Decyzja Komisji

z dnia 22 lutego 2001 r.

ustanawiająca plany pobierania próbek i metody diagnostyczne do celów wykrywania i potwierdzania występowania niektórych chorób ryb oraz uchylająca decyzję 92/532/EWG

(notyfikowana jako dokument nr (2001) 426)

(Tekst mający znaczenie dla EOG)

(2001/183/WE)

KOMISJA WSPÓLNOT EUROPEJSKICH,

uwzględniając Traktat ustanawiający Wspólnotę Europejską,

uwzględniając dyrektywę Rady 91/67/EWG z dnia 28 stycznia 1991 r. dotycząca warunków zdrowotnych zwierząt obowiązujących przy wprowadzaniu na rynek zwierząt i produktów akwakultury [1], ostatnio zmienioną dyrektywą 98/45/WE [2], w szczególności jej art. 15,

a także mając na uwadze, co następuje:

(1) Plany pobierania próbek i metody diagnostyczne stosowane do wykrywania i potwierdzania występowania niektórych chorób ryb zostały ustanowione w decyzji Komisji 92/532/EWG [3], zmienionej decyzją Komisji 96/240/WE [4].

(2) Od czasu przyjęcia decyzji 92/532/EWG, zdobyto nową wiedze praktyczną i naukową, a także wprowadzono zmiany do dyrektywy 91/67/EWG. W związku z tym należy dokonać aktualizacji planów pobierania próbek i metod diagnostycznych.

(3) Taka aktualizacja wiąże się z badaniem i identyfikacją wirusów wywołujących wirusową posocznicę krwotoczną ryb łososiowatych (VHS) oraz zakaźną martwicę układu krwiotwórczego ryb łososiowatych (IHN), a także wprowadzeniem zmian zgodnie z ostatnimi zmianami dyrektywy 91/67/EWG.

(4) Przeprowadzono konsultacje w zakresie chorób ryb z laboratoriami referencyjnymi Wspólnoty, ustanowionymi na mocy dyrektywy Rady 93/53/EWG [5].

(5) Plany pobierania próbek i metody diagnostyczne stosowane do wykrywania i potwierdzania występowania niektórych chorób ryb, wprowadzone decyzją 92/532/EWG muszą zostać uchylone ze względu na większą przejrzystość.

(6) Środki przewidziane w niniejszej decyzji są zgodne z opinią Stałego Komitetu Weterynaryjnego,

PRZYJMUJE NINIEJSZĄ DECYZJĘ:

Artykuł 1

Plany pobierania próbek i metody diagnostyczne stosowane do wykrywania i potwierdzania występowania wirusowej posocznicy krwotocznej ryb łososiowatych (VHS) oraz zakaźnej martwicy układu krwiotwórczego ryb łososiowatych (IHN) są ustanowione w załączniku.

Artykuł 2

Niniejsza decyzja uchyla decyzję 92/532/EWG.

Artykuł 3

Niniejsza decyzja skierowana jest do Państw Członkowskich.

Sporządzono w Brukseli, dnia 22 lutego 2001 r.

W imieniu Komisji

David Byrne

Członek Komisji

[1] Dz.U L 46 z 19.2.1991, str. 1.

[2] Dz.U. L 189 z 3.7.1998, str. 12.

[3] Dz.U. L 337 z 21.11.1992, str. 18.

[4] Dz.U. L 79 z 29.3.1996, str. 19.

[5] Dz.U. L 175 z 19.7.1993, str. 23.

--------------------------------------------------

ZAŁĄCZNIK

PLANY POBIERANIA PRÓBEK ORAZ METODY DIAGNOSTYCZNE STOSOWANE DO WYKRYWANIA I POTWIERDZANIA WYSTĘPOWANIA WIRUSOWEJ POSOCZNICY KRWOTOCZNEJ RYB ŁOSOSIOWATYCH (VHS) ORAZ ZAKAŹNEJ MARTWICY UKŁADU KRWIOTWÓRCZEGO RYB ŁOSOSIOWATYCH (IHN)

WPROWADZENIE

Niniejszy załącznik:

a) zawiera wytyczne i określa minimalne wymagania dotyczące planów pobierania próbek i metod diagnostycznych stosowanych do wykrywania i potwierdzania występowania wirusowej posocznicy krwotocznej ryb łososiowatych (VHS) oraz zakaźnej martwicy układu krwiotwórczego ryb łososiowatych (IHN);

b) ujmuje w całość przepisy załączników B i C do dyrektywy 91/67/EWG, dotyczące zatwierdzania i utrzymywania statusu poszczególnych stref i gospodarstw w strefach niezatwierdzonych;

c) ustanawia przepisy dotyczące właściwej diagnozy VHS i IHN oraz oficjalnego uznawania statusu stref i gospodarstw w strefach niezatwierdzonych, zgodnie z art. 5 i 6 dyrektywy 91/67/EWG;

d) jest skierowany zarówno do władz odpowiedzialnych za zwalczanie VHS i IHN, jak i personelu laboratoriów wykonujących próbki na występowanie tych chorób. W związku z tym, nacisk jest w nim odpowiednio położony na procedury pobierania próbek, zasady i tryb przeprowadzania badań laboratoryjnych i oceny ich wyników, jak również na szczegółowy opis technik laboratoryjnych. Jednakże, w stosownych przypadkach, laboratoria mogą wprowadzać zmiany w testach opisanych w niniejszym załączniku, albo stosować inne testy, pod warunkiem, że są one równie wrażliwe i precyzyjne.

Część I zawiera plany pobierania próbek i opis metod diagnostycznych stosowanych do nadzoru nad VHS i IHN, w celu uzyskania i utrzymania statusu strefy zatwierdzonej lub gospodarstwa zatwierdzonego w strefie niezatwierdzonej.

Część II zawiera opis procedur diagnostycznych do potwierdzenia występowania VHS i IHN w wypadku podejrzenia wystąpienia tych chorób.

Część III zawiera kryteria i wytyczne dotyczące urzędowego programu inspekcji sanitarnych, potwierdzającego brak występowania VHS i/lub IHN w przeszłości.

Część IV zawiera zalecenia dotyczące procedur miareczkowaniu wirusa VHS i IHN, w celu sprawdzenia wrażliwości hodowli komórkowych na zakażanie.

Wykaz akronimów i skrótów znajduje się w części V.

