Dyrektywa Komisji 2004/73/WE

z dnia 29 kwietnia 2004 r.

dostosowująca po raz dwudziesty dziewiąty do postępu technicznego dyrektywę Rady 67/548/EWG w sprawie zbliżenia przepisów ustawowych, wykonawczych i administracyjnych odnoszących się do klasyfikacji, pakowania, i etykietowania substancji niebezpiecznych

(Tekst mający znaczenie dla EOG)

KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH,

uwzględniając Traktat ustanawiający Wspólnotę Europejską,

uwzględniając dyrektywę Rady 67/548/EWG z dnia 27 czerwca 1967 r. w sprawie zbliżenia przepisów ustawowych, wykonawczych i administracyjnych odnoszących się do klasyfikacji, pakowania i etykietowania substancji niebezpiecznych [1], w szczególności jej art. 28,

a także mając na uwadze, co następuje:

(1) Załącznik I do dyrektywy 67/548/EWG zawiera wykaz niebezpiecznych substancji, razem z szczegółowymi danymi klasyfikacji oraz etykietowania każdej z nich. Wykaz ten powinien zostać uaktualniony o zawarte dalej nowe substancje, a także o zawarte dalej zapisane już substancje oraz o obecny stan wiedzy naukowo-technicznej co do ustanawiania granic stężeń w środowisku pewnych substancji. Zgodnie z tym należy też wykreślić zapisy dla pewnych substancji i rozdzielić pewne zapisy z powodu zmiany klasyfikacji substancji podlegających tym zapisom. Oznaczenie substancji zawierających 1,3-butadien powinno zostać zmienione w celu odzwierciedlenia nowego zaklasyfikowania tej substancji jako mutagennej w niniejszej dyrektywie.

(2) Załącznik V do dyrektywy 67/548/EWG ustanawia metody określania właściwości fizykochemicznych, toksyczności i ekotoksyczności substancji i preparatów. Należy zmienić ten załącznik w celu ograniczenia do minimum liczby zwierząt wykorzystywanych do celów doświadczalnych zgodnie z dyrektywą Rady 86/609/EWG z dnia 24 listopada 1986 r. w sprawie zbliżenia przepisów ustawowych, wykonawczych i administracyjnych przyjętych przez Państwa Członkowskie, odnoszących się do zwierząt wykorzystywanych do celów doświadczalnych i innych celów naukowych [2]. Metody odnoszące się do podchronicznej toksyczności drogą pokarmową z rozdziałów B.1, B.4, B.5, B.31 i B.35 powinny zostać odpowiednio poprawione. Ponadto rozdział B.42 powinien zostać włączony do załącznika V w celu udostępnienia poprawionej metody odnoszącej się do podchronicznej toksyczności drogą pokarmową. Rozdział A.21 w sprawie właściwości fizykochemicznych, rozdział B.43 w sprawie podchronicznej toksyczności drogą pokarmową oraz rozdziały C.21–C.24 dotyczące toksyczności dla środowiska naturalnego powinny zostać dodane w celu umożliwienia wyznaczenia właściwości, jakie nie zostały jeszcze wystarczająco objęte metodami z załącznika V.

(3) Środki przewidziane w niniejszej dyrektywie są zgodne z opinią Komitetu ds. Dostosowania do Postępu Technicznego Dyrektyw w celu Usunięcia Barier Technicznych w Handlu Niebezpiecznymi Substancjami i Preparatami,

PRZYJMUJE NINIEJSZĄ DYREKTYWĘ:

Artykuł 1

W dyrektywie 67/548/EWG wprowadza się następujące zmiany:

1) w załączniku I wprowadza się następujące zmiany:

a) uwagę K we wstępie zastępuje się tekstem zamieszczonym w załączniku 1A;

b) pozycje odpowiadające pozycjom określonym w załączniku 1B do niniejszej dyrektywy zastępuje się tekstem zamieszczonym w tym załączniku;

c) pozycje określone w załączniku 1C do niniejszej dyrektywy włącza się zgodnie z kolejnością pozycji określoną w załączniku I do dyrektywy 67/548/EWG;

d) pozycje z numerami indeksu 604-050-00-X, 607-050-00-8, 607-171-00-6 i 613-130-00-3 skreśla się;

e) pozycję z numerem indeksu 048-002-00-0 zastępuje się pozycjami z numerami indeksu 048-002-00-0 i 048-011-00-X określonymi w załączniku 1D do niniejszej dyrektywy;

f) pozycję z numerem indeksu 609-006-00-3 zastępuje się pozycjami z numerami indeksu 609-006-00-3 i 609-065-00-5 określonymi w załączniku 1D do niniejszej dyrektywy;

g) pozycję z numerem indeksu 612-039-00-6 zastępuje się pozycjami z numerami indeksu 612-039-00-6 i 612-207-00-9 jak określono w załączniku 1D;

2) w załączniku V wprowadza się następujące zmiany:

a) tekst zamieszczony w załączniku 2A do niniejszej dyrektywy dodaje się jako rozdział A.21;

b) rozdział B.1a zastępuje się tekstem określonym w załączniku 2B do niniejszej dyrektywy;

c) rozdział B.1b zastępuje się tekstem określonym w załączniku 2C do niniejszej dyrektywy;

d) rozdział B.4 zastępuje się tekstem określonym w załączniku 2D do niniejszej dyrektywy;

e) rozdział B.5 zastępuje się tekstem określonym w załączniku 2E do niniejszej dyrektywy;

f) rozdział B.31 zastępuje się tekstem określonym w załączniku 2F do niniejszej dyrektywy;

g) rozdział B.35 zastępuje się tekstem określonym w załączniku 2G do niniejszej dyrektywy;

h) tekst zamieszczony w załączniku 2H do niniejszej dyrektywy dodaje się jako rozdział B.42 i B.43;

i) tekst zamieszczony w załączniku 2I do niniejszej dyrektywy dodaje się jako rozdział C.21 do C.24.

Artykuł 2

1. Państwa Członkowskie wprowadzają w życie przepisy ustawowe, wykonawcze i administracyjne niezbędne do wykonania niniejszej dyrektywy najpóźniej do dnia 31 października 2005 r. Przekazują one niezwłocznie Komisji teksty tych przepisów i tabelę korelacji pomiędzy tymi przepisami a niniejszą dyrektywą.Przepisy przyjęte przez Państwa Członkowskie zawierają odniesienie do niniejszej dyrektywy lub odniesienie takie towarzyszy ich urzędowej publikacji. Państwa Członkowskie określają metody dokonania takiego odniesienia.

2. Państwa Członkowskie przekazują Komisji teksty podstawowych przepisów prawa krajowego, przyjętych w dziedzinach objętych niniejszą dyrektywą.

Artykuł 3

Niniejsza dyrektywa wchodzi w życie dwudziestego dnia po jej opublikowaniu w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej.

Artykuł 4

Niniejsza dyrektywa skierowana jest do Państw Członkowskich.

Sporządzono w Brukseli, dnia 29 kwietnia 2004 r.

W imieniu Komisji

Margot Wallström

Członek Komisji

[1] Dz.U. 196 z 16.8.1967, str. 1. Dyrektywa ostatnio zmieniona rozporządzeniem (WE) nr 807/2003 (Dz.U. L 122 z 16.5.2003, str. 36).

[2] Dz.U. L 358 z 18.12.1986, str. 1. Dyrektywa ostatnio zmieniona dyrektywą 2003/65/WE Parlamentu Europejskiego i Rady (Dz.U. L 230 z 16.9.2003, str. 32).

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK 1A

"Uwaga K:

Sklasyfikowanie jako rakotwórcze nie powinno mieć zastosowania, jeśli można wykazać, że substancja zawiera mniej niż 0,1 % wagowo 1,3-butadienu (nr EINECS 203-450-8). Jeśli substancja nie jest sklasyfikowana jako rakotwórcza lub mutagen, należy zastosować przynajmniej sformułowania S (2-)9-16. Niniejszą uwagę stosuje się tylko do niektórych substancji kompleksowych pochodnych olejów w załączniku I."

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK 2A

A.21. WŁAŚCIWOŚCI UTLENIAJĄCE (CIECZE)

1. METODA

1.1 WPROWADZENIE

Ta metoda badawcza jest przeznaczona do pomiaru potencjału substancji ciekłej do zwiększenia szybkości spalania oraz intensywności spalania materiałów palnych lub do tworzenia mieszanin z materiałami palnymi, które spontanicznie zapalają się, kiedy są ze sobą dokładnie wymieszane. Jest oparta na badaniu ONZ dla cieczy utleniających (1) i jest z nim równoważna. Jednakże metoda A.21 jest przede wszystkim zaprojektowana, aby spełniać wymagania dyrektywy 67/548, gdzie wymagane jest porównanie tylko z jedną substancją odniesienia. Konieczne może być badanie i porównanie z dodatkowymi substancjami odniesienia, gdyby wyniki badań miały być wykorzystywane do innych celów [1].

To badanie nie musi być przeprowadzone, jeżeli badanie wzoru strukturalnego wyjaśnia ponad wszelką zasadną wątpliwość, że ta substancja nie jest zdolna do reakcji egzotermicznej z materiałem palnym.

Przed przeprowadzeniem tego badania przydatne jest posiadanie wstępnych informacji na temat jakichkolwiek potencjalnych właściwości wybuchowych substancji.

Badanie to nie ma zastosowania do ciał stałych, gazów, substancji wybuchowych lub łatwopalnych, bądź nadtlenków organicznych.

Można nie przeprowadzać tego badania, jeżeli są już dostępne dla substancji badanej wyniki próby ONZ dla cieczy utleniających (1).

1.2 DEFINICJE I JEDNOSTKI

Średni czas wzrostu ciśnienia jest wartością średnią mierzonych czasów, w jakich badana mieszanina spowoduje wzrost ciśnienia z 690 kPa do 2070 kPa powyżej ciśnienia atmosferycznego.

1.3 SUBSTANCJA ODNIESIENIA

Jako substancja odniesienia wymagany jest 65 % (m/m) roztwór wodny kwasu azotowego (czysty do analizy) [2].

Ewentualnie, jeżeli osoba badająca przewiduje, że wyniki tego badania będą mogły ostatecznie zostać użyte do innych celów [3], może być również właściwe badanie dodatkowych substancji odniesienia [4].

1.4 ZASADY METODY BADAWCZEJ

Badana ciecz jest mieszana w stosunku wagowym 1 do 1 z celulozą włóknistą i wprowadzana do komory ciśnieniowej. Jeżeli podczas mieszania lub napełniania następuje spontaniczny zapłon, nie są konieczne dalsze badania.

Jeżeli nie następuje spontaniczny zapłon, przeprowadza się pełne badanie. Mieszanina jest ogrzewana w komorze ciśnieniowej i mierzony jest średni czas potrzebny do podniesienia ciśnienia od 690 kPa do 2070 kPa powyżej ciśnienia atmosferycznego. Otrzymana wartość jest porównywana ze średnim czasem wzrostu ciśnienia dla mieszaniny substancji odniesienia i celulozy w stosunku 1:1.

1.5 KRYTERIA JAKOŚCIOWE

W serii pięciu prób przeprowadzonych na pojedynczej substancji żaden wynik nie powinien odbiegać od średniej arytmetycznej o więcej niż 30 %. Wyniki różniące się od średniej o więcej niż 30 % powinny zostać odrzucone, procedura mieszania i napełniania powinna zostać poprawiona, a badanie powtórzone.

1.6 OPIS METODY

1.6.1 Przygotowanie

1.6.1.1 Substancja palna

Jako materiał palny jest używana sucha, włóknista celuloza o długości włókna od 50 do 250 μm i średniej średnicy równej 25 μm [5]. Jest suszona do stałej masy, w warstwie o grubości nieprzekraczającej 25 mm w temperaturze 105 °C przez 4 godziny i trzymana w suszarce, ze środkiem suszącym, aż do ochłodzenia i do momentu, gdy będzie potrzebna do użycia. Zawartość wody w suchej celulozie powinna być mniejsza niż 0,5 % suchej masy [6]. W razie potrzeby, należy przedłużyć czas suszenia, aż do osiągnięcia tego stanu [7]. W całym badaniu musi być używana ta sama partia celulozy.

1.6.1.2 Aparatura

1.6.1.2.1 Komora ciśnieniowa

Potrzebna jest komora ciśnieniowa. Komora ta składa się z cylindrycznego, stalowego zbiornika ciśnieniowego o długości 89 mm i średnicy zewnętrznej 60 mm (patrz: rysunek 1). Po przeciwległych stronach cylindra są ścięte dwie płaszczyzny (zmniejszające przekrój poprzeczny komory do 50 mm), aby ułatwić trzymanie podczas montażu zapłonnika i wkładki odpowietrzającej. Komora, która ma otwór o średnicy 20 mm, jest od wewnątrz na obu końcach rozwiercona do głębokości 19 mm oraz nagwintowana, tak aby można było wkręcić w nią rurę o średnicy 1 "wg norm British Standard Pipe (BSP) lub odpowiednik wg układu metrycznego. Urządzenie do pomiaru ciśnienia, w postaci ramienia bocznego, jest przykręcone do zakrzywionej powierzchni zewnętrznej komory ciśnieniowej w odległości 35 mm od jednego końca, pod kątem 90o do ściętej płaszczyzny. Gniazdo dla niego jest nawiercone na głębokość 12 mm i nagwintowane, tak aby można było wkręcić w nie gwint o średnicy 1/2" wg BSP (lub odpowiednik wg uk3adu metrycznego), znajdujący się na końcu ramienia bocznego. W razie potrzeby, stosuje się obojętną uszczelkę w celu zapewnienia gazoszczelności. Ramię boczne wystaje na 55 mm poza korpus komory ciśnieniowej i ma wywiercony otwór o średnicy 6 mm. Koniec ramienia bocznego jest rozwiercony i nagwintowany, tak aby można było osadzić manometr przeponowy. Może być stosowane dowolne urządzenie do pomiaru ciśnienia, pod warunkiem że będzie odporne na działanie gorących gazów lub produktów rozkładu i będzie zdolne reagować na zmiany wzrostu ciśnienia w zakresie 690–2070 kPa w czasie nie dłuższym niż 5 ms.

