmonijkowy. Odlać pierwsze 30 ml filtratu. W razie obecności krzemionki poddać 5 g próbki działaniu wystarczającej ilości (15-30 ml) kwasu solnego (ppkt 3.2), odparować do całkowitego wysuszenia na łaźni wodnej i wstawić do pieca rozgrzanego do temperatury 105 °C na jedną godzinę. Dalej postępować zgodnie z opisem zaczynającym się w ppkt 5.1.2 zdanie trzecie.

5.1.2. Pasze składające się głównie z substancji mineralnych

Z dokładnością do 1 mg odważyć 5 g próbki do tygla do spopielania i spopielać w piecu muflowym w temperaturze 550 °C aż do uzyskania popiołu wolnego od cząstek węglowych, a następnie pozostawić do ostygnięcia. W celu usunięcia krzemionki dodać do popiołu dostateczną ilość (15 - 30 ml) kwasu solnego (ppkt 3.2), odparować do całkowitego wysuszenia na łaźni wodnej i wstawić do pieca podgrzanego do temperatury 105 °C na jedną godzinę. Poddać pozostałość działaniu 10 ml kwasu solnego (ppkt 3.1) i wypłukać ciepłą wodą do 500-mililitrowej kolby miarowej. Pozostawić do ostygnięcia i uzupełnić do pełnej objętości wodą. Wymieszać i przefiltrować do suchej zlewki przez suchy filtr harmonijkowy. Odlać pierwsze 30 ml filtratu.

5.1.3. Pasze składające się głównie z substancji organicznych

Z dokładnością do 1 mg odważyć 5 g próbki do tygla do spopielania i spopielać w piecu muflowym w temperaturze 550 °C aż do uzyskania popiołu wolnego od cząstek węglowych. Poddać popiół działaniu 5 ml kwasu solnego (ppkt 3.2), odparować do całkowitego wysuszenia na łaźni wodnej, następnie suszyć przez godzinę w piecu, rozgrzanym do temperatury 105 °C, aby uczynić krzemionkę nierozpuszczalną. Poddać popiół działaniu 5 ml kwasu solnego (ppkt 3.1), wypłukać ciepłą wodą do 250-mililitrowej kolby miarowej, doprowadzić do wrzenia, pozostawić do ostygnięcia i uzupełnić do pełnej objętości wodą. Wymieszać i przefiltrować do suchej zlewki przez suchy filtr harmonijkowy. Odlać pierwsze 30 ml filtratu.

5.2. Pomiar metodą absorpcji atomowej

Rozcieńczając wodą roztwór wzorcowy (ppkt 3.5) sporządzić co najmniej 5 roztworów odniesienia o rosnącym stężeniu, odpowiadających optymalnemu zakresowi pomiarowemu spektrofotometru. Do każdego roztworu dodać 10 ml roztworu soli strontu (ppkt 3.4), a następnie uzupełnić wodą do 100 ml. Rozcieńczyć wodą jedną podwielokrotną część filtratu uzyskanego z ppkt 5.1.1, 5.1.2 lub 5.1.3 tak, aby uzyskać stężenie magnezu w zakresie stężeń roztworów odniesienia. Stężenie kwasu solnego w tym roztworze nie może przekraczać stężenia 0,4-normalnego. Dodać 10 ml roztworu soli strontu (ppkt 3.4) i uzupełnić wodą do 100 ml. Spektrofotometrem, przy długości fali 285,2 nm, zmierzyć absorpcję roztworu oznaczanego i roztworów odniesienia.

6. Obliczanie wyników

Obliczyć ilość magnezu w próbce przez odniesienie do roztworów odniesienia. Wynik wyrazić jako udział procentowy próbki.

Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń przeprowadzonych na tej samej próbce nie może przekraczać 5 % wartości względnej.

3 . OZNACZANIE SUROWEGO WŁÓKNA

1. Cel i zakres

Niniejsza metoda umożliwia oznaczenie w paszach ilości pozbawionych tłuszczu substancji organicznych, nierozpuszczalnych w kwasach i substancjach alkalicznych, i tradycyjnie zwanych surowym włóknem.

2. Zasada

Odtłuszczona, w razie konieczności, próbka jest poddawana działaniu kolejno wrzących roztworów kwasu siarkowego i wodorotlenku potasu o określonych stężeniach. Pozostałość jest oddzielana przez filtrację w obecności azbestu, wymywana, suszona, ważona i spopielana w temperaturze 900 °C. Ubytek masy wynikający ze spopielenia odpowiada zawartości surowego włókna w badanej próbce.

3. Odczynniki

3.1. 0,26-normalny kwas siarkowy.

3.2. Oczyszczony azbest: do rodzaju azbestu stosowanego razem z tyglem Goocha dodać wagowo około 5 razy więcej rozcieńczonego kwasu solnego (1 objętość kwasu solnego o gęstości 1,19 + 3 objętości wody). Mieszaninę gotować przez około 45 minut, pozostawić do ostygnięcia i przefiltrować przez lejek Buchnera. Wypłukiwać pozostałość najpierw wodą, dopóki kwas solny nie zniknie z wody płuczkowej, a następnie acetonem (ppkt 3.6). Azbest wysuszyć w piecu do suszenia, a następnie spopielać przez 2 godziny w temperaturze 900 °C. Pozostawić do ostygnięcia i przechowywać w zatkanej kolbie. Azbestu poddanego działaniu w ten sposób można używać kilka razy. Musi on spełniać warunki specyfikacji podane w pkt 5 dotyczące próby ślepej.

3.3. Emulsja przeciwpieniąca (np. silikon).

3.4. 0,23-normalny roztwór wodorotlenku potasu.

3.5. 0,5-normalny kwas solny.

