DECYZJA WYKONAWCZA KOMISJI (UE) 2015/1554

z dnia 11 września 2015 r.

ustanawiająca przepisy dotyczące stosowania dyrektywy 2006/88/WE w odniesieniu do wymogów w zakresie metod nadzoru i metod diagnostycznych

(notyfikowana jako dokument nr C(2015) 6188)

(Tekst mający znaczenie dla EOG)

KOMISJA EUROPEJSKA,

uwzględniając Traktat o funkcjonowaniu Unii Europejskiej,

uwzględniając dyrektywę Rady 2006/88/WE z dnia 24 października 2006 r. w sprawie wymogów w zakresie zdrowia zwierząt akwakultury i produktów akwakultury oraz zapobiegania niektórym chorobom zwierząt wodnych i zwalczania tych chorób (1), w szczególności jej art. 49 ust. 3, art. 50 ust. 4, art. 57 lit. b) i art. 61 ust. 3,

a także mając na uwadze, co następuje:

W dyrektywie 2006/88/WE ustanowiono minimalne środki zapobiegawcze w zakresie nadzoru i wczesnego wykrywania u zwierząt wodnych chorób wymienionych w wykazie w załączniku IV do tej dyrektywy („choroby ujęte w wykazie”) oraz środków zwalczania choroby stosowanych w wypadku zaistnienia podejrzenia wystąpienia lub wystąpienia ogniska chorób wymienionych w wykazie. W dyrektywie ustanowiono ponadto wymogi konieczne do uzyskania przez państwo członkowskie lub jego strefy lub enklawy statusu obszaru wolnego od choroby.

W całej Unii stosowane powinny być jednakowe zasady i jednakowe podejście naukowe w odniesieniu do zwalczania chorób ujętych w wykazie oraz do uzyskiwania statusu obszaru wolnego od choroby przez państwo członkowskie, strefę lub enklawę. Z tego powodu należy ustanowić na poziomie unijnym szczególne wymogi dotyczące systemów zwalczania i nadzoru oraz dotyczące metod pobierania próbek i metod diagnostycznych, które państwa członkowskie mają stosować w celu uzyskania statusu obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do całego terytorium lub strefy bądź enklawy.

W tym kontekście podręcznik diagnostyki zwierząt wodnych wymienia – w odniesieniu do wielu z chorób ujętych w wykazie – kilka badań i procedur, które należy stosować do celów badań laboratoryjnych. Aby ujednolicić na poziomie unijnym bazę naukową dla prac diagnostycznych odnoszących się do chorób ujętych w wykazie, należy dokonać wyboru między badaniami i procedurami diagnostycznymi zalecanymi przez OIE oraz określić, które badania powinny być obowiązkowe do celów badań laboratoryjnych w ramach realizacji badań nadzoru oraz do celów wykluczenia podejrzenia obecności chorób ujętych w wykazie lub potwierdzenia ich obecności. W określonych przypadkach istnieć będzie potrzeba dysponowania alternatywnymi metodami i procedurami, a zatem należy przygotować opisy i pewne wyjaśnienia naukowe dotyczące okoliczności i sposobu stosowania alternatywnych metod. Konieczne jest to szczególnie w odniesieniu do bardziej szczegółowych procedur diagnostycznych.

W celu uzyskiwania dokładnych i odtwarzalnych wyników diagnostycznych ważne jest, by szczegółowe procedury i protokoły, które mają być stosowane, były walidowane zgodnie z odpowiednimi normami jakości o których mowa w części I załącznika VI do dyrektywy 2006/88/WE. W przypadku wielu metod diagnostycznych przewidzianych w niniejszej decyzji stosowanie komercyjnych zestawów do badań stanowi nieodzowną część protokołu diagnostycznego i laboratoria referencyjne UE zwalidowały te zestawy w drodze akredytowanych badań w odniesieniu do odpowiednich chorób. Ze względów pewności prawa w niniejszej decyzji należy zawrzeć odniesienia do komercyjnych nazw tych zwalidowanych, komercyjnych zestawów do badań.

W przypadku niektórych państw członkowskich osiągnięcie statusu obszaru wolnego od choroby dla całego terytorium lub jego strefy bądź enklawy może być trudne w odniesieniu do jednej lub kilku chorób ujętych w wykazie. W takich sytuacjach zdarzyć się może, że dane państwo członkowskie nie chce uzyskać lub odzyskać statusu obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do danych chorób ujętych w wykazie. Minimalne środki zwalczania choroby stosowane w przypadku, gdy państwo członkowskie nie chce uzyskać lub odzyskać statusu obszaru wolnego od choroby, powinny być jednakowe na poziomie unijnym i powinny podlegać jednakowym kryteriom. Konieczne jest zatem ustanowienie zgodnie z dyrektywą 2006/88/WE szczegółowych przepisów dotyczących zapobiegania rozprzestrzenianiu się takich chorób ujętych w wykazie oraz minimalne wymogi dotyczące uchylania środków zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby.

W decyzji Komisji 2001/183/WE (2) ustanowiono wymagania dotyczące planów pobierania próbek oraz metod diagnostycznych do celów wykrywania i potwierdzania chorób ujętych w wykazie, zakaźnej martwicy układu krwiotwórczego ryb łososiowatych oraz wirusowej posocznicy krwotocznej. W decyzji Komisji 2003/466/WE (3) ustanowiono wymagania dotyczące planów pobierania próbek oraz metod diagnostycznych do celów wykrywania zakaźnej anemii (niedokrwistości) łososia oraz kryteria podziału na strefy i urzędowego nadzoru w następstwie podejrzenia lub potwierdzenia występowania tej choroby. W decyzji Komisji 2002/878/WE (4) ustanowiono wymagania dotyczące planów pobierania próbek oraz metod diagnostycznych do celów wykrywania i potwierdzania chorób mięczaków bonamiozy (Bonamia ostreae) i marteiliozy (Marteilia refringens). W celu aktualizacji tych wymagań niniejsza decyzja powinna zastąpić wymienione trzy decyzje. Decyzje 2001/183/WE, 2002/878/WE oraz 2003/466/WE powinny zatem zostać uchylone.

PRZYJMUJE NINIEJSZĄ DECYZJĘ:

Artykuł 1

Przedmiot

W niniejszej decyzji reguluje się następujące kwestie:

nadzór, strefy buforowe, metody pobierania próbek i metody diagnostyczne stosowane przez państwa członkowskie w związku z odnoszącym się do państw członkowskich, ich stref lub enklaw statusem dotyczącym nieegzotycznych chorób zwierząt wodnych ujętych w części II załącznika IV do dyrektywy 2006/88/WE („choroby ujęte w wykazie”);

Artykuł 2

Definicje

Do celów niniejszej decyzji stosuje się następujące definicje:

„zakażenie herpeswirusem koi” („KHVD”) oznacza chorobę spowodowaną przez herpeswirusa koi (KHV) należącego do rodziny Alloherpesviridae. Nazwa systematyczna tego wirusa to Cyprinid herpesvirus 3 (CyHV-3).

„zakaźna anemia łososia” („ISA”) oznacza chorobę spowodowaną zakażeniem wirusem zakaźnej anemii łososia (ISAV) z delecją w regionie wysoce polimorficznym (HPR), który to wirus należy do rodzaju Isavirus w obrębie rodziny Orthomyxoviridae;

Artykuł 3

Minimalne wymogi w zakresie programów zwalczania i nadzoru

Przyznając, cofając lub przywracając państwu członkowskiemu lub jego strefie bądź enklawie status obszaru wolnego od choroby ujętej w wykazie, państwo członkowskie zapewnia zachowanie zgodności z przepisami dotyczącymi programów zwalczania i nadzoru, stref buforowych, metod pobierania próbek i metod diagnostycznych ustanowionymi w załączniku I oraz szczególnymi metodami i szczegółowymi procedurami określonymi w załączniku II.

Artykuł 4

Minimalne wymogi w zakresie metod diagnostycznych i szczególnych procedur

Państwo członkowskie zapewnia zachowanie zgodności z metodami kontroli określonymi w załączniku I i ze szczególnymi metodami diagnostycznymi oraz szczegółowymi procedurami określonymi w załączniku II, gdy przeprowadzane są badania laboratoryjne w celu potwierdzenia lub wykluczenia obecności choroby ujętej w wykazie.

Artykuł 5

Minimalne środki zwalczania choroby do celów zapobiegania rozprzestrzenianiu się chorobom ujętym w wykazie oraz minimalne wymogi w odniesieniu do uchylania środków zapobiegania rozprzestrzenianiu się tych chorób w państwach członkowskich, strefach lub enklawach nieuznanych za wolne od chorób ujętych w wykazie

Przy wykonywaniu środków zwalczania choroby lub uchylaniu środków zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby ujętej w wykazie w odniesieniu do państwa członkowskiego lub w jego strefy bądź enklawy, które nie zostały uznane za wolne od przedmiotowych chorób ujętych w wykazie, państwo członkowskie zapewnia zachowanie zgodności z minimalnymi środkami zwalczania choroby oraz minimalnymi wymogami w odniesieniu do uchylania środków zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby określonymi w załączniku I.

Artykuł 6

Uchylenie

Decyzje 2001/183/WE, 2002/878/WE oraz 2003/466/WE tracą moc.

Artykuł 7

Rozpoczęcie stosowania

Niniejszą decyzję stosuje się od dnia 1 kwietnia 2016 r.

Artykuł 8

Adresaci

Niniejsza decyzja skierowana jest do państw członkowskich.

(1) Dz.U. L 328 z 24.11.2006, s. 14.

(2) Decyzja Komisji 2001/183/WE z dnia 22 lutego 2001 r. ustanawiająca plany pobierania próbek i metody diagnostyczne do celów wykrywania i potwierdzania występowania niektórych chorób ryb oraz uchylająca decyzję 92/532/EWG (Dz.U. L 67 z 9.3.2001, s. 65).

(3) Decyzja Komisji 2003/466/WE z dnia 13 czerwca 2003 r. ustanawiająca kryteria podziału na strefy i urzędowego nadzoru w następstwie podejrzenia lub potwierdzenia występowania niedokrwistości zakaźnej łososia (ISA) (Dz.U. L 156 z 25.6.2003, s. 61).

(4) Decyzja Komisji 2002/878/WE z dnia 6 listopada 2002 r. ustanawiająca plany pobierania próbek oraz metody diagnostyczne stosowane w celu wykrywania i potwierdzania występowania u mięczaków Bonamiosis (Bonamia ostreae) i Marteiliosis (Marteilia refringens) (Dz.U. L 305 z 7.11.2002, s. 57).

Systemy nadzoru obowiązujące dla państw członkowskich, stref i enklaw do celów utrzymania statusu obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do WSD, jak wskazano w pkt I.3

Metodą diagnostyczną stosowaną do celów uzyskania lub utrzymania statusu obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do zakażenia WSD, zgodnie ze szczegółowymi metodami i procedurami określonymi w załączniku II część 6, jest dwuetapowy PCR.

II.2. Metody diagnostyczne do celów uzyskania lub utrzymania statusu obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do WSD

we wszystkich gospodarstwach uznanych urzędowo za zakażone WSD i wszystkich innych gospodarstwach poddanych odłogowaniu/środkom alternatywnym zgodnie z lit. a), położonych w obrębie ustanowionej strefy ochronnej i strefy nadzoru odnowiono populację skorupiakami pozyskanymi z państw członkowskich, stref lub enklaw o statusie zdrowotnym kategorii I, II lub III odnoszącym się do WSD;

Państwo członkowskie, strefa lub enklawa, które posiadają status zdrowotny kategorii V w odniesieniu do WSD, mogą uzyskać status zdrowotny kategorii III w odniesieniu do tej choroby ujętej w wykazie pod następującymi warunkami:

I.4. Wymogi odnoszące się do uchylenia środków zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby przewidzianych w art. 39 dyrektywy 2006/88/WE (zmiana kategorii statusu zdrowotnego z V na III) w odniesieniu do WSD

Jeśli do utrzymania statusu zdrowotnego kategorii I wymagany jest nadzór ukierunkowany, jak przewidziano w art. 52 dyrektywy 2006/88/WE, wszystkie gospodarstwa utrzymujące gatunki podatne wymienione w części II załącznika IV do tej dyrektywy, położone w obrębie danego państwa członkowskiego, danej strefy lub enklawy obejmuje się badaniami stanu zdrowia i pobieraniem próbek zgodnie z sekcją II tabela 6.B, uwzględniając poziom zagrożenia dla danego gospodarstwa w odniesieniu do przeniesienia zakażenia WSD.

I.3. Szczególne wymogi do celów utrzymania statusu obszaru wolnego od choroby (kategoria I) w odniesieniu do WSD

Enklawa kontynentalna obejmująca pojedyncze gospodarstwo posiadające status zdrowotny kategorii I w odniesieniu do WSD, której status zdrowotny odnoszący się do tej choroby ujętej w wykazie jest niezależny od otaczających ją wód naturalnych zgodnie z częścią II pkt 3 załącznika V do dyrektywy 2006/88/WE i której cofnięto status kategorii I zgodnie z art. 53 ust. 3 wspomnianej dyrektywy, może odzyskać status zdrowotny kategorii I natychmiast po potwierdzeniu przez właściwy organ, że spełniono następujące warunki:

I.2.2.2. Wymogi odnoszące się do odzyskania statusu obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do WSD przez enklawy kontynentalne obejmujące pojedyncze gospodarstwo uznane wcześniej za wolne od choroby w odniesieniu do WSD

wszystkie gospodarstwa w obrębie państwa członkowskiego, strefy lub enklawy objętych programem zwalczania utrzymujące gatunki podatne wymienione w części II załącznika IV do dyrektywy 2006/88/WE oraz, gdy wymagany jest nadzór w populacjach ryb dziko żyjących, punkty pobierania próbek wybrane zgodnie z częścią I pkt 2 akapit drugi załącznika V do wspomnianej dyrektywy są następnie objęte przynajmniej programem określonym w pkt I.2.1.

