19)

w części C dodaje się rozdziały w brzmieniu: „C.47 Badanie toksycznego wpływu substancji na ryby we wczesnych stadiach rozwoju WPROWADZENIE 1. Niniejsza metoda badawcza jest równoważna metodzie opisanej w dotyczącej badań wytycznej OECD (TG) nr 210 (2013). Celem badań prowadzonych na rybach we wczesnych stadiach rozwoju jest określenie letalnego i subletalnego wpływu substancji chemicznych na badanych stadiach rozwoju i na badane gatunki. Badania pozwalają na uzyskanie informacji istotnych do celów oszacowania długoterminowego letalnego i subletalnego wpływu substancji chemicznej na inne gatunki ryb. 2. Dotycząca badań wytyczna nr 210 opiera się na wniosku Zjednoczonego Królestwa, który omówiono na posiedzeniu ekspertów OECD zorganizowanym w Medmenham (Zjednoczone Królestwo) w listopadzie 1988 r. i uaktualniono w 2013 r. celem odzwierciedlenia doświadczenia zdobytego podczas wykonywania tego badania i zaleceń z warsztatów OECD dotyczących badania toksyczności na rybach, które to warsztaty odbyły się we wrześniu 2010 r. (1). ZASADA BADANIA 3. Ryby we wczesnych stadiach rozwoju poddaje się narażeniu na działanie zakresu stężeń badanej substancji chemicznej rozpuszczonej w wodzie. Preferowane są warunki przepływowe; jeżeli jednak ich zapewnienie jest niemożliwe, dopuszczalne jest zastosowanie warunków półstatycznych. W celu uzyskania szczegółowych informacji należy zapoznać się z wytyczną OECD „Guidance document on aquatic toxicity testing of difficult substances and mixtures” (2). Badanie rozpoczyna się od umieszczenia zapłodnionych jaj w komorach badawczych i kontynuuje się je przez okres specyficzny dla danego gatunku potrzebny do osiągnięcia stadium młodocianego przez ryby kontrolne. Dokonuje się oceny letalnego i subletalnego wpływu i porównuje się go z wartościami kontrolnymi w celu określenia najniższego stężenia, przy którym obserwuje się zmiany (LOEC), aby ustalić (i) najwyższe stężenie, przy którym nie obserwuje się szkodliwych zmian (NOEC), lub (ii) ECx (np. EC10, EC20), stosując model regresji do oszacowania stężenia, które spowoduje zmianę mierzonego wpływu o x %. Zgłoszenie odpowiednich stężeń efektywnych i parametrów może zależeć od ram regulacyjnych. Badane stężenia powinny zawierać w swoim zakresie ECx, tak aby ECx wynikało raczej z interpolacji niż ekstrapolacji (definicje znajdują się w dodatku 1). INFORMACJE NA TEMAT BADANEJ SUBSTANCJI CHEMICZNEJ 4. Badana substancja chemiczna oznacza substancję będącą przedmiotem badania. Rozpuszczalność w wodzie (zob. rozdział A.6 niniejszego załącznika) i prężność par (zob. rozdział A.4 niniejszego załącznika) badanej substancji chemicznej powinna być znana, przy czym należy przyjąć wiarygodną metodę analityczną wykorzystywaną do oznaczania ilościowego zawartości substancji chemicznej w roztworach do badań o znanej i udokumentowanej dokładności i granicy oznaczalności. Chociaż wyniki badania ostrej toksyczności (zob. rozdziały C.1 lub C.49 niniejszego załącznika) nie są niezbędne do przeprowadzenia przedmiotowego badania, mogą one dostarczyć użytecznych informacji, zwłaszcza gdy zostały przeprowadzone na gatunku wybranym do tego badania. 5. Jeżeli daną metodę badawczą stosuje się do badania mieszaniny, należy w miarę możliwości jak najdokładniej scharakteryzować skład tej mieszaniny, np. podając nazwę chemiczną jej składników, ich ilości oraz właściwości specyficzne dla poszczególnych substancji (podobnie jak właściwości wspomniane powyżej). Przed zastosowaniem metody badawczej w badaniu regulacyjnym mieszaniny należy zastanowić się nad tym, czy wyniki uzyskane w wyniku jej stosowania będą możliwe do zaakceptowania w odniesieniu do założonego celu regulacyjnego. 6. Użyteczne informacje obejmują wzór strukturalny, czystość substancji, rozpuszczalność w wodzie, stabilność w wodzie i przy narażeniu na działanie światła, pKa, Pow, a także wyniki badania szybkiej biodegradowalności (np. rozdziały C.4 lub C.29 niniejszego załącznika). WAŻNOŚĆ BADANIA 7. Aby badanie było ważne, spełnione muszą być następujące warunki: — stężenie rozpuszczonego tlenu powinno wynosić > 60 % wartości nasycenia powietrzem przez cały czas trwania badania; — różnica temperatury wody między komorami badawczymi lub kolejnymi dniami w dowolnym momencie w czasie trwania badania nie powinna przekraczać ± 1,5 °C, a jej wartość należy utrzymywać w zakresie temperatur określonym dla danego gatunku doświadczalnego (dodatek 2); — pomiar analityczny badanych stężeń jest obowiązkowy; — ogólny wskaźnik przeżywalności zapłodnionych jaj i wskaźnik przeżywalności po wylęgu w próbach kontrolnych i, w stosownych przypadkach, w kontrolach z rozpuszczalnikiem powinien być większy niż wartości graniczne określone w dodatku 2 lub im równy. 8. Jeżeli zaobserwowane zostanie niewielkie odchylenie od kryteriów ważności, należy rozważyć konsekwencje dla wiarygodności danych z badania i należy uwzględnić takie rozważania w sprawozdaniu. Należy zgłosić i omówić wpływ na przeżywalność, wylęg lub wzrost w kontroli z rozpuszczalnikiem w porównaniu z kontrolną ujemną w kontekście wiarygodności danych z badania. OPIS METODY Komory badawcze 9. W badaniu można użyć dowolnych naczyń wykonanych ze szkła, stali nierdzewnej lub z innych chemicznie obojętnych materiałów. Ponieważ wiadomo, że silikon wykazuje wysoką zdolność do absorbowania substancji lipofilowych, należy zminimalizować wykorzystanie rur silikonowych w badaniach przepływowych i wykorzystanie uszczelek silikonowych mających kontakt z wodą i zastąpić je np. akwariami wykonanymi z jednego bloku szkła. Naczynia powinny być dostatecznie duże, aby umożliwić odpowiedni wzrost w próbie kontrolnej, utrzymanie stężenia rozpuszczonego tlenu (np. w przypadku małych gatunków ryb wystarczające będzie akwarium o objętości 7 l) oraz spełnienie kryteriów dotyczących wskaźnika obciążenia określonych w pkt 19. Zaleca się losowe rozmieszczenie komór badawczych w obszarze badania. Układ bloków losowanych, w ramach którego w każdym bloku następuje każde podanie substancji chemicznej, jest korzystniejszy niż układ całkowicie zrandomizowany. Komory badawcze powinny być zabezpieczone przed niepożądanymi zakłóceniami. Przed wprowadzeniem organizmów doświadczalnych zaleca się kondycjonowanie układu badawczego ze stężeniami badanej substancji chemicznej przez okres konieczny do wykazania stabilnych stężeń ekspozycyjnych. Wybór gatunku 10. Zalecane gatunki ryb wymieniono w tabeli 1. Nie wyklucza to możliwości stosowania innych gatunków, lecz może się to wiązać z koniecznością dostosowania procedury badawczej w celu zapewnienia odpowiednich warunków badania. W takim przypadku należy podać uzasadnienie wyboru gatunku i metody doświadczalnej. Utrzymywanie tarlaków 11. Szczegółowe informacje dotyczące utrzymywania tarlaków w zadowalających warunkach można znaleźć w dodatku 3 i w pozycjach (3)(4)(5) bibliografii. Postępowanie z zapłodnionymi jajami, embrionami i larwami 12. Początkowo zapłodnione jaja, embriony i larwy można poddawać narażeniu w obrębie naczynia głównego w mniejszych naczyniach wykonanych ze szkła lub stali nierdzewnej, których ściany lub podstawy są wykonane z siatki w celu umożliwienia przepływu roztworu do badań przez naczynie. Nieburzliwy przepływ w tych małych naczyniach można wywołać przez zawieszenie ich na wysięgniku przemieszczającym naczynie w górę i w dół, przy czym organizmy powinny być zawsze zanurzone. Zapłodnione jaja ryb łososiowatych można umieścić na statywach lub siatkach, których szczeliny są wystarczająco duże, aby larwy mogły przez nie spadać po wylęgu. 13. Jeżeli w głównym naczyniu badawczym wykorzystywano pojemniki, kratki lub siatki na jaja do umocowania jaj, elementy te należy usunąć po wylęgu larw, zgodnie z wytycznymi w dodatku 3; należy jednak zachować siatki, aby uniemożliwić larwom ucieczkę. Jeśli zachodzi konieczność przeniesienia larw, nie można ich narażać na działanie powietrza i nie wolno używać siatek do wypuszczania larw z pojemników na jaja. Moment takiego przeniesienia jest różny w zależności od gatunku; przy czym fakt ten należy udokumentować w sprawozdaniu. Przeniesienie nie zawsze jest jednak konieczne. Woda 14. Każda woda, w której gatunki doświadczalne wykazują odpowiednie długoterminowe przeżycie i wzrost, może być stosowana jako woda użyta do badania (dodatek 4). Powinna mieć ona stałą jakość w okresie trwania badania. Aby mieć pewność, że woda rozcieńczająca nie będzie wpływała zbytnio na wyniki badania (np. na skutek kompleksowania badanej substancji chemicznej) lub nie będzie wywierać szkodliwego wpływu na parametry tarlaków, należy co pewien czas pobierać próbki do analizy. Jeżeli wiadomo, że woda rozcieńczająca ma względnie stałą jakość, należy np. co dwa miesiące dokonywać pomiaru zawartości metali ciężkich (np. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd i Ni), głównych anionów i kationów (np. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl- i SO42-), amoniaku, całkowitego chloru resztkowego, pestycydów, całkowitego węgla organicznego i zawiesiny. Jeżeli wiadomo, że jakość wody jest zmienna, pomiary należy przeprowadzać częściej; częstotliwość przeprowadzania pomiarów zależy od tego, jak bardzo zmienna jest jakość wody. Niektóre właściwości chemiczne dopuszczalnej wody rozcieńczającej wymieniono w dodatku 4. Roztwory do badań 15. W przypadku badań przepływowych wymagany jest system, który nieprzerwanie dozuje i rozcieńcza roztwór podstawowy badanej substancji chemicznej (np. pompa dozująca, rozcieńczalnik proporcjonalny, sytnik) w celu doprowadzenia serii stężeń do komór badawczych. W trakcie badania należy okresowo sprawdzać natężenia przepływu roztworów podstawowych i wody rozcieńczającej, które przez cały czas trwania badania nie powinny różnić się o więcej niż 10 %. Za odpowiednie uznano natężenie przepływu równe co najmniej pięciu objętościom komory badawczej w ciągu 24 godzin (3). Jeżeli jednak przestrzegana jest wartość wskaźnika obciążenia wskazana w pkt 19, możliwe jest zastosowanie mniejszego natężenia przepływu, np. wynoszącego 2–3 objętości komór badawczych, w celu uniknięcia szybkiego usunięcia paszy. 16. Roztwory do badań o wybranych stężeniach przygotowuje się przez rozcieńczenie roztworu podstawowego. Roztwór podstawowy najlepiej jest przygotowywać poprzez mechaniczne mieszanie lub wstrząsanie badanej substancji chemicznej z wodą rozcieńczającą (np. poprzez mieszanie lub sonikację). Można zastosować kolumny nasyceniowe (rozpuszczające) lub metody pasywnego dawkowania (6) w celu uzyskania odpowiednio stężonego roztworu podstawowego. Nie zaleca się stosowania nośnika rozpuszczalnikowego. W przypadku gdy rozpuszczalnik jest niezbędny, należy równolegle przeprowadzić próbę kontrolną z rozpuszczalnikiem przy takim samym stężeniu rozpuszczalnika jak przy podaniach substancji chemicznej; tj. poziom rozpuszczalnika powinien być w miarę możliwości równy we wszystkich stężeniach oraz w kontroli z rozpuszczalnikiem. W przypadku niektórych układów z rozcieńczalnikiem może być to trudne z technicznego punktu widzenia; w takim przypadku stężenie rozpuszczalnika w kontroli z rozpuszczalnikiem powinno być równe najwyższemu stężeniu rozpuszczalnika w grupie badanej. W odniesieniu do substancji trudnych do zbadania należy zapoznać się z wytyczną OECD dotyczącą badania toksyczności wodnej trudnych substancji i mieszanin (Guidance Document No. 23 on aquatic toxicity testing of difficult substances and mixtures) (2). W przypadku stosowania rozpuszczalnika wybór rozpuszczalnika będzie uwarunkowany właściwościami chemicznymi substancji. W wytycznej OECD nr 23 zaleca się, by maksymalne stężenie wynosiło 100 μl/l. W celu uniknięcia potencjalnego wpływu rozpuszczalnika na mierzone punkty końcowe (7) zaleca się utrzymywanie stężenia rozpuszczalnika na jak najniższym poziomie. 