DYREKTYWA KOMISJI 2006/56/WE

z dnia 12 czerwca 2006 r.

zmieniająca załączniki do dyrektywy Rady 93/85/EWG w sprawie zwalczania bakteriozy pierścieniowej ziemniaka

KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH,

uwzględniając Traktat ustanawiający Wspólnotę Europejską,

uwzględniając dyrektywę Rady 93/85/EWG z dnia 4 października 1993 r. (1) w sprawie zwalczania bakteriozy pierścieniowej ziemniaka, w szczególności jej art. 12,

a także mając na uwadze, co następuje:

Jednym z ważnych organizmów szkodliwych dla ziemniaka jest Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., czynnik chorobotwórczy powodujący bakteriozę pierścieniową ziemniaka (zwany dalej „organizmem”).

Jeśli chodzi o techniczne elementy środków zwalczania choroby, poprawiono ustalenia co do: sposobu konserwacji badanych prób, aby móc śledzić drogę organizmu, elementów potrzebnych do stwierdzenia zasięgu prawdopodobnego porażenia, szczegółów powiadamiania o wszelkich potwierdzonych przypadkach występowania organizmu i odpowiedniej strefie porażenia, środków, które należy wprowadzić w miejscach produkcji określonych jako porażone, a znajdujących się w obrębie wyznaczonych stref.

PRZYJMUJE NINIEJESZĄ DYREKTYWĘ:

Artykuł 1

Załączniki do dyrektywy 93/85/EWG zostają niniejszym zastąpione odpowiednimi tekstami zawartymi w Załączniku do niniejszej dyrektywy.

Artykuł 2

1. Państwa członkowskie przyjmują i publikują, najpóźniej do dnia 31 marca 2007 r., przepisy ustawowe, wykonawcze i administracyjne niezbędne do wykonania niniejszej dyrektywy. Państwa członkowskie niezwłocznie przekazują Komisji teksty tych przepisów oraz tabelę korelacji między tymi przepisami i niniejszą dyrektywą.

Państwa Członkowskie stosują wspomniane przepisy od dnia 1 kwietnia 2007 r.

Przepisy przyjęte przez państwa członkowskie zawierają odniesienie do niniejszej dyrektywy lub odniesienie takie towarzyszy ich urzędowej publikacji. Sposób dokonania takiego odniesienia ustalany jest przez państwa członkowskie.

2. Państwa członkowskie niezwłocznie przekażą Komisji tekst podstawowych przepisów prawa krajowego, przyjętych w dziedzinach objętych niniejszą dyrektywą.

Artykuł 3

Niniejsza dyrektywa wchodzi w życie trzeciego dnia po jej opublikowaniu w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej.

Artykuł 4

Niniejsza dyrektywa skierowana jest do państw członkowskich.

(1) Dz.U. L 259 z 18.10.1993, str. 2.

ZAŁĄCZNIK I

SCHEMAT BADANIA DIAGNOSTYCZNEGO WYKRYWANIA I IDENTYFIKACJI BAKTERIOZY PIERŚCIENIOWEJ ZIEMNIAKA, CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (Smith) Davis et al. ssp. SEPEDONICUS (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al.

ZAKRES SCHEMATU TESTÓW

Przedstawiany schemat obejmuje różne procedury związane z:

i) diagnozą bakteriozy pierścieniowej w bulwach ziemniaka i roślinach;

ii) wykrywaniem Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus w próbach bulw ziemniaka i roślinach;

iii) identyfikacją Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (C. m. subsp. sepedonicus).

ZASADY OGÓLNE

Zoptymalizowane protokoły dla różnych metod, zatwierdzone odczynniki i szczegóły przygotowania materiałów testowych i kontrolnych zamieszczono w dodatkach. Lista laboratoriów, które brały udział w optymalizacji i zatwierdzaniu protokołów, została przedstawiona w dodatku 1.

Ponieważ protokoły obejmują wykrywanie organizmów poddawanych kwarantannie i będą obejmować wykorzystanie żywych kultur C. m. subsp. sepedonicus jako materiałów kontrolnych, konieczne będzie prowadzenie działań we właściwych warunkach kwarantanny, z odpowiednimi instalacjami usuwania odpadów i pod warunkiem posiadania odpowiednich licencji, wydawanych przez urzędowe instytucje odpowiedzialne za kwarantannę roślin.

Parametry testów muszą zapewniać spójne i powtarzalne wykrywanie poziomu C. m. subsp. sepedonicus przy ustalonych progach czułości wybranych metod.

Konieczne jest dokładne przygotowanie kontroli pozytywnych.

Przeprowadzanie testów stosownie do wymaganych progów oznacza także właściwe warunki w miejscu przeprowadzania badań, konserwację i kalibrację sprzętu, ostrożne przechowywanie i obchodzenie się z odczynnikami i wszelkie środki mające zapobiec kontaminacji między próbami, np. oddzielanie kontroli dodatnich od próbek testowych. Muszą być stosowane normy kontroli jakości, aby uniknąć błędów administracyjnych i innych, zwłaszcza dotyczących etykietowania i dokumentacji.

Podejrzewane wystąpienie, jak określono w art. 4 ust. 2 dyrektywy 93/85/EWG, oznacza wynik dodatni w testach diagnostycznych lub przesiewowych, przeprowadzanych na próbie zgodnie z tym, co przedstawiono w schematach blokowych.

Jeśli pierwszy test przesiewowy (IF lub PCR/FISH) jest dodatni, to podejrzewa się porażenie Cms i należy przeprowadzić drugi test przesiewowy. Jeśli drugi test przesiewowy jest dodatni, to podejrzenie zostaje potwierdzone (podejrzewane wystąpienie) i procedura musi być kontynuowana zgodnie ze schematem. Jeśli drugi test przesiewowy jest ujemny, uznaje się, że próba nie jest porażona Cms.

Tak więc dodatni wynik testu IF, jak określono w art. 4 ust. 2, jest wyznaczony przez dodatni odczyt IF, potwierdzony przez drugi test przesiewowy (PCR/FISH).

Zgodnie z treścią art. 5 ust. 1 dyrektywy 93/85/EWG potwierdzona obecność pociąga za sobą konieczność izolacji i identyfikacji czystej kultury C. m. subsp. sepedonicus z potwierdzeniem patogenności.

1. SCHEMAT BLOKOWY

1.1. Schemat wykrywania w przypadku diagnozowania bakteriozy pierścieniowej w bulwach ziemniaka i w roślinach ziemniaka na podstawie objawów bakteriozy pierścieniowej

Procedura testowa jest przeznaczona dla bulw ziemniaka i całych roślin z typowymi lub podejrzewanymi objawami bakteriozy pierścieniowej. Obejmuje szybki test przesiewowy, izolację czynnika chorobotwórczego z zainfekowanej tkanki przewodzącej na podłoże diagnostyczne i w przypadku dodatniego wyniku — identyfikację kultury jako C. m. subsp. sepedonicus.

1.2. Schemat wykrywania i identyfikacji Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus w próbach bulw ziemniaka niewykazujących objawów

Zasada

Procedura testowa jest przeznaczona do wykrywania utajonych infekcji w bulwach ziemniaka. Dodatni wynik w przynajmniej dwóch testach przesiewowych, opartych na różnych zasadach biologicznych, musi być uzupełniony o izolację czynnika chorobotwórczego; a następnie, w przypadku izolacji typowych kolonii, o potwierdzenie czystej kultury jako C. m. subsp. sepedonicus. Dodatni wynik z jednego tylko testu przesiewowego nie wystarcza, aby uznać próbę za podejrzaną.

Testy przesiewowe i testy izolacji muszą umożliwiać wykrycie od 103 do 104 komórek/ml zawiesiny kontroli pozytywnej włączonej do każdej serii testów.

1.3. Schemat wykrywania i identyfikacji Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus w próbach roślin ziemniaka niewykazujących objawów

2. BADANIE WIZUALNE OBJAWÓW BAKTERIOZY PIERŚCIENIOWEJ

2.1. Rośliny ziemniaka

W europejskich warunkach klimatycznych objawy są rzadko stwierdzane na polu i często jedynie na końcu sezonu. Co więcej, objawy są często zamaskowane przez inne choroby lub mylone z innymi chorobami, starzeniem się i uszkodzeniami mechanicznymi. Tak więc w czasie kontroli w terenie łatwo przeoczyć objawy. Objawy więdnięcia bardzo się różnią od objawów więdnięcia w przypadku śluzaka; więdnięcie zazwyczaj następuje powoli i początkowo ograniczone jest do krawędzi liści. Zainfekowane młode liście często nadal rosną, choć wolniej w rejonach zainfekowanych. Sprawia to, że liście przyjmują dziwaczne kształty. Liście dotknięte niedrożnością tkanek przewodzących w dolnej części łodygi często mają żółte do pomarańczowych chlorotyczne plamy między żyłkami. Zainfekowane listki, liście, a nawet łodygi mogą w końcu obumrzeć. Często liście i bulwy są po prostu mniejsze. Czasem rośliny są skarłowaciałe. Kolorowe ilustracje różnych objawów można obejrzeć na stronie internetowej http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

2.2. Bulwy ziemniaka

Do najwcześniejszych objawów, obserwowanych szczególnie w pobliżu części przystolonowych bulwy, należą nieznaczna szklistość lub przejrzystość tkanek, bez rozmiękczenia wokół wiązek przewodzących. Pierścień wiązek przewodzących w części przystolonowej może być nieco ciemniejszy niż zazwyczaj. Pierwszym łatwym do rozpoznania objawem jest przebarwienie pierścienia wiązek przewodzących na żółtawo. Po lekkim ściśnięciu bulwy z naczyń wydostają się „słupki” serowatej masy. Wyciek ten zawiera miliony bakterii. W tym stadium można obserwować brązowienie wiązek przewodzących, a objawy obserwowane w bulwach mogą przypominać objawy śluzaka, choroby powodowanej przez Ralstonia solanacearum. Początkowo objawy te mogą być ograniczone do jednej części pierścienia, niekoniecznie w pobliżu części przystolonowej, i mogą się rozszerzać stopniowo na cały pierścień. W miarę rozprzestrzeniania się infekcji dochodzi do zniszczenia wiązek przewodzących; kora zewnętrzna może oddzielać się od wewnętrznej. W zaawansowanym stadium infekcji na powierzchni bulwy pojawiają się spękania, które często mają czerwonawo-brązowe brzegi. Ostatnio w Europie obserwowano przypadki, w których centralna część kory gniła jednocześnie z pierścieniami wiązek przewodzących, co w rezultacie prowadziło do wtórnej inwazji z objawami wygniwania tkanek i nekrozy. Wtórna infekcja bakteryjna czy grzybowa może maskować objawy i dlatego odróżnienie zaawansowanego stadium infekcji bakteriozy pierścieniowej od innych zgnilizn może być trudne, a nawet niemożliwe. Możliwe są objawy nietypowe. Kolorowe ilustracje różnych objawów można obejrzeć na stronie internetowej http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

3. PRZYGOTOWANIE PRÓB

3.1. Bulwy ziemniaka

Uwaga:

— Standardowa wielkość próby wynosi 200 bulw. Bardziej intensywne badania wymagają większej ilości testów na próbach tej wielkości. Większa liczba bulw w próbie będzie uniemożliwiać lub utrudniać interpretację wyników. Jednak gdy dostępna jest mniejsza niż 200 liczba bulw, procedurę tę można stosować z powodzeniem.

— Zatwierdzanie wszystkich opisanych niżej metod wykrywania oparte było na testowaniu prób złożonych z 200 bulw.

— Opisany poniżej ekstrakt z ziemniaków może być także wykorzystany do wykrywania bakterii śluzaka, Ralstonia solanacearum.

