8)

W części B dodaje się rozdziały w brzmieniu: „B.63 BADANIE KLASYFIKACYJNE TOKSYCZNOŚCI REPRODUKCYJNEJ I ROZWOJOWEJ WPROWADZENIE 1. Niniejsza metoda badawcza jest równoważna wytycznej OECD dotyczącej badań (TG) nr 421 (2016). Okresowo dokonuje się przeglądu wytycznych OECD dotyczących badania substancji chemicznych pod kątem postępu naukowego. Pierwotna wytyczna dotycząca badań klasyfikacyjnych 421 została przyjęta w 1995 r. na podstawie protokołu „Wstępne badanie klasyfikacyjne toksyczności reprodukcyjnej ( Preliminary Reproduction Toxicity Screening Test )” omówionego na dwóch posiedzeniach ekspertów: w Londynie w 1990 r. (1) i w Tokio w 1992 r. (2). 2. Niniejsza metoda badawcza została zaktualizowana o właściwe punkty końcowe badania substancji zaburzającej funkcjonowanie układu hormonalnego w ramach działań następczych do działania o wysokim priorytecie podjętego przez OECD w 1998 r., mającego na celu zmianę istniejących wytycznych i opracowanie nowych wytycznych dotyczących badań klasyfikacyjnych i badania potencjalnych substancji zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego (3). Na przykład wytyczną dotyczącą badań nr OECD 407 (28-dniowe badanie toksyczności doustnej wywołanej powtarzanym dawkowaniem u gryzoni, rozdział B.7 niniejszego załącznika) wzbogacono w 2008 r. o parametry odpowiednie do wykrywania aktywności endokrynologicznej badanych substancji chemicznych. Celem aktualizacji wytycznej dotyczącej badań nr 421 było uwzględnienie niektórych właściwych punktów końcowych substancji zaburzającej funkcjonowanie układu hormonalnego w badaniach klasyfikacyjnych TG, gdzie okresy narażenia obejmują niektóre wrażliwe okresy w rozwoju (okresy przed lub wcześnie po urodzeniu). 3. Wybrane dodatkowe właściwe punkty końcowe badania substancji zaburzającej funkcjonowanie układu hormonalnego, stanowiące również część wytycznej dotyczącej badań 443 (Rozszerzone badanie toksyczności reprodukcyjnej w jednym pokoleniu, rozdział B.56 niniejszego załącznika), zostały włączone do wytycznej TG 421 na podstawie studium wykonalności dotyczącego kwestii naukowych i technicznych związanych z ich włączeniem, jak również możliwych dostosowań projektu badań potrzebnych do ich włączenia (4). 4. Niniejsza metoda badawcza ma na celu wygenerowanie ograniczonej ilości informacji dotyczących wpływu badanej substancji chemicznej na efektywność reprodukcyjną samców i samic, taką jak funkcja gonad, zachowanie kopulacyjne, zapłodnienie, rozwój jaja płodowego i poród. Nie jest ona metodą alternatywną dla istniejących metod badań B.31, B.34, B.35 lub B.56, ani ich nie zastępuje. ZAŁOŻENIA WSTĘPNE 5. Niniejsza metoda badania klasyfikacyjnego może być stosowana w celu dostarczenia wstępnych informacji na temat możliwego wpływu na reprodukcję lub rozwój, albo na wczesnym etapie oceny właściwości toksykologicznych substancji chemicznych lub na przedmiotowe substancje chemiczne. Może być również stosowana jako część zestawu wstępnych badań klasyfikacyjnych dla istniejących substancji chemicznych, w przypadku których dostępne są niewiele informacji toksykologicznych lub nie ma ich wcale, jako badanie ustalające zakres dawek dla bardziej ekstensywnych badań nad rozrodczością/rozwojem, lub w przypadku gdy jest to uznane za istotne w inny sposób. Przy prowadzeniu badania należy przestrzegać zasad i ustaleń określonych w dokumencie zawierającym wytyczne OECD nr 19 „Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluations” (5) (Wytyczne dotyczące uznawania, oceny i wykorzystywania objawów klinicznych jako punktów humanitarnego zakończenia w odniesieniu do zwierząt doświadczalnych wykorzystywanych w ocenach bezpieczeństwa). 6. Niniejsza metoda badawcza nie zapewnia pełnych informacji na temat wszystkich aspektów reprodukcji i rozwoju. W szczególności oferuje jedynie ograniczone środki wykrywania poporodowych przejawów narażenia prenatalnego lub skutków, które mogą być wywołane podczas narażenia postnatalnego. Ze względu (między innymi) na stosunkowo małą liczbę zwierząt w grupach dawkowania, selektywność punktów końcowych oraz krótki czas trwania badania, metoda ta nie dostarczy dowodów na definitywne stwierdzenie braku skutków. Ponadto wobec braku danych z innych badań toksyczności reprodukcyjnej/rozwojowej, wyniki dodatnie są przydatne do wstępnej oceny zagrożeń i przyczyniają się do podejmowania decyzji dotyczących konieczności i terminów dodatkowych badań. 7. Wyniki uzyskane za pomocą parametrów związanych z układem hormonalnym należy rozpatrywać w kontekście dokumentu „OECD Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals” („Ramy koncepcyjne OECD dotyczące testowania i oceny substancji chemicznych zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego”) (6). W niniejszych ramach koncepcyjnych rozszerzona wytyczna dotycząca badań OECD nr 421 zawarta jest na poziomie 4 jako test in vivo dostarczający danych na temat niekorzystnego wpływu na właściwe punkty końcowe w badaniu wpływu na układ hormonalny. Sygnał endokrynny może jednak nie być uważany za wystarczający dowód na to, że badana substancja chemiczna jest substancją zaburzającą funkcjonowanie układu hormonalnego. 8. Niniejsza metoda badawcza zakłada doustną drogę podawania badanej substancji chemicznej. W przypadku stosowania innych dróg narażenia, może być konieczne dokonanie modyfikacji. 9. Przed zastosowaniem przedmiotowej metody badawczej z użyciem mieszaniny w celu zgromadzenia danych na potrzeby założonego celu regulacyjnego należy zastanowić się, czy zastosowanie tej metody może doprowadzić do uzyskania wyników odpowiednich z punktu widzenia tego celu, a jeżeli tak, to dlaczego. Przeprowadzenie takiej analizy nie jest konieczne, jeżeli ustanowiono wymóg regulacyjny dotyczący badania danej mieszaniny. 10. Stosowane definicje znajdują się w dodatku 1. ZASADA BADANIA 11. Badana substancja chemiczna podawana jest w stopniowanych dawkach kilku grupom samców i samic. Samce powinny otrzymywać dawki substancji przez co najmniej cztery tygodnie do dnia przed planowanym uśmierceniem włącznie (obejmuje to co najmniej dwa tygodnie przed kryciem, w okresie krycia i około dwóch tygodni po kryciu). Ze względu na ograniczone dawkowanie przed kryciem u samców, płodność może nie być szczególnie czułym wskaźnikiem toksyczności w odniesieniu do jąder. W związku z tym niezbędne jest szczegółowe badanie histologiczne jąder. Uważa się, że połączenie dwutygodniowego okresu dawkowania w okresie przed kojarzeniem i późniejszych obserwacji krycia/płodności z ogólnym okresem dawkowania wynoszącym co najmniej cztery tygodnie, po którym następuje szczegółowa histopatologia gonad samców, jest wystarczające do wykrycia większości wpływu na płodność i spermatogenezę samców. 12. Samice powinny otrzymywać dawki przez cały czas trwania badania. Obejmuje to dwa tygodnie przed kryciem (w celu objęcia co najmniej dwóch pełnych cykli estrogenowych), zmienny czas do zapłodnienia, czas trwania ciąży i co najmniej trzynaście dni po porodzie, do dnia planowanego uśmiercenia włącznie. 13. Czas trwania badania, po aklimatyzacji i ocenie cyklu estrogenowego przed dawkowaniem, zależy od efektywności samic i wynosi około 63 dni, [co najmniej 14 dni okresu przed kojarzeniem, (do) 14 dni krycia, 22 dni ciąży, 13 dni laktacji]. 14. Podczas okresu dawkowania każdego dnia zwierzęta są dokładnie obserwowane w celu wykrycia oznak toksyczności. Zwierzęta, które zginą lub zostaną uśmiercone w okresie badania, są poddawane autopsji, a zwierzęta, które przeżyją, są po zakończeniu badania uśmiercane i poddawane autopsji. OPIS METODY Wybór gatunku zwierząt 15. Niniejsza metoda badawcza jest przeznaczona do stosowania z wykorzystaniem szczurów. W przypadku gdy parametry określone w niniejszej metodzie badawczej badane są z wykorzystaniem innego gatunku gryzoni, należy podać uzasadnienie. Szczur był jedynym gatunkiem wykorzystywanym w międzynarodowym programie walidacyjnym dotyczącym substancji zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego w wytycznej dotyczącej badań OECD nr 407 (odpowiadającej rozdziałowi B.7 niniejszego załącznika). Nie należy stosować szczepów o niskiej płodności lub powszechnie znanej wysokiej częstości występowania wad rozwojowych. Należy wykorzystać zdrowe zwierzęta dziewicze, które nie były wcześniej poddawane procedurom badawczym. Badane zwierzęta należy scharakteryzować z uwzględnieniem ich gatunku, szczepu, płci, masy i wieku. W momencie rozpoczęcia badania różnice w masie ciała wykorzystywanych zwierząt powinny być minimalne i nie powinny przekraczać 20 % średniej masy ciała u każdej z płci. W przypadku gdy badanie przeprowadza się jako badanie wstępne w stosunku do badania długoterminowego lub pełnopokoleniowego, zaleca się, aby w obu badaniach wykorzystywać zwierzęta tego samego szczepu i źródła. Warunki utrzymywania i karmienia 16. Wszystkie procedury powinny być zgodne z lokalnymi normami utrzymywania zwierząt laboratoryjnych. Temperatura w pomieszczeniu, w którym przetrzymuje się zwierzęta doświadczalne, powinna wynosić 22 °C (± 3 °). Wilgotność względna, poza okresem sprzątania pomieszczenia, powinna wynosić co najmniej 30 % i raczej poniżej 70 %, należy starać się ją utrzymać na poziomie 50–60 %. Oświetlenie powinno być sztuczne w cyklu 12 godzin z dostępem światła i 12 godzin bez dostępu światła. Do żywienia można stosować konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dostępem do wody pitnej. Na wybór paszy może mieć wpływ potrzeba zapewnienia odpowiedniej domieszki badanej substancji chemicznej w przypadku podawania jej w ramach opisywanej metody. 17. Zwierzęta należy przetrzymywać razem, w małych grupach składających się z osobników tej samej płci; można je przetrzymywać pojedynczo, jeżeli ma to naukowe uzasadnienie. W przypadku przetrzymywania w grupach, w jednej klatce należy umieszczać nie więcej niż pięć zwierząt. Procedury krycia powinny być przeprowadzane w klatkach nadających się do tego celu. Ciężarne samice powinny być przetrzymywane w osobnych klatkach i mieć zapewnione materiały do budowy gniazda. Samice w okresie ciąży będą przebywać w indywidualnych klatkach ze swoim potomstwem. 18. Paszę należy regularnie analizować pod kątem obecności zanieczyszczeń. Próbkę paszy należy zachować do momentu ukończenia sprawozdania. Przygotowanie zwierząt 19. Zdrowe młode dorosłe osobniki zwierząt są losowo przydzielane do grup kontrolnych oraz grup poddawanych działaniu substancji. Klatki należy rozmieścić w taki sposób, aby zminimalizować potencjalny wpływ ich układu. Zwierzęta są identyfikowane jednoznacznie i przetrzymywane w klatkach przez co najmniej pięć dni przed rozpoczęciem badania, żeby umożliwić aklimatyzację do warunków laboratoryjnych. Przygotowanie dawek 20. Zaleca się, aby badana substancja chemiczna była podawana doustnie, chyba że za bardziej odpowiednią uzna się inną drogę podawania. W przypadku wybrania doustnej drogi podawania, badaną substancję chemiczną zazwyczaj podaje się za pomocą sondy; można jednak również zastosować metodę alternatywną polegającą na podaniu badanych substancji chemicznych w paszy lub w wodzie do picia. 21. W razie potrzeby badaną substancję chemiczną rozpuszcza się lub przygotowuje jako zawiesinę w odpowiednim nośniku. Zaleca się, w miarę możliwości, najpierw rozważyć zastosowanie roztworu wodnego/zawiesiny, następnie roztworu/emulsji w oleju (np. z zastosowaniem oleju kukurydzianego), a potem możliwego roztworu w innych nośnikach. W przypadku nośników innych niż woda właściwości toksyczne tego nośnika powinny być znane. Należy określić stabilność i jednorodność badanej substancji chemicznej w nośniku. PROCEDURA Liczba i płeć zwierząt 22. Zaleca się, aby w każdej grupie na początku znajdowało się co najmniej 10 samców i 12–13 samic. Ocena samic będzie prowadzona przed narażeniem pod kątem cykliczności estrogenowej, a do badania nie zostaną włączone zwierzęta, które nie wykażą typowych 4–5 dniowych cykli; w związku z tym zaleca się zastosowanie dodatkowych samic w celu uzyskania 10 samic w każdej grupie. Poza przypadkiem, w którym występują wyraźne efekty toksyczne, oczekuje się, że zapewni to co najmniej 8 ciężarnych samic na grupę, co zazwyczaj stanowi najniższą dopuszczalną liczbę ciężarnych samic na grupę. Celem jest wyprodukowanie odpowiedniej liczby ciąż i potomstwa w celu zapewnienia znaczącej oceny wpływu badanej substancji chemicznej na płodność, ciążę, zachowanie macierzyńskie i zwierząt ssących oraz wzrost i rozwój potomstwa F 1 w okresie od chwili poczęcia do 13 dnia po porodzie. Dawkowanie 23. Zasadniczo należy wykorzystać co najmniej trzy grupy badane i jedną grupę kontrolną. Poziomy dawek mogą opierać się na informacjach z badań dotyczących ostrej toksyczności lub na wynikach badań wielokrotnej dawki. Z wyjątkiem podawania badanej substancji chemicznej zwierzęta w grupie kontrolnej należy traktować w identyczny sposób jak zwierzęta w grupie badanej. Jeżeli przy podawaniu badanej substancji chemicznej jest stosowany nośnik, grupa kontrolna powinna otrzymać największą użytą objętość nośnika. 