Decyzja Komisji

z dnia 15 lipca 1994 r.

dotycząca warunków zdrowotnych zwierząt i świadectw weterynaryjnych dla przywozu nasienia bydła z państw trzecich

(94/577/WE)

KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH,

uwzględniając Traktat ustanawiający Wspólnotę Europejską,

uwzględniając dyrektywę Rady 88/407/EWG z dnia 14 czerwca 1988 r. ustanawiającą warunki zdrowotne zwierząt wymagane w handlu wewnątrzwspólnotowym oraz w przywozie zamrożonego nasienia bydła domowego [1], ostatnio zmieniona dyrektywą 93/60/EWG [2], w szczególności jej art. 10 i 11,

a także mając na uwadze, co następuje:

wykaz państw trzecich, z których Państwa Członkowskie zatwierdzają przywóz nasienia bydła domowego (zwany dalej "wykazem państw trzecich") został ustanowiony decyzją Komisji 90/14/EWG [3], ostatnio zmienioną decyzją 91/276/EWG [4];

sytuacja w zakresie chorób w Izraelu doprowadziła decyzją Komisji 91/277/EWG [5] do zakazu przywozu z tego państwa;

decyzje Komisji 91/479/EWG [6], 91/549/EWG [7], 92/123/EWG [8], 92/124/EWG [9], 92/125/EWG [10], 92/126/EWG [11], 92/127/EWG [12], 92/128/EWG [13], 92/386/EWG [14], 92/387/EWG [15] oraz 92/445/EWG [16] ustanawiają warunki zdrowotne zwierząt oraz świadectwa weterynaryjne dla przywozu nasienia bydła, odpowiednio, ze Stanów Zjednoczonych Ameryki Północnej, Kanady, Polski, Finlandii, Nowej Zelandii, Austrii, Szwajcarii, Szwecji, Węgier, Norwegii i Czechosłowacji;

dyrektywa 93/60/EWG, która musi zostać wprowadzona w życie w Państwach Członkowskich najpóźniej do dnia 1 lipca 1994 r., zmienia dyrektywę 88/407/EWG w następstwie powodując konieczność wprowadzenia zmian do wyżej wspomnianych decyzji, dotyczących poszczególnych państw trzecich; w celu uproszczenia i wyjaśnienia legislacji wspólnotowej w tym zakresie, niezbędne jest pogrupowanie wyżej wspomnianych decyzji oraz uchylenie decyzji obowiązujących odrębnie w odniesieniu do poszczególnych państw;

z uwagi na odpowiednie przepisy Porozumienia o Europejskim Obszarze Gospodarczym, nie jest konieczne zachowanie świadectw zdrowia zwierząt dla przywozu nasienia bydła z Austrii, Finlandii, Norwegii oraz Szwecji;

zgodnie z opinią Naukowego Komitetu Weterynaryjnego, wymagany jest dodatkowy test na epizootyczną chorobę krwotoczną;

tylko w stosunku do Kanady przeprowadzane są przed pobieraniem rutynowe testy na obecność tej choroby, przeprowadzane w sześciomiesięcznych odstępach dlatego jest konieczneustanowienieokresu przejściowego, dla wprowadzenia niniejszej decyzji w odniesieniu do Kanady, aby kanadyjskie władze weterynaryjne uzyskały wystarczający okres czasu na wprowadzenie nowego testu w ramach ich rutynowego programu;

w następstwie najnowszych osiągnięć naukowych w rozumieniu epidemiologii choroby niebieskiego języka, przywóz nasienia bydła z Australii może być obecnie dozwolony;

ogólna sytuacja w zakresie zdrowia zwierząt w krajach, umieszczonych w wykazie państw trzecich, jest dobra oraz jest kontrolowana przez dobrze zorganizowane i o odpowiedniej strukturze służby weterynaryjne, w odniesieniu do chorób przenoszonych przez nasienie;

