PL Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej L 220/1

ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (WE) NR 761/2009

z dnia 23 lipca 2009 r.

zmieniające, w celu dostosowania do postępu technicznego, rozporządzenie (WE) nr 440/2008 ustalające metody badań zgodnie z rozporządzeniem (WE) nr 1907/2006 Parlamentu Europejskiego i Rady w sprawie rejestracji, oceny, udzielania zezwoleń i stosowanych ograniczeń w zakresie chemikaliów (REACH)

(Tekst mający znaczenie dla EOG)

KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH,

uwzględniając Traktat ustanawiający Wspólnotę Europejską,

uwzględniając rozporządzenie (WE) nr 1907/2006 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 18 grudnia 2006 r. w sprawie rejestracji, oceny, udzielania zezwoleń i stosowanych ograniczeń w zakresie chemikaliów (REACH), utworzenia Europejskiej Agencji Chemikaliów, zmieniające dyrektywę 1999/45/WE oraz uchylające rozporządzenie Rady (EWG) nr 793/93 i rozporządzenie Komisji (WE) nr 1488/94, jak również dyrektywę Rady 76/769/EWG i dyrektywy Komisji 91/155/EWG, 93/67/EWG, 93/105/WE i 2000/21/WE (1), w szczególności jego art. 13 ust. 3,

a także mając na uwadze, co następuje:

(1) Rozporządzenie Komisji (WE) nr 440/2008 (2) zawiera metody badań, służące określaniu właściwości fizykochemicznych, toksyczności oraz ekotoksyczności substancji, które należy stosować do celów rozporządzenia (WE) nr 1907/2006.

(2) Należy zaktualizować rozporządzenie (WE) nr 440/2008 w celu uwzględnienia zmian pewnych metod badania i włączenia kilku nowych metod badania przyjętych przez OECD. W sprawie tego wniosku skonsultowano się z zainteresowanymi stronami. Zmiany dostosowują powyższe metody do postępu naukowo-technicznego.

(3) Należy zmienić przepisy dotyczące prężności par w celu włączenia do nich nowej metody efuzji.

(4) Należy dodać nową metodę pomiaru długości włókien o geometrycznej średniej ważonej średnicy.

(5) Właściwe jest zaktualizowanie rozporządzenia (WE) nr 440/2008 w celu uwzględnienia jako priorytet nowej metody badania działania drażniącego na skórę in vitro, aby uzyskać zmniejszenie liczby zwierząt wykorzystywanych do celów doświadczalnych, zgodnie z dyrektywą Rady 86/609/EWG z dnia 24 listopada 1986 r. w sprawie zbliżenia przepisów ustawowych, wykonawczych i administracyjnych państw członkowskich dotyczących ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów doświadczalnych i innych celów naukowych (3). Mimo iż metoda badania działania drażniącego na skórę in vitro jest wciąż na etapie dyskusji w ramach OECD, w tym wyjątkowym przypadku należy uwzględnić ją w przedmiotowym rozporządzeniu. Metoda B 46 powinna być uaktualniona tak szybko, jak to możliwe po osiągnięciu porozumienia w ramach OECD, lub w przypadku dostępu do nowych informacji uzasadniających wprowadzenie zmian.

(6) Przepisy dotyczące badania inhibicji glonów należy poddać przeglądowi w celu uwzględnienia dodatkowych gatunków i spełnienia wymogów oceny zagrożeń i klasyfikacji chemikaliów.

(7) Należy dodać nową metodę pomiaru tlenowej mineralizacji na powierzchni wody, polegającą na symulacyjnym teście biodegradacji, oraz nową metodę oceny toksyczności dla rodzaju Lemna, polegającą na teście zahamowania wzrostu.

(8) Należy zatem odpowiednio zmienić rozporządzenie (WE) nr 440/2008.

(9) Środki przewidziane w niniejszym rozporządzeniu są zgodnie z opinią komitetu ustanowionego na mocy art. 133 rozporządzenia (WE) nr 1907/2006,

PRZYJMUJE NINIEJSZE ROZPORZĄDZENIE:

Artykuł 1

W załączniku do rozporządzenia (WE) nr 440/2008 wprowadza się następujące zmiany:

1) w części A wprowadza się następujące zmiany: a) rozdział A.4 zastępuje się rozdziałem A.4 w brzmieniu określonym w załączniku I do niniejszego rozporządzenia; b) dodaje się rozdział A.22 w brzmieniu określonym w załączniku II do niniejszego rozporządzenia;

2) w części B wprowadza się następujące zmiany: dodaje się rozdział B.46 w brzmieniu określonym w załączniku III do niniejszego rozporządzenia;

3) w części C wprowadza się następujące zmiany: a) rozdział C.3 zastępuje się rozdziałem C.3 w brzmieniu określonym w załączniku IV do niniejszego rozporządzenia; b) dodaje się rozdziały C.25 i C.26 w brzmieniu określonym w załączniku V i VI do niniejszego rozporządzenia.

Artykuł 2

Niniejsze rozporządzenie wchodzi w życie trzeciego dnia po jego opublikowaniu w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej.

Niniejsze rozporządzenie wiąże w całości i jest bezpośrednio stosowane we wszystkich państwach członkowskich. Sporządzono w Brukseli dnia 23 lipca 2009 r. W imieniu Komisji Stavros DIMAS Członek Komisji

(1) Dz.U. L 396 z 30.12.2006, s. 1.

(2) Dz.U. L 142 z 31.5.2008, s. 1.

(3) Dz.U. L 358 z 18.12.1986, s. 1.