Opcjonalna procedura wstępna, poprzedzająca przygotowanie próby:

Umyć bulwy. Między kolejnymi próbami używać odpowiednich środków dezynfekujących (związków chloru, jeśli ma zostać przeprowadzany test PCR, aby całkowicie usunąć DNA czynnika chorobotwórczego), i detergentów. Wysuszyć bulwy na powietrzu. Ta procedura mycia jest szczególnie użyteczna (lecz niewymagana) w przypadku prób z nadmierną ilością ziemi i jeśli mają być stosowane test PCR lub metoda bezpośredniej izolacji.

3.1.1. Za pomocą czystego i zdezynfekowanego skalpela lub noża do warzyw zdjąć skórkę z części przystolonowej każdej bulwy tak, aby stała się widoczna tkanka naczyniowa. Należy starannie wyciąć niewielki stożek tkanki przewodzącej z części przystolonowej i zostawić jak najmniejszą ilość innych tkanek (patrz: strona internetowa: http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main)

Uwaga:

Odłożyć na bok wszystkie bulwy z podejrzeniem objawów bakteriozy pierścieniowej i testować je oddzielnie.

Jeżeli w czasie pobierania tkanki przystolonowej obserwuje się objawy nasuwające podejrzenie bakteriozy pierścieniowej, należy przeprowadzić wzrokowe badanie bulwy po przecięciu jej w pobliżu części przystolonowej. Każda przecięta bulwa z podejrzanymi objawami musi być poddana korkowaceniu w temperaturze pokojowej przez 2 dni oraz przechowywana w warunkach odizolowania (w temperaturze 4–10 °C) aż do chwili ukończenia wszystkich testów. Wszystkie bulwy danej próby (w tym bulwy podejrzane) powinny być przechowywane zgodnie z zasadami określonymi w załączniku II.

3.1.2. Fragmenty części przystolonowych umieścić w nieużywanych wcześniej pojemnikach jednorazowego użytku, które można szczelnie zamknąć (w przypadku powtórnego użycia pojemników należy je starannie oczyścić i zdezynfekować przy użyciu związków chloru). Pobrane fragmenty części przystolonowych najlepiej poddać obróbce niezwłocznie. Jeśli nie jest to możliwe, przechowywać je w pojemniku, nie dodając buforu, nie dłużej niż 72 godziny w lodówce, zaś w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 24 godziny. Wysuszenie i korkowacenie rdzeni oraz rozwój saprofitów w czasie przechowywania mogą utrudnić wykrywanie bakterii powodujących bakteriozę pierścieniową.

3.1.3. Z pobranymi fragmentami części przystolonowych postępować według jednej z następujących procedur:

a) Fragmenty tkanki przystolonowej pokryć dostateczną objętością (około 40 ml) buforu do ekstrakcji (dodatek 3) i mieszać na wytrząsarce obrotowej (50–100 obr./min) przez 4 godziny, utrzymując temperaturę poniżej 24 °C lub przez 16–24 godzin w lodówce; lub

b) Fragmenty tkanki przystolonowej homogenizować z odpowiednią ilością (około 40 ml) buforu do ekstrakcji (dodatek 3) albo z użyciem miksera (np. Waring lub Ultra Thurax), albo przez rozdrabnianie w szczelnie zamkniętej jednorazowej torebce do maceracji (np. Stomacher lub Bioreba z polietylenu o dużej wytrzymałości, 150 mm × 250 mm; sterylizowane promieniowaniem), używając gumowego młotka lub odpowiedniego aparatu do rozdrabniania (np. Homex).

Uwaga:

Jeśli próby są homogenizowane przy użyciu miksera, ryzyko kontaminacji między próbami jest znaczne. Należy podjąć odpowiednie środki ostrożności, aby nie dopuścić do powstania aerozolu lub rozlania w czasie procesu ekstrakcji. Należy się upewnić, że do każdej próby używane są świeżo wysterylizowane ostrza i naczynia miksera. Jeśli ma być stosowany test PCR, unikać przeniesienia DNA na pojemniki lub aparaty do rozdrabniania. Jeśli ma być zastosowany test PCR, zleca się rozdrabnianie w torebkach i stosowanie jednorazowych probówek.

3.1.4. Zdekantować supernatant. Jeśli jest zbyt mętny, sklarować — albo przez odwirowanie przy niskiej liczbie obrotów (przy nie więcej niż 180 g przez 10 minut w temperaturze 4–10 °C), albo przez filtrację w próżni (40–100 µm), myjąc filtr dodatkowym (10 ml) buforem do ekstrakcji (dodatek 3).

3.1.5. Zagęścić frakcję bakterii przez odwirowanie przy 7 000 g przez 15 minut (lub 10 000 g przez 10 minut) w temperaturze 4–10 °C i odrzucić supernatant bez naruszania osadu.

3.1.6. Zawiesić powtórnie osad w 1,5 ml buforu do zawieszania osadu (dodatek 3). Stosować 500 µl w badaniach na obecność C. m. subsp. sepedonicus, 500 µl w badaniach na obecność Ralstonia solanacearum i 500 µl do celów porównawczych. Dodać sterylną glicerynę aż do uzyskania ostatecznego stężenia 10–25 % (obj./obj.) i dodać do 500 µl zawiesiny porównawczej i do pozostałej zawiesiny testowej, zworteksować i przechowywać w temperaturze od –16 do –24 °C (tygodnie) lub od –68 do –86 °C (miesiące). W czasie wykonywania testu przechowywać zawiesiny testowe w temp. 4–10 °C.

Wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie nie jest wskazane.

Jeśli konieczny jest transport ekstraktu, zapewnić dostawę w przenośnej lodówce w ciągu 24 lub 48 godzin.

3.1.7. Jest niezwykle ważne, aby w celu uniknięcia kontaminacji wszystkie kontrole pozytywne C. m. subsp. sepedonicus i próby badać osobno. Odnosi się to zarówno do szkiełek IF, jak i do wszystkich testów.

3.2. Rośliny ziemniaka

Uwaga:

Do wykrywania utajonych populacji C. m. subsp. sepedonicus zaleca się stosowanie testów prób złożonych. Procedurę można bez problemów stosować do prób nieprzekraczających 200 części łodyg. (Jeśli przeprowadzane są badania statystyczne, należy się oprzeć na statystycznie reprezentatywnej próbie badanej populacji roślin).

3.2.1. Za pomocą zdezynfekowanego noża lub sekatora wyciąć 1–2-centymetrowy fragment łodygi tuż ponad powierzchnią gruntu.

Przez krótką chwilę dezynfekować fragmenty łodygi 70-procentowym etanolem i natychmiast osuszyć je bibułą.

Umieścić segmenty łodygi w zamkniętym, sterylnym pojemniku, stosując się do następujących procedur pobierania prób:

3.2.2. Poddać fragmenty łodyg jednej z następujących procedur:

a) Pokryć odcinki łodygi dostateczną objętością (około 40 ml) buforu ekstrakcyjnego (dodatek 3) i mieszać na wytrząsarce obrotowej (50–100 obr./min) przez 4 godziny w temperaturze poniżej 24 °C lub przez 16–24 godziny w lodówce; lub

b) Rozpocząć procedurę bezzwłocznie, miażdżąc odcinki łodygi w mocnej torebce do maceracji (np. Stomacher lub Bioreba) z odpowiednią ilością buforu ekstrakcyjnego (dodatek 3), używając gumowego młotka lub odpowiedniego urządzenia do rozdrabniania (np. Homex). Jeśli nie jest to możliwe, przechowywać odcinki łodyg nie dłużej niż 72 godziny w lodówce lub nie dłużej niż 24 godziny w temperaturze pokojowej.

3.2.3. Zdekantować supernatant po ustaleniu się przez 15 minut.

3.2.4. Dalsze klaryfikowanie ekstraktu lub zagęszczanie frakcji bakteryjnej zwykle nie jest wymagane, ale można je osiągnąć przez filtrację i/lub odwirowanie, jak opisano w częściach 3.1.4–3.1.6.

3.2.5. Podzielić czysty lub stężony ekstrakt z próby na dwie równe części. W czasie przeprowadzania testu jedną połowę trzymać w temperaturze 4–10 °C, a drugą połowę — z 10–25 % (obj./obj.) sterylnego glicerolu przechowywać w temperaturze –16 do –24 °C (tygodnie) lub w –68 do –86 ° C (miesiące), jeśli wymagane są dalsze testy.

4. TEST IF

Zasada

Stosowanie testu IF jako głównego testu przesiewowego jest zalecane z uwagi na wykazaną zdolność osiągania wymaganych progów wykrywalności.

Kiedy test IF jest stosowany jako główny test przesiewowy, a wynik IF jest dodatni, konieczne jest zastosowanie testu PCR lub FISH jako drugiego testu przesiewowego. Kiedy test IF jest stosowany jako drugi test przesiewowy, a odczyt IF jest dodatni, do zakończenia analizy wymagane jest przeprowadzanie dalszych testów, zgodnie ze schematem blokowym.

Uwaga:

Zawsze wtedy, kiedy test IF jest stosowany jako główny test przesiewowy, stosować przeciwciała poliklonalne. W przypadku pozytywnego wyniku IF z przeciwciałem poliklonalnym dalsze badanie próby przy użyciu przeciwciała monoklonalnego może zapewnić większą specyficzność, ale może być mniej czułe.

Używać przeciwciał do szczepu porównawczego C. m. subsp. sepedonicus. Zaleca się, aby dla każdej nowej partii przeciwciał określać miano. Miano jest określane jako największe rozcieńczenie, przy którym zachodzi optymalna reakcja w czasie testowania zawiesiny od 105 do 106 komórek na ml homologicznego szczepu C. m. subsp. sepedonicus i przy użyciu odpowiedniego koniugatu izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC), zgodnie z zaleceniami producenta. Stężone przeciwciała poliklonalne lub monoklonalne powinny mieć miano IF przynajmniej 1:2000. W czasie przeprowadzania testu przeciwciała powinny być stosowane przy stężeniu roboczym (WD) bliskim lub równym mianu. Stosować zatwierdzone przeciwciała (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Test powinien być przeprowadzany na świeżo przygotowanych ekstraktach z prób. Jeśli to konieczne, może być z powodzeniem przeprowadzany na ekstraktach przechowywanych w temperaturze od –68 do –86 °C w glicerolu. Glicerol może być usunięty z próby przez dodanie 1 ml buforu do zawieszania osadu (dodatek 4), powtórne odwirowanie przez 15 minut przy 7 000 g i powtórne zawieszenie w takiej samej objętości buforu do zawieszania osadu. Często nie jest to konieczne, zwłaszcza jeśli preparaty z prób były przygotowywane przy zastosowaniu opalania (patrz: 2.2).

Przygotować oddzielne szkiełka kontroli pozytywnej szczepu homologicznego lub innego szczepu odniesienia C. m. subsp. sepedonicus, zawieszonego w ekstrakcie z ziemniaka, jak szczegółowo opisano w dodatku 2, oraz ewentualnie w buforze.

W miarę możliwości na to samo szkiełko należy nanieść jako podobną kontrolę naturalnie zainfekowane tkanki (zachowane w formie liofilizowanej lub zamrożone w temperaturze od –16 do –24 °C).

Jako kontrolę negatywną stosować ekstrakty prób, które wcześniej dały w teście wynik ujemny.

Używać wielopunktowych szkiełek mikroskopowych, najlepiej z 10 okienkami, o średnicy co najmniej 6 mm.

Badać materiał kontrolny w identyczny sposób jak próbę(-y).