CZĘŚĆ I Plany pobierania próbek i metody diagnostyczne stosowane do celów nadzoru VHS i IHN w celu uzyskania i utrzymania statusu strefy zatwierdzonej lub gospodarstwa zatwierdzonego w strefie niezatwierdzonej

I. Inspekcje i pobieranie próbek

1. Ogólne przepisy dotyczące klinicznych badań zdrowotności, pobierania i wyboru próbek do celów nadzoru stref albo gospodarstw w strefach niezatwierdzanych do celów uzyskania i utrzymania statusu strefy lub gospodarstwa zatwierdzonego w odniesieniu do VHS i/lub IHN

Kliniczne inspekcje sanitarne i pobieranie próbek tkanek ryb i/lub płynu jajnikowego w strefach albo w gospodarstwach w strefach niezatwierdzanych, dokonywane do celów uzyskania i utrzymania statusu strefy zatwierdzonej lub gospodarstwa zatwierdzonego w odniesieniu do VHS i/lub IHN, zgodnie z załącznikami B i C do dyrektywy 91/67/EWG, są przedstawione w tabelach 1A, 1B i 1C. Dalsze szczegółowe informacje są podane w częściach I.I.2-I.I.4. Tabele 1A i 1B nie mają zastosowania do nowych gospodarstw i gospodarstw, które ponownie rozpoczynają działalność związaną z rybami, ikrą albo gametami pochodzącymi ze stref zatwierdzanych albo z zatwierdzonych gospodarstw w strefach niezatwierdzanych, pod warunkiem, że te gospodarstwa spełniają wymagania określone w części I.A.6 lit. a) lub I.A.6 lit. b) lub II.A.3 lit. a) lub II.A.3 lit. b) załącznika C do dyrektywy 91/67/EWG.

Inspekcje kliniczne należy przeprowadzać w okresie od października do czerwca albo ilekroć temperatura wody spada poniżej 14 °C. W przypadku, gdy gospodarstwa mają być poddane inspekcji klinicznej dwa razy w roku, odstępy między badaniami muszą wynosić, co najmniej cztery miesiące. Wszystkie jednostki produkcyjne (stawy, zbiorniki, sieci w postaci klatek itd.) muszą być poddane inspekcji w kierunku stwierdzenia obecności martwych, słabych albo anormalnie zachowujących się ryby. Szczególną uwagę należy zwrócić na ujścia wód, w których słabe ryby gromadzą się z powodu istniejącego prądu wody.

Ryby do próbek wybiera się w następujący sposób:

- Jeżeli występuje pstrąg tęczowy, do próbki wybiera się tylko ryby tego gatunku. Jeżeli pstrąg tęczowy nie występuje, próbka musi zawierać ryby wszystkich innych gatunków, w przypadku gdy należą one do gatunków wrażliwych na VHSV i/lub IHNV (zgodnie z wykazem w załączniku A do dyrektywy 91/67/EWG). Poszczególne gatunki muszą być proporcjonalnie reprezentowane w próbce.

- Jeżeli do produkcji ryb wykorzystuje się więcej niż jedno źródło wody, próbka musi obejmować ryby ze wszystkich źródeł.

- Jeżeli próbka obejmuje ryby słabe, anormalnie zachowujące się albo od niedawna martwe (jeszcze nie będące w stanie rozkładu), do próbki należy wybierać przede wszystkim takie ryby. Jeżeli natomiast takie ryby nie występują, próbka musi obejmować zdrowe ryby pozyskane w taki sposób, aby wszystkie części gospodarstwa oraz wszystkie przedziały wiekowe ryb były w niej proporcjonalnie reprezentowane.

2. Przepisy szczególne, w tym w zakresie pobierania próbek, dotyczące nadzoru stref albo gospodarstw w strefach niezatwierdzanych w celu uzyskania lub utrzymania statusu strefy zatwierdzonej lub gospodarstwa zatwierdzonego w odniesieniu do VHS i/lub IHN

1. Strefa albo gospodarstwo w strefie niezatwierdzonej, znajdujące się pod urzędowym nadzorem na podstawie:

a) dwuletniego programu nadzoru – Model A

Po co najmniej dwóch latach bez jakichkolwiek klinicznych bądź innych oznak występowania VHS i/lub IHN, wszystkie gospodarstwa w strefie albo każde gospodarstwo w niezatwierdzonej strefie, mające dopiero uzyskać zatwierdzenie, muszą być poddane inspekcjom sanitarnym dwa razy w roku przez okres dwóch lat. Podczas tego dwuletniego okresu kontroli, poprzedzającego nadanie statusu gospodarstwa zatwierdzonego, nie mogą wystąpić żadne kliniczne ani inne oznaki występowania VHS i/lub IHN a próbki do badania muszą być pobierane zgodnie z tabelą 1A. Ponadto, próbki muszą być wybierane, przygotowywane i badane w sposób opisany w częściach I.I - I.IV, a badania laboratoryjne muszą dawać ujemne wyniki na występowanie VHS i/lub IHN; albo

b) dwuletniego programu nadzoru przy zmniejszonej liczbie próbki – Model B

W ślad za urzędowym programem inspekcji sanitarnej, potwierdzającym brak obecności VHS i/lub IHN przez okres co najmniej czterech lat, wszystkie gospodarstwa w strefie albo każde gospodarstwo w niezatwierdzonej strefie, mające dopiero uzyskać zatwierdzenie, muszą być poddane inspekcji sanitarnej dwa razy w roku przez okres dwóch lat. Podczas tego dwuletniego okresu kontroli, poprzedzającego nadanie statusu gospodarstwa zatwierdzonego, nie mogą wystąpić żadne kliniczne ani inne oznaki występowania VHS i/lub IHN a próbki do badania muszą być pobierane zgodnie z tabelą 1B. Ponadto, próbki muszą być wybierane, przygotowywane i badane w sposób opisany w częściach I.I–I.IV, a badania laboratoryjne muszą dawać ujemne wyniki na występowanie VHS i/lub IHN. Aby program inspekcji sanitarnej mógł być urzędowo uznany przez właściwe urzędowe służby za potwierdzający brak występowania VHS i/lub IHN, musi on spełniać kryteria i wytyczne określone w części III.

2. Przepisy szczególne dotyczące zatwierdzania nowych gospodarstw i gospodarstw, które ponownie zaczynają działalność związaną z rybami, ikrą lub gametami z zatwierdzonej strefy lub zatwierdzonego gospodarstwa znajdującego się w strefie niezatwierdzonej

Nowe gospodarstwa oraz gospodarstwa, które ponownie zaczynają działalności związaną z rybami, ikrą lub gametami z zatwierdzonej strefy lub zatwierdzonych gospodarstw znajdujących się w strefie niezatwierdzonej mogą otrzymać status gospodarstwa zatwierdzonego zgodnie z wymaganiami ustanowionymi w części I.A.6 lit. a)/b) albo II.A.3 lit a)/b) załącznika C do dyrektywy 91/67/EWG. Przepisy dotyczące pobierania próbek w ramach powyższych modeli A i B (części I.I.2.1 lit. a) oraz części I.I.2.1. lit. b)) nie mają zastosowania do takich gospodarstw.

