3)

dodaje się rozdziały w brzmieniu: „B.49. BADANIE MIKROJĄDROWE IN VITRO W KOMÓRKACH SSAKÓW WSTĘP 1. Badanie mikrojądrowe in vitro (MNvit) jest badaniem genotoksyczności w celu wykrywania mikrojądra (MN) w cytoplazmie komórek w interfazie. Mikrojądra mogą pochodzić odpowiednio z acentrycznych fragmentów chromosomów (tj. nieposiadających centromera), lub z całych chromosomów, które nie są w stanie migrować do biegunów w stadium anafazy podziału komórek. To badanie wykrywa klastogenne i aneugenne działanie chemikaliów (substancji i mieszanin) (1) (2) w komórkach, w których doszło do podziału komórek podczas narażenia na działanie substancji badanej lub po nim. Niniejsza metoda badania (TM) dopuszcza stosowanie protokołów z inhibitorem polimeryzacji aktyny cytochalazyną B (cytoB) i bez niego. Dodanie cytoB przed ukierunkowaną mitozą umożliwia określenie i selektywną analizę częstotliwości występowania mikrojąder w komórkach, które ukończyły jedną mitozę, ponieważ takie komórki są dwujądrowe (3) (4). Niniejsza TM pozwala również na stosowanie protokołów bez zahamowania cytokinezy, pod warunkiem że istnieją dowody na to, że badana populacja komórek przeszła mitozę. 2. Oprócz badania MNvit wykorzystywanego do identyfikowania chemikaliów (substancji i mieszanin), które powodują powstawanie mikrojąder, informacji na temat mechanizmów uszkadzania chromosomu i formowania mikrojąder mogą dostarczyć również: zahamowanie cytokinezy, immunochemiczne oznakowanie kinetochorów lub hybrydyzacja z sondami centromerowymi/telomerowymi (fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH)) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16). Procedury oznaczania i hybrydyzacji mogą być wykorzystywane w przypadku, gdy następuje wzrost procesu formowania mikrojąder i badający zamierza ustalić, czy ten wzrost jest skutkiem klastogennych lub aneugennych zdarzeń. 3. Mikrojądra stanowią uszkodzenie, które zostało przekazane do komórek potomnych, podczas gdy aberracje chromosomowe znalezione w komórkach metafazy mogą nie być przekazywane. Ponieważ mikrojądra w komórkach w stadium interfazy można stosunkowo obiektywnie ocenić, pracownicy laboratorium muszą tylko określić, czy komórki się podzieliły i ile spośród komórek zawiera mikrojądro. W rezultacie preparaty mogą być ocenione względnie szybko, a analizy mogą być zautomatyzowane. Badanie staje się wydajniejsze, bo można oceniać tysiące zamiast setek komórek poddanych działaniu. Wreszcie, ponieważ mikrojądra mogą tworzyć się z chromosomów opóźnionych, istnieje możliwość wykrycia czynników wywołujących aneuploidię, które trudno badać w konwencjonalnych badaniach aberracji chromosomalnych, np. wytyczna ODCE dotycząca badań nr 473 (rozdział B.10 niniejszego załącznika) (17). Jednak badanie MNvit nie pozwala na różnicowanie chemikaliów wywołujących poliploidalność od tych wywołujących działanie klastogenne bez specjalnych technik, takich jak badanie FISH, opisane w pkt 2. 4. Badanie MNvit jest metodą in vitro, w której zazwyczaj wykorzystuje się hodowane komórki ludzkie lub gryzoni. Dostarcza ona kompleksowych podstaw do badania in vitro potencjalnego działania powodującego uszkodzenia chromosomowe, ponieważ można wykryć zarówno aneugeny, jak i klastogeny. 5. Badanie MNvit jest solidne i skuteczne w odniesieniu do różnych rodzajów komórek, oraz w obecności lub przy braku cytoB. Istnieje dużo danych na poparcie ważności badania MNvit z wykorzystaniem różnych linii komórkowych gryzoni (CHO, V79, CHL/IU i L5178Y) i ludzkich limfocytów (18) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30), (31). Obejmują one w szczególności międzynarodowe badania walidacyjne koordynowane przez Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (18) (19) (20) (21) (22) i sprawozdania z International Workshop on Genotoxicity Testing (międzynarodowych warsztatów z badań genotoksycznych) (4) (16). Dostępne dane zostały również poddane ponownej ocenie w oparciu o analizę ciężaru dowodów w retrospektywnym badaniu walidacyjnym przez Europejskie Centrum Uznawania Metod Alternatywnych (ECVAM) Komisji Europejskiej i metoda badania została zatwierdzona jako naukowo uzasadniona przez naukowy komitet doradczy ECVAM (ESAC) (32) (33) (34). Opisano wykorzystywanie ludzkich komórek z linii limfoblastoidów TK6 (35), komórek HepG2 (36) (37) i komórek zarodka chomika syryjskiego (38), pomimo że nie zostały one wykorzystane w badaniach walidacyjnych. DEFINICJE 6. Definicje są zamieszczone w dodatku 1. UWAGI WSTĘPNE 7. Badania przeprowadzane in vitro wymagają zazwyczaj wykorzystania egzogenicznego źródła aktywacji metabolicznej, chyba że komórki są metabolicznie wydolne w odniesieniu do badanych substancji. Egzogeniczny system aktywacji metabolicznej nie jest w stanie całkowicie naśladować warunków in vivo. Należy dołożyć wszelkich starań, aby uniknąć warunków, które mogłyby prowadzić do zniekształconych pozytywnych wyników nieodzwierciedlających wewnętrznej mutagenności, a które mogą wynikać ze zmian w pH lub w stężeniu osmolalnym lub być spowodowane przez wysokie poziomy cytotoksyczności (39) (40) (41). Jeśli badana substancja chemiczna powoduje zmianę w pH podłoża w momencie dodania, pH należy dostosować, najlepiej za pomocą buforowania roztworu podstawowego w taki sposób, aby wszystkie objętości we wszystkich badanych stężeniach oraz w odniesieniu do wszystkich kontroli pozostawały takie same. 8. Dla celów analizy indukcji mikrojąder istotne jest, aby mitoza miała miejsce zarówno w hodowlach komórkowych poddanych działaniu substancji, jak i w niepoddanych temu działaniu. Najpełniejsze informacje w zakresie obliczania mikrojąder można uzyskać na podstawie badań komórek, które ukończyły jedną mitozę w trakcie poddawania działaniu substancji badanej lub po nim. ZASADA BADANIA 9. Hodowle komórek ludzi lub ssaków są poddawane działaniu substancji badanej zarówno z egzogenicznym źródłem aktywacji metabolicznej, jak i bez niego, chyba że wykorzystuje się komórki o odpowiedniej zdolności metabolizowania. Stosowany równolegle rozpuszczalnik/nośnik (VC) i pozytywne substancje kontrolne (PC) są zawarte we wszystkich badaniach. 10. Komórki są hodowane w trakcie narażenia na działanie substancji badanej lub po nim przez okres, w którym uszkodzenia chromosomów lub wrzeciona mogą doprowadzić do tworzenia się mikrojąder w komórkach interfazy. Do indukcji aneuploidii substancja badana powinna zwykle być obecna w trakcie mitozy. Zebrane i zabarwione komórki interfazy są analizowane pod kątem obecności mikrojąder. W warunkach idealnych do powstania mikrojąder powinno dochodzić jedynie w tych komórkach, które ukończyły mitozę podczas narażenia na substancję badaną lub w okresie po narażeniu, jeżeli jest stosowany. W hodowlach, które były poddane działaniu substancji z blokerem cytokinezy można to osiągnąć poprzez liczenie jedynie komórek dwujądrowych. W przypadku braku blokera cytokinezy ważne jest, aby wykazać, że w poddanych analizie komórkach prawdopodobnie doszło do podziału komórek podczas narażenia na działanie substancji badanej lub po nim. Dla wszystkich protokołów ważne jest, aby wykazać, że proliferacja komórek miała miejsce zarówno w hodowlach kontrolnych, jak i w poddanych działaniu substancji, a także należy oszacować zakres cytotoksyczności wywołanej przez substancję lub cytostazy w hodowlach (lub w hodowlach równoległych), które są oceniane pod kątem zawartości mikrojąder. OPIS BADANIA Preparaty 11. Można wykorzystywać hodowane podstawowe limfocyty krwi obwodowej ludzi (5) (19) (42) (43) oraz komórki z szeregu linii komórkowych gryzoni, takich jak CHO, V79, CHL/IU i L5178Y (18) (19) (20) (21) (22) (25) (26) (27) (28) (30). Stosowanie innych linii komórkowych i typów powinno być uzasadnione na podstawie ich wykazanej efektywności w badaniu, zgodnie z kryteriami dopuszczalności opisanymi w odpowiednim rozdziale. Ponieważ podstawowa częstość występowania mikrojąder będzie miała wpływ na wrażliwość próby, zaleca się wykorzystywanie typów komórek, o niskiej, stałej częstości powstawania mikrojąder. 12. Limfocyty krwi obwodowej ludzi należy uzyskać od młodych (między 18 a 35 rokiem życia), zdrowych, niepalących osób, które ostatnio nie były narażone, o ile wiadomo, na działanie genotoksycznych substancji chemicznych lub na promieniowanie. Jeżeli dla celów stosowania łączy się komórki pochodzące od większej liczby dawców niż jeden, należy określić liczbę dawców. Częstość powstawania mikrojąder wzrasta wraz z wiekiem i tendencja ta jest wyraźniejsza w przypadku kobiet niż mężczyzn (44), dlatego należy to uwzględnić przy wyborze dawców komórek do łącznego poddawania działaniu. Pożywki i warunki hodowli kultury 13. W utrzymywaniu hodowli powinny być stosowane odpowiednie warunki podłoża hodowli oraz inkubacji (naczynia do hodowli, stężenie CO2, temperatura oraz wilgotność). Ustanowione linie komórkowe oraz szczepy powinny być rutynowo sprawdzane pod kątem stabilności zmiennej liczby chromosomów oraz nieobecności zanieczyszczenia mykoplazmą oraz nie powinny być wykorzystywane, jeżeli są zanieczyszczone lub w przypadku, gdy liczba chromosomów uległa zmianie. Powinien być znany normalny czas cyklów komórkowych w warunkach hodowli stosowanej w laboratorium przeprowadzającym badania. Jeżeli stosowana jest metoda z blokerem cytokinezy wówczas stężenie inhibitorów cytokinezy powinno być dostosowane do danego rodzaju komórek oraz należy wykazać, że jest ona w stanie wyprodukować wystarczającą liczbę komórek dwujądrowych dla celów oceny. Przygotowanie hodowli 14. Ustanowione linie komórkowe oraz szczepy: Komórki są rozmnażane z hodowli podstawowej, siane na podłożu hodowlanym w takiej gęstości, aby hodowle nie zrastały się w warstwach, a hodowle w zawiesinie nie osiągały nadmiernego zagęszczenia przed czasem pobierania, oraz inkubowane w temperaturze 37 °C. 15. Limfocyty: Krew pełną poddaną działaniu antykoagulantu (np. heparyny) lub oddzielone limfocyty hoduje się w obecności mitogenu np. fitohemoaglutyniny (PHA) przed narażeniem na działanie substancji badanej i cytoB. Aktywacja metaboliczna 16. Zewnątrzpochodny układ metabolizujący należy stosować w przypadku, gdy stosuje się komórki o niewłaściwej wewnątrzpochodnej pojemności metabolicznej. Najbardziej powszechnie wykorzystywanym systemem jest uzupełniana współczynnikiem frakcja pomitochondrialna (S9) przygotowana z wątroby gryzoni otrzymujących czynniki pobudzające enzymy takie jak Aroclor 1254 (45) (46) lub kombinacja fenobarbitonu oraz β-nafoflavonu (46) (47) (48) (49). To ostatnie połączenie nie pozostaje w sprzeczności z Konwencją sztokholmską w sprawie trwałych zanieczyszczeń organicznych (50) i rozporządzeniem (WE) nr 850/2004 dotyczącym trwałych zanieczyszczeń organicznych (66) i okazało się tak skuteczne jak Aroclor 1254 w wywołaniu oksydaz wieloczynnościowych (46) (47) (48) (49). Frakcja S9 jest zazwyczaj wykorzystywana w stężeniach o zakresie 1–10 % (v/v) w końcowym podłożu badawczym. Warunki systemu aktywacji metabolicznej mogą być uzależnione od klasy badanej substancji chemicznej i w niektórych przypadkach właściwe może okazać się wykorzystanie więcej niż jednego stężenia S9. 