Dyrektywa Komisji 96/54/WE

z dnia 30 lipca 1996 r.

dostosowująca po raz dwudziesty drugi do postępu technicznego dyrektywę Rady 67/548/EWG w sprawie zbliżania przepisów ustawowych, wykonawczych i administracyjnych odnoszących się do klasyfikacji, pakowania i etykietowania substancji niebezpiecznych

(Tekst mający znaczenie dla EOG)

KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH,

uwzględniając Traktat ustanawiający Wspólnotę Europejską,

uwzględniając dyrektywę Rady 67/548/EWG z dnia 27 czerwca 1967 r. w sprawie zbliżania przepisów ustawowych, wykonawczych i administracyjnych odnoszących się do klasyfikacji, pakowania i etykietowania substancji niebezpiecznych Dz.U. L 196 z 16.8.1967, str. 1., ostatnio zmienioną dyrektywą Komisji 94/69/WE Dz.U. L 381 z 31.12.1994, str. 1., w szczególności jej art. 28,

a także mając na uwadze, co następuje:

załącznik I do dyrektywy 67/548/EWG zawiera wykaz substancji niebezpiecznych wraz z danymi dotyczącymi klasyfikacji i etykietowania w odniesieniu do każdej substancji i, gdzie właściwe, ich charakterystykę stężeń granicznych i innych parametrów pozwalających na ocenę zagrożenia, jakie stanowią te substancje dla zdrowia człowieka i dla środowiska; wykaz ten musi zostać dostosowany w świetle obecnej wiedzy naukowej i technicznej; w następstwie konieczne jest uzupełnienie wstępu do załącznika I w celu zawarcia w nim uwag dotyczących etykietowania preparatów i dodania w tabeli B nowej grupy substancji organicznych; wykaz substancji niebezpiecznych w załączniku I zawiera substancje, dla których przyznane zostały dla Austrii i Szwecji tymczasowe odstępstwa dotyczące klasyfikacji i etykietowania na mocy Aktu Przystąpienia Austrii, Finlandii i Szwecji; Akt Przystąpienia przewiduje przegląd wymagań dotyczących klasyfikacji i etykietowania tych substancji; klasyfikacja niektórych z tych substancji została odpowiednio zmieniona;

załącznik III do dyrektywy 67/548/EWG zawiera wykaz zdań informujących o charakterze szczególnego ryzyka przypisywanego niebezpiecznym substancjom i preparatom; konieczne jest wprowadzenie zdania informującego o zagrożeniu dla zdrowia, występującego w przypadku wdychania niektórych substancji i preparatów;

załącznik V do dyrektywy 67/548/EWG ustanawia metody określania właściwości fizyko chemicznych, toksyczności i ekotoksyczności substancji i preparatów; konieczne jest dostosowanie tego załącznika do postępu technicznego;

załącznik VI do dyrektywy 67/548/EWG zawiera ogólne kryteria klasyfikacji i etykietowania niebezpiecznych substancji i preparatów; należy wprowadzić kryteria dotyczące substancji i preparatów niebezpiecznych dla zdrowia w przypadku ich wdychania; należy zmienić kryteria dotyczące substancji i preparatów powodujących uczulenie; należy wprowadzić kryteria etykietowania pojemników na gaz przeznaczonych na propan, butan lub płynny gaz (LPG);

przepisy niniejszej dyrektywy są zgodne z opinią Komitetu ds. Dostosowania do Postępu Technicznego Dyrektyw w Sprawie Usunięcia Barier Technicznych w Handlu Substancjami i Preparatami Niebezpiecznymi,

PRZYJMUJE NINIEJSZĄ DYREKTYWĘ:

Artykuł 1

W dyrektywie 67/548/EWG wprowadza się następujące zmiany:

1. W załączniku I wprowadza się następujące zmiany:

a) we wstępie uwaga 4 otrzymuje brzmienie:

"Uwaga 4

Preparaty zawierające te substancje muszą być klasyfikowane jako szkodliwe, z oznaczeniem R 65, o ile spełniają kryteria wymienione w ppkt 3.2.3 załącznika VI.";

b) dodaje się uwagę 5 w brzmieniu:

"Uwaga 5

Graniczne wartości stężeń dla preparatów lotnych wyrażone są jako procent objętości przez objętość.";

c) we wstępie tabela B załącznika I do dyrektywy 67/548/EWG dodaje się specjalną klasyfikację substancji organicznych w brzmieniu:

+++++ TIFF +++++

d) wpisy w załączniku I do niniejszej dyrektywy zastępuje się odpowiednimi wpisami;

e) wpisy w załączniku II do niniejszej dyrektywy zostają dodane po raz pierwszy;

f) skreśla się wpisy oznaczone następującymi numerami:

008–002–00–3

612–045–00–9

648–011–00–5

648–025–00–1

648–157–00-X

648–158–00–5

648–159–00–0

649–192–00–3

g) wpisy zawarte w załączniku III do niniejszej dyrektywy zostają zmienione przez zastąpienie wszystkich odniesień do "R 22" odniesieniami do "R 65".

2. W załączniku III dodaje się następujące wyrazy:

+++++ TIFF +++++

3. Część B załącznika V otrzymuje brzmienie:

a) tekst załącznika IV.A do niniejszej dyrektywy zastępuje pozycje i wprowadzenie ogólne do części B: metody określania toksyczności;

b) tekst załącznika IV.B do niniejszej dyrektywy dodaje się po rozdziale B.1 bis;

c) tekst załącznika IV.C do niniejszej dyrektywy zastępuje rozdział B.6;

d) tekst załącznika IV.D do niniejszej dyrektywy zastępuje rozdział B.7;

e) tekst załącznika IV.E do niniejszej dyrektywy dodaje się na końcu.

4. Załącznik VI do niniejszej dyrektywy zmienia się tekstem podanym w załączniku V.

Artykuł 2

1. Bez uszczerbku dla przepisów ust. 2, Państwa Członkowskie wprowadzają w życie przepisy ustawowe, wykonawcze i administracyjne, niezbędne dla celu zgodności z niniejszą dyrektywą, najpóźniej do dnia 31 maja 1998 r. Państwa Członkowskie niezwłocznie poinformują o tym Komisję.

2. Państwa Członkowskie wprowadzają z życie przepisy ustawowe, wykonawcze i administracyjne, niezbędne do wykonania pkt F, I i J załącznika V do niniejszej dyrektywy, najpóźniej do dnia 31 października 1997 r. i niezwłocznie powiadomią o tym Komisję.

3. Przepisy określone w ust. 1 i 2 przyjęte przez Państwa Członkowskie zawierają odniesienie do niniejszej dyrektywy lub odniesienie takie towarzyszy ich urzędowej publikacji. Metody takiego odniesienia określane są przez Państwa Członkowskie.

Artykuł 3

Niniejsza dyrektywa wchodzi w życie dwudziestego dnia po jej opublikowaniu w Dzienniku Urzędowym Wspólnot Europejskich.

Artykuł 4

Niniejsza dyrektywa skierowana jest do Państw Członkowskich.

Sporządzono w Brukseli, dnia 30 lipca 1996 r.

W imieniu Komisji

Ritt Bjerregaard

Członek Komisji

--------------------------------------------------

ANEXO I — BILAG I — ANHANG I — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ I — ANNEX I — ANNEXE I — ALLEGATO I — BIJLAGE I — ANEXO I — LIITE I — BILAGA I

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

--------------------------------------------------

ANEXO II — BILAG II — ANHANG II — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ II — ANNEX II — ANNEXE II — ALLEGATO II — BIJLAGE II — ANEXO II — LIITE II — BILAGA II

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

--------------------------------------------------

ANEXO III — BILAG III — ANHANG III — ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ III — ANNEX III — ANNEXE III — ALLEGATO III — BIJLAGE III — ANEXO III — LIITE III — BILAGA III

Index No

+++++ TIFF +++++

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK IV A

CZĘŚĆ B: METODY OZNACZANIA TOKSYCZNOŚCI I INNYCH SKUTKÓW ZDROWOTNYCH

WPROWADZENIE OGÓLNE: CZĘŚĆ B

A. UWAGA WYJAŚNIAJĄCA

Do celów wprowadzenia ogólnego stosuje się następującą numerację:

B.15. Mutacja genowa-Saccharomyces cerevisiae

B.16. Mitotyczna rekombinacja w Saccharomyces cerevisiae

B.17. Test mutacji genowej w komórce ssaka in vitro

B.18. DNA uszkodzenie i naprawa- nieplanowana synteza DNA – komórki ssaków - in vitro

B.19. Bliźniacza wymiana chromatyd w komórkach ssaków - in vitro

B.20. Sprzężona z płcią recesywna próba letalna na muszce owocowej

B.21. Testy in vitro transformacji komórki ssaka

B.22. Badanie dominantu letalnego u gryzoni

B.23. Cytogenetyka in vivo komórki generatywnej ssaka

B.24. Test plamkowy u myszy

B.25. Test dziedzicznej translokacji u myszy

B.26. Test podchronicznej toksyczności doustnej: 90-dniowy, wielokrotna dawka doustna z wykorzystaniem gatunków gryzoni

B.27. Test podchronicznej toksyczności doustnej: 90-dniowy, wielokrotna dawka doustna z wykorzystaniem gatunków niebędących gryzoniami

B.28. Badanie podchronicznej toksyczności skórnej: badanie 90-dniowe, wielokrotna dawka skórna z wykorzystaniem gatunków gryzoni

B.29. Badanie podchronicznej toksyczności wziewnej: badanie 90-dniowe, wielokrotna dawka wziewna z wykorzystaniem gatunków gryzoni

B.30. Test chronicznej toksyczności

B.31. Badanie teratogenności- gryzonie i gatunki niebędące gryzoniami

B.32. Test rakotwórczości

B.33. Łączony test toksyczności chronicznej/rakotwórczości

B.34. Jednopokoleniowy test toksyczności reprodukcyjnej

B.35. Dwupokoleniowy test toksyczności reprodukcyjnej

B.36. Toksykokinetyka

B. OGÓLNE DEFINICJE TERMINÓW UŻYWANYCH DO OPISU METOD BADAŃ W NINIEJSZYM ZAŁĄCZNIKU

i) Ostra toksyczność obejmuje niekorzystne skutki występujące w danym czasie (zwykle 14 dni) po podaniu jednorazowej dawki substancji.

ii) Widoczna toksyczność jest ogólnym terminem określającym wyraźne oznaki toksyczności następujące po podaniu substancji testowanej. Powinny one być wystarczające do oceny zagrożenia i takie, że można spodziewać się rozwoju ostrych oznak toksycznych i prawdopodobnej śmiertelności w wyniku zwiększenia podanej dawki.

iii) Dawka jest to ilość podanej substancji testowanej. Dawka jest określona jako masa (gramy lub miligramy) lub jako masa substancji testowanej na jednostkę masy zwierzęcia badanego (np. miligramy na kilogram masy ciała) lub jako stałe stężenia żywieniowe (części na milion lub miligramy na kilogram żywności).

iv) Dawkarozróżniająca jest najwyższą z czterech ustalonych poziomów dawki, która może być podana bez spowodowania śmiertelności powiązanej ze związkiem (w tym śmierci ludzi).

v) Dawkowanie jest ogólnym terminem obejmującym dawkę, częstotliwość i okres jej aplikowania.

vi) LD50 (średnia dawka śmiertelna) jest statystycznie wyznaczoną jednorazową dawką substancji, po której można się spodziewać śmierci 50 % badanych zwierząt. Wartość LD50 jest określana masą substancji testowanej na jednostkę masy badanego zwierzęcia (miligramy na kilogram).

vii) LC50 (średnie stężenie śmiertelne) jest statystycznie wyznaczonym stężeniem substancji, przy którym można się spodziewać śmierci, podczas ekspozycji lub w ciągu ustalonego czasu po ekspozycji, 50 % zwierząt wystawionych na działanie substancji przez określony czas.

Wartość LC50 jest określana masą substancji testowanej na objętość molową normalną powietrza (miligramy na litr).

viii) NOAEL jest skrótem oznaczającym poziom, przy którym brak jest niekorzystnych skutków i jest najwyższą dawką lub poziomem ekspozycji, przy zastosowaniu którego nie obserwuje się niekorzystnych wyników terapii.

ix) Dawka wielokrotna/Toksyczność podchroniczna obejmuje niekorzystne skutki występujące u zwierząt doświadczalnych w wyniku powtarzającego się, codziennego aplikowania związku chemicznego lub wystawiania na jego działanie, przez krótką część spodziewanej długości życia zwierząt.

x) Maksymalna dawka tolerowana (MTD) jest najwyższym poziomem dawki wywołującym u badanych zwierząt oznaki toksyczności bez znaczącego wpływu na przeżycie odnoszące się do testu, w którym jest użyta.

xi) Podrażnienie skóry jest produktem zmian zapalnych w skórze następujących po użyciu substancji testowanej.

xii) Podrażnienie oczu jest produktem zmian w oku następujących po użyciu substancji testowanej na przednią powierzchnię oka.

xiii) Uczulenie skórne (alergiczne kontaktowe zapalenie skóry) jest immunologiczną reakcją skórną na substancję.

xiv) Korozja skórna jest produktem nieodwracalnego zniszczenia tkanki w skórze następującym po nałożeniu substancji testowanej na okres od 3 minut do 4 godzin.

xv) Toksykokinetyka jest badaniem absorpcji, dystrybucji, metabolizmu i wydalania substancji testowanych.

xvi) Absorpcja jest procesem(-ami) wnikania podanej substancji w ciało.

xvii) Wydalanie jest procesem(-ami), usuwania z ciała podanej substancji i/lub jej metabolitów.

xviii) Dystrybucja jest procesem(-ami), rozdzielania podanej substancji i/lub jej metabolitów wewnątrz ciała.

xvv) Metabolizm jest procesem(-ami), podczas którego podane substancje ulegają przemianom strukturalnym w reakcjach enzymatycznych lub nieenzymatycznych.

