ZAŁĄCZNIK X

OZNACZANIE ESTRÓW METYLOWYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH METODĄ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ

1. ZAKRES

Niniejszy załącznik zawiera wytyczne w zakresie oznaczania metodą chromatografii gazowej wolnych i związanych kwasów tłuszczowych w tłuszczach i olejach roślinnych po ich przekształceniu na estry metylowe kwasów tłuszczowych (FAME).

Związane kwasy tłuszczowe w formie triglicerydów (TAG) oraz – w zależności od metody estryfikacji – wolne kwasy tłuszczowe (FFA) są przekształcane na estry metylowe kwasów tłuszczowych (FAME), które oznacza się metodą chromatografii gazowej na kolumnach kapilarnych.

Metoda opisana w niniejszym załączniku pozwala na oznaczanie FAME od C12 do C24, w tym estrów metylowych kwasów tłuszczowych nasyconych, cis- i trans-jednonienasyconych oraz cis- i trans-wielonienasyconych.

2. ZASADA

Do analizy ilościowej FAME stosuje się chromatografię gazową (GC). FAME są przygotowywane zgodnie z częścią A. Następnie są wstrzykiwane do dozownika i odparowywane. Rozdział FAME przeprowadza się w kolumnach analitycznych o określonej polarności i długości. Do wykrywania FAME stosuje się detektor płomieniowo-jonizacyjny (FID). Warunki badania określono w części B.

W chromatografii gazowej FAME z użyciem FID można użyć wodoru lub helu jako gazu nośnego (faza ruchoma). Wodór przyspiesza rozdział i daje wyraźniejsze piki. Fazą stacjonarną jest mikroskopijna warstwa cienkiego filmu cieczy naniesiona na obojętną powierzchnię z topionej krzemionki.

Podczas przejścia związków lotnych poddawanych analizie przez kolumnę kapilarną następuje ich oddziaływanie z fazą stacjonarną pokrywającą wewnętrzną powierzchnię kolumny. W wyniku różnych oddziaływań różnych związków elucja ma miejsce w różnym czasie – jest to tak zwany czas retencji związku chemicznego przy danym zbiorze parametrów analitycznych. Porównanie czasów retencji służy identyfikacji różnych związków chemicznych.

CZĘŚĆ A

PRZYGOTOWANIE ESTRÓW METYLOWYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH Z OLIWY Z OLIWEK ORAZ OLIWY Z WYTŁOCZYN Z OLIWEK

1. ZAKRES

W niniejszej części opisano przygotowanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych. Zawarto w niej metody przygotowania estrów metylowych kwasów tłuszczowych z oliw z oliwek oraz z oliw z wytłoczyn z oliwek.

2. ZAKRES ZASTOSOWANIA

Przygotowanie estrów metylowych kwasów tłuszczowych z oliw z oliwek oraz z oliw z wytłoczyn z oliwek przeprowadza się w drodze transestryfikacji roztworem metanolowym wodorotlenku potasu w temperaturze pokojowej. Konieczność oczyszczania próbki przed transestryfikacją zależy od zawartości wolnych kwasów tłuszczowych w próbce oraz od oznaczanych parametrów analitycznych; metodę można wybrać zgodnie z następującą tabelą:

Kategoria oliwy Metoda Oliwa z oliwek z pierwszego tłoczenia, o kwasowości ≤ 2,0 % 1. Kwasy tłuszczowe 2. Kwasy tłuszczowe trans 3. ΔECN42 (po oczyszczeniu żelem krzemionkowym SPE) Rafinowana oliwa z oliwek Oliwa z oliwek złożona z rafinowanej oliwy z oliwek i oliwy z oliwek z pierwszego tłoczenia Rafinowana oliwa z wytłoczyn z oliwek Oliwa z wytłoczyn z oliwek Oliwa z oliwek z pierwszego tłoczenia, o kwasowości > 2,0 % Surowa oliwa z wytłoczyn z oliwek 1. Kwasy tłuszczowe (po oczyszczeniu żelem krzemionkowym SPE) 2. Kwasy tłuszczowe trans (po oczyszczeniu żelem krzemionkowym SPE) 3. ΔECN42 (po oczyszczeniu żelem krzemionkowym SPE)