17. Genetycznie skonstruowane linie komórkowe oddające szczególne dla ludzi lub gryzoni enzymy aktywujące mogą sprawić, że zewnątrzpochodny system aktywacji metabolicznej stanie się niepotrzebny i mogą być stosowane jako komórki badane. W takich przypadkach wybór wykorzystywanych linii komórkowych powinien być uzasadniony naukowo, np. poprzez istotność oksydaz wieloczynnościowych dla metabolizmu substancji badanej (51) i ich zdolność do reagowania na znane klastogeny i aneugeny (zob. oddzielny rozdział dotyczący kryteriów dopuszczalności). Należy uwzględnić fakt, że badana substancja może nie być metabolizowana przez wyrażoną oksydazę wieloczynnościową; W takim przypadku negatywne wyniki nie wskazują na to, że badana substancja nie może wywołać procesu powstawania mikrojąder. Preparat substancji badanej 18. Stałe substancje chemiczne należy rozpuścić w odpowiednich rozpuszczalnikach lub nośnikach oraz rozcieńczyć, jeżeli jest to odpowiednie, zanim komórki zostaną poddane działaniu substancji badanej. Płynne substancje badane mogą być dodawane bezpośrednio do układu badawczego i/lub rozcieńczane przed poddaniem komórek działaniu substancji badanej. Gazy lub lotne substancje chemiczne powinny być badane za pomocą odpowiednich modyfikacji standardowych protokołów, takich jak poddawanie komórek działaniu substancji badanej w szczelnie zamkniętych naczyniach (52) (53). Należy wykorzystywać świeże preparaty substancji badanej, chyba że dane dotyczące stabilności wskazują, iż dopuszczalne jest składowanie substancji Warunki badania Rozpuszczalniki/nośniki 19. Rozpuszczalnik/nośnik nie powinien reagować z substancją badaną, lub uniemożliwiać przeżywania komórek lub utrzymania działania S9 przy wykorzystywanym stężeniu. Jeśli są stosowane inne niż dobrze znane rozpuszczalniki/nośniki (np. woda, podłoże hodowli komórkowych, sulfotlenek dimetylu), ich stosowanie powinno być wsparte danymi wskazującymi ich zgodność z substancją badaną oraz brak ich toksyczności genetycznej. Zaleca się, o ile to możliwe, aby w pierwszej kolejności rozważone zostało wykorzystanie wodnych rozpuszczalników/nośników. Wykorzystanie cytoB jako blokera cytokinezy 20. Jedną z najistotniejszych kwestii w wykonywaniu badania MNvit jest zapewnienie, że oceniane komórki zakończyły mitozę podczas poddania działaniu substancji badanej lub w okresie po poddaniu, jeżeli jest stosowany. CytoB to czynnik, który był powszechnie stosowany do zahamowania cytokinezy, ponieważ hamuje on polimeryzację aktyny, a tym samym zapobiega oddzielaniu komórek potomnych po mitozie, doprowadzając do tworzenia komórek dwujądrowych (5) (54) (55). Z tego względu liczenie mikrojąder można ograniczyć do komórek, które przeszły mitozę w trakcie ich poddawania działaniu substancji badanej lub po nim. Wpływ substancji badanej na kinetykę proliferacji komórek może być mierzony jednocześnie. CytoB powinno być wykorzystywane jako bloker cytokinezy w przypadku, gdy są stosowane ludzkie limfocyty, ponieważ czas cyklu komórkowego będzie różny dla różnych hodowli i różnych dawców oraz ze względu na to, że nie wszystkie limfocyty będą reagować na PHA. Inne metody zostały wykorzystane podczas badania linii komórkowych, aby ustalić, czy oceniane komórki się podzieliły; zostały one omówione poniżej (zob. pkt 26). 21. Laboratorium powinno określić odpowiednie stężenie cytoB dla każdego rodzaju komórek do osiągnięcia optymalnej częstości powstawania komórek dwujądrowych w hodowlach kontrolnych z wykorzystaniem rozpuszczalnika/nośnika. Odpowiednie stężenie cytoB zwykle wynosi między 3 i 6 μg/ml. Pomiar proliferacji komórek i cytotoksyczności oraz wybór stężeń narażenia 22. Przy ustalaniu najwyższego stężenia badanej substancji, które ma być badane, należy unikać stężeń, które mogą dawać zniekształcone pozytywne wyniki, takich jak te, które powodują nadmierną cytotoksyczność, opad w podłożu hodowlanym i znaczne zmiany pH lub osmolalności (39) (40) (41). 23. Dokonuje się pomiaru proliferacji komórek, aby upewnić się, że komórki poddane działaniu substancji przeszły mitozę podczas badania oraz że poddawanie działaniu substancji jest prowadzone na odpowiednim poziomie cytotoksyczności (zob. pkt 29). Cytotoksyczność powinna być oznaczana z aktywacją metaboliczną oraz bez niej w komórkach wymagających aktywacji metabolicznej, z wykorzystaniem względnego wzrostu liczby komórek (RICC) lub względnego podwojenia populacji (RPD) (zob. wzory w dodatku 2), chyba że wykorzystuje się cytoB. Gdy wykorzystuje się cytoB cytotoksyczność można określić, wykorzystując wskaźnik replikacji (RI) (zob. wzór w dodatku 2). 24. Poddawanie działaniu substancji badanej hodowli z cytoB i pomiar względnych częstości występowania komórek jednojądrowych, dwujądrowych i wielojądrowych w hodowli składają się na metodę dokładnego ilościowego określania wpływu na proliferację komórek i działanie cytotoksyczne lub cytostatyczne substancji badanej (5) oraz zapewnia, że liczone są jedynie komórki, w których dokonał się podział podczas poddawania działaniu substancji badanej lub po nim. 25. W badaniach z cytoB cytostatyczność/cytotoksyczność można określić ilościowo na podstawie wskaźnika proliferacji blokera cytokinezy (CBPI) (5) (26) (56) lub można ją uzyskać z RI dla co najmniej 500 komórek na hodowlę (zob. wzory w dodatku 2). Gdy wykorzystuje się cytoB do oceny proliferacji komórek, należy określić CBPI lub RI na podstawie co najmniej 500 komórek na hodowlę. Pomiary te, między innymi, można wykorzystać do oszacowania cytotoksyczności przez porównanie wartości w hodowlach, które zostały poddane działaniu substancji badanej oraz w hodowlach kontrolnych. Ocena innych markerów cytotoksyczności (np. zrastanie się, liczba komórek, apoptoza, martwica, liczenie metafaz) może dostarczyć użytecznych informacji. 26. W badaniach bez cytoB należy wykazać, że w ocenianych komórkach w hodowli dokonał się podział podczas poddawania działaniu substancji badanej lub po nim, inaczej można otrzymać fałszywie ujemne reakcje. Wśród metod, które zostały wykorzystane dla zapewnienia, że oceniane są komórki po podziale, można wyliczyć włączenie i późniejsze wykrywanie bromodeoksyurydyny (BrdU) w celu identyfikacji odtworzonych komórek (57), tworzenie się klonów, gdy komórki z trwałych linii komórkowych są poddawane działaniu i oceniane in situ na szkiełku mikroskopowym (wskaźnik proliferacji (PI)) (25) (26) (27) (28) lub pomiar względnego podwojenia populacji (RPD) czy względnego wzrostu liczby komórek (RICC) lub inne sprawdzone metody (16) (56) (58) (59) (zob. wzory w dodatku 2). Ocena innych markerów cytotoksyczności lub cytostazy (np. zrastanie się, liczba komórek, apoptoza, martwica, liczenie metafaz) może dostarczyć użytecznych informacji. 27. Co najmniej trzy nadające się do analizy stężenia badanej substancji powinny zostać poddane ocenie. Aby to osiągnąć, konieczne może okazać się przeprowadzanie doświadczenia z wykorzystaniem większej liczby stężeń o niewielkiej rozpiętości pomiędzy nimi i przeanalizowanie powstawania mikrojąder w tych stężeniach, przy zapewnieniu odpowiedniego zakresu cytotoksyczności. Alternatywnym sposobem postępowania jest wstępne zbadanie cytotoksyczności w celu ograniczenia zakresu ostatecznych badań. 28. Najwyższe stężenie powinno mieć na celu spowodowanie 55 ± 5 % cytotoksyczności. Wyższe poziomy mogą powodować uszkodzenie chromosomu jako drugorzędny skutek cytotoksyczności (60). W przypadku gdy pojawia się cytotoksyczność, wybrane stężenia badanej substancji powinny obejmować zakres od stężenia powodującego 55 ± 5 % cytotoksyczności do stężenia wywołującego niewielką cytotoksyczność lub jej brak. 29. Jeżeli nie występuje ani cytotoksyczność, ani opad, najwyższe stężenie badanej substancji powinno odpowiadać 0,01 M, 5 mg/mL lub 5 μl/mL, w zależności od tego, które ze stężeń jest najniższe. Stężenia wybrane do analizy powinny w zasadzie być rozdzielone o nie więcej niż 10. W przypadku substancji badanych, które wykazują gwałtowny wzrost krzywej stężenie-reakcja, konieczne może okazać się zmniejszenie rozpiętości pomiędzy stężeniami substancji badanej, tak aby możliwa była również ocena hodowli o umiarkowanych i niskich zakresach toksyczności. 30. Gdy czynnikiem ograniczającym jest rozpuszczalność, maksymalnym stężeniem, jeśli nie jest ono ograniczone przez cytotoksyczność, powinno być najniższe stężenie, przy którym widoczny jest minimalny opad w hodowlach, pod warunkiem że nie istnieją żadne zakłócenia oceny. Oceny opadu należy dokonać za pomocą metod takich, jak mikroskopia świetlna, obserwując opad, który utrzymuje się lub pojawia podczas hodowli (pod koniec poddawania działaniu substancji badanej). Kontrole 31. Równoległe kontrole pozytywne i kontrole z zastosowaniem rozpuszczalnika/nośnika zarówno z aktywacją metaboliczną, jak i bez niej powinny zostać uwzględnione w każdym doświadczeniu. 32. PC są potrzebne, aby wykazać zdolność komórek, a także protokołu badań, do rozpoznawania klastogenów i aneugenów oraz aby potwierdzić zdolność metaboliczną preparatu S9. PC powinna wykorzystywać znane czynniki wywołujące powstawanie mikrojąder w stężeniach, od których oczekuje się wytworzenia odtwarzalnego oraz wykrywalnego wzrostu poza tło, i wykazywać czułość systemu. Stężenia pozytywnych kontroli powinny zostać wybrane tak, aby skutki były jasne, ale by badającemu nie ujawniały bezpośrednio tożsamości zakodowanych szkiełek laboratoryjnych. 33. Klastogen, który wymaga aktywacji metabolicznej (np. cyklofosfamid; benzo[a]piren), powinien być wykorzystany, by wykazać zarówno wydolność metaboliczną, jak i zdolność systemu badania do wykrywania klastogenów. Można użyć innych PC, jeśli jest to uzasadnione. Jako że niektóre wymagające aktywacji metabolicznej PC mogą działać bez egzogenicznej aktywacji metabolicznej w pewnych warunkach poddawania działaniu substancji badanej lub w niektórych liniach komórkowych, potrzeba aktywacji metabolicznej i działalnie preparatu S9 powinny zostać zbadane w wybranej linii komórkowej i w wybranych stężeniach. 34. W chwili obecnej nie są znane anaugeny wymagające aktywacji metabolicznej dla ich działania genotoksycznego (16). Obecnie przyjęte PC w odniesieniu do działania aneugenicznego to, na przykład, kolchicyna i winblastyna. Inne substancje chemiczne mogą być wykorzystane, o ile powodują powstawanie mikrojąder wyłącznie lub przede wszystkim poprzez działanie aneugeniczne. Aby uniknąć konieczności stosowania dwóch PC (na klastogenność i aneugenność) bez aktywacji metabolicznej, kontrola aneugenności może służyć jako PC bez S9, a kontrola klastogenności może być stosowana do badania adekwatności stosowanego systemu aktywacji metabolicznej. PC zarówno na klastogenność, jak i aneugenność powinny być wykorzystywane w komórkach, które nie wymagają stosowania S9. Zalecane PC są zawarte w dodatku 3. 35. Wykorzystanie PC powiązanych z klasą chemiczną może być brane pod uwagę, jeżeli są dostępne odpowiednie substancje chemiczne. Wszystkie PC powinny być właściwe dla rodzaju komórki oraz warunków aktywacji. 36. Kontrole z zastosowaniem rozpuszczalnika/nośnika powinny zostać włączone w ramach każdego okresu pobierania hodowli. Ponadto NC niepoddane działaniu substancji badanej (brak rozpuszczalnika/nośnika) powinny być również wykorzystywane, chyba że istnieją opublikowane lub historyczne laboratoryjne dane dotyczące kontroli wykazujące, że wybrany rozpuszczalnik w zastosowanych stężeniach nie powoduje szkodliwych skutków. PROCEDURA BADANIA Harmonogram poddawania działaniu substancji 37. Aby zmaksymalizować prawdopodobieństwo wykrycia aneugenu lub klastogenu oddziaływującego na określonym etapie cyklu komórkowego, ważne jest, by wystarczającą liczbę komórek poddać działaniu substancji badanej na wszystkich etapach ich cykli komórkowych. Harmonogram poddawania działaniu substancji linii komórkowych i hodowli komórek podstawowych różni się nieznacznie od harmonogramu stosowanego w odniesieniu do limfocytów, które wymagają stymulacji mitogenicznej do rozpoczęcia cyklu komórkowego i o których mowa w pkt 41–43 (16). 38. Teoretyczne rozważania wraz z opublikowanymi danymi (18) wskazują na to, że większość aneugenów i klastogenów wykrywa się na skutek poddawania działaniu substancji przez krótki okres czasu, od 3 do 6 godzin, w obecności S9 i przy jej braku, po czym usuwa się badaną substancję i pozostawia na okres wzrostu trwający 1,5–2,0 cykli komórkowych (6). Próbki komórek pobiera się w czasie równoważnym zwykłej (tj. takiej jak w momencie niepoddawania działaniu substancji) długości cyklu komórkowego pomnożonej przez 1,5–2,0 po rozpoczęciu lub na końcu poddawania działaniu substancji (zob. tabela 1). Okres pobierania próbek i odzyskiwania może zostać przedłużony, jeżeli wiadomo lub podejrzewa się, że substancja badana ma wpływ na szybkość cyklu komórek (np. gdy bada się nuklozydowe substancje analogiczne). 39. Ze względu na potencjalne działanie cytotoksyczne preparatu S9 na hodowane komórki ssaków, przedłużone narażenie na działanie substancji badanej o długości 1,5–2,0 zwykłych cykli komórkowych stosuje się tylko w nieobecności S9. W przypadku przedłużonego poddawania działaniu substancji istnieją możliwości poddawania komórek działaniu substancji badanej w obecności cytoB lub bez cytoB. Z tych opcji można korzystać w sytuacjach, w których może istnieć niepewność co do możliwych reakcji między substancją badaną a cytoB. 