Odnowienie populacji przeprowadza się dopiero po dokonaniu we wszystkich gospodarstwach uznanych urzędowo za zakażone WSD opróżnienia ze zwierząt, oczyszczenia, zdezynfekowania i odłogowania zgodnie z pkt I.2.2.1 lit. c);

jedno badanie stanu zdrowia; w gospodarstwach, w których badania, o których mowa w ppkt (i), dały wyniki ujemne, badania stanu zdrowia prowadzi się nadal raz w miesiącu w trakcie sezonu o prawdopodobnie najwyższych wartościach rocznych temperatury, do czasu zniesienia strefy ochronnej zgodnie z pkt I.2.2.1 lit. c);

w wodach słodkich: całemu obszarowi zlewni gospodarstwa uznanego urzędowo za zakażone WSD; właściwy organ może ograniczyć obszar strefę ochronną do części obszaru zlewni, o ile nie stanowi to zagrożenia dla zapobiegania rozprzestrzenianiu się WSD;

Państwo członkowskie, strefa lub enklawa, które posiadają status zdrowotny kategorii V w odniesieniu do WSD, mogą uzyskać status zdrowotny kategorii I w odniesieniu do tej choroby, gdy wszystkie gospodarstwa w obrębie tego państwa członkowskiego, tej strefy lub enklawy utrzymujące gatunki podatne wymienione w części II załącznika IV do dyrektywy 2006/88/WE zostały objęte przynajmniej następującym programem zwalczania:

jest gospodarstwem kontynentalnym, którego status zdrowotny odnoszący się do WSD jest niezależny od odnoszącego się do tej choroby statusu zdrowotnego otaczających to gospodarstwo wód naturalnych, zgodnie z częścią II pkt 3 załącznika V do dyrektywy 2006/88/WE;

Państwo członkowskie, strefa lub enklawa, które w odniesieniu do WSD posiadają status zdrowotny kategorii III zgodnie z częścią B załącznika III do dyrektywy 2006/88/WE, mogą uzyskać status zdrowotny kategorii I w odniesieniu do tej choroby, jeśli wszystkie gospodarstwa utrzymujące gatunki podatne wymienione w części II załącznika IV do wspomnianej dyrektywy, położone w obrębie danego państwa członkowskiego, danej strefy lub enklawy, spełniają odpowiednie wymogi określone w załączniku V do tej dyrektywy, a wszystkie te gospodarstwa oraz, o ile wymagane jest to przepisem części I pkt 2 akapit drugi załącznika V do dyrektywy 2006/88/WE, punkty pobierania próbek u populacji ryb dziko żyjących wybrane zgodnie ze wspomnianą częścią poddano następującemu dwuletniemu programowi nadzoru obejmującemu badania stanu zdrowia oraz pobieranie próbek do badań.

I.2. Szczególne wymogi do celów uzyskania statusu zdrowotnego kategorii I w odniesieniu do WSD

jeśli w populacjach ryb dziko żyjących konieczny jest nadzór ukierunkowany zgodnie z częścią I pkt 2 akapit drugi załącznika V do dyrektywy 2006/88/WE, liczbę i rozmieszczenie geograficzne punktów pobierania próbek ustala się tak, by uzyskać rozsądny stopień pokrycia terytorium państwa członkowskiego, strefy lub enklawy. Punkty pobierania próbek powinny być reprezentatywne dla różnych ekosystemów stanowiących siedlisko populacji ryb dziko żyjących należących do gatunków podatnych, a mianowicie systemów morskich, przyujściowych, rzecznych i jeziornych.

Pobieranie próbek skorupiaków do celów badań laboratoryjnych prowadzi się w okresach o prawdopodobnie najwyższych wartościach rocznych temperatury. Powyższy wymóg dotyczący temperatury wody stosuje się również do badań stanu zdrowia, o ile są one wykonalne i stosowne.

I. Wymogi w zakresie programów nadzoru i zwalczania do celów uzyskania i utrzymania statusu obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do WSD oraz zapobiegania zakażeniu WSSV

Systemy nadzoru obowiązujące dla państw członkowskich, stref i enklaw do celów utrzymania statusu obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do inwazji wywołanej przez Bonamia ostreae, jak wskazano w pkt I.3

dochodzenie urzędowe obejmuje przynajmniej pobranie po rozpoczęciu okresu transmisji Bonamia ostreae jednej próbki składającej się z 30 mięczaków należących do gatunków podatnych, jeśli podejrzenie opiera się na sprawozdaniu o umieralności, albo – jeśli nie opiera się na takim sprawozdaniu – ze 150 mięczaków należących do gatunków podatnych. Jeśli okres transmisji nie jest znany, pobieranie próbek rozpoczyna się zimą lub wczesną wiosną. Próbki bada się przy wykorzystaniu metod diagnostycznych określonych w ppkt (i) zgodnie ze szczegółowymi metodami i procedurami diagnostycznymi określonymi w załączniku II część 5 pkt I.

Metodami diagnostycznymi stosowanymi do celów uzyskania lub utrzymania statusu obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do inwazji wywołanej przez Bonamia ostreae są histopatologia, odciski tkankowe lub PCR. Przy stosowaniu tych metod diagnostycznych stosuje się odpowiadające im szczegółowe metody i procedury określone w załączniku II część 5.

II.2. Metody diagnostyczne do celów uzyskania lub utrzymania status obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do inwazji wywołanej przez Bonamia ostreae

we wszystkich gospodarstwach lub obszarach chowu mięczaków uznanych urzędowo za zakażone i wszystkich innych gospodarstwach lub obszarach chowu mięczaków poddanych odłogowaniu/środkom alternatywnym zgodnie z lit. a). w obrębie ustanowionej strefy ochronnej i strefy nadzoru populację odnawia się mięczakami pozyskanymi z państw członkowskich, stref lub enklaw o statusie zdrowotnym kategorii I, II lub III odnoszącym się do inwazji wywołanej przez Bonamia ostreae;

Państwo członkowskie, strefa lub enklawa, które posiadają status zdrowotny kategorii V w odniesieniu do inwazji wywołanej przez Bonamia ostreae, mogą uzyskać status zdrowotny kategorii III w odniesieniu do tej choroby pod następującymi warunkami:

I.4. Wymogi odnoszące się do uchylenia środków zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby przewidzianych w art. 39 dyrektywy 2006/88/WE (zmiana kategorii statusu zdrowotnego z V na III) w odniesieniu do inwazji wywołanej przez Bonamia ostreae

Status obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do inwazji wywołanej przez Bonamia ostreae można utrzymać dopóty, dopóki badania wszystkich próbek przeprowadzone przy wykorzystaniu metod diagnostycznych określonych w pkt II.2 dają wyniki ujemne w odniesieniu do Bonamia ostreae, przy czym wykluczono wszelkie podejrzenie obecności inwazji Bonamia ostreae zgodnie z metodami diagnostycznymi określonymi w pkt II.3.

Jeśli do utrzymania statusu zdrowotnego kategorii I wymagany jest nadzór ukierunkowany, jak przewidziano w art. 52 dyrektywy 2006/88/WE, wszystkie gospodarstwa lub obszary chowu mięczaków utrzymujące gatunki podatne wymienione w części II załącznika IV do tej dyrektywy, położone w obrębie danego państwa członkowskiego, danej strefy lub enklawy obejmuje się badaniami stanu zdrowia i pobieraniem próbek zgodnie z sekcją II tabela 5.B, uwzględniając poziom zagrożenia dla danego gospodarstwa lub obszaru chowu mięczaków w odniesieniu do przeniesienia inwazji wywołanej przez Bonamia ostreae.

I.3. Szczególne wymogi do celów utrzymania statusu obszaru wolnego od choroby (kategoria I) w odniesieniu do inwazji wywołanej przez Bonamia ostreae

we wszystkich gospodarstwach lub obszarach chowu mięczaków uznanych urzędowo za zakażone i wszystkich innych gospodarstwach lub obszarach chowu mięczaków poddanych odłogowaniu w obrębie ustanowionej strefy ochronnej i strefy nadzoru populację odnawia się mięczakami pozyskanymi z państw członkowskich, stref lub enklaw o statusie zdrowotnym kategorii I odnoszącym się do inwazji wywołanej przez Bonamia ostreae. Odnowienie populacji przeprowadza się dopiero po dokonaniu we wszystkich gospodarstwach uznanych urzędowo za zakażone opróżnienia ze zwierząt, oczyszczenia, zdezynfekowania i odłogowania zgodnie z pkt I.2.2 lit. c);

wszystkie gospodarstwa i obszary chowu mięczaków, które utrzymują w obrębie strefy ochronnej gatunki podatne wymienione w części II załącznika IV do dyrektywy 2006/88/WE, a których nie uznano urzędowo za zakażone w wyniku inwazji wywołanej przez Bonamia ostreae, podlegają urzędowemu dochodzeniu obejmującemu przynajmniej pobranie do badań próbek 150 mięczaków należących do gatunków podatnych po rozpoczęciu okresu transmisji Bonamia ostreae. Jeśli okres transmisji nie jest znany, pobieranie próbek rozpoczyna się zimą lub wczesną wiosną;

Państwo członkowskie, strefa lub enklawa, które posiadają status zdrowotny kategorii V w odniesieniu do Bonamia ostreae, mogą uzyskać status zdrowotny kategorii I w odniesieniu do tej choroby, gdy wszystkie gospodarstwa lub obszary chowu mięczaków w obrębie tego państwa członkowskiego, tej strefy lub enklawy utrzymujące gatunki podatne wymienione w części II załącznika IV do dyrektywy 2006/88/WE zostały objęte przynajmniej następującym programem zwalczania:

jeśli próbka ma zawierać Ostrea edulis pochodzące z państwa członkowskiego, strefy lub enklawy o statusie zdrowotnym kategorii I, do próbki pobiera się zwierzęta wprowadzone do gospodarstwa lub obszaru chowu mięczaków nie później niż w okresie jesiennym bezpośrednio poprzedzającym okres, w którym przeprowadzany jest program nadzoru.

Gospodarstwa i obszary chowu mięczaków utrzymujące gatunki podatne wymienione w części II załącznika IV do dyrektywy 2006/88/WE były objęte badaniami stanu zdrowia i pobierano z nich próbki przez co najmniej dwa kolejne lata, jak przewidziano w tabeli 5.A;

Państwo członkowskie, strefa lub enklawa, które posiadają status zdrowotny kategorii III w odniesieniu do Bonamia ostreae, mogą uzyskać status zdrowotny kategorii I w odniesieniu do tej choroby, gdy wszystkie gospodarstwa w obrębie tego państwa członkowskiego, tej strefy lub enklawy utrzymujące gatunki podatne wymienione w części II załącznika IV do dyrektywy 2006/88/WE zostały objęte przynajmniej następującym programem nadzoru obejmującymi badania stanu zdrowia oraz pobieranie próbek do badań:

I.2. Szczególne wymogi do celów uzyskania statusu zdrowotnego kategorii I w odniesieniu do Bonamia ostreae

przy pobieraniu próbek w gospodarstwach, w których do produkcji mięczaków wykorzystuje się więcej niż jedno źródło wody, próbka obejmuje mięczaki reprezentujące wszystkie źródła wody zasilające gospodarstwo, tak by wszystkie części gospodarstwa były proporcjonalnie reprezentowane w próbce;

I. Wymogi w zakresie programów nadzoru lub zwalczania do celów uzyskania i utrzymania statusu obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do inwazji wywołanej przez Bonamia ostreae

Systemy nadzoru obowiązujące dla państw członkowskich, stref i enklaw do celów utrzymania statusu obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do inwazji wywołanej przez Marteilia refringens, jak wskazano w pkt I.3

dochodzenie urzędowe obejmuje przynajmniej pobranie jednej próbki składającej się z 30 mięczaków należących do gatunków podatnych, jeśli podejrzenie opiera się na sprawozdaniu o umieralności, albo – jeśli nie opiera się na takim sprawozdaniu – z 150 mięczaków należących do gatunków podatnych po rozpoczęciu okresu transmisji Marteilia refringens. Jeśli okres transmisji nie jest znany, pobieranie próbek rozpoczyna się w okresie po osiągnięciu przez wodę temperatury przekraczającej 17 °C;

Metodami diagnostycznymi stosowanymi do celów uzyskania lub utrzymania statusu obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do inwazji wywołanej przez Marteilia refringens, zgodnie ze szczegółowymi metodami i procedurami określonymi w załączniku II część 4, są histopatologia, odciski tkankowe lub PCR.

II.2. Metody diagnostyczne do celów uzyskania lub utrzymania status obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do inwazji wywołanej przez Marteilia refringens

we wszystkich gospodarstwach lub obszarach chowu mięczaków uznanych urzędowo za zakażone i wszystkich innych gospodarstwach lub obszarach chowu mięczaków poddanych odłogowaniu/środkom alternatywnym zgodnie z lit. a). w obrębie ustanowionej strefy ochronnej i strefy nadzoru populację odnawia się mięczakami pozyskanymi z państw członkowskich, stref lub enklaw o statusie zdrowotnym kategorii I, II lub III odnoszącym się do inwazji wywołanej przez Marteilia refringens;

Państwo członkowskie, strefa lub enklawa, które posiadają status zdrowotny kategorii V w odniesieniu do inwazji wywołanej przez Marteilia refringens, mogą uzyskać status zdrowotny kategorii III w odniesieniu do tej choroby ujętej w wykazie pod następującymi warunkami:

I.4. Wymogi odnoszące się do uchylenia środków zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby przewidzianych w art. 39 dyrektywy 2006/88/WE (zmiana kategorii statusu zdrowotnego z V na III) w odniesieniu do inwazji wywołanej przez Marteilia refringens

Jeśli do utrzymania statusu zdrowotnego kategorii I wymagany jest nadzór ukierunkowany, jak przewidziano w art. 52 dyrektywy 2006/88/WE, wszystkie gospodarstwa lub obszary chowu mięczaków utrzymujące gatunki podatne wymienione w części II załącznika IV do dyrektywy 2006/88/WE, położone w obrębie danego państwa członkowskiego, danej strefy lub enklawy obejmuje się badaniami stanu zdrowia i pobieraniem próbek zgodnie z sekcją II tabela 4.B, uwzględniając poziom zagrożenia dla danego gospodarstwa lub obszaru chowu mięczaków w odniesieniu do przeniesienia inwazji wywołanej przez Marteilia refringens.