3. METODOLOGIA

3.1. Transestryfikacja roztworem metanolowym wodorotlenku potasu w temperaturze pokojowej

3.1.1. Zasada

Estry metylowe powstają w wyniku transestryfikacji roztworem metanolowym wodorotlenku potasu na etapie pośrednim przed zmydlaniem.

3.1.2. Odczynniki

3.1.2.1. Metanol o zawartości wody nieprzekraczającej 0,5 % (m/m).

3.1.2.2. Heksan, jakość chromatograficzna.

3.1.2.3. Heptan, jakość chromatograficzna.

3.1.2.4. Eter dietylowy do analizy, stabilizowany.

3.1.2.5. Aceton, jakość chromatograficzna.

3.1.2.6. Rozpuszczalnik elucyjny do oczyszczania oliwy metodą chromatografii kolumnowej/SPE, w mieszaninie heksanu z eterem dietylowym 87/13 (v/v).

3.1.2.7. Wodorotlenek potasu, roztwór metanolowy ok. 2M: rozpuścić 11,2 g wodorotlenku potasu w 100 ml metanolu.

3.1.2.8. Wkłady z żelem krzemionkowym, 1 g (6 ml), do ekstrakcji do fazy stałej.

3.1.3. Aparatura

3.1.3.1. Probówki zakręcane (objętość 5 ml), zakrętka z uszczelką PTFE.

3.1.3.2. Pipety miarowe lub automatyczne, 2 ml i 0,2 ml.

3.1.4. Oczyszczanie próbek oliwy

W razie potrzeby próbki można oczyścić przez przepuszczenie oliwy przez wkład z żelem krzemionkowym do ekstrakcji do fazy stałej. Wkład z żelem krzemionkowym (3.1.2.8) umieszcza się w elucyjnej aparaturze próżniowej i przemywa się 6 ml heksanu (3.1.2.2); przemywanie odbywa się bez próżni. Następnie do kolumny podaje się roztwór oliwy (około 0,12 g) w 0,5 ml heksanu (3.1.2.2). Roztwór przepuszcza się przez kolumnę, a następnie poddaje elucji mieszaniną 10 ml heksanu/eteru dietylowego (87:13 v/v) (3.1.2.6). Wszystkie eluaty są homogenizowane i dzielone na dwie podobne objętości. Podwielokrotność odparowuje się do suchości w wyparce obrotowej pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze pokojowej. Pozostałość rozpuszcza się w 1 ml heptanu i roztwór jest gotowy do analizy kwasów tłuszczowych metodą chromatografii gazowej. Drugą podwielokrotność odparowuje się, a pozostałość rozpuszcza się w 1 ml acetonu do analizy triglicerydów metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), jeśli jest to konieczne.

3.1.5. Procedura

W zakręcanej probówce o pojemności 5 ml (3.1.3.1) odważyć ok. 0,1 g próbki oliwy. Dodać 2 ml heptanu (3.1.2.2) i wstrząsnąć. Dodać 0,2 ml roztworu metanolowego wodorotlenku potasu (3.1.2.7), zamknąć nakrętką z uszczelką PTFE, zacisnąć nakrętkę i wstrząsać energicznie przez 30 sekund. Pozostawić do rozwarstwienia, aż górna warstwa roztworu stanie się klarowna. Dekantować górną warstwę zawierającą estry metylowe. Roztwór heptanu jest gotowy do wstrzyknięcia do chromatografu gazowego. Zaleca się przechowywanie roztworu w chłodziarce do czasu analizy metodą chromatografii gazowej. Nie zaleca się przechowywania roztworu dłużej niż przez 12 godzin.

