ZAŁĄCZNIK I

ROZDZIAŁ 1

KRYTERIA WYDAJNOŚCI I INNE WYMOGI DLA METOD ANALITYCZNYCH

1.1. Wymogi dotyczące metod przesiewowych

1.1.1. Kategorie odpowiednich metod przesiewowych

Jako odpowiednie metody przesiewowe stosuje się metody jakościowe, półilościowe lub ilościowe.

1.1.2. Wymogi dotyczące biologicznych, biochemicznych lub fizykochemicznych metod przesiewowych

W przypadku substancji zakazanych lub niedopuszczonych CCβ powinno pozostawać na najniższym racjonalnie osiągalnym poziomie, a w każdym razie poniżej punktu odniesienia dla działań kontrolnych (RPA) w odniesieniu do substancji, dla których RPA ustanowiono zgodnie z rozporządzeniem (UE) 2019/1871.

W przypadku dopuszczonych substancji farmakologicznie czynnych CCβ powinno pozostawać poniżej maksymalnego limitu pozostałości (MLP) lub maksymalnej zawartości (MZ).

Do celów badań przesiewowych należy stosować wyłącznie te metody analityczne, co do których można wykazać w udokumentowany, możliwy do prześledzenia sposób, że są zwalidowane i posiadają współczynnik wyników fałszywie zgodnych niższy lub równy 5 % (błąd β). W przypadku podejrzenia wyniku niezgodnego wynik ten należy potwierdzić metodą potwierdzającą.

Ilościowe metody przesiewowe wykorzystywane zarówno do badań przesiewowych, jak i do potwierdzania, muszą spełniać takie same wymogi dotyczące dokładności, zakresu i precyzji, jak opisano w rozdziałach 1.2.2.1 i 1.2.2.2.

1.2. Wymogi dotyczące metod potwierdzających

1.2.1. Wymogi ogólne dotyczące metod potwierdzających

W przypadku substancji zakazanych lub niedopuszczonych wartość CCα powinna pozostawać na najniższym racjonalnie osiągalnym poziomie. Wartość CCα w odniesieniu do substancji zakazanych lub niedopuszczonych, dla których ustanowiono punkt odniesienia dla działań kontrolnych zgodnie z rozporządzeniem (UE) 2019/1871, powinna być równa temu punktowi lub od niego niższa.

W przypadku substancji dopuszczonych wartość CCα powinna być wyższa niż MLP lub MZ, jednak możliwie najbardziej zbliżona do tych wartości.

Do celów potwierdzenia należy stosować wyłącznie te metody analityczne, co do których można wykazać w udokumentowany, możliwy do prześledzenia sposób, że są zwalidowane i posiadają współczynnik wyników fałszywie niezgodnych (błąd α) niższy lub równy 1 % w przypadku substancji zakazanych lub niedopuszczonych bądź niższy lub równy 5 % w przypadku substancji dopuszczonych.

Metody potwierdzające dostarczają informacji na temat strukturalnego składu chemicznego analitu. W rezultacie metody potwierdzające oparte wyłącznie na analizie chromatograficznej bez wykrywania metodą spektrometrii mas nie są same w sobie odpowiednie do wykorzystania jako metody potwierdzające w odniesieniu do zakazanych lub niedopuszczonych substancji farmakologicznie czynnych. Jeżeli metoda spektrometrii mas nie jest odpowiednia dla substancji dopuszczonych, można zastosować inne metody, takie jak HPLC-DAD i -FLD, lub ich połączenie.

Jeżeli jest to wymagane w ramach metody potwierdzającej, do badanej części na początku procedury ekstrakcji dodaje się odpowiedni wzorzec wewnętrzny. W zależności od dostępności, należy stosować albo trwałe, izotopowo oznaczone postaci analitu, które są w szczególności odpowiednie do wykrywania metodą spektrometrii mas, albo analogi, które pod względem budowy są bardzo podobne do analitu. Jeżeli nie można wykorzystać żadnego odpowiedniego wzorca wewnętrznego, preferowanym sposobem potwierdzenia identyfikacji analitu jest chromatografia równoległa (1). W tym przypadku uzyskuje się tylko jeden pik, przy czym powierzchnia piku jest równoważna ilości dodanego analitu. Jeżeli jest to niewykonalne, stosuje się wzorzec przygotowany w ekstrakcie z matrycy lub wzorzec przygotowany z matrycy wzbogaconej przed ekstrakcją.

1.2.2. Ogólne kryteria wydajności metod potwierdzających

1.2.2.1. Poprawność zmierzona na podstawie odzysku

W przypadku powtórnych analiz certyfikowanego materiału odniesienia zakresy odchylenia doświadczalnie ustalonego średniego ułamka masowego, po uwzględnieniu odzysku, od wartości certyfikowanej muszą być zgodne z minimalnymi zakresami poprawności wymienionymi w tabeli 1.

Tabela 1

Minimalna poprawność metod ilościowych

Ułamek masowy Zakres ≤ 1 μg/kg -50 % do +20 % > 1 μg/kg do 10 μg/kg -30 % do +20 % ≥ 10 μg/kg -20 % do +20 %

Jeżeli certyfikowane materiały odniesienia są niedostępne, dopuszcza się inne sposoby oceny poprawności pomiaru, np. przy użyciu materiałów z przypisanymi wartościami z międzylaboratoryjnych badań porównawczych lub poprzez dodanie znanej ilości analitu lub analitów do matrycy zerowej.

1.2.2.2. Precyzja

Współczynnik zmienności (CV) dla powtórnej analizy materiału odniesienia lub materiału wzbogaconego, w warunkach odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej, nie może przekraczać poziomu obliczonego za pomocą równania Horwitza. Równanie jest następujące:

CV = 2(1 – 0,5 log C)

gdzie C to ułamek masowy wyrażony jako potęga (wykładnik) 10 (np. 1 mg/g = 10-3). W przypadku ułamków masowych poniżej 120 μg/kg zastosowanie równania Horwitza daje niedopuszczalnie wysokie wartości. W związku z tym dopuszczalny maksymalny współczynnik zmienności nie może przekraczać wartości przedstawionych w tabeli 2.

Tabela 2

Dopuszczalny współczynnik zmienności

Ułamek masowy Współczynnik zmienności odtwarzalności (%) > 1 000 μg/kg 16 (obliczone z równania Horwitza) > 120 μg/kg–1 000 μg/kg 22 (obliczone z równania Horwitza) 10–120 μg/kg 25 (*) < 10 μg/kg 30 (*)

W przypadku analiz prowadzonych w warunkach powtarzalności współczynnik zmienności w warunkach powtarzalności nie może wynosić więcej niż dwie trzecie wartości wskazanych w tabeli 2.

1.2.3. Wymogi dotyczące oznaczania metodą chromatografii

W przypadku chromatografii cieczowej (LC) lub gazowej (GC) minimalny dopuszczalny czas retencji dla badanego analitu lub badanych analitów wynosi dwukrotność czasu retencji odpowiadającego objętości martwej kolumny. Czas retencji analitu w ekstrakcie odpowiada czasowi retencji wzorca kalibracji, wzorca przygotowanego w ekstrakcie z matrycy lub wzorca przygotowanego z matrycy wzbogaconej przed ekstrakcją, z dokładnością ± 0,1 min. W przypadku szybkiej chromatografii, gdy czas retencji jest krótszy niż 2 minuty, dopuszczalne jest odchylenie wynoszące poniżej 5 % czasu retencji. W przypadku zastosowania wzorca wewnętrznego stosunek chromatograficznego czasu retencji analitu do czasu retencji wzorca wewnętrznego, tj. względny czas retencji analitu, odpowiada czasowi retencji wzorca kalibracji, wzorca przygotowanego w ekstrakcie z matrycy lub wzorca przygotowanego z matrycy wzbogaconej przed ekstrakcją przy maksymalnym odchyleniu wynoszącym 0,5 % w przypadku chromatografii gazowej i 1 % w przypadku chromatografii cieczowej dla metod zwalidowanych od dnia wejścia w życie niniejszego rozporządzenia.

1.2.4. Szczególne kryteria wydajności spektrometrii mas

1.2.4.1. Wykrywanie metodą spektrometrii mas

Wykrywanie metodą spektrometrii mas przeprowadza się przy wykorzystaniu niektórych z poniższych wariantów:

1. rejestracja pełnych widm masowych (pełne skany) – FS;

2. monitorowanie wybranych jonów (SIM);

3. techniki sekwencyjnej spektrometrii mas (MSn) takie jak monitorowanie wybranych reakcji (SRM);

4. połączenie technik spektrometrii mas (MS) lub sekwencyjnej spektrometrii mas (MSn) z odpowiednimi sposobami jonizacji.