40. Proponowane harmonogramy poddawania komórek działaniu substancji przedstawiono w tabeli 1. Te ogólne harmonogramy poddawania działaniu substancji mogą ulec zmianie w zależności od stabilności i reaktywności substancji badanej lub określonych właściwości wzrostowych danych komórek. Poddawanie działaniu substancji należy rozpocząć i zakończyć w momencie wykładniczego wzrostu komórek. Harmonogramy te przedstawiono bardziej szczegółowo poniżej w pkt 41–47. Tabela 1 Czas poddawania komórek działaniu substancji i czas pobierania hodowli w badaniu MNvit Limfocyty, komórki podstawowe i linie komórkowe poddane działaniu cytoB + S9 Poddawać działaniu przez 3–6 godzin w obecności S9; usunąć S9 oraz podłoże poddania działaniu; dodać świeże podłoże i cytoB; pobierać 1,5–2,0 zwykłych cykli komórkowych później. – S9 Krótkie narażenie na działanie Poddawać działaniu substancji przez 3–6 godzin; usunąć podłoże poddawania działaniu; dodać świeże podłoże i cytoB; pobierać 1,5–2,0 zwykłych cykli komórkowych później. – S9 Przedłużone narażenie na działanie Wariant A: Poddawać działaniu substancji przez 1,5–2,0 zwykłych cykli komórkowych w obecności cytoB; pobierać pod koniec okresu narażenia. Wariant B: Poddawać działaniu substancji przez 1,5–2,0 zwykłych cykli komórkowych; usunąć substancję badaną; dodać świeże podłoże i cytoB; pobierać 1,5–2,0 zwykłych cykli komórkowych później. Linie komórkowe poddawane działaniu substancji bez cytoB (identyczne z przedstawionymi powyżej harmonogramami poddawania działaniu substancji, z tym wyjątkiem, że nie zostało dodane cytoB) Limfocyty, komórki podstawowe i linie komórkowe poddane działaniu cytoB 41. Najbardziej skutecznym podejściem w odniesieniu do limfocytów jest rozpoczęcie narażenia na działanie substancji badanej na 44–48 godzin po stymulacji PHA, kiedy przestanie dochodzić do synchronizacji cykli (5). W badaniu początkowym komórki są poddawane działaniu substancji badanej przez 3 do 6 godzin w obecności S9 i przy jej braku. Usuwa się podłoże poddania działaniu i zastępuje świeżym podłożem zawierającym cytoB, a komórki są pobierane 1,5–2,0 zwykłych cykli komórkowych później. 42. Jeżeli obydwa początkowe badania polegające na krótkotrwałym (3–6 godzin) poddaniu działaniu substancji są negatywne lub niejednoznaczne, stosuje się przedłużone narażenie na działanie bez S9. Istnieją dwie opcje poddawania działaniu i obie są równie akceptowalne. Jednakże może okazać się bardziej stosowne stosowanie opcji A w odniesieniu do pobudzonych limfocytów, wówczas gdy wzrost wykładniczy może maleć w 96 godzin po stymulacji. Ponadto hodowle komórek, które nie osiągnęły stanu przegęszczenia w chwili końcowego pobierania prób w wariancie B. — Wariant A: komórki są poddawane działaniu substancji badanej przez 1,5–2,0 zwykłych cykli komórkowych i pobierane po zakończeniu poddawania działaniu. — Wariant B: komórki są poddawane działaniu substancji badanej przez 1,5–2,0 zwykłych cykli komórkowych. Podłoże poddania działaniu substancji jest usuwane i zastępowane świeżym podłożem, a komórki są pobierane po przeprowadzeniu dodatkowych 1,5–2,0 zwykłych cykli komórkowych. 43. Komórki podstawowe i linie komórkowe należy poddawać działaniu w sposób podobny do limfocytów, z wyjątkiem tego, że nie trzeba stymulować ich za pomocą PHA przez 44–48 godzin. Komórki inne niż limfocyty powinny być narażone na działanie w taki sposób, żeby pod koniec badania komórki nadal były w logarytmicznej fazie wzrostu. Linie komórkowe bez cytoB 44. Komórki powinny być poddawane działaniu substancji przez 3–6 godzin w obecności S9 i przy jej braku. Usuwa się podłoże poddania działaniu i zastępuje świeżym podłożem, a komórki są pobierane 1,5–2,0 zwykłych cykli komórkowych później. 45. Jeżeli obydwa początkowe badania polegające na krótkotrwałym (3–6 godzin) poddaniu działania substancji są negatywne lub niejednoznaczne, stosuje się przedłużone narażenie na działanie (bez S9). Istnieją dwie opcje poddawania działaniu i obie są równie akceptowalne: — Wariant A: komórki są poddawane działaniu substancji badanej przez 1,5–2,0 zwykłych cykli komórkowych i pobierane po zakończeniu poddawania działaniu. — Wariant B: komórki są poddawane działaniu substancji badanej przez 1,5–2,0 zwykłych cykli komórkowych. Podłoże poddania działaniu substancji jest usuwane i zastępowane świeżym podłożem, a komórki są pobierane po przeprowadzeniu dodatkowych 1,5 – 2,0 zwykłych cykli komórkowych. 46. W monowarstwach mogą być obecne komórki mitotyczne (można je rozpoznać po okrągłym kształcie i fakcie, że oddzielają się od powierzchni) pod koniec 3–6 godzin poddawania działaniu substancji. Z uwagi na łatwość oddzielania się, komórki mitotyczne mogą zostać utracone w momencie, gdy usuwane jest podłoże zawierające badaną substancję. Należy zadbać o to, by zostały pobrane w momencie mycia hodowli i zwrócone do hodowli, aby uniknąć w momencie pobierania utraty komórek, które są w trakcie mitozy i w których może dochodzić do powstawania mikrojąder. Liczba hodowli 47. Hodowle reprodukcyjne powinny być stosowane dla każdego stężenia substancji badanej oraz w odniesieniu do hodowli z wykorzystaniem rozpuszczalnika/nośnika oraz negatywnych hodowli kontrolnych. Gdy można wykazać minimalne zmiany między hodowlami reprodukcyjnymi na podstawie historycznych danych laboratoryjnych, dopuszczalne jest wykorzystanie pojedynczych hodowli. Jeżeli wykorzystywane są pojedyncze hodowle, zalecane jest zbadanie większej liczby stężeń. Pobieranie komórek i przygotowywanie szkiełek mikroskopowych 48. Każdą kulturę pobiera się oddzielnie i oddzielnie poddaje działaniu substancji. Przygotowanie komórek może obejmować hipotoniczne przetwarzanie komórek, ale etap ten nie jest konieczny, jeśli komórki rozprowadzono odpowiednio w inny sposób. Można wykorzystać różne techniki do przygotowania szkiełka, pod warunkiem że uzyskuje się wysokiej jakości preparaty komórkowe do celów oceny. Cytoplazmę komórek należy zachować w celu umożliwienia wykrycia mikrojąder oraz (w metodzie z wykorzystaniem blokera cytokinezy) przeprowadzenia wiarygodnej identyfikacji komórek dwujądrowych. 49. Szkiełka można barwić przy użyciu różnych metod, takich jak Giemsa lub fluorescencyjne szczególne barwniki DNA (59). Wykorzystanie szczególnego barwnika DNA (np. oranż akrydynowy (61) lub Hoechst 33258 plus pyronina-Y (62)) może wyeliminować niektóre spośród artefaktów związanych z barwnikiem nienadającym się do szczególnego szczepu DNA. W celu określenia treści mikrojądra (chromosom/fragment chromosomu) można zastosować przeciwciała antykinetochorowe, FISH z wykorzystaniem pancentromerycznych sond DNA lub syntezę in situ przy udziale startera ze starterami szczególnymi dla pancentromerów, wraz z odpowiednim barwieniem kontrastowym DNA, jeżeli informacje dotyczące mechanizmu ich powstawania są przedmiotem zainteresowania (15) (16). Inne metody rozróżnienia między klastogenami i aneugenami mogą być wykorzystane, o ile okazały się skuteczne. Analiza 50. Wszystkie szkiełka mikroskopowe, włącznie z tymi z rozpuszczalnikiem/nośnikiem i tymi dotyczącymi kontroli, powinny być niezależnie kodowane przed przeprowadzeniem analizy mikroskopowej. Alternatywnie, kodowane próbki mogą być analizowane przy pomocy zatwierdzonej automatycznej cytometrii przepływowej lub analizy obrazowej. 51. W hodowlach poddanych działaniu cytoB częstość powstawania mikrojąder powinna być analizowana w co najmniej 2 000 komórek dwujądrowych przypadających na stężenie (co najmniej 1 000 komórek dwujądrowych na hodowlę; dwie hodowle na stężenie). Jeżeli wykorzystywane są pojedyncze hodowle, przynajmniej 2 000 komórek dwujądrowych przypadających na stężenie powinno być oceniane z danej hodowli. Jeżeli dostępnych do celów oceny jest zasadniczo mniej niż 1 000 komórek dwujądrowych przypadających na hodowlę lub 2 000 w przypadku hodowli pojedynczej na każde stężenie oraz jeżeli nie wykryto znacznego wzrostu liczby mikrojąder, należy powtórzyć badanie, stosując więcej komórek lub mniej toksyczne stężenia, w zależności od tego, co bardziej właściwe. Należy zwrócić uwagę, by nie oceniać komórek dwujądrowych o nieregularnych kształtach lub w przypadku, gdy dwa jądra różnią się znacznie pod względem wielkości; nie należy również mylić komórek dwujądrowych ze źle rozprowadzonymi komórkami wielojądrowymi. Komórki zawierające więcej niż dwa jądra główne nie powinny być analizowane pod kątem zawartości mikrojąder, ponieważ podstawowa częstość powstawania mikrojąder może być wyższa w tych komórkach (63) (64). Ocena komórek wielojądrowych jest dopuszczalna, jeżeli wykazano, że substancja badana zakłóca działanie cytoB. 52. W liniach komórkowych badanych bez poddawania działaniu cytoB mikrojądra powinny być oceniane w przynajmniej 2 000 komórkach dla każdego stężenia (przynajmniej 1 000 komórek na hodowlę; dwie hodowle na stężenie). W przypadku gdy jest stosowana tylko jedna hodowla na stężenie, przynajmniej 2 000 komórek powinno zostać ocenione z tej hodowli. 53. Gdy jest stosowane cytoB, należy określić CBPI lub RI, aby ocenić proliferację komórek (zob. dodatek 2), używając co najmniej 500 komórek na hodowlę. Jeśli poddawanie działaniu odbywa się przy nieobecności cytoB, konieczne jest uzyskanie dowodów, że oceniane komórki podległy proliferacji, jak omówiono w pkt 24–27. Kryteria dopuszczalności 54. Laboratorium, w którym proponuje się wykonanie badania MNvit opisanego w niniejszej TM powinno wykazać, że jest w stanie w sposób wiarygodny i dokładny wykrywać substancje chemiczne o znanym działaniu aneugennym i klastogennym, z aktywacją metaboliczną i bez niej, jak również znane negatywne chemikalia, wykorzystując substancje chemiczne odniesienia wymienione w dodatku 3. Jako dowód zdolności do wykonania niniejszej TM prawidłowo laboratorium powinno przedstawić dane świadczące o tym, że komórki oceniane pod kątem tworzenia mikrojąder ukończyły jeden jądrowy podział, gdy badanie przeprowadza się bez użycia cytoB. 55. Chemikalia wymienione w dodatku 3 są zalecane do stosowania jako chemiczne substancje odniesienia. Można dodać zastępcze lub dodatkowe substancje chemiczne, jeśli ich działanie jest znane oraz jeśli powodują one powstawanie mikrojąder za pomocą takich samych mechanizmów działania, a także jeśli wykazano, że są odpowiednie dla chemikaliów, które będą badane przy wykorzystaniu procedury MNvit. Uzasadnienie mogłoby obejmować badanie walidacyjne z wykorzystaniem wielu różnorodnych substancji lub skoncentrowane na mniejszej ich liczbie na podstawie klasy chemicznej substancji badanej lub mechanizmu uszkadzania. 56. Kontrole z wykorzystaniem rozpuszczalnika/nośnika i niepoddane działaniu hodowle powinny dawać w rezultacie odtwarzalnie niską i stałą częstość powstawania mikrojąder (zazwyczaj 5–25 mikrojąder/1 000 komórek dla rodzajów komórek określonych w pkt 11). Inne rodzaje komórek mogą mieć różne zakresy reakcji, które należy ustalić podczas walidowania ich dla celów wykorzystania w badaniu MNvit. Należy wykorzystać dane z kontroli negatywnych, z wykorzystaniem rozpuszczalnika oraz kontroli pozytywnych w celu ustalenia historycznych zakresów kontroli. Wartości te należy wykorzystać do ustalenia adekwatności równoczesnych NC/PC dla celów eksperymentu. 57. Jeżeli proponuje się wprowadzenie nieznacznych zmian do badania (np. wykorzystanie automatycznych raczej niż ręcznych technik oceny, zastosowanie nowego rodzaju komórek), wówczas należy wykazać skuteczność zmiany, zanim zmieniony protokół zostanie uznany za możliwy do stosowania. Wykazanie skuteczności obejmuje udowodnienie, że można wykryć główne mechanizmy uszkadzania chromosomów oraz zyski lub straty oraz że odpowiednie pozytywne i negatywne wyniki można osiągnąć w odniesieniu do klasy danej substancji, lub wielu substancji, które mają być badane. DANE I SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA Opracowanie wyników 58. Jeżeli zastosowano technikę z blokerem cytokinezy, do oceny mechanizmu indukcji mikrojąder stosowane są jedynie komórki dwujądrowe z mikrojądrami (niezależnie od liczby mikrojąder przypadających na komórkę). Ocena liczby komórek z jednym, dwoma lub większą liczbą mikrojąder może dostarczyć użytecznych informacji, ale nie jest obowiązkowa. 59. Należy określić równoczesne pomiary cytotoksyczności oraz/lub cytostazy w odniesieniu do wszystkich poddanych działaniu substancji hodowli oraz hodowli kontrolnych z wykorzystaniem rozpuszczalnika/nośnika (58). Należy obliczyć CBPI lub RI dla wszystkich poddanych działaniu substancji hodowli oraz hodowli kontrolnych w charakterze pomiaru opóźnienia cyklu komórkowego, kiedy stosowana jest metoda z blokerem cytokinezy. W przypadku braku cytoB powinny być zastosowane RPD lub RICC lub PI (zob. dodatek 2). 