3.6. Aceton.

3.7. Eter dietylowy.

4. Aparatura

4.1. Zlewki o pojemności co najmniej 600 ml ze znakami pomiarowymi na poziomie 200 ml.

4.2. Krążki porcelanowe o średnicy około 80 mm i grubości około 4 mm z około 32 otworami o średnicy około 4 mm.

4.3. Kolby próżniowe o pojemności około 2 litrów ze znakami pomiarowymi na poziomie 800 ml, wyposażone w lejki szklane o średnicy 120 mm.

4.4. Płytki filtracyjne o średnicy około 40 mm i grubości około 4 mm, ze skośnymi krawędziami pasującymi do stożka lejka (ppkt 4.3), perforowane z około 16 otworami o średnicy około 4 mm każdy, pokryte siatką drucianą o rozmiarze oczek około 1 mm. Zarówno płytki jak i siatka muszą być odporne na działanie kwasów i zasad.

4.5. Platynowe lub krzemionkowe tygle do spopielania.

4.6. Elektryczny piec muflowy z termostatem.

4.7. Eksykator.

4.8. Filtr azbestowy: sporządzić zawiesinę 2,0 mg azbestu (ppkt 3.2) w 100 ml wody.

Przefiltrować w próżni przez płytkę filtracyjną pokrytą siatką drucianą (ppkt 4.4) oraz umieszczoną w lejku kolby próżniowej (ppkt 4.3). Zebrać filtrat i przefiltrować ponownie przez ten sam filtr. Odlać filtrat.

5. Procedura

Z dokładnością do 1 mg odważyć do zlewki (ppkt 4.1) 3 g próbki i 2 g oczyszczonego azbestu. Dodać 200 ml kwasu siarkowego (ppkt 3.1) i kilka kropli emulsji przeciwpieniącej (ppkt 3.3). Doprowadzić gwałtownie do wrzenia i gotować dokładnie przez 30 minut. W celu utrzymania stałej objętości przykryć zlewkę urządzeniem chłodzącym, takim jak okrągłodenna kolba o pojemności 500 ml, w której krąży zimna woda. Zatrzymać wrzenie dodając około 50 ml zimnej wody i natychmiast przefiltrować w próżni przez filtr azbestowy przygotowany zgodnie z ppkt 4.8.

Pozostałość wymyć 5 porcjami po około 100 ml bardzo gorącej wody, żeby uzyskać końcową objętość filtratu równą 800 ml. Pozostałość przenieść ilościowo do zlewki (ppkt 4.1) z porcelanowym krążkiem (ppkt 4.2) do regulacji wrzenia. Dodać 200 ml roztworu wodorotlenku potasu (ppkt 3.4). Doprowadzić gwałtownie do wrzenia i gotować dokładnie przez 30 minut. Dodać około 50 ml zimnej wody i natychmiast przefiltrować w próżni przez świeży filtr azbestowy przygotowany uprzednio zgodnie z ppkt 4.8. Pozostałość wymywać bardzo gorącą wodą, dopóki woda płuczkowa nie stanie się obojętna (sprawdzić papierkiem lakmusowym), a następnie 3 razy acetonem (ppkt 3.6) (razem użyć około 100 ml acetonu).

Pozostałość przenieść ilościowo do tygla do spopielania (ppkt 4.5), w razie potrzeby rozłamać i suszyć w piecu do suszenia, w temperaturze 130 °C aż do uzyskania stałej masy.

Pozostawić do ostygnięcia w eksykatorze (ppkt 4.7) i szybko zważyć.

Wstawić tygiel do pieca muflowego (ppkt 4.6) i pozostawić na 30 minut do spopielenia w temperaturze 900 °C. Pozostawić do ostygnięcia w eksykatorze (ppkt 4.7) i szybko zważyć.

Przeprowadzić ślepą próbę stosując tę samą procedurę do oczyszczonego azbestu (ppkt 3.2), lecz bez badanej próbki. Ubytek masy wynikający ze spopielenia 6 g azbestu nie może przekroczyć 10 mg.

6. Obliczanie wyników

Zawartość surowego włókna, wyrażona udziałem procentowym w próbce, podana jest w formie współczynnika:

· 100

3

gdzie:

a = ubytek masy po spopieleniu podczas oznaczania;

b = ubytek masy po spopieleniu podczas ślepej próby.

Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń przeprowadzonych na tej samej próbce nie powinna przekraczać:

0,3 w wartości bezwzględnej dla zawartości surowego włókna mniejszej niż 10 %;

3 % w wartości względnej dla zawartości surowego włókna większej lub równej 10 %.

7. Uwagi

7.1. Pasze zawierające ponad 10 % olejów i tłuszczów muszą zostać odtłuszczone przed analizą za pomocą eteru dietylowego (ppkt 3.7). W celu dokonania tego, umieścić próbkę (3 g odważone z dokładnością do 1 mg) na filtrze azbestowym (ppkt 4.8). Zalać 3 razy około 50 ml eteru dietylowego (ppkt 3.7) i za każdym razem starannie przefiltrować w próżni. Przenieść ilościowo odtłuszczoną próbkę i azbest do zlewki (ppkt 4.1) i kontynuować analizę zgodnie z pkt 5.

7.2. Pasze zawierające oleje i tłuszcze, których nie można wyekstrahować bezpośrednio, muszą zostać odtłuszczone zgodnie z ppkt 7.1 i odtłuszczone kolejny raz po wymyciu kwasu z pozostałości.

W celu dokonania tego wymyć kwas z pozostałości 3 razy acetonem (ppkt 3.6) (ogółem 100 ml), następnie 3 razy 50 ml eteru dietylowego (ppkt 3.7). Następnie przenieść ilościowo pozostałość do zlewki (ppkt 4.1) i kontynuować analizę zgodnie z pkt 5 akapit drugi (poddanie działaniu roztworu wodorotlenku potasu).