B.I Ostra – dawka wielokrotna/podchroniczna i chroniczna toksyczność

Ostre objawy zatrucia oraz narządowa i ogólnoustrojowa toksyczność substancji mogą być oszacowane przy użyciu zróżnicowanych testów toksyczności (metody B.1-B.5), w wyniku których, po zastosowaniu jednorazowej dawki, można otrzymać wstępne wskazanie toksyczności.

W zależności od toksyczności substancji, może być rozważone oznaczenie całkowitego LD50 testem granicznym, aczkolwiek nie uwzględniono testu granicznego w badaniach inhalacyjnych, ponieważ nie było możliwe określenie granicznej wartości jednorazowej ekspozycji inhalacyjnej.

Należy wziąć pod uwagę metody wykorzystujące możliwie najmniejszą liczbę zwierząt i minimalizujące ich cierpienie, przykładowo metodę stałej dawki (metoda B.1 bis) oraz klasę wysokotoksyczną (metoda B.1 tris). Na poziomie 1 testowania, badanie w drugim gatunku może uzupełniać wnioski wyciągnięte z badania pierwszego. W takim przypadku może być zastosowana metoda badania standardowego lub metoda może być przystosowana do mniejszej liczby zwierząt.

Test toksyczności dawki wielokrotnej (metody B.7, B.8 i B.9) obejmuje ocenę pojawiających się objawów zatrucia przy powtarzającej się ekspozycji. Kładzie się nacisk na staranne obserwacje kliniczne zwierząt aby otrzymać możliwie najwięcej informacji. Testy te powinny pomóc rozpoznać docelowe narządy toksyczności oraz toksyczne i nietoksyczne dawki. Może być potrzebne dalsze dogłębne zbadanie powyższych aspektów w badaniach długofalowych (metody B.26-B.30 i B.33).

B.II Mutagenność- Toksyczność genowa

Mutagenność odnosi się do wywołania trwałych, możliwych do przekazania zmian w ilości i strukturze materiału genetycznego komórek lub organizmów. Zmiany te, "mutacje", mogą dotyczyć pojedynczych genów lub segmentów genów, bloku genów, lub całych chromosomów. Skutki na całych chromosomach mogą być strukturalne i/lub numeryczne.

Mutagenna aktywność substancji jest oceniana przez próby in vitro prowadzące do mutacji genowych (punkt) w bakteriach (metoda B.13/14) i/lub strukturalnych odchyleń w komórkach ssaków, (metoda B.10).

Możliwe do przyjęcia są również procedury in vivo, np. test mikronukleus (metoda B.12) lub metafazowa analiza komórek szpiku kostnego, (metoda B.11). Jednakże, przy braku przeciwwskazań, metody in vitro są zdecydowanie preferowane.

Może istnieć potrzeba podjęcia dodatkowych kroków badawczych w celu dalszego zbadania mutagenności lub wstępnego badania rakotwórczości, aby zwiększyć ilość wyników i/lub przeprowadzić lub powtórzyć ocenę ryzyka. Mogą być stosowane w kilku celach: aby potwierdzić wyniki otrzymane w zestawie podstawowym; aby zbadać punkty końcowe nie badane w zestawie podstawowym; aby rozpocząć lub rozszerzyć badania in vivo.

W związku z powyższymi celami metody B.15 to B.25 obejmują układy eukariotyczne zarówno in vivo, jak i in vitro oraz rozszerzony zakres biologicznych punktów końcowych. Powyższe testy dostarczają bardziej kompleksowej informacji o mutacjach punktowych i o innych punktach końcowych w organizmach niż bakterie stosowane w zestawie podstawowym.

Należy przyjąć ogólną zasadę, że jeżeli rozważany jest program dalszych badań nad mutagennością, powinien on być tak zaprojektowany, aby dostarczyć istotne dodatkowe informacje dotyczące mutagennego i/lub rakotwórczego potencjału danej substancji.

Rzeczywiste badania, które mogą być odpowiednie w określonym przypadku, są zależne od licznych czynników, w tym: chemicznych i fizycznych charakterystyk substancji, wyników wstępnych oznaczeń bakteryjnych i cytogenetycznych, metabolicznego profilu substancji, wyników innych badań toksyczności, i znanych zastosowań substancji. Zważywszy na różnorodność czynników do rozważenia, ścisły harmonogram wyboru testów jest zatem niewłaściwy.

Niektóre ogólne zasady strategii testowania ustanawia dyrektywa 93/67/EWG, ale pełne strategie testowania znajdują się w dokumencie porad technicznych dotyczących Oceny Ryzyka. Niemniej jednak jest on elastyczny i może być przystosowany do określonych warunków.

Poniżej pogrupowane są metody dalszego badania, na podstawie ich głównych genetycznych punktów końcowych:

Badania w celu zbadania mutacji genowych (punkt)

a) Badania postępowej i wstecznej mutacji przy zastosowaniu mikroorganizmów eukariotycznych (Saccharomyces cerevisiae) (metoda B.15)

b) Badania in vitro w celu zbadania mutacji postępowej w komórkach ssaków, (metoda B.17)

c) Sprzężona z płcią recesywna próba letalna na muszce owocowej, (metoda B.20)

d) Próba mutacji komórki somatycznej in vivo, test plamkowy u myszy, (metoda B.24)

Badania w celu zbadania aberracji chromosomowych

a) Cytogenetyczne badania in vivo ssaków; Analiza metafazowa in vivo komórek szpiku kostnego powinna być rozważona, jeżeli nie obejmowała jej wstępna ocena (metoda B.11). Dodatkowo, in vivo może być badana cytogenetyka komórki generatywnej, (metoda B.23)

b) Cytogenetyczne badania in vitro komórek ssaków, jeżeli nie obejmowała ich wstępna ocena, (metoda B.10)

c) Badania dominantu letalnego u gryzoni, (metoda B.22)

d) Test dziedzicznej translokacji u myszy, (metoda B.25)

Skutki genotoksyczne – wpływ na DNA

Genotoksyczność, identyfikowana jako potencjalnie szkodliwy wpływ na materiał genetyczny, nie zawsze skojarzony z mutagennością, może być sygnalizowany przez indukowane uszkodzenie DNA bez bezpośrednich oznak mutacji. Do takich badań odpowiednie są następujące metody stosujące mikroorganizmy eukariotyczne lub komórki ssaków:

a) Mitotyczna rekombinacja w saccharomyces cerevisiae, (metody B.16)

b) DNA uszkodzenie i naprawa- nieplanowana synteza DNA – komórki ssaków - in vitro, (metoda B.18)

c) Bliżniacza wymiana chromatyd w komórkach ssaków - in vitro, (metoda B.19)

Alternatywne metody badania potencjału rakotwórczego

Dostępne są próby transformacji komórkowej ssaków, które mierzą zdolność substancji do indukowania morfologicznych i behawioralnych zmian w kulturach komórek. Uważa się, że zmiany są połączone z transformacją złośliwą - in vivo, (metoda B.21). W transformacji może być zastosowanych kilka różnych typów komórek i kryteriów.

Ocena ryzyka dziedzicznych skutków u ssaków

Dostępne są metody pomiaru dziedzicznych skutków mutacji genowej w odniesieniu do całych ssaków, np. właściwy test locus myszy do pomiaru mutacji komórki generatywnej w pierwszym pokoleniu (niezawarty w niniejszym załączniku) lub do badania aberracji chromosomowych, np. test dziedzicznej translokacji u myszy, (metoda B.25). Takie metody mogą być stosowane przy ocenie prawdopodobnego ryzyka genetycznego dla człowieka. Jednakże, uwzględniając złożoność niniejszych testów i bardzo dużą liczbę niezbędnych zwierząt, szczególnie we właściwym teście locus, przed podjęciem badań wymagane jest ich mocne uzasadnienie.

B.III Rakotwórczość

Związki chemiczne mogą być określone jako genotoksyczne i niegenotoksyczne substancje rakotwórcze, zależnie od przyjętego mechanizmu działania.

Wstępne informacje dotyczące genotoksycznego potencjału rakotwórczego substancji mogą być otrzymane z badań mutagenności/toksyczności. Dodatkowe informacje mogą być uzyskane z testów wielokrotnej dawki, podchronicznej i chronicznej toksyczności. Test toksyczności wielokrotnej dawki, metoda B.7 i dłuższe badania wielokrotnej dawki obejmują ocenę zmian histopatologicznych obserwowanych w testach toksyczności wielokrotnej dawki, np. hiperplazję w niektórych tkankach, która mogłaby być rozważona. Niniejsze badania i informacja toksykokinetyczna mogą pomóc rozpoznać związki chemiczne z potencjałem rakotwórczym, które mogą wymagać dalszych dogłębnych badań tego aspektu w teście rakotwórczości (metoda B.32) i często w połączonym badaniu chronicznej toksyczności/rakotwórczości (metoda B.33)

B.IV Toksyczność reprodukcyjna

Toksyczność reprodukcyjna może być wykryta za pomocą różnych metod, np. upośledzenia funkcji i zdolności rozrodczych samca i samicy, identyfikowanego jako "wpływy na płodność", lub wywołania niedziedzicznych, szkodliwych skutków w progrenach, identyfikowanego jako "toksyczność rozwojowa", która obejmuje również teratogenność i skutki podczas laktacji.

W odniesieniu do badań teratogenności jako części testowania toksyczności rozwojowej, metoda badania (metoda B.31) obejmuje głównie podawanie doustne. Alternatywnie, inne drogi aplikowania mogą być stosowane, zależnie od właściwości fizycznych testowanej substancji lub nadające się do ekspozycji człowieka. W takich przypadkach metoda badania powinna być odpowiednio dostosowana, biorąc pod uwagę właściwe elementy metod w teście 28-dniowym.

W przypadku gdy test reprodukcji (płodności) trójpokoleniowej jest wymagany, metoda opisana w teście reprodukcji dwupokoleniowej (metoda B.35) może być rozszerzona na trzecie pokolenie.

B.V Neurotoksyczność

Neurotoksyczność może być wykryta za pomocą różnych metod np. zmian funkcjonalnych i/lub strukturalnych oraz biochemicznych w centralnym i obwodowym układzie nerwowym. Wstępne oznaki neurotoksyczności mogą być otrzymane z testów ostrej toksyczności. Test toksyczności wielokrotnej dawki, metoda B.7, obejmuje ocenę działania neurotoksycznego, kładzie się nacisk na potrzebę starannych obserwacji klinicznych, aby otrzymać możliwie najwięcej informacji. Metoda ta powinna pomóc w zidentyfikowaniu związków chemicznych z potencjałem neurotoksycznym, które mogą wymagać dalszego dogłębnego badania w tym aspekcie. Dodatkowo, istotne jest rozważenie potencjału substancji do wywoływania specyficznych efektów neurotoksycznych, które nie mogą być wykryte w innych badaniach toksyczności. Przykładowo, zaobserwowano, że niektóre substancje powodują opóźnioną neurotoksyczność oraz mogą one być ocenione w metodach B.37 i B.38, w następstwie ekspozycji jednorazowej lub wielokrotnej dawki.

B.VI Immunotoksyczność

Immunotoksyczność może być wykryta za pomocą różnych metod np. immunosupresji i/lub wzmożenia reakcji układu odpornościowego, wynikającego z nadwrażliwości albo z indukowanej autoimmunizacji. Test toksyczności wielokrotnej dawki, metoda B.7, obejmuje ocenę działania immunotoksycznego. Metoda powinna pomóc zidentyfikować związki chemiczne z potencjałem immunotoksycznym, które mogą wymagać dalszego dogłębnego badania w tym aspekcie.

B.VII Toksykokinetyka

Badania toksykokinetyczne pomagają w interpretacji i ocenie danych dotyczących toksyczności. Mają one na celu wyjaśnienie określonych aspektów toksyczności związku chemicznego poddanego testowi, a wyniki mogą pomóc w zaprojektowaniu dalszych badań toksyczności. Nie przewiduje się, że w każdym przypadku będą musiały być oznaczone wszystkie parametry. Pełna seria badań toksykokinetycznych (absorpcja, wydalanie, dystrybucja i metabolizm) będzie konieczna jedynie w rzadkich przypadkach. Dla niektórych związków, mogą być wskazane zmiany w powyższej serii albo może być wystarczające badanie jednorazowej dawki (metoda B.36).

Informacja o strukturze chemicznej (SAR) i o właściwościach fizykochemicznych może również dostarczyć wskazówek dotyczących charakterystyk absorpcji w planowanej drodze aplikowania oraz stworzyć możliwość dystrybucji metabolicznej i tkankowej. Informacja dotycząca parametrów toksykokinetycznych może również pochodzić z poprzednich badań toksyczności i toksykokinetyki.

C. CHARAKTERYSTYKA SUBSTANCJI TESTOWANEJ

Skład substancji testowanej, w tym główne zanieczyszczenia oraz jej istotne właściwości fizykochemiczne, włącznie z trwałością, powinny być znane przed rozpoczęciem każdego badania toksyczności.

Właściwości fizykochemiczne substancji testowanej dostarczają ważnych informacji przy wyborze drogi aplikowania, projektowaniu każdego poszczególnego badania oraz posługiwaniu się i przechowywaniu substancji testowanej.

Rozpoczęcie badania powinno poprzedzać zastosowanie metody analitycznej w celu jakościowego i ilościowego oznaczenia substancji testowanej (wraz z głównymi zanieczyszczeniami, jeżeli możliwe) w ośrodku dawkującym i materiale biologicznym.

Wszystkie informacje dotyczące identyfikacji, właściwości fizyko-chemicznych, czystości i zachowania substancji testowanej powinny być zawarte w sprawozdaniu z testu.

D. UTRZYMANIE ZWIERZĄT

Rygorystyczna kontrola warunków otoczenia i właściwe techniki utrzymania zwierząt są niezbędne przy testowaniu toksyczności.

i) Warunki, w których przebywają zwierzęta

Warunki otoczenia w pomieszczeniach dla zwierząt doświadczalnych i zagrodach powinny być odpowiednie dla badanego gatunku. Odpowiednimi warunkami dla szczurów, myszy i świnek morskich są: temperatura pokojowa wynosząca 22 °C ± 3 °C i wilgotność względna 30–70 %; dla królików temperatura powinna wynosić 20 ± 3 °C przy wilgotności względnej 30–70 %.