Koniec komory ciśnieniowej najbardziej oddalony od ramienia bocznego jest zamknięty zapłonnikiem, który jest wyposażona w dwie elektrody, jedną izolowaną, a drugą uziemioną do jego korpusu. Drugi koniec komory ciśnieniowej jest zamknięty membraną bezpieczeństwa (ciśnienie uderzeniowe wynosi około 2200 kPa) utrzymywaną w swojej pozycji przy pomocy wkładki ustalającej, która ma otwór o średnicy 20 mm. W razie potrzeby, w celu zapewnienia dopasowania gazoszczelnego, przy zapłonniku stosowana jest uszczelka obojętna. Stojak (rysunek 2) utrzymuje zestaw podczas użytkowania na odpowiedniej wysokości. Składa się on zwykle z płytki podstawy, wykonanej z miękkiej stali, o wymiarach 235 mm × 184 mm × 6 mm i z profilu kwadratowego o długości 185 mm i wymiarach 70 mm × 70 mm × 4 mm.

Z każdego z przeciwległych boków na jednym końcu na długości profilu kwadratowego wycięto fragment, tak że powstała konstrukcja mająca dwie nóżki o płaskich ściankach, na której jest nienaruszony przekrój skrzynkowy o długości 86 mm. Końce tych płaskich ścianek są przycięte pod kątem 60o do poziomu i przyspawane do płytki podstawy. W jednym boku górnego końca głównego profilu wycięto szczelinę o szerokości 22 mm i głębokości 46 mm, żeby podczas wkładania zestawu komory ciśnieniowej, najpierw koniec z zapłonnikiem, do uchwytu z przekroju skrzynkowego, ramię boczne mieściło się w szczelinie. Kawałek stali o szerokości 30 mm i grubości 6 mm jest przyspawany do dolnej wewnętrznej ścianki przekroju skrzynkowego i działa jako rozpórka. Dwie śruby skrzydełkowe o średnicy 7 mm, przykręcone do przeciwległej ścianki, służą do trzymania komory ciśnieniowej mocno na miejscu. Dwa paski o szerokości 12 mm ze stali o grubości 6 mm, przyspawane do części bocznych, przylegając do podstawy przekroju skrzynkowego, podpierają komorę ciśnieniową od dołu.

1.6.1.2.2 System zapłonu

System zapłonu składa się drutu Ni/Cr o długości 25 cm o średnicy 0,6 mm i oporze 3,85 om/m. Drut jest zwinięty, przy pomocy pręta o średnicy 5 mm, w kształt cewki i podłączony do elektrod zapłonnika. Cewka powinna mieć jedną z konfiguracji przedstawionych na rysunku 3. Odstęp pomiędzy dnem komory a spodem cewki zapłonowej powinien wynosić 20 mm. Jeżeli elektrody nie są nastawne, końce przewodu zapłonowego pomiędzy cewką a dnem komory powinny być izolowane osłoną ceramiczną. Przewód jest ogrzewany prądem stałym o natężeniu przynajmniej 10A.

1.6.2 Prowadzenie badania [8]

Aparatura, złożona w całości z przetwornikiem ciśnieniowym i systemem ogrzewania, ale bez założonej membrany bezpieczeństwa, jest trzymana końcem z zapłonnikiem na dół. 2,5 g cieczy przeznaczonej do badania jest mieszane z 2,5 g wysuszonej celulozy w zlewce szklanej przy pomocy szklanej bagietki [9]. Dla bezpieczeństwa, mieszanie powinno być prowadzone za osłoną bezpieczeństwa umieszczoną między operatorem a mieszaniną. Jeżeli mieszanina zapali się podczas mieszania lub napełniania, nie będą konieczne żadne dalsze badania. Mieszanina jest podawana do komory ciśnieniowej małymi porcjami z lekkim ubijaniem. Należy przy tym zapewnić, żeby była dobrze upakowana wokół cewki zapłonowej i żeby się z nią dobrze stykała. Ważne jest, żeby nie poruszyć cewki podczas procesu upakowywania, ponieważ może to prowadzić do błędnych wyników [10]. Membrana bezpieczeństwa jest umieszczana na swoim miejscu, a nakrętka zabezpieczająca jest mocno przykręcana. Naładowana komora jest przenoszona membraną bezpieczeństwa do góry do stojaka, który powinien być umieszczony w odpowiednim, opancerzonym dygestorium lub komorze zapłonowej. Do zewnętrznych końcówek zapłonnika podłącza się zasilanie i podaje prąd o natężeniu 10A. Czas od rozpoczęcia mieszania do włączenia zasilania nie powinien przekraczać 10 min.

Sygnał generowany przez przetwornik ciśnieniowy jest zapisywany przez odpowiedni system, który pozwala zarówno na ocenę, jak i tworzenie ciągłego zapisu profilu zmiany ciśnienia w czasie (np. przejściowy rejestrator podłączony do rejestratora graficznego). Mieszanina jest ogrzewana aż do przerwania membrany bezpieczeństwa lub do upływu 60 s. Jeżeli membrana bezpieczeństwa nie zostanie zerwana, należy pozwolić mieszaninie ostygnąć przed ostrożnym demontażem aparatury, podejmując środki bezpieczeństwa na wypadek wzrostu ciśnienia. Z substancją badaną i z substancją(-ami) odniesienia wykonuje się pięć prób. Zapisywany jest czas potrzebny na zwiększenie ciśnienia od 690 kPa do 2070 kPa powyżej ciśnienia atmosferycznego. Obliczany jest średni czas wzrostu ciśnienia.

W niektórych przypadkach substancje mogą wytwarzać wzrost ciśnienia (zbyt duży lub zbyt mały) wskutek reakcji chemicznych niecharakteryzujących właściwości utleniających substancji. W tych przypadkach do wyjaśnienia przebiegu reakcji może być konieczne powtórzenie badania z substancją obojętną, np. diatomitem (ziemia okrzemkowa), zamiast celulozy.

2. DANE

Czasy wzrostu ciśnienia zarówno dla substancji badanej, jak i substancji odniesienia.

Czasy wzrostu ciśnienia dla badań z substancją obojętną, jeżeli zostały przeprowadzone.

2.1 OPRACOWANIE WYNIKÓW

Oblicza się średnie czasy wzrostu ciśnienia zarówno dla substancji badanej, jak i dla substancji odniesienia.

Oblicza się średni czas wzrostu ciśnienia dla badań z substancją obojętną (jeżeli przeprowadzono).

Przykładowe wyniki zostały przedstawione w tabeli 1.

Tabela 1

Przykładowe wyniki [14]

Substancja [13] | Średnia wartość wzrostu ciśnienia dla mieszaniny 1:1 z celulozą (ms) |

Dwuchromian amonu, nasycony roztwór wodny | 20800 |

Azotan amonu, nasycony roztwór wodny | 6700 |

Azotan żelaza, nasycony roztwór wodny | 4133 |

Nadchloran litu, nasycony roztwór wodny | 1686 |

Nadchloran magnezu, nasycony roztwór wodny | 777 |

Azotan niklu, nasycony roztwór wodny | 6250 |

Kwas azotowy, 65 % | 4767 [11] |

Kwas nadchlorowy, 50 % | 121 [11] |

Kwas nadchlorowy, 55 % | 59 |

Azotan potasu, 30 % roztwór wodny | 26690 |

Azotan srebra, nasycony roztwór wodny | – [12] |

Chloran sodu, 40 % roztwór wodny | 2555 [11] |

Azotan sodu, 45 % roztwór wodny | 4133 |

Substancja obojętna | |

Woda: celuloza | – [12] |

3. SPRAWOZDANIE

3.1 SPRAWOZDANIE Z BADAŃ

Sprawozdanie z badań powinno zawierać następujące informacje:

- identyfikację, skład, stopień czystości itp. badanej substancji,

- stężenie badanej substancji,

- procedurę suszenia celulozy,

- zawartość wody w użytej celulozie,

- wyniki pomiarów,

- ewentualne wyniki badań z zastosowaniem substancji obojętnej,

- obliczone średnie czasy wzrostu ciśnienia,

- jakiekolwiek odchylenia od tej metody i ich przyczyny,

- wszystkie dodatkowe informacje lub uwagi istotne dla interpretacji wyników,

3.2 INTERPRETACJA WYNIKÓW [15]

Wyniki są oceniane na podstawie:

a) czy mieszanina substancji badanej i celulozy zapala się spontanicznie; oraz

b) porównania średniego czasu potrzebnego do wzrostu ciśnienia od 690 kPa do 2070 kPa z tą samą wartością dla substancji odniesienia

Ciecz jest uznawana za utleniacz, jeżeli:

a) mieszanina w stosunku wagowym 1:1 badanej substancji i celulozy zapala się spontanicznie; lub

b) mieszanina w stosunku wagowym 1:1 substancji badanej i celulozy wykazuje średni czas wzrostu ciśnienia niższy lub równy średniemu czasowi wzrostu ciśnienia mieszaniny 1:1, wagowo, dla 65 % (m/m) roztworu wodnego kwasu azotowego i celulozy.

Aby uniknąć fałszywych wyników pozytywnych, w razie potrzeby przy interpretacji wyników należy również uwzględnić wyniki otrzymane w badaniu substancji z materiałem obojętnym.

4. BIBILIOGRAFIA

(1) Recommendations on the Transport of Dangerous Goods, Manual of Tests and Criteria. 3rd revised edition. Publikacja ONZ Nr: ST/SG/AC.10/11/Rev. 3, 1999, str. 342. Badanie O.2: Badanie na utlenianie cieczy.

+++++ TIFF +++++

Komora ciśnieniowa

(A) Korpus komory ciśnieniowej

(B) Wkładka ustalająca membrany bezpieczeństwa

(C) Zapłonnik

(D) Miękka uszczelka ołowiana

(E) Membrana bezpieczeństwa

(F) Ramię boczne

(G) Głowica przetwornika ciśnieniowego

(H) Uszczelka

(J) Elektroda izolowana

(K) Elektroda uziemiona

(L) Izolacja

(M) Stożek stalowy

(N) Rowek odkształcający uszczelkę

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

(A) Cewka zapłonowa

(B) Izolacja

(C) Elektrody

(D) Zapłonnik

Nota:

Może zostać użyta którakolwiek z tych konfiguracji.

[1] Jak, na przykład, w ramach przepisów transportowych ONZ.

[2] Kwas powinien być miareczkowany przed badaniem, aby potwierdzić jego stężenie.

[3] Jak, na przykład, w ramach przepisów transportowych ONZ.

[4] Np. 50 % (m/m) kwasu chlorowego (VII) i 40 % (m/m) chlorku sodowego stosuje się w pozycji bibliograficznej 1.

[5] Np. proszek celulozowy do kolumn chromatograficznych Whatmana CF 11, nr katalogowy 4021 050.

[6] Potwierdzone przez np. miareczkowanie metodą Karla-Fishera.

[7] Alternatywnie, tę zawartość wody można również osiągnąć przez np. ogrzewanie w 105 °C w próżni przez 24 h.

[8] Mieszaniny utleniaczy z celulozą muszą być traktowane jako potencjalnie wybuchowe i należy z nimi postępować z należytą ostrożnością.

[9] Można to osiągnąć w praktyce, przygotowując mieszaninę w stosunku 1:1 cieczy przeznaczonej do badania i celulozy w ilości większej, niż jest potrzebna do próby, i przenosząc 5 ± 0,1 g do komory ciśnieniowej. Mieszanina powinna być świeżo przygotowywana do każdej próby.

[10] W szczególności należy unikać zetknięcia sąsiednich zwojów cewki.

[11] Wartość średnia dla międzylaboratoryjnych prób porównawczych.

[12] Nie osiągnięto maksymalnego ciśnienia 2070 kPa.

[13] Roztwór nasycony powinien zostać przygotowany w 20 °C.

[14] Patrz: poz. (1) dla klasyfikacji według programu transportu ONZ.

[15] Patrz: odniesienie 1 w celu interpretacji wyników na mocy przepisów ONZ dotyczących transportu, stosując kilka substancji odniesienia.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK 2B

B.1a TOKSYCZNOŚĆ OSTRA POKARMOWA – PROCEDURA Z WYKORZYSTANIEM STAŁEJ DAWKI

1. METODA

Niniejsza metoda jest kopią OECD TG 420 (2001)

1.1 WPROWADZENIE

Tradycyjne metody oceny ostrej toksyczności wykorzystują śmierć zwierząt jako punkt końcowy. W 1984 r. Brytyjskie Towarzystwo Toksykologiczne zaproponowało nowe podejście do określania ostrej toksyczności, oparte na podawaniu serii dawek o stałym stężeniu (1). To podejście umożliwia uniknięcie śmierci zwierząt jako punktu końcowego, wykorzystując jako alternatywę obserwacje wyraźnych objawów zatrucia na danym etapie podawania serii dawek o stałym stężeniu. W następstwie badań weryfikacyjnych in vivo, przeprowadzonych przez Zjednoczone Królestwo (2) oraz na szczeblu międzynarodowym (3), procedura ta została przyjęta jako metoda badawcza w 1992 r. Jednocześnie, wykorzystując w szeregu badań modele matematyczne, poddano ocenie właściwości statystyczne procedury stałych dawek (4)(5)(6). Zarówno badania in vivo, jak i badania z wykorzystaniem modeli wykazały, że procedura ta jest powtarzalna, wymaga mniejszej liczby zwierząt i powoduje mniej cierpień niż metody tradycyjne, oraz że możliwa jest dzięki niej ocena substancji w podobny sposób, jak to ma miejsce z wykorzystaniem innych metod.

Wytyczne dotyczące wyboru najbardziej odpowiedniej metody badawczej dla indywidualnych przypadków zostały zamieszczone w Wytycznych dotyczących badania ostrej toksyczności drogą pokarmową (7). Wytyczne te zawierają także dodatkowe informacje na temat przeprowadzania i interpretacji metody badawczej B.1a.

Zasadniczo, w badaniu głównym z wykorzystaniem niniejszej metody stosuje się jedynie umiarkowane toksycznie dawki oraz unika się dawek mogących spowodować śmierć. Nie jest również konieczne podawanie dawek mogących powodować silny ból lub stres wynikający z działania żrącego lub podrażniającego. Zwierzęta w stanie agonalnym lub w oczywisty sposób cierpiące albo chore i przeżywające strach powinny zostać uśmiercone w humanitarny sposób i uwzględniane w interpretacji wyników badań jako zwierzęta padłe w trakcie badania. Kryteria podejmowania decyzji co do uśmiercenia zwierząt w stanie agonalnym lub cierpiących ból, oraz wytyczne dotyczące rozpoznania przewidywanego lub zbliżającego się zgonu, są zawarte w oddzielnych Wytycznych (8).