CZĘŚĆ B

ANALIZA ESTRÓW METYLOWYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH METODĄ CHROMATOGRAFII GAZOWEJ

1. ZAKRES

Niniejsza część zawiera ogólne wytyczne stosowania chromatografii gazowej na kolumnach kapilarnych do oznaczania składu jakościowego i ilościowego mieszaniny estrów metylowych kwasów tłuszczowych uzyskanych zgodnie z metodą określoną w części A.

Niniejsza część nie stosuje się do spolimeryzowanych kwasów tłuszczowych.

2. ODCZYNNIKI

2.1. Gaz nośny

Gaz obojętny (hel lub wodór) dokładnie osuszony i zawierający mniej niż 10 mg/kg tlenu.

Uwaga 1: Wodór może dwukrotnie przyspieszyć analizę, ale stwarza zagrożenie. Istnieją jednak urządzenia zabezpieczające.

2.2. Gazy pomocnicze

2.2.1. Wodór (czystość ≥ 99,9 %) niezawierający zanieczyszczeń organicznych.

2.2.2. Powietrze lub tlen niezawierające zanieczyszczeń organicznych.

2.2.3. Azot (czystość > 99 %).

2.3. Produkty wzorcowania

Mieszanina estrów metylowych czystych kwasów tłuszczowych lub estrów metylowych substancji tłuszczowej o znanym składzie, o ile to możliwe jak najbardziej zbliżonym do składu substancji tłuszczowej poddawanej analizie. Izomery cis i trans, oktadekanowe, oktadekadienowe i oktadekatrienowe estrów metylowych są przydatne w identyfikacji izomerów trans kwasów nienasyconych.

Należy przedsięwziąć wszelkie środki ostrożności, aby zapobiec utlenieniu kwasów tłuszczowych wielonienasyconych.

3. APARATURA

Podane zalecenia dotyczą powszechnie stosowanego sprzętu do chromatografii gazowej z wykorzystaniem kolumn kapilarnych i detektora płomieniowo-jonizacyjnego.

3.1. Chromatograf gazowy

Chromatograf gazowy składa się z następujących elementów:

3.1.1. System dozowania

Należy korzystać z systemu dozowania z kolumnami kapilarnymi, przy czym system ten powinien być tak skonstruowany, aby można było go używać z takimi kolumnami. Może to być dozownik z rozdziałem strumienia lub dozownik typu on-column bez rozdziału strumienia.

3.1.2. Piec

Piec musi być w stanie nagrzać kolumnę kapilarną do temperatury co najmniej 260 °C i utrzymać pożądaną temperaturę z dokładnością do 0,1 °C. Ten drugi wymóg jest szczególnie istotny w przypadku użycia rurki z topionej krzemionki.

Stosowanie urządzenia wyposażonego w programator temperatury jest zalecane we wszystkich przypadkach, w szczególności w przypadku kwasów tłuszczowych o liczbie atomów węgla mniejszej niż 16.

3.1.3. Kolumna kapilarna

3.1.3.1. Rurka z materiału obojętnego w stosunku do badanych substancji (na ogół ze szkła lub topionej krzemionki). Wewnętrzna średnica musi mieścić się w przedziale 0,20–0,32 mm. Powierzchnia wewnątrz musi być poddana odpowiedniej obróbce (np. przygotowanie powierzchni, dezaktywacja) przed nałożeniem warstwy fazy stacjonarnej. Długość 60 m jest wystarczająca dla kwasów tłuszczowych oraz izomerów cis i trans kwasów tłuszczowych.

3.1.3.2. Odpowiednie są kolumny z fazą sieciowanych polisiloksanów polarnych (cyjanopropylosilikon).

Uwaga 2: Istnieje ryzyko, że polisiloksany polarne mogą spowodować trudności przy określaniu i rozdzielaniu kwasu linolenowego i kwasów C20.

