ZAŁĄCZNIK I

Schemat testów, które należy przeprowadzić zgodnie z art. 3, 4, 5, 7 i 8

1. OGÓLNE ZASADY DOTYCZĄCE WYSTĘPOWANIA OKREŚLONEGO AGROFAGA

1.1. Występowanie określonego agrofaga podejrzewa się w przypadku uzyskania pozytywnego wyniku pierwszego testu wykrywania przeprowadzonego na określonej roślinie. W przypadku materiału roślinnego wykazującego objawy pierwszym testem wykrywania może być izolacja selektywna.

1.2. Występowanie określonego agrofaga potwierdza się w wykazujących objawy próbkach określonych roślin w następujących przypadkach: a) gdy pierwszym testem wykrywania jest izolacja selektywna, w wyniku której powstają kolonie o typowej morfologii: pozytywne wyniki uzyskuje się w dwóch testach identyfikacyjnych; b) gdy pierwszym testem wykrywania jest inny test niż izolacja selektywna: (i) pozytywne wyniki uzyskuje się w dwóch testach identyfikacyjnych po poddaniu próbki izolacji selektywnej; (ii) pozytywne wyniki uzyskuje się w drugim teście wykrywania, innym niż izolacja selektywna.

1.3. Występowanie określonego agrofaga potwierdza się w niewykazujących objawów próbkach określonych roślin w następujących przypadkach: a) gdy wynik pozytywny uzyskuje się w drugim teście wykrywania, pod warunkiem że pierwszy lub drugi test wykrywania jest testem molekularnym (opartym na DNA) (TaqMan® metodą PCR w czasie rzeczywistym lub konwencjonalnego PCR); b) w przypadku próbek pobranych w państwie członkowskim lub na obszarze państwa członkowskiego, w którym nie stwierdzono występowania określonego agrofaga, oraz w przypadku próbek pochodzących z innego państwa członkowskiego: gdy pozytywny wynik uzyskuje się w drugim teście wykrywania zgodnie z lit. a) oraz pozytywne wyniki uzyskuje się w dwóch testach identyfikacyjnych przeprowadzonych po poddaniu próbki izolacji selektywnej.

2. TESTY

2.1. Testy wykrywania

Testy wykrywania zapewniają spójne wykrywanie co najmniej 104 komórek/ml zawieszonego osadu.

Drugi test wykrywania opiera się na innych zasadach biologicznych lub innych regionach nukleotydowych niż pierwszy test wykrywania.

Stosuje się następujące testy wykrywania:

a) testy immunofluorescencyjne zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

b) test FISH (van Beuningen et al. (1995) (1)) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

c) izolacja zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych. Przeprowadza się jeden z dwóch poniższych wariantów: (i) bezpośrednia izolacja na podłożach półselektywnych (lub nieselektywnych) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych; (ii) po wzbogaceniu w ramach testu biologicznego izolacja zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

d) konwencjonalny test PCR z użyciem starterów Pastrik (2000) (2)) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

e) testy PCR TaqMan® w czasie rzeczywistym z użyciem starterów i sond: (i) Schaad et al. (1999) (3) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych; (ii) Vreeburg et al. (2018) (4) (tak zwany test NYtor) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych; (iii) Gudmestad et al. (2009) po dostosowaniu przez Vreeburg et al. (2018)4 zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych; (iv) Massart et al. (2014) (5)zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych.

2.2. Testy identyfikacyjne

Stosuje się następujące testy identyfikacyjne:

a) test immunofluorescencyjny zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

b) konwencjonalny test PCR (Pastrik (2000)) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

c) testy PCR TaqMan® w czasie rzeczywistym z użyciem starterów i sond: (i) Schaad et al. (1999) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych; (ii) Vreeburg et al. (2018) (tak zwany test NYtor) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych; (iii) Gudmestad et al. (2009) po dostosowaniu przez Vreeburg et al. (2018) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych; (iv) Massart et al. (2014) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

d) barkodowanie DNA zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych;

e) MALDI-TOF MS (Zaluga et al. (2011) (6)) zgodnie z opisem w międzynarodowych standardach diagnostycznych.