Niektóre techniki eksperymentalne są szczególnie wrażliwe na wpływ temperatury i w takich przypadkach szczegóły odpowiednich warunków są zawarte w opisie metody badania. We wszystkich badaniach działania toksycznego temperatura i wilgotność powinny być monitorowane, rejestrowane i zawarte w końcowym sprawozdaniu z badania.

Oświetlenie powinno być sztuczne, w cyklu 12 godzin jasno, 12 godzin ciemno. Szczegóły form oświetlenia powinny być rejestrowane i zawarte w końcowym sprawozdaniu z badania.

Przy braku innych wskazań w danej metodzie, zwierzęta mogą być umieszczane pojedynczo lub umieszczane w klatkach w małych grupach o tej samej płci; w przypadku umieszczania grupowego, nie więcej niż pięć zwierząt powinno być umieszczanych w jednej klatce.

W sprawozdaniach z eksperymentów na zwierzętach ważne jest wskazanie stosowanego typu umieszczania zwierząt w klatkach i liczby zwierząt umieszczanych w każdej klatce zarówno podczas ekspozycji na związek chemiczny, jak i w późniejszym okresie obserwacji.

ii) Warunki żywienia

Diety powinny w pełni spełniać zapotrzebowanie pokarmowe gatunku poddanego testowi. W przypadkach gdy substancje testowane są podawane zwierzętom w ich pożywieniu, wartość pokarmowa może być zredukowana przez interakcję tej substancji ze składnikiem pokarmowym. Możliwość takiej reakcji powinna być rozważona przy interpretacji wyników testów. Konwencjonalne diety laboratoryjne mogą być stosowane przy nieograniczonym dostarczaniu wody pitnej. Na wybór diety może mieć wpływ potrzeba zapewnienia odpowiedniej domieszki substancji testowanej przy podawaniu metodą powyższą.

Pokarmowe substancje zanieczyszczające, o których wiadomo, że wpływają na toksyczność, nie powinny być obecne w stężeniach przeszkadzających.

E. DOBROSTAN ZWIERZĄT

Opracowując szczegółowo metody badania, odpowiednio rozważono dobrostan zwierząt. Niektóre przykłady są pokrótce podane poniżej, ale wykaz nie jest wyczerpujący. Dokładny sposób sformułowania i/lub warunki powinny być odczytane w tekście metod:

- W celu wyznaczenia ostrej toksyczności doustnej, powinny zostać rozważone dwie alternatywne metody, "Procedura stałej dawki" i "Metoda klasy wysokotoksycznej". W "Procedurze stałej dawki" nie uznaje się śmierci jako właściwego punktu końcowego i wykorzystuje się mniej zwierząt. W "Metodzie klasy wysokotoksycznej" wykorzystuje się średnio 70 % mniej zwierząt niż w metodzie B.1 dotyczącej ostrej doustnej toksyczności. Obie metody alternatywne skutkują mniejszym bólem i cierpieniem niż metodologia klasyczna.

- Liczba wykorzystywanych zwierząt jest zredukowana do naukowo dopuszczalnego minimum: na poziom dawki, tylko 5 zwierząt o tej samej płci jest badanych do celów metod B.1 i B.3; tylko 10 zwierząt (i tylko 5 w negatywnej grupie kontrolnej) jest używanych przy określaniu sensybilizacji skóry za pomocą testu maksymalizacji na śwince morskiej (metoda B.6); liczba zwierząt potrzebna do kontroli pozytywnej przy testowaniu mutagenności in vivo jest również obniżona (metody B.11 i B.12)

- Ból i cierpienie zwierząt podczas testowania są minimalizowane: Może wystąpić konieczność humanitarnego zabicia zwierząt przejawiających ostre i trwałe oznaki cierpienia i bólu; Dawkowanie testowanych substancji w sposób, o którym wiadomo, że powoduje wyraźny ból i cierpienie z powodu właściwości korozyjnych i drażniących, nie musi być przeprowadzane (metody B.1, B.2 i B.3).

- Unika się testowania z użyciem nieodpowiednio wysokich dawek, przez wprowadzenie testów granicznych, nie tylko w testach ostrej toksyczności (metody B.1, B.2 i B.3), ale także w testach in vivo mutagenności (metody B.11 i B.12).

- Strategia testowania podrażnienia zezwala obecnie na niewykonanie testu lub jego zredukowanie do badania pojedynczego zwierzęcia, w przypadku gdy mogą być dostarczone wystarczające naukowe dowody.

Takie naukowe dowody mogą być oparte na właściwościach fizykochemicznych substancji, na wynikach innych testów już przeprowadzonych lub dobrze uzasadnionych wynikach testów in vitro. Przykładowo, jeżeli zostało przeprowadzone badanie ostrej toksyczności drogą skórną przy dawce testu granicznego (metoda B.3) i nie zaobserwowano żadnego podrażnienia skóry, dalsze testowanie dotyczące podrażnienia skóry (metoda B.4) może być niepotrzebne; materiały, które wykazywały wyraźną korozję i ostre podrażnienie skóry w badaniu podrażnienia skórnego (metoda B.4) nie powinny być dalej testowane w zakresie podrażnienia oka (metoda B.5).

F. TESTOWANIE ALTERNATYWNE

Naukowym celem Unii Europejskiej jest rozwijanie i zatwierdzanie technik alternatywnych, które mogą dostarczyć ten sam poziom informacji jak obecne testy na zwierzętach, ale które stosują mniej zwierząt, powodują mniejsze cierpienie lub całkowicie unikają wykorzystania zwierząt.

Takie metody, w przypadku gdy staną się dostępne, muszą być rozważane gdziekolwiek jest to możliwe przy charakteryzowaniu zagrożenia i późniejszym klasyfikowaniu i etykietowaniu wewnętrznych zagrożeń.

G. OCENA I INTERPRETACJA

Podczas oceny i interpretacji testów, muszą być rozważone ograniczenia zakresu, w którym wyniki badań na zwierzętach i in vitro mogą być odniesione bezpośrednio do człowieka i dlatego tam, gdzie dostępne są dowody niekorzystnych skutków dla ludzi, mogą one być użyte do potwierdzenia wyników testowania.

Powyższe wyniki mogą być wykorzystane w celu klasyfikowania i etykietowania nowych i istniejących związków chemicznych ze względu na wpływ na ludzkie zdrowie, na podstawie ich właściwości wewnętrznych, identyfikowanych i określanych ilościowo niniejszymi metodami. Właściwe kryteria klasyfikowania i etykietowania w załączniku VI odnoszą się również do punktów końcowych protokołów testowania w zakresie niniejszych metod badania.

Powyższe wyniki mogą być również wykorzystane do badań oceny ryzyka, nowych i istniejących związków chemicznych, a odpowiednie strategie testowania ze względu na wymienione cele są wskazane we właściwych dokumentach informacyjnych.

H. BIBLIOGRAFIA

Większość tych metod jest opracowana w ramach programu OECD - Wskazówki Dotyczące Testowania i powinny być one realizowane zgodnie z zasadami dobrej praktyki laboratoryjnej, aby zapewnić możliwie najszerszą "wzajemną akceptację danych".

Dodatkowe informacje mogą być odnalezione w bibliografii wskazówek OECD i odpowiedniej literaturze publikowanej w innych źródłach.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK IV B

"

B.1 tris OSTRA TOKSYCZNOŚĆ (DOUSTNA) – METODA KLASY WYSOKOTOKSYCZNEJ

1. METODA

1.1. Wprowadzenie

Metoda klasy wysokotoksycznej dostarcza informacji zarówno do oceny, jak i klasyfikacji zagrożeń.

Niniejsza metoda stosuje trzy stałe dawki, właściwie rozdzielone, aby umożliwić klasyfikację związku na podstawie wyników badania. Poza tym, procedura opisana w metodzie badania uwzględnia wybór dodatkowych trzech stałych dawek, które mogłyby być użyte jako opcje alternatywne w podanych punktach decyzyjnych albo jako opcja dalszego testowania. Zastosowanie (którejkolwiek z) dodatkowych dawek może być rozważone w przypadku, gdy dalsze udoskonalenie może być pożądane lub konieczne.

W tej metodzie stosowane są określone dawki początkowe i nie jest jej zamiarem dokładne obliczenie LD50, ale uwzględnia się wyznaczenie zakresu ekspozycji, w którym spodziewana jest śmiertelność, ponieważ śmierć części zwierząt jest wszelako ważnym punktem końcowym tego testu. Wyniki testu powinny uwzględniać klasyfikację zgodnie z kryteriami załącznika VI. Z powodu sekwencyjnej natury podejścia, czas trwania testu mógłby być dłuższy niż procedura opisana w B.1. Główną zaletą tej metody jest fakt, że wymaga ona mniejszej liczby zwierząt niż metoda ostrej toksyczności (doustna) (B.1), a także alternatywna metoda stałej dawki (B.1 bis).

Patrz także: Wprowadzenie Ogólne część B.

1.2. Definicje

Patrz: Wprowadzenie Ogólne część B.

1.3. Zasada metody badania

Substancja jest podawana doustnie grupie zwierząt doświadczalnych w jednej ze określonych dawek. Substancja jest testowana przy użyciu procedury krokowej, każdy krok stosuje trzy zwierzęta jednej płci. Nie jest konieczne wykonanie wstępnego badania oglądowego. Brak lub obecność powiązanej z substancją umieralności zwierząt dawkowanych w jednym kroku wyznaczy krok następny, tj.:

- nie ma potrzeby dalszego testowania,

- następny krok będzie wykonany z tą samą dawką, ale na zwierzętach innej płci,

- następny krok będzie wykonany z najbliższym wyższym lub najbliższym niższym poziomem dawki.

1.4. Opis metody badania

1.4.1. Przygotowania

Zdrowe, młode, dorosłe zwierzęta są wybierane losowo, znakowane w celu umożliwienia indywidualnej identyfikacji, i pozostawione w ich klatkach przez co najmniej 5 dni przed początkiem testu, aby uwzględnić aklimatyzację do warunków laboratoryjnych. Zwierzęta mogą być umieszczane w klatkach w grupach według płci lub dawki, ale liczba zwierząt przypadających na klatkę musi być taka, aby nie kolidowała z niezakłóconą obserwacją każdego zwierzęcia.

Substancja testowana jest podawana zwierzętom w jednorazowej dawce do żołądka przy użyciu rurki lub odpowiedniej kaniuli dotchawicznej.

Gdzie konieczne, substancja testowana jest rozpuszczona lub w postaci zawiesiny w odpowiednim nośniku. Zaleca się, żeby, gdziekolwiek jest to możliwe, najpierw było rozważone użycie wodnego roztworu/zawiesiny, następnie roztworu/emulsji w oleju (np. olej kukurydziany) i potem możliwy roztwór w innych nośnikach. W przypadku nośników niewodnych powinna być znana charakterystyka toksyczna nośnika, a jeżeli nie jest znana, powinna być określona przed testem.

Zwierzętom nie podaje się pożywienia przed dawkowaniem (np. szczurom nie podaje się przez całą noc, myszom przez 3-4 godziny); nie należy wstrzymywać podawania wody.

1.4.2. Warunki testu

1.4.2.1. Badane zwierzęta

Jeżeli nie ma przeciwwskazań, szczur jest preferowanym gatunkiem gryzonia. Samice powinny być nieciężarne i takie, które nie rodziły.

Na początku badania zmienność ciężaru zwierząt powinna być minimalna i nie przekraczać ± 20 procent średniego ciężaru dla każdej płci.

1.4.2.2. Liczba i płeć

W każdym kroku wykorzystuje się trzy zwierzęta jednej płci. W początkowym kroku może być użyta każda płeć.

1.4.2.3. Poziomy dawki

Wybierany jest jeden poziom dawki do zastosowania jako dawka wyjściowa, spośród trzech stałych poziomów tj. 25, 200 i 2000 mg/kg masy ciała. Poziomem dawki wyjściowej powinien być ten, który najprawdopodobniej doprowadzi do śmierci co najmniej niektórych z dawkowanych zwierząt. Można posłużyć się jednym ze schematów blokowych procedur opisanych w załączniku 1, w zależności od dawki wyjściowej.

Przy wyborze płci i dawki wyjściowej powinny być wykorzystane wszystkie dostępne informacje, w tym informacje o związkach struktury i aktywności. W przypadku gdy informacje wskazują, że śmiertelność jest mało prawdopodobna przy najwyższym poziomie dawki (2000 mg/kg masy ciała), powinien byś przeprowadzony test graniczny. W przypadku gdy brak jest informacji o substancji, która ma być testowana, ze względu na dobrostan zwierząt zaleca się użycie dawki wyjściowej 200 mg/kg masy ciała.

Czasami może być pożądane zdobycie informacji bardziej wyczerpującej niż byłoby to możliwe po przeprowadzeniu testu z trzema stałymi poziomami dawki: 25, 200 i 2000 mg/kg masy ciała. W takich przypadkach może być rozważone dalsze testowanie przy dodatkowych stałych poziomach dawki, wynoszących 5, 50 lub 500 mg/kg masy ciała.

Dawki, o których wiadomo, że powodują wyraźny ból i cierpienie z powodu działania korozyjnego i poważnie drażniącego, nie muszą być podawane.

Odstępy czasu między grupami poddawanymi badaniu są określone przez początek, czas trwania, i ostrość oznak toksycznych. Terapia zwierząt drugiej płci lub następną dawką powinna być odłożona do chwili, gdy wystąpi pewność, że przeżyją poprzednio dawkowane zwierzęta.

1.4.2.4. Test graniczny

Test graniczny z jednym poziomem dawki wynoszącym 2000 mg/kg masy ciała może być wykonany na trzech zwierzętach każdej płci. Jeżeli wystąpi umieralność powiązana z substancją, może być konieczne przeprowadzenie dalszego testowania przy 200 mg/kg (lub 500 mg/kg masy ciała.