17. W badaniu półstatycznym można postępować zgodnie z dwoma różnymi procedurami wymiany. W czystych naczyniach przygotowuje się nowe roztwory do badań i do nowych naczyń ostrożnie przenosi się jaja i larwy, które przeżyły albo organizmy doświadczalne pozostawia się w naczyniach badawczych i wymienia się część (co najmniej dwie trzecie) objętości roztworu do badań / substancji kontrolnej. PROCEDURA Warunki narażenia na działanie substancji Czas trwania 18. Badanie należy rozpocząć najwcześniej jak to możliwe po zapłodnieniu jaj, przy czym najlepiej zanurzyć je w roztworach do badań przed rozpoczęciem bruzdkowania tarczy zarodkowej lub jak najszybciej po tym stadium. Czas trwania badania będzie zależy od wykorzystanego gatunku. W dodatku 2 przedstawiono niektóre zalecane czasy trwania badania. Obciążenie 19. Liczba zapłodnionych jaj na początku badania musi być wystarczająca do spełnienia wymogów statystycznych. Należy je rozdzielić w taki sposób, by zostały poddane działaniu substancji chemicznej w sposób losowy, przy czym w każdym stężeniu należy wykorzystać co najmniej 80 jaj, rozdzielonych równo między co najmniej cztery komory badawcze będące kontrpróbami. Wskaźnik obciążenia (biomasa w przeliczeniu na objętość roztworu do badań) powinien być wystarczająco niski, by w stadium jaja i w stadium larwalnym możliwe było utrzymanie stężenia rozpuszczonego tlenu wynoszącego co najmniej 60 % wartości nasycenia powietrzem bez napowietrzania. Zaleca się, by wskaźnik obciążenia w badaniach przepływowych nie przekraczał 0,5 g/l mokrej masy na 24 godziny i by nie przekraczał 5 g/l roztworu w dowolnym momencie (3). Światło i temperatura 20. Fotoperiod i temperatura wody powinny być odpowiednie dla gatunku doświadczalnego (zob. dodatek 2). Karmienie 21. Pasza i karmienie są kluczowe, przy czym zasadnicze jest rozpoczęcie podawania paszy odpowiedniej dla każdego stadium życia w odpowiednim czasie i w ilości wystarczającej do utrzymania prawidłowego wzrostu. Wszystkie kontrpróby powinny otrzymywać w przybliżeniu takie same ilości paszy, chyba że zostały one dostosowane w celu uwzględnienia upadkowości. Aby zapobiec akumulacji odpadów, należy usuwać nadwyżkę paszy i ekskrementy. Szczegółowy opis schematów karmienia znajduje się w dodatku 3, lecz w miarę zdobywania doświadczenia schematy żywienia są stale udoskonalane, by poprawić przeżywalność i zoptymalizować wzrost. Pasza żywa stanowi źródło urozmaicenia warunków bytowania i w związku z tym należy stosować ją zamiast paszy suchej lub mrożonej lub jako dodatek do takiej paszy, gdy tylko jest ona odpowiednia dla danego gatunku i stadium rozwoju. Badane stężenia 22. Zwykle wymagane jest zastosowanie pięciu stężeń badanej substancji chemicznej, z co najmniej czterema kontrpróbami na stężenie, które różnią się o taką samą wielokrotność nieprzekraczającą 3,2. Podczas wyboru badanych stężeń należy uwzględnić informacje dotyczące badania ostrej toksyczności, najlepiej z wykorzystaniem tego samego gatunku lub badania ustalającego zakres (1), jeżeli tylko takie informacje są dostępne. Podczas wyboru zakresu badanych stężeń należy jednak wziąć pod uwagę wszystkie źródła informacji, w tym takie źródła, jak np. podejście przekrojowe lub dane z badania ostrej toksyczności na rybim embrionie. Jeżeli celem badania jest jedynie ustanowienie empirycznego NOEC, dopuszczalne jest przeprowadzenie badania granicznego lub rozszerzonego badania granicznego, w którym występuje mniej niż pięć stężeń, jako badania ostatecznego. Jeżeli użyto mniej niż pięć stężeń, należy podać uzasadnienie. Nie ma potrzeby przeprowadzania badania, gdy stężenia badanej substancji chemicznej są wyższe niż 96-godzinne LC50 lub 10 mg/l, którakolwiek z tych wartości jest niższa. Kontrole 23. Próba kontrolna z wodą rozcieńczającą i, w miarę potrzeby, kontrola z rozpuszczalnikiem zawierające nośnik rozpuszczalnikowy powinny być przeprowadzane wyłącznie jako dodatek do badania z wykorzystaniem serii stężeń badanej substancji chemicznej (zob. pkt 16). Częstotliwość oznaczeń i pomiarów analitycznych 24. Przed rozpoczęciem okresu narażenia należy zapewnić (np. poprzez dokonanie pomiaru badanych stężeń) prawidłowe działanie układu podawania substancji chemicznej we wszystkich kontrpróbach. Należy ustalić wymagane metody analityczne, w tym odpowiednią granicę oznaczalności i dostateczną wiedzę na temat stabilności substancji w układzie badawczym. W trakcie badania stężenia badanej substancji chemicznej oznacza się w regularnych odstępach czasu w celu scharakteryzowania narażenia. Konieczne jest wykonanie co najmniej pięciu oznaczeń. W przypadku układów przepływowych pomiary analityczne badanej substancji chemicznej w jednej kontrpróbie na stężenie należy wykonywać co najmniej raz w tygodniu, systematycznie zmieniając kontrpróby. Dodatkowe oznaczenia analityczne często będą miały korzystny wpływ na podniesienie jakości wyniku badania. Próbki mogą wymagać przefiltrowania w celu usunięcia ewentualnych cząstek stałych (np. przez filtr z porami o średnicy 0,45 μm) lub odwirowania, aby mieć pewność, że oznaczenia substancji chemicznej są wykonywane w rzeczywistym roztworze. Aby obniżyć adsorpcję badanej substancji chemicznej, należy nasączyć filtry przed ich użyciem. Jeżeli zmierzone stężenie nie utrzymuje się w granicach 80–120 % stężenia nominalnego, należy oznaczyć stężenia efektywne i wyrazić względem średniej arytmetycznej stężenia w badaniach przepływowych (zob. dodatek 6 metody badawczej C.20 w odniesieniu do obliczania średniej arytmetycznej(8)) i wyrazić względem średniej geometrycznej zmierzonych stężeń w przypadku badań półstatycznych (zob. rozdział 5 wytycznej OECD „Guidance Document on aquatic toxicity testing of difficult substances and mixtures” (2)). 25. W trakcie badania należy dokonywać pomiarów rozpuszczonego tlenu, pH i temperatury we wszystkich naczyniach badawczych, a co najmniej raz w tygodniu należy mierzyć zasolenie i twardość, jeżeli jest to uzasadnione, na początku i pod koniec badania. Zalecane jest stałe monitorowanie temperatury w co najmniej jednym naczyniu badawczym. Obserwacje 26. Stadium rozwoju embrionalnego : należy jak najdokładniej sprawdzić etap embrionalny na początku narażenia na działanie badanej substancji chemicznej. Można tego dokonać, stosując reprezentatywną próbkę jaj odpowiednio utrwalonych i oczyszczonych. 27. Wylęg i przeżywalność : obserwacje wylęgania i przeżywalności należy prowadzić co najmniej raz dziennie, a wartości liczbowe należy odnotowywać. W przypadku zaobserwowania pojawienia się grzyba we wczesnym stadium rozwoju embrionalnego (np. w pierwszym lub drugim dniu badania), należy takie jaja policzyć i usunąć. Martwe embriony, larwy i ryby młode należy usunąć bezzwłocznie po ich zauważeniu, ponieważ mogą szybko ulec rozkładowi i rozdrobnieniu w wyniku działalności pozostałych ryb. Należy zachować najwyższą ostrożność przy usuwaniu martwych osobników, aby nie uszkodzić fizycznie znajdujących się w pobliżu jaj/larw. Oznaki śmierci różnią się w zależności od gatunku i stadium rozwoju: Na przykład: — w przypadku zapłodnionych jaj: w szczególności we wczesnych stadiach znacząca utrata przezroczystości i zmiana w zabarwieniu spowodowane koagulacją lub strącaniem białek, przez co jaja stają się białe i nieprzezroczyste; — w przypadku embrionów, larw i ryb młodych: bezruch lub brak ruchu oddechowego lub brak bicia serca lub brak reakcji na bodźce mechaniczne. 28. Nietypowy wygląd : należy odnotowywać liczbę larw lub ryb młodych o nieprawidłowym wyglądzie ciała w regularnych odstępach czasu, w zależności od czasu trwania badania, podając opis charakteru anomalii. Należy zwrócić uwagę, że larwy i ryby młode z anomaliami są zjawiskiem naturalnym i w próbach kontrolnych niektórych gatunków ich odsetek może być rzędu kilku procent. Jeżeli deformacje i związane z tym nietypowe zachowanie zostaną uznane za tak poważne, że sprawiają organizmowi duże cierpienie, oraz jeżeli organizm osiągnął punkt, po przekroczeniu którego powrót do zdrowia nie będzie możliwy, można taki organizm wyeliminować z badania. Zwierzęta takie należy uśmiercić i potraktować jako przypadki upadkowości dla potrzeb późniejszej analizy danych. Normalny rozwój embrionalny został udokumentowany w odniesieniu do większości gatunków zalecanych do wykorzystywania w niniejszej metodzie badawczej (9) (10) (11) (12). 29. Nietypowe zachowanie : należy odnotowywać anomalie, np. hiperwentylacja, nieskoordynowane ruchy w czasie pływania, nietypowy spokój i nietypowe zachowanie podczas pobierania pokarmu, w regularnych odstępach czasu w zależności od czasu trwania badania (np. raz dziennie w przypadku gatunków ciepłowodnych). Powyższe objawy, które trudno jednak ocenić ilościowo, mogą, w przypadku ich zaobserwowania, pomóc w interpretacji danych dotyczących upadkowości. 30. Masa : pod koniec badania wszystkie ryby, które przeżyły, są ważone co najmniej na podstawie kontrpróby (zgłoszenie liczby zwierząt w kontrpróbie i średniej masy zwierzęcia): preferowana jest mokra masa (po osuszeniu bibułą), można jednak zgłaszać również dane dotyczące suchej masy (13). 31. Długość ciała : pod koniec badania mierzy się długość ciała poszczególnych osobników. Zaleca się podawać długość całkowitą, jeżeli jednak ma miejsce martwica lub uszkodzenia płetwy ogonowej, można stosować długość standardową. W stosunku do wszystkich ryb wykorzystanych w badaniu należy stosować taką samą metodę. Długość ciała poszczególnych osobników można mierzyć za pomocą np. suwmiarki, kamery cyfrowej lub wzorcowanego mikrometru okularowego. Typowe minimalne długości ciała zostały zdefiniowane w dodatku 2. DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ Opracowanie wyników 32. Zaleca się, aby plan doświadczenia i wybrany test statystyczny zapewniły dostateczną moc (80 % lub wyższą) do wykrycia zmian o znaczeniu biologicznym w punktach końcowych, w przypadku gdy należy zgłosić NOEC. Zgłoszenie odpowiednich stężeń efektywnych i parametrów może zależeć od ram regulacyjnych. Jeżeli należy zgłosić ECx, układ doświadczalny i wybrany model regresji powinny umożliwiać oszacowanie ECx, tak aby (i) 95-procentowy przedział ufności podany w odniesieniu do ECx nie zawierał zera i nie był zbyt szeroki, (ii) 95-procentowy przedział ufności w odniesieniu do prognozowanej średniej przy ECx nie zawierał średniej kontrolnej, (iii) nie istniało znaczące niedopasowanie modelu regresji do danych. Każde z tych podejść wymaga ustalenia procentowej zmiany w każdym punkcie końcowym, który jest ważny pod względem wykrycia lub oszacowania. Układ doświadczalny należy tak dostosować, aby to umożliwiał. Jeżeli nie zostaną spełnione powyższe warunki oznaczenia ECx, należy zastosować podejście oparte na NOEC. Istnieje małe prawdopodobieństwo, aby do wszystkich punktów końcowych miała zastosowanie taka sama zmiana procentowa, i równie mało prawdopodobne jest, aby można było zaplanować wykonalne doświadczenie spełniające te kryteria dla wszystkich punktów końcowych, w związku z tym należy skupić się na tych punktach końcowych, które są istotne dla danego doświadczenia, planując doświadczenie w odpowiedni sposób. W dodatkach 5 i 6 można znaleźć schematy statystyczne i wytyczne dotyczące każdego podejścia, które można wykorzystać przy przetwarzaniu danych i wyborze najodpowiedniejszego testu lub modelu statystycznego. Można również zastosować inne podejścia statystyczne, pod warunkiem że są one uzasadnione z naukowego punktu widzenia. 