7.3. Jeśli pasze są bogate w zawartość wapnia (ponad 2 % wapnia), umieścić próbkę (3 g odważone z dokładnością do 1 mg) w zlewce (ppkt 4.1) ze 100 ml 0,5-normalnego kwasu solnego (ppkt 3.5) i postawić w chłodnej temperaturze na 5 minut. Natychmiast przefiltrować i przemyć w zimnej wodzie. Jako pomocniczy materiał filtracyjny użyć 2,0 g azbestu przeznaczonego do gotowania z kwasem siarkowym. Jeśli filtrowanie okaże się trudne, rozcieńczyć zawiesinę acetonem (ppkt 3.6). Dalej postępować zgodnie z pkt 5.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK II

1. OZNACZANIE ZAWARTOŚCI RETINOLU (WITAMINY A)

1. Cel i zakres

Niniejsza metoda umożliwia oznaczenie zawartości retinolu (witaminy A) w paszach, koncentratach i premiksach. Dolną granicą oznaczania jest 10000 IU/kg dla pasz z dużą zawartością pigmentu i 4000 IU/kg dla pozostałych pasz [1]. Produkty klasyfikowane są w dwóch grupach według ich przypuszczalnej zawartości retinolu:

Grupa A: zawartość mniejsza od 200000 IU/kg;

Grupa B: zawartość równa lub większa 200000 IU/kg.

2. Zasada

Badana próbka jest poddawana procesowi hydrolizy roztworem wodorotlenku potasu w środowisku alkoholu etylowego w obecności antyutleniacza lub w azocie z powietrza. Mieszanina jest ekstrahowana 1,2-dwuchloroetanem. Ekstrakt jest odparowywany do uzyskania suchości i poddawany działaniu ropy naftowej. Roztwór badany jest metodą chromatograficzną w kolumnie tlenku glinu (dla produktów z grupy B chromatografia wymagana jest tylko w niektórych przypadkach). W przypadku produktów z grupy A retinol oznaczany jest metodą spektrofotometryczną przy długości fali 610 nm po wywołaniu barwnego kompleksu w reakcji Carra-Priece'a; dla produktów z grupy B — metodą spektrofotometryczną przy długości fali UV równej 325 nm.

3. Odczynniki

a) stosowane do analizowania produktów grup A i B

3.1. 96 % (procent objętościowy) alkoholu etylowego.

3.2. Czysty 10-procentowy (procent wagowy) roztwór askorbinianu sodu, lub

3.3. Oczyszczony azot.

3.4. Czysty 50-procentowy (procent wagowy) roztwór wodorotlenku potasu.

3.5. Czysty 1-normalny roztwór wodorotlenku sodu.

3.6. Czysty 0,5-normalny roztwór wodorotlenku potasu.

3.7. Czysty 1,2-dichloroetan.

3.8. Lekka ropa o zakresie wrzenia: 30 — 50 °C. W razie konieczności ropę oczyścić w następujący sposób: 1000 ml lekkiej ropy mieszać z 20 ml porcjami stężonego kwasu siarkowego do momentu aż kwas pozostaje bezbarwny. Usunąć kwas i przepłukać kolejno lekką ropę 500 ml wody, dwukrotnie 250 ml 10-procentowego (procent wagowy) roztworu wodorotlenku sodu i trzykrotnie 500 ml wody. Usunąć warstwę wodnistą, wysuszyć lekką ropę przez godzinę nad aktywnym węglem i bezwodnym siarczanem sodowym, przefiltrować i przedestylować.

3.9. Tlenek glinowy ustandaryzowany zgodnie z metodą Brockmanna: spopielać przez 8 godzin w temperaturze 750 °C, ostudzić w eksykatorze i przechowywać w butelce z brązowego szkła wyposażonej w szlifowany korek szklany. Przed zastosowaniem w chromatografii nawilżyć w następujący sposób: w butelce z brązowego szkła umieścić 10 g tlenku glinu i wlać 0,7 ml wody, zatkać korkiem, ponownie podgrzewać przez 5 minut we wrzącej łaźni wodnej jednocześnie potrząsając. Pozostawić do ostygnięcia. Sprawdzić aktywność przygotowanego w ten sposób glinu poddając znaną ilość retinolu (ppkt 3.17) (około 500 IU) procedurze ppkt 5.3 i 5.4 oraz sprawdzając odzysk.

3.10. Podstawowy tlenek glinu o stopniu aktywności 1 (Woelma, Mercka lub równoważnym).

3.11. Czysty eter dietylowy; usunąć nadtlenki i śladowe ilości wody metodą chromatografii kolumnowej podstawowego tlenku glinu (ppkt 3.10) (25 g tlenku glinu na 250 ml eteru dietylowego).

3.12. Roztwór lekkiej ropy naftowej; roztwór (ppkt 3.8) w 4, 8, 12, 16 i 20 % (procent objętościowy) eterze dietylowym (ppkt 3.11).

3.13. 0,5-molowy roztwór siarczku sodowego w 70-procentowej (procent objętościowy) glicerynie, sporządzony z czystego siarczku sodowego.

b) stosowane wyłącznie do analizowania produktów z grupy A

3.14. Czysty benzen ulegający krystalizacji.

3.15. Czysty chloroform; usunąć alkohol etylowy, fosgen i śladowe ilości wody metodą chromatografii kolumnowej podstawowego tlenku glinu (ppkt 3.10) (50 g tlenku glinu na 200 ml chloroformu; wskazane jest przepuścić przez kolumnę chromatograficzną po raz drugi pierwsze 50 ml eluatu).