I.3. Szczególne wymogi do celów utrzymania statusu obszaru wolnego od choroby (kategoria I) w odniesieniu do inwazji wywołanej przez Marteilia refringens

Odnowienie populacji przeprowadza się dopiero po dokonaniu we wszystkich gospodarstwach uznanych urzędowo za zakażone opróżnienia ze zwierząt, oczyszczenia, zdezynfekowania i odłogowania zgodnie z pkt I.2.2 lit. c);

we wszystkich gospodarstwach lub obszarach chowu mięczaków uznanych urzędowo za zakażone i wszystkich innych gospodarstwach lub obszarach chowu mięczaków poddanych odłogowaniu w obrębie ustanowionej strefy ochronnej i strefy nadzoru populację odnawia się mięczakami pozyskanymi z państw członkowskich, stref lub enklaw o statusie zdrowotnym kategorii I odnoszącym się do inwazji wywołanej przez Marteilia refringens.

wszystkie gospodarstwa i obszary chowu mięczaków, które utrzymują w obrębie strefy ochronnej gatunki podatne wymienione w części II załącznika IV do dyrektywy 2006/88/WE, a których nie uznano urzędowo za zakażone w wyniku inwazji wywołanej przez Marteilia refringens, podlegają urzędowemu dochodzeniu obejmującemu przynajmniej pobrania do badań próbek 150 mięczaków po rozpoczęciu okresu transmisji Marteilia refringens. Jeśli okres transmisji nie jest znany, pobieranie próbek rozpoczyna się w okresie po osiągnięciu przez wodę temperatury przekraczającej 17 °C;

Państwo członkowskie, strefa lub enklawa, które posiadają status zdrowotny kategorii V w odniesieniu do inwazji wywołanej przez Marteilia refringens, mogą uzyskać status zdrowotny kategorii I w odniesieniu do tej choroby, gdy wszystkie gospodarstwa lub obszary chowu mięczaków w obrębie tego państwa członkowskiego, tej strefy lub enklawy utrzymujące gatunki podatne wymienione w części II załącznika IV do dyrektywy 2006/88/WE zostały objęte przynajmniej następującym programem zwalczania:

jeśli próbka ma zawierać Ostrea edulis, Mytilus edulis lub Mytilus galloprovincialis pochodzące z państwa członkowskiego, strefy lub enklawy o statusie zdrowotnym kategorii I, do próbki pobiera się zwierzęta wprowadzone do gospodarstwa lub obszaru chowu mięczaków nie później niż w okresie wiosennym bezpośrednio poprzedzającym okres, w którym przeprowadzany jest program nadzoru.

Państwo członkowskie, strefa lub enklawa, które posiadają status zdrowotny kategorii III w odniesieniu do inwazji wywołanej przez Marteilia refringens, mogą uzyskać status zdrowotny kategorii I w odniesieniu do tej choroby, gdy wszystkie gospodarstwa lub obszary chowu mięczaków w obrębie tego państwa członkowskiego, tej strefy lub enklawy utrzymujące gatunki podatne wymienione w części II załącznika IV do dyrektywy 2006/88/WE zostały objęte przynajmniej następującym programem nadzoru obejmującymi badania stanu zdrowia oraz pobieranie próbek do badań:

I.2. Szczególne wymogi do celów uzyskania statusu zdrowotnego kategorii I w odniesieniu do Marteilia refringens

przy pobieraniu próbek w gospodarstwach utrzymujących mięczaki, w których do produkcji mięczaków wykorzystuje się więcej niż jedno źródło wody, próbka obejmuje mięczaki reprezentujące wszystkie źródła wody zasilające gospodarstwo, tak by wszystkie części gospodarstwa były proporcjonalnie reprezentowane w próbce;

jeśli w jednostce produkcyjnej lub na obszarze produkcyjnym występują Ostrea spp. i Mytilus spp., zwierzęta obu rodzajów pobiera się do próbki po równo. Jeśli występuje tylko jeden ze wspomnianych rodzajów, do próbki pobiera się ten rodzaj. Jeśli nie występuje ani rodzaj Ostrea, ani Mytilus, próbka musi być reprezentatywna dla wszystkich pozostałych gatunków podatnych, które tam występują;

I. Wymogi w zakresie programów nadzoru i zwalczania do celów uzyskania i utrzymania statusu obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do inwazji wywołanej przez Marteilia refringens

Systemy nadzoru obowiązujące dla stref i enklaw do celó w utrzymania statusu obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do ISA, jak wskazano w pkt I.3 (15)

Metodą diagnostyczną stosowaną do celów uzyskania lub utrzymania statusu obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do ISA zgodnie z pkt I.2 oraz I.3 jest RT-qPCR z następnym sekwencjonowaniem próbek dodatnich, zgodnie ze szczegółowymi metodami i procedurami określonymi w załączniku II część 3.

II.2. Metody diagnostyczne do celów uzyskania lub utrzymania statusu obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do ISA

we wszystkich gospodarstwach uznanych urzędowo za zakażone i wszystkich innych gospodarstwach poddanych odłogowaniu lub środkom alternatywnym zgodnie z lit. a), położonych w obrębie ustanowionej strefy ochronnej i strefy nadzoru odnowiono populację rybami pozyskanymi z państw członkowskich, stref lub enklaw o statusie zdrowotnym kategorii I, II lub III odnoszącym się do ISA;

I.4. Szczególne wymogi do celów uzyskania statusu zdrowotnego kategorii III w odniesieniu do ISAV z delecją w regionie HPR przez państwa członkowskie, strefy lub enklawy posiadające uprzednio status zdrowotny kategorii V

Status obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do ISA można utrzymać dopóty, dopóki badania wszystkich próbek przeprowadzone przy wykorzystaniu metod diagnostycznych określonych w pkt II.2 dają wyniki ujemne w odniesieniu do ISAV z delecją w regionie HPR, przy czym wykluczono wszelkie podejrzenie obecności ISA zgodnie z metodami diagnostycznymi określonymi w pkt II.3.

Jeśli do utrzymania statusu zdrowotnego kategorii I wymagany jest nadzór ukierunkowany, jak przewidziano w art. 52 dyrektywy 2006/88/WE, wszystkie gospodarstwa utrzymujące gatunki podatne wymienione w części II załącznika IV do tej dyrektywy, położone w obrębie danego państwa członkowskiego, danej strefy lub enklawy obejmuje się badaniami stanu zdrowia i pobieraniem próbek zgodnie z sekcją II tabela 3.B (11) , uwzględniając poziom zagrożenia dla danego gospodarstwa w odniesieniu do przeniesienia zakażenia ISA.

I.3. Minimalne środki zwalczania choroby do celów utrzymania statusu kategorii I w odniesieniu do ISA

Enklawa kontynentalna obejmująca pojedyncze gospodarstwo posiadające status zdrowotny kategorii I w odniesieniu do ISA, której status zdrowotny jest niezależny od otaczających ją wód naturalnych zgodnie z częścią II pkt 3 załącznika V do dyrektywy 2006/88/WE i której cofnięto status zdrowotny kategorii I zgodnie z art. 53 ust. 3 wspomnianej dyrektywy, może odzyskać ten status natychmiast po potwierdzeniu przez właściwy organ, że spełnia ona następujące warunki:

Odnowienie populacji przeprowadza się dopiero po dokonaniu we wszystkich gospodarstwach uznanych urzędowo za zakażone opróżnienia ze zwierząt, oczyszczenia, zdezynfekowania i odłogowania zgodnie z pkt I.2.2.1 lit. c);

we wszystkich gospodarstwach, które uznano urzędowo za zakażone ISAV z delecją w regionie HPR lub w przypadku których potwierdzono obecność ISA, i wszystkich innych gospodarstwach poddanych odłogowaniu w obrębie ustanowionej strefy ochronnej i strefy nadzoru populację odnawia się rybami pozyskanymi z państw członkowskich, stref lub enklaw o statusie zdrowotnym kategorii I odnoszącym się do ISA.

jedno badanie stanu zdrowia; w gospodarstwach, w których badania, o których mowa w ppkt (i) dały wyniki ujemne, badania stanu zdrowia prowadzi się nadal raz w miesiącu do zniesienia strefy ochronnej zgodnie z pkt I.2.2.1. lit. c);

w strefach śródlądowych: całemu obszarowi zlewni gospodarstwa uznanego urzędowo za zakażone ISA; właściwy organ może ograniczyć obszar strefę do części obszaru zlewni, o ile nie stanowi to zagrożenia dla zapobiegania rozprzestrzenianiu się ISA;

Państwo członkowskie, strefa lub enklawa, które posiadają status zdrowotny kategorii V w odniesieniu do ISA, mogą uzyskać status zdrowotny kategorii I w odniesieniu do tej choroby, gdy wszystkie gospodarstwa w obrębie tego państwa członkowskiego, tej strefy lub enklawy utrzymujące gatunki podatne wymienione w części II załącznika IV do dyrektywy 2006/88/WE zostały objęte przynajmniej następującym programem zwalczania zgodnym z lit. a)–e):

Państwo członkowskie, strefa lub enklawa, które w odniesieniu do ISA posiadają status zdrowotny kategorii III zgodnie z częścią B załącznika III do dyrektywy 2006/88/WE, mogą uzyskać status zdrowotny kategorii I w odniesieniu do tej choroby, jeśli wszystkie gospodarstwa utrzymujące gatunki podatne wymienione w części II załącznika IV do dyrektywy 2006/88/WE, położone w obrębie danego państwa członkowskiego, danej strefy lub enklawy, spełniają odpowiednie wymagania określone w załączniku V do tej dyrektywy, a wszystkie te gospodarstwa oraz, o ile wymagane jest to przepisem części I pkt 2 akapit drugi załącznika V do tej dyrektywy, punkty pobierania próbek w populacji ryb dziko żyjących wybrane zgodnie ze wspomnianą częścią poddano następującemu programowi nadzoru:

I.2. Szczególne wymogi do celów uzyskania statusu zdrowotnego kategorii I w odniesieniu do ISA

jeśli wśród gatunków podatnych obecnych w danym miejscu jest łosoś atlantycki, należy wybrać go do badania w pierwszym rzędzie. Jeśli w gospodarstwie rybackim nie ma łososia atlantyckiego, należy pobrać inne gatunki podatne;

Jeśli w populacjach ryb dziko żyjących konieczny jest nadzór ukierunkowany zgodnie z częścią I pkt 2 akapit drugi załącznika V do dyrektywy 2006/88/WE, liczbę i rozmieszczenie geograficzne punktów pobierania próbek ustala się tak, by uzyskać rozsądny stopień pokrycia terytorium państwa członkowskiego, strefy lub enklawy. Punkty pobierania próbek powinny być reprezentatywne dla różnych ekosystemów stanowiących siedlisko podatnych populacji dzikich.

Jeśli istnieje wymóg, by badania stanu zdrowia i pobieranie próbek w gospodarstwach przeprowadzane były częściej niż raz w roku zgodnie z częścią I pkt 2 akapit drugi załącznika V do dyrektywy 2006/88/WE, poszczególne badania stanu zdrowia lub poszczególne pobrania próbek odbywają się w możliwie największych odstępach czasu.

I. Wymogi w zakresie programów nadzoru i zwalczania do celów uzyskania i utrzymania statusu obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do ISA oraz zapobiegania zakażeniu wirusem zakaźnej anemii łososia z delecją w regionie HPR

System nadzoru do celów utrzymania statusu obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do KHVD w państwach członkowskich, strefach lub enklawach, w których liczba gospodarstw jest ograniczona, a nadzór ukierunkowany tych gospodarstw nie dostarcza wystarczających danych epidemiologicznych, jak wskazano w pkt I.3

Systemy nadzoru obowiązujące dla stref i enklaw do celów utrzymania statusu obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do KHVD, jak wskazano w pkt I.3

Metodą diagnostyczną do celów uzyskania statusu obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do KHVD jest łańcuchowa reakcja polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) zgodnie ze szczegółowymi metodami i procedurami diagnostycznymi określonymi w załączniku II część 2 pkt II.

II.2. Metody diagnostyczne w ramach nadzoru do celów uzyskania i utrzymania statusu obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do KHVD

II. Metody diagnostyczne i metody pobierania próbek w ramach nadzoru do celów uzyskania i utrzymania statusu obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do KHVD

we wszystkich gospodarstwach uznanych urzędowo za zakażone i wszystkich innych gospodarstwach poddanych odłogowaniu/środkom alternatywnym zgodnie z lit. a), położonych w obrębie ustanowionej strefy ochronnej i strefy nadzoru odnowiono populację rybami pozyskanymi z państw członkowskich, stref lub enklaw o statusie zdrowotnym kategorii I, II lub III odnoszącym się do KHVD;

Państwo członkowskie, strefa lub enklawa, które posiadają status zdrowotny kategorii V w odniesieniu do KHVD, mogą uzyskać status zdrowotny kategorii III w odniesieniu do tej choroby ujętej w wykazie pod następującymi warunkami:

I.4. Szczególne wymogi odnoszące się do uchylenia środków zapobiegania rozprzestrzenianiu się choroby przewidzianych w art. 39 dyrektywy 2006/88/WE w celu uzyskania statusu zdrowotnego kategorii III odnoszącego się do KHVD przez państwa członkowskie, strefy lub enklawy posiadające status zdrowotny kategorii V

Częstotliwość badań stanu zdrowia w kierunku KHVD w odniesieniu do enklaw kategorii I położonych na obszarach kontynentalnych i składających się z przynajmniej jednego gospodarstwa, którego status zdrowotny odnoszący się do KHVD jest zależny od statusu zdrowotnego tej choroby otaczających je wód naturalnych zgodnie z częścią II pkt 2 załącznika V do dyrektywy 2006/88/WE, jest zgodna z liczbą podaną w tabeli 2.C dla wysokiego poziomu ryzyka.

Jeśli do utrzymania statusu zdrowotnego kategorii I wymagany jest nadzór ukierunkowany, jak przewidziano w art. 52 dyrektywy 2006/88/WE, wszystkie gospodarstwa utrzymujące gatunki podatne wymienione w części II załącznika IV do tej dyrektywy, położone w obrębie danego państwa członkowskiego, danej strefy lub enklawy obejmuje się badaniami stanu zdrowia i pobieraniem próbek zgodnie z sekcją III tabela 2.B, uwzględniając poziom zagrożenia dla danego gospodarstwa w odniesieniu do przeniesienia zakażenia KHV.