33. Konieczna będzie analiza zmian w obrębie każdego zbioru kontrprób z zastosowaniem analizy wariancji lub procedur tablicy wielodzielczej oraz odpowiednich metod analizy statystycznej opartych na tej analizie. W celu dokonania porównania wielokrotnego wyników uzyskanych przy poszczególnych stężeniach z wynikami prób kontrolnych zaleca się stosowanie regresyjnego testu Jonckheere'a-Terpstry lub testu Williamsa w odniesieniu do reakcji ciągłych oraz testu Cochrana-Armitage'a w odniesieniu do reakcji kwantowych, które są spójne z monotoniczną zależnością stężenie-odpowiedź oraz w przypadku braku dowodów na wariancję większą niż dwumianowa (14) W przypadku dowodu na wariancję większą niż dwumianowa zaleca się opracowaną przez Rao-Scotta korektę testu Cochrana-Armitage'a (15) (16) lub test Williamsa lub Dunnetta (po przekształceniu za pomocą funkcji pierwiastek kwadratowy arcsin) lub test Jonckheere'a-Terpstry zastosowany do wartości procentowych odnotowanych w kontrpróbie. Jeżeli dane nie są spójne z monotoniczną zależnością stężenie-odpowiedź, metoda Dunnetta lub Dunna lub Manna-Whitneya może okazać się przydatna w odniesieniu do reakcji ciągłych, a dokładny test Fishera – w odniesieniu do reakcji kwantowych (14) (17) (18). Niezależnie od stosowanej metody statystycznej czy stosowanego modelu statystycznego należy zadbać o spełnienie wymogów danej metody lub danego modelu (np. w układzie doświadczalnym i zastosowanym teście lub modelu została oszacowana i uwzględniona zmienność między komorami). Dane należy oceniać pod katem normalności, a w dodatku 5 podano sposób postępowania z resztami z ANOVA. W dodatku 6 omówione zostały dodatkowe względy dotyczące podejścia regresyjnego. Aby spełnić wymagania testu statystycznego, należy wziąć pod uwagę transformacje. Transformacje umożliwiające dopasowanie modelu regresji wymagają jednak dużej ostrożności, ponieważ np. 25-procentowa zmiana w nieprzekształconej reakcji nie odpowiada 25-procentowej zmianie w reakcji nieprzekształconej. W przypadku wszystkich analiz jednostką analizy jest komora badawcza, a nie pojedyncza ryba, i w związku z tym jednostka doświadczalna oraz testy hipotez i regresja powinny to odzwierciedlać (3) (14) (19) (20). Sprawozdanie z badania 34. Sprawozdanie z badania powinno zawierać następujące informacje: Badana substancja chemiczna: Substancja jednoskładnikowa — wygląd fizyczny, rozpuszczalność w wodzie i dodatkowe istotne właściwości fizykochemiczne; — dane identyfikacyjne substancji chemicznej, takie jak nazwa IUPAC lub CAS, numer CAS, kod SMILES lib InChI, wzór strukturalny, czystość, nazwa chemiczna zanieczyszczeń w stosownych przypadkach, na ile jest to możliwe w praktyce, itd. (w tym zawartość węgla organicznego w stosownych przypadkach). Substancja wieloskładnikowa, UVCB i mieszaniny: — jak najdokładniejsza charakterystyka, np. nazwa chemiczna (zob. powyżej), ilość i istotne właściwości fizykochemiczne składników. Gatunek doświadczalny: — nazwa systematyczna, szczep, źródło i metoda pobierania zapłodnionych jaj i dalsza obróbka. Warunki badania: — zastosowana procedura badawcza (np. układ półstatyczny lub przepływowy, obciążenie); — fotoperiod(-y); — plan badania (np. liczba komór badawczych i kontrprób, liczba jaj w kontrpróbie, materiał i wielkość komory badawczej (wysokość, szerokość, objętość), objętość wody w każdej komorze badawczej); — metoda przygotowania roztworów podstawowych i częstotliwość wymiany (należy określić środek zwiększający rozpuszczalność i jego stężenie, jeśli został zastosowany); — metoda dawkowania badanej substancji chemicznej (np. pompy, układy rozcieńczające); — sprawność odzyskowa metody i badane stężenia nominalne, granica oznaczalności, średnie wartości pomiarowych oraz ich odchylenia standardowe w naczyniach badawczych, a także metoda użyta do ich uzyskania oraz dowody świadczące o tym, że pomiary odnoszą się do stężeń badanej substancji chemicznej w rzeczywistym roztworze; — cechy wody rozcieńczającej: pH, twardość, temperatura, stężenie rozpuszczonego tlenu, poziom chloru resztkowego (jeśli dokonano pomiaru), całkowity węgiel organiczny (jeśli dokonano pomiaru), zawiesina (jeśli dokonano pomiaru), zasolenie ośrodka użytego do badania (jeśli dokonano pomiaru) oraz wszelkie inne wykonane pomiary; — jakość wody w naczyniach badawczych: pH, twardość, temperatura i stężenie rozpuszczonego tlenu; — szczegółowe informacje dotyczące karmienia (np. rodzaj pokarmu, źródło, podawana ilość i częstotliwość podawania). Wyniki zgłaszane indywidualnie (lub na podstawie kontrprób) oraz jako średnia i współczynnik zmienności, w stosownych przypadkach, w odniesieniu do następujących punktów końcowych: — dowody, że próby kontrolne spełniają normę dopuszczalności ogólnego wskaźnika przeżywalności dla gatunku doświadczalnego (dodatek 2); — dane dotyczące upadkowości w każdym stadium (embrionalnym, larwalnym i młodocianym) oraz upadkowość zbiorcza; — liczba dni do wylęgu, liczba larw wylegających się każdego dnia oraz zakończenie okresu wylęgu; — liczba zdrowych ryb pod koniec badania; — dane dotyczące długości ciała (podać długość standardową albo całkowitą) i masa ciała zwierząt, które przeżyły; — częstość występowania, opis i liczba ewentualnych anomalii morfologicznych; — częstość występowania, opis i liczba przypadków ewentualnego wpływu na zachowanie; — metoda analizy statystycznej (analiza regresji lub analiza wariancji) oraz przetwarzanie danych (zastosowany test lub model statystyczny); — najwyższe stężenie, przy którym nie obserwuje się szkodliwych zmian, w odniesieniu do każdej ocenionej reakcji (NOEC); — najniższe stężenie, przy którym obserwuje się zmiany, (dla p = 0,05) w odniesieniu do każdej ocenianej reakcji (LOEC); — ECx w odniesieniu do każdej ocenianej reakcji, jeżeli dotyczy, i przedziały ufności (np. 90 % lub 95 %) oraz wykres dopasowanego modelu wykorzystanego do obliczeń, nachylenie krzywej stężenie-odpowiedź, wzór modelu regresji, szacowane parametry modelu i ich błędy standardowe. Wszelkie odstępstwa od metody badawczej. Omówienie wyników, w tym ewentualny wpływ odstępstw od niniejszej metody badawczej na wynik badania. Tabela 1 Gatunki ryb zalecane do badania SŁODKOWODNE WODY ESTUARYJNE i MORSKIE: Oncorhynchus mykiss Pstrąg tęczowy Cyprinodon variegatus Karpieniec zmienny Pimephales promelas Strzebla wielkogłowa Menidia sp. Menidia berylka Danio rerio Danio pręgowany Oryzias latipes Ryżanka japońska lub ryżanka BIBLIOGRAFIA (1) OECD (2012), Fish Toxicity Testing Framework, Publikacje na temat środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa, seria dotycząca badań i oceny nr 171, OECD, Paryż. (2) OECD (2000), Guidance Document on Aquatic Toxicity Testing of Difficult Substances and Mixtures, Publikacje na temat środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa, seria dotycząca badań i oceny. nr 23, OECD, Paryż. (3) ASTM (1988). Standard Guide for Conducting Early Life-Stage Toxicity Tests with Fishes. Amerykańskie Stowarzyszenie Badań i Materiałów. E 1241-88. 26. (4) Brauhn, J.L. i R.A. Schoettger (1975), Acquisition and Culture of Research Fish: Rainbow trout, Fathead minnows, Channel catfish and Bluegills, Ecological Research Series, EPA-660/3-75-011, Duluth, Minnesota. (5) Brungs, W.A. i B.R. Jones (1977), Temperature Criteria for Freshwater Fish: Protocol and Procedures, Ecological Research Series EPA-600/3-77-061, Duluth, Minnesota. (6) Adolfsson-Erici, et al. (2012), A flow-through passive dosing system for continuously supplying aqueous solutions of hydrophobic chemicals to bioconcentration and aquatic toxicity tests, Chemosphere 86, 593-599. (7) Hutchinson, T.H. et al. (2006), Acute and chronic effects of carrier solvents in aquatic organisms: A critical review, Aquatic Toxicology, 76, s. 69–92. (8) Rozdział C.20 niniejszego załącznika, Badanie wpływu substancji na rozrodczość Daphnia magna. (9) Hansen, D.J. i P.R. Parrish (1977), Suitability of sheepshead minnows (Cyprindon variegatus) for life-cycle toxicity tests, In Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation (red. F.L. Mayer i J.L. Hamelink), ASTM STP 634. (10) Kimmel, H. B.et al. (1995), Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics, 203:253–310. (11) Gonzalez-Doncel, M. et al. (2005), A quick reference guide to the normal development of Oryzias latipes (Teleostei, Adrinichthydae) Journal of Applied Ichthyology, 20:1–14. (12) Devlin, E.W. et al. (1996), Prehatching Development of the Fathead Minnow, Pimephales promelas Rafinesque. EPA/600/R-96/079. USEPA, Office of Research and Development, Washington, D.C.. (13) Oris, J.T., S.C. Belanger, i A.J. Bailer, (2012), Baseline characteristics and statistical implications for the OECD 210 Fish Early Life Stage Chronic Toxicity Test, Environmental Toxicology and Chemistry 31; 2, s. 370–376. (14) OECD (2006). Current Approaches in the Statistical Analysis of Ecotoxicity Data: A Guidance to Application, Environmental Health and Safety Publications Series on Testing and Assessment nr 54, OECD, Paryż. (15) Rao, J.N.K. i A.J. Scott (1992), A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, s. 577–585. (16) Rao, J.N.K. i A.J. Scott (1999), A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, s. 1373–1385. (17) Dunnett, C.W. (1955), A multiple comparisons procedure for comparing several treatments with a control, Journal of American Statistical Association, 50, s. 1096–1121. (18) Dunnett, C.W. (1964), New tables for multiple comparisons with a control. Biometrics, 20, s. 482–491. (19) Rand, G.M. i S.R. Petrocelli (1985), Fundamentals of Aquatic Toxicology. Hemisphere Publication Corporation, Nowy Jork. (20) McClave, J.T., J.H. Sullivan i J.G. Pearson (1980). Statistical Analysis of Fish Chronic Toxicity Test Data, Proceedings of 4th Aquatic Toxicology Symposium, ASTM, Filadelfia. Dodatek 1 DEFINICJE Długość ogonowa (FL): oznacza długość od czubka pyska do końca środkowego promienia płetwy ogonowej – parametr ten wykorzystuje się w odniesieniu do ryb, u których trudno jest wskazać miejsce, w którym kończy się kręgosłup (www.fishbase.org). Długość standardowa (SL): oznacza długość ryby mierzoną od czubka pyska do tylnej krawędzi ostatniego kręgu lub do tylnej krawędzi środkowotylnej części urostylu. Krótko mówiąc, ramach tego pomiaru nie bierze się pod uwagę długości płetwy ogonowej (www.fishbase.org). Długość całkowita (TL): oznacza długość mierzoną od czubka pyska do czubka dłuższego płata płetwy ogonowej, zazwyczaj mierzonego po zgięciu płatów do linii środkowej. Pomiar zdejmuje się wzdłuż linii prostej, nie wzdłuż krzywizny ciała ryby (www.fishbase.org). Wykres 1 Opis różnych stosowanych długości Substancja chemiczna: substancja lub mieszanina. ECx: (stężenie efektywne x %) jest stężeniem mającym x % wpływu na organizmy doświadczalne w danym okresie narażenia, w porównaniu z próbą kontrolną. Na przykład EC50 jest stężeniem, które w przybliżeniu ma wpływ na punkt końcowy badania w 50 % narażonej populacji w określonym okresie narażenia. Najniższe stężenie, przy którym obserwuje się zmiany, (LOEC) oznacza najmniejsze badane stężenie badanej substancji chemicznej, przy którym obserwuje się wystąpienie statystycznie istotnego wpływu (przy p ≤ 0,05) w porównaniu z próba kontrolną. Jednakże wszystkie badane stężenia powyżej LOEC powinny wywierać szkodliwy skutek równy skutkom lub większy niż skutki obserwowane przy LOEC. W przypadku gdy oba warunki nie mogą być spełnione, należy szczegółowo wyjaśnić, w jaki sposób wybrano LOEC (a następnie NOEC). W dodatkach 5 i 6 przedstawiono dodatkowe wytyczne w tym zakresie. Najwyższe stężenie, przy którym nie obserwuje się szkodliwych zmian, (NOEC) oznacza badane stężenie nieznacznie niższe niż LOEC, które nie wywiera statystycznie istotnego wpływu (p < 0,05) w ustalonym okresie narażenia w porównaniu z próbą kontrolną. Badana substancja chemiczna: dowolna substancja lub mieszanina badana za pomocą niniejszej metody badawczej. UVCB: substancje o nieznanym lub zmiennym składzie, złożone produkty reakcji lub materiały biologiczne. IUPAC: Międzynarodowa Unia Chemii Czystej i Stosowanej. SMILES: Simplified Molecular Input Line Entry Specification. Dodatek 2 WARUNKI BADANIA, CZAS TRWANIA BADANIA I KRYTERIA PRZEŻYCIA DLA ZALECANYCH GATUNKÓW GATUNEK WARUNKI BADANIA ZALECANY CZAS TRWANIA BADANIA Typowa minimalna średnia długość całkowita ryb kontrolnych pod koniec badania (mm) (98) PRZEŻYWALNOŚĆ RYB KONTROLNYCH (minimalna) Temperatura (° C) Zasolenie (0/00) Fotoperiod (godziny) Skuteczność wylęgu Przeżywalność po wylęgu Woda słodka: Oncorhynchus mykiss Pstrąg tęczowy 10 ± 1,5 (99) 12–16 (100) 2 tygodnie po rozpoczęciu swobodnego karmienia prób kontrolnych (lub po upływie 60 dni od wylęgu) 40 75 % 75 % Pimephales promelas Strzebla wielkogłowa 25 ± 1,5 16 32 dni od dnia rozpoczęcia badania (lub po upływie 28 dni od wylęgu) 18 70 % 75 % Danio rerio Danio pręgowany 26 ± 1,5 12–16 (101) po upływie 30 dni od wylęgu 11 70 % 75 % Oryzias latipes Ryżanka japońska lub ryżanka 25 ± 2 12–16 (101) po upływie 30 dni od wylęgu 17 80 % 80 % Wody estuaryjne i morskie: Cyprinodon variegatus Karpieniec zmienny 25 ± 1,5 15–35 (102) 12–16 (101) 32 dni od dnia rozpoczęcia badania (lub po upływie 28 dni od wylęgu) 17 75 % 80 % Menidia sp. Menidia berylka 22–25 15–35 (102) 13 28 dni 20 80 % 60 % Dodatek 3 WYTYCZNE W ZAKRESIE KARMIENIA WYLĘGU I ZWIERZĄT DOŚWIADCZALNYCH ZALECANEGO GATUNKU ORAZ WYTYCZNE W ZAKRESIE POSTĘPOWANIA Z TYM WYLĘGIEM I Z TYMI ZWIERZĘTAMI DOŚWIADCZALNYMI GATUNEK PASZA (*9) CZAS PRZENIESIENIA PO WYLĘGU CZAS PIERWSZEGO KARMIENIA Tarlaki Nowo wyklute larwy Osobniki młode Rodzaj Częstotliwość karmienia Woda słodka: Oncorhynchus mykiss Pstrąg tęczowy pasza dla pstrągów brak (1) starter pstrągowy BSN 2–4 karmienia dziennie 14–16 dni od dnia wylęgu lub od dnia wypłynięcia narybku 19 dni od dnia wylęgu lub od dnia wypłynięcia narybku Pimephales promelas Strzebla wielkogłowa BSN, pasza w formie płatków, FBS BSN BSN48, pasza w formie płatków 2–3 razy dziennie w momencie osiągnięcia skuteczności wylęgu na poziomie 90 % 2 dni po wylęgu Danio rerio Danio pręgowany BSN, pasza w formie płatków Pasza dla larw dostępna na rynku, pierwotniaki (2), białko (3) BSN48, pasza w formie płatków BSN raz dziennie; pasza w formie płatków dwa razy dziennie w momencie