Warstwy powinny być cienkie, tj. 0,1–0,2 μm.

3.1.3.3. Montaż i kondycjonowanie kolumny

Należy przestrzegać normalnych środków ostrożności obowiązujących przy czynnościach montażu kolumn kapilarnych, takich jak umieszczenie kolumny w piecu (podłoże), dobór i montaż połączeń (szczelność), rozmieszczenie końcówek kolumny w dozowniku i detektorze (zmniejszenie martwych przestrzeni). Umieścić kolumnę pod strumieniem gazu nośnego (na przykład o ciśnieniu 0,3 bara (30 kPa) dla kolumny o długości 25 m i średnicy wewnętrznej 0,3 mm).

Kondycjonować kolumnę, programując wzrost temperatury pieca na 3 °C/min od poziomu temperatury otoczenia aż do temperatury niższej o 10 °C od granicznej wartości temperatury, w której następuje rozpad fazy stacjonarnej. Utrzymywać tę temperaturę pieca przez jedną godzinę do momentu stabilizacji linii podstawowej. Obniżyć temperaturę do 180 °C, aby kontynuować pracę w warunkach stałej temperatury.

Uwaga 3: Odpowiednio prekondycjonowane kolumny są dostępne w handlu.

3.1.4. Detektor płomieniowo-jonizacyjny i konwerter-wzmacniacz

3.2. Strzykawka

Strzykawka musi mieć maksymalną pojemność 10 μl i być wyskalowana co 0,1 μl.

3.3. System odbioru danych

System odbioru danych, połączony bezpośrednio z detektorami i używany wraz z oprogramowaniem odpowiednim do integracji i normalizacji piku.

4. PROCEDURA

Szczegółowe zasady postępowania podane w pkt. 4.1–4.3 odnoszą się do stosowania detektora płomieniowo-jonizacyjnego.

4.1. Warunki badania

4.1.1. Dobór optymalnych warunków pracy dla kolumn kapilarnych

W związku ze sprawnością i drożnością kolumn kapilarnych rozdzielanie składników i czas trwania analizy zależą w bardzo dużym stopniu od natężenia przepływu gazu nośnego w kolumnie. Konieczne będzie zatem dokonanie optymalizacji warunków pracy przez dostosowanie tego parametru (lub spadku ciśnienia na wlocie kolumny) w zależności od tego, czy celem jest poprawa rozdzielania czy przyspieszenie analizy.

Poniższe warunki okazały się odpowiednie do rozdziału FAME (C4–C26). Przykładowe chromatogramy są zamieszczone w dodatku B:

Temperatura dozownika: 250 °C Temperatura detektora: 250 °C Temperatura pieca: 165 °C (8 min) do 210 °C przy 2 °C/min Gaz nośny wodór: ciśnienie na wlocie kolumny, 179 kPa Przepływ łącznie: 154,0 ml/min; Stosunek strumienia dzielonego: 1:100 Dozowana objętość: 1 μl

4.1.2. Określanie rozdzielczości (zob. dodatek A)

Obliczyć rozdzielczość R dwóch sąsiednich pików I i II, stosując wzór:

R = 2 × ((dr ( II ) – d r(I))/(ω(I) + ω(II))) lub R = 2 × ((tr ( II ) – t r(I))/(ω(I) + ω(II))) (USP) (United States Pharmacopeia),

lub

R = 1,18 × ((tr ( II ) – tr(I))/(ω0,5(I) + ω0,5(II))) (EP, BP, JP, DAB), (JP (Japanese Pharmacopeia), EP (Pharmacopée Européenne), BP (British Pharmacopeia))

gdzie:

d r(I) to odległość retencji piku I;

d r(II) to odległość retencji piku II;

t r(I) to czas retencji piku I;

t r(II) to czas retencji piku II;

ω(I) to szerokość piku I przy podstawie;

ω(II) to szerokość piku II przy podstawie;

ω0,5 to szerokość piku danego związku w połowie wysokości piku;

Jeżeli ω(I) ≈ ω(II), należy obliczyć R, korzystając z następujących wzorów:

R = (dr ( II ) – d r(I))/ω = (dr ( II ) – d r(I))/4σ

gdzie:

σ to odchylenie standardowe (zob. dodatek A, rys. 1).