odpowiedzialne władze weterynaryjne państw trzecich zobowiązały się do powiadamiania Komisji i Państw Członkowskich, z wykorzystaniem teleksu lub telefaksu, w terminie 24 godzin, o potwierdzeniu wystąpienia jakiejkolwiek choroby znajdującej się w wykazie A Międzynarodowego Biura ds. Epizoocji (OIE) lub o wszelkich zmianach w polityce szczepień w zakresie dotyczącym każdej z tych chorób, w odpowiednim terminie, o występowaniu chorób z wykazu B OIE oraz o wszelkich projektowanych zmianach w zasadach przywozu dotyczących zwierząt domowych lub ich nasienia lub zarodków;

odpowiedzialne władze weterynaryjne państw trzecich, umieszczonych w wykazie, zobowiązały się do urzędowego nadzorowania wydawania świadectw na mocy niniejszej decyzji oraz do zapewnienia, że wszystkie odpowiednie świadectwa, odstępstwa i wyniki badań laboratoryjnych, na których oparte jest świadectwo, pozostaną w aktach urzędowych przez okres co najmniej 12 miesięcy od dnia wysyłki nasienia, którego dotyczą;

odpowiedzialne władze weterynaryjne państw trzecich, umieszczonych w wykazie, zobowiązały się do urzędowego zatwierdzania punktów pobierania nasienia, przeznaczonego do wywozu do Europejskiej Wspólnoty Gospodarczej, jak jest to wymagane na mocy art. 9 dyrektywy 88/407/EWG;

warunki zdrowotne zwierząt i świadectwa weterynaryjne muszą być dostosowane do sytuacji zdrowia zwierząt w danym państwie trzecim;

środki przewidziane w niniejszej decyzji są zgodne z opinią Stałego Komitetu Weterynaryjnego,

PRZYJMUJE NINIEJSZĄ DECYZJĘ:

Artykuł 1

Państwa Członkowskie zatwierdzają przywóz nasienia bydła, który jest zgodny z warunkami wymienionymi w świadectwach w części 1 załączników A, B, C i D oraz wyłącznie z tych państw trzecich, które uwzględnia się w części 2 odpowiednio załączników A, B, C i D.

Jednakże, Państwa Członkowskie zatwierdzają przywóz z Kanady nasienia bydła pobranego i poddanego obróbce zgodnie z decyzją 91/549/EWG do dnia 31 grudnia 1994 r.

Artykuł 2

Tracą moc decyzje 91/479/EWG, 92/123/EWG, 92/124/EWG, 92/125/EWG, 92/126/EWG, 92/127/EWG, 92/128/EWG, 92/386/EWG, 92/387/EWG i 92/445/EWG.

Decyzja 91/549/EWG traci moc z dniem 1 stycznia 1995 r.

Artykuł 3

Przepisy odnoszące się do Kanady, wskazane w art. 1 akapit pierwszy, stosuje się od dnia 1 stycznia 1995 r.

Artykuł 4

Niniejsza decyzja skierowana jest do Państw Członkowskich.

Sporządzono w Brukseli, dnia 15 lipca 1994 r.

W imieniu Komisji

René Steichen

Członek Komisji

[1] Dz.U. L 194 z 22.7.1988, str. 10.

[2] Dz.U. L 186 z 28.7.1993, str. 28.

[3] Dz.U. L 8 z 11.1.1990, str. 71.

[4] Dz.U. L 135 z 30.5.1991, str. 58.

[5] Dz.U. L 135 z 30.5.1991, str. 60.

[6] Dz.U. L 258 z 16.9.1991, str. 1.

[7] Dz.U. L 298 z 29.10.1991, str. 6.

[8] Dz.U. L 48 z 22.2.1992, str. 1.

[9] Dz.U. L 48 z 22.2.1992, str. 10.

[10] Dz.U. L 48 z 22.2.1992, str. 19.

[11] Dz.U. L 48 z 22.2.1992, str. 28.

[12] Dz.U. L 48 z 22.2.1992, str. 37.

[13] Dz.U. L 48 z 22.2.1992, str. 46.

[14] Dz.U. L 204 z 21.7.1992, str. 13.

[15] Dz.U. L 204 z 21.7.1992, str. 22.