I.3. Szczególne wymogi do celów utrzymania statusu kategorii I w odniesieniu do KHVD

Enklawa kontynentalna obejmująca pojedyncze gospodarstwo posiadające status zdrowotny kategorii I w odniesieniu do KHVD, której status zdrowotny odnoszący się do KHVD jest niezależny od otaczających ją wód naturalnych zgodnie z częścią II pkt 3 załącznika V do dyrektywy 2006/88/WE i której cofnięto status kategorii I zgodnie z art. 53 ust. 3 wspomnianej dyrektywy, może odzyskać status zdrowotny kategorii I w odniesieniu do KHVD natychmiast po potwierdzeniu przez właściwy organ spełnienia następujących warunków:

I.2.2.2. Wymogi odnoszące się do odzyskania statusu obszaru wolnego od choroby przez enklawy kontynentalne obejmujące pojedyncze gospodarstwo uznane wcześniej za wolne od choroby w odniesieniu do KHVD

Odnowienie populacji przeprowadza się dopiero po dokonaniu we wszystkich gospodarstwach uznanych urzędowo za zakażone KHV opróżnienia ze zwierząt, oczyszczenia, zdezynfekowania i odłogowania zgodnie z pkt I.2.2.1 lit. c);

jedno badanie stanu zdrowia; w gospodarstwach, w odniesieniu do których badania, o których mowa w pkt III.2 dały wyniki ujemne; badania stanu zdrowia prowadzi się co miesiąc w sezonie, w którym temperatura wody prawdopodobnie osiągnie > 15 °C, do czasu zniesienia strefy ochronnej zgodnie z pkt I.2.2.1 lit. c);

w bezpośrednim sąsiedztwie gospodarstwa uznanego urzędowo za zakażone KHV ustanawia się strefę ochronną, która odpowiada całemu obszarowi zlewni gospodarstwa uznanego urzędowo za zakażone KHV; właściwy organ może ograniczyć obszar strefę do części obszaru zlewni, o ile nie stanowi to zagrożenia dla zapobiegania rozprzestrzenianiu się KHVD;

Państwo członkowskie, strefa lub enklawa, które posiadają status zdrowotny kategorii V w odniesieniu do KHVD, mogą uzyskać status zdrowotny kategorii I w odniesieniu do tej choroby, gdy wszystkie gospodarstwa w obrębie tego państwa członkowskiego, tej strefy lub enklawy utrzymujące gatunki podatne wymienione w części II załącznika IV do dyrektywy 2006/88/WE zostały objęte przynajmniej następującym programem zwalczania:

jest gospodarstwem kontynentalnym, którego status zdrowotny odnoszący się do KHVD jest niezależny od odnoszącego się do tej choroby statusu zdrowotnego populacji zwierząt wodnych w otaczających to gospodarstwo wodach naturalnych, zgodnie z częścią II pkt 3 załącznika V do dyrektywy 2006/88/WE;

jeśli w trakcie realizacji czteroletniego programu nadzoru określonego w lit. a) w gospodarstwie objętym tym programem potwierdzono zakażenie KHV i w następstwie cofnięto temu gospodarstwu status zdrowotny kategorii II, gospodarstwo to może natychmiast odzyskać status zdrowotny kategorii II i kontynuować realizację programu nadzoru w celu uzyskania statusu obszaru wolnego od choroby bez wdrażania programu zwalczania, o którym mowa w pkt I.2.2, o ile gospodarstwo to spełnia następujące warunki:

państwo członkowskie, strefa lub enklawa, które posiadają status zdrowotny kategorii III w odniesieniu do KHVD, mogą uzyskać status zdrowotny kategorii I, jeśli wszystkie gospodarstwa utrzymujące gatunki podatne wymienione w części II załącznika IV do dyrektywy 2006/88/WE, położone w obrębie danego państwa członkowskiego, danej strefy lub enklawy, spełniają wymagania dotyczące statusu obszaru wolnego od choroby określone w załączniku V do tej dyrektywy, a wszystkie te gospodarstwa oraz, o ile wymagane jest to przepisem części I pkt 2 akapit drugi wspomnianego załącznika, punkty pobierania próbek u populacji ryb dziko żyjących wybrane zgodnie ze wspomnianą częścią poddano jednemu z następujących programów nadzoru:

I.2. Szczególne wymogi do celów uzyskania statusu obszaru wolnego od choroby (kategoria I) w odniesieniu do KHVD

pobranie podpopulacji przy przeniesieniu ze stawów zimowych do letnich i przetrzymywanie ryb w tej samej jednolitej części wód, do której należy staw letni, do osiągnięcia wymagań dotyczących temperatury; lub

W miarę możliwości próbki pobiera się od ryb utrzymywanych przez dłuższy okres w zakresie temperatur umożliwiającym rozwój choroby, tj. przez dwa do trzech tygodni w temperaturze od 15 do 26 °C. Można jednak zaakceptować następujące podejście:

Jeśli w populacjach ryb dziko żyjących konieczny jest nadzór ukierunkowany zgodnie z częścią I pkt 2 akapit drugi załącznika V do dyrektywy 2006/88/WE, liczbę i rozmieszczenie geograficzne punktów pobierania próbek ustala się tak, by uzyskać rozsądny stopień pokrycia terytorium państwa członkowskiego, strefy lub enklawy. Punkty pobierania próbek powinny być reprezentatywne dla różnych ekosystemów stanowiących siedlisko podatnych populacji dzikich, a mianowicie systemów rzecznych i jezior.

I. Wymogi w zakresie programów nadzoru i zwalczania do celów uzyskania i utrzymania statusu obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do KHVD oraz zapobiegania zakażeniu herpeswirusem koi (KHV)

Systemy nadzoru obowiązujące dla stref i enklaw do celów utrzymania statusu obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do VHS lub IHN, jak wskazano w pkt I.3

Metodami diagnostycznymi do celów uzyskania lub utrzymania statusu obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do VHS lub IHN, zgodnie z zatwierdzonymi metodami i procedurami diagnostycznymi określonymi w załączniku II część 1 pkt I, są:

II.2. Metody diagnostyczne do celów uzyskania i utrzymania status obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do VHS lub IHN

we wszystkich gospodarstwach uznanych urzędowo za zakażone i wszystkich innych gospodarstwach poddanych odłogowaniu/środkom alternatywnym zgodnie z lit. a), położonych w obrębie ustanowionej strefy ochronnej i strefy nadzoru odnowiono populację rybami pozyskanymi z państw członkowskich, stref lub enklaw o statusie zdrowotnym kategorii I, II lub III odnoszącym się do VHS lub IHN;

Państwo członkowskie, strefa lub enklawa, które posiadają status zdrowotny kategorii V w odniesieniu do VHS lub IHN, mogą uzyskać status zdrowotny kategorii III w odniesieniu do tych chorób ujętych w wykazie pod następującymi warunkami:

Gdy określa się częstotliwość badań stanu zdrowia pod kątem VHS lub IHN w enklawach o statusie zdrowotnym kategorii I, które są położone na obszarach kontynentalnych i których status zdrowotny odnoszący się do VHS lub IHN jest zależny od statusu zdrowotnego populacji zwierząt wodnych w otaczających tę enklawę wodach naturalnych zgodnie z częścią II pkt 2 załącznik V do dyrektywy 2006/88/WE, ryzyko przeniesienia zakażenia VHS albo IHN bądź jednocześnie VHS i IHN uznaje się za wysokie.

Jeśli do utrzymania statusu zdrowotnego kategorii I wymagany jest nadzór ukierunkowany, jak przewidziano w art. 52 dyrektywy 2006/88/WE, wszystkie gospodarstwa utrzymujące gatunki podatne wymienione w części II załącznika IV do tej dyrektywy, położone w obrębie danego państwa członkowskiego, danej strefy lub enklawy obejmuje się badaniami stanu zdrowia, a próbki ryb pobiera się zgodnie z sekcją II tabela 1.C, uwzględniając poziom zagrożenia dla danego gospodarstwa w odniesieniu do przeniesienia zakażenia VHS albo IHN bądź jednocześnie VHS i IHN.

I.3. Szczególne wymogi do celów utrzymania statusu obszaru wolnego od choroby (kategoria I) w odniesieniu do VHS lub IHN

Enklawa kontynentalna, która obejmuje pojedyncze gospodarstwo uznane wcześniej za wolne od choroby w odniesieniu do VHS lub IHN, a której status zdrowotny odnoszący się do tych chorób jest niezależny od otaczających ją wód naturalnych zgodnie z częścią II pkt 3 załącznika V do dyrektywy 2006/88/WE i której cofnięto status zdrowotny kategorii I zgodnie z art. 53 ust. 3 wspomnianej dyrektywy, może odzyskać status zdrowotny kategorii I natychmiast po potwierdzeniu przez właściwy organ spełnienia następujących warunków:

I.2.2.2. Wymogi odnoszące się do odzyskania statusu obszaru wolnego od choroby przez enklawy kontynentalne obejmujące pojedyncze gospodarstwo uznane wcześniej za wolne od choroby w odniesieniu do IHN lub VHS

Odnowienie populacji przeprowadza się dopiero po dokonaniu we wszystkich gospodarstwach uznanych urzędowo za zakażone opróżnienia ze zwierząt, oczyszczenia, zdezynfekowania i odłogowania zgodnie z pkt I.2.2.1 lit. c);

we wszystkich gospodarstwach uznanych urzędowo za zakażone VHS albo IHN bądź jednocześnie VHS i IHN oraz wszystkich innych gospodarstwach poddanych odłogowaniu w obrębie ustanowionej strefy ochronnej i strefy nadzoru, o których mowa w lit. c), populację odnawia się rybami pozyskanymi z państw członkowskich, stref lub enklaw o statusie zdrowotnym kategorii I odnoszącym się do VHS lub IHN.

jedno badanie stanu zdrowia: w gospodarstwach, w odniesieniu do których badania, o których mowa w ppkt (i) dały wyniki ujemne; badania stanu zdrowia prowadzi się co miesiąc w okresie, w którym temperatura wody jest niższa niż 14 °C, chyba że stawy rybne i sadze są pokryte lodem, do czasu zniesienia strefy ochronnej zgodnie z pkt I.2.2.1 lit. c);

w strefach śródlądowych: całemu obszarowi zlewni gospodarstwa uznanego urzędowo za zakażone VHS albo IHN bądź jednocześnie VHS i IHN; właściwy organ może ograniczyć obszar strefę do części obszaru zlewni lub obszaru gospodarstwa, o ile nie stanowi to zagrożenia dla zapobiegania rozprzestrzenianiu się VHS lub IHN;

Państwo członkowskie, strefa lub enklawa o statusie zdrowotnym kategorii V odnoszącym się do VHS lub IHN mogą uzyskać status zdrowotny kategorii I w odniesieniu do tych chorób, o ile wszystkie gospodarstwa w obrębie tego państwa członkowskiego, tej strefy lub enklawy utrzymujące gatunki podatne wymienione w części II załącznika IV do dyrektywy 2006/88/WE zostały objęte programem zwalczania zgodnym z lit. a)–e):

jest gospodarstwem kontynentalnym, którego status zdrowotny odnoszący się do VHS lub IHN jest niezależny od odnoszącego się do tych chorób statusu zdrowotnego populacji zwierząt wodnych w otaczających to gospodarstwo wodach naturalnych, zgodnie z częścią II pkt 3 załącznika V do dyrektywy 2006/88/WE;

jeśli w trakcie realizacji programu nadzoru, o którym mowa w lit. a), w gospodarstwie objętym tym programem potwierdzono zakażenie VHS albo IHN bądź jednocześnie VHS i IHN i w następstwie cofnięto temu gospodarstwu status zdrowotny kategorii II, gospodarstwo to może natychmiast odzyskać status zdrowotny kategorii II i kontynuować realizację programu nadzoru w celu uzyskania statusu obszaru wolnego od choroby bez wdrażania programu zwalczania przewidzianego w pkt I.2.2, o ile gospodarstwo to spełnia następujące warunki:

państwo członkowskie, strefa lub enklawa, które w odniesieniu do VHS lub IHN posiadają status zdrowotny kategorii III, o którym mowa w części B załącznika III do dyrektywy 2006/88/WE, mogą uzyskać status zdrowotny kategorii I w odniesieniu do tych chorób ujętych w wykazie pod warunkiem że wszystkie gospodarstwa utrzymujące gatunki podatne wymienione w części II załącznika IV do tej dyrektywy, położone w obrębie danego państwa członkowskiego, danej strefy lub enklawy, spełniają wymagania określone w załączniku V do tej dyrektywy, a wszystkie te gospodarstwa oraz, o ile wymagane jest to przepisem części I pkt 2 akapit drugi załącznika V do tej dyrektywy, punkty pobierania próbek w populacji ryb dziko żyjących wybrane zgodnie ze wspomnianą częścią poddano jednemu z następujących programów nadzoru:

I.2. Szczególne wymogi do celów uzyskania statusu obszaru wolnego od choroby (kategoria I) w odniesieniu do VHS i IHN

jeśli w populacjach ryb dziko żyjących konieczny jest nadzór ukierunkowany zgodnie z częścią I pkt 2 akapit drugi załącznika V do dyrektywy 2006/88/WE, liczbę i rozmieszczenie geograficzne punktów pobierania próbek ustala się tak, by uzyskać rozsądny stopień pokrycia terytorium państwa członkowskiego, strefy lub enklawy. Punkty pobierania próbek powinny być reprezentatywne dla różnych ekosystemów, w których znajdują się populacje ryb dziko żyjących należących do gatunków podatnych;

I. Wymogi w zakresie programów nadzoru i zwalczania do celów uzyskania i utrzymania statusu obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do VHS i IHN oraz środki zapobiegania rozprzestrzenianiu się tych chorób ujętych w wykazie

„strefa kontynentalna” oznacza dokładny obszar geograficzny położony w kontynentalnej części państwa członkowskiego lub państw członkowskich, posiadający jednorodny system hydrologiczny obejmujący części obszaru zlewni od źródeł cieków wodnych do naturalnej lub sztucznej zapory, która zapobiega migracji zwierząt wodnych z położonych niżej odcinków zlewni, całkowity obszar zlewni od źródeł cieków wodnych do ujścia lub więcej niż jeden obszar zlewni wraz z ujściami ze względu na powiązanie epidemiologiczne obszarów zlewni poprzez ujście;

metody pobierania próbek i metody diagnostyczne stosowane do celów badań laboratoryjnych w przypadku podejrzenia obecności oraz w celu potwierdzenia obecności chorób nieegzotycznych wymienionych w części II załącznika IV do dyrektywy 2006/88/WE („choroby ujęte w załączniku”), jak przewidziano w art. 28 lit. a) oraz art. 57 lit. b) wspomnianej dyrektywy;

ZAŁĄCZNIK II

SZCZEGÓŁOWE METODY I PROCEDURY DIAGNOSTYCZNE

I. Wstęp

W niniejszym załączniku określa się szczegółowe procedury metod diagnostycznych stosowane do celów badań laboratoryjnych w ramach programów zwalczania i nadzoru określonych w załączniku I do niniejszej decyzji oraz do celów potwierdzenia lub wykluczenia podejrzenia obecności wymienionych niżej chorób nieegzotycznych ujętych w części II załącznika IV do dyrektywy 2006/88/WE („choroby ujęte w wykazie”) zgodnie z art. 57 lit. b) tej dyrektywy:

1. Wirusowa posocznica krwotoczna (VHS) Część 1 2. Zakaźna martwica układu krwiotwórczego ryb łososiowatych (IHN) Część 1 3. Zakażenie herpeswirusem koi (KHV) Część 2 4. Zakaźna anemia łososia (ISA) Część 3 5. Inwazja wywołana przez Marteilia refringens Część 4 6. Inwazja wywołana przez Bonamia ostreae Część 5 7. Zespół WSS (WSD) Część 6

II. Definicje

Do celów niniejszego załącznika „podłoże transportowe” oznacza podłoże do hodowli linii komórkowych zawierające 10 % surowicę cielęcą oraz 200 iu penicyliny, 200 μg streptomycyny oraz 200 μg kanamycyny na mililitr lub inne antybiotyki o sprawdzonej skuteczności.