60. Należy dostarczyć dane dotyczące poszczególnych hodowli. Dodatkowo wszelkie dane powinny być podsumowane w formie tabelarycznej. 61. Substancje chemiczne powodujące w badaniu MNvit powstawanie mikrojąder mogą doprowadzać do niego na skutek tego, że powodują uszkodzenia chromosomów czy ich utratę lub na skutek połączenia tych dwóch zjawisk. Dalsze analizy z wykorzystaniem przeciwciał anty-kinetochorowych, sond szczególnych dla centromerów in situ lub innych metod mogą służyć do określania, czy mechanizm indukcji mikrojąder jest spowodowany działaniem klastogennym czy aneugennym. Ocena i interpretacja wyników 62. Nie istnieje wymóg sprawdzania przez dodatkowe badanie wyraźnie pozytywnych lub negatywnych reakcji. Niejednoznaczne wyniki mogą być wyjaśniane w drodze analizy kolejnych 1 000 komórek z wszystkich hodowli, aby uniknąć strat związanych z utratą anonimowości próby. Jeśli takie podejście nie przesądzi o wyniku, należy przeprowadzić dalsze badania. Modyfikacja parametrów badawczych w celu poszerzenia zakresu ocenionych warunków powinna zostać rozważona w dalszych doświadczeniach, jeśli to stosowne. Parametry badawcze, które mogą być zmodyfikowane, obejmują zakres stężenia, terminy poddawania działaniu substancji i pobierania komórek i/lub warunki aktywacji metabolicznej. 63. Istnieją liczne kryteria oznaczania wyników pozytywnych, takie jak związany ze stężeniem wzrost lub statystycznie istotny wzrost w liczbie komórek zawierających mikrojądra. Biologiczne znaczenie wyników powinno zostać wzięte pod uwagę w pierwszej kolejności. Uwzględnienie, czy zaobserwowane wartości są w obrębie historycznych zakresów kontroli, czy też poza nimi może stanowić wskazówkę przy ocenie biologicznego znaczenia reakcji. Można wykorzystać odpowiednie metody statystyczne jako metody pomocnicze w przeprowadzaniu oceny wyników (65). Jednakże wyniki badań statystycznych powinny być oceniane w odniesieniu do zależności dawka-reakcja. Należy również wziąć pod uwagę odtwarzalność oraz dane historyczne. 64. Chociaż większość eksperymentów przyniesie wyraźnie pozytywne lub negatywne wyniki, w niektórych przypadkach uzyskane dane uniemożliwią dokonanie ostatecznego osądu o działaniu badanej substancji. Tego rodzaju niejednoznaczne lub sporne wyniki można uzyskiwać niezależnie od tego, ile razy powtarza się doświadczenie. 65. Wyniki pozytywne z badania MNvit wskazują, że substancja badana wywołuje uszkodzenia chromosomów lub ich utratę w hodowlanych komórkach ssaków. Wyniki negatywne wskazują, że w warunkach badawczych substancja badana nie wywołuje uszkodzeń w chromosomach i/lub zysków lub strat chromosomów w hodowlanych komórkach ssaków. Sprawozdanie z badania 66. Sprawozdanie z badania powinno zawierać co najmniej następujące informacje, o ile są one istotne dla przebiegu badania: Badana substancja chemiczna: — dane identyfikacyjne i numer w rejestrze Chemical Abstract Services oraz numer WE, — stan skupienia i czystość, — właściwości fizykochemiczne istotne dla przeprowadzenia badania, — reaktywność badanej substancji chemicznej w rozpuszczalniku/nośniku lub w hodowli komórkowej mediów. Rozpuszczalnik/nośnik: — uzasadnienie wyboru rozpuszczalnika/nośnika, — rozpuszczalność oraz stabilność substancji badanej w rozpuszczalniku/nośniku. Komórki: — typ i źródło wykorzystywanych komórek, — odpowiedniość wykorzystywanych komórek, — nieobecność mykoplazmy, jeżeli ma zastosowanie, — informacja dotycząca długości cyklu komórkowego, czasu podwojenia lub indeksu proliferacji, — jeżeli stosuje się limfocyty, płeć, wiek, liczbę dawców krwi, jeśli ma to zastosowanie, — jeżeli stosuje się limfocyty – informacja o tym, czy narażona jest krew pełna czy wydzielone limfocyty, — liczba przejść, jeżeli ma zastosowanie, — metoda utrzymania hodowli komórek, jeżeli ma zastosowanie, — zmienna liczba chromosomów, — zwykła (kontrola ujemna) długość cyklu komórkowego. Warunki badania: — dane identyfikacyjne substancji blokującej cytokinezę (np. cytoB), o ile jest wykorzystywana i jej stężenie oraz czas narażenia komórek, — racjonalne uzasadnienie wyboru stężeń oraz liczby hodowli, w tym np. dane dotyczące cytotoksyczności oraz ograniczeń rozpuszczalności, jeżeli są dostępne, — skład podłoża, stężenie CO2, jeżeli ma zastosowanie, — stężenia substancji badanej, — stężenia (i/lub objętość) nośnika oraz dodanej substancji badanej, — temperatura i czas inkubacji, — czas trwania poddania działaniu substancji, — okres pobierania po poddaniu działaniu, — gęstość komórki w czasie osadzania, jeżeli właściwe, — rodzaj oraz skład systemu aktywacji metabolicznej, w tym kryteria dopuszczalności, — substancje chemiczne kontroli pozytywnych i kontrole negatywne, — metody przygotowania szkiełek mikroskopowych oraz stosowane techniki barwienia, — kryteria identyfikacji mikrojąder, — liczba poddanych analizie komórek, — metody pomiaru cytotoksyczności, — wszelkie dodatkowe informacje dotyczące cytotoksyczności, — kryteria uznawania badań za pozytywne, negatywne lub niejednoznaczne, — stosowana(-e) metoda (-y) analizy statystycznej, — metody, takie jak wykorzystanie przeciwciał kinetochorowych, stosowane w celu określenia, czy mikrojądra zawierają całe lub rozdrobnione chromosomy, jeśli ma to zastosowanie. Wyniki: — zastosowany pomiar cytotoksyczności, np. CBPI lub RI w przypadku metody z wykorzystaniem blokera cytokinezy; RICC, RPD lub PI, gdy nie były wykorzystywane metody z wykorzystaniem blokera cytokinezy; inne uwagi w stosownych przypadkach, np. zrastanie się komórek, apoptoza, martwica, liczenie metafaz, częstotliwość występowania komórek dwujądrowych, — oznaki strącania, — dane dotyczące pH oraz osmolalności podłoża poddania działaniu substancji, jeżeli są określone, — definicja komórek dopuszczalnych do celów analizy, — dystrybucja jedno-, dwu- i wielojądrowych komórek, jeżeli stosowana jest metoda z wykorzystaniem blokera cytokinezy, — liczba komórek z mikrojądrami, podana oddzielnie dla każdej hodowli poddanej działaniu substancji i hodowli kontrolnej, wraz z informacją, czy to z komórek jedno- czy dwujądrowych, w stosownych przypadkach, — zależność stężenie-reakcja, o ile to możliwe, — dane dotyczące substancji chemicznej stosowanej jako równoczesna negatywna (rozpuszczalnik/nośnik) oraz pozytywna kontrola (stężenia i rozpuszczalniki, — historyczne dane dotyczące substancji chemicznej stosowanej jako równoczesna negatywna (rozpuszczalnik/nośnik) oraz pozytywna kontrola, wraz z zakresami, średnimi oraz standardowymi odchyleniami i przedziałem ufności (np. 95 %), — analiza statystyczna; wartości p, jeśli istnieją; Omówienie wyników Wnioski BIBLIOGRAFIA (1) Kirsch-Volders, M. (1997), Towards a validation of the micronucleus test. Mutation Res., 392, 1–4. (2) Parry, J.M. and Sors, A. (1993), The detection and assessment of the aneugenic potential of environmental chemicals: the European Community aneuploidy project, Mutation Res., 287, 3–15. (3) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Solutions to the kinetic problem in the micronucleus assay, Cytobios., 43, 233–246. (4) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr, Lorge, E., Norppa, H., Surralles, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2000), Report from the In Vitro Micronucleus Assay Working Group, Environ. Mol. Mutagen., 35, 167–172. (5) Fenech, M. (2007), Cytokinesis-block micronucleus cytome assay, Nature Protocols, 2(5), 1084–1104. (6) Fenech, M. and Morley, A.A. (1986), Cytokinesis-block micronucleus method in human lymphocytes: effect of in-vivo ageing and low dose X-irradiation, Mutation Res., 161, 193–198. (7) Eastmond, D.A. and Tucker, J.D. (1989), Identification of aneuploidy-inducing agents using cytokinesis-blocked human lymphocytes and an antikinetochore antibody, Environ. Mol. Mutagen., 13, 34–43. (8) Eastmond, D.A. and Pinkel, D. (1990), Detection of aneuploidy and aneuploidy-inducing agents in human lymphocytes using fluorescence in-situ hybridisation with chromosome-specific DNA probes, Mutation Res., 234, 9–20. (9) Miller, B.M., Zitzelsberger, H.F., Weier, H.U. and Adler, I.D. (1991), Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA, Mutagenesis, 6, 297–302. (10) Farooqi, Z., Darroudi, F. and Natarajan, A.T. (1993), The use of fluorescence in-situ hybridisation for the detection of aneugens in cytokinesis-blocked mouse splenocytes, Mutagenesis, 8, 329–334. (11) Migliore, L., Bocciardi, R., Macri, C. and Lo Jacono, F. (1993), Cytogenetic damage induced in human lymphocytes by four vanadium compounds and micronucleus analysis by fluorescence in situ hybridization with a centromeric probe, Mutation Res., 319, 205–213. (12) Norppa, H., Renzi, L. and Lindholm, C. (1993), Detection of whole chromosomes in micronuclei of cytokinesis-blocked human lymphocytes by antikinetochore staining and in situ hybridization, Mutagenesis, 8, 519–525. (13) Eastmond, D.A, Rupa, D.S. and Hasegawa, L.S. (1994), Detection of hyperdiploidy and chromosome breakage in interphase human lymphocytes following exposure to the benzene metabolite hydroquinone using multicolor fluorescence in situ hybridization with DNA probes, Mutation Res., 322, 9–20. (14) Marshall, R.R., Murphy, M., Kirkland, D.J. and Bentley, K.S. (1996), Fluorescence in situ hybridisation (FISH) with chromosome-specific centromeric probes: a sensitive method to detect aneuploidy, Mutation Res., 372, 233–245. (15) Zijno, P., Leopardi, F., Marcon, R. and Crebelli, R. (1996), Analysis of chromosome segregation by means of fluorescence in situ hybridization: application to cytokinesis-blocked human lymphocytes, Mutation Res., 372, 211–219. (16) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate Jr., M., Lorge, E., Norppa, H., Surrallés, J., von der Hude, W. and Wakata, A. (2003), Report from the in vitro micronucleus assay working group. Mutation Res., 540, 153–163. (17) OECD (1997), In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test, Test Guideline No. 473, OECD Guidelines for Testing of Chemicals, OECD, Paryż. Dostępny na stronie: [www.oecd.org/env/testguidelines] (18) Lorge, E., Thybaud, V., Aardema, M.J., Oliver, J., Wakata, A., Lorenzon G. and Marzin, D. (2006), SFTG International collaborative Study on in vitro micronucleus test. I. General conditions and overall conclusions of the study, Mutation Res., 607, 13–36. (19) Clare, G., Lorenzon, G., Akhurst, L.C., Marzin, D., van Delft, J., Montero, R., Botta, A., Bertens, A., Cinelli, S., Thybaud, V. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test. II. Using human lymphocytes, Mutation Res., 607, 37–60. (20) Aardema, M.J., Snyder, R.D., Spicer, C., Divi, K., Morita, T., Mauthe, R.J., Gibson, D.P., Soelter, S., Curry, P.T., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, III. Using CHO cells, Mutation Res., 607, 61–87. (21) Wakata, A., Matsuoka, A., Yamakage, K., Yoshida, J., Kubo, K., Kobayashi, K., Senjyu, N., Itoh, S., Miyajima, H., Hamada, S., Nishida, S., Araki, H., Yamamura, E., Matsui, A., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, IV. Using CHO/IU cells, Mutation Res., 607, 88–124. (22) Oliver, J., Meunier, J.-R., Awogi, T., Elhajouji, A., Ouldelhkim, M.