Dyrektywa komisji

z dnia 18 listopada 1987 r.

dostosowująca po raz dziewiąty do postępu technicznego dyrektywę Rady 67/548/EWG w sprawie zbliżania przepisów ustawowych, wykonawczych i administracyjnych odnoszących się do klasyfikacji, pakowania i etykietowania substancji niebezpiecznych

(88/302/EWG)

KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH,

uwzględniając Traktat ustanawiający Europejską Wspólnotę Gospodarczą,

uwzględniając dyrektywę Rady 67/548/EWG z dnia 27 czerwca 1967 r. w sprawie zbliżania przepisów ustawowych, wykonawczych i administracyjnych odnoszących się do klasyfikacji, pakowania i etykietowania substancji niebezpiecznych [1], po raz szósty zmienioną dyrektywą 79/831/EWG [2], w szczególności jej art. 19,

a także mając na uwadze, co następuje:

artykuł 3 ust. 1 dyrektywy 67/548/EWG przewiduje, że właściwości fizyczno-chemiczne, toksyczność i ekotoksyczność substancji i preparatów ustalane są zgodnie z metodami określonymi w załączniku V;

artykuł 3 ust. 2 dyrektywy 67/548/EWG przewiduje, że rzeczywiste lub potencjalne zagrożenie dla środowiska substancjami lub preparatami jest oceniane zgodnie z cechami wyszczególnionymi w załącznikach VII i VIII;

załącznik V do wersji wprowadzonej dyrektywą Komisji 84/449/EWG [3] obecnie zawiera jedynie metody analityczne odpowiadające cechom wyszczególnionym w załączniku VII, i konieczne jest również udostępnienie metod testowania odpowiadających cechom wyszczególnionym w załączniku VIII;

przepisy niniejszej dyrektywy są zgodne z opinią Komitetu ds. Dostosowania do Postępu Technicznego Przepisów dotyczących Usunięcia Barier Technicznych w Handlu Niebezpiecznymi Substancjami i Preparatami,

PRZYJMUJE NINIEJSZĄ DYREKTYWĘ:

Artykuł 1

Tekst Załącznika do niniejszej dyrektywy dodaje się do załącznika V do dyrektywy 67/548/EWG.

Artykuł 2

Państwa Członkowskie przyjmą i opublikują przed dniem 31 grudnia 1988 r. środki niezbędne do wykonania niniejszej dyrektywy i niezwłocznie powiadomią o tym Komisję. Środki te Państwa Członkowskie stosują najpóźniej od dnia 30 czerwca 1989 r.

Artykuł 3

Niniejsza dyrektywa skierowana jest do Państw Członkowskich.

Sporządzono w Brukseli, dnia 18 listopada 1987 r.

W imieniu Komisji

Stanley clinton davis

Członek Komisji

[1] Dz.U. 196 z 16.8.1967, str. 1/67.

[2] Dz.U. L 259 z 15.10.1979, str. 10.

[3] Dz.U. L 251 z 19.9.1984, str. 1.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK

Metody testowania opisane w niniejszym Załączniku służą do oznaczania niektórych właściwości toksykologicznych i ekotoksykologicznych wymienionych w załączniku VIII do dyrektywy Rady 79/831/EWG. Metody analityczne właściwe dla poziomu 1 i poziomu 2 załącznika VIII zostały opisane, ale badania nie są dzielone dalej jako funkcje różnych poziomów.

SPIS TREŚCI

| Strona |

CZĘŚĆ B: Metody ustalania toksyczności … | 4 |

Wprowadzenie ogólne: CZĘŚĆ B … | 4 |

Badanie podchronicznej toksyczności doustnej: 90-dniowe badania dawkowania doustnego z wykorzystaniem gatunków gryzoni … | 8 |

Badanie podchronicznej toksyczności doustnej: 90-dniowe badania dawkowania doustnego z wykorzystaniem gatunków innych niż gryzonie … | 12 |

Badanie podchronicznej toksyczności skóry: 90-dniowe badania dawkowania po naniesieniu na skórę z wykorzystaniem gatunków gryzoni … | 16 |

Badanie podchronicznej toksyczności inhalacyjnej: 90-dniowe badania inhalacyjne z wykorzystaniem gatunków gryzoni … | 20 |

Badanie działania teratogennego – gryzonie i inne gatunki … | 24 |

Badanie toksyczności chronicznej … | 27 |

Badanie rakotwórczości … | 32 |

Połączone badanie toksyczności chronicznej/rakotwórczości … | 37 |

Badanie toksyczności reprodukcji jednego pokolenia … | 43 |

Badanie toksyczności reprodukcji dwóch pokoleń … | 47 |

Toksykokinetyka … | 51 |

Badanie mutagenności i badania przesiewowe na rakotwórczość … | 55 |

—Mutacja genu – Saccharomyces cerevisiae… | 55 |

—Badanie rekombinacji genetycznej – Saccharomyces cerevisiae… | 58 |

—Badanie mutacji komórek genów ssaków in vitro… | 61 |

—Uszkodzenie i naprawa DNA – nieregularna synteza DNA – komórki ssaków in vitro… | 64 |

—Test wymiany chromatyd siostrzanych in vitro… | 68 |

—Badania sprzężonych z płcią recesywnych cech letalnych u Drosophila melanogaster… | 71 |

—Badania przemiany komórkowej ssaków in vitro… | 73 |

—Badanie dominującego genu letalnego gryzonia … | 76 |

—Cytogenetyka komórki zarodkowej ssaków in vivo… | 79 |

—Test plamkowy u myszy … | 82 |

—Przenoszenie dziedziczności u myszy … | 85 |

CZĘŚĆ C: Metody ustalania ekotoksyczności … | 88 |

Wprowadzenie ogólne: Część C … | 88 |

Badanie zahamowania wzrostu alg … | 89 |

Toksyczność dżdżownic: badanie sztucznej gleby … | 95 |

Biodegradacja: Badanie Zahn-Wellens … | 99 |

Biodegradacja: Badania symulacji aktywnych szlamów … | 106 |

Biodegradacja: Badanie hamowania oddychania aktywnych szlamów … | 118 |

Biodegradacja: Zmodyfikowane badanie SCAS … | 123 |

CZĘŚĆ B: METODY OZNACZANIA TOKSYCZNOŚCI

WPROWADZENIE OGÓLNE: CZĘŚĆ B

BADANIA DŁUGOTERMINOWE

Badania podchroniczności, chroniczności i rakotwórczości.

Charakterystyka substancji testowej i mieszaniny alenicznej

Skład substancji testowej, włączając większość zanieczyszczeń, oraz jej istotne właściwości fizyczno-chemiczne, włączając stabilność, powinien być znany przed rozpoczęciem jakichkolwiek badań dotyczących toksyczności.

Właściwości fizyczno-chemiczne substancji testowej dostarczają ważnych informacji dotyczących wyboru sposobu podawania, projektowania badań toksyczności podchronicznej, chronicznej oraz rakotwórczości, a także składowania i obchodzenia się z substancją testową.

Informacje dotyczące budowy chemicznej oraz właściwości fizyczno-chemicznych mogą również dostarczać wskazań w odniesieniu do cech absorpcji za pomocą zamierzonego sposobu podawania oraz możliwości metabolicznych i dystrybucji w tkankach. Informacje dotyczące parametrów toksykokinetycznych mogą pochodzić również z poprzednich badań toksyczności i badań toksykokinetycznych.

Rozpoczęcie badań powinien poprzedzać rozwój jakiejkolwiek metody analitycznej dotyczącej jakościowego i ilościowego oznaczania substancji testowej (włączając większość zanieczyszczeń w miarę możliwości) w dozowanym środku oraz materiale biologicznym.

Zwierzęta badane: wybór gatunków i szczepów

Ponieważ niezbędne jest prowadzenie badań na zwierzętach przez większość ich okresu życia, badania będą ograniczane do gatunków łatwych w utrzymaniu i o stosunkowo krótkim okresie życia. Wysoce pożądane jest poznanie przypadku samorzutnej choroby i nowotworów w szczepie wykorzystywanego zwierzęcia, utrzymywanego w podobnych warunkach.

Szczepy powinny być dobrze scharakteryzowane oraz wolne od wad wrodzonych. Wykorzystywanie szczepów wsobnych, mieszańców F1, w tym względzie wykazuje pewne korzyści, ale w przypadku dostępności dostatecznych danych dotyczących szczepów niekrewniaczych zwierząt wywodzących się ze stad zamkniętych, są one akceptowane.

Opieka nad zwierzętami, żywienie oraz zaopatrzenie w wodę

Badania na zwierzętach prowadzone są zgodnie z przepisami krajowymi oraz uwzględniają zasady ludzkie i międzynarodowy rozwój w dziedzinie dobrostanu zwierząt.

Rygorystyczna kontrola warunków środowiskowych oraz technik właściwej opieki nad zwierzętami jest konieczna w celu uzyskania miarodajnych wyników. Czynniki takie, jak warunki przebywania zwierząt, choroby wewnętrzne, terapia aleniczna, zanieczyszczenia w pożywieniu, powietrze, woda, ściółka, oraz ogólne udogodnienia związane z opieką nad zwierzętami mogą w znacznym stopniu wpłynąć na wynik powtarzalnych badań. Ogólnie biorąc, powinno być znane działanie środków sterylizujących stosowanych w badaniach.

Pożywienie powinno spełniać wszelkie potrzeby pokarmowe badanych gatunków i nie powinno zawierać zanieczyszczeń, które mogłyby wpłynąć na wyniki badania. Pożywienie i woda powinny być dostępne bez ograniczeń z wymianą pożywienia co najmniej raz w tygodniu. Obecnie wykorzystuje się trzy rodzaje pożywienia: konwencjonalne, syntetyczne oraz różnorodne.

Niezależnie od rodzaju wybranego pożywienia, dostawca musi określić, przez okresowy monitoring wartości odżywczej, poziom substancji w pożywieniu podstawowym oraz dostarczyć te informacje do laboratorium wraz z partią danej paszy. Wskazane jest poznanie wpływu reżimu dietetycznego na metabolizm, a także rozwój nowotworów i długość życia zwierząt.

Ponadto analizy kontrolne podstawowego pożywienia mogą być przeprowadzane przez laboratorium badawcze zarówno dla części składowych pożywienia, jak i substancji niezamierzonych, włączając czynniki rakotwórcze. Po dokonaniu powyższego, wyniki analiz powinny zostać zachowane i włączone do sprawozdania końcowego dotyczącego każdej substancji testowej.

Pospolite składniki pożywienia, o których wiadomo, że wpływają rakotwórczo (np. antyutleniacze, nienasycone kwasy tłuszczowe, selen), nie powinny być obecne w szkodliwych stężeniach. Potencjalny wpływ kilku pospolitych substancji występujących w pożywieniu na ocenę stopnia rakotwórczości wymaga zwrócenia szczególnej uwagi na obecność w pożywieniu pozostałości pestycydów, związków węglowodorów chlorowanych, aromatycznych węglowodorów wielopierścieniowych, estrogenów, metali ciężkich, nitrozoaminy i mykotoksyn.

W przypadku podawania testowej substancji w wodzie lub pożywieniu, niezbędne są badania stabilności. Właściwie przeprowadzone badania stabilności i jednorodności, przed rozpoczęciem powtarzających się badań, powinny zostać wykorzystane w celu ustalenia częstotliwości przygotowywania pożywienia i wymaganego monitoringu.

W przypadku sterylizacji pożywienia, skutki takich procedur związanych z substancją testową oraz składnikami pożywienia powinny być znane. Powinny zostać przeprowadzone wszelkie właściwe dostosowania.

W trakcie prowadzenia badań nad rakotwórczością badacze powinni być świadomi potencjalnej obecności substancji zanieczyszczających w wykorzystywanej wodzie. Woda przeznaczona do spożycia przez ludzi jest ogólnie w stanie zadowalającym, a informacje o jej składzie powinny być ogólnie dostępne.

Stężenie substancji testowej w pożywieniu może wymagać dostosowania z uwagi na wzrastanie zwierząt celem utrzymania w miarę stałej dawki substancji testowej odpowiedniej do wagi ciała.

Wartość odżywcza pożywienia kontrolnego oraz pożywienia testowego powinna być jak najbardziej zbliżona. A zatem należy rozważyć wartość odżywczą substancji testowej wmieszanej w pożywienie. Doświadczenie sugeruje, iż mało prawdopodobne jest, aby zawartość 5 % testowej substancji nieodżywczej w pożywieniu znacznie zakłócało wartość odżywczą pożywienia.

1. Badania inhalacyjne

Nie określono limitu badań ze względu na brak możliwości oznaczenia wartości granicznej jednorazowej ekspozycji przez drogi oddechowe.

2. Badania teratogenności

Metoda badawcza jest głównie skierowana na podawanie dawki drogą doustną. Odmiennie, można używać innych dróg w zależności od właściwości fizycznych substancji testowej lub prawdopodobnych dróg ekspozycji człowieka. W takich przypadkach metoda badawcza powinna być odpowiednio dostosowana, biorąc pod uwagę właściwe elementy 28-dniowych metod badawczych.

3. Toksykokinetyka

Badania toksykokinetyczne pomagają w interpretacji oraz ocenie danych toksyczności. Niniejsze badania mają na celu wyjaśnienie szczególnych aspektów toksyczności chemicznej, a wyniki mogą pomóc w dalszych badaniach nad toksycznością. Nie jest określone, że w każdym przypadku wszystkie parametry będą wymagały ustalenia. Jedynie w rzadkich przypadkach konieczne będzie przeprowadzenie pełnej kolejności badań toksykokinetycznych (absorpcja, ekskrecja, rozdział i metabolizm). Dla niektórych związków zmiana tej kolejności może być wskazana lub wystarczające może okazać się badanie dawki jednorazowej.

Definicje

Toksykokinetyka: | nauka o absorpcji, dystrybucji, metabolizmie i ekskrecji substancji testowych; |

Absorpcja: | proces (procesy) wprowadzania podawanych substancji do organizmu; |

Ekskrecja: | proces (procesy) usuwania z organizmu podawanej substancji i/lub jej metabolitów; |

Dystrybucja: | proces (procesy) dzielenia się wewnątrz organizmu podawanej substancji i/lub jej metabolity; |

Metabolizm: | proces (procesy) zmian strukturalnych podawanej substancji w organizmie przez reakcje enzymatyczne jak i nieenzymatyczne. |

4. Badania toksyczności ostrej i podostrej na drugim gatunku

Celem badań na drugim gatunku jest uzupełnienie wniosków wyciągniętych z badań na pierwszym gatunku.