Metoda umożliwia przedstawienie informacji na temat niebezpiecznych właściwości danej substancji i pozwala na ocenę i klasyfikację zgodną z Globalnym Zharmonizowanym Systemem (GHS) klasyfikującym związki chemiczne pod względem ich ostrej toksyczności (9).

Laboratorium badawcze powinno uwzględnić wszystkie dostępne informacje na temat badanej substancji przed rozpoczęciem badań. Informacje te powinny obejmować nazwę i budowę chemiczną substancji; właściwości fizyko-chemiczne; wyniki innych badań toksyczności in vitro lub in vivo; dane dotyczące toksyczności substancji zbliżonych pod względem budowy; przewidywane zastosowanie (zastosowania) tej substancji.Informacje te są niezbędne celem spełnienia wszelkich wymogów dotyczących ochrony zdrowia ludzkiego i pomocne w wyborze odpowiedniej dawki wyjściowej.

1.2 DEFINICJE

Toksyczność ostra pokarmowa: oznacza niepożądane skutki pojawiające się w następstwie podania doustnego pojedynczej dawki substancji lub wielu dawek w okresie 24 godzin.

Opóźniona śmierć: oznacza, że zwierzę nie umiera, ani nie wydaje się być w agonii przez 48 godzin, lecz pada później w 14-dniowym okresie obserwacyjnym.

Dawka: oznacza ilość podawanej substancji badanej. Dawka jest wyrażana jako masa próbki na jednostkę masy zwierzęcia (np. mg/kg).

Wyraźne działanie toksyczne: jest ogólnym terminem opisującym wyraźne objawy zatrucia występujące w następstwie podania substancji badanej (patrz: (3) celem uzyskania przykładów) pozwalające oczekiwać, że u większości zwierząt następna najwyższa stała dawka spowoduje, bądź silny ból, przewlekłe oznaki strachu, stan agonalny (kryteria są przedstawione w Wytycznych dotyczących humanitarnego punktu końcowego (8)) bądź zgon u większości badanych zwierząt.

GHS: Globalny zharmonizowany system klasyfikacji substancji i mieszanin chemicznych. Połączone działania OECD (w dziedzinie zdrowia ludzkiego i ochrony środowiska), Komitetu Ekspertów ONZ w sprawie transportu towarów niebezpiecznych (w zakresie właściwości fizyko-chemicznych) i Międzynarodowej Organizacji Pracy (ILO) (w zakresie wymiany informacji na temat niebezpieczeństw), koordynowane w ramach Międzyorganizacyjnego programu na rzecz właściwego zarządzania związkami chemicznymi (IOMC).

Zagrażająca śmierć: występuje w przypadku gdy przewiduje się wystąpienie stanu agonalnego lub śmierci przed następnym zaplanowanym czasem obserwacji. Objawy wskazujące na ten stan mogą obejmować u gryzonia konwulsje, ułożenie na boku, pozycję leżącą oraz drgawki (patrz: Wytyczne dotyczące humanitarnego punktu końcowego (9) celem uzyskania szczegółowych informacji).

LD50(średnia dawka śmiertelna): jest statystycznie wyprowadzoną pojedynczą dawką substancji, która powoduje zgon 50 % zwierząt przy podaniu drogą pokarmową. Wartość LD50 jest wyrażona w wadze substancji badanej na jednostkę masy badanego zwierzęcia (mg/kg).

Dawka graniczna: oznacza górną dawkę graniczną w badaniach (2000 lub 5000 mg/kg).

Stan agonalny: stan śmierci lub niezdolności do przeżycia nawet w przypadku zastosowania leczenia (patrz: Wytyczne dotyczące humanitarnego punktu końcowego (8) w celu uzyskania danych szczegółowych).

Przewidywalna śmierć: obecność objawów klinicznych wskazujących na nadchodzący zgon przed planowanym zakończeniem eksperymentu, na przykład: niezdolność do dotarcia do wody lub pożywienia (patrz Wytyczne dotyczące humanitarnego punktu końcowego (8) w celu uzyskania danych szczegółowych).

1.3 ZASADA METODY BADAWCZEJ

Grupom zwierząt tej samej płci podaje się, zgodnie z procedurą stopniową, stałe dawki na poziomie 5, 50, 300 i 2000 mg/kg (w wyjątkowych wypadkach można rozważyć podanie dodatkowej stałej dawki wynoszącej 5000 mg/kg, patrz sekcja 1.6.2). Poziom pierwszej stałej dawki jest określany na podstawie badania poglądowego na poziomie, który spowoduje wystąpienie określonych objawów zatrucia, lecz nie spowoduje ciężkich zatruć lub śmierci. Objawy kliniczne oraz objawy kojarzone z bólem, cierpieniem i zbliżającą się śmiercią zostały opisane w oddzielnych Wytycznych OECD (8). Następnej grupie zwierząt może zostać podana wyższa bądź niższa stała dawka, w zależności od obecności lub braku objawów zatrucia lub śmiertelności. Taka procedura jest powtarzana aż do osiągnięcia dawki powodującej wyraźne zatrucie lub powodującej nie więcej niż jeden przypadek śmiertelny, lub w przypadku braku skutków w następstwie podania najwyższej dawki, bądź w przypadku zgonu przy najniższej dawce.

1.4 OPIS METODY BADAWCZEJ

1.4.1 Wybór gatunków zwierząt

Preferowanym gatunkiem gryzonia jest szczur, choć dopuszcza się wykorzystywanie innych gatunków gryzoni. Na ogół w doświadczeniach wykorzystuje się samice (7). Wynika to z faktu, znajdującego swoje potwierdzenie w literaturze dotyczącej konwencjonalnych badań LD50, że różnice między płciami są znikome, lecz tam, gdzie występują, samice są z reguły nieznacznie bardziej wrażliwe (10). Jednakże, jeżeli wiedza na temat właściwości toksykologicznych i toksykokinetycznych związków o pokrewnej budowie wskazuje, że samce mogą być bardziej wrażliwe, w takim przypadku należy wybrać do badania tę płeć. Jeżeli badanie jest przeprowadzane na samcach, należy podać uzasadnienie.

Zaleca się wykorzystanie zdrowych, młodych, dorosłych zwierząt pochodzących ze szczepów na ogół wykorzystywanych w laboratorium. Samice powinny być bezdzietne i nieciężarne. Każde zwierzę na początku cyklu laboratoryjnego powinno być w wieku między 8 a 12 tygodniem, a jego masa nie powinna przekraczać lub być mniejsza o ± 20 % średniej masy wszystkich wykorzystywanych uprzednio zwierząt.

1.4.2 Warunki przebywania i warunki żywieniowe

Temperatura w badawczych pomieszczeniach hodowlanych powinna wynosić 22 °C (± 3 °C). Chociaż wilgotność względna powinna wynosić co najmniej 30 % i pożądane jest, żeby nie przekraczała 70 % poza czasem czyszczenia pomieszczenia, celem powinno być utrzymywanie jej na poziomie 50–60 %. Oświetlenie powinno być sztuczne, w cyklu 12 godzin jasno, 12 godzin ciemno. Do żywienia można stosować konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dostępem do wody pitnej. Zwierzęta mogą być grupowane w klatkach w sposób nieograniczający łatwej obserwacji pojedynczych sztuk.

1.4.3 Przygotowanie zwierząt

Zwierzęta są wybierane losowo, oznaczane w sposób umożliwiający identyfikację poszczególnych osobników, i przetrzymywane w swoich klatkach przynajmniej przez 5 dni przed podaniem pierwszej dawki, co umożliwia aklimatyzację do warunków laboratoryjnych.

1.4.4 Przygotowanie dawek

Na ogół badana substancja powinna być podawana w dawkach o stałej objętości przy zmianie stężenia dawkowanego preparatu. Jednakże w przypadku badania końcowego produktu będącego cieczą lub mieszaniny, dla celów oceny niebezpiecznego działania tej substancji, bardziej stosowne może okazać się wykorzystanie substancji nierozcieńczonej. tj. substancji o stałym stężeniu. Wymóg ten może być ponadto określony w niektórych przepisach wykonawczych. W żadnym razie niedopuszczalne jest przekroczenie maksymalnej objętości przewidzianej do podania. Maksymalna objętość cieczy podanej jednorazowo zależy od wielkości badanego zwierzęcia. Dla gryzoni objętość ta nie powinna przekraczać 1 ml/100 g masy ciała: jednakże w przypadku roztworów wodnych dopuszczalne jest przyjęcie dawki 2 ml/100 g masy ciała. Jeżeli chodzi o przygotowywanie dozowanego preparatu, należy użyć, o ile to możliwe, roztworów/zawiesin/emulsji wodnych, następnie rozważyć przygotowanie roztworów/zawiesin/emulsji w oleju (np. oleju kukurydzianym), a dopiero w następnej kolejności roztworów innych nośników. W przypadkach stosowania nośnika różnego od wody muszą być znane jego właściwości toksykologiczne. Dawki muszą być przygotowywane na krótko przed podaniem, chyba że stabilność przygotowanego preparatu w okresie, w jakim ma on być stosowany, jest znana i możliwa do przyjęcia.

1.5 PROCEDURA

1.5.1 Podawanie dawki

Substancja badana jest podawana w formie pojedynczej dawki przez zgłębnik przy użyciu sondy przełykowej lub odpowiedniej kaniuli intubacyjnej. W nietypowych przypadkach, gdy niemożliwe jest podanie pojedynczej dawki, jednorazowa dawka może zostać rozbita na mniejsze porcje i podawana w odstępach czasowych w okresie nieprzekraczającym 24 godzin.

Zwierzęta powinny być wyposzczone przed podaniem dawki (np. szczurom należy wstrzymać podawanie jedzenia przez noc, lecz nie wstrzymywać wody, myszom należy wstrzymać jedzenie przez 3–4 godziny, lecz nie wstrzymywać wody). Następnie, po wyposzczeniu, zwierzęta należy zważyć oraz podać im substancję badaną. W przypadku szczurów po podaniu substancji badanej można wstrzymać podawanie jedzenia przez 3–4 godziny, a w przypadku myszy przez 1–2 godziny. Jeżeli dawka jest podawana porcjami przez określony czas, może być konieczne podanie pokarmu i wody w zależności od długości okresu podawania dawki.

1.5.2 Badania poglądoweC

elem badań poglądowych jest wybranie odpowiedniej dawki początkowej dla badań zasadniczych. Substancja badana jest podawana poszczególnym zwierzętom w sposób sekwencyjny, zgodnie ze schematem postępowania zawartym w załączniku 1. Badania poglądowe są przerywane, gdy możliwe jest podjęcie decyzji co do ilości dawki wyjściowej (lub następuje śmierć w wyniku podania najmniejszej stałej dawki).

Dawka początkowa wyznaczona do badania poglądowego danej substancji jest wybierana, w oparciu o dane eksperymentalne z badań in vivo i in vitro tej samej substancji lub substancji pokrewnych pod względem budowy, spośród stałych dawek określonych na poziomie 5, 50, 300, i 2000 mg/kg, jako dawka, która powinna wywołać wyraźną toksyczność. W przypadku braku danych na temat takich substancji należy ustalić dawkę wyjściową na poziomie 300 mg/kg.

Dopuszczalna jest nie krótsza niż 24-godzinna przerwa w podawaniu dawki jednemu zwierzęciu. Wszystkie zwierzęta należy objąć obserwacją przez przynajmniej 14 dni.

W wyjątkowych okolicznościach, i wyłącznie jeżeli wymagają tego określone potrzeby regulacyjne, można rozważyć podanie dawki dodatkowej stałej na górnym poziomie 5000 mg/kg (patrz załącznik 3). Z uwagi na dobrostan zwierząt, badania na zwierzętach w zakresie kategorii 5 GSH (2000 i 5000 mg/kg) są odradzane i powinny być rozważane wyłącznie w przypadku znacznego prawdopodobieństwa, że wyniki takich badań przyniosą bezpośrednie korzyści dla ochrony zdrowia ludzkiego, zwierząt lub środowiska naturalnego).

W przypadku gdy zwierzę, któremu w badaniach poglądowych została podana najniższa stała dawka (5 mg/kg) ginie, normalną procedurą jest przerwanie badań i przypisanie substancji do kategorii 1 GSH (jak to przedstawiono w załączniku 1). Jednakże, w przypadku gdy wymagane jest potwierdzenie klasyfikacji wstępnej, możliwe jest przeprowadzenie procedury dodatkowej, zgodnie z poniższym opisem. Drugie zwierzę otrzymuje dawkę 5 mg/kg. Jeżeli również ono pada, przypisanie do kategorii 1 GHS zostaje potwierdzone, a badanie zostaje natychmiastowo przerwane. Jeżeli drugie zwierzę przeżyje, dawkę 5 mg/kg podaje się maksymalnie trzem kolejnym zwierzętom. Z uwagi na wysokie ryzyko śmiertelności, dawki powinny być podawane sekwencyjnie, co zapewni optymalną ochronę zwierząt. Przerwy w podawaniu dawek każdemu zwierzęciu powinny pozwalać na uzyskanie pewności, że poprzednie zwierzę przeżyje. W momencie wystąpienia drugiego przypadku śmiertelnego, sekwencyjne podawanie dawek zostaje natychmiast przerwane, a podawanie dawek kolejnym zwierzętom wstrzymane. Ponieważ wystąpienie drugiego przypadku śmiertelnego (niezależnie od liczby zwierząt poddanych badaniu do momentu ich przerwania) mieści się w wyniku A (2 lub więcej przypadków śmiertelnych), stosowana jest zasada klasyfikacji określona w załączniku 2, zgodnie z którą stężenie stałej dawki wynosi 5 mg/kg. Dodatkowo, do momentu przyjęcia nowego GHS, obowiązujące są wytyczne zawarte w załączniku 4, dotyczące klasyfikacji substancji w ramach systemu WE.