24. Poziomy dawki powinny być wybierane, biorąc pod uwagę jakiekolwiek istniejące dostępne dane o toksyczności i dane toksykokinetczne. Należy także wziąć pod uwagę, że mogą istnieć różnice w czułości między zwierzętami w ciąży a tymi niebędącymi w ciąży. Należy wybrać taki najwyższy poziom dawkowania, który powoduje oznaki toksyczności, ale nie powoduje śmierci lub silnego cierpienia. Następnie należy dobierać poziomy dawkowania w sekwencji malejącej w taki sposób, aby ukazać wszystkie reakcje powiązane z dawkowaniem i brak obserwowanych szkodliwych zmian przy najmniejszym poziomie dawkowania (NOAEL). Często do ustalenia malejących poziomów dawkowania optymalne jest zastosowanie poziomów dawkowania różniących się od dwu- do czterokrotnie, a zamiast stosować bardzo odległe (np. różniące się więcej niż 10-krotnie) poziomy dawkowania, często lepiej jest dodać czwartą grupę badaną. 25. Jeśli obserwowana jest ogólna toksyczność (np. spadek masy ciała, wpływ na wątrobę, serce, płuca lub nerki itp.) bądź inne zmiany, które nie muszą być efektami toksycznymi (np. zmniejszone pobieranie pokarmu, powiększenie wątroby), należy zachować ostrożność interpretując obserwowane skutki w punktach końcowych wpływu na układ hormonalny. Badanie graniczne 26. Jeżeli badanie z podawaniem doustnym przy jednym poziomie dawki równym co najmniej 1 000 mg/kg masy ciała/dzień lub, w przypadku podawania w paszy lub w wodzie do picia, równoważny procent w paszy lub wodzie do picia, stosując procedury opisane dla tego badania, nie wywołuje widocznych objawów zatrucia i jeżeli nie należałoby spodziewać się toksyczności na podstawie danych, dotyczących substancji strukturalnie pokrewnych, wtedy pełne badanie przy użyciu szeregu poziomów dawki może nie być konieczne. Ten test graniczny stosuje się z wyjątkiem przypadków, w których ekspozycja ludzi wskazuje na konieczność użycia wyższego poziomu dawki doustnej. W odniesieniu do innych dróg podawania, na przykład wziewnej lub stosowania na skórę, fizyczne własności chemiczne badanych substancji chemicznych mogą często wyznaczać najwyższe możliwe do osiągnięcia stężenie. Podawanie dawek 27. Zwierzętom podaje się badaną substancję chemiczną codziennie, przez siedem dni w tygodniu. Gdy badana substancja chemiczna jest podawana przez sondę, należy ją podawać zwierzętom w pojedynczej dawce przy użyciu sondy żołądkowej lub odpowiedniej kaniuli intubacyjnej. Maksymalna objętość płynu, jaką można podać jednorazowo, zależy od wielkości badanego zwierzęcia. Objętość ta nie powinna przekraczać 1 ml/100 g masy ciała, oprócz roztworów wodnych, w przypadku których można użyć 2 ml/100 g masy ciała. Poza drażniącymi lub żrącymi badanymi substancjami chemicznymi, które zwykle dają zaostrzone objawy przy wyższych stężeniach, zmienność objętości w badaniu powinna być zminimalizowana przez dostosowanie stężenia, aby zapewnić stałą objętość przy wszystkich poziomach dawki. 28. W przypadku substancji chemicznych podawanych z paszą lub wodą do picia należy dopilnować, aby ilości podawanej badanej substancji chemicznej nie zakłócały zwykłego odżywiania lub gospodarki wodnej organizmu. Przy podawaniu badanej substancji chemicznej wraz z pokarmem można zastosować stałe stężenie w pokarmie (ppm) lub też stały poziom dawki w zależności do masy ciała zwierzęcia; należy podać zastosowany wariant. W przypadku badanej substancji chemicznej podawanej przez sondę, dawka powinna być podawana każdego dnia o podobnej porze i w razie konieczności modyfikowana co najmniej raz na tydzień, aby utrzymać stały poziom dawki w zależności od masy ciała zwierzęcia. Harmonogram doświadczalny 29. Podawanie dawek substancji obu płciom powinno rozpocząć się co najmniej 2 tygodnie przed kryciem, po zaaklimatyzowaniu się osobników przez co najmniej pięć dni i poddaniu samic badaniu przesiewowemu pod kątem normalnych cykli estrogenowych (w dwa tygodnie przed okresem poddawania działaniu substancji). Badanie powinno być zaprogramowane w taki sposób, żeby ocena cyklu estrogenowego rozpoczynała się zaraz po osiągnięciu przez zwierzęta pełnej dojrzałości płciowej. Pod tym względem mogą występować nieznaczne różnice u różnych szczepów szczurów wykorzystywanych w różnych laboratoriach, np. szczury szczepu Sprague Dawley osiągają dojrzałość płciową po 10 tygodniach życia, a szczepu Wistar – po około 12 tygodniach. Matki posiadające potomstwo należy uśmiercić 13. dnia po porodzie lub wkrótce po tym dniu. Dzień narodzin (tj. dzień zakończenia porodu) określa się jako dzień 0 po porodzie. Samice, u których nie zaobserwowano oznak kopulacji, uśmierca się po 24–26 dniach od ostatniego dnia okresu krycia. Dawkowanie należy kontynuować u obu płci przez okres krycia. Dawkowanie u samców należy nadal stosować po okresie krycia co najmniej do zakończenia minimalnego łącznego okresu dawkowania wynoszącego 28 dni. Następnie samce są uśmiercane lub ewentualnie zatrzymywane i kontynuuje się dawkowanie w celu ewentualnego drugiego krycia, jeśli uzna się to za stosowne. 30. Codziennie dawkowanie u rodzicielskich samic powinno dalej trwać przez cały okres ciąży, co najmniej do 13. dnia po porodzie włącznie, lub do dnia poprzedzającego uśmiercenie. W przypadku badań, w których badaną substancję chemiczną podaje się drogą wziewną lub skórną, dawkowanie powinno trwać co najmniej do 19. dnia ciąży włącznie i powinno być ono wznowione najszybciej jak to możliwe – nie później niż w czwartym dniu po urodzeniu. 31. Diagram przedstawiający harmonogram doświadczenia znajduje się w dodatku 2. Procedura krycia 32. Podczas tego badania należy zazwyczaj wykorzystywać krycia 1:1 (jeden samiec na jedną samicę). W przypadku wystąpienia sporadycznych zgonów samców mogą pojawić się wyjątki. Samicę należy umieścić razem z tym samym samcem na okres trwający do momentu odnotowania kopulacji lub dwa tygodnie. Każdego dnia rano samice należy poddać badaniu na obecność plemników lub czopa pochwowego. Dzień 0 ciąży określa się jako dzień, w którym potwierdzono wystąpienie krycia (wykrycie czopa pochwowego lub plemników). Jeśli kojarzenie w parze nie uda się, można rozważyć krycie samic samcami o dowiedzionej płodności. Liczebność miotu 33. Czwartego dnia po porodzie można skorygować liczebność każdego miotu, eliminując dodatkowe, losowo wybrane młode w miocie, by otrzymać, na ile to możliwe, cztery lub pięć samic i cztery lub pięć samców na miot, w zależności od typowej liczebności miotów w szczepie wykorzystanych szczurów. Próbki krwi należy pobrać od dwóch młodych nieprzydzielonych do żadnej kohorty, zebrać i wykorzystać do określenia poziomów surowicy T4. Wybiórcza eliminacja młodych, np. na podstawie masy ciała lub odległości anogenitalnej jest nieodpowiednia. Ilekroć liczba młodych samców lub samic uniemożliwia uzyskanie czterech lub pięciu osobników każdej płci na miot, dopuszczalne jest częściowe dostosowanie (na przykład sześć samców i cztery samice). Żadne młode nie zostanie wyeliminowane, gdy liczebność miotu spadnie poniżej celu eliminacji (8 lub 10 młodych/miot) Jeżeli dostępne jest tylko jedno młode powyżej celu eliminacji, tylko jedno młode zostanie wyeliminowane i wykorzystane do pobrania krwi do ewentualnej oceny surowicy T4. 34. Jeżeli liczebność miotu nie została skorygowana, dwa młode na miot uśmierca się 4. dnia po urodzeniu, a próbki krwi pobiera się do pomiaru stężeń hormonów tarczycy w surowicy. Jeżeli to możliwe, dwa młode na miot powinny stanowić młode samice, aby zachować młode samce na potrzeby oceny zatrzymywania płynu w brodawkach sutkowych, oprócz przypadku, w którym eliminacja tych młodych powoduje, że nie pozostaną żadne samice do oceny końcowej przy uśmiercaniu. Żadne młode nie zostanie wyeliminowane, gdy rozmiar miotu spadnie poniżej 8 lub 10 młodych/miot (w zależności od typowego rozmiaru miotu w szczepie wykorzystanych szczurów). Jeżeli dostępne jest tylko jedno młode powyżej typowej liczebności miotu, tylko jedno młode zostanie wyeliminowane i wykorzystane do pobrania krwi do ewentualnej oceny surowicy T4. Obserwacje w trakcie życia Obserwacje kliniczne 35. W trakcie okresu badania ogólne obserwacje kliniczne należy przeprowadzać co najmniej raz dziennie, a w przypadku zaobserwowania oznak toksyczności należy zwiększyć ich częstotliwość. Najlepiej prowadzić je każdego dnia o tej samej porze, biorąc pod uwagę szczytowy okres przewidywanych objawów po dawkowaniu. Należy odnotować zmiany w zachowaniu mające związek z badaniami, objawy trudnego lub długotrwałego porodu oraz wszelkie objawy toksyczności, włączając śmiertelność. Zapisy te powinny zawierać czas pojawienia się, stopień ciężkości i czas trwania objawów toksyczności. Masa ciała i spożycie pokarmu/wody 36. Samce i samice należy zważyć w pierwszym dniu dawkowania, a następnie co najmniej raz tygodniowo oraz w momencie zakończenia dawkowania. Samice w okresie ciąży należy ważyć w dniach 0, 7, 14 i 20 oraz w ciągu 24 godzin od porodu (w dniu 0 lub 1 po porodzie), a także co najmniej 4 i 13 dni po porodzie. Obserwacje te należy umieścić w sprawozdaniu oddzielnie w odniesieniu do każdego dorosłego zwierzęcia. 37. Przed kryciem, w okresie ciąży oraz laktacji spożycie pokarmu należy mierzyć co najmniej raz w tygodniu. W okresie krycia pomiar spożycia pokarmu nie jest obowiązkowy. Gdy badana substancja chemiczna podawana jest za pośrednictwem wody do picia, w trakcie tych okresów należy także mierzyć spożycie wody. Cykle estrogenowe 38. Monitorowanie cykli estrogenowych powinno odbywać się przed rozpoczęciem poddawania działaniu substancji, aby do badania wybrać samice o regularnej cykliczności (zob. pkt 22). Należy także codziennie, od rozpoczęcia poddawania działaniu substancji do potwierdzenia krycia, monitorować rozmazy śluzówki pochwy. Jeżeli istnieje obawa związana z wystąpieniem dotkliwych skutków stresu mogących zmienić cykle estrogenowe wraz z rozpoczęciem dawkowania, laboratoria mogą przez dwa tygodnie narażać zwierzęta doświadczalne, a następnie przez co najmniej dwa tygodnie codziennie pobierać rozmazy śluzówki pochwy by monitorować cykl estrogenowy w trakcie okresu poprzedzającego krycie, ciągle monitorując go w okresie krycia, aż do momentu jego zaistnienia. Przy pozyskiwaniu komórek pochwy / szyjki macicy należy zachować ostrożność, aby nie dopuścić do zaburzeń błony śluzowej, które mogłyby wywoływać ciążę rzekomą (7)(8). Parametry potomstwa 39. Począwszy od dnia 0 ciąży należy odnotowywać i liczyć czas jej trwania. Każdy miot należy zbadać tak szybko po urodzeniu jak to możliwe, w celu ustalenia liczby i płci młodych, płodów urodzonych martwo, płodów urodzonych żywo, słabowitych młodych w miocie (młodych o znacznie mniejszych rozmiarach niż odpowiadające młode kontrolne) oraz obecności poważnych nieprawidłowości. 40. Należy policzyć i ustalić płeć żywych młodych, a następnie zważyć mioty w ciągu 24 godzin od porodu (w dniu 0 lub 1. dniu po porodzie) oraz co najmniej 4. i 13. dnia po porodzie. W dodatku do obserwacji opisanych w pkt 35 należy odnotować wszelkie nieprawidłowe zachowania potomstwa. 41. Odległość anogenitalną każdego młodego należy mierzyć w tym samym dniu po urodzeniu – między 0. a 4. dniem po urodzeniu. W dniu pomiaru odległości anogenitalnej należy dokonać pomiaru masy ciała młodego, a odległość anogenitalną należy znormalizować w odniesieniu do pomiaru wielkości młodego, najlepiej jako pierwiastek kwadratowy masy ciała (9). Liczbę brodawek sutkowych / otoczek brodawek u młodych samców należy mierzyć, według zaleceń zawartych w wytycznej OECD nr 151, w 12. lub 13. dnia po urodzeniu (10). Biochemia kliniczna 42. Próbki krwi z określonego miejsca pobiera się według następującego planu: — od co najmniej dwóch młodych na miot 4. dnia po urodzeniu jeżeli liczba młodych na to pozwala (zob. pkt 33–34); — od wszystkich matek oraz co najmniej dwóch młodych z każdego miotu przy zakończeniu badania 13. dnia; oraz — od wszystkich dorosłych samców w dniu zakończenia badań. Wszystkie próbki krwi przechowuje się w odpowiednich warunkach. Próbki krwi pobrane od 13. dniowych młodych oraz dorosłych samców ocenia się pod kątem poziomów surowicy hormonów tarczycy (T4). Jeżeli uzna się za stosowne, przeprowadzana jest dalsza ocena T4 w próbkach krwi od matek oraz 4. dniowych młodych. Można opcjonalnie przeprowadzić pomiar innych hormonów. Krew młodych z każdego miotu można połączyć do celów analizy hormonów tarczycy. Hormony tarczycy (T4 i TSH) zaleca się mierzyć jako „całkowite”. 