W przypadku badań na drugim gatunku, opisana metoda badań może być wykorzystana lub dostosowana do mniejszej liczby zwierząt.

5. Badania płodności

W przypadku konieczności wykonania badania płodności trzeciego pokolenia, opisana metoda dla badania płodności drugiego pokolenia może zostać rozszerzona w celu objęcia nią trzeciego pokolenia.

6. Badania mutagenności

Dodatkowe badania mutagenności, włączając badania przesiewowe na rakotwórczość

W załączniku VIII do dyrektywy określono dodatkowe badania mutagenności lub badania przedprzesiewowe na rakotwórczość. Badania przedstawione w niniejszej sekcji mogą być ogólnie wykorzystywane celem zbadania każdego z aspektów.

Wstęp

Początkowa ocena aktywności mutagennej substancji składa się z opisu genowej (punktowej) mutacji bakterii oraz badania cytogenetycznego uszkodzenia komórek ssaków (in vitro lub in vivo); odpowiednie metody dla tych "podstawowych zestawów" badań zostały wcześniej opisane. Niniejsza sekcja dotyczy dodatkowych badań odpowiednich w celu weryfikacji i/lub rozszerzenia wyników otrzymanych w podstawowym zestawie, które mogą być wykorzystywane do wielu celów:

1. potwierdzenie wyników otrzymanych w podstawowym zestawie;

2. zbadanie punktów końcowych nie badanych w podstawowym zestawie;

3. zapoczątkowanie lub rozszerzenie badań in vivo.

Dla tych celów zakres opisanych badań obejmuje zarówno system eukariotyczny in vitro, jak i in vivo oraz rozszerzony zakres biologicznych punktów końcowych. Badania dostarczają informacji dotyczących punktów mutacji w organizmach bardziej złożonych niż bakteria wykorzystywana w podstawowym zestawie, oraz poszerzają zakres informacji dotyczących zdolności substancji do wywoływania aberracji chromosomowych.

Opisano również testy dotyczące punktów końcowych innych niż punkty mutacji i aberracji chromosomowych. Powyższe badania dostarczają informacji uzupełniających i mogą być stosowane odpowiednio w schematach badań.

Główną zasadą jest, że w przypadku rozważania dalszego programu badań mutagenności, dodatkowe badania powinny zostać zaprojektowane w celu dostarczenia istotnych dodatkowych informacji dotyczących wpływu substancji na mutagenność i/lub rakotwórczość.

Rzeczywiste badania, które mogą być właściwe w szczególnym przypadku, zależeć będą od wielu czynników, włączając chemiczne oraz fizyczne cechy substancji, wyniki początkowych testów bakteryjnych i cytogenetycznych, metaboliczny profil substancji, wyniki innych badań toksyczności oraz znane użycia substancji. Dlatego też ścisły harmonogram wyboru testów jest niewłaściwy ze względu na różnorodność czynników, które mogą wymagać rozważenia. Jakkolwiek, można kierować się niektórymi zasadami ogólnymi. Jeżeli badanie ma wynik pozytywny w zestawie podstawowym, dodatkowe badania powinny obejmować co najmniej jeden test umożliwiający wykrycie tego samego genetycznego punktu końcowego. Jeżeli oba testy w podstawowym zestawie były negatywne, test na mutacje genów, a także test na aberracje chromosomowe powinny zostać normalnie przeprowadzone jako dodatkowe badania. Właściwe jest również uzyskanie dodatkowych danych z testów wskaźnikowych (jak wyszczególniono poniżej).

Metody takich badań są zgrupowane poniżej, w oparciu o ich główny genetyczny punkt końcowy.

Badania mutacji genowych (punktowych)

W celu dalszego zbadania wpływu substancji związanego z produkcją mutacji genowych (punktowych), jedno lub inne badania opisane poniżej mogą okazać się właściwe:

a) przeniesienie lub odwrócenie badania mutacji, wykorzystując eukariotyczne drobnoustroje (Saccharomyces cerevisiae);

b) badania in vitro w celu zbadania mutacji przeniesionej do komórek ssaków;

c) test śmiertelności sprzężonej z recesywną płcią u Drosopbila melanogaster;

d) test mutacji komórki somatycznej in vivo: test plamkowy u myszy.

Badania nad aberracjami chromosomowymi

W celu dalszego zbadania wpływu substancji związanego z produkcją chromosomowych aberracji, właściwe może okazać się jedno lub więcej poniższych badań:

a) badania cytogenetyczne ssaków in vivo;

Analiza metafazalna in vivo komórek szpiku kostnego powinna zostać wzięta pod uwagę, jeżeli nie została zawarta w początkowej ocenie (badania "podstawowy zestaw"). Ponadto można wykonać cytogenetyczne badanie in vivo komórki zarodkowej;

b) badania cytogenetyczne komórek ssaków in vitro, jeżeli nie zostały zawarte w początkowej ocenie;

c) badania czynnika dominującego w odniesieniu do śmiertelności gryzoni;

d) badanie przenoszenia dziedziczności u myszy.

Badania wskaźnikowe wpływu na DNA

Dostępne metody dostarczają wskazówek dotyczących pewnych skutków wywieranych na DNA, ale nie mają mutagennego wpływu jako "punkt końcowy". Niniejsze badania mogą dostarczać informacji uzupełniających informacje otrzymane z badań mutagenności, i mogą być użyteczne w interpretacji takich badań. W przypadku konieczności przeprowadzenia niniejszych badań, właściwa może być jedna lub więcej z poniższych metod wykorzystujących eukariotyczne drobnoustroje komórek ssaków:

a) badanie rekombinacji genetycznej – Saccharomyces cerevisiae;

b) uszkodzenie i naprawa DNA – nieregularna synteza DNA – komórki ssaków (in vitro);

c) wymiana chromatyd siostrzanych w komórkach ssaków (in vitro).

Inne badania wskaźnikowe odnośnie do wpływu rakotwórczości

Dostępne są opisy przemiany komórek ssaków, które mierzą zdolność substancji do wywoływania zmian morfologicznych i związanych z zachowaniem w kultury komórkowej, które uważa się za powiązane ze złośliwymi przemianami in vivo. Do przemiany wykorzystywać można komórki różnego typu i kryteriów.

Ocena ryzyka skutków dziedziczności u ssaków

Istnieją dostępne metody mierzące skutki dziedziczności u ssaków wywoływane przez genowe (punktowe) mutacje (szczególne testy locus myszy [1]) lub dotyczące chromosomowych aberracji (testy przenoszenia dziedziczności u myszy). Takie metody mogą być wykorzystywane przy określaniu ewentualnego ryzyka genetycznego danej substancji w odniesieniu do człowieka. Jednakże z uwagi na złożoność takich badań oraz dużą ilość zwierząt potrzebną do ich przeprowadzenia, w szczególności w związku z szczególnymi testami locus, przed rozpoczęciem badań wymagane jest mocne uzasadnienie ich przeprowadzenia.

TEST PODCHRONICZNEJ TOKSYCZNOŚCI DOUSTNEJ

90-DNIOWE BADANIA DAWKOWANIA DOUSTNEGO Z WYKORZYSTANIEM GATUNKÓW GRYZONI

1. METODA

1.1. Wstęp

Patrz "Wprowadzenie ogólne" część B.

1.2. Definicje

Patrz "Wprowadzenie ogólne" część B.

1.3. Substancje odniesienia

Brak.

1.4. Zasada metody badawczej

Substancja testowa jest podawana codziennie, doustnie, w stopniowanych dawkach, kilku grupom zwierząt badanych, jedna dawka na grupę przez okres 90 dni. W okresie ekspozycji zwierzęta są obserwowane codziennie w celu wykrycia objawów toksyczności. Zwierzęta, które padną w czasie badania, poddawane są sekcji zwłok, a na końcu badania zwierzęta pozostałe przy życiu są zabijane i również poddawane sekcji zwłok.

1.5. Kryteria jakościowe

Brak.

1.6. Opis metody badawczej

Przygotowania

Zwierzęta podlegają warunkom przebywania i żywieniowym ustalonym do celów badania przez co najmniej 5 dni przed rozpoczęciem badania. Przed rozpoczęciem badania, młode zdrowe zwierzęta są losowo przydzielane do grup badanych i kontrolnych.

Substancja testowa może być podawana w pożywieniu, za pomocą dozownika, w postaci kapsułek lub w wodzie pitnej. Ta sama metoda podawania substancji testowej powinna być stosowana w odniesieniu do wszystkich zwierząt podczas całego okresu badania. W przypadku użycia jakiegokolwiek nośnika lub innych dodatków w celu usprawnienia dawkowania, należy upewnić się, iż nie powodują żadnych skutków toksyczności. Dane bazowe mogą być wykorzystane odpowiednio do potrzeb.

Warunki badania

Zwierzęta badane

Jeżeli nie ma przeciwwskazań, preferowanym gatunkiem jest szczur. Należy zastosować powszechnie wykorzystywane laboratoryjne szczepy młodych, zdrowych zwierząt, a podawanie dawki powinno rozpocząć się dokładnie przed rozpoczęciem szóstego tygodnia życia przez szczury, i w żadnym wypadku nie później niż po rozpoczęciu ósmego tygodnia życia. Na początku badań różnica w wadze wykorzystywanych zwierząt nie powinna przekraczać ± 20 % średniej wartości. W przypadku przeprowadzania testów podchroniczności doustnej jako wstęp do długoterminowych badań, ten sam gatunek i szczep powinny być wykorzystane w obu badaniach.

Liczba i płeć

Na każdym z poziomów dawkowania powinno być wykorzystanych co najmniej 20 zwierząt (10 samic i 10 samców). Samice powinny być nieciężarne i takie, które nie rodziły. Jeżeli planowane są zgony zwierząt w trakcie badania, liczba zwierząt badanych powinna zostać powiększona o liczbę odpowiadającą planowanej liczbie zgonów przed zakończeniem badań. Ponadto grupa satelitarna w ilości 20 zwierząt (10 zwierząt każdej płci) może zostać poddana działaniu wysokiej dawki przez okres 90 dni i obserwowana przez 28 dni po poddaniu czynnościom badawczym, pod względem odwracalności, odporności lub opóźnionego pojawienia się toksycznych skutków.

Poziomy dawek

Powinny zostać wykorzystane co najmniej trzy dawki i dawka kontrolna. Z wyjątkiem stosowania substancji testowej, zwierzęta grupy kontrolnej powinny być traktowane w identyczny sposób co podmioty grupy badanej. W przypadku użycia nośnika w celu usprawnienia dawkowania, grupa kontrolna otrzymuje dawkowanie za pośrednictwem nośnika tak jak grupa badana oraz otrzymuje taką samą ilość nośnika co grupa otrzymująca najwyższą dawkę. Najwyższa dawka powinna wywołać skutki toksyczności, ale nie powinna powodować, lub powodować niewiele przypadków wystąpienia śmiertelności. Najniższa dawka nie powinna wywoływać żadnych objawów toksyczności. W przypadku gdy przydatne jest rozważenie ekspozycji człowieka, najniższa dawka powinna ją przekraczać. Najlepiej byłoby, gdyby średnia dawka wywoływała minimalne dające się zaobserwować skutki toksyczności. W przypadku użycia więcej niż jednej średniej dawki, dawki powinny zostać rozszerzone w celu wywołania stopniowania skutków toksyczności.

W celu umożliwienia dokonania analizy wyników badań, jakiekolwiek przypadki śmiertelności w grupach otrzymujących niskie oraz średnie dawki, oraz w grupach kontrolnych powinny być nieliczne.

W przypadku podawania substancji testowej w pożywieniu, zarówno stałe stężenie pożywienia (ppm lub mg/kilogram pożywienia), jak i stała dawka w odniesieniu do wagi ciał zwierząt mogą być zastosowane; musi zostać określone alternatywne stosowanie. W przypadku substancji podawanej za pomocą dozownika, dawki powinny być podawane o podobnych porach każdego dnia. Dawki powinny być dostosowane do odpowiednich odstępów czasu (tygodniowo lub co dwa tygodnie) w celu utrzymania stałych dawek w odniesieniu do wagi ciał zwierząt.

Test graniczny

Jeżeli 90-dniowe badanie przeprowadzone zgodnie z metodą opisaną poniżej, przy jednej dawce w wysokości 1000 mg na kilogram wagi ciała na dzień, lub przy wyższej dawce związanej z możliwą ekspozycją człowieka, nie powoduje żadnych objawów toksyczności, dalsze badanie może być uznane za niepotrzebne. W odniesieniu do substancji o niskiej toksyczności istotne jest zapewnienie, że po podaniu tej substancji w pożywieniu, ilość oraz inne właściwości zawartej substancji testowej nie zakłócają zwykłych potrzeb żywieniowych.

Okres obserwacji

Wszystkie zwierzęta powinny być obserwowane codziennie, a objawowi toksyczności powinny być odnotowane podając czas ich rozpoczęcia, stopień oraz czas trwania. Czas zgonu oraz czas pojawienia się oraz czas zaniku objawów toksyczności powinny być odnotowane.

Procedura

Substancja testowa dawkowana jest zwierzętom najlepiej siedem dni w tygodniu przez okres 90 dni. Zwierzęta jakiejkolwiek grupy satelitarnej przeznaczone do obserwacji uzupełniających powinny być trzymane przez dalsze 28 dni bez podawania dawek w celu stwierdzenia odwracalności, lub odporności na skutki toksyczności.

Obserwacje zwierząt w klatkach powinny obejmować zmiany zachodzące na ich skórze i futrze, zmiany oczu i błony śluzowej, a także zmiany w układzie oddechowym, krążenia oraz autonomicznym i centralnym układzie nerwowym, aktywności somatomotorycznej oraz schematów zachowań. Raz w tygodniu należy dokonać pomiaru spożycia żywności (oraz spożycia wody jeżeli substancja testowa jest podawana w wodzie pitnej) oraz pomiaru wagi zwierząt.

Regularne obserwacje zwierząt są konieczne w celu zapewnienia, o ile to możliwe, że nie występują straty zwierząt na skutek takich przypadków, jak kanibalizm, autoliza tkanek lub nieodpowiednie umieszczenie. Na końcu okresu badania wszystkie zwierzęta pozostałe przy życiu z niesatelitarnej grupy badanej, zostają zabite i poddane sekcji zwłok. Zwierzęta konające powinny być usuwane i poddawane sekcji zwłok, kiedy zostanie to zauważone.