Odpowiednia jest zarówno niskorozdzielcza spektrometria mas (LRMS, przy jednostkowej rozdzielczości masy), jak i wysokorozdzielcza spektrometria mas (HRMS), w tym np. sektory z podwójnym ogniskowaniem, analizator czasu przelotu (TOF) oraz analizator Orbitrap.

W celu potwierdzenia tożsamości analitu w wysokorozdzielczej spektrometrii mas (HRMS) odchylenie masy wszystkich jonów pomocniczych powinno wynosić poniżej 5 ppm (lub w przypadku m/z < 200 poniżej 1 mDa). Na tej podstawie należy wybrać skuteczną rozdzielczość odpowiednią do celu, przy czym rozdzielczość zazwyczaj wynosi ponad 10 000 dla całego zakresu masy przy 10 % dolinie lub 20 000 przy szerokości piku w połowie jego wysokości (FWHM).

Gdy oznaczanie metodą spektrometrii mas jest przeprowadzane poprzez rejestrowanie pełnego skanu widm (zarówno LRMS, jak i HRMS), odpowiednie są wyłącznie jony pomocnicze o względnej intensywności ponad 10 % w widmie referencyjnym wzorca kalibracji, wzorca przygotowanego w ekstrakcie z matrycy lub wzorca przygotowanego z matrycy wzbogaconej przed ekstrakcją. Jony pomocnicze obejmują jon molekularny (jeżeli występuje przy intensywności ≥ 10 % piku podstawowego) oraz charakterystyczne jony fragmentacyjne lub jony potomne.

Selekcja jonu macierzystego: gdy oznaczanie metodą spektrometrii mas jest przeprowadzane poprzez fragmentację po selekcji jonu macierzystego, selekcji jonu macierzystego dokonuje się przy rozdzielczości jednostkowej lub lepszej rozdzielczości. Wybrany jon macierzysty musi być jonem molekularnym, charakterystycznym adduktem jonu molekularnego, charakterystycznym jonem potomnym lub jednym z ich jonów izotopowych. Jeżeli do selekcji jonu macierzystego stosuje się okno selekcji masy o wartości ponad 1 daltona (np. w przypadku akwizycji niezależnej od danych), technikę uznaje się za pełnoskanową analizę potwierdzającą.

Jony fragmentacyjne i potomne: Wybrane jony fragmentacyjne lub jony potomne stanowią fragment diagnostyczny dla mierzonego analitu/produktu. W miarę możliwości należy pomijać nieselektywne procesy przejściowe (np. kation tropyliowy lub utratę wody). Nadmiar jonów pomocniczych określa się na podstawie powierzchni lub wysokości piku zintegrowanych chromatogramów wyekstrahowanych jonów. Zasada ta ma zastosowanie również wówczas, gdy do identyfikacji wykorzystuje się pomiary pełnoskanowe. Stosunek sygnału do szumu (S/N) w przypadku wszystkich jonów pomocniczych musi być większy lub równy trzy do jednego (3:1).

Względna intensywność: względną intensywność jonów pomocniczych (proporcję jonów) wyraża się jako procent intensywności najbardziej nadmiarowego jonu lub produktu przejściowego. Proporcję jonów należy ustalić poprzez porównanie widm lub scalenie sygnałów śladów masy wyekstrahowanych jonów. Proporcja jonów analitu, która ma zostać potwierdzona, odpowiada proporcji wzorców przygotowanych w ekstrakcie z matrycy, wzorców przygotowanych z matrycy wzbogaconej przed ekstrakcją lub roztworów wzorcowych przy porównywalnych stężeniach, mierzonych w tych samych warunkach, w granicach ± 40 % odchylenia względnego.

W przypadku wszystkich analiz metodą spektrometrii mas należy ustalić co najmniej jedną proporcję jonów. Najlepiej, by były to jony uzyskane w ramach jednego skanu, jednak jony mogą również pochodzić z różnych skanów w ramach tego samego wtrysku (tj. pełny skan i skan fragmentacyjny).

1.2.4.2. Identyfikacja

W celu wyboru odpowiednich sposobów akwizycji i kryteriów oceny stosuje się system punktów identyfikacyjnych. Aby potwierdzić w matrycy tożsamość substancji, dla których ustalono MLP (dopuszczone zastosowanie), wymagane są co najmniej 4 punkty identyfikacyjne. W przypadku substancji niedopuszczonych lub zakazanych wymaganych jest 5 punktów identyfikacyjnych. Jeden punkt można uzyskać w drodze oznaczania metodą chromatografii. W tabeli 3 przedstawiono liczbę punktów identyfikacyjnych, którą można uzyskać dzięki każdej z technik. W celu uzyskania wymaganej do potwierdzenia liczby punktów identyfikacyjnych można dodać punkty identyfikacyjne uzyskane za pomocą różnych technik.

1. Wszystkie analizy metodą spektrometrii mas należy połączyć z techniką rozdzielania, która charakteryzuje się wystarczającą zdolnością rozdzielania i selektywnością dla danego zastosowania. Odpowiednie techniki rozdzielania obejmują między innymi chromatografię cieczową i gazową, elektroforezę kapilarną (CE) i chromatografię cieczą w stanie nadkrytycznym (SFC). W przypadku analitu, który zawiera dowolny związek izobaryczny lub izomeryczny, akceptowalność czasu retencji (tj. ± 0,5 % w przypadku GC oraz ± 1 % w przypadku LC i SFC) jest obowiązkowa w celu potwierdzenia tożsamości.

2. Można połączyć maksymalnie trzy różne techniki w celu osiągnięcia minimalnej liczby punktów identyfikacyjnych.

3. Różne sposoby jonizacji (np. jonizację elektronową (EI) i jonizację chemiczną (CI)) uznaje się za różne techniki. Tabela 3 Punkty identyfikacyjne z podziałem na techniki Technika Punkty identyfikacyjne Rozdzielanie (metodą GC, LC, SFC, CE) 1 Jon LR-MS 1 Selekcja jonu macierzystego przy zakresie masy wynoszącym < ±0,5 Da 1 (pośredni) Jon potomny LR-MSn 1,5 Jon HR-MS 1,5 Jon potomny HR-MSn 2,5 Tabela 4 Przykłady liczby punktów identyfikacyjnych uzyskanych dla określonych technik i ich kombinacji (n = liczba całkowita) Technika lub techniki Rozdzielanie Liczba jonów Punkty identyfikacyjne GC-MS (EI lub CI) GC n 1 + n GC-MS (EI oraz CI) GC 2 (EI) + 2 (CI) 1 + 4 = 5 GC-MS (EI lub CI) 2 pochodne GC 2 (pochodna A) + 2 (pochodna B) 1 + 4 = 5 LC-MS LC n (MS) 1 + n GC- lub LC-MS/MS GC lub LC 1 jon macierzysty + 2 jony potomne 1 + 1 + 2 × 1,5 = 5 GC- lub LC-MS/MS GC lub LC 2 jony macierzyste + 2 jony potomne 1 + 2 + 2 × 1,5 = 6 GC- lub LC-MS3 GC lub LC 1 jon macierzysty + 1 jon potomny MS2 + 1 jon potomny MS3 1 + 1 + 1,5 + 1,5 = 5 GC- lub LC-HRMS GC lub LC n 1 + n × 1,5 GC- lub LC-HRMS/MS GC lub LC 1 jon macierzysty (przy zakresie masy wynoszącym <±0,5 Da) + 1 jon potomny 1 + 1 + 2,5 = 4,5 GC- lub LC-HRMS i HRMS/MS GC lub LC 1 jon pełnoskanowy + 1 jon potomny HRMS (a) 1 + 1,5 + 2,5 = 5 GC- i LC-MS GC i LC 2 jony (GCMS) + 1 jon (LCMS) 1 + 1 + 2 + 1 + 1 = 6

1.2.5. Szczególne kryteria wydajności dla oznaczenia analitu za pomocą chromatografii cieczowej z wykorzystaniem technik wykrywania innych niż spektrometria mas

Wyłącznie w odniesieniu do substancji dopuszczonych można stosować następujące techniki jako metody alternatywne dla metod opartych na spektrometrii mas, pod warunkiem że spełnione są odpowiednie kryteria dla tych technik:

1. pełnoskanowa spektrofotometria z detekcją diodową (DAD) w przypadku stosowania w połączeniu z metodą HPLC;

2. detekcja fluorescencyjna (FLD) w przypadku stosowania w połączeniu z metodą HPLC.

Sama metoda chromatografii cieczowej z wykrywaniem UV/VIS (pojedyncza długość fali) nie jest odpowiednia jako metoda potwierdzająca.

1.2.5.1. Kryteria wydajności dla pełnoskanowej spektrofotometrii z detekcją diodową

Muszą być spełnione kryteria wydajności dla oznaczania metodą chromatografii określone w rozdziale 1.2.3.