43. Na zmienność i wartości bezwzględne stężeń przy oznaczaniu hormonów mogą mieć wpływ następujące czynniki: — czas uśmiercenia zwierzęcia w związku z dobową zmiennością stężeń hormonów; — metoda uśmiercenia zastosowana w celu uniknięcia zbędnego stresu dla zwierząt, mogącego wpłynąć na stężenia hormonów; — zestawy do oznaczania hormonów, których krzywe standardowe mogą się różnić. 44. Próbki osocza przeznaczone konkretnie do oznaczenia poziomu hormonów należy pobierać w porównywalnej porze dnia. Wartości liczbowe uzyskane w toku analizy stężeń hormonów różnią się w zależności od zastosowanego dostępnego w handlu zestawu testowego. Patologia Pełne rozpoznanie histopatologiczne 45. W momencie uśmiercenia lub śmierci w okresie trwania badania dorosłe zwierzęta należy zbadać makroskopowo pod kątem nieprawidłowości lub zmian patologicznych. Szczególną uwagę należy zwrócić na organy układu rozrodczego. Należy odnotować liczbę miejsc zagnieżdżenia. Rozmazy śluzówki pochwy należy zbadać z rana w dniu autopsji, aby określić stadium cyklu estrogenowego oraz umożliwić korelację z histopatologią jajników. 46. Jądra i najądrza, a także gruczoł krokowy i kanaliki nasienne z całymi gruczołami koagulującymi wszystkich dorosłych samców należy, w stosownym przypadku, wyczyścić z wszelkich przylegających tkanek, a ich mokrą masę, a ich mokrą masę należy pobrać jak najszybciej po dysekcji, aby zapobiec jej wyschnięciu. Ponadto opcjonalne masy narządów mogą w przypadku samców obejmować zespół mięśni dźwigacza odbytu i mięśni opuszkowo-jamistych, gruczoły Cowpera i żołądź, a w przypadku samic parę jajników (mokra masa) i macicę (wraz z szyjką); jeżeli są uwzględnione, masy te należy określić jak najszybciej po dysekcji. 47. Martwe młode i młode zabite 13. dnia po porodzie lub wkrótce potem należy co najmniej przebadać zewnętrznie z zachowaniem ostrożności pod kątem poważnych nieprawidłowości. Szczególną uwagę należy zwrócić na zewnętrzne narządy rozrodcze, które należy zbadać pod kątem zmian rozwojowych. W 13. dniu należy zachować tarczycę jednego samca i jednej młodej samicy na miot. 48. Należy zachować jajniki, jądra, płciowe narządy dodatkowe (macicę wraz z szyjką, najądrza, gruczoł krokowy, kanaliki nasienne i gruczoły koagulujące), tarczycę i wszystkie narządy wykazujące makroskopowe zmiany patologiczne wszystkich dorosłych zwierząt. Do rutynowych badań jąder i najądrzy nie zaleca się utrwalania w formalinie. Akceptowalną metodą w przypadku tych tkanek jest wykorzystanie utrwalacza Bouina lub zmodyfikowanego utrwalacza Davidsona (11). Błonę białawą trzeba delikatnie i płytko przekłuć igłą na obu biegunach narządu w celu umożliwienia szybkiego wniknięcia płynu utrwalającego. Histopatologia 49. Należy wykonać szczegółowe badanie histologiczne jajników, jąder i najądrzy (ze szczególnym naciskiem na stadia spermatogenezy i histopatologię śródmiąższowej struktury komórek jąder) zwierząt znajdujących się w grupie otrzymującej najwyższą dawkę oraz zwierząt znajdujących się w grupie kontrolnej. Można w razie potrzeby zbadać pozostałe zachowane organy, w tym tarczyce pochodzące od młodych i dorosłych zwierząt. Masę tarczycy można określić po utrwaleniu. Należy zachować dużą ostrożność przy okrawaniu i wykonywać je dopiero po utrwaleniu, w celu uniknięcia uszkodzenia tkanek. Mogłoby ono zakłócić analizę histopatologiczną. Badania powinny być rozciągnięte na inne grupy badane, gdy w grupie otrzymującej najwyższe dawki obserwuje się zmiany. W wytycznych dotyczących histopatologii (11) podano dodatkowe informacje dotyczące wycinania, utrwalania, dzielenia i histopatologii tkanek układu hormonalnego. DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ Dane 50. Należy podać dane każdego zwierzęcia. Ponadto wszystkie dane należy podsumować w formie tabeli wykazującej, w odniesieniu do każdej grupy badanej i każdego pokolenia, liczbę zwierząt na początku badania, liczbę zwierząt, które znaleziono martwe podczas badania lub zwierząt uśmierconych ze względów humanitarnych, czas śmierci lub humanitarnego uśmiercenia, liczbę zwierząt płodnych, liczbę ciężarnych samic, liczbę zwierząt wykazujących zaobserwowane oznaki toksyczności, z podaniem czasu ich pojawienia się, w tym czasu trwania, ciężkości wszelkich skutków toksyczności, rodzajów zmian histopatologicznych oraz wszelkich odnośnych danych miotów. W dodatku 3 przedstawiono podsumowanie w formie tabeli, które okazało się być bardzo przydatne przy ocenianiu efektu reprodukcyjnego/rozwojowego. 51. Ze względu na ograniczone wymiary badania, analizy statystyczne w postaci testów na „istotność” mają ograniczoną wartość dla wielu punktów końcowych, zwłaszcza reprodukcyjnych punktów końcowych. Jeżeli wykorzystywane są analizy statystyczne, wybrana metoda powinna być odpowiednia dla rozkładu badanej zmiennej i powinna być wybrana przed rozpoczęciem badania. Analiza statystyczna odległości anogenitalnej i zatrzymywania płynu w brodawkach powinna być oparta na danych dotyczących poszczególnych młodych z uwzględnieniem wpływu na miot. W stosownych przypadkach za jednostkę analityczną uznaje się miot. Analiza statystyczna masy ciała młodych powinna być oparta na danych dotyczących poszczególnych młodych z uwzględnieniem liczebności miotu. Ze względu na małą wielkość grupy, wykorzystanie historycznych danych dotyczących kontroli (np. dotyczących wielkości miotu), w przypadku gdy są one dostępne, może być również przydatne jako pomoc w interpretacji badania. Ocena wyników 52. Wyniki tego badania toksyczności powinny być oceniane w kategoriach zaobserwowanych skutków, wyników autopsji i badań mikroskopowych. Ocena obejmuje zależność pomiędzy dawką badanej substancji chemicznej a obecnością lub brakiem, częstością i ciężkością nieprawidłowości, w tym poważnych zmian patologicznych, wskazanymi organami docelowymi, bezpłodnością, nieprawidłowościami klinicznymi, zmienionymi funkcjami rozrodczymi i funkcjonowaniem miotów, zmianami masy ciała, wpływem na śmiertelność i wszelkimi innymi skutkami toksycznymi. 53. Ze względu na krótki okres poddania działaniu substancji w odniesieniu do samców, przy ocenie wpływu na rozrodczość u samców należy uwzględnić histopatologię jąder i najądrzy oraz dane dotyczące płodności. Wykorzystanie historycznych danych dotyczących kontroli odnoszących się do reprodukcji/rozwoju (np. dotyczących wielkości miotu, odległości anogenitalnej, zatrzymywania płynu w brodawkach, poziomu T4 w surowicy), w przypadku gdy są one dostępne, może być również przydatne jako pomoc w interpretacji badania. 54. Proponuje się, aby do celów kontroli jakości zbierać historyczne dane kontrolne i obliczać współczynniki zmienności dla danych liczbowych, szczególnie w odniesieniu do parametrów związanych z wykrywaniem substancji zakłócających funkcjonowanie układu hormonalnego. Dane te można wykorzystać do celów porównawczych przy ocenie bieżących badań. Sprawozdanie z badania 55. Sprawozdanie z badania powinno zawierać następujące informacje: Badana substancja chemiczna: — źródło, numer partii, termin przydatności, jeżeli są znane; — stabilność badanej substancji chemicznej, jeżeli jest znana. substancja jednoskładnikowa: — wygląd fizyczny, rozpuszczalność w wodzie i dodatkowe istotne właściwości fizykochemiczne; — dane identyfikacyjne substancji chemicznej, takie jak: nazwa IUPAC lub CAS, numer CAS, kod SMILES lub InChI, wzór strukturalny, czystość, nazwa chemiczna zanieczyszczeń, stosownie do przypadku i jeśli jest to praktycznie wykonalne, itp. Substancja wieloskładnikowa, UVCB i mieszaniny: — opisane w miarę możliwości przez podanie nazwy chemicznej (zob. powyżej), określenie ilości oraz istotnych właściwości fizykochemicznych składników. Nośnik (w stosownych przypadkach): — uzasadnienie wyboru nośnika, jeśli jest inny niż woda. Zwierzęta doświadczalne: — wykorzystany gatunek/szczep; — liczba, wiek i płeć zwierząt; — źródło pochodzenia, warunki utrzymywania, pasza itp.; — masa ciała poszczególnych zwierząt na początku badania; — uzasadnienie wyboru gatunku, jeśli jest inny niż szczur. Warunki badania: — uzasadnienie wyboru poziomu dawkowania; — szczegóły dotyczące postaci użytkowej badanej substancji chemicznej/przygotowania pokarmu, osiągnięte stężenie, stabilność i jednorodność preparatu; — szczegółowe informacje dotyczące podawania badanej substancji chemicznej; — wskaźnik konwersji stężenia badanej substancji chemicznej w pokarmie / wodzie pitnej (ppm) do dawki rzeczywistej (mg/kg masy ciała/dzień), jeśli ma to zastosowanie; — szczegółowe informacje dotyczące jakości pokarmu i wody; — szczegółowy opis procedury randomizacji stosowanej do doboru młodych do eliminacji w przypadku, gdy się jej dokonuje. Wyniki: — masa ciała / zmiany masy ciała, — spożycie pokarmu, spożycie wody (jeżeli dane są dostępne); — dane dotyczące efektu toksycznego ze względu na płeć i dawkę, włączając płodność, ciążę i wszelkie inne objawy toksyczności; — długość trwania ciąży; — skutki toksyczne lub inne wywierane na reprodukcję, potomstwo, wzrost pourodzeniowy itp.; — rodzaj, nasilenie i czas trwania obserwowanych objawów klinicznych (tak odwracalnych, jak i nieodwracalnych); — liczba dorosłych samic, u których występuje normalny lub nienormalny cykl estrogenowy i czas trwania cyklu; — liczba młodych urodzonych żywo i strat poimplantacyjnych, — dane dotyczące masy ciała młodego; — odległość anogenitalna u wszystkich młodych (oraz masa ciała na dzień pomiaru odległości anogenitalnej); — zatrzymywanie płynu w brodawkach u młodych płci męskiej; — poziom hormonów tarczycy, młode w 13. dniu żucia i dorosłe samce (oraz matki i młode w 4. dniu życia, jeśli dokonano pomiaru) — liczba młodych z wyraźnie widocznymi nieprawidłowościami, ocena wzrokowa zewnętrznych narządów płciowych, liczba słabowitych młodych w miocie; — czas zgonu podczas badania lub informacja o tym, czy zwierzęta przetrwały do czasu zakończenia badania; — liczba zagnieżdżeń, liczebność miotu i masa poszczególnych młodych w miocie w momencie rejestracji; — masa ciała w chwili uśmiercenia oraz masa narządów u zwierząt rodzicielskich; — wyniki autopsji; — szczegółowy opis wyników badania histopatologicznego; — dane dotyczące absorpcji (jeżeli są dostępne); — w stosownych przypadkach statystyczne opracowanie wyników. Omówienie wyników. Wnioski Interpretacja wyników 56. Badanie dostarczy ocen toksyczności reprodukcyjnej/rozwojowej związanej z zastosowaniem powtarzanego dawkowania (zob. pkt 5 i 6). Może ono stanowić wskazówkę co do potrzeby prowadzenia dalszych badań i stanowić wskazówkę przy projektowaniu kolejnych badań. Przy interpretowaniu wyników dotyczących rozrodczości i rozwoju pomocny może być dokument zawierający wytyczne OECD nr 43 (12). Wytyczne OECD nr 106 w sprawie oceny histologicznej badań endokrynologicznych i reprodukcyjnych u gryzoni („OECD Guidance Document No 106 on Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents”) (11) zawierają informacje na temat przygotowania i oceny narządów (endokrynologicznych) i rozmazów śluzówki pochwy, które mogą być pomocne w odniesieniu do tej wytycznej dotyczącej badań. BIBLIOGRAFIA (1) OECD (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. Dokument dostępny na wniosek w Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwoju w Paryżu. (2) OECD (1992). Chairman’s Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods, Tokio, 27–29 października 1992 Dokument dostępny na wniosek w Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwoju w Paryżu. (3) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force, 10–11 marca 1998 r. Dokument dostępny na wniosek w Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwoju w Paryżu. (4) OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints. [W:] Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (nr 217). Paryż: Organizacja Współpracy Gospodarczej i Rozwoju. (5) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations. [w:] seria dotycząca badań i oceny nr 19. Paryż: Organizacja Współpracy Gospodarczej i Rozwoju. (6) OECD (2011). Guidance Document on Standardised Test Guidelines for Evaluating Chemicals for Endocrine Disruption. [w:] Publikacje na temat środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa, seria dotycząca badań i oceny nr 150. Paryż: Organizacja Współpracy Gospodarczej i Rozwoju. (7) Goldman, J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M. i Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies. „Birth Defects Research” część B nr 80 (2), s. 84–97. (8) Sadleir R.M.F.S (1979). Cycles and Seasons, w: C.R. Auston i R.V. Short, (red.), Reproduction in Mammals, t. 1 Germ Cells and Fertilization. Cambridge, Nowy Jork. (9) Gallavan R.H. Jr, Holson J.F., Stump D.G., Knapp J.F. i Reynolds V.L.