1.5.3 Badania zasadnicze

1.5.3.1 Liczba zwierząt i poziomy dawek

Działania, jakie mają być podjęte w następstwie przeprowadzenia badań przy pomocy dawek wyjściowych, są przedstawione na schemacie postępowania zawartym w załączniku 2. Wymagany jest jeden z trzech schematów postępowania; bądź przerwanie testów i przypisanie do jednej z klas klasyfikacji niebezpieczeństwa, zbadanie zwierzęcia przy pomocy wyższej stałej dawki, bądź jego zbadanie przy pomocy niższej stałej dawki. Jednakże w celu ochrony zwierząt, poziom, który spowodował śmierć zwierzęcia w trakcie badań poglądowych, nie będzie powtórnie wykorzystany w badaniach zasadniczych (patrz załącznik 2). Doświadczenie wykazuje, że najbardziej prawdopodobny wynik na poziomie wyjściowym stałej dawki umożliwi klasyfikację substancji, skutkiem czego nie będą konieczne dalsze badania.

Normalnie wykorzystuje się ogólną liczbę pięciu zwierząt jednej płci dla każdego badanego poziomu dawki. Liczba ta obejmuje jedno zwierzę zbadane w trakcie badań poglądowych przy pomocy wybranej dawki oraz cztery inne zwierzęta (z wyjątkiem sytuacji, w których poziom dawki wykorzystanej w badaniach zasadniczych nie był wcześniej zastosowany w badaniach poglądowych).

Odstępy między podawaniem dawek na każdym poziomie określa się na podstawie czasu wystąpienia, długości trwania i dokuczliwości objawów zatrucia. Podanie zwierzęciu następnej dawki powinno zostać opóźnione do momentu uzyskania pewności co do możliwości przeżycia zwierząt, którym podano ostatnią dawkę. Zalecana jest przerwa rzędu 3 lub 4 dni między podaniem kolejnych dawek, o ile wystąpi taka potrzeba, w celu umożliwienia obserwacji opóźnionego zatrucia. Odstęp ten może zostać przedłużony, np. w przypadku niejednoznacznej reakcji.

W przypadku stosowania górnej dawki granicznej na poziomie 5000 mg/kg należy stosować procedurę przedstawioną w załączniku 3 (patrz także: sekcja 1.6.2).

1.5.3.2 Badanie graniczne

Badanie graniczne jest stosowane w sytuacji gdy badający posiada informacje sugerujące, że badany materiał może być nietoksyczny, np. posiada toksyczność na poziomie przekraczającym nieznacznie dawki graniczne określone przepisami wykonawczymi. Informacje na temat toksyczności można uzyskać na podstawie wiedzy na temat podobnych zbadanych związków lub podobnych badanych mieszanin lub produktów, z uwzględnieniem tożsamości i zawartości procentowej składników, o których wiadomo, że mają znaczenie z punktu widzenia toksyczności. W sytuacji niewystarczającej ilości lub braku informacji na temat toksyczności materiału badanego lub w przypadku, gdy oczekuje się, że badany materiał może być toksyczny, należy przeprowadzić badanie zasadnicze.

W przypadku zastosowania normalnej procedury, badanie graniczne dla potrzeb niniejszych wytycznych polega na podaniu dawki wyjściowej badania poglądowego, a następnie podaniu substancji czterem pozostałym zwierzętom.

1.6 OBSERWACJE

Zwierzęta są poddawane obserwacji osobniczej przynajmniej raz w ciągu pierwszych 30 minut po podaniu dawki, okresowo przez pierwsze 24 godziny, ze szczególnym uwzględnieniem pierwszych 4 godzin, a następnie codziennie, ogólnie przez 14 dni, z wyjątkiem sytuacji, w których muszą one zostać wyeliminowane z badań i uśmiercone w sposób humanitarny z uwagi na ich dobrostan, lub gdy padły. Jednakże czas trwania obserwacji nie powinien być ustalany według ścisłych reguł. Powinien zależeć od działania toksycznego, czasu wystąpienia skutków i długości okresu powrotu do stanu normalnego, i może skutkiem tego być wydłużony, w przypadku gdy zostanie to uznane za stosowne. Czas, w jakim pojawiają się i zanikają objawy zatrucia, jest istotny, szczególnie w przypadku występowania opóźnionych objawów zatrucia (11). Wszystkie spostrzeżenia są systematycznie zapisywane w ewidencji prowadzonej osobno dla każdego osobnika.

Dodatkowe obserwacje są wymagane, jeżeli zwierzęta wciąż wykazują objawy zatrucia. Obserwacje powinny dotyczyć zmian na skórze i futrze, oczach i błonach śluzowych, a także w układach oddechowym, krążenia, autonomicznym i centralnym układzie nerwowym oraz zmian w funkcjonowaniu somatomotorycznym i schematach zachowań. Szczególną uwagę należy poświęcić obserwacjom drżenia, konwulsji, ślinienia się, biegunki, letargu, snu i śpiączki.Należy przestrzegać zasad i kryteriów streszczonych w Wytycznych dotyczących humanitarnego punktu końcowego. Zwierzęta, u których stwierdzono stan agonalny oraz zwierzęta wykazujące objawy silnego bólu powinny zostać uśmiercone w sposób humanitarny. W przypadku uśmiercenia zwierząt z przyczyn humanitarnych lub ich zgonu, czas zgonu powinien zostać zapisany najdokładniej jak to możliwe.

1.6.1 Masa ciała

Masa każdego zwierzęcia powinna zostać określona na krótko przed podaniem substancji badanej i przynajmniej w odstępie tygodnia od jej podania. Zmiany masy powinny zostać obliczone i zapisane. Po zakończeniu badań zwierzęta, które przeżyły, są ważone i uśmiercane w sposób humanitarny.

1.6.2 Patologia

Wszystkie badane zwierzęta (włączając zwierzęta, które padły podczas badań lub zostały wyeliminowane z badań ze względu na ich dobrostan) powinny zostać poddane całkowitej sekcji zwłok. Wszystkie całkowite zmiany patologiczne powinny zostać zapisane oddzielnie dla każdego zwierzęcia. Badanie mikroskopowe organów wykazujących wyraźne zmiany patologiczne u zwierząt, które przeżyły 24 lub więcej godzin po podaniu pierwszej dawki, mogą również zostać rozważone, ponieważ mogą one dostarczyć użytecznych informacji.

2. DANE

Należy podać dane dla każdego zwierzęcia. Dodatkowo, wszystkie dane powinny zostać streszczone w tabeli, pokazującej dla każdej badanej grupy liczbę wykorzystanych sztuk, liczbę zwierząt wykazujących objawy zatrucia, liczbę zwierząt padłych w trakcie badań lub uśmierconych z przyczyn humanitarnych, czas zgonu poszczególnych zwierząt, opis oraz przebieg w czasie skutków zatrucia oraz powrotu do stanu normalnego, a także wyniki sekcji zwłok.

3. SPRAWOZDANIE

3.1 SPRAWOZDANIE Z BADAŃ

Sprawozdanie z badań musi zawierać następujące informacje, jeśli są one stosowne:

Substancja badana:

- charakter fizyczny, czystość, i jeśli to stosowne, właściwości fizyko-chemiczne (włączając rodzaj izomerii),

- identyfikację, w tym numer CAS.

Nośnik (jeśli był użyty):

- uzasadnienie wyboru nośnika, jeśli jest inny niż woda.

Zwierzęta badane:

- użyty gatunek/szczep,

- stan mikrobiologiczny zwierzęcia, jeśli jest znany,

- liczbę, wiek i płeć zwierząt (włączając, o ile to stosowne, uzasadnienie wykorzystania samców zamiast samic),

- źródło, warunki środowiska, pożywienie itp.

Warunki badań:

- szczegóły dotyczące postaci substancji badanej, włączając stan skupienia podawanego środka,

- szczegóły dotyczące podawania substancji badanej, włączając objętość dawki oraz czas podawania dawki,

- szczegóły dotyczące jakości pożywienia i wody (włączając w to rodzaj/źródło diety, źródło wody),

- uzasadnienie wyboru dawki wyjściowej.

Wyniki:

- tabelę przedstawiającą dane nt. reakcji oraz poziomów dawek dla każdego zwierzęcia (np. zwierząt wykazujących objawy zatrucia, włączając śmiertelność, a także charakter, intensywność oraz trwałość objawów),

- tabelę zawierającą informację na temat masy ciała oraz zmiany masy ciała,

- masę indywidualną zwierząt w dniu podania dawki, następnie w odstępach tygodniowych, a także w momencie śmierci lub uśmiercenia,

- data i czas śmierci, o ile nastąpiła przed przewidywanym uśmierceniem,

- przebieg w czasie objawów zatrucia i informacje, czy były one odwracalne w przypadku każdego zwierzęcia,

- wyniki sekcji zwłok oraz badań histopatologicznych dla każdego zwierzęcia, jeżeli są dostępne.

Omówienie i interpretacja wyników.

Wnioski.

4. BIBLIOGRAFIA

(1) British Toxicology Society Working Party on Toxicity (1984). Special report: a new approach to the classification of substances and preparation on the basis of their acute toxicity. Human Toxicol., 3,85-92.

(2) Van den Heuvel, M.J., Dayan, A.D. and Shillaker, R.O. (1987). Evaluation of the BTS approach to the testing of substances and preparation for their acute toxicity. Human Toxicol., 6, 279-291.

(3) Van den Heuvel, M.J., Clark, D.G., Fielder, R.J., Koundakjian, P.P., Oliver, G.J.A., Pelling, D., Tomlinson,N.J. and Walker, A.P. (1990). The international validation of a fixed-dose procedure as an alternative to the classical LD50 test. Fd. Chem. Toxicol. 28, 469-482.

(4) Whitehead, A. and Curnow, R.N. (1992). Statistical evaluation of the fixed-dose procedure. Fd. Chem.Toxicol., 30, 313-324.

(5) Stallard, N. and Whitehead, A. (1995). Reducing numbers in the fixed-dose procedure. Human Exptl.Toxicol. 14, 315-323. Human Exptl. Toxicol.

(6) Stallard, N., Whitehead, A. and Ridgeway, P. (2002). Statistical evaluation of the revised fixed doseprocedure. Hum. Exp. Toxicol., 21, 183-196.

(7) OECD (2001). Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N. 24. Paris.

(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assesment N. 19.

(9) OECD (1998). Harmonised Integrated Hazard Classification for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p.11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/ pages/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html].

(10) Lipnick, R.L., Cotruvo, J.A., Hill, R.N., Bruce, R.D., Stitzel, K.A., Walker, A.P., Chu, I., Goddard, M., Segal, L., Springer, J.A. and Myers, R.C. (1995). Comparison of the Up-and-Down, Conventional LD50, and Fixed-Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol. 33, 223-231.

(11) Chan P.K and A.W. Hayes (1994) Chapter 16 Acute Toxicity and Eye Irritation. In: Principles and Methods of Toxicology. 3rd Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd. New York, USA.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK 2C

"B.1b. TOKSYCZNOŚĆ OSTRA POKARMOWA – METODA KLAS OSTREJ TOKSYCZNOŚCI

1. METODA

Niniejsza metoda badawcza jest kopią OECD TG 423 (2001)

1.1 WPROWADZENIE

Metoda klas ostrej toksyczności (1) przyjęta w tym badaniu jest procedurą stopniową, w której dla każdego stopnia wykorzystywane są trzy osobniki zwierząt jednej płci. Zależnie od śmiertelności oraz/lub stanu agonalnego zwierząt, do stwierdzenia ostrej toksyczności badanej substancji konieczne mogą być średnio 2–4 etapy. Niniejsza procedura jest powtarzalna, w jej toku wykorzystuje się niewiele zwierząt i daje ona możliwość klasyfikacji substancji w sposób podobny do innych metod badania ostrej toksyczności. Metoda klas ostrej toksyczności opiera się na ocenach biometrycznych (2)(3)(4)(5) przeprowadzonych z wykorzystaniem stałych dawek, oddzielonych w odpowiedni sposób umożliwiający ocenę substancji dla celów klasyfikacji i oceny niebezpieczeństwa. Metoda ta została przyjęta w 1996 r. i była poddawana intensywnej weryfikacji in vivo w oparciu o dane o LD50 uzyskane z literatury, zarówno na szczeblu narodowym (6), jak i międzynarodowym (7).

Wytyczne dotyczące wyboru najbardziej odpowiedniej metody badawczej dla danego przypadku zostały zamieszczone w Wytycznych dotyczących badania toksyczności ostrej pokarmowej (7). Wytyczne te zawierają ponadto dodatkowe informacje na temat przeprowadzania i interpretacji Metody badawczej B.1b.

Nie jest również konieczne podawanie dawek mogących powodować silny ból lub strach wynikający z działania żrącego lub podrażniającego.Zwierzęta w stanie agonalnym lub w oczywisty sposób cierpiące albo chore i doświadczające strachu powinny zostać uśmiercone w humanitarny sposób i uwzględniane w interpretacji wyników badań jako zwierzęta padłe w trakcie badania. Kryteria podejmowania decyzji co do uśmiercenia zwierząt w stanie agonalnym lub cierpiących ból oraz wytyczne dotyczące rozpoznawania przewidywalnego lub zbliżającego się zgonu są zawarte w oddzielnych Wytycznych. (9)

Metoda opiera się na wcześniej określonych dawkach, a wyniki uzyskane w wyniku jej zastosowania pozwalają na ocenę i klasyfikację zgodną z Globalnym Zharmonizowanym Systemem klasyfikacji związków chemicznych pod względem ich ostrej toksyczności (10).

W zasadzie niniejsza metoda nie pozwala na dokładne obliczenie LD50, lecz pozwala na określenie zakresu ekspozycji, tam gdzie oczekiwana jest śmiertelność, ponieważ śmierć określonego odsetka zwierząt nadal stanowi jeden z głównych punktów końcowych badania. Metoda umożliwia określenie wartości LD50, wyłącznie w przypadku, gdy przynajmniej dwie dawki spowodowały śmiertelność wyższą niż 0 %, lecz mniejszą niż 100 %. Wykorzystanie selekcji wcześniej określonych dawek, niezależnie od substancji badanej, której klasyfikacja jest wyraźnie powiązana z liczbą zwierząt obserwowanych na poszczególnych etapach, poprawia możliwości laboratoriom w zakresie konsekwencji i powtarzalności sprawozdań laboratoryjnych.