Maksima absorpcji w widmie UV analitu muszą mieć te same długości fal co wzorzec kalibracji w matrycy z maksymalną tolerancją uzależnioną od rozdzielczości systemu wykrywania. W przypadku szybkiego detektora diodowego tolerancja ta wynosi zazwyczaj ± 2 nm. Widmo analitu powyżej 220 nm, dla tych części obu widm o absorbancji względnej większej lub równej 10 %, nie może różnić się widocznie od widma wzorca kalibracji. Kryterium to jest spełnione, kiedy, po pierwsze, obecne są te same maksima i, po drugie, kiedy różnica między tymi dwoma widmami w żadnym punkcie nie przekracza 10 % absorbancji wzorca kalibracji. W przypadku korzystania ze wspomaganego komputerowo przeszukiwania biblioteki i dopasowywania porównanie danych widmowych w urzędowych próbkach z danymi roztworu kalibracyjnego musi przekroczyć wartość współczynnika dopasowania krytycznego. Współczynnik należy ustalić w czasie procesu walidacji dla każdego analitu na podstawie widm, dla których spełnione są opisane powyżej kryteria. Należy sprawdzić zmienność widm spowodowaną matrycą próbki oraz działaniem detektora.

1.2.5.2. Kryteria wydajności dla detekcji fluorescencyjnej

Muszą być spełnione kryteria wydajności dla oznaczania metodą chromatografii określone w rozdziale 1.2.3.

Wyboru długości fal wzbudzenia i emisji w powiązaniu z warunkami chromatografii należy dokonać w taki sposób, aby zminimalizować oddziaływanie zakłócających składników w zerowych ekstraktach próbek. Różnica między długością fali wzburzenia a długością fali emisji powinna wynosić co najmniej 50 nanometrów.

Najbliższe maksimum piku w chromatogramie oddzielone jest od wyznaczonego piku analitu o co najmniej jedną pełną szerokość piku przy 10 % maksymalnej wysokości piku analitu.

Dotyczy to cząsteczek, które wykazują naturalną fluorescencję oraz cząsteczek wykazujących fluorescencję po przemianie albo derywatyzacji.

ROZDZIAŁ 2

WALIDACJA

2.1. Elementy charakterystyki wydajności, które należy ustalić dla metod analitycznych

Poprzez walidację metody wykazuje się, że metoda analityczna spełnia kryteria mające zastosowanie do odpowiednich elementów charakterystyki wydajności. Różne cele kontrolne wymagają różnych kategorii metod. W tabeli 5 określono, który element charakterystyki wydajności należy zweryfikować dla poszczególnych rodzajów metod, przy czym w niniejszym rozdziale przedstawiono dalsze wyjaśnienia dotyczące każdego z parametrów.

Tabela 5

Klasyfikacja metod analitycznych według elementów charakterystyki wydajności, które należy ustalić

Metoda Potwierdzenie Metoda przesiewowa Jakościowe Ilościowe Jakościowa Półilościowa Ilościowa Substancje A A, B A, B A, B A, B Identyfikacja zgodnie z rozdziałem 1.2 x x CCα x x CCβ – x x x Poprawność x x Precyzja x (x) x Względny efekt matrycowy/odzysk bezwzględny (*) x x Selektywność/specyficzność x x x x Stabilność (#) x x x x Odporność x x x x x: Wymagane jest udowodnienie poprzez walidację, że wymogi dotyczące danego elementu charakterystyki wydajności są spełnione. (x) Wymogi dotyczące precyzji określone w rozdziale 1.2.2.2 nie muszą być spełnione w przypadku półilościowych metod przesiewowych. Należy jednak określić precyzję w celu udowodnienia, że dana metoda umożliwia uniknięcie fałszywie zgodnych wyników analiz. A: substancje zakazane lub niedopuszczone B: substancje dopuszczone

2.2. Poprawność, powtarzalność i odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna

W niniejszym rozdziale podano przykłady i odniesienia dla procedur walidacji. Można zastosować inne podejścia w celu wykazania, że metoda jest zgodna z kryteriami wydajności, pod warunkiem że zapewniają one ten sam poziom i tę samą jakość informacji.

2.2.1. Walidacja konwencjonalna

Obliczanie parametrów zgodnie z metodami konwencjonalnymi wymaga przeprowadzenia szeregu indywidualnych doświadczeń. Dla każdej większej zmiany należy określić każdy element charakterystyki wydajności (zob. rozdział 2.4). W przypadku metod wieloanalitowych kilka analitów można analizować równocześnie, o ile uprzednio wykluczy się ewentualne istotne interferencje. W podobny sposób można oznaczyć szereg elementów charakterystyki wydajności. W związku z tym, aby zminimalizować obciążenie pracą, zaleca się łączenie doświadczeń w największym możliwym zakresie (np. powtarzalność i odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjną ze specyficznością, analizą próbek zerowych w celu oznaczenia decyzyjnej wartości granicznej na potrzeby potwierdzenia i badaniem specyficzności).

2.2.1.1. Wyznaczanie poprawności na podstawie certyfikowanego materiału odniesienia

Zaleca się, by poprawność metody analitycznej wyznaczać na podstawie certyfikowanego materiału odniesienia (CRM). Procedura ta jest opisana szczegółowo w normie ISO 5725-4:1994 (2).

Przykład jest podany poniżej:

1. Należy przeanalizować sześć replik CRM zgodnie z instrukcjami dotyczącymi badań dla metody.

2. Należy ustalić stężenie analitu obecnego w każdej próbce replik.

3. Należy obliczyć średnią, odchylenie standardowe i współczynnik zmienności (%) dla tych sześciu replik.

4. Należy obliczyć poprawność, dzieląc wykryte średnie stężenie przez wartość certyfikowaną (mierzoną jako stężenie) i mnożąc przez 100, aby wyrazić wynik jako procent.

Poprawność (%) = (średnie wykryte stężenie z uwzględnieniem odzysku) × 100/wartość certyfikowana

2.2.1.2. Wyznaczanie poprawności na podstawie próbek wzbogaconych

W przypadku niedostępności certyfikowanego materiału odniesienia poprawność metody wyznacza się, przeprowadzając doświadczenia z wykorzystaniem wzbogaconej matrycy zerowej, które powinny być zgodne z co najmniej następującym schematem:

1. W przypadku metod zwalidowanych od dnia wejścia w życie niniejszego rozporządzenia należy wybrać materiał zerowy i wzbogacić go przy stężeniu równym: a) 0,5- (3), 1,0- i 1,5-krotności RPA; lub b) 0,1- (4), 1,0- i 1,5-krotności MLP lub MZ w przypadku substancji dopuszczonych; lub c) 1,0-, 2,0- i 3,0-krotności LCL (najniższy poziom skalibrowany) w przypadku substancji niedopuszczonych (w odniesieniu do których nie ustalono RPA).

2. Na każdym poziomie analizę należy wykonać z co najmniej sześcioma replikami.

3. Należy przeanalizować próbki.

4. Należy obliczyć stężenie wykryte w poszczególnych próbkach.

5. Należy obliczyć poprawność dla każdej próbki za pomocą poniższego równania, a następnie obliczyć średnią poprawność i współczynnik zmienności dla sześciu wyników na każdym poziomie stężenia.

Poprawność (%) = (średnie wykryte stężenie z uwzględnieniem odzysku) × 100/poziom wzbogacenia

W przypadku metod dotyczących substancji dopuszczonych zwalidowanych przed datą rozpoczęcia stosowania niniejszego rozporządzenia wystarczające jest określenie poprawności metody z wykorzystaniem 6 wzbogaconych podwielokrotności przy 0,5-, 1,0- i 1,5-krotności MLP lub MZ.

2.2.1.3. Powtarzalność

1. W przypadku metod zwalidowanych od dnia wejścia w życie niniejszego rozporządzenia należy przygotować zestaw próbek o takich samych matrycach zerowych tego samego gatunku. Należy je wzbogacić analitem tak, aby uzyskać stężenia równe: a) 0,5- (5), 1,0- i 1,5-krotności RPA; b) 0,1- (6), 1,0- i 1,5-krotności MLP lub MZ w przypadku substancji dopuszczonych; lub c) 1,0-, 2,0- i 3,0-krotności LCL w przypadku substancji niedopuszczonych lub zakazanych, jeżeli RPA nie ma zastosowania.