[16] Dz.U. L 247 z 27.8.1992, str. 1.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK A

CZĘŚĆ 1

ŚWIADECTWO ZDROWIA

dla przywozu nasienia bydła

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

CZĘŚĆ 2

Wykaz krajów upoważnionych do stosowania wzoru świadectwa zdrowia określonego w załączniku A część 1

REPUBLIKA CZESKA

WĘGRY

NOWA ZELANDIA

POLSKA

RUMUNIA

SZWAJCARIA

REPUBLIKA SŁOWACKA

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK B

CZĘŚĆ 1

ŚWIADECTWO ZDROWIA

dla przywozu nasienia bydła ze Stanów Zjednoczonych Ameryki Północnej

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

CZĘŚĆ 2

Wykaz krajów upoważnionych do stosowania wzoru świadectwa zdrowia określonego w załączniku B część 1

STANY ZJEDNOCZONE AMERYKI PÓŁNOCNEJ

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK C

CZĘŚĆ 1

ŚWIADECTWO ZDROWIA

dla przywozu nasienia bydła

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

CZĘŚĆ 2

Wykaz krajów upoważnionych do stosowania wzoru świadectwa zdrowia zwierząt określonego w załączniku C część I

KANADA: z wyłączeniem rejonu Doliny Okanagan Kolumbii Brytyjskiej, który jest oznaczony jako obszar rozgraniczony linią nakreśloną z punktu na granicy kanadyjsko-amerykańskiej 120o 15' długości geograficznej 49o szerokości geograficznej północnej do punktu 119o 35' długości geograficznej, 50o 30' szerokości geograficznej północno-wschodniej do punktu 119o długości geograficznej, 50o 45' szerokości geograficznej południowej do punktu na granicy kanadyjsko-amerykańskiej 118o 15' długości geograficznej i 49o szerokości geograficznej.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK D

CZĘŚĆ 1

ŚWIADECTWO ZDROWIA ZWIERZĄT

dla przywozu nasienia bydła

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

CZĘŚĆ 2

Wykaz państw trzecich upoważnionych do stosowania wzoru świadectwa zdrowia określonego w załączniku D części 1

AUSTRALIA

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK E

Protokół wykonywania testu ELISA (testu immunoabsorbcji enzymozależnej), z zastosowaniem specyficznego grupowo, monoklonalnego przeciwciała dla wykrywania wirusowych przeciwciał choroby niebieskiego języka

TEST ELISA SŁUŻĄCY DO WYKRYWANIA CHOROBY NIEBIESKIEGO JĘZYKA STOSUJĄCY MONOKLONALNE PRZECIWCIAŁO 3–17-A3

Test ten służy do wykrywania przeciwciał wszystkich znanych serotypów wirusa choroby niebieskiego języka (BTV).

Zasadą testu jest blokowanie reakcji zachodzącej między antygenem choroby niebieskiego języka a specyficznym grupowo przeciwciałem monoklonalnym (3–17-A3) poprzez dodanie rozcieńczenia badanej surowicy. Zawarte w badanej surowicy przeciwciała blokują reakcję przeciwciała monoklonalnego (MAB) i w wyniku tego następuje obniżenie intensywności oczekiwanego zabarwienia po dodaniu substratu enzymu.

MATERIAŁY I ODCZYNNIKI

1. Mikropłytki płaskodenne.

2. Antygen: przygotowany według zamieszczonego poniżej opisu.

3. Roztwór buforowy: 5 % (w/v) "Marvel" mleko w proszku 0,1 % (v/v) Tween-20 (dostarczany jako syrop sorbitolowy polyoxyetylenu) w buforowanym roztworze chlorku sodu, fosforanu sodu i fosforanu potasu (PBS).

4. Przeciwciało monoklonalne: 3–17-A3 (dostarczane w formie supernatantu hodowli komórkowej) przechowywane w – 20 °C lub liofilizowane, rozcieńczone bezpośrednio przed użyciem w 1/50 z roztworem buforowym skierowane przeciwko specyficznemu grupowo polipetdydowi p7.

5. Koniugat: globulina przeciwciał anty-mysich (absorbowana i wypłukana) koniugowana w peroksydazę chrzanową oraz przetrzymywana w ciemności w temperaturze 4 °C.