4.1. Przygotować szkiełka testowe według jednej z następujących procedur:

i) W przypadku osadu zawierającego stosunkowo niewielkie ilości skrobi: Za pomocą pipety nanieść na pierwsze okienko odmierzoną standardową objętość (15 µl jest odpowiednią objętością dla okienek o średnicy 6 mm — zwiększyć objętość w przypadku okienek o większej średnicy) rozcieńczenia 1/100 zawieszonego osadu ziemniaka. Kolejno nanosić podobną objętość nierozcieńczonego osadu (1/1) na pozostałe okienka w rzędzie. Drugi rząd może być użyty jako powtórzenie lub do drugiej próby, zgodnie ze schematem na rysunku 1.

ii) Dla innych osadów: Przygotować dziesięciokrotne rozcieńczenia (1/10 i 1/100) zawiesiny w buforze do zawieszania osadu. Nanieść standardową objętość (15 µl odpowiada 6 mm średnicy okienka — dla większych okienek odmierzyć proporcjonalnie większą objętość) zawiesiny na szereg okienek za pomocą pipety. Drugi rząd może być użyty jako powtórzenie lub do drugiej próby, zgodnie ze schematem na rysunku 2.

4.2. Krople suszyć w temperaturze pokojowej lub przez podgrzewanie w temperaturze od 40 do 45 °C. Komórki bakteryjne utrwalać na szkiełku albo przez podgrzewanie (15 minut przy 60 °C), opalanie, 95-procentowym etanolem lub według szczegółowych instrukcji dostawcy przeciwciał.

Jeśli trzeba, przed dalszym testowaniem, utrwalone szkiełka mogą być przechowywane w stanie zamrożonym w suchym pojemniku tak krótko jak to możliwe (do trzech miesięcy).

Metoda IF:

i) Przygotować szkiełka tak jak opisano w części 4.1 ppkt i): Przygotować zestaw dwukrotnych rozcieńczeń surowicy w buforze IF. Pierwsza studzienka powinna zawierać roztwór o mianie 1/2 (T/2), inne o mianie 1/4 (T/4), mianie 1/2 (T/2), mianie (T) i mianie 2 (2T).

ii) Przygotować szkiełka tak jak opisano w części 4.1 ppkt ii): Przygotować rozcieńczenie robocze (RR) surowicy w buforze IF. Rozcieńczenie robocze ma wpływ na specyficzność.

Rysunek 1. Przygotowanie szkiełka testowego zgodnie z częścią 4.1 ppkt i) i częścią 4.3 ppkt i)

Rozcieńczenia zawieszonego osadu 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1  Rozcieńczenie zawieszonego osadu (T = miano) T/2 T/4 T/2 T 2T  Dwukrotne rozcieńczenia surowicy/przeciwciała Próba 1 1 2 3 4 5 Powtórzenie próby 1 lub próba 2 6 7 8 9 10





Rysunek 2. Przygotowanie szkiełka testowego zgodnie z częścią 4.1 ppkt ii) i częścią 4.3 ppkt ii)

Rozcieńczenia robocze surowicy/przeciwciała 1/1 1/10 1/100 pusty pusty  Dziesieciokrotne rozcieńczenie zawieszonego osadu Próba 1 1 2 3 4 5 Powtórzenie próby 1 lub próba 2 6 7 8 9 10

4.3.1. Ułożyć szkiełka na wilgotnym papierze. Całkowicie pokryć każde okienko roztworem(-ami) przeciwciał. Objętość przeciwciał nakładanych na każde okienko musi co najmniej odpowiadać objętości nakładanego ekstraktu.

W przypadku braku szczegółowych instrukcji od dostawcy przeciwciał należy postępować według następującej procedury:

4.3.2. Inkubować preparaty na wilgotnym papierze pod przykryciem przez 30 minut w temperaturze otoczenia (18–25 °C).

4.3.3. Strząsnąć kropelki z każdego szkiełka i delikatnie przepłukać buforem IF. Umyć przez zanurzenie na 5 minut w buforze IF Tween (dodatek 3), a następnie przez 5 minut w buforze IF. Unikać powstawania aerozoli i przenoszenia kropelek, co mogłoby doprowadzić do kontaminacji miedzy próbami. Ostrożnie usunąć nadmiar wilgoci przez delikatne osuszanie bibułą.

4.3.4. Ułożyć szkiełka na wilgotnym papierze. Pokryć okienka testowe roztworem koniugatu FITC używanym do określenia miana. Objętość koniugatu nakładanego na okienka musi być identyczna z objętością nakładanych przeciwciał.

4.3.5. Inkubować preparaty na wilgotnym papierze pod przykryciem przez 30 minut w temperaturze otoczenia (18–25 °C).

4.3.6. Strząsnąć krople koniugatu ze szkiełka. Wypłukać i umyć jak poprzednio (4.3.3).

Delikatnie usunąć nadmiar wilgoci.

4.3.7. Na każde okienko nanieść pipetą 5–10 µl 0,1M buforu fosforanowo-glicerynowego (dodatek 3) lub komercyjnego utrwalacza zapobiegającego odbarwianiu i nakryć szkiełkiem nakrywkowym.

Odczytywanie testu IF:

4.4.1. Pod mikroskopem epifluorescencyjnym z filtrami odpowiednimi do wzbudzenia FITC, przy powiększeniu 500–1 000, z użyciem imersji olejowej lub wodnej obejrzeć szkiełka testowe. Okienka przeglądać w poprzek dwóch średnic przeciętych pod kątem prostym oraz wokół obwodu okienka. W przypadku prób niezawierających komórek lub zawierających ich niewiele obserwować co najmniej 40 pól.

Sprawdzić najpierw szkiełko z kontrolą pozytywną. Komórki muszą być wyraźnie zabarwione i wykazywać jaskrawą fluorescencję przy ustalonym mianie lub rozcieńczeniu roboczym. W przypadku niewłaściwego zabarwienia test IF musi zostać powtórzony (część 4).

4.4.2. Poszukiwać w okienkach szkiełek testowych jaskrawo fluoryzujących komórek, o charakterystycznej morfologii C. m. subsp. sepedonicus (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intensywność fluorescencji musi być taka sama jak lub większa niż szczepu użytego jako kontrola pozytywna przy tym samym rozcieńczeniu przeciwciał. Komórki niecałkowicie zabarwione lub słabo fluoryzujące należy pominąć.

Jeśli zachodzi jakiekolwiek podejrzenie kontaminacji, test należy powtórzyć. Może tak być, jeśli wszystkie płytki w danej partii zawierają dodatnie komórki z powodu kontaminacji buforu lub jeśli na powierzchni szkiełka występują komórki dodatnie (poza okienkiem szkiełka).

4.4.3. Ze specyficznością testu immunofluorescencyjnego wiąże się nieodłącznie kilka problemów. W osadzie z części przystolonowych bulw ziemniaka i odcinka łodygi prawdopodobne jest występowanie w tle populacji fluoryzujących komórek o nietypowej morfologii oraz bakterii saprofitycznych o wielkości i morfologii podobnej do C. m. sepedonicus i dających reakcje krzyżowe.

4.4.4. Uwzględniać wyłącznie fluoryzujące komórki o typowych wymiarach i morfologii przy mianie lub rozcieńczeniu roboczym, takim jak w części 4.3.

4.4.5. Interpretacja odczytów IF:

i) Jeśli zostanie stwierdzona obecność jaskrawo fluoryzujących komórek o charakterystycznej morfologii, należy oszacować przeciętną liczbę typowych komórek w polu widzenia i obliczyć liczbę typowych komórek na ml zawieszonego osadu (dodatek 4). Wynik IF jest dodatni dla prób z przynajmniej 5 × 103 typowych komórek na ml zawieszonego osadu. Próba uznawana jest za potencjalnie porażoną i wymagane są dalsze testy.

ii) Odczyt IF jest ujemny w przypadku prób o liczbie komórek mniejszej niż 5 × 103 na ml zawieszonego osadu i próba jest uznawana za ujemną. Kolejne testy nie są wymagane.

5. TEST FISH

Zasada

W przypadku gdy test FISH jest stosowany jako pierwszy test przesiewowy i stwierdza się w nim wynik dodatni, należy przeprowadzić test IF jako drugi, obowiązkowy test przesiewowy. Kiedy test FISH jest stosowany jako drugi test przesiewowy i daje wynik dodatni, do ukończenia diagnozowania konieczne jest przeprowadzenie dalszych testów, zgodnie ze schematem blokowym.

Uwaga:

Stosować zatwierdzone sondy oligonukleotydowe specyficzne dla C. m. subsp. sepedonicus (dodatek 7). Wstępne testy z użyciem tej metody powinny pozwolić na powtarzalne wykrywanie przynajmniej 103–104 komórek C. m. subsp. sepedonicus na ml dodanych do ekstraktów prób, które wcześniej dały w testach wynik ujemny.

Następującą procedurę najlepiej jest stosować na świeżo przygotowanym ekstrakcie próby, ale może ona być także z powodzeniem stosowana na ekstrakcie próby, przechowywanym pod gliceryną w temperaturze od –16 do –24 °C lub od –68 do –86 °C.

Jako kontroli negatywnych używać ekstraktu prób, które wcześniej dały wynik ujemny w testach na C. m. subsp. sepedonicus.

Jako kontrole pozytywne stosować zawiesiny zawierające od 105 do 106 komórek C. m. subsp. sepedonicus na ml (np. NCPPB 4053 lub PD 406) w 0,01M buforze fosforanowym, przygotowane z 3–5 dniowej kultury (sposób przygotowania opisano w dodatku 2). Przygotować oddzielne szkiełka kontroli pozytywnej z homologicznego szczepu lub dowolnego innego szczepu odniesienia C. m. subsp. sepedonicus, zawieszonego w ekstrakcie z ziemniaków, jak opisano w dodatku 2.

Stosowanie znakowanej FITC eubakteryjnej sondy oligonukleotydowej daje możliwość kontrolowania procesu hybrydyzacji, ponieważ barwione będą wszystkie eubakterie obecne w próbie.

Badać materiał kontrolny w identyczny sposób jak próbę(-y).

5.1. Utrwalanie ekstraktu z ziemniaków

Poniższa procedura oparta jest na pracy Wullings et al., (1998):

5.1.1. Przygotować roztwór utrwalający (patrz dodatek 7).

5.1.2. Za pomocą pipety przenieść 100 µl ekstraktu każdej próby do probówki Eppendorfa i wirować przez 8 min przy 7 000 g.

5.1.3. Usunąć supernatant i rozpuścić osad w 500 µl utrwalacza przygotowanego < 24 godziny wcześniej. Zamieszać i inkubować do następnego dnia przy 4 °C.

Alternatywnym utrwalaczem jest 96-procentowy etanol. W tym przypadku rozpuścić osad z etapu 5.1.2 w 50 µl 0,01M PB i 50 µl 96 % etanolu. Zworteksować mieszaninę i inkubować przez 30–60 minut w 4 °C.

5.1.4. Wirować przez 8 minut przy 7 000 g, usunąć supernatant i zawiesić osad w 75 µl 0,01M PB (patrz: dodatek 3).

5.1.5. Nanieść po 16 µl utrwalonych zawiesin na czyste szkiełko wielopunktowe, tak jak pokazano na rys. 3. Na szkiełko nakładać dwie różne próby, nierozcieńczone i w rozcieńczeniu1:100, używając 10 µl, aby uzyskać rozcieńczenie 1:100 (w 0,01M PB). Pozostały roztwór próby (49 µl) może być przechowywany w -20 °C po dodaniu 1 objętości 96 % etanolu. W przypadku konieczności powtórzenia testu FISH, usunąć etanol przez wirowanie i dodać tę samą ilość 0,01M PB (zworteksować).