Laboratorium badawcze powinno uwzględniać wszystkie dostępne informacje na temat badanej substancji przed rozpoczęciem badań. Informacje te powinny obejmować tożsamość i budowę chemiczną substancji; właściwości fizyko-chemiczne; wyniki innych badań toksyczności in vitro lub in vivo substancji; dane dotyczące toksyczności substancji pokrewnych pod względem budowy; przewidywane zastosowanie (zastosowania) tej substancji. Informacje te są niezbędne w celu spełnienia wszelkich wymogów dotyczących ochrony zdrowia ludzkiego i umożliwienia wyboru najbardziej odpowiedniej dawki wyjściowej.

1.2 DEFINICJE

Toksyczność ostra pokarmowa: oznacza niepożądane skutki pojawiające się w następstwie podania doustnego pojedynczej dawki substancji lub wielu dawek w okresie 24 godzin.

Opóźniona śmierć: oznacza, że zwierzę nie umiera, ani nie wydaje się być w agonii przez 48 godzin, lecz pada później w 14-dniowym okresie obserwacyjnym.

Dawka: oznacza ilość podanej substancji badanej. Dawka jest wyrażana w wadze próbki na jednostkę masy zwierzęcia (np. mg/kg).

GHS: Globalny zharmonizowany system klasyfikacji substancji i mieszanin chemicznych. Połączone działania OECD (w dziedzinie zdrowia ludzkiego i ochrony środowiska), Komitetu Ekspertów ONZ w sprawie transportu towarów niebezpiecznych (w zakresie właściwości fizyko-chemicznych) i Międzynarodowej Organizacji Pracy (ILO) (w zakresie wymiany informacji na temat niebezpieczeństw), koordynowane w ramach Międzyorganizacyjnego programu na rzecz właściwego zarządzania związkami chemicznymi (IOMC).

Zagrażająca śmierć: występuje w przypadku, gdy przewiduje się wystąpienie stanu agonalnego lub śmierć przed następnym zaplanowanym punktem czasowym obserwacji. Objawy wskazujące na ten stan mogą obejmować u gryzonia konwulsje, ułożenie na boku, pozycję leżącą oraz drgawki (patrz: Wytyczne dotyczące humanitarnego punktu końcowego(9) celem uzyskania szczegółowych informacji).

LD50(średnia dawka śmiertelna): jest statystycznie wyprowadzoną pojedynczą dawką substancji, która powoduje zgon 50 procent zwierząt przy podaniu drogą pokarmową. Wartość LD50 jest wyrażona w wadze substancji badanej na jednostkę masy badanego zwierzęcia (mg/kg).

Dawka Graniczna: oznacza górną dawkę graniczną w badaniach (2000 lub 5000 mg/kg).

Stan agonalny: stan śmierci lub niezdolności do przeżycia nawet w przypadku zastosowania leczenia (patrz: Wytyczne metodyczne dotyczące humanitarnego punktu końcowego (9) w celu uzyskania danych szczegółowych).

Przewidywana śmierć: obecność objawów klinicznych wskazujących na nadchodzący zgon w przewidzianym czasie w przyszłości przed planowanym zakończeniem eksperymentu, na przykład niezdolność do dotarcia do wody lub pożywienia (patrz: Wytyczne metodyczne dotyczące humanitarnego punktu końcowego (9) w celu uzyskania danych szczegółowych).

1.3 ZASADA METODY BADANIA

Zasadą badania jest to, że w oparciu o procedurę etapową z użyciem minimalnej liczby zwierząt na każdym etapie uzyskiwane są wystarczające informacje na temat ostrej toksyczności substancji badanej w celu jej zaklasyfikowania. Substancja jest podawana doustnie grupie zwierząt laboratoryjnych w jednej z określonych dawek. Substancja jest badana przy użyciu procedury etapowej, na każdym etapie wykorzystywane są trzy zwierzęta jednej płci (na ogół samice). Brak lub obecność śmiertelności związanej z podaniem odczynnika zwierzętom, determinuje następny etap, tj.:

- dalsze badania są zbyteczne,

- dawka zostaje podana trzem następnym zwierzętom,

- dawka na następnym niższym bądź wyższym poziomie zostaje podana trzem następnym zwierzętom.

Szczegóły procedury są opisane w załączniku 1. Metoda pozwala na ocenę w odniesieniu do przypisania substancji badanej do jednej z szeregu klas toksyczności określonych poprzez ustalone wartości odcinania D50.

1.4 OPIS METODY BADAWCZEJ

1.4.1 Wybór gatunków zwierząt

Preferowanym gatunkiem gryzonia jest szczur, choć dopuszcza się wykorzystywanie innych gatunków gryzoni. Na ogół w doświadczeniach wykorzystuję się samice (9). Wynika to z faktu, znajdującego swoje potwierdzenie w literaturze na temat konwencjonalnych badań LD50, że różnice między płciami są znikome, lecz tam gdzie występują, samice są z reguły nieznacznie bardziej wrażliwe (11). Jednakże, jeżeli wiedza na temat właściwości toksykologicznych i toksokinetycznych związków o podobnej budowie wskazuje na to, że samce mogą być bardziej wrażliwe, w takim przypadku należy wybrać do badania tę płeć. Jeżeli badanie jest przeprowadzane na samcach, należy podać uzasadnienie

Zaleca się wykorzystanie zdrowych, młodych, dorosłych zwierząt pochodzących ze szczepów na ogół wykorzystywanych w laboratorium. Samice powinny być bezdzietne i nieciężarne. Każde zwierzę na początku cyklu laboratoryjnego powinno być w wieku między 8 a 12 tygodniem, a jego masa nie powinna przekraczać lub być mniejsza o ± 20 % średniej masy wszystkich wykorzystywanych uprzednio zwierząt.

1.4.2 Warunki przebywania i warunki żywieniowe

Temperatura w badawczych pomieszczeniach hodowlanych powinna wynosić 20 °C (± 3 °C). Chociaż wilgotność względna powinna wynosić co najmniej 30 % i pożądane jest, żeby nie przekraczała 70 % poza czasem czyszczenia pomieszczenia, celem powinno być utrzymywanie jej na poziomie 50–60 %. Oświetlenie powinno być sztuczne, w cyklu 12 godzin jasno, 12 godzin ciemno. Do żywienia można stosować konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dostępem do wody pitnej. Zwierzęta mogą być grupowane w klatkach w sposób nieograniczający łatwej obserwacji pojedynczych sztuk.

1.4.3 Przygotowanie zwierząt

Zwierzęta są wybierane losowo, oznaczane w sposób umożliwiający identyfikację pojedynczych osobników i przetrzymywane w swoich klatkach przynajmniej przez 5 dni przed podaniem pierwszej dawki, co umożliwia aklimatyzację do warunków laboratoryjnych.

1.4.4 Przygotowanie dawek

Na ogół badana substancja powinna być podawana w dawkach o stałej objętości przy zmianie stężenia dawkowanego preparatu. Jednakże w przypadku badania końcowego produktu będącego cieczą lub mieszaniną, dla celów oceny ryzyka tej substancji bardziej stosowne może okazać się wykorzystanie w badaniach substancji nierozcieńczonej, tj. substancji o stałym stężeniu. Wymóg ten może być ponadto określony w niektórych przepisach wykonawczych. W żadnym razie niedopuszczalne jest przekroczenie maksymalnej objętości przewidzianej do podania. Maksymalna objętość cieczy podanej jednorazowo zależy od wielkości badanego zwierzęcia. Dla gryzoni objętość ta nie powinna przekraczać 1ml/100g masy ciała; jednakże w przypadku roztworów wodnych dopuszczalne jest przyjęcie dawki 2ml/100g masy ciała. Jeżeli chodzi o przygotowywanie dozowanego preparatu, należy użyć, o ile to możliwe, roztworów/zawiesin/emulsji wodnych, następnie rozważyć przygotowanie roztworów/zawiesin/emulsji w oleju (np. oleju kukurydzianym), a dopiero w następnej kolejności roztworów innych nośników. W przypadkach stosowania nośnika różnego od wody muszą być znane jego właściwości toksykologiczne. Dawki muszą być przygotowywane na krótko przed podaniem, chyba że stabilność przygotowanego preparatu w okresie, w jakim ma on być stosowany, jest znana i możliwa do przyjęcia.

1.5 PROCEDURA

1.5.1 Podawanie dawki

Substancja badana jest podawana w formie pojedynczej dawki przez zgłębnik przy użyciu sondy przełykowej lub odpowiedniej kaniuli intubacyjnej. W nietypowych przypadkach, gdy niemożliwe jest podanie pojedynczej dawki, jednorazowa dawka może zostać rozbita na mniejsze porcje i podawana w odstępach czasowych w okresie nieprzekraczającym 24 godzin.

Zwierzęta powinny być wyposzczone przed podaniem dawki (np. szczurom należy wstrzymać podawanie jedzenia przez noc, lecz nie wstrzymywać podawania wody, myszom należy wstrzymać podawanie jedzenia przez 3–4 godziny, lecz nie wstrzymywać wody). Następnie, po wyposzczeniu, zwierzęta należy zważyć oraz podać im substancję badaną. W przypadku szczurów po podaniu substancji badanej można wstrzymać podawanie jedzenia przez 3–4 godziny, a w przypadku myszy przez 1–2 godziny. Jeżeli dawka jest podawana porcjami przez określony czas, może być konieczne podanie pokarmu i wody w zależności od długości okresu podawania dawki.

1.5.2 Liczba zwierząt i poziomy dawki

Na każdym etapie wykorzystywane są trzy zwierzęta. Poziom dawki, która ma być wykorzystana jako dawka wyjściowa, jest wybierana z jednego z czterech stałych poziomów 5, 50, 300 i 2000 mg/kg masy ciała. Poziom wyjściowy dawki powinien być taki, żeby powodował śmiertelność u niektórych zwierząt, którym ją zaaplikowano. Schemat postępowania zamieszczony w załączniku 1 opisuje procedurę, którą należy podjąć dla każdej dawki wyjściowej. Dodatkowo, do momentu przyjęcia nowego GHS, obowiązujące są wytyczne zawarte w załączniku 4, dotyczące klasyfikacji substancji w ramach systemu WE.

Jeżeli dostępne informacje sugerują brak prawdopodobieństwa śmiertelności przy najwyższym poziomie dawki (2000 mg/kg masy ciała), powinno zostać przeprowadzone badanie graniczne. W przypadku braku informacji na temat danej substancji, która ma być badana, z uwagi na dobrostan zwierząt zalecane jest zastosowanie dawki wyjściowej 300 mg/kg masy ciała.

Odstępy między podawaniem dawek na każdym poziomie określa się na podstawie czasu wystąpienia, długości trwania i dokuczliwości objawów zatrucia. Podanie zwierzęciu następnej dawki powinno zostać opóźnione do momentu uzyskania pewności co do możliwości przeżycia zwierząt, którym podano ostatnią dawkę.

W wyjątkowych okolicznościach, i wyłącznie jeżeli wymagają tego określone potrzeby regulacyjne, można rozważyć podanie dawki dodatkowej ustalonej na górnym poziomie 5000 mg/kg (patrz załącznik 3). Z uwagi na dobrostan zwierząt, badania na zwierzętach w zakresie kategorii 5 GSH (2000 i 5000 mg/kg) są odradzane i powinny być rozważane wyłącznie w przypadku znacznego prawdopodobieństwa, że wyniki takich badań przyniosą bezpośrednie korzyści dla ochrony zdrowia ludzkiego, zwierząt lub środowiska naturalnego.

1.5.3 Badanie graniczne

Badanie graniczne jest stosowane w sytuacji gdy badający posiada informacje sugerujące, że badany materiał może być nietoksyczny, np. posiada toksyczność na poziomie przekraczającym nieznacznie dawki graniczne określone przepisami wykonawczymi. Informacje na temat toksyczności mogą zostać uzyskane na podstawie wiedzy na temat podobnych zbadanych związków lub podobnych zbadanych mieszanin lub produktów, z uwzględnieniem tożsamości i zawartości procentowej składników, o których wiadomo, że mają znaczenie z punktu widzenia toksyczności. W sytuacji niewystarczającej ilości lub braku informacji na temat toksyczności materiału testowego lub w przypadku gdy, zgodnie z oczekiwaniami, badany materiał może być toksyczny, należy przeprowadzić badanie zasadnicze.

Badanie graniczne dla jednej dawki na poziomie 2000 mg/kg masy ciała może zostać przeprowadzone na sześciu zwierzętach (trzy na każdym etapie). W wyjątkowych okolicznościach dopuszczalne jest przeprowadzenia badania granicznego przy jednej dawce na poziomie 5000 mg/kg na trzech zwierzętach (patrz załącznik 2). W przypadku wystąpienia śmiertelności związanej z substancją badaną, konieczne może okazać się przeprowadzenie badania na następnym niższym poziomie.

1.6 OBSERWACJE

Zwierzęta są poddawane obserwacji osobniczej przynajmniej raz w ciągu pierwszych 30 min. po podaniu dawki, okresowo przez pierwsze 24 godziny, ze szczególnym uwzględnieniem pierwszych 4 godzin, a następnie codziennie ogólnie przez 14 dni, z wyjątkiem sytuacji w których muszą one zostać wyeliminowane z badań i humanitarnie zabite ze względu na ich dobro, lub zostały znalezione martwe. Jednakże czas trwania obserwacji nie powinien być ustalany według ścisłych reguł. Powinien on być zależny od działania toksycznego, czasu wystąpienia skutków i długości okresu powrotu do stanu normalnego, i może skutkiem tego być przedłużany, w przypadku gdy zostanie to uznane za stosowne. Czas, w jakim pojawiają się i zanikają objawy zatrucia, jest istotny, szczególnie w przypadku występowania opóźnionych objawów zatrucia (11). Wszystkie obserwacje są systematycznie zapisywane w ewidencji prowadzonej osobno dla każdego zwierzęcia.