Załącznik I A.4. Ciśnienie pary 1. METODA Niniejsza metoda odpowiada wytycznej OECD TG 104 (2004). 1.1. WSTĘP Niniejsza zmieniona wersja metody A.4 (1) zawiera jedną dodatkową metodę: metodę efuzji, opartą na termograwimetrii izotermicznej, przeznaczoną do substancji chemicznych o bardzo niskich ciśnieniach (do 10–10 Pa). Wobec zapotrzebowania na procedury, zwłaszcza dotyczące wyznaczania ciśnienia pary dla substancji o bardzo niskim ciśnieniu pary, dokonano ponownej oceny innych procedur niniejszej metody pod względem zakresu stosowalności. W stanie równowagi termodynamicznej ciśnienie pary substancji czystej jest jedynie funkcją temperatury. Podstawowe zasady opisano w innym miejscu (2)(3). Nie ma jednej procedury pomiarowej, która miałaby zastosowanie do całego zakresu ciśnień pary, od poniżej 10–10 aż do 105 Pa. Niniejsza metoda obejmuje osiem metod pomiaru ciśnienia pary, które mogą być stosowane w różnych zakresach ciśnienia. Porównanie poszczególnych metod pod względem zastosowania i zakresu pomiarowego przedstawiono w tabeli 1. Metody te można stosować tylko do związków, które nie rozkładają się w warunkach badania. W przypadkach gdy ze względów technicznych nie można zastosować metod doświadczalnych, ciśnienie pary można również oszacować, a zalecaną metodę szacowania przedstawiono w dodatku. 1.2. DEFINICJE I JEDNOSTKI Ciśnienie pary substancji określa się jako ciśnienie nasycenia nad substancją w stanie stałym lub ciekłym. Należy używać jednostki ciśnienia obowiązującej w układzie SI, którą jest paskal (Pa). Poniżej podano inne jednostki, które były stosowane historycznie, wraz z ich współczynnikami przeliczeniowymi: 1 tor = 1 mm Hg = 1,333 × 102 Pa 1 atmosfera = 1,013 × 105 Pa 1 bar = 105 Pa Jednostką temperatury w układzie SI jest kelwin (K). Przeliczenia stopni Celsjusza na kelwiny dokonuje się według wzoru: T = t + 273,15 gdzie T jest temperaturą w skali Kelwina lub temperaturą termodynamiczną, zaś t jest temperaturą w skali Celsjusza. Tabela 1 Metoda pomiarowa Substancje Szacowana powtarzalność Szacowana odtwarzalność Zalecany zakres Stałe Ciekłe Metoda dynamiczna Łatwotopliwe Tak do 25 % 1–5 % do 25 % 1–5 % 103 Pa do 2 × 103 Pa 2 × 103 Pa do 105 Pa Metoda statyczna Tak Tak 5–10 % 5–10 % 10 Pa do 105 Pa 10–2 Pa do 105 Pa (1) Metoda izoteniskopowa Tak Tak 5–10 % 5–10 % 102 Pa do 105 Pa Metoda efuzji: równowaga ciśnienia pary Tak Tak 5–20 % do 50 % 10–3 do 1 Pa Metoda efuzji: komórka Knudsena Tak Tak 10–30 % — 10–10 do 1 Pa Metoda efuzji: grawimetria izotermiczna Tak Tak 5–30 % do 50 % 10–10 do 1 Pa Metoda nasycania gazu Tak Tak 10–30 % do 50 % 10–10 do 103 Pa Metoda wirującego rotora Tak Tak 10–20 % — 10–4 do 0,5 Pa 1.3. ZASADA BADANIA Na ogół ciśnienie pary wyznacza się w różnych temperaturach. W ograniczonym zakresie temperatury logarytm ciśnienia pary substancji czystej jest liniową funkcją odwrotności temperatury termodynamicznej, zgodnie z uproszczonym równaniem Clapeyrona-Clausiusa: gdzie: p = ciśnienie pary w paskalach, ΔHv = ciepło parowania w J mol–1, R = uniwersalna stała gazowa: 8,314 J mol–1 K–1, T = temperatura w K. 1.4. SUBSTANCJE ODNIESIENIA Nie ma potrzeby stosowania substancji odniesienia. Służą one głównie do sporadycznego sprawdzenia działania metody, jak również do umożliwienia porównania wyników uzyskanych różnymi metodami. 1.5. OPIS METODY 1.5.1. Metoda dynamiczna (metoda Cottrella) 1.5.1.1. Zasada Ciśnienie pary wyznacza się, mierząc temperaturę wrzenia substancji przy różnych określonych wartościach ciśnienia w przybliżonych granicach od 103 do 105 Pa. Metoda ta jest również zalecana do wyznaczania temperatury wrzenia. Do tego celu jest ona użyteczna do temperatury 600 K. Temperatury wrzenia cieczy są o około 0,1 °C wyższe na głębokości 3 do 4 cm niż na powierzchni z powodu ciśnienia słupa cieczy. W metodzie Cottrella (4) termometr umieszcza się w parze powyżej powierzchni cieczy tak, iż wrząca ciecz w sposób ciągły omywa zbiornik termometru. Zbiornik termometru pokrywa cienka warstwa cieczy, która jest w równowadze z parą pod ciśnieniem atmosferycznym. W ten sposób termometr wskazuje rzeczywistą temperaturę wrzenia, bez błędów powodowanych przegrzaniem lub ciśnieniem hydrostatycznym. Pompę pierwotnie zastosowaną przez Cottrella przedstawiono na rysunku 1. Rurka A zawiera wrzącą ciecz. Wtopiony w dno platynowy drut B ułatwia równomierne wrzenie. Boczna rurka C prowadzi do skraplacza, zaś osłona D zapobiega przedostawaniu się zimnych skroplin do termometru E. Podczas wrzenia cieczy zawartej w rurce A wychwycone przez lejek pęcherzyki i ciecz są wylewane poprzez dwa ramiona pompki F na zbiornik termometru. Rysunek 1 Rysunek 2 Pompa Cottrella (4) A: Termopara B: Próżniowa objętość buforowa C: Ciśnieniomierz D: Próżnia E: Punkt pomiarowy F: Element grzewczy ok. 150 W 1.5.1.2. Przyrząd Na rysunku 2 przedstawiono bardzo dokładny przyrząd wykorzystujący zasadę Cottrella. Składa się on z rurki z sekcją wrzenia w dolnej części, chłodnicą w części środkowej oraz wylotem i kołnierzem w części górnej. Pompa Cottrella jest umieszczona w sekcji wrzenia, która jest ogrzewana za pomocą wkładu elektrycznego. Temperatura jest mierzona przez termoparę z osłoną lub termometr oporowy wprowadzony poprzez kołnierz u góry. Wylot jest podłączony do układu regulacji ciśnienia. Układ ten zawiera pompę próżniową, objętość buforową, manostat do wpuszczania azotu celem regulacji ciśnienia oraz manometr. 1.5.1.3. Procedura Substancję umieszcza się w sekcji wrzenia. W przypadku niesproszkowanych ciał stałych można napotkać problemy, lecz niekiedy można je rozwiązać, ogrzewając płaszcz chłodzący. Przyrząd zamyka się szczelnie na kołnierzu, a substancję poddaje się odgazowaniu. Metoda ta nie nadaje się do pomiaru substancji pieniących się. Następnie nastawia się najniższe żądane ciśnienie i włącza się ogrzewanie. Równocześnie czujnik temperatury podłącza się do rejestratora. Równowaga jest osiągnięta, gdy przy stałym ciśnieniu rejestrowana jest stała temperatura wrzenia. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie dopuścić do uderzenia podczas wrzenia. Ponadto musi nastąpić całkowite skroplenie na chłodnicy. Podczas oznaczania ciśnienia pary łatwotopliwych substancji stałych należy zachować ostrożność, aby nie dopuścić do zablokowania skraplacza. Po zarejestrowaniu punktu równowagi nastawia się wyższe ciśnienie. Proces kontynuuje się w ten sposób aż do osiągnięcia ciśnienia 105 Pa (uzyskując ogółem około 5 do 10 punktów pomiarowych). Dla sprawdzenia należy powtórzyć punkty równowagi przy malejących ciśnieniach. 1.5.2. Metoda statyczna 1.5.2.1. Zasada W metodzie statycznej (5) ciśnienie pary w stanie równowagi termodynamicznej wyznacza się w określonej temperaturze. Metoda ta nadaje się do substancji i cieczy wieloskładnikowych oraz ciał stałych w przedziale od 10–1 do 105 Pa, a pod warunkiem zachowania staranności również w przedziale od 1 do 10 Pa. 1.5.2.2. Przyrząd Przyrząd pomiarowy składa się z łaźni stałotemperaturowej (dokładność ±0,2 K), pojemnika na próbkę podłączonego do przewodu próżniowego, manometru oraz układu do regulacji ciśnienia. Komora próbki (rysunek 3a) jest podłączona do przewodu próżniowego poprzez zawór i manometr różnicowy (U-rurkę zawierającą odpowiednią ciecz manometryczną), który służy jako wskaźnik zera. Do zastosowania w manometrze różnicowym nadają się: rtęć, silikony i ftalany, w zależności od zakresu ciśnienia i zachowania się badanej substancji pod względem chemicznym. Ze względu na ochronę środowiska naturalnego należy w miarę możliwości unikać stosowania rtęci. Badana substancja nie może w dostrzegalny sposób rozpuszczać się w cieczy zawartej w U-rurce ani wchodzić z nią w reakcje. Zamiast U-rurki można użyć ciśnieniomierza (rysunek 3b). W manometrze można stosować rtęć w zakresie od ciśnienia normalnego do 102 Pa, natomiast płyny silikonowe i ftalany nadają się do użycia w zakresie ciśnienia poniżej 102 Pa aż do 10 Pa. Istnieją inne ciśnieniomierze, których można używać przy ciśnieniu poniżej 102 Pa, zaś podgrzewanych przeponowych manometrów pojemnościowych można używać nawet przy ciśnieniu poniżej 10–1 Pa. Temperaturę mierzy się na zewnętrznej ścianie zbiornika zawierającego próbkę lub w samym zbiorniku. 1.5.2.3. Procedura Używając przyrządu przedstawionego na rysunku 3a, napełnić U-rurkę wybraną cieczą, którą przed dokonaniem odczytów należy odgazować w podwyższonej temperaturze. Badaną substancję umieszcza się w przyrządzie i odgazowuje w obniżonej temperaturze. W przypadku próbki wieloskładnikowej temperatura powinna być dostatecznie niska dla zapewnienia, że skład materiału nie ulegnie zmianie. Równowagę można osiągnąć szybciej dzięki mieszaniu. Próbkę można schłodzić za pomocą ciekłego azotu lub suchego lodu, lecz należy zachować ostrożność, aby nie dopuścić do skroplenia powietrza lub cieczy pompy. Przy otwartym zaworze nad zbiornikiem próbki włącza się na kilka minut zasysanie, aby usunąć powietrze. W razie potrzeby operację odgazowania powtarza się wielokrotnie. Rysunek 3a Rysunek 3b Gdy próbka jest podgrzewana przy zamkniętym zaworze, ciśnienie pary wzrasta. Powoduje to zmianę równowagi cieczy w U-rurce. Aby skompensować tę zmianę, do przyrządu wprowadza się azot lub powietrze, aż do ponownego wyzerowania się różnicowego wskaźnika ciśnienia. Wymagane do tego ciśnienie można odczytać z manometru lub z przyrządu o wyższej dokładności. Ciśnienie to odpowiada ciśnieniu pary substancji w temperaturze pomiaru. Używając przyrządu przedstawionego na rysunku 3b, ciśnienie pary odczytuje się bezpośrednio. Ciśnienie pary wyznacza się w odpowiednio małych odstępach czasu (w sumie około 5–10 punktów pomiarowych) aż do żądanego maksimum temperatury. Dla sprawdzenia należy powtórzyć odczyty przy malejącej temperaturze. Jeżeli wartości otrzymane z powtórzonych odczytów nie pokrywają się z krzywą uzyskaną dla temperatury rosnącej, to może to wynikać z jednej z następujących sytuacji: (i) próbka nadal zawiera powietrze (np. w przypadku substancji o dużej lepkości) lub substancje o niskiej temperaturze wrzenia, wydzielające się podczas ogrzewania; (ii) substancja ulega reakcji chemicznej w badanym zakresie temperatury (np. rozkładowi, polimeryzacji). 1.5.3. Metoda z użyciem izoteniskopu 1.5.3.1. Zasada Izoteniskop (6) oparty jest na zasadzie metody statycznej. Metoda ta polega na umieszczeniu próbki w bańce utrzymywanej w stałej temperaturze i podłączonej do manometru oraz pompy próżniowej. Zanieczyszczenia bardziej lotne od badanej substancji usuwa się przez odgazowanie przy obniżonym ciśnieniu. Ciśnienie pary próbki w wybranych temperaturach jest równoważone znanym ciśnieniem gazu obojętnego. Izoteniskop został skonstruowany do pomiaru ciśnienia pary pewnych ciekłych węglowodorów, lecz nadaje się również do badania substancji stałych. Metoda ta zwykle nie nadaje się do układów wieloskładnikowych. Wyniki obciążone są jedynie nieznacznym błędem w przypadku próbek zawierających zanieczyszczenia nielotne. Zalecany zakres wynosi od 102 do 105 Pa. 1.5.3.2. Przyrząd Przykład urządzenia pomiarowego przedstawiono na rysunku 4. Pełny opis można znaleźć w ASTM D 2879–86 (6). 1.5.3.3. Procedura W przypadku cieczy badana substancja sama służy jako płyn w manometrze różnicowym. Do izoteniskopu wprowadza się ilość cieczy wystarczającą do wypełnienia bańki i krótszego ramienia manometru. Izoteniskop przyłącza się do układu próżniowego i usuwa z niego powietrze, a następnie napełnia azotem. Opróżnianie i oczyszczanie układu powtarza się dwukrotnie, aby usunąć resztki tlenu. Napełniony izoteniskop ustawia się w położeniu poziomym, tak aby próbka rozłożyła się cienką warstwą w bańce próbnej i manometrze. Ciśnienie w układzie obniża się do 133 Pa, a próbkę łagodnie się ogrzewa, aż zacznie wrzeć (usunięcie rozpuszczonych gazów). Następnie izoteniskop ustawia się, tak aby próbka powróciła do bańki i napełniła krótsze ramię manometru. Ciśnienie utrzymywane jest na poziomie 133 Pa. Wyciąganą końcówkę bańki próbkowej podgrzewa się małym płomieniem, aż wydzielona z próbki para rozpręży się dostatecznie, aby wyprzeć część próbki z górnej części bańki i ramienia manometru, tworząc wypełnioną parą przestrzeń wolną od azotu. Izoteniskop umieszcza się następnie w łaźni stałotemperaturowej, a ciśnienie azotu nastawia się, tak aby równe było ciśnieniu próbki. W stanie równowagi ciśnienie azotu równe jest ciśnieniu pary substancji. Rysunek 4 W przypadku substancji stałych i w zależności od zakresu ciśnienia i temperatury stosuje się ciecze manometryczne, takie jak płyny silikonowe lub ftalany. Odgazowaną ciecz manometryczną umieszcza się w bańce wykonanej na długim ramieniu izoteniskopu. Następnie badaną substancję stałą wkłada się do bańki próbkowej i odgazowuje w podwyższonej temperaturze. Po wykonaniu tego izoteniskop przechyla się, tak aby ciecz manometryczna mogła wpłynąć do U-rurki. 1.5.4. Metoda efuzji: równowaga ciśnienia pary (7) 1.5.4.1. Zasada Próbkę badanej substancji ogrzewa się w małym piecu i umieszcza w dzwonie szklanym, w którym wytworzono próżnię. Piec przykryty jest pokrywą, która posiada niewielkie otwory o znanej średnicy. Ulatniająca się przez otwory para substancji kierowana jest na szalę wagi o wysokiej czułości, która również jest zamknięta w opróżnionym dzwonie szklanym. W niektórych rozwiązaniach konstrukcyjnych szala wagi umieszczona jest w komorze chłodzącej, która zapewnia odprowadzenie ciepła na zewnątrz. Promieniowanie powoduje ochłodzenie szali wagi, tak iż ulatniająca się para skrapla się na niej. Pęd strumienia pary działa na szalę jak siła. Ciśnienie pary można wyprowadzić dwoma sposobami: bezpośrednio z siły działającej na szalę wagi oraz z szybkości parowania przy użyciu równania Hertza-Knudsena (2): gdzie: G = szybkość parowania (kg s–1 m–2), M = masa molowa (g mol–1), T = temperatura (K), R = uniwersalna stała gazowa (J mol–1 K–1), P = ciśnienie pary (Pa). Zalecany zakres wynosi od 10–3 do 1 Pa. 1.5.4.2. Przyrząd Schemat ideowy przyrządu pomiarowego zilustrowano na rysunku 5. Rysunek 5 A: Płyta podstawy F: Komora chłodząca i pręt chłodzący B: Przyrząd z ruchomą cewką G: Piec wyparki C: Dzwon szklany H: Naczynie Dewara z ciekłym azotem D: Waga z szalą I: Pomiar temperatury próbki E: Urządzenie do pomiaru próżni J: Badana substancja 1.5.5. Metoda efuzji: komórka Knudsena 1.5.5.1. Zasada Metoda ta polega na oszacowaniu masy badanej substancji w postaci pary wypływającej w jednostce czasu z komórki Knudsena (8) przez mikrootwór w warunkach wysokiej próżni. Masę pary, która wypłynęła, można określić poprzez wyznaczenie straty masy komórki lub przez skroplenie pary w niskiej temperaturze i wyznaczenie masy ulotnionej substancji przy pomocy chromatografii. Ciśnienie pary oblicza się stosując zależność Hertza-Knudsena (zob. sekcja 1.5.4.1) ze współczynnikami korekcji w zależności od parametrów przyrządu pomiarowego (9). Zalecany zakres wynosi od 10–10 do 1 Pa (10)(11)(12)(13)(14). 1.5.5.2. Przyrząd Schemat ideowy przyrządu pomiarowego zilustrowano na rysunku 6. Rysunek 6 1: Podłączenie do układu próżniowego 7: Pokrywa gwintowana 2: Pochwy platynowego termometru oporowego lub urządzenia do pomiaru i regulacji temperatury 8: Nakrętki motylkowe 3: Pokrywa zbiornika próżniowego 9: Śruby 4: Pierścień uszczelniający (O-ring) 10: Komórki efuzyjne ze stali nierdzewnej 5: Aluminiowy zbiornik próżniowy 11: Wkładka grzewcza 6: Urządzenie do zakładania i wyjmowania komórek efuzyjnych 1.5.6. Metoda efuzji: termograwimetria izotermiczna 1.5.6.1. Zasada Metoda ta polega na wyznaczeniu szybkości przyspieszonego parowania badanej substancji w podwyższonych temperaturach i pod ciśnieniem otoczenia przy pomocy grawimetrii (10)(15)(16)(17)(18)(19)(20). Wartości szybkości parowania vT otrzymuje się, poddając wybrany związek działaniu atmosfery powoli płynącego gazu obojętnego i obserwując utratę ciężaru w określonych, stałych temperaturach T (wyrażonych w kelwinach) w ciągu odpowiednich okresów. Wartości ciśnienia pary pT oblicza się na podstawie wartości vT przy użyciu liniowej zależności pomiędzy logarytmem ciśnienia pary i logarytmem szybkości parowania. W razie potrzeby można dokonać ekstrapolacji do temperatur 20 i 25 °C za pomocą analizy regresji log pT w zależności od 1/T. Metoda ta nadaje się do substancji o ciśnieniu pary sięgającym minimum 10–10 Pa (10–12 mbar) i o czystości możliwie jak najbliższej 100 % dla uniknięcia błędnej interpretacji zmierzonych wartości utraty ciężaru. 