Dziesiąta Dyrektywa Komisji

z dnia 25 lipca 1984 r.

ustanawiająca wspólnotowe metody analizy do celów urzędowej kontroli pasz

(84/425/EWG)

KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH,

uwzględniając Traktat ustanawiający Europejską Wspólnotę Gospodarczą,

uwzględniając dyrektywę Rady 70/373/EWG z dnia 20 lipca 1970 r. w sprawie wprowadzenia wspólnotowych metod pobierania próbek i analizy do celów urzędowej kontroli pasz [1], ostatnio zmienioną Aktem Przystąpienia Grecji, w szczególności jej art. 2,

a także mając na uwadze, co następuje:

dyrektywa stawia wymóg, aby urzędowa kontrola pasz była przeprowadzana przy użyciu wspólnotowych metod pobierania próbek i analizy do celów sprawdzania zgodności z wymaganiami wynikającymi z przepisów ustawowych, wykonawczych lub administracyjnych dotyczących jakości i składu pasz;

w dyrektywach Komisji 71/250/EWG [2], 73/46/EWG [3], 74/203/EWG [4], 75/84/EWG [5], 76/372/EWG [6], ostatnio zmienionych dyrektywą 81/680/EWG [7], dyrektywach 71/393/EWG [8], 72/199/EWG [9], 78/633/EWG [10], ostatnio zmienionych dyrektywą 84/4/EWG [11] oraz w dyrektywie 81/715/EWG [12] ustanowiono już szereg metod analizy; ze względu na dokonane od tamtej pory postępy prac zalecane byłoby przyjęcie nowych metod;

środki przewidziane w niniejszej dyrektywie są zgodne z opinią Stałego Komitetu ds. Pasz,

PRZYJMUJE NINIEJSZĄ DYREKTYWĘ:

Artykuł 1

Państwa Członkowskie wymagają, aby analizy do celów urzędowej kontroli pasz w odniesieniu do zawartości spiramycyny były przeprowadzane zgodnie z metodą opisaną w Załączniku.

Artykuł 2

Państwa Członkowskie wprowadzą w życie, najpóźniej do dnia 30 czerwca 1985 r., przepisy ustawowe, wykonawcze i administracyjne niezbędne do wykonania niniejszej dyrektywy i niezwłocznie powiadomią o tym Komisję.

Artykuł 3

Niniejsza dyrektywa skierowana jest do Państw Członkowskich.

Sporządzono w Brukseli, dnia 25 lipca 1984 r.

W imieniu Komisji

Poul Dalsager

Członek Komisji

[1] Dz.U. L 170 z 3.8.1970, str. 2.

[2] Dz.U. L 155 z 12.7.1971, str. 13.

[3] Dz.U. L 83 z 30.3.1973, str. 21.

[4] Dz.U. L 108 z 22.4.1974, str. 7.

[5] Dz.U. L 32 z 5.2.1975, str. 26.

[6] Dz.U. 102 z 15.4.1976, str. 8.

[7] Dz.U. L 246 z 29.8.1981, str. 32.

[8] Dz.U. L 279 z 20.12.1971, str. 7.

[9] Dz.U. L 123 z 29.5.1972, str. 6.

[10] Dz.U. L 206 z 29.7.1978, str. 43.

[11] Dz.U. L 15 z 18.1.1984, str. 28.

[12] Dz.U. L 257 z 10.9.1981, str. 38.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK

OZNACZANIE SPIRAMYCYNY POPRZEZ DYFUZJĘ NA PODŁOŻU AGAROWYM

1. Cel i zakres

Metoda służy oznaczaniu spiramycyny w paszach i premiksach. Dolna granica oznaczenia to 1 mg/kg (1 ppm) [1]

2. Zasada

Próbka jest ługowana za pomocą mieszaniny metanolu/roztworu buforowego będącego wodorowęglanem fosforanowym, o współczynniku pH 8. Ekstrakt jest dekantowany bądź odwirowywany i rozcieńczany. Jego aktywność antybiotykowa jest oznaczana poprzez pomiar dyfuzji spiramycyny w podłożu agaru posianym Micrococcus luteus. Dyfuzję objawia się tworzeniem stref hamujących rozwój mikroorganizmów. Przyjmuje się, że średnica tych stref jest wprost proporcjonalna do logarytmu stężenia antybiotyków w zakresie zastosowanych stężeń antybiotyków.