Rysunek 3. Rozkład na szkiełku FISH

Próba 1 Puste Puste Puste Próba 2 okienko 1 okienko 2 okienko 3 okienko 4 okienko 5 Próba 1 Puste Puste Puste Próba 2 okienko 6 okienko 7 okienko 8 okienko 9 okienko 10 Szkiełko nakrywkowe 1 Szkiełko nakrywkowe 2

5.1.6. Wysuszyć szkiełka na powietrzu (lub w suszarce do szkiełek przy 37 °C) i utrwalić je przez opalanie.

Na tym etapie procedurę można przerwać. Hybrydyzację można kontynuować następnego dnia. Szkiełka powinny być przechowywane w suchym, pozbawionym kurzu środowisku, w temperaturze pokojowej.

5.2. Prehybrydyzacja i hybrydyzacja

5.2.1. Przygotować roztwór lizozymowy, zawierający 10 mg lizozymu (Sigma L–6876) w 10 ml buforu (100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH 8.0). Roztwór ten może być przechowywany, ale powinien być zamrażany-odmrażany tylko raz. Pokryć każdą próbę około 50 µl roztworu lizozymowego i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie jednokrotnie zanurzyć szkiełka w wodzie demineralizowanej i wysuszyć za pomocą bibuły filtracyjnej.

Inna procedura polega na naniesieniu na każde okienko 50 µl 40–400 µg ml–1 proteinazy K w buforze (20 mM Tris-HCl, 2 mM CaCl2, pH 7,4) zamiast lizozymu i inkubowaniu przez 30 minut w temp. 37 °C.

5.2.2. Odwadniać komórki w serii rozcieńczeń etanolu 50 %, 80 % i 96 %, przez 1 minutę w każdej. Wysuszyć szkiełka na powietrzu w statywie.

5.2.3. Przygotować wilgotną komorę do inkubacji, wykładając dno szczelnie zamykanego pojemnika bibułą lub papierem filtracyjnym nasączonym mieszaniną hybrydyzacyjną 1x (hybmix) (dodatek 7). Wstępnie inkubować pojemnik w cieplarce do hybrydyzacji co najmniej przez 10 minut w temperaturze 55 °C.

5.2.4. Przygotować roztwór hybrydyzacyjny (dodatek 7), przeznaczając 45 µl na szkiełko, i wstępnie inkubować przez 5 minut w temperaturze 55 °C.

5.2.5. Umieścić szkiełka na gorącej płycie do suszenia preparatów w temp. 45 °C i nałożyć 10 µl roztworu hybrydyzacyjnego na każde z czterech okienek na szkiełku (szkiełkach).

5.2.6. Nałożyć dwa szkiełka nakrywkowe (24 × 24 mm) na każde szkiełko podstawowe, starając się, aby nie uwięzić powietrza. Umieścić szkiełka we wstępnie ogrzanej wilgotnej komorze i poddawać hybrydyzacji do następnego dnia, w ciemności i w temperaturze 55 °C.

5.2.7. Przygotować trzy zlewki zawierające 1 l ultraczystej wody (UPW), 1 l 1x mieszaniny hybmix (334 ml 3x hybmix i 666 ml UPW) oraz 1 l 1/2x hybmix (167 ml 3x hybmix i 833 ml UPW). Inkubować wstępnie wszystkie w łaźni wodnej, w temperaturze 55 °C.

5.2.8. Zdjąć szkiełka nakrywkowe z podstawowych i umieścić szkiełka podstawowe w statywie.

5.2.9. Pozbyć się nadmiaru sondy przez inkubację przez 15 minut w zlewce z 1x roztworem hybmix temperaturze 55 °C.

5.2.10. Przenieść statyw do szkiełek do 1/2 roztworu do płukania hybmix i poddawać inkubacji przez następnych 15 minut.

5.2.11. Zanurzyć na krótko szkiełka w ultraczystej wodzie, a następnie położyć je na bibule filtracyjnej. Usunąć nadmiar wilgoci przez delikatne przykrycie powierzchni bibułą filtracyjną. Nanieść pipetą 5–10 µl roztworu utrwalającego, zapobiegającego odbarwieniu (np. Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA lub równoważny) na każde okienko i nałożyć duże (24 × 60 mm) szkiełko nakrywkowe na całe szkiełko podstawowe.

5.3. Odczytywanie testu FISH

5.3.1. Oglądać szkiełka natychmiast, używając mikroskopu dostosowanego do mikroskopii epifluoroscencyjnej pod powiększeniem 630 lub 1000x, pod olejkiem imersyjnym. Przy filtrze odpowiednim do izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC), komórki eubakteryjne (w tym większość komórek Gram ujemnych) są zabarwione na kolor fluorescencyjno zielony. Przy stosowaniu filtra do 5-izotiocyjanianu tetrametylorodaminy barwione komórki Cy3 C. m. subsp. sepedonicus są fluoryzująco czerwone. Morfologię komórek porównać z tą w kontroli pozytywnej. W przypadku niewłaściwego zabarwienia test FISH (część 9.4) należy powtórzyć. Okienka przeglądać w poprzek dwóch średnic przeciętych pod kątem prostym oraz wokół obwodu okienka. W przypadku prób niezawierających komórek lub zawierających ich niewiele obserwować co najmniej 40 pól.

5.3.2. Poszukiwać w okienkach szkiełek testowych jaskrawo fluoryzujących komórek, o charakterystycznej morfologii C. m. subsp. sepedonicus (patrz: strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Intensywność fluorescencji musi być taka sama jak lub większa niż szczepu użytego jako kontrola pozytywna. Komórki niecałkowicie zabarwione lub słabo fluoryzujące należy pominąć.

5.3.3. Jeśli zachodzi jakiekolwiek podejrzenie kontaminacji, test należy powtórzyć. Może tak być, jeśli wszystkie płytki w danej partii zawierają dodatnie komórki z powodu kontaminacji buforu lub jeśli na powierzchni szkiełka występują komórki dodatnie (poza okienkiem szkiełka).

5.3.4. Ze specyficznością testu FISH wiąże się nieodłącznie kilka problemów. W osadzie z części przystolonowej bulw ziemniaka i fragmentów łodygi prawdopodobne jest występowanie w tle populacji fluoryzujących komórek o nietypowej morfologii oraz dających reakcje krzyżowe bakterii saprofitycznych o wielkości i budowie podobnej do C. m. subsp. sepedonicus choć znacznie rzadziej niż w przypadku testu IF.

5.3.5. Uwzględniać wyłącznie fluoryzujące komórki o typowych wymiarach i morfologii, patrz: część 5.3.2.

5.3.6. Interpretacja wyniku testu FISH:

i) Prawidłowe wyniki testu FISH są otrzymywane wtedy, gdy przy użyciu filtra FITC obserwuje się jaskrawozielone, fluoryzujące komórki o wielkości i morfologii typowej dla C. m. subsp. sepedonicus i jeśli we wszystkich kontrolach pozytywnych, a w żadnej kontroli negatywnej, są obserwowane przy użyciu filtra rodaminowego jaskrawoczerwone fluoryzujące komórki. Jeśli zostanie stwierdzona obecność jaskrawo fluoryzujących komórek o charakterystycznej morfologii, należy oszacować przeciętną liczbę typowych komórek w polu widzenia i obliczyć liczbę typowych komórek na ml zawieszonego osadu (dodatek 4). Próby z przynajmniej 5 × 103 typowych komórek na ml zawieszonego osadu są uznawane za potencjalnie porażone. Potrzebne są dalsze testy. Próby, w których występuje mniej niż 5 × 103 typowych komórek na ml zawieszonego osadu, są uważane za ujemne.

ii) Test FISH jest ujemny, jeśli przy użyciu filtra rodaminowego nie są obserwowane jaskrawo fluoryzujące komórki o wielkości i morfologii typowej dla C. m. subsp. sepedonicus, pod warunkiem że w preparatach kontroli pozytywnej przy użyciu filtra rodaminowego obserwowane są jaskrawoczerwone fluoryzujące komórki.

6. TEST PCR

Zasady

Kiedy test PCR jest stosowany jako główny test przesiewowy i daje wynik dodatni, należy przeprowadzić test IF jako drugi, obowiązkowy test przesiewowy. Kiedy test PCR jest stosowany jako drugi test przesiewowy i daje wynik dodatni, do ukończenia diagnozowania konieczne jest przeprowadzenie dalszych testów, zgodnie ze schematem blokowym.

Pełne wykorzystanie tej metody jako głównego testu przesiewowego jest zalecane, tylko w przypadku, gdy uzyskano ekspertyzę specjalistyczną.

Uwaga:

Wstępne testy przy zastosowaniu tej metody powinny pozwolić na powtarzalne wykrywanie od 103 do 104 komórek C. m. subsp. sepedonicus na ml dodanych do ekstraktów prób, które we wcześniejszych testach okazały się ujemne. Mogą być wymagane eksperymenty optymalizacyjne, aby we wszystkich laboratoriach osiągnąć maksymalny poziom czułości i specyficzności.

Stosować zatwierdzone odczynniki do procedury PCR. Najlepiej wybrać metodę z kontrolą wewnętrzną.

Stosować właściwe środki ostrożności, aby uniknąć kontaminacji próby docelowym DNA. Test PCR powinien być przeprowadzony przez doświadczonych techników, w przeznaczonych do tego laboratoriach biologii molekularnej, aby możliwość kontaminacji docelowym DNA była jak najmniejsza.

Kontrole negatywne (ekstrakcja DNA i metoda PCR) należy zawsze przeprowadzać jako ostatnie próby w procedurze, aby upewnić się, czy nie nastąpiło jakiekolwiek przeniesienie DNA.

W teście PCR powinny się znaleźć następujące kontrole negatywne:

— Ekstrakt próby, która wcześniej okazała się w testach ujemna pod względem C. m. subsp. sepedonicus.

— Bufory kontrolne stosowane do ekstrakcji bakterii i DNA z próby.

— Mieszanina do reakcji PCR.

Należy uwzględnić następujące kontrole pozytywne:

— Zawiesiny osadów, do których dodano C. m. subsp. sepedonicus (przygotowanie, patrz: dodatek 2).

— Zawiesina 106 komórek na ml C. m. subsp. sepedonicus w wodzie z wirulentnym izolatem (np. NCPPB 2140 lub NCPPB 4053).

— Jeśli to możliwe, przeprowadzając test PCR korzystać także z ekstraktu DNA z kontroli pozytywnych.

Aby uniknąć potencjalnej kontaminacji, przygotowywać kontrole dodatnie w miejscu odizolowanym od prób, które mają zostać poddane testom.

Ekstrakty stanowiące próby powinny być jak najdokładniej oczyszczone z ziemi. Być może w niektórych przypadkach godne polecenia byłoby przygotowanie ekstraktów z umytych ziemniaków, jeśli mają zostać zastosowane procedury PCR.

6.1. Metody oczyszczania DNA

Stosować kontrolę pozytywną i negatywną, jak opisano powyżej.

Przygotować materiał kontrolny w sposób identyczny jak próbę(-y).

Istnieje wiele metod oczyszczania docelowego DNA ze złożonych substratów próby, a zarazem usuwania inhibitorów PCR i innych reakcji enzymatycznych oraz koncentracji docelowego DNA w ekstrakcie z próby.

Metoda przedstawiona poniżej została zoptymalizowana do użytku z zatwierdzoną metodą PCR przedstawioną w dodatku 6.

6.1.a) Metoda według Pastrika (2000)

1. Wkroplić 220 µl roztworu buforowego do lizy (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) do 1,5 ml probówki Eppendorfa.

2. Dodać 100 µl ekstraktu próby i umieścić na 10 minut w bloku grzejnym lub w łaźni wodnej w 95 °C.

3. Umieścić probówkę na lodzie na 5 minut.

4. Dodać 80 µl roztworu lizozymu (50 mg lizozymu na ml w 10 mM Tris HCl, pH 8,0) i inkubować przez 30 minut w 37 °C.

5. Dodać 220 µl roztworu Easy DNA® solution A (Invitrogen), wymieszać dobrze za pomocą worteksu i przez 30 minut inkubować w 65 °C.