1.5.6.2. Przyrząd Schemat ideowy zestawu doświadczalnego przedstawiono na rysunku 7. Rysunek 7 Płytka nośna próbki, zawieszona na mikrowadze w komorze o regulowanej temperaturze, jest omiatana strumieniem suchego gazowego azotu, który porywa odparowane cząsteczki badanej substancji. Po opuszczeniu komory strumień gazu jest oczyszczany przez urządzenie sorpcyjne. 1.5.6.3. Procedura Badaną substancję nakłada się na powierzchnię chropowatej płytki szklanej w postaci jednorodnej warstwy. W przypadku substancji stałych płytkę zwilża się równomiernie roztworem substancji w odpowiednim rozpuszczalniku i suszy w atmosferze obojętnej. Do celu pomiaru pokrytą płytkę zawiesza się w analizatorze termograwimetrycznym, a następnie mierzy się w sposób ciągły utratę jej ciężaru w funkcji czasu. Szybkość parowania vT w określonej temperaturze oblicza się na podstawie utraty ciężaru Δm płytki próbnej za pomocą wzoru: gdzie F jest polem powierzchni nałożonej substancji badanej, zwykle równym polu powierzchni płytki próbnej, zaś t jest czasem utraty ciężaru Δm. Ciśnienie pary pT oblicza się na podstawie szybkości parowania vT, za pomocą wzoru: Log pT = C + D log vT gdzie C i D są stałymi charakterystycznymi dla użytego zestawu doświadczalnego, zależnymi od średnicy komory pomiarowej i od natężenia przepływu gazu. Stałe te należy wyznaczyć raz poprzez wykonanie pomiaru dla grupy związków o znanym ciśnieniu pary i dokonanie regresji zależności log pT od log vT (11)(21)(22). Zależność pomiędzy ciśnieniem pary pT a temperaturą T w kelwinach jest dana wzorem: Log pT = A + B 1/T gdzie A i B są stałymi uzyskanymi z regresji zależności log pT od 1/T. Za pomocą tego równania można obliczyć ciśnienie pary dla dowolnej innej temperatury przez ekstrapolację. 1.5.7. Metoda nasycania gazu (23) 1.5.7.1. Zasada Gaz obojętny o temperaturze pokojowej przepuszcza się przy znanym natężeniu przepływu przez próbkę badanej substancji lub ponad nią dostatecznie powoli, aby zapewnić nasycenie. Osiągnięcie nasycenia w fazie gazowej ma decydujące znaczenie. Przenoszona substancja jest wychwytywana (zwykle przy użyciu sorbentu), po czym określa się jej ilość. Alternatywnie wobec wychwytywania i analizy pary, do określenia ilości przenoszonego materiału można wykorzystać współbieżne techniki analityczne, np. chromatografię gazową. Ciśnienie pary oblicza się w oparciu o założenia, że zachowane jest prawo gazu doskonałego i że całkowite ciśnienie mieszaniny gazów jest równe sumie ciśnień gazów będących jej składnikami. Ciśnienie cząstkowe badanej substancji, tj. ciśnienie pary, oblicza się ze znanej całkowitej objętości gazu i masy przenoszonego materiału. Procedura nasycania gazu ma zastosowanie do stałych lub ciekłych substancji chemicznych. Może być stosowana do ciśnień pary sięgających minimum 10–10 Pa (10)(11)(12)(13)(14). Metoda ta jest najbardziej pewna dla ciśnień pary poniżej 103 Pa. Powyżej tej wartości ciśnienie pary jest zwykle oszacowywane zbyt wysoko, prawdopodobnie na skutek tworzenia się aerozolu. Ponieważ pomiary ciśnienia pary wykonuje się w temperaturze pokojowej, nie ma konieczności ekstrapolacji danych z wysokich temperatur i unika się wynikających stąd często poważnych błędów. 1.5.7.2. Przyrząd Procedura wymaga użycia komory stałotemperaturowej. Szkic na rysunku 8 przedstawia komorę zawierającą po trzy pojemniki na próbki stałe i ciekłe, które umożliwiają potrojenie analizy próbki stałej substancji stałej lub ciekłej. Temperatura jest regulowana z dokładnością do ±0,5 °C lub lepszą. Rysunek 8 Zwykle jako obojętny gaz nośny używany jest azot, lecz niekiedy może być wymagany inny gaz (24). Gaz nośny musi być suchy. Strumień gazu zostaje rozdzielony na 6 strumieni regulowanych przez zawory iglicowe (o wielkości otworu ok. 0,79 mm) i wpływa do skrzynki poprzez rurkę miedzianą o średnicy wewnętrznej 3,8 mm. Po wyrównaniu się temperatury gaz przepływa przez próbkę i pułapkę sorbentową, a następnie wypływa z komory. Próbki substancji stałych umieszcza się w rurce szklanej o średnicy wewnętrznej 5 mm pomiędzy korkami z waty szklanej (zob. rysunek 9). Rysunek 10 przedstawia pojemnik na próbkę ciekłą i układ sorbentu. Najwyższą odtwarzalność pomiaru ciśnienia pary cieczy zapewnia metoda polegająca na oblaniu cieczą perełek szklanych lub obojętnego sorbentu (np. krzemionki) i napełnieniu zbiornika tymi perełkami. Alternatywnie gaz nośny można przepuścić przez grubą frytę, a następnie w postaci pęcherzyków przez kolumnę z badaną substancją ciekłą. Rysunek 9 Rysunek 10 Układ sorbentu zawiera przednią i rezerwową sekcję sorbentu. Przy bardzo niskich ciśnieniach pary na sorbencie zatrzymywane są jedynie małe ilości i poważnym problemem może być adsorpcja na wełnie szklanej i rurce szklanej pomiędzy próbką a sorbentem. Innym skutecznym sposobem zbierania odparowanego materiału są pułapki chłodzone stałym CO2. Nie powodują one wstecznego ciśnienia na kolumnie saturatora, a ponadto łatwe jest wybranie wychwyconego materiału w sposób ilościowy. 1.5.7.3. Procedura Natężenie przepływu wypływającego gazu nośnego mierzy się w temperaturze pokojowej. Natężenie przepływu jest często sprawdzane w trakcie doświadczenia w celu zapewnienia jego odpowiedniej wartości dla łącznej objętości gazu nośnego. Zaleca się pomiar ciągły za pomocą przepływomierza masowego. Nasycenie fazy gazowej może wymagać znacznego czasu kontaktu, a zatem dość niskiego natężenia przepływu gazu (25). Na koniec doświadczenia analizę przeprowadza się oddzielnie dla przedniej i rezerwowej sekcji sorbentu. Związek w każdej sekcji desorbuje się przez dodanie rozpuszczalnika. Otrzymane w wyniku tego roztwory poddaje się analizie ilościowej w celu określenia masy zdesorbowanej z każdej sekcji. O wyborze metody analitycznej (a także o wyborze sorbentu i rozpuszczalnika desorbującego) decyduje charakter badanej substancji. Sprawność desorpcji wyznacza się przez wstrzyknięcie znanej ilości próbki do sorbentu, zdesorbowanie jej i przeprowadzenie analizy odzyskanej ilości. Ważne jest, aby sprawność desorpcji sprawdzić przy stężeniu próbki występującym w warunkach badania lub zbliżonym do niego. Aby zapewnić nasycenie gazu nośnego badaną substancją stosuje się trzy różne natężenia przepływu. Jeżeli obliczone ciśnienie pary wykazuje brak zależności od natężenia przepływu, gaz uznaje się za nasycony. Ciśnienie pary oblicza się przy pomocy równania: gdzie: p = ciśnienie pary (Pa), W = masa odparowanej substancji (g), V = objętość nasyconego gazu (m3), R = uniwersalna stała gazowa 8,314 (J mol–1 K–1), T = temperatura (K), M = masa molowa badanej substancji (g mol–1). Zmierzone wartości należy skorygować pod względem różnic ciśnienia i temperatury pomiędzy przepływomierzem a saturatorem. 1.5.8. Wirujący rotor 1.5.8.1. Zasada Metoda ta wykorzystuje lepkościomierz z wirującym rotorem, w którym elementem pomiarowym jest kulka stalowa zawieszona w polu magnetycznym i wprowadzana w ruch przez wirujące pola (26)(27)(28). Pomiar prędkości jej wirowania umożliwiają cewki przetwornikowe. Po osiągnięciu przez kulkę określonej prędkości obrotowej (zwykle około 400 obrotów na sekundę) zasilanie energią zostaje wyłączone i następuje wytracanie prędkości spowodowane tarciem gazu. Spadek prędkości obrotowej mierzony jest w funkcji czasu. Ciśnienie pary wyznacza się na podstawie zależnego od ciśnienia spowalniania ruchu kulki stalowej. Zalecany zakres wynosi od 10–4 do 0,5 Pa. 1.5.8.2. Przyrząd Schemat zestawu doświadczalnego pokazano na rysunku 11. Głowicę pomiarową umieszcza się w komorze o stałej temperaturze regulowanej z dokładnością do 0,1 °C. Pojemnik z próbką umieszcza się w oddzielnej komorze, w której temperatura jest również regulowana z dokładnością do 0,1 °C. Wszystkie pozostałe części zestawu są utrzymywane w wyższej temperaturze, aby zapobiec kondensacji. Cały przyrząd połączony jest z układem wysokopróżniowym. Rysunek 11 2. DANE I SPORZĄDZENIE SPRAWOZDANIA 2.1. DANE Ciśnienie pary badane dowolną z powyższych metod należy wyznaczyć dla co najmniej dwóch temperatur. Zaleca się przeprowadzenie pomiarów dla trzech lub więcej wartości temperatury w przedziale od 0 do 50 °C, aby sprawdzić liniowość krzywej ciśnienia pary. W przypadku metody efuzji (komórki Knudsena i termograwimetrii izotermicznej) oraz metody nasycania gazu zaleca się zakres temperatury pomiaru w granicach od 120 do 150 °C, zamiast od 0 do 50 °C. 2.2. SPRAWOZDANIE Z BADANIA Sprawozdanie z badania musi zawierać następujące informacje: — wskazanie zastosowanej metody, — dokładne określenie substancji (nazwa i zanieczyszczenia) oraz zabieg wstępnego oczyszczania, o ile jest zastosowany, — co najmniej dwie — a najlepiej trzy lub więcej — wartości ciśnienia pary i temperatury wymagane w przedziale od 0 do 50 °C (lub od 120 do 150 °C), — co najmniej jedna z wartości temperatury powinna wynosić 25 °C lub poniżej, jeżeli jest to technicznie możliwe zgodnie z wybraną metodą, — wszystkie dane wyjściowe, — krzywą zależności log p od 1/T, — oszacowanie ciśnienia pary w temperaturze 20 lub 25 °C. Jeśli obserwowana jest przemiana (zmiana stanu, rozkład), to należy podać następujące informacje: — charakter zmiany, — temperaturę, w której zachodzi zmiana przy ciśnieniu atmosferycznym, — ciśnienie pary w temperaturze 10 i 20 °C poniżej temperatury przemiany oraz 10 i 20 °C powyżej tej temperatury (chyba że przemiana zachodzi ze stanu stałego w gazowy). Należy podać wszystkie informacje i uwagi mające znaczenie dla interpretacji wyników, zwłaszcza w odniesieniu do zanieczyszczeń i fizycznego stanu substancji. 3. LITERATURA (1) Dziennik Urzędowy Wspólnot Europejskich L 383 A, 26–47 (1992). (2) Ambrose, D. (1975). Experimental Thermodynamics, Vol. II, Le Neindre, B., Vodar, B., Eds., Butterworths, London. (3) Weissberger R., ed. (1959). Technique of Organic Chemistry, Physical Methods of Organic Chemistry, 3rd ed., Vol. I, Part I. Chapter IX, Interscience Publ., New York. (4) Glasstone, S. (1946). Textbook of Physical Chemistry, 2nd ed., Van Nostrand Company, New York. (5) NF T 20–048 AFNOR (September 1985). Chemical products for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within a range from 10–1 to 105 Pa — Static method. (6) ASTM D 2879–86, Standard test method for vapour pressure — temperature relationship and initial decomposition temperature of liquids by isoteniscope. (7) NF T 20–047 AFNOR (September 1985). Chemical products for industrial use — Determination of vapour pressure of solids and liquids within range from 10–3 to 1 Pa — Vapour pressure balance method. (8) Knudsen, M. (1909). Ann. Phys. Lpz., 29, 1979; (1911), 34, 593. (9) Ambrose, D., Lawrenson, I.J., Sprake, C.H.S. (1975). J. Chem. Thermodynamics 7, 1173. (10) Schmuckler, M.E., Barefoot, A.C., Kleier, D.A., Cobranchi, D.P. (2000), Vapor pressures of sulfonylurea herbicides; Pest Management Science 56, 521–532. (11) Tomlin, C.D.S. (ed.), The Pesticide Manual, Twelfth Edition (2000). (12) Friedrich, K., Stammbach, K., Gas chromatographic determination of small vapour pressures determination of the vapour pressures of some triazine herbicides. J. Chromatog. 16 (1964), 22–28. (13) Grayson, B.T., Fosbraey, L.A., Pesticide Science 16 (1982), 269–278. (14) Rordorf, B.F., Prediction of vapor pressures, boiling points and enthalpies of fusion for twenty-nine halogenated dibenzo-p-dioxins, Thermochimia Acta 112 Issue 1 (1987), 117–122. (15) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection; Pesticide Science 4 (1973) 137–147. (16) Gückel, W., Synnatschke, G., Ritttig, R., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection II. Application to Formulated Products; Pesticide Science 5 (1974) 393–400. (17) Gückel, W., Kaestel, R., Lewerenz, J., Synnatschke, G., A Method for Determining the Volatility of Active Ingredients Used in Plant Protection. Part III: The Temperature Relationship between Vapour Pressure and Evaporation Rate; Pesticide Science 13 (1982) 161–168. (18) Gückel, W., Kaestel, R., Kroehl, T., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part IV: An Improved Thermogravimetric Determination Based on Evaporation Rate; Pesticide Science 45 (1995) 27–31. (19) Kroehl, T., Kaestel, R., Koenig, W., Ziegler, H., Koehle, H., Parg, A., Methods for Determining the Vapour Pressure of Active Ingredients Used in Crop Protection. Part V: Thermogravimetry Combined with Solid Phase MicroExtraction (SPME); Pesticide Science, 53 (1998) 300–310. (20) Tesconi, M., Yalkowsky, S.H., A Novel Thermogravimetric Method for Estimating the Saturated Vapor Pressure of Low-Volatility Compounds; Journal of Pharmaceutical Science 87(12) (1998) 1512–20. (21) Lide, D.R. (ed.), CRC Handbook of Chemistry and Physics, 81th ed.(2000), Vapour Pressure in the Range -25 °C to 150 °C. (22) Meister, R.T. (ed.), Farm Chemicals Handbook, Vol. 88 (2002). (23) 40 CFR, 796. (1993). pp 148–153, Office of the Federal Register, Washington DC. (24) Rordorf B.F. (1985). Thermochimica Acta 85, 435. (25) Westcott et al. (1981). Environ. Sci. Technol. 15, 1375. (26) Messer G., Röhl, P., Grosse G., Jitschin W. (1987). J. Vac. Sci. Technol. (A), 5(4), 2440. (27) Comsa G., Fremerey J.K., Lindenau, B. (1980). J. Vac. Sci. Technol. 17(2), 642. (28) Fremerey, J.K. (1985). J. Vac. Sci. Technol. (A), 3(3), 1715. (1) Używając manometru pojemnościowego. Dodatek Metoda szacowania WSTĘP Szacunkowych wartości ciśnienia pary można użyć: — do ustalenia, która z metod doświadczalnych jest odpowiednia, — do podania wartości szacunkowej lub granicznej w przypadkach, gdy z powodów technicznych nie można zastosować metody doświadczalnej. METODA SZACOWANIA Ciśnienie pary substancji ciekłych i stałych można oszacować przy użyciu zmodyfikowanej korelacji Watsona (a). Jedyną wymaganą daną doświadczalną jest normalna temperatura wrzenia. Metoda ta ma zastosowanie w przedziale ciśnienia od 105 Pa do 10–5 Pa. Szczegółowe informacje na temat tej metody podano w publikacji „Handbook of Chemical Property Estimation Methods” (b). Zob. także: OECD Environmental Monograph No. 67 (c). PROCEDURA OBLICZENIOWA Ciśnienie pary oblicza się następująco: gdzie: T = rozpatrywana temperatura, Tb = normalna temperatura wrzenia, PVP = ciśnienie pary w temperaturze T, ΔHVb = ciepło parowania, ΔZb = współczynnik ściśliwości (oszacowany na 0,97), m = współczynnik empiryczny zależny od stanu fizycznego w rozpatrywanej temperaturze. Dalej gdzie KF jest współczynnikiem empirycznym uwzględniającym polarność substancji. Dla szeregu typów związków współczynniki KF podano w opracowaniu (b). Dość często dostępne są dane, w których podana jest temperatura wrzenia przy obniżonym ciśnieniu. W takim przypadku ciśnienie pary oblicza się następująco: gdzie T1 jest temperaturą wrzenia przy obniżonym ciśnieniu P1. SPRAWOZDANIE W przypadku użycia metody szacowania sprawozdanie powinno zawierać wyczerpującą dokumentację obliczeń. LITERATURA (a) Watson, K.M. (1943). Ind. Eng. Chem, 35, 398. (b) Lyman, W.J., Reehl, W.F., Rosenblatt, D.H. (1982). Handbook of Chemical Property Estimation Methods, McGraw-Hill. (c) OECD Environmental Monograph No. 67. Application of Structure-Activity Relationships to the Estimation of Properties Important in Exposure Assessment (1993).