Wszystkie zwierzęta, włączając zwierzęta z grup kontrolnych, zwyczajowo poddawane są następującym badaniom:

a) badanie oftalmologiczne z wykorzystaniem oftalmoskopu lub podobnego sprzętu, powinno zostać przeprowadzone przed podaniem substancji testowej oraz przed zakończeniem badań, najlepiej na wszystkich zwierzętach, ale co najmniej na zwierzętach grupy najwyższego dawkowania i grupy kontrolnej. W przypadku wykrycia zmian w oczach należy przebadać wszystkie zwierzęta;

b) hematologia, włączając hematokryt, badanie stężenia hemoglobiny, badanie ilości krwinek czerwonych, całkowitej ilości krwinek białych i obraz białokrwinkowy, pomiar wskaźników krzepliwości krwi, takich jak czas krzepnięcia, czas protrombinowy, czas tromboplastynowy lub ilość płytek krwi powinien zostać przeprowadzony na końcu okresu badania;

c) powinno zostać przeprowadzone określenie klinicznej biochemii krwi na końcu okresu badania. Obszarami uważanymi za właściwe dla wszystkich badań są: równowaga elektrolityczna, metabolizm węglowodanów, funkcje wątroby i nerek. Wybór szczególnych badań będzie uzależniony od obserwacji sposobu działania substancji. Proponowane oznaczenia to: pomiar wapnia, fosforu, chlorku, sodu, potasu, stężenia glukozy na czczo (z zastosowaniem okresu wstrzymania podawania pożywienia odpowiednio do gatunku zwierzęcia), transaminaza pirogronianowo-glutaminowa surowicy [2], transaminaza szczawiowooctowoglutamylowa surowicy [3], dekarboksylazy ornityny, transpeptydaza gammaglutamylowa, mocznika azotu, albuminy, kreatyny krwi całkowitej bilirubiny oraz całkowitej surowicy białka. Inne ustalenia, które mogą być niezbędne do właściwej oceny toksykologicznej, obejmują analizy lipidów, hormonów, równowagę kwasowo-zasadową, czynności metahemoglobiny i cholinoesteraza. Dodatkowa biochemia kliniczna może być zastosowana w miarę potrzeb w celu rozszerzenia badania obserwowanych skutków;

d) analiza moczu nie jest wymagana jako badanie rutynowe, ale jedynie w przypadku spodziewanej lub obserwowanej toksyczności.

Jeżeli dane bazowe są niewystarczające, należy rozważyć określenie parametrów hematologicznych i biochemii klinicznej przed rozpoczęciem dawkowania.

Sekcja zwłok

Wszystkie zwierzęta powinny być poddane sekcji zwłok, która obejmuje badanie zewnętrznej powierzchni ciała, wszelkich otworów, jamy czaszkowej, klatki piersiowej i jamy brzusznej oraz ich zawartości. Wątroba, nerki, nadnercza i jądra powinny być zważone niezwłocznie po przeprowadzeniu sekcji w celu uniknięcia ich wyschnięcia.

Poniższe organy i tkanki powinny być zachowane w odpowiednim pojemniku w celu ewentualnego przyszłego badania histopatologicznego: wszystkie ogólne zmiany patologiczne, mózg, włączając części rdzenia/most, móżdżek i kora mózgowa, przysadka mózgowa, tarczyca/przytarczyce, tkanki grasicy, tchawica i płuca, serce, aorta (gruczoły ślinowe), wątroba, śledziona, nerki, nadnercza, trzustka, gruczoły płciowe, macica (dodatkowe organy genitaliów), (skóra), przełyk, żołądek, dwunastnica, jelito czcze, talerz, jelito ślepe, okrężnica, odbytnica, pęcherz moczowy, przedstawiciel pachowych węzłów chłonnych, (żeńskie gruczoły malene), (umięśnienie uda), nerwy obwodowe, mostek wraz ze szpikiem kostnym, (oczy), (kość udowa, włączając powierzchnie stawowe), (rdzeń kręgowy w trzech poziomach – szyjny, śródpiersiowy i lędźwiowy) i (gruczoły łzowe). Tkanki wymienione w nawiasach będą wymagały przebadania w przypadku powstania objawów toksyczności lub zaangażowania danych organów.

Badania histopatologiczne

a) Pełna histopatologia powinna zostać przeprowadzona na organach i tkankach zwierząt w grupie kontrolnej i grupie najwyższego dawkowania.

b) Wszelkie uszkodzenia powinny zostać zbadane.

c) Organy docelowe w innych grupach dawkowania powinny zostać zbadane.

d) Płuca zwierząt w grupach niskiego i średniego dawkowania powinny zostać poddane badaniu histopatologicznemu w celu stwierdzenia objawów infekcji, ponieważ niniejsze badanie dostarcza dogodnej analizy stanu zdrowia zwierząt. Należy również rozważyć badanie histopatologiczne wątroby i nerek we wspomnianych grupach. Przeprowadzanie dalszych badań histopatologicznych nie musi być wymagane jako rutynowe w odniesieniu do zwierząt w tych grupach, ale zawsze musi być przeprowadzane na organach, które wykazują zmiany patologiczne w grupie najwyższego dawkowania.

e) W przypadku wykorzystania grupy satelitarnej histopatologia powinna zostać przeprowadzona na tkankach i organach zidentyfikowanych jako wykazujące skutki, w grupach poddanych badaniu.

2. DANE

Dane powinny zostać podsumowane w formie tabeli wskazującej liczbę zwierząt każdej badanej grupy na początku badań, liczbę zwierząt wykazujących zmiany patologiczne, oraz procent zwierząt wykazujących każdy z rodzajów zmian. Wyniki powinny zostać ocenione właściwą metodą statystyczną. Można zastosować jakąkolwiek uznawaną metodę statystyczną.

3. SPRAWOZDANIE

3.1. Sprawozdanie z badań

Sprawozdanie z badań zawiera, jeżeli możliwe, następujące informacje:

- gatunek, szczep, źródło, warunki środowiskowe, pożywienie,

- warunki badania,

- dawkowanie, (włączając nośnik, jeżeli został użyty) oraz ich stężenie,

- dane dotyczące reakcji na toksyczność ze względu na płeć i dawkę,

- brak skutków,

- czas zgonu podczas badań lub informacja, czy zwierzęta przetrwały do czasu zakończenia badań,

- opis skutków toksyczności lub innych,

- okres obserwacji każdego nietypowego objawu i późniejszego postępowania,

- dane dotyczące wagi ciała i pożywienia,

- wyniki badań oftalmologicznych,

- zastosowane badania hematologiczne oraz wszystkie wyniki,

- zastosowane kliniczne badania biochemiczne oraz wszystkie wyniki (włączając wyniki wszelkich analiz moczu),

- wyniki badań sekcji zwłok,

- szczegółowy opis wszystkich wyników badań histopatologicznych,

- statystyczne ujęcie wyników, jeżeli to możliwe,

- analiza wyników,

- interpretacja wyników.

3.2. Analiza i interpretacja

Patrz "Wprowadzenie ogólne" część B.

4. ODNIESIENIA

Patrz "Wprowadzenie ogólne" część B.

BADANIE PODCHRONICZNEJ TOKSYCZNOŚCI DOUSTNEJ

90-DNIOWE BADANIA DAWKOWANIA DOUSTNEGO Z WYKORZYSTANIEM GATUNKÓW INNYCH NIŻ GRYZONIE

1. METODA

1.1. Wstęp

Patrz "Wprowadzenie ogólne", Część B.

1.2. Definicje

Patrz "Wprowadzenie ogólne", Część B.

1.3. Substancje odniesienia

Brak.

1.4. Zasada metody badawczej

Substancja testowa jest podawana codziennie, doustnie, w stopniowanych dawkach, kilku grupom zwierząt badanych (inne niż gryzonie), jedna dawka na grupę przez okres 90 dni. W okresie podawania dawki zwierzęta są codziennie obserwowane celem wykrycia objawów toksyczności. Zwierzęta, które padną w czasie trwania badania, poddawane są sekcji zwłok, a na końcu badania zwierzęta pozostałe przy życiu są zabijane i również poddawane sekcji zwłok.

1.5. Kryteria jakościowe

Brak.

1.6. Opis metody badawczej

Przygotowania

Zwierzęta podlegają warunkom przebywania i żywieniowym ustalonym do celów badania przez co najmniej 5 dni przed rozpoczęciem badania. Przed rozpoczęciem badania młode zdrowe zwierzęta są losowo przydzielane do grup badanych i kontrolnych.

Substancja testowa może być podawana w pożywieniu, przy użyciu dozownika, w postaci kapsułek lub w wodzie pitnej. Ta sama metoda podawania substancji testowej powinna być stosowana do wszystkich zwierząt w trakcie całego okresu badania. W przypadku użycia jakiegokolwiek nośnika lub innych dodatków w celu usprawnienia dawkowania, należy upewnić się, iż nie powodują żadnych skutków toksyczności. Dane bazowe mogą być wykorzystane odpowiednio do potrzeb.

Warunki badania

Zwierzęta badane

Powszechnie wykorzystywanym gatunkiem innym niż gryzonie jest pies, najlepiej o określonej rasie. Wykorzystywać można również inne gatunki. Należy wykorzystywać młode zdrowe zwierzęta i, w przypadku psa, dawkowanie powinno rozpocząć się najlepiej w czwartym do szóstym miesiącu życia, a najpóźniej do dziewiątego miesiąca życia zwierzęcia. W przypadku przeprowadzania testów podchroniczności doustnej jako wstęp do długoterminowych badań, ten sam gatunek/rasę należy wykorzystać w obu badaniach.

Liczba i płeć

Na każdym z poziomów dawkowania powinno być wykorzystanych co najmniej osiem zwierząt (cztery samice i cztery samce). Liczba zwierząt przy zakończeniu badań musi być właściwa w celu uzyskania miarodajnej oceny skutków toksyczności.

Poziomy dawek

Wymagane są co najmniej trzy dawki i dawka kontrolna. Oprócz stosowania substancji testowej, zwierzęta grupy kontrolnej należy traktować w identyczny sposób co podmioty grupy badanej. Najwyższa dawka powinna doprowadzić do skutków toksyczności, ale nie powinna spowodować przypadków śmiertelności. Najniższa dawka nie powinna powodować żadnych objawów toksyczności. W przypadku gdy przydatne jest rozważenie ekspozycji człowieka, najniższa dawka powinna ją przekraczać. Najlepiej byłoby, gdyby średnia dawka wywoływała minimalne dające się zaobserwować skutki toksyczności. W przypadku użycia więcej niż jednej średniej dawki, dawki powinny zostać rozszerzone w celu wywołania stopniowania skutków toksyczności.

W grupach otrzymujących niskie oraz średnie dawki, oraz w grupach kontrolnych, nie powinny wystąpić jakiekolwiek przypadki śmiertelności.

W przypadku podawania substancji testowej w pożywieniu, zarówno stałe stężenie pożywienia (ppm lub mg/kilogram pożywienia), jak i stała dawka w odniesieniu do wagi ciał zwierząt mogą być zastosowane; alternatywne użycie musi zostać określone.

W przypadku substancji podawanej bezpośrednio, np. w kapsułkach, dawka powinna być podawana o podobnych porach dnia i jeżeli konieczne, dostosowana do odpowiednich tygodniowych odstępów czasu w celu utrzymania stałej dawki w odniesieniu do wagi ciał zwierząt.

W przypadku stosowania testu podchroniczności jako wstęp do długotrwałych badań, w obu badaniach powinna być zazwyczaj stosowane podobne pożywienie.

Test graniczny

Jeżeli 90-dniowe badanie przeprowadzone zgodnie z metodą opisaną poniżej, przy jednej dawce w wysokości 1000 mg/kilogram wagi ciała na dzień, lub przy wyższej dawce związanej z ewentualną ekspozycją człowieka, nie daje żadnych dowodów toksyczności, dalsze badanie może być uznane za niepotrzebne. W odniesieniu do substancji o niskiej toksyczności istotne jest zapewnienie, że po podaniu takiej substancji w pożywieniu, ilość oraz inne właściwości zawartej substancji testowej nie zakłócą normalnych potrzeb żywieniowych.

Okres obserwacji

Wszystkie zwierzęta powinny być obserwowane codziennie, a objawy toksyczności odnotowane, włączając czas ich rozpoczęcia, stopień oraz czas trwania. Czas zgonu i czas wystąpienia oraz zaniku objawów toksyczności powinny być odnotowane.

Procedura

Substancja testowa podawana jest zwierzętom najlepiej siedem dni w tygodniu przez okres 90 dni. Jednakże opierając się głównie na względach praktycznych, w przypadku podawania substancji inaczej niż w pożywieniu, dawkowanie przez pięć dni w tygodniu uznaje się za dopuszczalne.

Obserwacje powinny obejmować, ale nie wyłącznie, zmiany zachodzące na skórze i futrze zwierząt, zmiany oczu i błony śluzowej, a także zmiany układu oddechowego, krążenia oraz autonomicznego i centralnego układu nerwowego, czynności somatomotoryczne oraz schematy zachowań. Powinny być dokonywane pomiary spożycia żywności (oraz spożycia wody, jeżeli substancja testowa jest podawana w wodzie pitnej) oraz pomiary wagi zwierząt raz w tygodniu.

Dokładne badania kliniczne zwierząt powinny być przeprowadzane codziennie wraz z właściwymi działaniami podjętymi w celu zminimalizowania strat na zwierzętach związanych z badaniami. Na końcu okresu ekspozycji wszystkie zwierzęta pozostałe przy życiu zostają zabite i poddane sekcji zwłok. Zwierzęta konające powinny być usuwane i poddawane sekcji zwłok po stwierdzeniu takiego faktu.