3. Program nadzoru w zakresie utrzymania statusu strefy zatwierdzonej lub gospodarstwa zatwierdzonego w odniesieniu do VHS i/lub IHN

W celu utrzymania statusu zatwierdzonej strefy lub zatwierdzonego gospodarstwa w strefie niezatwierdzonej w odniesieniu do VHS i/lub IHN, inspekcje i pobieranie próbek do badania muszą odbywać się zgodnie z tabelą 1C. Próbki muszą być wybierane, przygotowywane i badane w sposób opisany w częściach I.I–I.IV, a badania laboratoryjne na obecności czynników VHS i/lub IHN muszą dawać wynik ujemny.

3. Przygotowywanie i wysyłka pobieranych próbek z ryb

Przed wysyłką albo przekazaniem próbek laboratoryjnych, części organów przeznaczone do badania muszą być pobrane przy użyciu wyjałowionych narzędzi i umieszczone w sterylnych plastikowych probówkach zawierających podłoże transportowe, w którym próbki będą transportowane tj. podłoże hodowli komórkowych z 10 % surowicą cielęcą oraz antybiotykami. Zaleca się stosowanie mieszanki 200 j.m. penicyliny, 200 μg streptomycyny i 200 μg kanamycyny na mililitr (ml), ale można również zastosować inne antybiotyki o udowodnionej skuteczności. Do badań należy pobrać tkanki śledziony, nerki przedniej, a także serca lub mózgu. W niektórych przypadkach, należy poddać badaniu płyn jajnikowy (tabele 1A–C).

Płyn jajnikowy albo części organów, pochodzące od maksymalnie 10 ryb (tabele 1A–C), mogą być pobrane do jednej wyjałowionej próbówki zawierającej co najmniej 4 ml podłoża transportowego i stanowić jedną zbiorczą próbkę. Tkanka w każdej próbce powinna mieć masę co najmniej 0,5 grama g).

Próbówki należy umieścić w izolowanych pojemnikach (na przykład pudełkach wykładanych grubą warstwą polistyrenu) wraz z wystarczającą ilością lodu albo "zamrożonych chłodzących bloków", aby zapewnić chłodzenie próbek podczas przewozu do laboratorium. Nie należy dopuścić do zamarznięcia próbek. Temperatura próbki podczas transportu nie powinna w żadnym momencie przekraczać 10 °C, a w chwili przekazywania próbek do laboratorium, w pojemniku powinien jeszcze znajdować się lód, a w przypadku zamrożonych bloków, co najmniej jeden z nich powinien być całkowicie lub częściowo zamrożony.

Badanie wirusologiczne musi być przeprowadzone w możliwie jak najkrótszym czasie i nie później niż 48 godziny po pobraniu próbek. W wyjątkowych [1] przypadkach badanie wirusologiczne może być wykonane w ciągu 72 godzin od pozyskania materiału, pod warunkiem, że był on chroniony za pomocą podłoża transportowego oraz że mogą być przestrzegane wymagania dotyczące temperatury podczas jego przewozu (część I.I 3 ust. 3).

Cała ryba może być przesłana do laboratorium, jeżeli podczas przewozu można zapewnić wymaganą temperaturę. Cała ryba może być zawinięta w papier posiadający właściwości absorpcyjne, umieszczona w torebce plastikowej, schłodzona w sposób podany wyżej. Do badań można także przesłać żywą rybę.

Wszystkie opakowania i etykiety muszą być odpowiadać obowiązującym regulacjom w zakresie transportu krajowego i międzynarodowego.

4. Pobieranie dodatkowego materiału diagnostycznego

Stosownie do ustaleń z laboratoriami diagnostycznymi przeprowadzającymi badania, inne tkanki ryb mogą być pozyskane i przygotowywane do celów wykonania dodatkowych badań.

II. Przygotowywanie próbek do badań wirusologicznych

1. Zamrażanie próbek w wyjątkowych przypadkach

W przypadku wystąpienia trudności praktycznych (np. złe warunki meteorologiczne, dni wolne od pracy, problemy z prawidłowym funkcjonowaniem laboratorium itd.), uniemożliwiających inokulację komórek w ciągu 48 godzin od pozyskania tkanek, dopuszcza się zamrożenie tkanek w podłożu hodowlanym komórkowych w temperaturze -20 °C lub niższej, i wykonanie badań wirusologicznych w ciągu kolejnych 14 dni. Jednakże tkanka przed badaniem może być zamrożona i rozmrożona tylko raz. Należy prowadzić szczegółowe zapisy dotyczące zamrożenia z podaniem przyczyn konieczności zamrożenia tkanki (np. burza, obumarcie linii komórkowych itd.)

2. Homogenizacja organów

W laboratorium tkanka w probówkach musi zostać poddana homogenizacji (w stomacherze lub homogenizatorze, albo jałowym piaskiem przy pomocy moździerza i tłuczka), a następnie zawieszona w pierwotnym podłożu transportowym.

Jeżeli próbkę stanowi cała ryby o długości poniżej 4 cm, rybę należy pokroić przy użyciu wyjałowionego noża bądź skalpela, po uprzednim usunięciu części ciała znajdujących się za otworem jelitowym. Jeżeli próbkę stanowi cała ryby o długości 4–6 cm, taka próbka powinna zawierać trzewia, w tym nerkę. Jeśli próbkę stanowi cała ryby o długości powyżej 6 cm, tkanka do badania powinna być pozyskana zgodnie z opisem zawartym w części I.I.3. Tkankę należy rozdrobnić przy pomocy wyjałowionych nożyczek albo skalpela, poddać homogenizacji w sposób opisany powyżej i zawiesić w podłożu użytym transportowym.

Końcowy stosunek tkanki i podłoża transportowego, musi być ustalony w laboratorium i wynosić 1:10.

3. Wirowanie materiału homogenizowanego

Homogenat poddaje się odwirowywaniu w schładzanej 2–5 °C wirówce o obrotach 2000–4000 x g przez 15 minut, a następnie zbiera się supernatant i poddaje działaniu antybiotyków np. 1 mg/ml gentamycyny, albo przez cztery godziny w temperaturze 15 °C, albo pozostawia na noc w temperaturze 4 °C.

Jeżeli wysyłana próbka była na czas transportu umieszczona w odpowiednim podłożu transportowym (tzn. pozostawała pod działaniem antybiotyków), poddanie supernatantu działaniu antybiotyków można pominąć.