3.16. Odczynnik Carra-Price'a: wymieszać około 25 g czystego trichlorku antymonu (przechowywanego w eksykatorze) ze 100 ml chloroformu (ppkt 3.15), dopóki roztwór nie stanie się nasycony. Lekki osad trichlorku antymonu nie stwarza problemu. Dodać 2 ml czystego bezwodnika octowego. Trzymać w chłodziarce w butelce z brązowego szkła ze szlifowanym korkiem szklanym. Roztwór zachowuje trwałość przez kilka tygodni.

3.17. Retinol — mianowany spektrofotometrycznie.

c) stosowane wyłącznie do analizowania produktów z grupy B

3.18. Izopropanol do chromatografii.

4. Aparatura

4.1. Łaźnia wodna.

4.2. Aparatura do odparowywania próżniowego z okrągłymi kolbami o różnych pojemnościach.

4.3. Szklane rurki do chromatografii (o długości 300 mm i średnicy wewnętrznej około 13 mm).

4.4. Spektrofotometr z 10-milimetrowymi ogniwami. Pomiar promieniowania UV wymaga ogniw krzemowych.

4.5. Lampy UV odpowiednie do długości fali 365 nm.

5. Procedura

Uwaga:

Wszystkie czynności muszą być wykonywane z dala od źródła bezpośredniego światła, w razie potrzeby z użyciem wyposażenia z brązowego szkła.

5.1. Próbka do badania

Z dobrze podzielonej próbki pobrać próbkę do badania o masie proporcjonalnej do zakładanej zawartości retinolu, tzn.

0,1 — 1,0 g dla koncentratów (zawartość większa niż 20000 IU/g);

3,0 — 5,0 g dla premiksów (zawartość między 400 a 20000 IU/g);

10 — 20 g dla mieszanek mineralnych;

30 g dla produktów z grupy A.

Natychmiast umieścić próbkę do badania w kolbie o pojemności 500 ml ze szlifowanym korkiem szklanym.

5.2. Hydroliza i ekstrakcja [2]

Do próbki do badania dodać kolejno 40 ml alkoholu etylowego (ppkt 3.1), 2 ml roztworu askorbinianu sodu [3], 10 ml roztworu wodorotlenku potasu (ppkt 3.4) i 2 ml roztworu siarczku sodowego (ppkt 3.13).

Podgrzewać przez 30 minut w temperaturze 70 — 80 °C pod chłodnicą zwrotną, a następnie postawić do ostygnięcia pod strumieniem wody. Dodać 50 ml etanolu (ppkt 3.1) i 100 ml 1,2-dichloroetanu (ppkt 3.7) (pobranego pipetą). Energicznie wstrząsnąć i następnie zlać ciecz sklarowaną nad osadem do dekantera. Dodać do dekantera 150 ml roztworu wodorotlenku potasu (ppkt 3.5), potrząsać przez 30 sekund i pozostawić do odstania do momentu rozdzielenia się warstw. Zebrać warstwę dichloroetanu (dolna warstwa) w dekanterze, dodać 40 ml roztworu wodorotlenku potasu (ppkt 3.6), potrząsać przez 10 sekund i pozostawić do odstania do momentu rozdzielenia się warstw. Zebrać warstwę dichloroetanu w dekanterze i wymywać 6 — 8 razy 40-mililitrowymi porcjami wody, dopóki nie zostaną usunięte związki alkaliczne (sprawdzić fenoloftaleiną). Zebrać warstwę dichloroetanu i usunąć paskami bibuły filtracyjnej ostatnie śladowe ilości wody.

Odparować do uzyskania suchości podwielokrotną część roztworu w próżni i na łaźni wodnej w temperaturze 40 °C. Szybko poddać pozostałość działaniu 5 ml lekkiej ropy (ppkt 3.8).

Dla produktów z grupy A chromatografię przeprowadzać zgodnie z ppkt 5.3.1.

Dla produktów z grupy B przenieść roztwór do kolby miarowej o pojemności 50 ml, uzupełnić do pełnej objętości lekką ropą (ppkt 3.8), wymieszać i zmierzyć gęstość optyczną zgodnie z ppkt 5.4.2.

5.3. Chromatografia

5.3.1. Produkty z grupy A

Do wysokości 200 mm wypełnić rurkę chromatograficzną (ppkt 4.3) 10 g tlenku glinu (ppkt 3.9) uprzednio zmieszanego z lekką ropą (ppkt 3.8). Nalać do rurki roztwór uzyskany w ppkt 5.2 i natychmiast dodać 20 ml lekkiej ropy (ppkt 3.8). Wymywać kolejno 10-mililitrowymi porcjami roztworów lekkiej ropy w 4-, 8-, 12-, 16- i 20-procentowym eterze dietylowym (ppkt 3.12) pod ciśnieniem lub w częściowej próżni, z szybkością przepływu równą 2 — 3 kropli na sekundę.

Najpierw wymywany jest karoten [4] Na ogół retinol wymywany jest roztworem lekkiej ropy w 20-procentowym eterze dietylowym (ppkt 3.12). Wymywanie następuje pod wpływem światła ultrafioletowego (krótkie napromienianie kolumny lampą rtęciową). Strefa fluorescencyjna retinolu jest wyraźnie oddzielona od następujących po niej żółtych stref ksantofilu. Zawierającą retinol frakcję eluatu zebrać w kolbie Erlenmeyera.

5.3.2. Produkty z grupy B

Chromatografię należy przeprowadzać tylko wtedy, gdy wyniki pomiarów gęstości optycznej uzyskane w ppkt 5.4.2 nie spełniają wymagań podanych w ppkt 5.4.2.