Wszystkie zwierzęta, włączając zwierzęta z grup kontrolnych, zwyczajowo poddawane są następującym badaniom:

a) badanie oftalmologiczne z wykorzystaniem oftalmoskopu lub podobnego sprzętu, powinno zostać wykonane przed podaniem substancji testowej oraz zakończeniem badań, najlepiej na wszystkich zwierzętach, a co najmniej na zwierzętach z grupy najwyższej dawki i grupy kontrolnej. W przypadku wykrycia zmian w oczach należy przebadać wszystkie zwierzęta;

b) hematologia, włączając hematokryt, badanie stężenia hemoglobiny, badanie ilości krwinek czerwonych, całkowitej ilości krwinek białych i obraz białokrwinkowy, pomiar wskaźników krzepliwości krwi, takich jak czas krzepnięcia, czas protrombinowy, czas tromboplastynowy lub liczba płytek krwi powinny zostać przeprowadzone na początku okresu badania, następnie w odstępach miesięcznych albo w środku okresu badania i na zakończenie okresu badania;

c) powinno zostać przeprowadzone oznaczenie klinicznej biochemii krwi na początku okresu badania, a następnie w odstępach miesięcznych albo w środku okresu badania i na zakończenie okresu badania. Obszarami uważanymi za właściwe dla wszystkich badań są: równowaga elektrolityczna, metabolizm węglowodanów, funkcje wątroby i nerek. Wybór szczególnych badań uzależniony będzie od obserwacji formy i działania substancji. Sugerowane ustalenia to: pomiar wapnia, fosforu, chlorku, sodu, potasu, stężenie glukozy na czczo (z okresem wstrzymania podawania pożywienia odpowiednim dla gatunku zwierzęcia/rasy), transaminaza pirogronianowo-glutaminowa surowicy [4], transaminaza szczawiowooctowoglutamylowa surowicy [5], dekarboksylazy ornityny, transpeptydaza gammaglutamylowa, mocznika azotu, albuminy, kreatyny krwi całkowitej bilirubiny oraz całkowitej surowicy białka. Inne ustalenia, które mogą być niezbędne do właściwej oceny toksykologicznej obejmują analizy lipidów, hormonów, równowagi kwasowo-zasadowej, czynności metahemoglobiny i cholinoesteraza. Dodatkowa biochemia kliniczna może zostać zastosowana w miarę potrzeb, w celu rozszerzenia badań w odniesieniu obserwowanych skutków. Gatunki inne niż gryzonie powinny być głodzone przez okres (nie dłuższy niż 24 godziny) przed pobraniem próbek krwi;

d) analiza moczu nie jest wymagana jako badanie rutynowe ale jedynie w przypadku spodziewanej lub obserwowanej toksyczności.

Sekcja zwłok

Wszystkie zwierzęta powinny być poddane sekcji zwłok, która obejmuje badanie zewnętrznej powierzchni ciała, wszelkich otworów, jamy czaszkowej, klatki piersiowej i jamy brzusznej oraz ich zawartości. Wątroba, nerki, nadnercza, tarczyca (wraz z przytarczycami) oraz jądra powinny być zważone niezwłocznie po przeprowadzeniu sekcji w celu uniknięcia wyschnięcia.

Poniższe organy i tkanki powinny być zachowane w odpowiednim pojemniku w celu ewentualnego przyszłego badania histopatologicznego: wszystkie zmiany patologiczne, mózg – włączając części rdzenia/most, móżdżek i kora mózgowa, przysadka mózgowa, tarczyca/przytarczyce, tkanki grasicy, (tchawica), płuca, serce, aorta, gruczoły ślinowe, wątroba, śledziona, nerki, nadnercza, trzustka, gruczoły płciowe, macica (dodatkowe organy genitaliów), (skóra), woreczek żółciowy, przełyk, żołądek, dwunastnica, jelito czcze, talerz, jelito ślepe, okrężnica, odbytnica, pęcherz moczowy, przedstawiciel pachowych węzłów chłonnych, (żeńskie gruczoły malene), (umięśnienie uda), nerwy obwodowe, (oczy), mostek wraz ze szpikiem kostnym, (kość udowa, włączając powierzchnie stawowe) i (rdzeń kręgowy w trzech poziomach – szyjny, śródpiersiowy i lędźwiowy). Tkanki wymienione w nawiasach będą wymagały przebadania w przypadku powstania objawów toksyczności lub organów, na które było skierowane działanie substancji testowej.

Badanie histopatologiczne

Pełna histopatologia powinna zostać przeprowadzona na organach i tkankach zwierząt w grupie kontrolnej i w grupie najwyższego dawkowania. Dalsze badania histopatologiczne w grupach otrzymujących inne dawki powinny być przeprowadzone na organach wykazujących zmiany patologiczne w grupie wysokiego dawkowania lub w odniesieniu do których kliniczne obserwacje wskazują na taką potrzebę.

2. DANE

Dane powinny zostać podsumowane w formie tabeli, wskazującej liczbę zwierząt każdej badanej grupy na początku badań, liczbę zwierząt wykazujących zmiany patologiczne, rodzaje zmian oraz procent zwierząt wykazujących każdy z rodzajów zmian. Wyniki powinny zostać oszacowane właściwą metodą statystyczną. Można zastosować każdą uznaną metodę statystyczną.

3. SPRAWOZDANIE

3.1. Sprawozdanie z badań

Sprawozdanie z badań zawiera, jeżeli możliwe, następujące informacje:

- gatunek lub szczep, źródło, warunki środowiska, pożywienie,

- warunki badania,

- dawkowanie, (włączając nośnik, jeżeli został użyty) oraz jego stężenie,

- dane dotyczące reakcji na toksyczność ze względu na płeć i dawkę,

- brak skutków w przypadkach gdy to możliwe,

- czas zgonu podczas badań lub informacja o tym, czy zwierzęta przetrwały do czasu ich zakończenia,

- opis skutków toksyczności lub innych (ze szczególną uwagą odnośnie do wyników badań klinicznych),

- okres obserwacji każdego nietypowego objawu i późniejszego postępowania,

- dane dotyczące wagi ciała i pożywienia,

- wyniki badań oftalmologicznych,

- zastosowane badania hematologiczne oraz wszystkie wyniki,

- zastosowane kliniczne badania biochemiczne oraz wszystkie wyniki (włączając wyniki wszelkich analiz moczu),

- wyniki badań sekcji zwłok,

- szczegółowy opis wszystkich wyników badań histopatologicznych,

- statystyczne ujęcie wyników, odpowiednio do potrzeb,

- analiza wyników,

- interpretacja wyników.

3.2 Analiza i interpretacja

Patrz "Wprowadzenie ogólne", część B.

4. ODNIESIENIA

Patrz "Wprowadzenie ogólne" część B.

BADANIE PODCHRONICZNEJ TOKSYCZNOŚCI SKÓRY

90-DNIOWE BADANIA POWTARZANEGO DAWKOWANIA NA SKÓRZE Z WYKORZYSTANIEM GATUNKÓW GRYZONI

1. METODA

1.1. Wstęp

Patrz "Wprowadzenie ogólne", część B.

1.2. Definicje

Patrz "Wprowadzenie ogólne", część B.

1.3. Substancje odniesienia

Brak.

1.4. Zasada metody badawczej

Substancja testowa jest nanoszona codziennie na skórę, w stopniowanych dawkach, kilku grupom zwierząt badanych, jedna dawka na grupę przez okres 90 dni. W okresie podawania dawki zwierzęta obserwowane są codziennie celem wykrycia objawów toksyczności. Zwierzęta, które padną w czasie trwania badania, poddawane są sekcji zwłok, a na zakończenie badania, zwierzęta pozostałe przy życiu są zabijane i również poddawane sekcji zwłok.

1.5. Kryteria jakościowe

Brak.

1.6. Opis metody badawczej

Przygotowania

Zwierzęta podlegają warunkom przebywania i żywieniowym ustalonym do celów badania przez co najmniej 5 dni przed rozpoczęciem badania. Przed rozpoczęciem badania młode zdrowe zwierzęta są losowo przydzielane do grup badanych i kontrolnych. Tuż przed rozpoczęciem badania futro zostaje ostrzyżone w części grzbietowej tułowia badanych zwierząt. Można zastosować golenie, ale powinno być przeprowadzone około 24 godziny przed rozpoczęciem badania. Ponowne strzyżenie lub golenie jest zazwyczaj potrzebne w przybliżeniu co tydzień. Podczas strzyżenia lub golenia futra należy uważać, aby nie otrzeć skóry. Nie mniej niż 10 % powierzchni skóry powinno zostać oczyszczone w celu podania substancji testowej. Należy uwzględnić wagę zwierząt w chwili podjęcia decyzji o powierzchni oczyszczanej skóry oraz o powierzchni jej pokrycia. Badając substancje stałe, które mogą być ścierane w odpowiednich przypadkach, substancję testową powinno się odpowiednio nawilżać wodą lub, w miarę potrzeby, za pomocą odpowiedniego nośnika w celu zapewnienia dobrego kontaktu ze skórą. Płynne substancje testowe na ogół są aplikowane nierozcieńczone. Substancja aplikowana jest zasadniczo przez pięć do siedmiu dni w tygodniu.

Warunki badania

Zwierzęta badane

Wykorzystywać można dorosłe szczury, króliki lub świnki morskie. W chwili rozpoczęcia badania rozpiętość różnicy wagowej powinna wynosić ± 20 % wagi średniej. W przypadku przeprowadzania podchronicznych badań na skórze jako badań wstępnych do badań długoterminowych, ten sam gatunek i szczep powinny być wykorzystane w obu badaniach.

Liczba i płeć

Co najmniej 20 zwierząt (10 samic i 10 samców) ze zdrową skórą powinno być wykorzystanych na każdym z poziomów dawek. Samice powinny być nieciężarne i takie, które nie rodziły. Jeżeli planowane są zgony zwierząt, ich liczba powinna zostać powiększona o liczbę zwierząt planowanych do uśmiercenia przed zakończeniem badań. Ponadto grupa satelitarna w ilości 20 zwierząt (10 zwierząt każdej płci) może zostać poddana wysokiej dawce przez okres 90 dni i obserwowana pod względem odwracalności, odporności, lub opóźnionego wystąpienia toksycznych skutków przez 28 dni po przeprowadzeniu czynności badawczych.

Poziomy dawek

Powinny zostać wykorzystane co najmniej trzy poziomy dawek łącznie z dawką kontrolną lub kontrolą nośnika, jeżeli jest stosowany. Okres ekspozycji na substancję powinien wynosić co najmniej sześć godzin dziennie. Substancję należy stosować o podobnych porach każdego dnia, a ilość stosowanej substancji dostosowana jest do odpowiednich odstępów czasu (tygodniowych lub dwutygodniowych), w celu utrzymania stałej dawki w odniesieniu do wagi ciała zwierząt. Oprócz stosowania substancji testowej, zwierzęta grupy kontrolnej powinny być traktowane w identyczny sposób, co obiekty grupy badanej. W przypadku użycia nośnika w celu usprawnienia dawkowania, grupa kontrolna przyjmuje dawki w ten sam sposób, co grupy badane, oraz otrzymuje tę samą ilość nośnika, co ilość podawana grupie otrzymującej najwyższą dawkę. Najwyższa dawka powinna wywołać objawy toksyczności ale nie powinna powodować, lub powodować niewiele przypadków śmiertelności. Najniższa dawka nie powinna powodować żadnych objawów toksyczności. W przypadku rozważenia ekspozycji człowieka, najniższa dawka powinna ją przekraczać. Najlepiej było by gdyby średnia dawka wywoływała minimalne, dające się zaobserwować skutki toksyczności. W przypadku użycia więcej niż jednej średniej dawki, należy rozszerzyć stosowane poziomy dawek w celu wywołania stopniowania skutków toksyczności. W grupach otrzymujących niskie oraz średnie dawki, oraz w grupach kontrolnych, jakiekolwiek przypadki śmiertelności powinny być nieliczne w celu umożliwienia dokonania miarodajnej oceny wyników badań.

W przypadku gdy aplikowanie substancji testowej powoduje poważne podrażnienia skóry, stężenie powinno zostać obniżone, co może doprowadzić do zmniejszenia lub braku innych objawów toksyczności w grupie najwyższego dawkowania. Jeżeli skóra została poważnie uszkodzona, konieczne może okazać się zakończenie bieżących badań i podjęcie nowych badań z niższymi stężeniami.

Test graniczny

Jeżeli wstępne badanie przy dawce w wysokości 1000 mg/kilogram, lub przy wyższej dawce związanej z ewentualną ekspozycją człowieka, nie wywołuje żadnych objawów toksyczności, dalsze badanie może być uznane za niepotrzebne.

Okres obserwacji

Zwierzęta badane powinny być codziennie obserwowane w celu wykrycia objawów toksyczności. Czas zgonu oraz czas pojawienia się i zaniku objawów toksyczności należy odnotować.

Procedura

Zwierzęta powinny zostać umieszczone w osobnych klatkach. Zwierzęta należy poddać działaniu substancji testowej najlepiej siedem dni w tygodniu, przez okres 90 dni.

Zwierzęta z grup satelitarnych przeznaczone do obserwacji uzupełniających powinny być trzymane przez dodatkowy okres 28 dni bez podawania jakichkolwiek substancji w celu stwierdzenia regeneracji lub odporności na skutki toksyczności. Czas ekspozycji powinien wynosić sześć godzin dziennie.

Substancja testowa powinna być aplikowana w sposób jednolity na powierzchni, która stanowi około 10 % ogólnej powierzchni ciała. W odniesieniu do substancji wysokotoksycznych, pokryty obszar powierzchni ciała może być mniejszy, ale pozostała powierzchnia powinna być pokryta tak cienką i jednolitą warstwą jak to możliwe.

W czasie ekspozycji substancja testowa wchodzi w kontakt ze skórą za pomocą porowatego opatrunku z gazy i niedrażniącej taśmy. Następnie badane miejsce powinno być w odpowiedni sposób okryte w celu utrzymania opatrunku z gazy oraz substancji testowej i zapewnienia, że zwierzę nie będzie w stanie spożyć substancji testowej. W celu zapobieżenia spożycia substancji testowej mogą zostać zastosowane środki zabezpieczające, ale całkowite unieruchomienie nie jest zalecaną metodą.

Na zakończenie okresu ekspozycji pozostała substancja testowa powinna zostać usunięta, w przypadku gdy to możliwe, za pomocą wody lub innej właściwej metody oczyszczania skóry.