2. Na każdym poziomie analizę należy wykonać z co najmniej sześcioma replikami.

3. Należy przeanalizować próbki.

4. Należy obliczyć stężenie wykryte w poszczególnych próbkach.

5. Należy obliczyć średnie stężenie, odchylenie standardowe i współczynnik zmienności (%) dla próbek wzbogaconych.

6. Należy powtórzyć te kroki co najmniej dwukrotnie.

7. Należy obliczyć ogólne średnie stężenia, odchylenia standardowe (poprzez uśrednienie odchylenia standardowego podniesionego do kwadratu z poszczególnych przypadków i wyciągnięcie pierwiastka kwadratowego z tej wartości) oraz współczynniki zmienności dla próbek wzbogaconych. W przypadku metod dotyczących substancji dopuszczonych zwalidowanych przed datą wejścia w życie niniejszego rozporządzenia wystarczające jest określenie powtarzalności z wykorzystaniem wzbogaconych matryc przy stężeniach równych 0,5-, 1,0- i 1,5-krotności MLP lub MZ. Alternatywnie powtarzalność można obliczyć zgodnie z normą ISO 5725-2:2019 (7).

2.2.1.4. Odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna

1. W przypadku walidacji dokonanych po dacie wejścia w życie niniejszego rozporządzenia należy przygotować zestaw próbek określonego materiału badawczego (identyczne lub różne matryce), wzbogaconych analitem lub analitami tak, aby uzyskać stężenia równe: a) 0,5- 5, 1,0- i 1,5-krotności RPA; b) 0,1-(6), 1,0- i 1,5-krotności MLP lub MZ w przypadku substancji dopuszczonych; lub c) 1,0-, 2,0- i 3,0-krotności LCL w przypadku substancji niedopuszczonych lub zakazanych, jeżeli RPA nie ma zastosowania.

2. Należy wykonać analizę na każdym poziomie stężenia z co najmniej sześcioma replikami materiału zerowego.

3. Należy przeanalizować próbki.

4. Należy obliczyć stężenie wykryte w poszczególnych próbkach.

5. Należy powtórzyć te kroki co najmniej dwukrotnie z innymi partiami materiału zerowego, z innymi podmiotami i w jak najbardziej zróżnicowanych warunkach środowiskowych, np. z różnymi partiami odczynników, rozpuszczalników, w różnych temperaturach pokojowych, z użyciem różnych przyrządów lub przy zmianie innych parametrów.

6. Należy ustalić średnie stężenie, odchylenie standardowe i współczynnik zmienności (%) dla próbek wzbogaconych. W przypadku metod dotyczących substancji dopuszczonych zwalidowanych przed datą wejścia w życie niniejszego rozporządzenia wystarczające jest określenie odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej z wykorzystaniem wzbogaconych matryc przy stężeniach równych 0,5-, 1,0- i 1,5-krotności MLP lub MZ. Alternatywnie odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjną/precyzję pośrednią można również obliczyć zgodnie z normami ISO 5725-2:2019 i ISO 11843-1:1997 (8) oraz wytycznymi Komisji Kodeksu Żywnościowego CAC/GL 59-2006 (9).

2.2.2. Walidacja według modeli alternatywnych

Obliczanie parametrów zgodnie z modelami alternatywnymi wymaga wykonania planu doświadczeń. Plan doświadczeń należy sporządzić w oparciu o liczbę różnych gatunków i czynników poddanych badaniu. W związku z tym pierwszym etapem całej procedury walidacji jest analiza populacji objętych próbą, które będą badane w laboratorium w przyszłości, aby określić najważniejsze gatunki i czynniki, które mogą wpłynąć na wyniki pomiaru. Podejście oparte na czynnikach pozwala na ocenę niepewności pomiaru wyników badań uzyskanych w różnych warunkach badawczych w danym laboratorium, obejmujących np. przeprowadzanie analiz przez różnych analityków, z wykorzystaniem różnych przyrządów, różnych partii odczynników, różnych matryc, w różnych temperaturach, a także różny czas trwania analizy. Następnie należy wybrać zakres stężeń w sposób dostosowany do celu i zgodnie z MLP lub MZ w przypadku substancji dopuszczonych bądź RPA lub LCL w przypadku substancji zakazanych lub niedopuszczonych.

Celem podejścia opartego na czynnikach jest wyznaczenie wiarygodnych danych dotyczących precyzji i danych pomiarowych poprzez jednoczesne kontrolowanie zmienności wybranych czynników. Umożliwia ono ocenę łącznego wpływu efektów czynnikowych i efektów losowych. Układ doświadczalny pozwala także na zbadanie odporności (10) metody analitycznej i ustalenie odchylenia standardowego wewnętrznej odtwarzalności w poszczególnych matrycach.

Poniżej podano przykład alternatywnego podejścia wykorzystującego ortogonalny plan układu doświadczalnego.

Można zbadać do siedmiu czynników (czynniki szumu). Badanie jest zaprojektowane w taki sposób, aby precyzję, poprawność (w oparciu o próbki wzbogacone), czułość, niepewność pomiaru i stężenia krytyczne można było określić jednocześnie poprzez wykonanie planu doświadczeń.

Tabela 6

Przykład ortogonalnego planu układu doświadczalnego z 7 czynnikami (I–VII) zróżnicowanymi na dwóch poziomach (A/B) w badaniu walidacyjnym obejmującym 8 prób (kombinacja poziomów czynnika)

Czynnik I II III IV V VI VII Próba 01 A A A A A A A Próba 02 A A B A B B B Próba 03 A B A B A B B Próba 04 A B B B B A A Próba 05 B A A B B A B Próba 06 B A B B A B A Próba 07 B B A A B B A Próba 08 B B B A A A B

Obliczanie elementów charakterystyki metody odbywa się zgodnie z opisem w Jülicher et al. (11).

2.2.3. Inne podejścia do walidacji

Można zastosować inne podejścia w celu wykazania, że metoda jest zgodna z kryteriami wydajności na potrzeby charakterystyki wydajności, pod warunkiem że zapewniają one ten sam poziom i tę samą jakość informacji. Walidację można również przeprowadzić poprzez wykonanie międzylaboratoryjnego badania porównawczego ustanowionego przez Kodeks Żywnościowy, ISO lub IUPAC (12) bądź zgodnie z metodą alternatywną, taką jak badanie w pojedynczym laboratorium lub walidacja wewnętrzna (13). W przypadku stosowania alternatywnych procedur walidacji będący podstawą model i strategię z odpowiednimi warunkami wstępnymi, założenia i wzory należy opisać w protokole walidacji lub przynajmniej należy podać odniesienia do ich dostępności.

2.3. Selektywność/specyficzność

Należy ustalić w możliwe najszerszym zakresie zdolność odróżniania analitu od blisko spokrewnionych z nim substancji. Należy określić interferencję homologów, izomerów, produktów degradacji, substancji endogennych, analogów, metabolitów danej pozostałości, związków matrycowych lub każdej innej substancji mogącej powodować interferencję, a w razie potrzeby metodę należy zmienić w celu uniknięcia zidentyfikowanych interferencji. Do określenia specyficzności metody stosuje się następujące podejście:

1. Należy wybrać szereg chemicznie spokrewnionych związków lub innych substancji, które prawdopodobnie mogą współwystępować z danym związkiem i mogą być obecne w próbkach, oraz zweryfikować, czy mogą zakłócać analizę docelowego analitu lub docelowych analitów.

2. Należy przeanalizować odpowiednią liczbę reprezentatywnych próbek zerowych, np. różnie partie lub partie różnych gatunków zwierząt (n ≥ 20), i sprawdzić, czy występują jakiekolwiek interferencje sygnałów, pików lub śladów jonów w danym regionie, w którym docelowy analit ma być eluowany.

3. Należy wzbogacić reprezentatywne próbki zerowe przy odpowiednim stężeniu substancjami, które mogą zakłócać identyfikację lub kwantyfikację analitu, oraz sprawdzić, czy dodana substancja: a) może prowadzić do mylnej identyfikacji; b) zakłóca identyfikację docelowego analitu; c) znacząco wpływa na kwantyfikację.

2.4. Odporność

Metodę analityczną należy zbadać pod kątem jej ciągłej wydajności w różnych warunkach doświadczalnych, które obejmują np. różne warunki pobierania próbek oraz niewielkie zmiany, które mogą wystąpić w badaniach rutynowych. W celu zbadania odporności metody zmiany wprowadzone w warunkach doświadczalnych powinny być niewielkie. Należy ocenić wagę tych zmian. Każdy element charakterystyki wydajności należy ustalić dla wszystkich niewielkich zmian wykazujących istotny wpływ na wydajność analizy.

2.5. Stabilność

Jako że niestabilność może wpłynąć na wyniki badania, należy określić stabilność wzorca kalibracji, wzorca przygotowanego w ekstrakcie z matrycy lub wzorców przygotowanych z matrycy wzbogaconej przed ekstrakcją, a także analitu lub składników matrycy w próbce podczas przechowywania lub analizy.