(1999). Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights. „Reproductive Toxicology” nr 13, s. 383–390. (10) OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study, [W:] Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (nr 151). Paryż: Organizacja Współpracy Gospodarczej i Rozwoju. (11) OECD (2009). Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents. [w:] Publikacje na temat środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa, seria dotycząca badań i oceny nr 106. Paryż: Organizacja Współpracy Gospodarczej i Rozwoju. (12) OECD (2008). Guidance Document on Mammalian Reproductive Toxicity Testing and Assessment. [W:] Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (nr 43). Paryż: Organizacja Współpracy Gospodarczej i Rozwoju. Dodatek 1 DEFINICJE (ZOB. RÓWNIEŻ WYTYCZNA OECD NR 150 (6)) Działanie androgenowe jest to zdolność substancji chemicznej do działania przypominającego działanie naturalnego hormonu androgenowego (np. testosteronu) w organizmach ssaków. Działanie antyandrogenowe jest to zdolność substancji chemicznej do hamowania działania naturalnego hormonu androgenowego (np. testosteronu) w organizmach ssaków. Działanie antyestrogenowe jest to zdolność substancji chemicznej do hamowania działania naturalnego hormonu estrogenowego (np. 17ß-estradiolu) w organizmach ssaków. Działanie antytyroidowe jest to zdolność substancji chemicznej do hamowania działania naturalnego hormonu tarczycy (np. T3) w organizmach ssaków. Substancja chemiczna oznacza substancję lub mieszaninę. Toksyczność rozwojowa: objawy toksyczności reprodukcyjnej, reprezentującej zaburzenia przedporodowe, okołoporodowe, poporodowe, strukturalne lub czynnościowe u potomstwa. Dawkowanie jest terminem ogólnym obejmującym dawkę, częstotliwość i czas trwania dawkowania. Dawka jest to ilość podawanej badanej substancji chemicznej. Dawkę wyraża się jako masę badanej substancji chemicznej na jednostkę masy ciała zwierzęcia doświadczalnego na dzień (np. mg/kg masy ciała/dzień) lub jako stałe stężenie w diecie. Wyraźna toksyczność jest to określenie ogólne opisujące wyraźne oznaki toksyczności występujące po podaniu badanej substancji chemicznej. Powinny one być wystarczające do oceny ryzyka i mieć taki charakter, że można oczekiwać, iż zwiększenie podawanej dawki spowoduje pojawienie się silnych oznak toksyczności i prawdopodobną śmiertelność. Upośledzenie płodności oznacza zaburzenie funkcji reprodukcyjnych lub zdolności reprodukcyjnych samców lub samic. Toksyczność matczyna: niekorzystny skutek dla ciężarnych samic, występujący swoiście (skutek bezpośredni) lub nieswoiście (skutek pośredni). NOAEL jest to skrót oznaczający poziom dawkowania, przy którym nie obserwuje się szkodliwych zmian. Jest to najwyższy poziom dawkowania, przy którym nie obserwuje się szkodliwych efektów związanych z podawaniem substancji na skutek jej podawania. Działanie estrogenowe jest to zdolność substancji chemicznej do działania przypominającego działanie naturalnego hormonu estrogenowego (np. 17ß-estradiolu) w organizmach ssaków. Toksyczność reprodukcyjna oznacza szkodliwy wpływ na potomstwo lub upośledzenie funkcji lub zdolności reprodukcyjnych u samców i samic. Badana substancja chemiczna oznacza każdą substancję lub mieszaninę badaną za pomocą niniejszej metody badawczej. Działanie tyroidowe jest to zdolność substancji chemicznej do działania przypominającego działanie naturalnego hormonu tarczycy (np. T3) w organizmach ssaków. Walidacja jest to proces naukowy mający na celu scharakteryzowanie wymogów operacyjnych i ograniczeń metody badawczej i wykazanie jej wiarygodności oraz odpowiedniości do danego celu. Dodatek 2 SCHEMAT EKSPERYMENTALNEGO PLANU WSKAZUJĄCY MAKSYMALNY CZAS TRWANIA BADANIA, OPARTY NA PEŁNYM 14-DNIOWYM OKRESIE KRYCIA Dodatek 3 TABELARYCZNE SPRAWOZDANIE PODSUMOWUJĄCE WPŁYW NA REPRODUKCJĘ/ROZWÓJ OBSERWACJE WARTOŚCI Dawkowanie (jednostki) 0 (kontrola) … … … … Zapoczątkowane pary (N) Cykl estrogenowy (co najmniej średnia długość i częstość występowania nieregularnych cykli) Samice wykazujące oznaki kopulacji (N) Samice zachodzące w ciążę (N) Dni poczęcia 1–5 (N) Dni poczęcia 6–… (21) (N) Ciąża ≤ 21 dni (N) Ciąża = 22 dni (N) Ciąża ≥ 23 dni (N) Matki z urodzonymi żywymi młodymi (N) Matki z żywymi młodymi w 4. dniu po porodzie (N) Implanty/matka (średnia) Żywe młode/matkę przy porodzie (średnia) Żywe młode/matka w 4 dniu (średnia) Proporcja płci (samiec/samica) przy porodzie (średnia) Proporcja płci (samiec/samica) w 4 dniu (średnia) Masa miotu przy porodzie (średnia) Masa miotu w 4 dniu (średnia) Masa ciała młodego przy porodzie (średnia) Masa ciała młodego przy pomiarze odległości anogenitalnej (średnia dla samców, średnia dla samic) Odległość anogenitalna młodego w tym samym dniu po urodzeniu, urodzenie – 4. dzień (średnia dla samców, średnia dla samic, zaznaczyć dzień po urodzeniu) Masa ciała młodego w 4 dniu (średnia) Zatrzymywanie płynu w brodawkach u młodych płci męskiej w 13 dniu (średnia) Masa ciała młodego w 13 dniu (średnia) MŁODE Z ZABURZENIAMI Matki z 0 Matki z 1 Matki z ≥ 2 UTRATA POTOMSTWA Przedurodzeniowe/postimplantacyjne (implantacje minus żywe urodzenia) Samice z 0 Samice z 1 Samice z 2 Samice z ≥ 3 Pourodzeniowe (żywe urodzenia minus żywe 13. dnia po urodzeniu) Samice z 0 Samice z 1 Samice z 2 Samice z ≥ 3 B.64 POŁĄCZONE BADANIE Z UŻYCIEM DAWKI POWTARZANEJ I BADANIE KLASYFIKACYJNE TOKSYCZNOŚCI REPRODUKCYJNEJ/ROZWOJOWEJ WPROWADZENIE 1. Niniejsza metoda badawcza jest równoważna metodzie opisanej w dotyczącej badań wytycznej dotyczącej badań OECD nr 422 (2016). Okresowo dokonuje się przeglądu wytycznych OECD dotyczących badania substancji chemicznych pod kątem postępu naukowego. Pierwotna wytyczna dotycząca badań klasyfikacyjnych nr 422 została przyjęta w 1996 r. na podstawie protokołu „Połączone badanie z użyciem dawki powtarzanej i badanie klasyfikacyjne reprodukcyjne/rozwojowe (Combined Repeat Dose and Reproductive/Developmental Screening Test)” omówionego na dwóch posiedzeniach ekspertów: w Londynie w 1990 r. (1) i w Tokio w 1992 r. (2). 2. Niniejsza metoda badawcza łączy część dotyczącą badań klasyfikacyjnych toksyczności reprodukcyjnej/rozwojowej, która opiera się na doświadczeniu zdobytym w państwach członkowskich w związku ze stosowaniem pierwotnej metody w odniesieniu do istniejących substancji chemicznych produkowanych w dużych objętościach oraz w badaniach eksploracyjnych z substancjami służącymi do kontroli dodatniej (3) (4), oraz część dotyczącą badania toksyczności z użyciem dawki powtarzanej, zgodnie z wytyczną dotyczącą badań OECD nr 407 (28-dniowe badanie toksyczności doustnej wywołanej powtarzanym dawkowaniem u gryzoni, odpowiadająca rozdziałowi B.7 niniejszego załącznika). 3. Niniejsza metoda badawcza została zaktualizowana o właściwe punkty końcowe dotyczące substancji zaburzającej funkcjonowanie układu hormonalnego w ramach działań następczych do działania o wysokim priorytecie podjętego przez OECD w 1998 r., mającego na celu zmianę istniejących wytycznych i opracowanie nowych wytycznych dotyczących badań klasyfikacyjnych i badania potencjalnych substancji zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego (5). W tym kontekście wytyczną dotyczącą badań nr 407 (opowiadającą rozdziałowi B.7 niniejszego załącznika) wzbogacono w 2008 r. o parametry odpowiednie do wykrywania aktywności endokrynologicznej badanych substancji chemicznych. Celem aktualizacji wytycznej dotyczącej badań nr 422 było uwzględnienie niektórych właściwych punktów końcowych substancji zaburzającej funkcjonowanie układu hormonalnego w badaniach klasyfikacyjnych TG, gdzie okresy narażenia obejmują niektóre wrażliwe okresy w rozwoju (okresy przed lub wcześnie po urodzeniu). 4. Wybrane dodatkowe właściwe punkty końcowe dotyczące substancji zaburzającej funkcjonowanie układu hormonalnego, stanowiące również część wytycznej dotyczącej badań nr 443 (Rozszerzone badanie toksyczności reprodukcyjnej w jednym pokoleniu, odpowiadająca rozdziałowi B.56 niniejszego załącznika), zostały włączone do wytycznej dotyczącej badań nr 422 na podstawie studium wykonalności dotyczącego kwestii naukowych i technicznych związanych z ich włączeniem, jak również możliwych dostosowań projektu badań potrzebnych do ich włączenia (6). 5. Niniejsza metoda badawcza ma na celu wygenerowanie ograniczonej ilości informacji dotyczących wpływu badanej substancji chemicznej na efektywność reprodukcyjną samców i samic, taką jak funkcja gonad, zachowanie kopulacyjne, zapłodnienie, rozwój jaja płodowego i poród. Nie jest ona metodą alternatywną dla istniejących metod badań B.31, B.34, B.35 lub B.56, ani ich nie zastępuje. ZAŁOŻENIA WSTĘPNE 6. Przy szacowaniu i ocenie właściwości toksycznych badanej substancji chemicznej oznaczenie toksyczności doustnej przy zastosowaniu powtarzanego dawkowania można prowadzić po uzyskaniu początkowej informacji o toksyczności na podstawie badań toksyczności ostrej. Badanie to dostarcza informacji na temat możliwych zagrożeń dla zdrowia, które mogą wynikać z powtarzającego się narażenia przez stosunkowo ograniczony czas. Metoda obejmuje podstawowe badanie toksyczności wywołanej powtarzanym dawkowaniem, które można przeprowadzić w przypadku substancji chemicznych, dla których nie ma obowiązku wykonania badania 90-dniowego (np. wtedy, gdy wielkość produkcji nie przekracza pewnych limitów) lub jako badanie wstępne do badania długoterminowego. Przy prowadzeniu badania należy przestrzegać zasad i ustaleń określonych w dokumencie zawierającym wytyczne OECD nr 19 „Guidance Document on the recognition, assessment, and use of clinical signs as humane endpoints for experimental animals used in safety evaluations” (7) (Wytyczne dotyczące uznawania, oceny i wykorzystywania objawów klinicznych jako punktów humanitarnego zakończenia w odniesieniu do zwierząt doświadczalnych wykorzystywanych w ocenach bezpieczeństwa). 7. Ponadto obejmuje ono badanie klasyfikacyjne toksyczności reprodukcyjnej/rozwojowej, a zatem może być również wykorzystywane w celu dostarczenia wstępnych informacji na temat możliwych skutków dla sprawności reprodukcyjnej samców i samic, takich jak funkcja gonad, zachowanie kopulacyjne, zapłodnienie, rozwój jaja płodowego i poród, albo na wczesnym etapie oceny właściwości toksykologicznych badanych substancji chemicznych lub na przedmiotowe badane substancje chemiczne. Niniejsza metoda badawcza nie zapewnia pełnych informacji na temat wszystkich aspektów reprodukcji i rozwoju. W szczególności oferuje jedynie ograniczone środki wykrywania poporodowych przejawów narażenia prenatalnego lub skutków, które mogą być wywołane podczas narażenia postnatalnego. Ze względu (między innymi) na selektywność punktów końcowych oraz krótki czas trwania badania, metoda ta nie dostarczy dowodów na definitywne stwierdzenie braku skutków reprodukcyjnych/rozwojowych. Ponadto wobec braku danych z innych badań toksyczności reprodukcyjnej/rozwojowej, wyniki dodatnie są przydatne do wstępnej oceny zagrożeń i przyczyniają się do podejmowania decyzji dotyczących konieczności i terminów dodatkowych badań. 8. Wyniki uzyskane za pomocą parametrów związanych z układem hormonalnym należy rozpatrywać w kontekście dokumentu „OECD Conceptual Framework for Testing and Assessment of Endocrine Disrupting Chemicals” („Ramy koncepcyjne OECD dotyczące testowania i oceny substancji chemicznych zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego”) (8). W niniejszych ramach koncepcyjnych rozszerzona wytyczna dotyczącej badań OECD nr 422 zawarta jest na poziomie 4 jako test in vivo dostarczający danych na temat niekorzystnego wpływu na właściwe punkty końcowe dotyczące układu hormonalnego. Sygnał endokrynny może jednak nie być uważany za wystarczający dowód na to, że badana substancja chemiczna jest substancją zaburzającą funkcjonowanie układu hormonalnego. 