Stosowanie antybiotyków ma na celu zwalczanie bakteryjnego zarażenia próbek, co zwalnia z konieczności filtrowania ich przez membrany filtracyjne.

Jeżeli zebrany supernatant jest przechowywany w temperaturze -80 °C w ciągu 48 godzin po pobraniu próbki, może on być ponownie użyty w badaniu wirusologicznym tylko raz.

W przypadku zaistnienia trudności praktycznych (np. uszkodzenia inkubatora, problemów z hodowlami komórkowymi itd.), uniemożliwiających inokulację komórek w ciągu 48 godzin po ich pozyskaniu, dopuszcza się zamrożenie supernatantu w temperaturze -80 °C i wykonanie badania wirusologicznego w ciągu kolejnych 14 dni.

Przed inokulacją komórek, supernatant miesza się w równych częściach z odpowiednio rozcieńczoną surowicą odpornościową pierwotnych serotypów wirusa IPN, po czym poddaje inkubacji przez co najmniej jedną godzinę w temperaturze 15 °C albo nie dłużej niż 18 godzin w temperaturze 4 °C. Miano surowicy odpornościowej musi wynosić 1/2000 w przypadku testu neutralizacji na płytkach 50 %.

Poddawanie wszystkich inokulów działaniu surowicy odpornościowej zawierającej przeciwciała swoiste wobec wirusa IPN (wirusa, który w kilku częściach Europy występuje w 50 % próbek ryb) ma na celu zapobieganie CPE wywołanemu wirusem IPN. Dzięki takiemu postępowaniu skraca się czas badania wirusologicznego, jak również liczbę przypadków, w których występowanie CPE musiałoby być uznane jako potencjalnie wskazujące na obecność VHSV albo IHNV.

W przypadku próbek pochodzących z jednostek produkcyjnych, które są uznane za wolne od IPN, nie jest konieczne poddawanie zaszczepionych hodowli komórkowych działaniu surowicy odpornościowej zawierającej przeciwciała swoiste wobec wirusa IPN.

III. Badanie wirusologiczne

1. Hodowle komórkowe i podłoża

BF-2 albo RTG-2, oraz komórki EPC lub FHM wzrastają w 20 % przy temperaturze do 30 °C w odpowiednim podłożu np. płynie hodowlanym Eagle’s (lub jego modyfikacjach) z dodatkiem 10 % płodowej surowicy bydlęcej i antybiotyków o standardowych stężeniach.

W przypadku, gdy komórki są hodowane w zamkniętych fiolkach, do buforowania podłoża hodowlanego zaleca się stosowanie wodorowęglanu. Podłoże używane do hodowli komórek w otwartych jednostkach może być buforowane przy użyciu Tris-HCl (23 mM) i dwuwęglanu sodu (6 mM). pH musi wynosić 7,6 ± 0,2.

Hodowle komórkowe używane do inokulacji materiału tkankowego powinny być młode (4–48 godzin) i czynnie wzrastać (nie zlewając się) przy inokulacji.

2. Inokulacja hodowli komórkowych

Zawiesinę organów poddanych działaniu antybiotyku wszczepia się do hodowli komórkowych w dwóch rozcieńczeniach tj. rozcieńczeniu pierwotnym oraz rozcieńczeniu uzyskanym w wyniku rozcieńczenia roztworu pierwotnego w stosunku 1:10, uzyskując w ten sposób ostateczne rozcieńczenia materiału tkankowego w pożywce hodowli komórkowych odpowiednio 1:100 i 1:1000 (w celu uniknięcia jednorodnego przenikania). Co najmniej dwie linie komórkowe muszą być zaszczepione (patrz część I. III.1). Wielkość inokulum i objętość podłoża hodowlanego hodowli komórkowej powinny pozostawać w stosunku 1:10.

Dla każdego rozcieńczenia i każdej linii komórkowej należy wykorzystać co najmniej 2 cm2 powierzchni komórek, co odpowiada jednemu basenikowi na płytce 24-basenikowej. Zaleca się stosowanie płytek do hodowli komórek, ale można również używać innych jednostek o podobnej lub większej powierzchni wzrostu.

3. Inkubacja hodowli komórkowych

Zaszczepione hodowle komórkowe poddaje się inkubacji w temperaturze 15 °C w ciągu 7–10 dni. Zmiana zabarwienia podłoża hodowli komórkowej z czerwonego na żółte, wskazuje na jego zakwaszenie. W takim przypadku należy odpowiednio skorygować pH przy użyciu wyjałowionego wodorowęglanu lub innego równoważnego środka, aby zapewnić wrażliwość komórek na zakażanie wirusem.

Co najmniej raz na sześć miesięcy, lub w razie podejrzenia, że nastąpiło zmniejszenie wrażliwości komórek, należy wykonać miareczkowanie zamrożonych zapasów VHSV i IHNV w celu sprawdzenia wrażliwości hodowli komórkowych na zakażanie. Zalecaną procedurę przedstawiono w części IV.

4. Badanie mikroskopowe

Inokulowane hodowle komórkowe należy regularnie sprawdzać (co najmniej trzy razy na tydzień) przy 40–150-krotnym powiększeniu, w celu stwierdzenia, czy występuje CPE. Jeżeli zauważono wyraźny CPE, należy niezwłocznie przystąpić do identyfikacji wirusa, stosownie do zaleceń opisanych w części I.IV.

5. Hodowla wtórna

Jeżeli nie wystąpił CPE 7–10 dniach od pierwszej inkubacji, na świeżych hodowlach komórkowych wykonuje się hodowle wtórne, na powierzchni komórek zbliżonej pod względem wielkości do pierwotnej hodowli.

Jednakową objętość podłoża hodowlanego (supernatantu) ze wszystkich hodowli/baseników stanowiących hodowlę pierwotną zbiera się w jedną łączną porcję zgodnie z linią komórkową 7–10 dni po inokulacji i następnie inokuluje się ją na jednorodnych hodowlach komórkowych, w formie nierozcieńczonej lub rozcieńczonej w stosunku 1:10 (uzyskując ostateczne stężenie supernatantu odpowiednio w stosunku 1:10 i 1:100), zgodnie z opisem w części I.III2. Jednakową objętość 10 % podłoża hodowlanego pochodzącego z pierwotnej hodowli można również przesiewać bezpośrednio do basenika ze świeżą hodowlą komórkową (z basenika do basenika z hodowlą wtórną). Inokulację może poprzedzać inkubacją odpowiednio rozcieńczonych roztworów z surowicą odpornościową zawierającą przeciwciała swoiste wobec wirusa IPN, zgodnie z opisem podanym w części I.II.3.