Wszystkie zwierzęta powinny być obserwowane codziennie, a objawy toksyczności powinny być odnotowane, włączając porę ich rozpoczęcia, stopień oraz czas trwania. Obserwacje zwierząt w klatkach powinny obejmować zmiany zachodzące na ich skórze i futrze, zmiany oczu i błony śluzowej, a także zmiany układu oddechowego, krążenia oraz autonomicznego i centralnego układu nerwowego, czynności somatomotorycznych oraz schematów zachowań. Powinny być dokonywane pomiary spożycia żywności oraz pomiary wagi ciała zwierząt raz w tygodniu. Regularne obserwacje zwierząt są konieczne w celu zapewnienia, że nie dochodzi do strat na zwierzętach w wyniku takich przypadków jak kanibalizm, autoliza tkanek lub nieprawidłowe umieszczenie. Na końcu okresu badania wszystkie zwierzęta pozostałe przy życiu z niesatelitarnej grupy badanej, zostają zabite i poddane sekcji zwłok. Zwierzęta konające powinny być usuwane i poddawane sekcji zwłok po stwierdzeniu takiego faktu.

Wszystkie zwierzęta, włączając zwierzęta z grup kontrolnych, zwyczajowo poddawane są następującym badaniom:

a) Badanie oftalmologiczne z wykorzystaniem oftalmoskopu lub podobnego sprzętu, powinno zostać przeprowadzone przed zastosowaniem substancji testowej oraz zakończeniem badań, najlepiej na wszystkich zwierzętach, a co najmniej na zwierzętach z grupy najwyższej dawki i grupy kontrolnej. W przypadku wykrycia zmian w oczach należy przebadać wszystkie zwierzęta.

b) Hematologia, włączając hematokryt, badanie stężenia hemoglobiny, ilości krwinek czerwonych, ogólnej ilości krwinek białych i obraz białokrwinkowy, pomiar wskaźników krzepliwości krwi, takich jak czas krzepnięcia, czas protrombinowy, czas tromboplastynowy czy ilość płytek krwi, powinny zostać zbadane na końcu okresu badania.

c) Powinno zostać przeprowadzone oznaczenie klinicznej biochemii krwi na końcu okresu badania. Obszarami zainteresowania uważanymi za właściwe dla wszystkich badań są: równowaga elektrolityczna, metabolizm węglowodanów, funkcje wątroby i nerek. Wybór szczególnych badań będzie uzależniony od obserwacji formy i działania substancji. Sugerowane ustalenia to: pomiar wapnia, fosforu, chlorku, sodu, potasu, stężenie glukozy na czczo (z okresem głodzenia stosownym do gatunku zwierzęcia), transaminaza pirogronianowo-glutaminowa surowicy [6], transaminaza szczawiowooctowoglutamylowa surowicy [7], dekarboksylazy ornityny, transpeptydaza gammaglutamylowa, mocznika azotu, albuminy, kreatyny krwi całkowitej bilirubiny oraz całkowitej surowicy białka.

Inne ustalenia, które mogą być niezbędne do właściwej analizy toksykologicznej, obejmują badania lipidów, hormonów, równowagi kwasowo-zasadowej, czynności metahemoglobiny i cholinoesteraza. Dodatkowa biochemia kliniczna może zostać zastosowana w miarę potrzeby w celu rozszerzenia badań odnośnie do obserwowanych skutków.

d) Analiza moczu nie jest wymagana jako badanie rutynowe, ale jedynie w przypadku spodziewanej lub obserwowanej toksyczności.

Jeżeli dane bazowe są niewłaściwe, należy zwrócić uwagę na określenie parametrów hematologicznych i klinicznej biochemii przed rozpoczęciem dawkowania.

Całkowita sekcja zwłok

Wszystkie zwierzęta powinny być poddane całkowitej sekcji zwłok, która obejmuje badanie zewnętrznej powierzchni ciała, wszelkich otworów, jamy czaszkowej, klatki piersiowej i jamy brzusznej oraz ich zawartości. Wątroba, nerki, nadnercza oraz jądra powinny być zważone niezwłocznie po przeprowadzeniu sekcji w celu uniknięcia wyschnięcia. Poniższe organy i tkanki powinny być zachowane w odpowiednim pojemniku w celu ewentualnego przyszłego badania histopatologicznego: wszelkie zmiany patologiczne, mózg – włączając części rdzenia/most, móżdżek i kora mózgowa, przysadka mózgowa, tarczyca/przytarczyca, tkanki grasicy, (tchawica), płuca, serce, aorta, gruczoły ślinowe, wątroba, śledziona, nerki, nadnercza, trzustka, gruczoły płciowe, macica, dodatkowe organy genitaliów, woreczek żółciowy (jeżeli obecny), przełyk, żołądek, dwunastnica, jelito czcze, talerz, jelito ślepe, okrężnica, odbytnica, pęcherz moczowy, przedstawiciel pachowych węzłów chłonnych, (żeńskie gruczoły malene), (umięśnienie uda), nerwy obwodowe, (oczy), (mostek wraz ze szpikiem kostnym), (kość udowa, włączając powierzchnie stawowe), i (rdzeń kręgowy w trzech poziomach – szyjny, śródpiersiowy i lędźwiowy) i (oczodołowe gruczoły łzowe). Tkanki wymienione w nawiasach będą wymagały przebadania w przypadku powstania objawów toksyczności lub zaangażowania danych organów.

Badania histopatologiczne

a) Pełna histopatologia powinna zostać przeprowadzona na normalnej i badanej skórze oraz na organach i tkankach zwierząt w grupie kontrolnej i grupie najwyższego dawkowania.

b) Wszelkie zmiany patologiczne powinny zostać zbadane.

c) Organy docelowe działania substancji w grupach innego dawkowania powinny zostać zbadane.

d) W przypadku gdy wykorzystywane są szczury, płuca zwierząt w grupach niskiego i średniego dawkowania powinny zostać poddane badaniu histopatologicznemu w celu stwierdzenia dowodów infekcji, ponieważ badanie to dostarcza dogodnej analizy stanu zdrowia zwierząt. Przeprowadzanie dalszych badań histopatologicznych nie musi być wymagane jako rutynowe w odniesieniu do zwierząt w tych grupach, ale zawsze musi być przeprowadzane na organach, które wykazują objawów zmian patologicznych w grupie najwyższego dawkowania.

e) W przypadku wykorzystywania grupy satelitarnej, histopatologia powinna zostać przeprowadzona na tkankach i organach zidentyfikowanych jako te wykazujące skutki w grupach poddanych badaniu.

2. DANE

Dane powinny zostać podsumowane w formie tabeli, wykazującej liczbę zwierząt każdej badanej grupy na początku badań, liczbę zwierząt wykazujących zmiany patologiczne, rodzaj zmian oraz procent zwierząt wykazujących każdy z rodzajów zmian. Wyniki powinny zostać oszacowane właściwą metodą statystyczną. Można zastosować każdą uznaną metodę statystyczną.

3. SPRAWOZDANIE

3.1. Sprawozdanie z badań

Sprawozdanie z badań zawiera, w miarę możliwości, następujące informacje:

- gatunek lub szczep, źródło, warunki środowiska, pożywienie,

- warunki badania,

- dawkowanie (włączając nośnik, jeżeli został użyty) oraz jego stężenie,

- dane dotyczące reakcji na toksyczność ze względu na płeć i dawkę,

- brak skutków,

- czas zgonu podczas badań lub informacja o tym, czy zwierzęta przetrwały do czasu ich zakończenia,

- opis skutków toksyczności lub innych,

- okres obserwacji każdego nietypowego objawu i późniejszego postępowania,

- brak skutków,

- dane dotyczące wagi ciała i pożywienia,

- wyniki badań oftalmologicznych,

- zastosowane badania hematologiczne oraz wszystkie wyniki,

- zastosowane kliniczne badania biochemiczne oraz wszystkie wyniki (włączając wyniki wszelkich analiz moczu),

- wyniki badań sekcji zwłok,

- szczegółowy opis wszystkich wyników badań histopatologicznych,

- statystyczne ujęcie wyników, jeżeli to możliwe,

- analiza wyników,

- interpretacja wyników.

3.2 Analiza i interpretacja

Patrz "Wprowadzenie ogólne", część B.

4. ODNIESIENIA

Patrz "Wprowadzenie ogólne", część B.

BADANIE PODCHRONICZNEJ TOKSYCZNOŚCI INHALACYJNEJ

90-DNIOWE BADANIA INHALACYJNE Z WYKORZYSTANIEM GATUNKÓW GRYZONI

1. METODA

1.1. Wstęp

Patrz "Wprowadzenie ogólne", Część B.

1.2. Definicje

Patrz "Wprowadzenie ogólne", Część B.

1.3. Substancje odniesienia

Brak.

1.4. Zasada metody badawczej

Kilka grup zwierząt badanych poddane jest codziennemu oddziaływaniu substancji testowej w stopniowanych stężeniach przez wyznaczony okres czasu, jeden rodzaj stężenia jest używany w danej grupie przez okres 90 dni. W przypadku wykorzystania nośnika w celu wytworzenia właściwego stężenia substancji testowej w powietrzu, należy wykorzystać grupę kontrolną do oceny nośnika. W okresie podawania dawki zwierzęta obserwowane są codziennie celem wykrycia objawów toksyczności. Zwierzęta, które padną w czasie trwania badania, poddawane są sekcji zwłok, a przy zakończeniu badania, zwierzęta pozostałe przy życiu również należy zabić i poddać sekcji zwłok.

1.5. Kryteria jakościowe

Brak.

1.6. Opis metody badawczej

Przygotowania

Zwierzęta podlegają warunkom przebywania i żywieniowym ustalonym do celów badania przez co najmniej 5 dni przed rozpoczęciem badania. Przed rozpoczęciem badania młode zdrowe zwierzęta są losowo przydzielane do grup badanych i kontrolnych. W miarę potrzeby do substancji testowej może zostać dodany odpowiedni nośnik celem wspomożenia wytworzenia właściwego stężenia substancji w powietrzu. W przypadku użycia jakiegokolwiek nośnika lub innych dodatków w celu usprawnienia dawkowania, należy upewnić się, iż nie powodują żadnych skutków toksyczności. Dane bazowe mogą być wykorzystane stosownie do potrzeb.

Warunki badania

Zwierzęta badane

Jeżeli nie ma przeciwwskazań, preferowanym gatunkiem jest szczur. Należy zastosować powszechnie wykorzystywane laboratoryjne szczepy młodych, zdrowych zwierząt. Na początku badania różnica w wadze wykorzystywanych zwierząt nie powinna przekraczać ± 20 % odpowiedniej średniej wartości. W przypadku przeprowadzania testów podchroniczności doustnej jako wstęp do badań długoterminowych, ten sam gatunek i szczep powinny być wykorzystane w obu badaniach.

Liczba i płeć

Co najmniej 20 zwierząt (10 samic i 10 samców) powinno być poddanych ekspozycji każdej wielkości stężenia substancji. Samice powinny być nieciężarne i takie, które nie rodziły. Jeżeli planowane są zgony zwierząt, ich liczba powinna zostać powiększona o liczbę zwierząt planowanych do uśmiercenia przed zakończeniem badań. Ponadto grupa satelitarna w ilości 20 zwierząt (10 zwierząt każdej płci) może zostać poddana działaniu wysokiego stężenia przez okres 90 dni i obserwowana pod względem odwracalności, odporności lub opóźnionego pojawienia się toksycznych skutków, przez 28 dni po zakończeniu czynności badawczych.

Stężenia do celów ekspozycji

Wymagane są co najmniej trzy rodzaje stężenia, dla grupy kontrolnej i w grupy kontrolnej do oceny nośnika (odpowiadające stężeniu nośnika przy najwyższej wielkości dawki), w przypadku stosowania nośnika. Z wyjątkiem zastosowania substancji testowej, zwierzęta z grupy kontrolnej powinny być traktowane w identyczny sposób co podmioty z grupy badanej. Najwyższe stężenie powinno wywołać skutki toksyczności, ale żadnych lub kilka przypadków śmiertelności. W przypadku rozważenia ekspozycji człowieka, najniższa dawka powinna ją przekraczać. Najlepiej byłoby, gdyby średnie stężenie wywoływało minimalne dające się zaobserwować skutki toksyczności. W przypadku użycia więcej niż jednego średniego stężenia, stężenia powinny zostać rozszerzone w celu wywołania stopniowania skutków toksyczności. W grupach poddanych niskiemu i średniemu stężeniu oraz w grupach kontrolnych jakiekolwiek przypadki śmiertelności powinny być nieliczne, w celu umożliwienia dokonania miarodajnej oceny wyników badań.

Czas ekspozycji

Dzienny czas trwania ekspozycji powinien wynosić sześć godzin po zrównoważeniu stężeń w komorach. Inne długości czasu trwania ekspozycji mogą zostać zastosowane w celu spełnienia szczególnych wymagań.

Wyposażenie

Zwierzęta powinny być badane z użyciem sprzętu inhalacyjnego zaprojektowanego w celu podtrzymania dynamicznego przepływu powietrza przy co najmniej 12 wymianach powietrza na godzinę w celu zapewnienia odpowiedniej zawartości tlenu oraz równomiernie dystrybuowanego powietrza z zawartością substancji. W przypadku stosowania komory, jej projekt powinien zminimalizować tłoczenie się badanych zwierząt i zminimalizować, przez inhalację, ich narażenie na substancję testową. Ogólnie rzecz biorąc, w celu zapewnienia stabilności komory powietrznej, ogólna liczba (objętość) badanych zwierząt nie powinna przekraczać 5 % objętości komory badawczej. Wykorzystywane mogą być komory ustno-nosowe, obejmujące całą głowę lub całe ciało; pierwsze dwie komory minimalizują pobieranie substancji innymi drogami.

Okres obserwacji

Badane zwierzęta powinny być obserwowane codziennie w celu wykrycia objawów toksyczności podczas całego okresu badania oraz okresu regeneracji. Należy odnotować czas zgonu i czasu pojawienia się i zaniku objawów toksyczności.

Procedura

Zwierzęta poddane są działaniu substancji przez cały dzień, pięć do siedmiu dni w tygodniu, przez okres 90 dni. Zwierzęta jakiejkolwiek grupy satelitarnej przeznaczone do obserwacji uzupełniających powinny być trzymane przez dalsze 28 dni bez podawania dawek w celu stwierdzenia odwracalności lub odporności na skutki toksyczności. Wysokość temperatury, w jakiej przeprowadzane jest badanie należy utrzymywać na poziomie 22 ± 3 °C. Należy utrzymywać względną wilgotność między 30 % i 70 %, ale w niektórych przypadkach (np. badania aerozoli) stosowanie powyższego nie jest wymagane. Należy wstrzymać wydawanie pożywienia i wody w czasie ekspozycji na działanie substancji. Substancja testowa dawkowana jest zwierzętom najlepiej siedem dni w tygodniu przez okres 90 dni.