Zazwyczaj stabilność analitu jest dobrze określona dla różnych warunków przechowywania. Wymaganych informacji mogą dostarczyć doświadczenia przeprowadzane w celu monitorowania warunków przechowywania wzorców i próbek, które wykonuje się w ramach normalnego systemu akredytacji i kontroli jakości laboratorium. Jeżeli dane dotyczące stabilności analitów w matrycy są dostępne (np. można je uzyskać z laboratoriów referencyjnych UE, dane te są publicznie dostępne itp.), nie muszą one być wyznaczane przez każde laboratorium. Wykorzystanie dostępnych danych dotyczących stabilności analitów w roztworze i matrycy jest jednak dopuszczalne wyłącznie w przypadku zastosowania identycznych warunków.

W przypadku gdy wymagane dane dotyczące stabilności nie są dostępne, należy zastosować poniższe podejścia.

2.5.1. Oznaczanie stabilności analitu w roztworze

1. Należy sporządzić świeże roztwory podstawowe analitu lub analitów i rozcieńczyć zgodnie z instrukcjami dotyczącymi badań w celu uzyskania wystarczającej liczby podwielokrotności (np. 40) dla każdego wybranego stężenia. Próbki powinny być przygotowane z: a) roztworów analitu, które wykorzystuje się do wzbogacania; b) roztworów analitu, które wykorzystuje się do ostatecznej analizy; c) wszelkich innych roztworów będących przedmiotem zainteresowania (np. derywatyzowanych wzorców).

2. Należy zmierzyć zawartość analitu w świeżo sporządzonym roztworze zgodnie z instrukcjami dotyczącymi badań.

3. Należy dozować właściwe ilości do odpowiednich pojemników, umieścić etykiety i przechowywać zgodnie z warunkami dotyczącymi światła i temperatury określonymi na schemacie przedstawionym w tabeli 7. Czas przechowywania należy ustalić z uwzględnieniem stosowanej praktyki analitycznej, przy czym proces przechowywania powinien się optymalnie zakończyć z chwilą zaobserwowania pierwszych oznak degradacji podczas identyfikacji lub kwantyfikacji. Jeżeli podczas badania stabilności nie zostaną zaobserwowane żadne oznaki degradacji, czas przechowywania w ramach badania stabilności powinien być równy maksymalnemu okresowi przechowywania roztworu.

4. Należy obliczyć stężenie analitu lub analitów w każdej podwielokrotności w porównaniu ze stężeniem analitu w świeżo sporządzonym roztworze, zgodnie z poniższym wzorem: pozostały analit (%) = Ci × 100/Cświeży Ci = stężenie w punkcie czasowym i Cświeży = stężenie świeżego roztworu Średnia wartość pięciu roztworów replik, które były przechowywane, nie może się różnić o więcej niż 15 % od średniej wartości pięciu świeżo przygotowanych roztworów replik. Jako podstawę do obliczenia różnicy procentowej należy zastosować średnią wartość pięciu świeżo przygotowanych roztworów. Tabela 7 Schemat oznaczania stabilności analitu w roztworze -20 °C + 4 °C + 20 °C Ciemno 10 podwielokrotności 10 podwielokrotności 10 podwielokrotności Jasno 10 podwielokrotności

2.5.2. Oznaczanie stabilności analitu lub analitów w matrycy

1. Jeżeli istnieje taka możliwość, należy wykorzystać pobrane próbki. Jeżeli nie jest dostępna żadna pobrana matryca, wykorzystuje się matrycę zerową wzbogaconą analitem.

2. Jeżeli dostępna jest pobrana matryca, określa się stężenie w matrycy, gdy jest ona jeszcze świeża. Kolejne podwielokrotności homogenizowanej pobranej matrycy przechowuje się w temperaturze -20 °C lub niższej, jeśli jest to wymagane, i określa się stężenia analitu, dopóki próbka znajduje się w laboratorium.

3. Jeżeli nie jest dostępna żadna pobrana matryca, należy zhomogenizować matrycę zerową. Matrycę należy podzielić na pięć podwielokrotności. Każdą podwielokrotność należy wzbogacić analitem, który najlepiej jest przygotować w niewielkiej ilości roztworu wodnego. Jedną podwielokrotność należy przeanalizować bezzwłocznie. Pozostałe podwielokrotności należy przechowywać w temperaturze co najmniej -20 °C lub w razie potrzeby niższej i przeanalizować po krótko-, średnio- i długoterminowym przechowywaniu, biorąc pod uwagę zastosowane metody analityczne.

4. Należy odnotować maksymalny dopuszczalny czas przechowywania i optymalne warunki przechowywania. Średnia wartość pięciu roztworów replik, które były przechowywane, nie może się różnić o więcej, niż wynosi odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna metody, od średniej wartości pięciu świeżo przygotowanych roztworów replik. Jako podstawę do obliczenia różnicy procentowej należy zastosować średnią wartość pięciu świeżo przygotowanych roztworów.

2.6. Decyzyjna wartość graniczna na potrzeby potwierdzenia (CCα)

CCα ustala się dla metod potwierdzających. CCα należy ustalić w warunkach zgodnych z wymogami dotyczącymi identyfikacji lub identyfikacji z kwantyfikacją określonymi w rozdziale 1 „Kryteria wydajności i inne wymogi dla metod analitycznych”.

W celu kontroli zgodności próbek złożona standardowa niepewność pomiaru została już uwzględniona w wartości CCα (decyzyjna wartość graniczna na potrzeby potwierdzenia).

1. W przypadku niedopuszczonych lub zakazanych substancji farmakologicznie czynnych CCα oblicza się w następujący sposób: a) Metoda 1: poprzez procedurę krzywej wzorcowej zgodnie z normą ISO 11843-1:1997 (14) (określoną tutaj jako wartość krytyczna zmiennej stanu netto). W tym przypadku należy użyć materiału zerowego, który zostaje wzbogacony na poziomie i powyżej RPA lub LCL w jednakowo odległych krokach. Należy przeanalizować próbki. Po identyfikacji należy sporządzić wykres sygnału, o ile to możliwe, lub ponownie obliczonego stężenia w stosunku do dodanego stężenia. Odpowiadające stężenie w punkcie przecięcia z osią y plus 2,33-krotność odchylenia standardowego odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej w punkcie przecięcia równa się decyzyjnej wartości granicznej. Metodę tę stosuje się wyłącznie do analiz ilościowych. Decyzyjne wartości graniczne uzyskane w ramach tego podejścia należy zweryfikować poprzez analizę matrycy zerowej wzbogaconej na poziomie obliczonej decyzyjnej wartości granicznej. b) Metoda 2: analizując co najmniej 20 reprezentatywnych materiałów zerowych dla każdej matrycy, aby móc obliczyć stosunek sygnału do szumu w oknie czasowym, w którym spodziewany jest analit. Jako decyzyjną wartość graniczną można wykorzystać trzykrotność stosunku sygnału do szumu. Metodę tę stosuje się do analiz ilościowych i jakościowych. Decyzyjne wartości graniczne uzyskane w ramach tego podejścia należy zweryfikować poprzez analizę matrycy zerowej wzbogaconej na poziomie obliczonej decyzyjnej wartości granicznej. c) Metoda 3: CCα = LCL + k (jednostronny, 99 %) × (złożona) standardowa niepewność pomiaru na poziomie LCL W przypadku niedopuszczonych lub zakazanych substancji farmakologicznie czynnych w zależności od doświadczenia dotyczącego walidacji (i jego odpowiednich stopni swobody) można rozsądnie zastosować rozkład t lub – jeżeli za podstawę przyjmuje się rozkład Gaussa (jednostronny, n=∞) – należy zastosować współczynnik k równy 2,33. Odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna i poprawność są odpowiednie do określenia (złożonej) standardowej niepewności pomiaru, jeżeli zostały wyznaczone z uwzględnieniem wszystkich odpowiednich oddziałujących czynników. Metodę 2 służącą do obliczania CCα można stosować wyłącznie do dnia 1 stycznia 2026 r. w przypadku metod zwalidowanych przed datą wejścia w życie niniejszego rozporządzenia. W przypadku metod zwalidowanych po dacie wejścia w życie niniejszego rozporządzenia należy stosować wyłącznie metody 1 lub 3.