-C., Bichet, N., Thybaud, V., Lorenzon, G., Marzin, D. and Lorge, E. (2006), SFTG International collaborative study on the in vitro micronucleus test, V. Using L5178Y cells, Mutation Res., 607, 125–152. (23) Albertini, S., Miller, B., Chetelat, A.A. and Locher, F. (1997), Detailed data on in vitro MNT and in vitro CA: industrial experience, Mutation Res., 392, 187–208. (24) Miller, B., Albertini, S., Locher, F., Thybaud, V. and Lorge, E. (1997), Comparative evaluation of the in vitro micronucleus test and the in vitro chromosome aberration test: industrial experience, Mutation Res., 392, 45–59. (25) Miller, B., Potter-Locher, F., Seelbach, A., Stopper, H., Utesch, D. and Madle, S. (1998), Evaluation of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosomal aberration assay: position of the GUM Working Group on the in vitro micronucleus test. Gesellschaft fur Umwelt-Mutations-forschung, Mutation Res., 410, 81–116. (26) Kalweit, S., Utesch, U., von der Hude, W. and Madle, S. (1999), Chemically induced micronucleus formation in V79 cells – comparison of three different test approaches, Mutation Res. 439, 183–190. (27) Kersten, B., Zhang, J., Brendler Schwaab, S.Y., Kasper, P. and Müller, L. (1999), The application of the micronucleus test in Chinese hamster V79 cells to detect drug-induced photogenotoxicity, Mutation Res. 445, 55–71. (28) von der Hude, W., Kalweit, S., Engelhardt, G., McKiernan, S., Kasper, P., Slacik-Erben, R., Miltenburger, H.G., Honarvar, N., Fahrig, R., Gorlitz, B., Albertini, S., Kirchner, S., Utesch, D., Potter-Locher, F., Stopper, H. and Madle, S. (2000), In vitro micronucleus assay with Chinese hamster V79 cells - results of a collaborative study with in situ exposure to 26 chemical substances, Mutation Res., 468, 137–163. (29) Garriott, M.L., Phelps, J.B. and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test, I. Contributions to the development of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 16 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 517, 123–134. (30) Matsushima, T., Hayashi, M., Matsuoka, A., Ishidate, M. Jr., Miura, K.F., Shimizu, H., Suzuki, Y., Morimoto, K., Ogura, H., Mure, K., Koshi, K. and Sofuni, T. (1999), Validation study of the in vitro micronucleus test in a Chinese hamster lung cell line (CHL/IU), Mutagenesis, 14, 569–580. (31) Elhajouji, A., and Lorge, E. (2006), Special Issue: SFTG International collaborative study on in vitro micronucleus test, Mutation Res., 607, 1–152. (32) ECVAM (2006), Statement by the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) Scientific Advisory Committee (ESAC) on the scientific validity of the in vitro micronucleus test as an alternative to the in vitro chromosome aberration assay for genotoxicity testing. 25. konferencja ESAC, 16-17 listopada, 2006 r., dostępny na stronie: [http://ecvam.jrc.it/index.htm] (33) ESAC (2006), ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) Peer Review, Retrospective Validation of the In Vitro Micronucleus Test, Summary and Conclusions of the Peer Review Panel, dostępne na stronie: [http://ecvam.jrc.it/index.htm] (34) Corvi, R., Albertini, S., Hartung, T., Hoffmann, S., Maurici, D., Pfuhler, S, van Benthem, J., Vanparys P. (2008), ECVAM Retrospective Validation of in vitro Micronucleus Test (MNT), Mutagenesis, 23, 271–283. (35) Zhang, L.S., Honma, M., Hayashi, M., Suzuki, T., Matsuoka, A. and Sofuni, T. (1995), A comparative study of TK6 human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines in the in vitro micronucleus test, Mutation Res., 347, 105–115. (36) Ehrlich, V., Darroudi, F., Uhl, M., Steinkellner, S., Zsivkovits, M. and Knasmeuller, S. (2002), Fumonisin B1 is genotoxic in human derived hepatoma (HepG2) cells, Mutagenesis, 17, 257–260. (37) Knasmüller, S., Mersch-Sundermann, V., Kevekordes, S., Darroudi, F., Huber, W.W., Hoelzl, C., Bichler, J. and Majer, B.J. (2004), Use of human-derived liver cell lines for the detection of environmental and dietary genotoxicants; current state of knowledge, Toxicol., 198, 315–328. (38) Gibson, D.P., Brauninger, R., Shaffi, H.S., Kerckaert, G.A., LeBoeuf, R.A., Isfort, R.J. and Aardema, M.J. (1997), Induction of micronuclei in Syrian hamster embryo cells: comparison to results in the SHE cell transformation assay for National Toxicology Program test chemicals, Mutation Res., 392, 61–70. (39) Scott, D., Galloway, S.M., Marshall, R.R., Ishidate, M. Jr., Brusick, D., Ashby, J. and Myhr, B.C. (1991), International Commission for Protection Against Environmental Mutagens and Carcinogens, Genotoxicity under extreme culture conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Res., 257, 147-205. (40) Morita, T., Nagaki, T., Fukuda, I. and Okumura, K. (1992), Clastogenicity of low pH to various cultured mammalian cells, Mutation Res., 268, 297–305. (41) Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations, Environ. Mutagen., 8, 789–886. (42) Fenech, M. and Morley, A.A. (1985), Measurement of micronuclei in lymphocytes, Mutation Res., 147, 29–36. (43) Fenech, M. (1997), The advantages and disadvantages of cytokinesis-blood micronucleus method, Mutation Res., 392, 11–18. (44) Bonassi, S., Fenech, M., Lando, C., Lin, Y.P., Ceppi, M., Chang, W.P., Holland, N., Kirsch-Volders, M., Zeiger, E., Ban, S., Barale, R., Bigatti, M.P., Bolognesi, C., Jia, C., Di Giorgio, M., Ferguson, L.R., Fucic, A., Lima, O.G., Hrelia, P., Krishnaja, A.P., Lee, T.K., Migliore, L., Mikhalevich, L., Mirkova, E., Mosesso, P., Muller, W.U., Odagiri, Y., Scarffi, M.R., Szabova, E., Vorobtsova, I., Vral, A. and Zijno, A. (2001), HUman MicroNucleus Project: international database comparison for results with the cytokinesis-block micronucleus assay in human lymphocytes, I. Effect of laboratory protocol, scoring criteria and host factors on the frequency of micronuclei, Environ. Mol. Mutagen. 37, 31–45. (45) Maron, D.M. and Ames, B.N. (1983), Revised methods for the Salmonella mutagenicity test, Mutation Res., 113, 173–215. (46) Ong, T.-m., Mukhtar, M., Wolf, C.R. and Zeiger, E. (1980), Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver, J. Environ. Pathol. Toxicol., 4, 55–65. (47) Elliott, B.M., Combes, R.D., Elcombe, C.R., Gatehouse, D.G., Gibson, G.G., Mackay, J.M. and Wolf, R.C. (1992), Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in-vitro genotoxicity assays. Mutagenesis, 7, 175–177. (48) Matsushima, T., Sawamura, M., Hara, K. and Sugimura, T. (1976), A safe substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, In: de Serres, F.J., Fouts, J. R., Bend, J.R. and Philpot, R.M. (eds), In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, Elsevier, North-Holland, pp. 85–88. (49) Johnson, T.E., Umbenhauer, D.R. and Galloway, S.M. (1996), Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environ. Mol. Mutagen., 28, 51–59. (50) UNEP (2001 r.), Konwencja Sztokholmska w sprawie trwałych zanieczyszczeń organicznych, Program Narodów Zjednoczonych ds. Ochrony Środowiska (UNEP). Dostępny na stronie: [http://www.pops.int/] (51) Doherty, A.T., Ellard, S., Parry, E.M. and Parry, J.M. (1996), An investigation into the activation and deactivation of chlorinated hydrocarbons to genotoxins in metabolically competent human cells, Mutagenesis, 11, 247–274. (52) Krahn, D.F., Barsky, F.C. and McCooey, K.T. (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, In: Tice, R.R., Costa, D.L. and Schaich, K.M. (eds), Genotoxic Effects of Airborne Agents. Nowy Jork, Plenum, pp. 91–103. (53) Zamora, P.O., Benson, J.M., Li, A.P. and Brooks, A.L. (1983), Evaluation of an exposure system using cells grown on collagen gels for detecting highly volatile mutagens in the CHO/HGPRT mutation assay, Environ. Mutagenesis 5, 795–801. (54) Fenech, M. (1993), The cytokinesis-block micronucleus technique: a detailed description of the method and its application to genotoxicity studies in human populations, Mutation Res., 285, 35–44. (55) Phelps, J.B., Garriott, M.L., and Hoffman, W.P. (2002), A protocol for the in vitro micronucleus test. II. Contributions to the validation of a protocol suitable for regulatory submissions from an examination of 10 chemicals with different mechanisms of action and different levels of activity, Mutation Res., 521, 103–112. (56) Kirsch-Volders, M., Sofuni, T., Aardema, M., Albertini, S., Eastmond, D., Fenech, M., Ishidate, M. Jr., Kirchner, S., Lorge, E., Morita, T., Norppa, H., Surralles, J., Vanhauwaert, A. and Wakata, A. (2004), Corrigendum to »Report from the in vitro micronucleus assay working group«, Mutation Res., 564, 97–100. (57) Pincu, M., Bass, D. and Norman, A. (1984), An improved micronuclear assay in lymphocytes, Mutation Res., 139, 61–65. (58) Lorge, E., Hayashi, M., Albertini, S. and Kirkland, D. (2008), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Res., 655, 1–3. (59) Surralles, J., Xamena, N., Creus, A., Catalan, J., Norppa, H. and Marcos, R. (1995), Induction of micronuclei by five pyrethroid insecticides in whole-blood and isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 341, 169–184. (60) Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environ. Molec. Mutagenesis 35, 191–201. (61) Hayashi, M., Sofuni, T., and Ishidate, M. Jr. (1983), An Application of Acridine Orange Fluorescent Staining to the Micronucleus Test, Mutation Res., 120, 241–247. (62) MacGregor, J. T., Wehr, C. M., and Langlois, R. G. (1983), A Simple Fluorescent Staining Procedure for Micronuclei and RNA in Erythrocytes Using Hoechst 33258 and Pyronin Y, Mutation Res., 120, 269–275. (63) Hayashi, M., Sofuni, T. and Ishidate, M. Jr. (1983), An application of acridine orange fluorescent staining to the micronucleus test, Mutation Res., 120, 241–247. (64) Fenech, M., Chang, W.P., Kirsch-Volders, M., Holland, N., Bonassi, S. and Zeiger, E. (2003), HUMN project: detailed description of the scoring criteria for the cytokinesis-block micronucleus assay using isolated human lymphocyte cultures, Mutation Res., 534, 65–75. (65) Hoffman, W.P., Garriott, M.L. and Lee, C. (2003), In vitro micronucleus test, In: Encyclopedia of Biopharmaceutical Statistics, Second edition. S. Chow (ed.), Marcel Dekker, Inc. Nowy Jork, NY, pp. 463–467. (66) Rozporządzenie (WE) nr 850/2004 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 29 kwietnia 2004 r. dotyczące trwałych zanieczyszczeń organicznych i zmieniające dyrektywę 79/117/EWG, Dz.U. L 229 z 30.4.2004, s. 5. Dodatek 1 Definicje Aneugen: każda substancja lub proces, który poprzez reakcję z elementami mitotycznego i mejotycznego cyklu podziału komórek prowadzi do aneuploidii w komórkach lub organizmach. Aneuploidia: wszelkie odchylenia od zwykłej diploidalnej (lub haploidalnej) liczby chromosomów w pojedynczym chromosomie lub w większej ich liczbie, ale nie w całym zestawie(-ach) chromosomów (poliploidalność). Apoptoza: zaprogramowana śmierć komórki, na którą składa się szereg etapów prowadzących do rozpadu komórek w cząstki otoczone błoną, które są następnie eliminowane przez fagocytozę lub wydalanie. Proliferacja komórek: wzrost liczby komórek powstały w wyniku mitotycznego podziału komórek. Centromer: region DNA chromosomu, w którym obydwie chromatydy się łączą i do którego są przyczepione obydwa kinetochory, jeden obok drugiego. Klastogen: każda substancja lub proces, który powoduje strukturalne aberracje chromosomalne w populacjach komórek lub organizmów. Cytokineza: proces podziału komórki następujący bezpośrednio po mitozie, mający na celu utworzenie dwóch komórek potomnych, z których każda zawiera jedno jądro. Wskaźnik proliferacji blokera cytokinezy (CBPI): odsetek komórek w trakcie drugiego podziału w populacji poddanej działaniu substancji w stosunku do hodowli kontrolnej niepoddawanej działaniu (zob. dodatek 2). Cytostaza: hamowanie wzrostu komórek (zob. wzór w dodatku 2). Cytotoksyczność: szkodliwe skutki dla struktury lub funkcji komórek, ostatecznie powodujące śmierć komórki. Genotoksyczny: termin ogólny, obejmujący wszystkie rodzaje uszkodzeń DNA lub chromosomu, w tym przerwy, przegrupowania adduktów, mutacje, aberracje chromosomowe i aneuploidię. Nie wszystkie rodzaje skutków genotoksycznych powodują mutacje lub stałe uszkodzenia chromosomu. Komórki w interfazie: komórki nie w fazie mitozy. Kinetochor: struktura zawierająca białko na centromerze chromosomu, do której przyczepiają się włókna wrzeciona kariokinetycznego w trakcie podziału komórki, umożliwiając uporządkowane przemieszczanie się chromosomów potomnych do biegunów komórek potomnych. Mikrojądra: małe jądra, oddzielone oraz występujące dodatkowo w stosunku do jądra głównego komórek, wytwarzane w trakcie telofazy mitozy lub mejozy przez opóźnione fragmenty chromosomów lub całe chromosomy. Mitoza: podział jądra komórkowego, na który zazwyczaj składają się profaza, prometafaza, metafaza, anafaza i telofaza. Indeks mitotyczny: stosunek komórek w metafazie podzielony przez całkowitą liczbę komórek zaobserwowanych w populacji komórek; wskazanie stopnia proliferacji komórek tej populacji. Mutagenny: tworzy dziedziczne zmiany w sekwencji(-ach) pary zasad DNA w genach lub w strukturze chromosomów (aberracje chromosomowe). Nondysjunkcja: nierozdzielenie się pary chromatyd i brak odpowiedniego ich rozdziału do komórek potomnych, w wyniku czego powstają komórki potomne z nieprawidłową liczbą chromosomów. Poliploidalność: liczbowe aberracje chromosomowe w komórkach lub organizmach, obejmujące cały zestaw(-y) chromosomów, a nie pojedyncze chromosomy (aneuploidia). Wskaźnik proliferacji (PI): metoda pomiaru cytotoksyczności, kiedy nie stosuje się cytoB (zob. wzór w dodatku 2). Względny wzrost liczby komórek (RICC): metoda pomiaru cytotoksyczności, kiedy nie stosuje się cytoB (zob. wzór w dodatku 2). Względne podwojenie populacji (RPD): metoda pomiaru cytotoksyczności, kiedy nie stosuje się cytoB (zob. wzór w dodatku 2). Wskaźnik replikacji (RI): odsetek zakończonych cykli podziału komórkowego w hodowli poddanej działaniu substancji w stosunku do hodowli kontrolnej niepoddawanej działaniu, podczas okresu narażenia i odzysku (zob. wzór w dodatku 2). Substancja badana (określana także jako badana substancja chemiczna): każda substancja lub mieszanina, badana za pomocą niniejszej TM. Dodatek 2 Wzory do celów oceny cytotoksyczności 1. Kiedy stosuje się cytoB ocena cytotoksyczności powinna opierać się na wskaźniku proliferacji blokera cytokinezy (CBPI) lub wskaźniku replikacji (RI) (16) (58). CBPI określa średnią liczbę cykli komórkowych przypadających na komórkę w okresie narażenia na cytoB i może być wykorzystane do obliczenia proliferacji komórek. RI określa względną liczbę jąder w hodowlach poddawanych działaniu substancji w stosunku do hodowli kontrolnych i może być wykorzystane do obliczenia % cytostazy: % cytostazy = 100 – 100{(CBPIT – 1) ÷ (CBPIC – 1)} oraz T = hodowla poddana działaniu substancji badanej C = nośnik kultury kontrolnej gdzie: Dlatego też wartość CBPI równa 1 (wszystkie komórki są jednojądrowe) jest równoważna 100 % cytostazy. Cytostaza = 100 – RI T = hodowle poddawane działaniu substancji C = hodowle kontrolne 2. Tym samym wartość RI równa 53 % oznacza, że w porównaniu do liczby komórek, które podzieliły się i utworzyły komórki dwu- i wielojądrowe w hodowli kontrolnej, jedynie 53 % tej liczby podzieliło się w hodowli poddanej działaniu, czyli cytostaza wynosi 47 %. 