3. Drobnoustroje: Micrococcus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB 8553)

3.1. Utrzymanie kultury macierzystej

Dokonać posiewu Microcossus luteus na pożywce umieszczonej w probówkach (ppkt 4.1) i inkubować drobnoustroje przez 24 godziny w temperaturze 30 oC. Przechowywać w lodówce w temperaturze około 4 oC. Dokonywać posiewu co dwa tygodnie.

3.2. Przygotowanie zawiesiny bakteryjnej [2]

Zebrać przyrost ze świeżo przygotowanej powierzchni agaru (ppkt 3.1) za pomocą 2-3 ml roztworu chlorku sodowego (ppkt 4.3). Użyć niniejszą zawiesinę do posiania 250 ml pożywki (ppkt 4.1), zawartej w kolbie Rouksa, i inkubować 18-20 godzin w temperaturze 30 oC. Zebrać przyrost w 25 ml roztworu chlorku sodowego (ppkt 4.3) i wymieszać. Rozcieńczyć roztwór dziesięciokrotnie za pomocą roztworu chlorku sodowego (ppkt 4.3). Transmisja światła zawiesiny powinna przechodzić przez zawiesinę, zmierzona przy 650 nm, w naczynku 1 cm w stosunku do roztworu chlorku sodowego (ppkt 4.3), powinna wynosić około 75 %. Zawiesina ta może być przechowywana przez tydzień w temperaturze około 4 oC.

4. Pożywki i odczynniki

4.1. Pożywka [3]

Pepton mięsa | 6,0 g |

Trypton | 4,0 g |

Ekstrakt z drożdży | 3,0 g |

Ekstrakt z mięsa | 1,5 g |

Glukoza | 1,0 g |

Agar | 10,0-20,0 g |

Woda | 1000 ml |

pH 6,5-6,6 (po sterylizacji). | |

4.2. Odczynnik do oznaczenia [4]

Trypton | 5,0 g |

Ekstrakt drożdży | 4,0 g |

Ekstrakt z mięsa | 3,0 g |

Agar | 10,0-20,0 g |

Woda | 1000 ml |

pH 8.0 (po sterylizacji). | |

4.3. 0,8-procentowy (stężenie wagowe) roztwór chlorku sodowego

Rozpuścić 8 g chlorku sodowego w wodzie i rozcieńczyć do 1000 ml; poddać sterylizacji.

4.4. Buforowy roztwór wodorowęglanu fosforanu, pH 8,0

Wodorofosforan dwupotasowy K2HPO4 | 16,7 g |

Dwuwodorofosforan potasu KH2PO4 | 0,5 g |

Wodorowęglan sodu NaHCO3 | 20,0 g |

Woda do | 1000 ml |

4.5. Mieszanina roztworu buforowego wodorowęglanu fosforanu (ppkt 4.4)

50/50 (objętościowo/objętościowo).

4.6. Substancja wzorcowa

Spiramycyna o znanej aktywności (w jednostkach międzynarodowych).

5. Roztwory wzorcowe

Rozpuścić dokładnie odważoną ilość substancji wzorcowej (ppkt 4.6) w mieszaninie (ppkt 4.5) i rozcieńczyć tę samą mieszaniną, aby uzyskać roztwór podstawowy zawierający 1000 jednostek międzynarodowych spiramycyny na mililitr. Roztwór ten przechowywany w zakorkowanej kolbie w temperaturze 4 oC jest stabilny przez pięć dni.

Na bazie tego roztworu, rozcieńczając go stopniowo za pomocą mieszaniny (ppkt 4.5), należy przygotować następujące roztwory:

S8 | 1 | j.m./ml |

S4 | 0,5 | j.m./ml |

S2 | 0,25 | j.m./ml |

S1 | 0,125 | j.m./ml |

6. Przygotowanie ekstraktu i roztworów do oznaczania

6.1. Ekstrakcja

Odważyć próbkę 20,0 g w przypadku pasz oraz 1,0-20,0 g w przypadku premiksów. Dodać 100 ml mieszaniny (ppkt 4.5) i potrząsać przez 30 minut. Odwirować lub dekantować, a ciecz zlaną znad osadu rozcieńczyć mieszaniną (ppkt 4.5), aby uzyskać oczekiwaną zawartość spiramycyny wynoszącą 1 j.m./ml (= U8).