ZAŁĄCZNIK II A.22. WAŻONA DŁUGOŚCIĄ ŚREDNIA GEOMETRYCZNA ŚREDNICA WŁÓKIEN 1. METODA 1.1. WSTĘP W opisie metody przedstawiono procedurę stosowaną do określenia ważonej długością średniej geometrycznej średnicy włókna (LWGMD) sztucznych włókien mineralnych luzem (MMMF). Ponieważ LWGMD populacji z prawdopodobieństwem 95 % znajdzie się między dwoma 95 % poziomami ufności (LWGMD ± dwa błędy standardowe) próby, wartością przedstawianą (wartością testową) będzie niższy przedział ufności próby (tj. LWGMD — 2 błędy standardowe). Metoda opiera się na aktualizowanej (czerwiec 1994) wstępnej wersji procedury HSE w przemyśle, uzgodnionej na spotkaniu ECFIA z HSE w Chester 26.09.1993 i opracowanej dla i na podstawie wyników drugiego testu międzylaboratoryjnego (1, 2). Ta metoda pomiaru może być stosowana do charakteryzowania średnicy włókien substancji luzem lub produktów zawierających MMMF, w tym ogniotrwałych włókien ceramicznych (RCF), sztucznych włókien szklistych (MMVF), włókien krystalicznych i polikrystalicznych. Ważenie długością jest sposobem kompensowania efektu rozkładu średnicy włókien, spowodowanego łamaniem się długich włókien w czasie pobierania próbek lub manipulowania materiałem. Do pomiaru rozkładu średnic MMMF stosuje się parametry statystyczne (średnia geometryczna), ponieważ średnice te mają zwykle rozkład wielkości zbliżony do lognormalnego. Pomiar długości, a także średnicy, jest żmudny i czasochłonny, ale jeśli mierzone są tylko te włókna, które dotykają nieskończenie cienkiej linii w polu widzenia skaningowego mikroskopu elektronowego, to prawdopodobieństwo wybrania danego włókna jest proporcjonalne do jego długości. Ponieważ w obliczeniach ważonych długością uwzględniona jest długość, to jedyną wymaganą miarą jest średnica i LWGMD-2SE może być obliczana, jak opisano. 1.2. DEFINICJE Cząstka: obiekt o stosunku długości do szerokości mniejszym niż 3:1. Włókno: obiekt o stosunku długości do szerokości (wydłużenie) co najmniej 3:1. 1.3. ZAKRES I OGRANICZENIA Metoda ta została opracowana w celu obserwacji rozkładu średnic, które charakteryzują się medianą od 0,5 μm do 6 μm. Większe średnice mogą być mierzone przy zastosowaniu mniejszego powiększenia mikroskopu, ale zastosowanie metody jest coraz bardziej ograniczone w miarę zmniejszania się włókien i dla mediany średnic poniżej 0,5 μm zaleca się stosowanie TEM (transmisyjny mikroskop elektronowy). 1.4. ZASADA METODY TESTOWEJ Z włókniny lub włókien luzem pobierana jest pewna liczna reprezentatywnych próbek rdzeniowych. W procedurze kruszenia zmniejsza się długość włókien luzem i reprezentatywna podpróbka jest rozprowadzana w wodzie. Alikwoty są ekstrahowane i filtrowane przez filtry poliwęglanowe o otworach 0,2 μm i przygotowywane do badań przy zastosowaniu techniki skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM). Średnice włókien są mierzone przy powiększeniu × 10 000 lub większym (1) przy zastosowaniu metody przecięcia linii, aby otrzymać nieprzekłamaną szacunkową wielkość średnicy. Obliczany jest niższy 95 % przedział ufności (na podstawie testu jednostronnego) w celu uzyskania szacunkowej najniższej wartości średniej geometrycznej średnicy włókien materiału. 1.5. OPIS METODY TESTOWEJ 1.5.1. Bezpieczeństwo/środki ostrożności Należy ograniczać kontakt z zawieszonymi w powietrzu włóknami i przy manipulowaniu suchymi włóknami należy stosować wyciąg lub komorę rękawicową. Należy przeprowadzać okresowy monitoring ekspozycji w celu określenia skuteczności zastosowanych metod zabezpieczenia. Przy pracy z MMMF należy używać rękawic jednorazowych, aby zmniejszyć podrażnienie skóry i zapobiec skażeniu krzyżowemu. 1.5.2. Aparatura/sprzęt — Prasa (o nacisku co najmniej 10 MPa) i formy, — poliwęglanowy filtr o porach kapilarnych średnicy 0,2 μm (średnica filtra 25 mm), — celulozowy filtr membranowy stosowany jako filtr wstępny, — szklana aparatura filtracyjna (lub jednorazowe systemy filtracyjne) do umocowania filtrów (np. szklany zestaw do mikroanalizy Millipore, typ nr XX10 025 00), — świeżo destylowana woda, która została przefiltrowana przez filtr o średnicy porów 0,2 μm w celu usunięcia mikroorganizmów, — napylarka do napylania złotem lub złotem/palladem, — skaningowy mikroskop elektronowy o rozdzielczości do 10 nm i mogący pracować przy powiększeniu × 10 000, — dodatkowe: szpatułki, ostrza skalpeli typ 24, pincety, rurki SEM, klej węglowy lub węglowa taśma klejąca, srebro koloidalne, — sonda ultradźwiękowa lub podręczna myjka ultradźwiękowa, — urządzenie do pobierania próbek rdzeniowych lub korkociąg do pobierania próbek rdzeniowych z włókniny MMMF. 1.5.3. Procedura testowa 1.5.3.1. Pobieranie próbek W przypadku włókniny i płatów materiału do pobierania prób przekroju stosuje się 25 mm urządzenie do pobierania prób rdzeniowych lub korkociąg. Próbki powinny być pobierane z miejsc rozmieszczonych równomiernie na całej szerokości włókniny, jeśli ma ona niewielką długość lub miejsc losowych w przypadku długich płatów włókniny. Te same urządzenia mogą być używane do pobierania losowych próbek z włókien luzem. Jeśli to możliwe należy pobierać sześć próbek, aby uwzględnić zróżnicowanie przestrzenne materiału luzem. Sześć próbek rdzeniowych należy pokruszyć w formie o średnicy 50 mm, stosując nacisk 10 MPa. Materiał mieszany jest szpatułką i powtórnie prasowany przy zastosowaniu nacisku 10 MPa. Materiał następnie wyjmuje się z formy i umieszcza w szczelnej szklanej butelce. 1.5.3.2. Przygotowanie próby Jeśli to konieczne, można usunąć organiczny środek wiążący przez umieszczenie włókien na około 1 godzinę w piecu o temperaturze 450 °C. Próby podzielić przez stożkowanie i ćwiartkowanie (należy to zrobić w komorze odpylającej). Szpatułką dodać niewielką ilość (< 0,5 g) próbki do 100 ml świeżo destylowanej wody, która została przefiltrowana przez filtr membranowy 0,2 μm (można użyć alternatywnych źródeł ultraczystej wody, jeśli wykazano, że są zadowalającej jakości). Rozprowadzić dokładnie sondą ultradźwiękową przy mocy roboczej 100 W, ustawionej tak, aby zachodziła kawitacja. (Jeśli nie ma sondy zastosować następującą metodę: wytrząsać wielokrotnie i odwrócić na 30 sekund; umieścić w myjce ultradźwiękowej na pięć minut; następnie wielokrotnie wytrząsać i odwrócić ponownie na 30 sekund). Natychmiast po rozproszeniu włókien pobrać kilka alikwot (np. trzy alikwoty 3, 6 i 10 ml) przy użyciu szerokiej pipety (pojemności 2–5 ml). Każdą alikwotę przefiltrować próżniowo przez 0,2 μm filtr poliwęglanowy z dodatkowym filtrem wstępnym MEC o średnicy porów 5 µm, stosując 25 mm szklany lejek z cylindrycznym zbiornikiem. Do lejka należy wlać 5 ml przefiltrowanej wody destylowanej, a alikwotę należy wolno pipetować do wody, przy czym jej końcówka powinna znajdować się poniżej menisku. Po pipetowaniu należy dokładnie spłukać pipetę i zbiorniczek, ponieważ cienkie włókna często zalegają na powierzchni. Uważnie wyjąć filtr i przed umieszczeniem w naczyniu do suszenia oddzielić go od dodatkowego filtra. Odciąć ćwiartkę lub połowę przekroju filtru przefiltrowanego osadu ostrzem skalpela typu 24, stosując ruch wahadłowy. Ostrożnie przymocować odcięty przekrój do stolika SEM, stosując klej węglowy lub węglową taśmę klejącą. Srebro koloidalne należy nałożyć przynajmniej w trzech miejscach, aby zapewnić lepszy kontakt elektryczny na krawędziach filtra i stolika. Po wyschnięciu kleju/srebra koloidalnego napylić ok. 50 nm warstwę złota lub złota/palladu na powierzchnię osadu. 1.5.3.3. Kalibracja i obsługa SEM 1.5.3.3.1. Kalibracja Kalibracja SEM powinna być sprawdzana przynajmniej raz w tygodniu (najlepiej codziennie) przy użyciu certyfikowanej siatki kalibracyjnej. Kalibracja powinna być porównywana z certyfikowanym wzorcem i jeśli zmierzona wartość (SEM) nie mieści się w granicach ±2 % wartości wzorcowej, należy przeprowadzić kalibrację SEM i powtórzyć kontrolę. Mikroskop SEM powinien mieć rozdzielczość wystarczającą co najmniej do zidentyfikowania widzialnej średnicy 0,2 µm przy użyciu prawdziwego materiału próbki przy powiększeniu × 2 000. 1.5.3.3.2. Obsługa SEM powinien działać przy powiększeniu 10 000 razy (2) w warunkach, które zapewniają dobrą rozdzielczość, przy możliwej do przyjęcia jakości obrazu i przy niskiej prędkości skanowania, na przykład 5 sekund na obraz. Wprawdzie wymagania operacyjne mogą się różnić w przypadku poszczególnych SEM, ale generalnie, aby otrzymać najlepszą widzialność i rozdzielczość z materiałami o stosunkowo niskiej masie atomowej powinno się stosować napięcia przyspieszające 5–10 keV, przy stosunkowo małej średnicy plamki i niewielkiej odległości roboczej. Ponieważ przeprowadzane jest przesuwanie liniowe, należy zastosować pochylenie 0°, aby zminimalizować konieczność ponownego ustawienia ogniskowej lub, jeśli SEM wyposażony jest w stolik eucentryczny, należy zastosować eucentryczną odległość roboczą. Mniejsze powiększenia można stosować, jeśli materiał nie zawiera małych (pod względem średnicy) włókien i wszystkie średnice włókien są > 5 μm. 1.5.3.4. Rozmiary 1.5.3.4.1. Badanie przy małym powiększeniu, aby ocenić próbkę Najpierw należy obejrzeć próbkę przy małym powiększeniu, aby sprawdzić, czy występują skupienia dużych włókien i ocenić gęstość włókien. W przypadku nadmiernej grudkowatości zaleca się przygotowanie nowej próbki. Aby zapewnić statystyczną dokładność konieczne jest zmierzenie minimalnej liczby włókien, a wysoka gęstość włókien może zostać uznana za przydatną właściwość, ponieważ badanie pustych pól jest czasochłonne i niewiele wnosi do analizy. Jeśli jednak filtr jest przeładowany, dokonanie pomiaru wszystkich możliwych do zmierzenia włókien staje się trudne, a ponieważ małe włókna mogą być zasłaniane przez większe, można je przeoczyć. Tendencja do popełniania błędu przeszacowania LWGMD może wynikać z gęstości włókien powyżej 150 włókien na milimetr liniowego przesunięcia. Z drugiej strony niskie zagęszczenie włókien wydłuża czas analizy i często przygotowanie próbki z zagęszczeniem włókien bliższym optimum jest bardziej ekonomiczne niż poleganie na zliczeniach na filtrach o niskim zagęszczeniu. Przy optymalnym zagęszczeniu, na pole widzenia przy powiększeniu 5 000 razy powinno przypadać średnio jedno lub dwa policzalne włókna. Optymalne zagęszczenie zależy jednak od wielkości (średnicy) włókien, tak więc konieczne jest, aby operator korzystał ze specjalistycznych ocen, które pozwolą mu stwierdzić czy zagęszczenie włókien jest bliskie optymalnemu czy nie. 1.5.3.4.2. Ważenie długością średnic włókien Liczone są tylko te włókna, które dotykają (lub przecinają) (nieskończenie) cienkiej linii na ekranie SEM. Z tego powodu przez środek ekranu przebiega pozioma (lub pionowa) linia. Alternatywną możliwością jest umieszczenie jednego punktu na środku ekranu i stałe skanowanie przez filtr w jednym kierunku. Średnica każdego włókna o współczynniku smukłości większym niż 3:1 i dotykającym tego punktu lub go przecinającym jest mierzona, a wyniki są rejestrowane. 1.5.3.4.3. Wyznaczanie wielkości włókien Zaleca się, aby zmierzyć co najmniej 300 włókien. Każde włókno mierzone jest tylko raz w punkcie przecięcia z linią lub punktem narysowanym na obrazie (lub blisko punktu przecięcia, jeśli brzegi włókna są niewyraźne). Jeśli napotyka się włókna o niejednorodnym przekroju, należy stosować miarę mówiącą o średniej średnicy włókna. Należy zachować ostrożność przy wyznaczaniu krawędzi i mierzeniu najmniejszej odległości między brzegami włókien. Pomiary mogą być przeprowadzane on-line lub off-line na zapisanych obrazach lub fotografiach. Zaleca się stosowanie półautomatycznych systemów pomiarów obrazu, które ładują dane bezpośrednio do arkusza kalkulacyjnego, ponieważ oszczędzają one czas, eliminują błędy transkrypcji, a obliczenia mogą być zautomatyzowane. Końce długich włókien powinny być sprawdzane przy małych powiększeniach, aby upewnić się, że włókna te nie zwijają się z powrotem, nie wracają do pola widzenia i że są mierzone tylko raz. 2. DANE 2.1. POSTĘPOWANIE Z WYNIKAMI Zwykle średnice włókien nie odbiegają od rozkładu normalnego. Dokonując jednak przekształcenia logarytmicznego, możliwe jest uzyskanie rozkładu, który w przybliżeniu odpowiada normalnemu. Obliczyć średnią arytmetyczną (średnia lnD) i odchylenie standardowe (SDlnD) wartości logarytmu logarytmu naturalnego (lnD) średnic n włókien (D). (1) (2) Odchylenie standardowe dzieli się przez pierwiastek kwadratowy liczby pomiarów (n) w celu obliczenia błędu standardowego (SElnD). (3) Odjąć dwa błędy standardowe od średniej i obliczyć wykładnik dla tej wartości (średnia minus dwa błędy standardowe), aby otrzymać średnią geometryczną minus dwa błędy standardowe. (4) 3. RAPORTOWANIE RAPORT Z TESTU Raport z przeprowadzonego testu musi zawierać przynajmniej następujące informacje: — wartość LWGMD-2SE, — wszelkie odstępstwa od procedury, a w szczególności te, które mogą mieć wpływ na precyzję lub dokładność wyników, z odpowiednimi wyjaśnieniami. 4. LITERATURA (1) B. Tylee SOP MF 240. Health and Safety Executive. February 1999. (2) G. Burdett and G. Revell. Development of a standard method to measure the length-weighted geometric mean fibre diameter: Results of the Second inter-laboratory exchange. IR/L/MF/94/07. Project R42.75 HPD. Health and Safety Executive. Research and Laboratory Services Division. 1994. (1) Ta skala powiększenia jest wskazana dla włókien 3 µm, dla włókien 6 µm właściwsze może być powiększenie × 5 000. (2) W przypadku włókien 3 μm zob. poprzedni przypis.