1.4.2.5. Okres obserwacji

Prawidłowo zwierzęta powinny być obserwowane przez 14 dni, poza przypadkami, w których zwierzęta muszą być usunięte z badania i humanitarnie zabite ze względu na ich dobro lub w przypadku gdy są nieżywe. Jednakże czas trwania obserwacji nie powinien być sztywno ustalony. Powinien on być określony przez reakcje toksyczne, początek i długość okresu regeneracji, i może być przedłużony, jeżeli stwierdzi się taką konieczność. Czas, w którym pojawiają się i znikają oznaki toksyczności jest ważny, szczególnie jeżeli istnieje tendencja do opóźnionego występowania oznak toksyczności. Wszystkie obserwacje są systematycznie zapisywane z zachowaniem osobnych zapisów dla każdego zwierzęcia.

1.4.3. Procedura

Po okresie przerwy w żywieniu zwierzęta powinny być zważone przed podaniem substancji testowanej. Po podaniu substancji, pokarm może być wstrzymany przez dalsze 3-4 godziny. W przypadkach gdy dawka jest aplikowana w częściach przez pewien czas, może być konieczne zaopatrzenie w żywność i wodę, w zależności od długości tego okresu.

Maksymalna objętość cieczy, która może być podana jednorazowo, zależy od wielkości badanego zwierzęcia. Dla gryzoni, prawidłowo, objętość nie powinna przekraczać 1 ml/100 g masy ciała; jednakże w przypadku roztworów wodnych można rozważyć 2 ml/100 g masy ciała. Zmienność objętości w teście powinna być zminimalizowana przez dostosowanie stężenia tak, aby zapewnić stałą objętość dla wszystkich poziomów dawki. Jeżeli pojedyncza dawka nie jest możliwa, może ona być podawana w mniejszych częściach przez okres nieprzekraczający 24 godzin.

Szczegóły procedury testowania są opisane w załączniku 1.

1.4.3.1. Obserwacje ogólne

Staranne obserwacje kliniczne powinny być przeprowadzone co najmniej dwukrotnie w dniu dawkowania lub częściej, jeżeli jest to wskazane z powodu reakcji zwierząt na działania, i od tego czasu co najmniej raz dziennie. Zwierzęta konające oraz przejawiające ostry ból i trwałe oznaki poważnego cierpienia powinny być humanitarnie zabite. Zwierzęta zabite z powodów humanitarnych są brane pod uwagę tak, jak zwierzęta, które zdechły w trakcie testu.

W przypadku gdy zwierzęta są zabite z powodów humanitarnych lub są znalezione martwe, chwila śmierci powinna być odnotowana możliwie najdokładniej. Dodatkowe obserwacje będą niezbędne, jeżeli zwierzęta będą nadal wykazywać oznaki toksyczności. Obserwacje powinny obejmować zmiany w skórze i sierści, oczach i śluzówce, jak również układach: oddechowym, krążenia, autonomicznym i centralnym nerwowym oraz aktywność motoryczną ciała i model zachowania. Należy skierować uwagę na obserwację drżeń, konwulsji, ślinotoku, biegunki, letargu, snu i śpiączki.

Wszystkie obserwacje są systematycznie zapisywane z zachowaniem osobnych zapisów dla każdego zwierzęcia.

1.4.3.2. Waga ciała

Wszystkie zwierzęta powinny być zważone na krótko przed podaniem substancji testowanej i od tego czasu co najmniej raz na tydzień. Zmiany wagi powinny być obliczone i zanotowane. Na końcu testu zwierzęta, które przeżyły, są ważone, zanim zostaną humanitarnie zabite.

1.4.3.3. Sekcja zwłok

Wszystkie badane zwierzęta, w tym te, które zdychają w trakcie testu lub są usuwane z badania, powinny być poddane sekcji zwłok. Wszystkie ogólne zmiany patologiczne powinny zostać odnotowane dla każdego zwierzęcia. Badanie mikroskopowe narządów wykazujących oznaki ogólnej patologii, u zwierząt przeżywających 24 godziny lub więcej, może być również rozważone, ponieważ może ono dostarczyć przydatnych informacji.

2. DANE

Powinny zostać dostarczone dane indywidualne zwierząt. Dodatkowo, wszystkie dane powinny być podsumowane w formie tabeli, przedstawiając w odniesieniu do każdej grupy badanej liczbę użytych zwierząt, liczbę zwierząt wykazujących oznaki toksyczności, liczbę zwierząt, które znaleziono martwe podczas testu lub zabito z powodów humanitarnych, czas śmierci pojedynczych zwierząt, opis i czasowy przebieg objawów toksycznych oraz ich odwracalność, i wyniki sekcji zwłok.

Ogólna wskazówka w sprawie interpretacji wyników w celu klasyfikacji jest podana w załączniku 2.

3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA

Sprawozdanie z testu

Sprawozdanie z testu obejmuje, jeżeli to możliwe, następujące informacje:

Zwierzęta badane:

- gatunek/rasa;

- stan mikrobiologiczny zwierząt, jeżeli jest znany;

- liczba, wiek i płeć zwierząt;

- źródło, warunki, w których przebywają zwierzęta, dieta itp.;

- indywidualna waga zwierząt na początku testu, w tygodniowych odstępach czasu podczas badania i na końcu testu.

Warunki testu:

- uzasadnienie wyboru nośnika, jeżeli jest inny, niż woda;

- szczegóły podawania substancji testowanej obejmujące objętości i czas dawkowania;

- szczegóły jakości żywności i wody (w tym typ/źródło, źródło wody);

- racjonalna podstawa wyboru dawki wyjściowej.

Wyniki:

- Zestawienie danych dotyczących reakcji w tabeli, według płci i poziomu dawki dla każdego zwierzęcia (tj. zwierzęta wykazujące oznaki toksyczności, w tym umieralność, natura, ostrość i czas trwania objawów);

- Czasowy przebieg początku występowania oznak toksyczności i czy były one odwracalne w przypadku każdego zwierzęcia;

- wyniki sekcji zwłok i jakiekolwiek wyniki histopatologiczne w odniesieniu do każdego zwierzęcia, jeżeli dostępne.

Rozpatrzenie wyników.

Wnioski.

4. BIBLIOGRAFIA

Niniejsza metoda jest analogiczna do OECD TG 423.

ZAŁĄCZNIK 1

PROCEDURA TESTOWA

1. Jak wskazano w ppkt 1.4.2.3, dawką wyjściową powinna być taka dawka, która może doprowadzić do umieralności co najmniej niektórych spośród zwierząt przyjmujących dawkę. Informacje, które mogłyby być wykorzystane przy wyborze dawki wyjściowej obejmują:

- dane dotyczące właściwości fizycznych i chemicznych;

- związek struktura-aktywność;

- wszystkie dane z innych testów toksyczności; i

- przewidywane zastosowanie substancji testowanej.

2. Dla każdej dawki wyjściowej, poszczególne schematy testowania zawarte w niniejszym załączniku, przedstawiają w zarysie procedurę, którą należy stosować. Zależnie od liczby humanitarnie zabitych i nieżywych zwierząt procedura testowa przebiega zgodnie ze wskazanymi strzałkami.

3. W przypadku gdy przy dawce wyjściowej wynoszącej 25 lub 200 mg/kg masy ciała, tylko jedno zwierzę drugiej płci zdycha, prawidłowo prowadziłoby to do braku dalszego testowania. Jednakże jeżeli nie obserwuje się oznak zatrucia u pozostałych pięciu zwierząt, podczas sekcji zwłok powinna być rozważona możliwość, że śmiertelność mogła nie być powiązana z substancją. W takim przypadku test powinien być kontynuowany z dawkowaniem na najbliższym wyższym poziomie.

4. W przypadku gdy przy dawce wynoszącej 2000 mg/kg masy ciała, jedno zwierzę każdej płci zdycha, należy oczekiwać, że wartość LD50 przekracza 2000 mg/kg masy ciała. Jednakże ponieważ jest to wynik graniczny, reakcja pozostałych dwóch zwierząt każdej płci powinna być uważnie rozważona i występowanie odrębnych, wyraźnych oznak toksycznych u tych zwierząt może zdecydowanie prowadzić do klasyfikowania tego przypadku do wartości LD50 wynoszącej 2000 mg/kg masy ciała lub mniej, lub mogłoby uzasadniać dalsze testowanie na tym samym poziomie.

5. Procedura uwzględnia testowanie przy trzech dodatkowych stałych dawkach (opcja 2). Opcja ta mogłaby być zastosowana albo do wyboru dawki alternatywnej w danym punkcie decyzyjnym, albo do dalszego testowania po ukończeniu rzeczywistego testu (opcja 1). W opcji 1, procedura testowa jest wskazana strzałkami tłustym drukiem, podczas gdy dla procedury testu w opcji 2, użyte są strzałki drukiem zwykłym.

a) Procedura testowa z dawką wyjściową 25 mg/kg masy ciała

+++++ TIFF +++++

b) Procedura testowa z dawką wyjściową 200 mg/kg masy ciała

+++++ TIFF +++++

c) Procedura testowa z dawką wyjściową 2000 mg/kg masy ciała

+++++ TIFF +++++

ZAŁĄCZNIK 2

INTERPRETACJA WYNIKÓW NA PODSTAWIE TESTOWANIA WEDŁUG OPCJI 1

Kratki szare poniżej kratki "brak dalszego testowania" w schematach niniejszego załącznika, przedstawiają obniżone wartości do klasyfikacji. Stosując procedurę testową, jak przedstawiono w zarysie w opcji 1, należy podążać zgodnie z odpowiednią strzałką dalej w dół, aż dotrze ona do szarej kratki będącej przedmiotem zainteresowania.

a) Interpretacja wyników na podstawie testowania według opcji 1

Dawka wyjściowa: 25 mg/kg masy ciała

+++++ TIFF +++++

b) Interpretacja wyników na podstawie testowania według opcji 1

Dawka wyjściowa: 200 mg/kg masy ciała

+++++ TIFF +++++

c) Interpretacja wyników na podstawie testowania według opcji 1

Dawka wyjściowa: 2000 mg/kg masy ciała

+++++ TIFF +++++

"

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK IV C

"

B.6 SENSYBILIZACJA SKÓRY

1. METODA

1.1. Wprowadzenie

Uwagi:

Czułość i zdolność testów do wykrywania potencjalnych sensybilizatorów ludzkiej skóry uważa się za ważne w systemie klasyfikacji toksyczności odnoszącej się do zdrowia publicznego.

Nie ma jednej metody badania, która właściwie zidentyfikuje wszystkie substancje z potencjałem do sensybilizowania ludzkiej skóry i która odnosi się do wszystkich substancji.

Czynniki, takie jak fizyczne charakterystyki substancji, w tym jej zdolność do wnikania w skórę, muszą być wzięte pod uwagę przy wyborze testu.

Są wykorzystywane dwa typy testów stosujących świnki morskie: testy ze środkiem wspomagającym, w których stan alergiczny jest potęgowany przez rozpuszczenie lub utworzenie zawiesiny substancji testowanej w kompletnym środku wspomagającym Freunda (FCA), i testy niewspomagane.

Testy ze środkiem wspomagającym mogą być bardziej precyzyjne w przewidywaniu prawdopodobnego działania substancji prowadzącego do sensybilizacji skóry u ludzi niż metody nie stosujące kompletnego środka wspomagającego Freunda i są zatem metodami preferowanymi.

Test maksymalizacyjny świnki morskiej (GPMT) jest szeroko stosowanym testem ze środkiem wspomagającym. Pomimo iż kilka innych metod może być wykorzystanych w celu wykrycia potencjału substancji do wywołania reakcji sensybilizacji skóry, GPMT uważa się za preferowaną technikę wspomagającą.

W przypadku wielu kategorii związków chemicznych testy niewspomagane (preferowany jest test Buehlera) uważa się za mniej czułe.

W niektórych przypadkach mogą istnieć słuszne powody wyboru testu Buehlera, wymagającego aplikowania miejscowego zamiast iniekcji śródskórnej, wykorzystywanej w teście maksymalizacyjnym świnki morskiej. W przypadku stosowania testu Buehlera powinno być podane naukowe uzasadnienie.

Test maksymalizacyjny świnki morskiej (GPMT) i test Buehlera są opisane w niniejszej metodzie. Inne metody mogą być stosowane, pod warunkiem że są potwierdzone i podane jest naukowe uzasadnienie.

Jeżeli uzyskano wynik pozytywny w ogólnie przyjętym badaniu sortującym, substancja testowana może być nazwana potencjalnym sensybilizatorem i przeprowadzanie testu świnki morskiej może nie być konieczne. Jednakże jeżeli uzyskano wynik negatywny w takim teście, test świnki morskiej musi zostać przeprowadzony, z zastosowaniem procedury opisanej w tej metodzie badania.

Patrz także Wprowadzenie ogólne w części B.

1.2. Definicje

Sensybilizacja skóry: (alergiczne kontaktowe zapalenie skóry) jest immunologiczną reakcją skórną na substancję. U ludzi reakcje mogą charakteryzować się swędzeniem, rumieniem, obrzękiem, grudkami, pęcherzykami, wzniesieniami naskórka wypełnionymi przeźroczystą, wodną cieczą lub połączeniem tych objawów. W przypadku innych gatunków reakcje mogą się różnić i mogą być zaobserwowane tylko rumień i obrzęk.

Ekspozycja indukcyjna: eksperymentalna ekspozycja podmiotu na substancję testowaną z zamiarem wywołania stanu nadwrażliwego.

Okres indukcji: okres co najmniej jednego tygodnia następujący po ekspozycji indukcyjnej, podczas którego stan nadwrażliwy może się rozwinąć.

Ekspozycja prowokacyjna: eksperymentalna ekspozycja podmiotu poddanego wcześniej działaniu substancji testowanej, następująca po okresie indukcji w celu ustalenia, czy podmiot reaguje w sposób nadwrażliwy.

1.3. Substancje odniesienia

Czułość i niezawodność stosowanej techniki eksperymentalnej powinna być oceniana co sześć miesięcy przez zastosowanie substancji, o których wiadomo, że mają właściwości od słabej do miarkowanej sensybilizacji skóry.

