ZAŁĄCZNIK I

Metody przeprowadzania testów w celu wykrycia i identyfikacji określonego agrofaga, o których mowa w art. 3 ust. 2

1. Przeprowadzanie testów za pomocą zarodników

W celu wykrywania i identyfikacji wykorzystuje się zarodnie letnie i zarodniki przetrwalnikowe, które uzyskuje się z gleby po przesianiu lub bezpośrednio z materiału roślinnego.

2. Metody wykrywania

W celu ekstrakcji z gleby zarodników określonego agrofaga stosuje się jedną z następujących metod:

a) metoda przesiewania gleby opisana przez Pratt (1976) (1);

b) metoda przesiewania gleby opisana przez van Leeuwen et al. (2005) (2);

c) technika wirowania warstwowego do wysokowydajnego testowania próbek opisana przez Wandera et al. (2007) (3).

3. Metody identyfikacji

Wyekstrahowane zarodniki określonego agrofaga identyfikuje się jedną z następujących metod:

a) identyfikacja morfologiczna pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 100–400x;

b) konwencjonalny PCR z zastosowaniem starterów według Lévesque et al. (2001) (4) oraz van den Boogert et al. (2005) (5);

c) PCR w czasie rzeczywistym z zastosowaniem starterów i sond według van Gent-Pelzer et al. (2010) (6);

d) PCR w czasie rzeczywistym z zastosowaniem starterów i sond według Smith et al. (2014) (7).

4. Żywotność zarodników przetrwalnikowych

Żywotność zarodników przetrwalnikowych można określić za pomocą badania mikroskopowego lub testu biologicznego. Żywotność zarodników można określić za pomocą badania mikroskopowego zarodni umieszczonych w laktofenolu lub w wodzie (Przetakiewicz 2015) (8). Zarodnie z ziarnistą zawartością lub z protoplazmą lekko oddzieloną od ściany można uznać za żywe. Te, które uległy trwałej plazmolizie lub nie zawierają widocznej zawartości, uznaje się za martwe.

Alternatywnie lub w przypadku wątpliwości można przeprowadzić test biologiczny zgodnie z opisem w załączniku IV pkt 3.

5. Określanie patotypów

Do określenia patotypów potrzebne są świeże narośla.

Inokulum do badania przygotowuje się, stosując jedną z poniższych metod:

a) metodę SASA (Science and Advice for Scottish Agriculture), składającą się z dwóch następujących etapów: (i) wytworzenie inokulum Starą (brązową) tkankę naroślową dzieli się na mniejsze kawałki i suszy na powietrzu w temperaturze pokojowej, aż stanie się twarda. Twardą tkankę rozdrabnia się ręcznie albo mechanicznie. Rozdrobniony materiał przesiewa się na sucho, zbierając frakcję od 25 do 75 μm, a następnie poddaje ekstrakcji metodą chloroformową według Pratt (1976)1; (ii) wytworzenie świeżych narośli Około 10 mg wyekstrahowanych zarodników przetrwalnikowych rozsypuje się na powierzchni 10 ml sterylnej wody destylowanej na małej plastikowej płytce Petriego i inkubuje w ciemności w temperaturze 20 °C do momentu kiełkowania. Bulwy ziemniaka z małymi kiełkami o długości około 1–2 mm umieszcza się w przezroczystych plastikowych pojemnikach wyłożonych wilgotną bibułą, z zaznaczonymi kiełkami skierowanymi do góry. Kiełki otacza się roztopioną wazeliną za pomocą strzykawki. Pierścień powinien być szczelny i na tyle wysoki, aby zawiesina zarodników nie przeciekała. 10 ml kiełkujących zarodników przetrwalnikowych rozcieńcza się dodatkowo do 20 ml sterylną wodą i umieszcza w pierścieniach za pomocą pipety lub wyciskanej butelki, aż kiełek będzie całkowicie zanurzony w zawiesinie zarodników. Plastikowe pojemniki przykrywa się pokrywkami i inkubuje przez 4 dni w temperaturze 10 °C, po czym otwiera się je, usuwa inokulum i pierścienie wazelinowe, a pojemniki przenosi do zraszanej szklarni o temperaturze 15–18 °C (16 godzin światła);

b) metodę Spiekermanna i Kotthoffa (1924) (9);

c) metodę Potočka et al. (1991) (10);

d) metodę Glynne-Lemmerzahl (Glynne 1925 (11); Lemmerzahl 1930 (12); Noble i Glynne 1970 (13)).