ZAŁĄCZNIK III B.46. DZIAŁANIE DRAŻNIĄCE NA SKÓRĘ IN VITRO: BADANIE NA MODELU ZREKONSTRUOWANEGO LUDZKIEGO NASKÓRKA 1. METODA 1.1. WPROWADZENIE Działanie drażniące na skórę oznacza powodowanie odwracalnego uszkodzenia skóry w wyniku nałożenia na skórę badanej substancji na okres do 4 godzin [zgodnie z definicją Globalnie Zharmonizowanego Systemu Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów (GHS) Organizacji Narodów Zjednoczonych (ONZ)](1). Niniejsza metoda badania obejmuje procedurę in vitro, która — zależnie od potrzeb informacyjnych — może umożliwić ustalenie drażliwości substancji dla skóry na podstawie samodzielnego badania zastępczego w ramach strategii badawczej, zgodnie z podejściem uwzględniającym wartość naukową danych (2). Ocena działania drażniącego na skórę obejmowała na ogół wykorzystanie zwierząt laboratoryjnych (zob. metoda B.4)(3). Z uwagi na konieczność zapewnienia dobrostanu zwierząt opracowano metodę B.4, która pozwala na ustalenie działania żrącego/drażniącego na skórę dzięki zastosowaniu strategii badań sekwencyjnych, przy użyciu zwalidowanych metod in vitro i ex vivo, co pozwala na uniknięcie zadawania bólu zwierzętom i powodowania ich cierpienia. Do części dotyczącej badań działania żrącego w ramach strategii badań sekwencyjnych B.4 przydatne są trzy zwalidowane metody badania (wytyczne do badań) in vitro B.40, B.40bis i TG 435 (4, 5, 6). Niniejsza metoda badania opiera się na wykorzystaniu modeli zrekonstruowanego ludzkiego naskórka, które pod względem ogólnej struktury (zastosowanie keratynocytów naskórka pochodzenia ludzkiego jako źródła komórek, reprezentatywna tkanka i cytoarchitektura) imitują ściśle biochemiczne i fizjologiczne właściwości górnych części ludzkiej skóry, tj. naskórka. Procedura opisana w niniejszej metodzie badania pozwala na identyfikację zagrożeń powodowanych przez substancje drażniące zgodnie z kategorią 2 GHS ONZ. Niniejsza metoda badania obejmuje również zestaw norm efektywności do oceny podobnych i zmodyfikowanych metod badania z wykorzystaniem zrekonstruowanego ludzkiego naskórka (7). Przeprowadzono badania wstępne, optymalizacyjne i walidacyjne dwóch metod badania in vitro (8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17), dostępnych w handlu pod nazwami EpiSkin™ i EpiDerm™, wykorzystujących modele zrekonstruowanego ludzkiego naskórka. Badania te przeprowadzono z udziałem substancji należących do kategorii R38. Niektóre aspekty ponownych obliczeń na potrzeby Globalnie Zharmonizowanego Systemu Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów znajdują się w pozycji 25 Literatury. Metody o porównywalnej wydajności z EpiDerm™ (zwalidowana metoda referencyjna 1), są zalecane jako samodzielne metody badania zastępujące badanie in vivo na królikach kwalifikujące do kategorii 2 według GHS, substancje drażniące. EpiDerm™ (zwalidowana metoda referencyjna 2) zaleca się do stosowania jedynie jako przesiewową metodę badania lub w ramach strategii badań sekwencyjnych, zgodnie z podejściem uwzględniającym wartość naukową danych, w celu zaklasyfikowania do kategorii 2 według GHS, substancje drażniące. Zanim będzie możliwe wykorzystanie proponowanego badania działania drażniącego na skórę in vitro na modelu zrekonstruowanego ludzkiego naskórka do celów regulacyjnych, należy ustalić jego wiarygodność, istotność (dokładność) i ograniczenia w zakresie dotyczącym jego proponowanego stosowania, aby zapewnić jego porównywalność ze zwalidowaną metodą referencyjną 1, zgodnie z normami efektywności określonymi w niniejszej metodzie badania (dodatek). Dwie inne metody badania in vitro z użyciem zrekonstruowanego ludzkiego naskórka zostały zwalidowane zgodnie z wymaganiami na podstawie niniejszej metody badania i dają podobne wyniki jak zwalidowana metoda referencyjna 1 (18). Są to zmodyfikowana metoda badania EpiDerm™ (zmodyfikowana metoda referencyjna 2) i metoda badania SkinEthic RHE™ (metoda naśladowcza 1). 1.2. DEFINICJE W ramach niniejszej metody badania stosowane są następujące definicje: Dokładność: bliskość zgodności pomiędzy wynikami zastosowania metody badania a przyjętymi wartościami odniesienia. Jest to miara efektywności metody badania i jeden z aspektów jej istotności. Pojęcia tego często używa się zamiennie z pojęciem „zgodność” na oznaczenie odsetka prawidłowych wyników uzyskiwanych przy użyciu metody badania. Substancja do kontroli serii: substancja wzorcowa powodująca średnią reakcję tkankową pod względem żywotności komórek. Żywotność komórek: parametr określający całkowitą aktywność populacji komórek, np. zdolność dehydrogenaz w mitochondriach komórek do obniżenia zawartości przyżyciowego barwnika MTT (bromek 3–(4,5-dimetylotiazolo-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowy, błękit tiazolilowy), który, w zależności od mierzonego punktu końcowego i zastosowanego schematu badania, odpowiada całkowitej liczbie i/lub żywotności żywych komórek. ET50 : czas ekspozycji potrzebny do zmniejszenia żywotności komórek o 50 % po zastosowaniu markera w określonym, stałym stężeniu, zob. również IC50. Odsetek wyników fałszywie ujemnych: Odsetek wszystkich obecnych substancji fałszywie zidentyfikowanych w wyniku zastosowania metody badania jako nieobecne. Jest to jeden ze wskaźników efektywności metody badania. Odsetek wyników fałszywie dodatnich: odsetek wszystkich nieobecnych (nieaktywnych) substancji fałszywie zidentyfikowanych w wyniku zastosowania metody badania jako obecne. Jest to jeden ze wskaźników efektywności metody badania. Dawka nieograniczona: ilość substancji badanej nakładana na skórę, przekraczająca ilość konieczną do całkowitego, jednolitego pokrycia jej powierzchni. GHS (Globalnie Zharmonizowany System Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów): wprowadzony w UE na mocy rozporządzenia (WE) nr 1272/2008 system proponujący klasyfikację substancji i mieszanin według znormalizowanych rodzajów i poziomów zagrożeń fizycznych, zdrowotnych i środowiskowych oraz omawiający odpowiednie elementy komunikacyjne, takie jak piktogramy, hasła ostrzegawcze, zwroty wskazujące rodzaj zagrożenia, zwroty wskazujące środki ostrożności i karty charakterystyki substancji i produktów niebezpiecznych, aby przekazać informacje na temat ich działań niepożądanych w celu zapewnienia ochrony ludzi (w tym pracowników, robotników, przewoźników, konsumentów i ratowników) i środowiska (1). IC50 : stężenie, w którym marker powoduje zmniejszenie żywotności tkanek o 50 % (IC50) po stałym czasie ekspozycji, zob. również ET50. Normy efektywności: normy oparte na zwalidowanej metodzie referencyjnej, zapewniające podstawę do oceny porównywalności proponowanej metody badania, która jest podobna do metody referencyjnej pod względem mechanistycznym i funkcjonalnym. Uwzględnia się I) istotne składowe metody badania; II) wykaz minimum substancji referencyjnych wybranych spośród substancji wykorzystywanych do wykazania dopuszczalnej efektywności zwalidowanej metody referencyjnej oraz III) oparte na wynikach uzyskanych w odniesieniu do zwalidowanej metody referencyjnej, porównywalne poziomy dokładności i wiarygodności, które powinna wykazać proponowana metoda badania w ocenie dokonywanej przy użyciu wykazu minimum substancji referencyjnych. Wiarygodność: miary zakresu, w jakim metoda badania może zostać wykonana w sposób odtwarzalny w jednym laboratorium i pomiędzy laboratoriami w czasie, w przypadku jej wykonywania przy użyciu tego samego protokołu. Ocenia się ją poprzez obliczenie odtwarzalności wewnątrz- i międzylaboratoryjnej. Czułość: odsetek wszystkich obecnych/aktywnych substancji prawidłowo sklasyfikowanych w badaniu. Jest to miara dokładności metody badania, która daje wyniki kategoryczne, stanowiąca parametr istotny dla oceny istotności metody badania. Swoistość: odsetek wszystkich nieobecnych/nieaktywnych substancji prawidłowo sklasyfikowanych w badaniu. Jest to miara dokładności metody badania, która daje wyniki kategoryczne, stanowiąca parametr istotny dla oceny istotności metody badania. Działanie drażniące na skórę: powodowanie odwracalnego uszkodzenia skóry w wyniku nałożenia na skórę badanej substancji na okres do 4 godzin. Działanie drażniące na skórę jest powstającą miejscowo, nieimmunogenną reakcją, która pojawia się wkrótce po stymulacji (24). Jego główną cechą jest odwracalny proces obejmujący reakcje zapalne oraz większość charakterystycznych objawów klinicznych podrażnienia (rumień, obrzęk, świąd i ból) związanych z procesem zapalnym. 1.3. ZAKRES I OGRANICZENIA Ograniczeniem badań z użyciem zrekonstruowanego ludzkiego naskórka objętych niniejszą metodą badania jest to, że pozwalają one jedynie na zaklasyfikowanie substancji jako drażniących dla skóry według kategorii 2 GHS ONZ. Ponieważ nie umożliwiają one zaklasyfikowania substancji do opcjonalnej kategorii 3 zdefiniowanej w GHS ONZ, wszystkie pozostałe substancje nie będą klasyfikowane (brak kategorii). Może zaistnieć konieczność weryfikacji niniejszej metody badania, w zależności od potrzeb regulacyjnych i ewentualnego uwzględnienia w przyszłości nowych punktów końcowych bądź też udoskonaleń metody lub opracowania nowych badań naśladowczych. Niniejsza metoda badania umożliwia identyfikację zagrożeń stwarzanych przez drażniące substancje jednoskładnikowe (19), jednak nie zapewnia wystarczających informacji na temat działania żrącego na skórę. Nie można badać gazów i aerozoli, a w badaniu walidacyjnym nie oceniano jeszcze mieszanin. 1.4. ZASADA METODY BADANIA Substancję badaną nakłada się miejscowo na trójwymiarowy model zrekonstruowanego ludzkiego naskórka, składający się z prawidłowych keratynocytów naskórka pochodzących od człowieka, które poddano hodowli w celu uzyskania wielowarstwowego, wysoce zróżnicowanego modelu ludzkiego naskórka. Model ten składa się ze zorganizowanych warstw: podstawnej, kolczystej i ziarnistej oraz z wielopoziomowej warstwy rogowej zawierającej międzykomórkowe, blaszkowate warstwy lipidów ułożonych w struktury analogiczne do stwierdzanych in vivo. Zasada badań z użyciem modelu zrekonstruowanego ludzkiego naskórka opiera się na założeniu, że substancje drażniące wykazują zdolność do przenikania przez warstwę rogową na drodze dyfuzji i są cytotoksyczne dla komórek głębszych warstw. Żywotność komórek mierzy się na podstawie konwersji przez dehydrogenazę przyżyciowego barwnika MTT [bromek 3–(4,5-dimetylotiazolo-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowy, błękit tiazolilowy; numer EINECS 206–069–5, numer CAS 298–93–1)] w niebieską sól formazanową, którą oznacza się ilościowo po ekstrakcji z tkanek (20). Substancje drażniące identyfikuje się na podstawie ich zdolności do zmniejszenia żywotności komórek poniżej określonych wartości progowych (tj. ≤ 50 % dla substancji drażniących kategorii 2 GHS ONZ). Substancje, które prowadzą do zachowania żywotności komórek powyżej określonego poziomu progowego, nie będą klasyfikowane (tj. > 50 % — brak kategorii). Systemy modeli zrekonstruowanego ludzkiego naskórka mogą być stosowane do badania substancji stałych, płynnych, półstałych i wosków. Płyny mogą być wodne lub niewodne; substancje stałe mogą być rozpuszczalne w wodzie lub nie. W miarę możliwości substancje stałe powinny być badane w postaci drobnoziarnistego proszku. Ponieważ do badań walidacyjnych systemów modeli zrekonstruowanego ludzkiego naskórka wykorzystano 58 starannie wybranych substancji chemicznych reprezentujących szeroki wachlarz ich klas, oczekuje się, że omawiane metody powinny zasadniczo być odpowiednie dla różnych klas substancji chemicznych (16). Badania walidacyjne objęły 13 substancji kategorii 2 GHS. Należy podkreślić, że badania walidacyjne nie objęły niektórych niekorodujących kwasów, zasad, soli i innych substancji nieorganicznych, oraz nie objęły, bądź objęły jedynie w ograniczonym stopniu niektóre znane klasy organicznych substancji drażniących takich jak wodoronadtlenki, fenole oraz substancje powierzchniowo czynne. 1.5. WYKAZANIE EFEKTYWNOŚCI Przed rozpoczęciem rutynowego stosowania zwalidowanej metody zgodnej z niniejszą metodą badania laboratoria mogą chcieć wykazać jej efektywność techniczną z wykorzystaniem dziesięciu substancji chemicznych zaleconych w tabeli 1. Zgodnie z niniejszą metodą badania, opcjonalna kategoria 3 GHS ONZ jest uznawana za brak kategorii. W przypadku nowych podobnych (naśladowczych) metod badania opracowanych na podstawie niniejszej metody badania, podobnych strukturalnie i funkcjonalnie do zwalidowanych metod referencyjnych, lub w przypadku modyfikacji zwalidowanych metod należy zastosować normy efektywności opisane w dodatku do niniejszej metody badania, aby wykazać porównywalną wiarygodność i dokładność nowej metody badania przed jej zastosowaniem do badań regulacyjnych. Tabela 1 Substancje do oceny efektywności, które stanowią podgrupę referencyjnych substancji wymienionych w dodatku Substancja Numer CAS Ocena in vivo Stan fizyczny Kategoria GHS Kwas naftylooctowy 86–87–3 0 S Brak kat. Izopropanol 67–63–0 0,3 C Brak kat. Stearynian metylu 112–61–8 1 S Brak kat. Maślan heptylu 5870–93–9 1,7 C Opcjonalna kat. 3 Salicylan heksylu 6259–76–3 2 C Opcjonalna kat. 3 Aldehyd cyklamenu 103–95–7 2,3 C Kat. 2 1-bromoheksan 111–25–1 2,7 C Kat. 2 Metakrylan butylu 97–88–1 3 C Kat. 2 1-metylo-3-fenylo-1-piperazyna 5271–27–2 3,3 S Kat. 2 Heptanal 111–71–7 4 C Kat. 2 1.6. OPIS METODY Poniżej przedstawiono opis składowych i procedur badania oceniającego działanie drażniące na skórę przy użyciu modelu zrekonstruowanego ludzkiego naskórka. Model zrekonstruowanego ludzkiego naskórka może zostać utworzony lub przygotowany samodzielnie bądź też uzyskany na rynku (np. EpiSkin™, EpiDerm™ i SkinEthic RHE™). Standardowe protokoły metod badania z użyciem modeli EpiSkin™, EpiDerm™ i SkinEthic RHE™ można uzyskać na stronie internetowej [http://ecvam.jrc.ec.europa.eu] (21, 22, 23). Badania należy wykonywać zgodnie z poniższymi zaleceniami: 1.6.1. Składowe modelu zrekonstruowanego ludzkiego naskórka 1.6.1.1. Ogólne warunki modelu Do tworzenia naskórka należy użyć prawidłowych ludzkich keratynocytów. Pod zachowującą funkcje życiowe warstwą rogową powinno znajdować się kilka warstw żywych komórek naskórka (warstwa podstawna, warstwa kolczysta, warstwa ziarnista). Warstwa rogowa powinna być wielopoziomowa i powinna zawierać lipidy niezbędne do utworzenia czynnościowej bariery na tyle wytrzymałej, aby uniemożliwiała szybkie przenikanie cytotoksycznych markerów, np. soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS) lub markera Triton X-100. Funkcję bariery można ocenić albo poprzez ustalenie stężenia, w którym marker zmniejsza żywotność tkanek o 50 % (IC50) po ustalonym czasie ekspozycji, albo poprzez ustalenie czasu ekspozycji potrzebnego do zmniejszenia żywotności komórek o 50 % (ET50) po zastosowaniu markera w określonym, stałym stężeniu. Właściwości izolacyjne modelu powinny zapobiegać przechodzeniu materiału przez warstwę rogową do żywej tkanki, gdyż w innym razie modelowanie ekspozycji skóry mogłoby być niewłaściwe. Model skóry nie powinien być skażony bakteriami, wirusami, mykoplazmami ani grzybami. 