osiągnięcia skuteczności wylęgu na poziomie 90 % 2 dni po wylęgu Oryzias latipes Ryżanka japońska lub ryżanka pasza w formie płatków BSN, pasza w formie płatków (lub pierwotniaki lub wrotki) BSN48, pasza w formie płatków (lub wrotki) BSN raz dziennie; pasza w formie płatków dwa razy dziennie lub pasza w formie płatków i wrotki raz dziennie nie dotyczy 6–7 dni po tarle Wody estuaryjne i morskie: Cyprinodon varieqatus Karpieniec zmienny BSN, pasza w formie płatków, FBS BSN BSN48 2–3 karmienia dziennie nie dotyczy 1 dzień po wylęgu / wypłynięciu narybku Menidia sp. Menidia berylka BSN48, pasza w formie płatków BSN BSN48 2–3 karmienia dziennie nie dotyczy 1 dzień po wylęgu / wypłynięciu narybku Dodatek 4 NIEKTÓRE WŁAŚCIWOŚCI CHEMICZNE DOPUSZCZALNEJ WODY ROZCIEŃCZAJĄCEJ Składnik Stężenie graniczne Cząstki stałe 5 mg/l Całkowity węgiel organiczny 2 mg/l Amoniak niejonizowany 1 μg/l Chlor resztkowy 10 μg/l Całkowita zawartość pestycydów fosforoorganicznych 50 ng/l Całkowita zawartość pestycydów chloroorganicznych oraz polichlorowanych bifenyli 50 ng/l Całkowity chlor organiczny 25 ng/l Glin 1 μg/l Arsen 1 μg/l Chrom 1 μg/l Kobalt 1 μg/l Miedź 1 μg/l Żelazo 1 μg/l Ołów 1 μg/l Nikiel 1 μg/l Cynk 1 μg/l Kadm 100 ng/l Rtęć 100 ng/l Srebro 100 ng/l Dodatek 5 WYTYCZNE STATYSTYCZNE W ZAKRESIE USTALANIA WARTOŚCI NOEC Informacje ogólne Za jednostkę analityczną uznaje się zbiornik z kontrpróbą. Dlatego też w przypadku ciągłych pomiarów, np. pomiarów wielkości, należy obliczyć średnią lub medianę kontrpróby – w takim przypadku wartości obliczone dla kontrpróby uznaje się za dane do analizy. Należy wykazać moc stosowanych testów, najlepiej w oparciu o bazę danych historycznych poszczególnych laboratoriów. W odniesieniu do każdego punktu końcowego należy określić wpływ na wielkość, który można wykryć z 75–80 % mocą, wraz z testem statystycznym, który należy zastosować. Zgodnie z informacjami zawartymi w bazach danych dostępnych w chwili opracowywania niniejszej metody badawczej moc można określić zgodnie z zalecanymi procedurami statystycznymi. Poszczególne laboratoria powinny wykazać swoją zdolność do spełnienia wymogów w zakresie mocy testu, przeprowadzając swoją własną analizę mocy albo wykazując, że współczynnik zmienności (CV) dla każdej reakcji nie przekracza 90. percentyla CV wykorzystanych przy opracowywaniu wytycznej dotyczącej badań. Odpowiednie wartości CV przedstawiono w tabeli 1. Jeżeli w danym przypadku dostępne są wyłącznie średnie lub mediany dla kontrpróby, można pominąć wartości CV odnotowane w ramach kontrpróby. Tabela 1 90. percentyl CV dla wybranych gatunków ryb słodkowodnych Gatunek Reakcja CV_między kontrpróbami CV_w ramach kontrprób Pstrąg tęczowy Długość 17,4 9,8 Masa 10,1 28 Strzebla wielkogłowa Długość 16,9 13,5 Masa 11,7 38,7 Danio pręgowany Długość 43,7 11,7 Masa 11,9 32,8 W ramach praktycznie wszystkich testów statystycznych przeprowadzanych w celu oceny badań toksykologicznych prowadzonych przez dane laboratorium za porównania będące przedmiotem zainteresowania uznaje się porównania między grupami badanymi a grupą kontrolną. Z tego względu ustanowienie wymogu przeprowadzenia istotnego testu F w ramach analizy wariancji przed przeprowadzeniem testu Dunnetta lub Williamsa lub ustanowienie wymogu przeprowadzenia istotnego testu Kruskala-Wallisa przed przeprowadzeniem testu Jonckheere'a-Terpstry, Manna-Whitneya lub Dunna nie jest odpowiednie (Hochberg i Tamhane 1987, Hsu 1996, Dunnett 1955, 1964, Williams 1971, 1972, 1975, 1977, Robertson et al. 1988, Jonckheere 1954, Dunn 1964). W ramach testu Dunnetta automatycznie dokonuje się korekty z tytułu wielokrotnych porównań, przy czym zastosowanie testu F jako tekstu kontrolnego (ang. gatekeeper) może niekorzystnie wpłynąć na odsetek wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych uzyskiwanych w rezultacie zastosowania tego testu. Podobnie zastosowanie regresyjnego testu Williamsa i regresyjnego testu Jonckheere'a-Terpstry, w których wykorzystuje się poziom istotności wynoszący 0,05 na każdym etapie testu, prowadzi do zachowania ogólnego odsetka wyników fałszywie dodatnich na poziomie 5 % – zastosowanie testu-F lub testu Kruskala-Wallisa w celach weryfikacyjnych (ang. gatekeeper) wywiera niekorzystny wpływ na ten odsetek oraz na siłę testów. W przypadku przeprowadzenia testu Manna-Whitneya i testu Dunna należy zastosować korektę z tytułu wielokrotnych porównań – w tym przypadku zaleca się zastosowanie korekty Bonferroniego-Holma. Większość zaleceń dotyczących testowania hipotez i weryfikacji założeń leżących u podstaw wspomnianych testów została szczegółowo omówiona w wytycznych OECD z 2006 r., w których przedstawiono również obszerną literaturę poświęconą tej problematyce. Postępowanie próbami kontrolnymi w przypadku zastosowania rozpuszczalnika W przypadku wykorzystania rozpuszczalnika należy uwzględnić zarówno próbę kontrolną z wodą rozcieńczającą, jak i próbę kontrolną z rozpuszczalnikiem. Poszczególne reakcje odnotowane w tych dwóch grupach kontrolnych należy porównać i połączyć je do celów analizy statystycznej, jeżeli nie wykryto między nimi istotnej różnicy. W przeciwnym wypadku do celów oznaczenia NOEC lub oszacowania wartości ECx należy wykorzystać próbę kontrolną z rozpuszczalnikiem i nie należy opierać się na próbie kontrolnej z wodą. Zob. ograniczenie ustanowione w kryteriach ważności (pkt 7). Jeżeli chodzi o dane dotyczące długości, masy, skuteczności wylęgu z jaj, upadkowości larw lub larw, u których zaobserwowano anomalie, a także dane dotyczące pierwszego lub ostatniego dnia wylęgu lub wypłynięcia narybku, do celów porównania próby kontrolnej z wodą rozcieńczającą z próbą kontrolną z rozpuszczalnikiem przy poziomie istotności wynoszącym 0,05, należy stosować test t-Studenta lub test Manna-Whitneya, pomijając wszystkie grupy badane. Wyniki tych testów należy odnotować w sprawozdaniu. Pomiary wielkości (długość i masa) Wartości dotyczące długości i masy poszczególnych ryb mogą przebiegać zgodnie z funkcją rozkładu normalnego lub zgodnie z funkcją rozkładu logarytmiczno-normalnego. Niezależnie od danego przypadku średnie wartości dla kontrprób przebiegają zazwyczaj zgodnie z funkcją rozkładu normalnego na podstawie centralnego twierdzenia granicznego, co znajduje potwierdzenie w danych zgromadzonych w ponad 100 badaniach we wczesnym stadium rozwoju przeprowadzonych w odniesieniu do trzech gatunków słodkowodnych. Alternatywnie, jeżeli z danych lub informacji zawartych w bazach danych historycznych wynika, że wartości dotyczące wielkości poszczególnych ryb przebiegają zgodnie z funkcją rozkładu normalnego, można obliczyć średnią logarytmiczną wartości dotyczących poszczególnych ryb w kontrpróbach, co umożliwi przeprowadzenie analizy na antylogarytmach średnich logarytmicznych obliczonych dla kontrprób. Dane należy ocenić pod kątem spójności przy założeniu rozkładu normalnego i jednorodności wariancji. W tym celu należy skorzystać z reszt uzyskanych po zastosowaniu modelu ANOVA, wykorzystując stężenie jako jedyną zmienną objaśniającą. Dopuszcza się możliwość przeprowadzania analizy wzrokowej na podstawie wykresów punktowych i histogramów lub na podstawie szeregów rozdzielczych. Alternatywnie można zastosować test formalny, np. test Shapiro-Wilka lub test Andersona-Darlinga. Zgodność z jednorodnością wariancji można ocenić, poddając ten sam wykres punktowy analizie wzrokowej lub przeprowadzając formalny test Levene'a. Wymóg przeprowadzenia oceny zgodności z rozkładem normalnym lub oceny jednorodności wariancji obowiązuje wyłącznie w przypadku testów parametrycznych (np. testu Williamsa, testu Dunnetta). Należy pamiętać o możliwości wystąpienia wartości odstających i o ich wpływie na analizę. W tym kontekście dopuszcza się możliwość zastosowania testu Tukeya na wartość odstającą oraz przeprowadzenia analizy wzrokowej tych samych wykresów reszt, o której mowa powyżej. Należy pamiętać, że przedmiotem obserwacji są całe kontrpróby, dlatego też decyzję o pominięciu wartości odstającej w analizie należy podjąć wyłącznie po dokładnym rozpatrzeniu danego przypadku. Do testów statystycznych, w których wykorzystuje się specyficzne elementy związane z układem doświadczalnym i oczekiwanymi wartościami biologicznymi, zalicza się regresyjne testy tendencji, np. test Williamsa i test Jonckheere'a-Terpstry. W ramach tych testów zakłada się monotoniczność zależności stężenie-odpowiedź, przy czym dane powinny zostać ocenione pod kątem zgodności z tym założeniem. Taką ocenę można przeprowadzić, dokonując analizy wzrokowej wykresu punktowego, na którym średnie wartości odnotowane dla poszczególnych kontrprób zostały zestawione z badanym stężeniem. W tym kontekście pomocne może okazać się nałożenie segmentowego wykresu liniowego łączącego wartości średnich stężeń ważonych wielkością kontrprób na wykres punktowy. Znaczne odchylenie segmentowego wykresu liniowego od monotoniczności może świadczyć o konieczności zastosowania testów innych niż testy tendencji. Alternatywnie można zastosować testy formalne. W ramach podstawowego testu formalnego oblicza się kontrasty liniowe i kwadratowe dla średnich wartości stężenia. Jeżeli po przeprowadzeniu stosownych obliczeń okaże się, że kontrast kwadratowy jest istotny, a kontrast liniowy nie, może to świadczyć o wystąpieniu problemu związanego z monotonicznością, który powinien zostać poddany dalszej analizie w oparciu o wykresy. Jeżeli podejrzewa się, że źródłem problemu mogą być kwestie związane z rozkładem normalnym lub jednorodnością wariancji, wspomniane kontrasty można sporządzić w oparciu o dane pozyskane w rezultacie przeprowadzenia transformacji pozycyjno-rangowej. Dopuszcza się również możliwość zastosowania alternatywnych procedur, np. testu monotoniczności Bartholomew'a, ale takie procedury zwiększają złożoność analizy. Rysunek 2 Schemat pomiarów wielkości (długość i masa) NOEC O ile dane nie będą sprzeczne z wymogami przewidzianymi dla tego rodzaju testów, wartość NOEC ustala się, stosując regresyjny test Williamsa lub regresyjny test Jonckheere'a-Terpstry. Szczegółowe informacje na temat stosownych procedur przedstawiono w wytycznych OECD z 2006 r. W odniesieniu do danych, które nie spełniają wymogów regresyjnego testu tendencji, dopuszcza się możliwość zastosowania testu Dunnetta lub testu Tamhane'a-Dunnetta (T3), ponieważ w ramach tych testów automatycznie dokonuje się korekty z tytułu wielokrotnych porównań. Testy te bazują na założeniu rozkładu normalnego, a w przypadku testu Dunnetta – jednorodności wariancji. Jeżeli wspomniane warunki nie zostaną spełnione, można zastosować nieparametryczny test Dunna. Szczegółowe informacje na temat wszystkich wspomnianych testów zawarto w wytycznych OECD z 2006 r. Na podstawie ogólnych informacji przedstawionych na rys. 2 można ustalić, który test należy zastosować w danym przypadku. Wylęg z jaj i przeżywalność larw Dane przyjmują postać wartości procentowej wskazującej odsetek jaj, z których wykluły się nowe osobniki, lub odsetek larw, które przeżyły, w poszczególnych kontrpróbach. Takie dane powinny zostać ocenione pod kątem wariancji większej niż dwumianowa, co stanowi typową, ale nie powszechnie stosowaną, metodę oceny stosowaną w odniesieniu do tego rodzaju pomiarów. Informacje zawarte na schemacie przedstawionym na rys. 3 dostarczają wskazówek przydatnych przy dokonywaniu wyboru odpowiedniego testu; testy zostały szczegółowo omówione w tekście. W tym kontekście zazwyczaj stosuje się dwa testy: test Tarone'a C(α) (Tarone, 1979) i test chi kwadrat, każdy z nich przeprowadzany niezależnie dla poszczególnych badanych stężeń. Jeżeli w przynajmniej jednym badanym stężeniu odnotowana zostanie wariancja większa niż dwumianowa, należy zastosować metody zapewniające możliwość należytego uwzględnienia tego faktu. Wzór 1 Test Tarone'a C (α) (Tarone 1979) gdzie ̂ oznacza średnią wartość procentową dla danego stężenia, m oznacza liczbę zbiorników z kontrpróbą, nj oznacza liczbę osobników w kontrpróbie j, a xj oznacza liczbę osobników reagujących w danej kontrpróbie, tj. niewyklutych lub martwych. Test ten przeprowadza się dla każdego stężenia z osobna. Test ten można przeprowadzić w formie dostosowanego testu chi kwadrat, ale z przeprowadzonych przez Tarone'a ograniczonych symulacji mocy wynika, że moc testu Tarone'a jest większa niż moc testu chi kwadrat. Rysunek 3 Schemat wylęgu z jaj i upadkowości larw NOEC W przypadku braku istotnych dowodów wskazujących na wystąpienie wariancji większej niż dwumianowa można zastosować regresyjny test