CZĘŚĆ 1

SZCZEGÓŁOWE METODY I PROCEDURY DIAGNOSTYCZNE DO CELÓW NADZORU I POTWIERDZENIA W ODNIESIENIU DO IHN I VHS

I. Metody i procedury diagnostyczne do celów nadzoru i potwierdzenia w odniesieniu do IHN i VHS

Gdy do celów uzyskania lub utrzymania statusu obszaru wolnego od choroby w odniesieniu do IHN lub VHS, jak określono w załączniku I część 1 sekcja I, pobiera się próbki i prowadzi badania laboratoryjne przy zastosowaniu metod diagnostycznych określonych w części 1 pkt II.1 i II.2 wspomnianego załącznika, stosuje się pkt I.1–I.6 określone poniżej.

I.1. Przygotowanie i wysyłka próbek ryb

I.1.1. Tkanki do badania wirusologicznego przy wykorzystaniu linii komórkowej

Przed wysyłką albo przekazaniem próbek laboratoryjnych od ryby pobiera się za pomocą sterylnych narzędzi sekcyjnych fragmenty narządów przeznaczone do badania i umieszcza w sterylnych probówkach plastikowych zawierających podłoże transportowe.

Ilość materiału biologicznego ryb nadającego się do badania wirusologicznego przy wykorzystaniu linii komórkowej oraz RT-qPCR zależy od wielkości ryb. Materiałem pobieranym do próbki powinny być zatem: wylęg w całości (długość ciała < 4 cm), narządy wewnętrzne włącznie z nerką (4 cm < długość ciała < 6 cm), a w przypadku ryb większych – nerka, śledziona, serce lub mózg, a także płyn jajnikowy tarlaków w czasie tarła.

Płyn jajnikowy lub mlecz lub fragmenty narządów pochodzące od maksymalnie 10 ryb mogą zostać zebrane w jedną sterylną probówkę zawierającą 4 ml podłoża transportowego i stanowić jedną próbkę zbiorczą. Tkanki w każdej próbce powinny ważyć przynajmniej 0,5 g.

Badanie wirusologiczne przy wykorzystaniu linii komórkowej należy rozpocząć jak najwcześniej, ale nie później niż 48 godzin po pobraniu próbek. W wyjątkowych przypadkach badanie wirusologiczne można rozpocząć nie później niż 72 godziny po pobraniu materiału, o ile materiał poddawany badaniu jest chroniony podłożem transportowym oraz o ile możliwe jest spełnienie wymogów dotyczących temperatury podczas transportu.

I.1.2. Próbki do analizy przy użyciu odwrotnej transkrypcji z łańcuchową reakcją polimerazy (RT-PCR lub RT-qPCR)

Próbki pobiera się od ryb zgodnie z procedurami opisanymi w pkt I.1.1 przy użyciu sterylnego narzędzia i przenosi do sterylnej probówki plastikowej zawierającej podłoże transportowe. Tkanki z 10 ryb mogą zostać zebrane do jednej probówki i stanowią jedną próbkę zbiorczą. W przypadku małej ilości inokulum można jednak użyć tkanek pochodzących od maksymalnie pięciu ryb. Alternatywną metodą jest łączenie próbek w odczynnikach do stabilizacji RNA, takich jak 0,2 g tkanek/ml odczynnika zgodnie z zaleceniami producenta, przy czym każdą rybę należy poddać odrębnej obróbce i nie łączyć w próbkach ze względu na małą ilość materiału wykorzystywanego do ekstrakcji.

Do laboratorium wysyłać można również całe ryby.

I.2. Wysyłka próbek ryb

Probówki zawierające tkanki ryb w podłożu transportowym do celów analizy przy wykorzystaniu linii komórkowej lub RT-PCR/RT-qPCR umieszcza się w izolowanych pojemnikach, takich jak grubościenne pudła polistyrenowe, wraz z taką ilością lodu lub alternatywnego chłodziwa o równoważnym efekcie chłodzącym, która zapewnia chłodzenie próbek podczas transportu do laboratorium. Należy jednak unikać zamrażania próbek. Temperatura próbki podczas tranzytu nie może przekroczyć 10 °C, a w chwili przyjęcia w pudle transportowym musi być nadal lód bądź też przynajmniej jeden z bloków mrożących musi być zamrożony w części lub w całości.

Do laboratorium przesyłać można całe ryby, jeśli możliwe jest spełnienie wymogów dotyczących temperatury, o których mowa w akapicie pierwszym. Całą rybę należy owinąć w papier o zdolnościach absorpcyjnych, a przy ostatecznej wysyłce należy stosować torbę plastikową. Wysyłać można również ryby żywe.

I.3. Pobieranie dodatkowego materiału diagnostycznego

Jeśli zatwierdzi to laboratorium diagnostyczne, można również pobierać inne tkanki ryb i przygotowywać je do dodatkowych badań.

I.4. Przygotowanie próbek do badania przy wykorzystaniu linii komórkowej i RT-qPCR

I.4.1. Zamrażanie w wyjątkowych przypadkach

W razie pojawienia się trudności natury praktycznej, które uniemożliwiają obróbkę próbek w ciągu 48 godzin od pobrania tkanek ryb, dopuszczalne może być zamrożenie próbek tkanek w podłożu transportowym w temperaturze – 20 °C lub niższej i przeprowadzenie badania wirusologicznego w ciągu 14 dni. Przed badaniem tkanki ryb można zamrozić i odmrozić tylko raz. Zachowuje się dokumentację zawierającą szczegółowe powody każdego przypadku zamrażania próbek tkanek ryb.

I.4.2. Homogenizacja narządów

W laboratorium znajdujące się w probówce tkanki ryb poddaje się pełnej homogenizacji przy wykorzystaniu stomachera, malaksera lub moździerza i tłuczka ze sterylnym piaskiem, a następnie umieszcza w oryginalnym podłożu transportowym.

Próbkę składającą się z całych ryb o długości poniżej 4 cm rozdrabnia się przy użyciu sterylnych nożyczek lub sterylnego skalpela po uprzednim usunięciu części ciała znajdującej się za otworem jelitowym. Jeżeli próbkę stanowi cała ryba o długości ciała między 4 a 6 cm, pobrać należy narządy wewnętrzne, w tym nerkę. Jeśli próbkę stanowi cała ryba o długości ciała ponad 6 cm, próbki tkanek pobiera się, jak określono w pkt I.1. Próbki tkanek rozdrabnia się sterylnymi nożyczkami lub sterylnym skalpelem i homogenizuje zgodnie z opisem w akapicie pierwszym, a następnie umieszcza w podłożu transportowym.

W laboratorium ostateczny stosunek materiału biologicznego do podłoża transportowego koryguje się tak, by odpowiadał 1:10.

I.4.3. Wirowanie homogenatu

Homogenat poddaje się odwirowaniu z prędkością 2 000 do 4 000 × g przez 15 minut w wirówce chłodzącej w temperaturze 2 – 5 °C, a pobrany supernatant można poddać działaniu antybiotyków przez cztery godziny w temperaturze 15 °C lub przez noc w temperaturze 4 – 8 °C. Jeśli próbkę przesłano w podłożu transportowym, można zrezygnować z poddania supernatantu działaniu antybiotyków.

W razie pojawienia się trudności natury praktycznej, takich jak poważne uszkodzenie inkubatora lub problemy z liniami komórkowymi, które to trudności uniemożliwiają inokulację komórek w ciągu 48 godzin od pobrania próbek tkanek ryb, supernatant można zamrozić do temperatury – 80 °C i przeprowadzić badanie wirusologiczne w ciągu 14 dni.

Jeśli pobrany supernatant przechowywano w temperaturze – 80 °C przez 48 godzin od pobrania próbki, można ponownie użyć go jedynie jednokrotnie do badania wirusologicznego.

Przed inokulacją komórek supernatant miesza się w równych częściach z odpowiednio rozcieńczonymi łączonymi surowicami odpornościowymi przeciwko rodzimym serotypom wirusa zakaźnej martwicy trzustki (IPN) i inkubuje go z tymże przez maksymalnie jedną godzinę w temperaturze 15 °C lub przez maksymalnie 18 godzin w temperaturze 4 °C. Miano surowicy odpornościowej powinno wynosić przynajmniej 1/2 000 w teście neutralizacji przy użyciu płytek (50 %).

Poddanie całego inokulum działaniu surowicy odpornościowej przeciwko wirusowi IPN ma zapobiec powstaniu w inokulowanych liniach komórkowych efektu cytopatycznego (CPE) spowodowanemu wirusem IPN. Ograniczy to czas trwania badań wirusologicznych oraz liczbę przypadków, w których powstanie efektu cytopatycznego (CPE) prowadziłoby do potencjalnego wskazania obecności VHSV lub IHNV.

Jeśli próbki pochodzą z jednostek produkcyjnych uznanych za wolne od choroby w odniesieniu do IPN, można zaniechać poddania inokulum działaniu surowicy odpornościowej przeciwko wirusowi IPN.

I.4.4. Przygotowanie próbek do programów nadzoru opartych na RT-PCR i RT-qPCR

Jeśli próbki pobrano na podłoże transportowe, przeprowadza się procedury określone w pkt I.4.2. i I.4.3. Po odwirowaniu supernatant pobiera się i ekstrahuje RNA. Jeśli bezpośrednio po odwirowaniu nie mają być prowadzone dalsze badania, próbki zamraża się natychmiast do temperatury – 20 °C lub niższej.

Do celów analizy tkanek ryb zachowanych w odczynniku do stabilizacji RNA należy przeprowadzić dalsze prace z zachowaniem następujących terminów w odniesieniu do próbek przechowywanych w różnych temperaturach:

próbki przechowywane w temperaturze 37 °C: jeden dzień;

próbki przechowywane w temperaturze 25 °C: jeden tydzień;

próbki przechowywane w temperaturze 4 °C: jeden miesiąc;

próbki przechowywane w temperaturze – 20 °C: brak ograniczenia czasowego

Próbki zbiorcze w odczynniku do stabilizacji RNA traktuje się tak samo jak próbki pojedyncze w odczynniku do stabilizacji RNA. Liczba próbek w próbkach zbiorczych w odczynniku do stabilizacji RNA nie może przekraczać liczby zalecanej przez producenta przy ekstrakcji za pomocą zestawów RNA, takich jak RNeasy Mini kits (Qiagen) lub podobnych. W razie łączenia większych próbek zestawy ekstrakcji lub metody muszą odzwierciedlać takie łączenie.

Próbek umieszczonych w odczynnikach do stabilizacji RNA nie wolno wykorzystywać do linii komórkowych.

I.4.5. Łączenie próbek do celów RT-qPCR

Ponieważ istniejące protokoły RT-qPCR mają co najmniej taką samą wrażliwość, co metody z zastosowaniem linii komórkowych, dopuszczalne może być wykorzystanie do PCR supernatantu z homogenizowanego materiału biologicznego ryb składającego się z łączonych narządów pochodzących od maksymalnie 10 ryb w podłożu do hodowli linii komórkowych. Jednak ze względu na to, że do PCR używa się znaczne mniejszego inokulum niż do linii komórkowych, wszystkie tkanki ryb należy poddać starannej homogenizacji przed pobraniem materiału do ekstrakcji.

Tę samą zasadę stosuje się do próbek umieszczonych w odczynnikach do stabilizacji RNA. Jednakże w tym wypadku trudno jest często zebrać reprezentatywny materiał pochodzący od maksymalnie 10 ryb w jedną probówkę i dlatego liczbę ryb na jedną próbkę łączoną należy ograniczyć do 2–5.

I.5. Badanie wirusologiczne przy wykorzystaniu linii komórkowej

I.5.1. Linie komórkowe i podłoża

Linia komórkowa pochodząca z narybku bassa niebieskiego (BF-2) lub linia komórkowa pochodząca z gonad pstrąga tęczowego (RTG-2) oraz linia komórkowa pochodząca z komórek epitelialnych karpia (EPC) albo linia komórkowa pochodząca z komórek epitelialnych ciernika promienistego utrzymywana jest na odpowiednim podłożu w temperaturze 20 do 30 °C, tj. podłożu Eagle′a (podłoże MEM) lub jego modyfikacjach, z dodatkiem płodowej surowicy bydlęcej (10 %) oraz antybiotyków w stężeniach standardowych.

W razie hodowli w zamkniętych fiolkach podłoże buforuje się diwęglanem. Podłoże wykorzystywane do hodowli komórek w jednostkach otwartych można buforować trihydroksymetyloaminometanem-HCl (Tris-HCl) (23 mM) oraz diwęglanem sodu (6 mM). Wartość pH musi wynosić 7,6 ± 0,2.

Linie komórkowe stosowane do inokulacji materiałem biologicznym ryb muszą być młode, zwykle, w miarę możliwości, jednodniowe, jednowarstwowe; można zaakceptować jednak wiek mieszczący się w zakresie 4 do 48 godzin. Komórki muszą aktywnie rosnąć w momencie inokulacji.

I.5.2. Inokulacja linii komórkowych

Zawiesinę z narządów poddanych działaniu antybiotyków inokuluje się do linii komórkowych w dwóch rozcieńczeniach, tj. w rozcieńczeniu pierwszym i w rozcieńczeniu 1:10 rozcieńczenia pierwszego, co prowadzi do końcowych rozcieńczeń materiału biologicznego w podłożu do hodowli linii komórkowych wynoszących odpowiednio 1:100 i 1:1 000, co ma na celu zapobieżenie interferencji homologicznej. Przynajmniej dwie linie komórkowe należy inokulować, jak opisano w pkt I.5.1. Stosunek wielkości inokulum do objętości podłoża do hodowli linii komórkowych powinien wynosić około 1:10.

Do każdego rozcieńczenia każdej linii komórkowej wykorzystuje się obszar komórek nie mniejszy niż 2 cm2, odpowiadający jednemu dołkowi na 24-dołkowej płytce do linii komórkowej. W miarę możliwości należy stosować płytki do linii komórkowej.