Dodatkowe obserwacje będą wymagane, jeżeli zwierzęta wciąż wykazują objawy zatrucia. Obserwacje powinny dotyczyć zmian na skórze i futrze, oczach i śluzówce a także w układach oddechowym, krążenia, autonomicznym i centralnym układzie nerwowym oraz zmian w funkcjonowaniu somatomotorycznym i schematach zachowania. Szczególną uwagę należy poświęcić obserwacjom drżenia, drgawek, ślinienia się, biegunki, letargu, snu i śpiączki.Należy przestrzegać zasad i kryteriów streszczonych w Wytycznych dotyczących humanitarnego punktu końcowego. Zwierzęta, u których stwierdzono stan agonalny oraz zwierzęta wykazujące objawy silnego bólu powinny zostać uśmiercone w sposób humanitarny. W przypadku uśmiercenia zwierząt z przyczyn humanitarnych lub stwierdzenia u nich zgonu, czas zgonu powinien zostać zapisany najdokładniej, jak to jest możliwe.

1.6.1 Masa ciała

Masa każdego zwierzęcia powinna zostać określona na krótko przed podaniem substancji badanej i przynajmniej w odstępie tygodnia od jej podania. Zmiany masy powinny zostać obliczone i zapisane. Po zakończeniu badań zwierzęta, które przeżyły, są ważone i humanitarnie uśmiercane.

1.6.2 Patologia

Wszystkie badane zwierzęta (włączając zwierzęta, które padły podczas badań lub zostały wyeliminowane z badań ze względu na ich dobro) powinny zostać poddane całkowitej sekcji zwłok. Wszystkie całkowite zmiany patologiczne powinny zostać zapisane oddzielnie dla każdego zwierzęcia. Badanie mikroskopowe organów wykazujących ewidentne zmiany patologiczne u zwierząt, które przeżyły 24 lub więcej godzin po podaniu pierwszej dawki, mogą również zostać wzięte pod uwagę, ponieważ mogą one dostarczyć użytecznych informacji.

2. DANE

Należy podać dane dla każdego zwierzęcia. Dodatkowo, wszystkie dane powinny zostać streszczone w tabeli, pokazującej dla każdej badanej grupy liczbę wykorzystanych sztuk, liczbę zwierząt wykazujących objawy zatrucia, liczbę zwierząt, u których stwierdzono zgon w trakcie badań lub uśmierconych z przyczyn humanitarnych, czas zgonu poszczególnych zwierząt, opis oraz przebieg w czasie objawów zatrucia oraz powrotu do stanu normalnego, a także wyniki sekcji.

3. SPRAWOZDANIE

3.1 Sprawozdanie z badań

Sprawozdanie z badań musi zawierać następujące informacje, o ile są one stosowne:

Substancja badana:

- charakter fizyczny, czystość, i jeśli to stosowne, właściwości fizyko-chemiczne (włączając rodzaj izomerii),

- identyfikację w tym numer CAS.

Nośnik (jeśli był użyty):

- uzasadnienie wyboru nośnika, jeśli jest inny niż woda.

Zwierzęta badane:

- użyty gatunek/szczep,

- stan mikrobiologiczny zwierzęcia jeśli jest znany,

- liczbę, wiek i płeć zwierząt (włączając, o ile to stosowne, uzasadnienie wykorzystania samców zamiast samic),

- źródło, warunki środowiska, pożywienie itp.

Warunki badań:

- szczegóły dotyczące postaci substancji badanej, włączając stan skupienia podawanego środka,

- szczegóły dotyczące podawania substancji badanej, włączając objętość dawki oraz czas podawania dawki,

- szczegóły dotyczące jakości pożywienia i wody (włączając w to rodzaj/źródło diety, źródło wody),

- uzasadnienie wyboru dawki wyjściowej.

Wyniki:

- tabelę przedstawiającą dane nt. reakcji oraz poziomów dawek dla każdego zwierzęcia (np. zwierząt wykazujących objawy zatrucia, włączając śmiertelność, charakter, intensywność oraz trwałość objawów),

- tabelę zawierającą informacje na temat masy ciała oraz zmian masy ciała,

- masę indywidualną zwierząt w dniu podania dawki, następnie w tygodniowych odstępach, a także w momencie śmierci lub uśmiercenia,

- data i czas śmierci, o ile nastąpiła przed przewidywanym uśmierceniem,

- przebieg w czasie objawów zatrucia i czy były one odwracalne w przypadku każdego zwierzęcia,

- wyniki sekcji oraz badań histopatologicznych w odniesieniu do każdego zwierzęcia, jeżeli są dostępne.

Omówienie i interpretacja wyników.

Wnioski.

4. BIBLIOGRAFIA

(1) Roll R., Höfer-Bosse Th. And Kayser D. (1986). New Perspectives in Acute Toxicity Testing of Chemicals. Toxicol. Lett., Suppl. 31, 86

(2) Roll R., Riebschläger M., Mischke U. and Kayser D. (1989). Neue Wege zur Bestimmung der akuten Toxizität von Chemikalien. Bundesgesundheitsblatt 32, 336-341.

(3) Diener W., Sichha L., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1994). The Biometric Evaluation of the Acute-Toxic-Class Metoda (Oral). Arch. Toxicol. 68, 559-610

(4) Diener W., Mischke U., Kayser D. and Schlede E. (1995). The Biometric Evaluation of the OECD Modified Version of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 729-734.

(5) Diener W., and Schlede E. (1999) Acute Toxicity Class Metodas: Alterations to LD/LC50 Tests. ALTEX16, 129-134

(6) Schlede E., Mischke U., Roll R. and Kayser D. (1992). A National Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method. An Alternative to the LD50 Test. Arch. Toxicol. 66, 455-470.

(7) Schlede E., Mischke U., Diener W. and Kayser D. (1994). The International Validation Study of the Acute-Toxic-Class Method (Oral). Arch. Toxicol. 69, 659-670.

(8) OECD (2001) Guidance Document on Acute Oral Toxicity Testing. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Grade N. 24. Paris.

(9) OECD (2000) Guidance Document on the Recognition, Grade and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment N 19.

(10) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System For Human Health And Environmental Effects Of Chemical Substances as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals in November 1998, Part 2, p. 11 [http://webnet1.oecd.org/oecd/stronas/home/displaygeneral/0,3380,EN-documents-521-14-no-24-no-0,FF.html]

(11) Lipnick R L, Cotruvo, J A, Hill R N, Bruce R D, Stitzel K A, Walker A P, Chu I; Goddard M, Segal L, Springer J A and Myers R C (1995) Comparison of the Up-and Down, Conventional LD50, and Fixed Dose Acute Toxicity Procedures. Fd. Chem. Toxicol 33, 223-231.

(12) Chan P.K. and A.W. Hayes. (1994 ). Chap. 16. Acute Toxicity and Eye Irritancy. Principles and Methods of Toxicology. Third Edition. A.W. Hayes, Editor. Raven Press, Ltd., New York, USA."

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK 2D

B.4. OSTRA TOKSYCZNOŚĆ: PODRAŻNIENIA/KOROZJA SKÓRY

1. METODA

Niniejsza metoda jest kopią OECD TG 404 (2002).

1.1 WPROWADZENIE

W przygotowywaniu niniejszej zaktualizowanej metody, specjalną uwagę poświęcono możliwym ulepszeniom w zakresie zagadnień dotyczących dobrostanu zwierząt, a także ocenie wszystkich dostępnych informacji na temat substancji badanej, w celu uniknięcia niepotrzebnych badań na zwierzętach laboratoryjnych. Niniejsza metoda zawiera zalecenie, zgodnie z którym przed przystąpieniem do opisywanego badania in vivo na korozję/podrażnienia skórne wywołane przez daną substancję zostanie przeprowadzona analiza wagi dowodów uzyskanych na podstawie istniejących danych. Jeżeli dostępne dane są niewystarczające, mogą zostać opracowane przy pomocy badań sekwencyjnych (1). Strategia badań zawiera wykaz zweryfikowanych i zaakceptowanych badań in vitro i stanowi załącznik do niniejszej metody. Dodatkowo, tam gdzie to stosowne, zamiast jednoczesnej aplikacji zwierzęciu trzech łat testowych, zalecane jest stosowanie aplikacji sekwencyjnej, zamiast symultanicznej, we wstępnych badaniach in vivo.

Z uwagi na dobrze pojęty interes nauki i dobrostan zwierząt, badania in vivo nie powinny być podejmowane, jeżeli wszystkie dostępne dane odnoszące się do potencjalnego działania korozyjnego/podrażniającego skórę w wyniku działania substancji nie zostały uzyskane z analizy wagi dowodów. Takie dane będą zawierały dowody z wykonanych badań na ludziach oraz/lub zwierzętach laboratoryjnych, dowody korozji/podrażnień wywołanych przez jedną lub wiele substancji pokrewnych pod względem budowy lub mieszanin takich substancji, dane wskazujące na silną kwasowość lub alkaliczność substancji (2)(3) oraz wyniki zweryfikowanych i zaakceptowanych badań in vivo lub ex vivo (4)(5)(5a). Takie analizy powinny ograniczyć potrzebę badań in vivo pod kątem korozji/podrażnień skórnych wywołanych przez substancje, w odniesieniu do których już istnieje wystarczający materiał dowodowy w odniesieniu do dwóch odnośnych punktów docelowych, zgromadzony w wyniku prowadzenia innych badań.

Preferowaną strategię badań sekwencyjnych, obejmującą przeprowadzenie zweryfikowanych i zaakceptowanych badań in vivo i ex vivo działania korozyjnego/podrażniającego, zawiera załącznik do niniejszej metody. Strategia ta została opracowana i jednomyślnie zalecona przez uczestników warsztatów OECD (6), a następnie zatwierdzona jako zalecana strategia badań w ramach Globalnego Zharmonizowanego Systemu klasyfikacji związków chemicznych (GHS) (7). Zaleca się realizację tej strategii badań przed podjęciem badań in vivo. Dla nowych substancji strategia ta jest zalecanym stopniowym podejściem badawczym służącym opracowywaniu danych wartościowych z naukowego punktu widzenia dotyczących korozyjnego/podrażniającego działania substancji na skórę. W odniesieniu do istniejących substancji, na temat których brak wystarczających danych co do ich działania korozyjnego/podrażniającego, strategia ta powinna zostać wykorzystana w celu uzupełnienia brakujących danych. Użycie innych strategii badawczych bądź procedur lub decyzja o nieprzyjęciu stopniowego podejścia badawczego wymaga uzasadnienia.

Jeżeli określenie korozyjności lub podrażnienia nie może zostać przeprowadzone przy użyciu analizy wagi dowodów, która jest zbieżna ze strategią badań sekwencyjnych, należy rozważyć badanie in vivo (patrz załącznik).

1.2 DEFINICJE

Podrażnienie skórne: jest wynikiem odwracalnych uszkodzeń skóry wynikających z zastosowania substancji badanej przez okres 4 godzin.Korozja skórna: jest wynikiem nieodwracalnego uszkodzenia skóry; mianowicie widocznej martwicy przebiegającej przez naskórek w głąb skóry, spowodowanej zaaplikowaniem substancji badanej na okres nieprzekraczający czterech godzin.

Rodzaje korozji obejmują wrzody, krwawienie, strupy oraz, po zakończeniu 14-dniowej obserwacji, odbarwienia wynikłe ze zbielenia skóry, obszary jednolitej alopecji, a także blizny. Celem oceny niejasnych zmian można przeprowadzić badanie histopatologiczne.

1.3 ZASADA METODY BADAWCZEJ

Substancja, która ma być zbadana, jest nakładana na skórę zwierzęcia doświadczalnego w pojedynczej dawce; część skóry niepoddana zabiegowi służy jako część kontrolna. Stopień korozji/podrażnienia jest oceniany przy pomocy punktacji w określonych odstępach i zapisywany, a następnie dodatkowo opisywany w celu całkowitego oszacowania skutków działania. Czas trwania badania powinien być wystarczający do oceny odwracalności lub nieodwracalności zaobserwowanych skutków.

Zwierzęta wykazujące ciągłe objawy silnego strachu i/lub bólu na jakimkolwiek etapie badań powinny zostać uśmiercone w sposób humanitarny, a substancja oceniona stosownie do zaobserwowanych skutków. Kryteria podejmowania decyzji co do uśmiercenia zwierząt w stanie agonalnym lub cierpiących ból zostały określone w załączniku (8).

1.4 OPIS METODY BADAWCZEJ

1.4.1 Przygotowanie do badań in vivo

1.4.1.1 Wybór gatunku zwierząt

Biały królik jest preferowanym gatunkiem zwierząt laboratoryjnych. Wykorzystywane są zdrowe młode dorosłe króliki. W przypadku wykorzystania innych gatunków należy podać uzasadnienie.

1.4.1.2 Przygotowanie zwierząt

Na około 24 godziny przed badaniem należy usunąć futro z tułowia zwierzęcia poprzez gładkie wygolenie obszaru skóry na grzbiecie. Należy unikać otarć naskórka. Należy wykorzystywać wyłącznie zwierzęta ze zdrową nienaruszoną skórą.

Niektóre szczepy królików posiadają kępy futra, których gęstość jest większa w określonych porach roku. Takie obszary gęstego futra nie powinny być używane jako miejsca badań.

1.4.1.3 Warunki przebywania i warunki żywieniowe

Temperatura w badawczych pomieszczeniach hodowlanych powinna wynosić 20 °C (± 3°) dla królików. Chociaż wilgotność względna powinna wynosić co najmniej 30 % i pożądane jest, żeby nie przekraczała 70 % poza czasem czyszczenia pomieszczenia, celem powinno być utrzymywanie jej na poziomie 50–60 %. Oświetlenie powinno być sztuczne, w cyklu 12 godzin jasno, 12 godzin ciemno. Do żywienia można stosować konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dostępem do wody pitnej.

1.4.2 Procedura badań

1.4.2.1 Podanie substancji badanej

Substancja badana powinna zostać zaaplikowana na małym obszarze skóry (około 6 cm2) i przykryta łatą gazy przytrzymywaną na miejscu przy pomocy niepodrażniającego plastra. W przypadku gdy zaaplikowanie substancji bezpośrednio nie jest niemożliwe (np. w przypadku cieczy lub niektórych past), substancja badana powinna zostać najpierw nałożona na gazę, a następnie na skórę. Gaza powinna luźno przylegać do skóry i powinna być przyczepiona do skóry na czas trwania ekspozycji przy pomocy odpowiedniego opatrunku półokluzyjnego. Jeżeli substancja badana została podana na łacie, powinna ona być przyczepiona do skóry w sposób zapewniający dobry kontakt i równomierne rozprowadzenie substancji na skórze. Należy zapobiec dostępowi zwierzęcia do gazy oraz spożyciu lub inhalacji substancji badanej przez zwierzę.