Cochrana-Armitage'a. W ramach tego testu pomija się kontrpróby, a więc w przypadku wystąpienia dowodów świadczących o wystąpieniu wariancji większej niż dwumianowa, zaleca się zastosowanie korekty Rao-Scotta w odniesieniu do testu Cochrana-Armitage'a (RSCA), co pozwoli wziąć pod uwagę kontrpróby, wielkość kontrprób i wariancję większą niż dwumianowa. Alternatywne testy, jakie można zastosować w tym kontekście, to regresyjny test Williamsa, regresyjny test Jonckheere'a-Terpstry oraz regresyjny test Dunnetta, jak opisano w sekcji poświęconej pomiarom wielkości. Testy te można zastosować niezależnie od tego, czy w danym przypadku występuje wariancja większa niż dwumianowa, przy czym ich moc jest nieco mniejsza (Agresti 2002, Morgan 1992, Rao i Scott 1992, 1999, Fung et al. 1994, 1996). Pierwszy lub ostatni dzień wylęgu lub wypłynięcia narybku Reakcja jest liczbą całkowitą i wskazuje dzień badania, w którym dokonano określonej obserwacji w danym zbiorniku z kontrpróbą. Zakres wartości jest zazwyczaj bardzo ograniczony i często charakteryzuje się znacznym udziałem wartości powiązanych, np. pierwszy dzień wylęgu odnotowuje się we wszystkich kontrpróbach, a także – potencjalnie – w jednej lub dwóch próbach kontrolnych poddanych działaniu niższych badanych stężeń. Zastosowanie testów parametrycznych – takich jak test Williamsa i Dunnetta – w odniesieniu do takich danych nie jest odpowiednie. W przypadku braku dowodów świadczących o wystąpieniu poważnego przypadku braku monotoniczności uznaje się, że zastosowanie regresyjnego testu Jonckheere'a-Terpstry zapewnia dostateczną moc, aby wykryć wpływ poddania działaniu badanej substancji chemicznej. W przeciwnym razie można zastosować test Dunna. Anomalie u larw Reakcja odpowiada liczbie larw, u których stwierdzono wystąpienie określonych anomalii. Przedmiotowa reakcja często cechuje się niską incydencją i wiąże się z podobnymi problemami jak te odnotowywane w przypadku pierwszego dnia wylęgu; ponadto niekiedy można zaobserwować jej zmienność, jeżeli chodzi o zależność stężenie-odpowiedź. Jeżeli rozkład danych jest przynajmniej w ogólnym zarysie zbliżony do rozkładu właściwego dla stężenia monotonicznego, uznaje się, że zastosowanie regresyjnego testu Jonckheere'a-Terpstry zapewnia dostateczną moc, aby wykryć wpływ poddania działaniu substancji chemicznej. W przeciwnym razie można zastosować test Dunna. BIBLIOGRAFIA Agresti, A. (2002); Categorical Data Analysis, wydanie drugie, Wiley, Hoboken. Dunnett C. W. (1955); A multiple comparison procedure for comparing several treatments with a control, J. American Statistical Association 50, s. 1096–1121. Dunn O. J. (1964); Multiple Comparisons Using Rank Sums, Technometrics 6, s. 241–252. Dunnett C. W. (1964); New tables for multiple comparisons with a control, Biometrics 20, s. 482–491. Fung, K.Y., D. Krewski, J.N.K. Rao, A.J. Scott (1994); Tests for Trend in Developmental Toxicity Experiments with Correlated Binary Data, Risk Analysis 14, s. 639–648. Fung, K.Y, D. Krewski, R.T. Smythe (1996); A comparison of tests for trend with historical controls in carcinogen bioassay, Canadian Journal of Statistics 24, s. 431–454. Hochberg, Y. i A. C. Tamhane (1987); Multiple Comparison Procedures, Wiley, Nowy Jork. Hsu, J.C. (1996); Multiple Comparisons: Theory and Methods; Chapman and Hall/CRC Press, Boca Raton. Jonckheere A. R. (1954); A distribution-free k-sample test against ordered alternatives, Biometrika 41, s. 133. Morgan, B.J.T. (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, Londyn. OECD (2006). Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Seria dotycząca badań i oceny, nr 54. Organizacja Współpracy Gospodarczej i Rozwoju, OECD, Paryż. Rao, J.N.K. i Scott, A.J. (1992) – A simple method for the analysis of clustered binary data, Biometrics 48, s. 577–585. Rao, J.N.K. i Scott, A.J. (1999) – A simple method for analyzing overdispersion in clustered Poisson data, Statistics in Medicine 18, s. 1373–1385. Robertson, T., Wright F.T. i Dykstra R.L. (1988); Order restricted statistical inference, Wiley. Tarone, R.E. (1979); Testing the goodness of fit of the Binomial distribution, Biometrika 66, s. 585–590. Williams, D.A. (1971); A test for differences between treatment means when several dose levels are compared with a zero dose control, Biometrics 27, s. 103–117. Williams, D.A. (1972); The comparison of several dose levels with a zero dose control, Biometrics 28, s. 519–531. Williams D. A. (1975); The Analysis of Binary Responses from Toxicological Experiments Involving Reproduction and Teratotlogy, Biometrics 31, s. 949–952. Williams, D.A. (1977); Some inference procedures for monotonically ordered normal means, Biometrika 64, s. 9–14. Dodatek 6 WYTYCZNE STATYSTYCZNE W ZAKRESIE SZACOWANIA REGRESJI Informacje ogólne Obserwacje wykorzystywane w modelu to średnie wartości odnotowane w kontrpróbie (długość i masa) lub wartości procentowe odnotowane w kontrpróbie (skuteczność wylęgu z jaj i upadkowość larw) (OECD 2006). Zasadniczo zaleca się stosowanie regresji ważonej wielkością próbki pobranej z kontrpróby. Dopuszcza się również możliwość zastosowania innych systemów ważenia, takich jak ważenie przewidywaną średnią reakcją lub połączenie tej metody ważenia z ważeniem wielkością próbki pobranej z kontrpróby. Ważenie odwrotnością wariancji stężenia wewnątrz próbki nie jest zalecane (Bunke et al. 1999, Seber i Wild, 2003, Motulsky i Christopoulos 2004, Huet et al. 2003). Wszelkie transformacje reakcji przed analizą powinny zapewnić możliwość zachowania niezależności obserwacji i ECx, a granice ufności powinny zostać wyrażone w pierwotnych jednostkach miary, a nie w jednostkach po transformacji. Na przykład zmiana wartości logarytmu długości o 20 % nie jest równoważna 20-procentowej zmianie długości (Lyles et al. 2008, Draper i Smith 1999). Schemat przedstawiony na rys. 4 zawiera ogólne informacje dotyczące sporządzania szacunków ECx. Bardziej szczegółowe informacje na ten temat przedstawiono poniżej. Rysunek 4 Schemat sporządzania szacunków ECx dotyczących średniej długości i masy lub procentowej wartości wylęgu z jaj lub upadkowości larw w kontrpróbie – bardziej szczegółowe informacje w tym zakresie znajdują się w tekście. Kwestie związane z wylęgiem z jaj i upadkowością larw Jeżeli chodzi o wylęg z jaj i upadkowość larw, zasadniczo najlepiej jest dopasować model spadkowy, chyba że dopasowuje się model probitowy, jak opisano poniżej. Oznacza to, że w modelu należy wziąć pod uwagę odsetek jaj, z których nie wylęgły się nowe osobniki, lub odsetek padłych larw. Wynika to z faktu, że wartość ECx oznacza stężenie, w przypadku którego odnotowuje się zmianę odpowiadającą x % średniej reakcji w danej próbie kontrolnej. Jeżeli z 5 % jaj w próbie kontrolnej nie wylęgną się nowe osobniki, a stosowany model bazuje na wskaźniku niewylęgnięcia się nowych osobników z jaj, wartość EC20 odpowiada stężeniu, przy którym odnotowuje się zmianę odpowiadającą 20 % wartości 5-procentowego wskaźnika niewylęgnięcia się nowych osobników z jaj w próbie kontrolnej, co odpowiada zmianie o 0,2*0,05=0,01 lub 1 punkt procentowy – w rezultacie wartość wskaźnika niewylęgnięcia się nowych osobników z jaj wynosi 6 %. Takiej niewielkiej zmiany nie można oszacować w rozsądny sposób na podstawie dostępnych danych i nie jest ona istotna z biologicznego punktu widzenia. Jeżeli jednak stosowany model bazuje na wartości procentowej określającej odsetek jaj, z których wylęgły się nowe osobniki, wartość procentowa dla próby kontrolnej wyniosłaby w omawianym przypadku 95 %, a 20-procentowy spadek w stosunku do średniej dla próby kontrolnej oznaczałby zmianę o 0,95*0,2=0,18, a zatem skuteczność wylęgu zmniejszyłaby się z 95 % do 77 % (= 95 – 18) – w takim przypadku można oszacować wpływ na stężenie, a opisane obliczenia mają istotniejsze znaczenie. Opisana problematyka nie ma większego znaczenia w kontekście pomiarów wielkości, choć niekorzystny wpływ na wielkość zasadniczo oznacza spadek wielkości. Modele wykorzystywane przy pomiarze wielkości (długości lub masy) oraz skuteczności wylęgu z jaj lub przeżywalności larw. Poza hormetycznym modelem Braina-Cousensa wszystkie te modele zostały opisane w wytycznych OECD z 2006 r. i zgodnie z treścią tych wytycznych zaleca się ich stosowanie. Modele określane jako OECD 2–5 zostały również omówione w kontekście doświadczeń w dziedzinie ekotoksyczności w Slob (2002). Istnieje oczywiście wiele innych modeli, które mogą okazać się przydatne. Bunke et al. (1999) wymienia szereg modeli, które nie zostały omówione w niniejszym opracowaniu, przy czym w literaturze przedmiotu można znaleźć liczne odniesienia do innych modeli. Zaproponowane poniżej powszechnie stosowane modele uznano za szczególnie odpowiednie w kontekście doświadczeń w dziedzinie ekotoksyczności. Modele z pięcioma badanymi stężeniami i próbą kontrolną — model Bruce'a-Versteega — prosty model wykładniczy (OECD 2) — prosty model wygładzania wykładniczego z parametrem kształtu (OECD 3) — prosty model wykładniczy z metodą zerową (OECD 4) Modele z sześcioma lub większą liczbą badanych stężeń i próbą kontrolną — model wygładzania wykładniczego z parametrem kształty i metodą zerową (OECD 5) — model Michaelisa-Mentena — model Hilla W przypadku odnotowania metodą wzrokową symptomów świadczących o wystąpieniu hormezy (której wystąpienie jest mało prawdopodobne w przypadku skutecznego wylęgu z jaj lub przeżywalności larw, ale która może wystąpić w ramach obserwacji wielkości) — hormetyczny model Braina-Cousensa; Brain i Cousens (1989) Alternatywne modele, które można zastosować przy przeprowadzaniu pomiarów poziomu niewylęgnięcia się nowych osobników z jaj i upadkowości larw — modele bazujące na wzroście stosowane w przypadku tych reakcji mogą zostać dopasowane w oparciu o modele probitowe (lub logistyczne), jeżeli nie istnieją dowody świadczące o wystąpieniu wariancji większej niż dwumianowa, a poziom incydencji w próbie kontrolnej szacuje się przy dopasowywaniu modelu. Stosowanie takiej metody dopasowywania nie jest zalecane, ponieważ w jej ramach za jednostkę analizy uznaje się pojedyncze osobniki, a nie kontrpróbę (Morgan 1992, O'Hara Hines i Lawless 1993, Collett 2002, 2003). Zgodność pojedynczego modelu — należy przeprowadzić analizę wzrokową zaobserwowanego i przewidywanego spadku wartości procentowej poszczególnych badanych stężeń (Motulsky i Christopoulos 2004, Draper i Smith 1999); — korzystając z testu F, należy porównać błąd średniokwadratowy regresji z czystym błędem średniokwadratowym (Draper i Smith 1999); — należy sprawdzić, czy wszystkie parametry stosowane w modelu są istotnie różne od zera (tj. należy ustalić, czy wszystkie parametry stosowane w modelu są istotne) (Motulsky i Christopoulos 2004); — należy zestawić reszty z regresji z wartością badanego stężenia na wykresie, najlepiej stosując skalę log(stężenie). Wykresu nie należy wykreślać w oparciu o jakikolwiek schemat; punkty należy rozmieścić losowo wzdłuż linii poziomej na wysokości zerowej; — dane należy ocenić pod kątem zgodności z rozkładem normalnym i jednorodności wariancji zgodnie z metodą opisaną w dodatku 5; — ponadto należy ocenić zgodność rozkładu reszt pozostałych po zastosowaniu modelu regresji z rozkładem normalnym, stosując te same metody co opisane w dodatku 5 metody dotyczące reszt z analizy ANOVA. Porównywanie modeli — należy stosować kryteria informacyjne Akaikego (AICc). Niższe wartości uzyskane po zastosowaniu kryteriów informacyjnego Akaikego świadczą o lepszym dopasowaniu, a jeżeli AICc(B)-AICc(A) ≥10, wówczas model A jest prawie na pewno lepszy niż model B (Motulsky i Christopoulos (2004)); — należy porównać dwa modele metodą wzrokową, koncentrując się na tym, w jakim stopniu spełniają one przedstawione powyżej kryteria dotyczące pojedynczego modelu; — zaleca się zastosowanie zasady prostoty, która stanowi, że należy korzystać z najprostszego modelu, który można w rozsądny sposób dopasować do danych (Ratkowsky 1993, Lyles et al. 2008). Jakość szacunków ECx Przedział ufności (CI) dla ECx nie powinien być zbyt szeroki. Przy podejmowaniu decyzji dotyczącej szerokości przedziału ufności dla ECx, jaką można przyjąć, by zachować użyteczność ECx, należy kierować się właściwym osądem statystycznym. Wyniki symulacji modeli regresji dopasowanych do danych dotyczących wylęgu z jaj i wielkości wskazują, że około 75 % przedziałów ufności dla ECx (x=10, 20 lub 30) obejmuje co najwyżej dwa badane stężenia. Symulacje dostarczają ogólnych wskazówek na temat wartości, jakie