Jeśli chromatografia okaże się niezbędna, umieszcza się w kolumnie chromatograficznej podwielokrotną część roztworu w lekkiej ropie uzyskanego w ppkt 5.2, zawierającego około 500 IU retinolu i przeprowadza chromatografię zgodnie z ppkt 5.3.1.

5.4. Pomiar gęstości optycznej

5.4.1. Produkty z grupy A

Odparować w próżni do uzyskania suchości eluat zawierający retinol uzyskany w ppkt 5.3.1. Pozostałość poddać działaniu 2 ml benzenu (ppkt 3.14). Pobrać 0,3 ml tego roztworu i dodać 3 ml odczynnika Carra-Price'a (ppkt 3.16). Powstaje niebieskie zabarwienie. Zmierzyć gęstość optyczną spektrofotometrem przy długości fali wynoszącej dokładnie 610 nm, 30 sekund po rozpoczęciu reakcji. Oznaczyć zawartość retinolu korzystając z krzywej wzorcowej uzyskanej dla roztworów benzenu o wzrastającym stężeniu wzorcowego retinolu poddanych działaniu odczynnika Carra-Price'a (2 — 16 IU wzorcowego retinolu (ppkt 3.17) na 0,3 ml benzenu (ppkt 3.14) + 3 ml odczynnika Carra-Price'a (ppkt 3.16)). Krzywa wzorcowa musi być sprawdzana regularnie i często na podstawie wzorcowego i świeżo sporządzanego roztworu odczynnika Carra-Price'a.

5.4.2. Produkty z grupy B

Pobrać podwielokrotną część roztworu w lekkiej ropie, uzyskanego w ppkt 5.2, zawierającego około 200 IU retinolu. Odparować w próżni do uzyskania suchości i poddać pozostałość działaniu 25 ml izopropanolu (ppkt 3.18). Zmierzyć gęstość optyczną spektrofotometrem przy długościach fali 325, 310 i 334 nm. Maksimum absorpcji występuje dla wartości 325 nm. Zawartość retinolu w roztworze obliczana jest w następujący sposób:

E325. 18,30 = IU retinolu/ml

Jednakże stosunek gęstości optycznych

E310: E325 oraz E334 : E325

musi być równy 6 : 7 = 0,857.

Jeśli jeden z tych stosunków różni się znacząco od niniejszej wartości (< 0,830 lub >0,880), pomiar gęstości optycznej musi zostać poprzedzony chromatografią przeprowadzoną zgodnie z metodą opisaną w ppkt 5.3.2. Jeśli pomiar gęstości optycznych przeprowadzony po chromatografii wykazuje, że powyższe stosunki nadal znacząco różnią się od wartości 0,857 (< 0,830 lub >0,880), oznaczenie należy przeprowadzić według metody podanej dla produktów z grupy A.

6. Obliczanie wyników

Obliczyć zawartość retinolu w próbce uwzględniając masę próbki i rozcieńczenia przeprowadzone w czasie analizy. Wynik wyrazić w jednostkach IU retinolu na kg paszy lub na kg koncentratu lub premiksu.

Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń przeprowadzonych na tej samej próbce nie może przekraczać:

- 20 % w wartości względnej dla zawartości retinolu mniejszej od 75000 IU/kg;

- 15000 IU dla zawartości retinolu w przedziale między 75000 IU/kg a 150000 IU/kg;

- 10 % w wartości względnej dla zawartości retinolu w przedziale między 150000 IU/kg a 250000 IU/kg;

- 25000 IU dla zawartości retinolu w przedziale między 25000 IU/kg a 500000 IU/kg;

- 5 % wartości względnej dla zawartości retinolu większej od 500000 IU/kg.

2. OZNACZANIE ZAWARTOŚCI TIAMINY (WITAMINY B1, ANEURYNY)

1. Cel i zakres

Niniejsza metoda umożliwia oznaczenie zawartości tiaminy (aneuriny, witaminy B1) w paszach, koncentratach i premiksach. Dolną granicą oznaczania jest 5 ppm (części na milion).

2. Zasada

Gorący roztwór poddawany jest działaniu rozcieńczonego kwasu siarkowego, a następnie poddany enzymatycznej hydrolizie. Uzyskany roztwór jest poddawany utlenianiu związkami alkalicznymi. Powstały tiochrom jest ekstrahowany izobutanolem i oznaczany w analizie fluorymetrycznej.

3. Odczynniki

3.1. Wzorcowy roztwór tiaminy 100 μg/ml: rozpuścić 112,3 mg chlorowodorku tiaminy, uprzednio wysuszonego w próżni do uzyskania stałej masy, w 1000 ml 0,2-normalnego kwasu siarkowego (ppkt 3.2). Roztwór ten można trzymać przez miesiąc, pod warunkiem przechowywania w chłodnym oraz ciemnym miejscu.

3.2. 0,2-normalny kwas siarkowy.

3.3. Czysty wodorosiarczyn sodowy.

3.4. Czysty 20-procentowy (procent wagowy) roztwór żelazicyjanku potasu.

3.5. Czysty 25-procentowy (procent wagowy) roztwór wodorotlenku potasu.

3.6. Mieszanina utleniająca: wymieszać 2 ml roztworu żelazicyjanku potasu (ppkt 3.4) z 48 ml roztworu wodorotlenku potasu (ppkt 3.5). Mieszaniny tej nie można przechowywać dłużej niż przez 4 godziny.

3.7. Czysty izobutanol.

3.8. 2,5-normalny roztwór octanu sodowego.

3.9. Wieloenzymatyczny preparat zawierający proteazę, fosfatazę i amylazę, np. Clarase.

3.10. 96-procentowy (procent objętościowy) etanol.

4. Aparatura

4.1. Łaźnia wodna.