6. Substrat i chromogen: 0,2 % ortofenylo dwuamina (OPD) rozpuszczona w roztworze buforowym zawierającym 2553 gm kwasu cytrynowego i 4574 gm fosforanu dwu-sodowego sporządzone do 500 ml w wodzie destylowanej, podzielone na dawki po 25 ml i przetrzymywane w ciemności w – 20 °C z 12 μl/25 ml nadtlenku wodoru (w/v 30 %) dodane tuż przed użyciem.

OPD STOSOWAĆ OSTROŻNIE — NAKŁADAĆ GUMOWE RĘKAWICE — MOŻLIWE DZIAŁANIE MUTAGENNE.

7. 1 molarny kwas siarkowy: 26,6 ml kwasu dodanego do 473,4 ml wody destylowanej.

UWAGA: ZAWSZE NALEŻY DODAWAĆ KWAS DO WODY — NIGDY NIE DODAWAĆ WODY DO KWASU.

8. Wytrząsarka obrotowa.

9. Czytnik do ELISA (test może być odczytany wizualnie).

FORMUŁA TESTU

+++++ TIFF +++++

PROTOKÓŁ DOTYCZĄCY STOSOWANIA TESTU

Kontrola ślepa

Rząd 1A — H jest kontrolą ślepą składająca się z antygenu BTV i koniugatu. Może ona być stosowana do sprawdzania czytnika ELISA.

Kontrola MAB

Rząd 2A — H jest kontrolą przeciwciała monoklonalnego i składa się z antygenu BTV, przeciwciała monoklonalnego i koniugatu. Stanowi to kontrolę ujemną. Średni odczyt gęstości optycznej z tego rzędu kontrolnego stanowi 0 % wartości zahamowania.

Kontrola dodatnia

Rząd 3A — H jest kontrolą dodatnią. Składa się ona z antygenu BTV, rozcieńczenia dodatniej surowicy BTV, MAB i koniugatu. Stanowi to wskaźnik czy test funkcjonuje prawidłowo a w teście powinny być otrzymane podobne poziomy zahamowania.

Surowice badane

W zamieszczonym powyżej schemacie testu, może zostać zbadane 18 surowic w rozcieńczeniu 1/2, 1/4/, 1/8 i 1/16. To powinno dać pewną informację o mianie przeciwciał w badanych surowicach. Rozcieńczenie surowic może być dokonywane dalej, aby otrzymać końcowe miano. Z drugiej strony dla dokonywania badań serologicznych na dużą skalę, surowice mogą być badane w jednokrotnym rozcieńczeniu (1/4) lub w dwu rozcieńczeniach (1/2 I 1/4) jako szybkie badanie odsiewowe.

PROCEDURA

1. Rozcieńczyć antygen BTV w PBS, do stężenia przed miareczkowaniem, poddać sonifikacji (jeśli taki aparat nie jest dostępny, zamieszać intensywnie pipetą) oraz dodać 50 μl do wszystkich dołków mikropłytki ELISA. Uderzyć w boki płytki, aby rozproszyć antygen.

2. Inkubować w temperaturze 37 °C w ciągu 60 minut w wytrząsarce obrotowej. Przeprowadzić trzykrotne płukanie płytek przez napełnianie i opróżnianie dołków niesterylnym PBS a następnie osuszyć płytkę na ligninie.

3. Dodać 50 μl roztworu buforowego na studzienkę. Dodać surowice badane i surowice dodatnie do odpowiednich dołków oraz rozcieńczyć na całej płytce używając pipety wielokanałowej. Nie należy dodawać surowic do kontroli ślepej i do kontroli MAB.

4. Niezwłocznie po rozcieńczeniu surowic, należy rozcieńczyć MAB w płynie do rozcieńczania (do rozcieńczenia przed miareczkowaniem) i dodać 50 μl do wszystkich dołków płytki, z wyjątkiem kontroli ślepej.

5. Inkubować w temperaturze 37 °C w ciągu 60 minut w wytrząsarce obrotowej Przeprowadzić trzykrotne płukanie płytek przez napełnianie i opróżnianie dołków niesterylnym PBS a następnie osuszyć płytkę na ligninie.

6. Rozcieńczyć koncentrat globuliny przeciwciał anty-mysich do 1/5000 w roztworze buforowym i dodać 50 μl do wszystkich dołków płytki.