można uznać za dopuszczalne, oraz praktycznych wskazówek na temat wartości, jakie są możliwe do osiągnięcia. Szereg autorów zwraca uwagę na konieczność ujawniania przedziałów ufności dla wszystkich parametrów wykorzystywanych w modelu oraz podkreśla, że ustanowienie szerokich przedziałów ufności w odniesieniu do parametrów wykorzystywanych w modelach skutkuje tym, że takie modele należy uznać za niedopuszczalne (Ott i Longnecker 2008, Alvord i Rossio 1993, Motulsky i Christopoulos 2004, Lyles et al. 2008, Seber i Wild 2003, Bunke et al. 1999, Environment Canada 2005). Przedział ufności dla ECx (lub dla jakiegokolwiek innego parametru wykorzystywanego w modelu) nie powinien zawierać zera (Motulsky i Christopoulos 2004). Wartość ta odpowiada regresji równoważnej najmniejszej istotnej różnicy często przywoływanej w podejściach dotyczących testowania hipotez (np. Wang et al. 2000). Odpowiada ona również przedziałowi ufności, ponieważ średnie reakcje przy LOEC nie obejmują średniej dla próby kontrolnej. Należy ocenić, czy szacunki dotyczące danego parametru są wiarygodne z naukowego punktu widzenia. Na przykład jeżeli przedział ufności dla y0 wynosi ±20 %, żadne szacunki EC10 nie będą wiarygodne. Jeżeli w modelu przewiduje się 20-procentowy wpływ przy stężeniu C, a maksymalny zaobserwowany wpływ przy stężeniu C i przy niższych stężeniach wynosi 10 %, wówczas wartość EC20 należy uznać za niewiarygodną (Motulsky i Christopoulos 2004, Wang et al. 2000, Environment Canada 2005). Oszacowanie wartości ECx nie powinno wiązać się z koniecznością dokonania ekstrapolacji wykraczającej poza zakres stężeń dodatnich (Draper i Smith 1999, OECD 2006). Na przykład orientacyjnie można przyjąć, że wartość ECx nie powinna być niższa od najniższego zbadanego stężenia o więcej niż 25 % lub nie powinna być wyższa od najwyższego zbadanego stężenia o więcej niż 25 %. BIBLIOGRAFIA Alvord, W.G., Rossio, J.L. (1993); Determining confidence limits for drug potency in immunoassay, Journal of Immunological Methods 157, s. 155–163. Brain P. i Cousens R. (1989); An equation to describe dose responses where there is stimulation of growth at low doses. Weed res. 29: s. 93–96. Bunke, O., Droge, B. i Polzehl, J. (1999). Model selection, transformations and variance estimation in nonlinear regression. Statistics 33, s. 197–240. Collett, D. (2002); Modelling Binary Data, wydanie drugie, Chapman and Hall, Londyn. Collett, D. (2003); Modelling Survival Data in Medical Research, wydanie drugie, Chapman and Hall, Londyn. Draper, N.R. i Smith, H. (1999); Applied Regression Analysis, wydanie trzecie. Nowy Jork: John Wiley & Sons. Environment Canada (2005); Guidance Document on Statistical Methods for Environmental Toxicity Tests, sprawozdanie EPS 1/RM/46 Huet, S., A. Bouvier, M.-A. Poursat, E. Jolivet (2003); Statistical Tools for Nonlinear Regression: A Practical Guide with S-PLUS and R Examples, Springer Series in Statistics, Nowy Jork. Lyles, R. H.,C. Poindexter, A. Evans, M. Brown, i C.R. Cooper (2008); Nonlinear Model-Based Estimates of IC50 for Studies Involving Continuous Therapeutic Dose-Response Data, Contemp Clin Trials. listopad 2008; 29(6): s. 878–886. Morgan, B.J.T. (1992); Analysis of Quantal Response Data, Chapman and Hall, Londyn. Motulsky, H., A. Christopoulos (2004); Fitting Models to Biological Data Using Linear and Nonlinear Regression: A Practical Guide to Curve Fitting, Oxford University Press, USA. O'Hara Hines, R. J. i J. F. Lawless (1993); Modelling Overdispersion in Toxicological Mortality Data Grouped over Time, Biometrics t. 49, s. 107–121. OECD (2006); Current approaches in the statistical analysis of ecotoxicity data: A guidance to application. Seria dotycząca badań i oceny, nr 54, Organizacja Współpracy Gospodarczej i Rozwoju, OECD, Paryż. Ott, R.L., M.T. Longnecker, An Introduction to Statistical Methods and Data Analysis, wydanie szóste, 2008, Brooks-Cole, Belmont, CA. Ratkowsky, D.A. (1993); Principles of nonlinear regression, Journal of Industrial Microbiology 12, s. 195–199. Seber, G.A.F., C.J. Wild, Nonlinear Regression, Wiley, 2003. Slob W. (2002); Dose-response modelling of continuous endpoints. Toxicol. Sci., 66, s. 298–312. Wang, Q., D.L. Denton i R. Shukla (2000); Applications and Statistical Properties Of Minimum Significant Difference-Based Criterion Testing In a Toxicity Testing Program, Environmental Toxicology and Chemistry, t. 19, s. 113–117, 2000. C.48. Krótkoterminowe badanie rozrodczości ryb WPROWADZENIE 1. Niniejsza metoda badawcza jest równoważna metodzie opisanej w dotyczącej badań wytycznej OECD (TG) nr 229 (2012). Konieczność opracowania i zweryfikowania badania ryb umożliwiającego wykrycie substancji chemicznych zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego wynika z obawy, że środowiskowe poziomy substancji chemicznych mogą wywoływać działania niepożądane zarówno u ludzi, jak i w przypadku dzikiej flory i fauny ze względu na interakcję tych substancji chemicznych z układem hormonalnym. W 1998 r. OECD zapoczątkowała działania o najwyższym priorytecie mające na celu przegląd istniejących wytycznych dotyczących badań i opracowanie nowych wytycznych dotyczących odsiewania i badania potencjalnych substancji zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego. Jednym z elementów tych działań było opracowanie wytycznej dotyczącej badań w odniesieniu do odsiewania substancji chemicznych oddziałujących na układ hormonalny określonych gatunków ryb. Krótkoterminowe badanie rozrodczości ryb poddano zakrojonemu na szeroką skalę programowi weryfikacji, który obejmował badania międzylaboratoryjne z wykorzystaniem wybranych substancji chemicznych, aby wykazać, że badanie przesiewowe stanowi istotną i wiarygodną metodę wykrywania substancji chemicznych, które mają wpływ na rozrodczość ryb, za pomocą różnych mechanizmów, w tym zmian hormonalnych (1, 2, 3, 4, 5). Wszystkie punkty końcowe określone w dotyczącej badań wytycznej OECD zostały zweryfikowane na strzebli wielkogłowej, przy czym podzbiór punktów końcowych zostały zweryfikowany na ryżance japońskiej (tj. witellogenina i drugorzędowe cechy płciowe) oraz na danio pręgowanym (tj. witellogenina). Działania weryfikacyjne zostały zrecenzowane częściowo przez panel ekspertów powołanych przez koordynatorów krajowych programu wytycznych dotyczących badań OECD (6), a częściowo przez niezależny panel ekspertów powołany przez Agencję Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych (29). Przedmiotowe badanie nie ma na celu zidentyfikowania konkretnych mechanizmów zaburzeń hormonalnych, ponieważ zwierzęta doświadczalne mają nieuszkodzoną oś podwzgórze-przysadka-gonady, która może reagować na substancje chemiczne wywierające wpływ na tę oś na różnych poziomach. 2. W niniejszej metodzie badawczej opisuje się badanie przesiewowe in vivo, w którym dojrzałe płciowo samce ryb i samice ryb w okresie tarła utrzymuje się razem i poddaje działaniu substancji chemicznej przez ograniczoną część ich cyklu życia (21 dni). Na zakończenie 21-dniowego okresu narażenia mierzy się dwa punkty końcowe biomarkerów u samców i samic jako wskaźniki oddziaływania badanej substancji chemicznej na układ hormonalny; te punkty końcowe to witellogenina i drugorzędowe cechy płciowe. Witellogeninę mierzy się u strzebli wielkogłowej, ryżanki japońskiej i danio pręgowanego, natomiast drugorzędowe cechy płciowe mierzy się u strzebli wielkogłowej i ryżanki japońskiej. Ponadto przez cały czas trwania badania codziennie przeprowadza się pomiar płodności w ujęciu ilościowym. Zachowuje się również gonady, dzięki czemu można przeprowadzić analizę histopatologiczną i ocenić sprawność rozrodczą zwierząt doświadczalnych, co zwiększa wagę dowodów zgromadzonych dla innych punktów końcowych. 3. Niniejszy test biologiczny pełni rolę badania przesiewowego rozrodczości in vivo, a kwestie związane z jego stosowaniem regulują postanowienia dokumentu pt. „OECD Conceptual Framework for the Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals” (30). W ramach koncepcyjnych ustanowionych w przywołanym powyżej dokumencie krótkoterminowe badanie rozrodczości ryb zostało wstępnie sklasyfikowane na poziomie 3 jako badanie in vivo dostarczające danych na temat wybranych mechanizmów/ścieżek wywierania wpływu na funkcjonowanie układu hormonalnego. ZAŁOŻENIA WSTĘPNE I OGRANICZENIA 4. Witellogenina (VTG) jest normalnie wytwarzana w wątrobie jajorodnych kręgowców płci żeńskiej w reakcji na endogenny estrogen w układzie krążenia. Jest ona prekursorem białek żółtka i po wytworzeniu w wątrobie jest przenoszona przez krew do jajnika, gdzie jest pobierana i modyfikowana przez rozwijające się jaja. Witellogenina jest niemalże niewykrywalna w osoczu niedojrzałych samic i samców ryb, ponieważ nie mają one wystarczającej ilości estrogenu w krwiobiegu; wątroba ma jednak zdolność syntezy i wydzielania witellogeniny w reakcji na egzogenną stymulację estrogenem. 5. Pomiar witellogeniny służy wykrywaniu substancji chemicznych o różnych estrogennych charakterach działania. Wykrycie estrogennych substancji chemicznych jest możliwe dzięki pomiarowi indukcji witellogeniny u samców ryb i zostało bogato udokumentowane w recenzowanej literaturze naukowej (np. (7)). Indukcję witellogeniny wykazano również po narażeniu na działanie aromatyzowalnych androgenów (8, 9). Obniżenie poziomu estrogenu w układzie krążenia w przypadku samic, na przykład na skutek inhibicji aromatazy przekształcającej endogenny androgen w naturalny estrogen 17β-estradiol, powoduje zmniejszenie poziomu VTG, którą wykorzystuje się do wykrywania substancji chemicznych działających jak inhibitory aromatazy (10, 11). Biologiczne znaczenie reakcji witellogeniny po inhibicji aktywności substancji estrogennej/aromatazy zostało ustalone i szeroko udokumentowane. Możliwe jest jednak, że na wytwarzanie VTG u samic mogą również wpływać ogólna toksyczność i niehormonalne sposoby działania toksycznego, np. hepatotoksyczność. 6. Opracowano i znormalizowano z dobrym wynikiem kilka metod pomiaru w celu rutynowego wykorzystywania. Dotyczy to metod opartych na właściwym dla danego gatunku teście immunoenzymatycznym (ELISA), w którym wykorzystuje się immunochemię do oznaczenia ilościowego wytworzonej VTG w małych próbkach krwi lub wątroby pobranych od pojedynczych osobników ryb (12, 13, 14, 15, 16, 17, 18). W celu dokonania pomiaru VTG pobiera się próbki krwi strzebli wielkogłowej, krwi lub homogenatu głowy/ogona danio pręgowanego i wątroby ryżanki. W przypadku ryżanki istnieje dobra korelacja między VTG mierzoną w próbkach krwi i wątroby (19). W dodatku 6 przedstawiono zalecane procedury pobierania próbek do celów analizy VTG. Zestawy do pomiaru VTG są powszechnie dostępne; powinny one opierać się na zweryfikowanej, właściwej dla danego gatunku metodzie ELISA. 7. Drugorzędowe cechy płciowe samców niektórych gatunków ryb są widoczne na zewnątrz, są kwantyfikowalne oraz reagują na poziom endogennych androgenów w krwiobiegu; dotyczy to strzebli wielkogłowej i ryżanki, lecz nie danio pręgowanego, który nie posiada kwantyfikowalnych drugorzędowych cech płciowych. Samice zachowują zdolność do wykształcania drugorzędowych męskich cech płciowych, gdy zostaną narażone na działanie androgennych substancji chemicznych w wodzie. W literaturze przedmiotu można znaleźć kilka badań, które dokumentują tego rodzaju reakcję u strzebli wielkogłowej (20) i ryżanki (21). Zmniejszenie nasilenia drugorzędowych cech płciowych u samców należy interpretować ostrożnie ze względu na niską wartość mocy statystycznej, opierając się na specjalistycznej opinii i wadze dowodów. Istnieją ograniczenia w zakresie wykorzystania danio pręgowanego w tym badaniu ze względu na brak kwantyfikowalnych drugorzędowych cech płciowych, które reagują na substancje chemiczne o działaniu androgennym. 8. W przypadku strzebli wielkogłowej głównym wskaźnikiem egzogennego narażenia na działanie androgenne jest liczba guzków godowych na pysku samic ryb. W przypadku ryżanki liczba procesów tworzenia się brodawek stanowi główny marker egzogennego narażenia samic ryb na substancje chemiczne o działaniu androgennym. W dodatkach 5A i 5B wskazano zalecane procedury, które należy stosować do oceny cech płciowych odpowiednio u strzebli wielkogłowej i ryżanki. 