6. Dodać 100 µl roztworu Easy DNA® solution B (Invitrogen), energicznie mieszać, dopóki osad nie zacznie swobodnie przemieszczać się w probówce, a próba stanie się jednolicie kleista.

7. Dodać 500 µl chloroformu i mieszać, dopóki lepkość nie zmniejszy się, a mieszanina nie stanie się homogeniczna.

8. Wirować przez 20 minut przy 15 000 g w temperaturze 4 °C, aby rozdzielić fazy i utworzyć interfazę.

9. Przenieść górną fazę do nowej probówki Eppendorfa.

10. Dodać 1 ml 100 % etanolu (–20 °C), przez krótką chwilę mieszać i inkubować na lodzie przez 10 minut.

11. Wirować przez 20 minut przy 15 000 g w temp. 4 °C i usunąć etanol z osadu.

12. Dodać 500 µl 80 % etanolu (–20 °C) i zamieszać przez odwrócenie probówki.

13. Wirować przez 10 minut przy 15 000 g w temp. 4 °C, zachować osad i usunąć etanol.

14. Pozwolić, aby osad wysechł na powietrzu lub w wirówce próżniowej DNA.

15. Zawiesić osad w 100 µl sterylnej UPW i pozostawić w temperaturze pokojowej co najmniej na 20 minut.

16. Przechowywać w temp. –20 °C do momentu, kiedy będzie potrzebny do PCR.

17. Oddzielić cały biały precypitat przez wirowanie i użyć do PCR 5 µl supernatantu zawierającego DNA.

6.1.b) Inne metody

Można zastosować inne metody ekstrakcji DNA (np. Qiagen DNeasy Plant Kit), pod warunkiem że wykazano, iż są one równie skuteczne w oczyszczaniu DNA pochodzącego z prób kontrolnych zawierających od 103 do 104 komórek patogenu na ml.

6.2. PCR

6.2.1. Przygotować matryce testowe i kontrolne do PCR zgodnie z zatwierdzoną procedurą (dodatek 6). Przygotować jedno dziesięciokrotne rozcieńczenie ekstraktu próby DNA (1:10 w UPW).

6.2.2. Przygotować odpowiednią mieszaninę reakcyjną PCR w nieskażonym środowisku, zgodnie z ustaloną procedurą (dodatek 6). Zatwierdzona procedura PCR jest złożoną reakcją, która obejmuje także wewnętrzną kontrolę PCR.

6.2.3. Dodać 5 µl ekstraktu DNA na 25 µl mieszaniny reakcyjnej PCR w sterylnych probówkach PCR.

6.2.4. Dołączyć kontrolę negatywną zawierającą tylko mieszaninę reakcyjną PCR i dodać tę samą UPW, która była używana w mieszaninie PCR zamiast próby.

6.2.5. Umieścić probówki w tym samym termocyklerze, który był używany w badaniu wstępnym, i uruchomić odpowiednio skonfigurowany program PCR (dodatek 6).

6.3. Analiza produktu PCR

6.3.1. Rozdzielić amplikony PCR metodą elektroforezy na żelu agarozowym. Użyć co najmniej 12 µl mieszaniny reakcyjnej amplifikowanego DNA z każdej próby, zmieszanego z 3 µl buforu obciążającego (dodatek 6) w 2,0 % (masa/obj.) żelu agarozowym w buforze tris-acetate-EDTA (TAE) (dodatek 6) przy 5–8 V na cm. Stosować odpowiedni marker DNA, np. 100 bp ladder.

6.3.2. Uwidocznić prążki DNA przez barwienie w bromku etydyny (0,5 mg na L) przez 30–45 min, stosując odpowiednie środki ostrożności przy obchodzeniu się z tym mutagenem.

6.3.3. Oglądać zabarwiony żel w transiluminatorze UV przy małej długości fal (np. λ = 302 nm), szukając zamplifikowanych produktów PCR o oczekiwanej wielkości (dodatek 6), i udokumentować wyniki.

6.3.4. Dla wszystkich nowych wyników/przypadków weryfikować autentyczność amplikonu PCR, przeprowadzając analizę z użyciem enzymów restrykcyjnych na próbce pozostałego zamplifikowanego DNA przez inkubację w optymalnej temperaturze i przez odpowiedni czas z właściwym enzymem i buforem (patrz dodatek 6). Rozdzielić strawione fragmenty za pomocą elektroforezy na żelu agarozowym jak wcześniej i oglądać charakterystyczny układ fragmentów strawionych przez enzymy restrykcyjne w transiluminatorze UV po uprzednim barwieniu bromkiem etydyny. Porównać z niestrawioną i strawioną kontrolą pozytywną.

Interpretacja wyniku testu PCR:

Test PCR daje wynik ujemny, jeśli specyficzny dla C. m. subsp. sepedonicus amplikon PCR o oczekiwanej wielkości nie zostanie wykryty w badanej próbie, ale jest wykrywany we wszystkich kontrolach pozytywnych (w przypadku wielokrotnego PCR ze specyficznymi roślinnymi starterami kontroli wewnętrznej: drugi produkt PCR o oczekiwanej wielkości musi być zamplifikowany z badaną próbą).

Test PCR daje wynik dodatni, jeśli stwierdzi się obecność specyficznego dla C. m. subsp. sepedonicus o oczekiwanej wielkości i o oczekiwanym wzorze restrykcji (jeśli to wymagane) amplikonu PCR, pod warunkiem że nie jest on amplifikowany z którejkolwiek kontroli negatywnej. Wiarygodne potwierdzenie wyniku dodatniego można także uzyskać, powtarzając test z drugim zestawem starterów PCR (część 9.3).

Uwaga:

Można podejrzewać inhibicję PCR, jeśli oczekiwany amplikon został uzyskany z kontroli pozytywnej, zawierającej amplikon C. m. subsp. sepedonicus w wodzie, ale przy badaniu kontroli pozytywnej z C. m. subsp. sepedonicus w ekstrakcie ziemniaczanym zostały uzyskane wyniki ujemne. W procedurach wielokrotnego PCR na inhibicję reakcji wskazuje sytuacja, w której nie jest otrzymywany żaden z dwóch amplikonów.

Kontaminacji można się spodziewać, jeśli oczekiwany amplikon otrzymywany jest w jednej lub więcej kontrolach negatywnych.

7. TEST BIOLOGICZNY

Uwaga:

Wstępne testy przy użyciu tej metody powinny pozwolić na powtarzalne wykrywanie od 103 do 104 jednostek tworzących kolonie C. m. subsp. sepedonicus na ml dodanych do ekstraktów prób, które we wcześniejszych testach dały wyniki ujemne (sposób przygotowania opisano w dodatku 2).

Najwyższej czułości wykrywania można oczekiwać, kiedy stosuje się świeżo przygotowane ekstrakty i zapewnia się optymalne warunki wzrostu. Metodę tę można jednak z powodzeniem stosować do ekstraktów, które były przechowywane pod glicerolem w temp. od –68 do –86 °C.

Niektóre odmiany oberżyny stanowią znakomite selektywne wzbogacone podłoże do wzrostu C. m. subsp. sepedonicus nawet przy braku objawów i stanowią także świetny test potwierdzający obecność bakterii w organizmie żywiciela.

Należy zapewnić optymalne warunki wzrostu, aby zredukować niebezpieczeństwo otrzymania fałszywie ujemnych wyników testu.

Szczegóły hodowli zamieszczono w dodatku 8.

7.1. Rozdzielić między rośliny oberżyny całą pozostałą zawiesinę testową osadu według opisu w częściach 3.1.6 lub 3.2.5, stosując jedną z metod opisanych poniżej (7.3 lub 7.4). Używać wyłącznie roślin w stadium liści 2–3, do pełnego rozwoju trzeciego liścia właściwego. Aby zapewnić całkowite wykorzystanie zawieszonego osadu, jak również skuteczną inokulację, w procedurach przedstawionych poniżej należy zastosować 15–25 roślin oberżyny na jedną próbę.

7.2. Nie podlewać roślin oberżyny przez 1–2 dni przed inokulacją, aby zmniejszyć turgor.

Inokulacja przez nacięcie

7.3.1. Trzymając roślinę między dwoma palcami, nanieść na łodygę kroplę (średnio 5–10 µl) zawieszonego osadu w miejscu między liścieniami i pierwszym liściem.

7.3.2. Za pomocą sterylnego skalpela wykonać ukośne nacięcie, o długości 1,0 cm i na głębokość średnio 2/3 grubości łodygi, rozpoczynając od miejsca naniesienia kropli osadu.

7.3.3. Ranę zamknąć sterylną wazeliną ze strzykawki.

7.4. Inokulacja za pomocą strzykawki

Inokulować łodygi oberżyny powyżej liścieni za pomocą strzykawki z igłą do iniekcji podskórnej (nie mniejszej niż 23 G). Próbkę rozdzielić między rośliny oberżyny.

7.5. W celu otrzymania kontroli pozytywnej inokulować 5 roślin wodną zawiesiną od 105 do 106 komórek na ml znanej hodowli C. m. subsp. sepedonicus i, jeśli to możliwe, naturalnie porażoną tkanką bulwy (patrz: część 4), stosując tę samą metodę inokulacji (7.3 lub 7.4).

7.6. W celu otrzymania kontroli negatywnej inokulować pięć roślin sterylnym buforem do zawieszania osadu, stosując tę samą metodę inokulacji (7.3 lub 7.4).

7.7. Rośliny inkubować w pomieszczeniach do kwarantanny w temperaturze 18–24 °C do 4 tygodni, przy dostatecznym oświetleniu i wysokiej wilgotności (70– 80 %) i podlewać je tak, aby nie dopuścić do gromadzenia się wody lub więdnięcia z powodu niedoboru wody. Komórki C. m. sepedonicus giną w temperaturze powyżej 30° C, zaś temperatura dla nich optymalna wynosi 21° C. Aby uniknąć kontaminacji, należy inkubować rośliny stanowiące kontrolę pozytywną i negatywną w wyraźnie odizolowanych od siebie miejscach w szklarni lub w komorze wzrostowej lub, jeśli brak dostatecznie dużych powierzchni, zapewnić ścisłą izolację poszczególnych zabiegów. Jeśli rośliny należące do różnych prób muszą być blisko siebie, odizolować je za pomocą ekranów. Przy nawożeniu, podlewaniu, sprawdzaniu lub innych manipulacjach zachować wielką ostrożność, aby uniknąć kontaminacji. Jest kwestią zasadniczej wagi, aby w komorze wzrostowej nie było żadnych owadzich szkodników, ponieważ mogą one przenosić bakterie z jednej próby na drugą.

7.8. Po tygodniu należy zacząć regularnie sprawdzać, czy nie występują objawy. Policzyć rośliny wykazujące objawy. C. m. subsp. sepedonicus powoduje więdnięcie liści oberżyny, które może rozpoczynać się od brzegów lub przestrzeni międzynerwowej. Zwiędnięte tkanki mogą być początkowo ciemnozielone lub plamiste, lecz zanim ulegną nekrozie, stają się jaśniejsze. Więdnące tkanki między nerwami wyglądają często na „tłuste”, nasączone wodą. Tkanki nekrotyczne mają często jasnożółty brzeg. Rośliny nie zawsze zamierają; im dłuższy okres poprzedzający wystąpienie objawów, tym większa szansa na przeżycie. Rośliny mogą pokonać infekcję. Młode rośliny oberżyny są znacznie bardziej podatne na C.m subsp. sepedonicus o niskiej liczebności populacji niż rośliny starsze, stąd konieczność stosowania roślin w stadium trzech liści lub nieco młodszych.