3. Kiedy nie stosuje się cytoB, zaleca się przeprowadzenie oceny cytotoksyczności w oparciu o względny wzrost liczby komórek (RICC) lub względne podwojenie populacji (RPD) (58), ponieważ oba te wskaźniki uwzględniają odsetek populacji komórek, które się podzieliły. gdzie: Podwojenie populacji = [log (liczby komórek po poddaniu działaniu ÷ początkowa liczba komórek)] ÷ log 2 4. Dlatego też RICC lub RPD równe 53 % oznacza 47 % cytotoksyczności/cytostazy. 5. Stosując wskaźnik proliferacji (PI), można dokonać oceny cytotoksyczności poprzez liczenie klonów składających się z 1 komórki (cl1), 2 komórek (cl2), 3 – 4 komórek (cl4) i 5 do 8 komórek (cl8) 6. PI został wykorzystany jako cenny i wiarygodny parametr cytotoksyczności również w przypadku linii komórkowych hodowanych in situ w nieobecności cytoB (25) (26) (27) (28). Dodatek 3 Chemiczne substancje odniesienia zalecane dla oceny efektywności (16) Kategoria Chemikalia Nr CAS Nr WE 1. Klastogeny czynne bez aktywacji metabolicznej Arabinozyd cytozyny 147-94-4 205-705-9 Mitomycyna C 50-07-7 200-008-6 2. Klastogeny wymagające aktywacji metabolicznej Benzo(a)piren 50-32-8 200-028-5 Cyklofosfamid 50-18-0 200-015-4 3. Aneugeny Kolchicyna 64-86-8 200-598-5 Winblastyna 143-67-9 205-606-0 4. Substancje negatywne ftalan di(2-etyloheksylu) 117-81-7 204-211-0 Kwas nalidyksowy 389-08-2 206-864-7 Piren 129-00-0 204-927-3 Chlorek sodu 7647-14-5 231-598-3 B.50. DZIAŁANIE UCZULAJĄCE NA SKÓRĘ: BADANIE LOKALNYCH WĘZŁÓW CHŁONNYCH DA WSTĘP 1. Wytyczne OECD w odniesieniu do badania chemikaliów i metody badań UE są okresowo poddawane przeglądowi w związku z postępem naukowym, zmieniającymi się potrzebami regulacyjnymi oraz troską o dobrostan zwierząt. Pierwsza metoda badania (TM) (B.42) przy określaniu działania uczulającego na skórę u myszy – badanie lokalnych węzłów chłonnych (LLNA; wytyczna OECD 429 dotycząca badań) została poddana przeglądowi (1). Szczegóły walidacji LLNA i przegląd powiązanej bibliografii opublikowano w (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9). W LLNA radioizotopy tymidyny lub jodyny są stosowane do pomiaru proliferacji limfocytów i w związku z tym badanie ma ograniczone zastosowanie w przypadku, gdy nabycie, zastosowania lub usuwanie promieniotwórczości jest problematyczne. Badanie LLNA: DA (opracowane przez Daicel Chemical Industries, Ltd.) jest niepromieniotwórczym wariantem badania LLNA, dzięki któremu, poprzez wykorzystanie bioluminescencji, udaje się dokonać pomiaru ilościowego zawartości adenozynotrifosforanu (ATP), służącego za wskaźnik proliferacji limfocytów. Badanie LLNA: DA zostało zatwierdzone i poddane przeglądowi oraz zalecone przez międzynarodowy panel ds. wzajemnych przeglądów jako przydatne do rozpoznawania chemikaliów uczulających skórę i jej nieuczulających, z pewnymi zastrzeżeniami (10) (11) (12) (13). Ta TM jest zaprojektowana dla celów oceny potencjału uczulenia skóry przez chemikalia (substancje i mieszaniny) u zwierząt. Rozdział B.6 niniejszego załącznika oraz wytyczna OECD dotycząca badań nr 406 wykorzystują badania na świnkach morskich, w szczególności test maksymalizacji na śwince morskiej oraz test Buehlera (14). Metoda LLNA (rozdział B.42 niniejszego załącznika; wytyczna OECD dotycząca badań nr 429) oraz jej dwa niepromieniotwórcze warianty: LLNA: DA (rozdział B.50 niniejszego załącznika; wytyczna OECD dotycząca badań nr 442 A) oraz LLNA: BrdU-ELISA (rozdział B.51 niniejszego załącznika; wytyczna OECD dotycząca badań nr 442 B) zapewniają bardziej ograniczone i udoskonalone wykorzystanie zwierząt w porównaniu z badaniami na świnkach morskich opisanymi w B.6 i w wytycznej OECD dotyczącej badań nr 406 (14). 2. Podobnie jak metoda LLNA, LLNA: DA bada fazę indukcyjną uczulenia skóry i dostarcza danych ilościowych odpowiednich dla dokonania oceny dawka-reakcja. Ponadto zdolność do wykrywania substancji działających uczulająco na skórę bez konieczności korzystania z izotopowego oznaczania DNA eliminuje możliwość narażenia zawodowego na działanie promieniotwórcze oraz kwestie związane z usuwaniem odpadów. To z kolei może pozwolić na zwiększone wykorzystanie myszy w celu wykrycia substancji działających uczulająco na skórę, co może doprowadzić do dalszego ograniczenia stosowania świnek morskich do badania odporności na działanie uczulające na skórę (tj. B6; wytyczna OECD dotycząca badań nr 406) (14). DEFINICJE 3. Definicje są zamieszczone w dodatku 1. ZAŁOŻENIA WSTĘPNE I OGRANICZENIA 4. LLNA: DA to zmodyfikowana metoda LLNA do wykrywania chemikaliów potencjalnie uczulających skórę, ze szczególnymi ograniczeniami. Nie oznacza to, że należy koniecznie we wszystkich przypadkach stosować LLNA: DA zamiast LLNA lub badań na śwince morskiej (tj. B.6; wytyczna OECD dotycząca badań nr 406) (14), a tylko, że badanie to ma tę samą wartość merytoryczną i może zostać zastosowane jako badanie alternatywne, którego pozytywne lub negatywne wyniki nie wymagają już dalszego potwierdzenia (10) (11). Laboratorium badawcze powinno uwzględnić wszystkie dostępne informacje na temat badanej substancji przed rozpoczęciem badań. Informacje te powinny obejmować tożsamość i budowę chemiczną badanej substancji; jej właściwości fizyko-chemiczne; wyniki innych badań toksyczności in vitro lub in vivo badanej substancji i dane toksykologiczne dotyczące strukturalnie pokrewnych substancji chemicznych. Należy uwzględnić te informacje przy określaniu, czy metoda LLNA: DA jest odpowiednia do badania danej substancji (z uwagi na niekompatybilność niektórych rodzajów chemikaliów z metodą LLNA DA [zob. pkt 5] oraz przy wyborze dawki. 5. Będąc metodą in vivo, LLNA: DA nie eliminuje wykorzystania zwierząt w określaniu alergicznego kontaktowego działania uczulającego. Może ona jednak ograniczyć stosowanie zwierząt do tego celu w porównaniu z badaniami na świnkach morskich (B.6; wytyczna OECD dotycząca badań nr 406) (14). Co więcej, LLNA oferuje znacznie bardziej wyrafinowany sposób wykorzystywania zwierząt (mniej bólu i cierpienia) do badania alergicznego kontaktowego działania uczulającego, gdyż w odróżnieniu od B.6 i wytycznej OECD dotyczącej badań nr 406 metoda DA nie wymaga wywoływania reakcji nadwrażliwości skóry poprzez prowokację. Pomimo zalet LLNA: DA i jej przewagi nad B.6 i wytyczną OECD dotyczącą badań nr 406 (14), istnieją pewne ograniczenia, które mogą spowodować konieczność wykorzystania B.6 lub wytycznej OECD dotyczącej badań nr 406 (np. badanie niektórych metali, fałszywe wyniki pozytywne w przypadku niektórych środków drażniących skórę [takich jak niektóre substancje powierzchniowo czynne] (6) (1 oraz rozdział B.42 w niniejszym załączniku), rozpuszczalność badanej substancji). Ponadto klasy chemiczne lub substancje zawierające grupy funkcjonalne, co do których wykazano, że działają jako potencjalne czynniki zakłócające (16), mogą wymagać użycia badań na świnkach morskich (tj. B.6; wytyczna OECD dotyczącej badań nr 406 (14)). Zalecono stosowanie ograniczeń wskazanych w LLNA (1 oraz rozdział B.42 w niniejszym załączniku) również w odniesieniu do LLNA: DA (10). Ponadto wykorzystanie LLNA: DA może okazać się nieodpowiednie w przypadku badania substancji, które wpływają na poziom ATP (np. substancji działających jako inhibitory ATP) lub tych, które wpływają na pomiar międzykomórkowego ATP (np. z uwagi na obecność enzymów rozkładających ATP, obecność międzykomórkowego ATP w węźle chłonnym). Oprócz tych zidentyfikowanych przypadków metoda LLNA: DA powinna być odpowiednia do badania wszelkich substancji, chyba że istnieją właściwości związane z tymi substancjami, które mogą wpływać na dokładność badania LLNA: DA. Ponadto należy uwzględnić możliwość otrzymania pozytywnych wyników granicznych gdy wartości wskaźnika stymulacji (SI) kształtują się pomiedzy 1,8 a 2,5 (zob. pkt 31–32). Opiera się to na bazie danych uzyskanej przy zatwierdzaniu 44 substancji z wykorzystaniem SI ≥ 1,8 (zob. pkt 6), gdzie za pomocą LLNA: DA poprawnie zidentyfikowano wszystkie 32 LLNA substancje uczulające, lecz niewłaściwie oznaczono trzy z 12 LLNA substancji nieuczulających o wartościach SI pomiędzy 1,8 i 2,5 (tj. graniczne wartości dodatnie) (10). Jednak w związku z tym, że ten sam zestaw danych był stosowany do ustalania wartości SI i obliczania przewidywalnych właściwości badania, przytoczone wyniki mogą być zawyżonym szacunkiem prawdziwych przewidywalnych właściwości. ZASADA METODY BADANIA 6. Podstawową zasadą u podłoża LLNA: DA jest fakt, że czynniki uczulające wywołują proliferację limfocytów w węźle chłonnym odprowadzającym limfę z miejsca przyłożenia środka chemicznego. Ta proliferacja jest proporcjonalna do zastosowanej dawki oraz potencjału zastosowanego alergenu i jest prostym środkiem uzyskania ilościowego pomiaru uczulenia. Proliferacja jest mierzona przez porównanie średniej proliferacji w każdej badanej grupie do średniej proliferacji w grupie kontrolnej otrzymującej nośnik (VC). Określa się stosunek średniej proliferacji w każdej grupie poddanej działaniu środka do średniej proliferacji w równoległej grupie VC, który jest nazywany wskaźnikiem stymulacji (SI) i powinien wynosić ≥ 1,8 zanim substancja badana zostanie zaklasyfikowana jako potencjalny czynnik uczulający skórę. Procedury opisane w niniejszym dokumencie są oparte na wykorzystaniu pomiaru zawartości ATP na podstawie bioluminescencji (o której wiadomo, że jest zgodna z liczbą żywych komórek) (17) do wykrycia zwiększonej liczby rozmnażających się wegetatywnie komórek w odprowadzających usznych węzłach chłonnych (18) (19). Metoda z wykorzystaniem bioluminescencji posługuje się enzymem lucyferazy do katalizowania zjawiska powstawania światła z ATP i lucyferyny zgodnie z następującą reakcją: ATP + Luciferin + O 2 Oxyluciferin + AMP + PPi + CO 2 + Light Natężenie emitowanego światła jest liniowo powiązane ze stężeniem ATP i mierzy się je za pomocą luminometra. Badanie z wykorzystaniem lucyferyny-lucyferazy jest czułą metodą ilościowego pomiaru ATP wykorzystywaną w szerokim wachlarzu zastosowań (20). OPIS BADANIA Dobór gatunków zwierząt 7. Mysz jest gatunkiem preferowanym do tego badania. Badania walidacyjne dla LLNA: DA były przeprowadzane wyłącznie na szczepie CBA/J, który z tego względu uznaje się za szczep preferowany (12) (13). Wykorzystuje się młode dorosłe samice myszy, które są nieródkami i nie są w ciąży. Na początku doświadczenia samice powinny mieć 8–12 tygodni, a zróżnicowanie mas ciała poszczególnych zwierząt powinno być minimalne i nie przekraczać 20 % średniej masy ciała. Można ewentualnie wykorzystać inne szczepy i samce, jeżeli dysponuje się danymi świadczącymi o tym, że nie istnieją znaczące różnice w reakcji na LLNA: DA w zależności od szczepu i/lub płci. Warunki