9. Metoda badawcza kładzie również nacisk na objawy neurologiczne jako określony punkt końcowy, i podkreślana jest konieczność uważnych obserwacji klinicznych zwierząt, w celu otrzymania możliwie największej ilości informacji. Metoda ta powinna identyfikować chemikalia o potencjale neurotoksycznym, które mogą również dawać podstawy do dalszego dogłębnego badania tego aspektu. Ponadto metoda ta może również w podstawowym zakresie może wskazywać na skutki dla układu immunologicznego. 10. Wobec braku danych z innych badań toksyczności ogólnoustrojowej, toksyczności reprodukcyjnej/rozwojowej, neurotoksyczności lub immunotoksyczności, wyniki dodatnie są przydatne do wstępnej oceny zagrożeń i przyczyniają się do podejmowania decyzji dotyczących konieczności i terminów dodatkowych badań. Badanie może być szczególnie użyteczne jako część Screening Information Data Set (SIDS) OECD do oceny istniejących substancji chemicznych, w odniesieniu do których istnieje niewiele lub nie ma dostępnych informacji toksykologicznych i może służyć jako metoda alternatywna dla przeprowadzenia dwóch oddzielnych badań, odpowiednio toksyczności z użyciem dawki powtarzanej (wytyczna dotycząca badań OCD nr 407, odpowiadająca rozdziałowi B.7 niniejszego załącznika) i toksyczności reprodukcyjnej/rozwojowej (wytyczna dotycząca badań OECD nr 421, odpowiadająca rozdziałowi B.63 niniejszego załącznika). Może być również stosowana jako badanie ustalające zakres dawek dla bardziej ekstensywnych badań nad rozrodczością/rozwojem, lub w przypadku gdy jest to uznane za istotne w inny sposób. 11. Zakłada się zasadniczo, że istnieją różnice w czułości między zwierzętami ciężarnymi a tymi niebędącymi w ciąży. W związku z tym określenie w ramach tego badania łączonego poziomów dawek, które wystarczają do oceny zarówno ogólnej toksyczności ogólnoustrojowej i specyficznej toksyczności reprodukcyjnej i rozwojowej, może być bardziej skomplikowane niż w przypadku przeprowadzenia indywidualnych badań odrębnie. Interpretacja wyników badania w odniesieniu do ogólnej toksyczności ogólnoustrojowej może być ponadto trudniejsze niż przeprowadzanie odrębnego badania dawki powtórzonej, w szczególności kiedy parametry dotyczące surowicy i histopatologii nie są poddane ocenie w tym samym punkcie czasu badania. Ze względu na te złożoności techniczne przeprowadzenie tego łączonego badania klasyfikacyjnego wymaga znacznego doświadczenia w badaniu toksyczności. Z drugiej strony badanie łączne może, poza wykorzystaniem mniejszej liczby osób, stanowić lepszy sposób odróżnienia bezpośrednich skutków dotyczących reprodukcji i rozwoju od tych, które są drugorzędne względem innych skutków (ogólnoustrojowych). 12. Okres dawkowania jest dłuższy w tym badaniu niż w standardowym 28-dniowym badaniu dawki powtórzonej. Wykorzystuje się w nim jednak mniej zwierząt obojga płci w poszczególnych grupach w porównaniu z sytuacją, w której przeprowadza się standardowe 28-dniowe badanie dawki powtórzonej poza badaniem klasyfikacyjnym toksyczności reprodukcyjnej i rozwojowej. 13. Niniejsza metoda badawcza zakłada doustną drogę podawania badanej substancji chemicznej. W przypadku stosowania innych dróg narażenia, może być konieczne dokonanie modyfikacji. 14. Przed zastosowaniem przedmiotowej metody badawczej z użyciem mieszaniny w celu zgromadzenia danych na potrzeby założonego celu regulacyjnego należy zastanowić się, czy zastosowanie tej metody może doprowadzić do uzyskania wyników odpowiednich z punktu widzenia tego celu, a jeżeli tak, to dlaczego. Przeprowadzenie takiej analizy nie jest konieczne, jeżeli ustanowiono wymóg regulacyjny dotyczący badania danej mieszaniny. 15. Stosowane definicje znajdują się w dodatku 1. ZASADA BADANIA 16. Badana substancja chemiczna podawana jest w stopniowanych dawkach kilku grupom samców i samic. Samce powinny otrzymywać dawki przez co najmniej cztery tygodnie do dnia przed planowanym uśmierceniem włącznie (obejmuje to co najmniej dwa tygodnie przed kryciem, w okresie krycia i około dwóch tygodni po kryciu). Ze względu na ograniczone dawkowanie przed kryciem u samców, płodność nie może być szczególnie czułym wskaźnikiem toksyczności w odniesieniu do jąder. W związku z tym niezbędne jest szczegółowe badanie histologiczne jąder. Uważa się, że połączenie dwutygodniowego okresu dawkowania w okresie przed kojarzeniem i późniejszych obserwacji krycia/płodności z ogólnym okresem dawkowania wynoszącym co najmniej cztery tygodnie, po którym następuje szczegółowa histopatologia gonad samców, jest wystarczające do wykrycia większości wpływu na płodność i spermatogenezę samców. 17. Samice powinny otrzymywać dawki przez cały czas trwania badania. Obejmuje to dwa tygodnie przed kryciem (w celu objęcia co najmniej dwóch pełnych cykli estrogenowych), zmienny czas do zapłodnienia, czas trwania ciąży i co najmniej trzynaście dni po porodzie, do dnia planowanego uśmiercenia włącznie. 18. Czas trwania badania, po aklimatyzacji i ocenie cyklu estrogenowego przed dawkowaniem, zależy od efektywności samic i wynosi około 63 dni, [co najmniej 14 dni okresu przed kojarzeniem, (do) 14 dni krycia, 22 dni ciąży, 13 dni laktacji]. 19. Podczas okresu dawkowania każdego dnia zwierzęta są dokładnie obserwowane w celu wykrycia oznak toksyczności. Zwierzęta, które zginą lub zostaną uśmiercone w okresie badania, są poddawane autopsji, a zwierzęta, które przeżyją, są po zakończeniu badania uśmiercane i poddawane autopsji. OPIS METODY Wybór gatunku zwierząt 20. Niniejsza metoda badawcza jest przeznaczona do stosowania z wykorzystaniem szczurów. W przypadku gdy parametry określone w TG 422 badane są z wykorzystaniem innego gatunku gryzoni, należy podać uzasadnienie. Szczur był jedynym gatunkiem wykorzystywanym w międzynarodowym programie walidacyjnym dotyczącym substancji zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego w oparciu o TG 407. Nie należy stosować szczepów o niskiej płodności lub powszechnie znanej wysokiej częstości występowania wad rozwojowych. Należy wykorzystać zdrowe zwierzęta dziewicze, które nie były wcześniej poddawane procedurom badawczym. Badane zwierzęta należy scharakteryzować z uwzględnieniem ich gatunku, szczepu, płci, masy i wieku. W momencie rozpoczęcia badania różnice w masie ciała wykorzystywanych zwierząt powinny być minimalne i nie powinny przekraczać ± 20 % średniej masy ciała u każdej z płci. W przypadku gdy badanie przeprowadza się jako badanie wstępne w stosunku do badania długoterminowego lub pełnopokoleniowego, zaleca się, aby w obu badaniach wykorzystywać zwierzęta tego samego szczepu i źródła. Warunki utrzymywania i karmienia 21. Wszystkie procedury powinny być zgodne z lokalnymi normami utrzymywania zwierząt laboratoryjnych. Temperatura w pomieszczeniu, w którym przetrzymuje się zwierzęta doświadczalne, powinna wynosić 22 °C (± 3 °). Wilgotność względna, poza okresem sprzątania pomieszczenia, powinna wynosić co najmniej 30 % i najlepiej byłoby, gdyby utrzymywała się na poziomie 70 %. Oświetlenie powinno być sztuczne w cyklu 12 godzin z dostępem światła i 12 godzin bez dostępu światła. Do żywienia można stosować konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dostępem do wody pitnej. Na wybór paszy może mieć wpływ potrzeba zapewnienia odpowiedniej domieszki badanej substancji chemicznej w przypadku podawania jej w ramach opisywanej metody. 22. Zwierzęta należy przetrzymywać razem, w małych grupach składających się z osobników tej samej płci; można je przetrzymywać pojedynczo, jeżeli ma to naukowe uzasadnienie. W przypadku przetrzymywania w grupach, w jednej klatce należy umieszczać nie więcej niż pięć zwierząt. Procedury krycia powinny być przeprowadzane w klatkach nadających się do tego celu. Ciężarne samice powinny być przetrzymywane w osobnych klatkach i mieć zapewnione materiały do budowy gniazda. Samice w okresie ciąży będą przebywać w indywidualnych klatkach ze swoim potomstwem. 23. Paszę należy regularnie analizować pod kątem obecności zanieczyszczeń. Próbkę paszy należy zachować do momentu ukończenia sprawozdania. Przygotowanie zwierząt 24. Zdrowe młode dorosłe osobniki zwierząt wybiera się losowo i przypisuje do grup poddawanych działaniu substancji i do klatek. Klatki należy rozmieścić w taki sposób, aby zminimalizować potencjalny wpływ ich układu. Zwierzęta są identyfikowane jednoznacznie i przetrzymywane w klatkach przez co najmniej pięć dni przed rozpoczęciem badania, żeby umożliwić aklimatyzację do warunków laboratoryjnych. Przygotowanie dawek 25. Zaleca się, aby badana substancja chemiczna była podawana doustnie, chyba że za bardziej odpowiednią uzna się inną drogę podawania. W przypadku wybrania doustnej drogi podawania, badaną substancję chemiczną zazwyczaj podaje się za pomocą sondy; można jednak również zastosować metodę alternatywną polegającą na podaniu badanych substancji chemicznych w paszy lub w wodzie do picia. 26. W razie potrzeby badaną substancję chemiczną rozpuszcza się lub przygotowuje jako zawiesinę w odpowiednim nośniku. Zaleca się, w miarę możliwości, najpierw rozważyć zastosowanie roztworu wodnego/zawiesiny, następnie roztworu/zawiesiny w oleju (np. z zastosowaniem oleju kukurydzianego), a potem możliwego roztworu w innych nośnikach. W przypadku zastosowania nośników niewodnych właściwości toksyczne danego nośnika powinny być znane. Należy określić stabilność i jednorodność badanej substancji chemicznej w nośniku. PROCEDURA Liczba i płeć zwierząt 27. Zaleca się, aby w każdej grupie na początku znajdowało się co najmniej 10 samców i 12–13 samic. Ocena samic będzie prowadzona przed narażeniem pod kątem cykliczności estrogenowej, a do badania nie zostaną włączone zwierzęta, które nie wykażą typowych 4–5 dniowych cykli; w związku z tym zaleca się zastosowanie dodatkowych samic w celu uzyskania 10 samic w każdej grupie. Poza przypadkiem, w którym występują wyraźne efekty toksyczne, oczekuje się, że zapewni to co najmniej 8 ciężarnych samic na grupę, co zazwyczaj stanowi najniższą dopuszczalną liczbę ciężarnych samic na grupę. Celem jest wyprodukowanie odpowiedniej liczby ciąż i potomstwa w celu zapewnienia znaczącej oceny wpływu badanej substancji chemicznej na płodność, ciążę, zachowanie macierzyńskie i zwierząt ssących oraz wzrost i rozwój potomstwa F 1 w okresie od chwili poczęcia do 13 dnia po porodzie. Jeśli planuje się uśmiercanie w trakcie badania, liczbę należy zwiększyć o liczbę zwierząt przeznaczonych do uśmiercenia przed zakończeniem badań. Należy rozważyć włączenie dodatkowej satelitarnej grupy pięciu zwierząt obojga płci do grupy kontrolnej i grupy otrzymującej najwyższe dawki w celu obserwacji odwracalności, trwałości lub opóźnionego występowania skutków toksycznych przez co najmniej 14 dni po zakończeniu podawania substancji. Zwierzęta wchodzące w skład grup satelitarnych nie będą kryte, a zatem nie zostaną wykorzystane w ocenie toksyczności reprodukcyjnej/rozwojowej. Dawkowanie 28. Zasadniczo należy wykorzystać co najmniej trzy grupy badane i jedną grupę kontrolną. Jeżeli nie ma dostępu do odpowiednich danych dotyczących ogólnej toksyczności, można wykonać badanie ustalające zakres (z wykorzystaniem zwierząt tego samego szczepu, pochodzących z tego samego źródła) w celu określenia dawek, które mają być zastosowane. Z wyjątkiem podawania badanej substancji chemicznej zwierzęta w grupie kontrolnej należy traktować w identyczny sposób jak zwierzęta w grupie badanej. Jeżeli przy podawaniu badanej substancji chemicznej jest stosowany nośnik, grupa kontrolna powinna otrzymać największą użytą objętość nośnika. 29. Poziomy dawki powinny być wybierane, biorąc pod uwagę jakiekolwiek istniejące dostępne dane o toksyczności i dane toksykokinetczne. Należy także wziąć pod uwagę, że mogą istnieć różnice w czułości między zwierzętami w ciąży a tymi niebędącymi w ciąży. Należy wybrać taki najwyższy poziom dawkowania, który powoduje oznaki toksyczności, ale nie zgon lub widoczne cierpienie. Następnie należy dobierać poziomy dawkowania w sekwencji malejącej w taki sposób, aby ukazać wszystkie reakcje powiązane z dawkowaniem i brak niekorzystnych zmian przy najmniejszym poziomie dawkowania. Często optymalne jest zastosowanie poziomów dawkowania różniących się od dwu- do czterokrotnie, a zamiast stosować bardzo odległe (np. różniące się więcej niż 10-krotnie) poziomy dawkowania, często lepiej jest dodać czwartą grupę badaną. 