ZAŁĄCZNIK I

Schemat testów, które należy przeprowadzić zgodnie z art. 3, 4, 5 i 7

1. OGÓLNE ZASADY DOTYCZĄCE WYSTĘPOWANIA OKREŚLONEGO AGROFAGA

1.1. Występowanie określonego agrofaga podejrzewa się w przypadku uzyskania pozytywnego wyniku pierwszego testu wykrywania przeprowadzonego na określonej roślinie lub na próbkach wody.

1.2. Występowanie określonego agrofaga jest potwierdzone w następujących przypadkach: a) gdy pierwszym lub drugim testem wykrywania jest izolacja selektywna, w wyniku której powstają kolonie o typowej morfologii, a pozytywne wyniki uzyskuje się w dwóch testach identyfikacyjnych przeprowadzonych na tych koloniach; b) gdy pierwszym i drugim testem są testy inne niż izolacja selektywna, a pozytywne wyniki uzyskuje się w dwóch testach identyfikacyjnych po poddaniu próbki izolacji selektywnej, w wyniku której powstają kolonie o typowej morfologii. Jednym z tych dwóch testów identyfikacyjnych jest test, o którym mowa w pkt 2.2 lit. e), f) i g).

2. TESTY

2.1. Testy wykrywania

Testy wykrywania zapewniają spójne wykrywanie co najmniej 104 komórek/ml zawieszonego osadu pobranego z próbek niewykazujących objawów.

Drugi test wykrywania opiera się na innych zasadach biologicznych lub innych regionach nukleotydowych niż pierwszy test wykrywania.

Stosuje się następujące testy wykrywania:

a) testy immunofluorescencyjne zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

b) izolację określonego agrofaga na podłożu półselektywnym mSMSA zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

c) konwencjonalny test PCR z użyciem starterów Pastrik et al. (2002) (1) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

d) testy PCR TaqMan® w czasie rzeczywistym z użyciem starterów i sond: (i) Weller et al. (2000) (2) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych; (ii) Vreeburg et al. (2016) (3) (przy użyciu sondy TaqMan® zmodyfikowanej w stosunku do oryginalnej sondy opisanej przez Wellera et al. (2000)) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych; (iii) Vreeburg et al. (2018) (4) (tak zwany test NYtor) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych; (iv) Massart et al. (2014) (5) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

e) test LAMP (izotermiczna amplifikacja kwasów nukleinowych) z użyciem starterów Lenarčič et al. (2014) (6) (jedynie w przypadku materiału roślinnego o typowych objawach chorobowych) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych.

2.2. Testy identyfikacyjne

Stosuje się następujące testy identyfikacyjne:

a) testy immunofluorescencyjne zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

b) konwencjonalne testy PCR z użyciem starterów Pastrik et al. (2002) zgodnie ze szczegółowym opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

c) testy PCR TaqMan® w czasie rzeczywistym z użyciem starterów i sond: (i) Weller et al. (2000) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych; (ii) Vreeburg et al. (2016) (przy użyciu sondy TaqMan® zmodyfikowanej w stosunku do oryginalnej sondy opisanej przez Wellera et al. (2000)) zgodnie ze szczegółowym opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych; (iii) Vreeburg et al. (2018) (tak zwany test NYtor) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych; (iv) Massart et al. (2014) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

d) test LAMP (amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli) z użyciem starterów Lenarčič et al. (2014) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

e) specyficzny dla danego filotypu multipleksowy konwencjonalny test PCR (Opina et al. (1997) (7); Fegan i Prior (2005) (8) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

f) barkodowanie DNA (Wicker et al. (2007) (9) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

g) MALDI-TOF MS (van de Bilt et al. (2018) (10) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych.

3. SCHEMATY BLOKOWE PROCEDUR

Schemat blokowy nr 1: Procedura diagnostyczna dotycząca występowania określonego agrofaga w próbkach określonej rośliny

a Izolacja może być stosowana jako pierwszy lub drugi test wykrywania. Jeśli podejrzewa się występowanie określonego agrofaga na podłożu, kolonie oczyszcza się w celu uzyskania czystych kultur, na których należy przeprowadzić dwa testy identyfikacyjne.

b Jednym z tych dwóch testów identyfikacyjnych jest test, o którym mowa w pkt 2.2 lit. e), f) i g). W celu potwierdzenia występowania agrofaga wymagane są pozytywne wyniki w dwóch testach identyfikacyjnych.

c Trzeci test wykrywania opiera się na innych zasadach biologicznych lub innych regionach nukleotydowych.

Schemat blokowy nr 2: Procedura diagnostyczna dotycząca określonego agrofaga w próbkach wody

a Jednym z tych dwóch testów identyfikacyjnych jest test, o którym mowa w pkt 2.2 lit. e), f) i g). W celu potwierdzenia występowania agrofaga wymagane są pozytywne wyniki w dwóch testach identyfikacyjnych.

4. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI

4.1. Próbki pochodzące z bulw niewykazujących objawów

Standardowa próbka zawiera 200 bulw na każdy test. W międzynarodowych standardach diagnostycznych opisano właściwą procedurę laboratoryjną stosowaną do testowania fragmentów części przystolonowych w celu uzyskania ekstraktu do wykrywania określonego agrofaga.

4.2. Próbki pochodzące z określonych roślin niewykazujących objawów

Wykrywanie zakażeń utajonych przeprowadza się w próbkach złożonych z fragmentów łodygi lub ogonków liściowych. Procedurę można zastosować do maksymalnie 200 fragmentów łodygi lub 200 ogonków liściowych pobranych z różnych roślin w jednej próbce. W międzynarodowych standardach diagnostycznych opisano właściwą procedurę laboratoryjną stosowaną do odkażania i testowania fragmentów łodygi lub ogonków liściowych w celu uzyskania ekstraktu przeznaczonego do wykrywania określonego agrofaga.

4.3. Próbki pochodzące z wykazującego objawy materiału określonych roślin

Fragmenty tkanki pobiera się aseptycznie z pierścienia wiązek przewodzących bulwy ziemniaka albo z wiązek przewodzących łodygi określonych roślin wykazujących objawy więdnięcia. W międzynarodowych standardach diagnostycznych opisano szczegółowo właściwą procedurę laboratoryjną stosowaną do testowania tych tkanek w celu uzyskania ekstraktu przeznaczonego do wykrywania określonego agrofaga.

4.4. Próbki wody powierzchniowej lub recyrkulacyjnej (w tym ścieki pochodzące z obróbki ziemniaków lub ścieki ciekłe)

Podstawowym testem służącym do wykrywania określonego agrofaga w próbkach wód powierzchniowych, wód z systemów recyrkulacji oraz próbkach ścieków (przemysł przetwórczy ziemniaków) jest izolacja selektywna. W międzynarodowych standardach diagnostycznych opisano właściwą procedurę laboratoryjną stosowaną do testowania próbek wody.

(1) Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G., Pukall, R. (2002), „Sequence analysis and detection of Ralstonia solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S-23S ribosomal intergenic spacer region with internal positive control”, European Journal of Plant Pathology nr 108, s. 831–842.

(2) Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., Boonham, N., Stead, D.E. (2000), „Detection of Ralstonia solanacearum strains with a quantitative, multiplex, real-time, fluorogenic PCR (TaqMan) assay”, Applied and Environmental Microbiology nr 66, s. 2853–2858. https://journals.asm.org/doi/10.1128/AEM.66.7.2853-2858.2000.

(3) Vreeburg, R.A.M., Bergsma-Vlami, M., Bollema, R.M., de Haan, E.G., Kooman-Gersmann, M., Smits-Mastebroek, L., Tameling, W.I.L., Tjou-Tam-Sin, N.N.A., van de Vossenberg B.T.L.H, Janse, J.D. (2016), „Performance of real-time PCR and immunofluorescence for the detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus and Ralstonia solanacearum in potato tubers in routine testing”, Bulletin OEPP/EPPO Bulletin nr 46, s. 112–121.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018), „Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach”, EPPO Bulletin nr 48, s. 86–96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014), „Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay”, European Journal of Plant Pathology nr 138, s. 29–37.

(6) Lenarčič, R., Morisset, D., Pirc, M., Llop, P., Ravnikar, M., Dreo, T. (2014), „Loop-mediated isothermal amplification of specific endoglucanase gene sequence for detection of the bacterial wilt pathogen Ralstonia solanacearum”, PLoS ONE 9(4), e96027. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0096027.

(7) Opina, N., Tavner, F., Holloway, G., Wang, J.F., Li, T.H., Maghirang, R., Fegan, M., Hayward, A.C., Viji Krishnapillai, A., Wai-Foong Hong, Holloway, B.W, Timmis, J.N. (1997), „A novel method for development of species and strainspecific DNA probes and PCR primers for identifying Burkholderia solanacearum (formerly Pseudomonas solanacearum)”, Asia-Pacific Journal of Molecular Biology and Biotechnology nr 5, s. 19–30.

(8) Fegan, M., Prior, P. (2005), „How complex is the »Ralstonia solanacearum species complex«”, w Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex (wyd. Allen C., Hayward A.C. & Prior P.), s. 449–461. American Phytopathological Society, St Paul, MN (USA).

(9) Wicker, E., Grassart, L., Coranson-Beaudu, R., Mian, D., Guilbaud, C., Fegan, M., Prior, P. (2007), „Ralstonia solanacearum strains from Martinique French West Indies) exhibiting a new pathogenic potential”, Applied and Environmental Microbiology nr 73, s. 6790–6801.

(10) van de Bilt, J.L.J., Wolsink, M.H.L., Gorkink-Smits, P.P.M.A., Landman, N.M., Bergsma-Vlami, M. (2018), „Application of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-Of-Flight Mass Spectrometry for rapid and accurate identification of Ralstonia solanacearum and Ralstonia pseudosolanacearum”, European Journal of Plant Pathology, https://doi.org/10.1007/s10658-018-1517-5.