We właściwie przeprowadzonym teście powinno się spodziewać reakcji co najmniej 30 % w teście ze środkiem wspomagającym i co najmniej 15 % w teście niewspomaganym dla słabych/umiarkowanych sensybilizatorów.

Preferowane są następujące substancje:

Numery CAS | Numery EINECS | Nazwy EINECS | Nazwy zwyczajowe |

101–86–0 | 202–983–3 | aldehyd α-heksylocynamonowy | aldehyd α-heksylocynamonowy |

149–30–4 | 205–736–8 | benzotiazolo-2-tiol (2-merkapto-benzotiazol) | kaptaks |

94–07–7 | 202–303–5 | anestezyna | nordcaine |

Mogą istnieć sytuacje, w których, biorąc pod uwagę zadowalające uzasadnienie, mogą być stosowane inne substancje kontrolne spełniające powyższe kryteria.

1.4. Zasada metody badania

Zwierzęta badane są początkowo poddane działaniu substancji testowanej przez śródskórne iniekcje i/lub aplikowanie naskórkowe (ekspozycja indukcyjna). W następstwie 10 do 14-dniowego okresu odpoczynku (okres indukcji), podczas którego może się rozwinąć reakcja odpornościowa, zwierzęta są poddane działaniu dawki prowokacyjnej. Rozmiar i stopień reakcji skórnej na ekspozycję prowokacyjną u zwierząt badanych jest porównywany ze wykazywanym przez zwierzęta kontrolne, które są poddawane pozorowanej terapii podczas indukcji i ulegają ekspozycji prowokacyjnej.

1.5. Opis metod badania

Jeżeli uważa się za konieczne usunięcie substancji testowanej, powinno ono być dokonane przy użyciu wody lub odpowiedniego rozpuszczalnika, bez zmiany istniejącej reakcji lub integralności naskórka.

1.5.1. Test maksymalizacyjny świnki morskiej (GPMT)

1.5.1.1. Przygotowania

Zdrowe, młode, dorosłe, albinotyczne osobniki świnki morskiej są aklimatyzowane do warunków laboratoryjnych przez co najmniej 5 dni przed rozpoczęciem testu. Przed testem, zwierzęta są losowo przydzielane do grup. Sierść jest usuwana przez strzyżenie, golenie lub możliwie przez chemiczną depilację, zależnie od stosowanej metody badania. Przedmiotem troski powinno być unikanie otarcia skóry. Zwierzęta są ważone przed rozpoczęciem i na końcu testu.

1.5.1.2. Warunki testu

1.5.1.2.1. Zwierzęta badane

Wykorzystywane są powszechnie używane laboratoryjne rasy albinotyczne świnek morskich.

1.5.1.2.2. Liczba i płeć

Samce i/lub samice zwierząt mogą być wykorzystane. Jeżeli wykorzystane są samice, powinny one być nieciężarne i takie, które nie rodziły.

W grupie badanej jest wykorzystane co najmniej 10 zwierząt i co najmniej 5 zwierząt w grupie kontrolnej. Jeżeli użyto mniej niż 20 badanych i 10 kontrolnych świnek morskich, i nie jest możliwy wniosek, że testowana substancja jest sensybilizatorem, zdecydowanie zalecane jest badanie dodatkowych zwierząt, aby otrzymać w sumie co najmniej 20 badanych i 10 kontrolnych zwierząt.

1.5.1.2.3. Poziomy dawki

Stężenie substancji testowanej stosowane przy każdej ekspozycji indukcyjnej powinno być systematycznie dobrze tolerowane i powinno być najwyższe, powodujące od słabego do umiarkowanego podrażnienia skóry. Stężenie stosowane przy ekspozycji prowokacyjnej powinno być najwyższą dawką niedrażniącą. Jeżeli konieczne, właściwe stężenia mogą być określone na podstawie badania pilotażowego wykorzystującego dwa lub trzy zwierzęta. W tym celu powinno być rozważone wykorzystanie zwierząt poddanych działaniu FCA.

1.5.1.3. Procedura

1.5.1.3.1. Indukcja

Dzień 0-grupa badana

Trzy pary śródskórnych iniekcji o objętości 0,1 ml są podawane w okolicę barku, która jest oczyszczona z sierści tak, aby iniekcje każdej pary leżały po obu stronach linii środkowej.

Iniekcja 1: mieszanina 1:1 (objętościowo) FCA/woda lub fizjologiczny roztwór soli

Iniekcja 2: substancja testowana w odpowiednim nośniku w wybranym stężeniu

Iniekcja 3: substancja testowana przygotowana w wybranym stężeniu w mieszaninie 1:1 (objętościowo) FCA/woda lub fizjologicznym roztworze soli

W iniekcji 3 substancje rozpuszczalne w wodzie są rozpuszczane w fazie wodnej przed zmieszaniem z FCA. Przygotowuje się zawiesinę w FCA substancji rozpuszczalnych w tłuszczach i nierozpuszczalnych przed połączeniem z fazą wodną. Końcowe stężenie substancji testowanej musi być równe stężeniu użytemu w iniekcji 2.

Iniekcje 1 i 2 są podawane blisko siebie i najbliżej głowy, podczas gdy 3 jest podawana w kierunku części ogonowej powierzchni badanej.

Dzień 0-grupa kontrolna

Trzy pary śródskórnych iniekcji o objętości 0,1 ml są podawane w te same miejsca, co u zwierząt badanych.

Iniekcja 1: mieszanina 1:1 (objętościowo) FCA/woda lub fizjologiczny roztwór soli

Iniekcja 2: nierozcieńczony nośnik

Iniekcja 3: Preparat nośnika o stężeniu wagowym 50 % w mieszaninie 1:1(objętościowo) FCA/woda lub fizjologicznym roztworze soli.

Dzień 5-7 - grupy badana i kontrolna

Na około dwadzieścia cztery godziny przed zastosowaniem miejscowej indukcji, jeżeli substancja nie jest środkiem drażniącym skórę, badana powierzchnia, po dokładnym strzyżeniu i/lub goleniu, jest poddawana działaniu 0,5 ml laurylosiarczanu(VI) sodu w wazelinie o stężeniu10 %, w celu wywołania miejscowego podrażnienia.

Dzień 6–8 - grupa badana

Powierzchnia badana jest ponownie oczyszczana z sierści. Bibuła filtracyjna (2 × 4 cm) jest dokładnie pokrywana substancją testowaną w odpowiednim nośniku oraz nakładana na powierzchnię badaną i utrzymywana w kontakcie za pomocą szczelnego opatrunku przez 48 godzin. Wybór nośnika powinien być uzasadniony. Substancje stałe są drobno rozcierane i łączone z odpowiednim nośnikiem. Ciecze mogą być stosowane bez rozcieńczania, jeżeli właściwe.

Dzień 6–8 - grupa kontrolna

Powierzchnia badana jest ponownie oczyszczana z sierści. Nakładany jest tylko nośnik, w podobny sposób na powierzchnię badaną i utrzymywany w kontakcie za pomocą szczelnego opatrunku przez 48 godzin.

1.5.1.3.2. Prowokacja

Dzień 20–22 - grupy: badana i kontrolna

Boki badanych i kontrolnych zwierząt są oczyszczane z sierści. Łata lub komora wypełniona substancją testowaną jest nakładana na jeden bok zwierząt oraz, w odpowiednim przypadku, łata lub komora wypełniona tylko nośnikiem może być nałożona na drugi bok. Łaty są utrzymywane w kontakcie za pomocą szczelnego opatrunku przez 48 godzin.

1.5.1.3.3. Obserwacja i klasyfikacja: grupy: badana i kontrolna

- około 21 godzin po usunięciu łaty powierzchnia prowokacji jest czyszczona i dokładnie strzyżona i/lub golona i, jeżeli to konieczne, depilowana;

- około 3 godzin później (w przybliżeniu 48 godzin od początku stosowania prowokacji) reakcja skóry jest obserwowana i odnotowywana zgodnie z klasami wskazanymi w dodatku;

- około 24 godziny po tej obserwacji przeprowadza się drugą obserwację (72 godziny) i ponownie odnotowuje.

Ślepy odczyt wyników badań zwierząt badanych i kontrolnych jest wskazany.

Jeżeli konieczne jest wyjaśnienie wyników otrzymanych w pierwszej prowokacji, powinna być rozważona druga prowokacja (tj. powtórna prowokacja), gdzie właściwe z nową grupą kontrolną, w przybliżeniu jeden tydzień po pierwszej. Powtórna prowokacja może być również przeprowadzona na pierwotnej grupie kontrolnej.

Wszystkie reakcje skórne i jakiekolwiek niezwykłe wyniki badań, w tym reakcje ogólnoustrojowe, wynikające z procedur indukcji i prowokacji powinny być obserwowane i odnotowywane zgodnie ze skalą klasyfikacyjną Magnusson/Kligman (patrz dodatek). W celu wyjaśnienia wątpliwych reakcji mogą być przeprowadzone inne procedury, np. badanie histopatologiczne, pomiar grubości fałdy skórnej.

1.5.2. Test Buehlera

1.5.2.1. Przygotowania

Zdrowe, młode, dorosłe, albinotyczne osobniki świnki morskiej są aklimatyzowane do warunków laboratoryjnych przez co najmniej 5 dni przed rozpoczęciem testu. Przed testem, zwierzęta są losowo przydzielane do grup. Sierść jest usuwana przez strzyżenie, golenie lub możliwie przez chemiczną depilację, zależnie od stosowanej metody badania. Należy uważać, aby uniknąć otarcia skóry. Zwierzęta są ważone przed rozpoczęciem i na końcu testu.

1.5.2.2. Warunki testu

1.5.2.2.1. Zwierzęta badane

Wykorzystywane są powszechnie używane laboratoryjne rasy albinotyczne świnek morskich.

1.5.2.2.2. Liczba i płeć

Mogą być wykorzystane samce i/lub samice zwierząt. Jeżeli wykorzystane są samice, powinny one być nieciężarne i takie, które nie rodziły.

W grupie badanej jest wykorzystanych co najmniej 20 zwierząt i co najmniej 5 zwierząt w grupie kontrolnej.

1.5.2.2.3. Poziomy dawki

Stężenie substancji testowanej stosowane przy każdej ekspozycji indukcyjnej powinno być możliwie najwyższe, by spowodować słabe, ale nie nadmierne podrażnienie. Stężenie stosowane przy ekspozycji prowokacyjnej powinno być najwyższą dawką niedrażniącą. Jeżeli konieczne, właściwe stężenia mogą być wyznaczone na podstawie badania pilotażowego wykorzystującego dwa lub trzy zwierzęta.

W przypadku materiałów testowanych rozpuszczalnych w wodzie, właściwe jest stosowanie jako nośnika wody lub rozcieńczonego niedrażniącego roztworu środka powierzchniowo czynnego. W przypadku innych materiałów testowanych 80 % roztwór etanol/woda jest preferowany dla indukcji i aceton dla prowokacji.

1.5.2.3. Procedura

1.5.2.3.1. Indukcja

Dzień 0 - grupa badana

Jeden bok jest oczyszczany z sierści (dokładne strzyżenie). System łat powinien być całkowicie wypełniony substancją testowaną w odpowiednim nośniku (wybór nośnika powinien być uzasadniony; ciekłe substancje testowane mogą być stosowane bez rozcieńczania, jeżeli właściwe).

System łat jest nakładany na powierzchnię testowaną i utrzymywany w kontakcie ze skórą za pomocą szczelnej łaty lub komory i odpowiedniego opatrunku przez 6 godzin.

System łat musi być szczelny. Odpowiedni jest bawełniany tampon, który może być okrągły lub kwadratowy, o przybliżonej powierzchni 4–6 cm2. W celu zapewnienia szczelności, preferowane jest unieruchomienie badanego osobnika przy użyciu odpowiedniego elementu unieruchamiającego. Jeżeli zastosowane jest owijanie, mogą być potrzebne dodatkowe ekspozycje.

Dzień 0 - grupa kontrolna

Jeden bok jest oczyszczany z sierści (dokładne strzyżenie). Nakładany jest tylko nośnik, w sposób podobny do stosowanego w doniesieniu do grupy badanej. System łat jest utrzymywany w kontakcie ze skórą za pomocą szczelnej łaty lub komory i odpowiedniego opatrunku przez 6 godzin. Jeżeli można wykazać, że nie jest konieczna symulowana grupa kontrolna, można się posłużyć naturalną grupą kontrolną.

Dzień 6–8 i 13–15 - grupy: badana i kontrolna

Przeprowadza się takie samo aplikowanie jak w dniu 0, na tę samą powierzchnię badaną (oczyszczenie z sierści w razie konieczności) tego samego boku, w dniu 6–8 i ponownie w dniu 13–15.

1.5.2.3.2. Prowokacja

Dzień 27–29 - grupy: badana i kontrolna

Bok zwierząt badanych i kontrolnych, który nie był wykorzystywany do badania, jest oczyszczany z sierści (dokładne strzyżenie). Na zadnią część nieużywanego boku zwierząt badanych i kontrolnych nakładana jest łata lub komora, zawierająca odpowiednią ilość substancji testowanej w maksymalnym, niedrażniącym stężeniu.

Jeżeli ma to znaczenie, szczelna łata lub komora tylko z nośnikiem jest również nakładana na przednią część nieużywanego boku zarówno badanych, jak i kontrolnych zwierząt. Łaty i komory są utrzymywane w kontakcie ze skórą za pomocą odpowiedniego opatrunku przez 6 godzin.

1.5.2.3.3. Obserwacja i klasyfikacja

- około 21 godzin po usunięciu łaty powierzchnia prowokowana jest oczyszczana z sierści;

- około 3 godziny później (w przybliżeniu 30 godzin po przyłożeniu łaty prowokującej) reakcje skórne są obserwowane i odnotowywane zgodnie z klasami wskazanymi w dodatku;

- około 24 godziny później po 30-godzinnej obserwacji (w przybliżeniu 54 godziny po przyłożeniu łaty prowokującej) reakcje skórne są ponownie obserwowane i odnotowywane.