30. Jeśli obserwowana jest ogólna toksyczność (np. spadek masy ciała, wpływ na wątrobę, serce, płuca lub nerki itp.) bądź inne zmiany, które nie muszą być efektami toksycznymi (np. zmniejszone pobieranie pokarmu, powiększenie wątroby), należy zachować ostrożność interpretując obserwowane skutki w punktach końcowych wpływu na układ hormonalny. Badanie graniczne 31. Jeżeli badanie z podawaniem doustnym przy jednym poziomie dawki równym co najmniej 1 000 mg/kg masy ciała/dzień lub, w przypadku podawania w pożywieniu, równoważnej procentowej zawartości w pożywieniu lub wodzie pitnej (na podstawie ustalonej masy ciała), z zastosowaniem procedur opisanych dla tego badania, nie wywołuje widocznych efektów toksycznych i jeżeli nie należałoby spodziewać się toksyczności na podstawie danych dotyczących substancji strukturalnie pokrewnych, wówczas pełne badanie przy użyciu kilku poziomów dawki może nie być konieczne. Można zastosować badanie graniczne z wyjątkiem sytuacji, gdy narażenie ludzi wskazuje potrzebę zastosowania wyższego poziomu dawki. W odniesieniu do innych dróg podawania, na przykład wziewnej lub stosowania na skórę, fizyczne własności chemiczne badanych substancji chemicznych mogą często decydować o najwyższym możliwym do osiągnięcia narażeniu. Podawanie dawek 32. Zwierzętom podaje się badaną substancję chemiczną codziennie, przez siedem dni w tygodniu. Gdy badana substancja chemiczna jest podawana przez sondę, należy ją podawać zwierzętom w pojedynczej dawce przy użyciu sondy żołądkowej lub odpowiedniej kaniuli intubacyjnej. Maksymalna objętość płynu, jaką można podać jednorazowo, zależy od wielkości badanego zwierzęcia. Objętość ta nie powinna przekraczać 1 ml/100 g masy ciała, oprócz roztworów wodnych, w przypadku których można użyć 2 ml/100 g masy ciała. Poza drażniącymi lub żrącymi badanymi substancjami chemicznymi, które zwykle dają zaostrzone objawy przy wyższych stężeniach, zmienność objętości w badaniu powinna być zminimalizowana przez dostosowanie stężenia, aby zapewnić stałą objętość przy wszystkich poziomach dawki. 33. W przypadku substancji chemicznych podawanych w paszy lub w wodzie do picia należy dopilnować, aby ilości podawanej badanej substancji chemicznej nie zakłócały zwykłego odżywiania lub gospodarki wodnej organizmu. Przy podawaniu badanej substancji chemicznej wraz z pokarmem można zastosować stałe stężenie w pokarmie (ppm) lub też stały poziom dawki w zależności od masy ciała zwierzęcia; należy podać zastosowany wariant. W przypadku badanej substancji chemicznej podawanej przez sondę, dawka powinna być podawana każdego dnia o podobnej porze i w razie konieczności modyfikowana co najmniej raz na tydzień, aby utrzymać stały poziom dawki w zależności od masy ciała zwierzęcia. W przypadku wykorzystania badania łączonego jako badania wstępnego przed badaniem długoterminowym lub pełnym badaniem toksyczności reprodukcyjnej, należy w obu badaniach stosować podobną dietę. Harmonogram doświadczalny 34. Podawanie dawek osobnikom obu płci należy rozpocząć co najmniej dwa tygodnie przed kryciem, co najmniej pięć dni po aklimatyzacji i po poddaniu samic badaniu przesiewowemu pod kątem normalnych cykli estrogenowych (przez dwa tygodnie przed okresem poddawania działaniu substancji). Badanie powinno być zaprogramowane w taki sposób, żeby ocena cyklu estrogenowego rozpoczynała się zaraz po osiągnięciu przez zwierzęta pełnej dojrzałości płciowej. Pod tym względem mogą występować nieznaczne różnice u różnych szczepów szczurów wykorzystywanych w różnych laboratoriach, np. szczury szczepu Sprague Dawley osiągają dojrzałość płciową po 10 tygodniach życia, a szczepu Wistar – po około 12 tygodniach. Matki posiadające potomstwo należy uśmiercić 13. dnia po porodzie lub wkrótce po tym dniu. Aby umożliwić wstrzymanie podawania zwierzętom pokarmu matkom przed pobraniem krwi (jeżeli preferuje się taki wariant), matki i ich potomstwo nie muszą być uśmiercone tego samego dnia. Dzień narodzin (tj. dzień zakończenia porodu) określa się jako dzień 0 po porodzie. Samice, u których nie zaobserwowano oznak kopulacji, uśmierca się po 24–26 dniach od ostatniego dnia okresu krycia. Dawkowanie należy kontynuować u obu płci przez okres krycia. Dawkowanie u samców należy nadal stosować po okresie krycia co najmniej do zakończenia minimalnego łącznego okresu dawkowania wynoszącego 28 dni. Następnie samce są uśmiercane lub ewentualnie zatrzymywane i kontynuuje się dawkowanie w celu ewentualnego drugiego krycia, jeśli uzna się to za stosowne. 35. Codziennie dawkowanie u rodzicielskich samic powinno dalej trwać przez cały okres ciąży, co najmniej do 13. dnia po porodzie włącznie, lub do dnia poprzedzającego uśmiercenie. W przypadku badań, w których badaną substancję chemiczną podaje się drogą wziewną lub skórną, dawkowanie powinno trwać co najmniej do 19. dnia ciąży włącznie i powinno zostać wznowione najszybciej jak to możliwe, nie później niż w czwartym dniu po urodzeniu. 36. Jeżeli uwzględniono zwierzęta z grupy satelitarnej przeznaczone do obserwacji uzupełniających, nie wykorzystuje się ich do krycia. Należy je trzymać przez co najmniej 14 kolejnych dni po pierwszym planowanym uśmierceniu matek bez podawania substancji w celu wykrycia opóźnionego pojawienia się, utrzymywania lub ustąpienia efektów toksyczności. 37. Diagram przedstawiający harmonogram doświadczenia znajduje się w dodatku 2. Cykle estrogenowe 38. Monitorowanie cykli estrogenowych powinno odbywać się przed rozpoczęciem poddawania działaniu substancji, aby do badania wybrać samice o regularnej cykliczności (zob. pkt 27). Należy także codziennie, od rozpoczęcia poddawania działaniu substancji do potwierdzenia krycia, monitorować rozmazy śluzówki pochwy. Jeżeli istnieje obawa o wystąpienie dotkliwych skutków stresu mogących zmienić cykle estrogenowe wraz z rozpoczęciem dawkowania, laboratoria mogą przez dwa tygodnie narażać zwierzęta doświadczalne, a następnie przez co najmniej dwa tygodnie codziennie pobierać rozmazy śluzówki pochwy, by monitorować cykl estrogenowy w okresie poprzedzającym krycie i ciągle monitorować go w okresie krycia, aż do momentu zaistnienia oznak krycia. Przy pozyskiwaniu komórek pochwy/szyjki macicy należy zachować ostrożność, aby nie dopuścić do uszkodzenia błony śluzowej, które mogłoby wywoływać ciążę rzekomą (8)(9). Procedura krycia 39. Podczas tego badania należy zazwyczaj wykorzystywać krycia 1:1 (jeden samiec na jedną samicę). W przypadku wystąpienia sporadycznych zgonów samców mogą pojawić się wyjątki. Samicę należy umieścić razem z tym samym samcem na okres trwający do momentu odnotowania kopulacji lub dwa tygodnie. Każdego dnia rano samice należy poddać badaniu na obecność plemników lub czopa pochwowego. Dzień 0 ciąży określa się jako dzień, w którym potwierdzono wystąpienie krycia (wykrycie czopa pochwowego lub plemników). Jeśli kojarzenie w danej parze nie uda się, można rozważyć krycie samic samcami o dowiedzionej płodności. Liczebność miotu 40. Czwartego dnia po porodzie można skorygować liczebność każdego miotu, eliminując dodatkowe, losowo wybrane młode w miocie, by otrzymać, na ile to możliwe, cztery lub pięć samic i cztery lub pięć samców na miot, w zależności od typowej liczebności miotów w szczepie wykorzystanych szczurów. Próbki krwi należy pobrać od dwóch młodych nieprzydzielonych do żadnej kohorty, zebrać je i wykorzystać do określenia poziomów surowicy T4. Selektywna eliminacja młodych, np. oparta na masie ciała lub odległości anogenitalnej, jest nieodpowiednia. Ilekroć liczba młodych samców lub samic uniemożliwia uzyskanie czterech lub pięciu osobników każdej płci na miot, dopuszczalne jest częściowe dostosowanie (na przykład sześć samców i cztery samice). Żadne młode nie zostanie wyeliminowane, gdy liczebność miotu spadnie poniżej celu eliminacji (8 lub 10 młodych/miot) Jeżeli dostępne jest tylko jedno młode powyżej celu eliminacji, tylko jedno młode zostanie wyeliminowane i wykorzystane do pobrania krwi do ewentualnej oceny surowicy T4. 41. Jeżeli liczebność miotu nie została skorygowana, dwa młode na miot uśmierca się 4. dnia po urodzeniu, a próbki krwi pobiera się do pomiaru stężeń hormonów tarczycy w surowicy. Jeżeli to możliwe, dwa młode na miot powinny stanowić młode samice, aby zachować młode samce na potrzeby ocen zatrzymywania płynu w brodawkach sutkowych, oprócz przypadku, w którym eliminacja tych młodych powoduje, że nie pozostaną żadne samice do oceny końcowej przy uśmiercaniu. Żadne młode nie zostanie wyeliminowane, gdy rozmiar miotu spadnie poniżej 8 lub 10 młodych/miot (w zależności od typowego rozmiaru miotu w szczepie wykorzystanych szczurów). Jeżeli dostępne jest tylko jedno młode powyżej typowej liczebności miotu, tylko jedno młode zostanie wyeliminowane i wykorzystane do pobrania krwi do ewentualnej oceny surowicy T4. Obserwacje 42. Ogólne obserwacje kliniczne powinny być przeprowadzane co najmniej raz dziennie, najlepiej każdego dnia o tej samej porze, biorąc pod uwagę szczytowy okres przewidywanych objawów po dawkowaniu. Należy rejestrować stan zdrowia zwierząt. Co najmniej dwa razy dziennie wszystkie zwierzęta poddaje się obserwacjom pod kątem zachorowalności i śmiertelności. 43. Dla wszystkich rodzicielskich zwierząt należy przeprowadzać szczegółowe obserwacje kliniczne: jeden raz przed pierwszym narażeniem (w celu umożliwienia porównania badanych zwierząt), a następnie co najmniej raz w tygodniu. Obserwacji należy dokonywać poza klatką zwierzęcia, najlepiej w warunkach standardowych i każdego dnia o tej samej porze. Obserwacje należy starannie odnotowywać najlepiej za pomocą systemów punktacji wyraźnie określonych przez laboratorium badawcze. Należy dołożyć starań w celu dopilnowania, aby odchylenia w warunkach badania były minimalne, preferowane jest prowadzenie obserwacji przez osoby, które nie wiedzą, jaka substancja jest podawana. Odnotowane objawy powinny obejmować między innymi zmiany w skórze, sierści, oczach, błonach śluzowych, wystąpienie wydzielin i wydalin oraz aktywność autonomicznej części układu nerwowego (np. łzawienie, piloreksja, rozmiar źrenicy, zmieniony rytm oddychania). Należy odnotować także zmiany w sposobie chodzenia, postawie i reakcji na dotyk, jak również obecność ruchów klonicznych lub tonicznych, zachowań stereotypowych (np. nadmierne czyszczenie się, powtarzające się krążenie w kółko), trudny lub długotrwały poród oraz dziwne zachowania (np. samookaleczanie się, chodzenie do tyłu) (10). 44. Raz w ciągu badania należy przeprowadzić ocenę reaktywności na bodźce różnego typu (np. słuchowe, wzrokowe i czucia głębokiego) (8)(9)(11), ocenę siły uchwytu (12) oraz ocenę aktywności motorycznej (13) na pięciu samcach i pięciu samicach losowo wybranych z każdej z grup. Dalsze szczegółowe informacje na temat procedur, jakie można zastosować, podano w odpowiednich odniesieniach. Można jednak także zastosować również procedury inne niż te podane w odniesieniach. W przypadku samców danych obserwacji funkcjonalnych należy dokonać pod koniec ich okresu dawkowania, krótko przed planowanym uśmierceniem ale przed pobieraniem próbek krwi do analizy pod kątem hematologii lub chemii klinicznej (zob. pkt 53–56, w tym przypis 1). W trakcie tych badań funkcjonalnych samice powinny być w fizjologicznie podobnym stanie i najlepiej badać je raz w trakcie ostatniego tygodnia laktacji (np. LD 6–13), na krótko przed planowanym uśmierceniem. W miarę możliwości należy zminimalizować czas, w którym matki i młode przebywają osobno. 45. Obserwacje funkcjonalne przeprowadzane tylko raz odnośnie do końca badań mogą być pominięte, gdy badanie prowadzone jest jako badanie wstępne do późniejszego badania podchronicznego (90-dniowego) lub badania długofalowego. W takim przypadku obserwacje funkcjonalne należy zamieścić w tym badaniu uzupełniającym. Z drugiej strony, dostępność danych dotyczących obserwacji czynnościowych z tego badania z powtarzanym dawkowaniem może zwiększyć możliwości doboru poziomów dawkowania do celów późniejszego badania toksyczności podprzewlekłej lub badania długofalowego. 46. Wyjątkowo można pominąć obserwacje czynnościowe również w odniesieniu do grup, które oprócz tego przejawiają oznaki toksyczności nasilone na tyle, że mogłyby znacznie zakłócić wykonanie badania funkcjonalnego. 