Więdnięcia mogą być również spowodowane przez populacje innych bakterii lub grzybów zasiedlających tkanki bulwy. Do nich należą Ralstonia solanacearum, Erwinia carotovora subsp. carotovora i E. carotovora subsp. atroseptica, Erwinia chrysanthemi, Phoma exigua var. foveata, jak również duże populacje bakterii saprofitycznych. W szczególności Erwinia chrysanthemi może powodować na liściach objawy oraz więdnięcie bardzo podobne do objawów C. m. sepedonicus. Jedyną różnicą jest czernienie łodyg w przypadku zakażenia Erwinia chrysanthemi. Więdnięcie spowodowane przez C. m. subsp. sepedonicus. od innych więdnięć można wtedy odróżnić, gdy gwałtownie więdną całe liście lub rośliny. Można również przygotować barwienie metodą Grama: test ten pozwoli na odróżnienie C. m. subsp. sepedonicus od Erwinia spp.

7.9. Niezwłocznie po stwierdzeniu objawów w roślinach oberżyny należy przeprowadzić procedurę reizolacji, stosując fragmenty zwiędniętej tkanki liściowej lub tkanki łodyg (macerację tkanki opisano w 3.1.3). Liście i łodygi oberżyny zdezynfekować powierzchniowo poprzez przetarcie 70 % alkoholem etylowym. Przeprowadzić test IF lub PCR na soku oberżyny i izolować na właściwe (selektywne) podłoża (patrz: część 8). Można także przygotować barwnie metodą Grama (dodatek 9). Zidentyfikować oczyszczone hodowle podejrzewane o obecność C. m. subsp. sepedonicus i potwierdzić patogeniczność (patrz: części 9 i 10).

7.10. W niektórych okolicznościach, w szczególności gdy warunki uprawy nie są optymalne, istnieje możliwość występowania C. m. subsp. sepedonicus w formie infekcji utajonej w oberżynie, nawet po czterotygodniowej inkubacji. Jeśli po czterech tygodniach nie są obserwowane żadne objawy, przeprowadzić test IF/PCR na próbie składającej się z jednocentymetrowych odcinków łodyg każdej rośliny testowej, pobranych powyżej miejsca inokulacji. Jeśli test daje wynik dodatni, należy przeprowadzić reizolację na właściwej (selektywnej) pożywce po przeprowadzeniu procedury opisanej w części 8. Zidentyfikować oczyszczone hodowle podejrzewane o obecność C. m. subsp. sepedonicus i potwierdzić patogeniczność (część 9 i 10).

Interpretacja wyniku testu biologicznego.

Prawidłowe wyniki testu biologicznego są uzyskiwane, kiedy rośliny stanowiące kontrolę pozytywną wykazują typowe objawy, bakterie z tych roślin mogą być reizolowane, a na roślinach będących kontrolą negatywną nie występują objawy.

Test biologiczny jest ujemny, jeśli rośliny testowe nie są porażone C. m. subsp. sepedonicus, a C. m. subsp. sepedonicus jest wykrywany w roślinach będących kontrolą pozytywną.

Test biologiczny jest dodatni, jeśli rośliny testowe są porażone C. m. subsp. sepedonicus.

8. IZOLACJA C. M. SUBSP. SEPEDONICUS

Uwaga:

Diagnoza jest kompletna tylko wówczas, jeżeli C. m. subsp. sepedonicus zostanie wyizolowany, następnie zidentyfikowany (patrz: część 9) i potwierdzony za pomocą testu patogeniczności (część 10). Choć C. m. subsp. sepedonicus jest organizmem wymagającym, może być wyizolowany z tkanki, na której występują objawy.

Jednakże może on być zagłuszany przez szybko rosnące bakterie saprofityczne i dlatego bezpośrednia izolacja z osadu uzyskanego z tkanek bulwy lub łodygi ziemniaka (część 3.1.6 lub 3.2.5) jest trudna. Bezpośrednia izolacja C. m. subsp. sepedonicus jest możliwa przy zastosowaniu selektywnej pożywki i właściwego rozcieńczenia osadu z części przystolonowych bulw lub łodyg ziemniaka.

Izolacji należy dokonać ze wszystkich wykazujących objawy bulw i łodyg ziemniaka oraz roślin oberżyny, na których nie obserwowano objawów, ale wynik testu IF/PCR próby był dodatni (patrz: część 7.10). Macerację łodyg oberżyny, o ile jest to konieczne, należy wykonać, jak podano w części 3.1.3.

Aby przygotować kontrole pozytywne, należy sporządzić dziesięciokrotne rozcieńczenia z zawiesiny 106 cfu (jednostek tworzących kolonie) na ml C. m. subsp. sepedonicus (np. NCPPB 4053 lub PD 406). Aby uniknąć jakiejkolwiek możliwości kontaminacji, przygotować kontrole pozytywne w całkowitej izolacji od prób, które mają być poddane testowi.

Dla każdej świeżo przygotowanej partii pożywki selektywnej przed użyciem do testowania rutynowych prób należy sprawdzić jej przydatność do hodowli czynnika chorobotwórczego.

Badać materiał kontrolny w identyczny sposób jak próbę(-y).

8.1. Posiew na podłoża selektywne

8.1.1. Ze 100 µl zawiesiny osadu ziemniaka lub soku oberżyny przyrządzić dziesięciokrotne rozcieńczenia w buforze do zawieszania osadu (dodatek 3).

8.1.2. Izolacja z nierozcieńczonego osadu ziemniaków zwykle się nie udaje z powodu wysokich wymagań Cms i konkurencji saprofitów. Ponieważ bakteria jest zwykle obecna w porażonej tkance w dużych ilościach, możliwe jest wyeliminowanie saprofitów przez kolejne rozcieńczenia. Zaleca się wobec tego nanieść 100 µl z każdej próby, w rozcieńczeniu 1/100 do 1/10 000, na podłoże MTNA lub NCP-88 (dodatek 5) (jeśli używane są szalki Petriego o średnicy 90 mm, dostosować objętość do innych wymiarów szalki), stosując głaszczki i technikę rozsmarowywania.

Uwaga:

Alternatywnym sposobem postępowania jest nałożenie początkowych 100 µl zawiesiny osadu ziemniaka na pierwszą płytkę agarową za pomocą głaszczki, a następnie przeniesienie na drugą płytkę, wreszcie powtórzenie tego z trzecią płytką, w ten sposób osiągając efekt nakładania rozcieńczeń poprzez głaszczkę.

8.1.3. Inkubować szalki w ciemności, w temp. 21–23 °C.

8.1.4. Przeglądanie szalek polegające na porównaniu z szalkami kontrolnymi, zliczaniu wszelkich kolonii przypominających C. m. subsp. sepedonicus należy przeprowadzać po trzech dniach, z kolejnymi zliczeniami po 5, 7 i 10 dniach.

8.2. Oczyszczanie podejrzanych kolonii

Uwaga:

Oczyszczanie kolonii przypominających C. m. subsp. sepedonicus przez pasażowanie powinno być prowadzone na pożywce YGM w celu inokulacji roślin oberżyny i/lub późniejszej identyfikacji; należy to zrobić zanim nie nastąpi nadmierny wzrost bakterii na płytkach, tj. najlepiej po 3–5 dniach.

8.2.1. Kolonie przypominające C. m. subsp. sepedonicus posiać na jedno z następujących podłoży: (receptura podana jest w dodatku 5):

agar odżywczy z glukozą (tylko do przeszczepiania),

agar drożdżowo-peptonowo-glukozowy,

agar mineralny z ekstraktem drożdżowym.

Inkubować w temp. 21–24 °C przez okres do 10 dni.

C. m. subsp. sepedonicus jest organizmem wolno rosnącym, zwykle wytwarza w ciągu 10 dni kremowe, wypukłe kolonie wielkości łebka od szpilki. (Zdjęcia typowych kolonii C. m. subsp. Sepedonicus, patrz na stronie internetowej http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

8.2.2. Przeszczepianie w celu uzyskania czystej kultury.

Tempo wzrostu poprawia się przez przeszczepianie. Typowe kolonie są kremowo-białe, czasem żółte, zaokrąglone, gładkie, wzniesione, wypukłe, śluzowato-płynne, z całymi brzegami i zwykle mają średnicę od 1 do 3 mm.

Proste barwienie metodą Grama (dodatek 9) może pomóc wybrać kolonie do dalszych testów.

8.2.3. Zidentyfikować podejrzane kolonie (patrz: część 9) i przeprowadzić test patogeniczności (patrz: część 10).

9. IDENTYFIKACJA

Identyfikować czyste kultury podejrzanych izolatów C. m. subsp. sepedonicus, stosując co najmniej dwa z poniższych testów, opartych na różnych zasadach biologicznych.

W przypadku każdego przeprowadzanego testu uwzględniać, tam, gdzie to możliwe, znane szczepy referencyjne.

9.1. Testy identyfikacyjne – fizjologiczne i biochemiczne

Określić następujące właściwości fenotypowe, które powszechnie występują lub nie występują u C. m. subsp. sepedonicus, zgodnie z metodami opisanymi przez: Lelliott i Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001), Anonymous (1987).

Wszystkie pożywki powinny być inkubowane w temp. 21 °C i poddane oględzinom po sześciu dniach. Jeśli nie nastąpił żaden wzrost, kontynuować inkubację przez okres do 20 dni.

Wszystkie testy muszą obejmować znaną kontrolę C. m. subsp. sepedonicus. Testy biochemiczne i fizjologiczne muszą być przeprowadzane przy użyciu inokulum z agaru odżywczego izolatów uzyskanych w procesie pasażowania. Porównania morfologiczne muszą być przeprowadzane na kulturach wyrosłych na agarze odżywczym z glukozą.

Testy Oczekiwany wynik Test oksydacyjno-fermentacyjny (O/F) obojętny lub słabo utleniający Aktywność oksydazy – Wzrost przy 37 °C – Aktywność ureazy – Hydroliza eskuliny + Hydroliza skrobi – lub słaba Tolerancja wobec 7 % NaCl – Produkcja indolu – Aktywność katalazy + Produkcja H2S – Wykorzystanie cytrynianu – Upłynnianie żelatyny – Kwas glicerolowy – Kwas z laktozy — lub słaba Kwas z ramnozy – Kwas z salicyny – Barwienie metodą Grama (dodatek 9) +

9.2. Test IF

a) Przygotować zawiesinę około 106 komórek na ml w buforze IF (dodatek 3).

b) Przygotować serię dwukrotnych rozcieńczeń odpowiedniej surowicy.

c) Zastosować procedurę IF (część 4).

d) Wynik testu IF jest dodatni wtedy, kiedy miano kultury testowej jest takie samo jak miano kultury stanowiącej kontrolę pozytywną.

9.3. Test PCR

a) Przygotować zawiesinę około 106 komórek na ml w ultraczystej wodzie (UPW).

b) Podgrzewać 100 µl zawiesiny komórek w zamkniętych probówkach w bloku grzejnym lub wrzącej łaźni wodnej przy temp. 100 °C przez cztery minuty. Jeśli to konieczne, w lizie komórek może pomóc dodanie do ostatecznego stężenia 0,05 M świeżo sporządzonego NaOH. Próbki mogą być następnie przechowywane do momentu, kiedy będą potrzebne w temp. od –16 do –24 °C.

c) Stosować odpowiednie procedury PCR w celu amplifikacji specyficznych dla C. m. subsp. sepedonicus amplikonów (np. Pastrik, 2000; patrz: dodatek 4; Li and de Boer, 1995; Mills et al., 1997; Pastrik and Rainey, 1999; Schaad et al., 1999.

d) Pozytywna identyfikacja C. m. subsp. sepedonicus ma miejsce wtedy, gdy amplikony PCR są tej samej wielkości i wykazują ten sam polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych co szczep kontroli pozytywnej.