Konieczne jest wykorzystanie dynamicznego systemu inhalacji z odpowiednim analitycznym systemem kontroli stężenia. W celu ustalenia odpowiedniego stężenia zaleca się przeprowadzenie testu próbnego. Należy dostosować przepływ powietrza w celu zapewnienia jednolitych warunków w komorze. System powinien zapewnić jak najszybsze osiągnięcie stabilnych warunków działania czynnika.

Pomiary lub kontrole powinny obejmować:

a) tempo przepływu powietrza (stałe);

b) rzeczywiste stężenie substancji testowej mierzone w strefie oddychania. W czasie oddziaływania substancji stężenie nie powinno ulegać wahaniom wyższym niż ± 15 % średniej wartości. Jednakże w przypadku pyłów i aerozoli, niniejsza wielkość kontrolna może nie zostać osiągnięta i akceptuje się stosowanie szerszego zakresu. W czasie całego czasu trwania badań, dzienne stężenia powinny być utrzymywane na możliwie stałym poziomie. Rozwijając system wytwarzania, należy przeprowadzić analizę granulometryczną w celu ustalenia stabilności stężenia aerozoli. W czasie działania substancji należy przeprowadzać analizy tak często, jak będzie to konieczne celem ustalenia spójności dystrybucji granulometrycznej;

c) temperatura i wilgotność;

d) w czasie trwania działania substancji należy systematycznie odnotować uwagi; należy prowadzić indywidualne rejestry dla każdego zwierzęcia. Wszystkie zwierzęta powinny być codziennie obserwowane, a objawy toksyczności odnotowane, włączając czas ich rozpoczęcia, stopień oraz czas trwania. Obserwacje zwierząt w klatkach powinny obejmować: zmiany zachodzące na ich skórze i futrze, zmiany oczu i błonie śluzowej, a także zmiany układu oddechowego, krążenia oraz autonomicznego i centralnego układu nerwowego, czynności somatomotorycznych oraz schematów zachowań. Powinny być dokonywane pomiary spożycia żywności oraz pomiary wagi ciała zwierząt raz w tygodniu. Regularne obserwacje zwierząt są konieczne w celu zapewnienia, że nie występują straty w zwierzętach w wyniku takich przypadków, jak kanibalizm, autoliza tkanek lub nieprawidłowe umieszczenie. Na końcu okresu ekspozycji wszystkie zwierzęta pozostałe przy życiu zostają poddane sekcji zwłok. Zwierzęta konające powinny być usuwane i poddawane sekcji zwłok po stwierdzeniu takiego faktu.

Wszystkie zwierzęta, włączając zwierzęta z grup kontrolnych, zwyczajowo poddawane są następującym badaniom:

a) badanie oftalmologiczne z wykorzystaniem oftalmoskopu lub podobnego sprzętu, powinny zostać wykonane przed poddaniem działaniu substancji testowej oraz zakończeniem badań, najlepiej na wszystkich zwierzętach, a co najmniej na zwierzętach z grupy najwyższej dawki i grupy kontrolnej. W przypadku wykrycia zmian w oczach, należy przebadać wszystkie zwierzęta;

b) hematologia, włączając hematokryt, stężenie hemoglobiny, badanie ilości krwinek czerwonych, całkowitej ilości krwinek białych i obraz białokrwinkowy, pomiar wskaźników krzepliwości krwi takich jak czas krzepnięcia, czas protrombinowy, czas tromboplastynowy, czy ilość płytek krwi powinny zostać zbadane na końcu okresu badania;

c) powinno zostać przeprowadzone określenie klinicznej biochemii krwi na końcu okresu badania. Obszarami uważanymi za właściwe dla wszystkich badań są: równowaga elektrolityczna, metabolizm węglowodanów, funkcje wątroby i nerek. Wybór szczególnych badań będzie uzależniony od obserwacji formy i działania substancji. Sugerowane ustalenia to: pomiar wapnia, fosforu, chlorku, sodu, potasu, stężenie glukozy na czczo (z okresem głodzenia stosownym do gatunku zwierzęcia), transaminaza pirogronianowo-glutaminowa surowicy [8], transaminaza szczawiowooctowoglutamylowa surowicy [9], dekarboksylazy ornityny, transpeptydaza gammaglutamylowa, mocznika azotu, albuminy, kreatyny krwi całkowitej bilirubiny oraz całkowitej surowicy białka. Inne ustalenia, które mogą być niezbędne do właściwej analizy toksykologicznej, obejmują analizy lipidów, hormonów, równowagi kwasowo-zasadowej, czynności metahemoglobiny i cholinoesteraza. Dodatkowa biochemia kliniczna może zostać zastosowana w miarę potrzeby w celu rozszerzenia badań w zakresie obserwowanych skutków;

d) analiza moczu nie jest wymagana jako badanie rutynowe, ale jedynie w przypadku spodziewanej lub zaobserwowanej toksyczności.

Jeżeli dane bazowe są niewystarczające, należy rozważyć określenie parametrów hematologicznych i biochemii klinicznej przed rozpoczęciem dawkowania.

Sekcja zwłok

Wszystkie zwierzęta powinny być poddane sekcji zwłok, która obejmuje badanie zewnętrznej powierzchni ciała, wszelkich otworów, jamy czaszkowej, klatki piersiowej i jamy brzusznej oraz ich zawartości. Wątroba, nerki, nadnercza oraz jądra powinny być zważone niezwłocznie po przeprowadzeniu sekcji w celu uniknięcia wyschnięcia. Poniższe organy i tkanki powinny być zachowane w odpowiednim pojemniku w celu ewentualnego przyszłego badania histopatologicznego: wszystkie zmiany patologiczne, płuca, które należy usunąć w stanie nienaruszonym, należy zważyć i poddać działaniu odpowiedniego utrwalacza celem zapewnienia utrzymania struktury płuc (przepłukiwanie odpowiednim utrwalaczem uważane jest za skuteczną procedurę), tkanki nosogardzieli, mózg – włączając części rdzenia/most, móżdżek i kora mózgowa, przysadka mózgowa, tarczyca/przytarczyca, tkanki grasicy, tchawica, płuca, serce, aorta, gruczoły ślinowe, wątroba, śledziona, nerki, nadnercza, trzustka, gruczoły płciowe, macica, (dodatkowe organy genitaliów), (skóra) woreczek żółciowy (jeżeli obecny), przełyk, żołądek, dwunastnica, jelito czcze, talerz, jelito ślepe, okrężnica, odbytnica, pęcherz moczowy, przedstawiciel pachowych węzłów chłonnych, (żeńskie gruczoły malene), (umięśnienie uda), nerwy obwodowe, (oczy), mostek wraz ze szpikiem kostnym, (kość udowa, włączając powierzchnie stawowe) i (rdzeń kręgowy w trzech poziomach – szyjny, śródpiersiowy i lędźwiowy). Tkanki wymienione w nawiasach będą wymagały przebadania w przypadku powstania objawów toksyczności lub stanu organów, na które skierowane jest działanie substancji.

Badania histopatologiczne

a) Pełna histopatologia powinna zostać przeprowadzona na drogach oddechowych oraz na organach i tkankach zwierząt w grupie kontrolnej i grupie najwyższego dawkowania.

b) Wszelkie zmiany patologiczne powinny zostać zbadane.

c) Organy, na które skierowane jest działanie substancji, w grupach innego dawkowania powinny zostać zbadane.

d) Płuca zwierząt w grupach niskiego i średniego dawkowania powinny zostać poddane badaniu histopatologicznemu, ponieważ niniejsze badania dostarcza dogodnej oceny stanu zdrowia zwierząt. Przeprowadzanie dalszych badań histopatologicznych nie musi być wymagane jako rutynowe w odniesieniu do zwierząt w tych grupach, ale zawsze musi być przeprowadzane na organach, które wykazują dowody zmian patologicznych w grupie najwyższego dawkowania.

e) W przypadku wykorzystywania grupy satelitarnej, histopatologia powinna zostać przeprowadzona na tkankach i organach zidentyfikowanych jako wykazujące zmiany patologiczne w grupach poddanych badaniu.

2. DANE

Dane powinny zostać podsumowane w formie tabeli, wskazującej liczbę zwierząt w każdej badanej grupie na początku badań, liczbę zwierząt wykazujących zmiany patologiczne, rodzaje amin oraz odsetek zwierząt wykazujących każdy z rodzajów zmian. Wyniki powinny zostać oszacowane właściwą metodą statystyczną. Można zastosować każdą uznaną metodę statystyczną.

3. SPRAWOZDANIE

3.1. Sprawozdanie z badań

Sprawozdanie z badań zawiera, w miarę możliwości, następujące informacje:

- gatunek lub szczep, źródło, warunki środowiska, pożywienie,

- warunki badania,

Opis urządzeń badawczych: włączając projekt, typ, wymiary, źródło powietrza, system wytwarzania cząstek stałych zawieszonych w gazie i aerozoli, metoda klimatyzowania powietrza, oczyszczanie powietrza z komory i metoda umieszczania zwierząt w komorze badawczej w razie jej stosowania. Należy opisać sprzęt do pomiaru temperatury, wilgotności, w miarę potrzeb, stabilność stężenia aerozoli lub wielkości cząsteczki.

Dane dotyczące badania: powinny zostać umieszczone w tabeli i przedstawione jako wartość średnia wraz z pomiarem zmiennej (np. odchylenie standardowe) i powinny zawierać:

a) wskaźnik przepływu powietrza przez sprzęt inhalacyjny;

b) temperatura i wilgotność powietrza;

c) nominalne stężenia (całkowita ilość substancji testowej wprowadzana do sprzętu inhalacyjnego, podzielona przez ilość powietrza);

d) charakter nośnika, jeżeli był użyty;

e) właściwe stężenia w badanej strefie oddechowej;

f) średnie wielkości cząsteczki (gdzie sytuacja tego wymaga),

- dane dotyczące reakcji na toksyczność ze względu na płeć i stężenie,

- brak skutków,

- czas zgonu podczas badań lub informacja o tym czy zwierzęta przetrwały do czasu ich zakończenia,

- opis skutków toksyczności lub innych (ze szczególnym uwzględnieniem wyników badań klinicznych),

- okres obserwacji każdego nietypowego objawu i późniejszego postępowania,

- dane dotyczące wagi ciała i pożywienia,

- wyniki badań oftalmologicznych,

- zastosowane badania hematologiczne oraz wszystkie wyniki,

- zastosowane kliniczne badania biochemiczne oraz wszystkie wyniki (włączając wyniki wszelkich analiz moczu),

- wyniki badań sekcji zwłok,

- szczegółowy opis wszystkich wyników badań histopatologicznych,

- statystyczne ujęcie wyników, w odpowiednich przypadkach,

- analiza wyników,

- interpretacja wyników.

3.2. Analiza i interpretacja

Patrz "Wprowadzenie ogólne" część B.

4. ODNIESIENIA

Patrz "Wprowadzenie ogólne" część B.

BADANIE DZIAŁANIA TERATOGENNEGO – GRYZONIE I INNE GATUNKI

1. METODA

1.1. Wstęp

Patrz "Wprowadzenie ogólne" część B.

1.2. Definicje

Patrz "Wprowadzenie ogólne" część B.

1.3. Substancje odniesienia

Brak.

1.4. Zasada metody badawczej

Substancja testowa podawana jest w dawkach stopniowanych lub stężeniach, przez co najmniej ten okres ciąży obejmujący organogenezę, kilku grupom ciężarnych zwierząt badanych, w danej grupie stosowany jest jeden rodzaj dawki. Bezpośrednio przed przewidywanym terminem porodu matka jest uśmiercana, macica zostaje usunięta, a jej zawartości poddane badaniu. Niniejsza metoda badawcza dotyczy toksyczności zarodka i płodu.

1.5. Kryteria jakościowe

Brak.

1.6. Opis metody badawczej

Przygotowania

Zdrowe, młode, dorosłe, dziewicze samice w porównywalnym wieku i rozmiarach ciała są aklimatyzowane do warunków laboratoryjnych co najmniej przez okres pięciu dni przed rozpoczęciem testu i następnie kojarzone są z samcami o ustalonej płodności. Zainseminowane samice są dobierane losowo i przydzielane do grup badanych.

Krycie może być przeprowadzone w sposób naturalny lub przez sztuczne zainseminowanie. Substancja testowa jest podawana codziennie samicom bezpośrednio po ich zainseminowaniu, a jej podawanie kontynuowane jest przez okres organogenezy. Dzień przed porodem płody odbierane są przez histerektomię oraz poddawane są badaniom w celu wykrycia nieprawidłowości w ich wnętrznościach oraz budowie kostnej, włączając upośledzenie wzrostu, opóźniony proces kostnienia oraz krwotoki jelitowe.

Warunki badania

Zwierzęta badane

Powszechnie wykorzystywane gatunki to szczur, mysz, chomik i królik. Gatunkami najchętniej wykorzystywanymi są szczur i królik. Należy zastosować powszechnie wykorzystywane laboratoryjne szczepy. Szczep nie powinien wykazywać niskiej płodności i powinien być scharakteryzowany pod względem reakcji na czynniki teratogenne. Zwierzęta powinny być umieszczane w osobnych klatkach.

Liczba i płeć

Co najmniej 20 zapłodnionych samic szczura, myszy lub chomika lub 12 zapłodnionych samic królika wymagane jest w celu poddania działania każdej wielkości dawki. Celem jest zapewnienie odpowiedniej ilości miotu i młodych dla umożliwienia oceny teratogenetycznego wpływu substancji testowej.

Poziomy dawek

Powinny zostać wykorzystane co najmniej trzy dawki i dawka kontrolna. Jeżeli substancja testowa jest podawana z nośnikiem, to badania należy przeprowadzić z uwzględnieniem grupy kontrolnej, której podawany jest wyłącznie nośnik. Jeżeli stosuje się nośnik, to powinny być znane jego właściwości toksykologiczne; nie powinien wykazywać właściwości teratogennych lub wpływać na reprodukcję. Z wyjątkiem stosowania substancji testowej, zwierzęta grupy kontrolnej powinny być traktowane w identyczny sposób, co podmioty grupy badanej. Jeżeli dawka nie jest ograniczona fizyczno-chemicznymi lub biologicznymi właściwościami substancji, najwyższa wielkość dawki powinna wywoływać jawną toksyczność w okresie macierzyństwa, skutkującą nieznaczną utratą wagi ciała, ale wskaźnikiem zgonów matek nie większym niż 10 %. Niski poziom dawki nie powinien wywoływać dających się zaobserwować skutków przypisanych substancji testowej. Dawka(-i) średnia(-e) powinna być rozmieszczona geometrycznie między wysokim a niskim poziomem dawki.