Zaszczepione hodowle poddaje się inkubacji w ciągu 7–10 dni, w temperaturze 15 °C, przestrzegając zaleceń określonych w części I.III.4.

Jeżeli w ciągu pierwszych trzech dni inkubacji wystąpi toksyczny CPE, hodowla wtórna może być utworzona na tym etapie, ale komórki muszą wówczas być poddane inkubacji przez siedem dni, i hodowla wtórna musi być inkubowana przez kolejne siedem dni. Jeżeli toksyczny CPE wystąpi po pierwszych trzech dniach inkubacji, można dokonać jednej operacji przenikania komórek, aby łączny czas inkubacji wyniósł 14 dni, licząc od pierwszej inokulacji. W ostatnich siedmiu dniach inkubacji nie powinny wystąpić żadne oznaki toksyczności.

Jeżeli pomimo użycia antybiotyków wystąpi zarażenie bakteryjne, hodowlę wtórną należy uprzednio odwirować przy 2000–4000 x g w ciągu 15–30 minut w temperaturze 2–5 °C i/lub przefiltrować supernatant na filtrze 0,45 μm (membrana wiążąca białka niskoczasteczkowe). Poza tym sposób postępowania z hodowlą wtórną jest identyczny jak w przypadku toksycznego CPE.

IV. Identyfikacja wirusa

1. Testy identyfikacyjne wirusa

Jeżeli zaobserwowano oznaki CPE w hodowli komórkowej, pobiera się podłoże hodowlane (supernatant) i bada przy użyciu co najmniej jednego z poniższych testów: neutralizacji, IF, ELISA. Jeżeli te testy nie pozwoliły na ostateczne zidentyfikowanie wirusa w ciągu jednego tygodnia, supernatant należy przesłać do krajowego laboratorium referencyjnego, bądź do laboratorium referencyjnego UE właściwego dla chorób ryb w celu natychmiastowej identyfikacji.

2. Test neutralizacji

Wyodrębnić komórki z pozyskanego supernatantu poprzez odwirowanie (2000–4000 x g) albo przy użyciu filtra (0,45 μm) z membraną wiążącą białka niskocząsteczkowe i rozcieńczyć supernatant w stosunku 1:100 i 1:10000 w pożywce hodowli komórkowej.

Jednakową objętość każdego z dwóch rozcieńczonych roztworów supernatantu należy wymieszać i inkubować przez 60 minut w temperaturze 15 °C, z równymi częściami następujących odczynników:

- surowicy zawierającej przeciwciała grupowoswoiste wobec VHSV, w rozcieńczeniu w stosunku objętościowym 1:50 [2]

- surowicy zawierającej przeciwciała grupowoswoiste wobec IHNV w rozcieńczeniu w stosunku objętościowym 1:50 [3]

- grupy surowic odpornościowych wobec miejscowych serotypów IPNV w rozcieńczeniu w stosunku objętościowym 1:50 [4]

- tylko podłoża hodowlanego (kontrola dodatnia)

Dla każdej z mieszanin supernatantu i surowicy wykonuje się inokulację co najmniej dwóch hodowli komórkowych przy użyciu 50 μl każdej z mieszanin, a następnie poddaje inkubacji w temperaturze 15 °C. Występowanie CPE sprawdza się w sposób określony w części I.III.4.

Niektóre szczepy VHSV nie reagują na test neutralizacji. Takie wyizolowane szczepy muszą być identyfikowane przy użyciu testów IF albo ELISA.

Można zamiennie wykonać inne testy neutralizacji, jednak pod warunkiem, że ich skuteczność została uprzednio potwierdzona.

3. Test IF

Dla każdego izolatu wirusa, który ma być zidentyfikowany należy wykonać inokulację komórek na co najmniej ośmiu szkiełkach podstawowych lub podobnych, z zachowaniem gęstości prowadzącej do 60–90 % łączenia się po 24 godzinach hodowli. Zaleca się do tego celu komórki EPC z uwagi na ich zdolność silnego przylegania do powierzchni szkła; jednakże można również stosować inne linie komórkowe takie jak BF-2, RTG-2 albo FHM.

Po osadzeniu się komórek na powierzchni szkła (po jednej godzinie od inokulacji) lub po inkubacji hodowli przez nie więcej niż 24 godziny, wykonuję się inokulację wirusa, który ma być zidentyfikowany. Cztery hodowle inokuluje się w stosunku objętościowym 1:10, i cztery hodowle w stosunku 1:1000. Hodowle poddaje się następnie inkubacji w temperaturze 15 °C w ciągu 20–30 godzin.

Po inkubacji hodowle płucze się dwukrotnie z użyciem podłoża Eagle’a (MEM) bez surowicy, utrwala się w 80 % silnie schłodzonym acetonie i wybarwia poprzez naniesienie dwóch warstw IFAT. Pierwsza warstwa odczynnika zawiera poliklonalne albo monoklonalne przeciwciała o jakości referencyjnej. Drugą warstwą odczynnika jest surowica odpornościowa skoniugowana flourochromem z immunoglobulinami z pierwszej warstwy. Dla każdej badanej surowicy odpornościowej należy wybarwić co najmniej jedną hodowlę inokulowaną wysoką dawką i jedną inokulowaną niską dawką. W próbce powinny znaleźć się odpowiednie kontrole ujemne i dodatnie. Zaleca się stosowanie fluorochromów typu FITC albo TRITC.

Nanieść na szkiełka z wybarwionymi komórkami roztwór soli z dodatkiem gliceryny. Próbki zbadać w świetle ultrafioletowym (UV). Należy używać okularów mikroskopowych o 10- albo 12-krotnym powiększeniu oraz soczewek obiektywu o powiększeniu 25- lub 40-krotnym i obiektywu o aperturze numerycznej odpowiednio > 0,7 i > 1,3.

Powyższy test IF jest podany jako przykład. Zamiennie można wykorzystywać inne techniki IF (hodowle komórkowe, utrwalanie przeciwciał o jakości referencyjnej) mogą być, pod warunkiem ich udokumentowanej skuteczności.

4. Test ELISA

Baseniki w płytkach do mikromiareczkowania powleka się w nocy roztworami o zalecanym rozcieńczeniu zwierającymi frakcje oczyszczonych immunoglobulin przeciwciał pochodzących z surowic o referencyjnej jakości.