w pomieszczeniach dla zwierząt i pożywienie 8. Myszy powinny być trzymane w grupach (21), chyba że istnieją odpowiednie naukowe przesłanki dla trzymania myszy pojedynczo. Temperatura w badawczych pomieszczeniach hodowlanych powinna wynosić 22 ± 3 °C. Chociaż wilgotność względna powinna wynosić co najmniej 30 % i pożądane jest, żeby nie przekraczała 70 % poza czasem czyszczenia pomieszczenia, celem powinno być utrzymywanie jej na poziomie 50–60 %. Oświetlenie powinno być sztuczne, w cyklu 12 godzin światła, 12 godzin ciemności. Do żywienia można stosować konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dostępem do wody pitnej. Przygotowanie zwierząt 9. Zwierzęta wybierane są losowo i znakowane w sposób umożliwiający indywidualną identyfikację (ale nie przez jakiekolwiek znaki na uszach) i trzymane w klatkach przez co najmniej pięć dni przed rozpoczęciem dawkowania w celu umożliwienia zaaklimatyzowania do warunków laboratoryjnych. Przed rozpoczęciem podawania bada się wszystkie zwierzęta w celu upewnienia się, że nie mają żadnych zauważalnych zmian skórnych. Przygotowanie roztworów dozujących 10. Stałe substancje powinny zostać rozpuszczone lub zawieszone w odpowiednich rozpuszczalnikach lub nośnikach oraz rozcieńczone, jeżeli jest to odpowiednie, przed zastosowaniem na uchu myszy. Chemikalia płynne można zastosować czyste lub rozcieńczone przed dawkowaniem. Chemikalia nierozpuszczalne, takie jak te najczęściej spotykane w wyrobach medycznych, należy poddać ekstrakcji w wyjątkowych warunkach w odpowiednim rozpuszczalniku w celu wykrycia wszystkich możliwych do wyekstrahowania składników do badania przed zastosowaniem na uchu myszy. Substancje badane należy przygotowywać codziennie, chyba że dane dotyczące stabilności wykazują dopuszczalność składowania. Sprawdzenie wiarygodności 11. Pozytywne substancje kontrolne (PC) wykorzystuje się do wykazania właściwego działania badania poprzez ich reakcję z odpowiednią i powtarzalną czułością na badaną substancję uczulającą, dla której wielkość reakcji jest dobrze scharakteryzowana. Włączanie równoległej PC jest zalecane, ponieważ potwierdza się w ten sposób kompetencje laboratorium do skutecznego przeprowadzenia każdego badania i umożliwia dokonanie oceny odtwarzalności i porównywalności wewnątrz- i międzylaboratoryjnej. Niektóre organy regulacyjne mogą wymagać także PC dla każdego badania i w związku z tym zachęca się użytkowników do konsultacji z właściwymi organami przed rozpoczęciem LLNA: DA. Odpowiednio zaleca się rutynowe wykorzystywanie równoległej PC, aby uniknąć potrzeby dodatkowych badań na zwierzętach do spełnienia tych wymagań, które mogą powstać w związku ze stosowaniem okresowej PC (zob. pkt 12). PC powinna dać w teście LLNA: DA reakcję pozytywną na poziomie narażania, przy którym oczekuje się wzrostu wskaźnika stymulacji (SI) ≥ 1,8 większego niż w grupie kontroli negatywnej (NC). Dawkę PC należy dobrać w taki sposób, by nie powodować nadmiernego podrażnienia skóry lub ogólnoustrojowej toksyczności, a indukcja była powtarzalna, ale nie nadmierna (tj. SI > 10 byłyby uznane za zbyt wysokie). Preferowane PC to 25 % aldehyd cynamonowy heksylu (Chemical Abstracts Service [CAS] nr 101-86-0) i 25 % eugenol (numer CAS 97-53-0) w acetonie: oliwa z oliwek (w proporcji objętościowej 4:1 v/v). Mogą zaistnieć okoliczności, w których można użyć innych PC spełniających powyższe kryteria, pod warunkiem że istnieje po temu odpowiednie uzasadnienie. 12. Pomimo że zaleca się włączenie równoległej grupy PC, mogą zaistnieć sytuacje, w których okresowe badanie PC (tj. w odstępach nie dłuższych niż 6 miesięcy) może okazać się wystarczające w przypadku laboratoriów, które regularnie przeprowadzają badanie LLNA: DA (tj. przeprowadzają badanie LLNA: DA co najmniej raz na miesiąc) i dysponują wcześniejszymi danymi z pozytywnych kontroli, świadczącymi o tym, że laboratorium jest w stanie uzyskiwać odtwarzalne i dokładne wyniki w pozytywnych kontrolach. Można wykazać odpowiedni poziom biegłości w wykonywaniu badania LLNA: DA, uzyskując stałe pozytywne wyniki PC w co najmniej 10 niezależnych badaniach przeprowadzonych w rozsądnym terminie (tj. w okresie krótszym niż rok). 13. Należy zawsze włączać równoległą grupę PC, jeśli zachodzi proceduralna zmiana w LLNA: DA (np. zmiana przeszkolonego personelu, zmiany w metodzie badania materiałów i/lub odczynników, zmiany w metodzie badania urządzenia, zmiana źródła badanych zwierząt), a przedmiotowe zmiany powinny być udokumentowane w laboratoryjnych sprawozdaniach. Należy zwrócić uwagę na wpływ tych zmian na odpowiedniość ustalonych wcześniej danych przy określaniu konieczności zgromadzenia nowej bazy danych, aby udokumentować spójność wyników PC. 14. Badacze powinni być świadomi, że decyzja o przeprowadzeniu badania PC na zasadzie okresowej zamiast równolegle wywiera wpływ na odpowiedniość i akceptowalność negatywnych wyników badań uzyskanych bez równoległej PC w okresie pomiędzy każdym okresowym badaniem PC. Na przykład, jeżeli w okresowych PC uzyskany zostaje wynik fałszywie negatywny, negatywne wyniki substancji badanej uzyskane w okresie między ostatnim dopuszczalnym okresowym badaniem PC i niedopuszczalnym okresowym badaniem PC mogą być kwestionowane. Należy dokładnie rozważyć tego rodzaju skutki przy podejmowaniu decyzji, czy należy włączyć równoległą PC, czy tylko przeprowadzać PC na zasadzie okresowej. Należy również wziąć pod uwagę możliwość wykorzystania mniejszej liczby zwierząt w ramach grupy równoległej PC, jeżeli jest to naukowo uzasadnione oraz jeżeli laboratorium może wykazać, w oparciu o wcześniej zgromadzone dane, że można wykorzystać mniejszą liczbę myszy (22). 15. Chociaż substancja kontroli pozytywnej powinna być testowana w nośniku, o którym wiadomo, że wywołuje konsekwentną reakcję (np. aceton: oliwa z oliwek; w proporcji objętościowej 4:1, v/v), mogą jednak zaistnieć pewne sytuacje wynikające z przepisów, w których przetestowanie w niestandardowym nośniku (o formulacji odpowiedniej klinicznie/chemicznie) może być również konieczne (23). Jeżeli równoległa PC jest badana w innym nośniku niż substancja badana, wówczas należy włączyć oddzielną VC w odniesieniu do równoległej PC. 16. W przypadkach, gdy ocenia się substancje badane konkretnej klasy chemicznej lub zakres reakcji, substancje wzorcowe mogą być użyteczne, także aby wykazać, że metoda badawcza jest odpowiednia dla wykrywania potencjalnego działania uczulającego na skórę przez tego rodzaju substancje. Odpowiednie substancje wzorcowe powinny posiadać następujące właściwości: — strukturalne i funkcjonalne podobieństwo do klasy badanej substancji, — znane właściwości fizyczne i chemiczne, — dane potwierdzające z LLNA: DA, — dane potwierdzające z innych modeli zwierzęcych i/lub ludzkich. PROCEDURA BADANIA Liczba zwierząt i poziomy dawek 17. W każdej grupie badanej powinny być wykorzystane nie mniej niż cztery zwierzęta, z minimalną liczbą trzech stężeń substancji badanej oraz równoległą grupą NC otrzymującą jedynie nośnik substancji badanej i grupą kontrolną PC (równoległą lub najnowszą, na podstawie polityki laboratoryjnej, biorąc pod uwagę pkt 11–15). Należy rozważyć zbadanie wielu dawek PC, szczególnie gdy badanie PC jest prowadzone na zasadzie nieregularnej. Z wyjątkiem zastosowania substancji badanej, ze zwierzętami grup kontrolnych należy się obchodzić w sposób identyczny jak ze zwierzętami grup badanych. 18. Dobór dawek i wybór nośnika powinien być oparty na zaleceniach podanych w pozycjach (2) i (24) bibliografii. Kolejne dawki zazwyczaj wybiera się z odpowiedniego szeregu stężeń takich, jak 100 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 2,5 %, 1 %, 0,5 % itd. Do wyboru szeregu stężeń należy dołączyć odpowiednie naukowe uzasadnienie. O ile są dostępne, należy uwzględnić wszystkie istniejące informacje toksykologiczne (np. o ostrej toksyczności i o podrażnieniu skóry) oraz o strukturalnych i fizykochemicznych właściwościach badanej substancji (i/lub substancji zbliżonych pod względem budowy) przy wyborze trzech kolejnych stężeń, tak aby najwyższe stężenie maksymalizowało narażenie, nie doprowadzając jednak do ogólnoustrojowej toksyczności i/lub nadmiernego miejscowego podrażnienia skóry (24) (25). W przypadku braku takich informacji może okazać się konieczne przeprowadzenie badania wstępnego (zob. pkt 21–24) 19. Nośnik nie powinien zakłócać wyniku badania lub wpływać na niego oraz powinien być wybrany na podstawie maksymalizowania rozpuszczalności w celu uzyskania najwyższego osiągalnego stężenia, dając jednocześnie możliwość uzyskania roztworu/zawiesiny nadającej się do podania substancji badanej. Zalecanymi nośnikami są aceton: oliwa z oliwek (w proporcji objętościowej 4:1 v/v), N,N-dimetyloformamid, metylo etylo keton, glikol propylenowy i sulfotlenek dimetylowy (6), ale mogą być użyte inne, jeśli przedstawi się wystarczające uzasadnienie naukowe. W niektórych sytuacjach może okazać się konieczne użycie, jako dodatkowej kontroli, rozpuszczalnika odpowiedniego ze względów klinicznych, lub postaci handlowej, w której badana substancja wprowadzana jest na rynek. Szczególną uwagę należy zwrócić na zapewnienie, aby substancje hydrofilne zostały włączone do systemu nośnika, który nawilża skórę i nie spływa z niej natychmiast, przez włączenie odpowiednich środków zwiększających rozpuszczalność (np. 1 % Pluronic ® L92). A zatem należy unikać roztworów całkowicie wodnych. 20. Przetwarzanie węzłów chłonnych z poszczególnych myszy umożliwia ocenę zmienności pomiędzy zwierzętami oraz statystyczne porównanie różnicy między substancją badaną i pomiarami grupy VC (zob. pkt 33). Ponadto dokonanie oceny możliwości obniżenia liczby myszy w grupie PC jest wykonalne jedynie wówczas, gdy gromadzone są dane dotyczące poszczególnych zwierząt (22). Co więcej, niektóre organy regulacyjne wymagają zbierania danych dotyczących poszczególnych zwierząt. Regularne gromadzenie danych dotyczących poszczególnych zwierząt stanowi o dobrostanie zwierząt dzięki temu, że unika się powielania badań, do którego dochodziłoby w przypadku, gdyby wyniki dotyczące substancji badanej pierwotnie zebrane w jeden sposób (np. poprzez połączenie danych dotyczących zwierząt) miały zostać rozpatrzone w późniejszym terminie przez organy regulacyjne zgodnie z innymi wymogami (np. w ramach danych dotyczących poszczególnych zwierząt). Badanie wstępne 21. W przypadku braku informacji pozwalającej określić najwyższą dawkę, jaka ma zostać zbadana (zob. pkt 18), należy przeprowadzić badanie wstępne w celu określenia właściwego poziomu dawki do badania w metodzie LLNA: DA. Celem badania wstępnego jest opracowanie wytycznych dotyczących wyboru maksymalnej dawki, jaką należy stosować w głównym badaniu LLNA: DA, w przypadku gdy nie dysponuje się informacjami na temat stężenia powodującego toksyczność ogólnoustrojową (zob. pkt 24) i/lub nadmierne miejscowe podrażnienie skóry (zob. pkt 23). Maksymalny poziom badanej dawki powinien wynosić 100 % substancji badanej w przypadku cieczy lub maksymalne możliwe stężenie w przypadku ciał stałych lub zawiesin. 22. Badanie wstępne przeprowadza się w warunkach identycznych do tych, w jakich przeprowadza się główne badanie LLNA: DA, z tym że nie przeprowadza się oceny proliferacji węzła chłonnego oraz można wykorzystać mniejszą liczbę zwierząt w grupie badanej. Zaleca się jedno lub dwa zwierzęta w grupie badanej. Wszystkie myszy będą obserwowane codziennie pod kątem jakichkolwiek klinicznych oznak toksyczności ogólnoustrojowej lub miejscowego podrażnienia skóry w miejscu zastosowania. Masy ciała są rejestrowane przed badaniem i przed jego zakończeniem (dzień 8.). Obydwoje uszu każdej myszy bada się pod kątem wystąpienia rumienia i ocenia przy wykorzystaniu tabeli 1 (25). Pomiary grubości ucha są przeprowadzane przy wykorzystaniu grubościomierza (np. cyfrowych mikrometrów lub grubościomierza Peacock Dial) w dniu 1. (przed podaniem substancji), w dniu 3. (około 48 godzin następujących po podaniu pierwszej dawki) oraz w dniu 7. (24 godziny przed zakończeniem badania) i dniu 8. Ponadto w dniu 8. grubość ucha można określić za pomocą kolczykownicy do pomiaru masy, co powinno być przeprowadzone po uśmierceniu zwierząt w humanitarny sposób. Nadmierne miejscowe podrażnienie skóry jest sygnalizowane przez rumień o wyniku ≥ 3 i/lub zwiększenie grubości ucha o ≥ 25 % w dniu pomiaru (26) (27). Najwyższa dawka wybrana do głównego badania LLNA: DA to następna niższa dawka w szeregu stężeń badania wstępnego (zob. pkt 18), która nie wywołuje ogólnoustrojowej toksyczności i/lub nadmiernego miejscowego podrażnienia skóry. Tabela 1 Ocena punktowa rumienia Objawy Wynik Brak rumienia 0 Bardzo lekki rumień (prawie niewidoczny) 1 Wyraźny rumień 2 Rumień umiarkowany do mocnego 3 Mocny rumień (czerwień przypominająca barwę mięsa czerwonego) do form obrzęku wykluczających klasyfikację rumienia 4 23. Oprócz 25 % zwiększenia grubości ucha 26) (27), do zidentyfikowania substancji drażniących w metodzie LLNA wykorzystywano też statystycznie istotne zwiększenie grubości ucha u myszy badanych w porównaniu z myszami kontrolnymi (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34). O ile jednak statystycznie znaczące zwiększenie może wystąpić przy grubości ucha mniejszej niż 25 %, to nie udało się go powiązać z nadmiernym podrażnieniem (30) (31) (32) (33) (34). 