I.5.3. Inkubacja linii komórkowych

Inokulowane linie komórkowe inkubuje się w temperaturze 15 °C przez siedem do dziesięciu dni. Jeśli barwa podłoża do hodowli linii komórkowych zmieni się z czerwonej na żółtą, wskazując średnie zakwaszenie, należy dokonać korekty pH przy wykorzystaniu sterylnego roztworu diwęglanu lub równoważnych substancji, aby zapewnić podatność komórek na zakażenie wirusem.

Przynajmniej co sześć miesięcy lub w razie podejrzenia zmniejszenia wrażliwości komórek na zakażenie przeprowadza się mianowanie zarchiwizowanych izolatów VHSV i IHNV w celu sprawdzenia wrażliwości linii komórkowych na zakażenie. W miarę możliwości stosuje się procedurę określoną w sekcji III.

I.5.4. Mikroskopia

Inokulowane linie komórkowe poddane się regularnym kontrolom na obecność CPE nie rzadziej niż trzy razy w tygodniu w powiększeniu 40 do 150 ×. Jeśli stwierdzono ewidentny przypadek CPE, wszczynane są natychmiast procedury identyfikacji wirusa zgodnie z pkt I.6.

I.5.5. Pasażowanie

Jeśli w ciągu 7–10 dni po pierwszej inkubacji nie wystąpił efekt cytopatyczny, dokonuje się pasażowania do świeżych linii komórkowych przy wykorzystaniu podobnego obszaru komórek, co w przypadku pierwszej izolacji.

Supernatant ze wszystkich linii lub dołków stanowiących pierwszą izolację w linii komórkowej łączy się zgodnie z linią komórkową 7 – 10 dni po inokulacji. Połączone próbki inokuluje się następnie do homologicznych linii komórkowych, nierozcieńczonych i rozcieńczonych 1:10 (co prowadzi do rozcieńczeń końcowych supernatantu wynoszących odpowiednio 1:10 i 1:100), jak opisano w pkt I.5.2. Alternatywnie supernatant w ilości 10 % podłoża stanowiącego pierwszą izolację inokuluje się bezpośrednio do dołka ze świeżą linią komórkową (tj. pasażowanie komórek między dołkami). Przed inokulacją rozcieńczenia można inkubować z surowicą przeciwko wirusowi IPN w odpowiednim rozcieńczeniu, jak opisano w pkt I.4.3.

Inokulowane kultury inkubuje się następnie przez 7 do 10 dni w temperaturze 15 °C i kontroluje zgodnie z pkt I.5.4.

Jeśli w ciągu pierwszych trzech dni inkubacji wystąpi efekt toksyczny CPE, pasażowanie przeprowadza się na tym etapie, ale komórki inkubowane są następnie przez siedem dni i pasażowane ponownie oraz poddawane dalszej siedmiodniowej inkubacji. Jeśli efekt toksyczny CPE wystąpi po upływie trzech dni, komórki pasażuje się jednokrotnie i inkubuje tak długo, by łączny okres od dokonania pierwszej inkubacji wyniósł 14 dni. W ostatnich siedmiu dniach inkubacji nie może być żadnych dowodów toksyczności.

Jeśli mimo zastosowania antybiotyków wystąpi zanieczyszczenie bakteryjne, pasażowanie poprzedza się następnie wirowaniem z prędkością 2 000 do 4 000 × g przez 15 do 30 minut w temperaturze 2 do 5 °C lub filtrowaniem supernatantu przez filtr 0,45 μm (membranę o niskim współczynniku wiązalności białek). Ponadto pasażowanie powinno być prowadzone zgodnie z procedurami opisanymi dla efektu toksycznego CPE w akapicie czwartym.

Jeśli CPE nie występuje, można uznać, że badanie dało wynik ujemny.

I.6. Identyfikacja wirusa

Jeśli w linii komórkowej stwierdzono dowody na wystąpienie CPE, podłoże (supernatant) pobiera się i bada za pomocą przynajmniej jednej z następujących technik: test immunoenzymatyczny (ELISA), test immunofluorescencji (IF), test neutralizacji (SNT), RT-PCR lub RT-qPCR. Jeśli badania te nie pozwoliły na definitywne zidentyfikowanie wirusa w ciągu tygodnia, supernatant przekazuje się w celu natychmiastowej identyfikacji krajowemu laboratorium referencyjnemu lub laboratorium referencyjnemu UE ds. chorób ryb, o którym mowa w załączniku VI do dyrektywy 2006/88/WE.

I.6.1. ELISA

W celu identyfikacji izolatu wirusa przeprowadza się test ELISA – test podwójnego wiązania. Mikropłytki powinny być opłaszczone warstwą (50 μl/dołek (0,9 pg)) oczyszczonych immunoglobulin o sprawdzonej jakości wiążących białko A, uzyskanych z surowicy odpornościowej królika przeciwko IHNV lub VSHV, rozcieńczonych w buforze węglanowym (pH 9,6) zawierającym 15mM azydku sodu i inkubowane przez od 18 godzin do 2 tygodni w temperaturze 4 °C.

Każdą próbkę zawierającą 1 % Triton X-100 oraz kontrole dodatnie rozcieńcza się na płytce do rozcieńczania roztworem buforowym (tj. roztworem chlorku sodu buforowany fosforanami (PBS)-T-BSA, 1 % BSA)) w 4-krotnym rozcieńczeniu: nierozcieńczone, 1:4, 1:16, 1:64. Płytki do testu ELISA przemywa się w PBS zawierającym 0,05 % Tween-20 (PBS-T), a 50 μl każdego rozcieńczenia przenosi się z płytki do rozcieńczania na przemytą i opłaszczoną płytkę do ELISA.

Płytki ELISA inkubuje się następnie przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Następnie płytki przemywa się i inkubuje przez 30 minut w temperaturze 37 °C ze specyficznymi przeciwciałami monoklonalnymi (tj. do identyfikacji VHSV: MAb IP5B11, a identyfikacji IHNV: Hyb 136-3). 50μl króliczych przeciwciał anty-mysich skoniugowanych z peroksydazą chrzanową (HRP) rozcieńczonych 1:1 000 w PBS-T-BSA przenosi się na płytkę do testu ELISA.

Następnie, po ponownym przepłukaniu, wywołuje się reakcje poprzez dodanie 50 μl/dołek orto-fenylenodiaminy (OPD). Płytki do testu ELISA inkubuje się przez 20 minut w temperaturze pokojowej bez dostępu światła, a reakcję zatrzymuje się, dodając 100 μl/dołek 0,5 M H2SO4.

Absorbancję obserwuje się w czytniku do testów ELISA przy długości fali 492 i 620 nm. Próbki określa się jako dodatnie lub ujemne po porównaniu wyników testów z wartościami absorbancji dla kontroli dodatnich i ujemnych. Co do zasady próbki o absorbancji łącznej (A) < 0,5 dla materiału nierozcieńczonego uznaje się za ujemne, próbki o wartościach A między 0,5 a 1,0 uznaje się za podejrzane, zaś próbki o wartościach A > 1,0 uznaje się za dodatnie.

Zamiast wersji testu ELISA, o których mowa w niniejszym punkcie, można stosować inne jego wersje o sprawdzonej podobnej skuteczności.

I.6.2. Test immunofluorescencji (IF)

Identyfikacji ujętych w wykazie patogenów VHSV i IHNV dokonuje się poprzez zakażenie komórek na płytkach 96-dołkowych „Black”, konwencjonalnych płytkach 24-dołkowych lub szkiełkach nakrywkowych do płytek 24-dołkowych. Jeśli zidentyfikowano IHNV lub VHSV poprzez zakażenie komórek na szkiełkach nakrywkowych, stosuje się następujący protokół:

a) na szkiełkach nakrywkowych dokonuje się posiewu komórek prowadzącego do pokrycia powierzchni hodowlanej między 60 % a 90 % po 24 godzinach kultywacji. W miarę możliwości do tego celu należy wykorzystać linię komórkową EPC ze względu na jej dużą przyczepność do powierzchni szklanych, ale można również wykorzystywać inne linie komórkowe, takie jak BF-2, RTG-2 lub FHM. Dokonuje się podwójnej inokulacji 150 μl supernatantu linii komórkowej w dwóch różnych rozcieńczeniach (1:10 i 1:1 000) na jednodniowe jednowarstwowe hodowle komórek, a następnie poddaje inkubacji w temperaturze 15 °C przez 24 godziny;

b) następnie usuwa się podłoże do hodowli linii komórkowych oraz zakażone jednowarstwowe hodowle komórek utrwalone za pomocą 0,5 ml lodowatego wodnego roztworu acetonu (80 % vol:vol). Utrwalania dokonuje się w okapie wyciągowym przez 15 minut w temperaturze pokojowej, po czym usuwa się roztwór acetonu i osusza szkiełka nakrywkowe powietrzem przez przynajmniej 30 minut. Na tym etapie płytki należy poddać natychmiastowej obróbce albo przechowaniu w temperaturze – 20 °C do późniejszego wykorzystania;

c) specyficzne przeciwciała monoklonalne (tj. MAb IP5B11 do identyfikacji VHSV oraz Hyb 136-3i do identyfikacji IHNV) rozcieńcza się w 0,01 M PBST, pH 7,2 w rozcieńczeniu zalecanym przez dostawcę przeciwciał monoklonalnych; do utrwalonej jednowarstwowej hodowli komórek dodaje się 50 do 100 μl/dołek, a płytki inkubuje w komorze wilgotnej przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C;

d) szkiełka nakrywkowe przemywa się łagodnie trzy razy PBS zawierającym 0,05 % Tween-20 (PBS-T), a po ostatnim przemyciu usuwa się w całości bufor. Komórki inkubuje się następnie przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C z przeciwciałami przeciwko mysiej immunoglobulinie (stosowanymi jako przeciwciało pierwszorzędowe) skoniugowanymi z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) lub tetrametylorodamino-5-(oraz-6-)izotiocyjanianem (TRITC) rozcieńczonymi zgodnie ze wskazówkami dostawcy, przemywa ponownie w PBS-T i suszy. Zabarwione kultury osadza się na szklanych szkiełkach przy wykorzystaniu roztworu gliceryny w soli fizjologicznej i bada w świetle ultrafioletowym (UV). Należy korzystać z okularów 10 × lub 12 × i soczewek obiektywów 25 × lub 40 × o aperturze numerycznej, odpowiednio, > 0,7 i > 1,3.

Alternatywnie można korzystać z innych technik IF o sprawdzonej podobnej skuteczności w odniesieniu do linii komórkowych, utrwalania i przeciwciał o jakości referencyjnej.

I.6.3. Neutralizacja

Komórki wytrąca się z pobranego supernatantu za pomocą wirowania (2 000 to 4 000 × g) lub filtracji membranowej (0,45 μm) przy wykorzystaniu membrany o niskim współczynniku wiązalności białek, a supernatant rozcieńcza 1:100 i 1:10 000 w podłożu do hodowli linii komórkowych.

Supernatant pochodzący przynajmniej z dwóch rozcieńczeń miesza się i inkubuje w równych częściach przez 60 minut przy temperaturze 15 °C osobno z następującymi odczynnikami:

a) surowica zawierająca swoiste dla grupy przeciwciała przeciwko VHSV w rozcieńczeniu 1:50 (vol:vol);

b) surowica zawierająca swoiste dla grupy przeciwciała przeciwko IHNV w rozcieńczeniu 1:50 (vol:vol);

c) łączenie surowic odpornościowych przeciwko rodzimym serotypom IPNV w rozcieńczeniu 1:50 (vol:vol);

d) samo podłoże (kontrola dodatnia).

Przynajmniej dwie linie komórkowe z każdej mieszaniny supernatantu wirusa z surowicą inokuluje się po 50 μl, a następnie inkubuje w temperaturze 15 °C. Należy sprawdzić występowanie CPE, jak opisano w pkt I.5.4.

Szczepy i izolaty VHSV, które nie reagują na testy neutralizacji, identyfikuje się za pomocą IF lub ELISA.

Alternatywnie można wykorzystać inne testy neutralizacji o sprawdzonej podobnej skuteczności.

I.6.4. RT-PCR/RT-qPCR

I.6.4.1. Przygotowanie RNA wirusa

Wszelkie prace przy izolacji RNA wykonuje się na lodzie przy użyciu rękawiczek.

Ekstrakcji RNA dokonuje się, stosując metodę fenolowo-chloroformową lub kolumienkową zgodnie ze wskazówkami producenta. Można stosować dostępne komercyjnie zestawy do ekstrakcji RNA, dzięki którym uzyska się RNA wysokiej jakości nadające się do wykorzystania w ramach protokołów RT-PCR opisanych w poniższych punktach.

RNA zawiesza się ponownie w wodzie wolnej od RNaz (tj. wodzie poddanej działaniu 0,1 % dietylodiwęglanu) lub odpowiedniego bufora elucyjnego.

I.6.4.2. RT-PCR

Do wykrywania IHNV stosuje się następujące startery:

starter sensowny 5′-AGA-GAT-CCC-TAC-ACC-AGA-GAC-3′;

starter antysensowny 5′-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTG-CAA-3′.

Stosuje się następujące cykle (jednoetapowy RT-PCR): 1 cykl: 50 °C przez 30 minut; 1 cykl: 95 °C przez 2 minut; 30 cykli: 95 °C przez 30 sekund, 50 °C przez 30 sekund, 72 °C przez 60 sekund; 1 cykl: 72 °C przez 7 minut i chłodzenie w płynie w temperaturze 4 °C.

Do wykrywania VHSV stosuje się następujące startery:

VN For 5′-ATG-GAA-GGA-GGA-ATT-CGT-GAA-GCG-3′;

VN Rev 5′-GCG-GTG-AAG-TGC-TGC-AGT-TCC-C-3′.

Stosuje się następujące cykle (jednoetapowy RT-PCR): 50 °C przez 30 minut, 95 °C przez 15 minut, 35 cykli w temperaturze 94 °C przez 30 sekund, 55 °C przez 30 sekund oraz 68 °C przez 60 sekund. Następnie reakcję utrzymuje się w temperaturze 68 °C przez 7 minut.

Ilość i swoistość reakcji RT-PCR ewaluuje się za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (1,5 %) z bromkiem etydyny i obserwuje przy wykorzystaniu naświetlenia światłem ultrafioletowym. W przypadku IHNV można zaobserwować amplikon PCR 693 bp. W przypadku VHSV wielkość powinna wynosić 505 bp.