9.4. Test FISH

a) Przygotować zawiesinę około 106 komórek na ml w UPW.

b) Zastosować procedurę FISH (część 5).

c) Test FISH daje pozytywny wynik, jeśli kultura i kontrola pozytywna dają te same reakcje.

9.5. Analiza kwasów tłuszczowych (FAP)

a) Hodować kulturę na Tripticase Soy Agar (Oxoid) przez 72 godziny w temp. 21 °C (+/– 1°).

b) Zastosować odpowiednią metodę FAP (Janse, 1991; Stead, 1992).

c) Wynik FAP jest dodatni, jeśli profil podejrzanej kultury jest identyczny z profilem kontroli pozytywnej. Obecność charakterystycznych kwasów tłuszczowych: 15:1 Anteiso A, 15:0 Iso, 15:0 Anteiso, 16:0 Iso, 16:0 i 17:0 Anteiso często wskazuje na obecność. C. m. sepedonicus. Inne bakterie, takie jak Curtobacterium, Arthrobacter i Micrococcus, również zawierają niektóre z tych kwasów, ale 15:1 Anteiso A jest rzadkim kwasem w tych bakteriach, a występuje we wszystkich Clavibacter spp. w ilości 1–5 %. W przypadku C. m. sepedonicus poziom ten jest zwykle zbliżony do 5 %.

9.6. BOX-PCR

a) Przygotować zawiesinę około 106 komórek na ml w UPW.

b) Przeprowadzić test zgodnie z procedurą (Smith et al., 2001).

10. TEST POTWIERDZAJĄCY

Test patogeniczności musi zostać przeprowadzony w celu ostatecznego potwierdzenia diagnozy występowania C. m. subsp. sepedonicus oraz w celu oceny wirulencji kultur zidentyfikowanych jako C. m. subsp. sepedonicus:

10.1. Przygotować inokulum około 106 komórek na ml z trzydniowej kultury testowanego izolatu i odpowiedni szczep kontroli pozytywnej C. m. subsp. sepedonicus.

10.2. Inokulować 5–10 łodyg młodych siewek oberżyny w stadium trzeciego liścia (część 7.3 lub 7.4)

10.3. Inkubować w temperaturze 18–24 °C w warunkach dostatecznego oświetlenia i stosunkowo wysokiej wilgotności podlewając je tak, aby nie dopuścić do gromadzenia się wody lub więdnięcia z powodu niedoboru wody (patrz: 7.7). W przypadku czystych kultur typowe objawy więdnięcia uzyskuje się w okresie do 2 tygodni, lecz rośliny niewykazujące objawów po upływie tego czasu (patrz: 7.8) należy inkubować do 3 tygodni w temperaturze korzystnej dla uprawy oberżyny, ale nieprzekraczającej 25 °C (dodatek 8). Jeśli po 3 tygodniach objawy nie wystąpią, kultura nie może być uznana za patogeniczną formę C.m. subsp. sepedonicum.

10.4. Izolacji dokonywać z roślin wykazujących objawy przez pobranie dwucentymetrowego fragmentu łodygi powyżej miejsca inokulacji. Rozdrobnić i zawiesić w niewielkiej ilości sterylnej wody destylowanej lub 50 mM buforu fosforanowego (dodatek 3). Izolację z zawiesiny przeprowadzić przez posiew na MTNA i YPGA (dodatek 5), inkubację przez 3–5 dni w temp. 21–23 °C i obserwować tworzenie się kolonii typowych dla C. m. subsp. sepedonicus.

Dodatek 1 Laboratoria uczestniczące w optymalizacji i weryfikacji protokołów Laboratorium (1) Lokalizacja Kraj Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit Wiedeń i Linz Austria Departement Gewasbescherming Merelbeke Belgii Plantedirektoratet Lyngby Dania Central Science Laboratory York Anglia Scottish Agricultural Science Agency Edynburg Szkocja Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Unité de Bactériologie Angers Francja Laboratoire National de la Protection des Végétaux, Station de Quarantaine de la Pomme de Terre Le Rheu Francja State Laboratory Dublin Irlandia Biologische Bundesanstalt Kleinmachnow Germany Pflanzenschutzamt Hannover Hannover Germany Plantenziektenkundige Dienst Wageningen Niderlandy Norwegian Crop Research Institute, Plant Protection Centre Aas Norwegia Direcção-Geral de Protecção das Culturas Lizbona Portugalia Nacionalni institut za biologijo Lubljana Słowenia Centro de Diagnostico de Aldearrubia Salamanca Hiszpania (1) Badacze, z którymi można się kontaktować: patrz strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

Dodatek 2 Przygotowanie kontroli pozytywnych i negatywnych do testów przesiewowych PCR/IF i FISH Przygotować 72-godzinną kulturę wirulentnego szczepu C. m. subsp. sepedonicus [NCPPB 4053 lub PD 406] na podstawowej pożywce MTNA i zawiesić w 10 mM buforze fosforanowym, aby otrzymać gęstość komórek około 1–2 × 108 cfu (jednostek tworzących kolonie) na ml. Uzyskuje się zwykle lekko mętną zawiesinę odpowiadającą gęstości optycznej 0,20 przy 600 nm. Pobrać części przystolonowe z 200 bulw ziemniaków odmiany o białej skórce, o których wiadomo, że są wolne od C. m. subsp. sepedonicus. Z pobranymi częściami przystolonowymi postępować jak zwykle i zawiesić osad w 10 ml. Przygotować 10 sterylnych mikrofiolek 1,5 ml z 900 µl zawieszonego osadu. Przenieść 100 µl zawiesiny C. m. subsp. sepedonicus do pierwszej mikrofiolki. Zworteksować. Ustalić dziesiętne poziomy porażenia przez dalsze rozcieńczanie w następnych pięciu mikrofiolkach. Sześć porażonych mikrofiolek należy wykorzystać jako kontrolę pozytywną. Cztery nieporażone mikrofiolki należy wykorzystać jako kontrolę negatywną. Należy zaopatrzyć mikrofiolki w odpowiednie etykiety. Rozdzielić uzyskane zawiesiny po 100 µl do sterylnych 1,5 ml mikrofiolek otrzymując 9 powtórzeń każdego rozcieńczenia. Przechowywać w temp. –16 do –24 °C do chwili użycia. Obecność i liczebność C. m. subsp. sepedonicus w próbach kontrolnych należy najpierw potwierdzić przez test IF. W przypadku testu PCR dla każdej serii prób testowych dokonać ekstrakcji DNA z prób kontroli pozytywnej i negatywnej. W przypadku testów IF i FISH dla każdej serii prób testowych przeprowadzić badania na próbach kontroli pozytywnej i negatywnej. W przypadku testów IF, FISH i PCR C. m. subsp. sepedonicus musi zostać wykryty w przynajmniej 106 i 104 komórek/ml kontroli pozytywnej i nie wykryty w żadnej kontroli negatywnej.

Dodatek 3 Skład buforów i sposób ich przygotowania INFORMACJA OGÓLNA: Nieotwarte sterylne bufory mogą być przechowywane do jednego roku. 1. Bufory do ekstrakcji 1.1. Bufor do ekstrakcji (50 mM bufor fosforanowy, pH 7,0) Bufor ten jest stosowany do ekstrakcji bakterii z tkanek rośliny przez homogenizację lub wytrząsanie. Na2HPO4 (bezwodny) 4,26 g KH2PO4 2,72 g Woda destylowana 1,00 L Rozpuścić składniki, sprawdzić pH i przez 15 min sterylizować w autoklawie w temp. 121 °C. Przydatne mogą być następujące dodatkowe składniki: Przeznaczenie Ilość (na L) Lubrol w płatkach Deflokulant (1) 0,5 g środek przeciwpieniący DC silicone Środek przeciwpieniący (1) 1,0 ml Pirofosforan czterosodowy Przeciwutleniacz 1,0 g Poliwinylopyrolidon-40 000 (PVP-40) Wiązanie inhibitorów PCR 50 g 1.2. Bufor do zawieszania osadu (10 mM bufor fosforanowy, pH 7,2) Bufor ten jest stosowany do zawieszania i rozcieńczania ekstraktów z bulw ziemniaka po zagęszczeniu przez wirowanie. Na2HPO4.12H2O 2,7 g NaH2PO4.2H2O 0,4 g Woda destylowana 1,00 L Rozpuścić składniki, sprawdzić pH i przez 15 min sterylizować w autoklawie w temp. 121 °C. 2. Bufory do testu IF 2.1. Bufor IF (10 mM bufor fosforanowy (PBS), pH 7,2) Bufor jest używany do rozpuszczania przeciwciał. Na2HPO4.12H2O 2,7 g NaH2PO4.2H2O 0,4 g NaCl 8,0 g Woda destylowana 1,0 L Rozpuścić składniki, sprawdzić pH i przez 15 min sterylizować w autoklawie w temp. 121 °C. 2.2. Bufor IF-Tween Bufor ten jest stosowany do płukania szkiełek. Dodać 0,1 % Tween 20 do buforu IF. 2.3. Bufor fosforanowo-glicerynowy, pH 7,6 Bufor ten jest dodawany na okienka szkiełek IF, aby zwiększyć efekt fluorescencji. Na2HPO4.12H2O 3,2 g NaH2PO4.2H2O 0,15 g Gliceryna 50 ml Woda destylowana 100 ml Roztwory utrwalające o działaniu przeciwodbarwiającym są dostępne w handlu, np. Vectashield® (Vector Laboratories) lub Citifluor® (Leica). (1) Do stosowania w przypadku metody homogenizacji ekstraktu.

Dodatek 4 Określenie poziomu kontaminacji w testach IF i FISH 1. Określić średnią liczbę typowych fluoryzujących komórek w polu widzenia (c). 2. Określić liczbę typowych fluoryzujących komórek w okienku (C). C = c × S/s gdzie S = powierzchnia okienka szkiełka wielopunktowego, a s = pole powierzchni obiektywu:

s = πi2/4G2K2 gdzie i = współczynnik pola (zależy od typu okularu i zawiera się w granicach od 8 do 24) K = współczynnik tubusa (1 lub 1,25) G = powiększenie obiektywu (100x, 40x, itd.). 3. Określić liczbę typowych komórek fluoryzujących na ml zawieszonego osadu (N) N = C × 1 000/y × F gdzie y = objętość osadu naniesionego na każde z okienek, oraz F = rozcieńczenie zawieszonego osadu.