1.6.1.2. Funkcjonalne warunki modelu 1.6.1.2.1. Żywotność Zalecaną próbą ustalenia wielkości żywotności jest MTT (20). Gęstość optyczna (OD) ekstrahowanego (rozpuszczonego) barwnika z tkanki potraktowanej kontrolą negatywną (NC) powinna być co najmniej 20 razy większa niż OD samego rozpuszczalnika do ekstrakcji. Należy udokumentować stabilność w hodowli (uzyskiwanie podobnych wyników pomiarów żywotności) tkanki potraktowanej NC w okresie ekspozycji testowej. 1.6.1.2.2. Funkcja bariery Warstwa rogowa i wchodzące w jej skład lipidy powinny być na tyle odporne, aby nie było możliwe szybkie przenikanie przez nie cytotoksycznych markerów, np. SDS lub markera Triton X-100, według oceny na podstawie IC50 lub ET50. 1.6.1.2.3. Morfologia Odpowiednio wykwalifikowany personel powinien przeprowadzić badanie histologiczne zrekonstruowanej skóry/zrekonstruowanego naskórka, z wykazaniem istnienia struktury przypominającej ludzką skórę/ludzki naskórek (w tym wielopoziomowej warstwy rogowej). 1.6.1.2.4. Odtwarzalność Należy wykazać odtwarzalność w czasie wyników zastosowania metody wykorzystującej określony model, najlepiej z użyciem właściwej substancji (wzorcowej) do kontroli serii (zob. dodatek). 1.6.1.2.5. Kontrole jakości (QC) modelu Każda seria stosowanego modelu naskórka powinna spełniać określone kryteria zwolnienia do produkcji, spośród których najistotniejsze są te dotyczące żywotności (pkt 1.6.1.2.1) i funkcji bariery (pkt 1.6.1.2.2). Zakres dopuszczalności (górna i dolna granica) IC50 lub ET50 powinien zostać ustalony przez dostawcę modelu skóry (lub badacza w przypadku stosowania modelu opracowanego wewnętrznie). Właściwości bariery cechujące tkanki powinny być sprawdzane przez laboratorium po otrzymaniu tkanek. Do wiarygodnego przewidywania skutków drażniących można przyjąć wyłącznie wyniki uzyskane z użyciem zakwalifikowanych tkanek. Poniżej przedstawiono przykładowe zakresy dopuszczalności zwalidowanych metod referencyjnych. Tabela 2 Przykłady kryteriów zwolnienia serii na podstawie kontroli jakości Dolna granica dopuszczalności Średnia zakresu dopuszczalności Górna granica dopuszczalności Zwalidowana metoda referencyjna 1 (traktowanie SDS przez 18 godzin) IC50 = 1,0 mg/ml IC50 = 2,32 mg/ml IC50 = 3,0 mg/ml Zwalidowana metoda referencyjna 2 (1 % Triton X100) ET50 = 4,8 h ET50 = 6,7 h ET50 = 8,7 h 1.6.1.3. Nakładanie substancji badanej i kontrolnej Konieczne jest zastosowanie dostatecznej liczby powtórzeń poddawania tkanek działaniu badanej substancji i prób kontrolnych (co najmniej trzy powtórzenia na serię badań). W przypadku płynnych i stałych substancji należy nałożyć na skórę dostateczną ilość substancji badanej, tak aby równomiernie pokrywała powierzchnię skóry, unikając jednak nakładania dawki nieograniczonej (zob. 1.2 Definicje), tj. należy użyć co najmniej 25 μl/cm2 lub 25 mg/cm2. W przypadku substancji stałych przed ich nałożeniem należy zwilżyć powierzchnię naskórka wodą dejonizowaną lub destylowaną, aby zapewnić dobry kontakt ze skórą. W miarę możliwości substancje stałe powinny być badane w postaci drobnoziarnistego proszku. Pod koniec okresu ekspozycji substancję badaną należy ostrożnie zmyć z powierzchni skóry buforem wodnym lub 0,9 % NaCl. Zależnie od stosowanego modelu zrekonstruowanego ludzkiego naskórka okres ekspozycji może się wahać od 15 do 60 minut, a temperatura inkubacji może wynosić od 20 do 37 °C. Szczegółowe informacje określono w standardowych procedurach operacyjnych dotyczących trzech omawianych metod (21, 22, 23). W każdym badaniu należy stosować równocześnie kontrolę negatywną (NC) i pozytywną (PC), aby wykazać, że żywotność (NC), funkcja bariery i ostateczna czułość tkankowa (PC) są zawarte w dopuszczalnym zakresie zdefiniowanym na podstawie danych historycznych. Jako substancji stanowiącej PC zaleca się użycie 5 % roztworu wodnego SDS. Zalecanymi substancjami stanowiącymi NC są woda lub sól fizjologiczna zbuforowana fosforanem (PBS). 1.6.1.4. Pomiary żywotności komórek Najważniejszym elementem procedury badania jest to, że pomiarów żywotności nie wykonuje się natychmiast po ekspozycji na badane substancje, ale po dostatecznie długim okresie inkubacji tkanek przemytych po tej ekspozycji, w świeżym podłożu. Ten okres pozwala zarówno na ustąpienie słabo drażniących działań, jak i na pojawienie się wyraźnych działań cytotoksycznych. W trakcie fazy optymalizacji badania (9, 10, 11, 12, 13) okazało się, że optymalny jest okres 42 godzin inkubacji tkanek po ekspozycji, w związku z czym został on wykorzystany do walidacji referencyjnych metod badania. Próba konwersji MTT jest zwalidowaną metodą ilościową, którą należy wykorzystywać do pomiarów żywotności komórek. Można ją stosować do badań z użyciem trójwymiarowego wytworu tkankowego. Próbkę skóry umieszcza się w roztworze MTT o właściwym stężeniu (np. 0,3–1 mg/ml) na 3 godziny. Wytrącony niebieski produkt formazanowy ekstrahuje się następnie z tkanki przy użyciu rozpuszczalnika (np. izopropanol, kwaśny izopropanol) i mierzy się stężenie formazanu poprzez oznaczenie OD przy długości fali 570 nm, w paśmie maksimum ±30 nm. Właściwości optyczne substancji badanej lub jej działanie chemiczne na MTT mogą wpływać na próbę, powodując zafałszowanie oceny żywotności (ponieważ substancja badana może uniemożliwiać lub odwracać oraz powodować powstawanie barwy). Może tak się zdarzyć w przypadku niecałkowitego usunięcia określonej substancji badanej ze skóry przez przemywanie lub gdy substancja ta przeniknie przez naskórek. Jeśli substancja badana oddziałuje bezpośrednio na MTT, jest naturalnie barwna lub staje się barwna w trakcie oddziaływania na tkankę, należy zastosować dodatkowe kontrole w celu wykrycia i skorygowania wpływu substancji badanej na technikę pomiaru żywotności. Szczegółowy opis sprawdzenia, czy nie dochodzi do bezpośredniej redukcji MTT, zawarty jest w protokole metody badania dotyczącym zwalidowanych metod referencyjnych (21, 22, 23). Nieswoista barwa (NSC) związana z tymi oddziaływaniami nie powinna przekraczać 30 % NC (do korekcji). Jeśli NSC > 30 %, uznaje się, że badanie nie nadaje się do oceny badanej substancji. 1.6.1.5. Kryteria dopuszczalności próby W przypadku każdej próby z użyciem zwalidowanych serii (zob. pkt 1.6.1.2.5), tkanki traktowane NC powinny wykazywać OD odpowiednią do jakości tkanek poddanych wszystkim etapom wysyłki i odbioru oraz wszystkim procesom protokołu badania działania drażniącego. Wartości OD kontroli nie powinny być niższe niż dolne granice zdefiniowane na podstawie danych historycznych. Również tkanki traktowane PC, tj. 5 % wodnym roztworem SDS, powinny wykazywać czułość zachowaną przez tkanki i zdolność do reagowania na substancję drażniącą w warunkach każdej pojedynczej próby (np. żywotność ≤ 40 % w przypadku zwalidowanej metody referencyjnej 1 oraz ≤ 20 % w przypadku zwalidowanej metody referencyjnej 2). Należy zdefiniować powiązane i właściwe miary zmienności pomiędzy powtórzeniami tkankowymi (np. w przypadku stosowania odchyleń standardowych powinny być one < 18 %). 2. DANE 2.1. DANE W przypadku każdej ekspozycji należy przedstawić w formie tabelarycznej, z uwzględnieniem w stosownych przypadkach danych z powtórzeń eksperymentu, dane z poszczególnych, powtarzalnych prób (np. dane dotyczące wartości OD i obliczonej procentowej żywotności komórek dla każdej badanej substancji, łącznie z klasyfikacją). Dodatkowo należy przedstawić średnie ± odchylenie standardowe z każdej próby. Powinny być przedstawione zaobserwowane interakcje z odczynnikiem MTT i z barwnymi substancjami badanymi w odniesieniu do każdej badanej substancji. 2.2. INTERPRETACJA WYNIKÓW Wartości OD uzyskane dla każdej próbki badanej można wykorzystać do obliczenia procentowej żywotności w porównaniu do NC, której żywotność ustala się na 100 %. Należy wyraźnie zdefiniować i udokumentować wartość odcięcia procentowej żywotności komórek, odróżniającą drażniące substancje badane od niesklasyfikowanych substancji badanych, oraz procedury statystyczne stosowane do oceny wyników i identyfikacji substancji drażniących; należy również udowodnić, że są one właściwe. Poniżej podano wartości odcięcia do predykcji działania drażniącego, związane ze zwalidowanymi metodami referencyjnymi: Substancję badaną uznaje się za drażniącą dla skóry zgodnie z kategorią 2 GHS ONZ: (i) jeśli żywotność tkanki po ekspozycji i następującej po niej inkubacji jest mniejsza lub równa (≤) 50 %. Substancję badaną uznaje się za niezakwalifikowaną do żadnej kategorii: (ii) jeśli żywotność tkanki po ekspozycji i następującej po niej inkubacji jest większa niż (>) 50 %. 3. SPORZĄDZENIE SPRAWOZDANIA 3.1. SPRAWOZDANIE Z BADANIA Sprawozdanie z badania zawierać powinno następujące informacje: Substancje badane i kontrolne: — nazwy chemiczne, np. nazwa IUPAC lub CAS oraz numer CAS, jeśli jest znany, — czystość i skład substancji (w procentach wagowych), — właściwości fizykochemiczne istotne dla prowadzenia badania (np. stan fizyczny, stabilność i lotność, pH, rozpuszczalność w wodzie, jeśli jest znana), — w stosownych przypadkach, obróbka substancji badanych/kontrolnych przed badaniem (np. ogrzanie, zmielenie), — warunki przechowywania. Uzasadnienie dla zastosowanego modelu skóry i protokołu. Warunki badania: — zastosowany system komórkowy, — informacje na temat kalibracji urządzenia pomiarowego i pasma, które wykorzystano do pomiaru żywotności komórek (np. spektrofotometru), — pełne informacje podstawowe na temat stosowanego modelu skóry, z uwzględnieniem jego efektywności, w tym w szczególności następujące dane: (i) żywotność; (ii) funkcja bariery; (iii) morfologia; (iv) odtwarzalność i predykcyjność; (v) kontrole jakości (QC) modelu, — szczegółowe dane na temat zastosowanej procedury badania, — zastosowane badane dawki, czas trwania ekspozycji i okresu inkubacji po ekspozycji, — opis wszelkich modyfikacji procedury badania, — odwołanie do danych historycznych modelu. Powinno to w szczególności obejmować: (i) dopuszczalność danych QC z odwołaniem do danych dotyczących serii historycznych; (ii) dopuszczalność wartości kontroli pozytywnych i negatywnych, z określeniem pozytywnych i negatywnych średnich oraz zakresów kontroli, — opis stosowanych kryteriów oceny, z uzasadnieniem wyboru punktu(-ów) odcięcia w modelu predykcyjnym. Wyniki: — tabelaryczne zestawienie danych dotyczących pojedynczych badanych próbek, — opis innych zaobserwowanych skutków. Omówienie wyników. Wnioski. 4. LITERATURA (1) Organizacja Narodów Zjednoczonych (ONZ) (2007). Globalnie Zharmonizowany System Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów (GHS), wydanie drugie zmienione, ONZ, Nowy Jork i Genewa 2007. Dostępne na stronie internetowej: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html. (2) REACH: Guidance on Information Requirements and Chemical Safety Assessment. Dostępne na stronie internetowej: http://guidance.echa.europa.eu/docs/guidance_document/information_requirements_en.htm?time=1232447649. (3) Test Method B.4. ACUTE TOXICITY; DERMAL IRRITATION/CORROSION. (4) Test Method B.40. IN VITRO SKIN CORROSION: TRANSCUTANEOUS ELECTRICAL RESISTANCE TEST TER. (5) Test Method B.40 BIS. IN VITRO SKIN CORROSION: HUMAN SKIN MODEL TEST. (6) OECD (2006). Test Guideline 435. OECD Guideline for the Testing of Chemicals. In Vitro Membrane Barrier Test Method. Przyjęte 19 lipca 2006 r. Dostępne na stronie internetowej: http://www.oecd.org/document/22/0,2340,en_2649_34377_1916054_1_1_1_1,00.html. (7) ECVAM (2009) Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation. Dostępne pod poleceniem Download Study Documents, na stronie internetowej: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. (8) Fentem, J.H., Briggs, D., Chesné, C., Elliot, G.R., Harbell, J.W., Heylings, J.R., Portes, P., Roguet, R., van de Sandt, J.J.M. & Botham, P. (2001). A prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in Vitro 15, 57–93. (9) Portes, P., Grandidier, M.H., Cohen, C. & Roguet, R.(2002). Refinement of the EPISKIN protocol for the assessment of acute skin irritation of chemicals: follow-up to the ECVAM prevalidation study. Toxicology in Vitro 16, 765–770. (10) Kandárová, H., Liebsch, M., Genschow, E., Gerner, I., Traue, D., Slawik, B. & Spielmann, H. (2004). Optimisation of the EpiDerm test protocol for the upcoming ECVAM validation study on in vitro skin irritation tests. ALTEX 21, 107–114. (11) Kandárová, H., Liebsch, M., Gerner, I., Schmidt, E., Genschow, E., Traue, D. & Spielmann H. (2005) The EpiDerm Test Protocol fort the Upcoming ECVAM Validation Study on In Vitro Skin Irritation Tests — An Assessment of the Performance of the Optimised Test. ATLA 33, 351–367. (12) Cotovio, J., Grandidier, M.–H., Portes, P., Roguet, R. & G. Rubinsteen. (2005). The In Vitro Acute Skin Irritation of Chemicals: Optimisation of the EPISKIN Prediction Model within the Framework of the ECVAM Validation Process. ATLA 33, 329–249. (13) Zuang, V., Balls, M., Botham, P.A., Coquette, A., Corsini, E., Curren, R.D., Elliot, G.R., Fentem, J.H., Heylings, J.R., Liebsch, M., Medina, J., Roguet, R., van De Sandt, J.J.M., Wiemann, C. & Worth, A.(2002). Follow-up to the ECVAM prevalidation study on in vitro tests for acute skin irritation. ECVAM Skin Irritation Task Force Report 2. ATLA 30, 109–129. (14) Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007) The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA 35, 559–601. (15) Hoffmann, S. (2006). ECVAM Skin Irritation Validation Study Phase II: Analysis of the Primary Endpoint MTT and the Secondary Endpoint IL1-α. 135 s. + załączniki. Dostępne pod poleceniem Download Study Documents, na stronie internetowej: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. (16) Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. & Zuang. V (2007) ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals. ATLA 35, 603–619. (17) J. Cotovio, M.–H. Grandidier, D. Lelièvre, R. Roguet, E. Tinois-Tessonneaud, J. Leclaire (2007). In vitro acute skin irritancy of chemicals using the validated EPISKIN model in a tiered strategy – Results and performances with 184 cosmetic ingredients, AATEX, Special Issue-proceedings from WC6. Vol. 14, 351–358. (18) ESAC statement on updated EpiDerm and similar SkinEthic assays z dnia 5 listopada 2008 r. (19) WE (2006). Rozporządzenie (WE) nr 1907/2006 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 18 grudnia 2006 r. w sprawie rejestracji, oceny, udzielania zezwoleń i stosowanych ograniczeń w zakresie chemikaliów (REACH) i utworzenia Europejskiej Agencji Chemikaliów, zmieniające dyrektywę 1999/45/WE oraz uchylające rozporządzenie Rady (EWG) nr 793/93 i rozporządzenie Komisji (WE) nr 1488/94, jak również dyrektywę Rady 76/769/EWG i dyrektywy Komisji 91/155/EWG, 93/67/EWG, 93/105/WE i 2000/21/WE. Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej L 396 z 30.12.2006, s. 1. OPOCE, Luksemburg. (20) Mosman, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65, 55–63. (21) EpiSkin™ SOP, Version 1.6 (January 2005). Validation of the EpiSkin Skin Irritation Test — 42 Hours Assay For The Prediction of Acute Skin Irritation of Chemicals. Dostępne pod poleceniem Download Study Documents, na stronie internetowej: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. (22) EpiDerm™ SOP, Version 5.0 (October 2004). Draft Standard Operating Procedure. In Vitro Skin Irritation Test: Human Skin Model. Model: EpiDerm™- 200. Dostępne pod poleceniem Download Study Documents, na stronie internetowej: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. (23) SkinEthic RHE™ SOP. Tekst będzie dostępny pod poleceniem Download Study Documents, na stronie internetowej: http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. (24) Harvell, J.D., Lammintausta, K., Maibach H.I. (1995) Irritant contact dermatitis IN: Guin J.D. Practical Contact Dermatitis Mc Graw-Hill New York, s. 7–18. (25) Griesinger C, Barroso J & Zuang V: ECVAM background document on the recent adaptations of the ECVAM performance standards for in vitro skin irritation testing in the context of the drafting process of an EU test method and an OECD draft test guideline. Ispra, 13 listopada 2008 r. Dodatek Ocena charakterystyki efektywności proponowanych modeli in vitro zrekonstruowanego ludzkiego naskórka do badania działania drażniącego na skórę WPROWADZENIE Procedury proponowane do stosowania zgodnie z niniejszą metodą badania należy ocenić w celu ustalenia ich wiarygodności i dokładności, przy użyciu substancji reprezentujących pełny zakres wskaźników podrażnienia wg Draize’a. W ocenie z użyciem 20 zalecanych referencyjnych substancji (tabela 2) proponowana procedura powinna mieć wartość wiarygodności i dokładności porównywalną do wykazywanych przez zwalidowaną metodę referencyjną 1 (tabela 3) (1). Normy dokładności i wiarygodności, które powinny zostać osiągnięte, zostały przedstawione poniżej w pkt II i III. Uwzględniono tu substancje niesklasyfikowane i sklasyfikowane (według kategorii 2 GHS ONZ), reprezentujące istotne klasy substancji chemicznych, tak aby wiarygodność i wydajność (czułość, swoistość, odsetki wyników fałszywie ujemnych, odsetki wyników fałszywie dodatnich i dokładność) proponowanej metody badania można było porównać do tych cechujących zwalidowaną metodę referencyjną 1. Przed zastosowaniem metody badania do badań nowych substancji należy określić jej wiarygodność, a także zdolność do prawidłowej identyfikacji substancji drażniących należących do kategorii 2 GHS ONZ. NORMY EFEKTYWNOŚCI Normy efektywności obejmują następujące trzy elementy: I) istotne składowe metody badania, II) referencyjne substancje oraz III) zdefiniowane wartości dokładności i wiarygodności (2). Te normy efektywności są oparte na normach efektywności określonych po zakończeniu badania walidacyjnego ECVAM dotyczącego oceny działania drażniącego na skórę (3). I) Istotne składowe metody badania Ogólne warunki modelu Do tworzenia naskórka należy użyć prawidłowych ludzkich keratynocytów. Pod zachowującą funkcje życiowe warstwą rogową powinno znajdować się kilka warstw żywych komórek naskórka (warstwa podstawna, warstwa kolczysta, warstwa ziarnista). Warstwa rogowa powinna być wielopoziomowa i powinna zawierać lipidy niezbędne do utworzenia czynnościowej bariery na tyle wytrzymałej, aby uniemożliwiała szybkie przenikanie cytotoksycznych markerów, np. soli sodowej siarczanu dodecylu (SDS) lub markera Triton X-100. Funkcję bariery można ocenić albo poprzez ustalenie stężenia, w którym marker zmniejsza żywotność tkanek o 50 % (IC50) po ustalonym czasie ekspozycji, albo poprzez ustalenie czasu ekspozycji potrzebnego do zmniejszenia żywotności komórek o 50 % (ET50) po zastosowaniu markera w określonym, stałym stężeniu. Właściwości izolacyjne modelu powinny zapobiegać przechodzeniu materiału przez warstwę rogową do żywej tkanki, gdyż w innym razie modelowanie ekspozycji skóry mogłoby być niewłaściwe. Model skóry nie powinien być skażony bakteriami, wirusami, mykoplazmami ani grzybami. Funkcjonalne warunki modelu Żywotność Zalecaną próbą ustalenia wielkości żywotności jest MTT (4). Gęstość optyczna OD ekstrahowanego (rozpuszczonego) barwnika z tkanki potraktowanej NC powinna być co najmniej 20 razy większa niż OD samego rozpuszczalnika do ekstrakcji. Należy udokumentować stabilność w hodowli (uzyskiwanie podobnych wyników pomiarów żywotności) tkanki potraktowanej NC w okresie ekspozycji testowej. Funkcja bariery Warstwa rogowa i wchodzące w jej skład lipidy powinny być na tyle odporne, aby nie było możliwe szybkie przenikanie przez nie cytotoksycznych markerów, np. SDS lub markera Triton X-100, według oceny na podstawie IC50 lub ET50. Morfologia Odpowiednio wykwalifikowany personel powinien przeprowadzić badanie histologiczne zrekonstruowanej skóry/zrekonstruowanego naskórka, z wykazaniem istnienia struktury przypominającej ludzką skórę/ludzki naskórek (w tym wielopoziomowej warstwy rogowej). Odtwarzalność Należy wykazać odtwarzalność w czasie wyników zastosowania metody wykorzystującej określony model, najlepiej z użyciem właściwej substancji (wzorcowej) do kontroli serii (zob. definicje w sekcji 1.2). Kontrole jakości (QC) modelu Każda seria stosowanego modelu naskórka powinna spełniać określone kryteria zwolnienia do produkcji, spośród których najistotniejsze są te dotyczące żywotności i funkcji bariery. Zakres dopuszczalności (górna i dolna granica) IC50 lub ET50 powinien zostać ustalony przez dostawcę modelu skóry (lub badacza w przypadku stosowania modelu opracowanego wewnętrznie). Właściwości bariery cechujące tkanki powinny być sprawdzane przez laboratorium po otrzymaniu tkanek. Do wiarygodnego przewidywania skutków drażniących można przyjąć wyłącznie wyniki uzyskane z użyciem zakwalifikowanych tkanek. Poniżej przedstawiono przykładowe zakresy dopuszczalności zwalidowanych metod referencyjnych. Tabela 1 Przykłady kryteriów zwolnienia serii na podstawie kontroli jakości Dolna granica dopuszczalności Średnia zakresu dopuszczalności Górna granica dopuszczalności Zwalidowana metoda referencyjna 1 (traktowanie SDS przez 18 godzin) IC50 = 1,0 mg/ml IC50 = 2,32 mg/ml IC50 = 3,0 mg/ml Zwalidowana metoda referencyjna 2 (1 % Triton X100) ET50 = 4,8 h ET50 = 6,7 h ET50 = 8,7 h II) Referencyjne substancje Referencyjne substancje są wykorzystywane do ustalenia, czy wiarygodność i dokładność proponowanej nowej metody badania in vitro zrekonstruowanego ludzkiego naskórka, o udowodnionym dostatecznym podobieństwie strukturalnym i funkcjonalnym do zwalidowanych metod referencyjnych lub stanowiącej niewielką modyfikację zwalidowanej metody referencyjnej, wskazują na porównywalną efektywność tej metody z zatwierdzoną metodą referencyjną 1 (1). Do 20 referencyjnych substancji wymienionych w tabeli 2 należą substancje reprezentujące różne istotne klasy chemiczne, jak również substancje z kategorii 2 GHS ONZ. Wymienione substancje obejmują 10 substancji kategorii 2 GHS ONZ, 3 substancje opcjonalnej kategorii 3 GHS ONZ i 7 niesklasyfikowanych substancji. Zgodnie z niniejszą metodą badania opcjonalna kategoria 3 jest uznawana za brak kategorii. Te referencyjne substancje odpowiadają minimalnej liczbie substancji, które należy wykorzystać do oceny dokładności i wiarygodności proponowanej metody badania działania drażniącego na skórę z użyciem zrekonstruowanego ludzkiego naskórka. W sytuacjach, w których wymieniona substancja nie jest dostępna, można wykorzystać inne substancje, w odniesieniu do których są dostępne właściwe dane referencyjne z badań in vivo. W razie potrzeby wykaz minimum substancji referencyjnych można uzupełnić o dodatkowe substancje, reprezentujące inne klasy chemiczne, w odniesieniu do których są dostępne dostateczne dane referencyjne z badań in vivo, aby dodatkowo ocenić dokładność proponowanej metody badania. Tabela 2 Referencyjne substancje wykorzystywane do ustalenia dokładności i wiarygodności modeli zrekonstruowanego ludzkiego naskórka do badań działania drażniącego na skórę Substancja (1) Nr CAS Nr EINECS Stan fizyczny Ocena in vivo Kat. GHS in vitro Kat. GHS in vivo 1-bromo-4-chlorobutan 6940–78–9 230–089–3 C 0 Kat. 2 Brak kat. Ftalan dietylu 84–66–2 201–550–6 C 0 Brak kat. Brak kat. Kwas naftylooctowy 86–87–3 201–705–8 S 0 Brak kat. Brak kat. 2-propenylo fenoksyoctan 7493–74–5 231–335–2 C 0,3 Brak kat. Brak kat. Izopropanol 67–63–0 200–661–7 C 0,3 Brak kat. Brak kat. Aldehyd 4-metylo-tio-benzoesowy 3446–89–7 222–365–7 C 1 Kat. 2 Brak kat. Stearynian metylu 112–61–8 203–990–4 S 1 Brak kat. Brak kat. Maślan heptylu 5870–93–9 227–526–5 C 1,7 Brak kat. Opcjonalna kat. 3 Salicylan heksylu 6259–76–3 228–408–6 C 2 Brak kat. Opcjonalna kat. 3 Fosforan triizobutylu 126–71–6 204–798–3 C 2 Kat. 2 Opcjonalna kat. 3 1-dekanol 112–30–1 203–956–9 C 2,3 Kat. 2 Kat. 2 Aldehyd cyklamenu 103–95–7 203–161–7 C 2,3 Kat. 2 Kat. 2 1-bromoheksan 111–25–1 203–850–2 C 2,7 Kat. 2 Kat. 2 Chlorowodorek 2-chlorometylo-3,5-dimetylo-4-metoksypirydyny 86604–75–3 434–680–9 S 2,7 Kat. 2 Kat. 2 a-terpineol 98–55–5 202–680–6 C 2,7 Kat. 2 Kat. 2 Disiarczek di-n-propylu 629–19–6 211–079–8 C 3 Brak kat. Kat. 2 Metakrylan butylu 97–88–1 202–615–1 C 3 Kat. 2 Kat. 2 Benzenotiol, 5–(1,1-dimetyloetylo)-2-metylu 7340–90–1 438–520–9 C 3,3 Kat. 2 Kat. 2 1-metylo-3-fenylo-1-piperazyna 5271–27–2 431–180–2 S 3,3 Kat. 2 Kat. 2 Heptanal 111–71–7 203–898–4 C 4 Kat. 2 Kat. 2 Substancje wymienione w tabeli 2 stanowią reprezentatywny wybór spośród 58 substancji użytych w międzynarodowym badaniu walidacyjnym ECVAM dotyczącym oceny działania drażniącego na skórę (1). Ich wyboru dokonano na podstawie następujących kryteriów: — wymienione substancje są dostępne w handlu, — są reprezentatywne dla pełnego zakresu wskaźników podrażnienia wg Draize’a (od niedrażniących do silnie drażniących), — mają określoną budowę chemiczną, — są reprezentatywne dla odtwarzalności i zdolności predykcyjnej zwalidowanej metody, ustalonych w badaniu walidacyjnym wykonanym przez ECVAM, — są reprezentatywne dla funkcjonalności chemicznej wykorzystywanej w procesie walidacji, — nie wykazują bardzo wysoce toksycznych właściwości (np. nie są rakotwórcze ani toksyczne dla układu rozrodczego) i nie wiążą się z nadmiernymi kosztami usuwania pozostałości. III) Zdefiniowane wartości dokładności i wiarygodności Wydajność (czułość, swoistość, odsetek wyników fałszywie ujemnych, odsetek wyników fałszywie dodatnich i dokładność) proponowanej metody badania powinna być porównywalna z odpowiednimi wartościami w przypadku zwalidowanej metody referencyjnej 1 (tabela 3), tj. czułość powinna być większa lub równa (≥) 80 %, swoistość powinna być większa lub równa (≥) 70 %, a dokładność powinna być większa lub równa (≥) 75 %. Wydajność należy obliczyć z uwzględnieniem wszystkich uzyskanych klasyfikacji 20 substancji w uczestniczących laboratoriach. Klasyfikację każdej substancji w każdym laboratorium należy uzyskać na podstawie średniej wartości żywotności w trakcie wykonanych poszczególnych serii badań (minimum trzy ważne serie). Tabela 3 Wydajność zwalidowanej metody referencyjnej 1 (2) Metoda badania Liczba substancji Czułość Swoistość Odsetek wyników fałszywie ujemnych Odsetek wyników fałszywie dodatnich Dokładność Zwalidowana metoda referencyjna 1 (3) 58 87,2 % (4) 71,1 % (5) 12,8 % 29,9 % 74,7 % Zwalidowana metoda referencyjna 1 (3) 20 90 % 73,3 % 10 % 26,7 % 81,7 % Wiarygodność proponowanej metody badania powinna być porównywalna z wiarygodnością zwalidowanych metod referencyjnych. Odtwarzalność wewnątrzlaboratoryjna Ocena odtwarzalności wewnątrzlaboratoryjnej powinna wykazywać zgodność klasyfikacji (kategoria 2/brak kategorii) uzyskanej w różnych, niezależnych seriach badań 20 referencyjnych substancji w pojedynczym laboratorium większą lub równą (≥) 90 %. Odtwarzalność międzylaboratoryjna Ocena odtwarzalności międzylaboratoryjnej nie jest niezbędna, jeśli proponowana metoda badania ma być stosowana tylko w jednym laboratorium. Aby można było przenosić metody pomiędzy laboratoriami, zgodność klasyfikacji (kategoria 2/brak kategorii) uzyskanej w różnych, niezależnych seriach badań 20 referencyjnych substancji pomiędzy, najkorzystniej, minimalnie trzema laboratoriami powinna być większa lub równa (≥) 80 %. LITERATURA (1) Spielmann, H., Hoffmann, S., Liebsch, M., Botham, P., Fentem, J., Eskes, C., Roguet, R., Cotovió, J., Cole, T., Worth, A., Heylings, J., Jones, P., Robles, C., Kandárová, H., Gamer, A., Remmele, M., Curren, R., Raabe, H., Cockshott, A., Gerner, I. and Zuang, V. (2007) The ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Report on the Validity of the EPISKIN and EpiDerm Assays and on the Skin Integrity Function Test. ATLA 35, 559–601. (2) OECD (2005) Guidance Document No. 34 on the validation and international acceptance of new or updated test methods for hazard assessment. OECD, Paryż. (3) ECVAM (2007) Performance Standards for applying human skin models to in vitro skin irritation. Dostępne pod poleceniem Download Study Documents, na stronie internetowej http://ecvam.jrc.ec.europa.eu. Strona ostatnio sprawdzona w dniu 27.10.2008 r. (4) Mosman, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods 65, 55–63. (5) Eskes, C., Cole, T., Hoffmann, S., Worth, A., Cockshott, A., Gerner, I. & Zuang. V (2007) ECVAM International Validation Study on In Vitro Tests for Acute Skin Irritation: Selection of Test Chemicals. ATLA 35, 603–619. (1) 20 referencyjnych substancji stanowi reprezentatywny wybór spośród 58 substancji, które zostały pierwotnie użyte do zwalidowania metody referencyjnej 1 (EpiSkin™). Dostępny jest pełny wykaz substancji badanych i kryteriów ich wyboru (5). (2) W tabeli 3 podano wydajność określającą zdolność zwalidowanej metody referencyjnej 1 do prawidłowego zidentyfikowania substancji drażniących (kategoria 2 GHS ONZ) i niesklasyfikowanych substancji (brak kategorii, w tym opcjonalna kategoria 3) odpowiednio w odniesieniu do 58 i 20 referencyjnych substancji (tabela 2). (3) EpiSkin™. (4) Badanie z uwzględnieniem 13 substancji drażniących kategorii 2 GHS. (5) Badanie z uwzględnieniem 45 substancji drażniących kategorii 3 GHS lub substancji niesklasyfikowanych.