47. Począwszy od dnia 0 ciąży należy odnotowywać i liczyć czas jej trwania. Każdy miot należy zbadać tak szybko po urodzeniu jak to możliwe, w celu ustalenia liczby i płci młodych, płodów urodzonych martwo, płodów urodzonych żywo, słabowitych młodych w miocie (młodych o znacznie mniejszych rozmiarach niż odpowiadające młode kontrolne) oraz obecności poważnych nieprawidłowości. 48. Należy zliczyć i ustalić płeć żywych młodych, a mioty należy zważyć w ciągu 24 godzin od porodu (w dniu 0 lub 1. dnia po porodzie) oraz co najmniej 4. i 13. dnia po porodzie. W dodatku do obserwacji dotyczących zwierząt rodzicielskich (zob. pkt 43 i 44), należy odnotować wszelkie nieprawidłowe zachowania potomstwa. 49. Odległość anogenitalną każdego młodego należy mierzyć w tym samym dniu po urodzeniu – między 0. a 4. dniem po urodzeniu. W dniu pomiaru odległości anogenitalnej należy dokonać pomiaru masy ciała młodego, a odległość anogenitalną należy znormalizować w odniesieniu do pomiaru wielkości młodego, najlepiej jako pierwiastek kwadratowy masy ciała (14). Liczbę brodawek sutkowych / otoczek brodawek u młodych samców należy mierzyć, według zaleceń zawartych w wytycznej OECD nr 151, 12. lub 13. dnia po urodzeniu (15). Masa ciała i spożycie pokarmu/wody 50. Samce i samice należy zważyć w pierwszym dniu dawkowania, a następnie co najmniej raz tygodniowo oraz w momencie zakończenia dawkowania. Samice w okresie ciąży należy ważyć w dniach 0, 7, 14 i 20 oraz w ciągu 24 godzin od porodu (w dniu 0 lub 1. dniu po porodzie), a także co najmniej 4. i 13. dnia po porodzie. Obserwacje te należy umieścić w sprawozdaniu oddzielnie w odniesieniu do każdego dorosłego zwierzęcia. 51. Przed kryciem, w okresie ciąży oraz laktacji spożycie pokarmu należy mierzyć co najmniej raz w tygodniu. W okresie krycia pomiar spożycia pokarmu nie jest obowiązkowy. W tych okresach należy także mierzyć spożycie wody, jeżeli badana substancja chemiczna podawana jest za pośrednictwem tego nośnika. Hematologia 52. W okresie badania na pięciu samcach i pięciu samicach losowo wybranych z każdej z grup należy jednorazowo przeprowadzić następujące analizy hematologiczne: hematokryt, stężenia hemoglobiny, liczba erytrocytów, liczba retikulocytów, całkowita i różnicowa liczba leukocytów, liczba płytek krwi i pomiar czasu krzepnięcia krwi. Jeśli badana substancja chemiczna lub jej potencjalne metabolity mają właściwości utleniające lub podejrzewa się, że mogą mieć takie właściwości, należy również przeprowadzić inne oznaczenia, w tym stężenia methemoglobiny i ciałek Heinza. 53. Próbki krwi należy pobierać z wyznaczonego miejsca. Podczas pobierania próbek samice powinny być w fizjologicznie podobnym stanie. Aby uniknąć utrudnień praktycznych związanych ze zmiennością na początku ciąży, pobrania próbek krwi samic można dokonać na końcu okresu poprzedzającego krycie, ponieważ jest to metoda alternatywna do pobierania próbek tuż przed, lub w ramach procedury eutanazji zwierząt. Najlepiej, by próbki krwi samców pobierać tuż przed eutanazją zwierząt lub jako element tej procedury. Ewentualnie pobieranie próbek krwi od samców można także przeprowadzić pod koniec okresu poprzedzającego krycie, w przypadku gdy ten punkt czasowy był preferowany u samic. 54. Próbki krwi należy przechowywać we właściwych warunkach. Biochemia kliniczna 55. Oznaczenia biochemii klinicznej w celu zbadania głównych efektów toksycznych w tkankach, a w szczególności wpływu na nerki i wątrobę, powinny być wykonywane na próbkach krwi pobranych od wybranych pięciu samców i pięciu samic z każdej grupy. Zalecane jest wstrzymanie podawania pożywienia zwierzętom przez noc poprzedzającą pobranie krwi ( 22 ) . Badania osocza i surowicy powinny obejmować sód, potas, glukozę, cholesterol całkowity, mocznik, kreatyninę, białko całkowite i albuminę, co najmniej dwa enzymy wskazujące na skutki komórkowe w wątrobie (takie jak aminotransferaza alaninowa, aminotransferaza asparaginowa i dehydrogenaza sorbitolu) oraz kwasy żółciowe. W pewnych okolicznościach przydatnych informacji mogą dostarczyć pomiary dodatkowych enzymów (pochodzenia wątrobowego lub innego) oraz bilirubiny. 56. Próbki krwi z określonego miejsca pobiera się według następującego planu: — od co najmniej dwóch młodych na miot 4. dnia po urodzeniu, jeżeli liczba młodych na to pozwala (zob. pkt 40–41); — od wszystkich matek oraz co najmniej dwóch młodych z każdego miotu przy zakończeniu badania 13. dnia; oraz — od wszystkich dorosłych samców w dniu zakończenia badania. Wszystkie próbki krwi przechowuje się w odpowiednich warunkach. Próbki krwi pobrane od 13-dniowych młodych oraz dorosłych samców ocenia się pod kątem poziomów surowicy hormonów tarczycy (T4). Jeżeli uzna się za stosowne, przeprowadzana jest dalsza ocena T4 w próbkach krwi od matek oraz 4-dniowych młodych. Jeżeli uzna się to za stosowne, można przeprowadzić opcjonalny pomiar innych hormonów. Krew młodych z każdego miotu można połączyć do celów analizy hormonów tarczycy. Hormony tarczycy (T4 i TSH) zaleca się mierzyć jako „całkowite”. 57. Fakultatywnie u pięciu przypadkowo wybranych samców w każdej grupie można przeprowadzić następujące oznaczenia analityczne w moczu w ciągu ostatniego tygodnia badań; przejrzystość, objętość, osmolalność lub ciężar właściwy, pH, białka, glukoza i komórki krwi. 58. Dodatkowo należy rozważyć zastosowanie do badań surowicy znaczników ogólnego uszkodzenia tkanek. Inne oznaczenia, które powinny być przeprowadzone, jeżeli znane właściwości badanej substancji chemicznej mogą lub podejrzewa się, że mogą wpływać na pokrewne profile metaboliczne, obejmują wapń, fosforan, triglicerydy i glukozę po poście, hormony specyficzne, metahemoglobinę i cholinoesterazę. Kwestie te należy identyfikować indywidualnie dla każdego przypadku. 59. Na zmienność i wartości bezwzględne stężeń przy oznaczaniu hormonów mogą mieć wpływ następujące czynniki: — czas uśmiercenia zwierzęcia w związku z dobową zmiennością stężeń hormonów; — metoda uśmiercenia zastosowana w celu uniknięcia zbędnego stresu dla zwierząt, mogącego wpłynąć na stężenia hormonów; — zestawy do oznaczania hormonów, których krzywe standardowe mogą się różnić. 60. Próbki osocza przeznaczone konkretnie do oznaczenia poziomu hormonów należy pobierać w porównywalnej porze dnia. Wartości liczbowe uzyskane w toku analizy stężeń hormonów różnią się w zależności od zastosowanego dostępnego w handlu zestawu testowego. 61. Jeżeli historyczne dane odniesienia są niewystarczające, należy rozważyć oznaczenie zmiennych hematologicznych i biochemii klinicznej przed rozpoczęciem podawania dawek lub, lepiej, w grupie zwierząt niebędących zwierzętami doświadczalnymi. W przypadku samic dane muszą dotyczyć zwierząt w okresie laktacji. PATOLOGIA Pełne rozpoznanie histopatologiczne 62. Wszystkie dorosłe zwierzęta w badaniu powinny podlegać szczegółowemu pełnemu rozpoznaniu histopatologicznemu, które obejmuje staranne badanie zewnętrznej powierzchni ciała, wszystkich otworów ciała, jamy czaszkowej, klatki piersiowej i jamy brzusznej oraz ich zawartości. Szczególną uwagę należy zwrócić na organy układu rozrodczego. Należy odnotować liczbę miejsc zagnieżdżenia. Rozmazy śluzówki pochwy należy zbadać w dniu autopsji, aby określić stadium cyklu estrogenowego oraz umożliwić korelację z histopatologią organów rozrodczych samicy. 63. Jądra i najądrza, a także gruczoł krokowy i kanaliki nasienne z całymi gruczołami koagulującymi wszystkich dorosłych samców należy, w stosownym przypadku, wyczyścić z wszelkich przylegających tkanek, a ich mokrą masę należy pobrać jak najszybciej po dysekcji, aby zapobiec jej wyschnięciu. Ponadto opcjonalne masy narządów mogą w przypadku samców obejmować zespół mięśni dźwigacza odbytu i mięśni opuszkowo-jamistych, gruczoły Cowpera i żołądź, a w przypadku samic parę jajników (mokra masa) i macicę (wraz z szyjką); jeżeli są uwzględnione, masy te należy określić jak najszybciej po dysekcji. Należy zachować jajniki, jądra, najądrza, płciowe narządy dodatkowe i jakiekolwiek narządy wykazujące makroskopowe zmiany patologiczne wszystkich dorosłych zwierząt. 64. Gruczoły tarczowe wszystkich dorosłych samców i samic oraz jednego młodego, 13-dniowego samca i samicy powinny być zakonserwowane w najwłaściwszym środku utrwalającym dla zamierzonych kolejnych badań histopatologicznych. Masę tarczycy można określić po utrwaleniu. Należy zachować dużą ostrożność przy okrawaniu i wykonywać je dopiero po utrwaleniu, w celu uniknięcia uszkodzenia tkanek. Mogłoby ono zakłócić analizę histopatologiczną. Próbki krwi należy pobierać z wyznaczonego miejsca tuż przed eutanazją zwierząt lub jako element jej procedury i przechowywać w odpowiednich warunkach (zob. pkt 56). 65. Ponadto wątroby, nerki, nadnercza, grasice, śledziony, mózgi i serca co najmniej pięciu dorosłych, losowo wybranych z każdej grupy samców i samic (poza tymi, które znaleziono w agonii lub poddano eutanazji przed zakończeniem badania) należy wyczyścić z wszelkich przylegających tkanek, a ich mokrą masę, aby uniknąć wyschnięcia, należy pobrać możliwie najszybciej po dysekcji. Następujące tkanki powinny być zakonserwowane w najwłaściwszym środku utrwalającym dla obu typów tkanek i zamierzonych kolejnych badań histopatologicznych: wszystkie poważne zmiany patologiczne, mózg (reprezentatywne obszary, w tym kresomózgowie, móżdżek i most), rdzeń kręgowy, oko, żołądek, jelito cienkie i grube (w tym kępki Peyera), wątrobę, nerki, nadnercza, śledzionę, serce, grasicę, tchawicę i płuca (zakonserwowane przez napełnienie środkiem utrwalającym i następnie zanurzenie), gonady (jądra i jajniki), płciowe narządy dodatkowe (macicę i szyjkę macicy, najądrza, prostatę, pęcherzyki nasienne wraz z gruczołami koagulującymi), pochwę, pęcherz moczowy, węzły chłonne (poza najbliższym węzłem chłonnym należy pobrać inny węzeł w zależności od doświadczenia laboratorium (16)), nerw obwodowy (kulszowy lub piszczelowy), najlepiej w bliskiej odległości od mięśnia, mięsień szkieletowy i kość szkieletową wraz ze szpikiem kostnym (wycinek lub ewentualnie świeżo pobrany szpik kostny). Zaleca się utrwalenie jąder poprzez zanurzenie w utrwalaczu Bouina lub zmodyfikowanym utrwalaczu Davidsona (16)(17)(18); nie zaleca się utrwalania tych tkanek w formalinie. Błonę białawą trzeba delikatnie i płytko przekłuć igłą na obu biegunach narządu w celu umożliwienia szybkiego wniknięcia płynu utrwalającego. Wyniki badań klinicznych i inne ustalenia mogą wskazać na konieczność zbadania dodatkowych tkanek. Organy uznane za prawdopodobne organy docelowe, w oparciu o znane właściwości substancji badanej, także należy zachować. 66. Ważnych wskazówek co do efektów związanych z układem hormonalnym mogą dostarczyć badania następujących tkanek: gonad (jajników i jąder), płciowych narządów dodatkowych (macicy wraz z szyjką, najądrzy, pęcherzyków nasiennych z gruczołami koagulacyjnymi, części grzbietowo-bocznej i brzusznej prostaty), pochwy, przysadki mózgowej, męskich gruczołów mlekowych i gruczołu nadnerczowego. Zmiany w męskich gruczołach mlekowych nie są zbyt dobrze udokumentowane, ale parametr ten może być bardzo czuły na substancje o działaniu estrogenowym. Obserwacja organów/tkanek niewykazanych w pkt 65 jest opcjonalna. 67. Martwe młode i młode zabite 13. dnia po porodzie lub wkrótce potem należy co najmniej przebadać zewnętrznie z zachowaniem ostrożności pod kątem poważnych nieprawidłowości. Szczególną uwagę należy zwrócić na zewnętrzne narządy rozrodcze, które należy zbadać pod kątem zmian rozwojowych. Histopatologia 68. Należy wykonać szczegółową histopatologię zachowanych organów i tkanek zwierząt wytypowanych w grupach kontrolnych i grupach otrzymujących wysoką dawkę (ze szczególnym naciskiem na stadia spermatogenezy w gonadach samców i histopatologię śródmiąższowej struktury komórek jąder). Gruczoły tarczowe pochodzące od młodych i pozostałych dorosłych zwierząt w razie potrzeby mogą być badane. Badania te powinny być rozciągnięte na inne grupy badane, jeśli w grupie otrzymującej najwyższe dawki obserwuje się zmiany związane z działaniem substancji. W wytycznych dotyczących histopatologii (10) podano dodatkowe informacje dotyczące wycinania, utrwalania, dzielenia i histopatologii tkanek układu hormonalnego. 69. Należy przebadać wszystkie uszkodzenia. Aby ułatwić objaśnienie poziomów dawkowania, przy których nie obserwuje się szkodliwych zmian, należy zbadać organy docelowe w innych grupach otrzymujących dawkę, a w szczególności w grupach, które te poziomy rzekomo wykazują. 