W przypadku oczekiwanych zawartości spiramycyny poniżej 2,5 mg/kg paszy proces ekstrakcji musi być przeprowadzony w następujący sposób. Należy odważyć próbkę 20,0 g. Dodać 100 ml mieszaniny (ppkt 4.5) i potrząsać przez 30 minut. Odwirować przez kilka minut, wziąć 50 ml cieczy zlanej znad osadu i odparować do objętości około 4 ml w warunkach zmniejszonego ciśnienia w obrotowej wyparce w temperaturze 40 oC. Pozostałości należy rozcieńczyć mieszaniną (ppkt 4.5), aby uzyskać oczekiwaną zawartość spiramycyny wynoszącą 1 j.m./ml (= U8).

6.2. Roztwory do oznaczania

Z roztworu U8 przygotować roztwory U4 (zakładana zawartość: 0,5 j.m./ml), U2 (zakładana zawartość: 0,25 j.m./ml) oraz U1 (zakładana zawartość: 0,125 j.m./ml) w drodze kolejnych rozcieńczeń (1 + 1) za pomocą mieszaniny (ppkt 4.5).

7. Procedura oznaczania

7.1. Posiew odczynnika do oznaczania

Dokonać posiewu odczynnika do oznaczania (ppkt 4.2) za pomocą zawiesiny bakteryjnej (ppkt 3.2) w temperaturze około 50 oC. Za pomocą wstępnych prób na płytkach z odczynnikiem do oznaczania (ppkt 4.2) ustalić ilość zawiesiny bakteryjnej niezbędnej do uzyskania największych i najczystszych stref hamujących reakcję przy różnych wielkościach stężenia spiramycyny.

7.2. Przygotowanie płytek

Dyfuzję w agarze wykonuje się na płytkach z czterema stężeniami roztworów wzorcowych (S8, S4, S2, S1) oraz z czterema stężeniami roztworu do oznaczania (U8, U4, U2, U1). Powyższe cztery stężenia ekstraktu i wzorca muszą być koniecznie umieszczone na każdej płytce. W tym celu wybrać odpowiednio duże płytki dla umożliwienia wykonania co najmniej ośmiu otworów o średnicy 10-13 mm i nie mniej niż 30 mm między środkami, w podłożu agarowym. Próba może być wykonana na płytkach szklanych z pierścieniem z aluminium lub tworzywa sztucznego umieszczonym na górnej powierzchni, o średnicy 200 mm i 20 mm wysokości.

Do płytek wlać odpowiednią ilość odczynnika (ppkt 4.2), posianego zgodnie z opisem w ppkt 7.1, aby uzyskać 2-mm warstewkę (60 ml na płytkę o średnicy 200 mm). Pozostawić przez chwilę do ustalenia poziomu powierzchni, następnie naciąć otwory i umieścić w nich dokładnie odmierzone ilości roztworów do oznaczania i wzorcowych (0,10-0,15 ml na otwór, zgodnie ze średnicą). Zastosować każde stężenie co najmniej cztery razy, tak aby każde oznaczenie podlegało ocenie 32 stref hamujących.

7.3. Inkubacja

Inkubować płytki 16-18 godzin w temperaturze 30 oC ± 2 oC.

8. Ocena

Zmierzyć średnicę stref hamujących z dokładnością do 0,1 mm. Zapisać średnie wartości pomiarów dla każdego stężenia na papierze półlogarytmicznym, pokazując logarytm ze stężeń w zależności do średnicy stref hamujących. Wykreślić linie o najlepszej zgodności zarówno dla roztworu wzorcowego, jak i ekstraktu, na przykład jak poniżej.

Wyznaczyć punkt o najlepszej zgodności dla najniższego poziomu wzorcowego (S, stosując następujący wzór:

SL =

10

Wyznaczyć punkt o najlepszej zgodności dla najwyższego poziomu wzorcowego (SH), stosując następujący wzór:

SH =

10

W podobny sposób należy obliczyć punkty o najlepszej zgodności dla najniższego poziomu ekstraktu (UL) oraz dla najwyższego poziomu ekstraktu (UH), wstawiając w powyższych wzorach w miejsce wartości s1, s4 i s8 wartości u1, u2 i u4 [5].