Test graniczny

W przypadku substancji o niskiej toksyczności, jeżeli dawka wynosząca co najmniej 1000 mg/kilogram nie powoduje żadnych dowodów działania embriotoksyczngo lub teratogennego, badania przy zastosowaniu innych poziomy dawek mogą być uznane za niepotrzebne.

Okres ekspozycji

Dzień 0 badania to dzień obserwacji fizycznej zapłodnienia i/lub nasienia (jeżeli wykonalne). Okres dawkowania powinien obejmować okres głównej organogenezy. Jako okres ten można przyjąć 6–15 dni dla szczurów i myszy, 6–14 dni dla chomika lub 6–18 dni dla królika. Jeżeli dzień 0 oparty jest na obserwacji krycia lub sztucznej inseminacji, wymienione okresy powinny zostać dostosowane przez dodanie jednego dnia. Ewentualnie okres dawkowania może być przedłużony o około jeden dzień przed spodziewanym terminem porodu.

Okres obserwacji

Gruntowne badanie kliniczne powinno zostać przeprowadzone co najmniej raz dziennie. Każdego dnia należy przeprowadzać dodatkowe obserwacje, podejmując odpowiednie działania w celu zminimalizowania strat w badanych zwierzętach.

Procedura

Substancja jest podawana doustnie za pomocą dozownika. Substancja testowa powinna być podawana o podobnej porze dnia.

Samice badanych zwierząt poddawane są działaniu substancji testowej codziennie przez odpowiedni okres badania. Dawka może być oparta na wadze samic odnotowanej na początku okresu jej podawania, lub, ewentualnie, ze względu na szybką utratę wagi ciała, która ma miejsce w okresie ciąży, zwierzęta mogą być ważone okresowo, a dawka oparta na określeniu aktualnej wagi ciała. Należy odnotować objawy toksyczności w chwili ich zaobserwowania, włączając czas ich pojawienia się, stopień oraz czas trwania. Samice wykazujące objawy poronienia lub przedwczesnego porodu powinny zostać uśmiercone i poddane gruntownemu badaniu makroskopowemu. Okres obserwacji po zakończeniu poddania działaniu substancji powinien trwać do około jednego dnia przed terminem porodu; celem jest objęcie badaniem większości okresu ciąży, jednakże unikając komplikacji interpretacji wyników, która może nastąpić po dokonaniu porodu w sposób naturalny. Obserwacje zwierząt w klatkach powinny obejmować, ale nie wyłącznie, zmiany zachodzące na ich skórze i futrze, zmiany oczu i błony śluzowej, a także zmiany układu oddechowego, krążenia oraz autonomicznego i centralnego układu nerwowego, czynności somatomotorycznych oraz schematów zachowań. Powinny być przeprowadzane pomiary spożycia żywności oraz pomiary wagi ciała zwierząt raz w tygodniu. Zwierzęta powinny być ważone raz w tygodniu.

Sekcja zwłok

W chwili śmierci lub po zakończeniu badań matkę należy poddać makroskopowemu badaniu celem wykrycia jakichkolwiek strukturalnych nieprawidłowości lub zmian patologicznych, które mogły wpłynąć na ciążę. Niezwłocznie po zgonie zwierzęcia należy usunąć macicę i zbadać zawartość w celu stwierdzenia ilości zarodków lub płodów martwych i żywych. Zazwyczaj możliwe jest oszacowanie czasu zgonu in utero (macicznego) w przypadku gdy taki nastąpił. W przypadku szczurów i królików można ustalić ilość ciałek żółtych. Należy ustalić płeć płodów i zważyć poszczególne osobniki a pomiary wagi należy odnotować i ustalić średnią wagę płodu. Po usunięciu, każdy płód powinien zostać zbadany zewnętrznie. W odniesieniu do szczurów, myszy i chomików, należy przygotować i zbadać jedną trzecią lub połowę każdego miotu w celu wykrycia nieprawidłowości szkieletowych, a pozostała część każdego miotu powinna zostać przygotowana i przebadana w celu wykrycia nieprawidłowości w tkance miękkiej z wykorzystaniem właściwych metod. W odniesieniu do królików, każdy płód powinien zostać zbadany przez dokładne przeprowadzenie sekcji zwłok w celu wykrycia nieprawidłowości wewnętrznych, a następnie nieprawidłowości szkieletowych.

2. DANE

Dane powinny zostać podsumowane w formie tabeli wykazującej liczbę zwierząt każdej badanej grupy na początku badań, liczbę i procent żywych płodów oraz płody z wszelkimi nieprawidłowościami tkanki miękkiej i kostnej oraz ich powiązania ze szczególnymi miotami. Wyniki należy oszacować właściwą metodą statystyczną. Można zastosować każdą uznaną metodę statystyczną.

3. SPRAWOZDANIE

3.1. Sprawozdanie z badań

Sprawozdanie z badań zawiera, jeżeli możliwe, następujące informacje:

- gatunek, szczep, źródło, warunki środowiska, pożywienie,

- warunki badania,

- dawkowanie (włączając nośnik, jeżeli został użyty) oraz jego stężenie,

- dane dotyczące reakcji na toksyczność ze względu na płeć i dawkę,

- brak skutków,

- czas zgonu podczas badań lub informacja o tym, czy zwierzęta przetrwały do czasu ich zakończenia,

- opis skutków toksyczności lub innych,

- okres obserwacji każdego nietypowego objawu i późniejszego postępowania,

- dane dotyczące wagi ciała i pożywienia,

- czas trwania ciąży oraz dane dotyczące miotu (włączając dane bazowe),

- dane dotyczące płodu (żywy/martwy, płeć, uszkodzenia tkanki miękkiej i kostnej),

- dane dotyczące miotu (żywy/martwy, płeć, uszkodzenia tkanki miękkiej i kostnej dla każdego miotu),

- statystyczne ujęcie wyników,

- analiza wyników,

- interpretacja wyników.

3.2. Analiza i interpretacja

Patrz "Wprowadzenie ogólne" część B.

4. ODNIESIENIA

Patrz "Wprowadzenie ogólne" część B.

BADANIE TOKSYCZNOŚCI CHRONICZNEJ

1. METODA

1.1. Wstęp

Patrz "Wprowadzenie ogólne" część B.

1.2. Definicje

Patrz "Wprowadzenie ogólne" część B.

1.3. Substancje odniesienia

Brak.

1.4. Zasada metody badawczej

Substancja testowa podawana jest zwykle przez siedem dni w tygodniu, odpowiednią drogą, kilku grupom zwierząt badanych, jedna dawka dla danej grupy przez większą część długości ich życia. Podczas ekspozycji oraz po jej zakończeniu zwierzęta obserwowane są codziennie w celu wykrycia objawów toksyczności.

1.5. Kryteria jakościowe

Brak.

1.6. Opis metody badawczej

Przygotowania

Zwierzęta podlegają warunkom przebywania i żywieniowym ustalonym do celów badania przez co najmniej 5 dni przed rozpoczęciem badania. Przed rozpoczęciem badania, młode zdrowe zwierzęta są losowo przydzielane do grup badanych i kontrolnych.

Warunki badania

Zwierzęta badane

Gatunkiem preferowanym jest szczur. W oparciu o wyniki wcześniej przeprowadzonych badań, inne gatunki (gryzonie lub inne) mogą zostać wykorzystane. Należy zastosować powszechnie wykorzystywane laboratoryjne szczepy młodych, zdrowych zwierząt, a dawkowanie należy rozpocząć, jeżeli możliwe, bezpośrednio po zakończeniu ssania.

W początkowej fazie badań, różnice wagi ciała wykorzystywanych zwierząt nie powinny przekroczyć ± 20 % wartości średniej. W przypadku przeprowadzania badań podchronicznej toksyczności doustnej jako wstęp do długotrwałych badań, do obu rodzajów badań należy wykorzystać ten sam gatunek/rasę i szczep.

Liczba i płeć

W przypadku gryzoni co najmniej 40 zwierząt (20 samic i 20 samców) powinno być wykorzystanych do podania każdej z dawek i równolegle grupie kontrolnej. Samice powinny być nieciężarne i takie, które nie rodziły. Jeżeli planowane jest uśmiercenie zwierząt, ich liczba powinna zostać powiększona o liczbę zwierząt planowanych do uśmiercenia przed zakończeniem badań.

W przypadku gatunków innych niż gryzonie akceptowana jest mniejsza liczba zwierząt, ale nie mniejsza niż cztery osobniki danej płci w danej grupie.

Poziomy dawek i częstotliwość ekspozycji

Należy zastosować co najmniej trzy poziomy dawek w uzupełnieniu do równoległej grupy kontrolnej. Najwyższa wielkość dawki powinna wywołać określone objawy toksyczności, nie powodując nadmiernej śmiertelności. Najniższa dawka nie powinna wywoływać żadnych objawów toksyczności.

Dawka(-i) pośrednia powinna zostać ustalona na średnim poziomie między najwyższą a najniższą dawką.

Przy wyborze poziomu dawek należy uwzględnić dane wcześniejszych testów toksyczności i badań.

Należy zastosować zwykłą, dzienną częstotliwość ekspozycji. Jeżeli substancja chemiczna podawana jest w wodzie pitnej lub domieszana jest do pożywienia, powinna być dostępna w sposób ciągły.

Kontrole

Należy wykorzystać równoległą grupę kontrolną, która pod każdym względem odpowiada grupom badanym, z wyjątkiem poddania jej ekspozycji na substancję testową.

W szczególnych okolicznościach, takich jak badania inhalacyjne z użyciem aerozoli lub podawanych doustnie środków emulgujących o niepoznanej dotychczas aktywności biologicznej konieczne jest dołączenie równoległej kontrolnej grupy negatywnej. Zwierzęta z kontrolnej grupy negatywnej są traktowane w ten sam sposób co grupa badana z wyjątkiem ekspozycji na substancję testową ani jakikolwiek nośnik.

Droga podawania substancji

Droga pokarmowa oraz oddechowa stanowią dwie główne drogi podawania substancji. Wybór drogi podawania substancji zależy od fizycznych i chemicznych właściwości substancji testowej i prawdopodobnych dróg ekspozycji człowieka.

Wybór drogi, jaką jest stosowanie substancji na skórze, przedstawia znaczne problemy natury praktycznej. Chroniczna toksyczność systemiczna wynikająca z absorpcji przez skórę może być normalnie wywnioskowana na podstawie wyników innego badania doustnego oraz na podstawie wiedzy z zakresu badań absorpcji przez skórę pochodzącej z wcześniejszych badań toksyczności.

Badania doustne

W przypadku wchłaniania substancji z przewodu żołądkowo-jelitowego, oraz jeżeli droga przyjmowania pokarmu stanowi drogę ekspozycji człowieka, pożądaną drogą podawania substancji jest droga pokarmowa, jeżeli nie istnieją przeciwwskazania.

Zwierzęta mogą otrzymywać substancję testową w pożywieniu, rozcieńczoną w wodzie pitnej lub podawaną w kapsułkach.

Najlepiej stosować codzienne dawkowanie przez siedem dni w tygodniu, ponieważ dawkowanie na zasadzie pięciu dni w tygodniu może powodować odwracalność lub cofnięcie toksyczności w okresie niepodawania dawki, przez co może wpłynąć na wyniki i ich późniejszą analizę. Jednakże głównie w oparciu o względy praktyczne, akceptowane jest dawkowanie na zasadzie dawkowania przez okres pięciu dni w tygodniu.

Badania inhalacyjne

Ponieważ badania inhalacyjne przedstawiają techniczne problemy o większej złożoności niż podawanie substancji innymi drogami, niniejszym podaje się bardziej szczegółowe wskazówki dotyczące tego sposobu podawania substancji. Należy również zauważyć, iż wewnątrztchawiczne wkraplanie może stanowić poważną alternatywę w szczególnych sytuacjach.

Długoterminowe ekspozycje są zazwyczaj wzorowane na przewidywanej ekspozycji człowieka na działanie substancji. Zwierzęta poddawane są sześciogodzinnej ekspozycji po wyrównaniu stężeń komory, przez pięć dni w tygodniu (ekspozycja nieregularna), istotne w związku z ewentualnym wpływem środowiska, 22–24 godzin poddania działaniu substancji dziennie przez siedem dni w tygodniu (ciągłe działanie), z godzinną przerwą na karmienie zwierząt w ciągu dnia o podobnej porze i konserwację komory. W obu przypadkach zwierzęta zazwyczaj poddane są działaniu stałych stężeń substancji testowej. Główna różnica między nieregularną a ciągłą ekspozycją polega na tym, że w okresie nieregularnej ekspozycji występuje przerwa 17–18 godzin, podczas której zwierzęta mogą się zregenerować w związku ze skutkami wywołanymi ekspozycją codziennej dawki, z jeszcze dłuższym okresem regeneracji w czasie przerwy weekendowej.

Wybór nieregularnego lub ciągłego dawkowania zależy od celów badań i symulacji sytuacji ekspozycji człowieka na działanie substancji. Jednakże należy wziąć pod uwagę niektóre trudności techniczne. Na przykład korzyści z ciągłej ekspozycji na symulowane warunki środowiska mogą być równoważone koniecznością pojenia oraz karmienia zwierząt podczas badania, oraz potrzebą wytworzenia bardziej skomplikowanych (i pewnych) aerozoli i oparów oraz technik kontroli.

Komory ekspozycyjne

Zwierzęta powinny być badane w komorach inhalacyjnych zaprojektowanych w celu podtrzymania dynamicznego przepływu powietrza, przy co najmniej 12 wymianach powietrza na godzinę dla zapewnienia odpowiedniej zawartości tlenu oraz równomiernej dystrybucji powietrza z zawartością substancji. Komory kontrolne i badawcze powinny być identyczne pod względem konstrukcji i projektu w celu zapewnienia porównywalnych warunków badania pod każdym względem, z wyjątkiem ekspozycji na substancję testową. Niewielkie ujemne ciśnienie wewnątrz komory jest na ogół utrzymywane w celu zapobieżenia wystąpieniu przecieku substancji testowej do otoczenia. Komory powinny zminimalizować tłoczenie się badanych zwierząt. Ogólnie, w celu zapewnienia stabilności komory powietrznej, ogólna liczba (objętość) badanych zwierząt nie powinna przekraczać 5 % objętości komory.