9. W ramach 21-dniowego badania ryb przeprowadza się ilościową ocenę wytwarzania jaj oraz zachowuje się gonady na potrzeby ewentualnej analizy histopatologicznej. Niektóre organy regulacyjne mogą ustanowić wymóg stosowania takiego dodatkowego punktu końcowego, aby zapewnić możliwość przeprowadzenia bardziej kompletnej oceny sprawności rozrodczej zwierząt doświadczalnych lub w przypadkach, gdy witellogenina i drugorzędowe cechy płciowe nie reagują na narażenie na działanie substancji chemicznej. Choć niektóre punkty końcowe mogą mieć wysoce diagnostyczny charakter (np. indukcja VTG u samców i tworzenie się guzków u samic), nie wszystkie punkty końcowe (np. płodność i histopatologia gonad) wykorzystywane w badaniu mają w założeniu umożliwić jednoznaczną identyfikację określonych mechanizmów oddziaływania komórkowego. Zestaw punktów końcowych, traktowanych zbiorczo, zapewnia możliwość wyciągnięcia pewnych wniosków dotyczących potencjalnych zaburzeń funkcjonowania układu hormonalnego i tym samym zapewnia wskazówki w zakresie prowadzenia dalszych badań. Choć płodność nie stanowi parametru specyficznego dla funkcjonowania układu hormonalnego, z uwagi na jej udowodnioną wrażliwość na znane substancje chemiczne zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (5), stanowi ona istotny punkt końcowy, który należy wziąć pod uwagę, ponieważ jeżeli ten i pozostałe punkty końcowe pozostaną niezmienione, pozwoli to uzyskać większy poziom pewności co do tego, że dany związek chemiczny prawdopodobnie nie zaburzy funkcjonowania układu hormonalnego. Jeżeli jednak odnotowany zostanie wpływ na płodność, będzie to miało istotne znaczenie dla wniosków wyciągniętych na podstawie wagi dowodów. Wytyczne w zakresie interpretacji danych i przyjmowania wyników badań przedstawiono w dalszej części niniejszej metody badawczej. 10. Definicje stosowane w niniejszej metodzie badawczej przedstawiono w dodatku 1. ZASADA BADANIA 11. W trakcie badania samce i samice ryb w stanie reprodukcyjnym poddaje się wspólnie narażeniu w naczyniach badawczych. Ich status osobników dorosłych oraz ich stan reprodukcyjny pozwalają na wyraźne rozróżnienie płci, a tym samym na przeprowadzenie związanej z płcią analizy każdego punktu końcowego, jak również zapewniają wrażliwość na egzogenne substancje chemiczne. Po zakończeniu badania płeć potwierdza się w badaniu makroskopowym gonad po otwarciu brzucha wzdłuż linii środkowej za pomocą nożyczek. Przegląd odpowiednich warunków testu biologicznego przedstawiono w dodatku 2. Badanie zwykle rozpoczyna się od pobrania próbki ryb z populacji w okresie tarła; nie należy wykorzystywać starzejących się zwierząt. Wytyczne dotyczące wieku ryb i stanu reprodukcyjnego podano w części dotyczącej wyboru ryb. Badanie przeprowadza się z zastosowaniem trzech stężeń ekspozycyjnych, jak również próby kontrolnej z wodą oraz, w razie potrzeby, próby kontrolnej z rozpuszczalnikiem. W przypadku danio pręgowanego stosuje się dwa naczynia lub kontrpróby na zabieg (każde naczynie zawiera 5 samców i 5 samic). W przypadku strzebli wielkogłowej stosuje się cztery naczynia lub kontrpróby na zabieg (każde naczynie zawiera 2 samce i 4 samice). Służy to odzwierciedleniu zachowania terytorialnego samców strzebli wielkogłowej, przy równoczesnym utrzymaniu wystarczającej mocy testu. W przypadku ryżanki stosuje się cztery naczynia lub kontrpróby na zabieg (każde naczynie zawiera 3 samce i 3 samice). Narażenie trwa 21 dni, a pobieranie próbek ryb odbywa się w 21. dniu narażenia. Pomiar płodności w ujęciu ilościowym przeprowadza się codziennie. 12. Po pobraniu próbek w 21. dniu wszystkie zwierzęta uśmierca się w sposób humanitarny. Drugorzędowe cechy płciowe mierzy się u strzebli wielkogłowej i ryżanki (zob. dodatek 5A i dodatek 5B); próbki krwi pobiera się w celu oznaczenia VTG u danio pręgowanego i strzebli wielkogłowej, ewentualnie można pobrać głowę/ogon w celu oznaczenia VTG u danio pręgowanego (dodatek 6); w celu analizy VTG u ryżanki pobiera się wątrobę (dodatek 6); gonady utrwala się w całości albo poddaje się je sekcji na potrzeby ewentualnej analizy histopatologicznej (22). KRYTERIA DOPUSZCZALNOŚCI BADANIA 13. Aby wyniki badania były dopuszczalne, muszą zostać spełnione następujące warunki: — upadkowość w próbach kontrolnych z wodą (lub rozpuszczalnikiem) nie powinna przekraczać 10 procent na koniec okresu narażenia; — stężenie rozpuszczonego tlenu powinno wynosić co najmniej 60 procent wartości nasycenia powietrzem (ASV) w trakcie okresu narażenia; — różnica temperatury wody między naczyniami badawczymi przez cały okres narażenia nie może być większa niż ± 1,5 °C i musi być utrzymywana w obrębie 2 °C w zakresie temperatur określonym w odniesieniu do gatunku doświadczalnego (dodatek 2); — powinny być dostępne dowody pozwalające wykazać, że stężenia badanej substancji chemicznej w roztworze utrzymano w granicach ± 20 % średnich wartości pomiarowych; — powinny być dostępne dowody świadczące o aktywnym wylęgu we wszystkich kontrpróbach przed narażeniem na działanie substancji chemicznej oraz w kontrpróbach kontrolnych w trakcie badania. OPIS METODY Aparatura 14. Zwykły sprzęt laboratoryjny, w szczególności: a) mierniki tlenu i pehametry; b) sprzęt do oznaczania twardości i zasadowości wody; c) odpowiednia aparatura do pomiaru temperatury, zalecane jest stałe monitorowanie; d) zbiorniki wykonane z chemicznie obojętnego materiału o odpowiedniej objętości w zależności od zalecanego obciążenia i obsady (zob. dodatek 2); e) podłoże tarłowe dla strzebli wielkogłowej i danio pręgowanego, niezbędne informacje szczegółowe podano w dodatku 4; f) waga o odpowiedniej dokładności (tj. dokładności do ± 0,5 mg). Woda 15. Badanie można przeprowadzić w każdej wodzie, w której gatunki doświadczalne wykazują odpowiednie długoterminowe przeżycie i wzrost. Powinna mieć ona stałą jakość w okresie trwania badania. Wartość pH wody powinna mieścić się w zakresie 6,5–8,5, lecz w trakcie danego badania powinna wynosić ± 0,5 jednostek pH. Aby upewnić się, że woda rozcieńczająca nie będzie wpływała zbytnio na wyniki badania (np. na skutek kompleksowania badanej substancji chemicznej), należy okresowo pobierać próbki wody do analizy. Jeżeli wiadomo, że woda rozcieńczająca ma względnie stałą jakość, należy dokonywać pomiaru, np. co trzy miesiące, zawartości metali ciężkich (np. Cu, Pb, Zn, Hg, Cd i Ni), głównych anionów i kationów (np. Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl- i SO4 2-), pestycydów (np. całkowitej zawartości pestycydów fosforoorganicznych i chloroorganicznych), całkowitego węgla organicznego i zawiesiny. Jeśli można wykazać, że jakość wody była stała przez co najmniej rok, oznaczeń można dokonywać rzadziej i w większych odstępach czasu (np. co sześć miesięcy). Niektóre właściwości chemiczne dopuszczalnej wody rozcieńczającej wymieniono w dodatku 3. Roztwory do badań 16. Roztwory do badań o wybranych stężeniach przygotowuje się przez rozcieńczenie roztworu podstawowego. Zalecane jest przygotowanie roztworu podstawowego przez zwykłe wymieszanie lub zbełtanie badanej substancji chemicznej w wodzie rozcieńczającej w sposób mechaniczny (np. za pomocą mieszadła lub ultradźwięków). Kolumny nasyceniowe (rozpuszczające) stosuje się w celu uzyskania odpowiednio stężonego roztworu podstawowego. Nie zaleca się stosowania nośnika rozpuszczalnikowego. W przypadku gdy rozpuszczalnik jest niezbędny, należy równolegle przeprowadzić próbę kontrolną z rozpuszczalnikiem w tym samym stężeniu rozpuszczalnika, które zastosowano przy podaniach substancji chemicznej. W przypadku substancji chemicznych, których badanie nastręcza trudności, rozpuszczalnik możne stanowić najlepsze rozwiązanie z technicznego punktu widzenia; należy zapoznać się z wytyczną OECD „Guidance Document on aquatic toxicity testing of difficult substances and mixtures” (23). Wybór rozpuszczalnika będzie uwarunkowany właściwościami chemicznymi danej substancji lub mieszaniny. W wytycznych OECD zaleca się maksymalne stężenie 100 μl/l, które należy zachować. W ostatnim przeglądzie (24) podkreślono jednak dodatkowe obawy związane ze stosowaniem rozpuszczalników do badania funkcjonowania układu hormonalnego. W związku z tym zaleca się, aby w razie konieczności minimalizować stężenie rozpuszczalnika, jeżeli tylko jest to technicznie wykonalne (w zależności od właściwości fizykochemicznych badanej substancji chemicznej). 17. Zastosowany zostanie przepływowy układ badawczy. System taki ciągle dozuje i rozcieńcza roztwór podstawowy badanej substancji chemicznej (np. pompa dozująca, rozcieńczalnik proporcjonalny, układ nasycalnika) do przesyłania szeregu stężeń do komór badawczych. W trakcie badania należy okresowo, najlepiej codziennie, sprawdzać natężenia przepływu roztworów podstawowych i wody rozcieńczającej, które przez cały czas trwania badania nie powinny różnić się o więcej niż 10 %. Należy starać się unikać stosowania rur z tworzywa sztucznego niskiej klasy lub innych materiałów, które mogą zwierać aktywne biologicznie substancje chemiczne. Podczas selekcji materiału do przepływowego układu badawczego należy rozważyć możliwą adsorpcję badanej substancji chemicznej do danego materiału. Utrzymywanie ryb 18. Ryby doświadczalne należy wybrać z populacji laboratoryjnej, najlepiej z jednego stada, które przez co najmniej dwa tygodnie przed badaniem było aklimatyzowane w warunkach jakości wody i oświetlenia zbliżonych do stosowanych w badaniu. Ważne jest, aby wskaźnik obciążenia i obsada (definicje można znaleźć w dodatku 1) były odpowiednie dla gatunków doświadczalnych (zob dodatek 2). 19. Po 48-godzinnym okresie adaptacji odnotowuje się upadkowość i zastosowanie mają następujące kryteria: — upadkowość przekracza 10 % populacji w ciągu siedmiu dni: należy odrzucić całą partię; — upadkowość na poziomie 5–10 % populacji: aklimatyzacja przez siedem dodatkowych dni; jeżeli upadkowość przekroczy 5 % w ciągu tych kolejnych siedmiu dni, należy odrzucić całą partię; — upadkowość mniejsza niż 5 % populacji w ciągu siedmiu dni: dopuścić partię. 20. Ryby nie powinny być leczone na żadną chorobę w okresie aklimatyzacji, w okresie poprzedzającym narażenie ani w okresie narażenia. Okres poprzedzający narażenie i wybór ryb 21. Zaleca się tygodniowy lub dwutygodniowy okres poprzedzający narażenie, w którym zwierzęta umieszcza się w naczyniach podobnych do faktycznych naczyń użytych do badania. Ryby należy karmić bez ograniczeń przez cały okres trzymania i na etapie narażenia. Etap narażenia rozpoczyna się z wykorzystaniem dymorficznych płciowo dorosłych ryb z laboratoryjnego źródła zwierząt dojrzałych płciowo (np. o wyraźnych drugorzędowych cechach płciowych widocznych w przypadku strzebli wielkogłowej i ryżanki), które wykazują aktywność tarłową. Zgodnie z ogólną wytyczną (której nie należy stosować w oderwaniu od obserwacji rzeczywistego stanu reprodukcyjnego danej partii ryb) strzebli wielkogłowe powinny być w wieku około 20 tygodni (± 2 tygodnie), zakładając, że były hodowane w temperaturze 25 ± 2 °C przez całą długość życia. Ryżanki japońskie powinny być w wieku około 16 tygodni (± 2 tygodnie), zakładając, że były hodowane w temperaturze 25 ± 2 °C przez całą długość życia. Danio pręgowane powinny być w wieku około 16 tygodni (± 2 tygodnie), zakładając, że były hodowane w temperaturze 26 ± 2 °C przez całą długość życia. Ocenę wytwarzania jaj powinno się przeprowadzać na etapie poprzedzającym narażenie na działanie substancji. Zaleca się obserwację tarła we wszystkich zbiornikach z kontrpróbą przed włączeniem go do etapu badania, na którym następuje narażenie na działanie substancji. Na tym etapie orientacyjne ustalenie pożądanej liczby jaj, jaka powinna zostać wytworzona każdego dnia, nie jest możliwe, ale z ogólnych obserwacji można wywnioskować, że średnia liczba jaj jest większa niż 10 jaj na samicę dziennie dla poszczególnych gatunków. Aby zapewnić równomierny rozkład kontrprób, przy przypisywaniu kontrprób do poszczególnych poziomów doświadczalnych należy stosować układ bloków losowanych sporządzony w oparciu o dane dotyczące wytwarzania jaj. PLAN BADANIA 22. Stosuje się trzy stężenia badanej substancji chemicznej, jedną próbę kontrolną (z wodą) i, w razie potrzeby, jedną próbę kontrolną z rozpuszczalnikiem. Dane można analizować w celu określenia statystycznie istotnych różnic między reakcjami w grupie badanej i grupie kontrolnej. Analizy te dostarczą informacji, czy wymagane jest dalsze długoterminowe badanie substancji chemicznej pod kątem działania niepożądanego (mianowicie wpływu na przeżycie, rozwój, wzrost i rozrodczość), czy też badanie takie ma służyć do wykorzystania w ocenie ryzyka (25). 