ZAŁĄCZNIK

W załączniku do rozporządzenia (WE) nr 440/2008 wprowadza się następujące zmiany:

dodaje się rozdziały B.53, B.54, B.55, B.56, B.57 i B.58 w brzmieniu:

„B.53. BADANIE NEUROTOKSYCZNOŚCI ROZWOJOWEJ

WPROWADZENIE

1. Niniejsza metoda badawcza jest zgodna z dotyczącą badań wytyczną OECD nr 426 (2007 r.). W czerwcu 1995 r. w Kopenhadze grupa robocza OECD ds. toksyczności reprodukcyjnej i rozwojowej omawiała potrzebę aktualizacji istniejących wytycznych OECD dotyczących badań w zakresie toksyczności reprodukcyjnej i rozwojowej oraz opracowania nowych wytycznych w odniesieniu do punktów końcowych, których jeszcze nie uwzględniono (1). Grupa robocza zaleciła opracowanie dotyczącej badań wytycznej w zakresie neurotoksyczności rozwojowej na podstawie wytycznej amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska, która została już poprawiona (2). W czerwcu 1996 r. w Kopenhadze odbyło się drugie spotkanie konsultacyjne, którego celem było dostarczenie Sekretariatowi wskazówek dotyczących konspektu nowej dotyczącej badań wytycznej w zakresie neurotoksyczności rozwojowej, w tym jej najbardziej istotnych elementów, np. szczegółów dotyczących doboru gatunków zwierząt, okresu dawkowania, okresu badania, punktów końcowych podlegających ocenie i kryteriów oceny wyników. Amerykańska wytyczna dotycząca oceny ryzyka neurotoksyczności została opublikowana w 1998 r. (3). Spotkanie konsultacyjne ekspertów OECD i warsztaty prowadzone przez Risk Science Institute przy ILSI odbyły się równolegle w październiku 2000 r., a spotkanie konsultacyjne ekspertów odbyło się w Tokio w 2005 r. Spotkania te miały na celu omówienie kwestii naukowych i technicznych związanych z aktualnymi wytycznymi dotyczącymi badań, a zalecenia, które były ich wynikiem (4)(5)(6)(7), uwzględniono w opracowaniu przedmiotowej metody badawczej. Dodatkowe informacje dotyczące procedury, interpretacji i terminologii stosowanej w przypadku tej metody badawczej można znaleźć w dokumencie zawierającym wytyczne OECD nr 43 »Reproductive Toxicity Testing and Assessment« (Badanie i ocena toksyczności reprodukcyjnej) (8) oraz nr 20 »Neurotoxicity Testing« (Badanie neurotoksyczności) (9).

USTALENIA WSTĘPNE

2. Znany jest szereg substancji chemicznych, które prowadzą do neurotoksyczności rozwojowej u ludzi i innych gatunków (10)(11)(12)(13). Określenie potencjału wywoływania neurotoksyczności rozwojowej może być niezbędne do oceny i zbadania toksycznych cech charakterystycznych substancji chemicznej. Badania neurotoksyczności rozwojowej mają na celu dostarczanie danych, w tym charakterystyki dawka-odpowiedź, dotyczących potencjalnych skutków czynnościowych i morfologicznych dla rozwijającego się układu nerwowego potomstwa, które mogą powstać w wyniku narażenia in utero i we wczesnym stadium życia.

3. Badanie neurotoksyczności rozwojowej można prowadzać jako oddzielne badanie włączone do badania toksyczności reprodukcyjnej lub badania neurotoksyczności u dorosłych osobników (np. metody badawcze B.34 (14), B.35 (15), B.43 (16)), lub w powiązaniu z badaniem przedurodzeniowej toksyczności rozwojowej (np. z metodą badawczą B.31 (17)). Jeżeli badanie neurotoksyczności rozwojowej jest włączone do innego badania lub z nim powiązane, konieczne jest zachowanie integralności obu rodzajów badań. Wszystkie badania powinny być zgodne z mającymi zastosowanie przepisami lub wytycznymi rządowymi i instytucjonalnymi, dotyczącymi wykorzystywania zwierząt doświadczalnych w badaniach (np. 18).

4. Laboratorium badawcze powinno uwzględnić wszystkie dostępne informacje na temat badanej substancji chemicznej przed przystąpieniem do badania. Informacje te powinny obejmować tożsamość i strukturę chemiczną substancji, jej właściwości fizykochemiczne; wyniki wszystkich innych badań toksyczności in vitro lub in vivo przeprowadzonych na substancji, dane toksykologiczne substancji chemicznych zbliżonych pod względem budowy oraz przewidywane zastosowanie (zastosowania) tej substancji. Informacje te są niezbędne dla przekonania wszystkich zainteresowanych stron, że badanie dotyczy ochrony zdrowia ludzi i jest pomocne w wyborze odpowiedniej dawki wyjściowej.

ZASADA BADANIA

5. Badaną substancję chemiczną podaje się zwierzętom przez okres ciąży i laktacji. Badania prowadzi się na matkach, aby ocenić skutki dla samic w okresie ciąży i laktacji oraz aby mieć możliwość uzyskania informacji porównawczych (matki w porównaniu z potomstwem). Do oceny neurotoksyczności potomstwo dobiera się losowo z miotu. Ocena polega na obserwacji mającej na celu wykrycie poważnych anomalii neurologicznych i behawioralnych, w tym na ocenie rozwoju fizycznego, rozwoju zachowań, aktywności ruchowej, funkcji motoryczno-sensorycznych, uczenia się i pamięci, ocenie mas mózgów i ocenie neuropatologicznej w okresie rozwoju pourodzeniowego i dorosłości.

6. Jeżeli metodę badawczą stosuje się jako odrębne badanie, można wykorzystać dodatkowe, dostępne zwierzęta z każdej grupy w celu przeprowadzenia szczegółowych procedur neurobehawioralnych, neuropatologicznych, neurochemicznych lub elektrofizjologicznych, które mogą uzupełnić dane otrzymane w badaniach zalecanych w ramach niniejszej metody (16)(19)(20)(21). Procedury uzupełniające mogą być szczególnie użyteczne w przypadkach, gdy obserwacje empiryczne, przewidywane skutki lub mechanizm/sposób działania wskazują na jakiś szczególny rodzaj neurotoksyczności. Te procedury uzupełniające można stosować zarówno w przypadku matek, jak i młodych. Ponadto można również stosować procedury ex vivo lub in vitro, o ile nie zmienią one integralności procedur in vivo.

PRZYGOTOWANIA DO BADANIA

Wybór gatunków zwierząt

7. Badania najlepiej jest przeprowadzać na szczurach; w stosownych przypadkach można wykorzystać inne gatunki. Należy jednak pamiętać, że liczba dni ciąży i liczba dni okresu postnatalnego określone w tej metodzie są charakterystyczne dla powszechnie stosowanych szczepów szczurów i w związku z tym należy dobrać porównywalne liczby dni w przypadku wykorzystania innego gatunku lub nietypowego szczepu. Należy uzasadnić wykorzystanie innego gatunku na podstawie danych toksykologicznych, farmakokinetycznych lub innych. Uzasadnienie powinno obejmować dostępne, określone dla gatunku oceny neurobehawioralne i neuropatologiczne przeprowadzone w okresie pourodzeniowym. Jeżeli wcześniej miało miejsce badanie, które wzbudziło zaniepokojenie, należy uwzględnić gatunek/szczep, w odniesieniu do którego miało to miejsce. Ze względu na zróżnicowane, związane z badaniami cechy różnych szczepów szczurów powinien istnieć dowód, że wybrany do badania szczep charakteryzuje się odpowiednią płodnością i zdolnością reagowania. Należy udokumentować wiarygodność i czułość innych gatunków pod względem wykrywania neurotoksyczności rozwojowej.

Warunki trzymania i żywienia

8. Temperatura w badawczych pomieszczeniach hodowlanych powinna wynosić 22 ± 3 °C. Chociaż wilgotność względna powinna wynosić co najmniej 30 % i najlepiej byłoby, gdyby nie przekraczała 70 % poza czasem czyszczenia pomieszczenia, docelowy poziom wilgotności powinien wynosić 50–60 %. Oświetlenie powinno być sztuczne, w cyklu dziennym 12 godzin światła, 12 godzin ciemności. Możliwe jest również odwrócenie cyklu światła przed kryciem i na okres trwania badania w celu przeprowadzenia oceny funkcjonalnych i behawioralnych punktów końcowych w fazie nocy (przy oświetleniu czerwonym światłem), tj. w czasie, gdy zwierzęta są zwykle aktywne (22). Wszelkie zmiany w cyklu dzień/noc powinny uwzględniać odpowiedni czas aklimatyzacji aby zwierzęta mogły przystosować się do nowego cyklu. Do żywienia można stosować konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dostępem do wody pitnej. Należy zgłosić rodzaj pokarmu i wodę i przebadać je pod kątem zanieczyszczeń.

9. Zwierzęta mogą być trzymane pojedynczo lub umieszczane w klatkach w małych grupach o tej samej płci. Procedury krycia powinny być przeprowadzane w klatkach nadających się do tego celu. Po stwierdzeniu, że kopulacja nastąpiła, lub nie później niż w 15 dniu ciąży, pokryte zwierzęta powinny być umieszczone oddzielnie w klatkach porodowych lub matczynych. Klatki powinny być ustawione w taki sposób, żeby zminimalizować możliwy wpływ położenia klatki. Tuż przed porodem należy zapewnić pokrytym samicom właściwe i określone materiały do budowy gniazda. Wiadomo powszechnie, że nieodpowiednie obchodzenie się ze zwierzęciem lub stres w czasie ciąży mogą pociągać za sobą niepożądane skutki, w tym straty przedurodzeniowe, wadliwy rozwój płodu i wadliwy rozwój pourodzeniowy. W celu ochrony przed stratą płodu spowodowaną czynnikami niezwiązanymi z doświadczeniem należy ostrożnie postępować ze zwierzętami w czasie ciąży i chronić je przed stresem wywoływanym czynnikami zewnętrznymi, takimi jak nadmierny hałas na zewnątrz.

Przygotowanie zwierząt

10. Należy wykorzystywać zdrowe zwierzęta zaaklimatyzowane do warunków laboratoryjnych i niepoddawane wcześniej procedurom doświadczalnym, chyba że badanie zostało włączone do innego badania (zob. pkt 3). Należy sporządzić charakterystykę badanych zwierząt pod kątem gatunku, szczepu, źródła pochodzenia, płci, wagi i wieku. Każdemu zwierzęciu należy nadać niepowtarzalny numer identyfikacyjny i oznaczyć je tym numerem. Na tyle, na ile to możliwe, we wszystkich badanych grupach zwierzęta powinny mieć jednakową masę ciała i być w tym samym wieku oraz mieścić się w zakresach typowych dla gatunku lub szczepu objętego badaniem. Do każdej dawki należy wykorzystać młode dojrzałe samice nieródki. Nie należy wykorzystywać rodzeństwa do krycia i należy dołożyć wszelki starań, aby to zapewnić. Dzień 0 danej ciąży jest dniem, w którym odnotowuje się czop pochwowy lub plemniki w pochwie. Po zakupie od dostawcy zapłodnionych w znanym czasie zwierząt należy dać im odpowiedni czas na aklimatyzację (np. 2–3 dni). Pokryte samice należy przydzielić w sposób losowy do grup kontrolnych i grup eksperymentalnych i, o ile to możliwe, rozdzielić je równomiernie między grupy (np. zaleca się procedurę warstwowego doboru losowego w celu zapewnienia równomiernego rozłożenia zwierząt między wszystkie grupy, np. na podstawie masy ciała). Samice inseminowane przez tego samego samca powinny być rozdzielone równomiernie między grupy.

PROCEDURA

Liczba i płeć zwierząt

11. Każda grupa badana i kontrolna powinna składać się z wystarczającej liczby ciężarnych samic, które mają być poddane działaniu badanej substancji chemicznej, aby uzyskać odpowiednią liczbę potomstwa do oceny neurotoksyczności. W odniesieniu do każdego poziomu dawki zaleca się wykorzystanie łącznie 20 miotów. Dopuszcza się schematy dawkowania powtarzanego i etapowego w odniesieniu do grupy, w przypadkach gdy udaje się uzyskać całkowitą liczbę miotów na grupę i stosuje się odpowiednie modele statystyczne, na podstawie których określa się powtórzenia.

12. W dniu 4. po urodzeniu lub przed nim (dzień porodu jest dniem 0) liczebność każdego miotu powinna zostać dostosowana przez wyeliminowanie dodatkowych młodych w miocie za pomocą doboru losowego, aby uzyskać jednakową liczebność wszystkich miotów (23). Liczebność miotu nie powinna przekraczać średniej liczebności miotu wykorzystanego szczepu gryzoni (8–12). Miot powinien się składać, w miarę możliwości, z takiej samej liczby młodych samców i samic. Selektywna eliminacja młodych, np. oparta na masie ciała, jest nieodpowiednia. Po dokonaniu standaryzacji miotów (eliminacji) i przed dalszymi badaniami funkcjonalnych punktów końcowych należy zidentyfikować w sposób niepowtarzalny poszczególne młode, które wybrano do badań przedodsadzeniowych lub poodsadzeniowych, za pomocą dowolnej odpowiedniej humanitarnej metody przeznaczonej do identyfikacji młodych (np. 24).

Wyznaczanie zwierząt do obserwacji funkcjonalnych i behawioralnych, ocen mas mózgów i ocen neuropatologicznych

13. W opisywanej metodzie badawczej dopuszcza się różne podejścia w odniesieniu do wyznaczania zwierząt, które są poddawane działaniu in utero i w okresie laktacji, do obserwacji funkcjonalnych i behawioralnych, oceny dojrzałości płciowej, pomiaru masy mózgu i oceny neuropatologicznej (25). Indywidualnie w odniesieniu do każdego przypadku można dodać inne badania funkcji neurobehawioralnej (np. zachowań społecznych), zmian neurochemicznych lub neuropatologicznych, dopóki nie będzie to zagrażać integralności pierwotnie wymaganych badań.