Ślepy odczyt zwierząt badanych i kontrolnych jest wskazany.

Jeżeli konieczne jest wyjaśnienie wyników otrzymanych z pierwszej prowokacji, powinna być rozważona druga prowokacja (tj. powtórna prowokacja), gdzie właściwe, z nową grupą kontrolną, w przybliżeniu jeden tydzień po pierwszej. Powtórna prowokacja może być również przeprowadzona na pierwotnej grupie kontrolnej.

Wszystkie reakcje skórne i jakiekolwiek nietypowe wyniki badań, w tym reakcje ogólnoustrojowe, wynikające z procedur indukcji i prowokacji powinny być zaobserwowane i odnotowywane zgodnie ze skalą klasyfikacyjną Magnusson/Kligman (Patrz dodatek). W celu wyjaśnienia wątpliwych reakcji mogą być przeprowadzone inne procedury, np. badanie histopatologiczne, pomiar grubości fałdy skórnej.

2. DANE (GPMT I BUEHLER)

Dane powinny być podsumowane w formie tabeli, przedstawiając reakcje skórne każdego zwierzęcia podczas każdej obserwacji.

3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA (GPMT AND BUEHLER)

Jeżeli jest wykonana próba sortująca przed testem świnki morskiej, muszą być podane opis i odniesienie do testu (np. miejscowa próba węzła chłonnego (LLNA), test obrzęku ucha myszy (MEST)), w tym szczegóły procedury, wraz z wynikami testu, oraz wynikami zastosowania substancji odniesienia.

Sprawozdanie z testu (GMPT i test Buehlera)

Sprawozdanie z testu obejmuje, jeżeli możliwe, następujące informacje:

Zwierzęta badane:

- wykorzystana rasa świnki morskiej;

- liczba, wiek i płeć zwierząt;

- źródło, warunki, w których przebywają zwierzęta, dieta itp.,

- indywidualna waga zwierząt na początku testu.

Warunki testu:

- technika przygotowania miejsca przyłożenia łaty;

- szczegóły dotyczące materiału łaty i techniki jej przykładania;

- wynik badania pilotażowego z wnioskiem, dotyczącym stężeń indukcyjnych I prowokacyjnych, które mają być zastosowane w teście;

- szczegóły dotyczące przygotowania, aplikowania i usuwania substancji testowanej;

- uzasadnienie wyboru nośnika;

- stężenia nośnika i substancji testowanej zastosowane w ekspozycji indukcyjnej i prowokacyjnej oraz całkowita ilość substancji użytej do indukcji i prowokacji.

Wyniki:

- podsumowanie wyników ostatniej kontroli czułości i niezawodności (patrz 1.3) wraz z informacją dotyczącą stosowanej substancji, stężenia i nośnika;

- dotyczące każdego zwierzęcia wraz z systemem klasyfikacji;

- opisowa relacja dotycząca natury i zakresu obserwowanych skutków;

- wszelkie wyniki histopatologiczne.

Rozpatrzenie wyników.

Wnioski.

4. BIBLIOGRAFIA

Niniejsza metoda jest analogiczna do OECD TG 423.

Dodatek

TABELA:

Skala klasyfikacji Magnusson/Kligman do oceny szkodliwych reakcji na łatę prowokacyjną

0 = | brak widocznych zmian |

1 = | odosobniony lub niejednolity rumień |

2 = | umiarkowany i zlewający się rumień |

3 = | silny rumień i obrzęk |

"

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK IV D

B.7 DAWKA WIELOKROTNA (28 DNI) TOKSYCZNOŚĆ (DOUSTNA)

1. METODA

1.1. Wprowadzenie

Patrz: Wprowadzenie ogólne w części B.

1.2. Definicje

Patrz: Wprowadzenie ogólne w części B.

1.3. Zasada metody badania

Substancja testowana jest podawana kilku grupom zwierząt doświadczalnych doustnie, codziennie, w stopniowanych dawkach, jeden poziom dawki na grupę przez okres 28 dni. Podczas okresu dawkowania każdego dnia zwierzęta są dokładnie obserwowane w celu wykrycia oznak toksyczności. Zwierzęta, które zdychają lub są zabijane podczas testu poddaje się sekcji zwłok, a na zakończenie testu zwierzęta, które przeżyły, są zabijane i poddawane sekcji zwłok.

Niniejsza metoda kładzie większy nacisk na objawy neurologiczne jako określony punkt końcowy, i podkreślana jest konieczność uważnych obserwacji klinicznych zwierząt, w celu otrzymania możliwie najwięcej informacji. Metoda ta powinna identyfikować związki chemiczne o potencjale neurotoksycznym, co może dawać podstawy do dalszego dogłębnego badania tego aspektu. Dodatkowo, metoda może wykazywać skutki immunologiczne i toksyczność organów rozrodczych.

1.4. Opis metody badania

1.4.1. Przygotowania

Zdrowe, młode, dorosłe zwierzęta są losowo przydzielane do grupy kontrolnej i badanej. Klatki powinny być ustawione w taki sposób, żeby zminimalizować możliwy wpływ położenia klatki. Zwierzęta są identyfikowane jednoznacznie i przetrzymywane w klatkach przez co najmniej pięć dni przed rozpoczęciem badania, żeby umożliwić aklimatyzację do warunków laboratoryjnych.

Substancja testowana jest podawana bezpośrednio do żołądka, w pożywieniu lub w wodzie pitnej. Metoda aplikowania zależy od celu badania, i właściwości fizycznych/chemicznych substancji.

W przypadku gdy to konieczne, substancja testowana jest rozpuszczona lub ma postać zawiesiny w odpowiednim nośniku. Zaleca się, aby jeżeli możliwe, najpierw było rozważone użycie wodnego roztworu/zawiesiny, następnie roztworu/emulsji w oleju (np. olej kukurydziany) i potem możliwy roztwór w innym nośnikach. W przypadku nośników innych niż woda musi być znana charakterystyka toksyczna nośnika. Powinna być określona trwałość testowanej substancji w nośniku.

1.4.2. Warunki badania

1.4.2.1. Zwierzęta badane

Preferowanym gatunkiem gryzonia jest szczur, chociaż inne gatunki gryzoni mogą być wykorzystane. Powinny być wykorzystywane powszechnie używane laboratoryjne rasy młodych, zdrowych, dorosłych zwierząt. Samice powinny być nieciężarne i takie, które nie rodziły.

Dawkowanie powinno się rozpocząć jak najszybciej po odsadzeniu od matki, a w każdym przypadku przed ukończeniem dziewięciu tygodni.

Na początku badania wahania wagi zwierząt powinny być minimalne i nie przekraczać ± 20 % średniej wagi dla każdej płci. W przypadku gdy badanie wielokrotnej dawki doustnej jest przeprowadzane jako badanie wstępne do badania długoterminowego, preferowane do obu badań są zwierzęta tej samej rasy i z tego samego źródła.

1.4.2.2. Liczba i płeć

Co najmniej 10 zwierząt (pięć samic i pięć samców) powinno być użytych dla każdego poziomu dawki. Jeżeli planowane jest uśmiercanie w międzyczasie, liczba powinna być powiększona o liczbę zwierząt, które według planu mają być zabite przed ukończeniem badania.

Dodatkowo, grupa satelicka 10 zwierząt (pięć zwierząt każdej płci) może być poddana działaniu wysokiego poziomu dawki przez 28 dni i obserwowana, przez 14 dni po dawkowaniu, pod kątem odwracalności, trwałości, i opóźnionego wystąpienia objawów zatrucia. Jest także stosowana grupa satelicka 10 zwierząt kontrolnych (pięć zwierząt każdej płci).

1.4.2.3. Poziomy dawki

Zasadniczo, powinny być wykorzystane co najmniej trzy grupy badane i grupa kontrolna. Z wyjątkiem zastosowania substancji testowanej, ze zwierzętami grupy kontrolnej powinno się obchodzić w sposób identyczny, jak z podmiotami grupy badanej. Jeżeli przy podawaniu substancji testowanej jest stosowany nośnik, grupa kontrolna powinna otrzymać największą użytą objętość nośnika.

Jeżeli z oceny innych danych należałoby oczekiwać braku objawów przy dawce 1000 mg/kg masy ciała/dzień, może być przeprowadzony test graniczny. Jeżeli nie są dostępne odpowiednie dane, może być wykonane badanie wyników zakresowych, pomagające określić dawki, które mają być użyte.

Poziomy dawki powinny być wybierane, biorąc pod uwagę jakiekolwiek istniejące dane o toksyczności i dane toksykokinetczne osiągalne dla substancji testowanej lub materiałów pokrewnych. Powinien zostać wybrany najwyższy poziom dawki, w celu wywołania objawów zatrucia, ale nie śmierci lub poważnego cierpienia. Od tego czasu malejąca sekwencja poziomów dawki powinna być dobierana w taki sposób, aby wykazać wszystkie reakcje powiązane z dawkowaniem i brak obserwowanych objawów niekorzystnych przy najmniejszym poziomie dawki (NOAEL). Dwie lub cztery ograniczone przerwy są często optymalne dla ustalenia malejących poziomów dawki i dodanie czwartej grupy badanej jest często bardziej pożądane niż stosowanie bardzo dużych przerw (np. współczynnik większy od 10) między dawkowaniem.

W przypadku substancji podawanych w pożywieniu lub wodzie pitnej ważne jest zapewnienie, aby wymagane ilości substancji testowanej nie kolidowały z prawidłową równowagą odżywiania lub wody. W przypadku gdy substancja testowana jest podawana w pożywieniu, może być stosowane stałe stężenie żywieniowe (ppm) albo stały poziom dawki odniesionej do masy ciała zwierząt; użyta opcja musi być wyszczególniona. W przypadku substancji podawanej bezpośrednio do żołądka, dawka powinna być podawana każdego dnia o podobnym czasie, i w razie konieczności modyfikowana, żeby utrzymać stały poziom dawki w odniesieniu do masy ciała zwierzęcia.

W przypadku gdy badanie wielokrotnej dawki jest przeprowadzane jako badanie wstępne do badania długoterminowego, w obu badaniach powinna być stosowana podobna dieta.

1.4.2.4. Test graniczny

Jeżeli test przy jednym poziomie dawki równym co najmniej 1000 mg/kg masy ciała/dzień, lub równoważny procent w pożywieniu lub wodzie pitnej (na podstawie ustalonej masy ciała), w przypadku podawania w pożywieniu lub wodzie pitnej, stosując procedury opisane dla tego badania, nie wywołuje widocznych objawów zatrucia i jeżeli nie należałoby spodziewać się toksyczności na podstawie danych, dotyczących substancji strukturalnie pokrewnych, wtedy pełne badanie przy użyciu trzech poziomów dawki może nie być konieczne. Niniejszy test graniczny ma zastosowanie, z wyłączeniem tych przypadków, w których ekspozycja ludzi wskazuje na konieczność użycia wyższego poziomu dawki.

1.4.2.5. Okres obserwacji

Okres obserwacji powinien wynosić 28 dni. Zwierzęta w grupie satelickiej wyznaczone do obserwacji uzupełniających powinny być przetrzymane przez co najmniej 14 dalszych dni bez terapii, w celu wykrycia opóźnionych objawów zatrucia, ich trwałości lub powrotu do zdrowia.

1.4.3. Procedura

Substancja testowana jest dawkowana zwierzętom codziennie przez siedem dni każdego tygodnia w okresie 28 dni; zastosowanie pięciodniowego tygodniowego reżimu dawkowania musi być uzasadnione. W przypadku gdy substancja testowana jest podawana bezpośrednio do żołądka, powinno to być zrobione w jednej dawce przy użyciu rurki lub odpowiedniej kaniuli dotchawicznej. Maksymalna objętość cieczy, która może być podana jednorazowo, zależy od rozmiarów badanego zwierzęcia. Objętość nie powinna przekraczać 1 ml/100 g masy ciała, oprócz roztworów wodnych, w przypadku których można użyć 2 ml/100 g masy ciała. Poza substancjami drażniącymi i korozyjnymi, które normalnie ujawniają zaostrzone objawy przy wyższych stężeniach, zmienność objętości w badaniu powinna być zminimalizowana przez dostosowanie stężenia, aby zapewnić stałą objętość przy wszystkich poziomach dawki.

1.4.3.1. Ogólne obserwacje

Ogólne obserwacje kliniczne powinny być przeprowadzane co najmniej raz dziennie, najlepiej każdego dnia w tym samym czasie, biorąc pod uwagę szczytowy okres przewidywanych objawów po dawkowaniu. Stan zdrowia zwierząt powinien być odnotowywany. Co najmniej dwa razy dziennie, wszystkie zwierzęta są obserwowane pod kątem zachorowalności i śmiertelności. Zwierzęta konające oraz zwierzęta przejawiające ostre cierpienie i ból powinny być usuwane, gdy zostanie to zauważone, humanitarnie zabite i poddane sekcji zwłok.

Jeden raz przed pierwszą ekspozycją (aby uwzględnić porównanie w obrębie podmiotów), i od tego czasu co najmniej raz w tygodniu, powinny być przeprowadzane szczegółowe obserwacje kliniczne wszystkich zwierząt. Obserwacje te powinny być przeprowadzane na zewnątrz klatki macierzystej na znormalizowanej powierzchni i najlepiej za każdym razem w tym samym czasie. Powinny one być starannie odnotowywane, najlepiej przy użyciu systemów zapisywania, wyraźnie zdefiniowanych przez laboratorium testujące. Powinny być podjęte wysiłki, aby zagwarantować, że zmiany warunków badania są minimalne i, że obserwacje są przeprowadzane najlepiej przez obserwatorów nieświadomych terapii. Zanotowane oznaki powinny obejmować, ale nie powinny być do nich ograniczone, zmiany w skórze, futrze, oczach, błonach śluzowych, wystąpienie wydzielin i wydalin aktywności wegetatywnej (np. łzawienie, podniesienie sierści, rozmiar źrenicy, niezwykła forma oddychania). Powinny być także odnotowywane zmiany w sposobie chodzenia, postawie, i reakcji na dotyk jak również obecność ruchów drgawkowych lub kurczowych, stereotypów (np. nadmierne czyszczenie się, powtarzające się krążenie w kółko) oraz dziwne zachowanie (np. samookaleczanie, chodzenie do tyłu).