Dodatek 5 Podłoża do izolacji i hodowli C. m. subsp. sepedonicus a) Ogólne podłoża wzrostowe Agar odżywczy (NA) Nutrient Agar (Difco) 23,0 g Woda destylowana 1,0 L Rozpuścić składniki i sterylizować przez 15 min w autoklawie w temp. 121 °C. Agar odżywczy z glukozą (NDA) Agar odżywczy z glukozą (prod. Difco) zawierający 1 % D(+) glukozy (monohydrat). Sterylizować w autoklawie w temperaturze 115 °C przez 20 minut. Agar drożdżowo-peptonowo-glukozowy (YPGA) Yeast extract (Difco) 5,0 g Bacto-Peptone (Difco) 5,0 g D(+) glukoza (monohydrat) 10,0 g Bacto-Agar (Difco) 15,0 g Woda destylowana 1,0 L Rozpuścić składniki i sterylizować przez 15 min w autoklawie w temp. 121 °C. Pożywka mineralna z wyciągiem drożdżowym (YGM) Bacto-Yeast-Extract (Difco) 2,0 g D(+) glukoza (monohydrat) 2,5 g K2HPO4 0,25 g KH2PO4 0,25 g MgSO4.7H2O 0,1 g MnSO4.H2O 0,015 g NaCl 0,05 g FeSO4.7H2O 0,005 g Bacto-Agar (Difco) 18 g Woda destylowana 1,0 L Rozpuścić składniki a pożywkę o objętości 0,5 litra sterylizować w autoklawie w temperaturze 115 °C przez 20 minut. b) Zatwierdzone selektywne podłoża wzrostowe Podłoże MTNA Jeśli nie zaznaczono inaczej, wszystkie komponenty pochodzą z BDH. Yeast extract (Difco) 2,0 g Mannitol 2,5 g K2HPO4 0,25 g KH2PO4 0,25 g NaCl 0,05 g MgSO4.7H2O 0,1 g MnSO4.H2O 0,015 g FeSO4.7H2O 0,005 g Agar (Oxoid nr. 1) 16,0 g Woda destylowana 1,0 L Rozpuścić składniki, ustalić pH na 7,2. Po autoklawowaniu (w temp. 121 °C przez 15 minut) i ochłodzeniu do 50 °C, dodać antybiotyki: trimethoprim 0,06 g, kwas nalidyksowy 0,002 g, amphotericin B 0,01 g. Podstawowy roztwór antybiotyków: trimethoprim (Sigma) i kwas nalidyksowy (Sigma) (oba w stężeniu 5 mg/ml), w 96 % metanolu, amphotericin B (Sigma) (1mg/ml) w sulfotlenku dimetylu. Roztwory podstawowe są sterylizowane na filtrze. Uwaga: Trwałość podstawowego podłoża wynosi trzy miesiące. Po dodaniu antybiotyków przy przechowywaniu w lodówce trwałość wynosi jeden miesiąc. Podłoże NCP-88 Nutrient agar (Difco) 23 g Yeast extract (Difco) 2 g D-mannitol 5 g K2HPO4 2 g KH2PO4 0,5 g MgSO4.7H2O 0,25 g Woda destylowana 1,0 L Rozpuścić składniki, ustalić pH na 7,2. Po autoklawowaniu i ochłodzeniu do 50 °C dodać następujące antybiotyki: Polymyxin B sulphate (Sigma) 0,003 g, kwas nalidyksowy (Sigma) 0,008 g, Cycloheximide (Sigma) 0,2 g. Rozpuszczać antybiotyki w roztworach podstawowych w następujący sposób: kwas nalidyksowy w 0,01 M NaOH, cycloheximide w 50 % etanolu, polymyxin B sulphate w wodzie destylowanej. Roztwory podstawowe są sterylizowane na filtrze. Uwaga: Trwałość podstawowego podłoża wynosi trzy miesiące. Po dodaniu antybiotyków przy przechowywaniu w lodówce trwałość wynosi jeden miesiąc.

Dodatek 6 Zatwierdzony protokół badania metodą PCR i odczynniki Uwaga: Wstępne testy powinny umożliwić powtarzalne wykrywanie co najmniej 103 do 104 komórek C. m. sepedonicus na ml ekstraktu próby. Wstępne testy powinny także wykazać brak fałszywie dodatnich wyników z panelu wybranych szczepów bakteryjnych. 1. Procedura wielokrotnego PCR z wewnętrzną kontrolą PCR (Pastrik, 2000) 1.1. Startery oilgonukleotydowe Starter forward PSA-1 5′- ctc ctt gtg ggg tgg gaa aa -3′ Starter reverse PSA-R 5′- tac tga gat gtt tca ctt ccc c -3′ Starter forward NS-7-F 5′- gag gca ata aca ggt ctg tga tgc -3′ Starter reverse NS-8-R 5′- tcc gca ggt tca cct acg ga -3′ Oczekiwana wielkość amplikonu z matrycy DNA C. m. subsp. sepedonicus = 502 bp (PSA-zestaw starterów). Oczekiwana wielkość amplikonu z 18S rRNA wewnętrznej kontroli PCR = 377 bp (NS-zestaw starterów). 1.2. Mieszanina do reakcji PCR Odczynnik Ilość na reakcję Stężenie końcowe Sterylna UPW 15,725 µl 10x bufor PCR (1) (15 mM MgCl2) 2,5 µl 1x (1,5 mM MgCl2) BSA (frakcja V) (10 %) 0,25 µl 0,1 % Mieszania d-NTP (20mM) 0,125 µl 0,1 mM Starter PSA-1 (10µM) 0,5 µl 0,2 µM Starter PSA-R (10µM) 0,5 µl 0,2 µM Starter NS-7-F (10µM) (2) 0,1 µl 0,04 µM Starter NS-8-R (10µM) (2) 0,1 µl 0,04 µM Polimeraza Taq (5U/µl) (1) 0,2 µl 1,0 U Objętość próbki 5,0 µl Całkowita objętość: 25,0 µl 1.3. Warunki reakcji PCR Przeprowadzić następujący program: 1 cykl: i) 3 minuty przy 95 °C (denaturacja matrycowego DNA) 10 cykli: ii) 1 minuta przy 95 °C (denaturacja matrycowego DNA) iii) 1 minuta przy 64 °C (dołączanie starterów) iv) 1 minuta przy 72 °C (wydłużanie kopii) 25 cykli: v) 30 sekund przy 95 °C (denaturacja matrycowego DNA) vi) 30 sekund przy 62 °C (dołączanie starterów) vii) 1 minuta przy 72 °C (wydłużanie kopii) 1 cykl: viii) 5 minut przy 72 °C (ostateczne wydłużanie) ix) zatrzymać przy 4 °C. Uwaga: Program ten jest zoptymalizowany do użytku z termocyklerem MJ Research PTC 200. W przypadku stosowania innych modeli może być konieczna modyfikacja czasu trwania etapów cykli ii), iii), iv), v), vi) oraz vii). 1.4. Analiza amplikonu przy użyciu enzymu restrykcyjnego. Produkty PCR ze zwielokrotnionego DNA C. m. subsp. sepedonicus dają po inkubacji w temp. 37 °C przez 30 minut charakterystyczny polimorfizm długości fragmentów restrykcyjnych uzyskanych za pomocą enzymu Bgl II. Fragmenty restrykcyjne uzyskane z C. m. subsp. sepedonicus mają wielkość 282 bp i 220 bp. 2. Przygotowywanie buforu obciążającego 2.1. Błękit bromofenolowy (10 % – roztwór podstawowy) Błękit bromofenolowy 5 g Woda destylowana (2x dest.) 50 ml 2.2. Bufor obciążający Glicerol 86 % 3,5 ml Błękit bromofenolowy(5.1) 300 µl Woda destylowana (2x dest.) 6,2 ml 3. Bufor 10X Tris Acetate EDTA (TAE), pH 8.0 Bufor Tris 48,4 g Kwas octowy lodowaty 11,42 ml EDTA (sól dwusodowa) 3,72 g Woda destylowana 1,00 L Rozcieńczyć do 1x przed użyciem. Dostępny także w handlu (np. Invitrogen lub odpowiednik). (1) Metody zostały zatwierdzone przy użyciu polimerazy Taq Perkin Elmer (AmpliTaq lub Gold) i Gibco BRL. (2) Stężenia starterów NS-7 F i NS-8-R zostały zoptymalizowane dla ekstraktów z części przystolonowych ziemniaków przy użyciu metody homogenizacji i oczyszczania DNA zgodnie z publikacją: Pastrik (2000) (patrz: część 6.1 a) i 6.2). Powtórna optymalizacja stężeń odczynników będzie wymagana, jeśli będzie zastosowana ekstrakcja przez wytrząsanie lub inne metody izolacji DNA.

Dodatek 7 Zatwierdzone odczynniki do testu FISH 1. Sondy oligonukleotydowe Sonda specyficzna dla Cms CMS-CY3-01: 5′- ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg -3′ Niespecyficzna sonda eubakteryjna EUB-338-FITC: 5′- gct gcc tcc cgt agg agt-3′ 2. Roztwór utrwalający [UWAGA! ŚRODEK UTRWALAJĄCY ZAWIERA PARAFORMALDEHYD, KTÓRY JEST TOKSYCZNY. NALEŻY ZAKŁADAĆ RĘKAWICE I NIE WDYCHAĆ. ZALECA SIĘ PRACĘ POD WYCIĄGIEM] i) Ogrzać 9 ml wody klasy stosowanej w biologii molekularnej (np. ultraczysta woda (UPW)) do około 60 °C i dodać 0,4 g paraformaldehydu. Paraformaldehyd rozpuszcza się po dodaniu pięciu kropli 1N NaOH i wymieszaniu na mieszadle magnetycznym. ii) Ustalić pH na 7,0 przez dodanie 1 ml 0.1 M buforu fosforanowego (PB; pH 7,0) oraz 5 kropli 1N HCl. Sprawdzić pH papierkiem lakmusowym i dostosować, jeśli trzeba, za pomocą HCl lub NaOH. [UWAGA! NIE STOSOWAĆ PH-METRU DO ROZTWORÓW ZAWIERAJĄCYCH PARAFORMALDEHYD] iii) Przefiltrować roztwór przez filtr membranowy 0,22 µm i przechowywać do czasu użycia w temp. 4 °C, zabezpieczywszy przed kurzem. iv) Uwaga: Alternatywny roztwór utrwalający: 96 % etanol. 3. 3x Hybmix NaCl 2,7 M Tris-HCl 60 mM (pH 7,4) EDTA (sterylizowany na filtrze i autoklawowany) 15 mM Rozcieńczyć do 1x, jak wymagane. 4. Roztwór do hybrydyzacji 1x Hybmix Siarczan dodecylu sodu (SDS) 0,01 % sonda EUB 338 5 ng/μl sonda CMSCY301 5 ng/μl Przygotować objętości roztworu do hybrydyzacji zgodnie z obliczeniami w tabeli 1. Dla każdego szkiełka (zawierającego dwie różne próby w powtórzeniu) potrzebnych jest 90 µl roztworu do hybrydyzacji. Tabela: Zalecane ilości do przygotowania mieszaniny do hybrydyzacji 2 szkiełka 8 szkiełek Sterylna UPW 50,1 200,4 3x hybmix 30,0 120,0 1 % SDS 0,9 3,6 Sonda EUB 338 (100 ng/μl) 4,5 18,0 Sonda CMSCY301 (100 ng/μl) 4,5 18,0 Całkowita objętość (μl) 90,0 360,0 Uwaga: Przechowywać wszystkie roztwory zawierające wrażliwe na światło sondy oligonukleotydowe w ciemności, w temperaturze –20 °C. W czasie stosowania chronić przed bezpośrednim światłem słonecznym lub światłem elektrycznym. 5. 0,1M bufor fosforanowy, pH 7,0 Na2HPO4 8,52 g KH2PO4 5,44 g Woda destylowana 1,00 L Rozpuścić składniki, sprawdzić pH i przez 15 min sterylizować w autoklawie w temp. 121 °C.

Dodatek 8 Hodowla oberżyny Nasiona oberżyny (Solanum melongena) wysiać do pasteryzowanego kompostu stosowanego dla nasion. Siewki z pełni rozwiniętymi liścieniami (od 10 do 14 dni) przesadzić do pasteryzowanego kompostu doniczkowego. Rośliny oberżyny powinny być hodowane w szklarni w następujących warunkach środowiskowych: Długość dnia 14 godzin lub naturalna długość dnia, w przypadku dnia dłuższego; Temperatura dzień 21 do 24 °C, noc 15 °C.

Wrażliwe odmiany oberżyny: „Black Beauty”, „Long Tom”, „Rima”, „Balsas”. Dostawca: patrz strona internetowa http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main