14. Młode dobiera się z każdej grupy dawkowania i przydziela pod kątem ocen punktów końcowych w dniu 4. po urodzeniu lub później. Dobór młodych należy przeprowadzić w taki sposób, aby, na ile to możliwe, obie płcie z każdego miotu w każdej grupie dawkowania były reprezentowane we wszystkich badaniach w jednakowym stopniu. W celu zbadania aktywności ruchowej należy przeprowadzić badanie na tej samej parze młodych, samca i samicy, na wszystkich etapach wiekowych przed odsadzeniem (zob. pkt 35). Do celów wszystkich innych badań można przydzielić te same lub inne pary samców i samic do różnych badań behawioralnych. Może być wymagane przydzielenie różnych młodych do badań funkcji poznawczych w okresie po odsadzeniu lub w okresie dojrzałości, aby nie dopuścić do pomylenia z wpływem wieku i wcześniejszych szkoleń na te pomiary (26)(27). Przy odsadzaniu (dzień 21. po urodzeniu) można humanitarnie uśmiercić młode, których nie wybrano do badań. Należy odnotować wszelkie zmiany w przydziałach młodych. Statystyczną jednostką miary powinien być miot (lub matka), a nie młode.

15. Istnieją różne sposoby przydzielania młodych do badań przedodsadzeniowych i poodsadzeniowych, badań funkcji poznawczych, badań patologicznych itp. (zob. rys. 1 w odniesieniu do ogólnego schematu i dodatek 1 w odniesieniu do przykładów przydzielania). Zalecana minimalna liczba zwierząt w każdej grupie dawkowania w odniesieniu do badań przedodsadzeniowych i poodsadzeniowych jest następująca:

obserwacje kliniczne i masa ciała wszystkie zwierzęta szczegółowe obserwacje kliniczne 20/płeć (1/płeć/miot) masa mózgu (po utrwalaniu) między dniem 11. a 22. po urodzeniu 10/płeć (1/miot) masa mózgu (nieutrwalona) w dniu 70. po urodzeniu 10/płeć (1/miot) neuropatologia (zanurzenie lub utrwalenie perfuzyjne) między dniem 11. a 22. po urodzeniu 10/płeć (1/miot) neuropatologia (utrwalenie perfuzyjne) w dniu 70. po urodzeniu 10/płeć (1/miot) dojrzałość płciowa 20/płeć (1/płeć/miot) inne charakterystyczne punkty rozwojowe (opcjonalne) wszystkie zwierzęta rozwój zachowań 20/płeć (1/płeć/miot) aktywność ruchowa 20/płeć (1/płeć/miot) funkcje motoryczno-sensoryczne 20/płeć (1/płeć/miot) uczenie się i pamięć 10/płeć (1) (1/miot)

Dawkowanie

16. Należy zastosować co najmniej trzy poziomy dawek i wprowadzić równoczesną grupę kontrolną. Dawki powinny być zróżnicowane w celu osiągnięcia stopniowania efektów toksycznych. Jeżeli charakter fizykochemiczny lub właściwości biologiczne substancji chemicznej nie powodują ograniczenia dawki, najwyższą dawkę należy dobrać w taki sposób, aby wywołać pewną toksyczność matczyną (np. objawy kliniczne, obniżony przyrost masy ciała (nie więcej niż 10 %) lub oznaki toksyczności ograniczającej wielkość dawki w organie docelowym). Z pewnymi wyjątkami dużą dawkę można ograniczyć do 1 000 mg/kg masy ciała/dzień. Na przykład przewidywane narażenie ludzi może wskazać na potrzebę zastosowania większej dawki. Ewentualnie należy przeprowadzić badania pilotażowe lub badania wstępne mające na celu ustalenie zakresu, aby określić największe dawkowanie, które można zastosować, a które wywoła minimalny stopień toksyczności matczynej. Jeżeli badana substancja chemiczna wykazała toksyczność rozwojową w standardowym badaniu toksyczności rozwojowej lub w badaniu pilotażowym, największa dawka powinna stanowić maksymalną dawkę niewywołującą nadmiernej toksyczności u potomstwa ani zgonu in utero lub neonatalnego lub wad rozwojowych, co wystarcza, aby uniemożliwić znaczącą ocenę neurotoksyczności. Najmniejsza dawka nie powinna wywoływać żadnych oznak toksyczności matczynej ani rozwojowej, w tym neurotoksyczności. Należy dobrać malejącą sekwencję dawek w celu wykazania wszystkich zależności dawka-odpowiedź i poziomów dawkowania, przy których nie obserwuje się szkodliwych zmian (NOAEL), lub dawki bliskie granicy wykrywalności, które pozwolą określić dawkę wyznaczającą. W odniesieniu do ustalenia malejących dawek często jest optymalne wprowadzenie podwójnych do poczwórnych odstępów, a dodanie czwartej grupy dawkowania jest na ogół lepsze niż stosowanie bardzo dużych odstępów (np. współczynnik większy od 10) między dawkowaniami.

17. Dawki należy dobierać, uwzględniając wszystkie istniejące dane dotyczące toksyczności oraz dodatkowe informacje na temat metabolizmu i toksykokinetyki badanej substancji chemicznej lub powiązanych materiałów. Informacje te mogą również pomóc w wykazaniu stosowności schematu dawkowania. Należy rozważyć bezpośrednie podawanie dawki młodym na podstawie informacji dotyczących narażenia i farmakokinetyki (28)(29). Przed przeprowadzeniem badań polegających na bezpośrednim dawkowaniu należy uważnie rozważyć ich zalety i ich wady (30).

18. Równoległa grupa kontrolna powinna stanowić grupę kontrolną poddaną terapii pozorowanej lubgrupę kontrolną nośnika, jeżeli przy podawaniu badanej substancji chemicznej stosowany jest nośnik. Wszystkim zwierzętom należy zwykle podawać taką samą ilość badanej substancji chemicznej lub nośnika obliczaną na podstawie masy ciała. Jeżeli w celu ułatwienia dawkowania używa się nośnika lub innego dodatku, należy uwzględnić następujące cechy charakterystyczne: wpływ na wchłanianie, dystrybucję, metabolizm lub zatrzymywanie badanej substancji chemicznej; wpływ na właściwości chemiczne badanej substancji chemicznej, które mogą zmienić jej charakterystykę toksyczną; oraz wpływ na przyjmowanie pokarmu lub wody, lub stan odżywienia zwierząt. Nośnik nie powinien wywoływać skutków, które mogłyby przeszkodzić w interpretacji wyników badania, ani nie powinien być toksyczny neurobehawioralnie, ani wpływać na reprodukcję lub rozwój. W przypadku nowatorskich nośników oprócz grupy kontrolnej nośnika należy włączyć grupę kontrolną poddaną terapii pozorowanej. Zwierzęta w grupie kontrolnej (grupach kontrolnych) powinny być traktowane w dokładnie taki sam sposób jak zwierzęta w grupach badanych.

Podawanie dawek

19. Badaną substancję chemiczną lub nośnik należy podawać najbardziej odpowiednią drogą w odniesieniu do potencjalnego narażenia u człowieka i na podstawie dostępnych informacji dotyczących metabolizmu i dystrybucji u badanych zwierząt. Drogą podawania będzie z reguły droga pokarmowa (np. przez sondę, z paszą, z wodą pitną), ale można wykorzystać inne drogi (np. naskórną lub wziewną) w zależności od cech charakterystycznych i przewidywanych lub znanych dróg narażenia u człowieka (dalsze wytyczne można znaleźć w dokumencie zawierającym wytyczne OECD nr 43 (8)). Należy uzasadnić wybór drogi podawania. Badaną substancję chemiczną należy podawać każdego dnia mniej więcej o tej samej porze.

20. Dawka podawana każdemu zwierzęciu powinna zwykle zależeć od bieżącej masy ciała danego osobnika. Należy jednak zachować ostrożność przy dostosowywaniu dawek w ostatnim trymestrze ciąży. Jeżeli odnotuje się nadmierną toksyczność u matek objętych podawaniem, należy uśmiercić je w sposób humanitarny.

21. Badaną substancję chemiczną lub nośnik należy podawać pokrytym samicom co najmniej raz dziennie od momentu zagnieżdżenia (6. dzień ciąży) przez cały okres laktacji (dzień 21. po urodzeniu), w związku z czym młode są poddawane narażeniu na badaną substancję chemiczną w okresie neurologicznego rozwoju przedurodzeniowego i pourodzeniowego. Wiek, w którym rozpoczyna się dawkowanie, oraz okres trwania i częstotliwość dawkowania można skorygować, jeżeli istnieją dowody na to, że taki schemat doświadczalny jest bardziej odpowiedni w odniesieniu do narażenia u ludzi. Należy skorygować okresy trwania dawkowania w odniesieniu do innych gatunków, aby zapewnić narażenie w czasie wszystkich wczesnych okresów rozwoju mózgu (tj. równoważnych rozwojowi mózgu człowieka w okresie przed urodzeniem i wczesnym okresie po urodzeniu). Dawkowanie można rozpocząć na początku ciąży (0. dzień ciąży), ale należy uwzględnić możliwość, że badana substancja chemiczna spowoduje utratę zarodka przed zagnieżdżeniem. Rozpoczęcie podawania w 6. dniu ciąży wyeliminowałoby to ryzyko, ale nie pozwoliłoby to zbadać stadiów rozwojowych między 0. a 6. dniem ciąży. W przypadku gdy laboratorium nabywa zwierzęta kryte w znanym czasie, rozpoczęcie dawkowania w 0. dniu ciąży jest niepraktyczne, zatem 6. dzień ciąży byłby dobrym punktem wyjściowym. Laboratorium badawcze powinno określić schemat dawkowania zgodnie z odpowiednimi informacjami dotyczącymi skutków badanej substancji chemicznej, wcześniejszymi doświadczeniami i kwestiami logistycznymi; może on obejmować przedłużenie dawkowania w okresie po odsadzeniu. Dawkowanie nie powinno mieć miejsca w dniu porodu w przypadku tych zwierząt, u których poród był niekompletny. Ogólnie rzecz biorąc, zakłada się, że młode zostaną poddane narażeniu przez mleko matki, należy jednak rozważyć bezpośrednie podawanie dawki młodym w tych przypadkach, w których nie ma dowodów stałego narażenia potomstwa. Dowody stałego narażenia można uzyskać np. z informacji farmakokinetycznych, toksyczności dla potomstwa lub zmian w biomarkerach (28).

OBSERWACJE

Obserwacje matek

22. Co najmniej raz dziennie należy przeprowadzić skrupulatną obserwację wszystkich matek pod kątem warunków dotyczących ich zdrowia, w tym zachorowalności i śmiertelności.

23. W czasie doświadczenia i obserwacji należy okresowo prowadzić bardziej szczegółowe obserwacje kliniczne (przynajmniej dwa razy w okresie dawkowania w czasie ciąży i dwa razy w okresie dawkowania w czasie laktacji), wykorzystując co najmniej dziesięć matek na każdą dawkę. Obserwacje zwierząt na zewnątrz klatki macierzystej powinni przeprowadzić wyszkoleni technicy, którzy nie wiedzą o podawaniu zwierzętom substancji chemicznych, stosując standardowe procedury w celu ograniczenia do minimum stresu u zwierząt i stronniczości obserwatora oraz uzyskania maksymalnej wiarygodności kilku obserwatorów. Zaleca się, aby obserwacje w danym badaniu przeprowadzał ten sam technik, jeżeli istnieje taka możliwość.

24. Należy odnotować występowanie obserwowanych objawów. W przypadkach, w których jest to możliwe, należy również odnotować skalę obserwowanych objawów. Obserwacje kliniczne powinny obejmować między innymi zmiany w skórze, sierści, oczach, błonach śluzowych, wystąpienie wydzielin oraz aktywność autonomicznej części układu nerwowego(np. łzawienie, piloreksja, rozmiar źrenicy, zmieniony rytm oddychania lub oddychanie przez jamę ustną i wszelkie nietypowe objawy związane z oddawaniem moczu lub wypróżnianiem).

25. Należy również odnotowywać wszelkie nietypowe reakcje dotyczące pozycji ciała, poziomu aktywności (np. obniżenie lub podwyższenie poziomu eksploracji standardowej powierzchni) i koordynacji ruchowej. Należy także odnotować zmiany w sposobie chodzenia (np. chód kaczkowaty, ataksja), postawie (np. przygarbiony grzbiet) i reaktywności na kontakt, przenoszenie i inne bodźce ze środowiska, jak również obecność ruchów klonicznych lub tonicznych, konwulsji, drżenia, stereotypii (np. nadmiernego czyszczenia się, nietypowych ruchów głową, powtarzanego kręcenia się), lub dziwnych zachowań (np. gryzienia lub nadmiernego wylizywania, samookaleczania, chodzenia do tyłu, wydawania dźwięków) lub agresji.

26. Należy odnotować wszystkie oznaki toksyczności, w tym dzień ich wystąpienia, porę dnia, stopień i okres trwania.

27. W okresie dawkowania należy ważyć zwierzęta przynajmniej raz na tydzień przez cały okres trwania badania, w dniu porodu lub tuż przed lub po nim i w dniu 21. po urodzeniu (odsadzenie). W przypadku badań z wykorzystaniem sondy należy ważyć matki przynajmniej dwa razy w tygodniu. Dawki powinny być korygowane w momencie określania masy ciała każdego osobnika, stosownie do przypadku. Należy co tydzień mierzyć ilość przyjmowanego pokarmu, co najmniej w okresach ciąży i laktacji. Ilość wypitej wody powinna być mierzona co najmniej raz w tygodniu, jeżeli zwierzę jest poddane narażeniu za pośrednictwem wody pitnej.

Obserwacje potomstwa

28. Co najmniej raz dziennie należy przeprowadzić skrupulatną obserwację całego potomstwa pod kątem oznak toksyczności i zachorowalności oraz śmiertelności.

29. W okresach podawania substancji i obserwacji należy prowadzić bardziej szczegółowe obserwacje kliniczne potomstwa. Obserwacje potomstwa (przynajmniej jednego młodego/płeć/miot) powinni prowadzić wyszkoleni technicy, którzy nie wiedzą o podawaniu zwierzętom substancji, stosując standardowe procedury w celu ograniczenia do minimum stronniczości oraz uzyskania maksymalnej wiarygodności kilku obserwatorów. Zaleca się, aby obserwacje przeprowadzał ten sam technik, jeżeli istnieje taka możliwość. Należy monitorować co najmniej punkty końcowe opisane w pkt 24 i 25 stosownie do obserwowanego stadium rozwojowego.