Jeżeli odległość dr pomiędzy dwoma pikami d r(II) – d r(I) jest równa 4σ, wówczas współczynnik rozdzielczości R = 1.

Jeżeli dwa piki nie są całkowicie oddzielone, styczne do punktów przegięcia tych dwóch pików przecinają się w punkcie C. Aby oddzielić całkowicie te dwa piki, odległość między nimi musi być równa:

d r(II) – d r(I) = 6 σ skąd R = 1,5 (zob. dodatek A, rys. 3).

5. PREZENTACJA WYNIKÓW

5.1. Analiza jakościowa

Należy określić piki estrów metylowych próby z chromatogramu w dodatku B, rys. 1 w razie potrzeby przez interpolację lub przez porównanie z pikami mieszanin wzorcowych estrów metylowych (jak określono w pkt 2.3).

5.2. Analiza ilościowa

5.2.1. Oznaczanie składu

Należy obliczyć ułamek masowy w i poszczególnych estrów metylowych kwasów tłuszczowych, wyrażony jako wartość procentowa masy estrów metylowych, w następujący sposób:

5.2.2. Metoda obliczania

5.2.2.1. Przypadek ogólny

Obliczyć zawartość danego składnika i, wyrażoną jako wartość procentowa masy estrów metylowych, określając wartość procentową powierzchni odpowiedniego piku do sumy powierzchni wszystkich pików, stosując wzór:

wi = (Ai/ΣA) × 100

gdzie:

Ai to powierzchnia pod pikiem danego estru metylowego kwasu tłuszczowego i;

ΣA to suma powierzchni pod wszystkimi pikami dla wszystkich estrów metylowych kwasów tłuszczowych.

Wyniki podaje się z dokładnością do dwóch miejsc po przecinku.

Uwaga 4: Dla tłuszczów i olejów, ułamek masowy estrów metylowych kwasów tłuszczowych jest równy ułamkowi masowemu w przypadku triglicerydów w gramach na 100 g. W przypadkach, gdy takie założenie jest niedopuszczalne, zob. pkt. 5.2.2.2.

5.2.2.2. Stosowanie współczynników korygujących

W niektórych przypadkach, na przykład w obecności kwasów tłuszczowych o liczbie atomów węgla mniejszej niż osiem lub kwasów z grupami drugorzędowymi, powierzchnie koryguje się odpowiednimi współczynnikami korygującymi (Fci). Współczynniki te ustala się dla każdego instrumentu. W tym celu należy używać odpowiednich materiałów wzorcowych z certyfikowaną zawartością kwasów tłuszczowych w odpowiednim zakresie.

Uwaga 5: Współczynniki korygujące nie są identyczne z teoretycznymi współczynnikami korygującymi FID, które podano w dodatku A, ponieważ obejmują one również wydajność systemu dozowania itp. Jednakże w przypadku większych różnic, należy sprawdzić działanie całego systemu.

Dla tej mieszaniny wzorcowej ułamek masowy FAME i oblicza się zgodnie ze wzorem:

wi = (mi /Σm) × 100

gdzie:

m i to masa FAME i w mieszaninie wzorcowej;

Σm to suma mas różnych składników jako FAME w mieszaninie wzorcowej.

Na podstawie chromatogramu mieszaniny wzorcowej, należy obliczyć wartość procentową według powierzchni dla FAME i w następujący sposób:

wi = (Ai/ΣA) × 100

gdzie:

Ai to powierzchnia FAME i w mieszaninie wzorcowej;

ΣA to suma wszystkich powierzchni wszystkich FAME w mieszaninie wzorcowej.