4.2. Wirówka (3500 obr./min) z rurkami o pojemności 30—50 ml ze szklanymi szlifowanymi korkami.

4.3. Fluorymetr.

5. Procedura

5.1. Hydroliza enzymatyczna

Umieścić w każdej z dwóch kolb miarowych A i B o pojemności 250 ml identyczne ilości drobno rozdrobnionej próbki, zawierające około 100 μg tiaminy i 125 ml kwasu siarkowego (ppkt 3.2). Tylko do kolby A dodać także 1,0 ml roztworu wzorcowego (ppkt 3.1) (wzorzec wewnętrzny).

Wstrząsnąć kolby energicznie, umieścić na wrzącej łaźni wodnej i trzymać tam przez 15 minut wstrząsając od czasu do czasu. Pozostawić do ostygnięcia do temperatury około 45 °C. Do każdej kolby dodać 20 ml roztworu octanu sodu (ppkt 3.8) i 0,5 g preparatu wieloenzymatycznego (ppkt 3.9), następnie pozostawić na 20 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 20 ml roztworu octanu sodu (ppkt 3.8) uzupełnić do pełnej objętości wodą, poddać homogenizacji i przefiltrować. Zebrać filtraty A i B po zlaniu pierwszych 15 ml. Sporządzić następujące roztwory:

5.1.1. Roztwór odniesienia T

Umieścić w rurce wirówki (ppkt 4.2) 5 ml filtratu A i około 10 mg wodorosiarczanu sodu (ppkt 3.3). Zanurzyć probówkę we wrzącej łaźni wodnej na 15 minut, a następnie pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej.

5.1.2. Roztwory A (wzorzec wewnętrzny) i B (próbka)

Umieścić w rurce wirówki (ppkt 4.2) 5 ml filtratu A i 5 ml filtratu B w kolejnej rurce wirówki (ppkt 4.2).

5.2. Utlenianie

Do roztworów T, A i B dodać 5 ml mieszaniny utleniającej (ppkt 3.6) i, po upływie minuty, 10 ml izobutanolu (ppkt 3.7). Zatkać próbówki korkami i energicznie wstrząsać przez 5 sekund. Pozostawić do odstania przez 1 minutę i odwirować w celu oddzielenia warstw. Z każdej próbówki przenieść 5 ml warstwy sklarowanego izobutanolu do kolb miarowych o pojemności 25 ml, uzupełnić do pełnej objętości etanolem (ppkt 3.10), poddać homogenizacji (= ekstrakty T, A i B).

5.3. Pomiar fluorescencji

Przeprowadzić pomiary przy takiej długości fali, przy której fluorymetr daje optymalną odpowiedź na fluorescencję tiochromu. Napromieniowywać przy długości fali 365 nm.

Wyregulować przyrząd na 0 (zero) stosując ekstrakt T. Zmierzyć natężenie fluorescencji ekstraktów A i B.

6. Obliczanie wyników

Zawartość tiaminy w mg/kg próbki wyraża się stosunkiem:

c

gdzie:

a = natężenie fluorescencji — ekstraktu A (wzorca wewnętrznego);

b = natężenie fluorescencji ekstraktu B (próbki);

c = masa badanej próbki w g;

d = ilość tiaminy w μg dodana do badanej próbki (wewnętrzny wzorzec).

Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń przeprowadzonych na tej samej próbce nie może przekraczać:

10 % wartości względnej dla zawartości mniejszych niż 500 mg/kg, i

5 % wartości względnej dla zawartości równych lub większych od 500 mg/kg.

3. OZNACZANIE ZAWARTOŚCI KWASU ASKORBINOWEGO I DEHYDROASKORBINOWEGO

(WITAMINY C)

1. Cel i zakres

Niniejsza metoda umożliwia oznaczenie całkowitej zawartości kwasu askorbinowego i dehydroaskorbinowego (witaminy C) w paszach, koncentratach i premiksach. Dolną granicą oznaczania jest 5 ppm (części na milion). Produkty klasyfikowane są w dwóch grupach według ich założonej zawartości witaminy C:

Grupa A: zawartość mniejsza niż 10 g/kg;

Grupa B: zawartość równa lub większa 10 g/kg.

2. Zasada

Próbka jest zawieszona w rozcieńczonym roztworze kwasu metafosforowego i ekstrahowana chloroformem. Faza wodna jest poddawana działaniu roztworu 2,6-dichlorofenolo-indofenolu w celu przekształcenia kwasu askorbinowego w kwas dehydroaskorbinowy, a następnie roztworu 2,4-dinitrofenylohydrazyny. Otrzymany hydrazon jest ekstrahowany mieszaniną octanu etylowego, kwasu octowego lodowatego i acetonu. Roztwór badany jest metodą chromatograficzną w kolumnie żelu krzemionkowego, eluat odparowywany do uzyskania suchości, a pozostałość rozpuszczana w rozcieńczonym kwasie siarkowym. Gęstość optyczna roztworu mierzona jest spektrofotometrem przy długości fali 509 nm.

Dla produktów z grupy A eluat powstały podczas analizy chromatograficznej w kolumnie jest nadal badany w chromatografii cienkowarstwowej w celu wyodrębnienia hydrazonu.

3. Odczynniki

3.1. Roztwór wzorcowy 0,05-procentowego kwasu L-askorbinowego: rozpuścić 50 mg czystego kwasu L-askorbinowego w około 20 ml roztworu kwasu metafosforowego (ppkt 3.2) i uzupełnić wodą do 100 ml. Sporządzić bezpośrednio przed użyciem.

3.2. 10-procentowy (procent wagowy) roztwór kwasu metafosforowego: po zmieleniu w moździerzu rozpuścić w wodzie 200 g czystego kwasu metafosforowego i uzupełnić wodą do 2000 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Roztwór zachowuje trwałość przez tydzień.