30. Należy odnotować wszystkie oznaki toksyczności u potomstwa, w tym dzień ich pojawienia się, porę dnia, stopień i okres trwania.

Fizyczne i rozwojowe punkty charakterystyczne

31. Zmiany w charakterystycznych punktach rozwojowych w okresie przed odsadzeniem (np. rozwijanie się małżowiny ucha, otwieranie oczu, wyrzynanie się siekaczy) są ściśle związane z masą ciała (30)(31). Masa ciała może być najlepszym wskaźnikiem rozwoju fizycznego. W związku z tym zaleca się dokonywanie pomiarów charakterystycznych punktów rozwojowych jedynie wówczas, gdy wcześniej pojawiły się oznaki wskazujące, że te punkty końcowe będą stanowić źródło dodatkowych informacji. Częstotliwość przeprowadzania oceny tych parametrów przedstawiono w tabeli 1. W zależności od przewidywanych skutków i wyników pomiarów wstępnych może być zalecane wprowadzenie dodatkowych punktów czasowych lub wykonanie pomiarów na innych stadiach rozwojowych.

32. Do oceny rozwoju fizycznego zaleca się wykorzystywanie zwierząt w okresie po kopulacji, a nie w okresie po urodzeniu (33). Jeżeli przeprowadza się badanie na młodych w dniu odsadzenia, zaleca się, aby badanie to zostało przeprowadzone przed faktycznym odsadzeniem w celu uniknięcia efektu dezorientacji zwierząt spowodowanego stresem towarzyszącym odsadzeniu. Ponadto wszelkie badania na młodych w okresie po odsadzeniu nie powinny być prowadzone przez pierwsze dwa dni po odsadzeniu.

Tabela 1

Częstotliwość przeprowadzania oceny charakterystycznych punktów fizycznych i rozwojowych oraz funkcjonalnych/behawioralnych punktów końcowych (2)

Okres rozwoju Punkty końcowe Przed odsadzeniem (3) Dojrzewanie (3) Wczesna dorosłość (3) Charakterystyczne punkty fizyczne i rozwojowe Masa ciała i obserwacje kliniczne co tydzień (4) co najmniej raz na dwa tygodnie co najmniej raz na dwa tygodnie Masa mózgu dzień 22. po urodzeniu (5) na koniec badania Neuropatologia dzień 22. po urodzeniu (5) na koniec badania Dojrzewanie płciowe — w stosownych przypadkach — Inne charakterystyczne punkty rozwojowe (6) w stosownych przypadkach — — Funkcjonalne/behawioralne punkty końcowe Rozwój zachowań co najmniej dwa pomiary Aktywność ruchowa (w tym habituacja) 1–3 razy (7) — raz Funkcje motoryczno-sensoryczne — raz raz Uczenie się i pamięć — raz raz

33. Należy policzyć żywe młode i określić ich płeć, np. dokonując kontroli wizualnej lub pomiaru odległości anogenitalnej (34)(35), a każde młode z miotu powinno być indywidualnie ważone przy porodzie lub wkrótce po nim, co najmniej raz w tygodniu w okresie laktacji i co najmniej raz na dwa tygodnie po nim. Podczas dokonywania oceny dojrzałości płciowej należy określić wiek i masę ciała zwierzęcia w momencie otwarcia pochwy (36) lub oddzielenia napletka (37) co najmniej w odniesieniu do jednego samca i jednej samicy na miot.

Rozwój zachowań

34. Należy dokonywać pomiarów rozwoju wybranych zachowań u co najmniej jednego młodego/płeć/miot w odpowiednim okresie wiekowym, przy czym to samo młode jest wykorzystywane przez wszystkie dni badania do oceny wszystkich zachowań. Należy zachować jednakowy odstęp dni pomiarów w tym okresie, aby określić normalne lub związane z doświadczeniem zmiany w rozwoju danego zachowania (38). Niektóre przykłady zachowań, w odniesieniu do których można ocenić ich rozwój, są następujące: odruch przyjmowania wyprostowanej postawy, ujemna geotaksja i aktywność ruchowa (38)(39)(40).

Aktywność ruchowa

35. Należy monitorować aktywność ruchową (41)(42)(43)(44)(45) w okresie przed odsadzeniem i w wieku dorosłym. W odniesieniu do badań w czasie odsadzania zob. pkt 32. Sesja badawcza powinna być na tyle długa, aby wykazać w jej trakcie habituację grup kontrolnych nieobjętych narażeniem. Wyraźnie zaleca się wykorzystanie aktywności ruchowej do oceny rozwoju zachowań. Jeżeli wykorzystuje się ją do badania rozwoju zachowań, we wszystkich sesjach badawczych prowadzonych przed odsadzeniem powinno się poddawać ocenie te same zwierzęta. Badanie powinno odbywać się wystarczająco często, aby ocenić rozwój habituacji w trakcie danej sesji (44). W tym celu mogą być wymagane trzy lub więcej okresów czasu, obejmujące okres przed odsadzeniem i dzień odsadzenia (np. dni 13., 17., 21. po urodzeniu). Badanie tych samych zwierząt lub zwierząt z jednego miotu powinno także mieć miejsce w odniesieniu do zwierząt dorosłych tuż przed zakończeniem badania (np. dzień 60–70. po urodzeniu). W razie potrzeby można przeznaczyć dodatkowe dni na badanie. Należy monitorować aktywność ruchową za pomocą zautomatyzowanego sprzętu do rejestrowania aktywności, który powinien być w stanie wykryć zarówno wzrost, jak i obniżenie aktywności (tj. podstawowy poziom aktywności mierzony przez urządzenie nie powinien być tak niski, aby uniemożliwić wykrycie obniżenia aktywności, ani tak wysoki, aby uniemożliwić wykrycie jej wzrostu). Każde urządzenie powinno zostać przetestowane w ramach standardowych procedur, aby zapewnić na ile to tylko możliwe niezawodność działania poszczególnych urządzeń w poszczególnych dniach. Na ile to możliwe eksperymentalne grupy powinny zostać przydzielone równomiernie do poszczególnych urządzeń. Każde zwierzę należy badać indywidualnie. Należy równomiernie dostosować grupy eksperymentalne do pór dnia badania, aby uniknąć zakłócenia wywołanego dobowym rytmem aktywności biologicznej. Należy dołożyć starań, aby rozbieżności w warunkach badania były minimalne i niepowiązane systematycznie z podawaniem. Do zmiennych, które mogą wpłynąć na wiele składowych pomiaru zachowania, w tym aktywność ruchową, należą poziom dźwięku, rozmiar i kształt klatki do badań, temperatura, wilgotność względna, warunki świetlne, zapachy, stosowanie klatki macierzystej lub nowatorskiej klatki do badań i zakłócenia środowiskowe.

Funkcje motoryczno-sensoryczne

36. Należy szczegółowo zbadać funkcje motoryczno-sensoryczne co najmniej raz w okresie dojrzewania i raz na wczesnym etapie dorosłości (np. dzień 60–70. po urodzeniu). W odniesieniu do badań w czasie odsadzania zob. pkt 32. Należy przeprowadzić ilość testów wystarczającą do zapewnienia odpowiedniego ilościowego próbkowania modalności sensorycznych (np. somatosensorycznych, równowagi) i funkcji motorycznych (np. siła, koordynacja). Niektóre przykłady badań dotyczących funkcji motoryczno-sensorycznych obejmują odruch prostowania się (46), odruch przyjmowania prawidłowej pozycji (47)(48), habituację do nagłych dźwięków (40)(49)(50)(51)(52)(53)(54) oraz potencjały wywołane (55).

Badania dotyczące uczenia się i pamięci

37. Po odsadzeniu (np. w dniu 25. ± 2 po urodzeniu) i w odniesieniu do młodych dorosłych (dzień 60. po urodzeniu i starsze) należy przeprowadzić badanie asocjacyjnego uczenia się i pamięci. W odniesieniu do badań w czasie odsadzania zob. pkt 32. Na tych dwóch etapach rozwojowych można zastosować to samo badanie lub różne badania. Dopuszcza się pewną elastyczność w wyborze badania (badań) w odniesieniu do uczenia się i pamięci u szczurów odsadzanych i dorosłych. Badania muszą być jednak skonstruowane w taki sposób, aby spełniały dwa kryteria. Po pierwsze, należy oceniać uczenie się jako zmianę w szeregu powtarzanych prób lub sesji uczenia się lub, w badaniach składających się z pojedynczej próby, w odniesieniu do warunku kontrolującego nieasocjacyjne skutki przyzwyczajenia. Po drugie, oprócz podstawowego uczenia się (przyswajania) badania powinny obejmować niektóre pomiary pamięci (krótkotrwałej lub długotrwałej), ale nie można odnotować tego pomiaru pamięci, jeżeli brak jest pomiaru przyswajania uzyskanego w tym samym badaniu. Jeżeli badania uczenia się i pamięci wykażą wpływ badanej substancji chemicznej, można rozważyć przeprowadzenie dodatkowych badań w celu wykluczenia alternatywnych interpretacji na podstawie zmian w zdolnościach sensorycznych, motywacyjnych lub motorycznych. Poza powyższymi dwoma kryteriami zaleca się, aby wybór badania dotyczącego uczenia się i pamięci był oparty na wykazanej w badaniu czułości na klasę badanej substancji chemicznej, jeżeli informację dotyczącą tej wrażliwości można znaleźć w literaturze. W przypadku braku takiej informacji przykłady badań, które mogłyby zostać przeprowadzone, aby spełnić powyższe kryteria, obejmują: unikanie bierne (43)(56)(57), opóźnienie w orientacji przestrzennej w przypadku dorosłych szczurów (58) i szczurów tuż po urodzeniu (59), warunkowanie węchowe (43)(60), labirynt wodny Morrisa (61)(62)(63), labirynt Biela lub labirynt typu Cincinnati (64)(65), koncentrycznie ramienny labirynt (66), labirynt typu T (43) oraz nabycie i utrzymanie zachowań kontrolowanych zgodnie z planem (26)(67)(68). Dodatkowe badania opisano w literaturze dotyczącej szczurów odsadzonych (26)(27) i dorosłych szczurów (19)(20).

Sekcja zwłok

38. Po odsadzeniu potomstwa matki można poddać eutanazji.

39. Ocena neuropatologiczna potomstwa zostanie przeprowadzona przy użyciu tkanek zwierząt uśmierconych w sposób humanitarny w dniu 22. po urodzeniu lub we wcześniejszym punkcie czasowym między dniem 11. a 22. po urodzeniu oraz na koniec badania. W przypadku potomstwa uśmierconego w dniu 22. po urodzeniu należy ocenić tkanki mózgu, a w przypadku zwierząt uśmierconych na koniec badania należy ocenić zarówno tkanki ośrodkowego układu nerwowego, jak i tkanki obwodowego układu nerwowego. Zwierzęta uśmiercone w dniu 22. po urodzeniu lub wcześniej mogą zostać utrwalone za pomocą zanurzenia lub perfuzji. Zwierzęta uśmiercone na koniec badania należy utrwalić za pomocą perfuzji. Na wszystkich etapach preparowania próbek tkanek, począwszy od procesu perfuzji zwierząt przez wycinanie próbek tkanki, przetwarzanie tkanki i barwienie preparatów, należy stosować zrównoważony schemat, tak aby każda seria zawierała reprezentatywne próbki z każdej grupy dawkowania. Dodatkowe wytyczne dotyczące neuropatologii można znaleźć w dokumencie zawierającym wytyczne OECD nr 20 (9), zob. również (103).

Przetwarzanie próbek tkanki

40. Należy odnotować wszystkie poważne anomalie dostrzegalne podczas autopsji. Pobrane próbki tkanek powinny reprezentować wszystkie główne obszary układu nerwowego. Próbki tkanek należy przechowywać w odpowiednim utrwalaczu i przetwarzać zgodnie z opublikowanymi znormalizowanymi protokołami histologicznymi (69)(70)(71)(103). Dopuszczalne jest zanurzenie tkanek ośrodkowego układu nerwowego i obwodowego układu nerwowego w parafinie, ale stosowanie osmu po utrwaleniu wstępnym wraz z zanurzeniem w żywicach epoksydowych może być odpowiednie, gdy wymagany jest wyższy stopień rozdzielczości (np. w przypadku nerwów obwodowych, gdy podejrzewa się neuropatię obwodową, lub w przypadku analizy morfometrycznej nerwów obwodowych). Tkankę mózgową zgromadzoną do celów analizy morfometrycznej należy zanurzyć w odpowiednich roztworach w odniesieniu do wszystkich dawek w tym samym czasie, aby uniknąć pojawienia się artefaktów będących efektem kurczenia się pobranego materiału, co może być związane z przedłużonym przechowywaniem w utrwalaczu (6).

Badanie neuropatologiczne

41. Cele obserwacji jakościowej są następujące:

(i) identyfikacja obszarów w układzie nerwowym wykazujących dowody zmian neuropatologicznych;

(ii) identyfikacja rodzajów zmian neuropatologicznych wynikających z narażenia na działanie badanej substancji chemicznej; oraz

(iii) określenie zakresu dotkliwości zmian neuropatologicznych.

Odpowiednio wyszkolony patolog powinien zbadać mikroskopowo reprezentatywne wycinki histologiczne próbek tkanek pod kątem wystąpienia zmian neuropatologicznych. Wszystkim zmianom neuropatologicznym należy przypisać subiektywny stopień wskazujący dotkliwość. Barwniki hemotaksylina i eozyna mogą być wystarczające do przeprowadzenia oceny wycinków mózgu zwierząt uśmierconych w sposób humanitarny w dniu 22. po urodzeniu lub wcześniej. W odniesieniu do wycinków tkanek ośrodkowego układu nerwowego i obwodowego układu nerwowego pochodzących od zwierząt uśmierconych na koniec badania zaleca się jednak barwnik mieliny (np. luxol fast blue/fiolet krezylowy) i barwnik srebrny (do barwienia metodą Bielschowsky'ego lub Bodiana (srebrzenie)). Z zastrzeżeniem profesjonalnego osądu patologa i rodzaju zaobserwowanych zmian można uznać adekwatność innych barwników do identyfikowania i scharakteryzowania szczególnych rodzajów zmian (np. kwaśne białko włókienkowe (GFAP) lub histochemia lektyn do oceny zmian komórek glejowych lub mikroglejowych (72), fluorochrom Fluor-Jade do wykrywania martwicy (73)(74), lub barwniki srebrne, w szczególności w odniesieniu do chorób neurodegeneracyjnych (75)).