W celu określenia wszystkich patotypów, o których wiadomo, że są istotne dla Unii (1(D1), 2(G1), 6(O1), 18(T1) i 38(Nevşehir)), stosuje się test różnicujący na podstawie reakcji na zakażenie różnych odmian określonej rośliny, jak wskazano w tabeli. Test na zakażenie przeprowadza się zgodnie z protokołem wymienionym w lit. d) (metoda Glynne’a-Lemmerzahla).

Selektywna wrażliwość odmian ziemniaka w celu określania patotypów S. endobioticum

Odmiana uprawna Patotypy S. endobioticum 1(D1) 2(G1) 6(O1) 18(T1) 38(Nevşehir) Tomensa/Evora/Deodara S S S S S Irga/Producent R S S S S Talent R R* R* S S Saphir R S R R S Ikar/Gawin/Karolin/Belita R R R R R „S”: Podatne „R”: Odporne *: Wskazuje na słabą podatność odmiany na S. endobioticum („występowanie pól zarodników nieotoczonych nekrozą, bez tworzenia się narośli”).

(1) Pratt MA. (1976), „A wet-sieving and flotation technique for the detection of resting sporangia of Synchytrium endobioticum in soil”, Annals of Applied Biology nr 82, s. 21–29.

(2) van Leeuwen GCM., Wander JGN., Lamers J., Meffert JP., van den Boogert PHJF., Baayen RP. (2005), „Direct examination of soil for sporangia of Synchytrium endobioticum using chloroform, calcium chloride and zinc sulphate as extraction reagents”, EPPO Bulletin nr 35, s. 25–31.

(3) Wander JGN., van den Berg W., van den Boogert PHJF., Lamers JG., van Leeuwen GCM., Hendrickx G., Bonants P. (2007), „A novel technique using the Hendrickx centrifuge for extracting winter sporangia of Synchytrium endobioticum from soil”, European Journal of Plant Pathology nr 119, s. 165–174.

(4) Lévesque CA., de Jong SN., Ward LJ. i de Boer SH. (2001), „Molecular phylogeny and detection of Synchytrium endobioticum, the causal agent of potato wart”, Canadian Journal of Plant Pathology nr 23, s. 200–201.

(5) van den Boogert PHJF., van Gent-Pelzer MPE., Bonants PJM., de Boer SH., Wander JGN., Lévesque CA., van Leeuwen GCM., Baayen RP. (2005), „Development of PCR-based detection methods for the quarantine phytopathogen Synchytrium endobioticum, causal agent of potato wart disease”, European Journal of Plant Pathology nr 113, s. 47–57.

(6) van Gent-Pelzer MPE., Krijger M., Bonants PJM. (2010), „Improved real-time PCR assay for the detection of the quarantine potato pathogen, Synchytrium endobioticum, in zonal centrifuge extracts from soil and in plants”, European Journal of Plant Pathology nr 126, s. 129–133.

(7) Smith DS., Rocheleau H., Chapados JT., Abbott C., Ribero S., Redhead SA., Lévesque CA., De Boer SH. (2014), „Phylogeny of the genus Synchytrium and the development of TaqMan PCR assay for sensitive detection of Synchytrium endobioticum in soil”, Phytopathology nr 104, s. 422–432.

(8) Przetakiewicz J. (2015), „The Viability of Winter Sporangia of Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. from Poland.”, American Journal of Potato Research nr 92, s. 704–708.

(9) Spieckermann A., Kotthoff P. (1924), „Testing potatoes for wart resistance”, Deutsche Landwirtschaftliche Presse nr 51, s. 114–115.

(10) Potoček J., Krajíčková K., Klabzubová S., Krejcar Z., Hnízdil M., Novák F., Perlová V. (1991), „Identification of new Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. pathotypes in Czech Republic”, Ochrana Rostlin nr 27, s. 191–205.

(11) Glynne MD. (1925), „Infection experiments with wart disease of potatoes. Synchytrium endobioticum”, Annals of Applied Biology nr 12, s. 34–60.

(12) Lemmerzahl J. (1930), „A new simplified method for inoculation of potato cultivars to test for wart resistance”, Züchter nr 2, s. 288–297.

(13) Noble M., Glynne MD. (1970), „Wart disease of potatoes”, FAO Plant Protection Bulletin nr 18, s. 125–135.