24. Następujące obserwacje kliniczne mogą wskazywać na toksyczność ogólnoustrojową (35), jeśli są wykorzystywane jako część zintegrowanej oceny i w związku z tym mogą określać maksymalne dawki do stosowania w LLNA: DA: zmiany w funkcjach układu nerwowego (np. piloerekcja, ataksja, drżenia, oraz konwulsje); zmiany w zachowaniu (na przykład agresja, zmiany w czyszczeniu, wyraźna zmiana w poziomie aktywności); zmiany w sposobie oddychania (np. zmiany w częstotliwości i intensywności oddychania, takie jak duszność, dyszenie oraz rzężenie), a także zmiany w konsumpcji żywności i wody. Ponadto w ocenie należy wziąć pod uwagę oznaki stanów zwiększonej senności i/lub brak reakcji oraz wszelkie objawy kliniczne sygnalizujące coś więcej niż chwilowy ból i cierpienie, lub > 5 % spadek masy ciała od dnia 1. do dnia 8. czy śmiertelność. Zwierzęta konające oraz zwierzęta wykazujące objawy silnego bólu i zagrożenia należy humanitarnie uśmiercić (36). Harmonogram doświadczalny głównego badania 25. Harmonogram doświadczalny badania jest następujący: — Dzień 1: Indywidualnie określić i odnotować wagę każdego zwierzęcia oraz wszelkie obserwacje kliniczne. Nałożyć 1 % roztworu wodnego dodecylo siarczanu sodu (SLS) na część grzbietową każdego ucha przy użyciu pędzla zanurzonego w roztworze SLS, tak aby cała grzbietowa część każdego ucha została pokryta za pomocą czterech do pięciu pociągnięć pędzla. Po godzinie od momentu podania SLS nakłada się 25 μl właściwego roztworu substancji badanej lub samego nośnika lub kontroli pozytywnej (równoległej lub najnowszej, na podstawie polityki laboratoryjnej, biorąc pod uwagę pkt 11–15), na część grzbietową każdego ucha. — Dni 2, 3 i 7: Powtórzyć przeprowadzoną w dniu 1. procedurę wstępnego poddania działaniu 1 % wodnego roztworu SLS i nałożenia substancji badanej. — Dni 4, 5 i 6: Bez podawania. — Dzień 8: Zanotować wagę każdego zwierzęcia oraz wszelkie obserwacje kliniczne. Około 24 do 30 godzin po rozpoczęciu stosowania w dniu 7. należy uśmiercić zwierzęta w sposób humanitarny. Wyciąć uszne węzły chłonne z każdego ucha myszy i przetwarzać oddzielnie w roztworze chlorku sodu buforowanym fosforanami (PBS) dla każdego zwierzęcia. Informacje i schematy identyfikacji i rozbioru węzła chłonnego można znaleźć w pozycji (22). Do celów dalszego monitorowania miejscowych reakcji skóry w badaniu głównym, w protokole badania można uwzględnić dodatkowe parametry, takie jak punktacja rumienia ucha lub pomiar grubości ucha (zrobiony za pomocą grubościomierza lub za pomocą kolczykownicy do pomiaru masy w czasie sekcji). Przygotowanie zawiesiny komórek 26. Przygotowuje się jednokomórkową zawiesinę z komórek węzła chłonnego (LNC) usuniętych obustronnie dla każdego zwierzęcia, przez umieszczenie węzłów chłonnych pomiędzy dwoma szkiełkami mikroskopowymi i zastosowanie lekkiego nacisku w celu rozdrobnienia węzłów. Po upewnieniu się, że tkanki zostały rozprowadzone cienką warstwą, należy rozdzielić oba szkiełka. Zawiesić tkanki z obu szkiełek w PBS, trzymając każde szkiełko pod kątem nad szalką Petriego i płucząc przy użyciu PBS i jednocześnie zeskrobując tkankę ze szkiełka skrobakiem do komórek. Ponadto węzły chłonne u zwierząt z grupy kontroli negatywnej są niewielkie, tak więc ostrożne działanie ma istotne znaczenie dla uniknięcia sztucznego wpływu na wartości SI. Do płukania szkiełek należy wykorzystać całkowitą objętość 1 mL PBS. Zawiesinę LNC w szalce Petriego należy homogenizować lekko za pomocą skrobaka do komórek. 20 μL alikwoty zawiesiny LNC zbiera się następnie za pomocą mikropipety, przy czym należy uważać aby nie zebrać widocznej dla oka membrany, a następnie miesza się z 1,98 mL PBS, tak aby otrzymać 2 mL próbki. Następnie przygotowuje się drugą 2 mL próbkę zgodnie z tą samą procedurą, tak aby przygotowane zostały dwie próbki dla każdego zwierzęcia. Określenie proliferacji komórkowych (pomiar zawartości ATP limfocytów) 27. Wzrost zawartości ATP w węzłach chłonnych jest mierzony za pomocą metody lucyferyny-lucyferazy z zastosowaniem zestawu do pomiaru ATP, który mierzy bioluminescencję w umownych jednostkach luminescencyjnych (RLU). Czas badania od momentu uśmiercenia zwierząt do pomiaru zawartości ATP dla każdego osobnika powinien być jednolity, w ciągu około 30 minut, ponieważ uważa się, że zawartość ATP stopniowo maleje wraz z upływem czasu od momentu uśmiercenia zwierząt (12). Zatem serię procedur, poczynając od usunięcia usznych węzłów chłonnych aż do pomiaru ATP, należy zakończyć w ciągu 20 minut zgodnie z wcześniej ustalonym harmonogramem, takim samym dla każdego zwierzęcia. Pomiar luminescencji ATP należy przeprowadzić w każdej 2 mL próbce w taki sposób, aby w odniesieniu do każdego osobnika przeprowadzano łącznie dwa pomiary ATP. Ustala się wówczas średnią wartość luminescencji ATP i wykorzystuje ją w późniejszych obliczeniach (zob. pkt 30). OBSERWACJE Obserwacje kliniczne 28. Zwierzęta poddaje się starannej obserwacji klinicznej raz dziennie pod kątem jakichkolwiek oznak klinicznych, czy to miejscowego podrażnienia w miejscu zastosowania, czy też ogólnoustrojowej toksyczności. Wszystkie obserwacje kliniczne są systematycznie odnotowywane w postaci zapisów prowadzonych dla każdej myszy. Plany monitorowania powinny obejmować kryteria umożliwiające szybką identyfikację tych myszy, które wykazują oznaki toksyczności ogólnoustrojowej, nadmiernego miejscowego podrażnienia skóry lub żrącego działania na skórę, w celu eutanazji (36). Masy ciała 29. Jak wskazano w pkt 25, indywidualne masy ciała określane są na początku badania i przy planowanym humanitarnym uśmierceniu zwierząt. OBLICZANIE WYNIKÓW 30. Wyniki dla każdej grupy badanej są wyrażane jako średni SI. SI otrzymuje się przez podzielenie średniej wartości RLU/mysz w obrębie każdej grupy dawkowania substancji badanej oraz grupy PC przez średnią RLU/mysz obliczoną dla grupy rozpuszczalnika/VC. Średnie SI dla grup VC wynosi zatem jeden. 31. Proces decyzyjny uznaje wynik za pozytywny, gdy SI ≥ 1,8 (10). Jednakże siła reakcji na dawkę, znaczenie statystyczne i spójność reakcji rozpuszczalnik/nośnik i PC mogą również być stosowane przy ustalaniu, czy wynik graniczny (tj. wartość SI pomiędzy 1,8 a 2,5) można uznać za pozytywny (2) (3) (37). 32. W przypadku granicznego wyniku pozytywnego o wartości SI pomiędzy 1,8 i 2,5 użytkownicy mogą rozważyć dodatkowe informacje, takie jak relacja dawka-reakcja, oznaki toksyczności ogólnoustrojowej lub nadmiernego podrażnienia oraz, w stosownych przypadkach, istotność statystyczna wraz z wartościami SI w celu potwierdzenia, czy wyniki te są pozytywne (10). Należy również rozważyć różne własności substancji badanej, w tym rozważyć, czy jest ona strukturalnie pokrewna znanym czynnikom uczulającym, czy powoduje nadmierne podrażnienie skóry u myszy, oraz zaobserwowany charakter relacji dawka-reakcja. Te i inne względy omówione są szczegółowo gdzie indziej (4). 33. Gromadzenie danych dotyczących poszczególnych myszy umożliwi analizę statystyczną danych w odniesieniu do obecności i relacji dawka-reakcja. Ocena statystyczna może obejmować ocenę relacji między dawką a reakcją, jak również odpowiednio dostosowane porównania badanych grup (np. grupę badaną w parach w porównaniu z równoległą grupą kontrolną otrzymującą nośnik/rozpuszczalnik). Analizy statystyczne mogą obejmować np. regresję liniową lub badanie Williamsa w celu dokonania oceny tendencji w relacji między dawką a reakcją oraz badanie Dunnetta w odniesieniu do porównań par. Przy wyborze właściwej metody analizy statystycznej danych prowadzący badanie powinien zachować świadomość możliwej nierówności wariancji lub innych powiązanych problemów, które mogą spowodować konieczność transformacji danych lub przeprowadzenia nieparametrycznej analizy statystycznej. W każdym przypadku prowadzący badanie musi liczyć się z koniecznością przeprowadzenia obliczeń SI i analiz statystycznych z wykorzystaniem pewnych punktów danych i bez nich (tzw. »wartości odstające«). DANE I SPORZĄDZANIE SPRAWOZDANIA Dane 34. Dane powinny być podsumowane w formie tabelarycznej pokazującej wartości RLU odnoszące się do poszczególnych zwierząt, średnie wartości RLU/zwierzę w danej grupie, związana wartość błędu (np. SD, SEM), oraz średnie SI dla każdej grupy badanej porównywane z równoległą grupą kontrolną z zastosowaniem rozpuszczalnika/nośnika. Sprawozdanie z badań 35. Sprawozdanie z badania powinno zawierać następujące informacje: Badane i kontrolne substancje chemiczne: — numery identyfikujące (np. CAS lub WE, jeśli są dostępne); źródło: czystość; znane zanieczyszczenia; numer partii), — cechy fizyczne i własności fizykochemiczne (np. lotność, stabilność, rozpuszczalność), — jeżeli jest to mieszanina, skład i względne udziały procentowe składników. Rozpuszczalnik/nośnik: — dane identyfikacyjne (czystość; stężenie, tam gdzie stosowne; wykorzystane objętości), — uzasadnienie wyboru nośnika. Zwierzęta badane: — źródło, z którego pochodzą myszy szczepu CBA, — status mikrobiologiczny zwierząt, jeśli jest znany, — liczba i wiek zwierząt, — źródło pochodzenia zwierząt, warunki środowiska, pokarm itp. Warunki badania: — źródło, numer partii i dane producenta dotyczące zapewniania/kontroli jakości dla zestawu ATP, — szczegóły przygotowania i stosowania substancji badanej, — uzasadnienie doboru dawek (łącznie z wynikami z badania wstępnego, jeśli było przeprowadzane), — nośnik i użyte stężenia substancji testowej oraz całkowita ilość zastosowanej substancji badanej, — szczegóły dotyczące jakości pożywienia i wody (włączając w to rodzaj/źródło diety, źródło wody), — szczegóły dotyczące poddania działaniu substancji oraz harmonogramów pobierania próbek, — metody pomiaru toksyczności, — kryteria uznawania badań za pozytywne lub negatywne, — szczegóły dotyczące protokołu odchyleń i wyjaśnienie, w jaki sposób odchylenie ma wpływ na planowanie badań i ich wyniki. Sprawdzenie wiarygodności: — podsumowanie wyników ostatniego sprawdzenia wiarygodności badań, w tym informacji o wykorzystanej substancji badanej, stężeniach i nośniku, — dane dotyczące równoległej lub wcześniejszej kontroli pozytywnej i dotyczące równoległej negatywnej (rozpuszczalnik/nośnik) kontroli z laboratorium testującego, — jeżeli nie włączono równoległej grupy PC, data i sprawozdanie laboratoryjne z ostatniego okresowego PC i sprawozdanie wyszczególniające wcześniejsze dane dotyczące PC dla danego laboratorium, uzasadniające przyczyny dla których nie przeprowadzono PC równolegle. Wyniki: — masa poszczególnych myszy na początku dawkowania i przy planowanym uśmierceniu; jak również średnia i opis powiązanego błędu (np. SD, SEM) w odniesieniu do każdej grupy badanej, — przebieg czasowy pojawienia się i oznaki toksyczności, w tym podrażnień skóry w miejscu podania, jeśli takie wystąpiły, u każdego zwierzęcia, — godzina uśmiercenia i godzina pomiaru ATP dla każdego zwierzęcia, — tabela wartości RLU dla poszczególnych myszy i wartości SI dla każdej grupy badanej, — średni oraz powiązany okres błędu (np. SD, SEM) dla RLU/mysz dla każdej grupy badanej i wyniki analizy obserwacji nietypowych dla każdej grupy badanej, — obliczone SI i właściwe pomiary zmienności, uwzględniające zmienność pomiędzy zwierzętami w odniesieniu do grup substancji badanej i grup kontrolnych, — relacja dawka-reakcja, — analizy statystyczne, tam gdzie stosowne. Omówienie wyników: — krótki komentarz do wyników, analiza zależności reakcji od dawki oraz w stosownych przypadkach, analizy statystyczne, z wni