42. Należy przeprowadzić ocenę morfometryczną (ilościową), ponieważ uzyskane z niej dane mogą pomóc w wykrywaniu skutków związanych z podawaniem i są cenne w interpretowaniu związanych z podawaniem różnic w masie mózgu lub morfologii (76)(77). Należy pobrać próbki tkanki nerwowej i spreparować je w celu umożliwienia przeprowadzenia oceny morfometrycznej. Ocena morfometryczna może obejmować np. pomiary liniowe lub powierzchniowe określonych obszarów mózgu (78). Pomiary liniowe lub powierzchniowe wymagają zastosowania homologicznych wycinków, które starannie wybrano na podstawie wiarygodnych, mikroskopowych punktów charakterystycznych (6). Można zastosować stereologię w celu zidentyfikowania związanego z podawaniem wpływu na parametry takie jak objętość lub liczba komórek w odniesieniu do określonych obszarów neuroanatomicznych (79)(80)(81)(82)(83)(84).

43. Należy zbadać mózgi pod kątem wszelkich dowodów zmian neuropatologicznych związanych z podawaniem i pobrać odpowiednie próbki ze wszystkich głównych obszarów mózgu (np. opuszków węchowych, kory mózgu, hipokampu, jądra podstawnego, wzgórza, podwzgórza, śródmózgowia (pokrywy śródmózgowia, nakrywki śródmózgowia i konarów mózgu), mostu, rdzenia przedłużonego, móżdżka), aby zapewnić dokładność badania. Ważne jest, aby wycinki od wszystkich zwierząt zostały pobrane w tej samej płaszczyźnie. W odniesieniu do zwierząt dorosłych uśmierconych w sposób humanitarny na koniec badania należy pobrać próbki reprezentatywnych wycinków rdzenia kręgowego i obwodowego układu nerwowego. Obszary badane powinny obejmować oko z nerwem wzrokowym i siatkówką, rdzeń kręgowy na poziomie opuchniętych kręgów szyjnych i lędźwiowych, włókno korzeni grzbietowych i brzusznych, proksymalny odcinek nerwu kulszowego, proksymalny odcinek nerwu piszczelowego (przy kolanie) i gałęzie mięśniowe nerwu piszczelowego. Skrawki rdzenia kręgowego i nerwów obwodowych powinny obejmować przekroje poprzeczne i podłużne.

44. Oprócz zmian komórkowych (np. wakuolizacji neuronów, degeneracji, martwicy) i zmian tkanek (np. glejozy, nacieku leukocytów, torbieli) ocena neuropatologiczna powinna obejmować badanie pod kątem wskaźników zaburzeń rozwojowych w układzie nerwowym (6)(85)(86)(87)(88)(89). W tym względzie ważne jest odróżnienie skutków związanych z podawaniem od zwykłych zjawisk związanych z rozwojem, o których wiadomo, że wystąpią w stadium rozwojowym odpowiadającym czasowi uśmiercenia (90). Przykłady znacznych zmian, które wskazują na nieprawidłowy rozwój, obejmują między innymi:

— zmiany wielkości lub kształtu opuszek węchowych, mózgu lub móżdżka,

— zmiany względnej wielkości różnych obszarów mózgu, w tym zmniejszenia lub powiększenia wielkości obszarów wynikające ze straty lub utrzymywania się zwykle przejściowych populacji komórek bądź rzutów neuronów (np. zewnętrzne listki zarodkowe móżdżka, ciało modzelowate),

— zmiany w proliferacji, migracji i różnicowaniu, na które wskazują obszary nadmiernej apoptozy lub martwicy, skupiska lub rozproszone populacje ektopowych, zdezorientowanych lub zdeformowanych neuronów lub zmian we względnej wielkości różnych warstw struktur korowych,

— zmiany w strukturach mielinacji, w tym ogólna redukcja wielkości lub zmienione barwienie struktur mielinowych,

— oznaki wodogłowia, w szczególności powiększenie komór, zwężenie wodociągu mózgu i coraz cieńsze półkule mózgu.

Analiza zależności dawka-odpowiedź w zmianach neuropatologicznych

45. Do celów przeprowadzenia neuropatologicznej analizy jakościowej i ilościowej zaleca się stosowanie następujących procedur sekwencyjnych. Po pierwsze, wycinki z grupy otrzymującej wysoką dawkę porównuje się z wycinkami pozyskanymi z grupy kontrolnej. Jeżeli u zwierzęcia z grupy otrzymującej wysoką dawkę nie wykryto żadnych zmian neuropatologicznych, dalsze analizy nie są wymagane. Jeżeli w grupie otrzymującej wysoką dawkę występują zmiany neuropatologiczne, poddaje się badaniom zwierzęta z grupy otrzymującej średnią dawkę i z grupy otrzymującej niską dawkę. W przypadku gdy grupa otrzymująca wysoką dawkę zostaje wyeliminowana ze względu na śmierć lub inną zakłócającą toksyczność, należy zbadać grupy otrzymujące średnią i niską dawkę pod kątem zmian neuropatologicznych. W przypadku wystąpienia jakiejkolwiek oznaki neurotoksyczności w grupach otrzymujących niższe dawki należy przeprowadzić w tych grupach badanie neuropatologiczne. Jeżeli podczas badania jakościowego lub ilościowego wykryto jakiekolwiek zmiany neuropatologiczne związane z podawaniem, należy określić zależność tej zmiany od dawki oraz częstotliwość i stopień dotkliwości zmian patologicznych lub zmian morfometrycznych na podstawie oceny wszystkich zwierząt ze wszystkich grup dawkowania. Należy objąć tą oceną wszystkie obszary mózgu, w których występują jakiekolwiek oznaki zmian neuropatologicznych. W odniesieniu do każdego rodzaju zmiany patologicznej należy opisać cechy charakterystyczne stosowane przy określaniu każdego stopnia dotkliwości, wskazując na te cechy, które różnicują poszczególne stopnie. Należy odnotować częstotliwość występowania każdego rodzaju zmiany i stopień jej dotkliwości oraz przeprowadzić analizę statystyczną w celu dokonania oceny charakteru zależności dawka-odpowiedź. Zaleca się stosowanie zakodowanych szkiełek laboratoryjnych (91).

DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ

Dane

46. Dane należy odnotowywać oddzielnie w formie zestawień tabelarycznych przedstawiających w odniesieniu do każdej grupy badanej rodzaj zmiany i liczbę matek, liczbę potomstwa w podziale na płeć i liczbę miotów, u których wystąpił każdy rodzaj zmiany. Jeżeli przeprowadzono bezpośrednie narażenie potomstwa po urodzeniu, należy odnotować drogę, czas trwania i okres narażenia.

Ocena i interpretacja wyników

47. Badanie neurotoksyczności rozwojowej dostarczy informacji na temat wpływu powtarzanego narażenia na substancję chemiczną podczas rozwoju in utero i wczesnego rozwoju po urodzeniu. Ponieważ szczególną uwagę przywiązuje się do punktów końcowych toksyczności ogólnej i neurotoksyczności rozwojowej, wyniki badania pozwolą na odróżnienie skutków neurorozwojowych występujących przy braku ogólnej toksyczności matczynej od występujących jedynie na poziomach, które są toksyczne również dla matki. Ze względu na złożone wzajemne powiązania między projektem badania, analizą statystyczną i biologicznym znaczeniem danych odpowiednia interpretacja danych dotyczących neurotoksyczności rozwojowej będzie wymagała profesjonalnego osądu (107)(109). Przy interpretowaniu wyników badania należy stosować podejście wagi dowodów (20)(92)(93)(94). Należy omówić wzory wyników badań behawioralnych lub morfologicznych, jeżeli występują, oraz dowody zależności dawka-odpowiedź. W tej charakterystyce należy zawrzeć dane pochodzące ze wszystkich badań powiązanych z oceną neurotoksyczności rozwojowej, w tym badań epidemiologicznych lub studiów przypadków u ludzi, i badań na zwierzętach doświadczalnych (np. dane toksykokinetyczne, informacje dotyczące związku między strukturą a działaniem, dane z innych badań toksyczności). Obejmują one związek między dawkami badanej substancji chemicznej a obecnością lub brakiem, częstotliwością występowania i zakresem każdego skutku neurotoksycznego w odniesieniu do każdej płci (20)(95).

48. Ocena danych powinna obejmować omówienie istotności biologicznej i statystycznej. Należy postrzegać analizę statystyczną raczej jako narzędzie, które nie determinuje interpretacji danych, a tylko wskazuje sposób. Brak istotności statystycznej nie powinien stanowić jedynego uzasadnienia dla stwierdzenia braku skutków związanych z podaniem, tak jak istotność statystyczna nie powinna stanowić jedynego uzasadnienia dla stwierdzenia skutków związanych z podaniem. Aby chronić przed ewentualnie fałszywie ujemnymi wynikami i trudnościami wiążącymi się nieodłącznie z »przeprowadzaniem dowodu negatywnego«, należy omówić dostępne dane dotyczące dodatniej i historycznej kontroli, zwłaszcza jeżeli nie występują skutki związane z podaniem (102)(106). Należy omówić prawdopodobieństwo fałszywie dodatnich wyników w kontekście całkowitej oceny statystycznej danych (96). Ocena powinna obejmować związek, jeżeli taki występuje, między obserwowanymi zmianami neuropatologicznymi i behawioralnymi.

49. Należy przeanalizować wszystkie wyniki, stosując modele statystyczne odpowiednie do schematu doświadczalnego (108). Należy uzasadnić wybór analizy parametrycznej lub nieparametrycznej, uwzględniając czynniki takie jak charakter danych (przetworzone lub nieprzetworzone) i ich rozkład oraz względną odporność wybranej analizy statystycznej. Wybór analizy statystycznej powinien być podyktowany celem i projektem badania, aby ograniczyć do minimum błędy typu I (fałszywie dodatnie) i typu II (fałszywie ujemne) (96)(97)(104)(105). W badaniach rozwojowych, w których wykorzystuje się gatunki wielorodne i w których badaniom poddana jest większa liczba młodych z danego miotu, należy uwzględnić miot w modelu statystycznym, aby uniknąć zbyt wielu błędów typu I (98)(99)(100)(101). Statystyczną jednostką miary powinien być miot, a nie młode. Doświadczenia powinny być zaprojektowane w taki sposób, aby zwierzęta z jednego miotu nie były traktowane jak oddzielne obiekty obserwacji. Należy kilkakrotnie przeprowadzić analizę każdego punktu końcowego mierzonego w tym samym podmiocie, stosując modele statystyczne, które wyjaśniają zależność tych pomiarów.

Sprawozdanie z badania

50. Sprawozdanie z badania powinno zawierać następujące informacje:

Badana substancja chemiczna:

— charakter fizyczny i, w stosownych przypadkach, właściwości fizykochemiczne,

— dane identyfikacyjne, w tym źródło,

— czystość preparatu i znane lub przewidywane zanieczyszczenia.

Nośnik (w stosownych przypadkach):

— uzasadnienie wyboru nośnika, jeżeli jest inny niż woda lub roztwór soli fizjologicznej.

Badane zwierzęta:

— wykorzystany gatunek i szczep oraz uzasadnienie, jeżeli wykorzystano inne zwierzęta niż szczury,

— dostawca badanych zwierząt,

— liczba zwierząt, ich wiek na początku badań i ich płeć,

— źródło pochodzenia, warunki trzymania, pasza, woda itp.,

— masa ciała każdego zwierzęcia na początku badania.

Warunki badania:

— uzasadnienie w odniesieniu do wyboru poziomu dawki,

— uzasadnienie w odniesieniu do drogi dawkowania i okresu dawkowania,

— specyfikacje w zakresie podawanych dawek, w tym szczegóły dotyczące nośnika, objętości i formy fizycznej podawanego materiału,

— szczegóły dotyczące przygotowania formy użytkowej badanej substancji chemicznej/przygotowania paszy, uzyskanego stężenia, trwałości i jednorodności preparatu,

— metoda stosowana do niepowtarzalnej identyfikacji matek i potomstwa,

— szczegółowy opis procedur(-y) randomizacji stosowanych(-ej) do przydzielania matek do grup badanych, doboru młodych do eliminacji i przydzielania młodych do grup eksperymentalnych,

— szczegóły dotyczące podawania badanej substancji chemicznej,

— w stosownych przypadkach przeliczenie stężeń (ppm) badanej substancji chemicznej w paszy/wodzie pitnej lub roztworze do inhalacji na dawkę faktyczną (mg/kg masy ciała/dzień),

— warunki środowiskowe,

— szczegóły dotyczące jakości pokarmu i wody (np. kranowa, destylowana),

— daty rozpoczęcia i zakończenia badania.

Obserwacje i procedury badawcze:

— szczegółowy opis procedur stosowanych do standaryzacji obserwacji i procedur oraz definicji operacyjnych do celów punktowego oceniania obserwacji,

— wykaz wszystkich procedur badawczych i uzasadnienie ich zastosowania,

— szczegóły dotyczące zastosowanych procedur badań behawioralnych/funkcjonalnych, patologicznych, neurochemicznych lub elektrofizjologicznych, w tym informacje i szczegóły dotyczące urządzeń automatycznych,

— procedury kalibracji i zapewniania równoważności urządzeń oraz bilansowanie grup eksperymentalnych w procedurach badawczych,

— krótkie uzasadnienie wyjaśniające wszelkie decyzje wiążące się z profesjonalnym osądem.