3. SCHEMATY BLOKOWE PROCEDUR

Schemat blokowy nr 1: Procedura diagnostyczna dotycząca występowania określonego agrofaga w wykazujących objawy próbkach określonej rośliny

a Izolacja może być stosowana jako pierwszy lub drugi test wykrywania. Jeśli podejrzewa się występowanie określonego agrofaga na podłożu, kolonie oczyszcza się w celu uzyskania czystych kultur, na których należy przeprowadzić dwa testy identyfikacyjne. W celu potwierdzenia występowania agrofaga wymagane są pozytywne wyniki w dwóch testach identyfikacyjnych.

b Trzeci test wykrywania opiera się na innych zasadach biologicznych lub innych regionach nukleotydowych.

Schemat blokowy nr 2: Procedura diagnostyczna dotycząca określonego agrofaga w niewykazujących objawów próbkach określonej rośliny

a Nie stosuje się izolacji.

b Trzeci test wykrywania opiera się na innych zasadach biologicznych lub innych regionach nukleotydowych. Nie stosuje się izolacji.

c W przypadku próbek, o których mowa w pkt 1.3 lit. b), potwierdzenie występowania określonego agrofaga po drugim dodatnim teście wykrywania wymaga wyizolowania określonego agrofaga z próbki, a następnie przeprowadzenia dwóch dodatnich testów identyfikacyjnych.

4. PRZYGOTOWANIE PRÓBKI

4.1. Próbki pochodzące z bulw niewykazujących objawów

Standardowa próbka zawiera 200 bulw na każdy test. W międzynarodowych standardach diagnostycznych opisano właściwą procedurę laboratoryjną stosowaną do testowania fragmentów części przystolonowych w celu uzyskania ekstraktu do wykrywania określonego agrofaga.

4.2. Próbki pochodzące z niewykazującego objawów materiału roślinnego innego niż bulwy

Wykrywanie zakażeń utajonych przeprowadza się w próbkach zbiorczych złożonych z fragmentów łodygi. Procedurę można zastosować do maksymalnie 200 fragmentów łodygi pobranych z różnych roślin wchodzących w skład jednej próbki. W międzynarodowych standardach diagnostycznych opisano właściwą procedurę laboratoryjną stosowaną do odkażania i testowania fragmentów łodygi w celu uzyskania ekstraktu przeznaczonego do wykrywania określonego agrofaga.

4.3. Próbki pochodzące z określonych roślin wykazujących objawy

Fragmenty tkanki pobiera się aseptycznie z pierścienia wiązek przewodzących bulwy lub z wiązek przewodzących łodygi określonych roślin wykazujących objawy więdnięcia. W międzynarodowych standardach diagnostycznych opisano szczegółowo właściwą procedurę laboratoryjną stosowaną do testowania tych tkanek w celu uzyskania ekstraktu do wykrywania określonego agrofaga.

(1) van Beuningen, A.R., Derks, H., Janse, J.D. (1995), „Detection and identification of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus with special attention to fluorescent in situ hybridization (FISH) using a 16S rRNA targeted oligonucleotide probe”, Züchtungs Forschung nr 1, s. 266–269.

(2) Pastrik, K.H. (2000), „Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by multiplex PCR with coamplification of host DNA”, European Journal of Plant Pathology, nr 106, s. 155–165.

(3) Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A., Knorr, D. (1999), „Detection of Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIOPCR and an automated real-time fluorescence detection system”, Plant Disease nr 83, s. 1095–1100.

(4) Vreeburg, R., Zendman, A., Pol A., Verheij, E., Nas, M., Kooman-Gersmann, M. (2018), „Validation of four real-time TaqMan PCRs for the detection of Ralstonia solanacearum and/or Ralstonia pseudosolanacearum and/or Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers using a statistical regression approach”, EPPO Bulletin nr 48, s. 86–96.

(5) Massart, S., Nagy, C., Jijakli, M.H. (2014), „Development of the simultaneous detection of Ralstonia solanacearum race 3 and Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus in potato tubers by a multiplex real-time PCR assay”, European Journal of Plant Pathology nr 138, s. 29–37.

(6) Zaluga, J., Heylen, K., Van Hoorde, K., Hoste, B., Vaerenbergh, J., Maes, M., De Vos, P. (2011), „GyrB sequence analysis and MALDI-TOF MS as identification tools for plant pathogenic Clavibacter”, Systematic and applied microbiology nr 34, s. 400–407. 10.1016/j.syapm.2011.05.001.