Ciekłe substancje badane są na ogół stosowane w stanie nierozcieńczonym. W przypadku badania substancji stałych (których postać można zmienić na postać proszkową, o ile zachodzi tak konieczność), substancja badana powinna zostać rozcieńczona przy użyciu minimalnej ilości wody (lub, o ile to konieczne, innego odpowiedniego nośnika), wystarczającej do zapewnienia dobrego kontaktu ze skórą. Jeżeli stosowany jest inny nośnik niż woda, potencjalny wpływ na podrażnienia skóry przez tę substancję powinien być minimalny lub żaden.

O ile to możliwe, na zakończenie okresu ekspozycji, który na ogół trwa 4 godziny, pozostałości substancji badanej powinny zostać usunięte przy użyciu wody lub innego odpowiedniego rozcieńczalnika, w sposób pozwalający na uniknięcie zmian w zaistniałej reakcji oraz nienaruszenie naskórka.

1.4.2.2 Poziom dawki

Aplikowana jest dawka 0,5 ml cieczy lub 0,5 g ciała stałego lub pasty na badany obszar skóry.

1.4.2.3 Badanie wstępne (Badanie in vivo podrażnienia/korozji skóry przy użyciu jednego zwierzęcia)

Stanowczo zaleca się, aby badania in vivo były przeprowadzane wstępnie przy użyciu jednego zwierzęcia, zwłaszcza w przypadku podejrzeń, że substancja jest potencjalnie korozyjna. Jest to zgodne z sekwencyjną strategią badawczą (patrz załącznik 1).

Jeżeli oceniono, że substancja może mieć właściwości korozyjne na podstawie analizy wagi dowodów, nie są wymagane dalsze badania na zwierzętach. W przypadku większości substancji, w odniesieniu do których istnieje podejrzenie korozyjności, niewymagane są zazwyczaj dodatkowe badania in vivo. Jednakże w przypadkach, gdzie istnieje potrzeba dostarczenia dodatkowych danych z uwagi na niewystarczające dowody, mogą zostać przeprowadzone ograniczone badania na zwierzętach z zastosowaniem następującej procedury: na skórę zwierzęcia nakłada się maksymalnie do trzech łat testowych. Pierwsza łata jest usuwana po trzech minutach. Jeżeli nie zaobserwowano żadnych poważnych reakcji skórnych, nakładana jest druga łata i usuwana po godzinie. Jeżeli obserwacje na tym etapie wskazują na to, że ekspozycja może być humanitarnie przeprowadzana, należy wydłużyć jej czas do czterech godzin, trzecia łata jest nakładana i zdejmowana po czterech godzinach, a reakcja punktowana.

Jeżeli działanie korozyjne jest stwierdzone po jednej z trzech sekwencyjnych ekspozycji, badanie jest natychmiast przerywane. W przypadku niestwierdzenia działania korozyjnego po usunięciu ostatniej łaty, zwierzę jest poddawane obserwacji w okresie 14 dni, o ile wcześniej nie rozwinie się korozja.

W przypadku gdy nie przewiduje się, że substancja badana może powodować korozję, lecz może wywoływać podrażnienia, powinna ona zostać zaaplikowana jednemu zwierzęciu na czas czterech godzin.

1.4.2.4 Badanie potwierdzające (badanie in vivo podrażnienia skórnego przy wykorzystaniu dodatkowych zwierząt)

W przypadku niestwierdzenia działań korozyjnych w badaniach wstępnych, działanie podrażniające lub jego brak należy potwierdzić przy wykorzystaniu maksymalnie dwóch dodatkowych zwierząt. Każde powinno zostać zbadane przy pomocy jednej łaty w czterogodzinnym okresie ekspozycji. W przypadku stwierdzenia działania podrażniającego w badaniu wstępnym, badanie potwierdzające może zostać przeprowadzone w sposób sekwencyjny lub poprzez ekspozycję dwóch dodatkowych zwierząt jednocześnie. W wyjątkowym przypadku nieprzeprowadzania badania wstępnego, można zbadać dwa lub trzy zwierzęta, z których każde zostanie poddane działaniu jednej łaty, usuniętej następnie po czterech godzinach. Jeżeli w przypadku wykorzystywania dwóch zwierząt, obydwa wykazują te same reakcje, nie wymaga się przeprowadzania dalszych badań.W innym wypadku zbadane zostaje również trzecie zwierzę. Niejednoznaczna reakcja może wymagać oceny z wykorzystaniem dodatkowych zwierząt.

1.4.2.5 Okres obserwacji

Czas trwania obserwacji powinien być wystarczający do pełnej oceny odwracalności zaobserwowanych efektów. Jednakże eksperyment powinien zostać przerwany, skoro tylko zwierzę zacznie wykazywać trwałe objawy silnego bólu lub strachu. W celu określenia odwracalności skutków zwierzę powinno być obserwowane maksymalnie przez okres 14 dni od usunięcia łat. W przypadku zaobserwowania odwracalności przed upływem 14 dni eksperyment powinien zostać przerwany.

1.4.2.6 Obserwacja kliniczna i ocena punktowa reakcji skóry

Zwierzęta powinny zostać zbadane pod kątem wystąpienia objawów rumienia i obrzęku oraz reakcji odnotowanych po 60 minutach, a następnie po 24, 48 oraz 72 godzinach od usunięcia łaty. W badaniu wstępnym przeprowadzanym na jednym zwierzęciu miejsce zaaplikowania substancji badanej jest badane również natychmiast po usunięciu łaty. Reakcje skórne są oceniane przy pomocy wartości punktowych i zapisywane zgodnie z punktacją podaną w tabeli poniżej. W przypadku uszkodzenia naskórka, którego nie można zidentyfikować jako podrażnienia ani korozji po 72 godzinach, w celu określenia odwracalności efektów konieczne może okazać się prowadzenie obserwacji do dnia 14. Oprócz spostrzeżeń na temat podrażnień, należy w pełni opisać i zarejestrować wszelkie miejscowe skutki toksyczne, takie jak odtłuszczenie skóry oraz wszelkie ogólnoustrojowe niekorzystne skutki (np. skutki klinicznych objawów zatrucia i utrata masy ciała). Celem wyjaśnienia niejednoznacznych reakcji można posłużyć się badaniem histopatologicznym.

Ocena punktowa reakcji skóry jest z konieczności subiektywna. Celem propagowania harmonizacji oceny punktowej reakcji skóry oraz zapewnienia pomocy laboratoriom badawczym oraz osobom zaangażowanym w prowadzenie oraz interpretację obserwacji, personel prowadzący obserwacje powinien być odpowiednio przeszkolony w zakresie stosowanego systemu oceny (patrz tabela poniżej). Pomocne mogą okazać się ilustrowane instrukcje dotyczące klasyfikacji podrażnień i innych zmian skóry (9).

2. DANE

2.1 PREZENTACJA WYNIKÓW

Streszczenie wyników badań powinno zostać przedstawione w formie tabeli w sprawozdaniu końcowym z badań, która powinna zawierać wszystkie pozycje wymienione w sekcji 3.1.

2.2 OCENA WYNIKÓW

Wartości punktowe podrażnienia skóry winny być ocenianie stosownie do natury oraz natężenia zmian, oraz w świetle ich odwracalności lub jej braku. Poszczególne wyniki nie stanowią normy bezwzględnej właściwości podrażniających danego materiału, ponieważ ocenie poddawane są również pozostałe skutki ekspozycji na badany materiał. Alternatywnie, poszczególne wyniki powinny być traktowane jako wartości odniesienia, które muszą być oceniane w świetle wszystkich pozostałych spostrzeżeń z badań.

W ocenie reakcji podrażnienia, pod uwagę powinna być brana odwracalność zmian skóry. Jeżeli reakcje takie jak alopecja (na ograniczonej powierzchni), hiperkeratoza, hiperplazja i łuszczenie są nadal obecne wraz z upływem 14-dniowego okresu obserwacji, substancja badana powinna zostać uznana za drażniącą.

3. SPRAWOZDANIE

3.1 SPRAWOZDANIE Z BADAŃ

Sprawozdanie z badań musi zawierać następujące informacje:

Uzasadnienie badań in vivo: analizę wagi dowodów, włączając wyniki realizacji strategii badań sekwencyjnych:

- opis odpowiednich danych z uprzednio przeprowadzonych badań,

- dane uzyskane w wyniku realizacji każdego etapu strategii badawczej,

- opis przeprowadzonych badań in vitro, włączając szczegółowe dane na temat procedur, wyników otrzymanych z zastosowaniem substancji testowych/odniesienia,

- analiza wagi dowodów istniejących danych dla celów przeprowadzenia badań in vivo.

Substancja badana:

- identyfikacja (np. numer CAS, źródło, czystość, znane zanieczyszczenia, numer osobnika),

- stan skupienia i właściwości fizyko-chemiczne (np. pH, lotność, rozpuszczalność, stabilność),

- w przypadku mieszaniny, skład i zawartość procentową składników.

Nośnik:

- identyfikacja, stężenie (jeżeli dotyczy), użyta objętość,

- uzasadnienie wyboru nośnika.

Badane zwierzęta:

- wykorzystany gatunek/szczep, uzasadnienie wykorzystania zwierząt innych niż białe króliki,

- liczba zwierząt każdej płci,

- indywidualna masa ciała na początku i na końcu badań,

- wiek na początku badań,

- źródło pochodzenia zwierząt, warunki przetrzymywania, dieta itp.

Warunki badań:

- technika przygotowywania miejsc przyłożenia łat;

- szczegółowy opis materiału, z którego wykonane są łaty i sposób ich przykładania;

- szczegóły dotyczące przygotowania, zaaplikowania i usunięcia substancji badanej.

Wyniki:

- tabele wyników podrażnienia/korozji dla każdego zwierzęcia w każdym punkcie czasowym pomiaru,

- opis wszelkich zaobserwowanych zmian,

- słowny opis rodzaju i stopnia zaobserwowanego podrażnienia lub korozji, oraz wszystkie dane histopatologiczne,

- opis innych niekorzystnych zmian miejscowych i ogólnoustrojowych (np. odtłuszczenie skóry) towarzyszących podrażnieniu lub korozji skóry.

Omówienie wyników.

4. BIBLIOGRAFIA

(1) Barratt, M.D., Castell, J.V., Chamberlain, M., Combes, R.D., Dearden, J.C., Fentem, J.H., Gerner, I.,Giuliani, A., Gray, T.J.B., Livingston, D.J., Provan, W.M., Rutten, F.A.J.J.L., Verhaar, H.J.M., Zbinden, P.(1995) The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard. ECVAM Workshop Report 8. ATLA 23, 410–429.

(2) Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. InVitro, 2, 19–26.

(3) Worth, A.P., Fentem, J.H., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Liebsch, M. (1998) Evaluation of the proposed OECD Testing Strategy for skin corrosion. ATLA 26, 709–720.

(4) ECETOC (1990) Monograph No. 15, "Skin Irritation", European Chemical Industry, Ecology and Toxicology Centre, Brussels.

(5) Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Esdaile, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 12, 483–524.

(5a) Testing Method B.40 Skin Corrosion.

(6) OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Held in Solna, Sweden, 22–24 January 1996 (http://www1.oecd.org/ehs/test/background.htm).

(7) OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www1.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).

(8) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Grade and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications. Series on Testing and Grading No. 19 (http://www1.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

(9) EPA (1990). Atlas of Dermal Lesions, (20T-2004). United States Environmental Protection Agency, Office of Pesticides and Toxic Substances, Washington, DC, August 1990. [Dostępne na wniosek w sekretariacie OECD].

TABELA I: PUNKTOWA OCENA REAKCJI SKÓRY

TWORZENIE RUMIENIA I OBRZĘKU

Brak rumienia … | 0 |

Bardzo lekki rumień (prawie niewidoczny) … | 1 |

Wyraźny rumień … | 2 |

Rumień umiarkowany do mocnego … | 3 |

Mocny rumień (czerwień przypominająca barwę mięsa czerwonego) do form obrzęku wykluczających klasyfikację zmiany jako rumienia … | 4 |

Maksymalna możliwa wartość punktowa: 4 |

Tworzenie się obrzęku

Brak obrzęku … | 0 |

Bardzo słaby obrzęk (prawie niewidoczny) … | 1 |

Lekki obrzęk (dobrze wyodrębniony) … | 2 |

Umiarkowany obrzęk (wzniesienie na około 1 mm) … | 3 |

Mocny obrzęk (wniesienie ponad 1 mm, sięgający poza obszar eksponowania) … | 4 |

Maksymalna możliwa wartość punktowa: 4 |

Celem wyjaśnienia reakcji niejednoznacznych można przeprowadzić badanie histopatologiczne.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK 2E

B. 5. TOKSYCZNOŚĆ OSTRA: PODRAŻNIENIE/KOROZJA OCZU

1. METODA

Niniejsza metoda jest kopią OECD TG 405 (2002)

1.1 WPROWADZENIE

W przygotowywaniu niniejszej zaktualizowanej metody specjalną uwagę poświęcono możliwym ulepszeniom w zakresie zagadnień dotyczących dobrostanu zwierząt, a także ocenie wszystkich dostępnych informacji na temat substancji badanej, w celu uniknięcia niepotrzebnych badań na zwierzętach laboratoryjnych. Niniejsza metoda zawiera zalecenie, zgodnie z którym przed przystąpieniem do opisywanego badania in vivo na korozję/podrażnienia oka wywołane przez daną substancję zostanie przeprowadzona analiza wagi dowodów uzyskanych na podstawie istniejących danych (1). Jeżeli dostępne dane są niewystarczające, mogą zostać opracowane przy pomocy badań sekwencyjnych (2)(3). Strategia badań zawiera wykaz zweryfikowanych i zaakceptowanych badań in vitro i stanowi załącznik do niniejszej metody. Dodatkowo, zalecane jest przeprowadzenie badań in vivo podrażnień/korozji skóry w celu oszacowania korozji oka przed przystąpieniem do badań in vivo oka.