Wyniki (indywidualne i zbiorcze, w tym średnia i wariancja w stosownych przypadkach):

— liczba zwierząt na początku badania i liczba zwierząt na końcu badania,

— liczba zwierząt i miotów wykorzystanych do każdej metody badawczej,

— numer identyfikacyjny każdego zwierzęcia i miot, z którego pochodzi,

— liczebność miotu i jego średnia ważona przy urodzeniu w podziale na płeć,

— masa ciała i dane dotyczące zmiany masy ciała, w tym masa ciała matek i potomstwa na koniec badań,

— dane dotyczące spożycia pokarmu oraz, w razie potrzeby, wypitej wody (np. jeżeli badana substancja chemiczna jest podawana z wodą),

— dane dotyczące reakcji toksycznej według płci i dawki, w tym objawy toksyczności lub śmiertelność, w stosownych przypadkach z podaniem czasu i przyczyny śmierci,

— charakter szczegółowych obserwacji klinicznych, ich dotkliwość, czas trwania, dzień rozpoczęcia, pora dnia i ich późniejszy przebieg,

— wynik punktowy w odniesieniu do każdego charakterystycznego punktu rozwojowego (masy ciała, dojrzałości płciowej i rozwoju zachowań) z każdego okresu obserwacji,

— szczegółowy opis wszystkich wyników badań behawioralnych, funkcjonalnych, neuropatologicznych, neurochemicznych, elektrofizjologicznych według płci, w tym wzrosty i spadki w porównaniu do grupy kontrolnej,

— wyniki sekcji zwłok,

— masy mózgów,

— wszelkie diagnozy postawione na podstawie objawów neurologicznych i zmian patologicznych, w tym pojawiające się w sposób naturalny choroby lub warunki,

— obrazy przykładowych wyników badań,

— obrazy z urządzeń o małej mocy do oceny homologii wycinków zastosowanych do celów morfometrii,

— dane dotyczące wchłaniania i metabolizmu, w tym dane uzupełniające z odrębnych badań toksykokinetycznych, jeżeli są dostępne,

— statystyczne opracowanie wyników, w tym modele statystyczne zastosowane w celu analizy danych, i wyniki, niezależnie od tego, czy były istotne,

— wykaz personelu badawczego, w tym odbyte szkolenia zawodowe.

Omówienie wyników:

— informacje dotyczące zależności dawka-odpowiedź według płci i grupy,

— związek wszelkich innych skutków toksycznych z wnioskiem dotyczącym neurotoksycznego potencjału badanej substancji chemicznej według płci i grupy,

— wpływ wszelkich informacji toksykokinetycznych na wnioski,

— podobieństwa skutków do jakichkolwiek znanych środków neurotoksycznych,

— dane potwierdzające wiarygodność i czułość metody badawczej (np. dodatnie i historyczne dane kontrolne),

— związki, jeżeli występują, między skutkami neuropatologicznymi a czynnościowymi,

— NOAEL lub dawka wyznaczająca w odniesieniu do matek i potomstwa według płci i grupy.

Wnioski:

— omówienie ogólnej interpretacji danych na podstawie wyników, w tym wniosek dotyczący tego, czy badana substancja chemiczna spowodowała neurotoksyczność rozwojową, i NOAEL.

LITERATURA

(1) OECD (1995), Draft Report of the OECD Ad Hoc Working Group on Reproduction and Developmental Toxicity, Kopenhaga, Dania, 13–14 czerwca 1995 r.

(2) US EPA (1998). U.S. Environmental Protection Agency Health Effects Test Guidelines. OPPTS 870.6300. Developmental Neurotoxicity Study. US EPA 712-C-98-239, Dostępne na stronie: [http://www.epa.gov/opptsfrs/OPPTS_Harmonized/870_Health_Effects_Test_Guidelines/Series/].

(3) US EPA (1998). Guidelines for Neurotoxicity Risk Assessment. US EPA 630/R-95/001F. Dostępne na stronie: [http://cfpub.epa.gov/ncea/cfm/recordisplay.cfm?PrintVersion=True&deid=12479].

(4) Cory-Slechta, D.A., Crofton, K.M., Foran, J.A., Ross, J.F., Sheets, L.P., Weiss B., Mileson B. (2001), »Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: I. Behavioral effects«, Environ. Health Perspect. 109, s. 79–91.

(5) Dorman, D.C., Allen, S.L., Byczkowski, J.Z., Claudio, L., Fisher J.E. Jr., Fisher J.W., Harry G.J., Li A.A., Makris S.L., Padilla S., Sultatos L.G., Mileson B.E. (2001), »Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: III. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations«, Environ. Health Perspect. 109, s. 101–111.

(6) Garman, R.H., Fix, A.S., Jortner, B.S., Jensen, K.F., Hardisty, J.F., Claudio, L., Ferenc, S. (2001), »Methods to identify and characterize developmental neurotoxicity for human health risk assessment: II. Neuropathology«, Environ. Health Perspect. 109, s. 93–100.

(7) OECD (2003), Report of the OECD Expert Consultation Meeting on Developmental Neurotoxicity Testing, Waszyngton D.C., US, 23–25 października 2000 r.

(8) OECD (2008), OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 43. Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. Environment Directorate, OECD, Paryż, lipiec 2008 r. Dostępne na stronie: [http://search.oecd.org/officialdocuments/displaydocumentpdf/?cote=env/jm/mono(2008)16&doclanguage=en].

(9) OECD (2003). OECD Environment, Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment No. 20. Guidance Document for Neurotoxicity Testing. Environment Directorate, OECD, Paryż, wrzesień 2003 r. Dostępne na stronie: [http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html].

(10) Kimmel, C.A., Rees, D.C., Francis, E.Z. (1990), »Qualitative and quantitative comparability of human and animal developmental neurotoxicity«, Neurotoxicol. Teratol. 12, s. 173–292.

(11) Spencer, P.S., Schaumburg, H.H., Ludolph, A.C. (2000), Experimental and Clinical Neurotoxicology, 2nd Edition, ISBN 0195084772, Oxford University Press, Nowy Jork.

(12) Mendola, P., Selevan, S.G., Gutter, S., Rice, D. (2002), »Environmental factors associated with a spectrum of neurodevelopmental deficits«, Ment. Retard. Dev. Disabil. Res. Rev. 8, s. 188–197.

(13) Slikker, W.B., Chang, L.W. (1998), Handbook of Developmental Neurotoxicology, 1st Edition, ISBN 0126488606, Academic Press, Nowy Jork.

(14) Rozdział B.34 niniejszego załącznika: »Badanie toksyczności reprodukcji jednego pokolenia«.

(15) Rozdział B.35 niniejszego załącznika: »Dwupokoleniowe badanie toksyczności reprodukcyjnej«.

(16) Rozdział B.43 niniejszego załącznika: »Badanie neurotoksyczności u gryzoni«.

(17) Rozdział B.31 niniejszego załącznika: »Badanie przedurodzeniowej toksyczności rozwojowej«.

(18) Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady 2010/63/UE z dnia 22 września 2010 r. w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych. Dz.U. L 276 z 20.10.2010, s. 33.

(19) WHO (1986), Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals (Environmental Health Criteria 60), Albany, Nowy Jork: World Health Organization Publications Center, USA. Dostępne na stronie: [http://www.inchem.org/documents/ehc/ehc/ehc060.htm].

(20) WHO (2001), Neurotoxicity Risk Assessment for Human Health: Principles and Approaches (Environmental Health Criteria 223), World Health Organization Publications, Genewa. Dostępne na stronie: [http://www.intox.org/databank/documents/supplem/supp/ehc223.htm].

(21) Chang, L.W., Slikker, W. (1995), Neurotoxicology: Approaches and Methods, 1st Edition, ISBN 012168055X, Academic Press, Nowy Jork.

(22) De Cabo, C., Viveros, M.P. (1997), »Effects of neonatal naltrexone on neurological and somatic development in rats of both genders«, Neurotoxicol. Teratol. 19, s. 499–509.

(23) Agnish, N.D., Keller, K.A. (1997), »The rationale for culling of rodent litters«, Fundam. Appl. Toxicol. 38, s. 2–6.

(24) Avery, D.L., Spyker, J.M. (1977), »Foot tattoo of neonatal mice«, Lab. Animal Sci. 27, s. 110–112.

(25) Wier, P.J., Guerriero, F.J., Walker, R.F. (1989), »Implementation of a primary screen for developmental neurotoxicity«, Fundam. Appl. Toxicol. 13, s. 118–136.

(26) Spear, N.E., Campbell, B.A. (1979), Ontogeny of Learning and Memory. ISBN 0470268492, Erlbaum Associates, New Jersey.

(27) Krasnegor, N.A., Blass, E.M., Hofer, M.A., Smotherman, W. (1987), Perinatal Development: A Psychobiological Perspective, Academic Press, Orlando.

(28) Zoetis, T., Walls, I. (2003), Principles and Practices for Direct Dosing of Pre-Weaning Mammals in Toxicity Testing and Research, ILSI Press, Waszyngton, DC.

(29) Moser, V., Walls, I., Zoetis, T. (2005), »Direct dosing of preweaning rodents in toxicity testing and research: Deliberations of an ILSI RSI expert working group«, Int. J. Toxicol. 24, s. 87–94.

(30) Conolly, R.B., Beck, B.D., Goodman, J.I. (1999), »Stimulating research to improve the scientific basis of risk assessment«, Toxicol. Sci. 49, s. 1–4.

(31) ICH (1993) ICH Harmonised Tripartite Guideline: »Detection of Toxicity to Reproduction for Medical Products (S5 A)«. Międzynarodowa konferencja ds. harmonizacji wymagań technicznych dla rejestracji produktów leczniczych stosowanych u ludzi.

(32) Lochry, E.A. (1987), »Concurrent use of behavioral/functional testing in existing reproductive and developmental toxicity screens: Practical considerations«, J. Am. Coll. Toxicol. 6, s. 433–439.

(33) Tachibana, T., Narita, H., Ogawa, T., Tanimura, T. (1998), »Using postnatal age to determine test dates leads to misinterpretation when treatments alter gestation length, results from a collaborative behavioral teratology study in Japan«, Neurotoxicol. Teratol. 20, s. 449–457.

(34) Gallavan, R.H. Jr., Holson, J.F., Stump, D.G., Knapp, J.F., Reynolds, V.L. (1999), »Interpreting the toxicologic significance of alterations in anogenital distance: potential for confounding effects of progeny body weights«, Reprod. Toxicol. 13, s. 383–390.

(35) Gray, L.E. Jr., Ostby, J., Furr, J., Price, M., Veeramachaneni, D.N., Parks, L. (2000), »Perinatal exposure to the phthalates DEHP, BBP, and DINP, but not DEP, DMP, or DOTP, alters sexual differentiation of the male rat«, Toxicol. Sci. 58, s. 350–365.

(36) Adams, J., Buelke-Sam, J., Kimmel, C.A., Nelson, C.J., Reiter, L.W., Sobotka, T.J., Tilson, H.A., Nelson, B.K. (1985), »Collaborative behavioral teratology study: Protocol design and testing procedure«, Neurobehav. Toxicol. Teratol. 7, s. 579–586.

(37) Korenbrot, C.C., Huhtaniemi, I.T., Weiner, R.W. (1977), »Preputial separation as an external sign of pubertal development in the male rat«, Biol. Reprod. 17, s. 298–303.

(38) Spear, L.P. (1990), »Neurobehavioral assessment during the early postnatal period«, Neurotoxicol. Teratol. 12, s. 489–95.

(39) Altman, J., Sudarshan, K. (1975), »Postnatal development of locomotion in the laboratory rat«, Anim. Behav. 23, s. 896–920.

(40) Adams, J. (1986), »Methods in Behavioral Teratology«, [w:] Handbook of Behavioral Teratology, Riley, E.P., Vorhees, C.V. (red.) Plenum Press, Nowy Jork, s. 67–100.

(41) Reiter, L.W., MacPhail, R.C. (1979), »Motor activity: A survey of methods with potential use in toxicity testing«, Neurobehav. Toxicol. 1, s. 53–66.

(42) Robbins, T.W. (1977), »A critique of the methods available for the measurement of spontaneous motor activity«, [w:] Handbook of Psychopharmacology, Vol. 7, Iverson, L.L., Iverson, D.S., Snyder, S.H., (red.) Plenum Press, Nowy Jork, s. 37–82.

(43) Crofton, K.M., Peele, D.B., Stanton, M.E. (1993), »Developmental neurotoxicity following neonatal exposure to 3,3'-iminodipropionitrile in the rat«, Neurotoxicol. Teratol. 15, s. 117–129.

(44) Ruppert, P.H., Dean, K.F., Reiter, L.W. (1985), »Development of locomotor activity of rat pups in figure-eight mazes«, Dev. Psychobiol. 18, s. 247–260.

(45) Crofton, K.M., Howard, J.L., Moser, V.C., Gill, M.W., Reiter, L.W., Tilson, H.A., MacPhail, R.C. (1991), »Interlaboratory comparison of motor activity experiments: Implications for neurotoxicological assessments«, Neurotoxicol. Teratol. 13, s. 599–609.

(46) Ross, J.F., Handley, D.E., Fix, A.S., Lawhorn, G.T., Carr, G.J. (1997), »Quantification of the hind-limb extensor thrust response in rats«, Neurotoxicol. Teratol. 19, 1997 r., s. 405–411.

(47) Handley, D.E., Ross, J.F., Carr, G.J. (1998), »A force plate system for measuring low-magnitude reaction forces in small laboratory animals«, Physiol. Behav. 64, s. 661–669.

(48) Edwards, P.M., Parker, V.H. (1977), »A simple, sensitive, and objective method for early assessment of acrylamide neuropathy in rats«, Toxicol. Appl. Pharmacol. 40, s. 589–591.

(49) Davis, M. (1984), »The mammalian startle response«, [w:] Neural Mechanisms of Startle Behavior, Eaton, R.C. (red.), Plenum Press, Nowy Jork, s. 287–351.

(50) Koch, M. (1999), »The neurobiology of startle«, Prog. Neurobiol. 59, s. 107–128.

(51) Crofton, K.M. (1992), »Reflex modification and the assessment of sensory dysfunction«, [w:] Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicology, Tilson, H., Mitchell, C. (red.). Raven Press, Nowy Jork, s. 181–211.

(52) Crofton, K.M., Sheets, L.P. (1989), »Evaluation of sensory system function using reflex modification of the startle response«, J. Am. Coll. Toxicol. 8, s. 199–211.

(53) Crofton, K.M, Lassiter, T.L, Rebert, C.S. (1994), »Solvent-induced ototoxicity in rats: An atypical selective mid-frequency hearing deficit«, Hear. Res. 80, s. 25–30.

(54) Ison, J.R. (1984), »Reflex modification as an objective test for sensory processing following toxicant exposure«, Neurobehav. Toxicol. Teratol. 6, s. 437–445.

(55) Mattsson, J.L., Boyes, W.K., Ross, J.F. (1992), »Incorporating evoked potentials into neurotoxicity test schemes«, [w:] Target Organ Toxicology Series: Neurotoxicity, Tilson, H., Mitchell, C., (red.), Raven Press, Nowy Jork. s. 125–145.