2. W przypadku substancji dopuszczonych CCα oblicza się w następujący sposób: a) W przypadku substancji dopuszczonych w układach matryca/gatunek, dla których określono MLP lub MZ: (i) Metoda 1: poprzez procedurę krzywej wzorcowej zgodnie z normą ISO 11843-1:1997 (określoną tutaj jako wartość krytyczna zmiennej stanu netto). W tym przypadku należy użyć materiału zerowego, który zostaje wzbogacony na poziomie i powyżej MLP lub MZ w jednakowo odległych krokach. Należy przeanalizować próbki. Po identyfikacji należy sporządzić wykres sygnału, o ile to możliwe, lub ponownie obliczonego stężenia w stosunku do dodanego stężenia. Odpowiadające stężenie na poziomie MLP lub MZ plus 1,64-krotność odchylenia standardowego odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej przy dopuszczalnej wartości granicznej równa się decyzyjnej wartości granicznej (α = 5 %). (ii) Metoda 2: CCα = MLP (lub MZ) + k (jednostronny, 95 %) × (złożona) standardowa niepewność pomiaru na poziomie MLP lub MZ. W przypadku substancji dopuszczonych w zależności od doświadczenia dotyczącego walidacji (i jego odpowiednich stopni swobody) można rozsądnie zastosować rozkład t lub – jeżeli za podstawę przyjmuje się rozkład Gaussa (jednostronny, n=∞) – należy zastosować współczynnik k równy 1,64. Odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna i poprawność są odpowiednie do określenia (złożonej) standardowej niepewności pomiaru, jeżeli zostały wyznaczone z uwzględnieniem wszystkich odpowiednich oddziałujących czynników. W przypadku substancji farmakologicznie czynnych, dla których MLP jest ustalony dla sumy różnych substancji, w celu oceny sumy substancji w mierzonej próbce – jako CCα należy stosować CCα substancji o najwyższym stężeniu w próbce. b) W przypadku substancji dopuszczonych w układach matryca/gatunek, dla których nie określono MLP, pozostałości nie występują, chyba że miało miejsce dopuszczone leczenie, o którym mowa w art. 11 dyrektywy 2001/82/WE. W przypadku substancji dopuszczonych, w odniesieniu do których nie wyznaczono MLP, do celów obliczenia CCα należy wykorzystać kaskadowy MLP wyznaczony zgodnie z rozporządzeniem wykonawczym Komisji (UE) 2018/470 (15). Należy zastosować metodę 1 lub 2 określone w powyższym punkcie, jednak „MLP” odpowiada „0,5-krotności kaskadowego MLP, przy docelowym założeniu 0,1-krotności kaskadowego MLP, jeżeli jest to racjonalnie wykonalne”.

2.7. Zdolność wykrywania w badaniach przesiewowych(CCβ)

CCβ ustala się dla metod przesiewowych. CCβ należy ustalić zgodnie z rozdziałem 1 niniejszego załącznika „Kryteria wydajności i inne wymogi dla metod analitycznych” oraz z uwzględnieniem wymogów zawartych w tabeli 5. Pełne wymogi w zakresie identyfikacji (por. rozdziały 1.2.3, 1.2.4 i 1.2.5) nie muszą być jednak stosowane w odniesieniu do metod przesiewowych.

1. W przypadku niedopuszczonych lub zakazanych substancji farmakologicznie czynnych należy zapewnić, by błąd β wynosił maksymalnie 5 %. CCβ oblicza się w następujący sposób: a) Metoda 1: procedura krzywej wzorcowej zgodnie z normą ISO 11843-1:1997 (określona tutaj jako minimalna wykrywalna wartość zmiennej stanu netto). W tym przypadku należy użyć reprezentatywnego materiału zerowego, który zostaje wzbogacony na poziomie RPA i poniżej lub – jeżeli nie wyznaczono RPA – około STC (przesiewowe stężenie docelowe), w jednakowo odległych krokach. Należy przeanalizować próbki. Należy sporządzić wykres sygnału w stosunku do dodanego stężenia. Odpowiadające stężenie na poziomie STC plus 1,64-krotność odchylenia standardowego odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej średniej zmierzonej zawartości przy STC równa się zdolności wykrywania. Ekstrapolację znacznie poniżej najniższego poziomu wzbogacania (< 50 % najniższego poziomu wzbogacania) należy potwierdzić danymi doświadczalnymi na etapie walidacji. b) Metoda 2: badanie wzbogaconego materiału zerowego przy stężeniu na poziomie STC i powyżej. Dla każdego poziomu stężenia należy przeanalizować 20 wzbogaconych próbek zerowych w celu zapewnienia rzetelnej podstawy tego oznaczenia. Poziom stężenia, przy którym pozostaje jedynie ≤ 5 % fałszywie zgodnych wyników, równa się zdolności wykrywania metody. c) Metoda 3: CCβ = STC + k (jednostronny, 95 %) × (złożona) standardowa niepewność pomiaru na poziomie lub powyżej STC W przypadku niedopuszczonych lub zakazanych substancji farmakologicznie czynnych w zależności od doświadczenia dotyczącego walidacji (i jego odpowiednich stopni swobody) można rozsądnie zastosować rozkład t lub – jeżeli za podstawę przyjmuje się rozkład Gaussa (jednostronny, n=∞) – należy zastosować współczynnik k równy 1,64. Odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna i poprawność są odpowiednie do określenia (złożonej) standardowej niepewności pomiaru, jeżeli zostały wyznaczone z uwzględnieniem wszystkich odpowiednich oddziałujących czynników.

2. W przypadku substancji dopuszczonych należy zapewnić, by błąd β wynosił maksymalnie 5 %. CCβ oblicza się w następujący sposób: a) Metoda 1: poprzez procedurę krzywej wzorcowej zgodnie z normą ISO 11843-1:1997 (określoną tutaj jako minimalna wykrywalna wartość zmiennej stanu netto). W tym przypadku należy użyć reprezentatywnego materiału zerowego, który zostaje wzbogacony na poziomie dopuszczalnej wartości granicznej i poniżej, począwszy od STC, w jednakowo odległych krokach. Należy przeanalizować próbki i zidentyfikować analit lub anality. Należy obliczyć odchylenie standardowe średniej zmierzonej zawartości przy STC. Odpowiadające stężenie na poziomie STC plus 1,64-krotność odchylenia standardowego odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej średniej zmierzonej zawartości przy STC równa się zdolności wykrywania. b) Metoda 2: poprzez badanie wzbogaconego materiału zerowego przy poziomach stężenia poniżej dopuszczalnej wartości granicznej Dla każdego poziomu stężenia należy przeanalizować 20 wzbogaconych próbek zerowych w celu zapewnienia rzetelnej podstawy tego oznaczenia. Poziom stężenia, przy którym pozostaje jedynie ≤ 5 % fałszywie zgodnych wyników, równa się zdolności wykrywania metody. c) Metoda 3: CCβ = STC + k (jednostronny, 95 %) × (złożona) standardowa niepewność pomiaru na poziomie STC lub powyżej W przypadku substancji dopuszczonych w zależności od doświadczenia dotyczącego walidacji (i jego odpowiednich stopni swobody) można rozsądnie zastosować rozkład t lub – jeżeli za podstawę przyjmuje się rozkład Gaussa (jednostronny, n=∞) – należy zastosować współczynnik k równy 1,64 (niezależnie od tego, czy w ramach zastosowania kaskadowego, czy też w ramach zwykłego zastosowania MLP). Odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna i poprawność są odpowiednie do określenia (złożonej) standardowej niepewności pomiaru, jeżeli zostały wyznaczone z uwzględnieniem wszystkich odpowiednich oddziałujących czynników. W przypadku substancji farmakologicznie czynnych, dla których MLP jest ustalony dla sumy różnych substancji, jako CCβ w celu oceny sumy substancji w mierzonej próbce należy stosować CCβ substancji o najwyższym stężeniu w próbce.

2.8. Krzywe wzorcowe

W przypadku stosowania krzywych wzorcowych do kwantyfikacji:

1) w budowaniu krzywej należy wykorzystać co najmniej pięć poziomów (w tym poziom zero), najlepiej równo od siebie oddalonych;

2) należy opisać zakres roboczy krzywej;

3) należy opisać wzór matematyczny krzywej oraz zgodność danych z krzywą (współczynnik determinacji R2);

4) należy opisać zakresy akceptowalności dla parametrów krzywej.

W przypadku krzywych wzorcowych opartych na roztworze wzorcowym, wzorcach przygotowanych w ekstrakcie z matrycy lub wzorcach przygotowanych z matrycy wzbogaconej przed ekstrakcją należy wskazać dopuszczalne zakresy dla parametrów krzywej wzorcowej, które mogą się różnić w zależności od serii.

2.9. Odzysk bezwzględny

Odzysk bezwzględny metody należy ustalić wówczas, gdy nie zastosowano żadnego wzorca wewnętrznego ani kalibracji z użyciem wzorca przygotowanego z matrycy wzbogaconej przed ekstrakcją.

Jeżeli wymogi dotyczące poprawności są spełnione zgodnie z tabelą 1, można zastosować stały współczynnik korekty. W przeciwnym razie należy zastosować współczynnik odzysku uzyskany dla tej konkretnej partii. Alternatywnie zamiast współczynnika korekty odzysku stosuje się procedurę dodawania wzorca (16) lub wzorzec wewnętrzny.