70. Jeśli wykorzystuje się grupę satelitarną, należy przeprowadzić badanie histopatologiczne tych tkanek i organów, w których – w grupach otrzymujących substancję badaną – stwierdzono skutki podania substancji. DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ Dane 71. Należy podać dane każdego zwierzęcia. Ponadto wszystkie dane należy podsumować w formie tabeli wykazującej, w odniesieniu do każdej grupy badanej i każdego pokolenia, liczbę zwierząt na początku badania, liczbę zwierząt, które znaleziono martwe podczas badania lub zwierząt uśmierconych ze względów humanitarnych, czas śmierci lub uśmiercenia, liczbę zwierząt płodnych, liczbę ciężarnych samic, liczbę zwierząt wykazujących zaobserwowane oznaki toksyczności, z podaniem czasu ich pojawienia się, w tym czasu trwania, ciężkości wszelkich skutków toksyczności, rodzajów zmian histopatologicznych oraz wszelkich odnośnych danych miotów. W dodatku 3 przedstawiono podsumowanie w formie tabeli, które okazało się być bardzo przydatne przy ocenianiu efektów reprodukcyjnych/rozwojowych. 72. O ile to możliwe, wyniki liczbowe należy poddawać ocenie za pomocą właściwych i ogólnie przyjętych metod statystycznych. Przy porównywaniu skutków dla różnych dawek należy unikać stosowania wielokrotnego porównywania testem t-Studenta. Metody statystyczne należy wybrać podczas planowania badania. Analiza statystyczna odległości anogenitalnej i zatrzymywania płynu w brodawkach powinna być oparta na danych dotyczących poszczególnych młodych z uwzględnieniem wpływu na miot. W stosownych przypadkach za jednostkę analityczną uznaje się miot. Analiza statystyczna masy ciała młodych powinna być oparta na danych dotyczących poszczególnych młodych z uwzględnieniem liczebności miotu. Ze względu na ograniczone wymiary badania, analizy statystyczne w postaci testów na „istotność” mają ograniczoną wartość dla wielu punktów końcowych, zwłaszcza reprodukcyjnych punktów końcowych. Niewłaściwe są niektóre z najszerzej stosowanych metod, zwłaszcza badania parametryczne dotyczące średnich. Jeżeli wykorzystywane są analizy statystyczne, wybrana metoda powinna być odpowiednia dla rozkładu badanej zmiennej i powinna być wybrana przed rozpoczęciem badania. Ocena wyników 73. Wyniki tego badania toksyczności powinny być oceniane w kategoriach zaobserwowanych skutków, wyników autopsji i badań mikroskopowych. Ocena obejmuje zależność pomiędzy dawką badanej substancji chemicznej a obecnością lub brakiem, częstością i ciężkością nieprawidłowości, w tym poważnych zmian patologicznych, wskazanymi organami docelowymi, bezpłodnością, nieprawidłowościami klinicznymi, zmienionymi funkcjami rozrodczymi i funkcjonowaniem miotów, zmianami masy ciała, wpływem na śmiertelność i wszelkimi innymi skutkami toksycznymi. 74. Ze względu na krótki okres poddania działaniu substancji w odniesieniu do samców, przy ocenie wpływu na rozrodczość u samców należy uwzględnić histopatologię jąder i najądrzy oraz dane dotyczące płodności. Wykorzystanie historycznych danych dotyczących kontroli odnoszących się do reprodukcji/rozwoju (np. dotyczących wielkości miotu, odległości anogenitalnej, zatrzymywania płynu w brodawkach, poziomu T4 w surowicy), w przypadku gdy są one dostępne, może być również przydatne jako pomoc w interpretacji badania. 75. Proponuje się, aby do celów kontroli jakości zbierać historyczne dane kontrolne i obliczać współczynniki zmienności dla danych liczbowych, szczególnie w odniesieniu do parametrów związanych z wykrywaniem substancji zakłócających funkcjonowanie układu hormonalnego. Dane te można wykorzystać do celów porównawczych przy ocenie bieżących badań. Sprawozdanie z badania 76. Sprawozdanie z badania powinno zawierać następujące informacje: Badana substancja chemiczna: — źródło, numer partii, termin przydatności, jeżeli są znane; — stabilność badanej substancji chemicznej, jeżeli jest znana. substancja jednoskładnikowa: — wygląd fizyczny, rozpuszczalność w wodzie i dodatkowe istotne właściwości fizykochemiczne; — dane identyfikacyjne substancji chemicznej, takie jak: nazwa IUPAC lub CAS, numer CAS, kod SMILES lub InChI, wzór strukturalny, czystość, nazwa chemiczna zanieczyszczeń, stosownie do przypadku i jeśli jest to praktycznie wykonalne, itp. Substancja wieloskładnikowa, UVCB i mieszaniny: — opisane w miarę możliwości przez podanie nazwy chemicznej (zob. powyżej), określenie ilości oraz istotnych właściwości fizykochemicznych składników. Nośnik (w stosownych przypadkach): — uzasadnienie wyboru nośnika, jeśli jest inny niż woda. Zwierzęta doświadczalne: — wykorzystany gatunek/szczep; — liczba, wiek i płeć zwierząt; — źródło pochodzenia, warunki utrzymywania, pasza itp.; — masa ciała poszczególnych zwierząt na początku badania; — uzasadnienie wyboru gatunku, jeśli jest inny niż szczur. Warunki badania: — uzasadnienie wyboru poziomu dawkowania; — szczegóły dotyczące przygotowania formy użytkowej badanej substancji chemicznej / przygotowania paszy, uzyskanego stężenia, trwałości i jednorodności preparatu, — szczegółowe informacje dotyczące podawania badanej substancji chemicznej; — wskaźnik konwersji stężenia badanej substancji chemicznej w pokarmie / wodzie pitnej (ppm) do dawki rzeczywistej (mg/kg masy ciała/dzień), jeśli ma to zastosowanie; — szczegółowe informacje dotyczące jakości pokarmu i wody; — szczegółowy opis procedury randomizacji stosowanej do doboru młodych do eliminacji w przypadku, gdy się jej dokonuje. Wyniki: — masa ciała / zmiany masy ciała, — dane dotyczące spożycia pokarmu oraz wody, w stosownych przypadkach; — dane dotyczące efektu toksycznego ze względu na płeć i dawkę, włączając płodność, ciążę i wszelkie inne objawy — toksyczności; — długość trwania ciąży; wpływ toksyczności lub innych skutków na reprodukcję, potomstwo i rozwój poporodowy itp.; — rodzaj, nasilenie i czas trwania obserwowanych objawów klinicznych (tak odwracalnych, jak i nieodwracalnych); — oceny aktywności sensorycznej, siły uchwytu i aktywności motorycznej; — badania hematologiczne wraz z odpowiednimi wartościami odniesienia; — badania biochemii klinicznej wraz z odpowiednimi wartościami odniesienia; — liczba dorosłych samic, u których występuje normalny lub nienormalny cykl estrogenowy i czas trwania cyklu; — liczba młodych urodzonych żywo i strat poimplantacyjnych; — liczba młodych z wyraźnie widocznymi nieprawidłowościami; ocena wzrokowa zewnętrznych narządów płciowych, liczba słabowitych młodych w miocie; — czas zgonu podczas badania lub informacja o tym, czy zwierzęta przetrwały do czasu zakończenia badania; — liczba zagnieżdżeń, liczebność miotu i masa poszczególnych młodych w miocie w momencie rejestracji; — dane dotyczące masy ciała młodego; — odległość anogenitalna u wszystkich młodych (oraz masa ciała na dzień pomiaru odległości anogenitalnej); — zatrzymywanie płynu w brodawkach u młodych płci męskiej; — poziom hormonów tarczycy, młode w 13. dniu życia i dorosłe samce (oraz matki i młode w 4. dniu życia, jeśli dokonano pomiaru) — masa ciała w chwili uśmiercenia oraz masa narządów u zwierząt rodzicielskich; — wyniki autopsji; — szczegółowy opis wyników badania histopatologicznego; — dane dotyczące absorpcji (jeżeli są dostępne); — w stosownych przypadkach statystyczne opracowanie wyników. Omówienie wyników. Wnioski Interpretacja wyników 77. Badanie dostarczy ocen toksyczności reprodukcyjnej/rozwojowej związanej z zastosowaniem powtarzanego dawkowania. W szczególności, ponieważ szczególną uwagę przywiązuje się do punktów końcowych toksyczności ogólnej i toksyczności reprodukcyjnej/rozwojowej, wyniki badania pozwolą na odróżnienie skutków reprodukcyjnych/rozwojowych występujących przy braku ogólnej toksyczności od występujących jedynie na poziomach, które są toksyczne również dla zwierząt rodzicielskich (zob. pkt 7–11). Może ono stanowić wskazówkę co do potrzeby prowadzenia dalszych badań i może dostarczyć wytycznych przy opracowywaniu kolejnych badań. Przy interpretowaniu wyników dotyczących rozrodczości i rozwoju pomocny może być dokument zawierający wytyczne OECD nr 43 (19). Wytyczne OECD nr 106 w sprawie oceny histologicznej badań endokrynologicznych i reprodukcyjnych u gryzoni (OECD Guidance Document 106 on Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents) (16) zawierają informacje na temat przygotowania i oceny narządów (endokrynologicznych) i rozmazów śluzówki pochwy, które mogą być pomocne w niniejszej metodzie badawczej. BIBLIOGRAFIA (1) OECD (1990). Room Document No 1 for the 14th Joint Meeting of the Chemicals Group and Management Committee. Dokument dostępny na wniosek w Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwoju w Paryżu. (2) OECD (1992). Chairman’s Report of the ad hoc Expert Meeting on Reproductive Toxicity Screening Methods , Tokio, 27–29 października 1992. Dokument dostępny na wniosek w Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwoju w Paryżu. (3) Mitsumori K., Kodama Y., Uchida O., Takada K., Saito M. Naito K., Tanaka S., Kurokawa Y., Usami, M., Kawashima K., Yasuhara K., Toyoda K., Onodera H., Furukawa F., Takahashi M. i Hayashi Y. (1994). Confirmation Study, Using Nitro-Benzene, of the Combined Repeat Dose and Reproductive/ Developmental Toxicity Test Protocol Proposed by the Organization for Economic Cooperation and Development (OECD), „J. Toxicol, Sci.” nr 19, s. 141–149. (4) Tanaka S., Kawashima K., Naito K., Usami M., Nakadate M., Imaida K., Takahashi M., Hayashi Y., Kurokawa Y. i Tobe M. (1992). Combined Repeat Dose and Reproductive/Developmental Toxicity Screening Test (OECD): Familiarization Using Cyclophosphamide. „Fundamental and Applied Toxicol.” nr 18, s. 89–95. (5) OECD (1998). Report of the First Meeting of the OECD Endocrine Disrupter Testing and Assessment (EDTA) Task Force , Dokument dostępny na wniosek w Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwoju w Paryżu, 10–11 marca 1998. (6) OECD (2015). Feasibility Study for Minor Enhancements of TG 421/422 with ED Relevant Endpoints . [W:] Environment, Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment (nr 217). Paryż: Organizacja Współpracy Gospodarczej i Rozwoju. (7) OECD (2000). Guidance Document on the Recognition, Assessment, and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluations , [W:] Publikacje na temat środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa, seria dotycząca badań i oceny nr 19. Paryż: Organizacja Współpracy Gospodarczej i Rozwoju. (8) Goldman J.M., Murr A.S., Buckalew A.R., Ferrell J.M. i Cooper R.L. (2007). The Rodent Estrous Cycle: Characterization of Vaginal Cytology and its Utility in Toxicological Studies , „Birth Defects Research” część B, nr 80 (2), 84–97. (9) Sadleir R.M.F.S. (1979). Cycles and Seasons , w: C.R. Auston i R.V. Short, (red.), Reproduction in Mammals: I. Germ Cells and Fertilization . Cambridge, Nowy Jork. (10) IPCS (1986). Principles and Methods for the Assessment of Neurotoxicity Associated with Exposure to Chemicals , [W:] Environmental Health Criteria Document nr 60. (11) Moser V.C., McDaniel K.M. i Phillips P.M. (1991). Rat Strain and Stock Comparisons Using a Functional Observational Battery: Baseline Values and Effects of Amitraz , „Toxicol. AppliedPharmacol.” nr 108, s. 267–283. (12) Meyer O.A., Tilson H.A., Byrd W.C. i Riley M.T. (1979). A Method for the Routine Assessment of Fore- and Hindlimb Grip Strength of Rats and Mice , „Neurobehav. Toxicol.” nr 1, s. 233–236. (13) Crofton K.M., Howard J.L., Moser V.C., Gill M.W., Reiter L.W., Tilson H.A., MacPhail R.C. (1991). Interlaboratory Comparison of Motor Activity Experiments: Implication for Neurotoxicological Assessments , „Neurotoxicol. Teratol.” nr 13, s. 599–609. (14) Gallavan R.H. Jr, J.F. Holson, D.G. Stump, J.F. Knapp i V.L. Reynolds. (1999). Interpreting the Toxicologic Significance of Alterations in Anogenital Distance: Potential for Confounding Effects of Progeny Body Weights , „Reproductive Toxicology” nr 13, s. 383–390. (15) OECD (2013). Guidance Document in Support of the Test Guideline on the Extended One Generation Reproductive Toxicity Study, [W:] Publikacje na temat środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa, seria dotycząca badań i oceny nr 151. Organizacja Współpracy Gospodarczej i Rozwoju. (16) OECD (2009) Guidance Document for Histologic Evaluation of Endocrine and Reproductive Tests in Rodents , [W:] Publikacje na temat środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa, seria dotycz