(56) Peele, D.B., Allison, S.D., Crofton, K.M. (1990), »Learning and memory deficits in rats following exposure to 3,3'-iminopropionitrile«, Toxicol. Appl. Pharmacol. 105, s. 321–332.

(57) Bammer, G. (1982), »Pharmacological investigations of neurotransmitter involvement in passive avoidance responding: A review and some new results«, Neurosci. Behav. Rev. 6, s. 247–296.

(58) Bushnell, P.J. (1988), »Effects of delay, intertrial interval, delay behavior and trimethyltin on spatial delayed response in rats«, Neurotoxicol. Teratol. 10, s. 237–244.

(59) Green, R.J., Stanton, M.E. (1989), »Differential ontogeny of working memory and reference memory in the rat«, Behav. Neurosci. 103, s. 98–105.

(60) Kucharski, D., Spear, N.E. (1984), »Conditioning of aversion to an odor paired with peripheral shock in the developing rat«, Develop. Psychobiol. 17, s. 465–479.

(61) Morris, R. (1984), »Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat«, J. Neurosci. Methods 11, s. 47–60.

(62) Brandeis, R., Brandys, Y., Yehuda, S. (1989), »The use of the Morris water maze in the study of memory and learning«, Int. J. Neurosci. 48, s. 29–69.

(63) D'Hooge, R., De Deyn, P.P. (2001), »Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory«, Brain Res. Rev. 36, s. 60–90.

(64) Vorhees, C.V. (1987), »Maze learning in rats: A comparison of performance in two water mazes in progeny prenatally exposed to different doses of phenytoin«, Neurotoxicol. Teratol. 9, s. 235–241.

(65) Vorhees, C.V. (1997), »Methods for detecting long-term CNS dysfunction after prenatal exposure to neurotoxins«, Drug Chem. Toxicol. 20, s. 387–399.

(66) Akaike, M., Tanaka, K., Goto, M., Sakaguchi, T. (1988), »Impaired Biel and Radial arm maze learning in rats with methyl-nitrosurea induced microcephaly«, Neurotoxicol. Teratol. 10, s. 327–332.

(67) Cory-Slechta, D.A., Weiss, B., Cox, C. (1983), »Delayed behavioral toxicity of lead with increasing exposure concentration«, Toxicol. Appl. Pharmacol. 71, s. 342–352.

(68) Campbell, B.A., Haroutunian, V. (1981), »Effects of age on long-term memory: Retention of fixed interval responding«, J. Gerontol. 36, s. 338–341.

(69) Fix, A.S, Garman, R.H. (2000), »Practical aspects of neuropathology: A technical guide for working with the nervous system«, Toxicol. Pathol. 28, s. 122–131.

(70) Prophet, E.B., Mills, B., Arrington, J.B., Sobin, L.H. (1994), Laboratory Methods in Histotechnology, American Registry of Pathology, Waszyngton, DC, s. 84–107.

(71) Bancroft, J.D., Gamble, M. (2002), Theory and Practice of Histological Techniques, 5th edition, Churchill Livingstone, Londyn.

(72) Fix, A.S., Ross, J.F., Stitzel, S.R., Switzer, R.C. (1996), »Integrated evaluation of central nervous system lesions: stains for neurons, astrocytes, and microglia reveal the spatial and temporal features of MK-801-induced neuronal necrosis in the rat cerebral cortex«, Toxicol. Pathol. 24, s. 291–304.

(73) Schmued, L.C., Hopkins, K.J. (2000), »Fluoro-Jade B: A high affinity tracer for the localization of neuronal degeneration«, Brain Res. 874, s. 123–130.

(74) Krinke, G.J., Classen, W., Vidotto, N., Suter, E., Wurmlin, C.H. (2001), »Detecting necrotic neurons with fluoro-jade stain«, Exp. Toxic. Pathol. 53, s. 365–372.

(75) De Olmos, I.S., Beltramino, C.A., and de Olmos de Lorenzo, S. (1994), »Use of an amino-cupric-silver technique for the detection of early and semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia and physical trauma«, Neurotoxicol. Teratol. 16, s. 545–561.

(76) De Groot, D.M.G., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Pakkenberg, B., Pelgrim, M.T.M., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Waanders, M.M., Gundersen, H.J. (2005a), »Regulatory developmental neurotoxicity testing: A model study focusing on conventional neuropathology endpoints and other perspectives«, Environ. Toxicol. Pharmacol. 19, s. 745–755.

(77) De Groot, D.M.G., Hartgring, S., van de Horst, L., Moerkens, M., Otto, M., Bos-Kuijpers, M.H.M., Kaufmann, W.S.H., Lammers, J.H.C.M., O'Callaghan, J.P., Waalkens-Berendsen, I.D.H., Pakkenberg, B., Gundersen, H.J. (2005b), »2D and 3D assessment of neuropathology in rat brain after prenatal exposure to methylazoxymethanol, a model for developmental neurotoxicity«, Reprod. Toxicol. 20, s. 417–432.

(78) Rodier, P.M., Gramann, W.J. (1979), »Morphologic effects of interference with cell proliferation in the early fetal period«, Neurobehav. Toxicol. 1, s. 129–135.

(79) Howard, C.V., Reed, M.G. (1998), Unbiased Stereology: Three-Dimensional Measurement in Microscopy, Springer-Verlag, Nowy Jork.

(80) Hyman, B.T., Gomez-Isla, T., Irizarry, M.C. (1998), »Stereology: A practical primer for neuropathology«, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 57, s. 305–310.

(81) Korbo, L., Andersen, B.B., Ladefoged, O., Møller, A. (1993), »Total numbers of various cell types in rat cerebellar cortex estimated using an unbiased stereological method«, Brain Res. 609, s. 262–268.

(82) Schmitz, C. (1997), »Towards more readily comprehensible procedures in disector stereology«, J. Neurocytol. 26, s. 707–710.

(83) West, M.J. (1999), »Stereological methods for estimating the total number of neurons and synapses: Issues of precision and bias«, Trends Neurosci. 22, s. 51–61.

(84) Schmitz, C., Hof, P.R. (2005), »Design-based stereology in neuroscience«, Neuroscience 130, s. 813–831.

(85) Gavin, C.E., Kates, B., Gerken, L.A., Rodier, P.M. (1994), »Patterns of growth deficiency in rats exposed in utero to undernutrition, ethanol, or the neuroteratogen methylazoxymethanol (MAM)«, Teratology 49, s. 113–121.

(86) Ohno, M., Aotani, H., Shimada, M. (1995), »Glial responses to hypoxic/ischemic encephalopathy in neonatal rat cerebrum«, Develop. Brain Res. 84, s. 294–298.

(87) Jensen KF, Catalano SM. (1998), »Brain morphogenesis and developmental neurotoxicology«, [w:] Handbook of Developmental Neurotoxicology, Slikker, Jr. W., Chang, L.W. (red.), Academic Press, Nowy Jork, s. 3–41.

(88) Ikonomidou, C., Bosch, F., Miksa, M., Bittigau, P., Vöckler, J., Dikranian, K., Tenkova, T.I., Stefovska, V., Turski, L., Olney, J.W. (1999), »Blockade of NMDA receptors and apoptotic neurodegeneration in the developing brain«, Science 283, s. 70–74.

(89) Ikonomidou, C., Bittigau, P., Ishimaru, M.J., Wozniak, D.F., Koch, C., Genz, K., Price, M.T., Sefovska, V., Hörster, F., Tenkova, T., Dikranian, K., Olney, J.W. (2000), »Ethanol-induced apoptotic degeneration and fetal alcohol syndrome«, Science 287, s. 1056–1060.

(90) Friede, R. L. (1989), Developmental Neuropathology, wydanie drugie, Springer-Verlag, Berlin.

(91) House, D.E., Berman, E., Seeley, J.C., Simmons, J.E. (1992), »Comparison of open and blind histopathologic evaluation of hepatic lesions«, Toxicol. Let. 63, s. 127–133.

(92) Tilson, H.A., MacPhail, R.C., Crofton, K.M. (1996), »Setting exposure standards: a decision process«, Environ. Health Perspect. 104, s. 401–405.

(93) US EPA (2005), Guidelines for Carcinogen Risk Assessment US EPA NCEA-F-0644 A.

(94) US EPA (1996), Guidelines for Reproductive Toxicity Risk Assessment, Federal Register 61(212): 56274-56322.

(95) Duńska Agencja Ochrony Środowiska (1995), Neurotoxicology. Review of Definitions, Methodology, and Criteria. Miljøprojekt nr. 282. Ladefoged, O., Lam, H.R., Østergaard, G., Nielsen, E., Arlien-Søborg, P.

(96) Muller, K.E., Barton, C.N., Benignus, V.A. (1984), »Recommendations for appropriate statistical practice in toxicologic experiments«, Neurotoxicology 5, s. 113–126.

(97) Gad, S.C. (1989), »Principles of screening in toxicology with special emphasis on applications to Neurotoxicology«, J. Am. Coll. Toxicol. 8, s. 21–27.

(98) Abby, H., Howard, E. (1973), »Statistical procedures in developmental studies on a species with multiple offspring«, Dev. Psychobiol. 6, s. 329–335.

(99) Haseman, J.K., Hogan, M.D. (1975), »Selection of the experimental unit in teratology studies«, Teratology 12, s. 165–172.

(100) Holson, R.R., Pearce, B. (1992), »Principles and pitfalls in the analysis of prenatal treatment effects in multiparous species«, Neurotoxicol. Teratol. 14, s. 221–228.

(101) Nelson, C.J., Felton, R.P., Kimmel, C.A., Buelke-Sam, J., Adams, J. (1985), »Collaborative Behavioral Teratology Study: Statistical approach«, Neurobehav. Toxicol. Teratol. 7, s. 587–90.

(102) Crofton, K.M., Makris, S.L., Sette, W.F., Mendez, E., Raffaele, K.C. (2004), »A qualitative retrospective analysis of positive control data in developmental neurotoxicity studies«, Neurotoxicol. Teratol. 26, s. 345–352.

(103) Bolon, B., Garman, R., Jensen, K., Krinke, G., Stuart, B., oraz grupa robocza ad hoc STP Scientific and Regulatory Policy Committee. (2006), »A ‘best practices’ approach to neuropathological assessment in developmental neurotoxicity testing — for today«, Toxicol. Pathol. 34, s. 296–313.

(104) Tamura, R.N., Buelke-Sam, J. (1992), »The use of repeated measures analysis in developmental toxicology studies«, Neurotoxicol. Teratol., 14(3), s. 205–210.

(105) Tukey, J.W., Ciminera, J.L., Heyse, J.F. (1985), »Testing the statistical certainty of a response to increasing doses of a drug«, Biometrics, 41, s. 295–301.

(106) Crofton, K.M., Foss, J.A., Haas, U., Jensen, K., Levin, E.D., and Parker, S.P. (2008), »Undertaking positive control studies as part of developmental neurotoxicity testing: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints«, Neurotoxicology and Teratology, 30(4), s. 266–287.

(107) Raffaele, K.C., Fisher, E., Hancock, S., Hazelden, K., and Sobrian, S.K. (2008), »Determining normal variability in a developmental neurotoxicity test: report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints«, Neurotoxicology and Teratology, 30(4), s. 288–325.

(108) Holson, R.R., Freshwater, L., Maurissen, J.P.J., Moser, V.C., and Phang, W. (2008), »Statistical issues and techniques appropriate for developmental neurotoxicity testing: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints«, Neurotoxicology and Teratology, 30(4), s. 326–348.

(109) Tyl, R.W., Crofton, K.M., Moretto, A., Moser, V.C., Sheets, L.P., and Sobotka, T.J. (2008), »Identification and interpretation of developmental neurotoxicity effects: a report from the ILSI Research Foundation/Risk Science Institute expert working group on neurodevelopmental endpoints«, Neurotoxicology and Teratology, 30(4), s. 349–381.

Rysunek 1

Ogólny schemat badań w odniesieniu do badań behawioralnych/funkcjonalnych, oceny neuropatologicznej i mas mózgów. Poniższy diagram jest oparty na opisach z pkt 13–15. Przykłady przydzielania zwierząt znajdują się w dodatku 1.