7. Inkubować w temperaturze 37 °C w ciągu 60 minut w wytrząsarce obrotowej Przeprowadzić trzykrotne płukanie płytek przez napełnianie i opróżnianie dołków niesterylnym PBS a następnie osuszyć płytkę na ligninie.

8. Rozmrozić OPD oraz bezpośrednio przed użyciem dodać 12 μl 30 % nadtlenku wodoru do każdej dawki 25 ml OPD. Dodać 50 μl do każdego dołka płytki. Dać czas na pojawienie się zabarwienia, około 10 minut, a następnie należy zatrzymać reakcję 1 M kwasem siarkowym (50 μl do dołka). Zabarwienie powinno wystąpić w dołkach kontrolnych MAB oraz w dołkach nie zawierających przeciwciała przeciwko BTV.

9. Wyniki należy odczytać za pomocą czytnika ELISA albo wizualnie.

ANALIZA WYNIKÓW

Należy obliczyć średnią wartość gęstości optycznej z kontroli MAB. Daje to wartość 0 % hamowania wartości. Odczyty gęstości optycznej surowic badanych są wyrażone jako procent hamowania wartości stosując następujące równanie:

% hamowania wartości = 100 −

× 100

Wartości zahamowania wyższe niż 40 %, przy rozcieńczeniu surowicy 1/4, są uważane za dodatnie. Odczyt wizualny jest również możliwy, ponieważ 40 % zahamowania jest najniższym poziomem łatwo zauważalnym przez oko.

PRZYGOTOWYWANIE ANTYGENU BTV DO TESTU ELISA

1. Przemyj 10 butelek roux z wyrośniętą hodowlą komórek BHK-21, trzykrotnie płynem Eagla bez surowicy i zakaź wirusem choroby niebieskiego języka serotyp 1, rozcieńczonym w płynie Eagla bez surowicy.

2. Inkubuj w 37 °C i przeglądaj codziennie czy wystąpił efekt cytopatyczny (cpe).

3. Jeśli efekt cytopatyczny obejmie 80-90 % warstwy komórek w każdej z butelek, dokonaj zbioru wirusa przez potrząsanie butelki.

4. Odwiruj przy 2000–3000 obrotów na minutę, oby otrzymać grudkę komórek.

5. Odrzuć supernatant i zawieś komórki z osadu w około 30 ml PHS, który zawiera 1 % sarkosylu i 2 ml fenylometylosulfanylo fluorku (bufor lizujący). Takie postępowanie może spowodować powstanie żelu z komórek i może być potrzebne dodanie więcej buforu lizującego aby zredukować ten efekt.

UWAGA:

fenylometylosulfanylo fluorek jest szkodliwy i należy obchodzić się z nim ostrożnie.

6. Rozbijaj komórki sondą ultradźwiękową przez 60 sekund przy amplitudzie 30 mikronów.

7. Odwiruj przy 10000 obrotów przez 10 minut.

8. Odstaw supernatant w temperaturze – 4 °C i rozpuść powstałą grudkę komórek w 10-20 ml buforu lizującego.

9. Sonifikuj i klaruj zbierając supernatant na każdym etapie i powtórz to trzykrotnie.

10. Połącz wszystkie supernatanty i odwiruj przy 24000 obrotów na minutę przez 120 minut przy temperaturze + 4 °C na 5 mililitrowej poduszce 40 % sacharozy (w/v w PBS) używając 30 ml próbówek Beckmana i wirnika SW 28.

11. Odrzuć supernatant, przepłucz dokładnie probówki i zawieś grudkę w PBS przez sonifikację. Przechowuj antygen w małych ilościach przy temperaturze – 70 °C.