Odzysk bezwzględny oblicza się dla co najmniej sześciu reprezentatywnych partii matrycy.

Podwielokrotność matrycy zerowej należy wzbogacić analitem przed ekstrakcją, a drugą podwielokrotność matrycy zerowej należy wzbogacić po przygotowaniu próbki przy odpowiednim poziomie stężenia oraz ustalić stężenie analitu.

Odzysk oblicza się w następujący sposób:

Odzysk (analitu) = (wzorzec przygotowany z matrycy wzbogaconej przed ekstrakcją)/(wzorzec przygotowany w ekstrakcie z matrycy) × 100

2.10. Względne efekty matrycowe

Względne efekty matrycowe należy określić we wszystkich przypadkach. Może się to odbyć w ramach procesu walidacji albo odrębnych doświadczeń. Względny efekt matrycowy oblicza się dla co najmniej 20 różnych próbek zerowych (matryca/gatunek) zgodnie z zakresem metody, np. ujmując różne gatunki.

Matrycę zerową należy wzbogacić po ekstrakcji analitem na poziomie RPA, MLP lub MZ oraz poddać analizie wraz z czystym roztworem analitu.

Względny efekt matrycowy lub współczynnik matrycy (MF) oblicza się w następujący sposób:

IS: wzorzec wewnętrzny

MMS: wzorzec przygotowany w ekstrakcie z matrycy

Współczynnik zmienności nie może być większy niż 20 % dla MF (wzorca znormalizowanego dla IS).

ROZDZIAŁ 3

KONTROLA JAKOŚCI PODCZAS RUTYNOWYCH ANALIZ – CIĄGŁA WERYFIKACJA WYDAJNOŚCI METODY

Spełnione muszą być wymagania dotyczące zapewniania jakości wyników analiz określone w rozdziale 7.7 normy ISO/IEC 17025:2017 (17).

Podczas rutynowych analiz preferowaną formą dowodu potwierdzającego wydajność metody jest analiza certyfikowanego materiału odniesienia (CRM). Ponieważ CRM, które zawierają odpowiednie anality przy wymaganych poziomach stężenia, są rzadko dostępne, jako wariant alternatywny można wykorzystać również materiały odniesienia dostarczone i scharakteryzowane przez laboratoria referencyjne UE lub laboratoria posiadające akredytację ISO/IEC 17043:2010 (18). Innym wariantem alternatywnym są wewnętrzne materiały odniesienia podlegające regularnej kontroli.

Ciągłą weryfikację wydajności metody podczas rutynowych analiz należy przeprowadzać na etapie badania przesiewowego i etapie potwierdzania.

1. Etap badania przesiewowego W przypadku każdej serii (partii) przeprowadzonych analiz należy jednocześnie przeanalizować zestaw następujących próbek do celów kontroli jakości: a) próbkę kontrolną służącą do oceny przydatności przyrządu do pracy w systemie, najlepiej specyficzną dla danej metody; b) próbki do celów kontroli jakości wzbogacone na poziomie stężenia bliskiego STC, a najlepiej na poziomie CCβ w badaniach przesiewowych w przypadku dopuszczonych substancji farmakologicznie czynnych, a także w przypadku substancji zakazanych lub niedopuszczonych; c) zgodne próbki kontrolne (próbki zerowe) oraz – w stosownych przypadkach – odczynniki do próbek zerowych.

2. Etap potwierdzenia W przypadku każdej serii (partii) przeprowadzonych analiz należy jednocześnie przeanalizować zestaw następujących próbek do celów kontroli jakości: a) próbkę kontrolną służącą do oceny przydatności przyrządu do pracy w systemie, najlepiej specyficzną dla danej metody; b) próbki do celów kontroli jakości wzbogacone na poziomie stężenia bliskiego MLP lub MZ w przypadku dopuszczonych substancji farmakologicznie czynnych bądź bliskiego RPA lub LCL w przypadku substancji zakazanych lub niedopuszczonych (niezgodne próbki kontrolne); c) zgodne próbki kontrolne (próbki zerowe) oraz – w stosownych przypadkach – odczynniki do próbek zerowych.

Zaleca się następującą kolejność w przypadku próbek do celów kontroli jakości: próbka kontrolna służąca do oceny przydatności przyrządu do pracy w systemie, zgodna próbka kontrolna, próbka lub próbki do potwierdzenia, ponownie zgodna próbka kontrolna oraz wzbogacona próbka do celów kontroli jakości (niezgodne próbki kontrolne).

W przypadku metod ilościowych w odniesieniu do każdej partii próbek urzędowych należy przeanalizować i zmierzyć krzywą wzorcową przed wyżej wymienionymi próbkami lub po tych próbkach.

W miarę możliwości należy ocenić poprawność (na podstawie próbek wzbogaconych) wszystkich docelowych analitów w niezgodnych próbkach kontrolnych za pośrednictwem tabel kontroli jakości zgodnie z rozdziałem 7.7 normy ISO/IEC 17025:2017. Jeżeli wymaga to nieproporcjonalnie dużej liczby oznaczeń poprawności, liczbę analitów można zmniejszyć do liczby analitów reprezentatywnych.

ROZDZIAŁ 4

ROZSZERZENIE ZWALIDOWANEGO ZAKRESU UPRZEDNIO ZWALIDOWANEJ METODY

Czasami konieczne jest rozszerzenie zakresu uprzednio kompleksowo zwalidowanej metody. W takich przypadkach zakres powinien zostać rozszerzony w sposób skuteczny i uzasadniony z analitycznego punktu widzenia. Cel ten można osiągnąć, dokonując walidacji na zmniejszonej liczbie próbek (np. połowie liczby próbek) w porównaniu z pełną walidacją.

Rodzaj i liczbę zmian, które mają zostać zwalidowane w ramach pojedynczego ograniczonego schematu walidacji, należy jednak każdorazowo ustalić w oparciu o wiedzę specjalistyczną i wcześniejsze doświadczenia, np. zmiana techniki wykrywania wymagałaby w każdym przypadku pełnej walidacji.

Co do zasady w celu zapewnienia ciągłości ważności metody jej wydajność należy stale monitorować i porównywać z pierwotnie uzyskanymi parametrami walidacyjnymi. W idealnym scenariuszu ciągła kontrola wydajności metody powinna być zaplanowana w taki sposób, by brakujące dane na potrzeby pełnej walidacji mogły być gromadzone w czasie (np. za pomocą kilku punktów danych pochodzących z próbek do celów kontroli jakości w każdej serii analitycznej).

4.1. Rozszerzenie zakresu metod w odniesieniu do zakresu stężeń

Ze względu na zmiany MLP, MZ i RPA konieczne może być dostosowanie zakresu stężenia, w odniesieniu do którego metoda została zwalidowana. W takim przypadku dopuszcza się zastosowanie ograniczonego schematu walidacji.

Krzywe wzorcowe w odniesieniu do zmienionego zakresu należy sporządzić zgodnie ze zwalidowaną procedurą. Należy przeanalizować różne partie wzbogacone na różnych poziomach stężenia (por. rozdziały 2.2.1 i 2.2.2). Wartości poprawności, powtarzalności i odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej/precyzji pośredniej powinny mieścić się w dopuszczalnym zakresie w porównaniu z odpowiadającymi wartościami w ramach pierwotnie zwalidowanej metody. W stosownych przypadkach należy ponownie obliczyć CCβ (metody przesiewowe) oraz CCα (metody potwierdzające).

4.2. Rozszerzenie zakresu metod w odniesieniu do dodatkowych substancji

Co do zasady rozszerzenie zakresu metody na dodatkowe związki możliwe jest wyłącznie w przypadku analitów, które są podobne pod względem struktury i cech charakterystycznych do analitów objętych już daną metodą analityczną. W takim przypadku dopuszcza się zastosowanie ograniczonego schematu walidacji. Podobnie nie dopuszcza się żadnych odstępstw od opisu metody.

Krzywe wzorcowe w odniesieniu do dodatkowych substancji należy sporządzić zgodnie ze zwalidowaną procedurą. Należy przeanalizować różne partie materiałów matrycowych wzbogacone na różnych poziomach stężenia (por. rozdziały 2.2.1 i 2.2.2). Wartości poprawności, powtarzalności i odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej/precyzji pośredniej powinny mieścić się w zakresie porównywalnym z zakresem odpowiadających wartości pozostałych analitów w ramach pierwotnie zwalidowanej metody oraz być zgodne z wymogami określonymi w rozdziale 1.2.2. Dla nowych analitów należy obliczyć CCβ (metody przesiewowe) oraz CCα (metody potwierdzające).