Z uwagi na dobrze pojęty interes nauki i dobrostan zwierząt, badania in vivo nie powinny być podejmowane, jeżeli wszystkie dostępne dane odnoszące się do potencjalnego działania korozyjnego/podrażniającego skórę w wyniku działania substancji nie zostały uzyskane z analizy wagi dowodów. Takie dane będą zawierały dowody z wykonanych badań na ludziach i/lub zwierzętach laboratoryjnych, dowody korozji/podrażnień wywołanych przez jedną lub wiele substancji pokrewnych pod względem budowy lub mieszanin takich substancji, dane wskazujące na silną kwasowość lub alkaliczność substancji (4)(5) oraz wyniki zweryfikowanych i zaakceptowanych badań in vivo lub ex vivo (6)(6a). Takie badania mogą być przeprowadzone przed lub w następstwie analizy wagi dowodów.

W przypadku pewnych substancji takie analizy mogą wskazywać na potrzebę badań in vivo potencjalnego korozyjnego/drażniącego działania danej substancji na oko. W każdym takim przypadku przed podjęciem badań in vivo oka zostaną przeprowadzone najpierw badania in vivo skutków działania substancji na skórę, zgodnie z metodą badawczą B.4 (7). Zastosowanie analizy wagi dowodów i strategii badań sekwencyjnych powinno ograniczyć potrzebę prowadzenia badań in vivo pod kątem korozji/podrażnienia oka przez substancje, w odniesieniu do których już istnieje wystarczający materiał dowodowy, zgromadzony w wyniku prowadzenia innych badań. Jeżeli nie jest możliwe określenie potencjalnego działania korozyjnego lub drażniącego na oka przy zastosowaniu strategii badań sekwencyjnych, nawet po przeprowadzeniu badań in vivo pod kątem korozji i podrażnienia skóry, można przeprowadzić badania in vivo pod kątem korozji/podrażnienia oka.

Załącznik do niniejszej metody zawiera preferowaną strategię badań sekwencyjnych, obejmującą przeprowadzenie zweryfikowanych oraz zaakceptowanych badań in vivo i ex vivo działania korozyjnego/podrażniającego. Strategia ta została opracowana i jednomyślnie zalecona przez uczestników warsztatów OECD (8), a następnie zatwierdzona jako zalecana strategia badań w ramach Globalnego Zharmonizowanego Systemu klasyfikacji związków chemicznych (GHS) (9). Zaleca się realizację tej strategii badań przed podjęciem badań in vivo. Dla nowych substancji strategia ta jest zalecanym stopniowym podejściem badawczym służącym opracowywaniu wartościowych z naukowego punktu widzenia danych dotyczących korozyjnego/podrażniającego działania substancji. W odniesieniu do istniejących substancji, na temat których brak wystarczających danych co do ich działania korozyjnego/podrażniającego, strategia ta powinna zostać wykorzystana w celu uzupełnienia brakujących danych. Użycie innych strategii badawczych bądź procedur, lub decyzja o nieprzyjęciu stopniowego podejścia badawczego, wymaga uzasadnienia.

1.2 DEFINICJE

Podrażnienie oka: zmiany w oku spowodowane zaaplikowaniem substancji badanej na wierzchnią warstwę oka, które w pełni odwracalne w ciągu 21 dni po zaaplikowaniu.

Korozja oka: uszkodzenie tkanki oka lub poważne fizyczne uszkodzenie wzroku, spowodowane zaaplikowaniem substancji badanej na wierzchnią warstwę oka, które nie jest w pełni odwracalne w ciągu 21 dni po zaaplikowaniu.

1.3 ZASADA METODY BADAWCZEJ

Substancja, która ma być zbadana, jest nakładana na jedno oko zwierzęcia doświadczalnego, drugie oko jest wykorzystywane do badania kontrolnego. Stopień korozji/podrażnienia jest oceniany poprzez ocenę punktową zmian spojówki, rogówki oraz tęczówki w określonych odstępach. Inne zmiany w oku i niekorzystne skutki ogólnoustrojowe są również opisywane w celu uzyskania kompletnej oceny skutków. Długość trwania badania powinien być odpowiedni do oszacowania odwracalności lub nieodwracalności obserwowanych skutków.

Zwierzęta wykazujące ciągłe objawy silnego strachu i/lub bólu na jakimkolwiek etapie badania powinny zostać uśmiercone w sposób humanitarny, a substancja odpowiednio oceniona. Kryteria dotyczące podjęcia decyzji o uśmierceniu w sposób humanitarny zwierząt w stanie agonalnym i silnie cierpiących zawiera załącznik (10).

1.4 OPIS METODY BADAWCZEJ

1.4.1 Przygotowanie do badań in vivo

1.4.1.1 Wybór gatunków zwierząt

Biały królik jest preferowanym gatunkiem zwierząt laboratoryjnych. Wykorzystywane są zdrowe młode dorosłe króliki. W przypadku wykorzystania innych gatunków, należy podać uzasadnienie.

1.4.1.2 Przygotowanie zwierząt

Obydwoje oczu zwierzęcia doświadczalnego wstępnie wybranego do badania powinny być zbadane na 24 godziny przed przystąpieniem do badań. Zwierzęta z objawami podrażnienia oczu, wad wzroku lub uszkodzeń rogówki nie powinny być wykorzystywane w badaniu.

1.4.1.3 Warunki przetrzymywani i karmieniaZwierzęta powinny być przetrzymywane oddzielnie.

Temperatura w badawczych pomieszczeniach hodowlanych powinna wynosić 20 °C (± 3 °C) dla królików. Chociaż wilgotność względna powinna wynosić co najmniej 30 % i pożądane jest, żeby nie przekraczała 70 % poza czasem czyszczenia pomieszczenia, celem powinno być utrzymywanie jej na poziomie 50–60 %. Oświetlenie powinno być sztuczne, w cyklu 12 godzin jasno, 12 godzin ciemno. Do żywienia można stosować konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dostępem do wody pitnej.

1.4.2 Procedura badań

1.4.2.1 Podawanie substancji

Substancja badana powinna zostać umieszczona na spojówce jednego oka każdego ze zwierząt po delikatnym odsunięciu powieki z gałki ocznej. Powieki są następnie delikatnie zamykane na około jedną sekundę w celu zapobieżenia utraty materiału badanego. Drugie, nienaruszone oko jest przedmiotem badania kontrolnego.

1.4.2.2 Nawilżanie

Oczy zwierząt badanych nie powinny być przepłukiwane przez przynajmniej 24 godziny po wkropleniu substancji badanej, z wyjątkiem badania ciał stałych (patrz: sekcja 1.4.2.3.2) i przypadków natychmiastowego działania korozyjnego lub podrażniającego. O ile to stosowne, po 24 godzinach można przepłukać oczy.

Włączanie dodatkowej satelickiej grupy zwierząt w celu zbadania skutków przepłukiwania nie jest zalecane, chyba że ma to uzasadnienie naukowe. W przypadku potrzeby grupy satelickiej, należy użyć dwóch królików. Warunki przepłukiwania powinny być dokładnie dokumentowane np. czas przepłukiwania, skład i temperatura roztworu, długość trwania, objętość i szybkość aplikowania.

1.4.2.3 Poziom dawki

1.4.2.3.1 Badanie cieczy

W badaniu cieczy stosuje się dawkę o objętości 0,1ml. Nie powinno się stosować cieczy pod ciśnieniem do aplikowania substancji bezpośrednio na oko. Struga cieczy powinna zostać rozprężona i zebrana w zbiorniku przed aplikowaniem jej 0,1ml na oko.

1.4.2.3.2 Badanie substancji stałych

W badaniu ciał stałych, past i cząstek stałych stosowana ilość powinna mieć objętość 0,1 ml lub wagę nie większą niż 100 mg. Badany materiał powinien zostać sproszkowany. Objętość ciała stałego powinna być mierzona po delikatnym zbiciu np. poprzez ostukanie pojemnika pomiarowego. Jeżeli substancja badana w formie ciała stałego nie została usunięta w wyniku działania mechanizmów fizjologicznych w pierwszym punkcie czasowym obserwacji po upłynięciu godziny, oko może zostać przepłukane roztworem soli fizjologicznej lub wodą destylowaną.

1.4.2.3.3 Badanie aerozoli

Zaleca się, aby wszystkie strugi cieczy pod ciśnieniem i aerozole zostały rozprężone i zebrane przed osadzeniem na oku. Wyjątek stanowią substancje w aerozolach znajdujące się w pojemnikach pod ciśnieniem, które nie mogą zostać zebrane z powodu ich parowania. W takich przypadkach należy przytrzymać oko w pozycji otwartej, i zaaplikować substancję badaną do oka jednym podmuchem, trwającym około sekundy, z odległości 10 cm prostopadle do oka. Ta odległość może zależeć w znacznym stopniu od ciśnienia w rozpylaczu i jego zawartości. Należy uważać, aby nie doszło do uszkodzenia oka z powodu ciśnienia w rozpylaczu. W odpowiednich przypadkach, może być niezbędna ocena możliwości potencjalnego "mechanicznego" uszkodzenia oka spowodowanego siłą rozpylacza.

Oszacowanie dawki aerozolu może być wykonane poprzez następującą symulację badania: substancja jest napylana na papierek wagowy przez otwór o rozmiarze oka królika znajdujący się bezpośrednio przed papierkiem. Poziom wzrostu wagi papierka wykorzystuje się celem określenia przybliżonej ilości, jaka byłaby zaaplikowana do oka. Dla substancji lotnych dawka może zostać oszacowana poprzez zważenie pojemnika odbiorczego przed i po usunięciu badanego materiału.

1.4.2.4 Badanie wstępne (Badanie in vivo podrażnienia/korozji oka z wykorzystaniem jednego zwierzęcia)

Zgodnie ze strategią badań sekwencyjnych (patrz: załącznik 1), stanowczo zaleca się, aby badania in vivo były przeprowadzane wstępnie przy użyciu jednego zwierzęcia

Jeżeli wyniki takich badań wskazują, że substancja ma właściwości korozyjne lub powoduje silne podrażnienia oka, procedura przewiduje zaprzestanie dalszych badań podrażnień oczu.

1.4.2.5 Znieczulenie miejscowe

Znieczulenie miejscowe może zostać zastosowane na podstawie analizy wyników uzyskanych w indywidualnych przypadkach. Jeżeli analiza wagi dowodów wskazuje na to, że substancja może potencjalnie powodować ból, lub badania wstępne pozwalają sądzić, że pojawią się bolesne reakcje, można zastosować miejscowe znieczulenie przed zaaplikowaniem substancji badanej. Rodzaj, stężenie i dawka znieczulenia miejscowego powinny zostać uważnie wybrane, tak aby zapewnić, że różnice w reakcji na substancję badaną, nie są wynikiem zastosowania znieczulenia. Oko kontrolne powinno również zostać znieczulone.

1.4.2.6 Badanie potwierdzające (Badanie in vivo podrażnienia oka na dodatkowych zwierzętach)

W przypadku niestwierdzenia działań korozyjnych w badaniu wstępnym, działanie podrażniające lub jego brak należy potwierdzić przy wykorzystaniu maksymalnie dwóch dodatkowych zwierząt. Jeżeli obserwuje się silne działanie podrażniające w badaniu wstępnym, zaleca się, aby badanie potwierdzające zostało przeprowadzone w sposób sekwencyjny na jednym zwierzęciu, a nie jednocześnie na dwóch zwierzętach. Jeżeli działanie na drugim zwierzęciu okaże się korozyjne lub silnie podrażniające, badanie nie będzie kontynuowane. Dodatkowe zwierzę może być potrzebne w celu potwierdzenia słabego lub średniego działania podrażniającego.

1.4.2.7 Okres obserwacji

Długość trwania obserwacji powinien być wystarczający do oceny pełnej odwracalności obserwowanych efektów. Jednakże eksperyment powinien zostać przerwany w momencie, gdy zwierzę wykazuje objawy silnego bólu lub strachu (9). W celu określenia odwracalności efektów, w normalnych okolicznościach, zwierzę powinno być obserwowane przez 21 dni po zaaplikowaniu substancji badanej. Jeżeli odwracalność jest obserwowana przed upływem 21 dni, eksperyment powinien zostać przerwany w tym momencie.

1.4.2.7.1 Obserwacje kliniczne i ocena reakcji oka

Oczy powinny zostać zbadane po 1, 24, 48 i 72 godzinach od podania substancji badanej. Zwierzęta powinny być pod obserwacją nie dłużej niż to konieczne do uzyskania wszystkich informacji. Zwierzęta wykazujące objawy ciągłego silnego bólu lub strachu powinny zostać bezzwłocznie uśmiercone w sposób humanitarny, a substancja odpowiednio oceniona. Uśmiercone w sposób humanitarny powinny zostać zwierzęta z następującymi zmianami oka zaszłymi w następstwie zaaplikowania substancji: perforacja lub owrzodzenie rogówki, włączając garbiak; krwawienie z tylnej komory oka; zmętnienie rogówki równe 4 utrzymujące się 48 godzin; brak odbicia światła (reakcja rogówki o wartości punktowej 2), utrzymująca się 72 godziny; owrzodzenie błony spojówki; martwica spojówki lub błony mrużnej; lub oddzielająca się tkanka martwicza. Wynika to z faktu, że tego typu zmiany są na ogół nieodwracalne.

Zwierzęta, u których nie wystąpiły zmiany oczne, mogą zostać uśmiercone nie wcześniej niż na 3 dni od zaaplikowania substancji.

Zwierzęta z łagodnymi lub umiarkowanymi zmianami powinny przebywać pod obserwacją do czasu zaniknięcia zmian lub przez 21 dni, po których badanie zostaje przerwane. Obserwacje powinny być prowadzone 7., 14. i 21. dnia w celu określenia stanu zmian oraz ich odwracalności lub nieodwracalności.

Wartości punktowe reakcji oka (spojówki, rogówki i tęczówki) powinny być zapisywane dla każdego badania (tabela I). Należy również podać informacje na temat innych zmian oka (np. przekrwienie, plamy) lub innych niekorzystnych skutków ogólnoustrojowych.

Badanie reakcji może zostać wykonane przy zastosowaniu lupy stereoskopowej, ręcznej lampy szczelinowej, biomikroskopu lub innego odpowiedniego urządzenia. Po zapisaniu obserwacji w 24. godzinie oko może zostać poddane dalszym badani