Po przepłukaniu studzienek roztworem buforowym PBS-Tween-20, wirus, który ma być zidentyfikowany wprowadza się do basenika w dwu- albo czterokrotnym rozcieńczeniu i pozostawia na 60 minut w temperaturze 37 °C, aby umożliwić reakcję z powłoką zawierającą przeciwciała. Po przepłukaniu w roztworze PBS-Tween-20 dodaje się biotynylowane przeciwciała o swoistości odpowiadającej przeciwciałom powłoki i pozostawia na 60 minut w temperaturze 20 °C, aby umożliwić reakcję. Po kolejnym płukaniu w podany powyżej sposób, dodaje się streptawidynę skoniugowaną HRP i pozostawia na godzinę w temperaturze 20 °C, aby umożliwić reakcję. Po ostatnim płukaniu, związany enzym wywoływany przy użyciu odpowiednich substratów wykorzystywanych w technice ELISA (OPD lub innych).

Powyżej prezentowana wersja testu ELISA, oparta na układzie biotyna-awidyna jest podana jako przykład. Zamiennie można stosować inne warianty testu ELISA, pod warunkiem ich udokumentowanej skuteczności.

TABELA 1A

Plan inspekcji i pobierania próbek dla stref oraz gospodarstw w strefach niezatwierdzanych dla dwuletniego okresu kontroli, który poprzedza osiągnięcie zatwierdzonego statusu dla VHS i/lub IHN

(zgodnie z dyrektywą 91/67/EWG, załącznikami B i C oraz przepisami części I niniejszego załącznika)

Maksymalna liczba ryb w próbce: 10

[5] [6] [7] [8]

| Liczba inspekcji klinicznych w roku (w ciągu dwóch lat) | Liczba badań laboratoryjnych w roku (w ciągu dwóch lat) | [5]Badanie laboratoryjne na obecność wirusa |

Liczba hodowlanych ryb (próbki organów) | Liczba ryb wylęgowych (płyn jajnikowy) |

Strefy kontynentalne i gospodarstwa położone w obrębie tych stref

a)Gospodarstwa z wylęgarnią | 2 | 2 | 120 (pierwsza inspekcja) [6] 150 (druga inspekcja) | 30 (pierwsza inspekcja) [7] 0 (druga inspekcja) |

b)Gospodarstwa wyłącznie z wylęgarnią | 2 | 2 | 0 | 150 (pierwsza albo druga inspekcja) [7] |

c)Gospodarstwa bez wylęgarni | 2 | 2 | 150 (pierwsza lub druga inspekcja) | 0 |

Strefy przybrzeżne i gospodarstwa położone w obrębie tych stref

a)Gospodarstwa z wylęgarnią | 2 | 2 | 120 (pierwsza inspekcja) 150 (druga inspekcja) | 30 (pierwsza inspekcja) [7] 0 (druga inspekcja) |

b)Gospodarstwa hodowli łososi, bez wylęgarni | 2 | 2 | 30 (pierwsza inspekcja) [8] | 0 |

c)Gospodarstwa nie prowadzące hodowli łososi, bez wylęgarni | 2 | 2 | 150 (pierwsza i druga inspekcja) | 0 |

TABELA 1B

Plan inspekcji i pobierania próbek dla dwuletniego okresu kontroli poprzedzającego uzyskanie statusu zatwierdzonej strefy lub zatwierdzonego gospodarstwa w odniesieniu do VHS i/lub IHN w strefach i gospodarstwach położonych w strefach niezatwierdzonych, oficjalnie uznanych za wolne od tych chorób w przeszłości

(zgodnie z dyrektywą 91/67/EWG, załącznikami B i C oraz przepisami części I i III niniejszego załącznika)

Maksymalna liczba ryb w próbce: 10

[9] [10] [11]

| Liczba inspekcji klinicznych w roku (w ciągu dwóch lat) | Liczba badań laboratoryjnych w roku (w ciągu dwóch lat) | Badanie laboratoryjne na obecność wirusa |

Liczba ryb hodowlanych (próbki organów) | Liczba ryb wylęgowych (płyn jajnikowy) |

Strefy kontynentalne i gospodarstwa położone w obrębie tych stref

a)Gospodarstwa z wylęgarnią | 2 | 2 | 0 (pierwsza inspekcja) [5] 30 (druga inspekcja | 30 (pierwsza inspekcja) [6] 0 (druga inspekcja) |

b)reine Brutanlagen | 2 | 1 | 0 | 30 (pierwsza i druga inspekcja) [6] |

c)Gospodarstwa bez wylęgarni | 2 | 2 | 30 (pierwsza i druga inspekcja) | 0 |

Strefy przybrzeżne i gospodarstwa położone w obrębie tych stref

a)Gospodarstwa z wylęgarnią | 2 | 2 | 0 (pierwsza inspekcja) 30 (druga inspekcja) | 30 (pierwsza inspekcja) [6] 0 (druga inspekcja) |

b)Gospodarstwa hodowli łososi, bez wylęgarni | 2 | 2 | 30 (pierwsza i druga inspekcja) [7] | 0 |

c)Gospodarstwa hodowli łososi, bez wylęgarni | 2 | 2 | 30 (pierwsza i druga inspekcja) | 0 |

TABELA 1C

Plan inspekcji i pobierania próbek dla stref oraz gospodarstw położonych w strefach niezatwierdzanych, w celu utrzymania zatwierdzonego statusu w odniesieniu do VHS i/lub IHN

(zgodnie z dyrektywą 91/67/EWG, załącznikami B i C oraz przepisami części I niniejszego załącznika)

Maksymalna liczba ryb w próbce: 10

[12] [13] [14]

| Liczba inspekcji klinicznych w roku | [5]Liczba ryb w grupie testowej do badania laboratoryjnego |

Liczba ryb hodowlanych | Liczba ryb wylęgowych |

Strefy kontynentalne i gospodarstwa położone w obrębie tych stref

a)Gospodarstwa z wylęgarnią | 2 | 20 (pierwsza albo druga inspekcja) | 10 (pierwsza albo druga inspekcja) [6] |

b)Gospodarstwa tylko z wylęgarnią | 2 | 0 | 30 (pierwsza albo druga inspekcja) |

c)Gospodarstwa bez wylęgarni | 2 | 30 | 0 |

Strefy przybrzeżne i gospodarstwa położone w obrębie tych stref

a)Gospodarstwa z wylęgarnią | 2 | 20 (pierwsza albo druga inspekcja) | 10 (pierwsza albo druga inspekcja) [6] |

b)Gospodarstwa bez wylęgarni | 1 | 30 [7] | 0 |

CZĘŚĆ II Procedury diagnostyczne stosowane w celu potwierdzenia VHS i IHN w przypadkach podejrzeń wystąpienia tych chorób

W celu stwierdzenia obecności VHS i IHN stosuje się jedną lub więcej z poniższych procedur:

- A. Konwencjonalną izolację wirusa z następującą po niej identyfikacją serologiczną wirusa,

- B. Izolację wirusa z jednoczesną identyfikacją serologiczną wirusa,

- C. Inne techniki diagnostyczne (IFAT, ELISA).