Pomiary lub kontrole powinny obejmować:

i) przepływ powietrza: tempo przepływu powietrza przez komorę powinno być stale kontrolowane;

ii) stężenie: w czasie oddziaływania substancji stężenie nie powinno ulegać wahaniom wyższym niż ± 15 % średniej wartości;

iii) temperatura i wilgotność: dla gryzoni należy utrzymywać temperaturę na poziomie 22 ± 2 °C, i wilgotność w komorze 30–70 %, z wyjątkiem, gdy woda używana jest w celu zawieszenia substancji testowej w powietrzu wewnątrz komory. Oba wskaźniki należy stale kontrolować;

iv) pomiary wielkości cząsteczki: należy ustalić rozkład wielkości cząstek w atmosferze komory, włączając aerozole ciekłe i stałe. Cząsteczki aerozoli powinny posiadać wielkość możliwą do wchłonięcia przez badane zwierzęta. Próbki powietrza komory należy pobrać ze strefy oddechowej zwierząt. Próbka powietrza powinna być reprezentatywna dla warunków dystrybucji cząsteczek, działaniu, których poddane są zwierzęta i powinna obejmować, na zasadzie grawimetrycznej, całą ilość zawieszonego w powietrzu aerozolu nawet w przypadku gdy duża ilość aerozolu nie jest wchłaniana. Należy przeprowadzać częste analizy wielkości cząsteczki w czasie rozwijania systemu wytwarzania w celu zapewnienia stabilności aerozolu, a następnie tak często jak to konieczne podczas badań celem ustalenia odpowiedniego składu cząsteczek podlegających dystrybucji, których działaniu poddane są zwierzęta.

Czas trwania badań

Czas trwania podawania substancji powinien wynosić co najmniej 12 miesięcy.

Procedura

Obserwacje

Należy przeprowadzić dokładne badania kliniczne, co najmniej raz dziennie. Należy przeprowadzać dodatkowe obserwacje, każdego dnia podejmując odpowiednie działania w celu zminimalizowania strat w zwierzętach podczas badania, na przykład: sekcja zwłok lub schładzanie padłych zwierząt i odizolowywanie lub uśmiercanie słabych lub konających zwierząt. Należy przeprowadzić dokładne obserwacje w celu wykrycia początku powstawania skutków a także zminimalizowania strat w zwierzętach spowodowanych chorobą, autolizą lub kanibalizmem.

Objawy kliniczne, włączając zmiany neurologiczne i oczne, a także śmiertelność, powinny być odnotowane w odniesieniu do wszystkich zwierząt. Należy odnotować czas rozpoczęcia i kontynuację warunków toksyczności, włączając podejrzane nowotwory.

Należy odnotować wagę ciała indywidualnie dla każdego zwierzęcia raz w tygodniu podczas okresu pierwszych 13 tygodni okresu badania i następnie, co najmniej raz na cztery tygodnie. Przyjmowanie pokarmu należy ustalać co tydzień w pierwszym okresie 13 tygodni po rozpoczęciu badań, a następnie w około trzymiesięcznych odstępach, jeżeli stan zdrowia lub zmiany wagi ciała wymuszą stosowanie innej procedury.

Badanie hematologiczne

Badanie hematologiczne (np. badanie składu hemoglobiny, hematokrytu, całkowitej ilości krwinek czerwonych, całkowitej ilości krwinek białych, płytek krwi lub inne pomiary wskaźników krzepliwości krwi) należy przeprowadzić w ciągu trzech miesięcy, sześciu miesięcy, a następnie w sześciomiesięcznych odstępach i na zakończenie badań na próbkach krwi pobranych od gatunków innych niż gryzonie i od 10 szczurów/obojga płci. Jeżeli możliwe, próbki należy pobrać od tych samych szczurów w każdym przedziale. Ponadto należy pobrać próbki przed rozpoczęciem badań od gatunków innych niż gryzonie.

Jeżeli kliniczne obserwacje wskazują na pogorszenie stanu zdrowia zwierząt podczas badań, należy przeprowadzić obraz białokrwinkowy u zarażonych zwierząt.

Obraz białokrwinkowy należy przeprowadzić na próbkach pobranych od zwierząt z grupy najwyższego dawkowania i kontrolnych. Obrazy białokrwinkowe przeprowadzane są w grupach niższego dawkowania jedynie w przypadku wystąpienia dużej różnicy między grupą najwyższego dawkowania i kontrolnymi lub w przypadku wystąpienia patologicznych wyników badań.

Analiza moczu

Należy pobrać próbki moczu od gatunków innych niż gryzonie i od 10 szczurów/płeć wszystkich grup, jeżeli możliwe od tych samych szczurów w tych samych odstępach czasu, w celu wykonania analizy hematologicznej. Należy dokonać następujących ustaleń dla poszczególnych zwierząt lub dla połączonych próbek/płeć/grupa gryzoni:

- wygląd: rozmiary i waga poszczególnych zwierząt,

- białko, glukoza, ketony, krew utajona w kale (półilościowo),

- badanie mikroskopowe szlamu (półilościowo).

Chemia kliniczna

W sześciomiesięcznych odstępach i przy zakończeniu badania próbki krwi pobierane są od wszystkich gatunków innych niż gryzonie i od 10 szczurów/płeć wszystkich grup, w celu wykonania pomiarów chemii klinicznej, jeżeli możliwe od tych samych szczurów w każdym przedziale. Ponadto należy pobrać próbki przed rozpoczęciem badań od gatunków innych niż gryzonie. Z niniejszych próbek przygotowywana jest plazma krwi oraz należy dokonać następujących ustaleń:

- całkowite stężenie białka,

- stężenie albuminy,

- badanie funkcjonowania wątroby (takie jak działanie fosfatazy alkaicznej, działanie transaminazy pirogronianowo-glutaminowej [10] i czynność transaminazy szczawiowooctowoglutamylowej [11]), transpeptydaza gammaglutamylowa, dekarboksylaza ornityny,

- metabolizm węglowodanów, taki jak stężenie glukozy we krwi,

- badanie funkcjonowania nerki, takie jak azotan mocznika krwi.

Sekcja zwłok

Należy przeprowadzić sekcję zwłok na wszystkich zwierzętach, włączając zwierzęta martwe w czasie trwania badania lub te, które zostały uśmiercone po stwierdzeniu stanu konania. Przed uśmierceniem zwierząt należy pobrać próbki krwi od wszystkich zwierząt w celu przeprowadzenia obrazów białokrwinkowych. Wszelkie widoczne zmiany patologiczne, przewidywane nowotwory lub zmiany o podłożu nowotworowym należy zachować. Należy podjąć próbę skorelowania wyników całości obserwacji z wynikami badań mikroskopowych.

Wszystkie organy i tkanki należy zachować w celu przeprowadzenia badania histopatologicznego. Zazwyczaj dotyczy ono następujących organów i tkanek: mózg [12] (rdzeń/most, móżdżek, kora mózgowa), przysadka mózgowa, tarczyca (włączając przytarczycę), grasica, płuca (włączając tchawicę), serce, aorta, gruczoły ślinowe, wątroba [13], śledziona, nerki [14], nadnercza [15], przełyk, żołądek, dwunastnica, jelito czcze, talerz, jelito ślepe, okrężnica, odbytnica, macica, pęcherz moczowy, węzły chłonne, trzustka, gruczoły płciowe [16], dodatkowe organy genitaliów, żeńskie gruczoły malene, skóra, umięśnienie, nerwy obwodowe, rdzeń kręgowy (szyjny, śródpiersiowy, lędźwiowy), mostek wraz ze szpikiem kostnym, kość udowa (włączając staw) i oczy. Napełnienie płuc i pęcherza moczowego w utrwalaczu jest optymalnym sposobem zachowania niniejszych tkanek; napełnienie płuc w badaniach inhalacyjnych jest istotna dla właściwego badania histopatologicznego. W badaniach szczególnych, takich jak badania inhalacyjne, należy dokonać badania całości dróg oddechowych, włączając nos, gardło i krtań.

W przypadku przeprowadzania innych badań klinicznych, otrzymane informacje należy udostępnić przed badaniem mikroskopowym, ponieważ mogą dostarczyć ważnych wskazówek patologowi.

Histopatologia

Wszelkie widoczne zmiany, w szczególności nowotwory oraz inne zmiany patologiczne powstałe w jakimkolwiek organie, powinny zostać poddane badaniu mikroskopowemu. Ponadto zaleca się następujące procedury:

a) badanie mikroskopowe wszelkich zachowanych organów i tkanek wraz z pełnym opisem wszystkich wykrytych zmian:

1. wszystkie zwierzęta martwe lub uśmiercone podczas badania;

2. wszystkie grupy najwyższego dawkowania i kontrolne;

b) organy lub tkanki wykazujące nieprawidłowości spowodowane lub prawdopodobnie spowodowane działaniem substancji testowej są również badane w grupach niskiego dawkowania;

c) w przypadku gdy wyniki badań dostarczają dowodów na znaczne obniżenie normalnej długości życia zwierząt lub wywołują skutki, które mogą wpływać na reakcje toksyczności, należy zbadać następną, niższą wielkość dawki, jak opisano powyżej;

d) informacje dotyczące występowania zmian patologicznych zazwyczaj występujących w szczepach wykorzystywanych zwierząt, w tych samych warunkach laboratoryjnych, tj. kontrola danych bazowych, są niezbędne w celu poprawnego oszacowania znaczenia obserwowanych zmian u badanych zwierząt.

2. DANE

Dane powinny zostać podsumowane w formie tabeli, wykazującej liczbę zwierząt każdej badanej grupy na początku badań, liczbę zwierząt wykazujących zmiany patologiczne oraz procent zwierząt wykazujących każdy z rodzajów zmian. Wyniki powinny zostać oszacowane właściwą metodą statystyczną. Można zastosować każdą uznaną metodę statystyczną.

3. SPRAWOZDANIE

3.1. Sprawozdanie z badań

Sprawozdanie z badań zawiera, w miarę możliwości, następujące informacje:

- gatunek lub szczep, źródło, warunki środowiska, pożywienie,

- warunki badania:

Opis urządzeń badawczych:

włączając projekt, typ, wymiary, źródło powietrza, system wytwarzania cząstek stałych zawieszonych w gazie i aerozoli, metoda klimatyzowania powietrza, oczyszczanie powietrza z komory i metoda umieszczania zwierząt w komorze badawczej w razie jej stosowania. Należy opisać sprzęt do pomiaru temperatury, wilgotności, w miarę potrzeb, stabilność stężenia aerozoli lub wielkości cząsteczki.

Dane dotyczące badania:

powinny zostać umieszczone w tabeli i przedstawione jako wartość średnia wraz z pomiarem zmiennej (np. odchylenie standardowe) i powinny zawierać:

a) wskaźnik przepływu powietrza przez sprzęt inhalacyjny;

b) temperatura i wilgotność powietrza;

c) nominalne stężenia (całkowita ilość substancji testowej wprowadzana do sprzętu inhalacyjny podzielona przez ilość powietrza);

d) charakter nośnika, jeżeli był użyty;

e) właściwe stężenia w badanej strefie oddechowej;

f) średnie wielkości cząsteczki (gdzie sytuacja tego wymaga),

- poziomy dawek (charakter nośnika, jeżeli był użyty) i stężenia,

- dane dotyczące reakcji na toksyczność ze względu na płeć i dawkę,

- brak skutków,

- czas zgonu podczas badań lub informacja o tym, czy zwierzęta przetrwały do czasu ich zakończenia,

- opis skutków toksyczności lub innych,

- okres obserwacji każdego nietypowego objawu i późniejszego postępowania,

- dane dotyczące wagi ciała i pożywienia,

- wyniki badań oftalmologicznych,

- zastosowane badania hematologiczne oraz wszystkie wyniki,

- zastosowane kliniczne badania biochemiczne oraz wszystkie wyniki (włączając wyniki wszelkich analiz moczu),

- wyniki badań sekcji zwłok,

- szczegółowy opis wszystkich wyników badań histopatologicznych,

- statystyczne ujęcie wyników, w odpowiednich przypadkach,

- analiza wyników,

- interpretacja wyników.

3.2. Analiza i interpretacja

Patrz "Wprowadzenie ogólne", część B.

4. ODNIESIENIA

Patrz "Wprowadzenie ogólne", część B.

BADANIE RAKOTWÓRCZOŚCI

1. METODA

1.1. Wstęp

Patrz "Wprowadzenie ogólne" część B.

1.2. Definicje

Patrz "Wprowadzenie ogólne" część B.

1.3. Substancje odniesienia

Brak.

1.4. Zasada metody badawczej

Substancja testowa zwykle podawana jest siedem dni w tygodniu, odpowiednią drogą, kilku grupom zwierząt badanych, jedna dawka dla danej grupy przez większą część długości ich życia. W okresie podawania dawki testowej oraz po zakończeniu jej stosowania, zwierzęta obserwowane są codziennie celem wykrycia objawów toksyczności, w szczególności po względem rozwoju nowotworów.

1.5. Kryteria jakościowe

Brak.

1.6. Opis metody badawczej

Zwierzęta podlegają warunkom przebywania i żywieniowym ustalonym do celów badania przez co najmniej 5 dni przed rozpoczęciem badania. Przed rozpoczęciem badania młode zdrowe zwierzęta są losowo przydzielane do grup badanych i kontrolnych.

Zwierzęta badane

W oparciu o wyniki wcześniej przeprowadzonych badań, inne gatunki (gryzonie lub inne) mogą zostać wykorzystane. Należy zastosować powszechnie wykorzystywane laboratoryjne szczepy młodych, zdrowych zwierząt, a dawkowanie należy rozpocząć, jeżeli możliwe, bezpośrednio po zakończeniu ssania.

W początkowej fazie badań różnice wagi ciała wykorzystywanych zwierząt nie powinny przekroczyć ± 20 % wartości średniej. W przypadku przeprowadzania badań synchronicznej toksyczności drogą pokarmową jako wstęp do długotrwałych badań, do obu rodzajów badań należy wykorzystać ten sam gatunek/rasę i szczep.

Liczba i płeć

W przypadku gryzoni, co najmni