Dodatek 1 1. Poniżej opisano i przedstawiono w formie tabeli przykłady ewentualnych przydziałów. Przykłady te mają na celu ukazać, że przydział zwierząt objętych badaniem do różnych modeli badania może przebiegać na wiele sposobów. Przykład 1 2. Do badania rozwoju zachowań w okresie przedodsadzeniowym wykorzystuje się grupę 20 młodych/płeć/dawkę (tj. 1 samca i 1 samicę na miot). Spośród tych zwierząt 10 młodych/płeć/dawkę (tj. 1 samiec lub 1 samica na miot) jest uśmiercanych w sposób humanitarny w dniu 22 po urodzeniu. Ich mózgi są usuwane, ważone i przetwarzane do oceny histopatologicznej. Poza tym gromadzi się dane dotyczące masy mózgu, stosując nieutrwalone mózgi pozostałych 10 samców i 10 samic na dawkę. 3. Kolejną grupę 20 zwierząt/płeć/dawkę (tj. 1 samca i 1 samicę na miot) wykorzystuje się do badań funkcjonalnych/behawioralnych w okresie poodsadzeniowym (szczegółowych obserwacji klinicznych, aktywności ruchowej, reakcji na nagły dźwięk i badania funkcji poznawczej u zwierząt w okresie dojrzewania) i oceny wieku dojrzewania płciowego. Spośród tych osobników 10 zwierząt/płeć/dawkę (tj. 1 samiec lub 1 samica na miot) zostaje znieczulonych i utrwalonych przez perfuzję na koniec badania (około dnia 70 po urodzeniu). Po dodatkowym utrwaleniu in situ usuwa się mózg i przetwarza się go w celu oceny neuropatologicznej. 4. W badaniu funkcji poznawczej u młodych dorosłych (np. dzień 60–70 po urodzeniu) wykorzystuje się trzecią grupę 20 młodych/płeć/dawkę (tj. 1 samca i 1 samicę na miot). Spośród tych osobników 10 zwierząt/płeć/dawkę (tj. 1 samiec lub 1 samica na miot) zostaje uśmierconych na koniec badania, a ich mózgi są usuwane i ważone. 5. Pozostałe 20 zwierząt/płeć/grupę zachowuje się do możliwych dodatkowych badań. Tabela 1 Nr młodego (8) Liczba młodych przydzielonych do badania Badanie m f 1 5 20 m + 20 f Rozwój zachowań 10 m + 10 f Masa mózgu/neuropatologia/morfometria w dniu 22 po urodzeniu 10 m + 10 f Masa mózgu w dniu 22 po urodzeniu 2 6 20 m + 20 f Szczegółowe obserwacje kliniczne 20 m + 20 f Aktywność ruchowa 20 m + 20 f Dojrzałość płciowa 20 m + 20 f Funkcje motoryczno-sensoryczne 20 m + 20 f Uczenie się i pamięć (dzień 25 po urodzeniu) 10 m + 10 f Masa mózgu/neuropatologia/morfometria młodego dorosłego w dniu 70 po urodzeniu 3 7 20 m + 20 f Uczenie się i pamięć (młode dorosłe) 10 m + 10 f Masa mózgu młodego dorosłego w dniu 70 po urodzeniu 4 8 — Zatrzymanie zwierząt w celu wymiany lub w celu dodatkowych badań Przykład 2 6. Do badania rozwoju zachowań w okresie przedodsadzeniowym wykorzystuje się grupę 20 młodych/płeć/dawkę (tj. 1 samca i 1 samicę na miot). Spośród tych zwierząt 10 młodych/płeć/dawkę (1 samiec lub 1 samica na miot) jest uśmiercanych w sposób humanitarny w dniu 11 po urodzeniu. Ich mózgi są usuwane, ważone i przetwarzane do oceny histopatologicznej. 7. Inną grupę 20 zwierząt/płeć/dawkę (1 samiec i 1 samica na miot) wykorzystuje się do badań po odsadzeniu (szczegółowych obserwacji klinicznych, aktywności ruchowej, oceny wieku dojrzewania płciowego oraz funkcji motoryczno-sensorycznych). Spośród tych osobników 10 zwierząt/płeć/dawkę (tj. 1 samiec lub 1 samica na miot) zostaje znieczulonych i utrwalonych przez perfuzję na koniec badania (około dnia 70 po urodzeniu). Po dodatkowym utrwaleniu in situ usuwa się mózg, waży się go i przetwarza w celu oceny neuropatologicznej. 8. W badaniu funkcji poznawczej u osobników dojrzewających i młodych dorosłych wykorzystuje się 10 młodych/płeć/dawkę (tj. 1 samca lub 1 samicę na miot). Do celów badań funkcji poznawczej w dniu 23 po urodzeniu i u młodych dorosłych wykorzystuje się inne zwierzęta. Na koniec badania 10 zwierząt/płeć/grupę objętych badaniem jako dorosłe zostaje uśmierconych, a ich mózgi są usuwane i ważone. 9. Pozostałe 20 zwierząt/płeć/grupę niewybranych do badań uśmierca się i utylizuje przy odsadzaniu. Tabela 2 Nr młodego (9) Liczba młodych przydzielonych do badania Badanie m f 1 5 20 m + 20 f Rozwój zachowań 10 m + 10 f Masa mózgu/neuropatologia/morfometria w dniu 11 po urodzeniu 2 6 20 m + 20 f Szczegółowe obserwacje kliniczne 20 m + 20 f Aktywność ruchowa 20 m + 20 f Dojrzałość płciowa 20 m + 20 f Funkcje motoryczno-sensoryczne 10 m + 10 f Masa mózgu/neuropatologia/morfometria młodego dorosłego w dniu 70 po urodzeniu 3 7 10 m + 10 f (10) Uczenie się i pamięć (dzień 23 po urodzeniu) 3 7 10 m + 10 f (10) Uczenie się i pamięć (młode dorosłe) Masa mózgu młodego dorosłego 4 8 — Zwierzęta uśmiercone i zutylizowane w dniu 21 po urodzeniu Przykład 3 10. Do celów pomiaru masy mózgu i oceny neuropatologicznej w dniu 11 po urodzeniu wykorzystuje się grupę 20 młodych/płeć/dawkę (tj. 1 samca i 1 samicę na miot). Spośród tych zwierząt 10 młodych/płeć/dawkę (tj. 1 samiec lub 1 samica na miot) zostaje uśmierconych w sposób humanitarny w dniu 11 po urodzeniu, a ich mózgi są usuwane, ważone i przetwarzane do oceny histopatologicznej. Poza tym gromadzi się dane dotyczące masy mózgu, stosując nieutrwalone mózgi pozostałych 10 samców i 10 samic na dawkę. 11. Kolejną grupę 20 zwierząt/płeć/dawkę (tj. 1 samca i 1 samicę na miot) wykorzystuje się do celów badania rozwoju zachowań (aktywności ruchowej), badań w okresie po odsadzeniu (aktywności ruchowej i oceny wieku dojrzewania płciowego) i badania funkcji poznawczej u osobników dojrzewających. 12. Następną grupę 20 zwierząt/płeć/dawkę (tj. 1 samca i 1 samicę na miot) wykorzystuje się do celów badania funkcji motoryczno-sensorycznych (reakcja na nagły dźwięk) i szczegółowych obserwacji klinicznych. Spośród tych osobników 10 zwierząt/płeć/dawkę (tj. 1 samiec lub 1 samica na miot) zostaje znieczulonych i utrwalonych przez perfuzję na koniec badania (około dnia 70 po urodzeniu). Po dodatkowym utrwaleniu in situ usuwa się mózg, waży się go i przetwarza w celu oceny neuropatologicznej. 13. Do badania funkcji poznawczej u młodych dorosłych wykorzystuje się inną grupę 20 młodych/płeć/dawkę (tj. 1 samca i 1 samicę na miot). Spośród nich 10 zwierząt/płeć/dawkę (tj. 1 samiec lub 1 samica na miot) zostaje uśmierconych na koniec badania, a ich mózgi są usuwane i ważone. Tabela 3 Nr młodego (11) Liczba młodych przydzielonych do badania Badanie m f 1 5 10 m + 10 f Masa mózgu/neuropatologia/morfometria w dniu 11 po urodzeniu 10 m + 10 f Masa mózgu w dniu 11 po urodzeniu 2 6 20 m + 20 f Rozwój zachowań (aktywność ruchowa) 20 m + 20 f Aktywność ruchowa 20 m + 20 f Dojrzewanie płciowe 20 m + 20 f Uczenie się i pamięć (dzień 27 po urodzeniu) 3 7 20 m + 20 f Reakcja na nagły dźwięk (osobniki dojrzewające i młode dorosłe) 20 m + 20 f Szczegółowe obserwacje kliniczne 10 m + 10 f Masa mózgu/neuropatologia/morfometria młodego dorosłego w dniu 70 po urodzeniu 4 8 20 m + 20 f Uczenie się i pamięć (młode dorosłe) 10 m + 10 f Masa mózgu młodego dorosłego

Dodatek 2 Definicje: Substancja chemiczna oznacza substancję lub mieszaninę. Badana substancja chemiczna oznacza każdą substancję lub mieszaninę badaną za pomocą opisywanej metody badawczej.

B.54. TEST BIOLOGICZNY WZROSTU MACICY U GRYZONI: KRÓTKOTERMINOWE BADANIE PRZESIEWOWE WŁAŚCIWOŚCI ESTROGENNYCH

WPROWADZENIE

1. Niniejsza metoda badawcza jest zgodna z dotyczącą badań wytyczną OECD nr 440 (2007 r.). W 1998 r. OECD podjęła działania o wysokim priorytecie, mające na celu zmianę istniejących wytycznych i opracowanie nowych wytycznych na potrzeby badań przesiewowych i badania potencjalnych substancji zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego (1). Jednym z elementów tych działań było opracowanie wytycznych dotyczących biologicznego testu wzrostu macicy u gryzoni. Test biologiczny wzrostu macicy u gryzoni był następnie przedmiotem rozszerzonego programu walidacyjnego, obejmującego sporządzenie szczegółowego dokumentu ramowego (2)(3) i przeprowadzenie obszernych wewnątrz- i międzylaboratoryjnych badań celem wykazania istotności i odtwarzalności testu biologicznego przy użyciu silnego estrogenu referencyjnego, słabych agonistów receptorów estrogenowych, silnego antagonisty receptorów estrogenowych oraz negatywnej chemicznej substancji odniesienia (4)(5)(6)(7)(8)(9). Przedmiotowa metoda badawcza B.54 została opracowana w oparciu o doświadczenia zdobyte w trakcie programu badań walidacyjnych i wyniki otrzymane za pomocą agonistów estrogennych w ramach tego programu.

2. Test biologiczny wzrostu macicy jest krótkoterminowym badaniem przesiewowym, zapoczątkowanym w latach 30. ubiegłego wieku (27)(28); po raz pierwszy został poddany standaryzacji w odniesieniu do badań przesiewowych przez komitet ekspertów w 1962 r. (32)(35). Test ten polega na zwiększeniu masy macicy lub reakcji polegającej na zwiększeniu masy macicy (w celu dokonania przeglądu zob. pkt 29). Test pozwala dokonać oceny zdolności substancji chemicznej do wywoływania aktywności biologicznej zgodnej z aktywnością agonistów i antagonistów naturalnych estrogenów (np. estradiolu 17-beta), jednak jest znacznie rzadziej wykorzystywany do wykrywania antagonistów niż do wykrywania agonistów. Macica reaguje na estrogeny na dwa sposoby. Wstępną reakcją jest wzrost masy w związku z imbibicją wody. Następnie dochodzi do przyrostu masy w związku ze rozrostem tkanki (30). Reakcje macicy u szczurów i myszy są porównywalne pod względem jakościowym.

3. Przedmiotowy test pełni rolę badania przesiewowego in vivo i jego stosowanie należy postrzegać w kontekście ram koncepcyjnych OECD w zakresie badań i oceny substancji zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego (»OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals«) (dodatek 2). W powyższych ramach koncepcyjnych test biologiczny wzrostu macicy przypisano do poziomu 3 jako test in vivo pozwalający uzyskać dane dotyczące pojedynczego mechanizmu układu hormonalnego, tj. estrogenności.

4. Biologiczny test wzrostu macicy ma zostać włączony do zestawu badań in vitro i in vivo w celu identyfikacji substancji chemicznych, które mogą wchodzić w interakcje z układem hormonalnym, co ostatecznie doprowadzi do oceny ryzyka w odniesieniu do zdrowia ludzi i środowiska. W programie walidacyjnym OECD zastosowano zarówno silnych, jak i słabych agonistów estrogenu, aby ocenić skuteczność testu pod względem identyfikacji estrogennych substancji chemicznych (4)(5)(6)(7)(8). W ten sposób oprócz wykazania dobrej odtwarzalności wewnątrz- i międzylaboratoryjnej doskonale wykazano także czułość procedury badawczej dla agonistów estrogenu.

5. Jeżeli chodzi o negatywne związki chemiczne, do programu walidacyjnego włączono zaledwie jedną »negatywną« chemiczną substancję odniesienia, w stosunku do której zgłoszono wynik negatywny w biologicznym teście wzrostu macicy, jak również w wiązaniu receptorowym in vitro, ale oceniono dodatkowe dane z badań niepowiązane z programem walidacyjnym OECD, przedstawiając dalsze dowody na swoistość biologicznego testu wzrostu macicy w odniesieniu do badań przesiewowych agonistów estrogenu (16).

ZAŁOŻENIA WSTĘPNE I OGRANICZENIA

6. Agoniści i antagoniści estrogenu działają jako ligandy w stosunku do receptorów estrogenowych a i b i mogą, odpowiednio, aktywować lub hamować działanie transkrypcyjne receptorów. Może powodować to niepożądane zagrożenia dla zdrowia, w tym wpływ na reprodukcję i rozwój. W związku z tym istnieje potrzeba dokonania oceny i zbadania substancji chemicznej jako potencjalnego agonisty lub antagonisty estrogenu. Powinowactwo ligandu wobec receptora estrogenu lub aktywacja transkrypcji genów reporterowych in vitro, mimo swojej wartości informacyjnej, stanowi tylko jeden z szeregu determinantów potencjalnego zagrożenia. Pozostałe determinanty mogą obejmować aktywację i dezaktywację metaboliczną w momencie dostania się do organizmu, dystrybucję do tkanek docelowych i klirens z organizmu, co najmniej częściowo w zależności od drogi podawania i badanej substancji chemicznej. Prowadzi to do konieczności przeprowadzenia badań in vivo ewentualnego działania substancji chemicznej w odpowiednich warunkach, chyba że odpowiednie informacje można już wywnioskować z właściwości danej substancji chemicznej w odniesieniu do wchłaniania, dystrybucji, metabolizmu i wydalania. Reakcją tkanek macicy na stymulację estrogenami jest nagły i silny wzrost, w szczególności u gryzoni laboratoryjnych, w przypadku których cykl estrogenowy trwa około 4 dni. Gryzonie, a w szczególności szczury, wykorzystuje się także powszechnie w badaniach toksyczności do celów charakteryzowania zagrożeń. W związku z tym macica gryzoni jest odpowiednim organem docelowym wykorzystywanym do celów badań przesiewowych in vivo dotyczących agonistów i antagonistów estrogenu.