Zapisać obliczone wartości SL i SH na tym samym papierze milimetrowym i połączyć je linią, łączącą punkty o najlepszej zgodności dla wzorcowego roztworu. W podobny sposób zapisać wartości UL i UH na papierze milimetrowym i połączyć je, uzyskując linię łączącą punkty o najlepszej dla ekstraktu.

W przypadku braku jakichkolwiek zakłóceń linie powinny być równoległe. Do celów praktycznych linie można uznać za równoległe, jeśli wartości (SH–SL) oraz (UH–UL) nie odbiegają więcej niż 10 % od ich wartości średniej.

Jeśli okaże się, że wykresy nie są równoległe, to albo u1 i s1 lub u8 i s8 mogą być odrzucone, a wartości SL, SH, UL oraz UH obliczone przy użyciu alternatywnego wzoru, który powinien dać linie łączące punkty o najlepszej zgodności:

SL =

5s

+ 2s

–s

5s

+ 2s

– s

86

SH =

6

vagy

6

podobnie dla wartości UL i UH. Alternatywne linie, łączące punkty o najlepszej zgodności, powinny być sprawdzone pod kątem równoległości, tak jak poprzednio. Fakt, że wyniki zostały otrzymane przy użyciu trzech różnych poziomów, należy odnotować w sprawozdaniu końcowym.

Kiedy linie zostaną uznane za równoległe, obliczyć logarytm względnej aktywności (log. A), stosując wzór podany poniżej, w zależności od tego, czy do oceny równoległości zastosowano trzy lub też cztery poziomy.

Dla czterech poziomów

Log A =

u

+u

+ u

+ u

– s

– s

– s

– s

8 × 0,602u4+ u8+ s4+ s8 –u1 – u2 – s1 – s2

lub

Log A =

u

+ u

+ u

– s

– s

– s

4 × 0,401u4+ s4 – u1 – s1

lub

Log A =

u

+ u

+ u

– s

– s

– s

8 × 0,401u8+ s8 – u2 – s2

Rzeczywista aktywność = aktywność domniemana × aktywność względna A

U

= S

× A

Jeśli okaże się, że względna aktywność nie mieści się w przedziale 0,5-2,0, powtórzyć procedurę oznaczenia po odpowiednim skorygowaniu stężeń ekstraktu lub, jeżeli nie jest to możliwe, to roztworów wzorcowych. Gdy nie można osiągnąć wartości względnej aktywności w wymaganym zakresie, to dowolny uzyskany wynik powinien być wzięty pod uwagę jako wynik przybliżony, co należy odnotować w sprawozdaniu końcowym.

W przypadku gdy linie nie są równoległe, powtórzyć oznaczenie. Jeśli nadal linie wykresów nie będą równoległe, oznaczenie uznaje się za niezadowalające.

Wynik podaje się w miligramach bazowej spiramycyny na kilogram paszy.

9. Powtarzalność

Różnica między wynikami dwóch oznaczeń przeprowadzonych na tej samej próbie, przez tego samego analityka, nie powinna przekraczać:

- 2 mg/kg, w wartościach bezwzględnych, dla zawartości roztworu bazowego spiramycyny do 10 mg/kg,

- 20 % w przypadku najwyższej zawartości spiramycyny w przedziale 10-25 mg/kg,

- 5 mg/kg, w wartościach bezwzględnych, dla zawartości spiramycyny w przedziale 25-50 mg/kg,

- 10 % w przypadku najwyższej zawartości powyżej 50 mg/kg.

[1] 1 mg roztworu bazowego spiramycyny równa się 3200 jednostkom międzynarodowym (IU).

[2] Mogą być stosowane inne metody pod warunkiem, że ustalono, że dają one takie same zawiesiny bakteryjne.

[3] Może być użyta dowolna inna, dostępna w handlu, pożywka o podobnym składzie i dająca takie same rezultaty.

[4] Może być użyta dowolna inna, dostępna w handlu, pożywka o podobnym składzie i dająca takie same rezultaty.

[5] Małe litery "s" i "u" odnoszą się do średnic stref hamujących.

--------------------------------------------------