23. W przypadku danio pręgowanego w 21. dniu doświadczenia pobiera się próbkę samców i samic z każdej grupy poddanej działaniu substancji chemicznej o określonym stężeniu (5 samców i 5 samic z każdej z dwóch kontrprób) i z grup kontrolnych w celu dokonania pomiaru witellogeniny. W przypadku ryżanki w 21. dniu doświadczenia pobiera się próbkę samców i samic z każdej grupy poddanej działaniu substancji chemicznej o określonym stężeniu (3 samców i 3 samic z każdej z dwóch kontrprób) i z grup kontrolnych w celu dokonania pomiaru witellogeniny i, w stosownych przypadkach, drugorzędowych cech płciowych. W przypadku strzebli wielkogłowej w 21. dniu narażenia pobiera się próbkę samców i samic (2 samce i 4 samice z każdej z czterech kontrprób i z grup kontrolnych) w celu dokonania pomiaru witellogeniny i drugorzędowych cech płciowych. Należy przeprowadzić ilościową ocenę płodności, przy czym w stosownych przypadkach należy utrwalić tkanki gonad w całości lub poddać je sekcji do celów ewentualnej oceny histopatologicznej. Dobór badanych stężeń 24. Do celów niniejszego badania najwyższym badanym stężeniem substancji chemicznej powinna być wartość maksymalnego tolerowanego stężenia wyznaczonego w badaniu ustalającym zakres lub za pomocą innych danych dotyczących toksyczności, 10 mg/l albo wartość maksymalnej rozpuszczalności w wodzie, w zależności od tego, która wartość jest najniższa. Maksymalne tolerowane stężenie definiuje się jako najwyższe badane stężenie substancji chemicznej, którego skutkiem jest upadkowość na poziomie poniżej 10 %. Przy zastosowaniu tego podejścia zakłada się istnienie empirycznych danych dotyczących przypadków ostrej toksyczności lub innych danych dotyczących toksyczności, na podstawie których można oszacować maksymalne tolerowane stężenie. Oszacowanie MTC może być niedokładne i zazwyczaj wymaga jeszcze oceny specjalistów. 25. Wymagane są trzy badane stężenia, które różnią się o taką samą wielokrotność nieprzekraczającą 10, oraz próba kontrolna z wodą rozcieńczającą (oraz, w razie potrzeby, z rozpuszczalnikiem). Zaleca się krotność odstępu wynoszącą od 3,2 do 10. PROCEDURA Wybór i ważenie ryb doświadczalnych 26. Istotne jest, aby zminimalizować zmienność masy ryb na początku badania. Odpowiedni zakres wielkości dla różnych gatunków zalecanych do wykorzystania w tym badaniu podano w dodatku 2. W odniesieniu do całej partii ryb wykorzystanych w badaniu zakres poszczególnych mas samców i samic ryb na początku badania należy w miarę możliwości utrzymać w zakresie ± 20 % średniej arytmetycznej masy dla tej samej płci. Zaleca się zważenie podpróbki ze stada ryb przed rozpoczęciem badania w celu oszacowania średniej masy. Warunki narażenia na działanie substancji Czas trwania 27. Czas trwania badania, następujący po okresie poprzedzającym narażenie, wynosi 21 dni. Zalecany okres poprzedzający narażenie wynosi dwa tygodnie. Karmienie 28. Ryby należy karmić bez ograniczeń, podając odpowiedni pokarm (dodatek 2), w porcjach wystarczających do utrzymania stanu zdrowia. Należy dołożyć starań, aby zapobiec rozwojowi mikroorganizmów i mętności wody. Zgodnie z ogólną wytyczną dzienną dawkę pokarmową można podzielić na dwie lub trzy równe porcje podawane w kilku posiłkach dziennie w odstępach co najmniej trzech godzin między poszczególnymi posiłkami. Dopuszczalna jest jedna większa dawka, w szczególności w weekendy. Karmienia ryb należy zaprzestać na 12 godzin przed pobraniem próbek/sekcją. 29. Paszę dla ryb należy ocenić pod kątem obecności zanieczyszczeń takich jak pestycydy chloroorganiczne, wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne (WWA), polichlorowane bifenyle (PCB). Należy unikać pokarmów o podwyższonej zawartości fitoestrogenów, które mogłyby wypaczyć reakcję w trakcie badania na znanego agonistę estrogenu (np. 17b-estradiol). 30. Niespożyty pokarm i odchody należy usuwać z naczyń badawczych co najmniej dwa razy w tygodniu, np. ostrożnie czyszcząc dno każdego zbiornika za pomocą syfonu. Światło i temperatura 31. Fotoperiod i temperatura wody powinny być odpowiednie dla gatunku doświadczalnego (zob. dodatek 2). Częstotliwość oznaczeń i pomiarów analitycznych 32. Przed rozpoczęciem okresu narażenia należy upewnić się, że system podawania substancji chemicznej działa prawidłowo. Należy ustalić wszystkie potrzebne metody analityczne, w tym zgromadzić dostateczną wiedzę na temat stabilności chemicznej układu badawczego. W trakcie badania stężenia badanej substancji chemicznej oznacza się w regularnych odstępach czasu w następujący sposób: natężenia przepływu rozcieńczalnika i roztworu podstawowego substancji toksycznej należy sprawdzać najlepiej codziennie, a co najmniej dwa razy na tydzień, przy czym nie powinny one różnić się o więcej niż 10 % przez cały czas trwania badania. Zaleca się, aby faktyczne stężenia badanej substancji chemicznej mierzyć we wszystkich naczyniach na początku badania, a następnie w odstępach tygodniowych. 33. Zaleca się, aby wyniki były oparte na mierzonych stężeniach. Jeżeli jednak stężenie badanej substancji chemicznej w roztworze można z powodzeniem utrzymywać w zakresie ± 20 % stężenia nominalnego przez cały czas trwania badania, wówczas wyniki mogą opierać się albo na wartościach nominalnych, albo na wartościach pomiarowych. 34. Próbki mogą wymagać przefiltrowania (np. przez filtr z porami o średnicy 0,45 μm) lub odwirowania. Jeżeli jest to konieczne, wówczas zalecaną procedurą jest odwirowanie. Jeżeli jednak badany materiał nie ulega adsorpcji na filtrze, dopuszczalna jest też filtracja. 35. Podczas badania we wszystkich naczyniach badawczych co najmniej raz na tydzień należy zmierzyć stężenie rozpuszczonego tlenu, temperaturę i pH. Całkowitą twardość i zasadowość należy mierzyć w próbach kontrolnych i w jednym naczyniu przy najwyższym stężeniu co najmniej raz na tydzień. Zalecane jest stałe monitorowanie temperatury w co najmniej jednym naczyniu badawczym. Obserwacje 36. W czasie trwania badania albo po jego zakończeniu ocenia się szereg reakcji ogólnych (np. przeżycie) i reakcji biologicznych (np. poziomy VTG). Należy codziennie monitorować płodność w ujęciu ilościowym. Procedurę pomiaru i oceny tych punktów końcowych i ich przydatność opisano poniżej. Przeżycie 37. W okresie badania ryby należy badać codziennie i odnotowywać wszelkie przypadki śmiertelne, zaś martwe ryby należy jak najszybciej usuwać. Martwych ryb nie należy zastępować ani w naczyniu kontrolnym, ani w naczyniu z badaną substancją. Płeć ryb, które umierają w trakcie badania, należy ustalić poprzez makroskopową ocenę gonad. Zachowanie i wygląd 38. Należy odnotować wszelkie przypadki nietypowego zachowania (w porównaniu z grupami kontrolnymi), które mogą obejmować oznaki ogólnej toksyczności, w tym hiperwentylację, nieskoordynowane pływanie, utratę równowagi i nietypowy spokój lub żerowanie. Dodatkowo należy odnotować anomalie zewnętrzne (takie jak krwotok, sinica). Do takich oznak toksyczności należy podchodzić ostrożnie podczas interpretacji danych, ponieważ mogą one wskazywać na stężenia, przy których biomarkery aktywności hormonalnej nie są wiarygodne. Takie obserwacje zachowania mogą również dostarczyć przydatnych informacji jakościowych na potrzeby potencjalnych przyszłych wymogów dotyczących badań ryb. Na przykład zaobserwowano agresję terytorialną u normalnych samców lub zmaskulinizowanych samic strzebli wielkogłowej po narażeniu na substancję o działaniu androgennym; u danio pręgowanego charakterystyczne zachowania związane z kryciem i tarłem po pojawieniu się światła o brzasku ulegają ograniczeniu lub zmniejszeniu wskutek narażenia na substancje o działaniu estrogennym i antyandrogennym. 39. Ponieważ niektóre aspekty wyglądu (przede wszystkim zabarwienie) mogą zmieniać się szybko w zależności od sposobu postępowania, ważne jest, aby obserwacji jakościowych dokonywać przed usunięciem zwierząt z układu badawczego. Jak wynika z dotychczasowych doświadczeń ze strzeblami wielkogłowymi, niektóre substancje chemiczne zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego mogą początkowo wywoływać zmiany w następujących cechach zewnętrznych: zabarwieniu ciała (jasne albo ciemne), wzorze zabarwienia (występowanie pionowych pręg) i kształcie ciała (głowa i obszar piersiowy). Dlatego też wygląd fizyczny ryb należy obserwować w trakcie badania i po jego zakończeniu. Płodność 40. Rezultaty codziennych obserwacji ilościowych tarła powinny być zapisywane dla poszczególnych kontrprób. Dane dotyczące wytwarzania jaj powinny być zapisywane dla poszczególnych kontrprób w następującym formacie: liczba jaj / żywą samicę / dzień. Jaja będą codziennie usuwane z komór badawczych. W przypadku strzebli wielkogłowej i danio pręgowanego podłoża tarłowe powinny zostać umieszczone w komorze badawczej, aby zapewnić rybom możliwość tarła w normalnych warunkach. W dodatku 4 przedstawiono dalsze szczegółowe informacje na temat zalecanych podłoży tarłowych dla danio pręgowanego (dodatek 4A) i strzebli wielkogłowej (dodatek 4B). Zapewnienie podłoża tarłowego dla ryżanki nie jest konieczne. Humanitarne uśmiercanie ryb 41. W 21. dniu, tj. po zakończeniu narażenia, ryby należy uśmiercić, podając im odpowiednie ilości tricainy (MS-222) (CAS 886-86-2) 100-500 mg/l buforowanej 300 mg/l NaHCO3 (wodorowęglanu sodu, CAS 144-55-8) w celu ograniczenia podrażnienia błon śluzowych; następnie pobiera się próbki krwi lub tkanek w celu oznaczenia witellogeniny, jak wyjaśniono w części dotyczącej witellogeniny. Obserwacja drugorzędowych cech płciowych 42. Niektóre substancje chemiczne zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego mogą wywoływać zmiany w wyspecjalizowanych drugorzędowych cechach płciowych (liczbie guzków godowych u strzebli wielkogłowej, procesie tworzenia się brodawek u samców ryżanki). Zwłaszcza substancje chemiczne o określonym charakterze działania mogą powodować nietypowe pojawianie się drugorzędowych cech płciowych u zwierząt przeciwnej płci; na przykład substancje będące agonistami receptorów androgenowych, takie jak trenbolon, metylotestosteron i dihydrotestosteron, mogą spowodować powstawanie u samic strzebli wielkogłowej widocznych guzków godowych lub tworzenie się brodawek u samic ryżanki (11, 20, 21). Odnotowano również, że agonisty receptorów estrogenowych mogą zmniejszać liczebność guzków godowych i wielkość wyściółki tłuszczowej na grzbiecie u dorosłych samców strzebli wielkogłowej (26, 27). Takie całościowe obserwacje morfologiczne mogą również dostarczyć przydatnych informacji ilościowych i jakościowych na potrzeby potencjalnych przyszłych wymogów dotyczących badań ryb. Liczbę i wielkość guzków godowych u strzebli wielkogłowej i procesów tworzenia się brodawek u ryżanki można określić ilościowo bezpośrednio albo, co jest bardziej praktycznym sposobem, u utrwalonych okazów. Zalecane procedury oceny drugorzędowych cech płciowych u strzebli wielkogłowej i ryżanki znaleźć odpowiednio w dodatkach 5A i 5B. Witellogenina (VTG) 43. Krew pobiera się z tętnicy/żyły ogonowej za pomocą kapilary mikrohematokrytowej powlekanej heparyną lub ewentualnie przez nakłucie serca za pomocą strzykawki. W zależności od wielkości ryby objętość krwi, jaką można pobrać, wynosi zwykle 5–60 μl na osobnika w przypadku strzebli wielkogłowej i 5–15 μl na osobnika w przypadku danio pręgowanego. Osocze oddziela się od krwi przez odwirowanie i przechowuje z inhibitorami proteaz w temperaturze -80 °C do czasu przeprowadzenia analizy pod kątem VTG. Alternatywnym źródłem tkanki do oznaczenia VTG u ryżanki będzie wątroba, zaś u danio pręgowanego można wykorzystać homogenat głowy/ogona (dodatek 6). Pomiar VTG powinien opierać się na zweryfikowanej homologicznej metodzie ELISA, w której wykorzystuje się homologiczną normę VTG i homologiczne przeciwciała. Zaleca się stosowanie metody pozwalającej na wykrycie poziomów VTG wynoszących zaledwie kilka ng/ml osocza (lub ng/ml tkanki), co stanowi poziom tła w przypadku samców ryb nienarażonych na działanie substancji. 44. Kontrola jakości analizy poziomu VTG zostanie przeprowadzona z wykorzystaniem norm, prób ślepych i przynajmniej analiz powtórnych. W przypadku każdej metody ELISA należy przeprowadzić test na wpływ matrycy (wpływ rozcieńczenia próbki) w celu oznaczenia minimalnego współczynnika rozcieńczenia próbki. Każda płytka do testu ELISA wykorzystana do badań VTG powinna zawierać następujące próbki kontroli jakości: co najmniej 6 wzorców kalibracyjnych obejmujących zakres oczekiwanych stężeń VTG i co najmniej jedną niespecyficzną, wiążącą próbę ślepą badania (poddawaną analizom powtórnym). Absorbancja tych prób ślepych powinna wynosić poniżej 5 % maksymalnej absorbancji wzorca ka