Potwierdzenie pierwszego przypadku VHS i/lub IHN w gospodarstwach znajdujących się w strefach zatwierdzonych nie może opierać się wyłącznie na metodzie C. Należy również zastosować metodę A lub B.

Oprócz materiału tkankowego, przeznaczonego do badania wirusologicznego, w niektórych przypadkach należy pobrać dodatkowy materiał do badania bakteriologicznego, parazytologicznego, histologicznego lub innego, w celu umożliwienia diagnozy różnicowej.

A. Konwencjonalna izolacja wirusa z następującą po niej identyfikacją serologiczną wirusa

I.1. Wybór próbek

Do badania należy wybrać co najmniej 10 ryb wykazujących typowe oznaki IHN lub VHS.

I.2. Przygotowanie i wysyłka próbek ryb

Zgodnie z przepisami części I.I.3

I.3. Pobieranie dodatkowego materiału diagnostycznego

Zgodnie z przepisami części I.I.4

II. Przygotowanie próbek do badania wirusologicznego

Zgodnie z przepisami części I.II

III. Badanie wirusologiczne

Zgodnie z przepisami części I.III

IV. Identyfikacja wirusa

Zgodnie z przepisami części I.IV

B. Izolacja wirusa z jednoczesną identyfikacją serologiczną wirusa

I.1. Wybór próbek

Zgodnie z przepisami części II.A.I.1

I.2. Przygotowanie i wysyłka próbek ryb

Zgodnie z przepisami części I.I.3

I.3. Pobieranie dodatkowego materiału diagnostycznego

Zgodnie z przepisami części I.I.4

II.1. Homogenizacja organów

Zgodnie z przepisami części I.II.2

II.2. Odwirowywanie homogenatu

Homogenat odwirowuje się w wirówce o obrotach 2000–4000 x g schładzanej 2–5 °C przez 15 minut a supernatant zbiera się i poddaje działaniu antybiotyków np. 1 mg/ml gentamycyny przez cztery godziny w temperaturze 15 °C, lub filtruje przez filtr (0,45 μm) wiążący białka niskocząsteczkowe.

II.3. Poddawanie supernatantu działaniu diagnostycznych surowic odpornościowych

Zawiesinę organów, poddaną działaniu antybiotyków lub przefiltrowaną, rozpuszcza się w mieszaninie podłoża do hodowli komórkowej w stosunku 1:10 i 1:1000, a następnie jednakowe objętości tak przygotowanych roztworów poddaje się inkubacji przez 60 minut w temperaturze 15 °C z równymi częściami odczynników wymienionych w części I.IV.2.

III.1. Hodowle komórkowe i podłoża

Zgodnie z przepisami części I.III.1

III.2. Inokulacja hodowli komórkowych

Z każdej mieszaniny szczep wirusa-surowica (przygotowanej w sposób podany w części II.B.II.3) inokuluje się co najmniej dwie hodowle komórkowe dla każdej linii komórkowej, przy użyciu 50 μl każdej z mieszanin.

III.3. Inkubacja hodowli komórkowych

Zgodnie z przepisami części I.III.I

III.4. Badanie mikroskopowe

Zaszczepione hodowle komórkowe sprawdza się codziennie pod kątem wystąpienia CPE przy 40–150-krotnym powiększeniu. Jeśli CPE jest hamowany przez jedną z użytych surowic odpornościowych, możne uznać, że wirus został odpowiednio zidentyfikowany.

Jeśli CPE nie jest zahamowany przez żadną z użytych surowic odpornościowych, należy przeprowadzić identyfikację wirusa, zgodnie z przepisami części I.IV.

III.5. Hodowla wtórna

Jeśli po 7–10 dniach nie wystąpił CPE, należy wykonać hodowlę wtórną z zaszczepionych hodowli komórkowych wraz z supernatantem i podłożem hodowlanym (część II.B.II.3), zgodnie z przepisami części I.III.5.

C. Inne techniki diagnostyczne

Supernatant przygotowany w sposób opisany w części I.II.2 można zbadać techniką IFAT lub ELISA, odpowiednio zgodnie z częścią I.IV.3 lub częścią I.IV.4. Badania wykonane tymi szybkimi technikami diagnostycznymi muszą być uzupełnione badaniem wirusologicznym w ciągu 48 godzin po pobraniu próbki, zgodnie z pkt A lub B, jeśli:

a) uzyskany wynik jest ujemny; lub

b) uzyskany wynik badania z materiałem reprezentującym pierwszy przypadek IHN lub VHS w strefie zatwierdzonej jest dodatni.

Materiał tkankowy może być poddany badaniu innymi technikami diagnostycznymi, takim jak RT-PCR, IF na zmrożonych wycinkach lub techniką immunohistochemii na materiale tkankowym utrwalonym formaliną. Badaniom wykonanym tymi technikami musi zawsze towarzyszyć inokulacja nieutrwalonego materiału tkankowego na hodowlach komórkowych.

CZĘŚĆ III Udokumentowany brak wcześniejszego występowania VHS i/lub IHN w strefach lub gospodarstwach usytuowanych w strefach niezatwierdzonych

Wytyczne i kryteria dla urzędowego programu inspekcji sanitarnej

1. Program inspekcji sanitarnej można rozpocząć jedynie:

- po zrealizowaniu urzędowo zatwierdzonego programu zwalczania VHSV i/lub IHNV, włącznie z usunięciem wszystkich ryb z terenu gospodarstwa, oczyszczeniem, dezynfekcją i po karencji przed sprowadzeniem nowych ryb z zatwierdzonych gospodarstw, lub

- w gospodarstwach, na terenie których w przeszłości nie miało miejsca zakażenie VHSV lub IHNV.

2. Program inspekcji sanitarnej musi opierać się zarówno na inspekcjach klinicznych jak i badaniach laboratoryjnych.

3. Program musi obejmować dwie inspekcje sanitarne rocznie, zgodnie z wytycznymi podanymi w części I.

4. Podczas co najmniej jednej inspekcji przeprowadzanej w każdym roku należy pobrać 30 tkanek rybnych i/lub próbek płynu jajnikowego z każdego gospodarstwa. Próbki powinny być wybrane, przygotowane i poddane badaniu laboratoryjnemu, zgodnie z przepisami części I, II i IV.

5. Program inspekcji sanitarnej powinien być prowadzony przez cztery lata we wszystkich gospodarstwach w strefie lub w gospodarstwie (ze strefy niezatwierdzonej), które ma zostać zatwierdzone.