3.3. Czysty chloroform.

3.4. 0,5-procentowy (procent wagowy) roztwór czystego 2,6-dichlorofenolo-indofenolu. Sporządzić bezpośrednio przed użyciem.

3.5. Filtracja pomocnicza (S. i S. nr 121 lub równoważny).

3.6. Kwasowy 2-procentowy (procent wagowy) roztwór 2,4-dinitrofenylohydrazyny: rozpuścić 2 g 2,4-dinitrofenylohydrazyny w 100 ml rozcieńczonego kwasu siarkowego (25 ml czystego kwasu siarkowego o gęstości 1,84 rozcieńczonego poprzez uzupełnienie wodą do 100 ml). Roztwór zachowuje trwałość przez tydzień pod warunkiem przechowywania w niskiej temperaturze.

3.7. Azot, lub

3.8. Ditlenek węgla.

3.9. Mieszanina octanu etylowego, kwasu octowego lodowatego i acetonu w stosunku 96:2:2 objętościowo.

3.10. Mieszanina czystego dichlorometanu i kwasu octowego lodowatego w stosunku 97:3 objętościowo.

3.11. Żel krzemionkowy o wielkości cząstek 0,05 — 0,2 mm.

3.12. Płytki z żelu krzemionkowego do chromatografii cienkowarstwowej.

3.13. Rozcieńczony kwas siarkowy: nalać 105 ml wody do kolby miarowej o pojemności 200 ml, uzupełnić do pełnej objętości czystym kwasem siarkowym o gęstości 1,84.

3.14. Rozpuszczalnik wymywający do chromatografii cienkowarstwowej: wymieszać 75 ml eteru dietylowego, 25 ml czystego eteru etylowego i 4,0 ml 96-procentowego (procent wagowy) czystego kwasu octowego. Wymienić po przeprowadzeniu 2 — 3 chromatografii.

4. Aparatura

4.1. Łaźnia wodna z termostatem nastawionym na 20 °C.

4.2. Wirówka (3500 obr./min.) z rurkami o pojemności 40 — 50 ml ze szklanymi szlifowanymi korkami.

4.3. Obrotowy aparat wyparny próżniowy z kolbami o pojemności 250 ml.

4.4. Szklane rurki chromatograficzne (o długości 100 mm i średnicy wewnętrznej 20 mm, z krążkiem ze spieku (np. rurki Allihna).

4.5. Spektrofotometr lub kolorymetr z filtrami z 10-milimetrowymi ogniwami.

4.6. Aparatura do chromatografii cienkowarstwowej z płytkami z żelu krzemionkowego (ppkt 3.12) powleczonymi na głębokość 0,5 — 0,6 mm. (właściwe są płytki gotowe). Wysuszyć płytki przez 2,5—3 godzin w piecu do suszenia w temperaturze 120-130 °C. Pozostawić do ostygnięcia, następnie trzymać w eksykatorze, przez co najmniej 24 godziny przed użyciem.

4.7. Piec do suszenia nastawiony na temperaturę 120 — 130 °C.

5. Procedura

5.1 Ekstrakcja

W dwóch kolbach miarowych A i B o pojemności 250 ml (ze szlifowanymi korkami szklanymi) umieścić identyczne ilości drobno rozdrobnionej próbki zawierającej około 200 μg witaminy C. Tylko do kolby A dodać 0,4 ml roztworu wzorcowego (ppkt 3.1) i wymieszać delikatnie wstrząsając (wzorzec wewnętrzny).

Do każdej kolby dodać 30 ml chloroformu (ppkt 3.3) i 25 ml roztworu kwasu metafosforowego (ppkt 3.2) o temperaturze 4 °C. Przez chwilę wstrząsać i pozostawić do odstania na 10 — 15 minut. Dodać 25 ml wody, zatkać kolby, wstrząsać energicznie przez 10 sekund i pozostawić do odstania na 10 — 15 minut w łaźni wodnej (ppkt 4.1). Odwirować w celu oddzielenia fazy wodnej od fazy chloroformu. Na ekstraktach wodnych A (wzorzec wewnętrzny) i B przeprowadzić operacje jednocześnie, zgodnie z poniższym opisem.

5.2 Utlenianie

Przenieść używając pipety 40 ml sklarowanego roztworu wodnego nad osadem (nieznacznie mętny) uzyskanego w ppkt 5.1) do rurki reakcyjnej wyposażonej w szlifowany korek szklany. Dodać 0,5 — 1 ml roztworu 2,6-dichlorofenolo-indofenolu (ppkt 3.4) i wymieszać. Wytwarza się czerwone zabarwienie, które powinno się utrzymywać przez co najmniej przez 15 minut. Następnie dodać około 300 mg pomocniczego materiału filtracyjnego (ppkt 3.5), wstrząsnąć i przefiltrować przez suchy filtr harmonijkowy. Filtrat niekoniecznie musi być klarowny.

5.3 Reakcja z 2,4-dinitrofenylohydrazyną i ekstrakcja hydrazonu

Przenieść używając pipety 10 ml filtratu uzyskanego w ppkt 5.2 do rurki wirówki (ppkt 4.2), dodać 2 ml roztworu 2,4-dinitrofenylohydrazyny (ppkt 3.6) i wymieszać. Szybko skierować strumień azotu (ppkt 3.7) lub ditlenku węgla (ppkt 3.8) do rurki, zatkać rurkę i zanurzyć ją na około 15 godzin (na noc) w łaźni wodnej (ppkt 4.1).