Wyniki PCR mogą być różne w zależności od warunków przeprowadzania testu – optymalizacji wymagać mogą protokoły termiczne w zależności od wykorzystywanego termocyklera. Ponadto wystąpić mogą wyniki fałszywie dodatnie ze względu na nieprawidłowe przyłączanie starterów lub zanieczyszczenia w laboratorium. Dlatego w celu uniknięcia wszelkich wątpliwości należy uwzględnić odpowiednie kontrole dodatnie i ujemne oraz sekwencje amplikonów. W przypadku starterów VHSV należy zachować szczególną staranność przy stosowaniu komórek BF-2, ponieważ startery te mogą reagować z linią komórkową DNA/RNA, dając wyniki fałszywie dodatnie o podobnym rozmiarze. Przy badaniu supernatantu z komórek BF-2 sekwencjonuje się wszystkie amplifikowane fragmenty PCR.

I.6.4.3. RT-qPCR w odniesieniu do VHSV

W przypadku VHSV amplifikację przeprowadza się przy wykorzystaniu następujących starterów i następującej sondy:

starter sensowny: 5′-AAA-CTC-GCA-GGA-TGT-GTG-CGT-CC-3′;

starter antysensowny: 5′-TCT-GCG-ATC-TCA-GTC-AGG-ATG-AA-3′;

i sonda: 5′-FAM-TAG-AGG-GCC-TTG-GTG-ATC-TTC-TG-BHQ1.

Jednoetapowy RT-qPCR:

Kontrole negatywne i kontrole dodatnie należy uwzględnić przy każdej analizie. Warunki reakcji: 50 °C przez 30 minut, 95 °C przez 15 minut, 40 cykli w temperaturze 94 °C przez 15 sekund, 60 °C przez 40 sekund, 72 °C przez 20 sekund; w stosownych przypadkach dokonuje się korekty. Alternatywnie można wykorzystać inne wersje RT-PCR lub RT-qPCR o sprawdzonej podobnej skuteczności.

I.6.4.4. RT-qPCR w odniesieniu do IHNV

W przypadku IHNV amplifikację przeprowadza się przy wykorzystaniu następujących starterów i następującej sondy:

starter sensowny: 5′- AGA-GCC-AAG-GCA-CTG-TGC-G-3′;

starter antysensowny: 5′- TTCTTTGCGGCTTGGTTGA – 3′;

i sonda: 5′ 6FAM-TGAGACTGAGCGGGACA-NFQ/MGB.

Dwuetapowy RT-qPCR:

Ponieważ przedmiotowy test opiera się na amplifikacji dwuetapowej, należy zachować wyjątkową staranność, obchodząc się z probówkami przy przejściu z jednej reakcji do drugiej, aby uniknąć zanieczyszczenia.

Warunki reakcji (po etapie RT): 50 °C przez 2 minut, 95 °C przez 10 minut, a następnie 40 cykli w temperaturze 95 °C przez 15 sekund, 60 °C przez 1 minutę; w stosownych przypadkach dokonuje się korekty.

Alternatywnie można wykorzystać inne wersje RT-PCR lub RT-qPCR o sprawdzonej podobnej skuteczności.

II. Szczegółowe procedury i metody diagnostyczne do celów potwierdzenia lub wykluczenia podejrzenia obecności VHS albo IHN bądź jednocześnie VHS i IHN w podejrzanych ogniskach choroby

Jeśli konieczne są badania laboratoryjne w celu potwierdzenia lub wykluczenia obecności IHN lub VHS zgodnie z art. 57 lit. b) dyrektywy 2006/88/WE przy zastosowaniu metod diagnostycznych określonych w załączniku I część 1 pkt II.3, stosuje się następujące szczegółowe metody i procedury diagnostyczne:

a) konwencjonalna izolacja wirusa z następującą po niej seroneutralizacją oraz immunochemiczną lub molekularną identyfikacją wirusa;

b) wykrywanie wirusa przy wykorzystaniu RT-PCR lub RT-qPCR;

c) inne techniki diagnostyczne, takie jak IFAT, ELISA, RT-PCR, IHC.

II.1. Konwencjonalna izolacja wirusa z następującą po niej identyfikacją wirusa

II.1.1. Wybór próbek

Do badania wybrać należy przynajmniej 10 ryb wykazujących typowe objawy IHN lub VHS

II.1.2. Przygotowanie i wysyłka próbek ryb

Przygotowanie i wysyłka do celów konwencjonalnej izolacji wirusa powinny być zgodne z metodami i procedurami określonymi w pkt I.2.

II.1.3. Pobieranie dodatkowego materiału diagnostycznego

Pobieranie dodatkowego materiału do celów konwencjonalnej izolacji wirusa powinno być zgodne z metodami i procedurami określonymi w pkt I.3.

II.1.4. Przygotowanie próbek do badania przy wykorzystaniu linii komórkowej

Przygotowanie próbek do badania przy wykorzystaniu linii komórkowej do celów konwencjonalnej izolacji wirusa powinno być zgodne z metodami i procedurami określonymi w pkt I.4.

II.1.5. Badanie wirusologiczne przy wykorzystaniu linii komórkowej

Badanie wirusologiczne do celów konwencjonalnej izolacji wirusa powinno być zgodne z metodami i procedurami określonymi w pkt I.5.

II.1.6. Identyfikacja wirusa

Identyfikacja wirusa do celów konwencjonalnej izolacji wirusa powinna być zgodna z metodami i procedurami określonymi w pkt I.6.

II.2. Wykrywanie wirusa przy wykorzystaniu RT-qPCR

II.2.1. Wybór próbek

Wybór próbek do celów wykrywania wirusa przy wykorzystaniu RT-qPCR powinien być zgodny z metodami i procedurami określonymi w pkt I.1.2.

II.2.2. Przygotowanie i wysyłka próbek ryb

Przygotowanie i wysyłka do celów wykrywania wirusa przy wykorzystaniu RT-qPCR powinny być zgodne z metodami i procedurami określonymi w pkt I.2.

II.2.3. Pobieranie dodatkowego materiału diagnostycznego

Pobieranie dodatkowego materiału diagnostycznego do celów wykrywania wirusa przy wykorzystaniu RT-qPCR powinno być zgodne z metodami i procedurami określonymi w pkt I.3.

II.2.4. Przygotowanie próbek do RT-qPCR

Przygotowanie próbek do celów wykrywania wirusa przy wykorzystaniu RT-qPCR powinny być zgodne z metodami i procedurami określonymi w pkt I.6.4.1.

II.2.5. RT-qPCR

Wykrywanie wirusa przy wykorzystaniu RT-qPCR powinno być zgodne z metodami i procedurami określonymi w pkt I.6.4.1, I.6.4.3 i I.6.4.4.

II.3. Inne metody diagnostyczne

Supernatant przygotowany zgodnie z opisem zawartym w pkt I.4.3 można poddać testowi ELISA zgodnie z pkt I.6.1, testowi immunofluorescencji pośredniej (IFAT) zgodnie z pkt I.6.2 lub RT-PCR zgodnie z pkt I.6.4. Materiał biologiczny można poddać badaniom przeprowadzonym przy wykorzystaniu innych metod diagnostycznych, takich jak IFAT na tkankach mrożonych, immunohistochemia na materiale biologicznym utrwalonym w formalinie. Te szybkie techniki uzupełnia się badaniami wirusologicznymi zgodnie z pkt II lit. a) lub b) w ciągu 48 godzin od pobrania próbek, jeśli:

a) uzyskano wynik ujemny; albo

b) uzyskano wynik dodatni na materiale stanowiącym pierwszy przypadek IHN lub VHS.

III. Procedura mianowania w celu sprawdzenia wrażliwości linii komórkowych na zakażenie

Przy przeprowadzaniu mianowania w celu sprawdzenia wrażliwości linii komórkowych na zakażenie, o czym mowa w pkt I.5.3, stosuje się procedury określone poniżej.

Stosuje się przynajmniej dwa izolaty VHSV lub jeden izolat IHNV. Izolaty powinny reprezentować główne grupy wirusów w Unii Europejskiej, tj. w przypadku VHSV – jeden izolat patogenny dla pstrąga tęczowego z wód słodkich i jeden izolat patogenny dla turbota z wód słonych, zaś w przypadku IHNV – jeden szczep patogenny dla pstrąga tęczowego z Unii Europejskiej. Należy stosować dobrze zdefiniowane izolaty z państw członkowskich. Serie wirusów w liniach komórkowych o niskim pasażu rozmnaża się w butelkach z użyciem komórek BF-2 lub RTG-2 w przypadku VHSV oraz komórek EPC lub FHM w przypadku IHNV. Stosuje się podłoże do hodowli linii komórkowych zawierające przynajmniej 10 % surowicy. Do inokulacji stosuje się niskie MOI (< 1).

Po osiągnięciu całkowitego efektu cytopatycznego wirus zbierany jest poprzez odwirowanie supernatantu linii komórkowej z prędkością 2 000 × g przez 15 minut, sterylizowany przez odfiltrowanie przez filtr membranowy 0,45 μm i supernatant przenoszony do oznakowanych krioprobówek. Wirus przechowuje się w temperaturze – 80 °C.

Tydzień po zamrożeniu rozmraża się pod zimną wodą trzy duplikatowe fiolki każdego z wirusów i mianuje na liniach komórkowych odpowiadających danemu wirusowi. Przynajmniej co sześć miesięcy lub w razie podejrzenia zmniejszenia wrażliwości linii komórkowych na zakażenie każdy izolat wirusa rozmraża się i mianuje.

Procedury mianowania w celu sprawdzenia wrażliwości linii komórkowych na zakażenie muszą być szczegółowo opisane, a za każdym razem należy stosować tę samą procedurę.

Mianowanie do punktu końcowego powinno obejmować przynajmniej sześć powtórzeń każdego szeregu rozcieńczenia. Miana należy porównać z mianami otrzymanymi uprzednio. Jeśli miano któregokolwiek z trzech izolatów wirusa spadnie, w porównaniu ze stężeniem pierwszym, o współczynnik wynoszący 2 log lub więcej, należy zaniechać dalszego wykorzystywania danej linii wirusa do celów nadzoru.

Jeśli w laboratorium przechowuje się różne linie komórkowe, każdą linię komórkową bada się osobno.

Dokumentację zachowuje się przez okres 10 lat.

CZĘŚĆ 2

SZCZEGÓŁOWE METODY I PROCEDURY DIAGNOSTYCZNE DO CELÓW NADZORU I POTWIERDZENIA W ODNIESIENIU DO ZAKAŻENIA HERPESWIRUSEM KOI (KHVD)

I. Szczegółowe metody i procedury diagnostyczne do celów potwierdzenia lub wykluczenia podejrzenia obecności KHVD

Jeśli konieczne są badania laboratoryjne w celu potwierdzenia obecności KHVD lub wykluczenia podejrzenia obecności tej choroby zgodnie z art. 57 lit. b) dyrektywy 2006/88/WE przy zastosowaniu metod diagnostycznych określonych w załączniku I część 2 sekcja III, stosuje się szczegółowe metody i procedury diagnostyczne określone w pkt I.1–I.2:

I.1. Przygotowanie próbek ryb

Do celów diagnostycznych do badań przy wykorzystaniu metod opartych na konwencjonalnym PCR lub qPCR można wykorzystać ryby przesyłane żywe lub uśmiercone, zapakowane osobno w hermetycznie zamknięte pojemniki aseptyczne lub alternatywnie zamrożone narządy lub fragmenty narządów zachowane w etanolu od 80 % do absolutnego lub wirusowe podłoże transportowe (które należy poddać obróbce w przeciągu 48 godzin od pobrania).

W celu wykrycia KHV pobiera się skrzela i nerki; do dodatkowej, odrębnej próbki włączyć można ponadto śledzionę, mózg i jelito. W nagłych przypadkach łączyć można materiał biologiczny pochodzący od maksymalnie pięciu ryb.

Ponadto w niektórych przypadkach można stosować próbki pobrane bez konieczności uśmiercania zwierząt, takie jak krew, wymaz ze skrzeli, biopsję skrzeli, zeskrobany śluz (oznacza to możliwość pobrania próbek od bardzo cennych ryb w razie podejrzenia obecności KHV).

I.1.1. Ekstrakcja DNA

Ekstrakcji DNA dokonuje się zgodnie z procedurami standardowymi.

Można stosować dostępne komercyjnie zestawy do ekstrakcji DNA, dzięki którym uzyskuje się DNA wysokiej jakości nadające się do wykorzystania w ramach protokołów PCR opisanych w pkt I.2.

I.2. Detekcja i identyfikacja czynnika za pomocą metod opartych na łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR)

I.2.1. qPCR do wykrywania KHV

Do wykrywania KHV stosuje się następujący test qPCR:

starter sensowny (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;

starter antysensowny (KHV-163r): 5′- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′;

i sonda (KHV-109p): 5′-FAM- CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.

Warunki reakcji: jeden cykl 15 minut w temperaturze 95 °C, a następnie 40 cykli 15 sekund w temperaturze 94 °C i 60 sekund w temperaturze 60 °C. Kontrole negatywne i kontrole dodatnie należy uwzględnić przy każdej analizie. Można jednak wykorzystać inne wersje qPCR o sprawdzonej podobnej skuteczności.

I.2.2. Konwencjonalne PCR do wykrywania KHV

Stosuje się opisany w niniejszym punkcie test w kierunku genu kinazy tymidynowej (TK) herpeswirusa koi. Alternatywnie można jednak zastosować inne testy PCR o udowodnionej czułości i swoistości porównywalnej z opisanym testem.

starter sensowny (KHV-TKf): 5′-GGGTTACCTGTAC GAG-3′;

starter antysensowny (KHV-TKr): 5′-CACCCAGTAGATTA TGC-3′.

Warunki reakcji: jeden cykl 5 minut w temperaturze 95 °C, a następnie 35 cykli 30 sekund w temperaturze 95 °C, 30 sekund w temperaturze 52 °C, jednej minuty w temperaturze 72 °C i jeden cykl 10 minut w temperaturze 72 °C. Wielkość produktu powinna wynosić 409 bp.

Wyniki PCR mogą być różne w zależności od warunków przeprowadzania testu – optymalizacji wymagać mogą protokoły termiczne w zależności od wykorzystywanego termocyklera. Ponadto wystąpić mogą wyniki fałszywie dodatnie ze względu na nieprawidłowe przyłączanie starterów lub zanieczyszczenia. Kontrole negatywne i kontrole dodatnie należy uwzględnić przy każdej analizie. Można jednak wykorzystać inne wersje PCR o sprawdzonej podobnej skuteczności.

Pierwszy przypadek wykrycia na danym obszarze należy potwierdzić sekwencjonowaniem lub przesłać krajowemu laboratorium referencyjnemu lub laboratorium referencyjnemu UE ds. chorób ryb, o którym mowa w załączniku VI do dyrektywy 2006/88/WE w celu natychmiastowej identyfikacji.