7. Przedmiotową metodę badawczą opracowano w oparciu o protokoły wykorzystywane w badaniu walidacyjnym OECD, które okazały się być wiarygodne i powtarzalne w badaniach wewnątrz- i międzylaboratoryjnych (5)(7). Obecnie dostępne są dwie metody, a mianowicie wykorzystywanie dorosłych samic poddanych owariektomii (metoda badania dorosłych osobników poddanych owariektomii) i wykorzystywanie niedojrzałych osobników niepoddanych owariektomii (metoda badania młodych osobników). W przypadku obu metod, w ramach programu walidacyjnego OECD, wykazano porównywalną czułość i odtwarzalność. Metoda badania niedojrzałych osobników jest jednak w pewnym stopniu mniej szczegółowa, ponieważ posiadają one nienaruszoną oś podwzgórze–przysadka–gonady (HPG), ale obejmuje szerszy zakres badania niż metoda badania zwierzęcia poddanego owariektomii, ponieważ zwierzę niedojrzałe może reagować na substancje chemiczne, które wchodzą w interakcje z osią podwzgórze–przysadka–gonady, a nie tylko z receptorem estrogenu. W przypadku szczurów oś podwzgórze–przysadka–gonady staje się funkcjonalna w wieku około 15 dni. Zanim to nastąpi, nie można przyspieszyć momentu osiągnięcia przez zwierzę dojrzałości płciowej, podając mu na przykład gonadoliberynę (GnRH). W momencie osiągania przez samice dojrzałości płciowej, jeszcze przed otwarciem pochwy, u samicy wystąpi szereg cykli bezowulacyjnych, w wyniku których nie dojdzie do otwarcia pochwy lub owulacji, ale zajdą pewne zmiany hormonalne. W przypadku gdy substancja chemiczna bezpośrednio lub pośrednio stymuluje oś podwzgórze–przysadka–gonady, następuje wczesne dojrzewanie, wczesna owulacja i przyspieszone otwarcie pochwy. Powodują to nie tylko substancje chemiczne oddziałujące na oś podwzgórze–przysadka–gonady, ale też niektóre pasze, zawierające wyższe poziomy metabolizowalnej energii niż pozostałe, będą stymulowały wzrost i przyspieszały otwarcie pochwy, nie posiadając przy tym właściwości estrogennych. Takie substancje chemiczne nie wywoływałyby reakcji wzrostu macicy u dorosłych zwierząt poddanych owariektomii, ponieważ w ich przypadku oś podwzgórze–przysadka–gonady nie funkcjonuje.

8. Ze względu na dobrostan zwierząt należy stosować przede wszystkim taką metodę, która polega na wykorzystaniu niedojrzałych szczurów, unikając wykonywania na zwierzętach wstępnych zabiegów chirurgicznych a także potencjalnego niewykorzystania tych zwierząt, które wykazują oznaki wejścia w cykl estrogenowy (zob. pkt 30).

9. Reakcja wzrostu macicy nie jest wyłącznie pochodzenia estrogennego, tj. reakcję tę mogą powodować także substancje chemiczne inne niż agoniści lub antagoniści estrogenów. Przykładowo podawanie stosunkowo wysokich dawek progesteronu, testosteronu lub różnych progestagenów syntetycznych może prowadzić do reakcji stymulującej (30). Każda reakcja może być poddana analizie histologicznej, aby wykazać keratynizację i rogowacenie pochwy (30). Niezależnie od ewentualnej przyczyny reakcji uzyskanie dodatniego wyniku biologicznego testu wzrostu macicy powinno z reguły prowadzić do działań zmierzających do dalszych wyjaśnień. Dodatkowe dowody wskazujące na estrogenność mogą pochodzić z testów in vitro, takich jak testy wiązań receptora estrogenu i badania aktywacji transkrypcji, lub z innych testów in vivo, takich jak test dojrzałości płciowej samic.

10. Biorąc pod uwagę, że test biologiczny wzrostu macicy pełni rolę badania przesiewowego in vivo, przyjęte podejście walidacyjne uwzględniało zarówno dobrostan zwierząt, jak i wielopoziomową strategię badań. W tym celu główny nacisk kładziono na rygorystyczną walidację odtwarzalności i czułości w odniesieniu do estrogenności stanowiącej kluczową kwestię w odniesieniu do wielu substancji chemicznych, natomiast niewielką uwagę przywiązywano do kwestii dotyczącej antyestrogenności testu. Zbadano tylko jeden antyestrogen o silnym działaniu, ponieważ liczba substancji chemicznych o wyraźnym profilu antyestrogennym (niezakłóconym przez aktywność estrogenową) jest bardzo ograniczona. W związku z tym przedmiotowa metoda badawcza przeznaczona jest dla protokołu estrogennego, natomiast protokół opisujący tryb testu dotyczący antagonistów zawarto w wytycznych (37). Odtwarzalność i czułość testu na obecność substancji chemicznych charakteryzujących się wyłącznie działaniem antyestrogennym zostanie doprecyzowana w dalszej kolejności, kiedy procedura badawcza będzie już przez jakiś czas stosowana rutynowo i zidentyfikowana zostanie większa liczba substancji chemicznych charakteryzujących się takim działaniem.

11. Uznano, że wszelkie procedury z wykorzystaniem zwierząt będą zgodne z lokalnymi normami w zakresie opieki nad zwierzętami; przedstawione poniżej opisy dotyczące opieki nad zwierzętami i ich traktowania stanowią minimalne standardy wykonywania badań i zostaną zastąpione przez lokalne przepisy, takie jak dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady 2010/63/UE z dnia 22 września 2010 r. w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych (38). OECD zapewnia dalsze wytyczne dotyczące humanitarnego traktowania zwierząt (25).

12. Podobnie jak w przypadku wszystkich testów, w których wykorzystuje się żywe zwierzęta, niezwykle istotne jest dopilnowanie przed rozpoczęciem testu, aby dane były faktycznie potrzebne. Przykładowo dwie sytuacje, w których dane takie mogą być wymagane, to:

— wysokie prawdopodobieństwo narażenia (poziom 1 ram koncepcyjnych, dodatek 2) lub prawdopodobieństwo estrogenności (poziom 2) w celu zbadania, czy takie działania mogą wystąpić in vivo,

— działania wskazujące na estrogenność na poziomie 4 lub 5 badania in vivo w celu uzasadnienia, że działania te były związane z mechanizmem estrogennym, który nie mógłby zostać wyjaśniony za pomocą badania in vitro.

13. Definicje stosowane w tej metodzie badawczej przedstawiono w dodatku 1.

ZASADA BADANIA

14. Test biologiczny wzrostu macicy w odniesieniu do swojej czułości opiera się na systemie badań na zwierzętach, u których oś podwzgórze-przysadka-jajnik nie funkcjonuje, co prowadzi do niskich endogennych poziomów cyrkulacji estrogenu. Zapewni to niską początkowa masę macicy i maksymalny zakres reakcji na podawane estrogeny. Następujące dwa stany wrażliwości na estrogeny u samic gryzoni spełniają ten wymóg:

(i) niedojrzałe samice po odsadzeniu i przed osiągnięciem dojrzałości płciowej; oraz

(ii) młode dojrzałe samice poddane owariektomii, u których zapewniono odpowiedni czas na regresję tkanek macicy.

15. Badaną substancję chemiczną podaje się codziennie przez sondę drogą doustną lub przez podskórne wstrzyknięcie. Stopniowane dawki badanej substancji chemicznej podaje się co najmniej dwóm grupom badanych (w celu uzyskania wskazówek zob. pkt 33) zwierząt doświadczalnych, stosując taką samą dawkę w każdej grupie i okres podawania wynoszący trzy kolejne dni w odniesieniu do metody badania osobników niedojrzałych oraz okres podawania wynoszący co najmniej trzy kolejne dni w odniesieniu do metody badania dorosłych osobników poddanych owariektomii. Zwierzęta poddaje się sekcji po upływie około 24 godzin od podania ostatniej dawki. W przypadku agonistów estrogenu szacuje się średnią masę macicy badanych grup zwierząt w odniesieniu do grupy kontrolnej nośnika w celu wykrycia istotnych statystycznie wzrostów. Statystycznie istotny wzrost średniej masy macicy w grupie badanej wskazuje na dodatnią reakcję będącą wynikiem tego testu biologicznego.

OPIS METODY BADAWCZEJ

Wybór gatunków zwierząt

16. Do badań wykorzystuje się powszechnie stosowane laboratoryjne szczepy gryzoni. Przykładowo podczas walidacji wykorzystano szczury szczepu Sprague-Dawley i Wistar. Nie należy wykorzystywać szczepów, w przypadku których stwierdzono lub podejrzewa się, że macice zwierząt mają mniejszą zdolność do wykazywania reakcji. Laboratorium powinno wykazać czułość wykorzystywanego szczepu zgodnie z opisem w punktach 26 i 27.

17. Szczury i myszy wykorzystywano do celów biologicznego testu wzrostu macicy od lat 30. ubiegłego stulecia. Badania walidacyjne OECD przeprowadzano jedynie u szczurów, opierając się na założeniu, że oba gatunki powinny być równoważne, w związku z tym jeden gatunek powinien wystarczyć do przeprowadzenia ogólnoświatowej walidacji dla oszczędzenia zasobów i zwierząt. Szczur jest gatunkiem preferowanym w przypadku większości badań toksyczności reprodukcyjnej i rozwojowej. Biorąc pod uwagę, że istnieje obszerna historyczna baza danych dotyczących myszy, przeprowadzono ograniczone uzupełniające badanie walidacyjne na tym gatunku w celu rozszerzenia zakresu metody testu biologicznego wzrostu macicy w odniesieniu do gryzoni na myszy jako gatunek eksperymentalny (16). Zgodnie z pierwotnym zamiarem oszczędzania zasobów i zwierząt wybrano stosowanie podejścia pomostowego polegającego na wykorzystywaniu ograniczonej liczby badanych substancji chemicznych, ograniczonej liczbie uczestniczących laboratoriów i nieprzeprowadzaniu badań kodowanych próbek. Przedmiotowe pomostowe badanie walidacyjne wykazało w odniesieniu do biologicznego testu wzrostu macicy u młodych dojrzałych myszy poddanych owariektomii, że dane otrzymane w przypadku szczurów i myszy odpowiadają sobie nawzajem pod względem jakościowym i ilościowym. W przypadkach, w których wynik biologicznego testu wzrostu macicy może poprzedzić badanie długoterminowe, możliwe jest wykorzystanie w obu badaniach zwierząt tego samego szczepu i pochodzących z tego samego źródła. Podejście pomostowe ograniczono do myszy poddanych owariektomii, a sprawozdanie nie zapewnia solidnego zbioru danych, aby dokonać walidacji modelu badań niedojrzałych osobników, w związku z czym model ten nie jest objęty zakresem bieżącej metody badawczej.

18. W związku z tym w niektórych przypadkach dopuszcza się wykorzystywanie myszy zamiast szczurów. Należy uzasadnić wykorzystanie tego gatunku w oparciu o kryteria toksykologiczne, farmakokinetyczne lub inne. W przypadku myszy może zajść konieczność modyfikacji protokołu. Przykładowo spożycie pokarmu przez myszy określane na podstawie masy ciała jest wyższe niż u szczurów, w związku z czym zawartość fitoestrogenów w karmie podawanej myszom powinna być niższa niż w karmie podawanej szczurom (9)(20)(22).

Warunki trzymania i żywienia

19. Wszystkie procedury powinny być zgodne z lokalnymi normami w zakresie opieki nad zwierzętami w warunkach laboratoryjnych. Opisy dotyczące opieki nad zwierzętami i ich traktowania stanowią minimalne normy i zostaną zastąpione przez lokalne przepisy, takie jak dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady 2010/63/UE z dnia 22 września 2010 r. w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych (38). Temperatura w pomieszczeniu ze zwierzętami doświadczalnymi powinna wynosić 22 °C (w przybliżeniu z tolerancją ± 3 °C). Wilgotność względna, poza okresem czyszczenia pomieszczenia, powinna wynosić co najmniej 30 % i nie przekraczać 70 %. Wilgotność względną należy docelowo utrzymywać w granicach 50–60 %. Oświetlenie powinno być sztuczne, w cyklu dziennym 12 godzin światła, 12 godzin ciemności.

20. Należy zapewnić paszę laboratoryjną i wodę pitną ad libitum. Młode dorosłe zwierzęta mogą być trzymane pojedynczo lub umieszczane w klatkach w grupach o liczebności nieprzekraczającej trzech zwierząt. Z uwagi na młody wiek niedojrzałych zwierząt zaleca się trzymanie ich w grupach społecznych.

21. Stwierdzono, że wysoka zawartość fitoestrogenów w paszach laboratoryjnych zwiększa masę macicy u gryzoni w stopniu wystarczającym, by zakłócało to wyniki biologicznego testu wzrostu macicy (13)(14)(15). Wysokie poziomy fitoestrogenów i metabolizowalnej energii w paszach laboratoryjnych mogą powodować także wczesne dojrzewanie płciowe w przypadkach, w których wykorzystuje się zwierzęta niedojrzałe. Obecność fitoestrogenów wynika przede wszystkim z dodawania wyrobów z soi i lucerny do pasz laboratoryjnych, a do tego wykazano, że partie standardowych pasz laboratoryjnych różnią się między sobą pod względem stężenia fitoestrogenów (23). Istotną zmienną jest masa ciała, ponieważ ilość spożywanego pokarmu ma związek z masą ciała. W związku z tym rzeczywista dawka spożywanych fitoestrogenów z tej samej paszy może różnić się między gatunkami i w zależności od wieku (9). W przypadku niedojrzałych samic szczurów spożycie pokarmu określane na podstawie masy ciała może być prawie dwa razy większe niż w przypadku młodych dorosłych samic poddanych owariektomii. W przypadku młodych dorosłych samic myszy spożycie pokarmu określane na podstawie masy ciała może być prawie cztery razy większe niż w przypadku młodych dorosłych samic szczurów poddanych owariektomii.

22. Wyniki biologicznego testu wzrostu macicy (9)(17)(18)(19) wykazują jednak, że ograniczone ilości fitoestrogenów w paszy są dopuszczalne i nie powodują obniżenia czułości testu biologicznego. Orientacyjnie zawartość fitoestrogenów nie powinna przekraczać 350 μg odpowiedników genisteiny/gram paszy laboratoryjnej w przypadku niedojrzałych samic szczurów szczepów Sprague Dawley i Wistar (6)(9). Takie pasze powinny także mieć zastosowanie w przypadku badania młodych dorosłych szczurów poddanych owariektomii, ponieważ spożycie pokarmu w stosunku do masy ciała jest niższe w przypadku młodych dorosłych zwierząt niż w przypadku zwierząt niedojrzałych. Jeżeli planuje się wykorzystanie myszy poddanych owariektomii lub szczurów o zwiększonej wrażliwości na fitoestrogeny, należy rozważyć proporcjonalne obniżenie zawartości fitoestrogenów w paszy (20). Ponadto różnice w metabolizowalnej energii dostępnej w różnych paszach mogą prowadzić do zmian czasowych w osiąganiu dojrzałości płciowej (21)(22).

23. Przed przeprowadzeniem badania wymagany jest ostrożny wybór paszy niezawierającej podwyższonego poziomu fitoestrogenów (aby uzyskać wytyczne zob. (6)(9)) lub metabolizowalnej energii, które mogą zakłócić w