Następnie dodać 3 ml wody, 20 ml mieszaniny octanu etylowego, kwasu octowego lodowatego i acetonu (ppkt 3.9) i około 800 mg pomocniczego materiału filtracyjnego (ppkt 3.5). Zatkać probówkę, energicznie wstrząsać przez 30 sekund i odwirować. Umieścić 15 ml fazy sklarowanej nad osadem do kolby wyparnej i odparowywać pod obniżonym ciśnieniem w obrotowym aparacie wyparnym (ppkt 4.3) aż do uzyskania oleistej pozostałości. Rozpuścić pozostałość w 2 ml mieszaniny octanu etylu, kwasu octowego lodowatego i acetonu (ppkt 3.9), przez ponowne podgrzanie do temperatury 50 °C, pozostawić do ostygnięcia, dodać 10 ml mieszaniny dichlorometanu/kwasu octowego lodowatego (ppkt 3.10) i wymieszać.

5.4 Chromatografia kolumnowa

Napełnić rurkę chromatograficzną (ppkt 4.4) do poziomu 30 mm mieszaniną dichlorometanu i kwasu octowego lodowatego (ppkt 3.10). Energicznie wstrząsając utworzyć zawiesinę 5 g żelu krzemionkowego (ppkt 3.11) w 30 ml mieszaniny dwuchlorometanu/kwasu octowego lodowatego (ppkt 3.10); wlać zawiesinę do rurki. Pozostawić do odstania, a następnie sprężyć azotem (ppkt 3.7) pod małym ciśnieniem. Zlać do rurki roztwór uzyskany w ppkt 5.3, wypłukać kolbę małą ilością mieszaniny dichlorometanu/kwasu octowego lodowatego (ppkt 3.10), a następnie przystąpić do mycia kolumny tą samą mieszaniną (3 — 4 porcji po około 5 ml), dopóki nie zostanie uzyskany bezbarwny eluat. Zlać część eluatu zabarwioną na żółto.

Wymyć czerwonawą strefę na górze kolumny mieszaniną octanu etylu/kwasu octowego lodowatego/acetonu (ppkt 3.9), zebrać eluat i odparować do uzyskania suchości.

5.4.1. Dla produktów z grupy A (zawartość witaminy C mniejsza od 10 g/kg) rozpuścić pozostałość w 2,0 ml mieszaniny octanu etylu/kwasu octowego lodowatego/acetonu (ppkt 3.9) i natychmiast przeprowadzić chromatografię cienkowarstwową zgodnie z ppkt 5.5.

5.4.2. W przypadku produktów z grupy B (zawartość witaminy C większa lub równa 10 g/kg) poddać oleistą pozostałość działaniu 4,0 ml rozcieńczonego kwasu siarkowego (ppkt 3.13), energicznie wstrząsnąć, aby całkowicie rozpuścić pozostałość i zmierzyć gęstość optyczną zgodnie z ppkt 5.6.

5.5 Chromatografia cienkowarstwowa

Wykonać dwukrotnie opisane poniżej czynności. Nanieść cienką warstwą na płytkę (ppkt 4.6) 0,5 ml roztworu uzyskanego w ppkt 5.4.1. Wywoływać przez 20 minut rozpuszczalnikiem wymywającym (ppkt 3.14), w zbiorniku nasyconym parami rozpuszczalnika, dopóki nie zostanie wyraźnie oddzielona różowa strefa hydrazonu. Pozostawić do wyschnięcia w odkrytym miejscu. Zaznaczyć granicę różowej strefy, zdrapać strefę szpachelką i przenieść ilościowo proszek do rurki chromatograficznej (ppkt 4.4).

Wymywać kolejno 2 ml i 1,5 ml mieszaniny octanu etylu/kwasu octowego lodowatego/acetonu (ppkt 3.9). Zebrać eluat w małej kolbie (ostatnia część musi być bezbarwna). Odparować do uzyskania suchości, poddać działaniu oleistej pozostałości 4,0 ml rozcieńczonego kwasu siarkowego (ppkt 3.13), energicznie wstrząsnąć, żeby rozpuścić całkowicie pozostałość i zmierzyć gęstość optyczną.

5.6 Pomiar gęstości optycznej

Zmierzyć gęstość optyczną spektrofotometrem, przy długości fali 509 nm, po upływie 20 — 30 minut po rozpuszczeniu pozostałości w kwasie siarkowym. Pomiary przeprowadzić porównując z rozcieńczonym kwasem siarkowym (ppkt 3.13).

5.7 Próba ślepa

Przeprowadzić próbę ślepą stosując tę samą procedurę, lecz bez próbki.

6. Obliczanie wyników

Zawartość witaminy C w próbce w g na kg wyrażona jest następującym stosunkiem:

· 2

· 10d

gdzie:

a = gęstość optyczna próbki ślepej;

b = gęstość optyczna wewnętrznego roztworu wzorcowego (wzorzec wewnętrzny);

c = gęstość optyczna roztworu próbki;

d = masa próbki w gramach.

Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch równoległych oznaczeń przeprowadzonych na tej samej próbce nie może przekraczać:

10 % wartości względnej dla zawartości witaminy C mniejszej niż 10 g/kg i

5 % wartości względnej dla zawartości witaminy C większej lub równej 10 g/kg.

[1] 1 IU = 0,3 μg retinolu.

[2] Dla pasz i produktów mlecznych z tendencją do zbrylania lub pęcznienia należy podwoić ilość odczynników wymienionych w ppkt 5.2 akapit pierwszy i drugi.

[3] Jeśli hydroliza przeprowadzana jest w atmosferze azotu, nie trzeba dodawać askorbinianu sodowego.

[4] Zawartość karotenu można oznaczyć mierząc gęstość optyczną przy długości fali 450 nm;E 1 %1 cm = 2600

--------------------------------------------------