II. Szczegółowe metody i procedury diagnostyczne do celów nadzoru i potwierdzenia w odniesieniu do KHVD

Gdy do celów uzyskania lub utrzymania określonego statusu w odniesieniu do KHVD lub VHS, jak określono w załączniku I część 2 sekcja I, pobiera się próbki i prowadzi badania laboratoryjne przy zastosowaniu metod diagnostycznych określonych w części 2 sekcja II lub III wspomnianego załącznika, stosuje się pkt II.1 i II.2.

II.1. Przygotowanie próbek ryb

W miarę możliwości próbki pobiera się od ryb utrzymywanych przez dłuższy okres w zakresie temperatur umożliwiającym rozwój choroby (tj. przez dwa do trzech tygodni w temperaturze 15 – 26 °C). W celu zwiększenia szansy wykrycia KHV próbki pobiera się w miarę możliwości w 24 godziny, ale nie później niż 72 godzin po takich czynnościach w ramach praktyk zarządzania zasobami akwakultury, które mogłyby reaktywować wirus u ryb będących jego żywicielami, jak na przykład odławianie siecią lub transport.

Do celów nadzoru nad KHVD ryby można przesyłać żywe lub uśmiercone, zapakowane osobno w hermetycznie zamkniętych pojemnikach aseptycznych; alternatywnie zamrożone narządy lub fragmenty narządów zachowane w alkoholu 80– 100 % lub wirusowe podłoże transportowe (które należy poddać obróbce w przeciągu 48 godzin od pobrania) można wykorzystać do badań przy wykorzystaniu metod opartych na PCR. W celu nadzoru nad KHVD pobiera się skrawki skrzeli i nerek.

Do celów nadzoru nad KHVD należy w miarę możliwości unikać łączenia próbek. Jeśli łączenie jest konieczne, można łączyć materiał biologiczny z nie więcej niż dwóch ryb. Większe próbki homogenizuje się za pomocą moździerza i tłuczka lub stomachera, a przed klarowaniem pobiera się podpróbki do ekstrakcji DNA. Alternatywnie podpróbki można pobrać z każdej tkanki wchodzącej w skład próbki i umieścić w probówkach do lizy.

II.1.1. Ekstrakcja DNA

Ekstrakcji DNA dokonuje się zgodnie z procedurami standardowymi. Można stosować dostępne komercyjnie zestawy do ekstrakcji DNA, dzięki którym uzyskuje się DNA wysokiej jakości nadające się do wykorzystania w ramach protokołów PCR opisanych w pkt II.2.

Dopuszczalny stosunek tkanek do podłoża wynosi 1:9 w/v. Badaniami obejmuje się 20 – 25 mg materiału biologicznego.

II.2. Nadzór nad KHVD za pomocą metod opartych na PCR

Do celów nadzoru nad KHV stosuje się qPCR. Jeśli próbki dodatnie pojawią się na obszarze, na którym dotychczas nie potwierdzono występowania próbek dodatnich, wyniki badań należy potwierdzić poprzez:

a) sekwencjonowanie produktu PCR lub zagnieżdżonego PCR z tych próbek. Otrzymana czysta sekwencja konsensusowa musi zgadzać się (w przynajmniej 98 %) z tymi sekwencjami referencyjnymi.

b) alternatywnie próbki można przesłać do krajowego laboratorium referencyjnego w celu potwierdzenia.

II.2.1. qPCR do wykrywania KHV

Stosuje się qPCR opisane poniżej:

starter sensowny (KHV-86f): 5′- GACGCCGGAGACCTTGTG -3′;

starter antysensowny (KHV-163r): 5′- CGGGTTCTTATTTTTGTCCTTGTT -3′;

i sonda (KHV-109p): 5′-FAM- CTTCCTCTGCTCGGCGAGCACG -3′.

Warunki reakcji: jeden cykl 15 minut w temperaturze 95 °C, a następnie 50 cykli 15 sekund w temperaturze 94 °C i 60 sekund w temperaturze 60 °C.

Wyniki qPCR mogą być różne w zależności od warunków przeprowadzania testu – optymalizacji wymagać mogą protokoły termiczne w zależności od wykorzystywanego termocyklera. Ponadto wystąpić mogą wyniki fałszywie dodatnie ze względu na nieprawidłowe przyłączanie starterów lub zanieczyszczenia w laboratorium. Kontrole negatywne i kontrole dodatnie należy uwzględnić przy każdej analizie. Można jednak wykorzystać inne wersje qPCR o sprawdzonej podobnej skuteczności.

II.2.2. Konwencjonalne PCR do potwierdzania wykrycia KHV

W celu potwierdzenia obecności zakażenia KHV stosuje się generyczne zagnieżdżone PCR opisane w poniższej tabeli 2.1 z następnym sekwencjonowaniem amplifikowanego produktu.

Tabela 2.1

Startery i warunki odnoszące się do testu techniką zagnieżdżonego PCR w kierunku wszystkich herpeswirusów koi karpia (CyHV-1, CyHV-2 i CyHV-3)

Nazwa startera Sekwencja Warunki reakcji Wielkość produktu CyHVpol-forward 5′-CCAGCAACATGTGCGACGG-3′ Pierwsza runda PCR 1 cykl: 95 °C przez 2 minuty 40 cykli: 95 °C przez 30 sekund 55 °C przez 30 sekund 72 °C przez 45 sekund 1 cykl: 72 °C przez 10 minut 362 bp CyHVpol-reverse 5′-CCGTARTGAGAGTTGGCGCA-3′ CyHVpol-internal forward 5′-CGACGGVGGYATCAGCCC-3′ Druga runda PCR 1 cykl: 95 °C przez 2 minuty 40 cykli: 95 °C przez 30 sekund 55 °C przez 30 sekund 72 °C przez 45 sekund 1 cykl: 72 °C przez 10 minut 339 bp CyHVpol-internal reverse 5′-GAGTTGGCGCAYACYTTCATC-3′

Wyniki PCR mogą być różne w zależności od warunków przeprowadzania testu – optymalizacji wymagać mogą protokoły termiczne w zależności od wykorzystywanego termocyklera. Ponadto wystąpić mogą wyniki fałszywie dodatnie ze względu na nieprawidłowe przyłączanie starterów lub zanieczyszczenia w laboratorium. Kontrole negatywne i kontrole dodatnie należy uwzględnić przy każdej analizie. Można wykorzystać inne wersje PCR o sprawdzonej podobnej skuteczności.

Sekwencjonowanie może być przeprowadzone przez laboratorium lub przez zewnętrzne wyspecjalizowane przedsiębiorstwa zajmujące się sekwencjonowaniem. Wyniki sekwencjonowania analizuje się poprzez dopasowanie sekwencji do znanych sekwencji referencyjnych KHV (numery dostępu GenBank AP008984, DQ657948 i DQ177346). Otrzymana czysta sekwencja konsensusowa musi zgadzać się w przynajmniej 98 % z tymi sekwencjami referencyjnymi.

CZĘŚĆ 3

SZCZEGÓŁOWE METODY I PROCEDURY DIAGNOSTYCZNE DO CELÓW NADZORU I POTWIERDZENIA ZAKAŻENIA ZAKAŹNĄ ANEMIĄ ŁOSOSIA (ISA)

I. Procedury pobierania próbek do celów nadzoru i kontroli w odniesieniu do ISA

W ramach pobierania próbek i badań laboratoryjnych do celów programów nadzoru lub zwalczania określonych w załączniku I część 3 lub do celów potwierdzenia lub wykluczenia obecności ISA zgodnie z art. 57 lit. b) dyrektywy 2006/88/WE stosuje się szczegółowe metody i procedury określone w pkt I.1, I.2 oraz I.3.

I.1. Przygotowanie próbek ryb

W miarę możliwości nie należy łączyć próbek ryb do celów badań laboratoryjnych na obecność ISA. Jednakże do celów nadzoru nad ISA dopuszcza się łączenie 2 – 5 ryb.

Próbki do analizy przy wykorzystaniu łańcuchowej reakcji polimerazy z odwrotną transkrypcją (RT-PCR) pobiera się ze wszystkich ryb pobranych jako próbka. Za pomocą sterylnego narzędzia od ryby pobiera się fragment nerki – części środkowej i przenosi do probówki zawierającej jeden ml roztworu substancji konserwującej RNA o sprawdzonej skuteczności. Tkanki pochodzące od maksymalnie pięciu ryb mogą zostać zebrane do jednej probówki z roztworem transportowym i stanowią jedną próbkę zbiorczą. Waga tkanek w jednej próbce powinna wynosić 0,5 g. Jeśli ryby są zbyt małe, by można było uzyskać próbkę o wymaganej wadze, można pobrać (w kolejności preferencji) fragmenty nerki, serca, śledziony, wątroby lub wyrostków pylorycznych, aby uzyskać 0,5 g.

Tkanki do celów badania histologicznego pobiera się jedynie ze świeżo uśmierconych ryb w normalnym stanie wykazujących objawy kliniczne lub oznaki pośmiertne wskazujące na obecność ISA. Pobiera się próbki obejmujące wszelkie uszkodzenia zewnętrzne lub wewnętrzne, a w każdych okolicznościach z poszczególnych ryb pobiera się, przy użyciu skalpela, próbki nerki – części środkowej, serca, wątroby, trzustki, przewodu pokarmowego, skrzeli i śledzony, przenosząc je następnie do 8–10 % (vol:vol) roztworu soli fizjologicznej buforowanego formaldehydem. Aby zapewnić wystarczający stopień zakonserwowania tkanek, stosunek utrwalacza do tkanek powinien wynosić przynajmniej 20:1. Do celów immunohistochemii (IHC) pobiera się próbki z nerki – części środkowej i serca.

Od wszystkich ryb pobranych jako próbka pobiera się tkanki do badań wirusologicznych przy wykorzystaniu linii komórkowej. Za pomocą sterylnego narzędzia od ryby pobiera się fragmenty wątroby, nerki – części głowowej lub środkowej, serca i śledziony i przenosi do probówek plastikowych zawierających 9 ml podłoża transportowego. Tkanki pochodzące od maksymalnie pięciu ryb mogą zostać zebrane do jednej probówki zawierającej roztwór transportowy i stanowią jedną próbkę zbiorczą. Waga tkanek w jednej próbce powinna wynosić 1,0 ± 0,5 g.

I.2. Wysyłka próbek ryb

Do laboratorium przesyłać można całe ryby, jeśli możliwe jest spełnienie wymogów dotyczących temperatury podczas transportu, o których mowa w akapicie trzecim. Całą rybę owija się w papier higroskopijny i wysyła w torbie plastikowej, schłodzoną, jak opisano w niniejszym akapicie.

Wysyłać można również żywe ryby, ale jedynie pod nadzorem krajowego laboratorium referencyjnego ds. chorób ryb i uwzględniając dodatkowe kwestie związane z dezynfekcją i bezpieczeństwem biologicznym odnoszące się do przewozu żywych ryb.

Próbki krwi i probówki zawierające tkanki ryb do celów badań wirusologicznych lub RT-PCR umieszcza się w izolowanych pojemnikach, takich jak grubościenne pudła polistyrenowe, wraz z taką ilością lodu lub bloków mrożących, która zapewnia chłodzenie próbek podczas transportu do laboratorium. Należy unikać mrożenia, a w chwili przyjęcia wysyłki w pudle transportowym musi być nadal lód bądź też przynajmniej jeden z bloków mrożących musi być zamrożony w części lub w całości. W wyjątkowych okolicznościach próbki do RT-PCR lub do badania wirusologicznego można poddać mrożeniu szokowemu i przesłać do laboratorium w temperaturze – 20 °C lub niższej.

Do analizy RT-PCR ekstrakcja RNA powinna być przeprowadzona z tkanek utrwalonych w utrwalaczu RNAlater z zachowaniem następujących terminów zależnych od temperatury, w której przechowywane są próbki:

próbki przechowywane w temperaturze 37 °C: jeden dzień;

próbki przechowywane w temperaturze 25 °C: jeden tydzień;

próbki przechowywane w temperaturze 4 °C: jeden miesiąc;

próbki przechowywane w temperaturze – 20 °C: brak ograniczenia czasowego.

Tkanki ryb przewożone w utrwalaczu do celów badania histologicznego wysyła się w szczelnych probówkach w pojemnikach odpornych na uderzenia. Należy unikać zamrażania tych próbek.

Badanie wirusologiczne przy wykorzystaniu linii komórkowej należy rozpocząć jak najwcześniej, ale nie później niż 48 godzin po pobraniu próbek. W wyjątkowych przypadkach badanie wirusologiczne można rozpocząć nie później niż 72 godziny po pobraniu materiału, o ile materiał poddawany badaniu jest chroniony podłożem transportowym oraz o ile możliwe jest spełnienie wymogów dotyczących temperatury podczas transportu.

I.3. Pobieranie dodatkowego materiału diagnostycznego

Jeśli zatwierdzi to laboratorium diagnostyczne, do dodatkowego badania można pobierać i przygotowywać tkanki ryb inne niż tkanki, o których mowa w pkt I.1.

II. Szczegółowe metody i procedury diagnostyczne do celów nadzoru i do celów potwierdzenia lub wykluczenia podejrzenia obecności ISA

Jeśli, wykorzystując metody diagnostyczne określone w załączniku I część 3 sekcja II, przeprowadza się badania laboratoryjne w celu uzyskania lub utrzymania określonego statusu zdrowotnego w odniesieniu do ISA, jak określono w załączniku I część 3 sekcja I, lub w celu potwierdzenia obecności ISA lub wykluczenia podejrzenia obecności tej choroby zgodnie z art. 57 lit. b) dyrektywy 2006/88/WE, stosuje się szczegółowe metody i procedury określone poniżej w pkt II.1–II.5.

II.1. Analiza próbek przy wykorzystaniu RT-PCR

Metodą diagnostyczną stosowaną do celów badań przesiewowych w odniesieniu do ISAV jest RT-qPCR. Jako że metoda RT-qPCR może dawać różne wyniki w zależności od warunków, w jakich przeprowadza się test, należy zastosować odpowiednie kontrole dodatnie i ujemne oraz amplikony w celu uniknięcia wszelkich wątpliwości.

II.1.1. Ekstrakcja całkowitego RNA

Wszelkie prace przy izolacji RNA wykonuje się na lodzie przy użyciu rękawiczek.

Ekstrakcji całkowitego RNA dokonuje się, stosując metodę fenolowo-chloroformową lub kolumienkową zgodnie ze wskazówkami producenta.

Oczyszczone RNA zawiesza się ponownie w wodzie wolnej od RNaz (tj. wodzie poddanej działaniu 0,1 % dietylodiwęglanu).

Stężenie i czystość wyekstrahowanego RNA ocenia się