W czwartym tygodniu ekspozycji powinna być przeprowadzona ocena reaktywności sensorycznej na różnego typu bodźce (np. bodźce słuchowe, wzrokowe i proprioreceptoryczne), ocena siły uchwytu i aktywności motorycznej. Dalsze szczegóły procedur, które mogłyby być zastosowane, są podane w literaturze (patrz Wprowadzenie ogólne w część B).

Obserwacje funkcjonalne przeprowadzane w czwartym tygodniu ekspozycji mogą być pominięte, gdy badanie prowadzone jest jako badanie wstępne do późniejszego badania (90-dniowego) podchronicznego. W takim przypadku obserwacje funkcjonalne powinny być zawarte w tym uzupełniającym badaniu. Z drugiej strony, dostępność danych dotyczących obserwacji funkcjonalnych z badania wielokrotnej dawki może poprawić możliwość wyboru poziomów dawki do celów późniejszego badania podchronicznego.

Wyjątkowo, obserwacje funkcjonalne mogą być pominięte w przypadku grup, które w przeciwnym przypadku ujawniają oznaki zatrucia w stopniu, który mógłby znacząco kolidować z wykonaniem testu funkcjonalnego.

1.4.3.2. Masa ciała i spożycie żywności/wody

Wszystkie zwierzęta powinny być ważone co najmniej raz w tygodniu. Pomiary spożycia żywności i wody powinny być wykonywane co najmniej raz na tydzień. Jeżeli substancja testowana podawana jest z wodą pitną, spożycie wody powinno być również mierzone co najmniej raz na tydzień.

1.4.3.3. Hematologia

Na końcu okresu badania powinny być przeprowadzone następujące analizy hematologiczne: hematokryt, stężenie hemoglobiny, liczba erytrocytów, całkowita i różnicowa liczba leukocytów, liczba płytek krwi i pomiar krzepliwości krwi czas/potencjał.

Próbki krwi powinny być pobierane z wyznaczonego miejsca tuż przed lub jako część procedury zabijania zwierząt, i przechowywane w odpowiednich warunkach.

1.4.3.4. Biochemia kliniczna

Oznaczenia biochemii klinicznej w celu zbadania znaczących skutków toksycznych w tkankach a ściśle, skutków w nerkach i wątrobie, powinny być wykonane na otrzymanych próbkach krwi wszystkich zwierząt tuż przed lub jako część procedury zabijania zwierząt (z wyjątkiem tych, które znaleziono konające i/lub zabite w międzyczasie). Zalecane jest wstrzymanie podawania pożywienia dla zwierząt przez noc poprzedzającą pobranie krwi W przypadku kilku pomiarów w osoczu i surowicy, zwłaszcza glukozy, pożądane byłoby wstrzymanie podawania pożywienia przez całą noc. Głównym powodem takich preferencji jest fakt, że zwiększona zmienność, która nieuchronnie wynikałaby z podawania pożywienia, przyczyniałaby się do maskowania bardziej subtelnych skutków i utrudniałaby interpretację. Z drugiej strony, jednakże wstrzymanie podawania pożywienia przez całą noc może szkodzić ogólnemu metabolizmowi zwierząt i, szczególnie w badaniach żywieniowych, może naruszać dzienną ekspozycję na substancję testowaną. Jeżeli przyjęte jest wstrzymanie podawania pożywienia przez całą noc, biochemiczne oznaczenia kliniczne powinny być wykonane po przeprowadzeniu obserwacji funkcjonalnych w czwartym tygodniu badania.. Badania osocza i surowicy muszą obejmować sód, potas, glukozę, całkowity cholesterol, mocznik, kreatyninę, całkowite białko i albuminę, co najmniej dwa enzymy wskazujące na skutki komórkowe w wątrobie (takie jak aminotransferaza alaninowa, aminotransferaza asparaginowa, alkaliczna fosfataza, transpeptydaza gamma-glutamylowa, i dehydrogenaza sorbitowa). Pomiary dodatkowych enzymów (wątrobowego lub innego pochodzenia) i kwasów żółciowych mogą dostarczyć przydatnych informacji w danych okolicznościach.

Fakultatywnie, stosując czasowe objętościowe zbieranie moczu podczas ostatniego tygodnia badań, mogłyby być wykonane następujące oznaczenia analizy moczu: wygląd, objętość, osmolarność i ciężar właściwy, pH, białko, glukoza i krew/komórki krwi.

Dodatkowo, powinno być rozważone badanie markerów surowicy dotyczących ogólnego uszkodzenia tkanki. Inne oznaczenia, które powinny być przeprowadzone, jeżeli znane właściwości substancji testowanej mogą lub podejrzewa się, że mogą wpływać na pokrewne profile metaboliczne, obejmują wapń, fosforan, triglicerydy po poście, hormony specyficzne, metahemoglobinę i cholinoesterazę. Powyższe musi zostać rozpoznane w odniesieniu do substancji w niektórych klasach lub na zasadzie analizy przypadku.

Ogólnie, istnieje konieczność elastycznego podejścia, zależnie od gatunku i obserwowanych i/lub spodziewanych skutków danej substancji.

Jeżeli dane poziomu tolerancji z przeszłości są niedostateczne, powinno się rozważyć oznaczenie zmiennych hematologicznych i biochemii klinicznej zanim rozpocznie się dawkowanie.

1.4.3.5. Sekcja zwłok

Wszystkie zwierzęta uczestniczące w badaniu muszą być poddane pełnej, szczegółowej sekcji zwłok, która obejmuje staranne badanie zewnętrznych powierzchni ciała, wszystkich otworów, i jam czaszkowych, piersiowych i brzusznych oraz ich zawartości. Wątroba, nerki, nadnercza, jądra, gruczoły opuszkowo - cewkowe, grasica, śledziona, mózg i serce wszystkich zwierząt powinny być właściwie oczyszczone z jakiejkolwiek przylegającej tkanki i zważone mokre, jak najszybciej po przeprowadzeniu sekcji, aby uniknąć wysuszenia.

Następujące tkanki powinny być zakonserwowane w utrwalającym ośrodku najbardziej odpowiednim zarówno dla typu tkanki, jak i zamierzonego późniejszego badania histopatologicznego: wszystkie duże zmiany patologiczne, mózg (reprezentatywne rejony w tym mózg, móżdżek i pons), rdzeń kręgowy, żołądek, jelito cienkie i grube (w tym kępki Peyera), wątroba, nerki, nadnercza, śledziona, serce, grasica, tarczyca, tchawica i płuca (zakonserwowane przez napełnienie środkiem utrwalającym i następnie zanurzenie), gruczoły płciowe, pomocnicze narządy płciowe (np. macica, prostata), pęcherz moczowy, węzły chłonne (najlepiej jeden węzeł chłonny obejmujący drogę podawania i inny węzeł odległy od drogi podawania, aby uwzględnić skutki ogólnoustrojowe), nerw obwodowy (kulszowy lub piszczelowy) najlepiej w bliskiej odległości od mięśnia, i część szpiku kostnego (lub, ewentualnie, świeżo pobrana mała objętość szpiku kostnego). Wyniki badań klinicznych i innych mogą wskazywać na konieczność zbadania dodatkowych tkanek. Powinny również zostać zakonserwowane inne narządy, na które może być skierowane działanie substancji testowanej, opierając się na jej znanych właściwościach.

1.4.3.6. Badanie histopatologiczne

Pełne badanie histopatologiczne powinno być przeprowadzone na zakonserwowanych narządach i tkankach wszystkich zwierząt z grupy kontrolnej i grupy wysokiej dawki. Badania te powinny być rozszerzone na zwierzęta z grup wszystkich innych dawek, jeżeli w grupie wysokiej dawki obserwowane są zmiany związane z działaniami badawczymi.

Wszystkie duże zmiany patologiczne muszą być zbadane.

W przypadku gdy stosowana jest grupa satelicka, badania histopatologiczne powinny być przeprowadzone na tkankach i narządach rozpoznanych jako wykazujące skutki w grupach badanych.

2. DANE

Powinny zostać dostarczone dane indywidualne zwierząt. Dodatkowo, wszystkie dane powinny być podsumowane w formie tabeli, przedstawiając dla każdej grupy badanej liczbę zwierząt na początku testu, liczbę zwierząt, które znaleziono martwe podczas testu lub zabito z powodów humanitarnych i czas każdej śmierci lub humanitarnego zabicia, liczbę zwierząt wykazujących oznaki toksyczności, opis obserwowanych oznak zatrucia, w tym czas rozpoczęcia, okres trwania, ostrość wszystkich objawów zatrucia, liczbę zwierząt wykazujących zmiany patologiczne, typ tych zmian i procent zwierząt przejawiających każdy typ zmian patologicznych.

W przypadkach gdy jest to możliwe, wyniki liczbowe powinny być ocenione za pomocą odpowiedniej i ogólnie akceptowanej metody statystycznej. Metody statystyczne powinny być wybrane podczas planowania badania.

3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA

Sprawozdanie z testu

Sprawozdanie z testu obejmuje, jeżeli możliwe, następujące informacje:

Zwierzęta badane:

- wykorzystany gatunek/rasa;

- liczba, wiek i płeć zwierząt;

- źródło, warunki przebywania zwierząt, dieta itp.;

- indywidualna waga zwierząt na początku testu, od tego czasu w tygodniowych odstępach i na końcu testu.

Warunki testu:

- uzasadnienie wyboru nośnika, jeżeli jest inny niż woda;

- racjonalna podstawa wyboru poziomu dawki;

- szczegóły dotyczące przygotowania formy użytkowej substancji testowanej/żywności, osiąganego stężenia, trwałości i homogeniczności preparatu;

- szczegóły podawania substancji testowanej;

- jeżeli ma zastosowanie, przeliczenie stężenia substancji testowanej w żywności/wodzie pitnej (ppm) na rzeczywistą dawkę (mg/kg masy ciała/dzień);

- szczegóły jakości pożywienia i wody

Wyniki:

- masa ciała/zmiany masy ciała;

- spożycie żywności, i spożycie wody, w odpowiednich przypadkach;

- dane, dotyczące reakcji toksycznej według płci i poziomu dawki, w tym oznaki toksyczności;

- natura, ostrość i czas trwania obserwacji klinicznych (czy odwracalne czy nie);

- ocena aktywności sensorycznej, siły uchwytu i aktywności motorycznej;

- testy hematologiczne z odpowiednimi wartościami poziomu tolerancji;

- kliniczne testy biochemiczne z odpowiednimi wartościami poziomu tolerancji;

- masa ciała w chwili zabicia i dane o masie narządów;

- wyniki sekcji zwłok;

- szczegółowy opis wszystkich wyników histopatologicznych

- dane absorpcji, jeżeli dostępne;

- statystyczna obróbka wyników, gdzie właściwe.

Rozpatrzenie wyników.

Wnioski.

4. BIBLIOGRAFIA

Niniejsza metoda jest analogiczna do OECD TG 407.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK IV E

"

B.37 OPÓŹNIONA NEUROTOKSYCZNOŚĆ SUBSTANCJI FOSFOROORGANICZNYCH PO DUŻEJ EKSPOZYCJI

1. METODA

1.1. Wprowadzenie

Przy ocenie i oszacowaniu skutków toksycznych substancji ważne jest rozważenie potencjału niektórych klas substancji do wywoływania określonych typów neurotoksyczności, które mogą nie być wykryte w innych badaniach toksyczności. Zaobserwowano, że niektóre substancje fosforoorganiczne powodują opóźnioną neurotoksyczność i powinny być wzięte pod uwagę jako związki, które mogą być zaliczone do oszacowania.

Testy sortujące in vitro mogłyby być zastosowane, aby rozpoznać te substancje, które mogą powodować opóźnioną polineuropatię; jednakże negatywne wyniki badań in vitro nie są dowodem, że substancja testowana nie jest substancją neurotoksyczną.

Patrz: także Wprowadzenie ogólne w części B.

1.2. Definicje

Substancje fosforoorganiczne obejmują nienaładowane estry fosforoorganiczne, tioestry i bezwodniki pochodnych organicznych kwasu fosforowego(V), kwasu fosfonowego i kwasów fosforoamidowych i ich tio-pochodnych lub inne substancje, które mogą wywoływać opóźnioną neurotoksyczność obserwowaną czasami w tej klasie substancji.

Opóźniona neurotoksyczność jest objawem powiązanym z przedłużonym zwłocznym początkiem ataksji, obwodową aksonopatią w rdzeniu kręgowym i nerwach obwodowych, i zahamowaniem i starzeniem esterazy wywołującej neuropatię (NTE) w obojętnej tkance.

1.3. Substancje odniesienia

Substancja odniesienia może być testowana na pozytywnej grupie kontrolnej jako środek w celu wykazania, że w warunkach testu laboratoryjnego, reakcja badanego gatunku nie zmieniła się znacząco.

Przykładem szeroko stosowanego środka neurotoksycznego jest ortofosforan(V) tritoilu (CAS 78–30–8, EINECS 201–103–5, nomenklatura CAS: kwas ortofosforowy(V), ester tris(2-metylofenylowy), znany jako fosforan trikrezylu.

1.4. Zasada metody badania

Substancja testowana jest podawana doustnie w pojedynczej dawce kurom domowym, które zostały zabezpieczone przed ostrymi skutkami cholinergicznymi, gdzie właściwe. Zwierzęta są obserwowane przez 21 dni pod kątem anomalii behawioralnych, ataksji, i paraliżu. Pomiary biochemiczne, w szczególności zahamowanie esterazy wywołującej neuropatię (NTE), przeprowadza się na kurach losowo wybranych z każdej grupy, prawidłowo 24 i 48 godzin po dawkowaniu. Dwadzieścia jeden dni po ekspozycji, pozostałe kury są zabijane i przeprowadzane jest badanie histopatologiczne wybranych obojętnych tkanek.