Współczynnik korygujący Fc wynosi wówczas

Fc = (mi × ΣA)/(Ai/Σm)

Dla próbki ułamek masowy każdego FAME i wynosi:

wi = (Fi × Ai)/Σ (Fi × Ai)

Wyniki podaje się z dokładnością do dwóch miejsc po przecinku.

Uwaga 6: Obliczona wartość odpowiada wartości procentowej masy każdego kwasu tłuszczowego obliczonej jako zawartość triglicerydów w 100 g tłuszczu.

5.2.2.3. Stosowanie wzorca wewnętrznego

W niektórych analizach (na przykład wówczas, gdy nie wszystkie kwasy tłuszczowe są oznaczane ilościowo i obok kwasów C16 i C18 występują kwasy C4 i C6, lub gdy zachodzi konieczność oznaczenia bezwzględnej ilości kwasów tłuszczowych w próbce), niezbędne jest zastosowanie wzorca wewnętrznego. Stosowane są często kwasy tłuszczowe z 5, 15 lub 17 atomami węgla. Należy wyznaczyć współczynnik korygujący wewnętrznego wzorca (jeżeli zachodzi taka potrzeba).

Procentowy udział masy składnika i wyrażony jako estry metylowe jest określany wzorem:

wi = (mIS × Fi × Ai)/(m × FIS × AIS)

gdzie:

A i to powierzchnia FAME i;

A IS to powierzchnia wzorca wewnętrznego;

F i to współczynnik korygujący kwasu tłuszczowego i, wyrażony jako FAME;

F IS to współczynnik korygujący wzorca wewnętrznego;

m to masa naważki, w miligramach;

m IS to masa wzorca wewnętrznego, w miligramach;

Wyniki podaje się z dokładnością do dwóch miejsc po przecinku.

6. SPRAWOZDANIE Z BADANIA

Sprawozdanie z badania musi określać metody zastosowane do przygotowania estrów metylowych i do analizy za pomocą chromatografii gazowej. Musi także ujmować wszystkie dane operacyjne niesprecyzowane w niniejszej metodzie normatywnej lub uznane za fakultatywne, łącznie z danymi dotyczącymi incydentów, które mogły wpłynąć na wyniki.

W sprawozdaniu z badania podaje się wszystkie informacje konieczne do pełnej identyfikacji próbki.

7. PRECYZJA

7.1. Wyniki badania międzylaboratoryjnego

Szczegółowe dane odnośnie do badania międzylaboratoryjnego dotyczącego precyzji metody podano w załączniku C do normy IOC/T.20/Doc. No 33. Wartości uzyskane w tym badaniu międzylaboratoryjnym nie mogą mieć zastosowania do zakresów stężeń i matryc innych niż podane.

7.2. Powtarzalność

Różnica bezwzględna między dwoma niezależnymi wynikami oddzielnych badań uzyskanymi przy użyciu tej samej metody i materiału badanego, w tym samym laboratorium, przez tego samego operatora, na tym samym sprzęcie i w zbliżonym czasie, nie może być w więcej niż 5 % przypadków większa od »r« podanego w tabelach 1–14 w załączniku C do normy IOC/T.20/Doc. No 33.

7.3. Odtwarzalność

Różnica bezwzględna między dwoma wynikami oddzielnych badań uzyskanymi przy użyciu tej samej metody i materiału badanego, w różnych laboratoriach, przez różnych operatorów korzystających z różnego sprzętu, nie może być w więcej niż 5 % przypadków większa od »R« podanego w tabelach 1–14 w załączniku C do normy IOC/T.20/Doc. No 33.

Dodatek A Rysunek 1 ω0,5 – szerokość w połowie wysokości trójkąta (ABC) i b – szerokość w połowie wysokości trójkąta (NPM). Rysunek 2 Rysunek 3