MIARECZKOWANIE ANTYGENU BTV DO TESTU ELISA

Antygen BTV do testu ELISA jest miareczkowany za pośrednictwem pośredniej metody ELISA. Dwukrotne rozcieńczenie antygenu jest miareczkowane w stosunku do stałego rozcieńczenia (1/50 przeciwciała monoklonalnego 3–17-A3). Procedura wygląda następująco:

PROCEDURA

1. Rozcieńcz antygen BTV w PBS na całej mikropłytce dwukrotnie (50 μl na dołek) używając pipety wielokanałowej.

2. Inkubuj 1 godzinę w temperaturze 37 °C w wytrząsarce obrotowej.

3. Płukcz płytki trzykrotnie PBS.

4. Dodaj 50 μl przeciwciała monoklonalnego 3–17-A3 (rozcieńczonego 1/50) do wszystkich dołków mikropłytki.

5. Inkubuj 1 godzinę w temperaturze 37 °C we wytrząsarce obrotowej.

6. Płucz płytki trzykrotnie PBS.

7. Dodaj 50 μl globuliny przeciwciał anty-mysich znakowaną peroksydazą chrzanową, rozcieńczoną do koncentracji przed miareczkowaniem do wszystkich dołków mikropłytki.

8. Inkubuj 1 godzinę w temperaturze 37 °C w wytrząsarce obrotowej.

9. Dodaj substrat i chromogen jak zostało to opisane wcześniej. Zatrzymaj reakcję po 10 minutach poprzez dodanie 1 molarnego kwasu siarkowego (50 μl do dołka).

W teście Elisa za pośrednictwem blokowania, przeciwciała monoklonalne muszą być w nadmiarze, dlatego musi być wybrane takie rozcieńczenie antygenu aby znajdowało się na krzywej miareczkowania (nie w regionie plateau), które daje w przybliżeniu 0,8 OD po 10 minutach.

Protokół dla wykonywania testu immunodyfuzji w żelu agarowym na wykrywanie przeciwciał epizootycznej choroby krwotocznej

Test immunodyfuzji w żelu agarowym jest przeprowadzany zgodnie z następującym Protokołem:

MATERIAŁY I ODCZYNNIKI

1. Antygen

Antygen do precypitacji jest przygotowywany na jakiejkolwiek hodowli komórkowej, która utrzymuje szybkie rozmnażanie odpowiednich serotypów wirusa epizootycznej choroby krwotocznej (zakażenia reowirusami). System BHK lub vero jest rekomendowany. Antygen znajduje się w supernatancie pod koniec rozmnażania wirusa, ale wymaga 50- do 100-krotnego stężenia. Stężenie to może być osiągnięte poprzez standardową technikę zagęszczania; wirus w antygenie może być inaktywowany poprzez dodanie 0,3 % (w/v) beta-propiolaktonu.

2. Znana dodatnia surowica kontrolna.

Używając standardowej surowicy referencyjnej i antygenu wytwarzana jest surowica standardowa a następnie standaryzowana w optymalnej proporcji do międzynarodowej surowicy wzorcowej, następnie zostaje poddana procesowi liofilizacji i stosowana jako surowica kontrolna w poszczególnych badaniach.

3. Surowica badana.

PROCEDURA:

1. 1 % agaroza, przygotowana w boranowym lub sodowym buforze barbitolowym, przy pH 8,5- 9,0 jest wylana do płytek Petriego przy minimalnej głębokości 3,0 mm.

2. W agarze zostaje wycięty wzór siedmiu, pozbawionych wilgoci, studzienek każda o średnicy 5,0 mm. Wzór składa się ze studzienki centralnej oraz sześciu studzienek peryferyjnych ułożonych peryferyjnie w promieniu 3 mm.

+++++ TIFF +++++

3. Studzienka centralna zostaje napełniona standardowym antygenem. Studzienki peryferyjne 2, 4 i 6 są napełnione znaną surowica dodatnią, studzienki 1, 3 i 5 zostają napełnione surowicami badanymi.

4. System zostaje inkubowany przez 72 godziny w temperaturze pokojowej w zamkniętej komorze wilgotnej.

INTERPRETACJA

Testowana surowica jest dodatnia, jeśli tworzy specyficzny prążek precypitacyjny z antygenem wirusowym i ten prążek precypitacyjny łączy się z surowicą kontrolną. Testowana surowica jest ujemna, jeśli nie tworzy specyficznego prążka precypitacyjnego z antygenem wirusowym i nie zakrzywia linii surowicy kontrolnej. Płytki Petriego powinny być oglądane w ciemności stosując oświetlenie niebezpośrednie.

--------------------------------------------------