6. Program może być oficjalnie uznany, jeżeli nie wystąpiły ani nie zostały wykryte przypadki zachorowania na VHS lub IHN (nie stwierdzono oznak klinicznych zakażenie bądź nie wyizolowano wirusa).

CZĘŚĆ IV Procedura miareczkowania w celu oceny podatności hodowli komórkowych na zakażenie

Zalecane procedury miareczkowania, określone w części LIIL3 są podane poniżej.

Należy użyć co najmniej dwa izolaty VHSV i jeden izolat IHNV. Izolaty powinny reprezentować główną grupę wirusów obecnych w UE np. dla VHSV: jeden izolat wirusa o patogennym potencjale od pstrąga tęczowego z wód słodkich oraz jeden izolat wirusa o patogennym potencjale od ryby morskiej – skarpia, natomiast dla IHNV: jeden izolat szczepu wirusa o patogennym potencjale od pstrąga tęczowego z Europy. Należy używać dobrze zdefiniowanych izolatów pochodzących z Państw Członkowskich. Izolaty referencyjne dla wszystkich chorób ryb są dostępne w laboratorium referencyjnym UE.

Grupy wirusów o małej liczbie przenikania do hodowli komórkowych namnaża się w kolbkach z użyciem komórek BF-2 lub RTG-2 dla VHSV oraz komórek EPC lub FHM dla IHNV. Należy używać podłoża do hodowli komórkowych, zwierającego co najmniej 10 % surowicy. Do inokulacji należy używać szczepów o niskim MOI (< 1).

Przy pełnym CPE, szczep wirusa pozyskuje się poprzez odwirowanie supernatantu hodowli komórkowej przy obrotach 2000 x g przez 15 minut i filtrowanie w warunkach sterylnych przez filtr 0,45μm. Uzyskany szczep rozdziela się do oznaczonych krioprobówek. Szczep wirusa przechowuje się w temperaturze -80 °C.

Tydzień po zmrożeniu, trzy probówki z każdym szczepem wirusa rozmraża się pod zimną wodą i miareczkuje na odpowiednich liniach komórkowych. Co najmniej co sześć miesięcy, lub jeśli podejrzewa się, że podatność linii komórkowej zmniejszyła się, każdy izolat wirusa jest rozmrażany i miareczkowany.

Procedury miareczkowania muszą być szczegółowo opisane, każdorazowo należy postępować zgodnie z tą sama procedurą.

Miareczkowanie do punktu końcowego należy wykonać dla co najmniej sześciu próbek z każdego rozcieńczenia. Miana porównuje się z uzyskanymi poprzednio. Jeśli nastąpi spadek miana któregokolwiek z trzech izolatów wirusa o 2 log lub więcej w porównaniu z mianem pierwotnym, linia komórkowa nie może być dłużej wykorzystywana do celów nadzoru.

Jeśli w laboratorium przechowuje się różne linie komórkowe, każda z nich powinna być badana odrębnie.

Wyniki badań należy przechowywać przez co najmniej 10 lat.

CZEŚĆ V Akronimy i skróty

BF-2 Linia komórkowa - Bluegill fry – 2

CPE Efekt cytopatyczny

CRL Laboratorium referencyjne Wspólnoty właściwe dla chorób ryb

ELISA enzymatyczny odczyn immunoabsorpcyjny

EPC Linia komórkowa – Epithelioma papulosum cyprini

FHM Linia komórkowa – Fathead minnow

FITC Izotiocyjanian fluoresceiny

Hepes Kwas 2-[4-(2-hydroksetylo)-1-piperazyno]etanosulfonowy

HRP Peroksydaza chrzanowa

IF Test immunofluorescencyjny

IFAT Test fluorescencyjny pośredni na przeciwciała

IHN(V) Wirus zakaźnej martwicy układu krwiotwórczego ryb łososiowatych

IPN Wirus infekcyjnego obumarcia tkanek trzustki

MEM Minimalna objętość podłoża

MOI Współczynnik zakażania (stosunek liczby cząsteczek wirusa zakażającego do znanej liczby komórek w hodowli)

OPD ortofenylenodiamina

PBS Sól fizjologiczna buforowana fosforanami

RTG-2 Gonada pstrąga tęczowego (linia komórkowa)

RT-PCR Odwrotna transkrypcja sprzężona z łańcuchową reakcja polimerazową

Tris-HCl Chlorowodorek hydroksymetyloaminometanu – HCl

TRITC Izotiocyjanian tetrametylorodaminy

VHS(V) Wirus wirusowej posocznicy krwotocznej ryb łososiowatych

[1] W wyjątkowych przypadkach, np. kiedy ryby są pozyskiwane z odległych terenów z których nie ma codziennych dostaw.

[2] Lub zgodnie ze specyfikacją laboratorium referencyjnego dotyczącą możliwej cytotoksyczności surowic odpornościowych.

[3] Lub zgodnie ze specyfikacją laboratorium referencyjnego dotyczącą możliwej cytotoksyczności surowic odpornościowych.

[4] Lub zgodnie ze specyfikacją laboratorium referencyjnego dotyczącą możliwej cytotoksyczności surowic odpornościowych.

[5] Zamiennie można użyć mniejszej próbki, zgodnie z tabelą 1B, jeżeli zostały spełnione wymagania określone w części II.1, I.I.2.1. lit. b) i III.

[6] Badania kliniczne.

[7] W wyjątkowych okolicznościach, jeżeli niemożliwe jest pobranie płynu jajnikowego, badaniu można poddać organy.

[8] Próbki muszą być pobrane nie wcześniej niż trzy tygodnie po przeniesieniu ryb z wody słodkiej do słonej.

[9] Badania kliniczne.

[10] W wyjątkowych okolicznościach, jeżeli niemożliwe jest pobranie płynu jajnikowego, badaniu można poddać odpowiednie organy.

[11] Próbki muszą być pobrane nie wcześniej niż trzy tygodnie po przeniesieniu ryb z wody słodkiej do słonej.

[12] W zatwierdzonych strefach próbki muszą być pobierane rotacyjnie w każdym roku tylko w 50 % gospodarstwa. W zatwierdzonych gospodarstwach w strefach niezatwierdzonych próbki muszą być pobierane każdego roku.

[13] W wyjątkowych okolicznościach, jeżeli nie jest możliwe pobranie płynu jajnikowego, badaniu można poddać odpowiednie organy.

[14] Próbki należy pobrać nie wcześniej niż trzy tygodnie po przeniesieniu ryb z wody słodkiej do słonej.

--------------------------------------------------