ZAŁĄCZNIK IV C.3. BADANIE INHIBICJI WZROSTU SŁODKOWODNYCH GLONÓW I CYJANOBAKTERII 1. METODA Niniejsza metoda odpowiada OECD TG 201 (2006) (1). 1.1. WSTĘP Metody badawcze są okresowo przeglądane i aktualizowane w świetle postępu naukowego. Metoda badawcza C.3 wymagała korekty, tak by objąć dodatkowe gatunki i spełnić wymagania w zakresie oceny zagrożenia oraz klasyfikacji substancji chemicznych. Korekty dokonano na podstawie szerokich doświadczeń praktycznych, postępu naukowego w dziedzinie badań nad toksycznością glonów oraz rozległego zastosowania regulacyjnego, które nastąpiło od czasu pierwotnego przyjęcia. 1.2. DEFINICJE Do celów niniejszej metody użyto następujących definicji i skrótów: Biomasa: jest to ciężar suchej materii żywej obecnej w populacji, wyrażony na objętość; np. mg glonów/litr badanego roztworu. Zwykle „biomasę” określa się w postaci masy, lecz w niniejszym badaniu słowo to użyte jest w odniesieniu do masy przypadającej na objętość. Ponadto w niniejszym badaniu zwykle mierzy się również surogaty biomasy, takie jak liczba komórek, fluorescencja, itp. i przez to określenie „biomasa” odnosi się także do tych surogatowych miar. Współczynnik zmienności: jest bezwymiarową miarą zmienności parametru, określoną jako stosunek odchylenia standardowego do średniej. Może on również być wyrażony jako wartość procentowa. Średni współczynnik zmienności średniej właściwej szybkości wzrostu w replikatowych kulturach kontrolnych należy obliczyć w następujący sposób: 1. Obliczyć % CV (współczynnik zmienności) średniej właściwej szybkości wzrostu z szybkości wzrostu dla odnośnego replikatu. 2. Obliczyć wartość średnią ze wszystkich wartości obliczonych w punkcie 1, otrzymując średni współczynnik zmienności właściwej szybkości wzrostu dla poszczególnych dni/odcinków w replikatowych kulturach kontrolnych. ECx : jest stężeniem substancji testowej rozpuszczonej w pożywce, powodującym zmniejszenie wzrostu badanego organizmu o x % (np. 50 %) w danym okresie ekspozycji (który należy wyraźnie podać, jeśli odbiega od pełnego lub normalnego czasu trwania badania). Aby w sposób jednoznaczny oznaczyć wartość EC otrzymaną z szybkości wzrostu lub z uzysku, używa się symboli, odpowiednio, „ErC” i „EyC”. Pożywka wzrostowa: jest to kompletne syntetyczne podłoże hodowlane, w którym wzrastają glony, gdy są wystawione na działanie substancji testowej. Substancja testowa zwykle jest rozpuszczona w pożywce. Szybkość wzrostu (średnia właściwa szybkość wzrostu): jest to logarytmiczny wzrost biomasy w ciągu okresu ekspozycji. Najmniejszy obserwowany poziom stężenia (LOEC): jest to najniższe badane stężenie, przy którym zostaje zaobserwowane, że substancja ma statystycznie istotny redukujący wpływ na wzrost (przy p < 0,05) w porównaniu do kultury kontrolnej, w danym okresie ekspozycji. Jednakże wszystkie badane stężenia powyżej LOEC muszą mieć szkodliwy wpływ równy lub większy niż te, które są obserwowane przy LOEC. Gdy te dwa warunki nie mogą być spełnione, należy podać pełne wyjaśnienie, w jaki sposób LOEC (a stąd NOEC) zostało wybrane. Nieobserwowany wpływ stężenia (NOEC): jest to stężenie bezpośrednio poniżej LOEC. Zmienna odpowiedzi: jest to zmienna dla oszacowania toksyczności uzyskana z dowolnych zmierzonych parametrów opisujących biomasę za pomocą różnych metod obliczania. W przypadku niniejszej metody szybkości wzrostu i uzysk są zmiennymi odpowiedzi uzyskanymi z pomiaru biomasy bezpośrednio lub pomiaru dowolnego ze wspomnianych surogatów. Właściwa szybkość wzrostu: jest to zmienna odpowiedzi określona jako iloraz różnicy logarytmów naturalnych parametru obserwacji (w niniejszej metodzie badawczej — biomasy) przez odpowiedni okres. Uzysk: jest to wartość zmiennej pomiarowej na końcu okresu ekspozycji minus wartość zmiennej pomiarowej na początku okresu ekspozycji, wyrażająca przyrost biomasy w ciągu badania. 1.3. STOSOWALNOŚĆ BADANIA Niniejszą metodę badawczą najłatwiej stosuje się do substancji rozpuszczalnych w wodzie, które — w warunkach badania — prawdopodobnie pozostaną w wodzie. Dla badania substancji lotnych, silnie adsorbujących, zabarwionych lub mających niską rozpuszczalność w wodzie, bądź substancji, które mogą wpływać na dostępność składników pokarmowych lub minerałów w pożywce, mogą być wymagane pewne modyfikacje opisywanej procedury (np. układ zamknięty, specjalne przygotowanie naczyń testowych). Wskazówki dotyczące niektórych stosownych modyfikacji podano w (2), (3) i (4). 1.4. ZASADA BADANIA Celem niniejszego badania jest określenie wpływu danej substancji na wzrost słodkowodnych mikroglonów i/lub cyjanobakterii. Wykładniczo wzrastające badane organizmy wystawia się na działanie substancji testowej w hodowlach statycznych na okres wynoszący zwykle 72 godziny. Pomimo stosunkowo krótkiego czasu trwania badania, skutki można ocenić na przestrzeni kilku pokoleń. Odpowiedź układu polega na ograniczeniu wzrostu w szeregu kultur glonów (badanych jednostek) wystawionych na działanie różnych stężeń substancji testowej. Odpowiedź ocenia się w funkcji stężenia w stosunku do średniego wzrostu replikatu, kultur kontrolnych niepoddawanych ekspozycji. Dla pełnego wyrażenia odpowiedzi układu na toksyczne oddziaływania (optymalnej czułości), kulturom umożliwia się nieograniczony wykładniczy wzrost w dostatecznych warunkach odżywczych i przy stałym świetle przez wystarczający czas, aby zmierzyć zmniejszenie właściwej szybkości wzrostu. Wzrost i inhibicję wzrostu określa się ilościowo poprzez pomiary biomasy glonów w funkcji czasu. Biomasę glonów określa się jako ciężar masy suchej przypadający na objętość, np. mg glonów/