4.3. Rozszerzenie zakresu metod w odniesieniu do matryc/gatunków

Decyzja o włączeniu nowych matryc lub gatunków do zwalidowanej już metody analitycznej musi być zawsze podejmowana indywidualnie w oparciu o wiedzę i doświadczenie zdobyte do tej pory podczas stosowania tej metody oraz wstępne doświadczenia służące ocenie potencjalnych efektów matrycowych i interferencji. Co do zasady będzie to możliwe wyłącznie w przypadku matryc o podobnych właściwościach oraz w przypadku analitów niekrytycznych (stabilność, wykrywalność).

Krzywe wzorcowe (w doniesieniu do wzorca lub matrycy) należy sporządzić zgodnie ze zwalidowaną procedurą. Należy przeanalizować różne partie materiału matrycowego wzbogacone na różnych poziomach stężenia (por. rozdziały 2.2.1 i 2.2.2). Wartości poprawności, powtarzalności i odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej/precyzji pośredniej powinny mieścić się w dopuszczalnym zakresie porównywalnym z zakresem odpowiadających wartości w ramach pierwotnie zwalidowanej metody oraz być zgodne z wymogami określonymi w rozdziale 1.2.2. W zależności od podejścia walidacyjnego konieczne może być ponowne obliczenie CCβ (metody przesiewowe) lub CCα (metody potwierdzające).

Jeżeli wyniki nie mieszczą się w dopuszczalnym zakresie w porównaniu z wartościami osiągniętymi dla pierwotnej matrycy, konieczna jest dodatkowa pełna walidacja w celu określenia parametrów wydajności specyficznych dla danej matrycy/danego gatunku.

Jeżeli MLP dla danej substancji różnią się w przypadku określonych matryc, najprawdopodobniej trudno będzie dostosować zakres metody do dodatkowej matrycy/dodatkowego gatunku oraz stężenia, ponieważ w takim przypadku należy rozważyć dwie zmiany. W tego rodzaju przypadkach zaleca się pełną walidację.

(1) Chromatografia równoległa oznacza procedurę, w ramach której przed etapem (etapami) chromatografii ekstrakt próbki dzielony jest na dwie części. Część pierwsza jest poddawana badaniu chromatograficznemu bez zmian. Część drugą miesza się z wzorcem analitycznym, który ma zostać zmierzony. Następnie mieszaninę tę również poddaje się badaniu chromatograficznemu. Ilość dodanego wzorca analitycznego musi być podobna do szacunkowej ilości analitu w ekstrakcie. Chromatografia równoległa ma na celu poprawę identyfikacji analitu w przypadku użycia metod chromatograficznych, w szczególności jeżeli nie można wykorzystać żadnego odpowiedniego wzorca wewnętrznego.

(*) Przedstawione współczynniki zmienności (%) mają charakter orientacyjny i powinny być na najniższym racjonalnie osiągalnym poziomie.

(a) a Nie uzyskuje się żadnego dodatkowego punktu identyfikacyjnego w przypadku selekcji jonu macierzystego, jeżeli ten jon macierzysty jest tym samym jonem (lub adduktem bądź izotopem) co jon HRMS monitorowany techniką pełnoskanową.

(#) Jeżeli dane dotyczące stabilności analitów w matrycy można zaczerpnąć z literatury naukowej lub uzyskać z innego laboratorium, przedmiotowe laboratorium nie musi ponownie określać tych danych. Wykorzystanie dostępnych danych dotyczących stabilności analitów w roztworze jest jednak dopuszczalne wyłącznie w przypadku zastosowania identycznych warunków.

(*) Dotyczy metod MS, w których przypadku wymagane jest udowodnienie poprzez walidację, że wymogi dotyczące określonych elementów charakterystyki wydajności są spełnione. Względny efekt matrycowy metody należy określić wówczas, gdy nie został on oceniony w trakcie procedury walidacji. Odzysk bezwzględny metody należy ustalić wówczas, gdy nie zastosowano żadnego wzorca wewnętrznego ani kalibracji z użyciem wzorca przygotowanego z matrycy wzbogaconej przed ekstrakcją.

(2) ISO 5725-4:2020 Dokładność (poprawność i precyzja) metod pomiarowych i wyników pomiarów – Część 4: Podstawowe metody wyznaczania poprawności standardowej metody pomiarowej (klauzula 3).

(3) Jeżeli w przypadku niedozwolonej substancji farmakologicznie czynnej walidacja stężenia równego 0,5-krotności RPA nie jest racjonalnie osiągalna, stężenie równe 0,5-krotności RPA można zastąpić najniższym stężeniem równym 0,5–1,0-krotności RPA, które jest racjonalnie osiągalne.

(4) Jeżeli w przypadku określonej substancji farmakologicznie czynnej walidacja stężenia równego 0,1-krotności MLP nie jest racjonalnie osiągalna, stężenie równe 0,1-krotności MLP można zastąpić najniższym stężeniem równym 0,1–0,5-krotności MLP, które jest racjonalnie osiągalne.

(5) Jeżeli w przypadku niedozwolonej substancji farmakologicznie czynnej walidacja stężenia równego 0,5-krotności RPA nie jest racjonalnie osiągalna, stężenie równe 0,5-krotności RPA można zastąpić najniższym stężeniem równym 0,5–1,0-krotności RPA, które jest racjonalnie osiągalne.

(6) Jeżeli w przypadku określonej substancji farmakologicznie czynnej walidacja stężenia równego 0,1-krotności MLP nie jest racjonalnie osiągalna, stężenie równe 0,1-krotności MLP można zastąpić najniższym stężeniem równym 0,1–0,5-krotności MLP, które jest racjonalnie osiągalne.

(7) ISO 5725-2:2019 Dokładność (poprawność i precyzja) metod pomiarowych i wyników pomiarów – Część 2: Podstawowa metoda określania powtarzalności i odtwarzalności standardowej metody pomiarowej (klauzula 3).

(8) ISO 11843-1:1997 Zdolność wykrywania – Część 1: Terminologia.

(9) Komisja Kodeksu Żywnościowego, Organizacja Narodów Zjednoczonych ds. Wyżywienia i Rolnictwa, Światowa Organizacja Zdrowia, Guidelines on estimation of uncertainty of results (Wytyczne dotyczące szacowania niepewności wyników) (CAC/GL 59-2006).

(10) Zmiany określonych w nim warunków doświadczalnych mogą dotyczyć materiałów tworzących próbkę, analitów, warunków przechowywania, warunków środowiskowych lub warunków przygotowywania próbek. Dla wszystkich warunków doświadczalnych, które w praktyce mogłyby ulegać zmianom (np. stabilność odczynników, skład próbki, pH, temperatura), należy wskazać wszystkie odchylenia, które mogłyby mieć wpływ na wynik analizy.

(11) Jülicher, B., Gowik, P. i Uhlig, S., „Assessment of detection methods in trace analysis by means of a statistically based in-house validation concept” (Ocena metod wykrywania w analizie śladowej na podstawie opartej na statystyce koncepcji wewnętrznej walidacji), 1998, Analyst, 120, s. 173.

(12) IUPAC, „Protocol for the design, conduct and interpretation of method-performance studies” (Protokół dotyczący opracowywania, przeprowadzania i interpretowania badań skuteczności analitycznej), 1995, Pure & Applied Chem, 67, s. 331.

(13) Gowik, P., Jülicher, B. i Uhlig, S., „Multi-residue method for non-steroidal anti-inflammatory drugs in plasma using high performance liquid chromatography-photodiode-array detection. Method description and comprehensive in-house validation” (Metoda wielopozostałościowa dotycząca niesteroidowych leków przeciwzapalnych w osoczu z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detektorem z matrycą fotodiodową. Opis metody i kompleksowa walidacja wewnętrzna), 1998, J. Chromatogr., 716, s. 221.

(14) ISO 11843-1:1997 Zdolność wykrywania – Część 1: Terminologia.

(15) Rozporządzenie wykonawcze Komisji (UE) 2018/470 z dnia 21 marca 2018 r. w sprawie szczegółowych przepisów dotyczących maksymalnych limitów pozostałości, które należy uwzględniać do celów kontroli środków spożywczych uzyskanych ze zwierząt leczonych w UE na podstawie art. 11 dyrektywy 2001/82/WE (Dz.U. L 79 z 22.3.2018, s. 16).

(16) Ilość dodanego wzorca analitycznego może być na przykład dwa do pięciu razy większa od szacowanej ilości analitu w próbce. Procedura ta ma na celu ustalenie zawartości analitu w próbce, uwzględniając odzysk procedury analitycznej.

(17) ISO/IEC 17025: 2017 Ogólne wymagania dotyczące kompetencji laboratoriów badawczych i wzorcujących (rozdział 7.7).

(18) ISO/IEC 17043:2010 Ocena zgodności – Ogólne wymagania dotyczące badania biegłości.