1.5. Opis metody badania

1.5.1. Przygotowania

Zdrowe, młode, dorosłe kury, wolne od kolidujących chorób wirusowych i leków oraz bez nieprawidłowości w sposobie chodzenia, powinny być losowo przydzielane do grupy badanej i kontrolnej oraz aklimatyzowane do warunków laboratoryjnych przez co najmniej 5 dni przed rozpoczęciem badania.

Powinno się stosować klatki i zagrody wystarczająco obszerne, aby umożliwić swobodne poruszanie się kur i niezakłóconą obserwację sposobu chodzenia.

Dawkowanie substancji testowanej powinno prawidłowo przebiegać drogą doustną, stosując aplikowanie bezpośrednio do żołądka, w kapsułkach żelatynowych lub metodą porównywalną. Ciecze powinny być podawane nierozcieńczone lub rozpuszczone w odpowiednim nośniku, takim jak olej kukurydziany; substancje stałe powinny być, w miarę możliwości, rozpuszczone, ponieważ duże dawki substancji stałych w żelatynie mogą nie być absorbowane wydajnie. W przypadku nośników niewodnych, powinna być znana charakterystyka toksyczna nośnika, a jeżeli nie jest znana, powinna być określona przed testem.

1.5.2. Warunki testu

1.5.2.1. Zwierzęta badane

Zalecana jest młoda, dorosła, kura domowa nioska (Gallus gallus domesticus), w wieku od 8 do 12 miesięcy. Powinny być wykorzystane odmiany i rasy standardowej wielkości, które prawidłowo powinny być wcześniej hodowane w warunkach umożliwiających swobodne poruszanie się.

1.5.2.2. Liczba i płeć

Oprócz grupy badanej powinna być stosowana zarówno grupa kontrolna nośnika, jak i pozytywna grupa kontrolna. Grupa kontrolna nośnika powinna być traktowana w sposób identyczny, jak grupa badana z wyjątkiem tego, że podawanie substancji testowanej jest pominięte.

W każdej grupie ptaków należy wykorzystać wystarczającą liczbę kur tak, aby co najmniej sześć ptaków można było zabić do celów oznaczenia biochemicznego (trzy w każdym z dwóch punktów czasowych) i sześć mogło przeżyć okres 21-dniowej obserwacji do celów patologii.

Pozytywna grupa kontrolna może być poddawana badaniu w tym samym czasie lub tez może ona być ostatnią grupą kontrolną w historii badania. Powinna składać się z co najmniej sześciu kur, poddawanych działaniu znanego opóźnionego środka neurotoksycznego, trzy kury przeznaczone są do celów biochemii i trzy do celów patologii. Zalecane jest okresowe uaktualnianie przeszłych danych. W przypadku gdy jakiś istotny element (np. rasa, żywienie, warunki przebywania) w przebiegu badania został zmieniony przez laboratorium wykonujące, należy uzyskać nowe pozytywne dane kontrolne.

1.5.2.3. Poziomy dawki

Aby oszacować poziom dawki, który ma być zastosowany w badaniu głównym, należy przeprowadzić badanie wstępne przy użyciu odpowiedniej liczby kur i grup poziomów dawki. Typowy i nieunikniony jest pewien poziom śmiertelności w badaniu wstępnym, w celu określenia właściwej dawki do badania głównego. Jednakże aby zapobiec śmierci z powodu ostrych skutków cholinergicznych może być użyta atropina lub inny środek ochronny, o którym wiadomo, że nie koliduje a opóźnionymi reakcjami neurotoksycznymi. Rozmaite metody badania mogą być stosowane w celu oszacowania maksymalnej, nie wywołującej śmierci dawki substancji testowanej (patrz metoda B.1bis). Poprzednie dane dotyczące kur lub inne dane toksykologiczne mogą być pomocne przy doborze dawki.

W głównym badaniu poziom dawki substancji testowanej powinien być możliwie najwyższy, biorąc pod uwagę wyniki wstępnego badania doboru dawki i górną dawkę graniczną wynoszącą 2000 mg/kg masy ciała. Jakakolwiek śmiertelność, która może wystąpić, nie powinna zakłócić przeżycia 21 dni przez wystarczającą liczbę zwierząt do celów biochemii (sześć) i histologii (sześć). Powinna być użyta atropina lub inny środek ochronny, o którym wiadomo, że nie koliduje a opóźnionymi reakcjami neurotoksycznymi, w celu zapobieżenia śmierci z powodu ostrych skutków cholinergicznych.

1.5.2.4. Test graniczny

Jeżeli test przy poziomie dawki wynoszącym co najmniej 2000 mg/kg masy ciała/dzień, z zastosowaniem procedury opisanej dla tego badania, nie powoduje widocznych objawów toksycznych i jeżeli nie należałoby spodziewać się toksyczności na podstawie danych, dotyczących substancji strukturalnie pokrewnych, wtedy badanie z zastosowaniem większej dawki może nie być konieczne. Ten test graniczny stosowany jest z wyjątkiem przypadków, w których ekspozycja ludzi wskazuje na konieczność użycia wyższego poziomu dawki.

1.5.2.5. Okres obserwacji

Okres obserwacji powinien wynosić 21 dni.

1.5.3. Procedura

Po podaniu środka ochronnego, aby zapobiec śmierci z powodu ostrych skutków cholinergicznych, substancja testowana jest podawana w pojedynczej dawce.

1.5.3.1. Ogólne obserwacje

Obserwacje powinny rozpocząć się bezpośrednio po ekspozycji. Wszystkie kury powinny być starannie obserwowane kilka razy w ciągu pierwszych 2 dni i od tego czasu co najmniej raz dziennie przez okres 21 dni lub do zaplanowanego zabicia. Wszystkie oznaki toksyczności powinny być odnotowywane, w tym czas rozpoczęcia, typ, ostrość i czas trwania anomalii behawioralnych. Ataksja powinna być mierzona według porządkowej skali klasyfikacyjnej, składającej się z co najmniej czterech poziomów, paraliż powinien być odnotowany. Co najmniej dwa razy w tygodniu wszystkie kury wybrane do celów patologii powinny być wyjmowane z klatek i poddawane okresowej wymuszonej aktywności motorycznej, takiej jak wspinanie się po drabinie, aby ułatwić obserwację minimalnych skutków toksycznych. Zwierzęta konające oraz zwierzęta przejawiające ostre cierpienie i ból powinny być usuwane, gdy zostanie to zauważone, humanitarnie zabite i poddane sekcji zwłok.

1.5.3.2. Masa ciała

Wszystkie kury powinny być ważone tuż przed podaniem substancji testowanej i od tego czasu co najmniej raz w tygodniu.

1.5.3.3. Biochemia

Sześć losowo wybranych kur z grup badanych i z grupy kontroli nośnika, i trzy kury z pozytywnej grupy kontrolnej (jeżeli grupa ta jest poddawana badaniu jednocześnie), powinny być zabite w ciągu kilku dni po dawkowaniu, mózg i lędźwiowy rdzeń kręgowy powinien być przygotowany i poddany analizie aktywności zahamowania esterazy wywołującej neuropatię. Dodatkowo, może być przydatne przygotowanie i poddanie tkanki nerwu kulszowego analizie aktywności zahamowania esterazy wywołującej neuropatię. Prawidłowo, trzy ptaki grupy kontrolnej i każdej grupy badanej są zabijane po 24 godzinach i trzy po 48 godzinach, podczas gdy trzy kury z pozytywnej grupy kontrolnej powinny być zabite po 24 godzinach. Jeżeli obserwacja klinicznych oznak zatrucia (często może to być ocenione przez obserwację czasu rozpoczęcia oznak cholinergicznych) wskazuje, że środek toksyczny może być usuwany bardzo powoli, bardziej pożądane może być pobranie próbki tkanki od trzech ptaków, w każdym z dwóch terminów między 24 a 72 godziną po dawkowaniu.

Analizy acetylocholinoesterazy (AChE) mogą być również wykonane na tych próbkach, jeżeli uzna się to za właściwe. Jednakże może mieć miejsce spontaniczna reaktywacja AChE in vivo, co może prowadzić do zbyt niskiego oszacowania potencji substancji jako inhibitora AChE.

1.5.3.4. Sekcja zwłok

Sekcja zwłok wszystkich zwierząt (zabitych planowo i zabitych jako konające) powinna obejmować obserwację wyglądu mózgu i rdzenia kręgowego.

1.5.3.5. Badanie histopatologiczne

Obojętna tkanka zwierząt przeżywających okres obserwacji, nie użyta w badaniach biochemicznych powinna być poddana badaniu mikroskopowemu. Tkanki powinny być przygotowane in situ, stosując techniki perfuzji. Odcinki powinny obejmować móżdżek (środkowy - wzdłużny poziom), rdzeń przedłużony, rdzeń kręgowy, i nerwy obwodowe. Odcinki rdzenia kręgowego powinny być pobrane z górnego segmentu karkowego, okolic środkowopiersiowych i lędźwiowo - krzyżowych. Powinny być pobrane odcinki z okolic obwodowych nerwu piszczelowego i jego odgałęzienia do mięśnia brzuchatego łydki oraz nerwu kulszowego. Odcinki powinny być zabarwione odpowiednią mieliną i barwnikami charakterystycznymi dla aksonów.

2. DANE

Negatywne wyniki w punktach końcowych wybranych w tej metodzie (biochemia, histopatologia i obserwacja behawioralna) prawidłowo nie wymagałyby dalszego badania, dotyczącego opóźnionej neurotoksyczności. Niejednoznaczne lub nieprzekonujące wyniki dla tych punktów końcowych mogą wymagać dalszej oceny.

Powinny zostać dostarczone indywidualne zwierząt. Dodatkowo, wszystkie dane powinny być podsumowane w formie tabeli, przedstawiając dla każdej grupy badanej liczbę zwierząt na początku testu, liczbę zwierząt wykazujących zmiany patologiczne, skutki behawioralne i biochemiczne, typy i ostrość tych zmian patologicznych lub skutków, i procent zwierząt okazujących każdy typ i ostrość zmiany patologicznej lub skutku.

Wyniki badania powinny być ocenione pod względem częstotliwości, ostrości, i korelacji skutków behawioralnych, biochemicznych i histopatologicznych oraz jakichkolwiek innych obserwowanych w grupach badanych i kontrolnych.

Wyniki liczbowe powinny być ocenione z zastosowaniem odpowiedniej i ogólnie akceptowanej metody statystycznej. Metody statystyczne powinny być wybrane podczas planowania badania.

3. SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA

Sprawozdanie z testu

Sprawozdanie z testu obejmuje, jeżeli możliwe, następujące informacje:

Zwierzęta badane:

- wykorzystana rasa;

- liczba i wiek zwierząt;

- źródło, warunki przebywania zwierząt itp.;

- indywidualna waga zwierząt na początku testu.

Warunki testu:

- szczegóły dotyczące przygotowania substancji testowanej, trwałości i homogeniczności; w odpowiednich przypadkach;

- uzasadnienie wyboru nośnika;

- szczegóły podawania substancji testowanej;

- szczegóły jakości pożywienia i wody;

- racjonalna podstawa wyboru dawki;

- parametry podawanych dawek, w tym dane szczegółowe dotyczące nośnika, objętości i formy fizycznej podawanych substancji;

- tożsamość i szczegóły podawania jakiegokolwiek środka ochronnego.

Wyniki:

- dane dotyczące masy ciała;

- dane dotyczące reakcji toksycznej według grup, w tym śmiertelność;

- natura, ostrość i czas trwania obserwacji klinicznych (czy odwracalne czy nie);

- szczegółowy opis metod biochemicznych i wyników;

- wyniki sekcji zwłok;

- szczegółowy opis wszystkich wyników histopatologicznych;

- gdzie właściwe, statystyczna obróbka wyników.

Rozpatrzenie wyników.

Wnioski.

4. BIBLIOGRAFIA

Niniejsza metoda jest analogiczna do OECD TG 418.

B.38 OPÓŹNIONA NEUROTOKSYCZNOŚĆ SUBSTANCJI FOSFOROORGANICZNYCH. 28 DNIOWE BADANIE WIELOKROTNEJ DAWKI

1. METODA

1.1. Wprowadzenie

Przy ocenie i oszacowaniu skutków toksycznych substancji, ważne jest rozważenie potencjału niektórych klas substancji do wywoływania określonych typów neurotoksyczności, które mogą nie być wykrywane podczas innych badań toksyczności. Zaobserwowano, że niektóre substancje fosforoorganiczne powodują opóźnioną neurotoksyczność i powinny być wzięte pod uwagę jako związki, które mogą być zaliczone do oszacowania.

Testy sortujące in vitro mogłyby być zastosowane w celu rozpoznania tych substancji, które mogą powodować opóźnioną polineuropatię; jednakże negatywne wyniki badań in vitro nie są dowodem na to, że substancja testowana nie jest substancją neurotoksyczną.

Ten 28-dniowy test opóźnionej neurotoksyczności dostarcza informacji, dotyczących możliwych zagrożeń zdrowia, które mogą się pojawiać się pod wpływem wielokrotnych ekspozycji przez ograniczony okres czasu. Dostarczy on informacji dotyczących reakcji na dawkę i może zapewnić oszacowanie poziomu braku obserwowanych niekorzystnych skutków, który może być przydatny przy ustalaniu kryteriów bezpieczeństwa dla ekspozycji.

Patrz także Wprowadzenie ogólne w części B.

1.2. Definicje

Substancje fosforoorganiczne obejmują nienaładowane estry fosforoorganiczne, tioestry i bezwodniki pochodnych organicznych kwasu fosforowego(V), kwasu fosfonowego i kwasów fosforoamidowych i ich tio-pochodnych, lub inne substancje, które mogą wywoływać opóźnioną neurotoksyczność obserwowaną czasami w tej klasie substancji.

Opóźniona neurotoksyczność jest objawem związanym z przedłużonym zwłocznym początkiem ataksji, obwodową aksonopatią w rdzeniu kręgowym i nerwach obwodowych, i zahamowaniem i starzenie